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DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Caracterização de loci com variação alélica no genoma de
Leishmania braziliensis passíveis de uso em testes diagnósticos e
em estudos epidemiológicos.
Rosana Santos Sousa
Salvador - Bahia
2006
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UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
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1
UNIVERSIDADE FEDERAL DA BAHIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM IMUNOLOGIA
Caracterização de loci com variação alélica no genoma de
Leishmania braziliensis passíveis de uso em testes diagnósticos e
em estudos epidemiológicos.
Rosana Santos Sousa
Orientador: Prof. Dr. Albert Schriefer
Salvador - Bahia
2006
Dissertação apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Imunologia,
Instituto de Ciências da Saúde,
Universidade Federal da Bahia como
requisito parcial para obtenção do título
de Mestre.
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Ficha Catalográfica elaborada pela
Biblioteca do ICS / UFBA – Salvador – Bahia
S725 Sousa, Rosana Santos,
Caracterização de Loci com variação alélica no genoma de Leishmania
braziliensis passíveis de uso em testes diagnósticos e em estudos
epidemiológicos / Rosana Santos Sousa. – Salvador, 2006.
115 f. ; il.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal da Bahia, Instituto de
Ciências da Saúde, Programa de Pós-Graduação em Imunologia, 2006.
Orientador: Prof. Dr. Albert Schriefer.
1. Leishmaniose. 2. Leishmania braziliensis . 3. Polimorfismo genético.
4. Variação alélica. 5.RAPD. I. Schriefer, Albert. II. Universidade
Federal da Bahia. Instituto de Ciências da Saúde. III. Titulo.
CDU: 616.993.161
3
Aos meus familiares e amigos pelo incentivo e
apoio nesta caminhada
4
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Nicolaus Albert B. Schriefer, meu orientador, por me aceitar no seu grupo de
pesquisa, depositando confiança em mim e por me orientar de maneira singular em
todos os momentos deste trabalho.
Ao Prof. Edgar Marcelino de Carvalho, chefe do Serviço de Imunologia (SIM),
referencial de pesquisador a minha enorme gratidão por ter me recebido neste
Serviço.
A Tânia Luna pelo carinho e amizade e pela sua importante participação para que
este trabalho acontecesse.
A Ana Lúzia Schriefer pela colaboração através dos ensinamentos das técnicas de
biologia molecular.
Aos médicos do Serviço de Imunologia que trabalham na área endêmica de Corte de
Pedra.
Ao Dr Aristóteles Góes Neto da Universidade Estadual de Feira de Santana (UEFS),
por sua contribuição na etapa do seqüenciamento do DNA das leishmanias e pelas
valiosas sugestões.
Aos laboratórios e pesquisadores do Centro de Pesquisas Gonçalo Moniz /
FIOCRUZ, pela colaboração e disponibilidade de seus recursos técnicos.
Aos meus colegas do SIM, alguns dos quais se tornaram amigos, que me ajudaram
de alguma maneira na construção deste trabalho.
A minha turma de Mestrado pelos alegres momentos em grupo.
5
Aos professores do PPGIm pela preciosa contribuição para o crescimento do
conhecimento.
As secretárias do PPGim, Dilcéia e Luciane por estarem sempre prestativas ao
atender os nossos interesses acadêmicos.
A minha grande amiga-irmã Paula Moreira pelo incentivo ao ingresso à pesquisa e
por todos os momentos em que esteve presente em minha vida.
Aos meus colegas de profissão e amigos de trabalho pela colaboração durante o
desenvolvimento deste projeto.
As “meninas” do 18º centro de saúde pelo apoio e pela carinhosa amizade.
6
Se queremos progredir, não devemos repetir a história,
mas fazer uma história nova. (Gandhi)
7
SUMÁRIO
LISTA DE FIGURAS 08
LISTA DE TABELAS 09
LISTA DE ABREVIATURAS 10
RESUMO 12
ABSTRACT 13
1 – INTRODUÇÃO 14
2 – REVISÃO DE LITERATURA 17
2.1 – O Agente Etiológico das Leishmanioses 17
2.2 – Aspectos Epidemiológicos 21
2.3 – Aspectos Clínicos e Imunológicos 24
2.4 – Epidemiologia molecular em Leishmania sp. 27
3 – HIPÓTESE 36
4 – OBJETIVOS
Geral 36
Específicos 37
5 – JUSTIFICATIVA 38
6 – MATERIAIS E MÉTODO 39
7 – RESULTADOS 55
8 – DISCUSSÃO 72
9 – PERSPECTIVAS 80
10 – CONCLUSÕES 81
11 – REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 82
ANEXOS 89
8
LISTA DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Dendrograma de 45 isolados de L. braziliensis obtidos de casos de
leishmaniose tegumentar americana da área endêmica de Corte de Pedra. O
dendrograma foi elaborado a partir da similaridade (UPGMA) de padrões
eletroforéticos obtidos após RAPD. Formas: cutânea (C), mucosa (M) e
disseminada (D); (?) casos sem a forma clínica confirmada. A árvore fenética
mostra a distribuição dos parasitos em nove clones (1 a 9) e cinco clados (A a
E). As setas indicam os isolados selecionados para o estudo.
41
Figura 2. Padrões eletroforéticos obtidos pelo RAPD com os seis isolados de
L. braziliensis selecionados para o estudo. Os protocolos RAPD foram: (A)
oligonucleotídeo iniciador ABI-04; (B) oligonucleotídeo iniciador A8; (C)
oligonucleotídeo iniciador ABI-18. Na raia 1 temos o marcador de pares de
base (100bp), nas raias 2 e 3 temos dois isolados para cada um dos
respectivos protocolos RAPD, sendo: (A) Lb49 e Lb36; (B) Lb48 e Lb14: (C)
Lb22 e Lb40. As setas indicam as bandas escolhidas para o estudo.
42
9
LISTA DE TABELAS
Pág.
Tabela 1. Caracterização dos fragmentos de DNA genômico dos isolados de
L. braziliensis amplificados pelo RAPD e selecionados para o estudo.
55
Tabela 2. Percentagem de nucleotídeos dos fragmentos genômicos obtidos
pelo RAPD usando o oligonucleotídeo iniciador ABI-04.
59
Tabela 3. Elementos repetitivos encontrados em fragmentos genômicos
obtidos pelo RAPD usando o oligonucleotídeo iniciador ABI-04.
62
Tabela 4. Percentagem de nucleotídeos dos fragmentos genômicos obtidos
pelo RAPD usando o oligonucleotídeo iniciador A8
65
Tabela 5. Elementos repetitivos encontrados em fragmentos genômicos
obtidos pelo RAPD usando o oligonucleotídeo iniciador A8.
68
Tabela 6. Percentagem de nucleotídeos dos fragmentos genômicos obtidos
pelo RAPD usando o oligonucleotídeo iniciador ABI-18.
69
10
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ABI-04 Oligonucleotídeo iniciador ABI-04
A8 Oligonucleotídeo iniciador A8
ABI-18 Oligonucleotídeo iniciador ABI-18
CaCl
2
Cloreto de cálcio
Células Th1 Células T auxiliadoras do tipo 1
CO
2
Gás carbônico
DNA Ácido desoxirribonucléico
DNTPs Desoxirribonucleotídeos
ECO RI Endonuclease de restrição de Escherichia coli
EDTA Ácido etilenodiaminotetracético
gp63 Glicoproteína 63 de superfície da Leishmania
IFN-γ
Interferon gama
IL-10 Interleucina-10
IPTG Isopropiltiogalactosídeo
kDNA Ácido desoxirribonucléico de cinetoplasto
LB Meio de cultura Luria Bertani
LIT Meio de cultura com infusão de fígado e triptose
LC Leishmaniose cutânea localizada
LD Leishmaniose disseminada
LM Leishmaniose mucosa
LPG Lipofosfoglicanos
LTA Leishmaniose tegumentar americana
MgCl
2
Cloreto de magnésio
mL Mililitro
µg
Micrograma
µL
Microlitro
mM Milimolar
MLST Tipagem por seqüências (multilocus sequence typing)
11
MLEE Eletroforese de isoenzimas (multilocus enzyme
electrophoresis)
NaOH Hidróxido de sódio
NNN Meio de cultura de Nicolle, Novy e McNeal
ng Nanograma
nm Nanômetro
PCR Reação em cadeia da polimerase (polymerase chain
reaction)
RAPD Amplificação randômica de DNA polimórfico (randomly
amplified polymorphic DNA)
RFLP Polimorfismo de comprimento de fragmentos de
restrição (restriction fragment length polymorphism)
rpm Rotações por minuto
SDS Dodecil sulfato de sódio
SNP Polimorfismo de nucleotídeo individual (single
nucleotide polymorphism)
STR Repetição curta em tandem (short tandem repeat)
TNF-α
Fator de necrose tumoral alfa
TBE Tris borato EDTA
TE Tris EDTA
UPGMA Algoritmo de similaridade (unweighted pair-group
method with arithmetic averages)
UV Ultravioleta
X-gal
5-bromo-4-cloro-3-indolil-β-D-galactopiranosídeo
12
RESUMO
A leishmaniose tegumentar americana (LTA) é uma doença infecciosa
causada pela L. braziliensis no estado da Bahia, Brasil. Esta espécie apresenta um
alto grau de variabilidade genética, o qual é acompanhado por um amplo espectro de
manifestações clínicas de doença. Um estudo prévio realizado com parasitos
isolados de pacientes provenientes de uma área endêmica demonstrou que a
população de L. braziliensis era multiclonal e formada por diferentes clados, os quais
foram associados a desfechos clínicos específicos. Neste estudo pretendeu-se
identificar a variação alélica em fragmentos de DNA gerados através de três perfis
eletroforéticos de RAPD (ABI-04, A8 e ABI-18). Usamos seis isolados de L.
braziliensis provenientes de clados distintos e amplificamos dois deles para cada
protocolo de RAPD. A partir dos perfis obtidos, submetemos seis bandas distintas ao
seqüenciamento (ABI-04: bandas B1 e B2; A8: bandas B1, B2, B3; e ABI-18: banda
B1). Das 24 reações submetidas, 22 foram seqüenciadas com sucesso. As
seqüências geradas a partir de cada protocolo de RAPD separadamente e entre os
pares de isolados foram alinhadas e comparadas quanto à: (a) identidade ao
conteúdo de nucleotídeos, caracterizando-as como loci homólogos; (b) a presença
de polimorfismos; e (c) a natureza dos polimorfismos detectados. Constatamos que
as seqüências provenientes das duas bandas correspondentes ao protocolo RAPD
ABI-04 e das três bandas para o protocolo RAPD A8 tiveram em torno de 90% de
identidade, que corresponderam a loci homólogos com alguma variação alélica. Os
polimorfismos detectados foram 97 SNPs, 227 indels e 08 microsatélites. Também
analisamos as seqüências para os potenciais sítios de digestão com enzima de
restrição para obtenção de sítios polimórficos que poderiam ser usados no
desenvolvimento de um método de discriminação baseado no RFLP, e encontramos
cerca de 120 sítios diferentes entre os nove loci. Futuramente, as variações alélicas
identificadas entre esses loci podem ser úteis para o desenvolvimento de
ferramentas epidemiológicas e diagnósticas com valor prognóstico sobre as
infecções humanas.
Palavras-chave: leishmaniose, L. braziliensis, polimorfismo genético, variação alélica,
RAPD.
13
ABSTRACT
American tegumentary leishmaniasis (ATL) in Bahia, Brazil is an infectious
disease caused by L. braziliensis. This species has a high degree of genetic
variability, as well as a large spectrum of clinical manifestations of illness. A previous
study of parasites isolated from patients from an endemic area demonstrated that the
population of L. braziliensis was multiclonal and contained different clades which
were associated with specific clinical outcomes. In this study, we wanted to identify
the allelic variation in the DNA fragments generated by our three RAPD eletrophoretic
profiles (ABI-04, A8 and ABI-18). We used six L. braziliensis isolates from different
clades and typed two isolates with each RAPD profile. From the profiles, we
submitted six distinct bands for sequencing (ABI-04: band B1 and B2, A8: band B1,
B2, B3 and ABI-18: band B1). Of 24 samples submitted, 22 were successfully
sequenced. The sequences generated from each RAPD profile separately and
between the pairs of isolates were aligned and compared for: (a) nucleotide sequence
identity: characterization as homologous loci; (b) the presence of polymorphisms; and
(c) the nature of the detected polymorphisms. We found that the sequences for two
corresponding bands of the ABI-04 RAPD protocol and for the three bands of the A8
RAPD protocol had around 90% sequence identity, that corresponded to homologous
loci with some allelic variation. The detected polymorphisms were 97 SNPs, 227
indels and 08 microsatellites. We also analyzed the sequences for potential restriction
digest sites to obtain polymorphic sites that could be used to develop an RFLP based
typing method, and found up to 120 different sites between the nine loci. In the future,
the allelic variations identified between these loci will be useful for the development of
epidemiological and diagnostic tools with prognostic value on the human infections.
Key words: leishmaniasis, L. braziliensis, genetic polymorphism, allelic variation,
RAPD.
14
INTRODUÇÃO
As leishmanioses abrangem um espectro de manifestações clínicas que
ocorrem predominantemente em áreas tropicais e subtropicais do globo, consistindo
atualmente em um importante problema de saúde pública ao assumir o caráter de
endemicidade em escala mundial (DESJEUX, 1992). Infecções ativas podem cursar
com variável gravidade, desde lesões cutâneas (do tipo tegumentar) auto-resolutivas,
até manifestações desfigurantes do tipo mucosa ou mesmo formas viscerais
(calazar). A evidência de diferentes formas clínicas de doença e diferenças na
evolução da infecção depende tanto de características biológicas do parasito como
também de fatores inerentes ao hospedeiro suscetível (CARVALHO e col, 1985;
CHANG e col, 1999). Levando-se em consideração as características do parasito e a
sua diversidade biológica, existem já descritas no Novo mundo pelo menos 14
espécies com considerável importância médica e com reconhecida variabilidade
entre elas alcançando o nível de subgênero. Assim, o conteúdo genético de tais
espécies representa um papel proeminente no tipo de manifestação clínica e
possivelmente no seu prognóstico (CUPOLILLO e col, 1998; SILVEIRA e col, 2004).
Isto reforça a importância da busca por marcadores mais precisos baseados em
características intrínsecas do parasito e não somente de marcadores fenotípicos já
tão bem descritos e caracterizados (GRIMALDI e col, 1993).
15
Dentre as espécies descritas que estão associadas com doença no Novo
Mundo se tem reconhecido que a espécie Leishmania braziliensis possui alto grau de
polimorfismo genético e fenotípico a nível intra-específico (GOMES e col, 1995;
SARAVIA e col, 2002; SCHRIEFER e col, 2004), o qual é acompanhado por um
amplo espectro de apresentações clínicas da leishmaniose tegumentar americana
(LTA) no hospedeiro humano infectado, incluindo: leishmaniose cutânea localizada
(LC), leishmaniose mucosa (LM) e a mais recentemente descrita leishmaniose
disseminada (LD). Estudos realizados com parasitos isolados de pacientes
pertencentes a uma área endêmica para a LTA, localizada no sudeste do estado da
Bahia, chamada Corte de Pedra, indicaram que a população local de L. braziliensis é
multiclonal, sendo os diferentes clones estatisticamente associados com formas
especificas de doença (SCHRIEFER e col, 2004).
Evidências de fortes associações entre uma determinada espécie do parasito,
em particular a L. braziliensis, e a forma de doença cutânea do hospedeiro
promovem um direcionamento para a busca de um maior conhecimento a respeito do
seu conteúdo genético e utilizá-lo como um recurso adicional numa classificação do
parasito levando-se em conta o seu genótipo molecular, e correlacionando-o com a
manifestação clinica. A elaboração de testes diagnósticos que sejam bastante
sensíveis e que consigam um grande poder discriminatório entre os possíveis
genótipos encontrados para os diferentes tipos de doença traria uma boa perspectiva
no tratamento dos indivíduos acometidos, principalmente naqueles casos de difícil
aderência ou mesmo de refratariedade frente ao esquema terapêutico de escolha.
16
Com o diagnóstico precoce, a possibilidade de mudança na abordagem clínica do
doente favoreceria como uma forma de profilaxia das formas mais agressivas da
LTA, o que contribuiria para a melhoria do prognóstico nestes casos.
Para tal objetivo, baseando-se na caracterização da estrutura populacional de
L. braziliensis feita previamente na região endêmica de Corte de Pedra, tivemos a
oportunidade de selecionar algumas regiões do conteúdo genético de seis
representantes dos isolados naturais do parasito com estreita homologia e de
comparar as seqüências entre tal grupo de locus homólogos na busca de tipos de
polimorfismos passíveis de utilização em ferramentas epidemiológicas e/ou
diagnósticas. Por conseguinte, os loci homólogos polimórficos detectados podem ser
úteis no desenvolvimento de protocolos de tipagem molecular baseada no genoma,
como a tipagem de seqüência multilocus, do inglês multilocus sequence typing
(MLST) e o polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição, do inglês
restriction fragment length polymorphism (RFLP), que possam ser empregados para
distinguir cepas de L. braziliensis que apresentem perfis distintos em associação com
as formas clínicas: LC, LM ou LD.
17
REVISÃO DE LITERATURA
1) O agente etiológico das leishmanioses
As Leishmanioses compreendem um grupo de enfermidades que acometem o
homem e que são causadas por várias espécies de protozoários do gênero
Leishmania. São caracterizadas pela ocorrência de eventos clínicos bastante
heterogêneos, que variam desde lesões cutâneas, auto-resolutivas, até lesões
destrutivas e desfigurantes ou mesmo formas sistêmicas (tipo visceral), os quais são
influenciados pela espécie envolvida e da relação do parasito com seu hospedeiro.
A primeira identificação deste parasito foi feita em 1885 por Cunningham,
estudando casos da doença na Índia (CUNNINGHAM, 1885 apud: OUMEISH, 1999).
Ainda na Índia, em 1903, Leishman e Donovan descreveram o protozoário
responsável pelo calazar, uma manifestação clínica do tipo visceral, e o identificou
como um membro pertencente à família Trypanosomatidae. Ainda em 1903, Ross
criou o gênero e deu o nome ao parasito de Leishmania donovani (OUMEISH, 1999;
AWASTHI e col, 2004). Em 1908, Nicolle foi o primeiro pesquisador a cultivar o
parasito em um meio de cultura contendo agar sangue chamado meio Nicolle, Novy
e McNeal (NNN) (NICOLLE, 1908 apud: OUMEISH, 1999). Na América do Sul, os
primeiros relatos de doença cutânea foram feitos por Lindenberg em 1909
(LINDENBERG, 1909 apud: OUMEISH, 1999). Em 1911, Vianna no Brasil atribuiu a
enfermidade a uma nova espécie, a qual nomeou Leishmania braziliensis (VIANNA,
1911 apud: OUMEISH, 1999).
18
Dentro da família Trypanosomatidae além do gênero Leishmania, existem
outros membros que possuem importância médica em relação à ocorrência de
doença em humanos como o Trypanosoma cruzi e o Trypanosoma brucei. Todos os
tripanosomatídeos mostram características morfológicas em comum como, por
exemplo: a presença de um único flagelo responsável pela locomoção e uma única
mitocôndria contendo uma significante quantidade de DNA formando uma estrutura
chamada de kinetoplasto. (GRIMALDI JR e col, 1993; BRINGAUD e col, 1998). No
gênero Leishmania as espécies apresentam duas formas evolutivas principais sendo
assim considerado um parasito digênico: uma forma flagelada, a promastigota,
móvel, extracelular, medindo cerca de 10 a 20 µm de diâmetro e mais
freqüentemente encontrada no hospedeiro invertebrado; e a forma aflagelada, a
amastigota, intracelular, que mede de 3 a 7 µm de diâmetro e pode ser vista nos
tecidos dos hospedeiros vertebrados (homem e outros mamíferos suscetíveis).
Assim, vive alternadamente em dois tipos de hospedeiros diferentes, permanecendo
uma parte do seu ciclo biológico no hospedeiro invertebrado e outra no vertebrado
(GRIMALDI JR e col, 1993; DE ALMEIDA e col, 2003).
A transmissão da doença acontece em decorrência da propagação do inseto
vetor, sendo os gêneros mais frequentemente associados o Lutzomyia no Novo
Mundo e Phlebotomus, no Velho Mundo (DE ALMEIDA e col, 2003). O ciclo biológico
de Leishmania se inicia quando as fêmeas dos flebotomíneos parasitadas inoculam
formas promastigotas metacíclicas infectantes em um hospedeiro vertebrado
suscetível durante seus repastos sanguíneos (AWASTHI e col, 2004). A saliva
19
também inoculada parece exercer papel importante na infecção, através de diversos
mecanismos dentre eles a quimiotaxia de macrófagos e monócitos ao local da picada
(ROGERS e col, 2002). Enquanto as formas promastigotas procíclicas são sensíveis
à lise mediada pela via alternativa do Complemento, as formas metacíclicas que são
inoculadas pelos flebotomíneos nos hospedeiros vertebrados ativam a via clássica,
sem sofrerem lise, explorando este mecanismo na facilitação da sua interiorização
pelos macrófagos (BOGDAN e col, 1998; CHANG e col, 1999; SACKS, 2002). Os
parasitos internalizados são capazes de resistir ao ataque de produtos derivados do
oxigênio, como o óxido nítrico, com o auxilio de moléculas próprias, como a gp63 e o
LPG, que se encontram presentes na superfície de suas membranas (BOGDAN e
col, 1998; DE ALMEIDA e col, 2003). À medida que a fusão dos lisossomos ao
fagossomo recentemente formado ocorre, o parasito transforma-se em amastigota e
passa a ser capaz de se multiplicar no ambiente ácido presente no fagolisossomo.
As formas amastigotas recém transformadas passam a se reproduzir por um
processo de fissão binária e suas sucessivas divisões favorecem o rompimento da
célula hospedeira o que contribui para a liberação do parasito e para que macrófagos
adicionais se tornem infectados perpetuando assim a infecção do organismo
hospedeiro (AWASTHI e col, 2004). Por outro lado, a infecção do hospedeiro
invertebrado ocorre quando o flebotomíneo ingere o sangue contendo as células
infectadas com formas amastigotas ao realizar o seu repasto sanguíneo em um
individuo infectado ou animal reservatório. No aparelho digestivo do inseto as
amastigotas se transformam em promastigotas, que se multiplicam intensamente,
passam a colonizar o epitélio digestivo, sob a forma de promastigota procíclica, e a
20
faringe sob a forma infectante metacíclica. Estas são extremamente móveis e se
alojam em parte no aparelho bucal do inseto, a partir do qual serão inoculadas em
animais vertebrados durante novos repastos sanguíneos (AWASTHI e col, 2004).
Uma das características mais marcantes apresentadas pelo gênero
Leishmania em comparação com os outros gêneros que fazem parte da família
Tripanosomatidae é a grande diversidade de espécies. Existem pelo menos 14
espécies distintas distribuídas no Novo Mundo reconhecidas como parasitos de
importância médica que se encontram incluídas nos subgêneros Leishmania e
Viannia (SILVEIRA e col, 2004). Desde a descrição desses parasitos, o número de
espécies identificadas vem crescendo continuamente e vários esquemas de
classificação taxonômica vêm sendo propostos (CUPOLILLO e col, 1998).
As espécies até então reconhecidas que estão associadas com doença em
humanos no Novo Mundo pertencentes ao subgênero Leishmania são: L.(L)
mexicana, L.(L) amazonensis, L.(L) venezuelensis, L.(L) chagasi e L.(L) major símile.
Dentre este grupo a L.(L) chagasi se destaca como responsável pela leishmaniose
visceral, seguida pela L.(L) amazonensis, que é responsável pela leishmaniose
cutânea. As espécies que pertencem ao subgênero Viannia são: L.(V) braziliensis,
L.(V) peruviana, L.(V) guyanensis, L.(V) panamensis, L.(V) lainsoni, L.(V) naiffi, L.(V)
colombiensis e L.(V) shawi (SILVEIRA e col, 2004). Dentre as espécies do
subgênero Viannia a L.(V) braziliensis tem uma grande importância em nosso meio
pelo seu alto grau de polimorfismo genético e fenotípico e pelo seu espectro de
21
manifestações clínicas observadas na leishmaniose tegumentar (SARAVIA e col,
1998; CUPOLILLO e col, 2003; SCHRIEFER e col, 2004).
2) Aspectos epidemiológicos da leishmaniose tegumentar
Estima-se que 400 milhões de indivíduos estejam sob risco de infecção por
Leishmania ao redor do mundo, com incidência anual estimada em 1 a 1.5 milhões e
prevalência 12 milhões de casos (DESJEUX, 2004). Segundo a Organização Mundial
de Saúde (OMS) a leishmaniose tegumentar se encontra entre as seis doenças
infecto-parasitárias de maior importância em saúde pública, sendo endêmica em pelo
menos 88 países, e tendo notificação compulsória em apenas 30 deles. Do total de
casos registrados de leishmaniose tegumentar, 90% ocorrem em apenas seis países:
Irã, Arábia Saudita, Síria e Afeganistão no Velho Mundo, e Brasil e Peru na América
do Sul (SCHALLIG e col, 2002; OMS, 2004).
A leishmaniose tegumentar americana (LTA) distribui-se amplamente nas
Américas desde o sul dos Estados Unidos até o norte da Argentina. A localidade
acometida mais importante é a sul-americana, que compreende todos os países,
com exceção do Uruguai e do Chile. No Brasil, vem se firmando como uma das
afecções dermatológicas que merece maior atenção, tendo o número de casos
crescido progressivamente durante os últimos 20 anos em praticamente todos os
Estados. Surtos epidêmicos têm ocorrido nas regiões Sudeste, Centro-Oeste,
Nordeste e, mais recentemente, na região Amazônica, estando associados ao
22
processo predatório de colonização. Nos últimos anos, o Ministério da Saúde
registrou média anual de 35 mil novos casos de LTA no país (OMS, 2004).
Salientando a LTA como um crescente problema de saúde em nosso país, a
incidência anual aumentou de 10,45 casos por 100.000 indivíduos em 1985 para
18,63 casos por 100.000 indivíduos em 2000 (OLIVEIRA e col, 2004). A região
Nordeste apresenta cerca de 39% dos casos de LTA, onde a maioria deles pertence
aos estados do Maranhão, Bahia e Ceará. A distribuição da leishmaniose em nosso
país tem sofrido mudanças nos últimos anos, pois a doença era considerada durante
muito tempo uma doença rural que acometia apenas as pessoas que viviam ou
trabalhavam no campo e atualmente vem aumentando o relato do número de casos
em áreas urbanas e periurbanas, atribuídos possivelmente a uma adaptação do
inseto vetor a novos ambientes (OLIVEIRA e col, 2004). Assim, as mudanças dos
hábitos humanos associados a alterações do meio ambiente têm contribuído para
grandes impactos na prevalência e nos padrões de transmissão, já que os dados
disponíveis até então sugerem que alguns dos parasitos e seus vetores possam
adaptar-se às mudanças ecológicas como o desmatamento e a urbanização
(CUPOLILLO e col, 1998). Além disso, as espécies de Leishmania consideradas de
importância médica apresentam características comuns de relevância epidemiológica
como: (1) serem restritas às regiões tropical e subtropical do planeta; (2)
apresentarem ciclos zoonóticos envolvendo animais selvagens e domésticos; (3) em
sua maioria infectam pessoas residentes em áreas rurais ou que tenham contato
com áreas silvestres (CUPOLILLO e col, 1998; OLIVEIRA e col, 2004). Na América
Latina há até o momento 14 espécies reconhecidas distribuídas nos subgêneros
23
Leishmania e Viannia. Na Amazônia a doença resulta da infecção devido a sete
espécies, sendo seis delas pertencentes ao subgênero Viannia (SILVEIRA e col,
2004). Entre tais espécies no Brasil destacam-se a L. (V) braziliensis, L. (L)
amazonensis e L. (V) guyanensis.
A L. (L) amazonensis é encontrada nos estados do Amazonas, Pará,
Rondônia, Tocantins e no sudoeste do Maranhão, particularmente em áreas de
vegetação e mata fechada. Sua presença também é observada no Nordeste, nos
estados da Bahia, do Ceará e do Piauí, no Sudeste, nos estados de Minas Gerais e
São Paulo e no Centro-Oeste, nos estados de Goiás e Mato Grosso (MINISTÉRIO
DA SAÚDE, 2000). A L. (V) guyanensis encontra-se distribuída ao norte da Bacia
Amazônica (Amapá, Amazonas, Pará e Roraima) e estende-se a outros países como
por exemplo as Guianas, Equador, Peru e Venezuela (MINISTÉRIO DA SAÚDE,
2000; BASANO e col, 2004). A L. (V) braziliensis é a mais importante espécie
causadora de LTA no Brasil. Possui ampla distribuição geográfica, aparecendo do sul
do Pará ao Nordeste, atingindo também o centro-sul do país e algumas áreas da
Amazônia Oriental. Esta espécie ocorre com freqüência em algumas regiões do país
onde o ambiente encontra-se intensamente modificado, mas que ainda apresente um
resquício da Mata Atlântica (MINISTÉRIO DA SAÚDE, 2000). Além destas espécies
de Leishmania, existem outras recentemente descritas que também acometem o
Brasil, sendo a L. (V) lainsoni, a L. (V) naiffi, com poucos casos humanos no Pará, a
L. (V) shawi encontrada nos estados do Pará e Maranhão (MINISTÉRIO DA SAÚDE,
2000).
24
3) Aspectos clínicos e imunológicos da leishmaniose tegumentar
A doença em nosso meio apresenta-se como uma enfermidade bastante
polimórfica que basicamente acomete a pele e mucosas. A riqueza de quadros
clínicos pode ser associada tanto a fatores relacionados à resposta imune do
hospedeiro como pela variabilidade das espécies envolvidas. As três formas
resultantes da infecção com L. (V) braziliensis são: leishmaniose cutânea localizada
(LC), leishmaniose mucosa (LM) e leishmaniose disseminada (LD) (CARVALHO e
col, 1994; CARVALHO e col, 1995).
A leishmaniose cutânea localizada é a mais comum das formas de
apresentação da enfermidade, podendo ser causada por parasitos pertencentes aos
subgêneros Viannia e Leishmania. A LC é caracterizada por uma ou poucas lesões
ulceradas bem delineadas, com bordas elevadas, encontradas principalmente em
áreas expostas do corpo como face, braços e pernas, e o paciente pode curar-se
espontaneamente (SILVEIRA e col, 2004, SHRIEFER e col, 2004). Pacientes com
LC apresentam uma resposta imunológica do tipo Th1 moderada e bem regulada
frente aos antígenos de Leishmania, o que lhes confere positividade a
intradermorreação de Montenegro (reação positiva ao teste cutâneo) (BACELLAR e
col, 2002). Como esses pacientes apresentam níveis elevados de Interferon-gama
(IFN-γ), uma citocina que induz a ativação de macrófagos, seus fagócitos
apresentam atividades antimicrobianas para as formas amastigotas do protozoário. O
estudo histológico das lesões revela riqueza de linfócitos e plasmócitos e escassez
25
ou ausência de parasitos. Em 4% dos casos ocorre associação com a leishmaniose
mucosa (LM) (CARVALHO e col, 1995).
A LM é caracterizada por envolvimento da mucosa oral, nasal ou faríngea,
concomitante à doença cutânea ou iniciada meses a anos após a resolução da lesão
primária em pele. É uma doença desfigurante e de difícil tratamento. Os indivíduos
acometidos apresentam uma forte imunidade celular representada por intensa
reação de hipersensibilidade do tipo tardia contra antígenos de Leishmania,
consistindo-se num pólo responsivo caracterizado pela produção exacerbada das
citocinas pró-inflamatórias IFN-γ e TNF-α (CARVALHO e col, 1995; BACELLAR e col,
2002). A forma mucocutânea ocorre predominantemente na América do Sul e requer
tratamento, pois os indivíduos que adquirem tal manifestação clínica da doença não
se curam espontaneamente (CARVALHO e col, 1994). A perfuração do septo nasal é
a complicação mais comum na LM, podendo ocorrer ainda disfagia devido ao
envolvimento da boca e faringe. A doença pode progredir até lesões desfigurantes e
destrutivas da cartilagem nasal, lábios e face, podendo algumas vezes ser fatal
(CHOI e col, 2001; BACELLAR e col, 2002).
A leishmaniose disseminada (LD) consiste em uma nova entidade clínica
distinta da leishmaniose cutânea difusa, a qual geralmente é causada pela L.
amazonensis (CARVALHO e col, 1994). A LD é uma forma clínica emergente da LTA
causada por L.(V) braziliensis que tem sido identificada no nosso estado
(CARVALHO e col, 1994; TURETZ e col, 2002). Esta forma clínica se caracteriza
26
pela presença de lesões numerosas do tipo ulceradas e não ulceradas na pele,
distribuídas em diversas áreas do corpo, como a face, tórax, abdome e membros
superiores e inferiores dos pacientes. As células da resposta imune dos indivíduos
acometidos produzem níveis menores de IFN-γ e TNF-α e níveis mais elevados de
IL-10 frente à estimulação com antígenos de Leishmania quando comparados aos
pacientes com LC (TURETZ e col, 2002).
Para o tratamento da LTA a droga de primeira escolha é o antimonial
pentavalente, existente sob duas formas: o antimoniato de N-metilglucamina
(Glucantime) e o stibogluconato de sódio (Pentostam), sendo que este último não é
comercializado no Brasil. Este medicamento está indicado para tratamento de todas
as formas de leishmaniose tegumentar, embora as formas mucosas exijam maior
atenção, já que os pacientes podem apresentar respostas mais lentas e maior
possibilidade de recidivas. A resposta ao esquema terapêutico varia
consideravelmente de acordo com a espécie envolvida, a resposta imune do
hospedeiro e a forma clínica ou estágio da doença (GRIMALDI e col, 1993). A
Anfotericina B, um antibiótico que possui também ação leishmanicida, é a droga de
segunda escolha, empregada quando não se obtém resposta ao tratamento com
antimonial ou na impossibilidade de seu uso. Outros medicamentos são utilizados
quando ocorre a refratariedade na terapêutica da LTA, como as pentamidinas (CHOI
e col, 2001; GRIMALDI e col, 1993).
27
O diagnóstico precoce da leishmaniose é importante a fim de evitar danos
mais graves ou mesmo a morte do indivíduo. Uma melhor compreensão dos fatores
que influenciam o curso clínico da infecção por L. (V) braziliensis relacionados ao
parasito ou mesmo aqueles desencadeados pela resposta imune do hospedeiro,
poderá resultar em novas abordagens que contribuiriam para a prevenção e para o
tratamento precoce da LTA. A implicação de uma única espécie do parasito em mais
de uma forma de leishmaniose sugere um papel da variabilidade intra-específica
sobre os desfechos clínicos dessa enfermidade, à semelhança da variabilidade que
observamos ao nível de espécies.
4) Epidemiologia molecular em Leishmania sp.
Leishmania sp. é um parasito diplóide e assexuado, isto é, sua forma de
reprodução é clonal, onde seu genótipo se propaga de forma completa entre os
descendentes (BANULS e col, 1999). Estudos genéticos populacionais realizados ao
longo do tempo indicaram que as duas conseqüências genéticas da reprodução
sexual (a segregação e a recombinação) estão ausentes em Leishmania, e um
modelo clonal foi proposto para o gênero, modelo este que reforça tanto a existência
de uma grande diversidade de espécies como de diferenças intra-espécies, embora
não possamos excluir totalmente a possibilidade de eventos de recombinação sexual
(CUPOLILLO e col, 1998; BANULS e col, 1999; ISHIKAWA e col, 2002, SCHRIEFER
e col, 2004). Por pertencer à ordem Kinetoplastida, a Leishmânia apresenta um DNA
nuclear que representa mais de 80% do DNA total da célula e um outro denominado
28
kDNA, situado numa única mitocôndria que forma o cinetoplasto na base do flagelo
do microorganismo. O tamanho do genoma de Leishmania varia conforme a espécie,
tendo em média 3,55 x 10
7
pares de base organizados em 34 a 36 cromossomos, a
depender da espécie, que não se condensam durante o ciclo mitótico e que
apresentam variabilidade em tamanho e em quantidade (STILES e col, 1999;
MELBY, 2002). O padrão do cariótipo molecular mediante observação através de
métodos como a Eletroforese de campo pulsatil (PFGE) é extremamente polimórfico,
até o ponto de ser quase específico para cada cepa (STILES e col, 1999). A
necessidade de se diferenciar e caracterizar as populações desses parasitos com o
objetivo de melhoria do diagnóstico e de determinação do prognóstico das infecções
tem estimulado o desenvolvimento de métodos de caracterização fenotípica e
genotípica com elevada capacidade de discriminação (SINGH, 1997; BANUS e col,
1999).
Um método para caracterização fenotípica baseado na análise de isoenzimas,
do inglês, multilocus enzyme electrophoresis (MLEE) foi uma das primeiras técnicas
utilizadas entre os métodos de caracterização de microorganismos e de uma maneira
geral é o método padrão amplamente empregado na identificação de cepas em
protozoários do gênero Leishmania, por possuir uma combinação desejável de poder
discriminatório e de detecção de clones independentemente de sua estabilidade
(CUPOLILLO e col, 1998; BOUGNOUX e col, 2004). É considerado um método
genético indireto, pois analisa a mobilidade eletroforética de um número definido,
geralmente entre 15 e 20, de enzimas metabólicas em géis de amido ou de
29
poliacrilamida, onde as variações observadas nestas mobilidades exprimem apenas
uma avaliação de regiões de seqüências já expressas, e que correspondem a
variações no lócus ou no gene codificante de determinada enzima. Cada variante
gerada se define como “variante alélica” e os diferentes alelos de cada um dos genes
formam o perfil alélico que por sua vez define um padrão eletroforético, o qual é
denominado de zimodema. Para Leishmania sp. do Novo mundo a classificação em
zimodemas foi definida por 13 sistemas enzimáticos e estes denominados de “MON”
que correspondem a todas as cepas que apresentem o mesmo perfil enzimático
(VAZQUEZ e col, 2004). Já a classificação por reatividade contra painéis de
anticorpos monoclonais se demonstrou útil para a identificação de espécies do
gênero Leishmania. Porém, este método requer o emprego de vários painéis de
anticorpos distintos e que são escolhidos de acordo com a origem e localização das
cepas a serem identificadas (SARAVIA e col, 2002).
Ainda sim, tanto a classificação dos parasitos em zimodemas como também
em sorodemas têm sido a abordagem tradicionalmente empregada na diferenciação
específica e intra-específica do gênero Leishmania. TOLEDO e colaboradores, num
estudo avaliando a variabilidade genética intra-específica de L. infantum proveniente
de formas clínicas, de hospedeiros e de regiões geográficas diferentes ao
correlacionar a identificação por zimodemas com marcadores genéticos obtidos ao
método de Amplificação randômica de DNA polimórfico, do inglês Randomly
Amplified Polymorphic DNA (RAPD) demonstraram que as duas metodologias
distinguem bem quando se comparam espécies diferentes, mas não se sobrepõem
30
quando envolvem a mesma espécie, evidenciando a existência de heterogeneidade
entre cepas pertencentes ao mesmo zimodema (TOLEDO e col, 2002). Além disso,
as caracterizações de parasitos obtidas através dos métodos isoenzimáticos trazem
consigo certas restrições em decorrência de tal metodologia. O método de
isoenzimas apresenta algumas limitações como a de ser uma técnica delongada que
requer grandes quantidades de parasitos obtidos através de culturas para a sua
execução, de pessoal treinado e existência de laboratórios de referência
principalmente nas áreas endêmicas, além também de ter uma capacidade restrita
para uma caracterização fenotípica entre espécies, que impossibilitam uma melhor e
maior discriminação entre cepas de microorganismos e protozoários
geograficamente próximos como também uma associação da tipagem molecular com
o desfecho clínico da doença.
Com a busca de métodos cada vez mais discriminatórios o RAPD aparece
como um método de grande capacidade discriminatória e que vem sendo bem
empregado para a melhor compreensão da variabilidade intra-específica de diversos
microorganismos. O RAPD é baseado na técnica de reação em cadeia da
polimerase, do inglês polymerase chain reaction (PCR), onde utilizamos
oligonucleotídeos iniciadores (primers) não específicos para uma região alvo no
genoma, e a reação é realizada em condições de baixa / média estringência (isto é,
temperatura de aproximadamente 30ºC e elevada concentração de MgCl
2
e primers).
Esta condição de baixa estringência resulta em padrões eletroforéticos com números
variáveis de bandas, caracterizando desta forma o genótipo molecular. Essa técnica
31
tem sido amplamente explorada, provando sua utilidade na tipagem de cepas e no
estudo da genética / estrutura populacional de protozoários (TIBAYRENC e col,
1993; MARTINEZ e col, 2003). Como exemplo, o RAPD foi empregado com sucesso
na demonstração da variação clonal em uma outra espécie de tripanosomatídeos, o
T. cruzi (STEINDEL e col, 1993; TIBAYRENC e col, 1993). A análise comparativa de
um grupo de isolados de T. cruzi por RAPD e pela técnica padrão ouro de tipagem
desses organismos - caracterização de isoenzimas (classificação por zimodemas),
resultou em dendrogramas de topologias significantemente correlacionadas,
demonstrando a adequação da genotipagem por RAPD na classificação de isolados /
cepas de protozoários (TIBAYRENC e col, 1993).
O RAPD tem sido bastante empregado na caracterização de parasitos do
gênero Leishmania e da L. braziliensis em particular. Por exemplo, GOMES e
colaboradores descreveram que cepas de L. braziliensis coletadas na região Sudeste
do Brasil mostraram-se marcadamente diferentes daquelas coletadas na região
Norte do país quando genotipadas com essa técnica (GOMES e col, 1995). Por outro
lado, avaliando a estrutura populacional de isolados de L. braziliensis de casos de
LTA na região endêmica de Corte de Pedra, no Sudeste do estado da Bahia,
SCHRIEFER e colaboradores encontraram uma estrutura multiclonal dos parasitos
responsáveis pela doença naquela área geográfica (SCHRIEFER e col, 2004). Além
disso, uma contribuição importante desse trabalho foi a detecção de uma associação
significante entre subpopulações de L. braziliensis e desfecho clínico de doença
32
humana, onde esta espécie é a principal causa de LC clássica em nossa região e
vem sendo o agente etiológico para a maioria dos casos emergentes de LD.
A identificação de uma população com estrutura multiclonal e associação
entre as subpopulações do parasito e formas clínicas de leishmaniose abrem a
possibilidade de se detectar polimorfismos genéticos cepa específicos para as L.
braziliensis que futuramente se tornariam marcadores genéticos desta espécie. Tais
marcadores genéticos, uma vez identificados e definidos, poderiam então ser
explorados no desenvolvimento de ferramentas epidemiológicas e / ou diagnósticas
com o valor preditivo sobre os desfechos da doença e respostas terapêuticas dos
pacientes, onde teria principal emprego no melhor manejo da forma mais agressiva
de doença, que é a forma mucosa. Todavia, a quantidade de polimorfismos em DNA
normalmente detectada pelo método de RAPD parece ser ilimitada, e pelo seu
método de aferição dos resultados baseados na mobilidade eletroforética de
fragmentos genômicos amplificados que geram padrões complexos. O RAPD se
aplica bem à investigação genética e em assuntos epidemiológicos, sobretudo por
combinar um bom grau de discriminação com custo efetivo baixo, e pelo fato de não
necessitar de conhecimento prévio do genoma avaliado. Todavia, a realização do
método na rotina demonstra grande desvantagem em relação à reprodutibilidade e à
comparabilidade de dados entre diferentes centros de pesquisa, e até num mesmo
laboratório tanto por basear-se em perfis eletroforéticos quanto pelas próprias
dificuldades inerentes aos protocolos de amplificação de DNA em condições de baixa
estringência (TIBAYRENC e col, 1993; BOUGNOUX e col, 2004).
33
Por conseguinte, na busca por alternativas mais precisas e mais sensíveis do
que os métodos usuais surgem os métodos baseados em seqüências de
nucleotídeos que se mostram mais adequados à comparação direta entre isolados
caracterizados em localidades diferentes como também naqueles situados numa
mesma área geográfica, promovendo uma perspectiva inestimável em estudos
epidemiológicos globais de cepas patogênicas e na avaliação de estruturas
populacionais e diversidade genética dentro de uma espécie (CHAN e col, 2001;
FEIL e col, 2004).
O método de tipagem de seqüência multilocus, do inglês multilocus sequence
typing (MLST) é um método altamente discriminatório que se baseia na análise de
polimorfismos de nucleotídeos na seqüência de DNA em genes constitutivos de pelo
menos sete fragmentos internos (loci) com aproximadamente 400-500 pares de base
(ENRIGHT e col, 1999; CHAN e col, 2001). Este método mostrou um elevado grau
de poder discriminatório intraespecífico para alguns patógenos (bactérias e fungos),
sendo inicialmente desenvolvido para várias espécies bacterianas, dentre as quais
Neisseria meningitidis, Streptococcus pneumonie, Staphylococcus aureus e
Streptococcus pyogenes, que representam patógenos de importância epidemiológica
e também em saúde pública (ENRIGHT e col, 1999; BOUGNOUX e col, 2004). A
grande vantagem do MLST é que os dados da seqüência são precisos e únicos e os
perfis alélicos dos isolados podem facilmente ser comparados com aqueles
presentes em uma grande base de dados central através da Internet (em contraste
com a maioria dos procedimentos de tipagem que envolvem comparações dos
34
fragmentos de DNA em gel eletroforético). Além disso, os perfis alélicos podem
também ser obtidos a partir de material clínico pela amplificação por PCR dos sete
loci gênicos diretamente do sítio de coleta da amostra, permitindo que os isolados
possam ser caracterizados de maneira precisa mesmo quando não podem ser
cultivados a partir de material clínico (MAIDEN e col, 1998; TAYLOR e col, 2003). O
método permite ainda que os perfis alélicos gerados para os microorganismos sejam
informatizados, ou seja, armazenados em banco de dados, gerando imensa
quantidade de informações passiveis de comparação entre centros de pesquisa
localizados geograficamente distantes visando principalmente à determinação de
clones de maior virulência e o rastreamento epidemiológico (CHAN e col, 2001;
BOUGNOUX e col, 2004).
O polimorfismo de comprimento de fragmentos de restrição, do inglês
restriction fragment length polymorphism (RFLP) é um outro método de tipagem
molecular que detecta diferenças genéticas por comparação de variação em
tamanho nos padrões de bandas do DNA após a análise com endonucleases de
restrição. É uma técnica em que os organismos podem ser diferenciados pela análise
dos padrões originados da clivagem de seus DNAs. A análise de similaridade dos
padrões gerados pode ser usada para diferenciar a espécie (e mesmo as cepas) de
dois organismos. Mostra-se como um método útil de aplicação pela possibilidade de
utilização de regiões intergênicas em estudos genéticos de variabilidade entre
isolados intra-específicos de Leishmania provenientes de um foco endêmico em
particular (VOLPINI e col. 2004).
35
O presente estudo pretendeu identificar seqüências polimórficas que
futuramente possam funcionar como marcadores genéticos suficientemente capazes
de distinguir cepas / isolados naturais de L. braziliensis e que possam ser utilizados
no desenvolvimento de uma ferramenta diagnóstica moderna e potente, como o
RFLP ou o MLST, que por sua vez poderia ser explorada para auxiliar na descoberta
precoce das formas clínicas de doença e com isso favorecer o estabelecimento de
uma terapêutica eficaz e favorável ao paciente.
36
HIPÓTESE
O polimorfismo observado ao nível de genótipo molecular ao RAPD entre as
diferentes cepas de L. braziliensis provenientes de uma área endêmica em LTA é
acompanhado por polimorfismos ao nível de seqüência de nucleotídeos (genoma).
Com base nestes polimorfismos, cepas do parasito associadas com manifestações
específicas de doença podem ser distinguidas. Funcionando como marcadores
moleculares (alvos genéticos do parasito) tais polimorfismos poderiam ser
explorados no desenvolvimento de ferramentas diagnósticas e epidemiológicas mais
robustas e potentes do que o RAPD, e isto poderia ser explorado na melhoria da
conduta clínica e terapêutica dos casos humanos e no entendimento da “clonalidade”
ou multi-clonalidade das infecções humanas.
OBJETIVO GERAL
• Identificar e caracterizar loci com variação alélica, em isolados naturais de L.
braziliensis, a serem utilizados em métodos que tenham capacidade de
discriminação entre cepas do parasito, como o MLST e o PCR-RFLP.
37
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1. Obter os produtos de DNA genômico gerados por três protocolos de RAPD de
isolados genotipicamente distintos de L. braziliensis .
2. Clonar e sequenciar os fragmentos de DNA amplificados por RAPD (bandas
nos géis agarose);
3. Caracterizar as seqüências obtidas quanto ao seu teor em nucleotídeos,
presença de repetições e sítios de restrição;
4. Avaliar, ao alinhamento, a homologia entre seqüências de DNA genômico
representadas em bandas dos RAPDs com mesmo peso molecular e mesma
altura presentes em isolados distintos do parasito;
5. Identificar e caracterizar os polimorfismos presentes nas seqüências de
nucleotídeos dos loci homólogos encontrados nos genomas dos diferentes
isolados;
6. Identificar possíveis marcadores genéticos que poderão ser explorados em
futuros protocolos de MLST e PCR-RFLP para a genotipagem de cepas de L.
braziliensis.
38
JUSTIFICATIVA
Todo o espectro de manifestações clínicas da LTA causada por L. braziliensis
pode ser visto na área endêmica de Corte de Pedra. Nesta região foi encontrada
uma estrutura populacional multiclonal de parasitos obtidos a partir dos casos de LC,
LM e LD e uma associação entre genótipos de L. braziliensis definidos ao RAPD e
forma clínica da doença humana (SCHRIEFER e col, 2004). Tais diferenças
genotípicas podem apresentar contrapartidas nas seqüências primárias do DNA
genômico dos parasitos, representando marcadores moleculares bem definidos, que
podem ser utilizados em métodos de discriminação altamente sensíveis e
específicos, e mais reproduzíveis que o RAPD. Esses métodos baseados na
identificação de polimorfismos presentes nas seqüências de nucleotídeos como o
MLST e o RFLP, viabilizariam uma identificação mais apurada de cepas naturais de
L. braziliensis, o que em última estância, essa maior capacidade de discriminação
poderia ser explorada na identificação de clones parasitários envolvidos nas
infecções, o que poderia mostrar-se de valor prognóstico, melhorando o manejo
clínico e terapêutico dos casos de doença humana.
39
MATERIAIS E MÉTODO
1) Seleção dos isolados de L. braziliensis empregados na detecção de loci
polimórficos.
Baseado em um estudo prévio onde avaliou-se o polimorfismo de L.
braziliensis e caracterizou-se sua estrutura populacional na região endêmica em LTA
de Corte de Pedra, situada a 265 Km ao sul de Salvador – Bahia, utilizando 45
amostras de isolados do parasito provenientes de pacientes atendidos no posto
médico da região num período compreendido entre 1992 a 2001, no qual estes
isolados tiveram os seus DNAs extraídos e submetidos a genotipagem por RAPD,
que contribuiu para definição da existência de cinco subpopulações (clados)
geneticamente distintas do parasito na região estudada (SCHRIEFER e col, 2004)
selecionamos seis representantes de tais isolados do parasito que apresentaram
genótipos distintos para a caracterização de determinados fragmentos genômicos.
Estes seis representantes foram divididos, sendo dois isolados de L. braziliensis
distintos para cada um dos três protocolos de RAPD (ABI-04, A8 e ABI-18), de
acordo com o padrão eletroforético observado para cada protocolo, levando-se em
consideração as bandas compartilhadas e as poucas bandas não compartilhadas.
Assim, para cada oligonucleotídeo iniciador avaliado testamos um par de isolados
com padrões eletroforéticos distintos, sendo para o ABI-04 os isolados Lb49 e Lb36;
para o A8 os isolados Lb48 e Lb14 e para o ABI-18 os isolados Lb40 e Lb22
(FIGURA 1).
40
Então, mediante os padrões eletroforéticos observados em gel de agarose
(FIGURA 2) para cada protocolo de RAPD testado, foram escolhidas para as
análises comparativas as bandas de equivalente altura e tamanho (definidas como
correspondentes) e de tamanho variando de aproximadamente 550 a 1500 pares de
base, entre os pares de isolados do parasito, que se mostraram de mais fácil corte e
extração e com menores probabilidades de contaminação com DNAs de outras
bandas próximas. Foram selecionadas bandas dos RAPD nessa faixa de peso
molecular visando facilitar o processo de detecção de seqüências úteis para a
exploração em protocolo MLST e PCR-RFLP.
41
Figura 1.
Figura 1. Dendrograma de 45 isolados de L. braziliensis obtidos de casos de
leishmaniose tegumentar americana da área endêmica de Corte de Pedra. O
dendrograma foi elaborado a partir da similaridade (UPGMA) de padrões
eletroforéticos obtidos após RAPD. Formas: cutânea (C), mucosa (M) e disseminada
(D); (?) casos sem a forma clínica confirmada. A árvore fenética mostra a
distribuição dos parasitos em nove clones (1 a 9) e cinco clados (A a E). As setas
indicam os isolados selecionados para o estudo.
42
Figura 2.
1 2 3 1 2 3 1 2 3
A B C
Figura 2. Padrões eletroforéticos obtidos pelo RAPD com os seis isolados de L.
braziliensis selecionados para o estudo. Os protocolos RAPD foram: (A)
oligonucleotídeo iniciador ABI-04; (B) oligonucleotídeo iniciador A8; (C)
oligonucleotídeo iniciador ABI-18. Na raia 1 temos o marcador de pares de base
(100bp), nas raias 2 e 3 temos dois isolados para cada um dos respectivos
protocolos RAPD, sendo: (A) Lb49 e Lb36; (B) Lb48 e Lb14: (C) Lb22 e Lb40. As
setas indicam as bandas escolhidas para o estudo.
B1
B2
B1
B1
B3
B2
600
900
1500
600
600
100
43
2) Obtenção de isolados de L. braziliensis utilizados para caracterização de loci
com variação alélica.
Um total de seis isolados de L. braziliensis foram selecionados para a
caracterização dos fragmentos genômicos. Os parasitos foram obtidos através de
aspiração de lesão cutânea ou mucosa com fins diagnósticos dos pacientes
atendidos no posto médico da região endêmica de estudo, e foram cultivados em
meio de cultura NNN com LIT a 23 ºC e 5% de CO
2
por 7 a 30 dias. Em seguida, os
isolados foram transferidos para o meio de cultura líquido Schneider (SCHNEIDER
INSECT EXTRACT MEDIUM, SIGMA) suplementado com 10% de soro bovino fetal
inativado (Gibco BRL, division of INVITROGEN, GAITHERSBURG, EUA), 2% de
urina masculina humana e o antibiótico Gentamicina 50 µg/ mL (Gibco BRL, division
of INVITROGEN, GAITHERSBURG, EUA), e cultivados até atingirem uma
suspensão de aproximadamente 1x 10
7
a 1x 10
8
células / mL. A partir deste estágio
de cultivo, a suspensão foi aliquotada com finalidade de congelamento e manutenção
dos estoques dos isolados em nitrogênio líquido no Serviço de Imunologia.
3) Obtenção e Estoque do DNA Genômico de L. braziliensis.
Os seis isolados de L. braziliensis foram descongelados e cultivados em meio
de cultura Schneider até que as promastigotas atingissem fase estacionária de
crescimento. Cerca de 1,7 mL de suspensão de promastigotas foram centrifugados a
44
200 g por 10 minutos e o sedimento foi ressuspenso em 150 µL de tampão de lise
TELT (50 mM Tris-HCl pH 8,0; 62,5 mM EDTA pH 9,0; 2,5 M LiCl e 4% v/v Triton
100x). Após homogeneização por inversão e incubação à temperatura ambiente por
5 minutos, DNA genômico foi extraído adicionando-se 150 µL de uma mistura de
Fenol e Clorofórmio (1:1 v/v) ao lisado celular, seguido de homogeneização vagarosa
em homogeneizador por 5 minutos e centrifugação a 10.000 g por 5 minutos. O
sobrenadante contendo DNA genômico foi colhido, transferido para novo tubo,
precipitado pela adição de 300 µL de etanol absoluto, homogeneizado por 5 minutos
e centrifugado a 10.000 g por 10 minutos. Então, o sobrenadante foi descartado e o
DNA precipitado foi lavado uma vez com 1 mL de etanol absoluto e centrifugado a
10.000 g por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado, depois de
seco, foi ressuspendido em 100 µL de tampão TE (Tris-Cl 10 mM, EDTA 1 mM pH
8,0) e estocado a -20º C até o momento do uso.
4) Amplificação de Alvos Genômicos em Seis Isolados de L. braziliensis de
Corte de Pedra por RAPD.
Os seis isolados utilizados neste estudo foram previamente caracterizados por
quatro protocolos de RAPD capazes de diferenciar cepas de L. braziliensis existentes
na área endêmica estudada. Desses quatro protocolos de RAPD, utilizamos os
oligonucleotídeos iniciadores, ou primers, de maneira isolada: ABI-04 (5’-
GGACTGGAGT-3’), A-8 (5’-GTGACGTAGG-3’) e ABI-18 (5’-CCACAGCAGT-3’). As
45
reações de amplificação foram realizadas em um volume final de 10 µL contendo: 20
ng de DNA alvo; 0,04 mM para cada oligonucleotídeo iniciador (INVITROGEN Life
Technologies, Inc.); dNTPs a 0,2 mM (Gibco BRL, division of INVITROGEN,
GAITHERSBURG, EUA); MgCl
2
3,5 mM (INVITROGEN Life Technologies, Inc.); 0,5
U de Taq platinum DNA polimerase (INVITROGEN Life Technologies, Inc.) e 1 µL de
tampão recomendado pelo fabricante (tampão 10x, INVITROGEN Life Technologies,
Inc.). As amplificações foram realizadas em termociclador PCR GeneAmp 9600
(Perkin Elmer Inc., MA, EUA) utilizando para cada protocolo uma etapa de
desnaturação a 95 ºC por 5 minutos, seguida por 35 ciclos de 94 ºC por 30
segundos, 36 ºC por 1 minuto e 72 ºC por 2 minutos. A etapa final de extensão a 72
ºC por 7 minutos foi adicionada ao protocolo para assegurar que os produtos de
amplificação apresentassem seus resíduos de adenina livres em suas extremidades
3’. Os produtos de reação foram então separados por eletroforese em gel de agarose
a 1,3 % por 50 minutos a 120 volts, em tampão TBE 0,5x (0,04M Tris-HCl-Borato e 1
mM EDTA). Os géis foram corados com brometo de etídeo a 0,5 µg/mL e
visualizados através de transiluminador UV acoplado a um sistema de captura
eletrônica de imagens (UVP LabWorks Laboratory Imaging and Analysis System Inc.,
CA, EUA).
46
5) Extração de Fragmentos de DNA Genômico de L. braziliensis Amplificados
por RAPD dos Géis de Agarose.
Um total de 12 pedaços de gel de agarose contendo os fragmentos de DNA
genômico de L. braziliensis amplificados ao RAPD escolhidos para a caracterização
molecular sendo para o oligonucleotideo iniciador ABI-04 foram retirados dois
fragmentos para cada um dos dois isolados selecionados, totalizando quatro
fragmentos; para o oligonucleotideo iniciador A-8, foram retirados três fragmentos
para cada um dos dois isolados selecionados, totalizando seis fragmentos, e para o
oligonucleotídeo iniciador ABI-18, foi retirado apenas um fragmento para cada um
dos dois isolados, totalizando dois fragmentos, foram cortados com o auxílio de uma
lâmina de bisturi sobre um transiluminador UV e extraídos através de uso do “kit”
comercial QIAEX II Gel Extraction Kit (QIAGEN) segundo orientação do fabricante.
Para a extração de DNA de gel de agarose, seguiu-se o protocolo assim descrito: o
pedaço de gel foi colocado em um tubo Eppendorf de 1,5 mL ao final foram
acrescentados 300 µL do Tampão Qx1. O reagente QIAEX II foi ressuspenso por
vortex durante 30 segundos e adicionado à amostra de acordo com a quantidade de
DNA presente, sendo 10 µL de QIAEX II para amostras com até 2 µg DNA. A mistura
foi deixada por 10 minutos a 50 ºC a fim de solubilizar a agarose e favorecer a
ligação do DNA com as partículas de sílica gel, sendo eventualmente agitada por
vortex para manter as partículas em suspensão. A amostra foi centrifugada por 1
minuto a 10.000 g, o sobrenadante foi desprezado e o sedimento foi lavado com 500
µL de Tampão Qx1 por centrifugação por 1 minuto a 10.000 g. Mais uma vez, o
47
sobrenadante foi removido e o sedimento foi lavado duas vezes com 500 µL do
Tampão PE por centrifugação por 1 minuto a 10.000 g. O sedimento foi deixado ao
ar por cerca de 15 minutos para a evaporação de etanol presente no tampão, em
seguida, 20 µL de Tris-Cl 10 mM pH 8,0 foram adicionados à mistura e esta foi
incubada por 5 minutos a temperatura ambiente, sendo posteriormente centrifugada
por 1 minuto a 10.000 g. Cuidadosamente, o sobrenadante foi transferido para um
novo tubo e esta última etapa repetida por mais uma vez para aumentar o
rendimento final. A amostra foi mantida armazenada a -20 ºC.
6) Preparo do Meio de Cultura Luria-Bertani
O meio de cultura utilizado para o cultivo das bactérias competentes foi o
Luria-Bertani (LB). O meio LB líquido foi preparado misturando 10g de triptona
(DIFCO Laboratories, DETROIT, MICHIGAN, EUA), 5g de extrato de levedura
(DIFCO Laboratories, DETROIT, MICHIGAN, EUA) e 5g de cloreto de sódio
(REAGEN, Quimbrás, RIO DE JANEIRO, BRA) em 1 litro de água bidestilada.
Estoques do meio foram autoclavados e guardados em temperatura ambiente até o
momento do uso. O meio LB agar foi preparado de maneira similar, adicionando-se
15g de bacto-agar (DIFCO Laboratories, DETROIT, MICHIGAN, EUA) à receita
acima. Após a autoclavagem, aproximadamente 20 mL foram distribuídos em placas
de petri. Após resfriamento as placas foram armazenadas a 4ºC até o uso. Alguns
48
lotes de placas foram preparados adicionando a Ampicilina (Gibco BRL, division of
INVITROGEN, GAITHERSBURG, EUA) na concentração de 100 µg/mL.
7) Preparo de Células Competentes
A linhagem da bactéria Escherichia coli utilizada como célula hospedeira de
plasmídeos recombinantes neste estudo foi a DH5α. As células foram quimicamente
tornadas competentes, sendo preparadas pelo tratamento com cloreto de cálcio,
segundo o método resumidamente descrito a seguir. Uma alíquota do estoque da
cepa mantida a -70 ºC em glicerol, foi semeada sobre o meio LB agar com uma alça
de platina. Após incubação a 37 ºC por aproximadamente 18 horas, uma colônia foi
inoculada em 2 mL de caldo LB líquido em tubo Falcon de 15 mL e cultivada por
aproximadamente 18 horas a 37 ºC sob agitação vigorosa de cerca de 250 rpm. Um
volume de 250 µL da suspensão foi transferido para Erlenmeyer de 250 mL contendo
25 mL de caldo LB líquido e incubados a 37 ºC sob agitação (250 rpm) até que a
densidade ótica entre 0,4 e 0,6 medida a 600 nm fosse atingida (aproximadamente 3
horas de incubação). Todo o conteúdo foi centrifugado a 4ºC, 8000 rpm por 5
minutos, o sobrenadante foi descartado e o sedimento bacteriano foi ressuspenso
em 5 mL de CaCl
2
50 mM gelado. A suspensão foi novamente centrifugada sob as
mesmas condições, o sobrenadante foi descartado e o sedimento bacteriano foi
ressuspenso em 2 mL de CaCl
2
50 mM e glicerol 20%. Após incubação por 10
minutos no gelo a suspensão de bactéria foi distribuída em alíquotas de 100 µL em
49
tubos Eppendorf previamente refrigerados. Os tubos Epperdorf foram armazenados e
mantidos a -70 ºC até o momento de uso.
8) Clonagem de fragmentos de DNA genômico de L. braziliensis amplificados
por RAPD em plasmídeo, Transformação Química e Seleção das E. coli DH5α
Recombinantes.
Os 12 fragmentos de DNA genômico de L. braziliensis extraídos de géis de
agarose foram clonados usando-se o TA Cloning Kit (INVITROGEN Life
Technologies, Inc.), segundo orientação do fabricante, conforme está descrito abaixo
de forma resumida.
Reação de ligação: inserção dos fragmentos de DNA no vetor, o plasmídeo
pCRII, com o auxílio da enzima T4 DNA ligase, por associação das suas
extremidades 5’ e 3’ com as do DNA alvo. Para um volume final de reação de 10 µL
acrescentou-se 6 µL de DNA, 1 µL de tampão apropriado, 2 µL de solução contendo
o vetor e 1 µL de solução contendo a enzima. A reação foi gentilmente misturada e
incubada a 14 ºC durante 16 horas.
Reação de transformação: a mistura contendo o vetor recombinante recém-
formado na reação de ligação foi adicionada a uma suspensão de células
hospedeiras competentes e estas foram submetidas à etapa de transformação
segundo o protocolo de reação térmica (SAMBROOK e col, 1989). Antes da reação
propriamente dita foram necessárias algumas etapas prévias como, cada alíquota
50
bacteriana utilizada foi retirada cerca de 5 minutos antes do estoque a -70 ºC e
colocada no gelo; retirou-se também placas com LB agar o LB meio liquido da
geladeira pelo menos uma hora antes do uso para que atingissem a temperatura
ambiente. Para a seleção primária, uma solução de uso contendo 40 µL de X-gal a
20 mg/mL (INVITROGEN Life Technologies, Inc.) e 4 µL de IPTG a 200 mg/mL
(INVITROGEN, Life Technologies, Inc.) por placa foi distribuída homogeneamente
pela superfície do meio LB agar e as placas foram deixadas em repouso a 37 ºC até
o momento de uso. Na reação de transformação foi acrescentado 1 µL de produto de
reação de ligação a uma alíquota de E. coli DH5α e a mistura incubada por 30
minutos no gelo. Então as células foram submetidas a um choque térmico, onde
foram incubadas por 3 minutos a 42 ºC e logo em seguida transferidas para o gelo e
deixadas por 2 minutos. Um volume de 800 µL de caldo LB foi acrescentado e a
mistura foi submetida à incubação a 37 ºC sob agitação por aproximadamente 1 hora
e 30 minutos. Cerca de 200 µL do conteúdo de cada tubo com produto de
transformação foram distribuídos homogeneamente na superfície do LB Agar, com o
auxilio da alça de Drigalski e suporte rotatório, e as placas incubadas durante a noite
em estufa a 37 ºC. Após o crescimento esperado, foi realizada a seleção primária,
onde para cada fragmento de DNA genômico empregado no estudo, 10 colônias
positivas (brancas) de DH5α, prováveis portadoras do vetor pCRII contendo o inserto
de interesse, foram isoladas e transferidas para tubos falcon contendo 5 mL de meio
LB líquido com ampicilina a 100 µg/mL. Essa suspensão foi incubada por 16 horas a
37 ºC, sob agitação em incubadora orbital rotatória a 250 rpm. A extração do DNA
plasmideal de alíquotas dessas suspensões foi realizada de acordo com o protocolo
51
de minipreparação pelo método da lise alcalina (SAMBROOK e col., 1989) resumido
a seguir. Colocou-se 1,5 mL de suspensão bacteriana em um tubo Eppendorf e
centrifugou-se por 1 minuto a 12.000 g. O sobrenadante foi removido por aspiração e
o sedimento bacteriano foi ressuspenso com 100 µL de uma solução gelada,
contendo Glicose a 50 mM, EDTA a 10 mM e Tris-Cl a 25 mM pH 8,0, através de uso
de agitador vortex até ficar bem disperso. Após a obtenção de uma suspensão
homogênea, o tubo Eppendorf foi incubado a temperatura ambiente por 5 minutos.
Em seguida, 200 µL de uma solução, recém preparada, contendo 1 mL de SDS 10%,
2 mL de NaOH 1N e 7 mL de água bidestilada foram acrescentados ao o tubo, o
conteúdo foi misturado por inversão rápida aproximadamente 3 vezes e o tubo foi
incubado por 5 minutos no gelo. Após este período, 150 µL de uma solução gelada
de acetato de potássio pH 4,8 foram acrescentados ao tubo e o conteúdo foi
misturado gentilmente por agitador vortex cerca de 10 segundos em uma posição
invertida e incubado por 5 minutos no gelo. O tubo foi então centrifugado por 5
minutos a 4 ºC, 12.000 g. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo,
previamente resfriado, e a ele foram adicionados 450 µL de uma mistura contendo
fenol e clorofórmio 1:1(v/v). O tubo foi centrifugado por 2 minutos a 4 ºC, 12.000 g.
Mais uma vez o sobrenadante foi transferido para um novo tubo, previamente
resfriado, 1 mL de etanol absoluto foi adicionado e a mistura deixada por 5 minutos à
temperatura ambiente. O tubo foi centrifugado por 5 minutos a 4 ºC e 12.000 g. O
sobrenadante foi desprezado e 1 mL de etanol a 70 % foi adicionado ao sedimento.
O tubo foi centrifugado sendo o sobrenadante removido e o sedimento seco ao ar.
Após a evaporação de etanol a 70 %, o sedimento de DNA foi ressuspendido com 50
52
µL de tampão TE, pH 8,0, contendo RNase A (Gibco BRL, division of INVITROGEN,
GAITHERSBURG, EUA) e a mistura armazenada a -20 ºC.
A identificação de colônias exibindo plasmídeo recombinante com segmento
de DNA de L. braziliensis foi realizada pela análise de restrição de DNA plasmideal
com a endonuclease ECO RI (INVITROGEN, Life Technologies, Inc.). Em resumo,
colocou-se 10 µL da solução de minipreparação em um tubo Eppendorf e
acrescentou-se 1,2 µL do tampão 10x apropriado e 0,8 µL da enzima de restrição
ECO RI. A mistura foi incubada a 37 ºC por uma hora. Então, os produtos de
digestão com a endonuclease de restrição foram fracionados eletroforeticamente em
gel de agarose a 1,3 %, por 50 minutos, a 120 volts em tampão TBE 0,5x (0,04M
Tris-HCl-Borato e 1 mM EDTA). Os géis foram então corados com brometo de etídeo
e visualizados através de transiluminador UV acoplado a um sistema de captura
eletrônica de imagens (UVP LabWorks Laboratory Imaging and Analysis System Inc.,
CA, EUA).
9) Seqüenciamento e análise dos fragmentos de DNA genômico de L.
braziliensis clonados no plasmídeo pCRII.
Numa etapa inicial cinco clones de cada um dos seis fragmentos de DNA
avaliados ao RAPD com o oligonucleotideo iniciador A8 foram submetidos ao
seqüenciamento. Como os clones se mostraram muito idênticos entre si nós
sequenciamos apenas um clone para cada um dos seis fragmentos restantes. Cada
53
clone contendo o seu respectivo fragmento de DNA foi submetido a duas reações de
seqüenciamento, uma empregando o oligonucleotídeo iniciador M13 direto e outra o
oligonucleotideo iniciador M13 reverso. As reações foram realizadas em microtubos
de 0,2 mL em um volume total de 12µL, sendo 4µL de mistura do “kit” de
seqüenciamento BigDye v.3.0 (Applied Biosystems), 5µL de água ultrapura, 1µL (3,2
pmoles/mL) de solução do oligonucleotídeo iniciador, e 20 ng de DNA purificado.
Após a reação de seqüenciamento, purificaram-se os produtos da reação através de
precipitação com acetato de sódio 3M pH 4,6 e etanol 95% gelado, com lavagens
sucessivas (mínimo de duas vezes) com etanol 70% seguido de secagem ao ar, à
temperatura ambiente e ressuspensão do sedimento em 18µL de uma mistura
contendo formamida e EDTA. As seqüências foram obtidas através de eletroforese
capilar em seqüenciador automático Spectrumedix - Aurora SCE2410 no Laboratório
de sistemática molecular de plantas (LAMOL) da Universidade Estadual de Feira de
Santana (UEFS). Cada fragmento foi seqüenciado em quadruplicata e as seqüências
consenso geradas foram empregadas para todas as análises subseqüentes do
estudo.
Para a realização de alinhamento das seqüências de nucleotídeos e procura
de sítios de restrição dos fragmentos de DNA clonados foi utilizado o programa
Bioedit Alignment Editor (http://www.mbio.ncsu.edu/BioEdit/bioedit.html, acesso em
dez 2005). Para a comparação entre loci detectados e seqüências presentes nas
bases de dados internacionais do Instituto Sanger: genoma da L. braziliensis
(GeneDB L. braziliensis); genoma da L. major (GeneDB L. major), e do Centro
54
nacional de informação biotecnológica - NCBI (GenBank) usamos o programa de
busca BLAST (ferramenta básica para a busca de alinhamento local, do inglês Basic
Local Alignment Search Tool).
55
RESULTADOS
1. Caracterização dos fragmentos genômicos clonados e comparados entre os
isolados de L. braziliensis.
Os seis fragmentos de DNA genômico de L. braziliensis escolhidos para
clonagem, seqüenciamento e caracterização se encontram resumidos na TABELA 1.
TABELA 1. Caracterização dos fragmentos de DNA genômico dos isolados de
L. braziliensis amplificados pelo RAPD e selecionados para o estudo.
Fragmento
Isolados de
L.
braziliensis
Iniciador
ao RAPD
Extensão
(pb)
Característica
Seqüências
geradas
B1 Lb49
Lb36
ABI-04 900 Polimórfico B1D e B1R
B2 Lb49
Lb36
ABI-04 1400 Conservado B2R
B1 Lb48
Lb14
A8 650 Conservado B1D e B1R
B2 Lb48
Lb14
A8 1000 Conservado B2D e B2R
B3 Lb48
Lb14
A8 1500 Conservado B3D e B3R
B1 Lb22
Lb40
ABI-18 550 Polimórfico B1D e B1R
56
2. Caracterização das seqüências genômicas de L. braziliensis obtidas e com
potencial uso no desenvolvimento de protocolos de MLST e PCR-RFLP.
As seqüências consenso que foram utilizadas para todas as análises
subseqüentes estão listadas nos Anexos A, B e C. Um total de 22 seqüências foi
gerado a partir do seqüenciamento das extremidades dos 12 clones de DNA
genômico de L. braziliensis, ou seja, cada um dos seis fragmentos para cada par de
isolados comparados, e cada uma contendo cerca de 500 nucleotídeos em extensão.
Em relação às seqüências obtidas, observamos que a maior parte apresentou
um valor percentual do conteúdo CG em torno de 50%, o que sugere, portanto, que
tratam-se de regiões intergênicas. Com o propósito de identificar se as seqüências
de DNA clonadas correspondiam a regiões gênicas de Leishmania sp. os 22
segmentos genômicos de L. braziliensis seqüenciados foram comparados com os
conteúdos existentes em bancos internacionais de bases de dados de DNA (Sanger,
NCBI) através da ferramenta de busca de homologia BLAST. Cada análise realizada
se encontra descrita adiante, de acordo com o oligonucleotídeo iniciador utilizado.
57
3. Comparação entre seqüências de nucleotídeos contidas em fragmentos
genômicos de isolados de L. braziliensis pertencentes a diferentes clados de
Corte de Pedra.
Tendo um total de 22 seqüências, somente aquelas obtidas de fragmentos de
igual tamanho e altura ao RAPD foram submetidas ao alinhamento. Nós obtivemos
nove loci genômicos em L. braziliensis (três obtidos com o ABI-04 e seis obtidos com
o A8) que renderam pares de seqüências que puderam ser alinhadas entre os
isolados analisados, e outros dois, obtidos com o ABI-18, que não apresentaram
homologia, pelo menos no segmento seqüenciado. Os dados de alinhamento das
seqüências comparadas para os nove loci evidenciaram que elas de fato
representavam regiões homólogas dos genomas avaliados já que o grau de
identidade é elevado (ANEXOS D e E).
Além da comprovação da homologia nas seqüências genômicas contidas em
bandas de RAPD com mesmo tamanho e altura, a análise teve como finalidade
também a busca de polimorfismos genéticos de diversas naturezas. Observamos a
presença de regiões de repetições curtas em tandem (STRs), de indels e de
polimorfismos de nucleotídeos individuais (SNPs) nas seqüências caracterizadas,
bem como de polimorfismo dos sítios alvo para endonucleases de restrição.
Utilizando-se o programa Bioedit foram obtidos mapas de restrição para todos os
fragmentos estudados. A comparação entre os loci homólogos mostrou que os nove
loci apresentaram variação nas freqüências de sítios de restrição, sugerindo que
58
estes fragmentos genômicos detectados são passíveis de emprego em protocolos de
PCR-RFLP para a discriminação de L. braziliensis geograficamente próximas. No
ANEXO F estão sumarizadas todas as posições onde polimorfismos foram
encontrados entre os loci clonados, além das enzimas de restrição.
4. Caracterização parcial dos segmentos de DNA genômico dos isolados de L.
braziliensis Lb49 e Lb36 amplificados por RAPD, usando-se o oligonucleotídeo
iniciador ABI-04 e clonados em plasmídeo pCR II.
4.1- Determinação da percentagem de nucleotídeos CG das extremidades
5’ e 3’ dos insertos dos clones Lb49 e Lb36.
Apenas uma das extremidades do inserto referente à Banda 2 sentido direto
de ambos os isolados testados (Lb49 e Lb36), não pôde ser obtida demonstrando
dificuldade de sequenciamento e subseqüente recuperação das seqüências. O valor
do conteúdo CG dos fragmentos genômicos obtidos está descrito na TABELA 2.
Com este oligonucleotídeo iniciador apenas o fragmento B2R em ambos os isolados
atingiu um percentual do conteúdo GC acima de 50%.
59
TABELA 2. Percentagem de nucleotídeos dos fragmentos genômicos obtidos
pelo RAPD usando o oligonucleotídeo iniciador ABI-04
Freq.%
Fragmento
A
(n)
C
(n)
G
(n)
T
(n)
G+C
A+T
TOTAL
(pb)
Lb49 B1D 24,16
(144)
20,13
(120)
26,01
(155)
29,70
(177)
46,14 53,86
596
Lb49 B1R 25,82
(157)
27,14
(165)
21,38
(130)
25,66
(156)
48,52 51,48
608
Lb49 B2R 26,58
(130)
24,74
(121)
30,27
(148)
18,40
(90)
55,01 44,99
489
Lb36 B1D 23,22
(134)
20,62
(119)
25,65
(148)
30,50
(176)
46,27 53,73
577
Lb36 B1R 25,94
(152)
27,30
(160)
21,33
(125)
25,43
(149)
48,63 51,37
586
Lb36 B2R 25,14
(131)
23,80
(124)
28,41
(148)
22,65
(118)
52,21 47,79
521
60
4.2- Determinação do grau de similaridade entre as seqüências de DNA
das extremidades correspondentes de insertos dos clones Lb49 e Lb36 e
seqüências presentes nos bancos de dados do Instituto Sanger.
Quando os fragmentos de seqüência foram comparados com o banco de
dados “Shotguns reads” empregado na montagem em andamento do genoma da L.
braziliensis (GeneDB), usando o BLAST N, observamos que as seis seqüências
analisadas mostraram elevada similaridade no genoma de L. braziliensis e com um
valor de E igual ou menor que 0,05.
A análise do banco de dados de genes da L. major usando a ferramenta
BLAST N revelou que para os seis fragmentos de seqüência obtidos apenas quatro
apresentaram detecções de similaridade significantes nessa espécie, sendo que o
conteúdo da banda inferior deste perfil eletroforético (Banda 1, FIGURA 2A) para o
isolado Lb49 mostrou elevada homologia com um gene presumível presente no
Cromossomo 24 daquela espécie do parasito.
61
4.3- Determinação de deleção, inserção e polimorfismo individual de
nucleotídeo (SNP) nas seqüências de DNA das extremidades correspondentes
de insertos dos clones Lb49 e Lb36.
Em relação às seqüências das extremidades dos fragmentos B1 e B2 dos dois
isolados, onde obtivemos três pares de seqüências homólogas (ANEXO D)
observamos a presença de 95 eventos de polimorfismos, dentre eles 75 indels e 20
SNPs.
A análise comparativa dos três loci resultantes do RAPD com o ABI-04
resultou na observação do fragmento com aproximadamente 900 pares de bases
(B1) numa das extremidades mostrando a presença de 15 indels e oito SNPs e na
outra 24 indels e três SNPs. Para a análise do fragmento B2 só obtivemos uma das
extremidades apresentando 36 indels e nove SNPs.
Em relação à presença de repetições de um único nucleotídeo nos fragmentos
derivados do RAPD, observamos o predomínio de repetições contendo o resíduo de
adenina (A6-B1D; A5 e A4-B1R) e timina (T6-B1D; T4-B1R) na banda 1 e de timina
(T9) e citosina (C5) na banda 2. A análise das sequencias de regiões repetitivas
curtas, do tipo microsatélites revelou o predomínio de repetições formadas por di e
trinucleotídeos (TABELA 3), mais freqüentes no fragmento inferior, a banda 1. No
fragmento B2R foi observada a presença de uma STR (TG3/TG4) com variação
alélica entre os dois isolados comparados.
62
TABELA 3. Elementos repetitivos encontrados em fragmentos genômicos
obtidos pelo RAPD usando o oligonucleotídeo iniciador ABI-04
Fragmento
IS Lb49
Posição(ões) / Seqüência
IS Lb36
Posição(ões) / Seqüência
B1D
87-92 (GA)3
117-124 (GT)4
197-200 (CA)2
369-372 (GA)2
375-378 (GC)2
87-92 (GA)3
117-124 (GT)4
197-200 (CA)2
369-372 (GA)2
375-378 (GC)2
B1R
18-23 (CAT)2
73-76 (GA)2
100-103, 176-179 (GT)2
147-150 (TC)2
205-208 (TA)2
505-510 (CT)3
18-23 (CAT)2
73-76 (GA)2
100-103, 176-179 (GT)2
147-150 (TC)2
205-208 (TA)2
505-510 (CT)3
B2R
39-42, 49-52, 76-79 (GA)2
190-195 (CA)3
266-269 (CA)2
309-316 (TG)3*
436-439 (GC)2
39-42, 49-52, 76-79 (GA)2
190-195 (CA)3
266-269 (CA)2
309-316 (TG)4*
436-439 (GC)2
*
variação alélica
63
4.4- Descrição de polimorfismos de sítios susceptíveis a digestão por
endonucleases de restrição das seqüências de DNA das extremidades
correspondentes de insertos dos clones Lb49 e Lb36.
Nossa análise com as seqüências das extremidades do fragmento 1 (B1D e
B1R) e com as seqüências da extremidade obtida do fragmento 2 (B2R) que contêm
em média 590 pares de base indicaram aproximadamente 100 enzimas com a
capacidade em diferenciar esses dois isolados de L. braziliensis, sendo que para a
definição de um protocolo de PCR-RFLP podemos destacar dentre as enzimas
descritas as mais comumente utilizadas e que atendam a finalidade de discriminação
entre as cepas como a HinfI, a TaqI, a SatI, entre outras.
5. Caracterização parcial dos segmentos de DNA genômico dos isolados de L.
braziliensis Lb48 e Lb14 amplificados por RAPD, usando-se o oligonucleotídeo
iniciador A8 e clonados em plasmídeo pCR II.
5.1- Determinação da percentagem de nucleotídeos CG das extremidades
5’ e 3’ dos insertos dos clones Lb48 e Lb14.
A percentagem do conteúdo CG para os fragmentos genômicos obtidos com o
A8 está descrito na TABELA 4. Com este oligonucleotídeo iniciador todos os
64
fragmentos em ambos os isolados tiveram um percentual do conteúdo GC acima de
50%.
5.2- Determinação do grau de similaridade entre as seqüências de DNA
das extremidades correspondentes de insertos dos clones Lb48 e Lb14 e
seqüências presentes nos bancos de dados do Instituto Sanger.
Quando os 12 fragmentos de seqüência foram comparados com o banco de
dados “Shotguns reads” usados na montagem em andamento do genoma da L.
braziliensis (GeneDB), utilizando o BLAST N, apenas o fragmento B2R do isolado
Lb48 não apresentou similaridade no genoma de L. braziliensis, enquanto que as 11
seqüências restantes apresentaram várias detecções com forte similaridade e com
um valor de E igual ou menor que 0,05, o que reforça a evidência de que os
fragmentos obtidos correspondem a loci genômicos da L. braziliensis.
Quando os 12 fragmentos de seqüência obtidos com o A8 foram comparados
ao banco de dados do genoma da L. major observamos que apenas o fragmento
B2R nos dois isolados apresentou detecções com elevada homologia com a
ocorrência de um gene presumível presente no Cromossomo 28 desta espécie do
gênero; os fragmentos B1 e B3 de ambos os isolados apresentaram detecções de
baixa similaridade e com um valor de E maior que 0,05 e os fragmentos B1R, B2D e
B3R dos dois isolados não representaram detecções em L. major.
65
TABELA 4. Percentagem de nucleotídeos dos fragmentos genômicos obtidos
pelo RAPD usando o oligonucleotídeo iniciador A8
Freq. %
Fragmento
A
(n)
C
(n)
G
(n)
T
(n)
G+C
A+T
TOTAL
(pb)
Lb48 B1D 22,05
(125)
27,51
(156)
27,87
(158)
22,57
(128)
55,38 44,62
567
Lb48 B1R 25,95
(157)
26,12
(158)
29,26
(177)
18,68
(113)
55,37 44,63
605
Lb48 B2D 23,85
(135)
26,15
(148)
26,50
(150)
23,50
(133)
52,65 47,35
566
Lb48 B2R 22,01
(136)
26,70
(165)
33,01
(204)
18,28
(113)
59,71 40,29
618
Lb48 B3D 25,84
(162)
28,87
(181)
29,19
(183)
16,11
(101)
58,05 41,95
627
Lb48 B3R 13,30
(54)
28,08
(114)
25,12
(102)
33,50
(136)
53,20 46,80
406
Lb14 B1D 22,02
(124)
27,18
(153)
28,24
(159)
22,56
(127)
55,42 44,58
563
Lb14 B1R 23,87
(143)
27,05
(162)
27,05
(162)
22,04
(132)
54,09 45,91
599
Lb14 B2D 23,89
(135)
25,84
(146)
26,55
(150)
23,72
(134)
52,39 47,61
565
Lb14 B2R 20,59
(125)
27,02
(164)
30,15
(183)
22,24
(135)
57,17 42,83
607
Lb14 B3D 26,05
(168)
29,15
(188)
28,53
(184)
16,28
(105)
57,67 42,33
645
Lb14 B3R 13,43
(54)
28,11
(113)
25,62
(103)
32,84
(132)
53,73 46,27
402
66
5.3- Determinação de deleção, inserção e polimorfismo individual de
nucleotídeo (SNP) nas seqüências de DNA das extremidades correspondentes
de insertos dos clones Lb48 e Lb14.
A comparação feita entre as sequencias obtidas com o A8 nos dois isolados,
que gerou seis pares de seqüências homólogas (ANEXO E), revelou a presença de
229 eventos de polimorfismos, onde encontramos 152 indels e 77 SNPs.
A análise comparativa dos 500 pares de base presentes em uma das
extremidades seqüenciadas (sentido direto) dos três produtos de amplificação
resultantes da amplificação ao RAPD revelou um maior polimorfismo para o
fragmento com tamanho inicial de aproximadamente 1500 bases (banda 3 FIGURA
2B), onde a seqüência B3D apresentou 24 indels e três SNPs em uma de suas
extremidades. No fragmento de aproximadamente 650 pares de bases (banda 1
FIGURA 2B) a seqüência B1D também apresentou marcado polimorfismo, contudo
foram 10 indels e quatro SNPs. Por outro lado, na banda intermediária deste perfil
eletroforético (banda 2 FIGURA 2B) a seqüência B2D foi a menos polimórfica,
detectando-se apenas quatro indels e quatro SNPs. Em relação aos segmentos
homólogos obtidos na extremidade oposta (sentido reverso) obtivemos 180 eventos
de polimorfismo, sendo 114 indels e 66 SNPs. Em contraste com o relatado acima, o
segmento B3R se mostrou o menos polimórfico, apresentando 10 indels e apenas
um SNP, seguido do segmento B1R, que apresentou 69 polimorfismos, com 48
indels e 21 SNPs e do segmento intermediário B2R, que foi o mais polimórfico,
detectando-se 100 eventos, com 56 indels e 44 SNPs.
67
Em relação à presença de repetições de um único nucleotídeo para os
fragmentos obtidos com o oligonucleotídeo iniciador A8, observamos apenas três
eventos no fragmento inferior (banda 1), e todos apresentando variação alélica entre
os isolados comparados: 3G/2G; 4A/5A; 5A/ 7A (isolado Lb48 / isolado Lb14). A
análise de regiões repetitivas curtas, do tipo microsatélites revelou o predomínio de
repetições formadas por di e trinucleotídeos (TABELA 5), mais freqüentes no
fragmento superior, ou seja, a banda 3. No fragmento intermediário (banda 2) foi
observada a presença de uma STR mais extensa (TG8/TG9) e com variação alélica
entre os dois isolados comparados.
5.4- Descrição de polimorfismos de sítios susceptíveis a digestão por
endonucleases de restrição das sequencias de DNA das extremidades
correspondentes de insertos dos clones Lb48 e Lb14.
Para a análise das seqüências das extremidades do fragmento 1 (B1): o
fragmento B1R foi o que mais variou já que apresentou um número maior de
enzimas com a capacidade de diferenciação entre os dois isolados analisados. O
fragmento B1 apresentou cerca de 80 enzimas com capacidade discriminativa dentre
as quais podemos citar a Hin4I e a TaqI (ANEXO F). Com relação à análise das
seqüências das extremidades do fragmento 3 este demonstrou uma menor
quantidade de enzimas porém com a ocorrência de sítios polimórficos passiveis de
uso apresentando potencial discriminatório entre os isolados, quando comparado
com os outros fragmentos.
68
TABELA 5. Elementos repetitivos encontrados para os fragmentos
genômicos obtidos pelo RAPD usando o oligonucleotídeo iniciador A8
Fragmento IS Lb48
Posição(ões) / Seqüência
IS Lb14
Posição(ões) / Seqüência
B1D
27-34 (CT)4
63-68, 294-299 (GAA)2
227-230 (CA)2
362-367 (GCC)2
385-390 (CCT)2
437-442 (GC)3
462-467 (GGT)2
27-34 (CT)4
63-68, 294-299 (GAA)2
227-230 (CA)2
362-367 (GCC)2
385-390 (CCT)2
437-442 (GC)3
462-467(GGT)2
B1R
51-54 (GA)2
91-96 (CAA)2
231-236 (GC)3
256-259, 387-390, 399-402 (GC)2
268-273 (CCT)2
309-314 (GGC)2
406-411 (CAG)2
448-451 (TG)2
568-571 (CA)2
51-54 (GA)2
91-96 (CAA)2
231-236 (GC)3
256-259, 387-390, 399-402 (GC)2
268-273 (CCT)2
309-314 (GGC)2
406-411 (CAG)2
448-451 (TG)2
568-571 (CA)2
B2D
23-26 (TA)2
79-84 (CA)3
264-269 (GC)3
368-383 (TG)8*
509-520 (CGCA)3
23-26 (TA)2
79-84 (CA)3
264-269 (GC)3
368-385 (TG)9*
509-520 (CGCA)3
B2R
115-120 (GAA)2
57-60 (CG)2
125-130* (GA)3
208-211 (GT)2
218-221 (CA)2
241-250 (CT)5
283-286, 311-314 (GC)2
297-302 (CG)3
405-410 (GCT)2
603-617* (CAG)5
12-17*, 115-120 (GAA)2
57-60 (CG)2
208-211 (GT)2
218-221 (CA)2
241-250 (CT)5
283-286, 311-314 (GC)2
297-302 (CG)3
405-410 (GCT)2
599-621* (CA)9
B3D
21-26 (GGT)2
143-148 (CA)3
343-348, 359-364 (CG)3
349-358 (CA)5
428-433 (GT)3
527-532 (CT)3
543-550 (CA)4
555-560 (CA)3*
564-569 (GC)3*
21-26 (GGT)2
143-148 (CA)3
343-348, 359-364 (CG)3
349-358 (CA)5
428-433 (GT)3
527-532 (CT)3
543-550 (CA)4
555-562 (CA)4*
566-569 (GC)2*
B3R
176-182 (TG)3
242-257 (GT)8
304-312 (CTT)3
176-182 (TG)3
242-259 (GT)9
304-312 (CTT)3
*
variação alélica
69
6. Caracterização parcial dos segmentos de DNA genômico dos isolados de L.
braziliensis Lb22 e Lb40 amplificados por RAPD, usando-se o oligonucleotídeo
iniciador ABI-18 e clonados em plasmídeo pCR II.
6.1- Determinação da percentagem de nucleotídeos CG das extremidades
5’ e 3’ dos insertos dos clones Lb22 e Lb40.
A percentagem do conteúdo CG para os fragmentos genômicos obtidos com o
oligonucleotídeo iniciador ABI-18 está descrita na TABELA 6. Com o ABI-18 todos os
fragmentos em ambos os isolados tiveram um percentual do conteúdo CG em torno
de 50%.
TABELA 6. Percentagem de nucleotídeos dos fragmentos genômicos obtidos
pelo RAPD usando o oligonucleotídeo iniciador ABI-18
Freq.%
Fragmento
A
(n)
C
(n)
G
(n)
T
(n)
G+C
A+T
TOTAL
(pb)
Lb22 B1D
29,07
(159)
23,22
(127)
29,98
(164)
17,73
(97)
53,20 46,80
547
Lb22 B1R
17,55
(123)
28,53
(200)
25,25
(177)
28,53
(200)
53,78 46,08
701
Lb40 B1D
22,22
(158)
27,85
(198)
26,86
(191)
23,07
(164)
54,71 45,29
711
Lb40 B1R
20,89
(155)
28,17
(209)
23,99
(178)
26,95
(200)
52,16 47,84
742
70
6.2- Determinação do grau de similaridade entre as seqüências de DNA
das extremidades correspondentes de insertos dos clones Lb22 e Lb40 e
seqüências presentes nos bancos de dados do Instituto Sanger.
Em relação aos quatro fragmentos de seqüência obtidos com o ABI-18,
quando os fragmentos de seqüência foram comparados com o banco de dados
“Shotguns reads” usado na montagem em andamento do genoma da L. braziliensis
(GeneDB), usando o BLAST N, observamos que apenas um deles, o isolado Lb40
B1R representou detecção de baixa similaridade no genoma de L. braziliensis,
enquanto que os três restantes apresentaram várias detecções com forte
similaridade e com um valor de E igual ou menor que 0,05.
Em relação aos quatro fragmentos de seqüência obtidos com o ABI-18,
apenas um dos fragmentos do isolado Lb40 (Lb40 B1R), não apresentou homologia
ao ser comparado ao genoma da L. major, enquanto que o outro fragmento deste
mesmo isolado, o Lb40 B1D, apresentou baixa similaridade com um valor de E maior
que 0,05 quando comparado a esta espécie. Os outros dois fragmentos pertencentes
ao isolado Lb22 (Lb22 B1D e Lb22 B1R) apresentaram detecções de similaridade
significantes com uma proteína hipotética conservada em Leishmania presente no
Cromossomo 35 da L. major.
71
6.3- Determinação de deleção, inserção e polimorfismo individual de
nucleotídeo (SNP) nas seqüências de DNA das extremidades correspondentes
de insertos dos clones Lb22 e Lb40.
As seqüências obtidas com o oligonucleotídeo iniciador ABI-18 para os dois
isolados demonstraram diferenças quando alinhadas, ou seja, as mesmas não
mostraram equivalência e com isso não foram realizadas as análises de busca de
polimorfismos.
6.4- Descrição de polimorfismos de sítios susceptíveis a digestão por
endonucleases de restrição das sequencias de DNA das extremidades
correspondentes de insertos dos clones Lb40 e Lb22.
O mapeamento dos sítios alvo para endonucleases de restrição não foi
realizado para os fragmentos obtidos com o RAPD para este oligonucleotídeo
iniciador, pois a análise só teria importância caso houvesse homologia entre as
seqüências dos isolados.
72
DISCUSSÃO
A Leishmaniose tegumentar americana em nosso estado é causada
principalmente pela L. braziliensis, uma das espécies que exibe grande variabilidade
genética e que está envolvida em diferentes manifestações clínicas de doença. O
estudo foi baseado na identificação e caracterização de regiões do genoma que
futuramente possam ser úteis e aplicáveis em métodos moleculares que representem
um maior poder de discriminação entre os indivíduos, como o PCR-RFLP e o MLST,
quando os comparamos com os métodos usuais freqüentemente utilizados. Estes
métodos sendo baseados em seqüência de nucleotídeos se mostram bastante
reproduzíveis e apresentam um elevado poder discriminatório, características
importantes para que sejam utilizados por exemplo, no estudo de subpopulações
geograficamente muito próximas de cepas de parasitos de uma mesma espécie.
Os 12 fragmentos de DNA genômico de L. braziliensis escolhidos para a
caracterização iniciada pela etapa de clonagem variaram de tamanho e em média
renderam, após a etapa de seqüenciamento, 22 seqüências genômicas de
aproximadamente 500 pares de base, pois, não obtivemos uma das extremidades do
fragmento da banda 2 gerado pelo RAPD com o oligonucleotídeo iniciador ABI-04 de
ambos os isolados testados (Lb49 e Lb36), levando-nos a supor que nestes
fragmentos existam estruturas ou mesmo uma constituição em bases nucleotídicas
mais complexas que levou a uma dificuldade de aquisição de seqüência útil quando
submetido ao seqüenciamento. Ao se obter seqüências apresentando este tamanho
visamos a detecção de seqüências úteis na elaboração de protocolos para os
73
métodos de MLST e de PCR-RFLP. Isto porque o método de MLST baseia-se na
comparação dos conteúdos de nucleotídeos em segmentos genômicos de 400 a 500
pares de bases, e o PCR-RFLP se beneficia do emprego de produtos de
amplificação de alvos genômicos que possam ser bem fracionados pelos métodos de
eletroforese em gel de agarose convencionais.
Em relação à busca da presença de genes nas 22 seqüências obtidas
observamos que a grande parte delas apresentou um valor percentual do conteúdo
CG em torno de 50%. Este achado sugere que estas seqüências estão contidas em
regiões intergênicas, fato esse muito importante para a adequada resolução de
genótipos de parasitos pertencentes a populações geograficamente limitadas. O uso
de tais áreas do genoma que apresentam a característica de evolução rápida se faz
importante, sendo um recurso útil de genotipagem nessa situação. A análise dos
conteúdos presentes nas bases internacionais de dados do genoma da L. major
(GeneDB L. major), através do programa de busca BLAST, revelou que a maioria
dos fragmentos obtidos com os três protocolos de RAPD apresentou detecções de
baixa similaridade com o genoma deste parasito, o que seria esperado já que existe
uma distância genética entre estas duas espécies do gênero. Quando os fragmentos
de seqüência foram comparados com o banco de dados do genoma da L.
braziliensis, constatamos que as 22 seqüências analisadas demonstraram elevada
similaridade no genoma deste parasito. Isto reforça a evidência de que os
fragmentos obtidos de fato correspondem a regiões genômicas da L. braziliensis.
74
Num total de 22 seqüências obtivemos ao alinhamento 09 loci genômicos em
L. braziliensis (três obtidos com o oligonucleotideo iniciador ABI-04 e seis obtidos
com o A8) que renderam nove pares de seqüências homólogas entre os isolados
comparados. Os fragmentos obtidos com o oligonucleotideo iniciador ABI-18
demonstraram dificuldades ao manejo experimental, ou seja, de remoção da matriz
do gel de agarose, de clonagem e conseqüentemente de continuidade das etapas de
caracterização de segmentos genômicos deste trabalho. Além destas dificuldades de
manipulação estes fragmentos demonstraram dificuldades ao alinhamento, onde as
seqüências obtidas para os dois isolados não mostraram homologia, o que em parte
pode ser explicada pela condição de baixa estringência da metodologia do RAPD.
A princípio, seria uma nova abordagem para a obtenção de marcadores
moleculares já que começamos a partir de um método de ampla discriminação pela
sua possibilidade de gerar diversos perfis eletroforéticos dentro de uma mesma
espécie, esperamos refinar as diferenças entre pedaços do genoma e assim
conseguir realmente denominá-las como marcadores de espécie. A quantidade de
loci genômicos obtida ainda não é a suficiente mas representa o ponto inicial para a
identificação e definição de regiões genômicas que venham a representar um
marcador da espécie e ainda se possível alcançar uma diferenciação ao nível
intraespecífico em L. braziliensis. O encontro de polimorfismos genéticos de diversas
naturezas, como indels, SNPs e microsatélites foram importantes para o começo de
um delineamento do método de MLST. A distribuição dos eventos de polimorfismos
variou não só entre os isolados, mas também entre os fragmentos empregados no
75
estudo. Em relação aos dois isolados genotipados com o oligonucleotideo iniciador
ABI-04 observamos a presença de 95 eventos de polimorfismos, dentre eles 75
indels e 20 SNPs. Quanto à presença de regiões repetitivas curtas encontramos no
fragmento B2R um microsatélite (TG3/TG4) com variação alélica importante entre os
dois isolados comparados. Já a comparação feita dos três fragmentos de DNA entre
dois isolados de diferentes clados genotipados com o oligonucleotideo iniciador A8
revelou a presença de 229 eventos de polimorfismos numa das extremidades, onde
encontramos 152 indels e 77 SNPs entre as L. braziliensis testadas, com as bandas
superior (B3D) e inferior (B1D) promovendo mais variações do que a banda
intermediária (B2D) e esta apresenta o achado interessante de um microsatélite mais
extenso e com variação alélica entre os dois isolados (oito repetições TG no isolado
Lb48 e nove no isolado Lb14) sendo também por acaso o fragmento menos
polimórfico em comparação com os demais. Em relação aos segmentos homólogos
obtidos na extremidade oposta obtivemos 180 eventos de polimorfismo, sendo 114
indels e 66 SNPs. Ao contrário com o achado anterior o fragmento correspondente à
banda 3 se mostrou o menos polimórfico. Em relação à presença de repetições de
um único nucleotídeo encontramos um total de três na banda 1, sendo 3G/2G;
4A/5A; 5A/7A (isolado Lb48 / isolado Lb14) com variação alélica entre os isolados
comparados. Está bem documentada a ocorrência de diversos elementos repetitivos
ao longo do genoma dos protozoários e da maioria dos eucariotas, que podem estar
localizados tanto em regiões codificantes como em regiões intergênicas. Não
sabemos ao certo a sua localização no genoma, mas este microsatélite ocorreu num
fragmento considerado conservado pelo fato de ser um fragmento presente em todos
76
os isolados genotipados ao RAPD. O fato de os isolados também estarem em clados
diferentes, isolado Lb48 – clado C e isolado Lb14 – clado B, bem como estarem
associados a formas clínicas distintas, isolado Lb48 – clado que predomina a LM e
isolado Lb14 – clado que predomina a LC sugere que esta variação alélica seja um
recurso provável na diferenciação de cepas do parasito associado à forma clinica de
doença, o que reforça a idéia de que este elemento poderia servir de base para a
elaboração de alvos moleculares de diagnóstico. Além disso, outros microsatélites
foram também detectados nesta avaliação promovendo sítios de polimorfismo
adicionais. BULLE e colaboradores descreveram um sistema de tipagem molecular
baseada na análise comparativa de regiões microsatélites para uma outra espécie do
gênero, a L. infantum, demonstrando a potencialidade deste tipo de polimorfismo na
determinação da diversidade genética destes parasitos (BULLE e col., 2002).
Uma vez que estas análises serão estendidas para os diferentes clados de
parasitos de Corte de Pedra, tais achados abrem perspectivas para a construção de
um adequado e representativo perfil alélico de L. braziliensis que faça parte de um
banco de dados de MLST. Ainda é o começo e futuramente deveremos agregar mais
isolados da população de parasitos da área endêmica bem como de isolados de
outras localidades para ampliar as comparações e conseqüentemente firmar a
definição do perfil alélico do parasito associado ao desfecho de doença em nossa
região. A exemplo, ROBLES e colaboradores avaliaram a confiabilidade do método
MLST para a discriminação entre cepas de Candida albicans analisando diferentes
77
regiões genômicas do microorganismo, comparando a técnica de genotipagem com
outras já bem estabelecidas (ROBLES e col, 2004).
Os resultados obtidos iniciam uma descoberta importante de regiões úteis
passiveis de serem reconhecidamente denominadas de marcadores genotípicos
espécie específicos para nossa realidade populacional do parasito, não podendo
portanto ainda inferir uma comparação entre as subpopulações / clados, já que não
fizemos a comparação baseada entre isolados de clados distintos. Assim sendo,
todos os segmentos clonados a partir dos genomas de L. braziliensis envolvidos em
infecções naturais mostraram riqueza em polimorfismos, o que os torna excelentes
alvos a serem explorados num protocolo de MLST para a tipagem em alta resolução
desses parasitos.
O MLST é um método relativamente recente que tem sido usado como
abordagem em epidemiologia molecular de espécies bacterianas. Atualmente este
método vem sendo aplicado na caracterização de patógenos eucariotas como a
Candida albicans, e isso demonstra que também seja possível ampliar o seu
emprego para protozoários, como em Leishmania. Uma etapa importante no
desenvolvimento de um protocolo MLST é a identificação de loci passíveis de
emprego no genoma do organismo a ser tipado. Para identificar esses loci
empregamos neste estudo protocolos de RAPD usados com sucesso como método
de tipagem molecular da população de L. braziliensis de Corte de Pedra
(SCHRIEFER e col., 2004), uma área endêmica de LTA com diferentes formas
78
clínicas de infecção com essa espécie de parasito. Os métodos baseados em PCR
utilizados na detecção de regiões conservadas do genoma de Leishmania se
mostram mais sensíveis do que qualquer método convencional para o diagnóstico
(VOLPINI e col., 2004), demonstrando a possibilidade de usá-lo como uma
alternativa em áreas endêmicas. A necessidade de se diferenciar e caracterizar as
populações desse parasito com o objetivo de se melhorar o diagnóstico e determinar
o prognóstico das infecções tem estimulado o desenvolvimento de métodos de
caracterização fenotípicos e genotípicos com elevada capacidade de discriminação
(BANUS e col, 1999; SINGH, 1997)
Uma outra consideração é o fato de que ao se estudar uma população de
parasitos provenientes de uma mesma localidade geográfica e bem delimitada
poderia influenciar na definição de tais marcadores genotípicos. Ainda é necessário
analisar dados comparativos de cepas provenientes de outras localidades, existindo
a necessidade, portanto de confirmação da freqüência destas seqüências entre as
diferentes cepas inclusive de organismos geograficamente próximos além do que
permitiria ampliar o número representativo de lócus necessário para o
estabelecimento do perfil alélico do parasito. Isto é particularmente importante devido
ao fato de que clones das cepas diversificam com o tempo, como uma conseqüência
de eventos mutacionais ou de recombinação (VAZQUEZ e col., 2004).
Para o mapeamento dos sítios alvo para endonucleases de restrição, que
possam vir a ser explorado em protocolo de PCR-RFLP, a comparação entre os 09
79
loci homólogos mostrou que todos apresentaram variação nas freqüências de sítios
de restrição e portanto todos os fragmentos genômicos detectados são passíveis de
emprego em protocolos de PCR-RFLP para a discriminação de L. braziliensis dentro
de uma mesma área geográfica e possivelmente em outras áreas endêmicas. Os
achados abrem perspectivas promissoras para o desenvolvimento desta metodologia
aplicável a regiões gênicas variáveis, já que outros estudos mostram sua utilidade
em outras regiões não codificantes como as situadas entre genes do RNA
ribossomal, regiões do DNA minicírculo entre outras (CUPOLILLO e col., 2003).
Ainda é necessário aplicar esta metodologia em outros isolados da área endêmica ou
mesmo diretamente em amostras clínicas para o seu aprimoramento enquanto
ferramenta diagnóstica.
Em resumo, tais ferramentas possibilitarão uma abordagem molecular
baseada em seqüência de nucleotídeos para os protozoários, em especifico a
Leishmania braziliensis, que está envolvida numa manifestação clínica tão
abrangente e heterogênea e uma melhoria no entendimento da noção de
“clonalidade” de cepas em infecções humanas como a leishmaniose tegumentar,
refletiria numa melhoria na conduta clínica de casos humanos considerando a
ausência de agentes terapêuticos adequados para as diferentes manifestações
clinicas e a falta de vacinas que existe atualmente.
80
PERSPECTIVAS
Análises subseqüentes em decorrência deste trabalho estão sendo extendidas
visando aumentar as nossas possibilidades de detecção de diferenças genéticas de
relevância clínica. Para tal finalidade, nós ampliamos o número de isolados testados
sendo eles distribuídos nos três clados de L. braziliensis mais representativos nos
quais predominam uma forma clínica em particular, visando à busca de um
refinamento maior da metodologia. Para avaliar a capacidade do método PCR-RFLP,
uma vez delineado, em identificar outras cepas de L. braziliensis dentro de uma
mesma área geográfica estaremos selecionando as enzimas de restrição para o
início da padronização da técnica. Além disso, foi projetado um par de iniciadores de
PCR específicos para os fragmentos de DNA obtidos a partir do RAPD com os
oligonucleotídeos iniciadores ABI-04 (banda 1R) e A8 (bandas 1, 2 e 3), os quais
inicialmente estão sendo utilizados para identificar os membros da população de
isolados da região endêmica que os contenham.
81
CONCLUSÕES:
1. As bandas do RAPD exploradas na caracterização da estrutura populacional
de L. braziliensis em Corte de Pedra utilizando os oligonuclotídeos iniciadores
ABI-04 e A8 representam mesmo seqüências genômicas homólogas.
2. Os polimorfismos genéticos entre isolados, previamente inferidos através da
presença / ausência de bandas ao RAPD, existem ao nível de seqüência de
nucleotídeos.
3. Os principais polimorfismos encontrados foram do tipo inserção/deleção,
SNPs, variações de único nucleotídeo e variações em seqüências repetitivas
(microsatélites).
4. Os achados descritos sugerem a viabilidade para a identificação de alvos
genéticos de cepas do parasito aplicáveis na avaliação de infecções humanas
clonal / mista em L. braziliensis.
5. Os alvos genéticos identificados propiciarão o início do desenvolvimento de
ferramentas diagnósticas com valor prognóstico em doença humana, como a
tipagem molecular pelo MSLT bem como também de um protocolo de PCR-
RFLP.
82
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89
ANEXO A: Seqüências obtidas com o oligonucleotídeo iniciador ABI-04
Isolado Lb49
Isolado Lb36
Lb49 B1D
GGACTGGAGT GATCGAAGTT ACTCGTTCTT CTATCTTTTT
TATTTGTTTA CTATTTCTCT TTTGATTTTC CTGGAAGCTT
TCAGATGAGA GAAAAAAAGA TGGTCTACTA TGGCACGTGT
TTGTCAAACG CAAGTGACTT TTGGGCTATG GATGTTGTGC
ATGACACGCG TCTACAACCA CTTTGTGTAG AAGTTGCACA
TTGCTATCGT CACGGATGAC CTCGCAAGTG CACTGTCATT
CCGTACCGGA AACAAATCTT CTCAACTTCT GTGCGTCCTT
ACAGGAAGCT GTCATGTACG TTATTTCTCT TCTTTGGCTG
CTTCTGTGCT TTTGCTCGAA TGCTTAGTAG CGGTGCGAAT
GGAATCGAGA CAGCGCATCT AATAATGCTT CGTCGAGGCG
TTTGCCGGAG TATCCCACTC TTGGGACCCA CGTTTACCGA
GCTCGTGGAG CGTCTGGACT CGTTTGAAAA GGAGTTTATT
GAATGGAAGG CGTTTCGCAA AGCGGTGGAG TCAACGTCGC
CGAAAGTAAC TGAGGCGGCG AAACAGATTA TGGCGGAGCA
GTATGAACGG GAGGGTAAAA AACGACTAAA GGTGAACTTG
GATAAACCCG TTTGACGCCT TGAAGGAAGT TCACGGGAAG
TTTGAACCAG TTCTATGCCA AGGC
Lb36 B1D
GGACTGGAGT GATCGAAGTT ACTCGTCTTC TATCTTTTTT
ATTTGTTACT ATTTCTCTTT TGATTTTCCT GAAGCTTTCA
GATGAGAGAA AAAAAGATGG CTACTATGGC ACGTGTTTGT
CAAACGCAAG TGACTTTTGG GCTATGGATG TTGTGCATGA
CACGCGTCTA CAACCACTTT GTGTAGAAGT TGCACATTGC
TATCGTCACG GATGACCTCG CAAGTGCACT GTCATTCCGT
ACCGGAAACA AATCTTCTCA ACTTCTGTGC GTCCTTACAG
GAAGCTGCAT GTACGTTATT TCTCTTCTTA GGCTGCTTCT
GTGCTTTTGC TCGAATGCTT ATGTATGCGG TGCGAATGAA
ATCGAGACAG CGCATCTAAT AATGCTTCGC GAGGCGTTTG
CCGGAGTACC CCACTCTTGG GACCCACGTT TACCGAGCTC
GTGGAGCGTC TGGACTCGTT TTGAAAAGGA GTTTATTGAA
TGGAAGGCGT TTCGCAAAGC GGGTGGAGTC AACGTCGCCG
AAAGAACTGA GCGGCGAAAC GATTATGGCG GAGACGATTG
AAGGATGGTT TTATTCG
Lb49 B1R
AACTGGAGTG CTGCGGACAT CATGAAAACT CCACTGGTAC
CACTTCTTCA GCTTTTGAAT TCCCGGCATT GTGAGAGGCC
ATACGGTGCA TGGCTCAATG TGTCGCACCC GACGGGCAAT
GCGCACAAGG TACTGTCGAA AAACAGTCTC CGCATGCTGC
ATCAGATCAT TCGGAGTGTT GATGTACAGT AAGTTCTCGA
AAACTATATC CTTCATCTTC TGCTTGGCAT AGAACTGGTT
CAACTCCGTG AACTCCTCAG GCGTCAACGG GTTATCCAAG
TTCAACTTAG TCGTTTATTA CCTCCTTCAT ACTCTCCGCC
ATAATCTGTT TCTGCCCGCC TCAGTTACTT TCTGGCGACG
TTGACTCCAC CTGCTTTGCG AAACGCCTTC CATTCAATAA
ACTCCTTTTC AAACGAGTCC AGACGCTCCA CTGAGCTCGG
TAAACTGTGG GTCCCAAGAG TGGGATACTC CGGCAAACGC
CTCGACGAAG CATTATTAGA TGCGCTGTCT CGATTCCATT
CGACCGTACT AAGCATTCGA GGCAAAACGC ACAAGAACAG
CAGCCAAAGG AAAGAGAAAT AACTGTACAT GACAGTTTCC
CTGGTAAG
Lb36 B1R
AACTGGAGTG CTGGAACATC ATGAAAACTC CACTGGTACC
ACTTCTTCAG CTTTTGAATT CCCGGCATTG TGAGAGGCCA
TACGGTGCAT GGCTCAAGTG TCGCACCCGA CGGGCAATGC
GCACAAGGTA CTGTCGAAAA ACAGTCTCCG CATGCTGCAT
CAGATCATTC GGAGTGTTGA TGTACAGTAA GTTCTCGAAA
ACTATATCCT TCATCTTCTG CTTGGCATAG AACTGGTTCA
ACTCCGTGAA CTCCTCAGGC GTCAACGGGT TATCCAAGTT
CACCTTAGTC GTTTTTACCT CCTTCATACT CTCCGCATAA
TCTGTTTCGC CGCCTCAGTT ACTTTCGGCG ACGTTGACTC
CACCGCTTTG CGAAACGCCT TCCATTCAAT AAACTCCTTT
TCAAACGAGT CCAGACGCTC CACGAGCTCG GTAAACGTGG
GTCCCAAGAG TGGGATACTC CGGCAAACGC CTCGACGAAG
CATTATTAGA TGCGCTGTCT CGATTTCATT CGCACCGCTA
CTAAGCATTC GAGCAAAAGC ACAGAAGCAG CAAAGAAGAG
AAATAACGTA CATGACAGTT CCTGTA
Lb49 B2R
GTGCTGGAAT TCGGCTTGGA CTGGAGTTAG GAAGGAAGGA
GACCTAAAGA GATCACGTGG GAGGTGGAAA ACACGAGAGG
GAGGGCCTAG GAAGCCGAGC AGTTCGCTCT ACTGAAGCGA
ATTCTTTCCG CTTTTTTTTT CGTCTTCGGC ACGAAAAGGG
GACCGCGAGC GTTGGAAAGA CACACAATGC GCCGCTATCA
AGAAGGCAGA AAGAGGGAAG CAAAACTGGT TTAAGTCCCA
ACCGCAGCAT CACATGACGC GCTCGAGGCC CCCTTCCTCA
TGACGGTGGG CGTGTCTGCG CTAGAGGGCC AACGGAGAAT
GAGAAGGCTC ACCACGGAGC CGAATGTGAT GCCCCCGAGA
ATTGCAAAGC ATATGTATGG CCCAGCAATT TCGCGTTCCT
TAGTTGCAAG CGCGGGTCGC CGCTTCCGAC GCTATCGCCA
GGCCAAGTAA ATAGCCGTTC GTGCTGCCAA GAGCAAGAAG
ACCACAATG
Lb36 B2R
GTGCTGGCAT CTGGCTTTAA CTGGAGTTAG GTAGGAAGGA
GACCTAAAGA GATCATGTGG GAGGTGGTAA AACAGAGAGG
GGAGGGCCTA GGAAGCCGAG CAGTTCGCTC TACTGAAGCG
AATTCTTTCC TGCTTTTTTT TTCTGTCTTC GGCACGAAAA
TGGGGACCTG CTGAGCTGTT TGGAAAGACA CACAATTGCT
GCCTGCTATC AAGAAGGCAG AAAGAGGGAA TGCAAAACTG
GTTTAATGTC CCAACCTGCA GCATCACATG ACTGCTGCTC
GAGGCCCCCT TCCTCATGAC GGTGGGCTGT GTCTGCGCTA
GAGGGCCAAC TGTGAGAATG AGAAGGCTCA CCACTGGAGC
CGAATGTGAT GCCCCCGAGA ATTGCAAAGC ATATGCATGG
CCCATGACAA TTTCGCGTCT CCTTAGTTGT CAAGCGCGGG
TCGCCGCTTC CTGTACGCTA TCTGCCAGGC CAAGTACAAT
AGCCGTTCGT GCTGCCAACG TAGCAAGAAG GACACACAAT
G
90
ANEXO B: Seqüências obtidas com o oligonucleotídeo iniciador A8
Isolado Lb48
Lb48 B1D
GTGACGTAGG GGTAGAGAAA CGCCGGCTCT CTCTGCGTCG
ATGTGCTCAC CTGCTTCCGG CTGAAGAAGG ACGTTGAACA
GAGGTGGGCG CCTCCCAGCT TGTAAGACCC ATGCTCTGTG
GTGTCGCTGC AGCGAGCGGC TCGTCAGTAC GCCTGCCGAA
ACGCCGGGTA CACTAGCGAC TTCAGCTACC ATATTCCCAG
CTGTTGGTGC TTTATAGTGC TCGTGCACAT GCGAATCACG
AGGGTAATCC GCTTGTTTTC CGGCCTGCTG TCAGCGCTCT
AGCCTGCGCT GCGAAGAACA TAATGCAGTA CTGAATCCCC
TCAAGGTCGT GATGCGTTTG CGAATTCATC AAAAAGTATT
GCCGCCTCTC GAGAGGAAAT GCCCTCCTGG CAAACGTCAG
GAGGCTTACG AGGCGCATCC TTCCATGTAT CCAGGCGCGC
TTCGAAGATG ACATGAATAG GTGGTACTCC ATGTAGGCAT
TGGCACCCGC CAACCTCATT GACCGAGATG CGCTGACAAA
TGCGATGAAG TGACGAACAC ATAGAGCGGC GTCCTTTGAC
ACGTTCG
Lb48 B1R
GACGTAGGCA CAGGAGCATC CTGGCGGGGG ATACGCAGAT
GTGAAATAAG AGACGAAAAG CCTTTCGGTG ACAGGCGGGA
CTCCCCCAAC AACATACACT GCAAGGACGG CCGCCTTCTT
GGTCGGCGAC CTTCATCGCA GTTGGGCAGC GGCATCAACG
GAACAATGAA GTGGCGGGTG CCAAGTGCCA CATGGGAGAC
CACCTATTCA TGTCATCTTC AAAGCGCGCC TGGATACGTG
AAGATAGCGC CTCGTAAGCC TCCTGACGTT TGCCAGGGAA
GGACATTTCC TCTACGAGAG GCGGCAATAC TTTATGATAG
AATTCGCAAA CGCATCACGA CCTTGGGGGA TTCAGTACTG
CATAATGTCT TACGCAGCGC AGGCTAGAGC GCTGACAGCA
GGCCGGAAAA CAAGGGGGAT CACCCTCGTG ATTCGCATGT
GCATCGAGCA CTATAAGAAG CACCAAAACA GCTGGAATAT
GGAGCTTGAA GTCGCTAGTG ACCCGGCGTT TTCGGGCTGG
CGTAACTGAC GAGCCGGCTC GCTGCAGCGA CACCACAGAG
GATGGCTTAC AAGCTGGAGG GCCCACCTAC AGTTTCAATC
GTCGG
Lb48 B2D
GTGACGTAGG TTCGCTAAGC GCTATAGACA CCTGGATCTT
GAGTGACGTT GACTGTGGTA AGCGGTGATT CCACACGCCA
CACAATCACG CGATTCAAGC TCGTCATACA AACCGGATCC
ACGGATGACT TCGCGCTTGT GGAGACACGG CACCGCGGTT
GTGGCGCTTA GAGATCGCTC GGTCTTTTCA TCTCTACCGT
TCGTTTCTGT TCGTTTGTTT TGTCGCTGCT CACTCTGCTC
GCTTGCTTTC CGACAACAGT TGAGCGCGCA TACGGCAAAG
AGCAAACTTC CGCTTGTTGA CGACGAGAGT TACGAGAAAA
AAAAAGAAAA AGAACAACAC AACGTCTTGT GCATGTACAG
GAGCGCATGT GTGTGTGTGT GTGAAGATAC TCTCCTAACC
TTCGATGCTG ACACAGGCAC CCGTGTCCTT TCCTGGTTGG
GGTCCTTGCA TCCTCGCTAG ACATCAGTGG AAGCCAAACA
GGTCGCTCAG CACCCCCATG TCCTCGCACG CACGCAAAAG
ACGAGCTGGG GGAGGGTAAC TGGGAAAAGG GAATACAGCA
CGCTCG
Lb48 B2R
ACGTAGGAGC GAAGGAAGCG GGGCCGGAGA CTGCTCGCAC
CGTACAAGGC CCGCGCGGGC CTTAGTCGGG CTCGAGATCC
CGCGGAACCT TGACGGGAAG GGAACAATGA AGAATCTAGA
GAGAAGGGCT AGAACCTAGC CCTGAGGACT TTATCTGGGC
ATGGAAGGCG GAGCGTGCGA GGAACAAGAG GCTCGTGTTA
TGGGCACAGG GAGACCTACG GTCTTTCTCT CTCTCTGCGA
AGGTCCGTGC TAGCTAGTGA AGAGGGGCGC TGCTAGGGTA
CGCGCGTGCT CGTGGCGCTT TCATGGAGTT CACCCACAAG
AGGAGCTGAT CTAGGACACT GACACCTTCC TTCACAGGCT
GCAGGTACCG GAGCATCACG GGGATCTCGC TGCTGATTTC
CACTTTTCCC AGTTACCCTC CCCCAAGCTC GGCTTTTTGG
GCGTGCGAGG ACCAATGGGG GGCTGAGCGA CCCTGTTTGG
CTTCCAGCCG AAGTCAGCGA GGATCGCAAG GACCCCAGGC
CAGGAAAGGA CCGGGTGCCT AGTGATACAG GCATCGAAGG
TAGGAGGAGA TTCTTCATCC AGCAGCAGCA GCAGCAAAGC
GGGCCTCCCT CGTATCGG
Lb48 B3D
GTGACGTAGG GGGTGGGGGC GGTGGTACGC ACATGAGCCC
GGATGGAGAT GAGCGGAGCG GCCCATGGTC AACGAGCCTC
GATGTACATC AGCATTCGCC AGAAGGGAAA GGAATCGGAC
ACGGTGTAAA AGAGAAAGCG CGCACACAGT TGGGCTGCAT
GCCCGACACG CCGCTTCGCC GTCGCCCGCC CTCTGACTCT
CCACAATTAG GGGACAAACC AACGCCATTT CAGAGTCCCC
TCAAGCTCTT CAAGCTACCT GGAGAAGCGA GCGAGCGCAT
CAACGAACGC GTGGAGTACA ACGCTACGCC AAACACACCA
CCTTCCCGTA ATCGGTTCCC GACGCGCGCA CACACACACG
CGCGCACGGT CGCGCCTCTG GAGCACCTGG CGTAGTGACG
GGCGAGCTTG GTGAGTTCAC TGCGTGGGTG TGTTTGGTGT
TGTATTTTTT GAAGAAGGGA CGAAGAAGAC AGGGCAGTCT
CTGAGCTAAA AGCCATCGAG TACAAAAAGT GCGTGATACG
CCGCTCTCTT TCTCACAAGC ACACACAGAC ACACAAGCGC
GCACACGCAC AGCGTCTGGC ATGCACACAG GAACGTGGGC
AGACACGCCT CAAGCAGAAA CATACAG
Lb48 B3R
ACGTAGGCTT GGTGATCTTT CTGTATCTCT GTGTAGGTGT
GCGTCAGTGT ATGCTGCACG CGTGCTCTTC TCCAACCTCC
ACTGCTCATG GGGGCGCGAC GACGAAGTAT AGTTTGGTTA
GATTATGTTA GATCCCCGCC TTTCCTGTAG CTTTGCTTCG
CCCCTTTTAC TCAGTTGTGT GATCTGTGCG CTCTATCGAA
CGCCAACGAG ACATCCCCTC CCCATCTAAC AGCTGCAGCA
GTGTGTGTGT GTGTGTAGGT TGTCGTGGAT CTATCTTGTA
CACGTGGTCG TACGTGTGGG CTTCTTCTTT TCCCTGCAGC
TCCCCGCAGC TGCCCCCTTC CTCGTTCCGT ACTTGGTGCG
CCTGTCACGG GTCCTTTTCA CTGTCGCGGT TGATTCGTTC
TATTCTCTCC CTCTTTCAGT TTTTATGGCT TTTGGCTGTG
TAACTGCTGT GCTTGCTGTG GAGTGCATGG ACTGCGCCAC
CGGGGACATG CCACTTGCAC AGGCGCGTCC CTCGCGACTG
ACAACCATAC GCAGACTACC CAAGCAGCGC ATCATTTTCC
TTTCTTCAGC CACATGTAGA TGGTGCACGT TGTATATAT
91
ANEXO B: Seqüências obtidas com o oligonucleotídeo iniciador A8
Isolado Lb14
Lb14 B1D
GTGACGTAGG GGTAGAGAAA CGCCGGCTCT CTCTGCGTCG
ATGTGCTCAC CTGCTTCCGG CTGAAGAAGG ACGTTGAACA
GAGGTGGGCG CCTCCCAGCT TGTAAGACCC ATGCTCTGTG
GTGTCGCTGC AGCGAGCGGC TCGTCAGTTA CGCCTGCCGA
AACGCCGGGT ACACTAGCGA CTTCAGCTAC CATATTCCCA
GCTGTTGGTG CTTTATAGTG CTCGTGCACA TGCGAATCAC
GAGGGTAATC CGCTTGTTTT CCGGCCTGCT GTCAGCGCTC
TAGCCTGCGC TGCGAAGAAC ATAATGCAGT ACTGAATCCC
CCAAGGTCGT GATGCGTTTG CGAATTCATC AAAAAGTATT
GCCGCCTCTC GTAGAGGAAA GGTCCTCCTG GCAAACGTCA
GGAGGCTTAC GAGGCGCATC CTTCCATGTA TCCAGGCGCG
CTTCGAAGAT GACATGAATA GGTGGTACTC CATGTGGCAT
TGGCACCCGC CACCTCATTG ACCGAGATGC GCTGACAAAT
GCGATGAAGT GACGAACACA AGAAGCGGCG TCCTTGACAG
TGT
Lb14 B1R
GACGTAGGCA CAGAGCATCC TGGCGTGTGG ATACGCAGAT
GTGAAATAAG AGACGAAAAG GCCTTTCGTG TAACAGCGGG
TACTCCCCCA ACAACATACA CTGTCAAGGA CGCCGCTTCT
TGTGTCGTCA CTTCATCGCA TTGTCAGCGC ATCTCGGTCA
ATGAGGTGGC GGGTGCCAAT GCCACATGGA GTACCACCTA
TTCATGTCAT CTTCGAAGCG CGCCTGGATA CATGGAAGGA
TGCGCCTCGT AAGCCTCCTG ACGTTTGCCA GGAGGACCTT
TCCTCTACGA GAGGCGGCAA TACTTTTTGA TGAATTCGCA
AACGCATCAC GACCTTGGGG GATTCAGTAC TGCATTATGT
TCTTCGCAGC GCAGGCTAGA GCGCTGACAG CAGGCCGGAA
AACAAGCGGA TTACCCTCGT GATTCGCATG TGCACGAGCA
CTATAAAGCA CCAACAGCTG GGAATATGGT AGCTGAAGTC
GCTAGTGTAC CCGGCTGTTT CGGCAGGCTG TAACTGACGA
GCCGCTCGCT GCAGCGACAC CACAGAGCAT GGGTCTTACA
AGCTGGGAGG CGCCCACCTC TGTTCAACGT CCTTCTTCA
Lb14 B2D
GTGACGTAGG TTCGCTAAGC GCTATAGACA CCTGGATCTT
GAGTGACGTT GACTGTGGTA AGCGGTGATT CCACACGCCA
CACAATCACG CGATTCAAGC TCGTCATACA AACCAGATCC
ACGGATGACT TCGCGCTTGT GGAGACACGG CACCGCGGTT
GTGGCGCTTA GAGATCGCTC GGTCTTTTCA TCTCTACCGT
TCGTTTCTGT TCGTTTGCTT TGTCGCTGCT CACTCTGCTC
GCTTGCTTTC CGACAACAGT TGAGCGCGCA TACGGCAAAG
AGCAAACTTC CGCTTGTTGA CGACGAGAGT TACGAGAAAA
AAAAAGAAAA AGAACAACAC AACGTCTTGT GCATGTACAG
GAGCGCATGT GTGTGTGTGT GTGTGAAGAT ACTCTCCTAA
CCTTCGATGC TGACACAGGC ACCCGTGTCC TTTCCTGGTT
GGGGTCCTTG CATCCTCGCT AGACATCAGT GGTAGCCAAA
CAGGGTCGCT CAGCACCCCC ATGGTCCTCG CACGCACGCA
AAAGACGAGC TGGGGGAGGG TAACTGGGAA AAGGGAATAC
AGCAT
Lb14 B2R
ACGTAGGAGC TGAAGAAGGC GGCGCTGGAA CTGCTTGCAC
CGTACAAGTG CCCGTCGCGG TACATTATCG TGCCAGAGAT
CCCGCGGAAC CAGACGGGTA AGGTGAACAA GAAGAATCTG
AAGAAGGCGC TGAACCTGCC CTGAGGTACT TTATCTGTGG
CATGTGAAGG TCGTGAGCTG CGAGGAACAA GATGGCTCGT
GTTATGGGCA CAGGGGAGAC CTTCGGTCTT TCTCTCTCTC
TGCGAAGGTC CGTGCTGCTG TGAAGTTGGC GGCGCTGCTG
TGGTACGCGC GTGCTCGTGG CGCTTTCATG GAGTTCACCC
AAAGGAGGAG CTGACTGGAC ACTGACACCT TCCTCACAGC
TGCAGCTCCG TTCCTTCACG GGTTCTCGCT GCTGTATTCC
ACTTTTCCCA GTTACCCTCC CCCAGGCTCG GTCTTTTGCG
TGCGTGCGAG GACCATGGGG GTGCTGAGCG ACCCTGTTTG
GCTACCACTG ATGTCTAGCG AGGATGCAAG GACCCCAACC
AGGAAAGGAC ACGGGTGCCT GTGTCAGCAT CGAAGGTTAG
GGAGAGTACT CTTCACACAC ACACACACAC ATGCGCTCCT
GTACATG
Lb14 B3D
GTGACGTAGG GGGTGGGGGC GGTGGTACGC ACATGAGCCC
GGATGGAGAT GAGCGGAGCG GCCCATGGTC AACGAGCCTC
GATGTACATC AGCATTCGCC AGAAGGGAAA GGAATCGGAC
ACGGTGTAAA AGAGAAAGCG CGCACACAGT TGGGCTGCAT
GCCCGACACG CCGCTTCGCC GTCGCCCGCC CTCTGACTCT
CCACAATTAG GGGACAAACC AACGCCATTT CAGAGTCCCC
TCAAGCTCTT CAAGCTACCT GGAGAAGCGA GCGAGCGCAT
CAACGAACGC GTGGAGTACA ACGCTACGCC AAACACACCA
CCTTCCCGTA ATCGGTTCCC GACGCGCGCA CACACACACG
CGCGCACGGT CGCGCCTCTG GAGCACCTGG CGTAGTGACG
GGCGAGCTTG GTGAGTTCAC TGCGTGGGTG TGTTTGGTGT
TGTATTTTTT GAAGAAGGGA CGAAGAAGAC AGGCAGTTTC
TGAGCTAAAA AGCCATCGAG TACAAAAAAA GTGCGTGATA
CGCCGCTCTC TTTCTCACAA GCACACACAC CGACACACAC
AAGTGCGCCG CACACACGCA AACAGCGTCT GGCATTGCAC
ACACCAGGAA CGTGGGGCAG ACCACGGCCT CAAGCACAGA
AACTT
Lb14 B3R
GACGTAGGCT TGGTGATCTT CTGTATCTCT GTGTAGGTGT
GCGTCAGTGT ATGCTGCACG CGTGCTCTTC TCCAACCTCC
ACTGCTCATG GGGGCGCGAC GACAAGTATA GTTGGTAGAT
TATGTAGATC CCCGCCTTTC CTGTAGCTTT GCTTCGCCCC
TTTTACTCAG TTGTGTGATC GTGCGCTCTA TCGAACGCCA
ACGAGACATC CCCTCCCCAT CTAACAGCTG CAGCAGTGTG
TGTGTGTGTG TGTAGGTTGT CGTGGATCTA TCTTGTACAC
GTGGTCGTAC GTGTGGGCTT CTTCTTTTCC CTGCAGCTCC
CCGCAGCGCC CCCTTCCTCG TTCTGTACTT GGTGCGCCTG
TCACGGGTCC TTTTCACTGT CGCGGTTGAT TCGTTCTATT
CT
92
ANEXO C: Seqüências obtidas com o oligonucleotídeo iniciador ABI-18
Isolado Lb40
Isolado Lb22
Lb40 B1D
TATCTGCAGA ATTCCAGCAC ACTGGCGGCG TTACTAGTGG
ATCCGAGCTC GGTACCAAGC TTGGCGTAAT CATGGTCATA
GCTGTTTCCT GTGTGAAATT GTTATCCGCT CACAATTCCA
CACAACATAC GAGCCGGAAG CATAAAGTGT AAAGCCTGGG
GTGCCTAATG AGTGAGCTAA CTCACATTAA TTGCGTTGCG
CTCACTGCCC GCTTTCCAGT CGGGAAACCT GTCGTGCCAG
CTGCATTAAT GAATCGGCCA ACGCGCGGGG AGAGGCGGTT
TGCGTATTTG GGCGCTCTTC CGCTTCCTCG CTCACTGACT
CGCTGCGCTC GGTCGTTCGG CTGCGGCGAG CGGTATCAGC
TCACTCAAAG GCGGTAATAC GGTTATCCAC AGAATCAGGG
GATAACGCAG GAAAGAACAT GTGAGCAAAA GGCCAGCAAA
AGGCCAGGAA CCGTAAAAAG GCCGCGTTGC TGGCGTTTTT
CCATAGGCTC CGGCCCCCTG ACGAGCATCA CAAAAATCGA
CGCTCAAGTC AGAGGTGGCG AAACCCGACA GGACTATAAA
GATACCAGGC GTTTCCCCCT GGAAGCTCCC TCGTGCGCTC
TCCTGTTCCT GACCCTGCCG CTTACCGGAT ACCTGTCCGC
TTTCTCCCTT CGGGAAGCGT GGCGCTTTCT CATAGTTCAC
GCTTGTAGGG TATCTCAGTC GGTGTAGGTC G
Lb22 B1D
TATCTGCAGA ATTCGGCTTC CACAGCAGTC CGGAGTTGTG
GAAGTAGCAA TAGTCGAGAA AGAAGTAGTG AAATCCTTGC
AGGCGGTATA CGATGTACTT GTACGACATG AAGATAAGCA
GGCCGACAAC GTAGCCCAGA CAATGATGTC TACCATGTGG
CATGAGAAAC CCCCTTCCAC GGCGAGGGAG GCGAAGAGGG
AACGATGAAT GTCAGCCGCA TCACTGCAGA CTTGCTTCAC
GTCCGGCCCC TCAGCGGCGC CGAGGACGCT GGCCGGTCAT
ACACGTACGG GCACGTCGAT ATGTCGAAGT AGGCCGCTGC
AATCAGCCCA CATAGAGGAG GGTTATCGAG CAACTGACGA
AGTACTGGGA CTTTGAAAAC TTGTGACCCA TGATACAGGC
ATTGCCGTCG GTCAGTCTGA AAAGAGGCAC AACCCACCGA
GGAAGGGGAA AAGAGCGGGG AAAAAGGGGC TGGAGCGAAA
AGGACGAAAC AAACGATAAA AGAAGGGTCA ATGCATTGCA
GTCCGTTGCG CTGGTGTCAC GTCTATT
Lb40 B1R
GGCCGCCAGT GTGCTGGAAC TTCTGCAGGT ATCCATCACA
CTGGCGGCCG CTCGAGCATG CATCTAGAGG GCCCAATTCG
CCCTATAGTG AGTCGTATTA CAATTCACTG GCCTGTCTGT
TTTACAACTG TCGTGACTGG GAAAACCCTG GCTGTTACCC
AACTTAATCT GCCTTGCAGC ACATCCCCCT TTCGCCAGCT
GGCGTAATAG CGAAGAGGCC CGCACCGATC GCCCTTCCCA
ACAGTTGCGC AGCCTGAATG GCGAATGGAC GCGCCCTGTA
GCGGCGCATT AAGCGCGGCG GGTGTGGTGG TTACGCGCAG
CGTGACCGCT ACACTTGCCA GCGCCCTAGC GCCCGCTCCT
TTCGCTTTCT TCCCTTCCTT TCTCGCCACT GTTCGCCGGC
TTTCCCCGTC AAGCTCTAAA TCGGGGGCTC CCTTTAGGGT
TCCGATTTAG TGCTTTACGG CACCTCGACC CCAAAAAACT
TGATTAGGGT GATGGTTCAC GTAGTGGGCC ATCGCCCTGA
TAGACGGTTT TTCGCCCTTT GACGTTAGGA GTCCACGTTC
TTTAATAGTG GACTCTTGTT CCAAACTGGA ACAACACTCA
ACCCTATCTC GGTCTATTCT TTTGATTTCA TAAGGGATTT
TTGCCGATTT CGGCCTATTG GTTTAAAAAA TGAGGCTGAT
TTAACAAAAA TTTAACGCGG AATTTTAAAC CAAAATTCAA
GGGCGCACAG GGCTTGGTTA AA
Lb22 B1R
TAACGGCGCA GTGTGCTGGC CATTCGGCGT AACAGCAGTA
TGTCATTATA GACGTGACAC AGCGCAACGG ACTGCATGCA
TTGACCTTCT TTATCGTTTG TTCGTCCTTC TCGCTCCAGC
CCCTTTTTCC GCCGCTCTTT TCCCCTTCCT CGGTGGGTGT
GTGCCTCTTT TCAGACTGAC CGACGGCAAT GCCTGTATCA
TGGGTCACAA GTTTTCAAAG TCCCAGTACT TCGTCAGTTG
CTCGATAACC CTCCTCTATG TGGGGCTGAT TGCAGCGGCC
TACTTCGACA TATCGACGTG CCCGTACGTG TATGACCGGC
CAGCGTCCTC GGCGCCGCTG AGGGGGCCGG ACGTGAAGCA
AGTCTGCAGT GATGCGGTGA CATTCATCGT TCCCTCTTCG
CCTCCCTCGC CGTGGAAGGG GGTTTCTCAT GCCACATGGT
AGACATCATT GTCTGGGCCT ACGTTGTCGG CCTGCTTTAT
CTTCATGTCG TACAAAGTAC ATCGTATACC GGCCTTGCAA
GGATTTCACC TTACTTTCTT TTCTCGAACT ATTTGCTATT
TCCCAAAACT TCCCGGGGAG CTGGCTTGTT GGGAAAGCCG
GAATTTTCTT GGCCAGAATT TTTCCCNTTT CAAACAACTT
GGGCGGCGCC GGGTCCGGAA GGCATTGGCA ATTCTTTAGG
AGGGGGCCCC AATTCCGGCC C
93
ANEXO D: Seqüências homólogas alinhadas referentes ao oligonucleotídeo
iniciador ABI-04
IS Lb49 B1D x IS Lb36 B1D
10 20 30 40 50 60
Lb49 B1D GGACTGGAGT GATCGAAGTT ACTCGTTCTT CTATCTTTTT TATTTGTTTA CTATTTCTCT
Lb36 B1D GGACTGGAGT GATCGAAGTT ACTCGT-CTT CTATCTTTTT TATTTGTT-A CTATTTCTCT
70 80 90 100 110 120
Lb49 B1D TTTGATTTTC CTGGAAGCTT TCAGATGAGA GAAAAAAAGA TGGTCTACTA TGGCACGTGT
Lb36 B1D TTTGATTTTC CTG-AAGCTT TCAGATGAGA GAAAAAAAGA TGG-CTACTA TGGCACGTGT
130 140 150 .160 170 180
Lb49 B1D TTGTCAAACG CAAGTGACTT TTGGGCTATG GATGTTGTGC ATGACACGCG TCTACAACCA
Lb36 B1D TTGTCAAACG CAAGTGACTT TTGGGCTATG GATGTTGTGC ATGACACGCG TCTACAACCA
190 200 210 220 230 240
Lb49 B1D CTTTGTGTAG AAGTTGCACA TTGCTATCGT CACGGATGAC CTCGCAAGTG CACTGTCATT
Lb36 B1D CTTTGTGTAG AAGTTGCACA TTGCTATCGT CACGGATGAC CTCGCAAGTG CACTGTCATT
250 260 270 280 290 300
Lb49 B1D CCGTACCGGA AACAAATCTT CTCAACTTCT GTGCGTCCTT ACAGGAAGCT GTCATGTACG
Lb36 B1D CCGTACCGGA AACAAATCTT CTCAACTTCT GTGCGTCCTT ACAGGAAGCT G-CATGTACG
310 320 330 340 350 360
Lb49 B1D TTATTTCTCT TCTTTGGCTG CTTCTGTGCT TTTGCTCGAA TGCTTA-GTA -GCGGTGCGA
Lb36 B1D TTATTTCTCT TCTTAGGCTG CTTCTGTGCT TTTGCTCGAA TGCTTATGTA TGCGGTGCGA
370 380 390 400 410 420
Lb49 B1D ATGGAATCGA GACAGCGCAT CTAATAATGC TTCGTCGAGG CGTTTGCCGG AGTATCCCAC
Lb36 B1D ATGAAATCGA GACAGCGCAT CTAATAATGC TTCG-CGAGG CGTTTGCCGG AGTACCCCAC
430 440 450 460 470 480
Lb49 B1D TCTTGGGACC CACGTTTACC GAGCTCGTGG AGCGTCTGGA CTCGTTT-GA AAAGGAGTTT
Lb36 B1D TCTTGGGACC CACGTTTACC GAGCTCGTGG AGCGTCTGGA CTCGTTTTGA AAAGGAGTTT
490 500 510 520 530 540
Lb49 B1D ATTGAATGGA AGGCGTTTCG CAAAGCGG-T GGAGTCAACG TCGCCGAAAG TAACTGAGGC
Lb36 B1D ATTGAATGGA AGGCGTTTCG CAAAGCGGGT GGAGTCAACG TCGCCGAAAG -AACTGAG-C
550 560 570 580 590 600
Lb49 B1D GGCGAAACAG ATTATGGCGG AGCAGTATGA ACGGGAGGGT AAAAAACGAC TAAAGGTGAA
Lb36 B1D GGCGAAAC-G ATTATGGCGG AGACGATTGA A--GGATGGT TTTATTCG-- ----------
INDEL:15
INDEL isolado Lb49
INDEL Isolado Lb36
SNPs:08
94
IS Lb49 B1R x IS Lb36 B1R
10 20 30 40 50 60
Lb49 B1R AACTGGAGTG CTGCGGACAT CATGAAAACT CCACTGGTAC CACTTCTTCA GCTTTTGAAT
Lb36 B1R AACTGGAGTG CTG-GAACAT CATGAAAACT CCACTGGTAC CACTTCTTCA GCTTTTGAAT
70 80 90 100 110 120
Lb49 B1R TCCCGGCATT GTGAGAGGCC ATACGGTGCA TGGCTCAATG TGTCGCACCC GACGGGCAAT
Lb36 B1R TCCCGGCATT GTGAGAGGCC ATACGGTGCA TGGCTCAA-G TGTCGCACCC GACGGGCAAT
130 140 150 160 170 180
Lb49 B1R GCGCACAAGG TACTGTCGAA AAACAGTCTC CGCATGCTGC ATCAGATCAT TCGGAGTGTT
Lb36 B1R GCGCACAAGG TACTGTCGAA AAACAGTCTC CGCATGCTGC ATCAGATCAT TCGGAGTGTT
190 200 210 220 230 240
Lb49 B1R GATGTACAGT AAGTTCTCGA AAACTATATC CTTCATCTTC TGCTTGGCAT AGAACTGGTT
Lb36 B1R GATGTACAGT AAGTTCTCGA AAACTATATC CTTCATCTTC TGCTTGGCAT AGAACTGGTT
250 260 270 280 290 300
Lb49 B1R CAACTCCGTG AACTCCTCAG GCGTCAACGG GTTATCCAAG TTCAACTTAG TCGTTTATTA
Lb36 B1R CAACTCCGTG AACTCCTCAG GCGTCAACGG GTTATCCAAG TTCACCTTAG TCGTTT-TTA
310 320 330 340 350 360
Lb49 B1R CCTCCTTCAT ACTCTCCGCC ATAATCTGTT TCTGCCCGCC TCAGTTACTT TCTGGCGACG
Lb36 B1R CCTCCTTCAT ACTCTCCGC- ATAATCTGTT TC-GCC-GCC TCAGTTACTT TC-GGCGACG
370 380 390 400 410 420
Lb49 B1R TTGACTCCAC CTGCTTTGCG AAACGCCTTC CATTCAATAA ACTCCTTTTC AAACGAGTCC
Lb36 B1R TTGACTCCAC C-GCTTTGCG AAACGCCTTC CATTCAATAA ACTCCTTTTC AAACGAGTCC
430 440 450 460 470 480
Lb49 B1R AGACGCTCCA CTGAGCTCGG TAAACTGTGG GTCCCAAGAG TGGGATACTC CGGCAAACGC
Lb36 B1R AGACGCTCCA C-GAGCTCGG TAAAC-GTGG GTCCCAAGAG TGGGATACTC CGGCAAACGC
490 500 510 520 530 540
Lb49 B1R CTCGACGAAG CATTATTAGA TGCGCTGTCT CGATTCCATT CG-ACCG-TA CTAAGCATTC
Lb36 B1R CTCGACGAAG CATTATTAGA TGCGCTGTCT CGATTTCATT CGCACCGCTA CTAAGCATTC
550 560 570 580 590 600
Lb49 B1R GAGGCAAAAC GCACAAGAAC AGCAGCCAAA GGAAAGAGAA ATAACTGTAC ATGACAGTTT
Lb36 B1R GAG-CAAAA- GCACA-GAA- -GCAGC-AAA G--AAGAGAA ATAAC-GTAC ATGACAGTT-
610
Lb49 B1R CCCTGGTAAG
Lb36 B1R -CCTG-TA--
INDEL:24
INDEL isolado Lb49
INDEL Isolado Lb36
SNPs:03
95
IS Lb49 B2R x IS Lb36 B2R
10 20 30 40 50 60
Lb49 B2R GTGCTGGAAT TCGGCTTGGA CTGGAGTTAG GAAGGAAGGA GACCTAAAGA GATCACGTGG
Lb36 B2R GTGCTGGCAT CTGGCTTTAA CTGGAGTTAG GTAGGAAGGA GACCTAAAGA GATCATGTGG
70 80 90 100 110 120
Lb49 B2R GAGGTGG-AA AACACGAGAG GG-AGGGCCT AGGAAGCCGA GCAGTTCGCT CTACTGAAGC
Lb36 B2R GAGGTGGTAA AACA-GAGAG GGGAGGGCCT AGGAAGCCGA GCAGTTCGCT CTACTGAAGC
130 140 150 160 170 180
Lb49 B2R GAATTCTTTC C-GCTTTTTT TTTC-GTCTT CGGCACGAAA A-GGGGACC- GC-GAGC-GT
Lb36 B2R GAATTCTTTC CTGCTTTTTT TTTCTGTCTT CGGCACGAAA ATGGGGACCT GCTGAGCTGT
190 200 210 220 230 240
Lb49 B2R T-GGAAAGAC ACACAAT-GC -GCC-GCTAT CAAGAAGGCA GAAAGAGGGA A-GCAAAACT
Lb36 B2R TTGGAAAGAC ACACAATTGC TGCCTGCTAT CAAGAAGGCA GAAAGAGGGA ATGCAAAACT
250 260 270 280 290 300
Lb49 B2R GGTTTAA-GT CCCAACC-GC AGCATCACAT GAC-GC-GCT CGAGGCCCCC TTCCTCATGA
Lb36 B2R GGTTTAATGT CCCAACCTGC AGCATCACAT GACTGCTGCT CGAGGCCCCC TTCCTCATGA
310 320 330 340 350 360
Lb49 B2R CGGTGGGC-G TGTCTGCGCT AGAGGGCCAA CGG--AGAAT GAGAAGGCTC ACCAC-GGAG
Lb36 B2R CGGTGGGCTG TGTCTGCGCT AGAGGGCCAA CTGTGAGAAT GAGAAGGCTC ACCACTGGAG
370 380 390 400 410 420
Lb49 B2R CCGAATGTGA TGCCCCCGAG AATTGCAAAG CATATGTATG GCCCA-G-CA ATTTCGCGTT
Lb36 B2R CCGAATGTGA TGCCCCCGAG AATTGCAAAG CATATGCATG GCCCATGACA ATTTCGCGT-
430 440 450 460 470 480
Lb49 B2R C--CTTAGTT G-CAAGCGCG GGTCGCCGCT TCC-G-ACGC TATC-GCCAG GCCAAGTA-A
Lb36 B2R CTCCTTAGTT GTCAAGCGCG GGTCGCCGCT TCCTGTACGC TATCTGCCAG GCCAAGTACA
490 500 510 520 530
Lb49 B2R ATAGCCGTTC GTGCTGCCAA -G-AGCAAGA AG-AC-CACA ATGGGGTTGG
Lb36 B2R ATAGCCGTTC GTGCTGCCAA CGTAGCAAGA AGGACACACA ATG-------
INDEL:36
INDEL isolado Lb49
INDEL Isolado Lb36
SNPs:09
96
ANEXO E: Seqüências homólogas alinhadas referentes ao oligonucleotídeo
iniciador A8
IS Lb48 B1D x IS Lb14 B1D
10 20 30 40 50 60
Lb48 B1D GTGACGTAGG GGTAGAGAAA CGCCGGCTCT CTCTGCGTCG ATGTGCTCAC CTGCTTCCGG
Lb14 B1D GTGACGTAGG GGTAGAGAAA CGCCGGCTCT CTCTGCGTCG ATGTGCTCAC CTGCTTCCGG
70 80 90 100 110 120
Lb48 B1D CTGAAGAAGG ACGTTGAACA GAGGTGGGCG CCTCCCAGCT TGTAAGACCC ATGCTCTGTG
Lb14 B1D CTGAAGAAGG ACGTTGAACA GAGGTGGGCG CCTCCCAGCT TGTAAGACCC ATGCTCTGTG
130 140 150 160 170 180
Lb48 B1D GTGTCGCTGC AGCGAGCGGC TCGTCAGT-A CGCCTGCCGA AACGCCGGGT ACACTAGCGA
Lb14 B1D GTGTCGCTGC AGCGAGCGGC TCGTCAGTTA CGCCTGCCGA AACGCCGGGT ACACTAGCGA
190 200 210 220 230 240
Lb48 B1D CTTCAGCTAC CATATTCCCA GCTGTTGGTG CTTTATAGTG CTCGTGCACA TGCGAATCAC
Lb14 B1D CTTCAGCTAC CATATTCCCA GCTGTTGGTG CTTTATAGTG CTCGTGCACA TGCGAATCAC
250 260 270 280 290 300
Lb48 B1D GAGGGTAATC CGCTTGTTTT CCGGCCTGCT GTCAGCGCTC TAGCCTGCGC TGCGAAGAAC
Lb14 B1D GAGGGTAATC CGCTTGTTTT CCGGCCTGCT GTCAGCGCTC TAGCCTGCGC TGCGAAGAAC
310 320 330 340 350 360
Lb48 B1D ATAATGCAGT ACTGAATCCC CTCAAGGTCG TGATGCGTTT GCGAATTCAT CAAAAAGTAT
Lb14 B1D ATAATGCAGT ACTGAATCCC C-CAAGGTCG TGATGCGTTT GCGAATTCAT CAAAAAGTAT
370 380 390 400 410 420
Lb48 B1D TGCCGCCTCT CG-AGAGGAA ATGCCCTCCT GGCAAACGTC AGGAGGCTTA CGAGGCGCAT
Lb14 B1D TGCCGCCTCT CGTAGAGGAA AGGTCCTCCT GGCAAACGTC AGGAGGCTTA CGAGGCGCAT
430 440 450 460 470 480
Lb48 B1D CCTTCCATGT ATCCAGGCGC GCTTCGAAGA TGACATGAAT AGGTGGTACT CCATGTAGGC
Lb14 B1D CCTTCCATGT ATCCAGGCGC GCTTCGAAGA TGACATGAAT AGGTGGTACT CCATGT-GGC
490 500 510 520 530 540
Lb48 B1D ATTGGCACCC GCCAACCTCA TTGACCGAGA TGCGCTGACA AATGCGATGA AGTGACGAAC
Lb14 B1D ATTGGCACCC GCCA-CCTCA TTGACCGAGA TGCGCTGACA AATGCGATGA AGTGACGAAC
550 560 570
Lb48 B1D ACATAGA-GC GGCGTCCTTT GACACGTTCG
Lb14 B1D ACA-AGAAGC GGCGTCCTT- GACA-GTGT-
INDELs: 10
INDEL isolado Lb48
INDEL Isolado Lb14
SNPs:04
97
IS Lb48 B1R x IS Lb14 B1R
10 20 30 40 50 60
Lb48 B1R GACGTAGGCA CAGGAGCATC CTGGCGGG-G GATACGCAGA TGTGAAATAA GAGACGAAAA
Lb14 B1R GACGTAGGCA CAG-AGCATC CTGGCGTGTG GATACGCAGA TGTGAAATAA GAGACGAAAA
70 80 90 100 110 120
Lb48 B1R G-CCTTTCG- GTGACAGGCG GG-ACTCCCC CAACAACATA CACTG-CAAG GACGGCCGCC
Lb14 B1R GGCCTTTCGT GTAACAG-CG GGTACTCCCC CAACAACATA CACTGTCAAG GACG-CCGC-
130 140 150 160 170 180
Lb48 B1R TTCTTG-GTC GGCGACCTTC ATCGCAGTTG GGCAGCGGCA TCAACGGAAC AATGAAGTGG
Lb14 B1R TTCTTGTGTC GTC-AC-TTC ATCGCA-TTG T-CAGCG-CA TCT-CGGT-C AATGAGGTGG
190 200 210 220 230 240
Lb48 B1R CGGGTGCCAA GTGCCACATG GGAG-ACCAC CTATTCATGT CATCTTCAAA GCGCGCCTGG
Lb14 B1R CGGGTGCCAA -TGCCACATG G-AGTACCAC CTATTCATGT CATCTTCGAA GCGCGCCTGG
250 260 270 280 290 300
Lb48 B1R ATACGTG-AA G-ATAGCGCC TCGTAAGCCT CCTGACGTTT GCCAGGGAAG GACATTTCCT
Lb14 B1R ATACATGGAA GGAT-GCGCC TCGTAAGCCT CCTGACGTTT GCCAGG--AG GACCTTTCCT
310 320 330 340 350 360
Lb48 B1R CTACGAGAGG CGGCAATACT TTATGATAGA ATTCGCAAAC GCATCACGAC CTTGGGGGAT
Lb14 B1R CTACGAGAGG CGGCAATACT TTTTGAT-GA ATTCGCAAAC GCATCACGAC CTTGGGGGAT
370 380 390 400 410 420
Lb48 B1R TCAGTACTGC ATAATGT-CT TACGCAGCGC AGGCTAGAGC GCTGACAGCA GGCCGGAAAA
Lb14 B1R TCAGTACTGC ATTATGTTCT T-CGCAGCGC AGGCTAGAGC GCTGACAGCA GGCCGGAAAA
430 440 450 460 470 480
Lb48 B1R CAAGGGGGAT CACCCTCGTG ATTCGCATGT GCATCGAGCA CTATAAGAAG CACCAAAACA
Lb14 B1R CAAGCGG-AT TACCCTCGTG ATTCGCATGT GCA-CGAGCA CTATAA--AG CACCAA--CA
490 500 510 520 530 540
Lb48 B1R GCTGG-AATA TGG-AGCTTG AAGTCGCTAG TG-ACCCGGC GTTTTCGGGC TGGC-GTAAC
Lb14 B1R GCTGGGAATA TGGTAGCT-G AAGTCGCTAG TGTACCCGGC TGTTTCGG-C AGGCTGTAAC
550 560 570 580 590 600
Lb48 B1R TGACGAGCCG GCTCGCTGCA GCGACACCAC AGAGGATGG- -CTTACAAGC TGG-AGG-GC
Lb14 B1R TGACGAGCCG -CTCGCTGCA GCGACACCAC AGAGCATGGG TCTTACAAGC TGGGAGGCGC
610 620
Lb48 B1R CCACCTACAG TTTCAATCGT CGG------
Lb14 B1R CCACCT-CTG TT-CAA-CGT CCTTCTTCA
INDEL:48
INDEL isolado Lb48
INDEL Isolado Lb14
SNPs:21
98
IS Lb48 B2D x IS Lb14 B2D
10 20 30 40 50 60
Lb48 B2D GTGACGTAGG TTCGCTAAGC GCTATAGACA CCTGGATCTT GAGTGACGTT GACTGTGGTA
Lb14 B2D GTGACGTAGG TTCGCTAAGC GCTATAGACA CCTGGATCTT GAGTGACGTT GACTGTGGTA
70 80 90 100 110 120
Lb48 B2D AGCGGTGATT CCACACGCCA CACAATCACG CGATTCAAGC TCGTCATACA AACCGGATCC
Lb14 B2D AGCGGTGATT CCACACGCCA CACAATCACG CGATTCAAGC TCGTCATACA AACCAGATCC
130 140 150 160 170 180
Lb48 B2D ACGGATGACT TCGCGCTTGT GGAGACACGG CACCGCGGTT GTGGCGCTTA GAGATCGCTC
Lb14 B2D ACGGATGACT TCGCGCTTGT GGAGACACGG CACCGCGGTT GTGGCGCTTA GAGATCGCTC
190 200 210 220 230 240
Lb48 B2D GGTCTTTTCA TCTCTACCGT TCGTTTCTGT TCGTTTGTTT TGTCGCTGCT CACTCTGCTC
Lb14 B2D GGTCTTTTCA TCTCTACCGT TCGTTTCTGT TCGTTTGCTT TGTCGCTGCT CACTCTGCTC
250 260 270 280 290 300
Lb48 B2D GCTTGCTTTC CGACAACAGT TGAGCGCGCA TACGGCAAAG AGCAAACTTC CGCTTGTTGA
Lb14 B2D GCTTGCTTTC CGACAACAGT TGAGCGCGCA TACGGCAAAG AGCAAACTTC CGCTTGTTGA
310 320 330 340 350 360
Lb48 B2D CGACGAGAGT TACGAGAAAA AAAAAGAAAA AGAACAACAC AACGTCTTGT GCATGTACAG
Lb14 B2D CGACGAGAGT TACGAGAAAA AAAAAGAAAA AGAACAACAC AACGTCTTGT GCATGTACAG
370 380 390 400 410 420
Lb48 B2D GAGCGCATGT GTGTGTGTGT GTG--AAGAT ACTCTCCTAA CCTTCGATGC TGACACAGGC
Lb14 B2D GAGCGCATGT GTGTGTGTGT GTGTGAAGAT ACTCTCCTAA CCTTCGATGC TGACACAGGC
430 440 450 460 470 480
Lb48 B2D ACCCGTGTCC TTTCCTGGTT GGGGTCCTTG CATCCTCGCT AGACATCAGT GGAAGCCAAA
Lb14 B2D ACCCGTGTCC TTTCCTGGTT GGGGTCCTTG CATCCTCGCT AGACATCAGT GGTAGCCAAA
490 500 510 520 530 540
Lb48 B2D CAGG-TCGCT CAGCACCCCC ATG-TCCTCG CACGCACGCA AAAGACGAGC TGGGGGAGGG
Lb14 B2D CAGGGTCGCT CAGCACCCCC ATGGTCCTCG CACGCACGCA AAAGACGAGC TGGGGGAGGG
550 560 570
Lb48 B2D TAACTGGGAA AAGGGAATAC AGCACGCTCG
Lb14 B2D TAACTGGGAA AAGGGAATAC AGCAT-----
INDELS: 04
INDEL isolado Lb48
INDEL Isolado Lb14
SNPs:04
99
IS Lb48 B2R x IS Lb14 B2R
10 20 30 40 50 60
Lb48 B2R ACGTAGGAGC -GAAGGAAGC GGGGCCGGAG ACTGCTCGCA CCGTACAAG- GCCCG-CGCG
Lb14 B2R ACGTAGGAGC TGAAGAAGGC GGCGCTGGA- ACTGCTTGCA CCGTACAAGT GCCCGTCGCG
70 80 90 100 110 120
Lb48 B2R GGCC-TTAGT CGGGCTCGAG ATCCCGCGGA ACCTTGACGG G-AAGG-GAA CAATGAAGAA
Lb14 B2R GTACATTA-T CGTGCCAGAG ATCCCGCGGA ACCA-GACGG GTAAGGTGAA CAA-GAAGAA
130 140 150 160 170 180
Lb48 B2R TCTAGAGAGA AGG-GCTAGA ACCTAGCCCT GAGG-ACTTT ATCTG-GGCA TG-GAAGG-C
Lb14 B2R TCT-GA-AGA AGGCGCT-GA ACCT-GCCCT GAGGTACTTT ATCTGTGGCA TGTGAAGGTC
190 200 210 220 230 240
Lb48 B2R G-GAGCGTGC GAGGAACAAG A-GGCTCGTG TTATGGGCAC AGGG-AGACC TACGGTCTTT
Lb14 B2R GTGAGC-TGC GAGGAACAAG ATGGCTCGTG TTATGGGCAC AGGGGAGACC TTCGGTCTTT
250 260 270 280 290 300
Lb48 B2R CTCTCTCTCT GCGAAGGTCC GTGCTAGCTA GTGAAGAGGG --GCGCTGCT AGGGTACGCG
Lb14 B2R CTCTCTCTCT GCGAAGGTCC GTGCT-GCT- GTGAAGTTGG CGGCGCTGCT GTGGTACGCG
310 320 330 340 350 360
Lb48 B2R CGTGCTCGTG GCGCTTTCAT GGAGTTCACC CACAAGAGGA GCTGATCTAG GACACTGACA
Lb14 B2R CGTGCTCGTG GCGCTTTCAT GGAGTTCACC CAAAGGAGGA GCTGA-CT-G GACACTGACA
370 380 390 400 410 420
Lb48 B2R CCTTCCTTCA CAGGCTGCAG GTACCGGAGC ATCACGGGGA TCTCGCTGCT GATTTCCACT
Lb14 B2R CCTTCCT-CA CAG-CTGCAG CT-CCGTTCC TTCACGGGT- TCTCGCTGCT GTATTCCACT
430 440 450 460 470 480
Lb48 B2R TTTCCCAGTT ACCCTCCCCC AAGCTCGGCT TTTTGGG--C GTGCGAGGAC CAATGGGGG-
Lb14 B2R TTTCCCAGTT ACCCTCCCCC AGGCTCGGTC TTTTGCGTGC GTGCGAGGAC CA-TGGGGGT
490 500 510 520 530 540
Lb48 B2R GCTGAGCGAC CCTGTTTGGC TTCCAGCCGA AGTC-AGCGA GGATCGCAAG GACCCCAGGC
Lb14 B2R GCTGAGCGAC CCTGTTTGGC TACCA-CTGA TGTCTAGCGA GGAT-GCAAG GACCCCAA-C
550 560 570 580 590 600
Lb48 B2R CAGGAAAGGA C-CGGGTGCC TAGTGATACA GGCATCGAAG GT-AGGAGGA G-ATTCTTCA
Lb14 B2R CAGGAAAGGA CACGGGTGCC T-GTG-T-CA G-CATCGAAG GTTAGGGAGA GTACTCTTCA
610 620 630 640
Lb48 B2R TCCAGCAGCA GCAGCAGCAA AGCGGGCCTC CCTCGTATCG G
Lb14 B2R CACA-CA-CA -CA-CA-CAC AT-GCG-CTC C-T-GTACAT G
INDEL:56
INDEL isolado Lb48
INDEL Isolado Lb14
SNPs:44
100
IS Lb48 B3D x IS Lb14 B3D
10 20 30 40 50 60
Lb48 B3D GTGACGTAGG GGGTGGGGGC GGTGGTACGC ACATGAGCCC GGATGGAGAT GAGCGGAGCG
Lb14 B3D GTGACGTAGG GGGTGGGGGC GGTGGTACGC ACATGAGCCC GGATGGAGAT GAGCGGAGCG
70 80 90 100 110 120
Lb48 B3D GCCCATGGTC AACGAGCCTC GATGTACATC AGCATTCGCC AGAAGGGAAA GGAATCGGAC
Lb14 B3D GCCCATGGTC AACGAGCCTC GATGTACATC AGCATTCGCC AGAAGGGAAA GGAATCGGAC
130 140 150 160 170 180
Lb48 B3D ACGGTGTAAA AGAGAAAGCG CGCACACAGT TGGGCTGCAT GCCCGACACG CCGCTTCGCC
Lb14 B3D ACGGTGTAAA AGAGAAAGCG CGCACACAGT TGGGCTGCAT GCCCGACACG CCGCTTCGCC
190 200 210 220 230 240
Lb48 B3D GTCGCCCGCC CTCTGACTCT CCACAATTAG GGGACAAACC AACGCCATTT CAGAGTCCCC
Lb14 B3D GTCGCCCGCC CTCTGACTCT CCACAATTAG GGGACAAACC AACGCCATTT CAGAGTCCCC
250 260 270 280 290 300
Lb48 B3D TCAAGCTCTT CAAGCTACCT GGAGAAGCGA GCGAGCGCAT CAACGAACGC GTGGAGTACA
Lb14 B3D TCAAGCTCTT CAAGCTACCT GGAGAAGCGA GCGAGCGCAT CAACGAACGC GTGGAGTACA
310 320 330 340 350 360
Lb48 B3D ACGCTACGCC AAACACACCA CCTTCCCGTA ATCGGTTCCC GACGCGCGCA CACACACACG
Lb14 B3D ACGCTACGCC AAACACACCA CCTTCCCGTA ATCGGTTCCC GACGCGCGCA CACACACACG
370 380 390 400 410 420
Lb48 B3D CGCGCACGGT CGCGCCTCTG GAGCACCTGG CGTAGTGACG GGCGAGCTTG GTGAGTTCAC
Lb14 B3D CGCGCACGGT CGCGCCTCTG GAGCACCTGG CGTAGTGACG GGCGAGCTTG GTGAGTTCAC
430 440 450 460 470 480
Lb48 B3D TGCGTGGGTG TGTTTGGTGT TGTATTTTTT GAAGAAGGGA CGAAGAAGAC AGGGCAGTCT
Lb14 B3D TGCGTGGGTG TGTTTGGTGT TGTATTTTTT GAAGAAGGGA CGAAGAAGAC AGG-CAGTTT
490 500 510 520 530 540
Lb48 B3D CTGAGCTAAA A-GCCATCGA GTACAAAAA- -GTGCGTGAT ACGCCGCTCT CTTTCTCACA
Lb14 B3D CTGAGCTAAA AAGCCATCGA GTACAAAAAA AGTGCGTGAT ACGCCGCTCT CTTTCTCACA
550 560 570 580 590 600
Lb48 B3D AGCACACACA --GACACACA --AGCGCGC- ----ACACGC A--CAGCGTC TGGCAT-GCA
Lb14 B3D AGCACACACA CCGACACACA CAAGTGCGCC GCACACACGC AAACAGCGTC TGGCATTGCA
610 620 630 640 650
Lb48 B3D CACA---GGA ACGTGGG-CA GAC-ACG-CC TCAAGCA--G AAACATACAG
Lb14 B3D CACACCAGGA ACGTGGGGCA GACCACGGCC TCAAGCACAG AAACTT----
INDEL:24
INDEL isolado Lb48
INDEL Isolado Lb14
SNPs:03
101
Lb48 B3R x Lb14 B3R
10 20 30 40 50 60
Lb48 B3R -ACGTAGGCT TGGTGATCTT TCTGTATCTC TGTGTAGGTG TGCGTCAGTG TATGCTGCAC
Lb14 B3R GACGTAGGCT TGGTGATCTT -CTGTATCTC TGTGTAGGTG TGCGTCAGTG TATGCTGCAC
70 80 90 100 110 120
Lb48 B3R GCGTGCTCTT CTCCAACCTC CACTGCTCAT GGGGGCGCGA CGACGAAGTA TAGTTTGGTT
Lb14 B3R GCGTGCTCTT CTCCAACCTC CACTGCTCAT GGGGGCGCGA CGAC-AAGTA TAGTT-GGT-
130 140 150 160 170 180
Lb48 B3R AGATTATGTT AGATCCCCGC CTTTCCTGTA GCTTTGCTTC GCCCCTTTTA CTCAGTTGTG
Lb14 B3R AGATTATGT- AGATCCCCGC CTTTCCTGTA GCTTTGCTTC GCCCCTTTTA CTCAGTTGTG
190 200 210 220 230 240
Lb48 B3R TGATCTGTGC GCTCTATCGA ACGCCAACGA GACATCCCCT CCCCATCTAA CAGCTGCAGC
Lb14 B3R TGATC-GTGC GCTCTATCGA ACGCCAACGA GACATCCCCT CCCCATCTAA CAGCTGCAGC
250 260 270 280 290 300
Lb48 B3R AGTGTGTGTG TGTGTGT--A GGTTGTCGTG GATCTATCTT GTACACGTGG TCGTACGTGT
Lb14 B3R AGTGTGTGTG TGTGTGTGTA GGTTGTCGTG GATCTATCTT GTACACGTGG TCGTACGTGT
310 320 330 340 350 360
Lb48 B3R GGGCTTCTTC TTTTCCCTGC AGCTCCCCGC AGCTGCCCCC TTCCTCGTTC CGTACTTGGT
Lb14 B3R GGGCTTCTTC TTTTCCCTGC AGCTCCCCGC AGC-GCCCCC TTCCTCGTTC TGTACTTGGT
370 380 390 400
Lb48 B3R GCGCCTGTCA CGGGTCCTTT TCACTGTCGC GGTTGATTCG TTCTATTCT
Lb14 B3R GCGCCTGTCA CGGGTCCTTT TCACTGTCGC GGTTGATTCG TTCTATTCT
INDEL:10
INDEL isolado Lb48
INDEL Isolado Lb14
SNPs:01
102
Fran piriANEXO 6: EVENTOS DE POLIMORFISMOS DE SÍTIOS DE RESTRIÇÃO
IS Lb49 B1D x IS Lb36 B1D
POSIÇÃO Lb49 B1D - 596 bp Lb36 B1D - 577 bp
13 Bbr7I
18 BpuAI; BbsI; BbvII; MboII; BpiI; BstV2I
19 MboII
44 MaeII
48 Hpy8I; MjaIV
69 BstSCI; Psp6I; EcoRII; PfoI; StyD4I; PspGI; BssKI; AjnI
71 MspR9I; MvaI; Bst2UI; BseBI; Bme1390I; ScrFI; BptI;
BstOI; BstNI
90 AcuI; Eco57MI; Eco57I
104 AccI; FblI; XmiI;
105 MjaIV; Hpy8I
106 MwoI; HpyF10VI; BstMWI
271 BstV1I; BbvI; BseXI
284 TseI; ApeKI
285 BisI; SatI; ItaI; Fsp4HI; Fnu4HI
287 BthCI; HpyCH4V; CviRI
291 BstNSI; NspI
307 HpyF3I; DdeI; BstDEI
343 BstDEI; DdeI; HpyF3I
362 HinfI; TfiI; PfeI
371 TspDTI
387 SelI
388 Hpy178III; Hpy188III
389 NruI; AccII; MvnI; BstFNI; BstUI; FnuDII; Bsp68I;
Bsh1236I
393 TaqI
394 EsaBC3I
395 Hpy99I
421 BciVI; BfuI
483 CspCI
491 Sth132I
492 SmuI; FauI
518 CspCI
525 MnlI; MaeIII
533 CjeI
545 AlwFI Esp3I; Alw26I;BsmAI; BstMAI; BsmBI
554 HpyAV
558 BccI
559 Sth132I
564 MnlI
567 CjeI
569 BstF5I; BseGI
578 TspDTI
103
IS Lb49 B1R x IS Lb36 B1R
POSIÇÃO Lb49 B1R - 608 bp Lb36 B1R - 586 bp
10 ApekI, TseI
11 SatI, ItaI, Fsp4HI, SisI, Fnu4HI
13 SsiI, BthCI, AciI
78 BpuEI, Bce83I
93 SmlI
272 AsuHPI, HphI
280 Hpy8I, MjaIV
305 EciI
310 CjeI
330 Fsp4HI, AspCNI, ItaI, SatI, BisI, Fnu4HI
332 TauI, BthCI
336 BstC8I, Cac8I
342 Sth132I
343 SmuI, FauI
344 CjeI
356 CspCI
363 SsiI, AciI
378 AarI, Acc36I, BspMI, BfuAI, BveI
391 CspCI
421 Bst2BI, BauI, BsiI, BssSI
422 BseMII
423 BspCNI MwoI, BstMWI, HpyF10VI
431 BstDEI, DdeI, HpyF3I
435 TspRI MaeII, HpyCH4IV
436 RleAI
438 TaiI
495 TspDTI
512 HinfI, TfiI, PfeI
515 SsiI, AciI
520 TaqI
521 EsaBC3I
524 Bsh1285I, BstMCI, BsiEI, McrI
525 Bst4CI, TaaI, HpyCH4III, Tsp4CI
526 Csp6I
527 AfaI
528 PabI
532 MnlI
539 BstMWI, HpyF10VI, MwoI
550 Bst6I, EarI, Eam1104I, Ksp632I
563 CviJI
569 TaiI
581 CaiI, AluNI
584 TaaI, Tsp4CI, HpyCH4III, Bsp1407I, TatI, BsrGI, BstAUI, Bst4CI,
SspBI
599 BstSCI, SecI, BseDI, BssECI, BssKI, PspGI, Psp6I, AjnI, StyD4I,
EcoRII, BsaII
104
IS Lb49 B2R x IS Lb36 B2R
POSIÇÃO Lb49 B2R - 489bp Lb36 B2R - 521bp
05 Cac8I, BstC8I
07 ApoI, XapI, AcsI, Tsp509I, Sse9I, TspEI, EcoRI, TasI
15 BscAI
16 SfaNI, LweI
17 Tru9I, Tru1I, MseI
25 HpyAV
46 RleAI
53 FatI
54 CviAII
55 HpyCH4IV, MaeI
56 PspCI, BstBAI, PmaCI, PmlI, AcvI, BsaAI, BbrPI, Eco72I
57 Hsp92II, Hin1II, NlaIII
58 TaiI
72 BsiI, BauI, Bst2BI, BssSI
128 AciI, SsiI
157 MslI, SmiMI
161 AceIII
162 BseMII
163 SsiI, AciI, SelI BspCNI
164 PpuMI, Psp5II, PspPPI, EcoO109I, DraII
165 FnuDII, BstFNI, Bsh1236I, AccII, MvnI, BstUI
167 BstC8I, Cac8I PssI, Tth111II
171 CelII, HpyF3I, BstDEI, Bsp1720I, Bpu1102I, DdeI,
EspI, BlpI
175 Acc36I, CviJI, BveI, AluI, BspMI, BfuAI
185 BstV1I, BbvI, BseXI
189 HinP1I, HspAI, Hin6I
191 HhaI, AspLEI, CfoI, BstHHI
192 SsiI, AspCNI, AciI
193 Sse9I, MfeI, Tsp509I, MunI, TasI, TspEI
194 TauI
198 ApeKI, TseI
203 BstC8I, Cac8I
232 CviRI, HpyCH4V
234 PctI, Mva1269I, BsmI, BsaMI
242 SsiI, AciI
256 BfmI, BstSFI, SfeI, SfcI, BpcI
257 SelI
258 MnlI CviRI, HpyCH4V
259 FnuDII, Hin6I, AccI, Bsh1236I, BstFNI, MvnI, HinP1I,
BstUI, HspAI
260 PstI, BspMAI
261 HhaI, CfoI, BstHHI, AspLEI Hin4I, BseXI, BstV1I, BbvI
263 BfuAI, Acc36I, BveI, BspMI
265 CseI, BstMWI, HpyF10VI, HgaI, MwoI
266 Nli3877I
105
Cont. IS Lb49 B2R x IS Lb36 B2R
POSIÇÃO Lb49 B2R - 489bp Lb36 B2R - 521bp
274 ApeKI, TseI
275 Fnu4HI, BisI, Fsp4HI, ItaI, SatI
277 BthCI
293 Hin4I
306 CviJI
312 BstMWI, HpyF10VI, MwoI
327 TspGWI
331 TaaI, Bst4CI
332 BseDI, SecI, BstDSI, BssECI, BtgI, BsaJI, DsaI
349 TspGWI
358 BseNI, BsrSI, TspRI, BsrI, Bse1I
375 GsuI, BpmI, Eco57MI
381 BseYI
395 HpyCH4V, CviRI, AvaIII, FatI
396 CviAII
397 NsiI, EcoT22I, Zsp2I, Mph1103I
399 Hin1II, NlaIII, Hsp92II
400 CjuI, CstMI
402 FatI
403 CviAII
404 CseI, HgaI
406 CviRI, HpyCH4V Hsp92II, Hin1II, NlaIII
408 Cac8I, BstC8I
422 BsmBI, BstMAI, BsmAI, Alw26I, Esp3I
427 Hpy188I
428 HpyF10VI, MwoI, BstMWI
431 Hpy99I
437 CseI, HgaI
439 BceAI
450 MmeI
453 Csp6I
454 RsaI, AfaI
455 PabI
473 TatI
474 Csp6I
475 AfaI, RsaI
476 PabI
484 BbsI, BpiI, BbuII, BpuAI, BstV2I
489 MboII
498 MaeII, HpyCH4IV
500 MwoI, BstMWI, HpyF10VI
501 HpyAV, TaiI
106
IS Lb48 B1D x IS Lb14 B1D
POSIÇÃO Lb48 B1D - 567 bp Lb14 B1D - 563 bp
146 MaeIII
147 Csp6I
148 RsaI; AfaI
149 PabI
305 BpuEI; Bce83I
317 BdaI
320 SmlI
321 StyI; Eco130I; BssECI; SecI; BssT1I; BsaJI; EcoT14I;
BseDI; ErhI
329 MnlI
365 Hin4I
366 MnlI
367 MnlI
368 PaeR7I; Hpy178III; SlaI; SmlI; BsiHKCI; Sfr274I; AvaI;
XhoI; Ama87I; Hpy188III; StrI; Eco88I; BsoBI; TliI;
369 TaqI
370 EsaBC3I; Hpy178III; SciI; Hpy188III UbaF11I
371 Pfl1108I
372 Nli3877I
378 CjeNII
380 VpaK11AI; UnbI
381 Psp5II; SinI; PpuMI; Sau96I; Bme18I; AvaII;
VpaK11BI; Eco109I; AsuI; PspPPI; Eco47I; DraII;
Sse8647I; AspS9I; Cfr13I
382 BmgT120I
384 FmuI; Psp03I; PssI
387 HpyF10VI; MwoI; BstMWI; BglI
397 Hin4I
438 FnuDII
457 CjeI
476 XcmI
491 CjeI
559 AflIII Tsp4CI; Bst4CI; HpyCH4III; TaaI
561 MaeII; HpyCH4IV
564 TaiI
107
IS Lb48 B2D x IS Lb14 B2D
POSIÇÃO Lb48 B2D - 566 bp Lb14 B2D - 565 bp
22 BfmI; BstH2I BpcI; Bsp143II
112 BsaWI; BetI
113 HapII; MspI; BsiSI; HpaII
114 Sth302II BspNCI
117 NlaIV; BspLI; PspN4I
123 BinI; AclWI; AlwI; BspPI
467 CjeI
468 Bsp24I; CjePI
475 TsoI
484 SimI
499 Bsp19I; BssECI; BssT1I; Eco130I; ErhI; NcoI; StyI;
BtgI; BsaJI; EcoT14I; SecI; DsaI; BstDSI
501 CjeI; CjePI
502 UnbI; VpaK11AI
503 AsuI; AspS9I; Sau96I; VpaK11BI; Cfr13I; Bme18I;
AvaII; SinI; Eco47I
506 Psp03I; FmuI
108
IS Lb48 B3R x IS Lb14 B3R
POSIÇÃO Lb48 B3R - 406 bp Lb14 B3R - 401 bp
08 MboII
104 Hpy99I
110 AjuI
316 BstV1I; BseXI; BbvI
326 HinP1I; Hin6I; HspAI
327 LpnI
328 AspLEI; CfoI; HhaI; BstHHI
329 AluI; PvuII; CviJI; MspA1I; NspBII; ApeKI; TseI HaeII; Bsp143II; BstH2I
330 Fnu4HI; BisI; ItaI; SatI; Fsp4HI
332 BthCI
336 TspGWI
344 TatI
109
IS Lb48 B3D x IS Lb14 B3D
POSIÇÃO Lb48 B3D - 627 bp Lb14 B3D - 645 bp
472 BseMII BspCNI
474 DseDI; DrdI; AasI
482 Alw26I; BsmAI; BstMAI
557 PauI; BsePI; SelI; BssHII
559 Hin6I; BstC8I; HspAI; Cac8I; BstUI; BstFNI; AccII;
HinP1I; FnuDII; Bsh1236I; CjeI; MvnI
560 SmiMI; AleI; MslI; OliI
561 CfoI; AspLEI; BstHHI; HhaI; HgaI; CseI
568 SatI; AspCNI; SsiI; BisI; Fsp4HI; Fnu4HI; AciI
570 BthCI; TauI
572 CjeI
574 HgaI
579 FatI
580 CviAII
581 Cac8I; BstC8I
583 XceI; NlaIII; NspI; PaeI; BbuI; BstNSI; Hsp92II; SphI;
Hin1II
592 Bse3DI; BsrDI; BseMI
593 CjeI
594 Bce83I; BpuEI
595 Tth111II
611 BstXI
614 Bce83I; BpuEI
622 BsaJI; BssECI; BtgI; BseDI; SecI; BstDSI; DsaI
627 BsuRI; BshFI; CviJI; PhoI; HaeIII; BspANI
640 BcefI; BceAI
110
IS Lb48 B1R x IS Lb14 B1R
POSIÇÃO Lb48 B1R - 605 bp Lb14 B1R - 599 bp
16 Sth132I
17 FauI, SmuI
24 AciI, SsiI
26 BslI, Bsc4I, BseLI
32 TstI
61 AatI, PceI, HaeIII, PhoI, StuI, BspANI, Eco147I, HaeI,
BsuRI, SseBI, BshFI
67 NmuCI, Tsp45I
73 PpsI, PleI
76 NspBII, MspA1I
78 FinI
79 AsuHPI, HinfI, HphI, SspD5I
80 Csp6I
81 AfaI, RsaI
82 PabI
91 BsmFI, BslFI, FaqI
96 BtsI
101 CviRI, HpyCH4V
102 Tsp4CI, HpyCH4III, Bst4CI, TaaI
107 HpyF10VI, MwoI, BstMWI
108 BseX3I, CfrI, BstZI, GdiII, Eco52I, EaeI, EagI, EclXI,
XmaIII
110 BsuRI, HaeIII, CviJI, BspANI, BshFI, PhoI BstACI, BsaHI, Hsp92I, AcyI, Hin1I
111 BstMCI, Bsh1285I, BsiEI, McrI
115 Hin4II
118 HgaI, CseI
123 BceAI, BcefI
124 HpyAV
126 NmuCI, Tsp45I, MaeIII
127 TsuI
131 Hin4II
140 HpyAV
144 BstMWI, HpyF10VI, TaqI, MwoI
146 ApeKI, TseI
147 ItaI, Fsp4HI, SatI, Fnu4HI, BisI Hin6I, HinP1I, HspAI
149 BthCI, MspA1I, SsiI, AciI, NspBII BstHHI, HhaI, AspLEI, CfoI
150 BisI, Fsp4HI, SatI, Fnu4HI, ItaI
152 BthCI, TauI
156 MnlI
158 BbvI, BstV1I, BseXI
173 TspGWI CjeI
181 TspDTI
188 XcmI
190 BsmAI, Bso31I, BstMAI, BspTNI, BsaI, Alw26I,
Eco31I
191 Csp6I
192 RsaI, AfaI
111
Cont. IS Lb48 B1R x IS Lb14 B1R
POSIÇÃO Lb48 B1R - 605 bp Lb14 B1R - 599 bp
193 PabI
207 CjeI
213 AsuII, NspV, BstBI, Bsp119I, BspT104I, SfuI, TaqI,
Bpu14I, Csp45I
214 EsaBC3I
229 HpyAV, LweI, SfaNI
230 FatI
231 CviAII
232 BscAI
234 Hin4I NlaIII, Hsp92II, Hin1II
236 HpyCH4IV, MaeI
237 BsaAI, BstBAI
239 TaiI
244 BstF5I, BseGI
248 LpnI
250 HaeII, BstH2I, Bsp143II
251 FokI
252 MboI StsI
265 MnlI
266 Hin4I
272 HpyAV
273 BseDI, BsaJI, BssECI, SecI UnbI, VpaK11AI
274 Sal96I, EcoO109I, Bme18I, AspS9I, Cfr13I, AvaII, AsuI,
PpuMI, DraII, VpaK11BI, Sse8647I, Eco47I, PspPPI, SinI,
Psp5II
275 BmgT120I
277 PssI, Psp03I, FmuI
325 TspDTI
341 StyI
353 MboII
406 SsiI, AciI
412 AsuHPI, HphI
417 Sal3AI, DpnII, NdeII, Kzo9I, BstMBI, MboI, BfuCI,
Bsp143I
419 MalI, DpnI
420 BstKTI
421 ChaI
424 BcgI
425 AclWI, AlwI, OliI, SmiMI, AleI, BspPI, BinI, MslI
430 VneI, Alw44I, ApaLI
432 MjaI, Hpy8I
433 BsiI, BauI, BssSI
434 MhlI, Alw21I, Bsp1286I, BsiHKAI, Bbv12I, HgiAI,
Bme1580I, BseSI, SduI
449 BscAI
450 LweI, SfaNI
454 MwoI, BstMWI, HpyF10VI
457 AccB7I, PflMI, BsiYI, Van91I, BseLI, Bsc4I, BseYI, BslI
112
Cont. IS Lb48 B1R x IS Lb14 B1R
POSIÇÃO Lb48 B1R - 605 bp Lb14 B1R - 599 bp
458 BcgI
478 MwoI, BstMWI, HpyF10VI
487 MjaIV, Hpy8I, Csp6I
488 AfaI, RsaI
489 PabI
494 Eco57MI, Eco57I, AcuI, CviJI
497 MaeIII, Tsp45I, NmuCI
499 SimI
500 HpyF10VI, MwoI, BstMWI
504 Sth132I
505 Cac8I, BstC8I
522 TssI, ItaI, AspCNI, SsiI, SatI, BisI, Fnu4HI, Fsp4HI, AciI
524 BthCI, BsrBI, MbiI, AccBSI, TauI
533 Cfr10I, BssAI, Bse118I, NgoMIV, MroNI, BsrFI
534 BsiSI, MspI, HapII, HpaII
535 PdiI, NaeI, Sth302II
536 Hin4I
537 CviJI
539 Cac8I
547 FatI
548 CviAII
549 CjeNII
551 MnlI Hin1II, NlaIII, Hsp92II
552 SimI
555 BccI
562 BseYI
565 CviJI
566 BseGI, BstF5I CjePI
568 Hin4I
573 FokI
574 StsI, CjeI
578 UnbI
113
IS Lb48 B2R x IS Lb14 B2R
POSIÇÃO Lb48 B2R - 618 bp Lb14 B2R - 607 bp
10 AluI, CviJI
12 FauI
16 MwoI
17 HpyF10VI
21 Fnu4HI
22 Sau96I, BsmAI
23 NlaIV TauI, HinP1I
24 CviJI, HaeIII
25 HpaII MboII, HhaI
26 HaeII
31 MwoI
32 Eco57I, Eco57MI, HpyF10VI
38 HpyCH4V
49 Sal96I, FauI
50 CviJI, HaeIII
52 Cac8I
53 Bme1580I
54 HinP1I
56 HhaI
58 Cac8I, Sau96I Hpy99I
59 FauI
60 CviJI, HaeIII
61 Csp6I
62 DdeI RsaI
67 BslI
68 MslI
71 CviJI
72 AvaI, SmlI, XhoI
73 BanII, TaqI
74 Hpy188III
106 Hpy8I
115 HphI
116 XbaI
117 Hpy188III, BfaI
120 Hpy188I
123 TspDTI
128 HinP1I
129 CviJI
130 BfaI HhaI
131 HaeII
133 MboI
136 MwoI
137 BfaI HpyF10VI
140 CviJI Eco57I, Eco57MI
114
Cont. IS Lb48 B2R x IS Lb14 B2R
POSIÇÃO Lb48 B2R - 618 bp Lb14 B2R - 607 bp
144 BspMI
147 Csp6I
148 RsaI
165 NspI, BbvI
166 MwoI
167 HpyF10VI
169 AciI
173 Hpy188III
175 MwoI
176 HpyF10VI, Cac8I
178 AluI, CviJI, TseI
179 Fnu4HI
182 MnlI
184 EciI
214 TaqII
221 HpyCH4III
242 BbvI
250 NheI
251 BfaI
252 Cac8I
254 BmtI, CviJI, AluI
255 BfaI, EarI
256 MnlI
270 AciI
271 Fnu4HI
272 MboII
273 TauI
274 BfaI
328 MboI
330 DpnI
331 BstKTI
332 BfaI
340 BsrI
353 BspMI
358 TspGWI
360 MspA1I, PvuII, AluI
363 MnlI
365 Acc65I, BanI
366 Csp6I AluI, CviJI
367 NlaIV, RsaI
368 BsaWI
369 KpnI, HpaII
383 SfaNI, BstYI, MboI
385 DpnI
115
Cont. IS Lb48 B2R x IS Lb14 B2R
POSIÇÃO Lb48 B2R - 618 bp Lb14 B2R - 607 bp
386 BstKTI
391 AlwI
417 FalI
419 TaqII
421 EcoNI
422 BsaJI, PspGI, StyD4I
424 BstNI, ScrFI
428 AluI
439 MwoI
440 HpyF10VI
449 FalI
454 BsaJI, BtgI, NcoI, StyI, FatI
458 NlaIII
459 BslI MslI
463 CviJI
493 TspRI
494 SfaNI
496 BfaI
502 MboI
504 MwoI, DpnI
505 HpyF10VI, BstKTI
507 HpyCH4V
509 BstF5I
510 AlwI
515 BsaJI
516 FokI
520 CviJI, HaeIII
529 AvaII, Sau96I
531 StyD4I
532 HpaII
533 NciI
540 BfaI
558 MnlI
561 Hin4I
563 FokI
565 TspDTI
566 TatI
567 Csp6I
568 ScaI, RsaI
570 HinfI, TfiI
576 BstF5I EarI
580 BseRI BsaXI
583 TseI
584 Fnu4HI
116
Cont. IS Lb48 B2R x IS Lb14 B2R
POSIÇÃO Lb48 B2R - 618 bp Lb14 B2R - 607 bp
586 TseI
587 Fnu4HI
589 MwoI, TseI MslI
590 HpyF10VI, Fnu4HI FatI
592 MwoI, TseI
593 Hin4I, HpyF10VI, Fnu4HI, FauI
594 NspI, NlaIII, HinP1I
595 BbvI
596 HhaI
598 BbvI
600 AciI
601 BbvI, MwoI BsrGI, TatI
602 HpyF10VI, Cac8I, Sau96I CspI
603 RsaI
604 BbvI, CviJI, HaeIII
615 MnlI
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