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Universidade Federal de Ouro Preto
Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas
Programa de Pós-Graduação em Ciências Biológicas
Caracterização e Avaliação da Atividade Ecto-
nucleotidásica do Trypanosoma cruzi e sua Relação com a
Infectividade in vitro.
Autor: Ramon de Freitas Santos
Orientadora: Dr
a.
Juliana Lopes Rangel Fietto
Co-orientadora: Dr
a.
Maria Terezinha Bahia
Ouro Preto
2008
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Livros Grátis
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II
“Há homens que lutam um dia e são bons.
Há homens que lutam um ano e são melhores.
Há os que lutam muito e são muito bons.
Mas há homens que lutam toda vida, esses são imprescindíveis.”
Bertold Brecht
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III
Dedicatória
À minha família, em especial aos meus pais – Ivanilda Lopes e
Januário Joaquim – alicerces da minha formação pessoal e
profissional, e aos meus irmãos – Bruninha e Barrigada – pelo
apoio e cumplicidade, indispensáveis para vencer qualquer desafio.
IV
Agradecimentos
À Força Maior, criadora do universo, pelo dom da vida, por estar aqui, mesmo que de
passagem, e poder encher de ar os pulmões.
À professora, tutora e amiga Juliana L. R. Fietto, minha eterna gratidão pela
oportunidade e pela confiança depositada, por ser responsável pela minha formação
profissional e por me mostrar que ciência se faz com o coração e, principalmente, com respeito
ao próximo.
À professora Maria Terezinha Bahia, pelas orientações quanto às técnicas
parasitológicas e pelo exemplo de personalidade marcante e dedicação à pesquisa.
Ao professor Luciano G. Fietto pelas valiosas discussões científicas, amizade e pelo
exemplo de profissional.
À minha perseverança, por esses dois anos orientado à distância, e por ver que podemos
ir muito mais longe depois de pensar que não se pode mais.
Aos animais, utilizados como modelos experimentais, sem os quais muitas de nossas
produções científicas se tornariam inviáveis.
Ao ensino público, gratuito e de qualidade.
À Vanja Maria Veloso e ao Sérgio Caldas pelas inúmeras ajudas nas coletas sangüíneas
dos camundongos, desde meus primeiros passos na iniciação científica.
Ao Paulo M. M. Guedes, a quem eu devo todo meu conhecimento adquirido, na prática,
no Laboratório de Doença de Chagas. Obrigado, acima de tudo, pela amizade.
Ao Matheus S. Bastos, por ter me incentivado a trabalhar no LBCM e, principalmente,
por ter me apresentado à Juliana. Além do amplo apoio recebido uma grande amizade foi
construída desde a graduação.
À Marcela, em especial, quem sempre esteve ao meu lado me ajudando das mais
diversas maneiras neste projeto, compartilhando dos momentos de cansaço e de alegria que ele
nos proporcionou.
V
Aos professores Ieso M. Castro e Rogélio L. Brandão, meus sinceros agradecimentos,
por terem aberto as portas do Laboratório de Biologia Celular e Molecular, disponibilizando
todo o suporte técnico para que eu pudesse desenvolver minha pesquisa.
Aos professores do curso de Pós-Graduação pelos ensinamentos transmitidos.
Ao Núcleo de Pesquisas em Ciências Biológicas pela oportunidade.
À minha querida amiga Maria Raquel pelo apoio, carinho, confiança e pelas ótimas
“trocas de idéias”!!!
À maravilhosa, monumental e histórica cidade de Ouro Preto, por ter me acolhido tão
bem. Sentirei saudades...
À querida e gloriosa República Tigrada, aos Ex-alunos e Tigres pelos melhores e
inesquecíveis momentos da minha estadia aqui em Ouro Preto. Família essa que tenho orgulho
e enorme felicidade de fazer parte há seis anos. “A Tigrada é a Tigrada”. Valeu!
À professora Marta de Lana pelas palavras cordiais durante os seminários internos do
laboratório de Doença de Chagas.
À Zezé Trópia, uma pessoa muito simpática e sempre disposta a ajudar. Terei sempre
um grande carinho por você onde estiver!
Aos funcionários do Biotério Central da Universidade Federal de Ouro Preto,
principalmente à Cristina, sem os quais não seria possível realizar e manter as experimentações
animais.
Ao professor Luis C. C. Afonso, pelo aporte científico e por me fazer sentir à vontade
trabalhando em seu laboratório.
Aos amigos do Laboratório de Biologia Celular e Molecular e do Laboratório de
Doença de Chagas pelo agradável convívio.
Às agências financiadoras deste projeto: CAPES, CNPq e FAPEMIG.
À minha querida amiga Nilza Satie Hangai, pessoa astral, “comandante da QG”, e por
ser parceira de golo... Os rock’s sem você não teriam graça!!!
VI
À amável Cida, secretária do programa de Pós-Graduação, pela atenção e cordialidade
em nos receber, semeando alegria pelos corredores do NUPEB.
À todos que auxiliaram na realização desse trabalho. Muito obrigado!
VII
Resumo
Neste trabalho foi avaliada a participação de ecto-nucleotidases, especialmente da família E-
NTPDase, na infecção in vitro pelo Trypanosoma cruzi. Foi demonstrado que diferentes cepas/clone
apresentam atividade ecto-nucleotídásica diversa, porém, as formas tripomastigotas mantém maior
hidrólise de ATP.
Adicionalmente, utilizando a cepa Y, que apresentou a maior polaridade entre hidrólise de ATP
e ADP, definimos uma cinética de atividade ecto-nucleotidásica sobre nucleotídeos de adenina durante a
manutenção do ciclo celular (passagens) em células VERO. Nas passagens celulares as formas
tripomastigotas apresentaram as maiores atividades ecto-ATPásicas e uma tendência à diminuição da
relação de hidrólise ATP/ADP com o aumento do número de passagens. Na terceira passagem poucos
parasitos foram capazes de internalizar, originando parasitos de P4, com perfil de hidrólise similar aos
parasitos das passagens anteriores. A maioria dos parasitos que não internalizaram se diferenciaram em
formas arredondadas do tipo amastigotas e apresentaram uma reduzida razão de hidrólise ATP/ADP,
semelhante aos amastigotas derivados de tripomastigotas de P1 e P3. Estes dados sugerem que a
diminuição da relação ATPase/ADPase seja um fator que de algum modo impede a internalização dos
parasitos, induzindo à sua diferenciação e diminuição da infectividade.
O uso dos inibidores de apirases como, Suramina, ARL67156 e GdCl
3
levou ao bloqueio parcial
da atividade ecto-ATPásica e ecto-ADPásica, nos parasitos vivos e na NTPDase-I recombinante
purificada, e foram capazes de inibir a infecção em células VERO até o máximo de 78%. A
infectividade in vitro também foi inibida pelo tratamento com antisoro anti-NTPDase-I, entretanto, este
não se mostrou capaz de bloquear significativamente a hidrólise de ATP e ADP, sugerindo que esta
proteína possa ter outras funções que afetam a infectividade além da regulação da concentração de
nucleotídeos extracelulares, como, por exemplo, participação na adesão celular.
Nossos dados, de maneira geral, indicam a participação das E-NTPDases e da NTPDase-I no
processo infectivo e sugerem fortemente que o bloqueio da sinalização dependente destes parece ser
realmente um bom alvo para a quimioterapia e possivelmente para imunização. Assim, a inibição do
metabolismo extracelular de nucleotídeos de adenina surge agora efetivamente como um novo alvo para
o bloqueio da infecção pelo T. cruzi.
VIII
Abstract
In this work we evaluated the role of ecto-nucleotidases (E-NTPDases) in VERO cells
Trypanosoma cruzi infection. It was demonstrated that different strains/clone of T. cruzi shows diverse
ecto-nucleotidase activities, although all infective forms trypomastigotes presented higher levels of ATP
hydrolysis.
In addition, using Y strain, that presented highest polarity in ATP x ADP hydrolysis we
performed a continuous in vitro infection of T. cruzi in VERO cells culture and evaluated the ecto-
nucleotidase activities using adenine nucleotides. The results showed clearly that ATP/ADP ratio
decreases with increase of the cellular passages. In the 3ª to 4ª passage parasites could not penetrate in
VERO cells and differentiated to amastigote-like. Analysis of ecto-nucleotidase activities from infective
P4 parasites showed higher ATP hydrolysis and ATPase/ADPase ratio. On the other hand the P4
amastigote-like parasites showed low levels of ATPase activity and lower ATPase/ADPase ratio. These
data suggested that lower ATPase/ADPase ratio could be related with the decreasing in infectivity and
induction of amastigote-like differentiation.
Using apyrase inhibitors (Suramin, GdCl
3
, ARL67156) we observed significant levels of
inhibition of ecto-apyrase activities in live trypomastigotes and in the recombinant purified T. cruzi
NTPDase-I. The VERO cells infection using these parasites leaded to the block of in vitro infection
achieving the maximum inhibition of 78% with 0.1 mM of Suramin.
VERO cells infection were inhibited to when trypomastigotes were treated with anti-apyrase
anti-serum (T. cruzi anti NTPDase-I), but this antiserum was not able to inhibit the T. cruzi ecto-apyrase
and NTPDase-I activities. These data suggested that the NTPDase-I could have any other function that
modulates the penetration of parasites in the host cells, maybe a role in adhesion events.
Our data strongly supports the effective participation of E-NTPDases and the NTPDase-I in the
T. cruzi in vitro infective processes. Additionally the partial blockage of this enzyme and related
signalizations could really be a new good target to chemotherapy and immunization of Chagas Disease.
Finishing, the inhibition of extra cellular adenine metabolism is now reveled as a new target to block T.
cruzi infection.
IX
DEDICATÓRIA.................................................................................................................................................... III
AGRADECIMENTOS...........................................................................................................................................IV
RESUMO.............................................................................................................................................................. VII
ABSTRACT.........................................................................................................................................................VIII
LISTA DE FIGURAS E TABELAS.....................................................................................................................XI
1. INTRODUÇÃO.................................................................................................................................................... 1
1.1. HISTÓRIA NATURAL DA DOENÇA DE CHAGAS ..............................................................................................2
1.2. FORMAS MORFOLÓGICAS E CICLO EVOLUTIVO............................................................................................ 6
1.3. SUB-LOCALIZAÇÃO CELULAR DO PARASITO.................................................................................................9
1.4. INTERAÇÃO PARASITO-HOSPEDEIRO – VIAS DE SINALIZAÇÕES CELULARES ............................................. 13
1.5. AS ECTO-NUCLEOTIDASES........................................................................................................................... 16
1.6. FAMÍLIA ECTO-NTPDASE........................................................................................................................... 19
1.7. RECEPTORES PURINÉRGICOS ...................................................................................................................... 20
1.8. FUNÇÕES DOS NUCLEOTÍDEOS EXTRACELULARES ..................................................................................... 24
1.9. PAPÉIS FISIOLÓGICOS DAS APIRASES EM ENDOPARASITOS ........................................................................27
2. OBJETIVOS.......................................................................................................................................................36
2.1. OBJETIVO GERAL......................................................................................................................................... 37
2.2. OBJETIVOS ESPECÍFICOS ............................................................................................................................. 37
3. ANIMAIS, MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................................................... 38
3.1. ANIMAIS ....................................................................................................................................................... 39
3.2. POPULAÇÕES DO T. CRUZI ........................................................................................................................... 39
3.3. MANUTENÇÃO DAS POPULAÇÕES DO T. CRUZI............................................................................................ 39
3.4. CURVA DE PARASITEMIA ............................................................................................................................. 39
3.5. MEIO LIT (LIVER INFUSION AND TRYPTOSE)............................................................................................. 40
3.6. CÉLULAS VERO.......................................................................................................................................... 40
3.7. MEIO DE CULTURA PARA CÉLULAS VERO – RPMI 1640..........................................................................41
3.8. CULTIVO DE CÉLULAS VERO ..................................................................................................................... 41
3.9. INFECÇÃO DE CÉLULAS VERO ................................................................................................................... 42
3.10. COLETA DE TRIPOMASTIGOTAS E OBTENÇÃO DE EPIMASTIGOTAS E AMASTIGOTAS .............................. 43
3.11. OBTENÇÃO DA NTPDASE-I RECOMBINANTE E DO ANTISORO POLICLONAL ANTI-NTPDASE-I DO T.
CRUZI................................................................................................................................................................... 44
3.12. PURIFICAÇÃO DE ANTICORPO (IGG) DO ANTISORO IMUNE......................................................................45
3.13. ENSAIOS DE ATIVIDADE ECTO-NUCLEOTIDÁSICA.....................................................................................46
3.14. ENSAIOS DE INFECTIVIDADE CELULAR ..................................................................................................... 47
3.15. COLORAÇÃO PELO MÉTODO DO GIEMSA.................................................................................................. 47
3.16. ANÁLISE ESTATÍSTICA DOS DADOS............................................................................................................ 48
4. RESULTADOS ..................................................................................................................................................49
4.1. CARACTERIZAÇÃO BIOLÓGICA ATRAVÉS DA ANÁLISE DA PARASITEMIA DE DIFERENTES ISOLADOS DO T.
CRUZI................................................................................................................................................................... 50
4.2. CARACTERIZAÇÃO DA ATIVIDADE ECTO-NUCLEOTIDÁSICA EM DIFERENTES ISOLADOS DO T. CRUZI...... 52
4.3. AVALIAÇÃO DA CAPACIDADE ECTO-NUCLEOTIDÁSICA DAS DIFERENTES FORMAS EVOLUTIVAS DO
PARASITO DURANTE A INFECÇÃO EXPERIMENTAL IN VITRO. ............................................................................54
4.4. ANÁLISE DA CAPACIDADE DE INIBIÇÃO DAS ATIVIDADES ATPASE E ADPASE DOS TRIPOMASTIGOTAS DO
T. CRUZI (CEPA Y) DE 1ª PASSAGEM CELULAR (VERO) POR INIBIDORES ESPECÍFICOS DE APIRASES (ARL
67156, SURAMINA E GDCL
3
). .............................................................................................................................61
X
4.5. ANÁLISE DA CAPACIDADE DE INIBIÇÃO DAS ATIVIDADES ATPASE E ADPASE POR INIBIDORES
ESPECÍFICOS DE APIRASES (ARL 67156, SURAMINA E GDCL
3
)
NA PROTEÍNA PURIFICADA NTPDASE-I
RECOMBINANTE DO T. CRUZI.............................................................................................................................. 63
4.6. ANÁLISE DA CAPACIDADE DE INIBIÇÃO DAS ATIVIDADES ATPASE E ADPASE DOS TRIPOMASTIGOTAS DO
T. CRUZI (CEPA Y) DE 1ª PASSAGEM CELULAR (VERO) UTILIZANDO O ANTISORO-POLICLONAL ANTI-
NTPDASE-I......................................................................................................................................................... 65
4.7. ANÁLISE DA INFECTIVIDADE DOS TRIPOMASTIGOTAS DO T. CRUZI (CEPA Y) DE 1ª PASSAGEM CELULAR
(VERO) PRÉ-TRATADOS COM INIBIDORES ESPECÍFICOS DE APIRASES, ANTISORO POLICLONAL ANTI-
NTPDASE-I E SORO PRÉ-IMUNE.........................................................................................................................67
5. DISCUSSÃO.......................................................................................................................................................76
6. CONCLUSÕES..................................................................................................................................................88
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................................................91
XI
Lista de Figuras e Tabelas
Figura 1. Formas morfológicas do T. cruzi-------------------------------------------------------7
Figura 2. Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi de acordo com Tyler & Engman
(2001). -----------------------------------------------------------------------------------------8
Figura 3. Representação esquemática do ciclo intracelular do T. cruzi de
acordo com Burleigh & Woolsey (2002). ----------------------------------------11
Figura 4. Topografia de membrana e propriedades catalíticas das diferentes
famílias de Ecto-nucleotidases segundo Zimmermann (2000). ---------18
Figura 5. Curva de parasitemia em camundongos Swiss inoculados por via
intraperitoneal com 5,0 x 10
3
tripomastigotas sangüíneos,
provenientes das cepas parentais Be-62, CL, Y e do clone CL Brener
do T. cruzi. ----------------------------------------------------------------------------------51
Figura 6. Comparação da atividade ecto-nucleotidásica dos tripomastigotas
de diferentes cepas/clone do T. cruzi obtidos após uma passagem
em cultivo celular (VERO) in vitro.--------------------------------------------------53
Figura 7. Atividade ecto-nucleotidásica em parasitos (intactos) da cepa Y do
T. cruzi submetidos ao cultivo em células VERO. ---------------------------56
Figura 8. Análise visual dos parasitos da 3ª para 4ª passagem celular. --------59
Figura 9. Avaliação da atividade ecto-nucleotidásica dos parasitos da 3ª para
4ª passagem celular. -------------------------------------------------------------------60
Figura 10. Efeito de inibidores de apirases na hidrólise de ATP e ADP em
tripomastigotas vivos da cepa Y do T. cruzi recuperados após uma
passagem celular em cultura de células VERO. -----------------------------62
XII
Figura 11. Efeito de inibidores de apirases sobre a NTPDase-I recombinante do
T. cruzi purificada.------------------------------------------------------------------------64
Figura 12. Efeito do antisoro-policlonal anti-NTPDase-I recombinante do T. cruzi
em diferentes diluições sobre a hidrólise de ATP e ADP em
tripomastigotas vivos (cepa Y) recuperados após uma passagem
celular em cultura de células VERO. ---------------------------------------------66
Figura 13. Análise da infectividade dos tripomastigotas do T. cruzi (cepa Y) de
1ª passagem celular (VERO) após 48 h de infecção. --------------------69
Tabela 1. Células de mamíferos e isolados do T. cruzi usados em ensaios de
invasão celular (Yoshida, 2005). ---------------------------------------------------10
Tabela 2. Subtipos de receptores P1 e P2 com afinidades estimadas para
ligantes fisiológicos e distribuição em células do sistema imune (Bours
e cols., 2006). ------------------------------------------------------------------------------23
Tabela 3. Resumo das características biológicas dos diferentes isolados do T.
cruzi versus cada um dos parâmetros analisados: PP, PPP, morte,
sobrevivência e pico de parasitemia. -------------------------------------------51
Tabela 4. Comparação da relação de hidrólise ATPase/ADPase das formas
tripomastigotas infectivas das diferentes cepas/clone do T. cruzi.----53
Tabela 5. Comparação entre o bloqueio da atividade ecto-nucleotidásica no
parasito intacto (tripomastigota) e na proteína recombinante
purificada (NTPDase-I) do T. cruzi. -------------------------------------------------64
Tabela 6. Efeito de inibidores específicos de apirases sobre a invasão de
células VERO pelos tripomastigotas de cultura (P1) do T. cruzi. --------68
Tabela 7. Efeito dos anticorpos policlonais anti-NTPDase-I e do soro pré-imune
sobre a invasão de células VERO pelos tripomastigotas de cultura
(P1) do T. cruzi.----------------------------------------------------------------------------68
XIII
Lista de Abreviações
(PI)-3-quinase – fosfatidil inositol-3-quinase
Ado – adenosina
ADP
e
– ADP extracelular
ATP
e
– ATP extracelular
Be-62 – cepa Berenice 62
Bz – benznidazol
CLB – clone CL Brener
E-NPP – ecto-nucleotídeo pirofosfatase/fosfosdiesterase
E-NTPDase – ecto-nucleotídeo trifosfato difosfohidrolase
GdCl
3
– cloreto de gadolínio
gp – glicoproteína
IP
3
– fofatidil inosotol 1,4,5-trifosfato
LIT – liver infusion and tryptose
LPS – lipopolissacarídeo
Nif – nifurtimox
P
i
– fosfato inorgânico
PIP
2
– fosfatidil inositol 3,4-bifosfato
PLC – fosfolipase C
PP – período patente
PPP – período pré-patente
SFB – soro fetal bovino
SMF – sistema mononuclear fagocitário
TCT – tripomastigota de cultura de tecidos
TM – tripomastigota metacíclico
TS – tripomastigota sangüíneo
1. INTRODUÇÃO
2
1.1. História natural da Doença de Chagas
A tripanossomíase americana ou doença de Chagas é uma antropozoonose prevalente
do continente americano ocorrendo do sul dos Estados Unidos ao Cone Sul da América do Sul
e com forte incidência no Brasil (WHO, 2005). O Trypanosoma (Schizotrypanum) cruzi, agente
etiológico dessa moléstia, é um protozoário digenético e hemoflagelado pertencente à ordem
Kinetoplastida e família Trypanosomatidae. Descoberta há quase um século, a doença de
Chagas ainda persiste como um grave problema de saúde pública, afetando milhões de pessoas
com alto impacto na morbidade e mortalidade (Dias e cols., 2002). Apesar dos inúmeros
esforços empregados na redução da sua incidência, estima-se que 13 milhões de pessoas
estejam infectadas pelo T. cruzi, nas Américas Central e do Sul, excluindo-se o México, sendo
que 3,0 a 3,3 milhões de indivíduos apresentam sinais clínicos característicos da fase crônica
sintomática da doença. A prevalência da doença de Chagas é de 200.000 novos casos e 50.000
óbitos/ano (WHO, 2005).
Graças aos programas coordenados por vários países sulistas da América a transmissão
da doença por vetores e por transfusão sangüínea foi interrompida no Uruguai em 1997, no
Chile em 1999, e em oito dos doze estados endêmicos do Brasil em 2000. Assim, a incidência
de novas infecções pelo T. cruzi no continente sul-americano diminuiu para menos de 70%
(Moncayo, 2003).
Essa doença, descoberta e descrita pelo grande cientista Carlos Ribeiro Justiniano das
Chagas, foi estudada em seus aspectos básicos pelo pesquisador. Naquela ocasião ele descreveu
o agente etiológico, seus estágios evolutivos e sua biologia nos hospedeiros vertebrados e
invertebrados, identificou os reservatórios naturais (silvestres e domésticos), descreveu a
doença e seu diagnóstico, além de caracterizar todos os aspectos básicos de sua epidemiologia
e patologia (Chagas, 1909).
A Doença de Chagas caracteriza-se por duas fases distintas, sendo a fase aguda
assintomática ou oligossintomática na maioria dos casos, entretanto, pode manifestar-se com
febre e apresentar alguns sinais de porta de entrada, como o sinal de Romaña (Romaña, 1935),
3
caracterizado por um edema unilateral bipalpebral, ou o chagoma de inoculação (edema
causado na pele pela picada do triatomíneo). Além destes sinais de entrada, esta fase pode ter
como sintomas um elevado parasitismo tecidual, edema subcutâneo, enfartamento ganglionar,
hepatoesplenomegalia e miocardite aguda acompanhada de cardiomegalia (Salgado e cols.,
1962; Salgado, 1980; Rassi, 1979; Rassi Jr. e cols., 2000). As taxas de óbito da fase aguda
variam entre 2% a 8%, especialmente entre crianças (Coura & de Castro, 2002). As lesões
inflamatórias nessa fase comprometem principalmente o tecido cardíaco, cujo quadro
histopatológico se caracteriza por reação inflamatória, constituída predominantemente por
células mononucleares, parasitadas ou não, produzindo fenômenos degenerativos intensos
(Parada e cols., 1997). A gênese e evolução das lesões são dependentes tanto de fatores
inerentes ao parasito quanto ao hospedeiro vertebrado. Os fatores relacionados à presença do
parasito associam-se diretamente ao tropismo, variabilidade e virulência da cepa, carga do
inóculo e antigenicidade (Higuchi, 1995; Dias, 2000). Em relação ao hospedeiro vertebrado,
fatores como idade, sexo, reinfecções, estado nutricional e perfil da resposta imune parecem
modular diferenças nas manifestações clínicas (Higuchi, 1995; Dias, 2000). Essa fase tem
duração média de dois meses, evoluindo então para a fase crônica da doença que persistirá por
toda a vida do paciente (Miles e cols., 2003).
Nesta segunda fase da doença, a resposta imune do hospedeiro é capaz de controlar a
proliferação do parasito, reduzindo a parasitemia a níveis subpatentes (Moncayo, 2003). A
maioria dos indivíduos (70%) permanece na forma indeterminada, caracterizada pela ausência
de alterações nos exames eletrocardiográficos e radiológicos do tórax e abdômen. Contudo,
vários anos pós-infecção, cerca de 20% a 35% desses indivíduos desenvolvem lesões
irreversíveis no sistema nervoso autônomo do coração, esôfago e/ou cólon (Moncayo, 2003),
caracterizando as formas clínicas sintomáticas da Doença de Chagas.
Aproximadamente 10% dos pacientes desenvolvem a forma digestiva da doença,
apresentando dilatações e alterações funcionais principalmente no esôfago e cólon, devido a
lesões no sistema nervoso autônomo intramural, parasitismo tecidual e ação do sistema imune
(Tafuri, 1970; Tafuri, 1987; Dias 1992).
4
A cardiopatia chagásica crônica é a maior causa de morbidade da doença entre
pacientes na faixa etária de 20-50 anos. Estes podem apresentar prognósticos e evolução
variáveis, desde pequenas alterações eletrocardiográficas até insuficiência cardíaca ou
progressão para uma eventual morte súbita. Ainda pode ser observado aumento global da área
cardíaca, tendo como fatores a destruição direta do tecido muscular cardíaco devido ao
parasitismo pelo T. cruzi, fibrose e auto-imunidade (Coura e cols., 1983; Dias, 1992; Leon e
cols., 2001; Kierszenbaum, 1999).
A patogênese da fase crônica da doença de Chagas e os mecanismos imunopatológicos
que promovem as lesões nos tecidos não estão, ainda, bem elucidados. A dificuldade em
detectar-se o parasito no miocárdio levou à postulação de teorias auto-imunes para explicar o
desenvolvimento dessas lesões inflamatórias miocárdicas. Algumas hipóteses têm sido
sugeridas para explicar estas lesões, como o resultado de reação de auto-imunidade envolvendo
auto-anticorpos ou linfócitos T auto-reativos derivados de mimetismo molecular de antígenos
do parasito aos do hospedeiro, ou a ativação bystander não envolvendo antígenos do T. cruzi,
induzida por antígenos procedentes de lesões teciduais (Leon e cols., 2001; Kierszenbaum,
1999; Cossio e cols., 1977; Anselmi e cols., 1966; Hyland e cols., 2007; Cunha-Neto e cols.,
2006; Gironès e cols., 2005; Ribeiro e cols., 2007). Na infecção humana pelo T. cruzi os auto-
anticorpos contra antígenos do tecido cardíaco, de músculo esquelético e tecido nervoso foram
assinalados (Kierszenbaum, 1999). O mimetismo molecular entre antígenos do parasito e do
hospedeiro com formação de auto-anticorpos foi descrito para miosina cardíaca, proteína P
ribossomal, queratina, receptores β-adrenérgicos e de muscarina, proteínas associadas aos
microtúbulos do esqueleto celular e proteínas neurais, dentre outros (López-Bergami e cols.,
2001; Levin e cols., 1989; Cunha-Neto e cols., 1996; Kerner e cols., 1991; Petry & Eisen,
1989; Hyland e cols., 2007; Cunha-Neto e cols., 2006; Gironès e cols., 2005; Ribeiro e cols.,
2007).
O tratamento da doença de Chagas iniciou-se em 1930, por Salvador Mazza, com o uso
de um derivado da quinolina 7602: Bayer, Buenos Aires, Argentina (Mazza e cols., 1937).
Segundo a Organização Mundial de Saúde e alguns autores, os requerimentos considerados
mais importantes de uma droga para a quimioterapia da doença de Chagas são: capacidade em
5
induzir cura parasitológica em ambas as fases, aguda e crônica, atividade ou em doses únicas
ou em pequenas doses, acessibilidade aos pacientes, uso no tratamento ambulatorial com o
mínimo de monitoramento e baixa probabilidade de desenvolvimento de resistência do parasito
(Brener & Filardi, 1984). Nos últimos anos, uma ampla variedade de drogas foram investigadas
com o objetivo de desenvolver uma quimioterapia mais segura e eficaz para a doença de
Chagas (Brener, 1979; de Castro, 1993). Ferreira (1961, 1962) e Ferreira e colaboradores
(1963) trataram dez casos agudos da doença de Chagas com nitrofurano, obtendo “bons
resultados” com poucos efeitos colaterais, mas o xenodiagnóstico apresentou cinco resultados
positivos após o tratamento. Coura e colaboradores (1961, 1962) trataram quatorze casos
crônicos com essa droga em esquema em longo prazo, observando nos primeiros quatro
pacientes que receberam doses progressivas de 10 a 30 mg/kg/dia, efeitos colaterais
importantes que conduziram a suspensão do tratamento devido a uma polineuropatia severa que
começou à terceira semana de administração do nitrofurano.
No final dos anos 60 e início dos anos 70 dois fármacos começaram a ser utilizados no
tratamento da doença de Chagas: o Nifurtimox, Nif, um 5-nitrofurano (3-metil-N-[(5-nitro-2-
furanil)-metileno]-4-tiomorfolinamina-1,1-dioxida; Bayer 2502) (Bock & Gönnert, 1972) e o
Benznidazol, Bz, (N-benzil-2-nitroimidazol-1-acetamida) (Polak & Richle, 1978). O modo de
ação do Nif envolve a geração de radicais nitroaniônicos pelas nitroredutases que, na presença
de oxigênio, produz intermediários reativos e, sendo o T. cruzi parcialmente deficiente na
eliminação desses radicais livres, torna-se susceptível a esses intermediários (DoCampo &
Moreno, 1986). Por outro lado, o mecanismo de ação do Bz envolve interações covalentes ou
outras interações de intermediários nitro-reduzidos (Polak & Richle, 1978), ou ligantes ao
DNA, lipídeos ou proteínas (Diaz de Toranzo e cols., 1988). Os efeitos colaterais mais
freqüentes com o tratamento com o Nif são anorexia, perda de peso, alterações psíquicas,
excitabilidade, sonolência e manifestações digestivas, como náuseas, vômitos e,
ocasionalmente, cólicas intestinais e diarréias. As reações adversas com o Bz podem ser
classificadas em três grupos: (i) sintomas de hipersensibilidade, linfadenopatia, dor articular e
muscular; dermatites com erupções cutâneas (usualmente aparecendo entre o 7º e o 10º dias de
tratamento); (ii) depressão da medula óssea, trombocitopenia e granulocitose; (iii)
polineuropatia, parestesia e polineurite dos nervos periféricos (Coura & de Castro, 2002).
6
Após os anos 80, a comercialização do Nif foi interrompida, primeiro no Brasil e depois
na Argentina, Chile e Uruguai (Coura & de Castro, 2002). Porém, além dessas drogas serem
pouco eficazes no tratamento, principalmente na fase crônica da doença, elas apresentam vários
efeitos colaterais desagradáveis que limitam seu uso na terapêutica (Guedes e cols., 2004).
Além disso, é importante salientar que devido à grande plasticidade genética do parasito, que
por sua vez reflete em diversidade de susceptibilidade das cepas do T. cruzi à ação das drogas,
geralmente ocorrem falhas terapêuticas, pois ainda não se tem conhecimento de nenhuma droga
que seja totalmente eficaz contra todas as cepas (Filardi & Brener, 1987; Urbina & Docampo,
2003; Guedes e cols., 2004).
1.2. Formas morfológicas e ciclo evolutivo
Ao longo do seu ciclo evolutivo o T. cruzi sofre profundas alterações em sua forma
morfológica que, de modo geral, refletem sua adaptação aos microambientes onde se
localizam. As diferentes formas recebem nomes de acordo com critérios morfológicos como,
suas dimensões, a posição de onde o flagelo emerge da bolsa flagelar e a localização do
cinetoplasto em relação ao núcleo celular, sendo facilmente identificadas por microscopia
óptica em preparações coradas com Giemsa (Figura 1).
As formas amastigotas, também conhecidas como esferomastigotas (nos estágios
evolutivos iniciais no barbeiro), responsáveis pela multiplicação intracelular nos hospedeiros
vertebrados, são formas ovóides, com comprimento médio de 8 µm e apresentam um flagelo
muito curto não emergente para o meio extracelular. Seu cinetoplasto está localizado próximo
ao núcleo e tem a forma de um bastonete (de Souza, 2002). Estudos realizados com essa forma
evolutiva do parasito mostraram que elas também são infectivas (em taxas muito reduzidas)
para células de mamíferos (Ley e cols., 1990; Carvalho & de Souza, 1986). Os epimastigotas
são organismos alongados ou fusiformes, com 20-40 µm de comprimento e cinetoplasto
localizado próximo e anterior à organela nuclear. O flagelo emerge da bolsa flagelar formando
uma curta membrana ondulante que se estende até à extremidade anterior do corpo celular do
parasito. Estas formas do T. cruzi são observadas em fase estacionária de crescimento (após
7
fase exponencial de crescimento) pela manutenção desses epimastigotas em meio de cultura
axênica (meio LIT) ou ainda naturalmente encontrados no intestino médio e posterior dos
hospedeiros invertebrados onde se multiplicam ativamente por fissão binária (de Souza, 2002).
Os tripomastigotas são considerados as formas infectivas para os hospedeiros vertebrados. Eles
medem aproximadamente 25 µm de comprimento e cerca de 2 µm de diâmetro. O cinetoplasto
está localizado posterior ao núcleo, e o flagelo, emergente da bolsa flagelar, estende-se da
extremidade posterior e percorre todo o corpo celular do tripomastigota, formando a membrana
ondulante (de Souza, 2002). Existem as formas tripomastigotas de tecidos ou sangüíneos (TS),
derivados do ciclo intracelular de multiplicação com liberação desses para o meio extracelular,
alcançando posteriormente os vasos sangüíneos, ou ainda derivados de cultura de tecidos in
vitro. Há também os tripomastigotas metacíclicos (TM), oriundos da diferenciação dos
epimastigotas em tripomastigotas por um processo conhecido como metaciclogênese, sendo
estes naturalmente encontrados na ampola retal dos hospedeiros invertebrados e eliminados
através das fezes e urina, sendo estes, portanto, as formas infectivas para os hospedeiros
vertebrados levando-se em consideração o mecanismo de infecção natural, via transmissão
vetorial (de Souza, 2002).
Figura 1. Formas morfológicas do T. cruzi (desenho didático). Essas distintas morfologias podem ser classificadas por critérios morfológicos
como, suas dimensões, a região de onde o flagelo emerge da bolsa flagelar e posição do cinetoplasto em relação ao núcleo. Da esquerda para a
direita, temos a forma epimastigota, tripomastigota metacíclico, amastigota e tripomastigota sangüíneo.
O complexo ciclo biológico do T. cruzi, caracterizado pela presença de vários estágios
de desenvolvimento, pode ser observado nos hospedeiros vertebrados e invertebrados (Figura
2, Tyler & Engman, 2001). Os “Barbeiros”, como são popularmente chamados os vetores e
hospedeiros invertebrados do T. cruzi, pertencem à família Reduviidae e subfamília
8
Triatominae, sendo machos e fêmeas hematófagos. O ciclo ocorre em áreas com focos naturais
apresentando os mais diversos e variados hábitats ou nichos ecológicos.
Figura 2. Ciclo de vida do Trypanosoma cruzi (Tyler & Engman, 2001). Os desenhos representam morfologias
comumente vistas nos hospedeiros vertebrados e invertebrados (sem escala). (i) é uma forma infectiva; (n) é uma
forma não infectiva; (+) representa uma forma proliferativa; (-) representa uma forma não proliferativa.
O ciclo inicia-se quando esses triatomíneos, ao realizar um repasto sangüíneo num
vertebrado infectado, ingerem TS circulantes. No estômago desses insetos os TS se
transformam em epimastigotas e outros em esferomastigotas. No intestino, os epimastigotas se
dividem repetidamente por fissões binárias (Zeledón, 1999; Kolien & Schaub, 2000; Garcia &
Azambuja, 1999). Na ampola retal, podem se aderir às células epiteliais por hemidesmossomos,
e se transformam em TM, os quais são eliminados juntamente com as fezes e urinas, sendo,
então, capazes de infectar os hospedeiros vertebrados (Zeledón, 1999; Kolien & Schaub, 2000;
Brack, 1968; Garcia & Azambuja, 1991). Esta infecção ocorre facilmente em mucosas e pode
ainda ser facilitada pelo ato de coçar a região da picada do inseto, carreando o parasito para a
região ferida.
9
Inicialmente os tripomastigotas invadem as células do sistema mononuclear fagocitário
(SMF) e se transformam em amastigotas. Estes se dividem repetidamente por fissões binárias
dando origem aos tripomastigotas que são liberados no meio extracelular, alcançando a
corrente circulatória. Após uma disseminação sistêmica esses TS penetram em outras células
nucleadas iniciando um novo ciclo. Diferentemente dos tripanosomos Africanos, os
tripomastigotas do T. cruzi não se multiplicam no sangue (de Souza, 2002).
Há um evidente polimorfismo entre os TS com variada proporção entre elas, de acordo
com a cepa do parasito (Ferriolli e cols., 1968; Andrade e cols., 1970; Coura e cols., 1966;
Belda Neto, 1974; Pereira da Silva, 1959; Brener & Chiari, 1963; Brener, 1965). Dois tipos
morfológicos são observados: as formas longas e delgadas, com núcleo alongado e cinetoplasto
subterminal, e as formas curtas e largas, com núcleo ovalado e cinetoplasto mais próximo a
este. A predominância de uma forma sobre a outra é dependente da variabilidade (isolado) do
parasito e do tempo de infecção, sendo, de um modo geral, as formas delgadas mais infectantes
nos estágios iniciais e as formas largas e mais resistentes às células do sistema imune presentes
nos estágios tardios da infecção aguda, independente do isolado do parasito (Ferriolli e cols.,
1968; Andrade e cols., 1970; Coura e cols., 1966; Belda Neto, 1974; Pereira da Silva, 1959;
Brener & Chiari, 1963; Brener, 1965). Por fim, foi sugerido que formas delgadas são as
principais responsáveis pela infecção dos hospedeiros vertebrados e, em contrapartida, as
formas largas são mais hábeis em infectar os triatomíneos (Brener, 1973).
1.3. Sub-localização celular do parasito
Diferentes isolados do T. cruzi e uma variedade de tipos de células de mamíferos, a
maioria células não fagocíticas, são utilizadas para elucidação do mecanismo de internalização
do parasito (Tabela 1, Yoshida, 2005).
10
Isolado ou clone do T. cruzi
CL, CL-14, Costalimai, Dm28, Dm28c, Dm30, F, MD, G, Guafitas, M226, 569, 588,
Silvio X-10/4, RA, Tulahuen, Y, CL-Brener, Be-62, Be-78, ABC
Tipos de células de mamíferos
Chinese hamster ovary (CHO) cell
Human carcinoma-derived epithelial HeLa cell
Human umbilical vein endothelial cell (HUVEC)
L
6
E
9
myoblast
LLC-MK
2
cell
Madin-Darby canine kidney (MDCK) cell
Mouse 3T3 fibroblast
My1Lu mink lung cell
Normal rat kidiney (NRK) fibroblast
Primary canine cardiac myocyte
Vero cell derived from African green monkey fibroblast
Tabela 1. Células de mamíferos e isolados do T. cruzi usados em ensaios de invasão celular (Yoshida, 2005).
Estudos dos mecanismos usados pelos tripomastigotas para invasão de células não
fagocíticas revelaram duas distintas estratégias. A primeira via, mediada pela enzima
membrana-ancorada fosfatidilinositol (PI)-3-quinase, envolve a indução da liberação de Ca
2+
livre no citosol pela geração de IP
3
, recrutamento e fusão de lisossomos da célula hospedeira
adjacente ao sítio de ligação do parasito, culminando na formação de um vacúolo parasitóforo
com propriedades lisossomais (Tardieux e cols., 1992; Rodriguez e cols., 1995; Rodriguez e
cols., 1996). A segunda via de internalização, envolvendo a invaginação da membrana
plasmática sem o recrutamento direto de lisossomos, foi sugerida após estudos morfológicos
realizados por Schenkman e Mortara (1992), e recentemente caracterizada após a inibição da
via envolvendo o recente recrutamento lisossomal pelo uso de inibidores da (PI)-3-quinase
(Woolsey e cols., 2003). Eles observaram que em células tratadas com Wortmannin ou
Ly294002 (inibidores da PI-3-quinase) a via lisossomal de entrada era abolida, mas níveis
basais de invasão eram ainda detectados. Nos estágios iniciais, estes poucos parasitos
11
internalizados são encontrados em vacúolos contendo marcadores moleculares para membrana
plasmática, por um mecanismo independente da polimerização de actina da célula hospedeira
(Woolsey e cols., 2003). Contudo, esta população de vacúolos parasitóforos derivados da
membrana plasmática, gradualmente adquire lisossomos (identificados por marcadores
lisossomais – Lamp1 positivos), recente ao processo infectivo, por um mecanismo único de
maturação que não é bloqueado por inibidores da PI-3-quinase (Woolsey e cols., 2003;
Carvalho & de Souza, 1989). Apesar dessa efêmera residência num vacúolo parasitóforo com
características lisossomais, não se sabe ainda muito bem qual a real importância desse
fenômeno no ciclo intracelular do T. cruzi (Andrade & Andrews, 2004).
Após a entrada nas células hospedeiras, o T. cruzi rompe o vacúolo parasitóforo,
possivelmente pela formação de poros na membrana desse vacúolo lisossomo-like, pela ação
de uma proteína lítica secretada e ativada em pH ácido (pH 5,5), denominada TcTox,
encontrando-se livre no citoplasma (Andrews, 1990; Andrews e cols., 1990; Andrews &
Whitlow, 1989; Ley e cols., 1990). A diferenciação tripomastigota-amastigota inicia-se dentro
desse vacúolo, onde são encontradas formas arredondadas com um longo flagelo (Figura 3,
Burleigh & Woolsey, 2002).
Figura 3. Representação esquemática do ciclo intracelular do T. cruzi. Os tripomastigotas aderem à superfície das células hospedeiras
desencadeando vias de sinalização que levam a um recrutamento localizado e fusão de lisossomos da célula hospedeira adjacente ao sítio de
ligação do parasito gerando um vacúolo parasitóforo com propriedades lisossomais. Os tripomastigotas iniciam então sua diferenciação no
interior desse vacúolo, escapam para o citoplasma pela secreção da TcTox, e terminam sua diferenciação em amastigotas replicativos livres no
citoplasma, processos nos quais duram aproximadamente 24 horas. Só então estão aptos a se dividirem através de fissões binárias (Burleigh &
Woolsey, 2002).
12
Durante esta transição, os parasitos diferenciam-se em amastigotas, os quais são
morfologicamente e antigenicamente distintos dos tripomastigotas invasivos e são capazes de
se multiplicarem no citosol (Brener, 1973).
Após ruptura do vacúolo, esses amastigotas encontram-se livres no citosol, há o
desaparecimento desse flagelo, e aproximadamente 24 horas depois, os amastigotas estão
completamente diferenciados e aptos a iniciarem o processo de divisão binária. O processo de
citocinese requer cerca de 25 minutos para se completar (Dvorak, 1976). Após a primeira
divisão ocorrem outras divisões e em poucos dias muitos parasitos são encontrados dentro da
célula hospedeira. Os amastigotas então iniciam a diferenciação para tripomastigotas por um
processo denominado de alongamento. Durante essa transição, ocorrem mudanças na
organização geral da célula, na estrutura do cinetoplasto, e na estrutura do flagelo (Meyer & De
Souza, 1976). Estas últimas estruturas aumentam de comprimento de 1-20 µm. Ao fim do ciclo
intracelular, o movimento desses parasitos, os quais agora têm longos flagelos, são intensos e
os ajudam a romper a célula hospedeira com sua conseqüente liberação no meio extracelular,
sendo capazes de infectar outras células nucleadas (De Souza, 2002).
Em relação à evasão do vacúolo parasitóforo, o T. cruzi difere notavelmente de outros
patógenos intracelulares como, Listeria monocytogenes e Shigella flexneri, no qual, ambos,
também rompem o fagossoma após entrada nas células e se replicam livre no citosol.
Beauregard e colaboradores (1997) e Glomski e colaboradores (2002) demonstraram que L.
monocytogenes rompe o vacúolo parasitóforo antes da fusão lisossomal brevemente após
internalização pela secreção de uma proteína, a LLO, formadora de poros e ativa em pH ácido.
Portnoy e colaboradores (2002) demonstraram que L. monocytogenes LLO mutantes eram
incapazes de escapar do vacúolo e de crescer intracelularmente. Observações similares foram
realizadas para S. flexneri, onde, mutantes IpaB (toxina formadora de poros ativa em pH ácido)
tiveram sua capacidade infectiva prejudicada frente às células epiteliais, bem como prejudicada
capacidade de evasão dos vacúolos fagocíticos (High e cols., 1992). Estes exemplos
contribuíram para reforçar a visão de que o escape da fusão lisossomal é vantajoso para a
sobrevivência de patógenos adaptados ao crescimento intracelular.
13
O fato do T. cruzi residir por um período efêmero, mas significativo, no interior de um
vacúolo parasitóforo lisossomo-like antes do escape para o citosol, levantou questões a respeito
do papel da fusão lisossomal no ciclo de vida do parasito. Andrade e Andrews (2004)
investigaram esse assunto levando em consideração a via de invasão membrana-mediada que
não envolve o recrutamento direto de lisossomos (Woolsey e cols., 2003). Elas verificaram que
a fusão lisossomal é crítica para a retenção intracelular e subseqüente replicação do T. cruzi.
Vários inibidores da PI-3-Kinase foram utilizados nesse trabalho, demonstrando que quando a
recente interação com lisossomos era inibida, poucos parasitos eram encontrados dentro de
vacúolos lamp1 positivos, sugerindo que a fusão lisossomal realiza um importante papel na
retenção dos tripomastigotas dentro das células hospedeiras. Além do mais, elas verificaram
também a presença de parasitos parcialmente internalizados em células tratadas com essas
drogas. Assim, essas descobertas sugeriram que o bloqueio da entrada lisossomo-mediada
conduzia a um processo de internalização reversível, com uma fração de parasitos
recentemente internalizados subseqüentemente saindo das células hospedeiras. Esta
possibilidade foi reforçada pela comprovação de que os tripomastigotas permanecem altamente
móveis por diversos minutos após a internalização (Andrade & Andrews, 2004).
1.4. Interação parasito-hospedeiro – vias de sinalizações celulares
A invasão de células de mamíferos pelo T. cruzi é crítico para sua sobrevivência no
hospedeiro. Assim, sua habilidade em infectar e replicar numa variedade de tipos celulares de
mamíferos é uma característica essencial do ciclo de vida do T. cruzi nos hospedeiros
vertebrados. Para promover a entrada numa ampla gama de células não fagocíticas, os
tripomastigotas infectivos exploram um arsenal de glicoproteínas de superfície, proteases
secretadas e agonistas sinalizantes para ativamente manipular as múltiplas vias de sinalização
celular que irão culminar na sua interiorização (Burleigh & Woolsey, 2002). É importante
salientar que somente as formas tripomastigotas, e amastigotas em menor proporção (Ley e
cols., 1990; Carvalho & de Souza, 1986), são capazes de internalizar em células de mamíferos
e, portanto, infectivas para os hospedeiros vertebrados. Isso reflete suas propriedades
antigênicas, ou seja, moléculas estágio-específicas, sendo as formas epimastigotas do parasito
14
incapazes de infectar as células do hospedeiro vertebrado (Burleigh & Woolsey, 2002;
Yoshida, 2005).
A invasão de células de mamíferos pelo T. cruzi tem sido extensivamente estudada in
vitro usando TM e tripomastigotas de cultura de tecidos (TCT). Diferentes isolados do parasito
e uma variedade de tipos celulares, na sua maioria células não fagocitárias, têm sido usadas
(Ver tabela 1, página 10).
A penetração do T. cruzi nas células hospedeiras é um processo de múltiplos passos
envolvendo várias moléculas do parasito e das células hospedeiras que, numa série combinada
de eventos, leva à mobilização de Ca
2+
celular, com esse aumento ocorrendo inicialmente nas
células hospedeiras seguido por um aumento citosólico desse íon no parasito, em tempos
recentes à adesão parasito-célula hospedeira (Docampo & Moreno, 1996; Burleigh & Andrews,
1995; Burleigh & Andrews, 1998; Tardieux e cols., 1994; Moreno e cols., 1994).
A adesão dos tripomastigotas é mediada por receptores e estes são restritos aos
domínios da superfície celular (Schenkman e cols., 1991). Para invadir as células de
mamíferos, os TM e TCT utilizam distintos grupos de moléculas de superfície que
diferentemente interagem com os componentes do hospedeiro. A glicoproteína gp82, específica
dos TM, se liga à mucina gástrica (Neira e cols., 2003) durante a infecção de células epiteliais
da mucosa gástrica, enquanto que membros da família da gp85, específicas dos TCT, ligam-se
à componentes da matriz extracelular, como a laminina e a fibronectina (Ouaissi e cols., 1986a;
Ouaissi e cols., 1986b; Giordano e cols., 1994).
Além do mais, existem outras moléculas envolvidas na invasão celular, como a
gp35/50, uma glicoproteína mucina-like, e a gp90, uma glicoproteína que possivelmente
modula negativamente a invasão celular pela ativação de uma tirosina fosfatase nos TM,
agindo contrariamente à proteína tirosina quinase pela defosforilação da p175 (Manque e cols.,
2003). Yoshida e colaboradores (1989) mostraram que a infectividade das formas metacíclicas
era afetada após interação com anticorpos monoclonais 10D8, os quais reagiam com epítopos
carboidratos de glicoconjugados de superfície de 35 e 50 KDa. A invasão de células VERO
pelas formas metacíclicas das cepas Tulahuen e G foi inibida em torno de 50 a 67% na
presença desses anticorpos (10D8), indicando que estas glicoproteínas poderiam realizar um
15
papel importante na interação parasito-célula hospedeira nos estágios iniciais da infecção pelo
T. cruzi (Yoshida e cols., 1989).
A gp82 e a gp35/50 se ligam às células-alvo de maneira mediada por receptor e
induzem um sinal bi-direcional de Ca
2+
. Após a ligação às células hospedeiras, a gp82
transmite um sinal ao parasito que resulta na ativação de uma proteína tirosina quinase (PTK) e
subseqüente fosforilação da p175, uma proteína que não é expressa nas formas epimastigotas
(Favoreto e cols., 1998). A cascata de sinalização induzida pela gp82 inclui a participação da
fosfolipase C (PLC), que gera inositol 1,4,5-trifosfato (IP
3
) via degradação do fosfatidil inositol
3,4-bifosfato (PIP
2
), como inferido pelos experimentos nos quais a infectividade dos parasitos
foi prejudicada pelo inibidor U73122, um inibidor específico da PLC, bem como por drogas,
como a heparina, um bloqueador competitivo de receptores de IP
3
, e cafeína, no qual afeta a
liberação de Ca
2+
de reservas sensíveis à IP
3
(Yoshida e cols., 2000).
Existe ainda a cruzipaína, uma cisteína protease (gp57/51) identificada na cepa
Talahuen do T. cruzi por Murta e colaboradores (1990) na qual é ativada numa faixa de pH
entre 5-7,5. Esta protease é expressa em todas as formas de desenvolvimento de diferentes
isolados (Murta e cols., 1990; Paiva e cols., 1998). Foi demonstrado que a cruzipaína é
diretamente responsável por danos teciduais mediante sua secreção pelo parasito,
possivelmente facilitando a ruptura das células hospedeiras, ou ainda acidentalmente liberada
após morte e lise do parasito, estimulando a resposta imunológica do hospedeiro (Murta e cols.,
1990; Paiva e cols., 1998; Eakin e cols., 1992). Adicionalmente, sua participação na invasão
celular está associada com a habilidade de gerar bradiquinina (Scharfstein e cols., 2000). Esse
grupo de pesquisadores demonstraram que a cruzipaína exógena purificada era capaz de
estimular o influxo de Ca
2+
citosólico em células CHO expressando receptores heterólogos do
tipo B
2
R (receptores específicos para quininogênios), mas não em células CHO selvagens
(Scharfstein cols., 2000). Essa bradiquinina, gerada pela degradação de quininogênios da
superfírcie da célula hospedeira, se liga a receptores na célula (B
2
R), estimula a produção de
IP
3
pela ativação da PLC, e mobiliza a liberação de Ca
2+
das reservas citosólicas (Scharfstein
cols., 2000).
16
Um fator solúvel de estrutura desconhecida, secretado pelas formas infectivas do
parasito, também estimula sinais de Ca
2+
nas células hospedeiras. Este fator solúvel é gerado
pela ação de uma serina endopeptidase alcalina de 120 KDa (oligopeptidase B) sobre
precursores inativos presentes somente nos tripomastigotas infectivos (Burleigh & Andrews,
1995).
Diversas outras moléculas do T. cruzi e do hospedeiro certamente estão implicadas na
invasão celular, bem como em outros processos associados ao sucesso da infecção, e muito
ainda há que se descobrir. Dessa maneira, podemos notar a intrincada e complexa rede de
sinalização celular já descrita no envolvimento da interiorização do parasito, onde a
combinação dessas moléculas, que variam sua expressão e funcionalidade de acordo com a
forma evolutiva e com a cepa do parasito, por exemplo, direcionam os passos que levam a uma
infecção produtiva.
1.5. As ecto-nucleotidases
As ecto-nucleotidases são importantes enzimas responsáveis pelo metabolismo
extracelular de nucleotídeos. Atualmente sabemos que estas enzimas podem tanto serem
secretadas quanto localizadas na porção externa de membranas celulares ou membranas de
organelas (Leal e cols., 2005; Ivanenkov e cols., 2005; Murphy-Piedmonte e cols., 2005;
Ivanenkov e cols., 2003). Antigamente acreditava-se que os nucleotídeos extracelulares eram
artefatos experimentais ou derivados somente de lise celular, porém, atualmente sabe-se que
estes compostos são sinalizadores celulares importantes em diversos processos biológicos
sendo produzidos de maneira finamente controlada (Sawada e cols., 2008; Osman e cols.,
2007; Gerasimovskaya e cols., 2007; Meyer-Fernandes, 2004). Durante as duas décadas
passadas houve uma expansão de conhecimento no campo das vias de sinalização de
nucleotídeos extracelulares e ainda há muito que descobrir e compreender. A clonagem
molecular de receptores e as análises farmacológicas e fisiológicas revelaram que várias células
em organismos vertebrados possuem receptores de superfície específicos para ATP
(Abbracchio & Burnstock, 1998; Bours e cols., 2006). Em particular, o ATP extracelular está
envolvido numa grande variedade de funções fisiológicas e patológicas (Haskó e cols., 2002).
17
Adicionalmente, outros nucleotídeos foram também reconhecidos como moléculas
sinalizadoras, estes incluem o ADP, UTP, UDP, GTP, GDP e uma variedade de outras
moléculas polifosfatos (Miras-Portugal e cols., 1998; Zimmermann, 1999).
Inicialmente assumiu-se que essas únicas e definidas enzimas hidrolisavam ATP (ecto-
ATPase), tendo a identidade e função dessas ecto-ATPases revisadas e o nome ATPases do
“Tipo E” proposto para essas enzimas (Plesner, 1995). Porém, mais tarde viu-se que algumas
dessas enzimas eram capazes de hidrolisar tanto ATP quanto ADP (Zimmermann, 1999). Após
a caracterização funcional e molecular de diversas novas famílias de enzimas, com
sobreposição de especificidade por substrato e distribuição tecidual, foi necessária uma nova
revisão para unificar essa nomenclatura (Zimmermann e cols., 2000).
As ecto-nucleotidases atualmente conhecidas incluem membros da família E-NTPDase
(ecto-nucleotídeo trifosfato difosfohidrolase) que atuam na conversão dos nucleotídeos tri e
difosfatados em seus componentes monofosfatados, a família E-NPP (ecto-nucleotídeo
pirofosfatase/fosfodiesterase) que utilizam diferentes substratos e possuem atividade
fosfodiesterásica e nucleotídeo pirofosfatásica, a família das fosfatases alcalinas que liberam
fosfato livre a partir de uma variedade de substratos, além da família ecto-5´-nucleotidase que
convertem nucleotídeos monofosfatos em nucleosídeos, na qual ambas apresentam uma ampla
distribuição tecidual (Zimmermann, 1996; Zimmermann & Braun, 1996; Zimmermann, 2000)
(Figura 3, Zimmermann, 2000).
O sítio catalítico das ecto-nucleotidases localiza-se voltado para o meio extracelular.
Quando estas proteínas se encontram ancoradas em membranas celulares, este fato fica bem
evidenciado em vários trabalhos que utilizam células intactas para medidas hidrolíticas
(Berrêdo-Pinho e cols., 2001; Jesus e cols., 2002; Fietto e cols., 2004). Além do mais, membros
desse grande grupo de enzimas podem ser encontrados ancorados por domínios
transmembranares ou do tipo âncora de GPI, ou ainda, podem ser liberadas no meio
extracelular na forma solúvel após clivagem na região do peptídeo sinal, podendo então ser
referidas como exonucleotidase (Zimmermann, 2000).
18
(A)
(B) C)
(D)
Figura 4. Topografia de membrana e propriedades catalíticas das diferentes famílias de Ecto-nucleotidases. (A)
Família E-NTPDase. As enzimas podem ocorrer como homomultímeros. A NTPDase 5 pode ocorrer como uma
proteína solúvel (seta). Uma possível NTPDase 6 (solúvel), de estrutura primária conhecida, está também
19
representada; (B) Família E-NPP. As enzimas podem como dímeros e podem se tornar solúveis através de
clivagem proteolítica. Os domínios protéicos específicos estão indicados por setas; (C) Família das fosfatases
alcalinas; (D) Família ecto-5’-nucleotidase de mamíferos. A enzima ocorre em dímeros e pode ser liberada da
membrana por uma fosfolipase endógena GPI-específica (Zimmermann, 2000).
1.6. Família Ecto-NTPDase
Dentro do grupo das ecto-nucleotidases (família E-NTPDase) foi descrita recentemente
uma NTPDase-I do T. cruzi (Fietto e cols., 2004). Na literatura existem vários sinônimos para
este grupo de enzimas, como, ecto-apirase, ecto-ATPDase, CD39, o que impulsionou o
desenvolvimento de uma nomenclatura única descrita por Zimmermann e colaboradores no ano
de 2000. Os membros dessa família podem hidrolisar ligações pirofosfato de nucleotídeos 5´-
trifosfato ou nucleotídeos 5´-difosfato, na presença de cátions divalentes (geralmente Ca
2+
ou
Mg
2+
), com variações para preferência individual pelo tipo de nucleotídeo (Laliberte &
Beaudoin, 1983). As NTPDases ou apirases da família CD39 não hidrolisam nucleotídeos
monofosfatos, fosfatos não nucleosídeos não são substratos e apesar de comumente serem
denominadas em função da utilização de nucleotídeos adenina (ATPase, ADPase), nem sempre
este é o substrato mais utilizado, tendo afinidade também por outros nucleotídeos: UTP, UDP,
GTP, GDP (Zimmermann, 1999).
Esta família de genes é amplamente distribuída na natureza, tendo membros
representantes em vertebrados, invertebrados, plantas, leveduras e protozoários (Handa e
Guidotti, 1996; Vasconcelos e cols., 1996; Smith e cols., 1997; Zimmermann & Braun, 1996;
Fietto e cols., 2004; Lemos e cols., 2002). Recentemente uma ecto-NTPDase (nomeada
NTPDase-I) foi descrita num organismo procarioto – Legionella pneumophila – um agente
causal de pneumonia (Sansom e cols., 2007).
Todos os membros dessa família possuem cinco regiões ou domínios muitos bem
preservados evolutivamente – regiões conservadas das apirases (ACR) – presumivelmente
sendo mais relevantes para sua atividade catalítica (Handa & Guidotti, 1996). Smith e Kirley
(1999) mostraram que mutagênese sítio-dirigida em resíduos de aminoácidos conservados das
regiões I e IV aboliram a atividade nucleotidásica dessas enzimas.
20
As E-NTPDases, usualmente chamadas de apirases, podem ser separadas em dois
grupos, presumivelmente de acordo com sua topografia de membrana (Zimmermann, 2000). Os
membros do primeiro grupo incluem os representantes em humanos: E-NTPDase 1 (Ecto-
ATPDase, CD39), E-NTPDase 2 (Ecto-ATPase, CD39L1), E-NTPDase 3 (Ecto-ATPDase,
CD39L3) e E-NTPDase 4 (UDPase), sendo que todas apresentam dois domínios
transmembrana, um localizado na porção N-terminal e o outro na extremidade C-terminal
(Zimmermann, 2000). O segundo grupo inclui a NTPDase 5 e uma possível NTPDase 6. Essas
são ancoradas à membrana por apenas um domínio hidrofóbico localizado na extremidade N-
terminal que é seguido por um sinal de clivagem, resultando numa forma solúvel e/ou secretada
da enzima. Estas enzimas, de um modo geral, hidrolisam não somente ATP e ADP, mas tem
em comum uma ampla especificidade de substrato para nucleotídeos purínicos e pirimidínicos,
diferindo, entretanto, em relação à preferência por determinado nucleotídeo 5´-trifosfato ou
nucleotídeo 5´-difosfato (Zimmermann, 2000).
1.7. Receptores purinérgicos
Atualmente sabe-se da existência de várias proteínas que são potenciais ligadoras de
nucleotídeos extracelulares, visto que estes não são capazes de atravessar membranas celulares,
dentre elas, os purinoreceptores e as ecto-nucleotidases (Dombrowski e cols., 2000).
Uma grande família de receptores ancorados à membrana media a sinalização celular
por ATP e adenosina (Ado). Estes receptores são caracterizados de acordo com os efeitos
farmacológicos de antagonistas e agonistas dos nucleosídeos e nucleotídeos (Bours e cols.,
2006). Estes são nomeados receptores purinérgicos e determinam uma variedade de efeitos
induzidos por esses nucleotídeos extracelulares. Atualmente foram definidas duas grandes
famílias de purinoreceptores, nomeadas como receptores P1 e P2 (Ralevic & Burnstock, 1998)
(Tabela 2, Bours e cols., 2006). Os receptores P1 pertencem à superfamília de receptores do
tipo serpentina (com sete domínios transmembrana), os quais são subdivididos em receptores
do subtipo A
1
, A
2A
, A
2B
e A
3
(Ralevic & Burnstock, 1998; Fredholm e cols., 2001a). Estes
subtipos ligam Ado extracelular com diferentes afinidades (Tabela 2, Bours e cols., 2006).
Sabemos que a adenosina é um potente agente imunomodulador, e a inosina, gerada pela
21
quebra da adenosina, também exibe propriedades imunomodulatórias pela ação agonista sobre
os receptores A
1
, A
2A
e A
3
sob concentrações micromolares (Jin e cols., 1997; Fredholm e
cols., 2001b; Gomez & Sitkovsky, 2003; Hasko e cols., 2004). A família dos receptores do tipo
P2 é subdividida em duas subfamílias: receptores P2X e receptores P2Y (Abbracchio &
Burnstock, 1994; Jacobson e cols., 2002; Burnstock & Knight, 2004). Os receptores do tipo
P2X são proteínas transmembrana em forma de canal iônico (transportam diferentes íons como
Na
+
, K
+
, Ca
2+
), dos quais sete subtipos já foram caracterizados até o momento (P2X
1-7
) (Khakh
e cols., 2001; North, 2002). Os receptores do tipo P2Y são proteínas transmembrana do tipo
serpentina (possuem sete domínios hidrofóbicos) acoplados à proteína G (GPCR), dos quais,
atualmente oito subtipos já foram identificados (P2Y
1, 2, 4, 6, 11-14
) (Von Kugelgen & Wetter,
2000; Jacobson e cols., 2002; Boeynaems e cols., 2003). Em contraste aos receptores P2X, os
quais respondem primariamente ao ATP extracelular, os receptores P2Y apresentam
responsividade subtipo-específico para seus ligantes fisiológicos e podem ser subdividos em
dois subgrupos baseados em homologia de seqüência (Abbracchio e cols., 2003; Boeynaems e
cols., 2003). O grupo 1 compreende receptores purínicos específicos (P2Y
1
, P2Y
11
), receptores
pirimidínicos específicos (P2Y
4
, P2Y
6
) e um receptor de especificidade mista (P2Y
2
). O grupo
2 abrange dois receptores específicos para ADP (P2Y
12
, P2Y
13
) e um receptor para UDP-
glicose (P2Y
14
) (Tabela 2, Bours e cols., 2006).
Os receptores purinérgicos são amplamente distribuídos por todos tecidos corporais,
sendo expressos sobre uma ampla variedade de células, tanto células imunes quanto não-
fagocíticas (Bours e cols., 2006). O papel do ATP e da Ado extracelular, particularmente na
imunidade e inflamação, depende da expressão de receptores purinérgicos pelos tipos celulares
que são essenciais à eficácia inflamatória e resposta imunológica (Tabela 2, Bours e cols.,
2006). A maioria das células imunes co-expressam ambos os subtipos de receptores, tanto P1
quanto P2, sugerindo uma dual regulação da função celular pela sinalização purinérgica. O
resultado dessa sinalização receptor-mediada é particularmente determinado pela magnitude da
expressão de receptores, por exemplo, a densidade desses. Essa densidade pode fatalmente
mudar durante o curso da inflamação e da resposta imune dependendo da natureza dessas
respostas, como vários imunomediadores já mostraram modular a expressão desses receptores
purinérgicos em diversos tipos celulares (Bours e cols., 2006). Por exemplo, receptores P2X
7
22
funcionais em monócitos e macrófagos são down-regulados por citocinas anti-inflamatórias
como a IL-4 e IL-10. De maneira oposta, estas mesmas células podem ser estimuladas por
mediadores pró-inflamatórios como o fator de necrose tumoral-α (TNF-α), o interferon-γ (IFN-
γ) e lipopolissacarídeos (LPS) (Falzoni e cols., 1995; Humphreys & Dubyak, 1996; Buell e
cols., 1998; Lemaire & Leduc, 2003). Concomitantemente à up-regulação dos receptores P2X
7
,
a ativação inflamatória de monócitos e macrófagos por LPS e IFN-γ induz uma down-
regulação de receptores P2Y
2
funcionais (Humphreys & Dubyak, 1996; Martin e cols., 1997).
A expressão de receptores do tipo P1 pode também ser modulada. Receptores A
2B
são up-
regulados por LPS, TNF-α, IFN-γ e IL-1 (Xaus e cols., 1999; Khoa e cols., 2003; Nemeth e
cols., 2003; Trincavelli e cols., 2004). Contrariamente, receptores A
2A
são down-regulados por
IFN-γ, mas up-regulados por TNF-α e IL-1 (Khoa e cols., 2001; Trincavelli e cols., 2002;
Khoa e cols., 2003). Assim, a expressão funcional tanto dos receptores P1 quanto dos
receptores P2 parece estar sob constante modulação.
De um modo geral, a literatura indica que a sinalização via receptores purinérgicos
depende de uma extensa variedade de fatores, incluindo a expressão e sensibilidade desses,
bem como os níveis extracelulares de nucleotídeos e nucleosídeos. A sinalização purinérgica
parece ser mais complexa dentro de condições inflamatórias, durante as quais a sinalização é
sujeita não somente à alterações dos níveis de nucleotídeos/nucleosídeos extracelulares, mas
também aos fatores modulatórios adicionais, como, por exemplo, mudanças na dinâmica da
expressão de receptores purinérgicos e ecto-enzimas em resposta aos vários imunomediadores
que são sintetizados durante o curso da inflamação e das respostas imunológicas de um modo
geral (Trincavelli e cols., 2002; Khoa e cols., 2003; Bours e cols., 2006).
23
Subtipo Ligantes fisiológicos Distribuição em células imunes
Receptores P1
A
1
Ado (EC
50
: 0.18-0.53 µM)
Inosina (EC
50
: 290 µM)
Neutrófilos; monócitos; macrófagos; células
dendríticas.
A
2A
Ado (EC
50
: 0.56-0.95 µM)
Inosina (EC
50
: 50 µM)
Neutrófilos; monócitos; macrófagos; células
dendríticas; linfócitos T; linfócitos B.
A
2B
Ado (EC
50
: 16.2-64.1 µM)
Neutrófilos; monócitos; macrófagos; células
dendríticas; linfócitos T.
A
3
Ado (EC
50
: 0.18-0.53 µM)
Inosina (EC
50
: 0.03-2.5 µM)
Neutrófilos; monócitos; macrófagos; células
dendríticas; linfócitos T.
Receptores P2
P2X
P2X
1
ATP (EC
50
: 0.05-1 µΜ)
Neutrófilos; monócitos; macrófagos; células
dendríticas; linfócitos T; células NK.
P2X
2
ATP (EC
50
: 1-30 µΜ)
P2X
3
ATP (EC
50
: 0.3-1 µΜ)
P2X
4
ATP (EC
50
: 1-10 µΜ)
Neutrófilos; monócitos; macrófagos; células
dendríticas; linfócitos T; células NK.
P2X
5
ATP (EC
50
: 1-10 µΜ)
Neutrófilos; monócitos; macrófagos; células
dendríticas; linfócitos T.
P2X
6
ATP (EC
50
: 1-12 µΜ)
P2X
7
ATP (EC
50
: 100-780 µΜ)
Neutrófilos; monócitos; macrófagos; células
dendríticas; linfócitos T; linfócitos B; células NK.
P2Y
P2Y
1
ADP (EC
50
: 8 µM)
Neutrófilos; monócitos; macrófagos; células
dendríticas; linfócitos T.
P2Y
2
UTP (EC
50
: 0.14 µM) = ATP (EC
50
: 0.23 µM)
Neutrófilos; monócitos; macrófagos; células
dendríticas; linfócitos T.
P2Y
4
UTP (EC
50
: 2.5-2.6 µM) >> ATP, UDP
Neutrófilos; monócitos; macrófagos; células
dendríticas; linfócitos T.
P2Y
6
UDP (EC
50
: 0.3 µM) >> UTP (EC
50
: 6 µM)
Neutrófilos; monócitos; macrófagos; células
dendríticas; linfócitos T.
P2Y
11
ATP (EC
50
: 17 µM)
Neutrófilos; monócitos; macrófagos; células
dendríticas; linfócitos T; linfócitos B.
P2Y
12
ADP (EC
50
: 0.07 µM) Monócitos; macrófagos; linfócitos T.
P2Y
13
ADP (EC
50
: 0.06 µM) > ATP (EC
50
: 0.26 µM) Monócitos; células dendríticas; linfócitos T.
P2Y
14
UDP-glicose (EC
50
: 0.1-0.5 µM) Neutrófilos; células dendríticas; linfócitos T.
Tabela 2. Subtipos de receptores P1 e P2 com afinidades estimadas para ligantes fisiológicos e distribuição em
células do sistema imune (Bours e cols., 2006).
24
1.8. Funções dos nucleotídeos extracelulares
A principal função das apirases descrita até o momento é a regulação da concentração
de nucleotídeos extracelulares. A literatura sobre a variedade de funções biológicas dos
nucleotídeos extracelulares é bastante vasta. Atualmente sabemos que o ATP extracelular
(ATP
e
) e seus subprodutos de degradação, ADP, AMP, adenosina e inosina, bem como outros
nucleotídeos e nucleosídeos, são componentes normais do meio extracelular e estão envolvidos
com vários efeitos em diferentes células, tecidos e órgãos (Dombrowski e cols., 1998).
O ATP
e
e outros nucleotídeos transmitem sinais às células via moléculas associadas à
superfície celular cujos sítios ligantes faceiam o meio extracelular. Enzimas ligantes de ATP
são expressas em células linfocitárias, sendo que análogos não hidrolisáveis do ATP
bloquearam a atividade lítica de células Natural Killer (NK) e células T CD8
+
bem como sua
atividade E-NTPDase (Langston e cols., 2003). Neste mesmo trabalho, eles demonstraram que
o ATP
e
é necessário para a secreção de algumas citocinas. Utilizando inibidores reversíveis e
irreversíveis destas enzimas, eles verificaram que a secreção de IL-2 e INF-γ, mas não de IL-4,
era profundamente reduzida, suportando a interpretação de que este nucleotídeo é importante
para a secreção de algumas citocinas, mas não todas, principalmente das inflamatórias
(Langston e cols., 2003). O ADP extracelular estimula a agregação plaquetária, mas não
mostrou efeito sobre linfócitos (Dombrowski e cols., 1998; North e cols., 2002).
De um modo geral, a sinalização mediada por receptores purinérgicos depende de uma
variedade de fatores, incluindo a expressão de receptores, sua sensibilidade aos ligantes, bem
como a concentração de nucleotídeos extracelulares. Nesse contexto, o ATP e a Ado são
moléculas mediadoras importantes da função das células imunes. Dependendo da concentração
dessas moléculas, elas podem se ligar a um ou outro subtipo de receptor purinérgico,
conduzindo, dessa maneira, a diferentes respostas fisiológicas (Bours e cols., 2006). Por
exemplo, neutrófilos expressam todos os quatro subtipos de receptores P1 (Martini e cols.,
1991; Salmon e cols., 1993; Sullivan e cols., 1999; Gessi e cols., 2005; Fortin e cols., 2006).
Martini e colaboradores (1991) sugeriram que a expressão desses receptores sobre neutrófilos
poderia ser afetada pela presença de uma reação inflamatória, demonstrando que alterações na
25
expressão de receptores do subtipo A
1
em neutrófilos humanos estavam associadas a algumas
doenças reumáticas.
O efeito da Ado sobre o recrutamento de neutrófilos na circulação parece ser bi-
direcional. Em baixas concentrações micromolares, a adenosina aumenta a adesão de
neutrófilos ao endotélio vascular pela estimulação de receptores A
1
, tanto em neutrófilos
(Crostein e cols., 1992; Felsh e cols., 1995) quanto em células endoteliais (Zahler e cols., 1994;
Zahler & Becker, 1998). O aumento na expressão de P-selectinas em células endoteliais via
receptores A
1
bem como a expressão de Mac-1 em neutrófilos possivelmente é responsável
pelo aumento da adesão (Zahler & Becker, 1998). Em contraste, a Ado extracelular em níveis
micromolares mais altos inibe a adesão de neutrófilos ao endotélio vascular (Cronstein e cols.,
1986; Jordan e cols., 1997; Zhao e cols., 2000; Kilian e cols., 2005) mediada por receptores
A
2A
e A
2B
expressos em neutrófilos (Minamino e cols., 1996; Sullivan e cols., 2004; Eltzschig
e cols., 2004). Este processo também pode ser favorecido pela expressão de receptores A
3
na
superfície de células endoteliais (Jordan e cols., 1999).
Os linfócitos são as principais células de resposta do sistema imune celular e humoral
(Alam & Gorska, 2003; Vallejo e cols., 2004; Weinstein e cols., 2004). As duas maiores
subclasses são as células B e as células T que expressam receptores antígeno-específicos, os
quais são responsáveis pela imunidade adaptativa. A função dos linfócitos está sujeita à
regulação por nucleotídeos extracelulares como sugerido por três linhas de evidências.
Primeiro, os linfócitos T são capazes de liberar ATP após ativação (Filippini & Stikovsky,
1990; Loomis e cols., 2003). Segundo, os linfócitos T expressam receptores purinérgicos para
nucleotídeos extracelulares. Diversos subtipos de receptores P2X são expressos em linfócitos T
periféricos, por exemplo, P2X
1,4,5,7
(Chused e cols., 1996; Gu e cols., 2000; Smith e cols.,
2001; Di Virgilio e cols., 2001; Li e cols., 2001; Adinolfi e cols., 2002; Budagian e cols., 2003;
Loomis e cols., 2003; Wang e cols., 2004). Loomis e colaboradores (2003) mostraram um
aumento na produção de IL-2 por células T ativadas por UTP, sugerindo a expressão funcional
de receptores P2Y seguinte à ativação celular. A terceira linha de evidência, na qual sugeriu
que a função de linfócitos T era regulada por nucleotídeos extracelulares, compreende a
expressão de diversas ecto-enzimas metabolizadoras de purinas sobre linfócitos T. As células T
26
exibem pouca ou nenhuma atividade CD73, mas tem uma alta expressão de E-NTPDase
(CD39), na qual essa atividade catalítica pode ser estimulada seguinte à ativação linfocitária
(Filippini e cols., 1990; Dombrowski e cols., 1995; Langston e cols., 2003; Leal e cols., 2005).
O ATP extracelular pode estar envolvido na resposta proliferativa de linfócitos. Em
linfócitos T periféricos murinos, o ATP, em altas concentrações (0,5-2,0 mM), inibiu a
proliferação em células T estimuladas (Dos Reis e cols., 1986). Usando linfócitos T periféricos
de humanos, Baricordi e colaboradores (2003) demonstraram que o ATP em níveis
micromolares (100-300 µM) mostrou ser um co-estimulador proliferativo de linfócitos T CD4
+
e CD8
+
via ativação de um receptor P2X, possivelmente o subtipo P2X
7
. Recentemente esta
possibilidade foi confirmada, demonstrando que o ATP induzia a proliferação de células T
Jurkat, resultado da estimulação da transcrição gênica de IL-2 mediada por ATP (Budagian e
cols., 2003).
Sabe-se que a Ado extracelular pode ser transportada para o citoplasma e incorporada
em vias de recuperação de purinas presentes em parasitos, como o T. cruzi, que é incapaz de
fazer a síntese de novo de purinas (El Kouni, 2003). Além disto, o acúmulo de Ado extracelular
contribui para a imunodeficiência, pois apresenta efeitos tóxicos frente ao desenvolvimento de
linfócitos (Nyhan, 2005; Blackburn & Kellems, 2005). Sabe-se também que a Ado e seu
produto de degradação, a inosina, são reguladores do processo inflamatório e possuem efeitos
imunomodulatórios caracteristicamente relacionados à inibição do processo inflamatório (Jijon
e cols., 2005; Nemeth e cols., 2005).
Outros nucleotídeos extracelulares, como o UDP, por exemplo, parecem exercer efeitos
biológicos importantes. Ele ativa especificamente os receptores do tipo P2Y
6
, que é expresso
em monócitos e particularmente em células T infiltrantes existentes em alguns estados
inflamatórios (Somers e cols., 1998). A ativação destes receptores em células T não é ainda
bem compreendida, porém, foi demonstrado que monócitos podem ser estimulados pelo UDP
extracelular via ligação ao seu receptor e este fato induz produção de IL-8, um quimioatrativo
de monócitos, além disso, foi demonstrado que sua degradação via apirase heteróloga inibe a
produção desta interleucina (Warny e cols., 2001).
27
Adicionalmente, a hidrólise de ATP extracelular pode ser necessária para a resistência
xenobiótica conferida por uma superfamília (ABC) de transportadores de drogas, nos quais são
referidos como transportadores de múltipla resistência a drogas (Kolaczkowski e cols., 1996;
Thomas e cols., 2000). Características como estrutura, topologia de membrana e mecanismo
fisiológico de ação desses transportadores essenciais foram evolutivamente bem preservados,
sendo ubíquos de bactérias a humanos (Schüller e cols., 2007; Sun e cols., 2006; Zimmerli e
cols., 2008; Sarkadi e cols., 2006).
As primeiras descrições para essas “bombas” na membrana plasmática das células que
excluem ativamente vários agentes citotóxicos em células tumorais foram feitas por Dano
(1973) e Juliano & Ling (1976). A estimulação da expressão de bombas e/ou seleção de células
tumorais resistentes resulta num fenômeno de múltipla resistência, se estendendo para vários
substratos desses transportadores (Dano, 1973; Juliano & Ling, 1976). Um grupo de
transportadores estimulados em resposta aos genes de múltipla resistência a drogas (MDR) são
as P-glicoproteínas, proteínas capazes de conferir resistência a drogas em linhagens de células
droga-sensíveis (Kolaczkowski e cols., 1996). Ensaios de competição envolvendo essas P-
glicoproteínas mostraram que as toxinas são preferencialmente removidas das células por esta
classe de transportadores (Sharom e cols., 1993).
As P-glicoproteínas transportam vários compostos heterocíclicos, aromáticos e
componentes nitrogenados (Gros & Hanna, 1996), e são dependentes da energia livre da
hidrólise do ATP (Sharom e cols., 1993). Thomas e colaboradores (2000) mostraram que a
ativação transgênica de uma ecto-ATPase confere resistência às leveduras que não tinham uma
prévia exposição a toxinas. Similarmente, leveduras que são deficientes na atividade ATPase
extracelular são mais sensíveis aos xenobióticos (Thomas e cols., 2000). Dentro deste contexto,
a hidrólise de ATP extracelular pelas fosfatases ou ecto-ATPases de endoparasitos pode ser
necessária também para maior virulência e patogenicidade desses parasitos.
1.9. Papéis fisiológicos das apirases em endoparasitos
As purinas são de importância vital para todos os organismos vivos. Elas são essenciais
para síntese de ácidos nucléicos, proteínas e outros metabólitos bem como para reações que
28
requerem energia. Em vista da elevada taxa metabólica e de replicação, os parasitos requerem
uma ativa síntese de ácidos nucléicos, nos quais necessitam de uma ampla demanda de
nucleotídeos purínicos. Em geral, esses nucleotídeos podem ser sintetizados pela via da
biossíntese de novo e/ou reciclados por uma via alternativa chamada de via de salvação de
nucleotídeos purínicos (El Kouni, 2003). A via de novo utiliza componentes simples para a
síntese de nucleotídeos purínicos. A via de salvação é uma rota de reutilização pela qual a
célula pode satisfazer seus requerimentos purínicos de fontes endógenas e/ou exógenas de
purinas pré-formadas (El Kouni, 2003). De maneira contrária aos seus hospedeiros, todos os
parasitos estudados, com exceção dos nematóides Angiostrongylus cantonensis (Wong & Ko,
1979) e Metastrongylus apri (Wong & Yeung, 1981), bem como dos protozoários
Acanthamoeba polyphaga (Ogbunude & Baer, 1993), Acanthamoeba astronyxis e
Acanthamoeba castellani (Hassan & Coombs, 1986), são incapazes de realizar a biossíntese de
novo e dependem da via de salvação para satisfazer seus requerimentos purínicos (Perrotto e
cols., 1971; Marr e cols., 1978; Boonlayangoor e cols., 1980; Berens e cols., 1981; Gutteridge
& Davies, 1981; Wang & Simashkevich, 1981; Fish e cols., 1982a, 1982b; Schwartzman &
Pfefferkorn, 1982; Miller & Lindstead, 1983; Senft & Crabtree, 1983; Wang & Aldritt, 1983;
Wang e cols., 1983; Dovey e cols., 1984; LaFon & Nelson, 1985). Além disso, em
conseqüência à grande distância filogenética entre o hospedeiro e o parasito, existem distinções
suficientes entre enzimas correspondentes da via de salvação de purinas do hospedeiro e do
parasito que podem ser exploradas para o desenho específico de novas drogas ou “substratos
subversivos” para o sítio catalítico das enzimas do parasito (El Kouni, 2003).
Assim sendo, nós sugerimos a possível participação das ecto-nucleotidases, bem como
da NTPDase-I do T. cruzi, no “turn over” de nucleotídeos, seqüencialmente gerando moléculas
menores e não carregadas para a via de salvação, participando, assim, indiretamente na
captação de purinas do meio extracelular, essencial a este parasito. Além disto, sugerimos o
envolvimento de ecto-nucleotidases, incluindo a NTPDase-I, com mecanismos de virulência
relacionados à hidrólise de ATP
e
e seus metabólitos, visto que as formas tripomastigotas
infectantes apresentam uma razão de hidrólise ATP/ADP maior que as formas epimastigotas
não infectantes (Fietto e cols., 2004). Esta hipótese é corroborada por vários trabalhos recentes
que sugerem uma correlação entre a capacidade de hidrólise de ATP
e
por parasitos
29
intracelulares e processos como virulência, sobrevivência intracelular e adesão celular (Asai e
cols., 1995; Nakaar e cols., 1998; Barros e cols., 2000; Berrêdo-Pinho e cols., 2001; De Jesus e
cols., 2002; Tasca e cols., 2004), e mais recentemente, a modulação do sistema imune do
hospedeiro vertebrado (Maioli e cols., 2004). Apesar destas suposições e evidências somente
para T. gondii foi realmente demonstrado na infecção in vitro a correlação entre a ativação da
hidrólise de ATP e um dado efeito biológico, no caso em questão, a indução da saída do
parasito do vacúolo parasitóforo (Silverman e cols., 1998) e controle da proliferação dentro do
vacúolo, onde a diminuição da expressão de um membro da família E-NTPDase por RNA anti-
senso levou a uma conseqüente e dramática redução dessa proliferação (Nakaar e cols., 1998).
Os papéis fisiológicos das E-NTPDases não são totalmente conhecidos ainda,
entretanto, algumas funções tem sido postuladas, incluindo a participação na imunorregulação,
na adesão celular, sinalização em terminações purinérgicas, secreção e tráfego de vesículas e
ainda reciclagem de purinas (Plesner, 1995; Gordon, 1996, Dombrowski, 1998). Tem sido
proposta uma associação entre uma ecto-NTPDase e uma 5´-ecto-nucleotidase (que converte
AMP em adenosina) na modulação desses processos biológicos, regulando a quantidade dos
nucleotídeos e seus metabólitos no microambiente.
O estudo das E-NTPDases tem avançado muito durante as últimas décadas, mostrando
a presença destas enzimas em várias linhagens de células e organismos, incluindo diferentes
endoparasitos, como, Toxoplasma gondii (Bermudes e cols., 1994; Silverman e cols., 1998;
Nakaar e cols., 1998), Schistosoma mansoni (Vasconcelos e cols., 1993; Vasconcelos e cols.,
1996; Torres e cols., 1998; De Marco e cols., 2003), Leishmania amazonensis (Coimbra e cols.,
2002; Berrêdo-Pinho e cols., 2001), Entamoeba histolytica (Barros e cols., 2000), Trichinella
spiralis (Gounaris, 2002), Trichomonas vaginalis (Matos e cols., 2001) e T. cruzi (Fietto e
cols., 2004).
A primeira E-NTPDase descrita de um endoparasito sangüíneo, patógeno humano, foi a
de Toxoplasma gondii (Asai e cols., 1983). Desde então esta e outras enzimas da mesma
família em diferentes agentes patogênicos têm sido estudadas e associadas a processos
biológicos importantes dentro do contexto das interações parasito-hospedeiro, por exemplo,
aquisição de purinas essenciais ao metabolismo do parasito, adesão e proliferação celular e
30
controle da resposta imune do hospedeiro (Vasconcelos e cols., 1993 e 1996; Torres e cols.,
1998; DeMarco e cols., 2003; Bermudes e cols., 1994; Silverman e cols., 1998; Maioli e cols.,
2004; Coimbra e cols., 2002; Berrêdo-Pinho e cols., 2001; Barros e cols., 2000; Jesus e cols.,
2002; Gounaris, 2002; Matos e cols., 2001; Lemos e cols., 2002; Sansom e cols., 2007). Em
2004, Fietto e colaboradores caracterizaram e imunolocalizaram uma E-NTPDase, denominada
NTPdifosfohidrolase ou NTPDase-I, na superfície das formas infectivas e não infectivas de
parasitos intactos do T. cruzi (cepa Y). Foi demonstrado neste mesmo trabalho que as formas
infectivas (tripomastigotas derivados de cultura celular) apresentaram uma relação de hidrólise
de ATP/ADP maior que as formas não infectivas (epimastigotas), sugerindo então que a
capacidade ecto-ATPásica possa ter um papel importante na infectividade do parasito.
É bem conhecido que os tripanosomatídeos do gênero Trypanosoma são incapazes de
sintetizar purinas de novo e assim, são dependentes de fontes exógenas desse nutriente
essencial (De Koning e cols., 2002). O ATP extracelular e seus produtos de degradação ADP,
AMP e adenosina, são componentes normais do meio extracelular. Esses nucleotídeos não
atravessam a membrana celular, mas suas ações biológicas são mediadas por receptores
específicos da superfície celular onde eles podem ser localmente metabolizados pelas ecto-
nucleotidases (El-Moatassim e cols., 1992; Dombrowski e cols., 1998). Três diferentes
atividades enzimáticas (ecto-ATPase, ecto-ADPase e ecto-5’-nucleotidase) presentes na
superfície do T. cruzi poderiam seqüencialmente defosforilar o ATP em adenosina: ATP →
ADP → AMP → adenosina, disponibilizando esta última para o T. cruzi a partir de
nucleotídeos nos quais, por causa de sua carga, não são permeáveis à membrana plasmática
(Meyer-Fernandes e cols., 2004). De maneira semelhante, Fonseca e colaboradores (2005)
confirmaram a habilidade do Trypanosoma rangeli em hidrolisar o ATP, ADP e AMP, bem
como um decréscimo da atividade ecto-ATPásica Mg
2+
-dependente desse parasito crescido na
presença de Ado, levando-os a especular que esta enzima em T. rangeli poderia realizar um
papel na via de salvação do meio extracelular. Tem sido demonstrado que moléculas lectina-
like estão envolvidas na ligação deste parasito em células da glândula salivar de Rodhinius
prolixus (Basseri e cols., 2002). Sob este ponto de vista, Fonseca e colaboradores (2005)
verificaram o possível efeito de diferentes carboidratos sobre a atividade ecto-ATPásica
presente em T. rangeli. Eles verificaram que diferentes monossacarídeos estimularam esta
31
enzima no mínimo duas vezes mais em relação à atividade enzimática na ausência desses
açúcares (Fonseca e cols., 2005).
Leite e colaboradores (2007) cresceram formas procíclicas de Trypanosoma brucei em
dois meios de cultura para tripanosomatídeos. O meio PFTM é um meio mínimo livre de fontes
purínicas como suplemento nutricional. O outro é um meio completo (SDM-79), suplementado
com todos os constituintes nutricionais básicos para o crescimento desses parasitos. Eles
observaram que os meios SDM-79 e PFTM suplementado com 100 µM de ATP ou 100 µM de
AMP estimularam o crescimento celular, indicando que a hidrólise seqüencial de ATP poderia
disponibilizar Ado ao T. brucei. Adicionalmente, os níveis de atividade ecto-ATPásica do
parasito crescido no meio PFTM suplementado com 100 µM de ATP foi duas vezes menor
quando comparado ao T. brucei crescido no meio PFTM depletado de purinas (Leite e cols.,
2007).
Há muita especulação sobre os papéis fisiológicos das ecto-ATPases e um possível
envolvimento na adesão celular pelo T. cruzi foi proposto (Bisaggio e cols., 2003). Neste
trabalho, utilizando as formas epimastigotas crescidas por 72 h na presença de Suramina, um
atagonista de purinoreceptores P2 e inibidor de algumas ecto-ATPases, eles observaram um
acentuado aumento do processo de interação em relação ao número de epimastigotas aderidos a
macrófagos. O aumento foi de aproximadamente 62% quando a interação foi realizada a 4º C
por 30 minutos e de 375% quando esta foi feita a 37º C por 1 hora (Bisaggio e cols., 2003).
Ainda neste trabalho, eles demonstraram a modulação da atividade ecto-ATPase Mg
2+
-
dependente pela Suramina. A atividade ecto-ATPase dos epimastigotas de 48 h e 72 h de
cultivo foi reduzida significativamente, cerca de 48% e 80%, respectivamente, quando
comparada à atividade de epimastigotas de 24 h de cultivo. Além do mais, as formas
epimastigotas cultivadas em meio LIT contendo 500 µM de Suramina mostraram um aumento
na atividade Mg
2+
ATPase quando comparadas com epimastigotas crescidas na ausência de
Suramina durante o mesmo período de tempo. Porém, a atividade ATPase dos parasitos
crescidos na presença dessa droga também diminuiu com o tempo de cultivo, entretanto, de
maneira menos acentuada quando comparada com as células controle (Bisaggio e cols., 2003).
A interação entre as formas tripomastigotas e macrófagos na presença de ATP também foi
32
analisada. O ATP, em concentrações acima de 100 µM, elevou significativamente o percentual
de macrófagos infectados, mas nenhuma diferença significativa foi observada em relação ao
número de tripomastigotas por macrófago infectado (Bisaggio e cols., 2003).
Recentemente foi demonstrado que formas invasivas de E. histolytica (Barros e cols.,
2000) e promastigotas virulentos de L. amazonensis (Berrêdo-Pinho e cols., 2001) apresentam
uma atividade ecto-ATPase Mg
2+
-dependente mais pronunciada do que formas não invasivas
de E. histolytica (Barros e cols., 2000) ou promastigotas não virulentos de L. amazonensis
(Berrêdo-Pinho e cols., 2001), sugerindo que esta enzima poderia ser considerada um marcador
de patogênese para estes parasitos. Meyer-Fernandes e colaboradores (2004) demonstraram que
estágios infectivos (tripomastigotas e amastigotas) do T. cruzi apresentam uma atividade ecto-
ATPase Mg
2+
-dependente cerca de 20 vezes mais elevada do que epimastigotas não infectivos.
Diversas linhas de evidências têm sugerido um papel para ecto-ATPases na adesão
celular. Silber e colaboradores (2002) verificaram que a galactose exposta na superfície de
eritrócitos humanos realiza um importante papel na interação destas células com o T. cruzi.
Adicionalmente, a atividade ecto-ATPase do T. cruzi foi estimulada de maneira dose-
dependente por este açúcar (Meyer-Fernandes e cols., 2004).
Uma ecto-ATPase também foi descrita e vem sem estudada em Trichomonas foetus
(Jesus e cols., 2002), protozoário parasito do trato urogenital bovino, taxonomicamente
próximo de Trichomonas vaginalis, parasito do trato urogenital humano. Além da
caracterização usualmente utilizada (atividade na presença de inibidores de outras ATPases,
dependência de cátions divalentes, estudos de alguns inibidores, perfil de ativação em
diferentes pHs), este grupo verificou uma alta estimulação da atividade enzimática na presença
de D-galactose, carboidrato conhecidamente exposto na superfície celular e envolvido no
processo de adesão, processo este de vital importância para a infectividade e internalização do
parasito nas células do hospedeiro.
Porém, curiosamente, estudos prévios têm demonstrado que Acanthamoeba se liga a
células epiteliais da córnea humana usando uma proteína conjugada ao carboidrato manose
(Morton e cols., 1991; Yang e cols., 1997). Recentes estudos também caracterizaram as
interações de Acanthamoeba com células endoteliais de cérebro humano (Alsam e cols., 2003).
33
Nesse trabalho foi determinado que Acanthamoeba usa sua proteína manose-ligante para
interagir com as células hospedeiras, ocasionando citotoxicidade celular, sugerindo que esta
glicoproteína esteja envolvida na adesão celular deste patógeno às células hospedeiras (Alsam e
cols., 2003). Sissons e colaboradores (2003) determinaram os efeitos da α-manose exógena
sobre a atividade ecto-ATPase de Acanthamoeba. Isolados pertencentes a genótipos
patogênicos desse parasito exibiram uma atividade ecto-ATPásica significativamente
aumentada na presença desse carboidrato. Em contraste, o isolado não patogênico pertencente
ao genótipo T7 não apresentou diferença de atividade ecto-ATPásica na presença ou ausência
de α-manose. Estes resultados sugerem que a atividade ecto-ATPásica seja estimulada por α-
mannose e que esta atividade ecto-ATPase possa estar associada com a proteína mannose-
ligante (Sisson e cols., 2003).
A apirase do T. gondii é secretada na forma de grânulos densos dentro do vacúolo
parasitóforo formado no interior da célula infectada (Bermudes e cols., 1994), sendo sugerida
sua participação na via de captação de Ado. Asai e colaboradores em 1995 demonstraram a
presença de duas isoformas da enzima em uma cepa virulenta (RH) do parasito. Neste mesmo
trabalho, os genes codificantes destas isoformas foram clonados, mostrando serem diferentes
em apenas 16 dos 628 aminoácidos presentes na seqüência primária descrita. O gene
correspondente à NTPDase-II estava presente em todas as cepas testadas (virulentas e não
virulentas) e o gene da NTDase-I foi encontrado apenas nas cepas virulentas, sendo então
associado como um fator importante no processo de sobrevivência intracelular e virulência do
parasito. Silverman e colaboradores (1998) demonstraram que a ativação dessa enzima por
DTT (ditiol) induzia uma rápida queda dos níveis de ATP celular culminando numa abrupta
saída dos parasitos das células hospedeiras.
Uma atividade ecto-ATPásica dependente de magnésio para sua máxima eficiência,
também foi descrita em Leishmania amazonensis, protozoário agente etiológico da
leishmaniose cutânea difusa na América do Sul (Berrêdo-Pinho e cols., 2001). Foi demonstrado
que a adição de MgCl
2
ao meio extracelular aumentava a atividade ecto-ATPase em células
intactas, de maneira dose-dependente, alcançando a atividade máxima com 5 mM de MgCl
2
(Berrêdo-Pinho e cols., 2001).
34
A composição da superfície celular altera dramaticamente durante o ciclo de vida de
espécies de Leishmania (Naderer e cols., 2004). De acordo com isso, Pinheiro e colaboradores
(2006) analisaram se as atividades ecto-NTPDase eram moduladas durante o crescimento in
vitro de promastigotas de L. amazonensis por um período de 24-96 h, através de mensuração
quantitativa por citometria de fluxo. Seus resultados demonstraram uma acentuada redução
dos níveis de atividade da ecto-NTPDase durante 96 h de crescimento em meio de cultura
associada ao decréscimo da expressão dos níveis dessa enzima na superfície dos parasitos.
Interessantemente, os amastigotas expressaram em sua superfície uma exacerbada atividade
ecto-ATPase em comparação aos promastigotas (Pinheiro e cols., 2006).
A comparação das atividades enzimáticas entre promastigotas virulentos e avirulentos
mostrou que os não virulentos possuem menor eficiência na hidrólise do ATP (Berrêdo-Pinho e
cols., 2001). Mais recentemente, a maior capacidade de hidrólise de ATP e AMP extracelulares
por L. amazonensis foi sugestivamente correlacionada com uma resposta imunológica
“anérgica”, incapaz de controlar a infecção em camundongos, o que implicaria em uma
inibição da resposta inflamatória mediada pelo ATP
e
aliada à estimulação da resposta anti-
inflamatória mediada pela Ado (Maioli e cols., 2004).
Adicionalmente, esta classe de enzimas hidrolíticas poderia providenciar os
requerimentos nutricionais para os amastigotas interiorizados em células hospedeiras. Neste
contexto, o envolvimento de ecto-ATPases na proliferação celular de promastigotas de L.
amazonensis foi estimulado em mais de duas vezes por 5 mM de AMP, ADP ou ATP, e em
mais de 5 vezes por 5 mM de Ado (Berrêdo-Pinho e cols., 2001). Além do mais, a Ado foi
capaz de induzir uma redução no reconhecimento da ecto-ATPase em promastigotas de L.
amazonensis de maneira dose-dependente mediante análise por citometria de fluxo (Pinheiro e
cols., 2006).
Barros e colaboradores em 2000 demonstraram que cepas patogênicas de E. histolytica
possuem maior atividade ecto-ATPásica dependente de Mg
2+
quando comparadas a cepas não
invasivas ou a amebas de vida livre, como a Entamoeba moshkoviskii.
Estes estudos demonstram de uma maneira geral dados que associam a presença
genética, a expressão gênica e/ou atividade enzimática de ecto-nucleotidases de parasitos, com
35
virulência, adesão celular, saída do parasito da célula infectada, controle da concentração de
nucleotídeos das células hospedeiras e do meio extracelular e evasão do sistema de defesa do
hospedeiro.
Dentro deste contexto, nesta dissertação de mestrado procuramos demonstrar que o T.
cruzi também é capaz de modular sinais na resposta do hospedeiro via controle da concentração
extracelular de nucleotídeos e que este fenômeno pode estar relacionado à virulência e
infectividade deste parasito. Assim sendo, este trabalho visou elucidar um pouco mais a
participação de ecto-nucleotidases e especificamente da NTPDase-I do T. cruzi na infectividade
em sistema de cultivo celular, auxiliando na elucidação do seu papel biológico e na avaliação
da possibilidade desta enzima ser utilizada como alvo em estratégia de quimioterapia racional.
36
2. OBJETIVOS
37
2.1. Objetivo geral
Avaliar a participação de ecto-nucleotidases na infectividade do T. cruzi em sistema de
cultivo celular e elucidar o papel da NTPDase-I neste processo.
2.2. Objetivos específicos
Comparar a atividade ecto-nucleotidásica sobre nucleotídeos de adenina dos
tripomastigotas do parasito em diferentes cepas/clone para selecionar uma como modelo
padrão para os demais experimentos;
Avaliar a capacidade ecto-nucleotidásica sobre nucleotídeos de adenina das diferentes
formas evolutivas do parasito durante a infecção experimental in vitro, acompanhando esta
atividade a partir da retirada dos parasitos de camundongos e mantidos em cultivo de células
(VERO) através de sucessivas passagens;
Definir uma cinética da atividade ecto-nucleotidásica sobre nucleotídeos de adenina e
relacioná-la com o comportamento em relação à infectividade in vitro;
Testar a ação de diferentes inibidores específicos das apirases sobre os tripomastigotas
de primeira passagem avaliando o efeito inibitório da hidrólise de ATP e ADP em relação à
infectividade in vitro (células VERO), comparando com o efeito dos inibidores sobre a
NTPase-I recombinante expressa em sistema bacteriano;
Testar a ação do antisoro policlonal anti-NTPDase-I recombinante do T. cruzi frente à
capacidade hidrolítica de nucleotídeos extracelulares em tripomastigotas de primeira passagem
da cepa Y;
38
Avaliar a ação do antisoro policlonal anti-NTPDase-I recombinante do T. cruzi em
relação à infecção de células VERO com tripomastigotas de primeira passagem da cepa Y.
3. ANIMAIS, MATERIAIS E MÉTODOS
39
3.1. Animais
Foram utilizados camundongos Swiss, com 30 dias de idade, machos (para manutenção
do repique e/ou coleta sanguínea via plexo ocular para inóculo em garrafas de cultura de
células VERO) e fêmeas (para os experimentos de curva de parasitemia), pesando
aproximadamente 20g, nascidos e mantidos no Biotério Central da Universidade Federal de
Ouro Preto.
3.2. Populações do T. cruzi
Foram utilizadas as cepas parentais Berenice-62 (Salgado e cols., 1962), proveniente da
paciente Berenice (considerada o primeiro caso clínico humano da Doença de Chagas), a cepa
Y (Silva & Nussenzweig, 1953), a cepa CL (Brener & Chiari, 1963) e um clone proveniente
desta última, o clone CL Brener, gentilmente cedidas pelo grupo da Dr
a.
Maria Terezinha Bahia
do Laboratório de Doença de Chagas da Universidade Federal de Ouro Preto.
3.3. Manutenção das populações do T. cruzi
As amostras do T. cruzi, após serem descongeladas do nitrogênio líquido, foram
crescidas em meio LIT (liver infusion and tryptose) a 28º C, criopreservadas e inoculadas em
camundongos Swiss. A seguir, elas foram mantidas em sucessivas passagens sangüíneas em
camundongos, utilizando-se um inóculo de 50.000 tripomastigotas sangüíneos pela rota
intraperitoneal.
3.4. Curva de parasitemia
Para as curvas de parasitemia as cepas parentais ou clone foram inoculadas por via
intraperitoneal em camundongos Swiss (inóculo de 5.000 tripomastigotas). O exame
parasitológico a fresco dos animais infectados pelo T. cruzi foi determinado diariamente, a
40
partir do 4º dia após o inóculo. O sangue periférico foi coletado pela punção dos vasos
sangüíneos da extremidade distal da cauda de cada animal. A quantificação dos parasitos foi
realizada segundo a técnica descrita por Brener (1962). A parasitemia foi avaliada até a não
constatação, por pelo menos cinco dias consecutivos, de parasitos (tripomastigotas sangüíneos)
no sangue periférico dos animais ou por um período mínimo de 30 dias naqueles animais que
apresentaram baixos níveis de parasitemia de forma intermitente. As curvas representam as
médias diárias dos parasitos observados, pelo exame de sangue a fresco, nos animais de cada
grupo.
3.5. Meio LIT (Liver infusion and tryptose)
Meio de cultura para crescimento axênico (epimastigotas). O soro fetal bovino (SFB)
foi descongelado em banho-maria à 37º C. Posteriormente foi preparada a solução A (glicose
1.0 g, NaCl 2.0 g, KCl 0.2 g, Na
2
PO
4
.12H
2
O 10.8 g, triptose 2.5 g, infuso de fígado 2.5 g) pela
diluição dos sais em 350 mL de água destilada e o pH ajustado para 7,2. Em seguida foi
adicionado 50 mL de SFB, 1.5 mL de hemina e, por último, 0.03 g de streptomicina. Essa
mistura foi filtrada em papel de filtro num balão volumétrico de 500 mL e o volume
completado (água destilada) para 1000 mL. Após a filtração, o meio foi dividido em frascos
estéreis.
3.6. Células VERO
Essa linhagem celular é uma das várias linhagens de células eucarióticas utilizadas para
ensaios experimentais in vitro. As células VERO são células carcinoma-derivadas de rim de
embrião de macaco verde africano (Chlorocebus aethiops) e, para seu cultivo, foi utilizado o
meio de cultura RPMI 1640. A linhagem VERO foi obtida da American Type Culture
Collection e armazenada em tubos de criopreservação no botijão de nitrogênio líquido (-196º
C) do Laboratório de Doença de Chagas da Universidade Federal de Ouro Preto.
A linhagem de células VERO foi mantida continuamente, e para tal, as garrafas de
cultura foram repicadas semanalmente e as células semeadas em nova garrafa de cultura estéril.
41
O meio de cultura foi complementado com soro fetal bovino (SFB) na proporção v/v
para 1 e 5%. A redução (para 1% SFB) do soro no meio para células infectadas é fundamental
para evitar que as células se multipliquem demais (pelo fato de serem células tumorais, estas
perderam sua capacidade de inibição por contato) e iniciem o processo de descolamento ou
formem uma dupla camada impossibilitando a liberação dos tripomastigotas para o meio
extracelular da cultura de tecido.
O meio de cultura foi trocado diariamente a fim de se evitar a acidificação do meio,
com conseqüente rompimento das células hospedeiras e liberação das formas amastigotas
intracelulares para o ambiente externo.
A incubação e manutenção da cultura de células VERO foi realizada em estufa à 37º C,
5% de CO
2
e atmosfera umidificada à 95%.
3.7. Meio de cultura para células VERO – RPMI 1640
O meio de cultura RPMI 1640 foi desenvolvido por Moore (1966) no Roswell Park
Memorial Institute (Moore e cols., 1967; Moore e cols., 1976).
O preparo deste meio de cultura, comercializado em pó (Sigma Cell Culture), foi
realizado a partir da dissolução em 1000 mL de água destilada, o pH acertado para 7.2 e, para
cada 100 mL de meio foram adicionados 1 ou 5 mL de SFB (para o preparo de RPMI 1% SFB
e RPMI 5% SFB, respectivamente), 200 µL de Garamicina (solução estoque de 10 mg/mL), 1
mL de L-Glutamina (solução estoque de 200 mM), 100 µL de 2-β-Mercaptoetanol (solução
estoque de 50 mM) e 2.5 mL de Hepes (4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)
1M. Posteriormente, o meio foi filtrado em membranas éster em celulose com poros de 0.22
µm (Millipore Indústria e Comércio LTDA) e estocados na geladeira à 4º C.
3.8. Cultivo de células VERO
Para a manutenção das células VERO foram utilizadas garrafas de cultura de 25 cm
3
contendo 7 mL de meio de cultura (RPMI) e semeada uma quantidade de 5 x 10
5
células
42
VERO. Os repiques dessas células foram feitos pela remoção do meio de cultura, lavagem da
monocamada de células com 10 mL de solução salina 0.9% (estéril), adição de 5 mL de tripsina
(100 mL de PBS 1X, 0,5g de tripsina e 0.02g de EDTA) e incubação por 2 a 3 minutos em
estufa à 37º C. A reação foi interrompida pela adição de 10 mL de solução salina 0.9% e
posterior homogeneização para ruptura dos grumos celulares. Esta suspensão celular foi
acondicionada num tubo Falcon de 15 mL, centrifugada por 10 minutos à 1100 rpm (5º C), o
sobrenadante descartado e o pellet suspenso em 10 mL de solução salina 0.9%. Uma alíquota
foi retirada para contagem em câmara de Neubauer. As células foram centrifugadas novamente
por 10 minutos a 1100 rpm (5º C), suspensas em meio RPMI 5% SFB e uma quantidade de 1 x
10
6
células foram semeadas em 15 mL de meio de cultura RPMI 5% SFB em garrafas de 75
cm
3
e incubadas em estufa à 37º C, 5% CO
2
e atmosfera umidificada à 95%.
3.9. Infecção de células VERO
Os camundongos infectados com os isolados do T. cruzi foram usados para coleta de
sangue nos respectivos dias do pico de parasitemia de cada um dos isolados. Os animais foram
anestesiados e o sangue coletado assepticamente pelo seio venoso retro-orbital com o auxílio
de pipetas Pasteur previamente esterilizadas contendo o anti-coagulante heparina sódica
(Hipolabor 5.000 U/mL). O sangue (1 mL) foi distribuído nas garrafas de cultura contendo
células VERO previamente crescidas por 48 h à 37º C. As garrafas foram novamente incubadas
à 37º C por 24 h para a internalização dos parasitos. Após esse período, essas garrafas foram
lavadas (3 vezes cada uma) com solução salina 0.9% (estéril) para remoção de células
sangüíneas e de parasitos não internalizados ou daqueles aderidos à superfície celular. Em
seguida foram adicionados 15 mL de meio RPMI 1% SFB e procedida nova incubação em
estufa à 33º C, 5% CO
2
e atmosfera umidificada à 95%, para diferenciação intracelular dos
parasitos até a liberação das formas tripomastigotas, concluindo-se assim uma passagem
celular.
43
3.10. Coleta de tripomastigotas e obtenção de epimastigotas e amastigotas
As formas tripomastigotas foram coletadas no sobrenadante de cultura após o
cumprimento do ciclo de replicação e diferenciação intracelular de cada cepa/clone. Para a cepa
Y, o ciclo intracelular in vitro tem duração de cerca de 5 dias. Para o clone CLB, o ciclo
completa-se em média após 6-8 dias pós-infecção. Já para as cepas CL e Be-62, o ciclo
finaliza-se em 9 dias. Estes parasitos foram então recuperados do meio extracelular pela coleta
do sobrenadante da cultura de células VERO, distribuídos em tubo Falcon de 50 mL e
centrifugados à 1100 rpm por 10 minutos (5º C) para remoção de células hospedeiras e/ou
restos celulares oriundos da ruptura dessas células. O pellet foi descartado e o sobrenadante
estocado noutro tubo Falcon de mesmo volume. Houve novamente mais um processo de
centrifugação, agora à 3500 rpm por 15 minutos à 5º C, para baixar os tripomastigotas. O pellet
obtido foi concentrado para 1 x 10
8
tripomastigotas por mL em tampão de atividade (para os
ensaios de atividade ecto-nucleotidásica, por exemplo).
Para aquisição das formas evolutivas epimastigotas originados a partir dos
tripomastigotas de cultura de células, foi realizado o mesmo procedimento acima, porém, os
tripomastigotas foram suspensos em 3 mL de meio LIT contido num tubo Falcon de 15 mL e
incubados em estufa à 28º C até a completa diferenciação dos parasitos. A cultura foi avaliada a
cada dois dias por exame à fresco em microscópio óptico (objetiva de 40X).
As formas evolutivas amastigotas foram coletadas pela incubação da cultura de células
VERO infectadas com T. cruzi em estufa à 37º C por um período mínimo de 7 dias sem troca
do meio de cultura. Devido ao metabolismo dos parasitos e das células hospedeiras, há uma
escassez de nutrientes bem como acidificação do pH do meio de cultura, induzindo dessa
maneira a diferenciação e liberação das formas arredondadas do parasito. Por último, foram
realizados os mesmos procedimentos de centrifugação realizados para a coleta dos
tripomastigotas. A concentração dos amastigotas também foi ajustada para 1 x 10
8
células/mL.
44
3.11. Obtenção da NTPDase-I recombinante e do antisoro policlonal anti-
NTPDase-I do T. cruzi.
A apirase (NTPDase-I) recombinante do T. cruzi foi expressa em sistema heterólogo
bacteriano pela transferência da seqüência gênica codificadora, sem o peptídeo sinal para
exportação, para o vetor de expressão em Escherichia coli pET21b (Novagen). Este vetor
possui uma seqüência codificadora de 6 histidinas adicionadas na porção carboxi-terminal da
proteína produzida. Estas histidinas, comumente denominadas cauda de hexa-histidina, são
utilizadas para purificação por cromatografia de afinidade em resinas ligadas à níquel ou
cobalto, sendo as proteínas eluídas por competição com imidazol (grupamento R da histidina)
ou por variação da faixa de pH. A NTPDase-I do T. cruzi foi expressa na cepa BL21-DE3 de E.
coli e sua produção foi induzida pela adição de 1 mM de IPTG por 1 hora, à 37ºC e agitação de
200 rpm. A purificação foi feita a partir de resina de níquel-agarose (NTI-agarose, GE-
Amersham). A resina foi diretamente incubada com amostras devidamente recolhidas da
indução, segundo Arêas e colaboradores (2002).
Foram preparados 2 mL de resina com tampão de ligação (50 mM de Tris, 500 mM de
NaCl, 5 mM de imidazol) para equilibrar a coluna. Posteriormente as proteínas foram diluídas
nesse tampão e incubadas em tubos Falcon de 15 mL, à 4º C sob leve agitação por 1 hora. Em
seguida o material foi centrifugado à 3700 rpm, 4º C por 10 minutos e o sobrenadante coletado.
Foram realizadas 2 lavagens com 4 mL por um período de 5 minutos sob agitação seguida de
centrifugação (3700 rpm, 4º C por 10 minutos). Em seguida foram feitas 4 eluições de 500 µL
cada, sob leve agitação.
A proteína recombinante (NTPDase-I), após purificada e dessalinizada, foi utilizada
para imunizar um coelho fêmea. Anterior à imunização foi isolado uma alíquota de sangue (3
mL) retirado pela veia marginal da orelha para obtenção do soro pré-imune (controle negativo).
Para obtenção do soro imune, a proteína recombinante purificada foi inoculada na dose de 0.25
mg em 0.5 mL de tampão de eluição (50 mM de tris, 300 mM de NaCl, 250 mM de imidazol)
juntamente com o adjuvante completo de Freud (Sigma) pela rota intraperitoneal. Após duas
semanas, mais uma dose de 0.5 mg da proteína recombinante foi novamente inoculada com o
45
adjuvante incompleto de Freud (Sigma) semelhantemente ao inóculo anterior. Decorridos mais
15 dias, período suficiente para a completa imunização do coelho, o sangue periférico foi
coletado por punção da veia marginal da orelha. O sangue foi centrifugado à 3000 rpm por 10
minutos em temperatura ambiente e o soro contendo os anticorpos foi distribuído em tubos
eppendorf de 1.5 mL. As alíquotas do soro foram aquecidas à 56º C, em banho-maria, por 30
minutos, para a completa inativação do sistema complemento (SC) do coelho, com a finalidade
de evitar a lise dos parasitos pelo SC quando estes fossem previamente incubados com os soros
pré-imune e imune. Após a inativação do soro, este foi estocado no freezer à -20ºC.
Tanto o soro (contendo os anticorpos policlonais anti-NTPDase-I do T. cruzi) quanto a
proteína recombinante, foram obtidos durante o trabalho de iniciação científica do aluno
Matheus Silva e Bastos no Laboratório de Biologia Celular e Molecular da Universidade
Federal de Ouro Preto.
3.12. Purificação de anticorpo (IgG) do antisoro imune
A técnica realizada foi a de precipitação com solução de sulfato de amônio saturada
(SAS), metodologia adotada pelos pesquisadores do Laboratório de Imunoparasitologia da
Universidade Federal de Ouro Preto.
A solução de sulfato de amônio saturada (767 g/L) foi preparada pelo aquecimento da
solução (50º C) e balanço do pH para 7.2 com hidróxido de amônio.
Para a purificação de IgG, o soro foi diluído 1:2 em PBS em banho de gelo. Foi
adicionada a SAS em volume suficiente para 45% ppt, gota a gota, sob agitação por 30 minutos
à 4º C. Após esse período, a mistura foi centrifugada por 15 minutos à 1000 g por 4º C. O pellet
lavado (SAS 45% em PBS) no volume original do soro diluído foi novamente centrifugado por
15 minutos à 4º C e suspenso no volume original de PBS. Esse pellet foi centrifugado à 5000 g,
15 minutos à 4º C, para remoção de todo o material insolúvel, e coletado o sobrenadante. Este
foi precipitado com SAS em volume suficiente para 40% ppt, gota a gota, sob agitação por 30
minutos à 4º C. Após esse período, a mistura foi centrifugada por 15 minutos à 1000 g por 4º
C. O pellet lavado (SAS 40% em PBS) no volume original do soro diluído foi novamente
46
centrifugado por 15 minutos à 4º C e suspenso no volume original de PBS. Essa amostra foi
dialisada contra 3L de PBS à 4º C, centrifugada à 5000 g, 15 minutos à 4º C, para remoção de
todo material insolúvel, e o sobrenadante coletado. Por último, foi retirada uma alíquota para
eletroforese em gel de poliacrilamida 8% e o restante foi estocado no freezer à -20º C.
3.13. Ensaios de atividade ecto-nucleotidásica
Os parasitos intactos ou a proteína recombinante (NTPDase-I) do T. cruzi foram
incubados por 1 h em banho-maria à 37º C numa mistura de reação (volume de 125 µL)
contendo 116 mM de NaCl, 5.4 mM de KCl, 5.6 mM de D-glicose, tampão Hepes-Tris 50 mM,
pH 7.2, 5 mM de MgCl
2
, 2.5 mM de nucleotídeo (ATP, ADP, AMP) como substrato e 2.5 x
10
6
parasitos (Berrêdo-Pinho e cols., 2001). Para os ensaios na presença de inibidores
específicos de apirases ou antisoro policlonal anti-NTPDase-I do T. cruzi, estes foram mantidos
por todo o experimento. As atividades ecto-nucleotidásicas foram determinadas pela
mensuração de fosfato inorgânico (P
i
) liberado pela hidrólise dos nucleotídeos usados como
substrato, segundo Taussky & Shorr (1953). Em geral, foram realizados três experimentos
independentes, cada um em triplicata. A reação foi iniciada pela adição de nucleotídeos e
interrompida pela adição de 125 µL de ácido tricloacético 10% (TCA 10%). Os tubos
eppendorfs foram centrifugados à 13.500 rpm por 10 minutos à 4º C. Alíquotas de 100 µL do
sobrenadante contendo P
i
liberado foram transferidas para poços de placas de 96 poços de
fundo reto. Em cada poço foi adicionado 100 µL de uma mistura de reagente colorimétrico (90
µL de molibidato de amônio 0.5% em HCl 0.8 M + 10 µL de reagente de cor: ANSA [0.25
mg/mL], N
2
SO
3
[5 mg/mL] e Na
2
S
2
O
5
[750 mg/mL]). As placas foram incubadas por 30
minutos, temperatura ambiente, e posteriormente foi realizada a leitura da absorbância no
aparelho Emax Precision Microplate Reader (Molecular Devices), no comprimento de onda de
650 nm, utilizando o software SOFTmax Pro 4.0.
47
3.14. Ensaios de infectividade celular
As células VERO, células embrionárias de rim de macaco carcinoma-derivadas, foram
obtidas como descrito anteriormente. Os ensaios de infectividade foram realizados como
detalhado, segundo modificação do protocolo de Yoshida e colaboradores (1989). As células
VERO foram pré-tratadas com tripsina (5 mg/mL por 3 minutos à 37º C) e 10
5
células foram
semeadas em cada poço de uma placa de 24 poços contendo lamínulas redondas de vidros,
estéreis, de 13 mm de diâmetro. Após incubação overnight à 37º C, as células foram infectadas
com 5 x 10
5
tripomastigotas de cultura de células de primeira passagem (P1) previamente
incubados em temperatura ambiente por 10 minutos em meio RPMI 1640 (5% SFB) com ou
sem inibidores específicos de apirases e com antisoro policlonal anti-NTPDase-I do T. cruzi.
Após prévia incubação, os parasitos foram centrifugados (3500 rpm por 15 minutos à 5º C),
suspensos em RPMI 1640 (5% SFB) e colocados em contato com a monocamada de células
VERO. Posterior à incubação de 24 h à 37º C, as lamínulas em triplicata foram lavadas três
vezes com solução salina 0.9%, estéril e gelada, adicionado a elas 1.5 mL de meio RPMI (1%
SFB) e incubadas por 24 h à 33º C. Por último, essas lamínulas foram fixadas e coradas pelo
método do Giemsa a lento. A razão de infecção foi calculada pela contagem do número de
células infectadas e do número de parasitos por célula infectada num total de no mínimo 300
células. As imagens visualizadas pela objetiva de 40X foram digitalizadas através da
microcâmera Leica DM 5000 B (Leica Application Suite, versão 2.4.0R1). Cada lâmina
fotografada foi analisada manualmente. Cada experimento foi realizado independentemente
com amostras de P1 de tripomastigotas derivados de diversas coletas sanguíneas. Para cada
lâmina digitalizada, foram fotografados e quantificados 3 campos selecionados aleatoriamente.
3.15. Coloração pelo método do Giemsa
Inicialmente as lamínulas foram fixadas em solução de Bouin (10 mL de formol [40%],
2 mL de ácido acético e 30 mL de solução saturada de ácido pícrico) por 15 minutos. Em
seguida elas foram lavadas em água destilada até o desaparecimento da cor amarelada do
fixador e imersas na solução de Giemsa (1 mL de Giemsa [Merck], 1mL de álcool metílico, 0.1
48
mL de Na
2
CO
3
0.5%, 40 mL de água destilada) por 18 horas. No dia seguinte as lamínulas
foram lavadas em água destilada, passadas rapidamente em álcool 70%, tratadas em mistura de
acetona-xilol e clarificadas, por último, em xilol.
3.16. Análise estatística dos dados
Todos os experimentos foram realizados em triplicata, com resultados similares obtidos
em ao menos três experimentos separados. Os dados foram analisados estatisticamente pelo
Teste T de Student. Os valores de P iguais ou menores que 0.05 foram considerados
significativos. Os dados foram expressos como médias ± os desvios padrões.
49
4. RESULTADOS
50
4.1. Caracterização biológica através da análise da parasitemia de diferentes
isolados do T. cruzi.
As curvas de parasitemia média obtidas em camundongos Swiss inoculados com as
cepas parentais Be-62, CL, Y e o clone CL Brener do T. cruzi estão apresentadas na figura 5.
Esses dados de parasitemia foram avaliados diariamente a partir do 4º dia de infecção e estão
expressos pela média do número de tripomastigotas/0.1 mL de sangue dos animais de cada
grupo. A taxa de infectividade observada nos grupos de animais infectados com cada uma das
respectivas cepas/clone foi de 100% (6/6). O período pré-patente (PPP) observado nos grupos
de animais infectados com a cepa Be-62, CL, Y e clone CLB foi de 4, 6, 4 e 7 dias,
respectivamente. O período patente (PP), correspondente aos dias em que os parasitos foram
detectados no sangue periférico dos animais, foi de 11 dias para os isolados Be-62, CL e Y, e
de 28 dias para o clone CLB. O PP nos animais inoculados com as cepas parentais Be-62, CL e
Y foi interrompido pela morte de todos os animais. Os animais infectados com a cepa Be-62
morreram (6/6) entre os dias 6 e 14 após a infecção. Os animais infectados com a cepa CL
morreram (6/6) entre os dias 16 e 18 após a infecção. Os animais infectados com a cepa Y
morreram (6/6) entre os dias 9 e 15 após a infecção.
Foi observado um pico de parasitemia, com uma média de 2.2 x 10
6
tripomastigotas/0.1
mL de sangue, no 7º dia pós-infecção no grupo de animais inoculados com a cepa Be-62. Os
animais inoculados com a cepa Y apresentaram um pico máximo de parasitemia de 2.32 x 10
6
tripomastigotas/0.1 mL de sangue ocorrido no 8º dia do curso da infecção. O grupo de animais
inoculados com o isolado CL apresentou um pico médio de parasitemia de 2.75 x 10
6
tripomastigotas/0.1 mL de sangue ocorrido no 16º dia pós-infecção. Nos animais inoculados
com o clone CLB houve um pico máximo de parasitemia muito baixo, quase não detectável,
com valor médio de 1.35 x 10
5
tripomastigotas/0.1 mL de sangue, ocorrido no 26º dia do curso
de infecção, não ocasionando a morte de nenhum do animais (0/6) durante os 60 dias de
observação. Estes dados estão resumidos na tabela 3.
51
Curva de Parasitemia
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
0 5 10 15 20 25 30
Dias após o inóculo
Nº de tripomastigotas x 10
3
/0,1 mL de sangue
Cepa CL
Clone CLB
Cepa Be-62
Cepa Y
Figura 5. Curva de parasitemia em camundongos Swiss inoculados por via intraperitoneal com 5,0 x 10
3
tripomastigotas sangüíneos, provenientes das cepas parentais Be-62, CL, Y e do clone CL Brener do T. cruzi.
Pico de parasitemia
Cepas/clone
do T. cruzi
PPP (dias) PP (dias)
Morte
(%)
Sobrev.
(%)
Dia
Tripomast./
0,1 mL de
sangue
Y
4 11 100 0 8º 2.32 x 10
6
Be-62
4 11 100 0 7º 2.2 x 10
6
CL
6 11 100 0 16º 2.75 x 10
6
CLB
7 28 0 100 26º 1.35 x 10
5
Tabela 3. Resumo das características biológicas dos diferentes isolados do T. cruzi versus cada um dos parâmetros
analisados: PP, PPP, morte, sobrevivência e pico de parasitemia.
52
4.2. Caracterização da atividade ecto-nucleotidásica em diferentes isolados
do T. cruzi
Podemos ver na figura 6 a comparação da atividade ecto-nucleotidásica da forma
evolutiva tripomastigota infectiva das cepas Be-62, CL e Y e do clone CLB recuperadas após a
primeira passagem em células VERO. Todos os isolados apresentaram uma maior atividade
ecto-ATPásica, onde, a ordem decrescente dessa atividade foi Y > CL > CLB > Be-62,
imediatamente seguida pela hidrólise de ADP, e somente o clone CLB apresentou hidrólise de
AMP detectável. Os resultados são expressos como médias de três experimentos realizados
independentemente, cada um deles utilizando triplicata nos ensaios.
A hidrólise de ATP
e
foi significativamente maior nas formas infectivas das diferentes
cepas testadas, quando comparadas à hidrólise de nucleotídeos pelas formas epimastigotas
extracelulares ou amastigotas intracelulares replicativas (dados não mostrados).
Podemos notar que a relação de hidrólise de ATP
e
/ADP
e
dos tripomastigotas (Tabela 4)
e que a hidrólise de AMP (Figura 6) foram muito diferenciadas nas cepas estudadas, o que
pode estar relacionado, por exemplo, com diferenças de comportamento biológico, como
capacidade diferenciada de modular a resposta imune.
53
Figura 6. Comparação da atividade ecto-nucleotidásica dos tripomastigotas de diferentes cepas/clone do T. cruzi
obtidos após uma passagem em cultivo celular (VERO) in vitro. Os dados representam a média ± os desvios
padrões de três experimentos realizados independentes, cada um, em triplicata.
CEPAS/CLONE Razão de hidrólise ATPe/ADPe
CL 3.98
CLB 2.86
Be-62 2.14
Y 17.56
Tabela 4. Comparação da relação de hidrólise ATPase/ADPase das formas tripomastigotas infectivas das
diferentes cepas/clone do T. cruzi.
54
4.3. Avaliação da capacidade ecto-nucleotidásica das diferentes formas
evolutivas do parasito durante a infecção experimental in vitro.
Nesta fase do projeto idealizamos acompanhar a atividade ecto-nucleotidásica
utilizando ATP, ADP e AMP como substrato em parasitos vivos (células intactas) da cepa Y
mantidos em cultura de células VERO e recuperados após cada ciclo completo (de cerca de 5
dias). Devido à cepa Y ser policlonal (Silva & Nussenzweig, 1953) podemos observar que a
liberação de parasitos que completaram o ciclo intracelular ocorre geralmente no 5º e 6º dias de
cultivo, o que sugere que em cada saída possamos ter grupos distintos de parasitos.
Deste modo, as formas tripomastigotas foram coletadas no sobrenadante da cultura na
primeira e segunda saída de cada passagem celular e utilizadas para dosagem direta da
atividade ecto-nucleotidásica. Estes mesmos parasitos foram utilizados para obtenção das
formas epimastigotas, por diferenciação em meio LIT, e das formas amastigotas, através da
incubação dos tripomastigotas (estufa à 37º C com 5% de CO
2
) em cultura de células VERO
sem troca de meio de cultura, onde, neste caso, o esgotamento de nutrientes e a acidificação do
meio induziram a diferenciação.
Observamos que só foi possível obtermos parasitos em quantidade suficiente para as
dosagens enzimáticas e nova infecção até a 4ª passagem, sendo que nesta última o número de
parasitos que completaram o ciclo replicativo (3ª para 4ª passagem) foi insuficiente para
prosseguirmos a infecção in vitro.
Podemos ver na figura 7 a comparação das atividades ecto-nucleotidásicas das
diferentes formas morfológicas do T. cruzi (cepa Y) recuperadas após a primeira e terceira
passagens em células VERO. As formas tripomastigotas apresentaram as maiores atividades
ecto-ATPásica e uma tendência à diminuição da relação de hidrólise ATP/ADP (P = 0.01) com
o aumento do número de passagens celulares, onde a hidrólise de ADP foi aumentada (painel
A). Nenhuma hidrólise de AMP foi detectada diretamente. É válido salientar que os parasitos
permaneceram viáveis durante todas as mensurações, demonstrando que as enzimas avaliadas
estavam presentes na superfície dos mesmos ou secretadas no microambiente.
55
As formas epimastigotas (painel B), derivadas dos tripomastigotas das passagens 1 e 3,
apresentaram um perfil de hidrólise de nucleotídeos extracelulares bem diferenciado das
formas infectivas (tripomastigotas) e intracelulares (amastigotas). Podemos visualizar que a
hidrólise de ATP foi menor que a dos tripomastigotas e maior quando comparadas ao perfil de
hidrólise dos amastigotas. A hidrólise de ADP novamente aumentou com o aumento do número
de passagens, refletindo mais uma vez uma diminuição na relação ATPase/ADPase. Alem
disto, detectamos uma alta hidrólise de AMP não observável tanto nos tripomastigotas quanto
nos amastigotas.
As formas amastigotas apresentaram baixa atividade ecto-nucleotidásica para o ATP e o
ADP e nenhuma atividade detectável sobre AMP (painel C).
56
Figura 7. Atividade ecto-nucleotidásica em parasitos (intactos) da cepa Y do T. cruzi submetidos ao cultivo em células VERO. (A)
Tripomastigotas isolados diretamente do sobrenadante da cultura após o 5º e 6º dias de cultivo (P1-1 e P1-2, respectivamente); (B)
Epimastigotas obtidos pelo cultivo em meio LIT dos tripomastigotas derivados da 1ª e 3ª passagens (do primeiro dia de coleta); (C)
Amastigotas obtidos a partir dos tripomastigotas em meio celular após esgotamento de nutrientes (derivados dos parasitos de primeira coleta).
*
*
57
Os dados representam os resultados das médias ± os desvios padrões de ensaios realizados em triplicata de um experimento contínuo. (*)
representa P < 0.05 entre a relação ATPase/ADPase de P1 e P3.
58
Na terceira passagem celular observamos que após o tempo estabelecido para a infecção
(24 h), a maioria dos parasitos (cerca de 80%) adicionados à monocamada de células VERO
não conseguiram penetrar e se diferenciaram para formas arredondadas semelhantes às
amastigotas (amastigota-like). Na figura 8 podemos observar, em A e B, através de fotografias
obtidas diretamente do microscópio invertido, a cultura de células VERO (3ª passagem) após
24 horas de infecção, onde a maioria dos parasitos do tipo amastigota-like encontram-se no
sobrenadante de cultura. Estes parasitos foram recolhidos do sobrenadante do cultivo celular e
utilizados em ensaio de atividade ecto-nucleotidásica.
Os parasitos que conseguiram internalizar nas células hospedeiras (aproximadamente
20% do total inicial), levando a uma infecção produtiva pelo cumprimento do ciclo intracelular
(P4), foram recuperados no sobrenadante de cultura após 5 dias de nova incubação. Na figura 9
observamos a comparação da atividade ecto-nucleotidásica dos parasitos que foram capazes de
completar a passagem celular em questão (tripomastigotas de 4ª passagem) e daqueles que
ficaram retidos do lado externo às células (amastigota-like). Esses amastigotas-like
apresentaram um perfil de hidrólise semelhante ao dos amastigotas derivados de P1 mostrados
na figura 7 (painel C). Novamente notamos que a relação ecto-ATPase/ecto-ADPase decresceu
significativamente devido à diminuição, neste caso, da hidrólise de ATP.
59
AA
BB
Figura 8. Análise visual dos parasitos da 3ª para 4ª passagem celular. Em A podemos ver uma fotografia direta da cultura de células VERO
infectada pelo T. cruzi (cepa Y) após 24 h de infecção, mostrando a maioria dos parasitos com forma arredondada no meio extracelular
(sobrenadante); Em B temos a seção marcada em A aumentada de tamanho para melhor visualização das formas arredondadas. As setas pretas
indicam os poucos tripomastigotas que não penetraram ou não se diferenciaram para a forma amastigota-like (evidenciados pelas setas
brancas).
60
Figura 9. Avaliação da atividade ecto-nucleotidásica dos parasitos da 3ª para 4ª passagem celular. Podemos observar a atividade ecto-
nucleotidásica dos tripomastigotas que foram capazes de concluir a 4ª passagem celular e a atividade daqueles que não conseguiram
internalizar, se diferenciando, portanto, nas formas arredondadas (amastigota-like) evidenciadas na figura 8 (painéis A e B).
61
4.4. Análise da capacidade de inibição das atividades ATPase e ADPase dos
tripomastigotas do T. cruzi (cepa Y) de 1ª passagem celular (VERO) por
inibidores específicos de apirases (ARL 67156, Suramina e GdCl
3
).
Inicialmente testamos a capacidade de inibição das atividades ATPásica e ADPásica
nos parasitos vivos usando diferentes concentrações dos compostos. Podemos ver na figura 10
que a atividade ATPase (painel A) foi mais inibida pela Suramina, atingindo cerca de 75% de
inibição em concentração próxima a 100 µM. Já os compostos ARL 67156 e GdCl
3
(cloreto de
gadolínio) inibiram aproximadamente 35% desta atividade em concentração de 300 e 500 µM,
respectivamente. Para o bloqueio da atividade ADPase (painel B) vemos uma ação mais efetiva
dos inibidores ARL 67156 e GdCl
3
, atingindo aproximadamente 55 a 60% de inibição em 300
e 500 µM, respectivamente. A Suramina foi capaz de inibir cerca de 55% da atividade sobre o
ADP na concentração de 100 µM. Curiosamente, a adição de 1 mM de Suramina gerou um
efeito não inibitório em relação à hidrólise de ADP (Figura 10, painel B). Além disto, não foi
possível o uso do GdCl
3
em concentração de 1 mM pois os parasitos foram mortos pela droga
nesta situação.
62
Figura 10. Efeito de inibidores de apirases na hidrólise de ATP e ADP em tripomastigotas vivos da cepa Y do T. cruzi recuperados após uma
passagem celular em cultura de células VERO. (A) Podemos ver o efeito de diferentes concentrações dos inibidores sobre a hidrólise de ATP;
(B) Efeito desses sobre o ADP. Todos os experimentos foram realizados após pré-incubação dos parasitos com os inibidores por 15 min. em
temperatura ambiente. Os inibidores foram mantidos nas concentrações indicadas durante todo o experimento. Os dados refletem a média ± os
desvios padrões de três experimentos independentes realizados em triplicata.
63
4.5. Análise da capacidade de inibição das atividades ATPase e ADPase por
inibidores específicos de apirases (ARL 67156, Suramina e GdCl
3
)
na
proteína purificada NTPDase-I recombinante do T. cruzi.
O mesmo ensaio de inibidores foi feito sobre a proteína recombinante purificada
(NTPDase-I do T. cruzi). As concentrações foram definidas com base nos melhores resultados
obtidos na inibição da atividade ATPase e ADPase dos tripomastigotas vivos (cepa Y). Para o
inibidor Suramina, a concentração utilizada foi a de 100 µM. Para os outros dois inibidores,
ARL 67156 e GdCl
3
, utilizamos a concentração de 300 µM. Podemos ver na figura 11 que sob
essas concentrações o efeito dos inibidores foi bem similar ao observado nos parasitos vivos,
especialmente para o tratamento com Suramina (figura 10). Para evidenciar este dado, a tabela
5 apresenta uma comparação entre o bloqueio da atividade ecto-nucleotidásica nos parasitos
intactos de primeira passagem (tripomastigota) e na proteína recombinante purificada
(NTPDase-I). Uma diferença significativa pôde ser detectada para o efeito do ARL67156 (0.3
mM) que foi bem mais pronunciado nos parasitos vivos do que na proteína purificada.
64
Figura 11. Efeito de inibidores de apirases sobre a NTPDase-I recombinante do T. cruzi purificada. A proteína recombinante purificada foi
pré-incubada com diferentes inibidores de apirases por 15 minutos à 4º C e posteriormente utilizada para ensaio da atividade de hidrólise de
ATP e ADP. Os inibidores foram mantidos nas concentrações especificadas durante todo o experimento. Os dados refletem a média ± os
desvios padrões de três experimentos independentes realizados em triplicata.
% Inibição ATPase
Inibidor
Tripomastigota NTPDase-I rec
Suramina 0.1 mM
75 ± 1.06 53 ± 0.43
ARL 67156 0.3 mM
32 ± 0.17 10 ± 0.59
GdCl
3
0.3 mM
30 ± 0.29 15 ± 0.23
% Inibição ADPase
Inibidor
Tripomastigota NTPDase-I rec
Suramina 0.1 mM
55 ± 0.53 65 ± 0.21
ARL 67156 0.3 mM
55 ± 0.25 5 ± 0.47
GdCl
3
0.3 mM
60 ± 0.72 30 ± 0.59
Tabela 5. Comparação entre o bloqueio da atividade ecto-nucleotidásica nos parasitos vivos (tripomastigotas de P1) e na proteína
recombinante purificada (NTPDase-I) do T. cruzi.
65
4.6. Análise da capacidade de inibição das atividades ATPase e ADPase dos
tripomastigotas do T. cruzi (cepa Y) de 1ª passagem celular (VERO)
utilizando o antisoro-policlonal anti-NTPDase-I.
Também testamos a capacidade de inibição das atividades ATPásica e ADPásica nos
parasitos vivos usando diferentes diluições (1:10; 1:50; 1:100) do antisoro anti-NTPDase-I do
T. cruzi purificado. No caso do antisoro bruto, foi detectada uma quantidade “contaminante” de
Pi que inviabilizou a dosagem enzimática. Por isso foi realizada a purificação de IgG como
descrito em materiais e métodos e a preparação resultante foi usada nos ensaios de inibição.
Podemos ver na figura 12 que a atividade ATPase não foi inibida de maneira
signifivativa. Nas diluições de 1:10 e 1:50 do antisoro, a atividade ecto-ATPásica foi reduzida
em apenas 2.39% (P = 0.08) e 2.82% (P = 0.08), respectivamente. Na diluição de 1:100 o
antisoro não mostrou nenhum efeito sobre esta atividade. Para o bloqueio da atividade ADPase
vemos uma ação mais efetiva do antisoro purificado. Ele foi capaz de inibir cerca de 8.5% (P =
0.03), 5.4% (P = 0.01) e 15.8% (P = 0.01) da atividade sobre o ADP nas diluições de 1:10,
1:50 e 1:100, respectivamente.
66
Figura 12. Efeito do antisoro-policlonal anti-NTPDase-I recombinante do T. cruzi em diferentes diluições sobre a hidrólise de ATP e ADP em
tripomastigotas vivos (cepa Y) recuperados após uma passagem celular em cultura de células VERO. Todos os experimentos foram realizados
após pré-incubação dos parasitos com o antisoro policlonal por 15 minutos em temperatura ambiente, sendo mantidos nas diluições
especificadas durante todo o ensaio. Os dados refletem a média ± os desvios padrões de três experimentos independentes realizados em
triplicata. Os desvios padrões foram menores que 1,5% dos valores apresentados. (*) indica P < 0.05 para o bloqueio da atividade sobre o
ADP.
*
*
*
67
4.7. Análise da infectividade dos tripomastigotas do T. cruzi (cepa Y) de 1ª
passagem celular (VERO) pré-tratados com inibidores específicos de
apirases, antisoro policlonal anti-NTPDase-I e soro pré-imune.
Podemos observar que ambos inibidores mostraram-se muito eficientes em bloquear a
internalização dos tripomastigotas (tabela 6), atingindo valores inibitórios próximos a 78%,
65% e 36% para Suramina, Gadolínio e ARL67156, respectivamente. As concentrações nas
quais cada inibidor teve sua máxima atividade inibitória foram de 0.1 mM, 0.3 mM e 0.3 mM
para Suramina, Gadolínio e ARL67156, respectivamente, resultados estes similares aos
observados para estes inibidores, nestas mesmas concentrações, quando comparados ao
bloqueio da atividade catalítica (Figura 10 e tabela 6).
Interessantemente, notamos que em concentrações mais elevadas, independente do
inibidor utilizado, estes se tornam menos efetivos em bloquear a infecção (tabela 6 e figura 13,
painéis A, B e C).
Ao utilizarmos o antisoro anti-NTPDase-I de T. cruzi não purificado, porém tratado por
30 min à 56º C para inativação do sistema complemento, para inibir a infecção em células
VERO, podemos observar que o efeito foi bastante pronunciado, chegando a atingir cerca de
50% nas diluições 1:50 e 1:100 (Tabela 7 e figura 13, painel D). Novamente, sob alta
concentração, em diluição de 1:10, o efeito inibidor não foi tão pronunciado, resultado similar
ao observado para os inibidores.
O efeito inibitório é específico para o antisoro imune, o que pôde ser comprovado pela
não constatação da redução de infectividade após o tratamento desses tripomastigotas com o
soro pré-imune (Tabela 7 e figura 13, painel E).
68
Inibidor Experimento Concentração
(mM)
Parasitos/céls.
Infectadas
Céls. Infect./300
céls.
Inibição (%)
1 0.1 2.992 ± 0.681 17.46 ± 4.002 44.62 ± 1.33
2 0.3 3.418 ± 0.226 36.72 ± 8.715 65.40 ± 2.90
GdCl
3
3 0.5 4.349 ± 0.793 21.25 ± 1.693 29.71 ± 0.56
1 0.1 3.243 ± 0.239 13.18 ± 2.736 77.96 ± 0.85
2 0.3 4.354 ± 0.947 12.89 ± 2.917 56.77 ± 0.97
3 0.5 4.693 ± 0.746 67.93 ± 4.763 27.44 ± 1.58
Suramina
4 1.0 2.976 ± 0.408 68.54 ± 7.071 26.78 ± 2.35
1 0.1 2.934 ± 0.605 32.87 ± 3.580 19.10 ± 1.19
2 0.3 2.346 ± 0.385 17.54 ± 3.521 36.37 ± 1.17
3 0.5 2.493 ± 0.484 27.55 ± 5.717 5.32 ± 1.91
ARL 67156
4 1.0 2.846 ± 0.299 65.46 ± 9.238 1.15 ± 0.36
Tabela 6. Efeito de inibidores específicos de apirases sobre a invasão de células VERO pelos tripomastigotas de cultura (P1) do T. cruzi. Os
valores representam as médias ± os desvios padrões dos experimentos realizados em triplicata. Cada experimento foi realizado independente e
a análise de cada grupo reflete a comparação com seu respectivo controle.
Inibidor Experimento
Diluição Parasitos/céls.
Infectadas
Céls. Infect./300
céls.
Inibição (%)
1 1:10 2.570 ± 0.258 26.47 ± 6.599 39.96 ± 2.19
2 1:50 2.040 ± 0.501 8.83 ± 1.749 53.25 ± 0.58
Ac policlonal
anti-NTPDase-I
3 1:100 2.203 ± 0.133 8.96 ± 1.156 47.84 ± 0.38
1 1:10 4.969 ± 0.826 104.63 ± 13.047
0
2 1:50 6.406 ± 1.301 135.68 ± 17.111
0
Soro pré-imune
3 1:100 5.338 ± 0.764 122.45 ± 11.506
0
Tabela 7. Efeito dos anticorpos policlonais anti-NTPDase-I e do soro pré-imune sobre a invasão de células VERO pelos tripomastigotas de
cultura (P1) do T. cruzi. Os valores representam as médias ± os desvios padrões dos experimentos realizados em triplicata. Cada experimento
foi realizado independente e a análise de cada grupo reflete a comparação com seu respectivo controle.
69
Figura 13. Análise da infectividade dos tripomastigotas do T. cruzi (cepa Y) de 1ª passagem celular (VERO) após
48 h de infecção. As células VERO (5 x 10
4
/mL de meio RPMI 5% SFB) foram infectadas com 5 x 10
5
(-) (+)
0,1 mM
0.3 mM
0.5 mM
1.0 mM
Suramina
70
tripomastigotas (P1) da cepa Y do T. cruzi. A infecção das células foi determinada pela contagem do número de
células infectadas e do número de parasitos por célula infectada. Foram analisadas no mínimo 300 células coradas
pelo Giemsa a lento. (A) Tripomastigotas previamente tratados com a Suramina por 10 minutos em temperatura
ambiente. (-) controle positivo (tripomastigotas não tratados). (+) tripomastigotas previamente tratados com o
inibidor.
71
Figura 13. Análise da infectividade dos tripomastigotas do T. cruzi (cepa Y) de 1ª passagem celular (VERO) após
48 h de infecção. As células VERO (5 x 10
4
/mL de meio RPMI 5% SFB) foram infectadas com 5 x 10
5
tripomastigotas (P1) da cepa Y do T. cruzi. A infecção das células foi determinada pela contagem do número de
0.1 mM
(-)
(+)
0.3 mM
1.0 mM
0.5 mM
ARL 67156
72
células infectadas e do número de parasitos por célula infectada. Foram analisadas no mínimo 300 células coradas
pelo Giemsa a lento. (B) Tripomastigotas previamente tratados com o ARL67156 por 10 minutos em temperatura
ambiente. (-) controle positivo (tripomastigotas não tratados). (+) tripomastigotas previamente tratados com o
inibidor.
73
Figura 13. Análise da infectividade dos tripomastigotas do T. cruzi (cepa Y) de 1ª passagem celular (VERO) após
48 h de infecção. As células VERO (5 x 10
4
/mL de meio RPMI 5% SFB) foram infectadas com 5 x 10
5
tripomastigotas (P1) da cepa Y do T. cruzi. A infecção das células foi determinada pela contagem do número de
células infectadas e do número de parasitos por célula infectada. Foram analisadas no mínimo 300 células coradas
pelo Giemsa a lento. (C) Tripomastigotas previamente tratados com o GdCl
3
por 10 minutos em temperatura
ambiente. (-) controle positivo (tripomastigotas não tratados). (+) tripomastigotas previamente tratados com o
inibidor.
0.1 mM
(
-
)
(+)
0.3 mM
0.5 mM
GdCl
3
74
Figura 13. Análise da infectividade dos tripomastigotas do T. cruzi (cepa Y) de 1ª passagem celular (VERO) após
48 h de infecção. As células VERO (5 x 10
4
/mL de meio RPMI 5% SFB) foram infectadas com 5 x 10
5
tripomastigotas (P1) da cepa Y do T. cruzi. A infecção das células foi determinada pela contagem do número de
células infectadas e do número de parasitos por célula infectada. Foram analisadas no mínimo 300 células coradas
pelo Giemsa a lento. (D) Tripomastigotas previamente tratados com o antisoro anti-rNTPDase-I do T. cruzi por
10 minutos em temperatura ambiente. (-) controle positivo (tripomastigotas não tratados). (+) tripomastigotas
previamente tratados com o antisoro.
1:10
(-)
(+)
1:50
1:100
Antisoro-policlonal anti-rNTPDase-I
75
Figura 13. Análise da infectividade dos tripomastigotas do T. cruzi (cepa Y) de 1ª passagem celular (VERO) após
48 h de infecção. As células VERO (5 x 10
4
/mL de meio RPMI 5% SFB) foram infectadas com 5 x 10
5
tripomastigotas (P1) da cepa Y do T. cruzi. A infecção das células foi determinada pela contagem do número de
células infectadas e do número de parasitos por célula infectada. Foram analisadas no mínimo 300 células coradas
pelo Giemsa a lento. (E) Tripomastigotas previamente tratados com o soro pré-imune por 10 minutos em
temperatura ambiente. (-) controle positivo (tripomastigotas não tratados). (+) tripomastigotas previamente
tratados com o soro pré-imune.
1:10
(-)
(+)
1:50
1:100
Soro pré-imune
76
5. DISCUSSÃO
77
Durante as duas décadas passadas, um considerável progresso foi alcançado no estudo
das ecto-nucleotidases de um modo geral (Zimmermann, 1996) e em particular sobre as ecto-
ATPases (Plesner, 1995). Este progresso está relacionado a descobertas que, ao contrário das
idéias previamente firmadas, os nucleotídeos podem ser encontrados em concentrações
significantes fora das células (Gordon, 1986; Dombrowski, 1998). Eles podem agir como
moléculas sinalizadoras, virtualmente, em todas as células. Em particular, o ATP está
envolvido numa grande variedade de funções fisiológicas e patológicas (Haskó e cols., 2002).
Além do mais, eles podem ser liberados para o meio extracelular e exercer seus efeitos sobre
células vizinhas pela ligação a específicos receptores de superfície (Dombrowski e cols., 1998).
O real papel das ecto-apirases dependentes de Mg
2+
ainda é alvo de especulação. Em
alguns parasitos, sua atividade enzimática de superfície é considerada um importante sinal
extracelular na regulação de virulência (Silverman e cols., 1998; Nakaar e cols., 1998; Pinheiro
e cols., 2006; Berrêdo-Pinho e cols., 2001).
No presente trabalho mostramos fortes evidências de que as ecto-NTPDases realmente
mediam a infecção do T. cruzi. A primeira evidência foi demonstrada pelas comparações entre
as atividades ecto-nucleotidásicas dos tripomastigotas intactos de diferentes cepas/clone do T.
cruzi (Figura 6). Nós podemos observar que independentemente da cepa/clone do T. cruzi
testada a atividade ecto-ATPase foi sempre superior às atividades ecto-ADPase ou ecto-
AMPase, possivelmente por causa do conhecido papel do ATP como molécula pró-
inflamatória.
Em outras palavras, no primeiro tópico deste projeto comparamos a atividade ecto-
nucleotidásica sobre nucleotídeos de adenina dos tripomastigotas do parasito em diferentes
cepas/clone para selecionarmos uma como modelo padrão para os demais experimentos. Todas
as cepas/clone apresentaram uma elevada atividade ecto-ATPásica (Figura 6), no mínimo duas
vezes maior quando comparada à atividade ecto-ADPásica (Figura 6 e tabela 4). A cepa Y
apresentou a maior atividade de hidrólise sobre o ATP (2232 ± 154 nmol P
i
/h x 10
8
células) em
relação às demais cepas/clone. A relação de hidrólise ATP/ADP (Tabela 4) e a hidrólise de
AMP (Figura 6) foram diferenciadas nas cepas estudadas, o que pode estar relacionado com
78
diferenças de comportamento biológico como, por exemplo, capacidade diferenciada de
modular a resposta imune. No caso da cepa Y aqui analisada, observamos uma elevada relação
de hidrólise de ATP/ADP (Tabela 4), com as formas infectivas intactas apresentando alta
atividade ATPásica mas pouca ou nenhuma atividade AMPásica, nos levando a sugerir que esta
relação influencia, de alguma maneira, na capacidade infectiva destes parasitos. Em
contrapartida, confere também maior susceptibilidade à resposta imune, pois não haveria
sinergismo de bloqueio da resposta inflamatória via quebra do ATP
e
e indução de resposta anti-
inflamatória via produção de Ado (Bours e cols., 2006). Estes dados estão de acordo com as
características biológicas desta cepa, conhecidamente uma forma delgada do parasito, portanto,
muito infectiva, mas sensível aos anticorpos circulantes (Silva & Nussenzweig, 1953).
Sabe-se que a Ado produzida via hidrólise de AMP é uma importante molécula anti-
inflamatória em sistemas eucariotos superiores (Bours e cols., 2006). Já foi demonstrado que a
Ado se liga a uma molécula ativadora de células T, a CD26. A interação Ado-CD26 na
superfície de células T serve para atenuar a sinalização imunossupressora (mediada pela
expressão de receptores P1) induzida por altos níveis de Ado (Dong e cols., 1996; Dong e cols.,
1997; Cordero e cols., 2001; Hashikawa e cols., 2004). Henttinen e colaboradores (2003)
mostraram que a Ado, em níveis micromolares (50 µM) era capaz de promover uma função
inibitória em relação à migração no endotélio vascular de células T ativadas. Estes resultados,
apresentados por diferentes autores, mostraram uma correlação positiva entre a presença da
Ado e suas propriedades fisiológicas na imunoregulação negativa. Curiosamente, o clone CLB
foi o único capaz de hidrolisar AMP (Figura 6). Observando a figura da curva de parasitemia
(Figura 5) notamos que os parasitos deste clone persistem no sangue periférico circulante dos
camundongos Swiss por mais de trinta dias, apresentando um pico máximo de parasitemia
muito baixo (1.35 x 10
5
tripos/0.1 mL de sangue) e não ocasionando a morte de nenhum dos
animais infectados (Tabela 3). Isso nos leva a sugerir que o sinergismo de hidrólise de ATP e
AMP teoricamente daria ao patógeno maior poder de manutenção da infecção com diminuição
da resposta inflamatória e escape do sistema imune, corroborando com o observado para
diferentes espécies de Leishmania (Maioli e cols., 2004) e com os resultados dos trabalhos
descritos acima sobre a molécula de adenosina.
79
Com habilidade em hidrolisar ATP, ADP e AMP (Figura 6), o T. cruzi poderia
sequencialmente defosforilar o ATP em adenosina, indicando que esta enzima poderia realizar
um papel na via de salvação de purinas do meio extracelular (El Kouni, 2003). As funções
fisiológicas das ecto-ATPases ainda não são totalmente conhecidas, entretanto, muitas funções
são sugeridas, incluindo papéis em terminações purinérgicas, na reciclagem de purinas e na
adesão celular (Plesner, 1995). A idéia de que uma atividade ecto-ATPase pudesse estar
relacionada com virulência também se aplica ao T. cruzi. Nós comparamos a atividade ecto-
ATPase dependente de Mg
2+
sobre ATP, ADP e AMP entre os estágios evolutivos do T. cruzi,
todos derivados de parasitos de primeira passagem celular. Os resultados demonstraram que os
estágios infectivos (tripomastigotas) do T. cruzi possuem uma atividade ecto-ATPase Mg
2+
-
dependente muito mais elevada do que os epimastigotas não infectivos e amastigotas
intracelulares. Este resultado está de acordo com o observado por Meyer-Fernandes e
colaboradores (2004), no qual eles também demonstraram uma atividade ecto-ATPase Mg
2+
-
dependente aumentada nos tripomastigotas infectivos do T. cruzi. Porém, nossos dados
divergem tanto quanto à atividade dos amastigotas (talvez pelo modo de obtenção dos mesmos
não ser exatamente o mesmo e as atividades serem realizadas em temperaturas diferentes),
quanto à atividade dos epimastigotas, em especial, devido ao tempo (número de gerações) de
obtenção desses parasitos.
No segundo momento deste projeto idealizamos acompanhar a atividade ecto-
nucleotidásica das diferentes formas evolutivas do parasito durante a infecção experimental in
vitro, utilizando ATP, ADP e AMP como substrato para os parasitos vivos (células intactas) da
cepa Y mantidos em cultura de células VERO e recuperados após cada ciclo completo (cerca
de 5 dias).
Deste modo, as formas tripomastigotas foram coletadas no sobrenadante da cultura após
o 5º e 6º dias de cultivo (primeira saída e segunda saída das células hospedeiras,
respectivamente) e utilizadas para dosagem direta de atividade ecto-nucleotidásica. A
constatação de mais de um dia de saída dos parasitos reforça o fato da cepa Y ser
caracteristicamente policlonal, podendo, neste caso, refletir a saída de diferentes clones com
tempos distintos de ciclo intracelular. Estes mesmos parasitos foram utilizados para obtenção
80
das formas epimastigotas, por diferenciação em meio LIT, e também das formas amastigotas,
através de incubação dos tripomastigotas em cultura de células VERO sem troca de meio de
cultura, para esgotamento de nutrientes e acidificação do meio, induzindo a diferenciação.
Inicialmente o planejamento do projeto era de fazermos o cultivo em células VERO até ao
menos a 10ª passagem celular (P1 à P10), mostrando para T. cruzi o que foi publicado para
Leishmania sp., ou seja, que as passagens fora do hospedeiro levam à diminuição da atividade
das E-NTPDases e que este evento se relaciona com a diminuição da virulência (Berrêdo-Pinho
e cols., 2001). Porém, observamos que só foi possível obtermos parasitos em quantidade
suficiente para as dosagens enzimáticas e nova infecção até a 4ª passagem, sendo que nesta
última, o número de parasitos que completaram o ciclo da 3ª para a 4ª passagem foi insuficiente
para prosseguirmos a infecção in vitro. Apesar de não mensuramos a infectividade diretamente
durante o cultivo das passagens podemos observar claramente que da 3ª para 4ª passagem o
número de parasitos que penetraram nas células VERO foi muito baixo, sendo que a maioria
dos parasitos não internalizados se diferenciaram em amastigotas-like no sobrenadante da
cultura. Este dado sugere fortemente que durante o cultivo celular a infectividade diminui
devido, provavelmente, à falta de pressão seletiva do hospedeiro fazendo com que moléculas
de infectividade, como as E-NTPDases, sejam diminuídas.
Na figura 7 vemos a comparação das atividades ecto-nucleotidásicas das diferentes
formas evolutivas do parasito recuperadas após a primeira e terceira passagens em células
VERO. As formas tripomastigotas (Painel A) apresentaram as maiores atividades ecto-
ATPásicas e uma tendência à diminuição da relação de hidrólise ATP/ADP com o aumento do
número de passagens, onde, neste caso, a hidrólise de ADP apresentou-se aumentada (Painel
A). Nenhuma hidrólise de AMP foi detectada diretamente. Além do mais, é válido salientar que
os parasitos permaneceram viáveis durante todas as dosagens, sugerindo que as enzimas
avaliadas devem estar presentes, portanto, na superfície dos mesmos ou secretadas no
microambiente durante a sua manipulação.
As formas epimastigotas (Figura 7, painel B), derivadas dos tripomastigotas das
passagens 1 e 3, apresentaram um perfil de hidrólise de nucleotídeos extracelulares bem
diferenciado das formas infectivas (tripomastigotas) e intracelulares (amastigotas). Notamos
81
que a hidrólise de ATP foi menor que nos tripomastigotas e maior que nos amastigotas. A
hidrólise de ADP novamente aumentou com o número de passagens, refletindo uma
diminuição na relação ATPase/ADPase. Além disto, detectamos uma alta hidrólise de AMP
que não foi observada para os tripomastigotas e amastigotas (Figura 7, painéis A e C,
respectivamente).
As formas amastigotas (Figura 7, painel C) apresentaram baixa atividade ecto-
nucleotidásica para ATP e ADP, e nenhuma atividade detectável sobre AMP, provavelmente
sugerindo que no microambiente onde a mesma se encontra (citosol celular), a baixa atividade
destas enzimas seja necessária para melhor adaptação ao organismo do hospedeiro, podendo,
assim, se estabelecer dentro da célula até que se prolifere de maneira adequada usando os
metabólitos da própria célula, como a adenosina, já disponíveis pelo próprio metabolismo da
célula hospedeira. Após a multiplicação, o parasito se diferencia para a forma tripomastigota
que, provavelmente pela alta hidrólise de ATP, consome os estoques de ATP da célula
hospedeira, induzindo seu rompimento com conseqüente liberação desses parasitos para uma
nova infecção celular. Processo semelhante a esta sugestão foi comprovado para o parasito T.
gondii, no qual controla sua atividade ecto-ATPásica solúvel dentro do vacúolo parasitóforo,
permitindo alta hidrólise de ATP somente quando o mesmo atinge o momento de necessidade
de rompimento da célula hospedeira para estabelecer novo processo infectivo em outra célula-
alvo (Silverman e cols., 1998).
Sendo o ATP uma molécula pró-inflamatória capaz de recrutar células do sistema
imune sinalizando a montagem de uma resposta protetora (Para revisão, ver Bours e cols.,
2006), é de se esperar que as formas infectivas do parasito possuam alta capacidade de
hidrólise de ATP para que sejam capazes de modular a resposta imune do hospedeiro, inibindo
a resposta inflamatória dependente de ATP. Esperávamos então que a hidrólise de ATP
diminuísse nos tripomastigotas com as passagens, mas este efeito não foi significativamente
detectado nos parasitos capazes de concluir o ciclo intracelular, porém, observamos o aumento
significativo da atividade ADPásica nos mesmos, e ainda não investigamos por quê a relação
ATPase/ADPase influencia a capacidade infectiva dos parasitos. Este fato nos leva a suspeitar
de um papel mais central para o ADP ainda não muito bem discutido entre a comunidade
82
científica. Apesar de a literatura enfatizar as funções inflamatórias do ATP e anti-inflamatórias
da Ado, já foram descritos vários receptores purinérgicos com maior afinidade por ADP, como,
P2Y
1, 12, 13
, expressos em várias células do sistema imune, como, neutrófilos, macrófagos,
células dendríticas, linfócitos T (Bours e cols., 2006).
Analisando os dados até aqui, podemos supor que na diferenciação de tripomastigota
para epimastigota, haja a indução da atividade de uma ecto-5’-nucleotidase, responsável pela
hidrólise de AMP (Figura 7, painel C). Talvez esta indução e mesmo o aumento da hidrólise de
ADP sejam eventos necessários para melhor aquisição de purinas pelo parasito, visto que o T.
cruzi, assim como outros patógenos intracelulares, também se apresenta destituído da via de
biossíntese de novo de purinas e, portanto, dependente de uma via alternativa de salvação (El
Kouni, 2003). Por outro lado, a função dos tripomastigotas é conseguir infectar células-alvo
para que prossiga o ciclo de vida, este processo deve ser rápido e não dependente de
multiplicação celular, já que esta forma do parasito não é capaz de se dividir, não sendo
necessária a hidrólise de AMP com intuito nutricional (Figura 7, painel A). Porém, a Ado é
uma importante molécula endógena sinalizadora da resposta imunológica (Bours e cols., 2006).
Dentro deste contexto, parasitos capazes de hidrolisar de maneira mais efetiva o AMP,
produzindo Ado no microambiente, teriam a vantagem de se esconder de maneira mais efetiva
do sistema imune do hospedeiro. Embora os papéis do ATP e da Ado durante o curso das
respostas imunológicas in vivo pareçam ser extremamente complexos, foi sugerido que estas
funções são interdependentes e, ao mesmo tempo, um evento de múltiplos passos, significando
que a natureza desses efeitos possa alterar o perfil da resposta, de imunoestimulatória para
imunomodulatória ou vice-versa, dependendo muito das concentrações extracelulares bem
como do padrão de expressão de receptores purinérgicos e de ecto-enzimas (Bours e cols.,
2006). Assim, o sinergismo da hidrólise de ATP e Ado teoricamente daria ao patógeno maior
poder de infecção e escape do sistema imune, tornando-o mais virulento.
Na terceira passagem celular observamos que após o tempo estabelecido para a infecção
(24 h), a maioria dos parasitos (cerca de 80%) colocados em contato com a monocamada de
células VERO não conseguiram internalizar, se diferenciando em formas do tipo arredondadas
(amastigota-like) semelhantes às formas amastigotas (Figura 8). Estes parasitos foram
83
recolhidos do sobrenadante do cultivo celular, separados por centrifugação e utilizados em
ensaio de atividade ecto-nucleotidásica. Os parasitos que conseguiram completar mais uma
passagem (cerca de 20% do total inicial), dando origem aos tripomastigotas de 4ª passagem,
foram também recolhidos após 5 dias de nova incubação. Estes dados estão apresentados na
figura 8, onde podemos ver em A e B, fotos tiradas diretamente no microscópio invertido da
garrafa de cultura de células VERO após 24 h de infecção, mostrando a maioria dos parasitos
com forma arredondada no sobrenadante de cultura (P3). Uma pequena região da foto (Painel
A) foi aumentada de tamanho e mostra com maior nitidez os parasitos diferenciados
(amastigotas-like) e não internalizados sobre a camada de células hospedeiras (Painel B). Na
figura 9 temos a comparação da atividade ecto-nucleotidásica dos tripomastigotas que foram
capazes de completar a passagem celular em questão, originando os tripomastigotas de 4ª
passagem, e daqueles que ficaram retidos do lado de fora das células, sendo também
recuperados no meio de cultura da 3ª passagem celular (amastigotas-like). Os tripomastigotas
de 4ª passagem apresentaram um perfil de atividade ATPásica e ADPásica similar ao dos
tripomastigotas das passagens anteriores (Figura 9 e figura 7, painel A). Além do mais, não foi
possível darmos continuidade às passagens in vitro devido ao número limitado de parasitos
recuperados na 4ª passagem celular.
Novamente notamos que a relação ecto-ATPase/ecto-ADPase decresceu
significativamente devido à diminuição da hidrólise de ATP pelos parasitos amastigota-like.
Nós acreditamos que este seja um fator importante que de algum modo impede a internalização
dos parasitos, diminuindo sua infectividade. Talvez por induzir sua diferenciação em formas
arredondadas menos infectivas como foi visto neste experimento. O que fica claro aqui é que a
alta relação de hidrólise ATP/ADP parece se correlacionar com uma maior capacidade
infectiva deste parasito.
Estes dados mostram que de alguma forma os parasitos perdem sua capacidade
infectiva quando na ausência do hospedeiro. Uma explicação possível para este fenômeno seria
a necessidade da presença de determinados fatores do hospedeiro para a manutenção dessas
moléculas de virulência do parasito, ou seja, a ausência de interação com o organismo
hospedeiro levaria em pouco tempo (cerca de 3 a 4 semanas) à perda de infectividade para a
84
maioria dos tripomastigotas. A pressão seletiva do hospedeiro com suas vias de interação
seriam, então, essenciais à manutenção da capacidade infectiva dos tripomastigotas e,
provavelmente, interferem na atividade das ecto-nucleotidases, umas vez que estas são
alteradas durante o processo das passagens celulares (Figura 7). Esta alteração no perfil de
hidrólise de nucleotídeos de adenina pode ser devida a vários fatores como, modificações na
expressão gênica, modificações diretas no estado de ativação destas proteínas ou mesmo
alterações de localização subcelular. Estes dados necessitam de maiores investigações para
serem mais bem compreendidos futuramente.
Para melhor avaliarmos a participação das ecto-nucleotidases, especialmente das
apirases, no processo infectivo em cultura de células, procedemos a este experimento usando
parasitos (tripomastigotas da cepa Y) recuperados da primeira passagem celular e submetidos à
infecção na presença ou ausência de inibidores específicos de apirases como, Suramina
(Ziganshin e cols., 1995; Meyer-Fernandes e cols., 2004), ARL 67156 (Mihaylova-Todorova e
cols., 2002) e GdCl
3
(Escalada e cols., 2004). Inicialmente, testamos a capacidade de inibição
das atividades ATPásica e ADPásica nos parasitos vivos usando diferentes concentrações dos
compostos, mantidos durante todo o experimento. Como mostrado na figura 10, tanto a
atividade ecto-ATPase (Painel A) quanto a atividade ecto-ADPase (Painel B), foram inibidas
por ambos inibidores, de maneira dose-dependente. Podemos ver que a atividade ATPase
(painel A) foi mais inibida pela Suramina, atingindo cerca de 75% de inibição em concentração
próxima a 100 µM. Já os compostos ARL 67156 e GdCl
3
(cloreto de gadolínio) inibiram
aproximadamente 35% desta atividade em concentração de 300 e 500 µM, respectivamente.
Para o bloqueio da atividade ADPase (painel B) vemos uma ação mais efetiva dos inibidores
ARL 67156 e GdCl
3
, atingindo aproximadamente 55 a 60% de inibição em 300 e 500 µM,
respectivamente. A Suramina foi capaz de inibir cerca de 55% da atividade sobre o ADP na
concentração de 100 µM. Curiosamente, a adição de 1 mM de Suramina gerou um efeito não
inibitório em relação à hidrólise de ADP (Figura 10, painel B). Além disto, não foi possível o
uso do GdCl
3
em concentração de 1 mM pelo fato de os parasitos serem mortos pela droga
nesta situação. O fato dos inibidores agirem de modo diferente em relação à hidrólise de ATP e
ADP pode sugerir que enzimas distintas estejam utilizando estes compostos como substrato, ou
ainda, caso a hidrólise seja realizada pela mesma enzima, poderia haver dois sítios de ligação
85
distintos ou que os inibidores bloqueiam diferentemente a entrada dos substratos em seus sítios
ativos.
Para evidenciarmos qual o papel da NTPDase-I do T. cruzi na infectividade do parasito,
procedemos o mesmo ensaio com inibidores, porém agora direcionados sobre a NTPDase-I
recombinante purificada (Figura 11). É importante salientar que a descrição do gene da
NTPdase-I foi feita em 2004 pelo nosso grupo, demonstrando que este gene é cópia única no
genoma da cepa Y e codifica para uma E-NTPDase da família das CD39. A concentração de
cada um dos inibidores foi definida com base nos melhores resultados obtidos nas inibições de
atividade ecto-nucleotidásica sobre tripomastigotas vivos (Figura 10). Na figura 11 vemos que
nas concentrações utilizadas, o efeito dos inibidores foi bem similar ao observado nos parasitos
vivos, principalmente para o tratamento com Suramina. Porém, para os outros inibidores, o
efeito foi bem menor sobre a proteína recombinante do que sobre os parasitos vivos (Figura 11
e tabela 5). Este dado pode sugerir que o ARL67156 e o cloreto de gadolínio (GdCl
3
) tenham
outros alvos no parasito, podendo ser que diretamente estas drogas afetem a atividade da
NTPDase-I ou alterem a atividade ecto-nucleotidásica de outra enzima ainda não descrita em
termos genéticos.
Em relação ao ensaio de atividade ecto-nucleotídasica dos tripomastigotas (P1) pré-
incubados com o antisoro-policlonal anti-NTPDase-I do T. cruzi, podemos ver na figura 12 que
a atividade ATPásica foi inibida de maneira não significativa. Nas diluições de 1:10 e 1:50 do
antisoro, a atividade ecto-ATPásica foi reduzida em apenas 2.39% (P = 0.08) e 2.82% (P =
0.08), respectivamente. Na diluição de 1:100 o antisoro não mostrou nenhum efeito sobre esta
atividade. Vemos uma ação mais efetiva do antisoro purificado sobre a atividade ADPásica, no
qual foi possível observar inibição de cerca de 8.5% (P = 0.03), 5.4% (P = 0.01) e 15.8% (P =
0.01) da atividade sobre o ADP nas diluições de 1:10, 1:50 e 1:100, respectivamente. É
importante ressaltarmos que o antisoro-policlonal estava ativo, uma vez que este se mostrou
efetivo (diluição de 1:1000) no reconhecimento específico da proteína recombinante em
ensaios de Western Blotting (dados não mostrados).
Para uma refinada avaliação da participação das ecto-nucleotidases, especialmente das
apirases, no processo infectivo em cultura de células, após comprovarmos que inibidores
86
específicos de apirases também inibem a atividade catalítica dessa enzima no T. cruzi,
procedemos a este experimento usando parasitos (tripomastigotas da cepa Y) recuperados da
primeira passagem celular e submetidos à infecção na presença ou ausência desses inibidores
específicos. Podemos observar que ambos inibidores mostraram-se muito eficientes em
bloquear a internalização dos tripomastigotas (tabela 6), atingindo valores inibitórios próximos
a 78%, 65% e 36% para Suramina, Gadolínio e ARL67156, respectivamente. As concentrações
nas quais cada inibidor teve sua máxima atividade inibitória foram de 0.1 mM, 0.3 mM e 0.3
mM para Suramina, Gadolínio e ARL67156, respectivamente, resultados estes similares aos
observados para estes inibidores, nestas mesmas concentrações, quando comparados ao
bloqueio da atividade catalítica (Figura 10 e tabela 6). Interessantemente, notamos que em
concentrações mais elevadas, independente do inibidor utilizado, estes se tornam menos
efetivos em bloquear a infecção (tabela 6 e figura 13, painéis A, B e C). Frente a estes
resultados podemos sugerir duas possíveis explicações para este fenômeno. A primeira seria a
possibilidade de esses inibidores formarem complexos, em virtude da alta concentração,
tornando-se inativos mediante sua precipitação. Outra possibilidade seria, talvez, a indução no
parasito, estimulada pela elevada concentração desses bloqueadores, do aumento da expressão
ou modificação da localização celular, na tentativa de contornar essa barreira, favorecendo sua
adesão e conseqüente internalização. Estes dados necessitam de maiores investigações para
serem mais bem compreendidos futuramente.
Ao utilizarmos o antisoro anti-NTPDase-I de T. cruzi não purificado, porém tratado por
30 min à 56º C para inativação do sistema complemento, para inibir a infecção em células
VERO, podemos observar que o efeito foi bastante pronunciado, chegando a atingir cerca de
50% nas diluições 1:50 e 1:100 (Tabela 7 e figura 13, painel D). Novamente, sob alta
concentração, em diluição de 1:10, o efeito inibidor não foi tão pronunciado, o que pode refletir
uma formação de imunocomplexos pela alta concentração de anticorpos diminuindo a
efetividade dos mesmos. O que fica bastante claro com estes experimentos é que existe uma
participação efetiva de proteínas com epítopos reconhecidos pelo antisoro, das quais
certamente a maior participação deve ser da NTPDase-I, visto que este gene já foi demonstrado
ser de cópia única no genoma da cepa Y (Fietto eet al., 2004) e, no genoma completo do clone
CL Brener, nenhuma isoforma de E-NTPDase além da NTPDase-I foi encontrada (dados não
87
mostrados). O efeito inibitório é específico para o antisoro imune, o que pôde ser comprovado
pela não constatação da redução da infectividade após o tratamento desses tripomastigotas com
o soro pré-imune (Tabela 7 e figura 13, painel E). Deste modo podemos concluir que a
NTPDase-I do T cruzi tem um papel importante na capacidade de infecção das células-alvo e
este evento parece não ser somente dependente da hidrólise direta dos nucleotídeos
extracelulares, sugerindo assim, um papel adicional para esta proteína. Nós sugerimos que este
papel possa incluir a participação no processo de adesão celular visto que o gene da NTPDase-I
tem um provável sítio de ligação à integrina (dados não mostrados) que poderia ser usado para
a adesão do parasito na célula-alvo.
88
6. CONCLUSÕES
89
Através da análise detalhada dos resultados apresentados neste trabalho
podemos concluir que:
Existe uma variabilidade de atividade ecto-nucleotidásica sobre nucleotídeos de adenina
nas diferentes cepas e no clone do T. cruzi estudados, porém, de uma maneira geral, as formas
tripomastigotas infectivas apresentaram maior hidrólise de ATP do que ADP e somente o clone
CL Brener foi capaz de hidrolisar AMP;
Apesar de evidenciarmos que o clone menos virulento (Cl Brener) foi o único a
apresentar atividade sobre AMP, para comprovarmos alguma correlação de hidrólise de
nucleotídeos extracelulares de adenina em relação às características biológicas específicas dos
parasitos derivados de diferentes cepas e clones, são necessários estudos específicos para cada
parasito em questão;
O aumento do número de passagens celulares in vitro da cepa Y leva à diminuição da
relação de hidrólise ATP/ADP e este evento parece estar relacionado com a diminuição da
infectividade e indução da diferenciação de tripomastigotas em amastigotas;
A relação de hidrólise de ATP, ADP e AMP pelas diferentes formas morfológicas dos
parasitos derivados das passagens celulares parece ter uma boa correlação com a função dos
nucleotídeos hidrolisados. Deste modo, formas mais infectivas hidrolisam muito ATP a fim de
possivelmente bloquear o efeito protetor deste em relação à resposta imune do hospedeiro. A
hidrólise mais expressiva de AMP nos epimastigotas sugere uma necessidade metabólica maior
de adenosina por esta forma do parasito;
A capacidade infectiva do T. cruzi parece ser influenciada pela hidrólise de
nucleotídeos extracelulares por enzimas da família das apirases, como a NTPDase-I.
Possivelmente, esta enzima tenha um papel adicional além da hidrólise de nucleotídeos
90
extracelulares, supostamente importante para a capacidade infectiva, participando, talvez, na
adesão celular.
91
8. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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