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PAULA PEIXOTO CAMPOS
CARACTERIZAÇÃO DO REPARO TECIDUAL EM UM
MODELO MURINO SUSCEPTÍVEL AO LÚPUS
BELO HORIZONTE
2008
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2
PAULA PEIXOTO CAMPOS
CARACTERIZAÇÃO DO REPARO EM UM MODELO
MURINO SUSCEPTÍVEL AO LÚPUS
Tese apresentada ao Programa de Pós - Graduação em
Ciências Biológicas - Fisiologia e Farmacologia da
Universidade Federal de Minas Gerais, como requisito para a
obtenção do grau de Doutor.
Área de concentração: Fisiologia
ORIENTADORA: DRA. SILVIA PASSOS ANDRADE
Laboratório de Angiogênese
Departamento de Fisiologia e Biofísica
Instituto de Ciências Biológicas- UFMG
Belo Horizonte
2008
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3
Dedico este trabalho a Deus, aos meus
pais, minhas irmãs, meu marido, Gabi
e a meu filhinho João Pedro.
4
AGRADECIMENTOS
-A Deus, pela vida e pelas oportunidades a mim concedidas.
-À PROFª.DRª. Silvia Passos Andrade, pelo aprendizado, pela amizade, pela orientação e
incentivo durante todo o trabalho
-Ao Prof. Dr. Anilton Cesar Vasconcelos, por ter me incentivado a continuar seguindo meu
caminho
-À Profª. Mônica Alves Diniz Ferreira, pelos ensinamentos
- Juliana, Monaliza, Fernanda pelos momentos alegres de convivência no lab., e também
pela amizade durante todos estes anos
- À Janaína, pela amizade, companheirismo e pelos momentos felizes e tristes que
passamos no ICB
-À minha mãe e ao meu pai, pelo apoio incondicional, por terem acreditado em mim e me
ajudado a seguir em busca de meu sonho
As minhas irmãs, pela amizade e companheirismo.
-Ao Adauto, pelo amor e presença constantes, pela compreensão nos momentos de ausência
e pelo incentivo.
- A Gabriela e João Pedro, por tornarem minha vida muito mais alegre
-A todos os professores do curso de pós-graduação em Fisiologia
-Ao CNPq - Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico, pela
concessão da bolsa de estudos, essencial para o desenvolvimento deste trabalho.
5
Ainda que eu falasse a língua dos
homens e dos anjos, sem amor eu nada
seria. “Ainda que eu conhecesse todos
os mistérios da ciência, sem amor eu
nada seria”.
(Adaptado: Coríntios-I, 13)
6
RESUMO
As respostas do hospedeiro a implantes sintéticos são análogas em muitos aspectos ao
processo de reparo que ocorre após lesões. Normalmente, a cicatrização de feridas segue
padrões bem estabelecidos, mas doenças autoimunes afetam profundamente o reparo
tecidual. Neste estudo foi analisado o processo de cicatrização em um modelo de feridas
induzido por implantes de esponjas em camundongos New Zealand White (susceptível ao
lúpus; NZW) e Balb/c (controle). Foram avaliadas a inflamação, a angiogênese, a
deposição de matriz extracelular e a produção de citocinas em discos de esponja de
poliéter-poliuretano implantados no espaço subcutâneo dorsal de camundongos machos
dessas duas linhagens. Análises da resposta cicatricial mostraram padrões distintos durante
o período estudado (7 a 21 dias) entre os dois grupos. A intensidade da inflamação,
avaliada pelos níveis circulantes de TNF-α e enzimas inflamatórias foi mais baixa nos
NZW comparada ao grupo controle. No entanto, a fibrose (colágeno e TGF-β1) foi maior
nos animais susceptíveis ao lúpus. A angiogênese, determinada pelos níveis intraimplante
de hemoglobina, VEGF e número de vasos atingiu o pico na fase inicial do processo (7-10
dias) nos NZW quando comparado com os animais Balb/c. Além disso, estudos
histoquímicos e morfométricos mostraram diferenças temporais no recrutamento de
mastócitos, na proliferação celular e apoptose entre as duas linhagens. Estes resultados
mostram que a resposta cicatricial induzida por implantes difere claramente nas duas
linhagens e sugerem que o padrão de reparo foi influenciado por inflamação deficiente e
angiogênese acelerada na linhagem susceptível ao lúpus.
Palavras-chave: angiogênese, modelo de esponja, reparo tecidual, doença autoimune
7
ABSTRACT
Host responses to synthetic implants are analogous to healing, the process of repair that
follows injury. Normally, the processes of wound healing follow well established patterns
but conditions such as autoimmune diseases profoundly affect tissue repair. We have
analyzed sponge-induced wound healing responses in lupus-prone New Zealand White and
control (Balb/c) mouse strains by measuring inflammation, extracellular matrix deposition,
angiogenesis and cytokine production in polyether–polyurethane sponge implanted
subcutaneously in male mice of these two strains. Although there was no difference in the
gross appearance of the implants, further analysis of the wound healing responses, induced
from 7 to 21 days post implantation, disclosed important differences between the New
Zealand White and Balb/c strains. The intensity of inflammation (circulating tumor necrosis
factor-α and inflammatory leukocytes levels) was lower but implant fibrosis (collagen and
transforming growth factor-b1) was higher in New Zealand White, compared with Balb/c
mice. Angiogenesis (hemoglobin, vascular endothelial growth factor and vascularity) in
New Zealand White implants peaked earlier (7-10 days) than in Balb/c mice.
Histochemistry and morphometric studies showed temporal differences in mast cell
recruitment, cellular proliferation and apoptosis profile between both strains. Sustained
apoptosis in sponge implants of NZW mice is fully compatible with the intrinsic
impairment in apoptotic cell clearance abnormal.
Key words: angiogenesis, sponge model, tissue repair, autoimmune disease
8
LISTA DE FIGURAS Página
FIGURA 1 Representação esquemática da evolução do processo de reparo........................ 21
FIGURA 2 Representação esquemática do processo angiogênico........................................
27
FIGURA 3 Número mínimo representativo de campos para a quantificação de vasos....... 51
FIGURA 4 Níveis sistêmicos de marcadores inflamatórios em NZW e Balb/c antes e
após a implantação (10 dias)..............................................................................
55
FIGURA 5 Níveis sistêmicos de citocinas pro-angiogênicas/fibrogênicas em animais
NZW e Balb/c antes e após a implantação (10 dias)..........................................
57
FIGURA 6
Infiltração celular, deposição de sulfato de condroitina e colágeno na matriz
extracelular e níveis de TGF-β em implantes dos camundongos NZW e
Balb/c..................................................................................................................
59
FIGURA 7 Cortes histológicos representativos (Picrosirius red) do tecido fibrovascular
que infiltra a matriz esponjosa nos animais........................................................
60
FIGURA 8 Marcadores inflamatórios nos implantes de esponja em camundongos NZW e
Balb/c..................................................................................................................
62
FIGURA 9 Angiogênese nos implantes de camundongos NZW e Balb/c............................ 64
FIGURA 10
Cortes histológicos representativos (5
µ
m, corados com H.E) do tecido
fibrovascular que infiltra o implante de esponja................................................
66
FIGURA 11 Quantificação da área fibrovascular por campo na esponja...............................
67
FIGURA 12
Cortes histológicos representativos de implantes (5
µ
m, corados com Azul de
Dominici) mostrando mastócitos entremeando o tecido fibrovascular que
infiltra a matriz sintética ....................................................................................
68
FIGURA 13 Quantificação do índice de mastócitos no implante de animais NZW e Balb/c
no 10º e 21º dia pos implantação........................................................................
68
10
FIGURA 14 Corte histológico de implantes (10 e 21dias), corado com AgNOR. Setas
indicam os grumos enegrecidos arredondados, como pequenos satélites
espalhados por todo o núcleo (NORs).................................................................
69
FIGURA 15 Evolução do índice de AgNORs por tempo de implante subcutâneo das
esponjas no 10º e 21º dia em animais NZW e Balb/c.........................................
70
FIGURA 16 Cortes histológicos representativos
mostrando a morfologia de células em
apoptose coradas pela reação de TUNEL
do tecido fibrovascular que infiltra o
implante de esponja.............................................................................................
71
FIGURA 17
Evolução do índice apoptótico das células presentes nos implantes de esponja de
animais NZW e Balb/c no 10º e 21º dia...............................................................
72
11
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANA Anticorpos anti nucleares
Ang angiopoetinas
AgNORs Do inglês “Argyrophillic Nucleolar Organizing Regions” - regiões organizadoras
de nucléolo coradas pela prata
ANOVA Análise de variância
b-FGF Fator de crescimento b derivado de fibroblasto
BXSB C57BL/6J x SB
B6.Sle1 C57BL/6 “susceptible loci, Sle1 on chromosome 1”
B6.Yaa C57BL/6 “Y-linked autoimmune acceleration (Yaa) gene”
CEBIO Centro de Bioterismo
CE Células endoteliais
CV Coeficiente de variação
DAB Diaminobenzidina
DMB “Dimethoxybenzidine”
DNA Deoxyribonucleic acid =Ácido desoxirribonucléico
DP Desvio padrão
EGF Fator de crescimento epidermal
ELISA Enzime-linked immunosorbent assay
EPO Peroxidase de eosinófilo
F1 Primeira geração
FGF Fator de crescimento fibroblástico
Flk-1 Fetal liver kinase
Flt-1 Fms-like tyrosine kinase (receptor VEGF)
Hb Hemoglobina
HE Hematoxilina-Eosina
HGF Fator de crescimento derivado de hepatócito
12
HLA Human Leukocyte Antigen
iNOS Inducible Nitric Oxide Synthase
IA Índice Apoptótico
ICB/UFMG Instituto de Ciências Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais
IFN -
γ
Interferon - gama
IGF Fator de crescimento semelhante à insulina
IgG Imunoglobulina G
IL- 1 Interleucina – 1
IL- 8 Interleucina – 8
kDa kilodalton
LES Lúpus Eritematoso Sistêmico
MEC Matriz extracelular
MMP Matriz metaloproteinases
MHC Complexo maior de histocompatibilidade
MPO Mieloperoxidase
MRL “Inbred strain, have a composite genome of LG (75%), AKR/J (12.6%), C3H
(12.1%) and C57BL/6 (0.3%)”
NZB New Zealand Black
NZW New Zealand White
NAG
N-acetil-
β
-glucosaminidase
NORs Nucleolar Organizing Region= Regiões organizadoras de nucléolos
NO Óxido nítrico
OD Optical Density - Densidade óptica
PA-I Plasminogênio
PAF Platelet Agregation Factor = Fator de agregação plaquetária
PDGF Platelet Derived Growth Factor” = Fator de crescimento derivado de plaquetas
PMN Polimorfonucleares
POD Peroxidase
13
TdT Terminal Deoxinucleotidyl Transferase =Transferase terminal de
nucleotídeos
TGF-
α
Transforming Growth Factor alfa =Fator de crescimento transformante-
α
TGF
β
1
Transforming Growth Factor beta = Fator de crescimento transformante Beta 1
TNF-α Tumor Necrosis Factor =Fator de necrose tumoral α
TUNEL Terminal Deoxinucleotidyl Transferase Uracyl Nick End Labeling=
Marcação in situ da fragmentação do genoma com a enzima Transferase
terminal de nucleotídeos
VEGF
Vascular Endothelial Growth Factor = Fator de crescimento de endotelio
vascular
14
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO...........................................................................................................
16
1.1- Doenças Autoimunes ……………………………………………………..…….. 16
1.1.1-Lúpus Eritematoso Sistêmico..................................................................................
17
1.2- Reparo tecidual……………………………………………………………….…… 20
1.2.1- Fase de hemostasia e inflamação ........................................................................
20
1.2.2- Fase proliferativa e angiogênese ...........................................................................
22
1.2.3-Fase de remodelamento e apoptose.........................................................................
23
1.3- Angiogênese...............................................................................................................
26
1.3.1-Indutores da Angiogênese
.
......................................................................................
30
Fator de crescimento endothelial vascular (VEGF)....................................................... 30
Fator de necrose tumoral-α (TNF- α) ............................................................................ 33
Fator de crescimento transformante-
β
(TGF-
β
)............................................................
34
1.4- Modelo de implantação de implantes para o estudo da angiogênese
inflamatória…….................................................................................…………………..
36
1.5- Modelos animais de doenças autoimunes 37
2- OBJETIVOS................................................................................................................
41
2.1- Objetivo geral........................................................................................................... 41
2.2- Objetivos específicos................................................................................................ 41
3. MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................................
42
3.1. Animais utilizados ................................................................................................... 42
3.2. Técnica de implantação ......................................................................................... 42
3.2.1- Implantes de esponjas........................................................................................... 42
3.2.2- Técnica de implantação em camundongos..........................................................
.
42
3.3- Remoção dos implantes............................................................................................ 43
3.4- Dosagem de hemoglobina......................................................................................... 43
3.5- Avaliação da atividade da mieloperoxidase (MPO) ................................................ 44
3.6- Avaliação da atividade de N- acetilglicosaminidase (NAG).................................... 45
3.7- Quantificação das citocinas (VEGF, TNF-
α
, TGF-
β
1) intraimplantes e no plasma
46
15
sanguíneo...........................................................................................................................
3.8- Quantificação do colágeno........................................................................................ 46
3.9-Dosagem glicosaminoglicanos GAG..........................................................................
47
3.10- Avaliação histológica ............................................................................................ 48
3.10.1- Parâmetros e estratégia morfométrica................................................................ 48
3.10.1.1- Ativação e proliferação celular ....................................................................... 50
3.10.1.2-Identificação e quantificação da apoptose.........................................................
50
3.11. Análise estatística.................................................................................................... 51
4. RESULTADOS............................................................................................................
53
4.1- Avaliação de marcadores inflamatórios a nível sistêmico dos animais antes e após
a implantação da matriz esponjosa...................................................................................
53
4.2- Avaliação dos níveis sistêmicos de citocinas pro-angiogênicas/fibrogênicas em
animais NZW e Balb/c antes e após a implantação...........................................................
54
4.3- Avaliação de parâmetros do tecido fibrovascular em implantes dos camundongos
NZW e Balb/c. .................................................................................................................
57
4.4- Avaliação de marcadores inflamatórios nos implantes de esponja em
camundongos NZW e Balb/c..........................................................................................
59
4.5- Avaliação da angiogênese nos implantes de camundongos Balb/c e NZW........... 62
4.6- Avaliação quantitativa de parâmetros morfológicos dos implantes......................... 64
4.6.1- Quantificação do número de mastócitos por campo............................................
66
4.6.2- Ativação e proliferação celular..............................................................................
68
- Morfologia das AgNORs.............................................................................................
68
- Índice de AgNORs.......................................................................................................
69
4.6.3- Apoptose................................................................................................................ 70
- Morfologia das células apoptóticas............................................................................... 70
- Índice Apoptótico por tempo pós implantação ............................................................. 71
5. DISCUSSÃO................................................................................................................
72
6
. CONCLUSÕES
........................................................................................................... 82
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................
83
8. ANEXOS......................................................................................................................
105
16
1- INTRODUÇÃO
1.1- Doenças autoimunes
Doenças auto-imunes, mais de 80 já catalogadas, ocorrem em 3 a 5% da população
em geral e são controladas por fatores genéticos e ambientais que determinam a
susceptibilidade do indivíduo à autoimunidade. As condições patológicas se manifestam
quando o número de células autoreativas, e em particular a avidez de seus receptores para
os antígenos próprios aumentam. O desencadeamento da doença depende do aumento da
imunogenicidade das células alvo, que pode ser secundário a infecções e à capacidade
individual de reconhecer os autoantígenos (genes HLA, repertório de células T)
(HAMMERLING et al., 1991; LIMMER et al., 1998). Para muitas doenças autoimunes o
papel das células T e B estão bem documentados (BETTELLI et al., 2007). Células
dendríticas, macrófagos e outras células mielóides também desempenham funções
importantes nas doenças auto-imunes, como células apresentadoras de antígenos e células
efetoras que destroem os tecidos (DAVIDSON & DIAMOND, 2001; GEIJTENBEEK et
al., 2004; MENSAH-BROWN et al., 2006; OHTSUBO & MARTH, 2006). Muitas dessas
doenças são classificadas de acordo com órgãos ou tecidos acometidos pela resposta imune
lesiva. Existe uma doença imune para quase todos os órgãos (rins, pulmões, pâncreas)
envolvendo, normalmente uma resposta a um antígeno expresso apenas naquele tecido
(doenças autoimunes órgão-específicas). Em algumas doenças autoimunes, no entanto,
como na artrite reumatóide, polimiosite/dermatomiosite e Lúpus eritematoso sistêmico,
nenhum tipo particular de célula pode ser considerada o alvo, pois a resposta parece ser
direcionada contra antígenos que são amplamente expressos no organismo (MARRACK et
17
al. 2001). Características comuns destas doenças são os aspectos multifatoriais envolvendo
disfunções de vários componentes do sistema imune inato e adaptativo (BLANK &
SHOENFELD, 2007; GAIPL et al., 2007; KOIKE et al., 2007; ORBAN et al., 2007) e o
fato de que elas são geralmente iniciadas por respostas agressivas do sistema imune
adaptativo contra antígenos próprios, resultando em lesões teciduais e seqüelas patológicas
(DAVIDSON & DIAMOND, 2001).
1.1.1-Lúpus Eritematoso Sistêmico
Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES) uma doença inflamatória multifenotípica de
causa desconhecida foi descrita inicialmente por Moritz Kaposi em 1872 (KOTZIN, 1996)
como uma doença rara e fatal. Ela acomete predominantemente mulheres em idade fértil
(1:1000) (KOTZIN, 1996). A presença de anticorpos contra constituintes celulares
classifica o LES como uma doença auto-imune. Os auto-anticorpos contra os componentes
nucleares e citoplasmáticos podem estar presentes anos antes do diagnóstico da doença e o
acúmulo progressivo frequentemente precede o desenvolvimento da doença (VYSE &
KOTZIN, 1996; HAN et al., 2003). Ao contrário de outras doenças auto-imunes órgãos-
específicas como esclerose múltipla e diabetes tipo I, o LES tem o potencial de envolver
diretamente muitos sistemas orgânicos incluindo pele, articulações, vasos, rins e o sistema
nervoso central. Esta doença está associada a uma hipergamaglobulinemia policlonal e altos
títulos de anticorpos contra vários auto-antígenos, especialmente antígenos nucleares
(PREBLE et al., 1982; VYSE & KOTZIN, 1996). As manifestações clínicas incluem lesões
de pele, vasculite, anemia hemolítica, trombocitopenia, poliartrite, insuficiência renal e
danos ao sistema nervoso devido à deposição de auto-anticorpos IgG (VYSE & TODD,
1996, DEAPEN et al., 1992; BOUMPAS et al., 1995a; BOUMPAS et al., 1995b). Estudos
18
familiares e étnicos e investigações com gêmeos idênticos sugerem fortes indícios de uma
base genética para esta doença bem como a influência do ambiente na susceptibilidade
genética (GRAININGER et al., 1987; KOTZIN, 1996; LAHITA, 1999; RUDOFSKY &
LAWRENCE, 1999). Assim, exposição aos raios ultravioleta (UV), radiação, infecção,
dieta, drogas terapêuticas, estress físico e mental, estado hormonal (gravidez) tem
profundos efeitos no sistema imune podendo contribuir para a patogenia do LES
(BOUMPAS et al., 1995; BOUMPAS et al., 1995; LAHITA, 1999; SARZI-PUTTINI et
al., 2005). Devido ao amplo alcance da penetrância do fenótipo do LES, tem sido
impossível determinar onde as influências ambientais nesta doença iniciam a patogenia ou
aumentam a penetrância de um fenótipo de baixo grau previamente não reconhecido.
Assim, a resposta auto-imune no LES não parece ser uma ativação policlonal
indiscriminada de clones silenciosos, mas várias ativações genéticas específicas com
contribuições dos genes do complexo maior de histocompatibilidade (MHC) e vários genes
não-MHC. Isto é similar em outras doenças autoimunes como diabetes tipo I e esclerose
múltipla. Genes etiológicos nestas desordens determinam que a susceptibilidade de nenhum
gene particular seja necessária ou suficiente para a expressão da doença (VYSE & TODD,
1996; THEOFILOPOULOS, 1995; DRAKE et al., 1995). A patogenia e a etiologia do LES
são ainda parcialmente entendidas, ocorre uma resposta imune inapropriada a vários auto-
antígenos, particularmente DNA nativo, cromatina, nucleoproteínas, nucleossomos,
histonas, fosfolipídios, mieloperoxidase, tireoglobulina e a várias organelas subcelulares
(TAN, 1989). Defeitos funcionais nos linfócitos T e B são necessários para a produção de
ANA (DATTA, 1998; DATTA, 1999; SHLOMCHIK, 2001; SOBEL et al., 2002). Estudos
sugerem que o início da doença ocorra devido a defeitos nos receptores de antígenos dos
linfócitos T que sinalizam, para as células B induzindo uma ativação excessiva destas
19
células, aumento espontâneo e diminuição da indução da apoptose, da produção de
citocinas e disfunção da tolerância imunológica (TSOKOS et al., 2003; KAMMER et al.,
2002; NAGY et al., 2005; KYTTARIS et al., 2004; CSISZAR et al., 2000; NAGY et al.,
2000; SAKAGUCHI et al., 2005).
As desordens genéticas complexas levam a uma apresentação crônica anormal de
alguns auto-antígenos às células B, que são ativadas pelas células dendríticas e células T a
se tornarem células plasmáticas produtoras de anticorpos que fixam complemento de alta
afinidade. Como estas células B não conseguem ser eliminadas elas geram células
plasmáticas de vida curta e longa e a doença se torna auto perpetuada (HOYER et al.,
2004). A formação ou deposição dos complexos imunes nos tecidos podem levar a uma
disfunção tecidual através da ativação do complemento e liberação secundária de
mediadores infamatórios por células imunes residentes e infiltrantes, gerando uma resposta
inflamatória crônica (KOUTOUZOV et al., 2006). Embora a inflamação seja um processo
importante na defesa do organismo contra agentes infecciosos e lesão, ela contribui para a
fisiopatologia de muitas doenças crônicas. Interações entre células do sistema imune inato,
do sistema imune adaptativo e mediadores inflamatórios orquestram aspectos da inflamação
aguda e crônica que estão envolvidos em disfunções de muitos órgãos. Uma série
coordenada de mecanismos efetores comuns da inflamação contribuem para a lesão
tecidual, estress oxidativo, remodelamento da matriz extracelular, angiogênese e fibrose em
diversos tecidos alvos (LIBBY, 2007).
Embora as lesões periféricas e internas do LES sejam bem caracterizadas, estudos quanto à
resposta inflamatória local e sistêmica a injúrias mecânicas em indivíduos portadores de
Lúpus ativo ou quiescente não estão ainda bem determinadas.
20
1.2- Reparo tecidual
O reparo tecidual é um processo biológico complexo, compreendido de uma série de
eventos seqüenciais que resultam no restabelecimento da integridade e função do tecido. O
papel do sistema imune neste processo é reconhecer e combater antígenos no local da lesão,
participar no debridamento da área lesada e contribuir para a restauração do tecido. A
seqüência de eventos envolvidas no reparo é composta de quatro fases que se sobrepõem
temporal e espacialmente (CLARK, 1996; TSIROGIANNI et al., 2006).
1.2.1- Fase de hemostasia e inflamação
Imediatamente após a lesão ocorre a ativação da cascata de coagulação (hemostasia) e o
início da fase inflamatória (CLARK, 2001; SZPADERSKA et al., 2003) que se caracteriza
por recrutamento de neutrófilos para o local lesado iniciando o papel crítico de fagocitose
para remoção de corpos estranhos, bactéria e debris teciduais (BEVILACQUA et al., 1985;
POHLMAN et al., 1986; LI et al., 2003a,b; SCHRUEFER et al., 2006). Estas células
geram radicais livres de oxigênio através da via da mieloperoxidase que combina com cloro
para ajudar a esterilizar a ferida (YAGER & NWOMEH, 1999). Ao menos que os
estímulos para o recrutamento de neutrófilos persistam no local lesado, sua infiltração cessa
em poucos dias. Estas células morrem por apoptose e são fagocitadas por macrófagos que
substituem os neutrófilos no local lesado dando continuidade à fase inflamatória. Esta
segunda população de células inflamatórias é atraída para o local em resposta a uma
variedade de fatores quimiotáticos originados de compartimentos intravasculares e extra
21
vasculares. Os macrófagos continuam a limpar o local removendo células lesadas,
neutrófilos, matriz danificada, debris celulares e liberando óxido nítrico que reagem com o
íon peróxido e radicais oxigenados para gerar radicais ainda mais tóxicos. Os macrófagos
ativados são mediadores da angiogênese através da síntese de citocinas pró-angiogênicas
dentre elas o fator de crescimento do endotélio vascular (VEGF), o fator de crescimento
epidermal (EGF) e o fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF). Os macrófagos
têm também um papel importante na indução dos mecanismos do sistema imune adaptativo
(POLVERINI et al., 1977; DIELGEMANN et al., 1981; DiPIETRO & POLVERINI,
1993a, b; WITTE & BARBUL, 2002; MOLDOVAN & MOLDOVAN, 2005). A figura 1
ilustra os principais eventos do processo de reparo.
FIGURA 1 –Representação esquemática do processo de reparo tecidual. (Copiado de
MENKE et al., 2007)
22
1.2.2- Fase proliferativa e angiogênese
Os fibroblastos e as células endoteliais são as células em proliferação predominantes
nesta fase. Os primeiros contribuem com a produção de citocinas fibrogênicas
principalmente o fator de crescimento transformante (TGF-β), a deposição de matriz
extracelular e a produção de colágeno e as células endoteliais, originadas de vênulas pós-
capilares, são responsáveis pela formação de novos vasos sanguíneos (FOLKMAN, 1995;
CLARK, 1996; TSIROGIANNI et al., 2006). Durante a fase proliferativa o TGF-β induz a
síntese do colágeno tipo I, diminui a produção de MMP, aumenta a produção de inibidores
de metaloproteinases, e aumenta a produção de proteínas de adesão celulares
(DESMOULIERE et al., 1993; ROBERTS & SPORN, 1996; ROBERTS et al., 1986;
GOLDMAN, 2004). A deposição da matriz extracelular segue um padrão pré-determinado
inicialmente a matriz é composta principalmente de fibrina e fibronectina (originadas da
hemostasia e dos macrófagos), posteriormente os fibroblastos sintetizam
glicosaminoglicanos, proteoglicanos, colágeno e outras proteínas (REGAN et al., 1991;
EHRLICH & KRUMMEL, 1996; CLARK, 2001). Este novo tecido formado é o tecido de
granulação. Durante este processo a celularidade da ferida aumenta e esta fase proliferativa
dura até que o local esteja preenchido e a integridade tecidual restaurada. À medida que o
tecido de granulação preenche a área lesada, o número de células inflamatórias diminui e os
fibroblastos e as células endoteliais continuam a sintetizar fatores de crescimento da matriz
extracelular. Como fagócitos profissionais do organismo, os macrófagos atuam como uma
importante central neste processo. Através do reconhecimento de sinais via vários
receptores diferentes, os macrófagos englobam células apoptóticas de forma rápida e
23
eficiente, intermedeiam a morte de células do estroma, parênquima e células imunológicas,
engajando-se no programa de morte celular que resulta em apoptose (DESMOULIERE et
al., 1995; DUFFIELD, 2003).
O VEGF secretado por queratinócitos, macrófagos, fibroblastos, plaquetas e células
endoteliais é a principal molécula na iniciação e formação de novos brotos capilares.
Vigorosa resposta angiogênica é essencial para uma reparação tecidual normal, pois além
de fornecer nutrientes e células inflamatórias para o tecido lesado, os novos vasos
sangüíneos facilitam a remoção de material residual e auxiliam no desenvolvimento do
tecido de granulação (NISSEN et al., 1998). Em condições inflamatórias crônicas, as
células endoteliais ativadas por citocinas e fatores de crescimento, recrutam ativamente
células imunes da circulação para o tecido e participam da angiogênese para dar suporte à
contínua demanda de oxigênio e nutrientes pelas células inflamatórias.
1.2.3-Fase de remodelamento e apoptose
Embora o remodelamento ocorra ao longo de todo o processo de cicatrização de feridas
ele se intensifica após o pico da atividade proliferativa. Nesta fase os fibroblastos se
diferenciam em um fenótipo contrátil, o miofibroblasto (TOMASEK et al., 2002; HINZ,
2007) que continuam proliferando e sintetizando colágeno (CLARK, 2001). A matriz
temporária é substituída por uma matriz mais forte e organizada composta de colágeno. O
colágeno depositado inicialmente é mais fino que o colágeno de um tecido sem lesão e está
orientado paralelamente à pele. Com o passar do tempo, o colágeno inicial é reabsorvido e
um colágeno mais grosso é depositado e organizado paralelamente às linhas de tensão.
Estas alterações são acompanhadas também com um aumento força tensil da ferida
24
indicando uma correlação positiva com a espessura do colágeno/orientação e força tensil
(MADDEN & SMITH , 1970; WITTE & BARBUL, 1997; DIEGELMANN, 2003).
Outro evento marcante do remodelamento é a apoptose responsável pelo controle da
inflamação e remoção das células que participam mais intensamente deste processo. Há
evidências de que a apoptose das células endoteliais são responsáveis pela regressão
vascular durante a evolução do tecido de granulação para uma cicatriz (DESMOULIERE et
al., 1995). Em contraste com a necrose, a apoptose está associada com a preservação da
integridade da membrana plasmática, então a liberação de conteúdos dos neutrófilos está
limitada e os neutrófilos inertes são fagocitados pelos macrófagos locais. Nesta via de
regulação para a diminuição das funções dos neutrófilos é desencadeada uma remoção
silenciosa pelos fagócitos, a apoptose promove um mecanismo para a segura destruição de
células inflamatórias potencialmente destrutivas (SAVILL et al., 1989; WOOLLEY et al.,
1996). Além disso, a apoptose age no sentido de diminuir a habilidade dos macrófagos em
produzir mediadores inflamatórios. As anormalidades na remoção de células apoptóticas
contribuem para a patogenia de doenças inflamatórias crônicas, incluindo aquelas de
etiologia autoimune (GESKE et al., 2002).
Mastócito, um outro tipo celular (subtipo de leucócito) também está envolvido no
processo de reparo, tanto na fase inflamatória quanto no remodelamento. Estas células
participam na patogênese de um grande número de doenças imunes da pele principalmente
escleroderma e doenças crônicas relacionadas a enxertos (NAVI et al., 2007). Eles liberam
mediadores pró-inflamatórios (histamina, serotonina) e citocinas (TNF-α TGF-β1, IL-13)
que podem promover a inflamação, alterações vasculares, proliferação de fibroblastos e
células endoteliais (REED et al., 1995; BLAIR et al., 1997; GRUTZKAA et al., 1998;
25
WELLER et al., 2006). Devido a estas variadas funções, os mesmos têm sido associados a
várias doenças fibrosantes com diferentes etiopatogenias e com ocorrência em diferentes
órgãos como pulmões, pele, fígado, trato gastrointestinal, olhos, coração (LEVI-
SCHAFFER & WEG, 1997; TRAUTMANN et al., 2000).
Também os linfócitos T chegam ao local da injúria em uma fase tardia durante a fase
proliferativa (FISHEL et al., 1987). Eles representam uma ferramenta adaptativa do sistema
imune, e desempenham um papel regulatório no processo de reparo, controlando as células
inflamatórias, a deposição de colágeno e a maturação da cicatriz (PETERSON et al., 1987;
BARBUL et al., 1989; PETERSON et al., 1987; SCHAFFER & BARBUL, 1998;
MARTIN & MUIR, 1990, HAVRAN, 2000; PARK & BARBUL, 2004).
Existem quatro respostas básicas que podem ocorrer após uma injuria. A resposta onde
ocorre o restabelecimento do equilíbrio entre a formação de cicatriz e a remodelação
cicatricial que é o reparo normal. Esta é a resposta típica da maioria dos tecidos humanos
após uma lesão. A resposta patológica à lesão é contrastante com a resposta normal de
reparo. Na cicatrização excessiva, por exemplo, há muita deposição de tecido conjuntivo o
que resulta em uma estrutura tecidual alterada e perda de função (CLARK, 1996; GROSS,
1996; STOCUM, 1996; VAN ZUIJEN et al., 2002) fibrose, contraturas e aderências são
exemplos do excesso do processo. Quelóides e cicatrizes hipertróficas na pele são exemplos
de fibroses (PIAGGESI et al., 2003; LOBMANN et al., 2005). Contração é parte normal do
processo de reparo, mas em excesso se torna patológico e é conhecida como contratura
(NWOMEH et al., 1999). Reparo deficiente é o oposto da fibrose; ocorre quando há uma
deposição insuficiente de matriz conjuntiva e o tecido fica fraco ao ponto de se romper. As
úlceras crônicas que não cicatrizam são exemplos de reparo deficiente. A regeneração é o
26
processo que ocorre quando há perda de estrutura e função, mas o organismo tem a
capacidade de reconstruir a estrutura perdida substituindo por um tecido exatamente igual
ao anterior da lesão (NWOMEH et al., 1998).
1.3- Angiogênese
A angiogênese é um componente vital para o reparo tecidual normal. O controle
preciso da formação de novos vasos sanguíneos durante o reparo não está claramente
entendido. Sabe-se que a angiogênese é um processo complexo que envolve intensa
intercomunicação entre as células, fatores solúveis e componentes da matriz extracelular
(LIEKENS et al., 2001).
Para que a angiogênese se inicie é necessária a presença de estímulos que podem ser
lesões teciduais, hipóxia, alterações isquêmicas ou liberação de citocinas e de fatores de
crescimento. A ativação de células endoteliais originadas de vasos sanguíneos pré-
existentes consiste na primeira etapa do processo angiogênico. Estas células ativadas
liberam enzimas proteolíticas que degradam a membrana basal adjacente (MIGNATTI &
RIFKIN, 1996). A seguir, as células endoteliais “livres” iniciam a migração em direção à
matriz extracelular degradada.
A etapa seguinte consiste na proliferação das células endoteliais e formação do
broto capilar, que será estimulado por uma variedade de fatores de crescimento, alguns dos
quais foram liberados pela própria degradação da matriz extracelular (PETTERSSON et al.
2000; LIEKENS et al., 2001; DVORAK et al., 2003; DVORAK, 2005).
27
A fase final do processo angiogênico inclui a formação de “alças” capilares e a
determinação da polaridade das células endoteliais, que será importante para a formação do
lúmen capilar e para as interações célula-célula e célula-matriz (BISCHOFF, 1997). A
estabilização do vaso sanguíneo neoformado é atingida após a migração de células
mesenquimais para o redor dos neovasos, e sua posterior diferenciação em pericitos ou
células musculares lisas (HIRSCHI & D’AMORE, 1997). As células periendoteliais são
essenciais para o amadurecimento dos vasos, pois estabilizam os vasos, estimulando a
produção de matriz e protegem os vasos contra a regressão (CARMELIET, 2000; VEALE
AND FEARON, 2006). A Figura 2 ilustra esquematicamente as etapas da angiogênese,
ativação das células endoteliais, degradação da matriz extracelular, migração, proliferação e
organização das células endoteliais, remodelamento da matriz extracelular e migração de
pericitos para a formação de um novo vaso (KULDO et al., 2005; KUMAR et al., 2005).
FIGURA 2- Representação esquemática do processo angiogênico. (Copiado de The
Angiogenesis Foundation)
28
O crescimento de novos vasos sangüíneos é intrínseco para a inflamação e está
associado a alterações ultra estruturais incluindo a ativação e proliferação das células
endoteliais e o remodelamento dos capilares e vênulas, o que resulta em expansão da rede
da microvasculatura do tecido (MAJNO, 1998; CARMELIET, 2000; BAGLI et al., 2004).
Uma conseqüência funcional desta expansão é a promoção da inflamação através de vários
mecanismos correlacionados. Primeiro, o influxo de células inflamatórias deve aumentar,
segundo, deve haver um aumento do suprimento de nutrientes que irá alimentar o processo
imune metabolicamente ativo, e terceiro o endotélio ativado contribui para a produção local
de citocinas, quimiocinas e matriz metaloproteinases (FIRESTEIN, 1999; SZEKANEC &
KOCH, 2004). Por isto a expansão anatômica da rede microvascular combinada com esta
ativação funcional pode continuar recrutando células inflamatórias, a angiogênese e a
inflamação devem se tornar processos cronicamente co-dependentes (JACKSON et al.,
1997; BAGLI et al., 2004; SZEKANEC & KOCH, 2004; CAMPOS et al., 2006).
A angiogênese é um processo de suma importância em várias condições fisiológicas
e patológicas. Durante processos fisiológicos, como, por exemplo: durante o
desenvolvimento do feto e após o nascimento para formar os vasos sanguíneos normais nos
tecidos dos adultos e em processos reparativos (ex. cicatrização de feridas) (FREDERICK
et al., 1984; AUERBACH & AUERBACH, 1997; NISSEN et al., 1998; RIBATTI et al.,
2001).
Paralelamente, um grande número de diferentes processos patológicos está
associado à formação de novos vasos sanguíneos (FOLKMAN, 1995). O crescimento
excessivo e persistente de novos vasos é característico de várias condições patológicas
categorizadas como “doenças angiogênicas” (FOLKMAN & KLASGSBRUN, 1987) e,
nesse caso, está geralmente associado à continuidade e à cronicidade de tais enfermidades.
29
Dentre estas se incluem inflamações crônicas, doenças autoimunes, como artrite rematóide
(PALEOLOG et al., 1998; SZEKANECZ et al., 1998), retinopatia diabética, psoríase,
ulcera péptica, doença de Alzheimer (FOLKMAN, 1995; GOULD & WAGNER, 2002;
CARMELIET, 2003) e tumores sólidos (CLAUSS et al., 1990).
Para um outro grupo de doenças, entretanto, a vascularização é insuficiente. Dentre
estas estão incluídas doenças isquêmicas cardíacas (ex. infarto do miocárdio e insuficiência
cardíaca congestiva), doença oclusiva vascular e malformações congênitas decorrentes de
falhas na vascularização durante a embriogênese (FOLKMAN & KLAGSBURG, 1987).
Em contraste à estrutura e função bem organizada da vasculatura normal, na
angiogênese estes vasos sanguíneos não se encontram uniformemente distribuídos e não
formam um padrão hierárquico de organização, como também são muito permeáveis ao
plasma e suas proteínas (BROWN et al. 1992; NAGY et al., 2002; DVORAK et al., 2003;
BYRNE et al., 2005; DVORAK, 2005).
Prevenir ou reverter a angiogênese é uma abordagem que ajuda no combate ao
câncer (BERGENS & BENJAMIN, 2003) e doenças inflamatórias, pois a angiogênese é
um componente crítico destas doenças, e induzir a angiogênese através da administração de
fatores angiogênicos exógenos é uma terapia em potencial para o reparo de tecidos
isquêmicos ou lesados (BENJAMIN, 2000; KESHET, 2003).
A angiogênese está sujeita a um complexo sistema de controle com fatores
angiogênicos e antiangiogênicos. Dentre os fatores antiangiogênicos estão os pericitos,
vários componentes da matriz extracelular e moléculas anti-angiogênicas (trombospondina,
fator plaquetário 4, endostatina, angiostatina). Entre as moléculas pró-angiogênicas estão o
fator de crescimento fibroblástico (FGF-1e-2), fator de crescimento derivado de hepatócito
(HGF), fator de crescimento derivado de plaquetas (PDGF), angiopoetinas (Ang-1 e -2),
30
fator de crescimento transformante (TGF) α e β, IL-8, VEGF, leptina, prostaglandinas,
vários lipídios, etc. (FOLKMAN & KLAGSBRUN, 1987; FOLKMAN & DÁMORE,
1996; CARMELIET & COLLEN, 1997; CARMELIET, 2000; YANCOPOULOS et al.,
2000). Algumas destas moléculas exemplos (TGF) α, (HGF), (FGF-2), agem pelo menos
em parte regulando a expressão de VEGF (DVORAK, 2003). A injúria, hipóxia,
quimiocinas e células inflamatórias também atuam como fatores pró-angiogênicos
(DÁMORE & THOMSON, 1987; BERNARDINI et al. 2003).
1.3.1-Indutores da Angiogênese
Os fatores angiogênicos são representados, principalmente, por polipeptídeos que
induzem uma ou mais etapas do processo angiogênico, interagindo com receptores
específicos nas células endoteliais e/ou recrutando e ativando células, tais como macrófagos
e leucócitos, que possuem a capacidade de produzir fatores angiogênicos (BERNARDINI
et al., 2003).
A identificação de fatores de crescimento e citocinas com propriedades
angiogênicas têm criado oportunidade para novas terapias no tratamento de uma variedade
de doenças angiogênese dependentes (GROSSMAN & GROSSMAN, 2002).
Fator de crescimento endothelial vascular (VEGF)
O VEGF é uma proteína purificada em 1983 por Senger et al. e, posteriormente, por
Ferrara & Henzel e Plouet et al. em 1989, é uma glicoproteína homodimérica de 40–45 kDa
31
altamente glicosilada (tem 30% de homologia com o PDGF). Como um tipo de citocina
multifuncional, o VEGF está entre os moduladores mais potentes da angiogênese e
vasculogênese em condições fisiológicas e patológicas (DVORAK et al., 1995) . O VEGF
também regula o crescimento e a manutenção vascular durante a embriogênese e em
adultos (YLA-HERTTUALA, 2006). A síntese e secreção do VEGF estimulam
diretamente a proliferação das CE in vitro e angiogênese in vivo (KLAGSBRUN &
MOSES, 1999), com grande afinidade por seus sítios de ligação, os receptores de células
endoteliais flk-1 e flt-1 (LEUNG et al., 1989; DE VRIES et al., 1992).
O gene que codifica o VEGF está localizado na região cromossomal 6p21.1, e as
regiões codificadoras da proteína estão organizadas em oito exons. (ROBINSON &
STRINGER, 2001; NAKAMURA et al., 2002) . As isoformas do VEGF diferem em seus
padrões de expressão, propriedades bioquímicas e biológicas (ROBINSON & STRINGER,
2001) .
Como um importante mitógeno e um fator protetor para as células vasculares, o
VEGF pode estimular e induzir a migração, proliferação, o aumento da permeabilidade
vascular e trombogenicidade (ROBINSON & STRINGER, 2001; NAKAMURA et al.,
2002) . Pode também estimular a expressão dos inibidores do plasminogênio (PA-I),
osteopontina e a integrina α
v
β
3
através do qual a osteopontina se liga resultando a migração
das células endoteliais in vitro (SENGER et al., 1996). A transcrição de seu mRNA pode
ser induzida pela secreção de diferentes fatores de crescimento e citocinas, incluindo,
PDGF, EGF, TNF-α, TGF-β e IL-1 (ENHOLM et al., 1997; AKAGI et al., 1999;
VEIKKOLA & ALITALO, 1999). Os níveis de VEGF liberados são regulados,
principalmente, pela tensão de oxigênio no tecido. Condições geradoras de hipóxia
32
induzem, rapidamente, um aumento da produção e secreção de VEGF local (FERRARA &
ALITALO, 1999).
A família do VEGF tem vários hormônios de crescimento que são naturalmente
produzidos por diversos tipos celulares incluindo células tumorais, macrófagos, células T,
células musculares lisas, astrócitos e osteoblastos em humanos (FERRARA et al., 1992) .
Estes hormônios são específicos e críticos para as células endoteliais derivadas dos vasos
sanguíneos induzirem o início do crescimento de finas arteríolas, chamadas colaterais, onde
o fluxo sanguíneo é limitado (GRIFFIN et al., 2002) .
Todas as isoformas de VEGF incluindo VEGF-A, VEGF-B (OLOFSSON et al.,
1996) , VEGF-C (JOUKOV et al., 1996) , VEGF-D (YAMADA et al., 1997) , VEGF-E
(LYTTLE et al., 1994) e fator de crescimento placentário (PLGF) (SAARISTO et al.,
2000; LIEKENS et al., 2001) , produzem seus efeitos nas células alvo através de dois
receptores de superfície, que são o receptor-1 de VEGF (VEGFR-1) ou c-fms-like tirosina
kinase (Flk) (VEGFR-1/Flt-1) (SHIBUYA et al., 1990; PETERS et al., 1993) e o receptor-
2 VEGF (VEGFR-2/KDR/Flk-1) ou o domínio kinase inserido (KDR) (MATTHEWS et
al., 1991) . Juntamente com o terceiro membro VEGFR-3, estes receptores formam uma
subfamília na superfamília dos receptores de imunoglobulinas que possuem uma estrutura
comum, apresentando oito domínios de imunoglobulinas extracelulares e um domínio
intracelular de tirosina kinase conservado (ROBINSON & STRINGER, 2001; HOEBEN et
al., 2004).
O VEGF é detectado no ovário durante a formação do corpo lúteo (FERRARA et
al., 1998), no útero durante proliferação endometrial e no sítio de implantação do
endométrio. Elevados valores de VEGF são detectados durante a fase proliferativa de
processos de cicatrização de feridas (NISSEN et al., 1998). O VEGF é igualmente
33
detectável em áreas onde as células endoteliais permanecem quiescentes, tais como pulmão,
coração e cérebro, sugerindo que esta citocina possui papel de fator de sobrevivência nestes
tecidos (VEIKKOLA & ALITALO, 1999; LIEKENS et al., 2001).
O VEGF provou ser o fator angiogênico mais importante identificado até hoje
(YIN-SHAN et al., 2006).
Fator de necrose tumoral-α (TNF- α)
O TNF-α, um polipeptídio de cadeia simples de 17 kDa, derivado de fagócitos
mononucleares, linfócitos, neutrófilos, células endoteliais, mastócitos e algumas células
tumorais (TNF-α) (SHERRY & CERAMI, 1988; BORISH & STEINKE, 2003),
juntamente com outros fatores de crescimento como FGF-2 e TGF-β. TNF-α é quimiotático
para macrófagos e neutrófilos, induzem a produção e secreção de FGF-2 pelas células
endoteliais (BEUTLER & CERAMI, 1986) , e estimula a proliferação de fibroblastos
(TRACEY et al., 1989). Quando administrado subcutaneamente em camundongos induz a
formação de tecido de granulação (PIGUET et al., 1990). O TNF- α atua no remodelamento
tecidual modulando a degradação da MEC pelos fibroblastos (ITA et al., 1990), a migração
celular no gel de colágeno (STRIETER, 1995) e a produção de colagenase (DAYER et al.,
1985).
O TNF é um dos principais mediadores das reações inflamatórias, imunológicas,
fisiológicas (FIERS, 1991) e também um potente ativador de neutrófilos, mediando a
aderência, quimiotaxia, degranulação e a explosão respiratória (SEDGWICK et al., 2000;
34
BORISH & STEINKE, 2003). Ele ativa as células endoteliais e tem um papel importante
nas interações entre a célula endoteliais e monócitos (GRELL et al., 1995).
O TNF-α aumenta a expressão de VEGF e dos receptores destas citocinas
nas células endoteliais (BALKWILL & MANTOVANI, 2001) além disso é mediador de
apoptose e sobrevivência em vários tipos celulares incluindo as células endoteliais
(PEIRETTI et al., 2005).
Fator de crescimento transformante-
β
(TGF-
β
)
O TGF-β, um polipeptídio homodímero 25kDa ligação disulfeto (composto de 50
aminoácidos), foi originalmente encontrado em uma linhagem celular fibroblástica. Os
TGF-βs formam uma grande superfamília incluindo inibina, ativina, e substâncias
inibidoras “mullerianas” (BELLON et al., 1993; ARTHUR et al., 2000; BELLONE et al.,
2001), que podem iniciar a proliferação e diferenciação de vários tipos celulares
(PEHLIVAN et al., 2001) . O polipeptídio é secretado como um grande precursor e a
quebra da região C-terminal resulta na liberação de dímeros maduros bioativos. Altos
níveis de TGF-βs são encontrados em plaquetas, linfócitos T e macrófagos, e controla as
funções dos fibroblastos (ROBERTS & SPORN, 1993) atuando na deposição da matriz
extracelular (ROBERTS, et al., 1992). O TGF-β aumenta a transcrição dos genes para
colágeno, proteoglicanos e fibronectina aumentando a produção da MEC ao mesmo tempo
em que diminui a secreção de proteases responsáveis pela degradação da matriz e estimula
o fator inibidor de metaloproteinases (TIMP) (HALL et al., 2003), sugerindo seu
envolvimento no reparo tecidual. As respostas celulares aos TGFβs dependem do tipo
35
celular e do ambiente. Os TGF-βs possuem várias atividades in vivo e in vitro. Estas
moléculas são potentes quimiotáticos para macrófagos e fibroblastos e postula-se que eles
estimulam a liberação de peptídeos angiogênicos como FGF-2, PDGF e TNF-α in vivo. Em
cultura de monocamada, a proliferação das células endoteliais é inibida pela adição de
TGF-β, enquanto que em gel de colágeno 3D, a adição de TGF-β induziu uma rápida
formação tubular (SANKAR et al., 1996) .
Em mamíferos os três principais TGF-βs (TGF-β1, TGF-β2 e TGF-β3) foram
identificados como citocinas multifuncionais com estruturas e funções similares que
regulam a proliferação, diferenciação, produção de matriz extracelular (VERRECCHIA &
MAUVIEL, 2002a) interagindo com proteínas ligantes específicas que funcionam através
da marcação de sítios específicos para ativação do TGF-β. A ligação do TGF-β com o seu
receptor ativa uma serina/tirosina kinase a qual emite um sinal intracelular (WRANA et al.,
1992) . Os TGF-βs ativados iniciam uma resposta celular através da ligação aos receptores
de superfície celular, que foram identificados como: receptores do tipo I (53kDa), do tipo II
(65kDa) e do tipo III (MOSES & SERRA, 1996) .
O TGF-β1 reduz a proliferação do trofoblasto, promove a diferenciação pela
indução da formação sincicial e inibe a invasão através da indução da expressão de
inibidores teciduais de metaloproteinases in vitro (GRAHAM & LALA, 1991;
HAYASHIDA & SCHNAPER, 2004) . Ele pode inibir a proliferação das células
endoteliais em aproximadamente 80% em uma placa de cultura em monocamada, enquanto
em gel 3D estimula a formação rápida de túbulos capilares e depósito de colágeno tipo V ao
longo da superfície basal das estruturas para estabilizá-las (MERWIN et al., 1990) . TGF-β
pode também regular os efeitos do VEGF in vitro, dependendo de sua concentração. Por
36
exemplo, altas concentrações de TGF-β podem inibir o receptor Flk do VEGF e a
angiogênese induzida por VEGF in vitro (MANDRIOTA et al., 1996) . O TGF-β1 pode
diminuir a expressão da subunidade da integrina α que interage com a fibronectina (FN),
colágeno e laminina reduzindo a expressão das subunidades da β integrina na superfície
celular, controlando as interações células-matriz (FRANK et al., 1996) . A presença de
quantidades excessivas de HA durante o desenvolvimento fetal neutraliza o efeito de ambas
as isoformas TGF-β1 e TGF-β2, enquanto aumenta os níveis de TGF-β3, reduzindo a
cicatriz e a resposta inflamatória (CABRERA et al., 1995) . Estudos mostram que aumentos
nos níveis de TGF-β3 e não de TGF-β1 estão associados com metástase em pacientes com
carcinoma de mama (GHELLAL et al., 2000; LI et al., 2000a; LI et al., 2001).
1.4- Modelo de implantação de esponjas para o estudo da Angiogênese
inflamatória
O modelo consiste na implantação de matrizes esponjosas inicialmente acelulares
no tecido subcutâneo de camundongos. A matriz implantada induz uma reação inflamatória
tipo corpo estranho, com a formação de tecido de granulação rico em novos vasos
sanguíneos representando um sistema que tem se mostrado apropriado para o estudo da
angiogênese inflamatória (GRINDLAY & WAUGH, 1951; ANDRADE et al.,1987.).
Assim, processos naturais como a vascularização de feridas em cicatrização podem ser
mimetizados utilizando-se este modelo. Outros fatores como desnutrição, doenças
inflamatórias sistêmicas, diabetes, tumores já mostraram afetar o processo de reparo neste e
37
em outros modelos (ANDRADE et al., 1997; TEIXEIRA et al., 1999; BRADSHAW et al.,
2001; FERREIRA et al., 2004; BELO et al., 2005; CAMPOS et al., 2006).
Além disso, o modelo permite o estudo temporal do infiltrado inflamatório, a
análise bioquímica dos fluidos coletados, os efeitos de drogas sobre o processo, além de
estudos histológicos e morfométricos (ANDRADE et al., 1987; BAILEY, 1988;
BARCELOS et al.,2004; JAIN et al.,1997). Utilizando-se esta abordagem metodológica
tem sido possível caracterizar vários componentes envolvidos na neoformação vascular
bem como sua associação com eventos inflamatórios (recrutamento e ativação de
leucócitos).
A avaliação do desenvolvimento de estruturas vasculares na esponja pode ser feita a
partir da estimativa do desenvolvimento do fluxo sanguíneo utilizando-se marcador
radioativo (ANDRADE et al., 1987) ou fluorescente (ANDRADE et al., 1987) ou a partir
da dosagem do conteúdo de hemoglobina (índice indireto de vascularização) (PLUNKETT
& HAILEY et al., 1990). A analise histológica associada a estudos imunohistoquímicos e
morfométricos apresenta-se, também, como aliada importante para a avaliação da
angiogênese. Além disso, pode-se determinar a funcionalidade das estruturas vasculares
neoformadas através de parâmetros que avaliam a reatividade dos vasos (ANDRADE et al.,
1992).
1.5- Modelos animais de doenças autoimunes
Modelos animais têm se mostrado a melhor maneira para estudar os mecanismos
das doenças em geral. Começando no início do século vinte no laboratório de Jackson (Bar
Harbor, Maine, United States) foram criadas linhagens cruzadas de coleções de animais
38
geneticamente idênticos obtidos através de cruzamentos selecionados. Estas linhagens têm
provido grupos experimentais homogêneos, nos quais a variabilidade inter-individual é
reduzida a fatores ambientais. Além disso, estas linhagens cruzadas apresentam uma
variedade de fenótipos distintos que tem sido explorados como modelos de doenças
humanas. Interessantemente, a porcentagem de genes de camundongos sem qualquer
homologia detectável (e vice-versa) foi estimada em menos que 1% fato que fortalece a
validade dos modelos de camundongos para doenças humanas (MOREL, 2004).
A maioria das doenças auto-imunes apresenta manifestações clínicas extremamente
heterogêneas, e modelos animais representam versões simplificadas. Apesar dos modelos
animais fornecerem uma abordagem reducionista devido à representação parcial da
complexidade biologia humana real, o fato é vantajoso para o estudo de mecanismos
alterações teciduais (MESTAS & HUGHES, 2004).
Modelos animais apropriados frequentemente ajudam a esclarecer a etiologia e a
patogenia das doenças autoimunes, embora nenhum animal seja um modelo perfeito que
mimetize a doença humana. Existem muitas linhagens cruzadas de animais que
desenvolvem sinais característicos do Lúpus espontaneamente, incluindo New Zealand
Black (NZB), geração F1 da NZB X New Zealand White (NZW) (B/W F1), MRL/Mp–
lpr/lpr, (MRL/lpr), e camundongos BXSB, os quais provem informações sobre os
antecedentes genéticos e traços autoimunes relacionados (THEOFILOPOULOS &
DIXON,1985). Camundongos machos das linhagens MRL/I e BXSB desenvolvem uma
doença semelhante ao Lúpus Eritematoso Sistêmico (SLE), mas mais aguda do que a
linhagem de camundongos NZB × W (ANDREWS et al., 1978).
39
Em camundongos (MRL/+) que manifestam características do Lúpus Eritematoso
Sistêmico uma doença multifenotípica com manifestações inflamatórias em vários órgãos e
tecidos (pele, articulações, rins), o reparo tecidual é acelerado, indicando que este processo
é controlado/modulado pela resposta imune. (CLARK et al., 1998; KENCH et al., 1999;
HEBER-KATZ et al., 2004; LEFEROVICH et al., 2001; UENO et al., 2005).
As linhagens de camundongos New Zealand (NZ) também representam um modelo de
Lúpus Eritematoso Sistêmico (LES). Quando os animais NZW são cruzados com várias
outras linhagens (NZB, BXSB, B6.Sle1, B6.Yaa) a geração híbrida F1 desenvolve uma
severa glomerulonefrite lúpica, doenças vasculares coronárias, níveis teciduais alterados de
fatores angiogênicos (VEGF, TNF-α), anticorpos contra enzimas inflamatórias
(mieloperoxidase) e mortalidade acelerada (RUDOFSKY & LAWRENCE., 1999; MOREL
et al., 1997; FUJIMURA et al., 1998). Os camundongos NZW são clinicamente saudáveis,
entretanto apresentam alterações sub-clínicas do LES como nefrite, aumento da
susceptibilidade a agentes do ambiente (RUDOFSKY & LAWRENCE, 1999) e lesões
orgânicas mediadas imunologicamente (XIE et al., 2003). Além disso, estes animais
apresentam deficiência na peroxidase eosinofílica (EPO) (OHMORI et al., 1996;
VASQUEZ-PINTO et al., 2007), resposta inflamatória anormal a insultos intraperitoneais
(POTTER et al., 2003), níveis alterados de fatores pró-angiogênicos e pró-fibrogênicas
(VASQUEZ-PINTO et al., 2007; SOUZA-FERNANDES et al., 2006).
Não encontramos na literatura qualquer estudo sobre o processo de reparo tecidual em
modelo murino susceptível ao Lúpus Eritematoso Sistêmico como os camundongos NZW
(New Zealand White). Assim em vista da susceptibilidade dos camundongos NZW
desenvolverem processos inflamatórios crônicos, da associação entre angiogênese e
40
inflamação e dos níveis alterados de moléculas pró-inflamatórias/angiogênicas nos tecidos,
propusemos investigar a cinética do processo de reparo nestes animais. Para isto utilizamos
o modelo de implante de esponja comparativamente a outra linhagem não susceptível à
doença. As diferentes linhagens de camundongos foram monitoradas sistemicamente para
marcadores inflamatórios (enzimas e citocinas) e localmente (intra-implante) para
angiogênese inflamatória e resposta fibrogênica.
41
2- OBJETIVOS
2.1- Objetivo geral
Caracterizar a cinética do processo de reparo tecidual em camundongos susceptíveis ao
lúpus utilizando-se o modelo de implante de esponja.
2.2- Objetivos específicos
• Caracterizar os níveis de marcadores inflamatórios (MPO, NAG) e angiogênicos
(VEGF, TNF-α, TGF-β) em camundongos das linhagens NZW e Balb/c.
• Caracterizar a cinética da inflamação, da angiogênese e da fibrogênese em
implantes subcutâneos nestes animais utilizando-se parâmetros bioquímicos e
morfométricos
• Estabelecer no tecido fibrovascular aspectos diferenciais entre Apoptose, AgNOR e
número de mastócitos nestas linhagens
42
2- OBJETIVOS
2.1- Objetivo geral
Caracterizar a cinética do processo de reparo tecidual em camundongos susceptíveis ao
lúpus utilizando-se o modelo de implante de esponja.
2.2- Objetivos específicos
• Caracterizar os níveis de marcadores inflamatórios (MPO, NAG) e angiogênicos
(VEGF, TNF-α, TGF-β) em camundongos das linhagens NZW e Balb/c.
• Caracterizar a cinética da inflamação, da angiogênese e da fibrogênese em
implantes subcutâneos nestes animais utilizando-se parâmetros bioquímicos e
morfométricos
• Estabelecer no tecido fibrovascular aspectos diferenciais entre Apoptose, AgNOR e
número de mastócitos nestas linhagens
43
3- MATERIAIS E MÉTODOS
3.1- Animais utilizados
Foram utilizados camundongos Balb/c machos, pesando aproximadamente 30
gramas, provenientes do Centro de Bioterismo (CEBIO) do Instituto de Ciências
Biológicas da Universidade Federal de Minas Gerais e animais NZW (New Zealand White)
machos do Centro de Bioterismo da Universidade Federal de São Paulo.
3.2- Técnica de implantação
3.2.1- Implantes de esponjas
Previamente confeccionados discos de esponjas de poliéster com 1.2cm de diâmetro
(Vitafoam Ltd Manchester) foram conservados em álcool 70% v/v durante 24 horas
anteriores à implantação e, posteriormente, fervidos em água destilada por 30 minutos
(ANDRADE et al., 1987).
3.2.2-Técnica de implantação em camundongos
Para o procedimento cirúrgico, os animais foram anestesiados com
Ketamina/Xilazina (10µl/g de peso corporal) (Sigma) 2,5% (i.p.), 1mL/100g e submetidos à
tricotomia e à assepsia da região dorsal. Em seguida, foi feita uma incisão de
aproximadamente 1cm na pele e, após delicada divulsão do tecido subcutâneo o disco de
esponja foi introduzido. Finalmente, a incisão dorsal foi suturada com fio inabsorvível.
Após a cirurgia, os animais foram mantidos sob aquecimento artificial até completo
44
restabelecimento de suas funções vitais. Após a recuperação da anestesia, os animais foram
colocados em gaiolas individuais com água e ração “ad libitum” (ANDRADE et. al 1987).
3.3- Remoção dos implantes
Em intervalos de tempos pré-determinados (07, 10, 14 e 21) dias pós-implantação
grupos de animais Blab/c e NZW foram anestesiados para coleta do sangue via plexo
braquial. Num segundo momento foi administrada uma “overdose” de anestésico para o
sacrifício do animal e retirada dos implantes. Estes foram removidos, pesados e
processados para estudos bioquímicos e histológicos.
Além dos implantes o soro dos animais também foi coletado para dosagens bioquimicas.
3.4-Dosagem de hemoglobina
A dosagem do conteúdo de hemoglobina intraimplante quantifica indiretamente a
neovascularização presente nos tecidos e tem sido utilizada como índice de vascularização
em modelos de angiogênese. Esta técnica utiliza o método do reagente de Drabkin
desenvolvido em 1932 e adaptado como índice de vascularização (PLUNKETT et al,.
1990; PASSANITI et. al., 1992; HU et al. 1995; FERREIRA et al., 2004; BELO et al.,
2005).
Os implantes foram homogeneizados (Tekmar TR-10, Ohio, USA) em 2,0 mL de
um reagente cromogênico específico para hemoglobina (Reagente de Drabkin- Kit de
Dosagem, de Hemoglobina Labtest). As amostras foram centrifugadas por 30 minutos a
15000 rpm e os homogenatos filtrados em membranas GV de 0,22µm (Millipore).
Posteriormente, as amostras eram colocadas em placas de 96 poços e a leitura
45
espectrofotométrica em comprimento de onda de 540nm realizada em Leitor de Elisa. A
concentração de hemoglobina de cada amostra foi calculada a partir de uma curva padrão
conhecida e os resultados expressos em concentração de hemoglobina (microgramas- µg)
por miligrama-mg de peso úmido de implante.
3.5- Avaliação da atividade da mieloperoxidase (MPO)
O acúmulo de neutrófilos é uma característica marcante do processo inflamatório e,
junto com os macrófagos, eles constituem as primeiras linhagens celulares presentes nos
sítios de injúria. Em 1982, BRADLEY et. al., desenvolveram um ensaio enzimático para a
detecção do acúmulo de neutrófilos, utilizando a enzima mieloperoxidase como marcador
quantitativo de neutrófilos.
Esta técnica foi adaptada para o modelo de implante de esponja (BAILEY, 1988;
FERREIRA et al., 2004; BELO et al., 2005).
Após a dosagem de hemoglobina, o sobrenadante foi desprezado e uma parte do
sedimento foi pesado, homogeneizado, ressuspendido em 2,0mL de tampão fosfato, pH 4,7
(0,1 M NaCl, 0,02 M Na
3
PO
4
, 0,015 M de NaEDTA) e centrifugado a 12,000 x G durante
20 min. Foram retirados 300µl do sobrenadante e adicionados 600µl de tampão de fosfato
de sódio 0.05 M (pH 5,4) contendo 0,5% de hexa-1,6-bisdecyltrimethylammonium bromide
(HTAB, Sigma). Esta mistura foi novamente centrifugada a 10,000x G durante 10 min. A
atividade da enzima MPO no sobrenadante resultante foi mensurada pela mistura de 100 µl
de tetrametibenzidina (TMB, Sigma), preparado em dimetil sulfoxido (DMSO, Merck) em
uma concentração de 1,6 mM, e 100µl do substrato H
2
O
2
na concentração 0,3mM,
dissolvida em tampão fosfato (pH 5,4). A reação foi paralisada com a adição de 100µl de
46
H
2
SO
4
e quantificada colorimetricamente à 450 nm em leitor de microplaca (Termoplate).
Os resultados foram expressos como densidade óptica (OD) por g de tecido úmido
(implante).
3.6- Avaliação da atividade de N- acetilglicosaminidase (NAG)
A enzima lisossômica N-acetil-β-glucosaminidase se encontra presente em
macrófagos ativados (BAILEY, 1988). Parte do sedimento remanescente após a dosagem
de Hb era pesado e utilizado para este ensaio visando detectar os níveis dessa enzima. Os
sedimentos foram homogeneizados em uma solução de NaCl (0,9% wv-1) contendo 0,1%v
v-1 Triton X-100 (Promega) e centrifugado (3000 x g; 10min 4° C). Amostras do
sobrenadante resultante (100µl) foram incubadas por 10 min com 100µl p-nitropenyl-N-
acetyl-β-glucosaminide (Sigma), preparado em tampão de citrato/fosfato (pH 4,5) em uma
concentração final de 2.24 mM. A reação foi paralisada pela adição de 100µl 0,2 M tampão
glicina pH 10.6.
Para realização do ensaio, adicionou-se 100µL das amostras em duplicata a uma
placa de 96 poços. Às amostras, foram adicionados 100µL do substrato (p-nitrofenil-N-
acetil-β-D-glicosaminida) (Sigma), diluído em tampão citrato/fosfato pH = 4,5. Seguiu-se
uma incubação a 37º C durante 30 minutos. Por último, foram adicionados 100µL de
tampão glicina 0,2M, pH = 10,6. A absorbância foi medida por leitor de microplaca
(Termoplate) em comprimento de onda de 400 nm. A hidrólise do substrato foi determinada
pela mensuração da absorção em 405 nm e a atividade enzimática expressa como densidade
óptica (OD) por grama de tecido úmido (implante).
47
3.7- Quantificação das citocinas (VEGF, TNF-α, TGF-β1) intraimplantes e no soro
sanguíneo
Para a determinação destas citocinas nos implantes foram utilizados 80 µl do
sobrenadante restante da dosagem de Hemoglobina e para a dosagem dos níveis sistêmicos
foram utilizados 80 µl do soro das duas linhagens de animais.
O ensaio enzimático foi realizado seguindo-se os passos do protocolo padronizado
pelo fornecedor do Kit Duoset (R&D Systems).
Diluições de sobrenadantes livres de células foram adicionadas em duplicada a
placa de ELISA que tinham um anticorpo monoclonal específico para camundongo contra a
citocina., seguido da adição um segundo anticorpo de detecção. Após lavagem para
remover anticorpos que não se ligaram, uma solução de substrato foi adicionada a placa de
ELISA (50µL de uma 1:1 solução de peróxido de hidrogênio e 10mg/ml de OPD). A reação
foi paralisada após 20 min de incubação com 2N de ácido sulfúrico (50 µL) e a intensidade
da cor foi quantifificada a 540 nm em leitor de microplaca (Thermoplate). Os padrões
foram diluições das citocinas recombinantes de camundongos de 7.5 pg a 1000 pg ml (100
µl). Os resultados foram expressos como pg de citocina por mg de peso úmido ou ml de
soro.
3.8- Quantificação do colágeno
A quantidade de colágeno solúvel total (tipos I-V) foi determinada
colorimetricamente baseada na reação do picrossirius red. Esta técnica foi desenvolvida
como um método de ligação ao [GLY-X-Y]n das seqüências de tripla hélices de todos os
48
colágenos nativos. Sucintamente, as amostras de esponja foram homogeneizadas com
tampão (1mL Triton X, pH 7.8). Depois da homogenização os debris foram removidos
pela centrifugação. Cinqüenta µl do reagente picrossirius red foram adicionados a 100 µl da
amostra. Após 30 min de incubação em temperatura ambiente o complexo colágeno-
picrosirius red foi separado por centrifugação a 10000 x g durante 10 minutos. Os
sobrenadantes foram descartados e o sedimento lavado com 500 µl de etanol (99% puro e
livre de methanol) e o complexo colágeno-corante foi reconstituído em 1 mL de reagente
alcalino (NaOH 0,5M). A absorbância foi quantificada a 540nm em um leitor de
microplacas (Thermoplate). A quantidade de colágeno em cada amostra foi determinada
através da comparação de uma curva padrão utilizando padrão de gelatina (Merck) e os
resultados expressos em µg de colágeno por mg de implante.
3.9-- Dosagem de glicosaminoglicanos
O conteúdo de glicosaminoglicanos (sulfato de condroitina) nas esponjas pode ser
considerado como mais um parâmetro de avaliação da matriz extracelular.
Imediatamente após a coleta, a esponja foi colocada em papel alumínio e pesada,
obtendo-se assim, seu peso úmido. A esponja foi cortada com tesoura e homogeneizada
com 1000µl de PBS. A esponja foi desprezada e o restante levado à centrifugação a 4°C e
16000g durante 10 minutos. O sobrenadante foi recolhido e congelado a -20°C.
O sobrenadante descongelado á temperatura ambiente foi utilizado para a dosagem
de glicosaminoglicanos na esponja através do método descrito por FARNDALE et al.
(1982) utilizando-se como padrão sulfato de condroitina preparado em água destilada.
49
Para realização do ensaio, as amostras (200µl) foram inicialmente digeridas em 1ml
de tampão digestivo (contendo 20µl da solução de papaína) durante 45 minutos a 65°C em
banho maria. A digestão foi interrompida através de resfriamento. Após digestão, em 200µl
do material digerido ou do padrão foram acrescentados 2,0ml da solução de DMB e a
absorbância foi lida imediatamente a 535nm no leitor de ELISA. As concentrações de
glicosaminoglicanos foram expressas em µg de glicosaminoglicanos/mg de esponja (peso
úmido).
3.10- Avaliaçâo histológica
Os implantes (4 a 6 para cada intervalo de tempo) foram fixados em formol
tamponado neutro a 10% por no mínimo 48 horas e processados rotineiramente para
inclusão em parafina. As secções de 5µm obtidas foram coradas em diferentes métodos:
hematoxilina-eosina (HE) para quantificação da área fibrovascular e número de vasos, Azul
de Dominici (para identificação de mastócitos), AgNOR (Impregnação pela prata para
identificação e quantificação das regiões organizadoras de nucléolos), Picrosirius (para
evidenciação histológica e morfometria do processo de colagenização) (LUNA, 1968) e
reação de TUNEL (para detecção in situ da fragmentação do genoma, na apoptose)
(GAVRIELI et al., 1992).
3.10.1- Parâmetros e estratégia morfométrica
De cada uma das lâminas estudadas, analisou-se o padrão de infiltração do tecido
fibrovascular, o número de vasos, o número de mastócitos, a expressão das AgNORs como
marcador de ativação e proliferação celular e, por fim, a identificação in situ da
50
fragmentação do genoma como marcador de apoptose (Reação de TUNEL). Em cada
campo microscópico estudado, a abordagem citomorfométrica utilizada referiu-se à
porcentagem de células marcadas (conforme o tipo celular ou a marcação) em relação às
células totais. Além disto, em cada campo microscópico quantificou-se o número e área de
vasos e obteve-se também a área média destes.
A quantificação das células marcadas (AgNORs e TUNEL) de cada campo foi feita
a partir de imagens digitalizadas obtidas de amostras dos campos histológicos em
microscópio de luz com objetiva de 100 vezes. A quantificação do número e área de vasos,
assim como a da área ocupada por colágeno em cada campo foi feita a partir de imagens
digitalizadas obtidas dos campos histológicos em microscópio de luz com objetiva de 10
vezes.
O número mínimo representativo de campos microscópicos para a quantificação da
marcação (AgNORs e TUNEL), do número de vasos e número de mastócitos foi
determinado a partir da contagem inicial em 50 a 100 campos tomados aleatoriamente de
uma secção de esponja (MORO et al., 2004). Desses, formaram-se 10 subamostras com
número crescente de campos (5, 10, 15... até 50) retirados aleatoriamente com reposição.
De cada grupo, calculou-se a média aritmética e respectivo Desvio Padrão (DP) para cada
tamanho amostral. À medida que o tamanho da amostra aumenta, os DPs tendem a diminuir
até se estabilizar. Assim, quando o incremento do número de campos não resulta em
redução considerável no valor do desvio padrão considera-se que o tamanho daquela
amostra como mínimo representativo (SAMPAIO, 1998) (FIG 3). As imagens foram
digitalizadas em microcamera (JVC TK-1270/JGB) e transferidas para o analisador de
imagens (Kontron Elektronics, Carl Zeiss - KS300 versão 2.0) (CALIARI, 1997).
51
Número mínimo de campos Vasos
0
0,05
0,1
0,15
5 10 15 20 25 30 35 40 50
Número de campos
Desvio Padrão
FIGURA 3- Número mínimo representativo de campos para a quantificação de
vasos.
3.10.1.1- Ativação e proliferação celular
Vinte imagens (obtidas de 20 campos distintos) com ampliação final de 1000X
(correspondendo a uma área de 8.533,37 µm
2
/campo) foram digitalizadas de cada uma das
lâminas coradas pela técnica de AgNOR de 5 animais nos períodos de 10 e 21 dias.
Quantificaram-se as AgNORs presentes em cada núcleo de cada célula presente no campo
histológico.
3.10.1.2- Identificação e quantificação da apoptose
Utilizou-se a técnica de TUNEL para marcar as células em apoptose e a
morfometria para a quantificação das mesmas, considerando-se ainda a morfologia
sugestiva de apoptose (VASCONCELOS, 2001). Os corpos apoptóticos quando inúmeros e
próximos uns dos outros foram quantificados como o resultado de uma única célula em
52
apoptose. Quando distantes entre si, foram considerados como resultado de apoptose em
células diferentes e contabilizados como tal.
A técnica de TUNEL para a marcação “in situ” da fragmentação do genoma
combina princípios histoquímicos e imuno-histoquímicos e é aplicada em corte de tecido
embebido em parafina identificando células apoptóticas. Requer o uso de uma enzima
exógena, a transferase terminal de deoxinucleotídeo (TdT) que incorpora um nucleotídeo
marcado na extremidade 3’0H do genoma em fragmentação. Os nucleotídeos marcados
inseridos são posteriormente identificados como grumos GAVRIELI et al., 1992
amarronzados a partir da reação da diaminobenzidina (DAB) com a Peroxidase (POD).
Utilizou-se o kit da Oncogene (TdT –FragEL
TM
) DNA Fragmentation Detection Kit.
Cinqüenta imagens (obtidas de 50 campos distintos) com ampliação final de 1000X
(correspondendo a uma área de 8.533,37 µm
2
/campo) foram digitalizadas de cada uma das
lâminas coradas pela técnica de TUNEL de de 5 animais nos períodos de 10 e 21 dias.
Quantificaram-se as células marcadas pela reação e com morfologia sugestiva presentes em
cada campo. O parâmetro morfométrico utilizado - o índice de marcação de apoptose (IA) -
referiu-se à proporção de células em apoptose em relação ao número total de células por
campo microscópico.
3.11- ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram apresentados como média ± erro padrão, conforme tenham tido
uma distribuição normal ou não, pelo teste de Kolmogorov-Smirnov. Quando a distribuição
foi normal utilizou-se a análise de variância (ANOVA) para avaliar eventuais diferenças
53
entre os parâmetros mensurados nos diferentes tempos de implante e aplicou-se o teste de
Newnam Keuls para comparar os grupos entre si. Os valores de P<0,05 foram considerados
significativos, utilizando-se o programa GraphPad Prism 3.0.
54
4-RESULTADOS
A implantação da matriz sintética nas duas linhagens de animais foi bem tolerada
não havendo sinais de infecção ou rejeição durante o período experimental estudado (7 – 21
dias). Também não foram observadas manifestações do lúpus na linhagem NZW.
4.1- Avaliação de marcadores inflamatórios sistêmicos dos animais antes e após a
implantação da matriz esponjosa.
Os níveis basais da atividade de MPO (um marcador para neutrófilos ativados) no
soro dos animais antes da implantação foram significativamente menores nos animais da
linhagem NZW quando comparados com os animais Balb/c (0,146±0,03; 0,259±0,02) (FIG
4A e B). Entretanto 10 dias após a implantação, a atividade de MPO aumentou nos dois
grupos, duas vezes no NZW e cerca de quatro vezes nos Balb/c(0,454±0,03; 0,926±0,14).
Os níveis circulantes da atividade de NAG (um marcador para monócitos/macrófagos)
mostraram-se similares nas duas linhagens e não se alteraram após a implantação da
esponja. (FIG.4 C e D).
55
NZW Pós implantação
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
*
#
#
Atividade MPO (OD/ml soro)
Balb/c Pós implantação
0.00
0.25
0.50
0.75
1.00
1.25
*
Atividade MPO (OD/ml soro)
NZW Pós implantação
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Atividade NAG (OD/ml soro)
Balb/c Pós implantação
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
Atividade NAG (OD/ml soro)
FIGURA 4- Níveis sistêmicos de marcadores inflamatórios em NZW e Balb/c antes e após
a implantação (10 dias). Em A e B, o nível basal da atividade da enzima MPO foi menor
nos animais lúpus-prone quando comparados os animais Balb/c. Após o estímulo
inflamatório os níveis da atividade da enzima quadruplicaram nos animais Balb/c quando
comparados com os animais NZW. Os níveis da atividade de NAG (C e D) não
apresentaram diferenças entre as duas linhagens antes ou após a implantação. Os valores
representam a média±epm de grupos de 4-6 animais. * diferença significativa entre as
avaliações da mesma linhagem antes e após o implante e # diferença significativa entre as
duas linhagens avaliadas antes e após o implante. Test t; P<0,05.
4.2- Avaliação dos níveis sistêmicos de citocinas pro-angiogênicas/fibrogênicas em animais
NZW e Balb/c antes e após a implantação
Nesta série de experimentos nós avaliamos após 10 dias o efeito da implantação da
esponja nos níveis circulantes de citocinas pró-angiogênicas. Os resultados mostraram que
A
B
C
D
56
os animais NZW antes da implantação, apresentaram níveis aumentados de VEGF
circulante (142,6±11,5), aproximadamente 50% maiores do que a linhagem Balb/c
(102,7±4,6) e a presença do implante durante 10 dias não alterou a quantidade circulante
desta citocina em ambos os grupos (129,6±3,7- NZW; 104,7±3,3) (FIG 5 A e B).
Diferentemente, os níveis sorológicos de TNF-α antes da implantação da esponja foram
menores nos camundongos NZW (3,03±1,2) (30%) quando comparados com a outra
linhagem (10±3.2 pg/ml). Após 10 dias de implantação, houve um aumento destes níveis
em ambas as linhagens, nos NZW ocorreu um aumento de oito vezes (23,7±5,2) e nos
Balb/c de sete vezes (65,7±17,7), mantendo a diferença de três vezes entre as linhagens
(FIG. 5C e D). Os níveis circulantes de TGF-β1 (FIG. 5E e F) não foram alterados nas duas
linhagens antes ou após o implante da esponja (1129±406, 1331±341- NZW; 1157±134,
1547±401).
57
NZW
Basal Pos implantação
0
50
100
150
200
#
#
VEGF (pg/ml soro)
Balb/c
Basal Pos implantação
0
100
200
VEGF (pg/ml soro)
NZW
Basal Pós implantação
0
1000
2000
3000
TGF
β
1
(pg/ml soro)
Balb/c
Basal Pós implantação
0
1000
2000
3000
TGF
β
1
(pg/ml soro)
Balb/c
Basal Pós implantação
0
30
60
90
TNF-
α
α
α
α
(pg/ml soro)
A
B
C
D
E
F
*
#
#
NZW
Basal Pós implantação
0
30
60
90
TNF-
α
α
α
α
(pg/ml serum)
*
FIGURA 5- Níveis sistêmicos de citocinas pro-angiogênicas/fibrogênicas em animais NZW
e Balb/c antes e após a implantação (10 dias). Os níveis de VEGF em animais NZW foram
maiores quando comparados com os animais Balb/c antes e após o implante (A e B). Em
contraste, os níveis sistêmicos de TNF-α foram menores nos animais NZW comparados
com os BAlb/c. O implante de esponja (10 dias) induziu o aumento desta citocina em
ambas as linhagens avaliadas, mais este aumento foi maior nos animais Balb/c (C e D).
58
Nenhuma diferença foi observada para os níveis sistêmicos de TGF-β1 nas duas linhagens
antes e após o implante. Os valores mostrados representam média±epm de grupos de 4 a 6
animais em cada intervalo de tempo avaliado. * diferença significativa entre as avaliações
na mesma linhagem antes e após o implante e # diferença significativa entre as duas
linhagens avaliadas antes e após o implante. Test t; P<0,05.
4.3- Avaliação de parâmetros do tecido fibrovascular em implantes dos camundongos NZW
e Balb/c.
A infiltração do tecido fibrovascular composto de células migrantes e proliferantes,
fibras conjuntivas e vasos na esponja foram avaliados através de parâmetros bioquímicos.
A infiltração celular e a quantidade de MEC total foram quantificadas pela avaliação do
peso úmido do implante. Os implantes dos animais NZW foram menos pesados nos tempos
avaliados e os implantes de ambas as linhagens perderam peso durante os 21dias (7-
148,1±5,9; 10- 145,1±5,3; 14- 136,8±3,8; 21- 119,8±6,2) quando comparados com os
Balb/c (7-164,4±3,8; 10- 162,5±8,0; 14- 158,6±5,3; 21- 141,44±8,9) (FIG. 6A). O conteúdo
de sulfato de condroitina avaliado não foi diferente entre as duas linhagens (7-1,8±0,46; 10-
1,4± 0,2; 21- 1,3± 0,23) nos NZW e (7-1,9± 0,34; 10- 1,7± 0,2; 21- 1,7± 0,4) nos Balb/c
(FIG. 6B). Entretanto o conteúdo de colágeno avaliado pelo método colorimétrico do
picrossirius red, apresentou-se maior nos implantes de NZW nos dias 7 (1,00±0,07) e 10
(1,2±0,08) quando comparados com os implantes de Balb/c (7- 0,8±0,03; 10- 1,0±0,04) e
com 21 dias 1,2±0,07 NZW e 1,06±0,07 Balb/c. Em ambos os implantes a deposição de
colágeno aumentou do 7º ao 10º dia (FIG. 6C). Os níveis de TGF-β (D) apresentaram-se
maiores nos animais NZW (7- 12,1±1,7; 10-6,99±1,08;21-16,05±0,81) quando comparados
com os animais Balb/c (10,8±1,08;2,52±1,03; 11,41±1,51).
59
7 10 21
110
120
130
140
150
160
170
180
NZW
Balb/c
*
*
Dias pós implante
Peso implante (mg)
TGF-β
ββ
β1
7 10 21
0
5
10
15
20
NZW
Balb
*
*
Dias pós implante
pg TGF
β/
β/
β/
β/
peso úmido
A
B
C
D
Colágeno
7 10 21
0.75
1.10
Bal/c
NZW
*
*
Dias pós implante
µ
µ
µ
µ
g de colágeno/mg de implante
GAG
7 10 21
1.0
1.5
2.0
2.5
Balb/c
NZW
Dias pós implante
µ
µ
µ
µ
g de glicosaminoglicanos/mg de implante
FIGURA 6- Infiltração celular, deposição de sulfato de condroitina e colágeno na matriz
extracelular e níveis de TGF-β em implantes dos camundongos NZW e Balb/c. O peso
úmido dos implantes foi menor nos NZW (A). Não houve diferença na deposição de sulfato
de condroitina entre as duas linhagens avaliadas (B). A deposição de colágeno avaliada
pelo método colorimétrico de picrossirius (C) e os níveis de TGF-β (D) apresentaram-se
maiores nos animais NZW quando comparados com os animais Balb/c. Os valores
representados correspondem média±epm de grupos de 4-6 animais para cada intervalo de
tempo avaliado. * diferença significativa entre as duas linhagens avaliadas em intervalos de
tempos pré determinados após o implante. Test t; P<0,05.
A avaliação histológica do colágeno confirmou os dados bioquímicos da diferença
entre as duas linhagens (FIG. 7). A quantidade de colágeno foi maior em ambos os tempos
avaliados nos animais NZW quando comparados com os Balb/c.
60
FIGURA 7 – Cortes histológicos representativos (Picrosirius red) do tecido fibrovascular
que infiltra a matriz esponjosa nos animais NZW no 10º (A) e 21º (C) dia, e dos animais
Balb/c no 10º (B) e 21º (D) dia, mostrando o padrão de deposição do colágeno. As imagens
são representativas de 6 animais para cada tempo avaliado. Barra 100µm
4.4- Avaliação de marcadores inflamatórios nos implantes de esponja em camundongos
NZW e Balb/c.
A cinética da infiltração leucocitária revelou diferenças relacionadas às linhagens
quanto ao perfil da resposta inflamatória (FIG. 8). A diferença na infiltração neutrofílica
(com a atividade de MPO) nos implantes ficou aparente somente no 7º dia pós implantação
(4,0±0,43) e a atividade do MPO nos NZW foi duas vezes maior que nos implantes dos
animais Balb/c (FIG. 8A). Após este tempo a atividade de MPO caiu nos implantes e se
Balb/c NZW
A B
C D
10 dias 10 dias
21 dias 21 dias
61
manteve constante e igual nos tempos de 10 (2,77±0,16 NZW e 2,75±0,42 Balb/c), 14
(1,5±0,14 NZW e 1,39±0,19 Balb/c)e 21 dias (1,4±0,14 NZW e 1,54±0,27 Balb/c). A
atividade da enzima NAG nos implantes, ao contrário, foi similar nos tempos iniciais, dia 7
(12,11±2,25 NZW e 9,47±1,36 Balb/c) e 10 (10,50±0,94 NZW e 12,94±2,35 Balb/c) em
ambas as linhagens e divergiu nos tempos restantes. Os implantes de NZW nos tempos de
14 (5,47±0,73) e 21 (10,04±2,9) dias apresentaram uma resposta inflamatória muito menor
(duas - vezes) quando comparados com a linhagem Balb/c (14- 11,71± 2,66; 21- 22,02±
0,65) (Fig. 8B). Nos animais NZW o conteúdo de macrófagos não se alterou ao longo do
intervalo de tempo avaliado, enquanto nos animais Balb/c a atividade desta enzima
aumentou progressivamente durante o período de 21 dias. Já, o conteúdo da citocina pró-
inflamatória TNF-α apresentou um curso paralelo para as duas linhagens avaliadas (7-
0,20±0,03; 10- 0,26±0,02; 21- 0,32±0,06) nos NZW e (7- 0,16±0,05; 10- 0,19±0,04; 21-
0,21±0,05 (FIG. 8C).
62
7 10 14 21
0
1
2
3
4
5
6
NZW
Balb /c
A
*
Dias pós implante
OD/ g peso úmido
7 10 14 21
0
5
10
15
20
25
NZW
Balb/c
*
*
B
Dias pós implante
OD /g peso umido
7 10 21
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
NZW
Balb/c
C
Dias pós implante
TNF
−
−
−
−
α
α
α
α
(pg/mg peso úmido)
FIGURA 8- Marcadores inflamatórios nos implantes de esponja em camundongos NZW e
Balb/c. O acúmulo de neutrófilos (avaliado pela atividade de MPO) foi maior nos animais
63
NZW inicialmente no 7° dia, mas mostrou-se similar nos outros intervalos temporais (A). O
acúmulo de macrófagos apresentou-se diminuído nos implantes de NZW após o 10° dia. Os
níveis de TNF-α nos implantes apresentaram um curso paralelo para as duas linhagens
avaliadas. Os valores representados correspondem média±epm de grupos de 4-6 animais
para cada intervalo de tempo avaliado. *representa diferença significativa entre as duas
linhagens avaliadas após o implante. Test t student; P<0,05.
4.5- Avaliação da angiogênese nos implantes de camundongos Balb/c e NZW
O conteúdo de hemoglobina (Hb) nos implantes fornece um índice bem validado de
neovascularização (BELO et al., 2005). O conteúdo de Hb dos implantes dos NZW se
manteve alto com níveis relativamente constantes durante o período de 7-21 dias (7-
1,04±0,22; 10- 0,95±0,15; 14- 1,05±0,10; 21 -0,64±0,08, enquanto que nos implantes de
Balb/c o conteúdo de Hb foi menor inicialmente no 7º dia (0,21±0,019) e aumentou
progressivamente (10- 0,62±0,09; 14-0,69±0,24) até ultrapassar os valores dos implantes
dos NZW no 21º dia (1,41±0,20) (FIG. 9A). A principal citocina pró-angiogênica avaliada,
o VEGF, nos implantes de animais Balb/c apresentou seus níveis inalterados durante os
quatro períodos avaliados (7- 0,74±0,32; 10- 1,06±0,29; 14- 0,83±0,25; 21- 0,76±0,43), e
os níveis de VEGF nos implantes dos camundongos NZW diminuiu significativamente do
10º ao 21º dia (7- 0,60± 0,11; 10- 0,93± 0,31; 14- 0,20± 0,10; 21- 0,00± 0,00) (FIG 9B). O
número médio de vasos por campo histológico estudado foi igual inicialmente (12,5±0,49
NZW e 12,06±0,79 Balb/c) nas duas linhagens avaliadas e no 21º ocorreu uma diminuição
deste número nos animais NZW (5,33±0,34), enquanto que nos Balb/c houve um aumento
progressivo destas estruturas (16,12±0,73) (FIG. 9C).
64
7 10 14 21
0
1
2
NZW
Balb c
*
*
Dias pós implante
Hb (
µ
µ
µ
µ
g/mg de peso úmido)
A
B
C
10 21
0
10
20
NZW
Balb
*
Dias pós implante
Média n
°
°
°
°
vasos/lamina
7 10 14 21
0.0
0.4
0.8
1.2
NZW
Balb
*
*
Dias pós implante
VEGF (pg/mg de peso úmido)
FIGURA 9- Angiogênese nos implantes de camundongos NZW e Balb/c. O conteúdo de
hemoglobina dos implantes (A) atingiu o pico no 7° dia após a implantação e diminuiu após
o 14° dia nos implantes de NZW. Em contraste, nos implantes dos camundongos Balb/c a
hemoglobina aumentou progressivamente. Os níveis de VEGF dos implantes apresentou
65
um perfil similar para ambas as linhagens na fase inicial (7° ao 10° dia) diminuindo
posteriormente nos implantes de camundongos NZW após o 14° dia (B). Quantificação da
média do número de vasos por campo na esponja em diferentes tempos de implante
subcutâneo. Os valores representados correspondem média±epm de grupos de 4-6 animais
para cada intervalo de tempo avaliado. * diferença significativa entre as duas linhagens
avaliadas. Test t student; P<0,05.
4.6- Avaliação quantitativa de parâmetros morfológicos dos implantes
Nesta série de experimentos, técnicas histoquímicas e imunohistoquímicas foram
utilizadas para caracterizar no tecido fibrovascular induzido por implantes os processos de
ativação, proliferação celular e apoptose. Como mostrado pela coloração de H&E (FIG.
10A, B, C e D) o tecido de granulação que infiltra a esponja é composto de um infiltrado
inflamatório denso, composto de macrófagos, fibroblastos e células endoteliais em
proliferação formando microvasos. Houve, entretanto, importantes diferenças entre as
linhagens. No 10º dia pós implantação os implantes dos animais NZW continham mais
vasos sanguíneos do que os implantes dos animais Balb/c no mesmo tempo pós
implantação. No 21º dia após a implantação, a celularidade total e o número de vasos
sanguíneos estavam diminuídos nos implantes dos animais NZW quando comparados com
os implantes do Balb/c. A avaliação histológica sugeriu uma diminuição na inflamação e
formação de novos vasos sanguíneos nos implantes dos NZW entre o 10º e o 21º dia.
Contrariamente, os implantes dos Balb/c apresentaram um aumento progressivo no
infiltrado inflamatório e na quantidade de vasos sanguíneos durante o mesmo período
avaliado. A avaliação quantitativa da área fibrovascular (FIG 11) corroborou a impressão
histológica dos implantes nas duas linhagens nos dois intervalos de tempo avaliados (10 e
21 dias).
66
FIGURA 10- Cortes histológicos representativos (5µm, corados com H.E) do tecido
fibrovascular que infiltra o implante de esponja em camundongos NZW (A e C) e Balb/c (B
e D) do 10° e 21° dia após a implantação. O tecido fibrovascular que infiltra os poros da
esponja era composto de vasos sanguíneos, células inflamatórias, fibroblastos. O tecido de
granulação nos implantes de NZW apresentaram-se mais densos e mais vascularizados no
10° dia quando comparados com os implantes dos Balb/c. No 21° dia os implantes do NZW
apresentaram mais colágeno, menor quantidade de células inflamatórias e vasos
sanguíneos. Barra 10µm.
10 dias
21 dias 21 dias
Balb/c
B
D
NZW
10 dias 10 dias
21 dias 21 dias
Balb/c
C
A
67
10 21
0
2.0×10
5
4.0×10
5
6.0×10
5
Balb/c
NZW
*
Dias pós implante
Area fibrovascular (
µ
µ
µ
µ
m
2
/campo)
FIGURA 11- Quantificação da área fibrovascular por campo na esponja . Os valores
representados correspondem média±epm de grupos de 4-6 animais para cada intervalo de
tempo avaliado. * diferença significativa entre as duas linhagens avaliadas. Test t student;
P<0,05.
4.6.1- Quantificação do número de mastócitos por campo
Os mastócitos presentes no implante foram corados com Azul de Dominici (FIG 12)
e foram quantificados morfometricamente pelo índice de mastócitos (número de células
totais/número de mastócitos) (FIG 13). Nos animais NZW foi observado uma grande
quantidade de mastócitos no 10º dia (5,92±0,45) e esta quantidade diminuiu no 21ºdia
(4,62±0,39) pós implantação, contrariamente nos implantes dos Balb/c o número de
mastócitos aumentou progressivamente (10- 2,42±0,34; 21- 4,78±0,35).
68
FIGURA 12- Cortes histológicos representativos de implantes (5µm, corados com Azul de
Dominici) mostrando mastócitos entremeando o tecido fibrovascular que infiltra a matriz
sintética (A e C= NZW) e (B e D=Balb/c). Bar 100µm.
10 21
0
1
2
3
4
5
6
7
NZW
Balb/c
*
Dias pós implante
Índice de Mastócito
(n
o
de células totais/ n
o
de mastócitos)
FIGURA 13- Quantificação do índice de mastócitos no implante de animais NZW e Balb/c
no 10º e 21º dia pos implantação. Os valores representados correspondem média±epm de
Balb/c NZW
10 dias 10 dias
21 dias 21 dias
A B
C D
69
grupos de 4-6 animais para cada intervalo de tempo avaliado. * diferença significativa entre
as duas linhagens avaliadas após o implante. Test t; P<0,0001.
4.6.2- Ativação e proliferação celular
- Morfologia das AgNORs
Na impregnação pela prata as AgNORs foram identificadas como grumos marrons
escuros, com forma, tamanho e distribuição variados. Os grumos eram isolados, ou
agregados, com formas arredondadas ou irregulares, distribuídos difusamente no núcleo ou
circundando o nucléolo, com aparência de rosário ou satélites. Os grumos resultantes da
impregnação pela prata foram quantificados nos tipos celulares presentes nos cortes
histológicos (FIG. 14).
FIGURA 14-
Corte histológico de implantes (10 e 21dias), corado com AgNOR. Setas indicam os
grumos enegrecidos arredondados, como pequenos satélites espalhados por todo o núcleo (NORs).
Balb/
c
NZW
10
dias
10
dias
21
dias
21
dias
A B
C D
70
M
atriz esponjosa dos animais NZW no 10º (A) e 21º (C) dia, e dos animais Balb/c no 10º
(B) e 21º (D) dia.
Barra= 10µm.
- Índice de AgNORs
A avaliação do número de NORs por núcleo células através do IAgNORs mostrou
que os implantes dos animais NZW apresentam uma quantidade maior de NORs em suas
células no 10º dia (2,73±0,04) quando comparados com os animais Balb/c (2,42±0,04), mas
este número foi igual no 21º dia pos implantação para as duas linhagens (2,76± 0,05 NZW
e 2,65± 0,05 Balb/c) (FIG. 15).
10 21
2.25
2.50
2.75
3.00
NZW
Balb/c
*
Dias pós implante
I AgNORs (AgNORs/células)
FIGURA 15-
Evolução do índice de AgNORs por tempo de implante subcutâneo das esponjas no
10º e 21º dia em animais NZW e Balb/c.
Os valores representados correspondem média±epm
de grupos de 4-6 animais para cada intervalo de tempo avaliado. * diferença significativa
entre as duas linhagens avaliadas após o implante. Test t; P<0,0001.
71
4.6.3- Apoptose
-Morfologia das células apoptóticas
Os núcleos das células em apoptose foram marcados pelo TUNEL, ficando com uma
coloração acastanhada escura, resultado da reação da Peroxidase (POD) com o seu
substrato, a diaminobenzidina (DAB) (FIG. 16). Observou-se também como critérios de
inclusão as características morfológicas da apoptose como: retração e perda de adesão entre
as células (anoiquia), enrrugamento celular, condensação do citoplasma e do núcleo, com
compactação da cromatina nuclear, fragmentação nuclear e posteriormente celular
formando corpos apoptóticos.
FIGURA 16- Cortes histológicos representativos
mostrando a morfologia de células em
apoptose coradas pela reação de TUNEL
do tecido fibrovascular que infiltra o implante de
Balb/c NZW
10 dias 10 dias
21 dias 21 dias
A B
C D
72
esponja em camundongos NZW (A e C) e Balb/c (B e D) do 10° e 21° dia após a
implantação. Bar 10µm
- Índice Apoptótico por tempo pós implantação
A proporção de células em apoptose em relação ao número total de células por
campo microscópico mostrou se igual inicialmente (20,00±0,98 NZW e 17,98±0,88 Balb/c)
para as duas linhagens avaliadas e maior no 21º dia no implante da linhagem NZW
(23,89±1,02) quando comparada à linhagem Balb/c (16,17± 1,05)(FIG. 17).
10 21
15.0
17.5
20.0
22.5
25.0
27.5
NZW
Balb/c
*
Dias pós implante
Índice Apoptótico
(n
o
de cels em apoptose/n
o
de cels totais X 100)
FIGURA 17-
Evolução do índice Apoptótico das células presentes nos implantes de esponja de
animais NZW e Balb/c no 10º e 21º dia.
Os valores representados correspondem média±epm
de grupos de 4-6 animais para cada intervalo de tempo avaliado. *diferença significativa
entre as duas linhagens avaliadas após o implante. Test t; P<0,0001.
73
5- DISCUSSÃO
Neste estudo analisamos o processo de reparo tecidual em camundongos NZW
devido à susceptibilidade que estes animais apresentam em desenvolver uma doença similar
ao Lúpus eritematoso sistêmico, seja espontaneamente, em animais idosos ou após uma
exposição prolongada a fatores ambientais ou insultos internos (UENO et al., 2005). Esta
doença autoimune sistêmica poligênica caracteriza-se pela produção de uma variedade de
auto-anticorpos que se ligam a antígenos próprios causando lesões inflamatórias em
diversos órgãos (RUDOFSKY & LAWRENCE, 1999; MOREL et al., 1997; VITTECOQ
et al., 1999; UENO et al.,2005). Esta característica genética (doença autoimune) em outra
linhagem de camundongos (MRL/+) alterou o fenótipo da resposta de reparo, regenerando
lesões (furos) produzidos na orelha, aumentando a revascularização do tecido cardíaco após
lesão por congelamento e proporcionando um rápido reparo em ferimentos causados por
queimadura alcalina na córnea destes animais (KENCH et al., 1999; LEFEROVICH et al.,
2001; UENO et al.,2005). Devido a estes fatos foi razoável pensar que outra linhagem de
camundongos com defeitos autoimunes, a linhagem NZW, pudesse também apresentar uma
resposta de reparo tecidual aberrante. Além da anormalidade da autoimunidade, estudos
mostraram que os camundongos NZW apresentam altos níveis de VEGF nos pulmões com
inflamação alérgica (VASQUEZ-PINTO et al., 2007). O VEGF é uma importante citocina
pro-angiogênica e a angiogênese é um componente essencial na resposta de reparo
(KLAGSBRUN & MOSES, 1999; YIN-SHAN et al., 2006; EMING et al., 2007).
O modelo experimental de implante de esponja in vivo para o estudo da angiogênese
(ANDRADE et al., 1997; HU et al., 1995; WANG et al., 2000; KIM et al., 2001) tem sido
utilizado para avaliar a formação do tecido fibrovascular, uma mimetização do processo de
74
cicatrização de feridas. Este modelo tem permitido que a estrutura e função dos vasos
neoformados possam ser avaliadas fisiológica, bioquímica e morfometricamente. A
utilização de modelos de implante tem possibilitado também a medida da área vascular
(DVORAK et al., 1987), a contagem de vasos (NGUYEN et al., 1994), a avaliação do
fluxo sanguíneo através de marcadores radioativo (ANDRADE et al., 1987; FAN &
POLVERINI, 1997) e fluorimétrico (ANDRADE et al., 1997), a reatividade vascular a
fármacos (ANDRADE et al., 1997) e a avaliação de moduladores inibidores e
estimuladores angiogênicos (DELLIAN et al., 1996; BELO et al., 2004; BARCELOS et
al., 2004).
As técnicas utilizadas neste trabalho que avaliaram a vascularização, a inflamação e
a produção de citocinas têm sido amplamente validadas na aferição desses processos
biológicos. A técnica de dosagem de hemoglobina (Hb) é uma avaliação quantitativa e bem
estabelecida do índice vascular em vários tecidos (PLUNKETT et al., 1990; BELO et al.,
2004). As dosagens das atividades das enzimas mieloperoxidase (MPO) e da N-acetil-β-D-
glicosaminidase (NAG) (MULLANE et al., 1985; BAILEY, 1988; CROSS et al., 2003;
BARCELOS et al., 2005) correlacionam-se respectivamente, com a quantidade de
neutrófilos e macrófagos recrutados, possibilitando demonstrar estes componentes
inflamatórios de forma quantitativa nos vários processos em que participam. O ensaio
imunoenzimático (ELISA) também tem sido largamente utilizado para determinação dos
níveis de citocinas e quimiocinas em uma variedade de modelos experimentais in vitro e in
vivo (SALCEDO et al., 2000; BARCELOS et al., 2004; BELO et al., 2004).
Neste trabalho o modelo de feridas utilizado foi o da implantação cirúrgica de uma
matriz sintética de poliéster-poliuretano no espaço subcutâneo dorsal de camundongos
75
machos NZW. Utilizando-se animais NZW foi avaliada a resposta de reparo tecidual
comparativamente à resposta de camundongos Balb/c que não apresentam susceptibilidade
ao lúpus. A implantação de matrizes sintéticas tem sido eficaz em induzir uma resposta
cicatricial que mimetiza aquela observada em feridas incisionais (WALSH et al., 1997). As
várias fases do processo (inflamação, proliferação, angiogênese, apoptose e
remodelamento) no modelo de implante já foram bem caracterizadas utilizando-se
parâmetros bioquímicos, funcionais e histológicos (ANDRADE et al., 1997; BRADSHAW
et al., 2001; BELO et al., 2005; CAMPOS et al., 2006). Nossos resultados mostraram que
neste modelo, o padrão da resposta de reparo diferiu entre as linhagens analisadas, NZW e
a linhagem controle Balb/c.
Na primeira série de experimentos nós confirmamos e observamos que a linhagem
NZW apresenta constitutivamente níveis alterados de marcadores inflamatórios e
angiogênicos. O nível de MPO (derivado dos neutrófilos) circulante encontrado nos
camundongos NZW foi cerca da metade do nível da linhagem Balb/c, antes e depois da
implantação da matriz esponjosa, implicando em uma menor produção endógena deste
marcador inflamatório e uma habilidade diminuída dos NZW em responder aos estímulos
inflamatórios do implante (FIG.5). Nossos resultados são compatíveis com trabalhos
publicados que mostraram uma diminuição da quantidade de MPO circulante nesta
linhagem (MOREL et al., 1997; VITTECOQ et al., 1999). Outros marcadores pró-
inflamatórios, como os níveis circulantes de TNF-α também foram similarmente mais
baixos nos camundongos NZW antes e depois da implantação da esponja, mostrando
novamente um baixo nível basal e uma diminuída resposta a estímulos inflamatórios.
Deficiência na produção do TNF-α nesta linhagem susceptível ao lúpus já tinha sido
76
descrita por Jacob et al. (1988), e Fujimura et al. (1998) mostrando que os macrófagos de
camundongos NZW produzem quantidades menores desta citocina quando estimuladas por
lipopolissacarídeo do que os animais NZB (New Zealand Black). Quando nós adicionamos
a estas alterações, a ausência de outra enzima pró-inflamatória derivada de leucócito a
peroxidase de eosinófilo –EPO- (OHMORI et al., 1996; VASQUEZ-PINTO et al., 2007)
fica claro que os camundongos NZW apresentam um potencial diminuído para respostas
inflamatórias.
O principal marcador pró-angiogênico que nós avaliamos foi a citocina VEGF, e a
linhagem NZW apresentou níveis circulantes basais maiores em relação à linhagem Balb/c
e estes níveis não foram afetados pela implantação da matriz esponjosa. Ambos, os altos
níveis basais e a ausência de alteração destes níveis após um estímulo inflamatório
concordam com os resultados de Vasquez-Pinto et al. (2007) que detectaram altos níveis
locais de VEGF no fluido do lavado broncoalveolar de animais NZW, antes e após um
estímulo alérgico. O baixo potencial inflamatório apresentado pela linhagem NZW parece
ser acompanhada por um alto potencial angiogênico.
Foram avaliados também os fatores inflamatórios e angiogênicos locais, no implante
de esponja durante 21 dias. Na avaliação macroscópica dos implantes dos animais Balb/c e
NZW, análises histológicas, celulares e de mediadores revelaram variações relacionadas as
linhagens importantes na resposta de reparo local.
Os componentes inflamatórios do implante foram quantificados através de várias
medidas. Análises histológicas mostraram claramente uma diminuição da celularidade nos
implantes dos NZW no período de 10 a 21 dias e uma alta celularidade nos implantes de
Balb/c que foi devido principalmente às células inflamatórias. O nível do acúmulo de
neutrófilos nos implantes (medido como atividade de MPO) foi maior nos NZW apenas no
77
7º dia pós-implantação, confirmando a aceleração do processo inflamatório quando
comparado aos camundongos Balb/c. Este resultado difere daquele obtido no soro (níveis
mais baixos) nos animais NZW, sugerindo que a resposta inflamatória local não é afetada
na linhagem susceptível ao Lúpus. Os macrófagos usualmente seguem os neutrófilos ao
local da inflamação e este padrão foi claramente observado nos implantes de Balb/c através
de um aumento na atividade da NAG (representada por macrófagos ativados) nos
implantes. Entretanto nos implantes dos NZW a atividade do NAG foi baixa e continuou
assim do 7º. ao 21º. dia. Esta diminuição da infiltração de macrófagos é compatível com a
observação que em camundongos susceptíveis ao lúpus o número de células mononucleares
recrutadas após injeção intraperitoneal de tioglicolato foi muito reduzido quando
comparado com linhagens de animais não susceptíveis à doença (POTTER et al., 2003). A
diminuição da celularidade e da inflamação foram compatíveis também com a diminuição
do peso dos implantes dos NZW, em relação ao dos animais Balb/c nos últimos 10 dias do
estudo. O aumento na deposição de colágeno e os níveis elevados de TGF-β1 foram sinais
subseqüentes da diminuída resposta inflamatória e/ou do alto ambiente de reparo nos
implantes do NZW. O processo angiogênico do implante foi observado através de vários
marcadores. Para os implantes da linhagem Balb/c, todos os ensaios, Hb, VEGF e a
histologia indicaram um aumento progressivo na formação de vasos sanguíneos durante os
21 dias enquanto que nos implantes dos animais NZW houve uma diminuição dos
marcadores a partir do 10º dia pós-implantação. Estudos realizados anteriormente em nosso
laboratório mostraram que o padrão progressivo da angiogênese e da inflamação foi
observado em outras linhagens de animais não susceptível ao lúpus como camundongos
78
C57Bl/6 e Swiss (ANDRADE et al., 1992; LAGE & ANDRADE, 2000; FERREIRA et al.,
2004).
Devido a estes fatos foi considerado que o padrão de reparo distinto observado nos
camundongos NZW ocorre devido ao seu genótipo particular, e não devido a variações na
resposta de reparo entre as diferentes linhagens de camundongos em geral.
Nos implantes dos NZW, a histologia mostrou uma diminuição nas estruturas
vasculares nos 10 últimos dias, o que foi compatível com a queda contínua do conteúdo de
VEGF. Entretanto, o conteúdo de Hb se manteve constante e não havia sinais de danos no
tecido fibrovascular destas esponjas. Nós interpretamos estes resultados como uma
formação precoce de vasos sanguíneos necessários para o reparo logo após o insulto
inflamatório (7º-10º dias). Uma possível explicação para esta neovascularização mais cedo
e mais rápida pode estar relacionada à quantidade elevada dos níveis basais VEGF
sistêmico nos NZW. Esta resposta de reparo precoce e mais acelerado em nosso modelo
concorda com os resultados em outros modelos relacionados de linhagens de camundongos.
A linhagem autoimune de camundongos MRL/1 apresenta reparo acelerado e completo em
furos de orelha, em lesões no coração e em queimaduras de córnea quando comparados
com linhagens controle, sugerindo uma ligação entre as alterações do sistema imune nestes
animais e o reparo (CLARK et al., 1998 ; KENCH et al., 1999; HEBER-KATZ et al.,
2004; LEFEROVICH et al., 2001; UENO et al., 2005). Estes animais também produzem
altas quantidades de TGF-β1 e apresentam uma resposta inflamatória diminuída ao
tioglicolato (CLARK et al., 1998; KENCH et al., 1999). Interessantemente, os níveis de
TGF-β1 têm sido correlacionados à fibrose em modelos que não apresentam um grande
componente inflamatório inicialmente ou na progressão da doença (SIME et al., 1997;
79
BONNIAUD et al., 2005). Esta correlação foi claramente demonstrada em nosso modelo,
no qual o componente inflamatório também se apresentou diminuído e os níveis de
citocinas pró-fibrogênicas nos implantes dos camundongos NZW foram maiores quando
comparados com o grupo controle. Outra observação importante nos camundongos MRL/1
e que é consistente com nossos achados foi o resultado encontrado que o tecido de
granulação formado após uma lesão tecidual se resolveu rápido devido a angiogênese
aumentada (LEFEROVICH et al., 2001) .
Colocando nossos dados junto com os outros descritos anteriormente, parece que o
traço susceptibilidade ao lúpus está associado ao padrão distinto de reparo que inclui
inflamação deficiente, angiogênese acelerada, alterações nas citocinas e aumento da
produção de matriz extracelular em vários processos de reparo que resultam de diferentes
lesões teciduais.
Uma combinação de níveis circulantes de fatores pró-inflamatórios endógenos
diminuídos (MPO e TNF-α) e um aumento do fator pró-angiogênico (VEGF) descritos
neste modelo, podem ser a base para o mecanismo de reparo aberrante observado em
linhagens de camundongos autoimunes. Particularmente, o VEGF tem sido descrito como
sendo o mediador chave e promotor da angiogênese seja direta ou indiretamente, in vitro e
in vivo, modulando as diversas fases e componentes da formação e remodelamento dos
vasos sanguíneos (KOWANETZ & FERRARA, 2006). A associação entre a super-
expressão de VEGF e o aumento da produção de muco e colágeno no tecido pulmonar já
foi descrita (LEE et al., 2004).Além disso, níveis elevados de VEGF no soro de humanos
com LES já foram relatados (HESHMAT et al., 2007), reforçando a associação entre níveis
aumentados desta citocina e doenças auto-imunes.
80
Na segunda etapa deste trabalho foram investigados por meio de técnicas
histológicas e abordagens morfométricas eventos celulares envolvidos no reparo tecidual.
Foram caracterizadas a população de mastócitos e as atividades proliferativas, fibrogênica e
apoptótica do tecido fibrovascular induzido pelos implantes nas duas linhagens de
camundongos. A determinação quantitativa da área fibrovascular mostrando que os dados
da formação do tecido novo não variaram entre os dias 10 e 21 (intervalos avaliados) nos
NZW o que corrobora os dados que indicam a aceleração do processo de reparo nesses
animais. Já nos implantes dos camundongos Balb/c o perfil da infiltração fibrovascular foi
ascendente, indicando a continuidade do processo. De forma similar, esta abordagem
confirmou que os vasos neo-formados e a deposição de colágeno nos implantes dos animais
NZW também atingiram o ápice aos 10 dias pós implantação e que aos 21 dias a fase de
remodelamento/resolução era predominante, pois a quantidade de estruturas vasculares
eram significantemente menores do que nos implantes dos Balb/c.
A análise do índice de mastócitos nos implantes mostrou que o maior recrutamento
destas células ocorreu aos 10 dias e permaneceu inalterado até 21 dias pós-implantação no
grupo NZW, enquanto que nos implantes dos Balb/c o maior recrutamento foi gradual do
10º ao 21º dia onde foi observado o pico de acúmulo de mastócitos. O fato de esta
população celular ter sido recrutada precocemente nos implantes dos NZW pode ter
contribuído, pelo menos em parte, para a aceleração do reparo nestes animais. Os
mastócitos produzem uma variedade de moléculas angiogênica (VEGF) fibrogênica (TGF-
β1) e inflamatórias (TNF-α) envolvidas na resolução de processos inflamatórios e
cicatrização de tecidos (BLAIR et al., 1997; WELLER et al., 2006). Curiosamente, estas
células e/ou seus produtos estão presentes em altas quantidades em doenças autoimunes e
81
têm sido associadas a várias disfunções em órgãos e tecidos, especialmente fibrose (LEVI-
SCHAFFER & WEG, 1997; TRAUTMAN et al., 2000).
Outro evento que caracteriza e determina o processo do reparo é a atividade
proliferativa de vários tipos celulares principalmente os fibroblastos e células endoteliais no
local da lesão. Neste estudo também foi avaliada esta fase do reparo nas duas linhagens de
camundongos utilizando-se a técnica de impregnação pela prata para identificação e
quantificação de regiões organizadoras de nucléolos (AgNOR). Esta técnica permite a
determinação da taxa proliferativa em várias condições patológicas (DERENZINI et al.,
1990; TUCCARI et al., 1999). Na cicatrização de feridas, a análise morfométrica de
AgNORs tem sido usada para estimar a fase evolutiva de lesões (GODOY et al., 2000).
Além disso, existe evidência de que em células quiescentes o número de NORs pode ser
considerado um marcador de atividade da síntese de proteínas (JOZSA et al., 1993). Esta
técnica também foi adaptada para avaliar a taxa de ativação celular e proliferação celular
em implantes de esponja (CAMPOS et al., 2006).
As AgNORs nos cortes de implantes de NZW e Balb/c foram detectadas como
agregados de pontos pretos nos nucléolos de células inflamatórias, células endoteliais e
células tipo-fibroblasto em ambos os implantes. A análise quantitativa pela morfometria
mostrou um maior número de AgNORs no 10º dia nos implantes dos NZW comparado aos
implantes dos Balb/c, indicando aumento da proliferação/ativação. Este resultado é
compatível com a aceleração do processo de reparo observada na linhagem susceptível ao
lúpus.
Neste estudo também foi avaliado o padrão do processo de apoptose nos implantes
das duas linhagens nos intervalos de 10 e 21 dias utilizando-se a técnica de TUNEL. Foi
interessante observar que nos implantes do grupo NZW o índice apoptótico aumentou do
82
10º para o 21º dia enquanto que nos implantes do grupo Balb/c este índice diminuiu. A
apoptose, uma forma de morte celular programada, é considerada o principal mecanismo
pelo qual as células inflamatórias são removidas dos locais das lesões (BROWN et al.,
1997; GREENHALPH, 1998) após terem exercido suas funções específicas. O fato de o
índice apoptótico ter se mantido elevado nos implantes dos animais NZW é totalmente
compatível com as observações de que em doenças autoimunes e em animais susceptíveis
ao lúpus o clearance das células apoptóticas é deficiente (POTTER et al., 2003). É possível
que a presença do estímulo inflamatório (implantes) associado à susceptibilidade genética
dos NZW tenha amplificado a apoptose como um mecanismo de controle do processo
inflamatório. Além disso, há contundentes evidências de que células apoptóticas e
necróticas são fontes de auto-antígenos no lúpus tanto em humanos manos como em
murinos e que muitos auto-antígenos são associados a corpos apoptóticos (CASCIOLA-
ROSEN et al. 1996; POTTER et al. 2003).
O modelo de implante usado neste estudo foi eficaz em induzir uma resposta de
reparo tecidual em camundongos susceptíveis ao lúpus (linhagem NZW) que diferiu em
muitos aspectos do reparo observado em camundongos da linhagem Balb/c (não-
susceptível). O padrão observado compartilha várias características descritas para a
linhagem MRL/1 (susceptível ao lúpus) utilizando diferentes modelos de reparo (lesões
cardíacas, córnea, queimadura). Nossos experimentos quantificaram estas diferenças em
termos do padrão temporal e da intensidade do componente inflamatório, angiogênico, da
produção de citocinas, do remodelamento tecidual. Este estudo evidencia que as maiores
influências no processo de reparo na linhagem NZW são a resposta inflamatória diminuída,
a angiogênese aumentada e a apoptose persistente.
83
6- CONCLUSÂO
Neste estudo o perfil do reparo tecidual em camundongos NZW (susceptível ao lúpus) e
Balbc/c foi avaliado utilizando-se o modelo de implante de esponja mostrando que a
susceptibilidade à doença influencia a resposta cicatricial quanto à intensidade e duração do
processo.
Os camundongos NZW, embora fenotipicamente saudáveis, apresentaram alterações
sistêmicas nos níveis de citocinas inflamatória e angiogênica que podem estar associadas às
diferenças no processo de reparo.
O modelo de implante de esponja e as técnicas utilizadas para avaliar os componentes
inflamatório, angiogênico e fibrogênico do tecido fibrovascular foram eficazes em
determinar aspectos diferenciais celulares e moleculares como deficiência no recrutamento
de macrófagos, perfil vascular regressivo, deposição aumentada de colágeno, níveis
diminuídos de VEGF e aumentados de TGF-β na linhagem NZW quando comparados com
os Balb/c.
Submetidos ao mesmo insulto (implante de esponja) o recrutamento de macrófagos foi
deficiente nos NZW durante o período experimental avaliado, indicando uma resposta
inflamatória deficiente intrínseca.
Os estudos histoquímicos e morfométricos também mostraram perfis temporais distintos
apresentando um maior recrutamento de mastócitos como também uma proliferação celular
aumentada na fase inicial enquanto que a apoptose aumentou aos 21 dias nos animais NZW
quando comparados com os Balb/c.
O padrão de reparo foi influenciado por inflamação deficiente e angiogênese acelerada na
linhagem susceptível ao lúpus.
84
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