( PDF ) Caracterização do fermento endógeno utilizado na fabricação do queijo canastra no município de Medeiros, Minas Gerais, com ênfase em leveduras

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JULIANA ESCARIÃO DA NÓBREGA

CARACTERIZAÇÃO DO FERMENTO ENDÓGENO

UTILIZADO NA FABRICAÇÃO DO QUEIJO

CANASTRA NO MUNICÍPIO DE MEDEIROS, MINAS

GERAIS, COM ÊNFASE EM LEVEDURAS

Dissertação apresentada à Universidade

Federal de Viçosa, como parte das

exigências do Programa de Pós-graduação

em Ciência e Tecnologia de Alimentos, para

obtenção do título de Magister Scientiae.

VIÇOSA

MINAS GERAIS - BRASIL

2007

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Ficha catalográfica preparada pela Seção de Catalogação e

Classificação da Biblioteca Central da UFV

Nóbrega, Juliana Escarião da, 1976-

N754c Caracterização do fermento endógeno utilizado na

2007 fabricação do queijo Canastra no município de Medeiros,

Minas Gerais, com ênfase em leveduras / Juliana Escarião

da Nóbrega. – Viçosa, MG, 2007.

xi, 82f. : il. (algumas col.) ; 29cm.

Inclui apêndice.

Orientador: Célia Lúcia de Luces Fortes Ferreira.

Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de

Viçosa.

Referências bibliográficas: f. 68-75.

1. Alimentos - Microbiologia. 2. Fermentação.

3. Alimentos - Análise. 4. Soro de queijo. 5. Queijarias.

6. Queijo - Brasil - Variedades. I. Universidade Federal de

Viçosa. II.Título.

CDD 22.ed. 664.001579

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JULIANA ESCARIÃO DA NÓBREGA

CARACTERIZAÇÃO DO FERMENTO ENDÓGENO

UTILIZADO NA FABRICAÇÃO DO QUEIJO

CANASTRA NO MUNICÍPIO DE MEDEIROS, MINAS

GERAIS, COM ÊNFASE EM LEVEDURAS

Dissertação apresentada à

Universidade Federal de Viçosa, como parte

das exigências do Programa de Pós-

graduação em Ciência e Tecnologia de

Alimentos, para obtenção do título de

Magister Scientiae.

APROVADA: 14 de agosto de 2007.

Prof. Antônio Fernandes de Carvalho Prof. Regina Célia Santos Mendonça

(Co-Orientador) (Co-Orientadora)

Prof. Mauro Mansur Furtado Prof. Daise Aparecida Rossi

Prof. Célia Lúcia de Luces Fortes Ferreira

(Orientadora)

Para ser grande, sê inteiro: nada

teu exagera ou exclui.

Sê todo em cada coisa. Põe quanto és

no mínimo que fazes.

Assim em cada lago a lua toda

brilha, porque alta vive.

Ricardo Reis

Aos meus pais,

irmãos,

sobrinhos e

amigos.

AGRADECIMENTOS

À Deus, por sua infinita presença em minha vida.

À professora Célia Lúcia de Luces Fortes Ferreira, pela orientação, amizade e apoio durante

todo o período do curso.

À professora Regina Célia Santos Mendonça, pela imprescindível contribuição.

À Universidade Federal de Viçosa, pela oportunidade de realizar o curso.

À Universidade Federal da Paraíba, por permitir que eu realizasse o curso e pela confiança.

A todos os amigos do Laboratório de Culturas Láticas, principalmente ao Célio Souza,

Elisângela Domingo e Edimara Ferreira.

As amigas Ana Carolina Volp, Luciana Rodrigues e Milene das Dores pelo apoio e

companhia.

SUMÁRIO

RESUMO...............................................................................................................

vii

ABSTRACT..........................................................................................................

1. INTRODUÇÃO.................................................................................................

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..........................................................................

2.1 Queijos artesanais em Minas Gerai

s e no Brasil.............................................

2.2 Queijo Minas Artesanal...................................................................................

2.3 Queijo Canastra..............................................................

.................................

2.3.1 Processo de fabricação do queijo Canastra...................................................

2.4 Microbiota lática em queijos artesanais...........................................................

2.5 Levedu

ras.........................................................................................................

2.5.1 Leveduras em alimentos...............................................................................

2.5.1.1 Leveduras em produtos l

áticos..................................................................

3. OBJETIVOS......................................................................................................

4. METODOLOGIA..............................................

................................................

4.1 Coleta das amostras.........................................................................................

4.2 Análises físico

químicas..........................................................

........................

4.2.1 Determinação da acidez titulável e do pH....................................................

4.2.2 Determinação de cloreto de sódio.................................................................

4.3 Análises mic

robiológicas.................................................................................

4.3.1 Contagem total e contagem de microrganismos indicadores.......................

4.3.2 Contagem da microbiota lática e leveduriforme..................

.........................

4.4 Isolamento e caracterização da microbiota lática............................................

4.5 Isolamento, caracterização e identificação das leveduras................................

4.5.1 Meios de cultura utili

zados na identificação ...............................................

4.5.2 Avaliações bioquímicas e físicas..................................................................

4.5.2.1 Assimilação e fermentação de fontes de carbono..................

....................

4.5.2.2 Crescimento a temperatura de 37

C.........................................................

4.5.2.3 Tolerância osmótica...................................................................................

4.5.2.4 Redu

ção de nitrato.....................................................................................

4.5.2.5 Hidrólise de amido.....................................................................................

4.6 Análises estatísticas...........

..............................................................................

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO.......................................................................

5.1 Análises físico

químicas............................................

......................................

5.2 Contagem total e de microrganismos indicadores...........................................

5.3 Contagem da microbiota lática e leveduriforme..............................................

5.4 Isolamento

e caracterização da microbiota lática e leveduriforme..................

5.5 Caracterização e identificação da microbiota leveduriforme..........................

5.5.1 Metodologia tradicional..........................................................

......................

5.5.2 Sistema API

20 C AUX..............................................................................

5.5.3 Comparação dos resultados pela metodologia tradicional e pelo sistema API

C AUX.....................................................................................................

5.5.4 Espécies leveduriformes predominantes nas unidades produtoras, nos dois

períodos avaliados.................................................................................................

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS............................................................................

7. REFERÊNCIAS................................................................................................

APÊNDICES .......

.................................................................................................

RESUMO

NÓBREGA, Juliana Escarião da, M. Sc., Universidade Federal de Viçosa, agosto de

2007. Caracterização do fermento endógeno utilizado na fabricação do

queijo Canastra no município de Medeiros, Minas Gerais, com ênfase em

leveduras. Orientadora: Célia Lúcia de Luces Fortes Ferreira. Co-orientadores:

Antônio Fernandes de Carvalho e Regina Célia Santos Mendonça.

Este trabalho teve por objetivo determinar parâmetros físico-químicos e

caracterizar a microbiota presente no fermento endógeno utilizado na fabricação do

queijo Canastra. O queijo Canastra é produzido na região da Serra da Canastra,

Minas Gerais, de forma artesanal, com leite cru de vaca e utiliza como cultura

iniciadora um fermento endógeno, preparado a partir do soro. Amostras do fermento

endógeno, utilizado em oito unidades produtoras do queijo Canastra, foram

coletadas assepticamente nas respectivas propriedades situadas na cidade de

Medeiros, MG. As mesmas propriedades foram amostradas no período das águas

(PA) e no período da seca (PS). Os valores de acidez e pH não sofreram alteração

(P>0,05) nos dois períodos amostrados. A acidez média encontrada foi 0,56 % e

0,66 %, no PA e PS, respectivamente. O pH apresentou média de 5,02 no PA e de

5,07 no PS. O teor de NaCl foi superior (P<0,05) no PA, com média de 7,39 %,

enquanto no PS, a média foi de 4,13 %. A contagem total de mesófilos aeróbios foi

menor (P<0,05) no PA com mediana de 5,94 Log UFC.mL

-1

, no PS a mediana

encontrada foi de 7,50 Log UFC.mL

-1

. As contagens de coliformes totais, E. coli e

S. aureus não diferiram (P>0,05) nos dois períodos amostrados e as medianas

encontradas foram respectivamente 2,30 Log UFC.mL

-1

, 1,50 Log UFC/ mL e 1,92

Log UFC.mL

-1

no PA e de 2,61 Log UFC.mL

-1

, 1,50 Log UFC.mL

-1

e 1,72 Log

UFC.mL

-1

no PS. Listeria sp. não foi detectada nas amostras. Salmonella sp. foi

detectada em uma das amostras analisadas no PA. Observaram-se elevadas

contagens das bactérias do ácido lático, todos os grupos avaliados apresentaram

contagens superiores a 5 ciclos logaritmos, 395 estirpes foram isoladas e estão em

processo de identificação. As contagens de leveduras não diferiram (P>0,05) nos

dois períodos avaliados e apresentaram medianas de 5,24 Log UFC.mL

-1

e 4,16

Log UFC.mL

-1

no PA e PS, respectivamente. As espécies de leveduras

predominantes no PA foram Debaryomyces hansenii, Torulaspora delbruekii e

Kluyveromyces lactis e, no PS, predominaram as espécies Kluyveromyces lactis,

Torulaspora delbruekii e Kluyveromyces marxianus. Houve similaridade de 80,87

% nos resultados entre o método tradicional e o kit API

20 C AUX, utilizados para

a identificação das leveduras. Este trabalho representa uma das etapas iniciais acerca

dos principais componentes físico-químicos e microbianos do fermento endógeno

utilizado na fabricação do queijo Canastra. Estudos para uma melhor compreensão

desses componentes, suas variações e interações, assim como a sua contribuição

para as características e a qualidade do queijo Canastra precisam ser definidos.

ABSTRACT

NÓBREGA, Juliana Escarião da, M. Sc., Universidade Federal de Viçosa, August,

2007. Characterization of natural whey cultures used in the manufacture of

the Canastra cheese in the city of Medeiros, Minas Gerais State, with

emphasis in yeasts. Adviser: Célia Lúcia de Luces Fortes Ferreira. Co-Advisers:

Antônio Fernandes de Carvalho and Regina Célia Santos Mendonça.

This work had the objective to determine physicochemical parameters and to

characterize the microbiota present in the natural whey cultures used in the

manufacture of the Canastra cheese. The Canastra cheese is produced in the region

of the Canastra Mountain range, Minas Gerais State, artisan made from raw cow’s

milk, and uses, as a culture starter, natural starters, prepared from the whey. The

samples were collected in 8 properties, in the rain period, and in the dry period. The

results demonstrated that the values of acidity and pH did not suffer alteration

(P>0,05) in the two sampled periods. The average acidity found was 0,56 % and

0,66 %, in the raining period and in dry period, respectively. The pH presented an

average of 5,02 in the raining period, and of 5,07 in the dry period. The NaCl index

was superior (P<0,05) in the raining period, and it presented average of 7,39 %,

while in the dry period, the average was of 4,13 %. The total counting of mesophile

bacteria was smaller (P<0,05) in the raining period, with average of 5,94 Log

UFC.mL

-1

, in the dry period the average found was of 7,50 Log UFC.mL

-1

.The total

coliform countings, E. coli and S. aureus did not differ (P>0,05) in the two sampled

periods, and the averages found were, respectively, 2,30 Log UFC.mL

-1

1,50 Log

UFC/ mL and 1,92 Log UFC.mL

-1

in the raining period, and 2,61 Log UFC.mL

-1

1,50 Log UFC.mL

-1

and 1,72 Log UFC.mL

-1

in the dry period. Listeria sp. was not

detected in any sample. Salmonella sp. was detected in 1 of the samples analyzed

during the raining period. Great figures in the lactic acid bacteria countings were

observed, all the evaluated groups presented countings superior than 5 logarithmic

cycles, 395 lineages were isolated, and are in identification process. The average of

the yeasts counting was of 5,24 Log UFC.mL

-1

in the raining period, and of 4,16

Log UFC.mL

-1

in the dry period. The predominant yeasts species during the raining

period were Debaryomyces hansenii, Torulaspora delbruekii and Kluyveromyces

lactis and in the dry period, had predominantly the Kluyveromyces lactis,

Torulaspora delbruekii and Kluyveromyces marxianus species. There was a

similarity of 80,87 % in the results between the traditional method and the 20 API®

C AUX kit, used for the yeasts identification. This work is the beginning of the

understanding of the main physicochemical and microbial components of the natural

whey cultures used in the manufacture of the Canastra cheese. Studies for a better

understanding of these components, their variations and interactions, as well as their

contribution for the Canastra cheese characteristics and quality must still be

determined.

1. INTRODUÇÃO

A fabricação artesanal de queijos no Estado de Minas Gerais resulta de uma

tradição secular, passada de pai para filho, como forma de aproveitamento da

produção leiteira nas pequenas propriedades rurais. Dificuldades com transporte e

comercialização do leite levaram os pequenos produtores das regiões montanhosas

mineiras a produzir seu próprio queijo. As características geográficas dessas regiões

forneceram condições para o desenvolvimento de um queijo com características

sensoriais peculiares, a exemplo do queijo produzido na região da Serra da Canastra.

Os produtores artesanais dessa região utilizam a microbiota naturalmente

presente no leite, como coadjuvante à produção do queijo. Diariamente, após

enformagem e salga do queijo, parte do soro eliminado é coletado e adicionado à

produção subseqüente. Esse fermento endógeno, comumente conhecido como pingo,

contém diversos grupos microbianos que direcionam a fermentação e maturação do

queijo. Essa prática insere ao produto uma microbiota diversificada, representativa

da região na qual o produto é fabricado e confere ao queijo características sensoriais

diferenciadas e endêmicas.

Estudos demonstram que o sistema enzimático da microbiota presente nos

queijos artesanais, fabricados a partir de leite cru, é mais complexo do que aquele

presente na microbiota de queijos fabricados com leite pasteurizado, adicionados de

fermentos selecionados, conduzindo a diferenças na qualidade sensorial entre esses

dois tipos de queijo (GRAPPIN & BEUVIER, 1997; PELÁEZ & REQUENA, 2005;

BALLESTEROS et al , 2006; CABEZAS et al, 2007).

Desde a década de 1950, com a adoção da pasteurização do leite para a

produção de queijos (MARTLEY & CROW, 1993) tornou-se necessário a utilização

de culturas iniciadoras para reposição da microbiota lática. Seu uso confere

qualidade tecnológica aos produtos láticos, mas, em contra partida, limita a

biodiversidade e, conseqüentemente as características sensoriais desses produtos

(MARINO et al, 2003; PELÁEZ & REQUENA, 2005; ZAMFIR et al, 2005).

Existe uma reconhecida demanda por novas estirpes que substituam ou

complementem os fermentos correntemente usados na indústria de produtos

fermentados, pois o número limitado dessas estirpes, disponíveis para a indústria

lática, tem sido extensivamente utilizado, intensificando, com isso, problemas como

infecção por bacteriófagos (SALAMA, 1995; POZNANSKI et al, 2004; PELÁEZ &

REQUENA, 2005; ZAMFIR et al, 2005).

Culturas iniciadoras específicas a uma particular variedade de queijo,

baseada na seleção de estirpes isoladas a partir do próprio produto,

presumivelmente, estará mais bem adaptada, além de assegurar propriedades

sensoriais semelhantes ao queijo original, quando fabricado com leite tratado

termicamente (ESTEPAR et al, 1999). Para tanto, é necessário o conhecimento

bioquímico e microbiológico desse ecossistema. A disponibilidade de culturas

endógenas, adaptadas às condições locais, é uma necessidade econômica e um

avanço tecnológico (CAVALCANTE, et al, 2003).

Fermentos naturais utilizados na fabricação de queijo constituem uma

complexa associação microbiana, formada predominantemente por bactérias do

ácido lático (BAL) e por uma microbiota não-lática como leveduras (COPOLA et al,

1988; REINHEIMER et al, 1995; PARENTE et al, 1997).

Apesar da extensiva utilização de fermento endógeno na fabricação de

queijos artesanais em Minas Gerais, pouco se sabe a respeito da sua composição. A

finalidade desse trabalho foi caracterizar o fermento endógeno utilizado na

fabricação do queijo artesanal da Serra da Canastra, em diferentes períodos do ano.

Este estudo contribuirá para melhor entendimento da composição físico-química e

microbiana do fermento endógeno e do papel que este exerce nas características

sensoriais do queijo Canastra, servindo de base para seleção de novas estirpes, que

poderão ser utilizadas pela indústria ou pelo produtor de queijo artesanal, para

manter as características desejáveis desses queijos.

2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA

2.1 Queijos artesanais em Minas Gerais e no Brasil

Informações sobre queijos artesanais no Brasil são escassas. Além dos

queijos tipo Minas, produzidos principalmente nas regiões mineiras de Araxá

(ARAÚJO, 2004), Serra da Canastra (ORNELAS, 2005), Alto Paranaíba

(FONSECA, 2005) e Serro (PINTO, 2004; MARTINS, 2006) podem ser citados os

queijos produzidos no Nordeste: queijo Manteiga e queijo Coalho (AQUINO, 1983;

GLOBO RURAL, 1999) e no Sul: queijo Serrano, também conhecido como queijo

Colonial (SOUZA et al, 2003; ANDRADE et al, 2006). Após a promulgação da Lei

Estadual n

14.185, de 31 de janeiro de 2002, que estabelece os queijos artesanais

das regiões mineiras, acima citadas, como patrimônio imaterial do Estado, aumentou

a preocupação quanto à necessidade de se obterem informações acerca dos

parâmetros físico-químicos e microbiológicos, assim como de se estabelecerem

ações com o intuito de proteger, os queijos artesanais produzidos em regiões

tradicionais não só em Minas Gerais, como em outros Estados (PINTO, 2004;

EMATER, 2007; SEBRAE, 2007).

2.2 Queijo Minas artesanal

A produção de queijos em Minas Gerais é de aproximadamente 215 mil

toneladas por ano, sendo 70 mil de queijo Minas artesanal, produzido em 519 dos

853 municípios mineiros. A produção caracteriza-se por ser em pequena escala,

fabricado diretamente nas propriedades rurais. Ocupa 30 mil famílias de pequenos

proprietários, totalizando aproximadamente 100 mil pessoas. Destes, 10.773 são

produtores das quatro principais regiões do Estado (Serro, Alto Paranaíba, Serra da

Canastra e Araxá), consideradas tradicionais e que produzem anualmente 33.570

toneladas de queijo em 46 municípios, gerando 26.870 empregos diretos (GLOBO

RURAL, 2002; EMATER, 2004a).

2.3 Queijo Canastra

A fabricação e o consumo de queijo na região da Serra da Canastra

confundem-se com a história do povoamento local, iniciado com a busca de

minerais e pedras preciosas. Relatos de naturalistas, contratados na época do

império, são ricos em descrições detalhadas da vegetação, tipo de solo, serras, rios e

seus habitantes. Dentre os costumes e hábitos alimentares descritos, o queijo,

fabricado de forma artesanal, já era incluído (EMATER, 2004).

Localizada no sudoeste do Estado (Figura 1), a região abriga o Parque

Nacional da Serra da Canastra, criado para proteger as nascentes do rio São

Francisco. Sua altitude varia de 637 m a 1.485 m acima do nível do mar, com

temperatura média anual de 22,2

C e índice pluviométrico em torno de 1.390 mm

anuais (EMATER, 2004). É formada pelos municípios de Bambuí, Delfinópolis,

Medeiros, Piumhi, São Roque de Minas, Tapiraí e Vargem Bonita, com expressiva

parte da sua população na zona rural, a exemplo de Medeiros (51,6 %) e Vargem

Bonita (46,6 %) (Tabela 1). Estes municípios possuem várias particularidades

naturais, sócio-culturais e econômicas em comum, entre elas o modo de fabricar o

queijo artesanal (EMATER, 2004).

Figura 1. Regiões produtoras do queijo Minas artesanal.

Tabela 1. Características gerais dos municípios produtores do queijo Canastra

Município

Área

(Km

)

População

(n)

População Rural

(%)

Bambuí 1.457 21.682 18,50

Delfinópolis 1.171 6.572

29,00

Medeiros

969

3.038

51,60

Piumhi 905 28.757

12,30

São Roque de Minas 2.107 6.326 41,00

Tapiraí 434 1.887

40,50

Vargem Bonita 409 2.206 46,60

Total 7.452 70.468

21,90

Fonte: EMATER-MG (2004).

Segundo dados da EMATER (2004), o queijo Minas artesanal da Serra da

Canastra é produzido por 1.795 produtores, com uma produção anual de 4.470

toneladas (Tabela 2), sendo grande parte dessa produção comercializada nos

mercados de Belo Horizonte e São Paulo. Emprega basicamente mão-de-obra

familiar, caracterizada pelo baixo nível de escolaridade (ORNELAS, 2005). Não

existem, até o momento, cooperativas ou associações para a comercialização do

queijo Canastra. Segundo Ornelas (2005), 92,5 % do queijo produzido na região é

comercializado por atravessadores, conhecidos como queijeiros.

Tabela 2. Produção de leite e queijo artesanal pelos municípios da Região da Serra

da Canastra

Município

Propriedades

Rurais (n)

Rebanho

(cabeças)

Prod. Leite

ano (1000

Litros)

Produtor de

queijo

Produção

anual de

queijo (ton.)

Bambuí 1.438 74.323 36.537 149 576

Delfinópolis 484 80.000 15.000 25 70

Medeiros

537

29.97

16.425

430

1.600

Piumhi 956 30.394 21.600 50 165

São R. de Minas 933 18.811 7.560 852 1.537

Tapiraí 258 18.320 4.438 89 162

Vargem Bonita 207 12.792 2.355 200 360

Total 4.813 264.611 103.915 1.795 4.470

Fonte: EMATER-MG (2004).

2.3.1 Processo de fabricação do queijo Canastra

A produção artesanal do queijo Canastra é realizada na própria fazenda onde

o leite é produzido. As queijarias caracterizam-se por serem construções simples,

localizadas próximas ao local da ordenha (Figura 2).

Figura 2. Queijaria da região da Serra da Canastra

O leite recém-ordenhado é filtrado e conduzido através de tubulação que

interliga a recepção à sala de processamento da queijaria, onde é acondicionado em

tanques plásticos para o seu processamento. O coalho e o fermento endógeno são

adicionados e, após coagulação, a massa é quebrada com o auxílio de uma pá de

madeira. A massa coagulada, coletada com o auxílio de peneira plástica, é colocada

em fôrmas plásticas, onde a prensagem é realizada manualmente com a ajuda de um

tecido. Após a prensagem, os queijos são recobertos com sal grosso. Passadas 24

horas, o excesso de sal é retirado, sendo os queijos transferidos para prateleiras,

permanecendo nas fôrmas por mais 24 horas. Os queijos são virados diariamente, até

a comercialização (Figura 3).

1. Ordenha

2. Filtragem do leite

3. Tanque de processamento do leite

4. Dosagem do coalho e do pingo

5. Coagulação do leite

6. Corte da massa

Continua...

7. Dessoragem

8. Enformagem

9. Prensagem

10. Salga

Coleta do pingo durante a salga

11. Maturação dos queijos

Figura 3. Etapas da fabricação do queijo Canastra

Pesquisas têm demonstrando que na região da Serra da Canastra não existe

padronização no processo de fabricação. A quantidade de coalho e fermento

endógeno utilizada assim como o tempo de coagulação variam entre os produtores

(ORNELAS, 2005; BORELLI, 2006). Problema semelhante também foi observado

em outras regiões produtoras do queijo Minas artesanal, a exemplo de Araxá e Serro

(ARAÚJO, 2004; PINTO, 2004).

2.4 Microbiota lática em queijos artesanais

Em muitos países, queijos fabricados em pequena escala, a partir de leite

cru, ordenhados pelos próprios produtores, são produzidos artesanalmente,

utilizando técnicas tradicionais. Na produção desses queijos, normalmente não se

empregam culturas iniciadoras comerciais, sendo esta função desempenhada pelas

BAL naturalmente presentes no leite (COGAN et al, 1997).

Alternativamente, tipos diferentes de culturas naturais são utilizadas,

produzidas a partir do soro ou do próprio leite. Embora a composição e o

desempenho desses fermentos endógenos sejam relativamente variáveis, possuem

propriedades importantes, como relativa insensibilidade ao ataque de bacteriófagos e

constituem uma rica e complexa associação microbiana, fonte de novas estirpes.

(REINHEIMER et al, 1995; REINHEIMER et al, 1996; COGAN et al, 1997;

PARENTE et al, 1997; BERESFORD et al, 2001).

A microbiota do queijo compreende o grupo de microrganismos iniciadores,

composto pelas BAL e o grupo de microrganismos secundários. As BAL estão

envolvidas no desenvolvimento da acidez durante a fabricação e também contribuem

no processo de maturação. A microbiota secundária, embora não contribua para a

acidez, geralmente tem papel significativo na fase de maturação do queijo. Esse

grupo inclui as BAL não iniciadoras, como espécies mesofílicas dos gêneros

Pediococcus e Lactobacillus e outros microrganismos a exemplo de Micrococcus,

Brevibacterium, bactérias propiônicas, bactérias corineformes, fungos e leveduras

(GOBBETTI et al, 1999; BERESFORD et al, 2001).

Pouco se sabe sobre as BAL envolvidas na fabricação e maturação de queijos

artesanais, sendo que a maioria das informações encontrada na literatura, diz

respeito aos queijos espanhóis (COGAN et al, 1997).

Pesquisas têm demonstrado que espécies de Lactococcus são de grande

relevância na microbiota dos queijos artesanais espanhóis, por exemplo, o queijo

Manchego é o mais popular e consumido, sendo fabricado na região de La Mancha,

a partir de leite cru de ovelha e maturado por 15 a 60 dias. Em estudo realizado por

Ballesteros et al (2004), a espécie predominantemente encontrada foi Lactococcus

lactis subsp. lactis, seguida de Enterococcus faecalis, Lactobacillus paracasei

subsp. paracasei, Leuconostoc mesenteroides subsp. dextranicum e Lactobacillus

platarum. Os autores também consideraram que os atributos sensoriais no

Manchego fabricado artesanalmente foram superiores aos apresentados pelo mesmo

queijo, quando fabricado industrialmente.

Segundo Estepar et al (1999), o queijo Peñamellera, outro tradicional queijo

artesanal espanhol, fabricado, ao norte do país, com leite cru de vaca, porém

adicionado de leite de cabra e ovelha, apresentou predominância do gênero

Lactococcus, com valores médios de 10

UFC.g

-1

, sendo a espécie Lactococcus

lactis subsp. lactis predominante. Os Lactobacillus apresentaram-se como o grupo

subdominante, com contagens médias de 5x 10

UFC.g

-1

, e as espécies que se

destacaram foram Lactobacillus brevis e Lactobacillus plantarum . O grupo

Lactococcus também se destaca como o principal durante a maturação do queijo

Ibores, fabricado com leite cru de cabra, na região sudoeste da Espanha e nos

queijos Roncal e Idiazábal, fabricados com leite cru de ovelha na região de Navarra

(ARIZCUN et al, 1997; MAS et al, 2002).

Cogan et al (1997) isolaram e caracterizaram 4.379 BAL em 35 produtos

artesanais fabricados na Europa, incluindo 24 queijos. Além de queijos, foram

avaliados fermentos endógenos, leites e leites fermentados. O estudo indicou

consideráveis variações nos tipos de BAL presentes, bem como sua capacidade de

produzir ácido, exopolissacarídios, bacteriocinas e proteinases, o que sugere que

cada tipo de queijo tem um ecossistema único. Dentre as BAL identificadas, foram

mais freqüentes Lactococcus (38 %), Enterococcus (17 %), Streptococcus

thermophilus (14 %), Lactobacillus mesófilicos (12 %), Leuconostoc (10 %) e

Lactobacillus termofílicos (9 %).

Zamfir et al (2005) ao avaliarem a biodiversidade de BAL em 110 amostras

de produtos láticos artesanais produzidos na Romênia, entre estes, os queijos Branza

Dulce, Telemea e Urda, observaram que há predominância de Lactococcus lactis,

Leuconostoc sp. e Enterococcus sp. Entre o grupo Enterococcus, uma nova espécie,

E. sacharominimus, foi encontrada, o que demonstra a importância dos produtos

artesanais como fonte potencial de microrganismos, cujas propriedades possam ser

utilizadas para o desenvolvimento de novas culturas iniciadoras.

No México, assim como no Brasil, o queijo tipo “frescal” é uma das

variedades populares mais consumidas. O queijo frescal mexicano é fabricado

artesanalmente em várias propriedades rurais, com leite cru de vaca, utilizando-se de

técnicas tradicionais, que inclui acidificação pelas BAL naturalmente presentes no

leite (TORRES & CHANDAN, 1981). No trabalho realizado por Torres-Llanez et

al (2006), a espécie predominante foi Lactococcus lactis subsp. lactis, seguida por

Enterococcus faecium e Lactobacillus casei. No entanto, no queijo Jben, fabricado

no Marrocos, com características semelhantes, Lactobacillus foi o gênero dominante

(34 % dos isolados), com destaque para a espécie Lactobacillus plantarum

(OUADGHIRI et al, 2005).

Estudo correlacionando a microbiota presente em queijos em diferentes

épocas do ano demonstrou variações sazonais na qualidade do leite e queijo dentro

do mesmo ano, bem como variações decorrentes da localização geográfica.

(TAVARIA et al, 2000).

No Brasil, uma das raras literaturas sobre BAL em queijos artesanais aponta

a espécie Lactobacillus plantarum como a predominante ao longo da fabricação do

queijo Canastra (BORELLI, 2006). O autor assinala as espécies Lactobacillus

plantarum e Lactobacillus casei como os microrganismos que potencialmente

poderiam ser utilizados como componentes da cultura iniciadora na fabricação desse

produto.

2.5 Leveduras

Levedura, por definição, é um microrganismo unicelular, que se reproduz

principalmente por brotamento. Não pertence a um grupo formal, o crescimento

leveduriforme é exibido por grande número de microrganismos não relacionados

entre si. Existem pelo menos 80 gêneros de leveduras com aproximadamente 600

espécies conhecidas (RAVEN et al, 2001) .

Ao microscópio, leveduras diferenciam-se de bactérias pela maior dimensão

das suas células, podendo variar de 5 a 8 mm de diâmetro. Crescem em uma ampla

faixa de pH ácido, em até 18 % de etanol e em presença de 55 % a 60 % de sacarose.

As colônias de leveduras são geralmente de consistência cremosa, brilhantes ou

opacas, de cor branca a creme, mas podem apresentar coloração do marfim ao

vermelho (JAY, 2005).

Leveduras produzem células simples, arredondadas, ovais ou alongadas, que

se reproduzem quase sempre por brotamento, geralmente na região polar. Algumas

leveduras podem produzir brotos, simultaneamente, em vários pontos. No processo

de brotamento, a célula-mãe origina uma gêmula, o blastoconídio (ou blastóporo)

(Figura 4). Os brotamentos são liberados da célula-mãe, formando células

independentes, ou continuam unidos, formando células alongadas, chamadas

pseudo-hifa, que se diferenciam das hifas verdadeiras, por apresentarem constrição

nos septos. Dentre os esporos assexuais mais comuns ainda podem-se citar os

artroconídios (Figura 5), que são células que se separam a partir de uma hifa em

crescimento (típico do gênero Trichosporon) e os clamidoconídios (Figura 6), os

quais podem ser reconhecidos pelas espessas paredes que apresentam e que são

facilmente observados em Candida albicans (LARPENT et al, 1991; RAVEN et al,

2001; JAY, 2005).

Figura 4. Blastoconídio e pseudo-hifa

Figura 5. Artroconídio

Figura 6. Clamidoconídio

As leveduras, segundo sua capacidade de reproduzir de forma sexuada, são

agrupadas em duas grandes classes: Ascomycetes, também conhecidos como

“leveduras verdadeiras”, ou ainda, leveduras ascosporogeneas, que formam em

certas condições, ascósporos no interior da célula. Outras são capazes de elaborar

esporos externos, essas são as leveduras pertencentes ao grupo Basidiomycetes.

“Leveduras falsas”, nas quais somente a reprodução assexuada é conhecida, formam

um conjunto artificial, conhecido por Deuteromycetes. Essas são incapazes de

formar ascósporos ou basidiósporos em condições habituais de laboratório. Com

base em suas características gerais, muitos deuteromicetos são ascomicetos ou

basidiomicetos, reproduzindo-se somente assexuadamente, em uma condição

também conhecida como estado anamorfo (LARPENT et al, 1991; RAVEN et al,

2001; JAY, 2005).

Várias espécies de leveduras têm sido descritas em seu estado anamorfo,

devido ao desconhecimento do seu modo de reprodução sexual (estado teleomorfo).

Em algumas leveduras, a habilidade de formar esporos sexuais ainda é

desconhecida. Porém, uma vez descoberto o teleomorfo para uma espécie conhecida

anteriormente como anamorfa, os nomes passam a ser sinônimos (DEÁK &

BEUCHAT, 1986). Observam-se, na tabela 3, algumas leveduras presentes em

alimentos e o respectivo sinônimo quando em estado anamorfo.

Tabela 3. Leveduras presentes em alimentos e seus anamorfos.

Teleomorfo

Anamorfo

Citeromyces matritensis

Candida globosa

(

C. globosa

)

Clavispora lusitaniae

C. lusitaniae

Debaryomyces hansenii

C. famata

Dekkera anômala

(

D. anômala

)

Brettanomyces anomalus

D. bruxellensis

B. bruxellensis

D. intermed

B. intermédia

Dipodascus geotrichum

Geotrichum candidum

Filobasidium capsuligenum

(F. capsuligenum)

Candida japonica

F. uniguttulatum

Cryptococcus uniguttulantus

(Cr. uniguttulantus)

Filobasidiella neoformans

Cr. neoformans

Hanseniaspora guilliermo

ndi

(H. guilliermondi)

Kloeckera apis

(K. apis)

H. occidentais

K. javanensis

H. osmophila

K. corticis

H. uvarum

K. apiculata

H. valbyensis

K. japonica

H. vinae

K. africana

Hyphopichia burtonii

Candida variabilis

Issatchenkia orientalis

C. krusei

yveromyces lactis

(

Kl.lactis

)

C. sphaerica

Kl. marxianus

C. kefyr

Kl. thermotolerans

C. dattila

Leucosporidium scottii

C. scottii

Metschnokowia pulcherrima

C. pulcherrima

M. reukaufii

C. reukaufii

Pichia anômala

(P.

anomala

)

C. pelliculosa

P. canad

ensis

C. melinii

P. capisulata

C. molischiana

P. fabianii

C. fabianii

P. fermentans

C. lambica

P. guilliermondii

C. guilliermondii

P. holstii

C. silvícola

P. humboldtii

C. ingens

P. jadinii

C. utilis

P. membranaefaciens

C. valida

P. nakasei

C.citr

P. norvegensis

C. norvegensis

P. stipitis

C. shehatae

Rhodosporidium infirmo

miniatum

(R. infirmo- miniatum)

Cr. infirmo-miniatus

R. toruloides

Rhodotorula glutinis

(

Rd. glutinis

)

R. paludigenum

Rd. graminis

R. dacryoideum

Rd.. minuta

Saccharomy

ces cerevisiae

(

S. cerevisiae

)

Candida robusta

S. exiguus

C. holmii

Sporidiobolus pararoseus

(

Sp. pararoseus

)

Sporobolomyces shibatanus

(

Sb. shibatanus

)

Sp. salmonicor

Sb. laurentii

Tremela auratia

Cr. laurentii

Torulaspora delbruekii

C. colliculosa

Wickerhamiella domercqiae

C. domercqiae

Yarrowia lipolytica

C. lipolytica

Zygosaccharomyces rouxii

C. mogii

Fonte: DEÁK & BEUCHAT, 1986.

As fontes de carbono são de grande importância para as leveduras, pois

propiciam a biossíntese de constituintes celulares variados como açúcares, lipídios,

proteínas, ácidos nucléicos, entre outros, e a sua oxidação fornece energia para a

célula (RAVEN et al, 2001). A via de degradação dos glicídios é a glicólise, onde a

glicose é oxidada a piruvato. Segundo Larpent et al (1991), dependendo da forma

como o piruvato é catabolizado, as leveduras podem ser divididas em dois grupos.

1. Aeróbios estritos: organismos que apresentam metabolismo exclusivamente

respiratório, sendo o piruvato oxidado pelo ciclo de Krebs. A incapacidade desses

organismos em fermentar pode ser explicada pela ausência da álcool desidrogenase,

enzima catalisadora da redução de acetaldeído a etanol. São exemplos desse grupo

os gêneros: Rhodotorula, Rhodosporidium, Lipomyces, Saccharomycopsis,

Cryptococcus e Sporobolomyces e espécies como: Candida famata, Pichia fluxuum,

Debaryomyces hansenii e Hansenula canadiesis. 2. Anaeróbios facultativos: nesses

organismos, o açúcar é metabolizado em etanol pela fermentação, quando em

situação de anaerobiose. Durante o crescimento em aerobiose, tanto a respiração

quanto a fermentação contribuem para a degradação da glicose. Segundo a

importância dessas vias metabólicas, dois subgrupos podem ser observados: a)

leveduras do tipo respiratório: durante o crescimento em presença de oxigênio,

menos de 30 % da glicose é fermentada. A intensidade respiratória é elevada e a

glicose é degradada em CO

e água, resultando em alto rendimento energético; b)

leveduras do tipo fermentativa: durante o crescimento em presença de oxigênio,

grande parte da glicose é fermentada (> 90 %) , a intensidade respiratória é fraca e

os glicídios, incompletamente oxidados a etanol. O rendimento energético é pequeno

e o crescimento é frequentemente mais lento que no caso precedente. Podem-se

observar, na Figura 7, pode-se observar as vias metabólicas utilizadas pelas

leveduras em aerobiose e anaerobiose.

Glicose-6-fosfato

NADH

Piruvato

ATP

Glicose-6-fosfato

Triose fosfato

Piruvato

Etanol Oxaloacetato

Succinato

Açúcar

mitocôndria

Respiração Aeróbica Fermentação Anaeróbica

Oxigênio

Ciclo do Ácido Cítrico

Fosforilação Oxidativa

Açúcar

Glicerol

Etanol

Succinato

célula

Adaptado de Larpent et al (1991).

Figura 7. Vias metabólicas em aerobiose e anaerobiose

2.5.1 Leveduras em alimentos

Leveduras apresentam grande significado em alimentos, devido a sua

capacidade de causar deterioração ou conduzir a uma fermentação desejável.

Tradicionalmente e do ponto de vista econômico, são os microrganismos mais

importantes, explorados pelo homem. São utilizadas na produção de pão, cerveja,

vinho e outras bebidas alcoólicas, assim como etanol para combustível, extrato de

levedura, pigmentos, probióticos e outras substâncias específicas para uso em

alimentos e pela indústria farmacêutica (FLEET, 1990; JAKOBSEN & NARVHUS,

1996).

Deák e Beuchat (1987), com base numa extensa pesquisa na literatura desde

a década de 1950, compilaram uma lista com 215 espécies de leveduras já citadas

em alimentos. Nessa lista, são representados 43 gêneros de leveduras. Quase a

metade das espécies vem dos gêneros Candida e Pichia (73 e 31 espécies,

respectivamente). Desse total, 50 espécies podem ser consideradas comumente

associadas com alimentos, sendo encontradas principalmente em deterioração. As 20

espécies mais freqüentes de leveduras, difundidas em quase todos os tipos de

alimento estão listadas na Tabela 4.

Tabela 4. Espécies de leveduras mais freqüentes em alimentos

Espécies

Ocorrência

Candida glabrata

(

C. glabrata

)

A, B, C, D, E, G, I

C. sake

A, D, E, F, G, I, K

C. tropicalis

A, B, C, D, E, F, G, H, I

C. versatilis

A, B, C, E, F, G, I

Cryptococcus albidus

A, D, E, G, H, I, K

Debaryomyces hansenii

A, B, C, D, E, F, G, H, I

Issatchenkia orientalis

A, B, C, D, E, F, G, H, I

Kluyveromyces marxianus

A, C, D, E, F, H, I

Pichia

anomala

(

P. anomala

)

A, B, C, D, E, F, G, K

P. fermentans

A, B, C, D, E, F, G, H, I, K

P. guilliermondii

A, B, C, D, E, F, G, H, I

P. membranaefaciens

A, B, C, D, E, F, G, H, I

Rhodotorula glutinis

(

R. glutinis

)

A, B, D, E, F, G, H, I, K

R. mucilagino

A, C, D, E, F, G, H, I, K

Saccharomyces cerevisiae

(S. cerevisiae)

A, B, C, D, E, F, G, I, K

S. exiguus

A, B, C, D, E, F, G, H, I

Sporobolomyces roseus

A, C, E, F, G, H, K

Torulaspora delbrueckii

A, B, C, D, E, F, G, H, I, K

Zygosaccharomyces bail

(Z. bailii)

A, C, D, E, F, I

Z. rouxii

A, B, C, D, E, F, H, I

Fonte:

Deák e Beuchat (1987)

Ocorrência: A: frutas, vegetais, saladas cruas; B: alimentos fermentados, salgados ; C: concentrados,

xaropes, geléias, mel; D: bebidas, refrigerantes, sucos; E: mosto, vinho, cidra; F: cerveja, ale; G:

carne, frango, derivados cárneos; H: leite, queijo, derivados láticos; I: outros produtos alimentícios

(ex: massas, pães, confeitarias, saladas,etc); K: ambiente da indústria alimentícia, ar, piso, esgoto.

Jay (2005) destaca 14 gêneros de leveduras de interesse em alimentos que

serão descritos, sucintamente, a seguir:

Brettanomyces: Leveduras fermentativas. Brotamento multilateral. Pseudomicélio e

micélio verdadeiro não septado possíveis. Produzem ácido acético a partir de glicose

em condições de aerobiose. Causam deterioração em cerveja, vinho, refrigerante e

conserva.

Candida: Fermentativas ou não. Brotamento multilateral ou polar. Pseudomicélio e

micélio verdadeiro possíveis. Os membros desse gênero são as leveduras mais

comuns em carne de gado crua moída e em carne de frango. Candida tropicalis é a

levedura mais encontrada em alimentos em geral.

Cryptococcus: Não fermentativas. Brotamento multilateral. Pseudomicélio ausente

ou rudimentar. Colônias mucosas, hialinas ou vermelho-alaranjadas, devido a

pigmentos carotenóides. Representam o anamorfo da Filobasidiella e de outros

Basiodiomycetes. São encontradas em plantas, solos, morangos e outras frutas,

peixes marinhos, camarão e carne de gado crua e moída.

Debaryomyces: Fermentação fraca. Brotamento multilateral. Pseudomicélio pode

estar presente. São também produtoras de esporos. Constituem um dos dois gêneros

mais encontrados em produtos lácteos. Crescem em salmoura e em queijos e causam

deterioração em suco de laranja concentrado e em iogurte.

Hanseniaspora: Leveduras fermentativas. Brotamento bipolar. São anamorfas das

Kloeckera spp. Ascósporos em forma de chapéu. Podem sem encontradas em uma

grande variedade de alimentos, principalmente figos, tomates, morangos, frutas

cítricas e na fermentação dos grãos de cacau.

Issatchenkia: Leveduras fermentativas. Brotamento multilateral. Produzem

pseudomicélios. Formam película em meio líquido. São comuns em grande

variedade de alimentos.

Kluyveromyces: Fermentativas. Brotamento multilateral. Produzem ascósporos. A

Kluyveromyces marxianus é uma das duas leveduras mais comuns em produtos

lácteos. É encontrada em grande variedade de frutas, sendo responsável pela

deterioração de queijos.

Pichia: Fermentação variável. Brotamento multilateral, pseudomicélio freqüentes e,

às vezes, produzem hifas verdadeiras. Podem formar artrósporos. Ascos

normalmente contêm quatro esporos esféricos, em forma de chapéu, ou semelhante a

saturno. Algumas são encontradas em peixes fresco e em camarão. Crescem em

salmoura de azeitonas e causam deterioração de picles e chucrute.

Rhodotorula: Não-fermentativas. Brotamento multilateral. Pseudo e verdadeiro

micélio possível. Produzem pigmentos rosados ou vermelhos e a maioria possui cor

laranja ou rosa-salmão. São anamorfas dos Basidiomycetes. Este gênero possui

muitas espécies psicrotróficas, podem ser encontradas em carne de frango, camarão,

peixes e carne de gado fresca. Algumas crescem na superfície da manteiga.

Saccharomyces: Apresentam rápida fermentação. Brotamento multilateral com a

possibilidade de formação de pseudomicélio. Ascósporos esféricos ou ovalares.

Todas as leveduras do pão, da cerveja, do vinho e do champanha são S. cerevisiae.

São encontradas em grãos de Kefir e podem ser isoladas de uma grande variedade de

alimentos, como salames secos e maturados e muitas frutas.

Schizosaccharomyces: Fermentativas e respiratórias. Multiplicação vegetativa por

fissão. Presença de micélio e,ou, artróporos. Formadoras de ascósporos esféricos,

ovalares ou reniformes. Osmofílicas e resistentes a alguns conservantes químicos.

Torulaspora: Forte fermentação. Brotamento multilateral, sem formação de

pseudomicélios. Ascósporos esféricos ou elipsóides. Torulaspora delbruekii é a

espécie mais comum.

Trichosporon: Fermentação fraca ou ausente. Multiplicam-se por brotamento e por

formação de artroconídio. Pseudomicélios e micélio verdadeiro abundantes. Já

foram isoladas de camarão fresco, carne de gado moída, frango, ovelha congelada,

entre outros alimentos.

Zygosaccharomyces: Apresentam forte fermentação. Brotamento multilateral,

pseudomicélio possível. Ascósporos em forma de feijão estão livres nos ascos.

Algumas estão envolvidas na fermentação do shoyo e do miso e outras deterioram

maionese e molhos para saladas.

2.5.1.1 Leveduras em produtos láticos

Embora a atividade fermentativa e de deterioração das leveduras seja bem

conhecida em muitos alimentos e bebidas, pouco se sabe a respeito da sua

ocorrência e significância nos derivados lácteos (FLEET, 1990). Usualmente, são

detectadas em grande quantidade, refletindo uma boa adaptação ao substrato rico em

proteínas, lipídios, açúcar e ácidos orgânicos. Sua ampla distribuição é conseqüência

da atividade lipolítica e proteolítica, da habilidade em fermentar/assimilar lactose, de

utilizar ácidos orgânicos, da capacidade de crescimento em baixas temperaturas e da

baixa atividade de água e resistência a compostos de limpeza e sanificação (FLEET,

1990; JAKOBSEN & NARVHUS, 1996; PRAPHAILONG & FLEET, 1997;

FADDA et al, 2004).

Nesses produtos, as leveduras podem interagir com outros microrganismos

de diferentes formas, inibindo ou eliminando microrganismos indesejáveis,

causadores de defeitos ou potencialmente patogênicos; podem agir de forma a inibir

as culturas iniciadoras; ou, ainda, contribuir positivamente em processos de

fermentação ou maturação, apoiando a função das culturas iniciadoras (JAKOBSEN

& NARVHUS, 1996).

Como parte da comunidade microbiana, juntamente com bactérias, leveduras

podem contribuir para as características sensoriais do kefir, koumiss e de diferentes

variedades de queijo, influenciando a biossíntese de compostos aromáticos

(ZOURARI & ANIFANTAKIS, 1988; ROOSTITA & FLEET, 1996a). Por outro

lado, leveduras podem causar a deterioração dos derivados láticos, sendo os defeitos

tipicamente observados: produção de gás, alteração no sabor e aroma, descoloração

e mudança de textura (FLEET, 1990; JAKOBSEN & NARVHUS, 1996). Um

aumento no índice de deterioração é observado quando os produtos são

suplementados ou decorados com frutas, mel, açúcar, castanhas, que são fontes de

contaminação, além de fornecerem nutrientes para o crescimento e fermentação das

leveduras (JAKOBSEN & NARVHUS, 1996).

Leveduras podem estar presentes ao longo da cadeia produtiva do leite, da

fazenda até o produto acabado. Como contaminantes naturais, as leveduras estão

amplamente distribuídas no ambiente da ordenha, no leite cru e em utensílios

(LOPANDIC et al, 2006). Embora o leite cru e o leite pasteurizado sejam

freqüentemente contaminados por leveduras, as populações são geralmente baixas

(<10

UFC.mL

-1

), quando comparadas com as das bactérias, sugerindo que o rápido

crescimento das bactérias restringe o crescimento das leveduras (FLEET, 1990;

ROOSTITA & FLEET, 1996).

Tudor e Board (1993) citados por Jakobsen e Narvhus (1996), apontam

Cryptococcus sp. e, em particular, Candida diffluens e Candida famata (estádio

imperfeito de Debaryomyces hansenii) como contaminantes comuns em leites

pasteurizados. Fleet e Mian (1987), em uma pesquisa com 26 amostras de leite

pasteurizado, descreveram, em ordem decrescente de freqüência, o isolamento de

Candida famata, Kluyveromyces marxianus, Cryptococcus flavus e Candida

diflluens. Em pesquisa realizada com leite pasteurizado, no interior de São Paulo,

Gusmão (2005) verificou que, todos os isolados identificados pertenciam ao gênero

Debaryomyces, sendo 96,77 % dessas Debaryomyces hansenii var. fabryii e 3,23 %

Debaryomyces hansenii var. hansenii . Já para o leite cru, pouco foi relatado sobre

sua diversidade em leveduras. Spanamberg et al (2004) encontraram os gêneros

Kluyveromyces, Rhodotorula, Candida, Geotrichum e Triscoporon em 36 amostras

coletadas em diferentes municípios do Rio Grande do Sul. Embora existam diversas

fontes de contaminação possíveis para a contaminação do leite cru por leveduras,

isso não acontece com o leite pasteurizado, sugerindo que sua freqüência em leite

pasteurizado advenha de certo grau de tolerância ao processo de pasteurização

(FLEET & MIAN, 1987; VADILLO et al, 1987).

A ocorrência de leveduras em queijos é esperada, devido ao baixo pH, baixa

umidade, elevada concentração de sal e estocagem sob refrigeração desses produtos

(FLEET, 1990). Entre as espécies encontradas, as mais freqüentes pertencem aos

gêneros Kluyveromyces, Debaryomyces, Pichia, Saccharomyces, Torulopsis,

Candida e Rhodotorula, detectadas em diferentes estágios da fabricação e em

diferentes tipos de queijos (LARPENT et al, 1991).

Hoje, já é reconhecida a importante contribuição das leveduras no processo

de maturação de queijos, em que linhagens de Debaryomyces hansenii, Yarrowia

lipolytica, Kluyveromyces marxianus e Saccharomyces cerevisie, freqüentemente

estão presentes em concentrações elevadas. As leveduras contribuem para o

desenvolvimento do sabor, aroma e da textura, devido à proteólise, lipólise,

utilização do ácido lático, fermentação da lactose e autólise da sua biomassa

(NUÑEZ et al, 1981; FLEET, 2007). Debaryomyces hansenii e Yarrowia lipolytica

têm sido consideradas potenciais agentes de maturação em queijos. Ferreira e

Viljoen (2003) propõem o uso destas como adjuntas da cultura iniciadora para a

produção do queijo Cheddar.

Borelli et al (2006), ao pesquisarem as leveduras associadas à produção do

queijo Canastra, identificaram Debaryomyces hansenii, Kluyveromyces lactis,

Kodamea ohmeri e Torulaspora delbruekii como as espécies mais freqüentes no

fermento endógeno, na massa coagulada e no queijo. Os autores ressaltam a notável

ocorrência de Kodamea ohmeri, visto que é a primeira vez que tal espécie é

reportada, associada à fabricação de queijos.

Nahabieh e Schmidt (1990) contribuíram para o estudo da microbiota

leveduriforme em queijos artesanais franceses, fabricados com leite caprino. Esses

autores isolaram 879 linhagens de leveduras dos queijos Bougon, Sainte-Maure,

Chabichou, Crottin de Chavignol, Pouligny Saint-Pierre e Chevrotin e concluíram

que a microbiota leveduriforme dos queijos de cabra é dominada por Debaryomyces

hansenii e Saccharomyces cerevisiae, seguidos por Kluyveromyces marxianus.

Porém, na maioria dos queijos estudados, uma parte importante da microbiota foi

bem representada por espécies pouco encontradas nos queijos de leite de vaca, a

exemplo de Candida lipolytica e Candida intermedia, evidenciando certa

originalidade da microbiota dos queijos de cabra em relação àqueles fabricados com

leite de vaca.

Leveduras são as maiores causas de contaminação em iogurte. Quando

produzido sob boas condições, seguindo as boas práticas de fabricação, o produto

não deve conter mais que 10 UFC.g

-1

. A deterioração de iogurtes por leveduras é

geralmente reconhecida por mudanças no sabor, aroma e na perda de textura, devido

à produção de gás e à dilatação da embalagem. A presença desses microrganismos

está associada à falta de higiene durante o processamento (FLEET, 1990). Moreira

(1998), ao avaliar 72 amostras de iogurtes comercializados em Minas Gerais,

identificou 11 espécies de leveduras, sendo Debaryomyces hansenii e

Saccharomyces cerevisiae as mais freqüentes.

Outros produtos fermentados, que têm parte de suas características derivada

da atividade das leveduras, incluem kefir, koumiss e laben. São produzidos pela

fermentação do leite por BAL, leveduras e outras bactérias, como as acéticas

(FLEET, 1990). No caso do kefir, grãos compostos de polissacarídios microbianos

que apresentam estrutura complexa, onde as leveduras se localizam tanto interna

quanto externamente, a variação da microbiota leveduriforme é resultante das

diferentes origens do grão, porém as espécies Kluyveromyces marxianus, Candida

kefir, Candida pseudotropicalis, Saccharomyces cerevisiae, Saccharomyces

exiguus e Torulopsis holmii tem sido reportadas (ZOURARI & ANIFANTAKIS,

1988; FLEET, 1990).

3. OBJETIVOS

3.1 Geral

ü Determinar os parâmetros físico-químicos e caracterizar a microbiota

endógena do fermento utilizado na fabricação do queijo artesanal da

microrregião de Medeiros, na Serra da Canastra, com ênfase em leveduras,

nos períodos da água e da seca.

3.2 Específicos

ü Determinar pH, acidez titulável em ácido lático e cloreto de sódio do

fermento endógeno.

ü Determinar a contagem total de microrganismos mesófilos aeróbios,

coliformes totais, Escherichia coli, Salmonella sp., Listeria sp. e

Staphylococcus aureus.

ü Quantificar e isolar os principais grupos: Enterococcus, Lactobacillus,

Lactococcus, Leuconostoc, Streptococcus e leveduriformes.

ü Caracterizar e identificar as espécies leveduriformes predominantes no

fermento endógeno.

4. METODOLOGIA

4.1 Coleta das amostras

Alíquotas contendo 100 mL do fermento endógeno, utilizado em oito

unidades produtoras do queijo Canastra, foram coletadas assepticamente nas

respectivas propriedades situadas na cidade de Medeiros, MG. As mesmas

propriedades foram amostradas no período da seca (período de abril a setembro) e

no período das águas (período de outubro a março) do ano de 2006. Após cada

coleta, o material foi transportado sob refrigeração em caixas isotérmicas para os

laboratórios do Departamento de Tecnologia de Alimentos (DTA) da Universidade

Federal de Viçosa (UFV) onde foi utilizado para determinações físico-químicas e

microbiológicas.

4.2 Análises físico-químicas

Foram realizadas no Laboratório de Análises Físico-químicas de Leite e

Derivados do DTA/UFV.

4.2.1 Determinação da acidez titulável e do pH

A acidez titulável foi determinada segundo o método oficial para a referida

análise (BRASIL, 2006). Para a determinação do pH, uma alíquota de

aproximadamente 40 mL do fermento endógeno foi transferida para um becker, ao

qual foi inserido o eletrodo do medidor de pH digital (Tecnal modelo pH Meter-

102), obtendo-se leitura direta.

4.2.2 Determinação do cloreto de sódio

O teor de cloreto de sódio (NaCl) foi determinado pelo método titrimétrico,

segundo Pereira (2001).

4.3 Análises microbiológicas

Foram realizadas no Laboratório de Culturas Láticas da UFV. Alíquotas de

10 mL das amostras de cada unidade produtora foram transferidas para 90 mL de

solução tampão fosfato estéril e homogeneizadas. Diluições decimais foram

preparadas e plaqueadas em duplicata em diferentes meios.

4.3.1 Contagem total e contagem de microrganismos indicadores

• Contagem total de mesófilos aeróbios (APHA, 1992).

• Coliformes a 30

C e Escherichia coli (E. coli): Método Rápido Petrifilm da 3M

(AOAC 991.14 - Contagem de Coliformes e E. coli em alimentos, película

reidratável seca).

• Staphylococcus aureus (S. aureus): Método Rápido Petrifilm da 3M (AOAC

981.15 - Rapid S. aureus (RSA) Count Plate).

• Salmonella sp.: Test Reveal - Salmonella Test System (AOAC 960801).

• Listeria sp.: Test Reveal - Listeria Test System (AOAC 960701).

4.3.2 Contagem da microbiota lática e leveduriforme

• Lactobacillus em MRS (De Man, Rogosa & Sharpe) (DE MAN et al, 1960)

modificado com a adição de etanol (WITTHUHN et al, 2004).

• Lacotococcus e Streptococcus em M17 (Oxoid, Basingstoke, Hampishire,

Inglaterra) (ERCOLINI et al, 2003).

• Leuconostoc em MRS (DE MAN et al, 1960) modificado pela adição de

vancomicina (WITTHUHN et al, 2004).

• Enterococcus em KF (Kenner fecal) (Oxoid, Bansingstoke, Hampishire,

Inglaterra).

• Leveduras em PDA (Potato dextrose agar) (Oxoid, Basingstoke, Hampishire,

Inglaterra), acidificado com ácido tartárico a 10 % (pH 3,5) e adicionado de

cloranfenicol (FADDA et al, 2004).

4.4 Isolamento e caracterização da microbiota lática

A partir das placas com os respectivos meios para cada grupo avaliado,

foram selecionadas colônias típicas em número correspondente à raiz quadrada da

contagem obtida, de acordo com recomendação do Bacteriological Analytical

Manual for Foods (FDA, 1972).

As estirpes de BAL isoladas foram submetidas ao teste morfológico e

tintorial de Gram e ao teste de catalase. Os isolados que se apresentaram catalase

negativos, Gram positivos, em forma de coco ou bacilo, foram repicados em LDR

10 % (leite desnatado reconstituído a 10 %), adicionados de 30 % de glicerol e

armazenados à temperatura de -80

C, para posterior caracterização e identificação.

4.5 Isolamento, caracterização e identificação das leveduras

As leveduras foram isoladas a partir das placas, em meio de cultura PDA, em

número igual ao da raiz quadrada da contagem, segundo recomendação do

Bacteriological Analytical Manual for Foods (FDA, 1972). As colônias selecionadas

foram inoculadas em tubos (15 mm x 100 mm) contendo PDA inclinado estéril e

incubadas a 28

C, por 48 h. Posteriormente, todos os isolados foram reespalhados

em placas contendo PDA, caracterizados quanto às suas características

macroscópicas e observados ao microscópio para verificação da sua morfologia e

pureza.

No estudo taxonômico dos isolados leveduriformes, realizaram-se os testes

de assimilação e fermentação propostos por Griffiths (1981). Os isolados foram

submetidos aos testes de fermentação de sacarose, glicose, galactose e lactose. Para

assimilação de fontes de carbono, foram crescidos na presença de maltose,

galactose, lactose, eritritol, amido solúvel, ribitol, sacarose, inositol, celobiose,

rafinose, nitrato, manitol, melibiose e xilose. Ainda, foram testados quanto à

capacidade de crescerem em meio contendo 50 % de glicose, 10 % de NaCl e em

temperatura de 37

C. A identificação dos isolados foi realizada segundo as chaves

descritas por Lodder (1970).

Os mesmos isolados foram caracterizados usando o kit API

20 C AUX

(BioMerieux

SA, Marcy-l´Etoile/França), seguindo as recomendações do

fabricante. O kit API

20 C AUX consiste em 19 cúpulas plásticas, contendo em

cada uma delas diferente fonte de carbono, além de uma cúpula controle (negativo)

(Figura 8). As cúpulas foram inoculadas com as leveduras suspensas em um meio

mínimo e incubadas a 29

C (± 2

C). A leitura dos resultados foi realizada após 48

h e 72 h, comparando-se o crescimento nas 19 cúpulas a cúpula controle.

Realizaram-se teste morfológico para determinação da presença de hifa ou pseudo-

hifa. Este teste constitui o vigésimo primeiro teste proposto pelo método. A

identificação foi obtida a partir do perfil numérico resultante do somatório dos

resultados positivos processados em um programa de identificação (Apiweb

). A

base de dados do API

20 C AUX inclui 45 espécies.

Testes Negativos

Testes Positivos

Figura 8. Cúpulas para testes de assimilação do kit API

20 C AUX

4.5.1 Meios de cultura utilizados na identificação

Meio basal para assimilação e fermentação de fontes de carbono (WICKERHAM,

1951).

Extrato de levedura

4,5

0 g

Peptona

7,50

Água destilada

1000 mL

Meio YEPD caldo com 50 % de glicose para teste de tolerância osmótica

(BARNETT et al, 1983)

Extrato de levedura

10,00 g

Peptona

10,00 g

Dextrose

500,00 g

Água destilada

1000 mL

Meio YEPD caldo com 10 % de NaCl para teste de tolerância osmótica (KREGER-

VAN RIJ, 1984)

Extrato de l

evedura

10,00 g

Peptona

10,00 g

Dextrose

20,00 g

NaCl

100,00 g

Água destilada

1000 mL

Meio ágar amido para teste de hidrólise de amido (MENDONÇA, 2000)

Extrato de carne

3,00 g

Peptona

5,00 g

Amido

2,00 g

Ágar

15,00 g

Água destilada

1000 mL

Meio GPY para crescimento a temperatura de 37

C ( KREGER-VAN RIJ, 1984)

Glicose

20,00 g

Peptona

10,00 g

Extrato de levedura

5,00 g

Água destilada

1000 mL

Meio mínimo para esgotamento das reservas de açúcares (MENDONÇA, 2000)

Extrato de levedur

10,00 g

Peptona

20,00 g

Água destilada

1000 mL

4.5.2 Avaliações bioquímicas e físicas

4.5.2.1 Assimilação e fermentação de fontes de carbono

Para esses testes, os isolados foram crescidos em meio mínimo para o

esgotamento das suas reservas nutritivas. Uma alíquota de 0,1 mL foi inoculada em

tubos contendo o meio basal mais a fonte de carbono a ser testada, na proporção de

2 % (exceto para rafinose, para a qual se utilizou 4 %).

Nos testes de fermentação, utilizou-se o mesmo critério, porém foram

acrescentados tubos de Durhan. Nos testes de assimilação, tubos-testemunha foram

preparados contendo meio basal e glicose (controle positivo) e apenas o meio basal

(controle negativo) (Figura 9).

Figura 9. Controle positivo e negativo para o teste de assimilação.

Após inoculação, os isolados foram incubados à temperatura de 28

C, por

até 10 dias. A assimilação de cada uma das fontes de carbono testadas foi verificada,

comparando-se cada tubo testado com os respectivos tubos testemunhas,

considerando-o positivo quando observada formação de massa celular ou turvação

do meio, quando comparado ao controle negativo.

Para os testes de fermentação, observou-se a formação ou não de gás no

interior dos tubos de Durhan. Considerou-se resultado positivo as amostras com

produção de gás em, pelo menos, 1/3 do volume do tubo de Durham (Figura 10)

+ + -

Figura 10. Potencial fermentativo.

4.5.2.2 Crescimento à temperatura de 37

Utilizando-se o meio GPY, alíquotas de 3,0 mL foram transferidas para tubos

e inoculadas com o auxílio de uma alça de platina. Após 48 h a 72 h de incubação,

os tubos que apresentaram massa celular ou turvação do meio, foram considerados

positivos.

4.5.2.3 Tolerância osmótica

Tubos contendo 3,0 mL do meio YEPD – 50 % de glicose e YEPD – 10 %

de NaCl foram inoculados com os isolados a serem testados e incubados a 28

C ,

sendo as leituras realizadas após 48 h e 72 h de incubação. Os tubos que

apresentaram massa celular ou turvação do meio foram considerados positivos.

4.5.2.4 Redução de nitrato

Alíquotas de 5,0 mL do meio basal, acrescidas com 0,78 g.L

-1

de nitrato de

potássio, foram inoculadas com os isolados a serem testados e incubados a 28

Após sete dias, inoculou-se um segundo tubo contendo o mesmo meio com 0,1 mL

do tubo anterior, reincubando-se nas mesmas condições. O surgimento de turvação

após sete dias foi interpretado como resultado positivo.

4.5.2.5 Hidrólise de amido

Os isolados foram inoculados em placas de petri com ágar amido, com o

auxílio de uma alça de platina. Após incubação a 28

C, por 48 h, adicionou-se

solução de lugol sobre as colônias. O surgimento de um halo claro ao redor das

colônias foi interpretado como resultado positivo.

4.6 Análises estatísticas

Foi realizada a análise de variância, considerando-se o delineamento

experimental em blocos casualizados com oito repetições (unidades produtoras) em

que se verificou o efeito do período de coleta (tratamentos) do fermento endógeno

sobre as variáveis estudadas. Foram realizados o teste F, a 5 % de significância

para os parâmetros físico-químicos e o teste Kruskal-Wallis, a 5 % para os

parâmetros microbiológicos.

5. RESULTADOS E DISCUSSÃO

5.1 Análises Físico-químicas

Os resultados referentes às concentrações de NaCl, acidez titulável e ao pH

das amostras de fermento endógeno coletados nas 8 propriedades amostradas, no

período das águas (PA) e no período da seca (PS), são mostrados na tabela 5.

Tabela 5. Parâmetros físico-químicos do fermento endógeno coletado no município

de Medeiros, região da Serra da Canastra/MG, nos períodos das águas

(PA) e da seca (PS).

Unidades

Produtoras

Acidez em Ácido Lático (%)

NaCl (%)

0,65

0,63

5,10

5,06

6,50

5,40

0,50

0,47

4,66

5,39

7,69

6,13

0,69

1,03

4,66

5,04

4,14

2,00

0,71

0,61

5,07

5,28

8,87

8,90

0,45

0,80

5,38

5,15

11,24

2,60

0,45

0,60

5,40

5,12

7,69

4,10

0,60

0,59

4,81

4,70

5,32

1,70

0,50

0,57

5,10

5,79

7,69

2,25

Médias

0,56a

0,66a

5,02a

5,07a

7,39a

4,13b

Médias para cada parâmetro, seguidas da mesma letra, não diferem entre si, pelo teste F a 5% de

probabilidade (P<0,05).

Observa-se na Tabela 5 que os resultados de acidez e pH não apresentaram

diferenças significativas entre os dois períodos avaliados. Os valores de acidez

encontrados no PA variaram entre 0,45 % e 0,71 % e, no PS, entre 0,47 % e 1,03 %.

Os resultados de pH, no PA, variaram entre 4,66 e 5,40 e no PS entre 4,70 e 5,79.

O fermento endógeno utilizado na fabricação do queijo Canastra permanece

a temperatura ambiente até o momento da sua utilização. Essa prática, aliada a

moderada temperatura encontrada na região, resultaram em valores médios de pH e

acidez, que permitem o crescimento de uma gama de microrganismos, como BAL ,

BAL não-iniciadoras, mofos, leveduras e algumas bactérias patogênicas, a exemplo

de S. aureus e E. coli (BETTS et al, 1998; GOBBETTI et al, 1999; JAY, 2005).

Fermentos naturais, fabricados a partir do soro, utilizados na Itália

(PARENTE et al, 1997) e Argentina (REINHEIMER et al, 1994, 1996), são

incubados até o momento da sua utilização e atingem baixos valores de pH e

elevada acidez. No fermento endógeno obtido a partir do soro, utilizado na região de

Santa Fé, Argentina, Reinheimer et al (1994), observaram altos níveis de acidez

(1,2 % a 1,4 %) e valor médio do pH de 3,3. Os autores encontraram BAL

termofílicas, cujas espécies dominantes foram Lactobacillus helveticus (Lb.

helveticus) e Lb. delbrueckii subsp. lactis e leveduras, como únicos contaminantes

naturais. Todos estes microrganismos apresentam boa tolerância a baixos valores de

pH.

O teor de NaCl foi o único parâmetro físico-químico a apresentar diferença

significativa entre os dois períodos amostrados. As concentrações de NaCl no PA

foram mais elevadas (P<0,05) e variaram de 4,14 % a 11,24 %, enquanto no PS,

variaram de 1,70 % a 8,90 %. Das oito unidades produtoras avaliadas, sete

aumentaram a concentração de NaCl no PA e uma manteve o mesmo percentual. O

teor de NaCl contribui de maneira expressiva para a modulação dos grupos

microbianos. Sabe-se, por exemplo, que patógenos como S. aureus e L.

monocytogenes apresentam alta tolerância ao sal e que as bactérias do ácido lático,

em geral, são pouco tolerantes.

A concentração de NaCl no fermento endógeno pode contribuir para

modulação da microbiota presente e, conseqüentemente, da microbiota do queijo

produzido com este fermento. A variação no teor de NaCl utilizado entre os

diferentes produtores do queijo Minas artesanal, assim como nos diferentes períodos

do ano, pode originar produtos com características distintas, mesmo quando

produzidos na mesma região e em condições semelhantes. Pimentel Filho et al

(2005), ao analisarem o fermento endógeno utilizado na fabricação do queijo

artesanal da região do Alto Paranaíba, encontraram amplitude de variação no teor

de NaCl ainda maior que a do presente trabalho, onde as concentrações variaram de

3,55 % a 22,38 %, em 15 amostras analisadas.

O conhecimento empírico dos produtores de queijo Minas artesanal assinala

o PA como o período do ano em que ocorre com maior freqüência a contaminação

dos queijos, caracterizado principalmente pelo estufamento precoce. Provavelmente,

por essa razão, nesse período do ano adiciona-se maior quantidade de NaCl ao

produto, na tentativa de inibir os causadores dessa contaminação.

A concentração de NaCl e o pH tem efeito sinergístico em relação ao

crescimento dos microrganismos (BETTS et al, 1998; JAY, 2005). Especial

importância deve ser dispensada a esses dois parâmetros, uma vez que podem ser os

principais moduladores da microbiota presente no fermento endógeno utilizado na

Serra da Canastra.

A falta de padronização ao longo do processamento dos queijos Minas

artesanal exige maior atenção por parte das entidades e associações ligadas a este

segmento. Variações no processamento refletirão nas características físico-químicas,

microbiológicas e sensoriais, dificultando o estabelecimento de descritores para

estes produtos. Somente através do estabelecimento de descritores e, conseqüente

caracterização dos queijos artesanais tradicionais mineiros, sua produção poderá ser

fortalecida e preservada.

5.2 Contagem total e de microrganismos indicadores

Na Tabela são mostrados os resultados da contagem total de mesófilos

aeróbios e de microrganismos indicadores, avaliados nos fermentos endógenos

provenientes do município de Medeiros, região da Serra da Canastra, MG, no PA e

PS.

Tabela 6. Parâmetros microbiológicos do fermento endógeno coletado no município de Medeiros,

região da Serra da Canastra/MG, nos períodos das águas (PA) e da seca (PS).

Unidades

Produtoras

Mesófilos aeróbios*

Coliformes a 30

E. coli*

S. aureus*

5,92

7,17

2,72

4,41

1,00

<1,00

1,77

1,60

5,85

7,27

1,47

<1,00

1,30

<1,00

2,14

2,23

6,11

7,99

4,20

3,61

1,00

<1,00

5,96

7,86

2,44

2,00

1,47

1,00

1,69

2,14

5,20

7,20

2,50

2,00

<1,00

2,00

2,07

1,84

4,14

7,73

1,60

2,30

1,30

2,30

1,00

2,75

6,39

7,80

3,04

2,77

<1,00

2,47

2,83

1,00

7,39

6,55

4,30

2,30

2,47

2,30

3,11

1,00

Medianas

5,94a

7,50b

2,30a

2,61a

1,50a

1,92a

1,72a

Letras diferentes entre as colunas, para uma mesma característica, indicam que existem diferenças entre as amostras pelo

teste de Kruskal-Wallis a 5% de probabilidade (P<0,05).

* Resultados em Log UFC. mL

-1

Foram observadas no PA contagens de mesófilos aeróbios de 1,4 x 10

UFC.

-1

a 2,5 x 10

UFC. mL

-1

e, no PS, as contagens de 3,6 x 10

UFC. mL

-1

a 9,9 x

UFC. mL

-1

. Os resultados indicam variações de três ciclos logaritmos no PA e

de um no PS. A contagem total de mesófilos aeróbios foi significativamente menor

no PA, época na qual, como discutido no item anterior, os produtores adicionam

uma maior quantidade de NaCl ao queijo, na tentativa de inibir as possíveis

contaminações, mais freqüentes nesse período do ano. Esse maior percentual de sal

adicionado favoreceu a inibição da microbiota mais sensível, gerando, por

conseqüência, a diminuição da contagem total de mesófilos.

Borelli (2006), ao avaliar o fermento endógeno da mesma região, encontrou

em três propriedades pesquisadas os valores >1,0 x 10

UFC. mL

-1

, 1,9 x 10

UFC.

-1

e 8,6 x 10

UFC. mL

-1

, respectivamente. Esses valores são semelhantes à média

encontrada neste trabalho no período das águas; porém o autor não especificou o

período em que realizou tais avaliações.

O grupo coliformes a 30

C e E. coli foi encontrado em praticamente todas

as amostras analisadas em ambos os períodos avaliados. A determinação da

concentração dos coliformes assume importância como parâmetro indicador da

possibilidade de existência de microrganismos patogênicos. Essas contagens

variaram de 3,0 x 10

UFC. mL

-1

a 2,0 x 10

UFC. mL

-1

e de < 1,0 x 10

UFC. mL

-1

a 4,1 x 10

UFC. mL

-1

, no PA e no PS, respectivamente. Já para E. coli , os valores

variaram de < 1,0 x 10

UFC. mL

-1

a 3,0 x 10

UFC. mL

-1

em ambos os períodos.

Os resultados de coliformes a 30

C e de E.coli, em ambos os períodos

avaliados, foram inferiores às médias encontradas por Borelli (2002) ao avaliar esses

parâmetros em 10 propriedades na mesma região, no período das águas. É possível

que a diminuição nas contagens seja reflexo das ações que vêm sendo desenvolvidas

para melhoria da qualidade do queijo artesanal, iniciadas com a promulgação da Lei

Estadual n

14.185, de 31 de janeiro de 2002, específica para os queijos artesanais.

Resultados semelhantes ao deste trabalho foram encontrados no fermento

endógeno utilizado para a fabricação do queijo Minas artesanal do Alto Paranaíba

(Pimental Filho et al, 2005). Os autores detectaram para coliformes totais e E. coli

contagens de até 6,3 x 10

UFC. mL

-1

e 1,0 x 10

UFC. mL

-1

, respectivamente, em

87 % das amostras analisadas.

As contagens de S. aureus foram numericamente superiores no PA, período

em que, as concentrações de NaCl, em média estiveram maiores. Os resultados

variaram de < 1,0 x 10

UFC. mL

-1

a 1,3 x 10

UFC. mL

-1

e de < 1,0 x 10

UFC.

-1

a 5,7 x 10

UFC. mL

-1

, no PA e no PS, respectivamente. O fermento endógeno

do Alto Paranaíba apresentou concentrações na mesma faixa observada nesta

avaliação (PIMENTAL FILHO et al, 2005). Porém, em pesquisa realizada por

Borelli (2002), na região da Serra da Canastra, no PA, os valores detectados para S.

aureus foram superiores ao do presente estudo, em ambos os períodos avaliados.

A legislação vigente para queijos artesanais preconiza a ausência de Listeria

monocytogenes e Salmonella sp. em 25 g do produto. Apesar da falta de legislação

para o fermento endógeno, esses dois microrganismos foram determinados e, a

exceção do produtor 7, no PA, onde foi detectada a presença de Salmonella sp.,

todos os demais produtores apresentaram ausência para esses dois parâmetros.

Embora o fermento endógeno do produtor 7, no PA, tenha indicado a presença de

Salmonella sp., este microrganismo não estava presente no queijo fabricado a partir

deste fermento, em análise realizada no produto com oito dias de maturação (dados

não mostrados).

Borelli (2006), estudando a produção de substâncias antagonistas em BAL

isoladas do queijo Canastra, constatou que vários desses isolados foram capazes de

produzir substâncias antagonistas contra Salmonella enterica subsp. enterica

sorotipo Typhimurium. Este fato infere importância à pesquisa com queijos

artesanais mineiros, como uma promissora fonte de novas estirpes de interesse

industrial, com capacidade antagonista frente à patógenos.

5.3 Contagem da microbiota lática e leveduriforme

Na Tabela 7 são mostrados os resultados das contagens dos grupos láticos e

leveduriformes avaliados no PA e PS, no município de Medeiros, região da Serra da

Canastra, MG.

Tabela 7. Valores da contagem da microbiota lática e leveduriforme do fermento endógeno coletado

no município de Medeiros, região da Serra da Canastra/MG, nos períodos das águas (PA) e

da seca (PS).

Unidades

Produtoras

Lactococcus/

Streptococcus*

Enterococcus* Lactobacillus* Leuconostoc*

Leveduras*

6,32

7,00

5,65

5,94

5,44

6,20

6,04

6,27

2,41

5,89

6,86

5,66

5,90

5,14

4,91

8,72

5,41

6,77

2,66

2,47

7,49

7,04

5,17

4,54

5,98

5,11

5,83

5,27

5,75

2,54

7,07

6,47

7,11

4,92

6,04

6,38

6,95

5,27

5,75

4,60

7,23

4,97

6,89

< 4,00

5,79

4,44

6,76

4,49

6,14

2,17

6,25

7,34

6,07

6,69

5,07

7,38

4,44

7,27

2,68

5,14

7,14

6,99

7,17

< 4,00

6,34

6,76

5,97

7,56

5,90

6,59

7,07

8,14

6,92

6,51

,61

6,41

6,23

6,75

4,73

3,72

Medianas

7,07a

6,99a

6,48a

5,54a

5,70a

6,39a

6,00a

6,51a

5,24a

4,16a

Letras diferentes entre as colunas, para uma mesma característica, indicam que existem diferenças entre as amostras pelo

teste de Kruskal-Wallis a 5% de probabilidade (P<0,05).

* Resultados em Log UFC. mL

-1

Foram observadas altas contagens de BAL, ficando evidenciado que esse grupo

compõe a microbiota dominante do fermento endógeno da Serra da Canastra. As

contagens dos grupos de BAL avaliados foram estatisticamente iguais (P>0,05), nos

dois períodos analisados. No entanto, as contagens de Lactococcus/Streptococcus e

Enterococcus apresentaram valores numericamente superiores no PA. Do mesmo modo,

os gêneros Lactobacillus e Leuconostoc foram numericamente superiores no PS. Borelli

(2006), ao analisar o fermento endógeno da mesma região, encontrou elevadas

populações de BAL, tendo como espécies mais freqüentes Lactobacillus plantarum (Lb.

plantarum) e Lb. casei.

Para leveduras, as contagens foram semelhantes (P>0,05) em ambos os períodos

avaliados, embora no PA tenham apresentado valores numericamente superiores. Os

resultados variaram de 2,6 x 10

UFC. mL

-1

a 1,4 x 10

UFC. mL

-1

no período das águas

e de 1,5 x 10

UFC. mL

-1

a 3,9 x 10

UFC. mL

-1

no período da seca. Borelli (2006), ao

analisar o fermento endógeno em três propriedades da Serra da Canastra, detectou

leveduras na faixa de 6,7 x 10

UFC. mL

-1

a 2,3 x 10

UFC. mL

-1

No PA, os resultados da contagem de levedura foram um ciclo logaritmo maior

que no PS, talvez devido ao aumento da concentração de sal, detectado no PA, visto

que, leveduras apresentam boa tolerância a sal.

5.4 Isolamento e caracterização preliminar da microbiota lática e leveduriforme

O número de isolados e a morfologia da microbiota lática e leveduriforme

isolados do fermento endógeno, em meios de cultura específicos, estão indicados na

Tabela 8.

Dos 605 isolados em meios seletivos para isolamento de BAL, 400

sobreviveram a purificação e as condições de laboratório e foram submetidos a uma

caracterização preliminar. Desses, 77,75 % corresponderam à morfologia de cocos e

22,25 % à morfologia de cocobacilos / bacilos. Todos apresentaram características

Gram positivas e apenas cinco isolados no meio M17 foram positivos para teste de

catalase. Os 118 isolados no meio PDA foram submetidos à caracterização e

identificação por intermédio da metodologia tradicional (MT) e pelo kit API

20 C

AUX (API).

Tabela 8. Quantitativos e morfologias das estirpes isoladas a partir do fermento

endógeno originado do município de Medeiros, região da Serra da

Canastra/MG

Meios

Utilizados no

Isolamento /

Grupo

isolado

Morfologias

Total

Isolados

Cocos

Bacilos/

Cocobacilos

Leveduras

Mais de

uma

Morfologia

Sem

Crescimento*

KF (

Enterococcus

)

140

MRS

(Lactobacillus)

09 89 - 47 07 152

MRSV

(Leuconostoc)

90 - - 30 20 140

M17 (Lactococcus/

Streptococcus)

115 - - 51 07 173

PDA

(Leveduras)

118

121

Totais

311

118

166

726

* Sem crescimento nas ativações precedentes a coloração de Gram.

MRS modificado pela adição de etanol.

MRS modificado pela adição de vancomicina.

5.5 Caracterização e identificação da microbiota leveduriforme

5.5.1 Metodologia Tradicional (MT)

Utilizando a MT, foram identificados 115 dos 118 isolados. Destes, 29

Debaryomyces hansenii (D. hansenii), 34 Kluyveromyces lactis (K. lactis), 5 Candida

kefyr (C. kefyr), 38 Torulaspora delbruekii (T. delbruekii), 02 Candida zeylanoides (C.

zeylanoides) e 7 Kodamaea ohmeri (K. ohmeri). As características bioquímicas e

morfológicas desses isolados estão demonstradas na Tabela 9.

Tabela 9. Características de fermentação, assimilação e morfológicas apresentadas pelas

leveduras presentes no fermento endógeno originado do município de

Medeiros, região da Serra da Canastra/MG

Debaryomyces hansenii

Fermentação de:

Sacarose

- - - - - - - - - -

Galactose

- - - - - - + - - -

Glicose

Lactose

Assimilação de:

Maltose

Galactose

Lactose

Nitrato

Eritritol

Amido

Ribitol

Sacarose

Inositol

Celobiose

Rafinose

Manitol

Melibiose

Xilose

Crescimento a

+ + + + + + + + + +

Crescimento em

50 % de glicose

+ + + + + + + + + +

Crescimento em

10 % de NaCl

+ + + + + + + + + +

Pigmento

C C C C C L L L L C

Pseudo micélio

A A A P A A A A A A

C= creme; L= alaranjado; A= ausente.

Continua...

Debaryomyces hansenii

Fermentação de:

Sacarose

- - - - - - - - + -

Galactose

- - - - - - - - + -

Glicose

+ - + - + + + + + +

Lactose

- - - - - - - - + -

Assimilação de:

Maltose

+ + + + + + + + + +

Galactose

+ + + + + + + + + +

Lactose

- - - - - - + - + -

Nitrato

+ + + + + + + + + +

Eritritol

+ + + + + + + + + +

Amido

- - - - - - - - - -

Ribitol

+ + + + + + + + + +

Sacarose

+ + + + + + + + + +

Inositol

- - - - - - - - - -

Celobiose

- + - - - - - - + -

Rafinose

+ + + + + + + + + +

Manitol

+ + + + + + + + + +

Melibiose

+ + + + + + + + + +

Xilose

+ + + + + + + + + +

Crescimento a

+ + + + + + + + + +

Crescimento em

50 % de glicose

+ + + + + + + + + +

Crescimento em

10 % de NaCl

+ + + + + + + + + +

Pigmento

C C C C C C C C C C

Pseudo micélio

A A A A A A A A A A

C= creme; A= ausente.

Continua...

Debaryomyces hansenii

Fermentação de:

Sacarose

+ - - - - - - - -

Galactose

+ - - - + + - - -

Glicose

+ + + + + + - - +

Lactose

- - - - - - - - -

Assimilação de:

Maltose

+ + + + + + + + +

Galactose

+ + + + + + + + +

Lactose

+ - - - - - - - +

Nitrato

+ + + + + + + + +

Eritritol

+ + + + + + + + -

Amido

- - - - - - - - -

Ribitol

+ + + + + + + + +

Sacarose

+ + + + + + + + +

Inositol

- - - - - - - - -

Celobiose

- - - - - + - - -

Rafinose

+ + + + + + + + +

Manitol

+ + + + + + + + +

Melibiose

+ + + + + + + + -

Xilose

+ + + + + + + + +

Crescimento a

+ + + + + + + + +

Crescimento em

50 % de glicose

+ + + + + + + + +

Crescimento em

10 % de NaCl

+ + + + + + + + +

Pigmento

C C C C C C C C C

Pseudo micélio

A A A A A A A A A

C= creme; A= ausente.

Continua...

Kluyveromyces lactis

Fermentação de:

Sacarose

+ + - + - - + + - +

Galactose

+ - + - + + + + - +

Glicose

+ - - + - + + + - +

Lactose

+ + + + + + + + - +

Assimilação de:

Maltose

- - + + + - - - - +

Galactose

+ + + + + - + + + +

Lactose

+ + + + + + + + + +

Nitrato

- - - - - - - - - -

Eritritol

- - - + - - - - - -

Amido

- - - - - - - - - -

Ribitol

- - - + - - - - - -

Sacarose

+ - - + - - + + + +

Inositol

- - - - - - - - - -

Celobiose

- - - + - - - - + -

Rafinose

+ + + + + + + + + +

Manitol

- - + + - - - - - +

Melibiose

- - - - - - - - - -

Xilose

- - - + - - - - - -

Crescimento a

+ + - + - + - - - +

Crescimento em

50 % de glicose

- - - + - - - + + +

Crescimento em

10 % de NaCl

- + - + + - + + - +

Pigmento

C C C C C C C C C C

Pseudo micélio

A A A A A A A A A A

C= creme; A= ausente.

Continua...

Kluyveromyces lactis

Fermentação de:

Sacarose

+ + - + + + - + - -

Galactose

+ + + + + - + + + +

Glicose

+ + - + - + + + - +

Lactose

+ + + + + + + + + +

Assimilação de:

Maltose

- - - - - - - - - -

Galactose

+ + + + + + + + + +

Lactose

+ + + + + + + + + +

Nitrato

- - - - - - - - - -

Eritritol

- - - - - - - - - -

Amido

- - - - - - - - - -

Ribitol

- - - + - - - - - -

Sacarose

+ + - + + + + + + +

Inositol

- - - - - - - - - -

Celobiose

- - - + - + + + + +

Rafinose

+ + + + + + + + + +

Manitol

- - - - - - - - - -

Melibiose

- - - - - - - - - -

Xilose

- - - - - - - - - -

Crescimento a

+ + + - - - - + - +

Crescimento em

50 % de glicose

+ + + - - - - - - +

Crescimento em

10 % de NaCl

+ + + + + + + + + +

Pigmento

C C C C C C C C C C

Pseudo micélio

A A A A A A A A A A

C= creme; A= ausente.

Continua...

Kluyveromyces lactis

Fermentação de:

Sacarose

+ - + + + - + - - +

Galactose

+ + + + + - + + + +

Glicose

+ - - + + - + - + +

Lactose

+ + + + + + + + - +

Assimilação de:

Maltose

- + + - + + + + + -

Galactose

+ + + + + + + + + +

Lactose

+ + + + + + + + - +

Nitrato

- - - - - - + - - -

Eritritol

- - - - - - - - - -

Amido

- - - - - - - - - -

Ribitol

- - - - - - - - - -

Sacarose

+ + + + + + + + - +

Inositol

- - - - - - - - - -

Celobiose

+ - - - - - - - - -

Rafinose

+ + + + + + + + + +

Manitol

- - - - - + - - - -

Melibiose

- - - - - - - - - -

Xilose

- - - - - - - - - -

Crescimento a

+ + + + - + + - + +

Crescimento em

50 % de glicose

+ - - + - - + + + +

Crescimento em

10 % de NaCl

+ + + + + + + + + +

Pigmento

C C C C C C C C C C

Pseudo micélio

A A A A A A A A A A

C= creme; A= ausente.

Continua...

Kluyveromyces lactis Candida kefyr

Fermentação de:

Sacarose

+ + + + - + - + +

Galactose

+ + + + + + + + +

Glicose

+ + + + - + + + +

Lactose

+ + + + + + + + +

Assimilação de:

Maltose

+ - - - - - - - -

Galactose

+ + + + + + + + +

Lactose

+ + + + + + + + +

Nitrato

- - - - - - - - -

Eritritol

- - - - - - - - -

Amido

- - - - - - - - -

Ribitol

- - - - - - - - -

Sacarose

+ + + + - + + + +

Inositol

- - - - - - - - -

Celobiose

- - - - - - - - -

Rafinose

+ + + + - + + + +

Manitol

- - - - - - - - -

Melibiose

- - - - - - - - -

Xilose

- - - - - - - - -

Crescimento a

- - - - + + + + +

Crescimento em

50 % de glicose

- + + + - - - - -

Crescimento em

10 % de NaCl

+ + + + + + + + +

Pigmento

C C C C C C C C C

Pseudo micélio

A A A A A A A A A

C= creme; A= ausente.

Continua...

Torulaspora delbruekii

Fermentação de:

Sacarose

+ + + + - + + + + +

Galactose

+ + + + - + + + + +

Glicose

+ + + + - + + + + +

Lactose

- - - - - - - - - -

Assimilação de:

Maltose

- - - - - - - - - -

Galactose

+ + + + + + + + + +

Lactose

- - - - - - - - - -

Nitrato

- - - - - - - - - -

Eritritol

- - - - - - - - - -

Amido

- - - - - - - - - -

Ribitol

- - - - - - - + - -

Sacarose

- + - + + + + + + +

Inositol

- - - - - - - - - -

Celobiose

- - - - - - - - - -

Rafinose

+ + + + + + + + + +

Manitol

- - - - - - - - - -

Melibiose

- - - - - - - - - -

Xilose

- - - - - - - - - -

Crescimento a

+ + + + + + + + + +

Crescimento em

50 % de glicose

+ + + + + + + + + +

Crescimento em

10 % de NaCl

+ + + + + + + + + +

Pigmento

C C C C C C C C C C

Pseudo micélio

A A A A A A A A A A

C= creme; A= ausente.

Continua...

Torulaspora delbruekii

Fermentação de:

Sacarose

+ + - + + - + - + +

Galactose

+ + - - + + + + + +

Glicose

- + - + + + + + + +

Lactose

- - - - - - - - - -

Assimilação de:

Maltose

- - - - - - - - - -

Galactose

+ + + + + + + + + +

Lactose

- - - - - - - - - -

Nitrato

- - - - - - - - - -

Eritritol

- - - - - - - - - -

Amido

- - - - - - - - - -

Ribitol

- - - - - - - - - -

Sacarose

+ + + + + + + - + +

Inositol

- - - - - - - - - -

Celobiose

- - - - - - - - - -

Rafinose

+ + + + + + + + + +

Manitol

- - - - - - - - - -

Melibiose

- - - - - - - + - -

Xilose

- - - - - - - - - -

Crescimento a

+ + + + + + + + + +

Crescimento em

50 % de glicose

+ + + + + + + + + +

Crescimento em

10 % de NaCl

+ + + + + + + + + +

Pigmento

C C C C C C C C C C

Pseudo micélio

A A A A A A A A A A

C= creme; A= ausente.

Continua...

Torulaspora delbruekii

Fermentação de:

Sacarose

+ + + + + + + -

Galactose

+ + + + + + + + + +

Glicose

- + + - + + + + + +

Lactose

- - - - - - - - - -

Assimilação de:

Maltose

- - - - - - - -

Galactose

+ + + + + + + + + +

Lactose

- - - - - - - - - -

Nitrato

- - - - - - - - - -

Eritritol

- - - - - - - - - -

Amido

- - - - - - - - - -

Ribitol

- - - - - - - - - -

Sacarose

+ + + + + + + - + +

Inositol

- - - - - - - - - -

Celobiose

- - - - - - - - - -

Rafinose

+ + + + + + + + + +

Manitol

- - - - - + - - - -

Melibiose

- - - + - + - - - -

Xilose

- - - - - - - - - -

Crescimento a

+ + + + + + + + + +

Crescimento em

50 % de glicose

+ + + + + + + + + +

Crescimento em

10 % de NaCl

+ + + + + + + + + +

Pigmento

C C C C C C C C C C

Pseudo micélio

A A A A A A A A A A

C= creme; A= ausente.

Continua...

Torulaspora delbruekii

Fermentação de:

Sacarose

- - + - - + - +

Galactose

+ + + + + + + +

Glicose

+ + + + + + + +

Lactose

- - - - - - - -

Assimilação de:

Maltose

- - - - - + - -

Galactose

+ + + + + + + +

Lactose

- - - - - - - -

Nitrato

- - - - - - - -

Eritritol

- - - - - + - -

Amido

- - - - - - - -

Ribitol

- - - - - - - -

Sacarose

- - + - + + + +

Inositol

- - - - - - - -

Celobiose

- - - - - - - -

Rafinose

+ + + + + + + +

Manitol

- + - - - - - -

Melibiose

- - - - - - - -

Xilose

- - - - - - - -

Crescimento a

+ + + + + + + +

Crescimento em

50 % de glicose

+ + + + + + + +

Crescimento em

10 % de NaCl

+ + + + + + + +

Pigmento

C C C C C C C C

Pseudo micélio

A A A A A A A A

C= creme; A= ausente.

Continua...

Candida zeylanoides Kodamaea ohmeri

Fermentação de:

Sacarose

- - + + - - + + +

Galactose

- - + + + + + + +

Glicose

- - + + + + + + +

Lactose

- - - - - - - - -

Assimilação de:

Maltose

- - + + + + + + +

Galactose

- + + + + + + + +

Lactose

- - - - - - - - -

Nitrato

+ - + + + + + + +

Eritritol

- - - - - - - - -

Amido

+ - - - - - - - -

Ribitol

+ - + + + + + + +

Sacarose

- + + + + + + + +

Inositol

- - - - - - - - -

Celobiose

- - + + + + + + +

Rafinose

+ + + + + + + + +

Manitol

+ - + + + + + + +

Melibiose

- - - + - - - - -

Xilose

- - - - - - - - -

Crescimento a

- + + + + + + + +

Crescimento em

50 % de glicose

- - + + + + + + +

Crescimento em

10 % de NaCl

+ + + + + + + + +

Pigmento

C C C C C C C C C

Pseudo micélio

P P P P P P P P P

C= creme; P= presente

Das espécies identificadas como D. hansenii, todas diferiram da descrição padrão

(LODDER, 1970), por assimilarem nitrato e não assimilarem amido. Dessas, 25 também

não assimilaram celobiose e 4 apresentaram pigmentação alaranjada. O isolado A2-14

diferiu da descrição padrão por fermentar lactose. Silva (2003), ao identificar leveduras

em queijo Minas frescal, também isolou essa espécie com a capacidade de assimilar

nitrato, fermentar lactose e de produzir de pigmentação.

Todos os isolados avaliados como T. delbruekii diferiram da descrição padrão por

crescerem a 37

C , assim como em 36 dos isolados, por não assimilarem manitol. Dentre

esses, 5 (A4-6, A5-5, A5-7, A6-7 e A8-3) não fermentaram glicose; sendo que os isolados

A4-6 e A5-5, também não fermentaram galactose; 1 (S7-2) fermentou maltose e eritritol e

o isolado A5-8 não fermentou galactose.

Dos 34 isolados identificados como Kl. lactis, 30 não assimilaram manitol,

diferindo, portanto, da descrição padrão. Desses, o isolado S7-5 não fermentou nem

assimilou lactose; os isolados A3-6, A7-3, S2-10, S3-2, S5-3 e S7-3 não fermentaram

glicose; e os isolados A3-3, S6-5 assimilaram nitrato. Dos três isolados que assimilaram

manitol, A3-5 não fermentou galactose.

Os sete isolados, identificados como Kodamea ohmeri, diferiram da descrição

padrão por assimilarem nitrato. O isolado A8-2, assimilou melibiose e os isolados A8-6 e

A8-7 não fermentaram sacarose.

Apenas dois isolados foram identificados como C. zeylanoides. O isolado A4-5

diferiu dos padrões de identificação utilizado por assimilar nitrato, amido e rafinose,

enquanto o isolado S5-2 diferiu por assimilar sacarose e rafinose e não assimilar manitol e

por crescer a temperatura de 37

Dos cinco isolados identificados como C. kefir, todos diferiram da descrição

padrão por crescerem em 10 % de NaCl e por não assimilarem celobiose. O A3-2 também

diferiu por não assimilar sacarose e rafinose, assim como por não fermentar glicose e

sacarose e o S4-1 por não fermentar sacarose.

5.5.2 Sistema API

20 C AUX (API).

Utilizando o API, foram identificados os 118 isolados. Dentre estes, 16 Candida

famata (C. famata), 13 C. parapsilosis, 01 Cryptococcus laurenti (Cr. laurenti), 33 C.

sphaerica, 01 Sacharomyces cerevisae (S. cerevisae), 05 C. kefyr , 38 C. colliculosa, 02

C. zeylanoides, 01 C. guilliermondii, 01 Geotrichium capitatum (G. capitatum) e 7

Kodamaea ohmeri (K. ohmeri). O perfil numérico encontrado, o percentual de acerto e a

classificação da identificação, verificados segundo o programa Apiweb

, estão

demonstradas na Tabela 10. A maioria das identificações (75,65 %) foi classificada como

boa, muito boa e excelente.

Tabela 10. Espécies de leveduras encontradas no fermento endógeno originado

do município de Medeiros, região da Serra da Canastra/MG,

identificadas pelo API

Código

API

20 C AUX

Perfil Numérico Espécie

% de

Acerto

Classificação

A1-1 6 7 5 6 1 7 3 C. famata 56,2 Muito boa identificação do gênero

A1-2 6 7 5 6 7 7 3 C. famata 98,2 Boa identificação

A1-3 6 7 5 6 1 7 1 C. famata 92,9 Boa identificação

A1-4 6 7 5 6 1 7 5 C. parapsilosis 99,9 Excelente identificação

A1-5 6 7 5 6 1 7 1 C. parapsilosis 92,9 Boa identificação

A2-1 6 7 5 6 1 7 3 C. famata 56,2 Muito boa identificação do gênero

A2-2 6 7 5 6 1 7 3 C. famata 56,2 Muito boa identificação do gênero

A2-3 6 7 5 6 1 7 3 C. famata 56,2 Muito boa identificação do gênero

A2-4 6 7 5 6 1 7 3 C. famata 56,2 Muito boa identificação do gênero

A2-5 6 7 5 6 1 7 1 C. parapsilosis 92,9 Boa identificação

A2-6 6 7 5 6 1 7 1 C. parapsilosis 92,9 Boa identificação

A2-7 6 7 5 6 1 7 3 C. famata 56,2 Muito boa identificação do gênero

A2-8 6 7 5 6 1 7 3 C. famata 56,2 Muito boa identificação do gênero

A2-9 6 7 5 6 1 7 3 C. famata 56,2 Muito boa identificação do gênero

A2-10 6 7 5 6 1 7 1 C. parapsilosis 92,9 Boa identificação

A2-11 6 7 5 6 1 7 1 C. parapsilosis 92,9 Boa identificação

A2-12 6 7 5 6 1 7 1 C. parapsilosis 92,9 Boa identificação

A2-13 6 7 5 6 1 7 3 C. famata 56,2 Muito boa identificação do gênero

A2-14 6 7 5 6 7 7 3 C. famata 98,2 Boa identificação

A2-15 6 7 5 2 1 7 1 C. parapsilosis 95,9 Boa identificação

A2-16 6 7 7 7 7 7 3 Cr. laurentii 46,1 Fraca discriminação

A2-17 6 7 5 6 1 7 3 C. famata 56,2 Muito boa identificação do gênero

A2-18 6 7 5 6 1 7 1 C. parapsilosis 92,9 Boa identificação

A2-19 6 7 5 6 1 7 1 C. parapsilosis 92,9 Boa identificação

A2-20 6 7 5 6 1 7 1 C. parapsilosis 92,9 Boa identificação

A2-21 6 7 5 6 1 7 1 C. parapsilosis 92,9 Boa identificação

A3-1 6 0 6 2 6 2 0 C. sphaerica 99,2 Muito boa identificação

A3-2 6 4 6 2 4 2 2 C. kefyr 98,4 Boa identificação

A3-3 6 4 6 2 4 6 0 C. sphaerica 94,5 Identificação aceitável no gênero

A3-4 6 0 6 2 4 0 0 C. sphaerica 73,8 Perfil duvidoso

A3-5 6 0 6 2 4 0 0 C. sphaerica 73,8 Perfil duvidoso

A3-6 6 0 6 6 6 7 3 C. sphaerica 99,9 Excelente identificação

A3-7 6 0 6 2 6 7 3 C. sphaerica 99,9 Excelente identificação

A4-1 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

A4-2 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

A4-3 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

A4-4 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

A4-5 6 1 0 2 1 0 4 C. zeylanoides 99,9 Excelente identificação

A4-6 6 1 4 0 0 6 6 C. colliculosa 99,8 Muito boa identificação

A4-7 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

A5-1 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

A5-2 6 1 4 0 0 6 2 C. colliculosa 97,2 Boa identificação

A5-3 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

A5-4 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

A5-5 6 3 4 2 0 6 2 C. colliculosa 95,3 Perfil duvidoso

A5-6 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

A5-7 6 1 4 0 0 6 6 C. colliculosa 99,8 Muito boa identificação

A5-8 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

A5-9 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

A6-1 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

A6-2 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

A6-3 6 1 4 0 0 6 0 C. colliculosa 86,2 Muito boa identificação do gênero

A6-4 6 1 4 2 0 6 0 C. colliculosa 85,4 Fraca discriminação

A6-5 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

A6-6 6 7 5 6 1 7 3 C.famata 56,2 Muito boa identificação do gênero

A6-7 6 1 4 2 0 4 2 C. colliculosa 94,7 Boa identificação

A7-1 6 0 6 2 6 7 2 C. sphaerica 99,9 Excelente identificação

A7-2 6 0 6 2 6 7 3 C. sphaerica 99,9 Excelente identificação

A7-3 6 1 6 2 6 7 3 C. sphaerica 99,5 Muito boa identificação

A7-4 6 1 6 2 6 7 2 C. sphaerica 99,3 Boa identificação

A7-5 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

A7-6 6 1 6 2 4 6 2 C. sphaerica 90,8 Boa identificação

A7-7 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

A7-8 6 1 6 2 4 6 2 C. sphaerica 90,8 Boa identificação

A7-9 6 1 6 2 4 6 2 C. sphaerica 90,8 Boa identificação

A8-1 6 1 5 6 2 7 6 K. ohmeri 99,9 Muito boa identificação

A8-2 6 1 5 6 2 7 6 K. ohmeri 99,9 Muito boa identificação

A8-3 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

A8-4 6 1 7 6 1 7 1 C. famata 57,3 Boa identificação do gênero

A8-5 6 7 5 6 1 7 1 C. parapsilosis 92,9 Boa identificação

A8-6 6 1 5 6 2 7 6 K. ohmeri 99,9 Muito boa identificação

A8-7 6 1 5 6 0 7 6 K. ohmeri 99,9 Muito boa identificação

S1-1 6 0 6 2 6 2 2 C. sphaerica 92,6 Muito boa identificação do gênero

S1-2 6 0 6 2 4 7 2 C. sphaerica 99,9 Excelente identificação

S1-3 6 4 6 2 4 6 3 C. sphaerica 99,5 Muito boa identificação

S1-4 6 0 6 2 4 7 3 C. sphaerica 99,9 Excelente identificação

S1-5 6 4 6 2 4 7 2 C. sphaerica 98,2 Boa identificação

S2-1 6 0 6 6 6 7 3 C. sphaerica 99,9 Excelente identificação

S2-3 6 0 5 6 3 7 6 K. ohmeri 99,9 Excelente identificação

S2-4 6 0 6 2 0 6 2 C. sphaerica 36,3 Perfil duvidoso

S2-5 6 0 5 6 3 7 6 K. ohmeri 99,9 Excelente identificação

S2-6 6 0 6 2 4 2 2 C. kefyr 76,2 Muito boa identificação do gênero

S2-7 6 0 6 2 4 7 3 C. sphaerica 99,9 Excelente identificação

S2-8 6 0 5 6 3 7 6 K. ohmeri 99,9 Excelente identificação

S2-9 6 6 7 6 3 7 7 C. guilliermondii 99,7 Muito boa identificação

S2-10 6 0 4 2 4 3 2 C. sphaerica 98,4 Boa identificação

S3-1 6 7 5 6 1 7 3 C. famata 56,2 Muito boa identificação do gênero

S3-2 6 0 6 2 4 7 3 C. sphaerica 99,9 Excelente identificação

S3-3 6 0 6 2 4 3 3 C. sphaerica 99,9 Excelente identificação

S4-1 6 4 6 2 4 2 2 C. kefyr 98,4 Boa identificação

S4-2 6 4 6 2 4 3 2 C. sphaerica 84,4 Boa identificação do gênero

S4-3 6 4 6 2 4 2 2 C. kefyr 98,4 Boa identificação

S5-1 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

S5-2 6 1 0 2 1 0 4 C. zeylanoides 99,9 Excelente identificação

S5-3 6 4 6 2 4 3 2 C. sphaerica 84,4 Boa identificação do gênero

S6-1 6 1 4 2 0 6 0 C. colliculosa 85,4 Fraca discriminação

S6-2 6 1 6 2 0 6 2 C. colliculosa 99,8 Muito boa identificação

S6-3 6 1 4 2 0 4 2 C. colliculosa 94,7 Boa identificação

S6-4 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

S6-5 6 1 6 2 4 6 2 C. sphaerica 90,8 Boa identificação

S6-6 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

S6-7 6 1 4 2 0 4 2 C. colliculosa 94,7 Boa identificação

S6-8 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

S6-9 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

S6-10 6 1 4 0 0 6 0 C. colliculosa 86,2 Muito boa identificação do gênero

S7-1 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

S7-2 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

S7-3 6 1 6 2 4 3 3 C. sphaerica 99,9 Muito boa identificação

S7-4 6 1 4 2 0 6 2 C. colliculosa 96,2 Boa identificação

S7-5 2 0 4 0 0 0 0 S. cerevisae 60,9 Fraca discriminação

S7-6 6 1 6 2 4 7 3 C. sphaerica 99,9 Muito boa identificação

S7-7 6 1 4 0 0 0 4 G. capitatum 80,4 Perfil duvidoso

S7-8 6 0 6 2 4 3 2 C. sphaerica 99,0 Muito boa identificação

S7-9 2 4 6 2 4 2 2 C. kefyr 99,9 Muito boa identificação

S7-10 6 1 4 2 0 6 0 C. colliculosa 85,4 Fraca discriminação

S8-1 6 0 4 2 4 3 1 C. sphaerica 99,9 Muito boa identificação

S8-2 6 0 4 2 4 3 1 C. sphaerica 99,9 Muito boa identificação

S8-3 6 0 4 2 4 3 1 C. sphaerica 99,9 Muito boa identificação

5.5.3 Comparação dos resultados pela metodologia tradicional e pelo sistema API

C AUX

A comparação dos resultados obtidos na identificação da microbiota

leveduriforme, utilizando a MT e o API, é demonstrada na Tabela 11.

Tabela 11. Comparação dos resultados da identificação, utilizando a metodologia

tradicional (MT) e o sistema API

20 C AUX (API).

API

Espécie

Quantitativos

Espécie

Quantitativos

D. hansenii 29

C. famata

C. parapsilosis

Cr. laurentii

Kl. lactis 34

C. sphaerica

S. cerevisae

C. kefyr

C. kefy

T. delbruekii

C. colliculosa

C. zeylanoides

K. ohmeri

N.A. 03

C. famata

C. guilliermondii

G. capitatum

N.A.: não avaliado.

Do total de 118 isolados, 115 foram identificados por intermédio das duas

metodologias utilizadas.

Dos 29 isolados identificados como D. hansenii pela MT, 15 foram identificados

como C. famata (forma imperfeita de D. hansenii), 13 como C. parapsilosis e um como

Cr. laurentii, utilizando o API. Observou-se certa dificuldade pelo método API em

diferenciar a espécie C. famata e C. parapsilosis. Na maioria dos perfis encontrados, a

assimilação (C. famata) ou não (C. parapsilosis) da rafinose foi o único parâmetro

diferenciador entre essas 2 espécies. Porém, o próprio método ressalta que 25 % das

estirpes C. famata não assimilam o referido açúcar. Essa pode ter sido a razão da

incongruência entre os resultados pela MT e API.

Dos 34 isolados identificados como Kl. lactis por meio da MT, 33 foram

identificados pelo API como C. sphaerica (forma imperfeita de Kl. lactis) e 1 como S.

cerevisae.

Os 38 isolados identificados pela MT como T. delbruekii foram identificados como

C. colliculosa (forma imperfeita de T. delbruekii).

As espécies C. zeylanoides, C. kefyr e K. homeri, que corresponderam a 2 , 5 e 7 do

total dos isolados, respectivamente, apresentaram a mesma identificação em ambos os

métodos utilizados.

Três isolados foram identificados apenas pelo API pelas espécies C. famata, C.

guilliermondi e G. capitatum.

A diferença entre a forma perfeita das espécies D. hansenii, Kl. lactis e T.

delbruekii e suas respectivas formas imperfeitas C. famata, C. sphaerica e C. colliculosa

advém da capacidade que essas espécies, quando em estado teleomorfo (perfeito), tem de

se reproduzirem sexuadamente (produção de ascósporos), embora apresentem as mesmas

características bioquímicas (LODDER, 1970; KREGER-VAN RIJ, 1984, TORNADIJO et

al, 1997). Portanto, foram consideradas, neste trabalho, como o mesmo microrganismo.

Dos 115 isolados testados por ambas as metodologias adotadas nesta pesquisa, os

resultados coincidiram em 93 espécies (80,87 %).

Silva et al (2005), ao avaliarem leveduras de importância clínica, encontraram 92

% de similaridade entre as duas metodologias. Porém, Török e King (1991), ao avaliarem

leveduras associadas a alimentos, encontraram similaridade inferior a 40 %, não

considerando o kit apropriado para identificação de leveduras associadas a alimentos,

principalmente pelo restrito número de espécies na sua base de dados.

Os métodos clássicos para identificação de leveduras ainda são bastante utilizados.

Porém, são necessários um laboratório bem equipado, a utilização de várias técnicas e

reagentes. A identificação tradicional é laboriosa e demanda tempo para sua realização.

Por essas razões, métodos rápidos de identificação, inicialmente desenvolvidos para

leveduras de origem clínica, têm sido utilizados para identificação de leveduras em

alimentos. No entanto, ambas as metodologias são passíveis de problemas, principalmente

quanto à leitura e interpretação dos resultados, gerando, em muitos casos, resultados

duvidosos.

Neste estudo, o principal problema encontrado foi quanto à visualização dos

resultados, principalmente quando se utilizou o API. Em vários isolados, a distinção entre

a assimilação e a não-assimilação, das diferentes fontes de carbono testadas, nem sempre

era nítida. A adoção de indicadores, que sinalizem assimilação ou não, através da

modificação da cor, certamente facilitará a utilização do kit.

Nas últimas décadas, progressos no estudo da biologia molecular têm possibilitado

a caracterização de leveduras ao nível genômico. Técnicas baseadas em análises de

fragmentos, como PFGE (Pulsefield gel electrophoresis), RFLP (restriction fragment

length polymorphism) e RAPD (random amplified polymorphic DNA) têm sido

reconhecidas como ferramentas mais seguras e rápidas para a identificação de leveduras

quando comparadas com os testes bioquímicos e fisiológicos utilizados nas identificações

fenotípicas (LOPANDIC et al, 2005).

5.5.4 Espécies leveduriformes predominantes nas unidades produtoras, nos dois

períodos avaliados

As espécies da microbiota leveduriforme isoladas do fermento endógeno nos dois

períodos amostrados, bem como a sua freqüência em cada unidade produtora avaliada,

podem ser observadas nas Figuras 11 e 12, respectivamente. Nessas, constam as espécies

identificadas de acordo com a MT, à exceção das que foram identificadas apenas pelo

API.

Figura 11. Freqüência das diferentes espécies leveduriformes identificadas no

período das águas (PA) e no período da seca (PS).

PA PS

Debaryomyces hansenii

Kluyveromyces lactis

Kluyveromyces marxianus

Torulaspora delbruekii

Candida zeylanoides

Kodamaea ohmeri

Pichia guilliermondii

Geotrichum capitatum

Figura 12. Freqüência das espécies de leveduras predominantes nas unidades

produtoras, no período das águas (PA) e no período da seca (PS).

Unidade produtora 1- PA

Debaryomyces

hansenii

Unidade produtora 1 - PS

Kluyveromyces

lactis

Unidade produtora 2 - PA

Debaryomyces

hansenii

Unidade produtora 2 - PS

Kluyveromyces

lactis

Kluyveromyces

marxianus

Kodamaea ohmeri

Pichia

guilliermondii

Unidade produtora 3 - PA

Kluyveromyces

lactis

Kluyveromyces

marxianus

Unidade produtora 3 - PS

Debaryomyces

hansenii

Kluyveromyces

lactis

Unidade produtora 4 - PA

Torulaspora

delbruekii

Candida

zeylanoides

Unidade produtora 4 - PS

Kluyveromyces

lactis

Kluyveromyces

marxianus

Unidade produtora 5 - PA

Torulaspora

delbruekii

Unidade produtora 5 - PS

Kluyveromyces

lactis

Torulaspora

delbruekii

Candida

zeylanoides

Unidade produtora 6 - PA

Debaryomyces

hansenii

Torulaspora

delbruekii

Unidade produtora 6 - PS

Kluyveromyces

lactis

Torulaspora

delbruekii

Unidade produtora 7 - PA

Kluyveromyces

lactis

Torulaspora

delbruekii

Unidade produtora 7 - PS

Kluyveromyces

lactis

Kluyveromyces

marxianus

Torulaspora

delbruekii

Geotrichum

capitatum

Unidade produtora 8 - PA

Debaryomyces

hansenii

Torulaspora

delbruekii

Kodamaea ohmeri

Unidade produtora 8 - PS

Kluyveromyces

lactis

No PA, D. hansenii foi a espécie mais freqüentemente encontrada dentre os

isolados avaliados (40,28 %), seguida por T. delbruekii (33,34 %) e Kl. lactis (18,05 %).

Essas três espécies corresponderam a 91,67 % do total de espécies isoladas nesse período.

Todas estão associadas a produtos láticos (FLEET, 1989; LARPENT et al, 1991).

O predomínio das espécies D. hansenii e T. delbruekii pode estar associado à

concentração de NaCl do fermento endógeno. Aguiar e Lucas (2000) demonstraram que

ambas crescem na presença de até 3M de NaCl, enquanto que espécies como Kl. lactis e

Kl. marxianus conseguem crescer na presença de até 2M de NaCl .

T. delbruekii, isolada em 5 das 8 unidades produtoras foi a espécie encontrada em

maior número de propriedades. Na propriedade 5 foi a única espécie isolada. D. hansenii

foi detectada em 4 unidades produtoras, constituindo a única espécie isolada em duas

destas (1 e 2). Kl. lactis, a terceira espécie isolada em termos percentuais, foi encontrada

somente em 2 das 8 unidades produtoras.

O fermento endógeno da unidade produtora 8 apresentou maior diversidade de

espécies (3 espécies). Já nos fermentos endógenos das unidades produtoras 1, 2 e 5

detectou-se a presença de apenas uma espécie.

Borelli (2002), ao analisar o fermento endógeno dessa região, também no período

das águas, encontrou a predominância de T. delbruekii, que apresentou maior distribuição

entre os 10 fermentos endógenos avaliados. D. hansenii e Kl. lactis também foram

isoladas de forma expressiva, figurando entre as quatro espécies mais freqüentes.

As espécies Kl. marxianus e C. zeylanoides foram detectadas apenas nas unidades

3 e 4, respectivamente. Essas espécies, aliadas a K. ohmeri, constituíram as espécies

encontradas em menor freqüência no período das águas. No entanto, Borelli (2002)

avaliou K. ohmeri como a segunda espécie mais freqüentemente encontrada no fermento

endógeno coletado em outro município (São Roque de Minas) da região.

No PS, foram isoladas as mesmas espécies identificadas na época das águas, porém

em freqüências diferentes (Figura 11) e ainda, as espécies P. guilliermondii e G.

capitatum.

Kl. lactis foi a espécie que mais se destacou no PS. Além de corresponder a 45,65

% do total de isolados nesse período, foi encontrada no fermento endógeno de todas as

unidades produtoras. Embora a grande maioria dos isolados identificados como Kl. lactis

tenha crescido na presença de 10 % de sal (Tabela 9), observou-se uma tendência desse

microrganismo em se destacar, nos fermentos endógenos com concentrações de NaCl de

até 6,5 %. À exceção de uma estirpe, isolada no fermento endógeno da unidade produtora

4 (PS), cuja concentração de NaCl foi de 8,90 %.

A segunda espécie mais freqüente foi T. delbruekii, apresentando uma freqüência

de 30,45 %, semelhante à encontrada no período das águas (33,34 %), porém com menor

distribuição (presente em três propriedades).

A terceira espécie mais encontrada foi C. kefyr. Sua freqüência (8,70 %) foi

superior à encontrada no período das águas, assim como sua distribuição (presente em três

propriedades). As demais espécies ocorreram em freqüências de 6,52 % para K. ohmeri e

de de 2,17 % para D. hansenii, Candida zeylanoides, P. guilliermondii e Geotrichum

capitatum.

O efeito de leveduras normalmente presentes em fermentos endógenos utilizados

na fabricação de queijo ainda não está claro. É possível que, em moderado número, sua

presença possa favorecer a produção de sabor e aroma em decorrência de uma moderada

atividade proteolítica, por outro lado, a presença de leveduras em altas contagens (> 10

UFC.mL

-1

) pode acarretar formação de sabores e aromas desagradáveis devido, por

exemplo, a uma indesejável fermentação alcoólica (REINHEIMER et al, 1994).

A microbiota leveduriforme presente no fermento endógeno na Serra da Canastra

no período da seca está sendo avaliada pela primeira vez neste trabalho. Observa-se, pelos

resultados, a presença das mesmas espécies em ambos os períodos, com diferença na

freqüência encontrada. Além disso, duas espécies (G. capitatum e P. guilliermondii) foram

detectadas somente no período da seca. A ocorrência de um número reduzido de espécies

indica que a composição do fermento endógeno, bem como as condições ambientais no

qual é produzido, promove a seleção de uma microbiota que se mantém praticamente

inalterada, em relação à diversidade de espécies, ao longo dos dois períodos avaliados,

mas que varia na freqüência com as quais são observadas.

6. CONSIDERAÇÕES FINAIS

Dos parâmetros físico-químicos avaliados, o teor de NaCl foi o único que

apresentou variações entre os dois períodos avaliados, sendo detectado em maior

concentração no período das águas.

Entre os parâmetros microbiológicos avaliados, as bactérias do ácido lático foram

o grupo predominante no fermento endógeno. A contagem total de mesófilos aeróbios

constituiu o único parâmetro que variou de acordo com o período avaliado e foi menor no

período das águas. A variação na contagem dos indicadores higiênico-sanitários indica que

há diferentes níveis de adequação às boas práticas de fabricação nas queijarias.

A diversidade de leveduras encontrada nos dois períodos avaliados foi

praticamente a mesma, porém em freqüências diferentes. O kit API

20 C AUX

apresentou as vantagens de facilidade de uso, armazenamento e rapidez, porém, em vários

isolados os resultados foram de difícil visualização. As leveduras mais freqüentemente

isoladas no período das águas foram D. hansenii, T. delbruekii e Kl. lactis. No período da

seca, destacaram-se as espécies Kl. lactis, T. delbruekii e Kl. marxianus.

Este trabalho refere-se ao início do conhecimento dos principais componentes físico-

químicos e microbianos do fermento endógeno utilizado na fabricação do queijo Canastra.

Estudos para uma melhor compreensão desses componentes, suas variações e interações, e

a sua contribuição para as características e a qualidade do queijo Canastra precisam ser

determinados.

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Apêndices

Apêndice A. Perfil de fermentação e assimilação apresentado pelas leveduras presentes no fermento endógeno originado do município

de Medeiros, região da Serra da Canastra/MG

Debaryomyces

hansenii

Kluyveromyces lactis Candida

kefyr

Torulaspora

delbruekii

Candida zeylanoides Kodamaea

ohmeri

Resultados

Positivos

Padrão*

Resultados

Positivos

Padrão*

Resultados

Positivos

Padrão*

Resultados

Positivos

Padrão*

Resultados

Positivos

Padrão*

Resultados

Positivos

Padrão*

de isolados 29 34 05 38 02 07

Fermentação:

Sacarose 02 V 22 + ou R- 03 + 28 - A 00 - 05 +

Galactose 05 V 29 + 05 + 35 + 00 - 07 +

Glicose 24 V 23 + 04 + 33 + 00 - 07 +

Lactose 01 - 32 + 05 + 00 - 00 - 00 -

Assimilação:

Maltose 29 + 12 V 00 - 01 - 00 - 07 +

Galactose 29 + 33 + 05 + 38 + 01 V 07 +

Lactose 04 V 33 + 05 + 00 - 00 - 00 -

Nitrato 29 - 01 - 00 - 00 - 01 - 07 -

Eritritol 28 V 01 - 00 - 01 - 00 - 00 -

Amido 00 + 00 - 00 - 00 - 01 - 00 -

Ribitol 29 + 02 V 00 - 01 - 01 V 07 + ou R-

Sacarose 28 + 28 + 04 + 31 - A 01 - 07 +

Inositol 00 - 00 - 00 - 00 - 00 - 00 -

Celobiose 04 + 09 + 00 + 00 - 00 - 07 +

Rafinose 29 + 34 + ou R- 04 + 38 - A 02 - 07 +

Manitol 29 + 04 + 00 - 02 + 01 + 07 +

melibiose 28 + ou R- 00 - 00 - 03 + 00 - 01 -

Xilose 29 + 01 V 00 - 00 - 00 - 00 -

Cresc. a 37

C 29 V 18 V 05 + 38 - 01 - 07 +

Cresc. em 50 %

de glicose

29 + 17 - ou R+ 00 N.A. 38 + 00 N. A. 07 +

Cresc. em 10 %

de NaCl

29 + 30 N. A. 05 - 38 N. A. 02 + 07 N. A.

* LODDER (1970); + = positivo; - = negativo; V= variável; R= raramente; A= adquirido; N.A.= não avaliado.

Apêndice B. Leveduras predominantes no fermento endógeno originado do município de Medeiros, região da Serra

da Canastra/MG, coletado no período das águas

Espécies

Unidades Produtoras

Total

2 3 4 5 6 7 8

D. hansenii

C. famata*

5 21 - - - 1 - 2

(40,28 %)

Kl. lactis

C. sphaerica*

- - 6 - - - 7 -

(18,05 %)

Kl. marxianus

C. kefyr*

- - 1 - - - - -

(1,39 %)

T. delbruekii

C. colliculosa*

- - - 6 9 6 2 1

(33,34 %)

C. zeylanoides - - - 1 - - - -

(1,39 %)

K. ohmeri

C. guilliermondii

var. membranifaciens*

- - - - - - - 4

(5,55 %)

Total 5 21 7 7 9 7 9 7

(100,00 %)

* Forma imperfeita.

Apêndice C. Leveduras predominantes no fermento endógeno originado do município de Medeiros, região da Serra

da Canastra/MG, coletado no período da seca.

Espécies

Unidades produtoras

Total

2 3 4 5 6 7 8

D. hansenii

C. famata*

- - 1 - - - - -

(2,17 %)

Kl. lactis

C. sphaerica*

5 4 2 1 1 1 4 3

(45,65 %)

Kl. marxianus

C. kefyr*

- 1 - 2 - - 1 -

(8,70 %)

T. delbruekii

C. colliculosa*

- - - - 1 9 4 -

(30,45 %)

C. zeylanoides - - - - 1 - - -

(2,17 %)

K. ohmeri

C. guilliermondii

var. membranifaciens*

- 3 - - - - - -

(6,52 %)

guilliermondii

C. guilliermondii*

- 1 - - - - - -

(2,17%)

G. capitatum - - - - - - 1 -

(2,17 %)

Total 5 9 3 3 3 10 10 3

(100,00 %)

* Forma imperfeita.

Apêndice D. Resultados microbiológicos do fermento endógeno originado do município de Medeiros, região da Serra da Canastra/MG,

nos dois períodos avaliados

Grupos

Avaliados

Período

Unidades Produtoras

Contagem total

de mesófilos*

Águas

8,4 x 10

7,2 x 10

1,3 x 10

9,3 x 10

1,6 x 10

1,4 x 10

2.5 x 10

2,5 x 10

Seca

1,5 x 10

1,9 x 10

9 x 10

7,3 x 10

1,6 x 10

5,4 x 10

6.4 x 10

3,6 x 10

Coliformes

totais*

Águas

5,3 x 10

3,0 x 10

1,6 x 10

2,8 x 10

3,2 x 10

4,0 x 10

1,1 x 10

2,0 x 10

Seca

2,6 x 10

<1,0 x 10

4,1 x 10

1,0 x 10

2,0 x 10

6,0 x 10

2,0 x 10

E. coli*

Águas

1,0 x 10

2,0 x 10

<1,0 x 10

3,0 x 10

<1,0 x 10

2,0 x 10

<1,0 x 10

3,0 x 10

Seca

<1,0 x 10

1,0 x 10

2,0 x 10

3,0 x 10

2,0 x 10

S. aureus*

Águas

6,0 x 10

1,4 x 10

<1,0 x 10

5,0 x 10

1,2 x 10

0 x 10

6,8 x 10

1,3 x 10

Seca

4,0 x 10

1,7 x 10

<1,0 x 10

1,4 x 10

7,0 x 10

5,7 x 10

1,0 x 10

Listeria sp.

Águas

Ausência

Seca

Ausência

Aus

ência

Ausência

Salmonella sp.

Águas

Ausência

Presença

Ausência

Seca

Ausência

Leveduras*

Águas

,6 x 10

4,6 x 10

5,7 x 10

1,4 x 10

4,8 x 10

8,0 x 10

5,4 x 10

Seca

7,8 x 10

3,0 x 10

3,5 x 10

4,0 x 10

1,5 x 10

1,4 x 10

3,9 x 10

5,3 x 10

Lactococcus /

Streptococcus*

Águas

2,1 x 10

7,3 x 10

3,1 x 10

1,2 x 10

1,7 x 10

1,8

x 10

1,4 x 10

1,2 x 10

Seca

1,0 x 10

4,6 x 10

1,1 x 10

3,0 x 10

9,5 x 10

2,2 x 10

9,9 x 10

1,4 x 10

Enterococcus*

Águas

4,5 x 10

8,0 x 10

1,5 x 10

1,3 x 10

7,9 x 10

1,2 x 10

1,5 x 10

8,5 x 10

Seca

8,9 x 10

1,4 x 10

3,5 x 10

8,5 x

<1,0

x 10

5,0 x 10

<1,0

x 10

3,3 x 10

Lactobacillus*

Águas

2,8 x 10

8,3 x 10

9,7 x 10

1,1 x 10

6,2 x 10

1,2 x 10

2,2 x 10

4,1 x 10

Seca

1,6 x 10

5,3 x 10

1,3 x 10

2,4 x 10

2,8 x 10

2,4 x 10

5,8 x 10

2,6 x 10

Leuconostoc*

Águas

1,1 x 10

2,6 x 10

6,9 x 10

9,0 x 10

5,8 x 10

2,8 x 10

9,5 x 10

1,7 x 10

Seca

1,9 x 10

5,9 x 10

1,9 x 10

3,1 x 10

1,9 x 10

3,7 x 10

5,7 x 10

Em UFC.mL

-1

100

Apêndice E. Resultado da identificação da microbiota leveduriforme pela

metodologia tradicional e pelo kit API

20 C AUX.

Código

Método

Tradicional

API

20 C AUX

Código

Método

Tradicional

API

20 C AUX

D. hansenii

C. famata

Kl. lactis

C. sphaerica

D. hansenii

C. famata

T. delbru

ekii

C. colliculosa

D. hansenii

C. famata

Kl. lactis

C. sphaerica

D. hansenii

C. parapsilosis

T. delbruekii

C. colliculosa

D. hansenii

C. parapsilosis

Kl. lactis

C. sphaerica

D. hansenii

C. famata

Kl. lactis

C. s

phaerica

D. hansenii

C. famata

K. ohmeri

D. hansenii

C. famata

K. ohmeri

D. hansenii

C. famata

T. delbruekii

C. colliculosa

D. hansenii

C. parapsilosis

D. hansenii

C. famata

D. hansenii

C. parapsilosis

D. hansenii

C. parapsilosis

D. hansenii

C. famata

K. ohmeri

D. hansenii

C. famata

K. ohmeri

D. hansenii

C. famata

Kl. lactis

C. sphaerica

D. hansenii

C. parapsilosis

Kl.

lactis

C. sphaerica

D. hansenii

C. parapsilosis

Kl. lactis

C. sphaerica

D. hansenii

C. parapsilosis

Kl. lactis

C. sphaerica

D. hansenii

C. famata

Kl. lactis

C. sphaerica

D. hansenii

C. famata

Kl. lactis

C. sp

haerica

D. hansenii

C. parapsilosis

K. ohmeri

D. hansenii

Cr. laurentii

Kl. lactis

C. sphaerica

D. hansenii

C. famata

K. ohmeri

D. hansenii

C. parapsilosis

C. kefyr

D. hans

enii

C. parapsilosis

Kl. lactis

C. sphaerica

D. hansenii

C. parapsilosis

K. ohmeri

D. hansenii

C. parapsilosis

C. guilliermondii

Kl. lactis

C. sphaerica

Kl. lactis

C. sphaerica

C. kefyr

D. hansenii

C. famata

Kl. lactis

C. sphaerica

Kl. lactis

C. sphaerica

Kl. lactis

C. sphaerica

Kl. lactis

C. sphaerica

Kl. lactis

C. sphaerica

C. kefyr

Kl. lactis

C. sphaerica

Kl. lactis

C. sphaerica

101

Kl. lactis

C. sphaerica

C. kefyr

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

C. zeylanoides

T. delbruekii

C. colliculosa

Kl. lactis

C. sphaerica

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

C. zeylanoides

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbr

uekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

Kl. lactis

C. sphaerica

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculos

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

T. del

bruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

Kl. lactis

C. sphaerica

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

T. delbruekii

C. colliculosa

Kl. lactis

S. cerevisae

T. delbruekii

C. colliculosa

Kl. lactis

C. sphaerica

T. delbruekii

C. colliculosa

G. capitatum

T. delbruekii

C. colliculosa

Kl. lactis

C. sphaerica

C. famata

C. kefyr

T. delbruekii

C. colliculo

T. delbruekii

C. colliculosa

Kl. lactis

C. sphaerica

Kl. lactis

C. sphaerica

Kl. lactis

C. sphaerica

Kl. lactis

C. sphaerica

Kl. lactis

C. sphaerica

Kl. lactis

C. sphaerica

NA – não avaliado

102

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