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UNIVERSIDADE FEDERAL DE SANTA MARIA
CENTRO DE CIÊNCIAS RURAIS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA E TECNOLOGIA
DOS ALIMENTOS
CARACTERIZAÇÃO DE COMPOSTOS
ANTIOXIDANTES EM GRÃOS DE DIFERENTES
CULTIVARES DE CEVADA (Hordeum vulgare L.)
DISSERTAÇÃO DE MESTRADO
Aline Sobreira Bezerra
Santa Maria, RS, Brasil
2009
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CARACTERIZAÇÃO DE COMPOSTOS ANTIOXIDANTES EM
GRÃOS DE DIFERENTES CULTIVARES DE CEVADA
(Hordeum vulgare L.)
por
Aline Sobreira Bezerra
Dissertação apresentada ao Curso de Mestrado do Programa de Pós-
Graduação em Ciência e Tecnologia dos Alimentos, da Universidade
Federal de Santa Maria (UFSM, RS), como requisito parcial para
obtenção do grau de
Mestre em Ciência e Tecnologia dos Alimentos.
Orientador: Prof. Dr. José Laerte Nörnberg
Santa Maria, RS, Brasil
2009
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Bezerra, Aline Sobreira
B574c
Caracterização de compostos antioxidantes em
grãos de diferentes cultivares de cevada (Hordeum
vulgare L.) / por Aline Sobreira Bezerra ; orientador
José Laerte Nörnberg ; co-orient. Leandro Machado
de Carvalho, Luisa Helena R. Kecktheuer. - Santa
Maria, 2009.
108 f. ; il.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal
de Santa Maria, Centro de Ciências Rurais,
Programa de Pós-Graduação em Ciência e
Tecnologia dos Alimentos, RS, 2009.
1. Tecnologia de alimentos 2. Cevada 3.
Hordeum vulgare L. 4. Compostos polifenólicos 5.
Folin-Ciocalteu 6. HPLC I. Nörnberg, Jose Laerte,
orient. II. Carvalho, Leandro Machado de, co-orient.
III. Hecktheuer, Luisa Helena Rycheki, co-orient.
IV. Título
CDU: 664.147
Ficha catalográfica elaborada por
Luiz Marchiotti Fernandes – CRB 10/1160
Biblioteca Setorial do Centro de Ciências Rurais/UFSM
Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Rurais
Programa de Pós-Graduação em Ciência e
Tecnologia dos Alimentos
A Comissão Examinadora, abaixo assinada,
aprova a Dissertação de Mestrado
CARACTERIZAÇÃO DE COMPOSTOS ANTIOXIDANTES EM GRÃOS
DE DIFERENTES CULTIVARES DE CEVADA (Hordeum vulgare L.)
elaborada por
Aline Sobreira Bezerra
como requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Ciência e Tecnologia dos Alimentos
Comisão Examinadora:
________________________________________
José Laerte Nörnberg, Dr.
(Presidente/Orientador)
________________________________________
Leandro Machado de Carvalho, Dr. (UFSM)
________________________________________
Luisa Helena R. Hecktheuer, Dr.ª (UFSM)
Santa Maria, 29 de janeiro de 2009.
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus por estar ao meu lado em todas as horas, amigo fiel e que
me garantiu essa vitória renovando a cada dia as minhas forças! Obrigada Senhor!
Ao meu querido marido Marcelo, pela força, companheirismo, ajuda e
paciência. Obrigada por ter compreendido e permitido as muitas vezes em que
dediquei grande parte do tempo que era seu nessa pesquisa! Eu te amo muito!
Aos meus pequeninos Mariana e Daniel. Mamãe ama muito vocês! Quando
vocês crescerem irão compreender todo o esforço da mamãe pela realização deste
sonho.
Ao cunhado Nelson Soares pela ajuda com os gráficos.
A todos os meus familiares e amigos que contribuíram muito com orações e
palavras de conforto e ânimo! Obrigada a todos!
Ao meu mestre e orientador, Prof. Dr. José Laerte Nörnberg, pela dedicação,
paciência e confiança em meu trabalho.
Ao meu mestre e co-orientador, Prof. Dr. Leandro Machado de Carvalho, pela
grande ajuda, confiança e estímulo para que esse trabalho acontecesse.
A minha mestre e co-orientadora Prof
a
. Dra. Luisa Helena R. Hecktheuer, pela
confiança e ajuda sempre que era necessário.
As grandes amigas da Química Adriana Bergravv, Carine Allebrandt,
Fernanda Lima e Larissa Sabo. Vocês são muito especiais e sem vocês esse
trabalho não teria acontecido! Obrigada por tudo!
A todos os colegas do curso de pós-graduação em especial a Milena Bagetti,
Tiffany Hautrive, Eduardo Brum e a Jaqueline Ritter. Vocês contribuíram muito para
o início desse projeto!
Aos professores do curso de Pós-graduação em Ciência e Tecnologia dos
Alimentos, por cada aprendizado e ajuda. Seus sábios conhecimentos transmitidos
não serão jamais esquecidos. Muito obrigada!
A secretária do curso Lia, ao funcionário Carlos e ao Sr. Luiz Marchiotti, pelos
serviços prestados.
À todos minha gratidão e carinho!
“Não temas, porque eu sou contigo; não
te assombres, porque eu sou o teu
Deus; eu te fortaleço, e te ajudo, e te
sustento com a minha destra fiel”.
(Is 41:10)
“E tudo o que pedirdes na
oração,crendo, o recebereis”.
(Mt 21.22)
RESUMO
Dissertação de Mestrado
Programa de Pós-Graduação em Ciência e Tecnologia dos Alimentos
Universidade Federal de Santa Maria-RS/Brasil
CARACTERIZAÇÃO DE COMPOSTOS ANTIOXIDANTES EM GRÃOS DE
DIFERENTES CULTIVARES DE CEVADA (Hordeum vulgare L.)
Autora: Aline Sobreira Bezerra
Orientador: José Laerte Nörnberg
Data e Local: Santa Maria, 29 de Janeiro de 2009.
Os antioxidantes são compostos conhecidos por reagirem com radicais livres e/ou
espécies reativas de oxigênio, de forma a inativá-los, prevenindo os danos oxidativos.
Muitos estudos têm apontado para o desequilíbrio entre oxidantes e antioxidantes como o
causador de muitas patologias, e devido à grande importância dada a este tema, existe uma
forte demanda de estudos envolvendo a identificação e quantificação dos compostos com
atividade antioxidante. O objetivo deste trabalho foi então quantificar e identificar os
compostos polifenólicos de grãos integrais de cultivares brasileiras de cevada, cultivadas no
município de Ibiaçá/RS, no ano agrícola de 2005 e 2006, provenientes do Centro de
Pesquisa da Embrapa/Trigo, Passo Fundo/RS, e avaliar as condições climáticas
(temperatura média, índice pluviométrico e insolação) entre a época de plantio e colheita da
cevada na quantificação dos fenólicos totais entre as diferentes safras. As amostras foram
caracterizadas quimicamente com relação à presença de polifenóis, empregando-se o
método de separação baseado no sistema de cromatografia líquida de alta eficiência em
fase reversa (RP-HPLC) com detecção UV-VIS a 254nm. Foram identificados os compostos
fenólicos rutina, ácido caféico, ácido ferúlico, quercitrina e miricetina, sendo a rutina e o
ácido caféico os mais abundantes entre as cultivares. Paralelamente foi realizada uma
quantificação dos fenólicos totais pela técnica de Folin-Ciocalteu, visando uma comparação
com a técnica cromatográfica. As técnicas mostraram-se satisfatórias para os objetivos de
quantificação e identificação na diferenciação das amostras de cevada analisadas.
Observou-se a diferenciação química das variedades de cevada com relação aos
compostos polifenólicos identificados e quantificados e entre variedades de diferentes anos
de cultivo. Na avaliação dos fatores climáticos, foi observado que uma menor temperatura
média, um maior índice pluviométrico e uma menor insolação recebida pela cevada entre as
épocas de plantio e colheita, refletiram em um aumento dos fenóis totais pelo método de
Folin-Ciocalteu e na quantificação do flavonóide rutina por HPLC.
Palavras-chave: compostos polifenólicos, Folin-Ciocalteu, Hordeum vulgare L., HPLC.
ABSTRACT
Master Dissertation
Pos-Graduate Course of Food Science and Technology
Federal University of Santa Maria, RS, Brazil
CHARACTERIZATION OF ANTIOXIDANTS COMPOUNDS IN GRAINS OF
DIFFERENT BARLEY CULTIVARS (Hordeum vulgare L.)
Author: Aline Sobreira Bezerra
Adviser: José Laerte Nörnberg
Date and Place: Santa Maria, January, 29, 2009.
Antioxidants are compounds known as free radicals react with and/or reactive oxygen
species in order to idle them, preventing the oxidative damage. Many studies have pointed to
the imbalance between oxidants and antioxidants as the cause of many diseases and
because of the great importance given to this issue, there is a strong demand for studies
involving the identification and quantification of compounds with antioxidant activity. This
work was then identify and quantify the polyphenolic compounds full of grains of Brazilian
cultivars of barley, grown in the municipality of Ibiaçá/RS, in the agricultural year of 2005 and
2006, from the Research Center of Embrapa/Wheat, Passo Fundo/RS and assess the
weather conditions (average temperature, precipitation index and insolation) between the
time of planting and harvesting barley in the quantification of phenolic compounds between
the different seasons. The samples were characterized chemically related to the presence of
polyphenols, using the method of separation based on the system of high performance liquid
chromatography in reversed phase (RP-HPLC) with UV-VIS detection to 254 nm. We
identified the phenolic compounds rutin, caffeic acid, ferulic acid, quercitrin and myricetin,
with rutin and caffeic acid the most abundant among cultivars. Alongside was a quantification
of phenolic compounds by the Folin-Ciocalteau technique of aiming at a comparison with the
chromatographic technique. The techniques have proved satisfactory for the purposes of
identification and quantification of differentiation in barley samples analyzed. There was a
chemical differentiation of the varieties of barley in relation to polyphenolic compounds
identified and quantified and between varieties of different years of cultivation. In the
assessment of climatic factors, it was observed that a lower average temperature, a higher
rainfall and less sunshine received by barley between planting and harvest seasons,
reflected in an increase of total phenols using the Folin-Ciocalteu and quantification of HPLC
flavonoid rutin.
Key words: polyphenolic compounds, Folin-Ciocalteu, Hordeum vulgare L., HPLC.
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
FIGURA 1- Estrutura do grão de cevada ...................................................................16
FIGURA 2- Estrutura básica e tipo de flavonóides ....................................................20
FIGURA 3- Estrutura química de flavan-3-ol e flavan-3,4-diol ..................................21
FIGURA 4- Estrutura química dos ácidos hidroxibenzóicos e hidroxicinâmicos .......22
FIGURA 5- Estrutura química da rutina .....................................................................27
FIGURA 6- Estrutura química do ácido caféico .........................................................28
FIGURA 7- Estrutura química do ácido ferúlico .........................................................29
FIGURA 8- Estrutura química da miricetina ..............................................................30
FIGURA 9- Estrutura química da quercitrina .............................................................31
SUMARIO
1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................12
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA....................................................................................14
2.1 Cevada (Hordeum vulgare L.)............................................................................14
2.1.1 Origem da cevada..............................................................................................14
2.1.2 Produção e consumo.........................................................................................14
2.1.3 Composição química e anatomia do grão.........................................................15
2.2 Estrutura química dos compostos fenólicos e efeitos desempenhados......17
2.3 Classificação dos compostos fenólicos...........................................................18
2.3.1 Flavonóides........................................................................................................18
2.3.2 Taninos...............................................................................................................20
2.3.3 Ácidos fenólicos.................................................................................................21
2.4 Radicais livres e estresse oxidativo..................................................................23
2.5 Compostos fenólicos em cevada......................................................................25
2.5.1 Rutina.................................................................................................................26
2.5.2 Ácido Caféico.....................................................................................................27
2.5.3 Ácido Ferúlico.....................................................................................................28
2.5.4 Miricetina............................................................................................................29
2.5.5 Quercitrina..........................................................................................................30
2.6. Métodos analíticos utilizados para a determinação de compostos fenólicos
.....................................................................................................................................31
2.6.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)..............................................31
2.6.2 Método de Folin-Ciocalteu.................................................................................32
3 ARTIGOS CIENTÍFICOS.........................................................................................34
ARTIGO 1....................................................................................................................35
ARTIGO 2....................................................................................................................48
ARTIGO 3....................................................................................................................60
4 CONSIDERAÇÕES GERAIS...................................................................................76
5 CONCLUSÕES........................................................................................................78
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...........................................................................80
12
1 INTRODUÇÃO
A pesquisa por produtos naturais que apresentem propriedades antioxidantes,
associadas às propriedades bactericidas ou bacteriostáticas, vem sendo investigada
mais atentamente nos últimos 15 anos. Esse fato não se restringe à área alimentícia
sob o ponto de vista tecnológico, mas também na procura por alimentos com
elevado potencial antioxidante.
A investigação e comprovação desta propriedade de forma efetiva conferem a
estes produtos o título de “alimento funcional”, podendo exercer seu poder sobre
diversos constituintes biológicos. Na saúde humana, o aumento no consumo desses
compostos fenólicos tem sido correlacionado com a redução do risco de doenças
cardiovasculares e certos tipos de câncer (BONOLI et al., 2004).
Na indústria de alimentos a aplicação dos mesmos é extremamente
importante na proteção de seus constituintes, principalmente de óleos e gorduras, de
modo a se evitar sabores e odores indesejáveis, mantendo de maneira efetiva a
palatabilidade, aceitabilidade e o valor nutricional dos produtos alimentícios,
retardando a deterioração, rancidez e descoloração decorrente da auto-oxidação
(POURCHET-CAMPOS, 1990).
Atualmente, alguns estudos têm identificado potentes antioxidantes em grãos
de cereais (HERNÁNDES-BORGES et al., 2005) e algumas formas já foram
encontradas em grãos de cevada (SHAHIDI; NACZK, 1995), em parte com estrutura
fenólica, enfatizando o papel antioxidante da mesma.
Sendo assim, muitos compostos antioxidantes naturais têm sido isolados de
diferentes partes de plantas tais como sementes, frutas, folhas e raízes, e muitos
estudos têm sido realizados na determinação de sua ação antioxidante (MANCINI-
FILHO et al., 1998).
Os principais compostos fenólicos presentes nos cereais são os flavonóides
e os ácidos fenólicos. O conteúdo de polifenóis em cereais é menor que 1% da
matéria seca, exceto para a variedade de sorgo (Sorghum bicolor) que alcançam
conteúdos superiores a 10%. A farinha de arroz contém 85,6 mg de ácidos fenólicos/
100g do produto, sendo este conteúdo similar ao contido nas farinhas de trigo e
aveia, respectivamente. Tanto na farinha de trigo como na de aveia, destaca-se o
13
ácido ferúlico como o principal componente fenólico (RAMÍREZ, 2005). Na farinha de
cevada, o conteúdo de ácidos fenólicos tem alcançado valores de 60,4-134,6
mg/100g (HOLTEKJØLEN; KINITZ; KNUTSEN, 2006) e de fenóis totais pelo método
de Folin-Ciocalteu de 75-156,0 mg/100g do produto (BEZERRA et al., 2008).
Informações a respeito do estudo da caracterização química de compostos
antioxidantes entre cultivares Brasileiras de cevada são escassos e de grande
importância em virtude do uso em larga escala desse grão pela indústria alimentícia.
Dessa forma, os objetivos desta pesquisa foram caracterizar diferentes
cultivares de cevada por meio da identificação e quantificação dos compostos
polifenólicos bioativos presentes com características antioxidantes por
Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em fase reversa (RP-HPLC) e pelo método
de Folin-Ciocalteu, a fim de se quantificar os fenóis totais nas amostras, visando à
comparação com o conteúdo de polifenólicos quantificados por HPLC. Os fatores
climáticos: insolação, índice pluviométrico e temperatura média foram considerados
para se verificar diferenças quantitativas de polifenólicos entre grãos de diferentes
anos de cultivo.
14
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Cevada (Hordeum vulgare L.)
2.1.1 Origem da cevada
Fragmentos de grãos de cevada datam de aproximadamente 7.900 AC, foram
encontrados no Irã. No entanto, em 1979, um artigo publicado localizou suas origens
em torno de 10.000 anos antes dessa data (KENDALL, 1994).
Relatos bíblicos mostram que a cevada era o cereal mais cultivado naquele
período, sendo o principal alimento dos pobres, devido ao valor comercial menor do
que o do trigo. A importância da cevada como alimento começou a declinar no
século XVI, quando os fazendeiros do Oriente Médio começaram a cultivar mais o
trigo como alimento, devido às melhores variedades que se tornaram disponíveis
(MUCHERONI, 2006).
Foi então um dos cereais mais precocemente familiarizados, e seu uso como
alimento para pessoas e animais foi na China e Europa em torno de 2.800 AC
Atualmente a Rússia é seu maior produtor seguido pela França, Canadá e Reino
Unido (STEPHEN; EISENDRATH, 1986).
2.1.2 Produção e consumo
A cevada é uma gramínea cerealífera típica de clima frio, pertencente à
família Gramineae, subfamília Festucoideae, da tribo Triticeae e gênero Hordeum
(KENDALL, 1994). Representa o cultivo de mais ampla distribuição, sendo adaptada
a várias condições de crescimento e cultivada em todo o mundo (SIMONI; MENA,
2006).
15
Cultura milenar e muito difundida no passado, classificada hoje em dia como
o quarto cereal mais cultivado no mundo, a cevada é basicamente utilizada pela
indústria cervejeira e na alimentação animal, e tem sido muito consumida em países
como Rússia, Canadá, Estados Unidos da América e outros países como um
“alimento funcional”, rico em fibra alimentar, constituído principalmente por fibra
solúvel, da qual as β-glucanas são os constituintes principais, estando associadas à
redução do risco de doenças cardíacas (BINNECK et al., 2002).
No Brasil, o seu cultivo ocupa uma área superior a 120.000 hectares, sendo
distribuída nos planaltos do Rio Grande do Sul, Santa Catarina e Paraná, em escala
comercial desde 1930, mostrando assim, uma significativa importância econômica. A
área cultivada nos últimos anos cresceu substancialmente, passando de 57.018
hectares em 1992 para 137.664 em 2000, sendo o Rio Grande do Sul o maior
produtor, contribuindo em 1998, com 70,6% da produção, seguido pelo Paraná e
Santa Catarina com 27,4% e 2,0%, respectivamente (MINELA, 2006).
Além disso, é o cereal que melhor se adapta a temperaturas extremas e
frequentemente cresce em terras expostas a luz, bem escoadas e porosas e toleram
melhor um solo com pH acima de 6,0, pois o baixo pH retarda o crescimento de sua
raiz (STEPHEN; EISENDRATH, 1986). O grão pode ser plantado no solo sem arar,
por esta razão pode ser cultivado em lotes minúsculos, em áreas inacessíveis aos
animais de tração, podendo se desenvolver em áreas demasiadamente secas para o
trigo (MUCHERONI, 2006).
2.1.3 Composição química e anatomia do grão
O grão de cevada (figura 1) é constituído por casca, farelo, endosperma e
embrião. A casca é formada pela palha, que é eliminada no beneficiamento e pela
membrana externa (farelo), que fica aderida ao grão. O endosperma é constituído
basicamente de amido e proteína sendo responsável pela formação de enzimas
durante a malteação, enquanto que o embrião é o local das atividades vitais do grão
(VICENZO, 2007).
A casca tem a função de proteção, contém fibras, antioxidantes, minerais e
vitaminas do complexo B. A cevada difere de outros grãos, pela fibra estar
16
distribuída em todo o grão e não apenas na camada externa (YALÇIN et al., 2007).
Assim, quando a casca, ou a camada externa é removida, apenas parte da fibra é
removida (OSCARSSON et al., 1996; XUE et al., 1997). O descascamento dos
grãos de cevada reduz a concentração de proteína bruta, de extrato etéreo, de
cinzas, de fibra solúvel, e, em especial, nos teores de fibra total e de fibra insolúvel
(MAYER et al., 2007). Desta forma, um produto processado a partir da camada
externa do grão de cevada, como o farelo, pode ser nutricionalmente atraente com
relação aos teores de fibra alimentar e de antioxidantes.
FIGURA 1- Estrutura do grão de cevada (fonte: www.google.com.br/figuras).
Os principais componentes do grão de cevada são: o amido, a proteína e a
fibra alimentar, e os componentes minoritários são os lipídeos, minerais e vitaminas.
Esses grupos, por sua vez, sofrem variações químicas por fatores genéticos e
ambientais (MOLINA-CANO et al., 1995; YALÇIN et al., 2007). Segundo Mayer et al.
(2007), grãos integrais e descascados de cultivares de cevada apresentam
variações quanto à composição de nutrientes devido à variabilidade genética entre
cultivares.
17
2.2 Estrutura química dos compostos fenólicos e efeitos desempenhados
Os compostos fenólicos são estruturas químicas que apresentam hidroxilas e
anéis aromáticos, nas formas simples ou de polímeros, que os confere o poder
antioxidante. Esses compostos podem ser naturais ou sintéticos. Quando presentes
em vegetais podem estar em formas livres ou complexadas a açúcares e proteínas.
Baseado em sua estrutura química, os polifenóis podem ser divididos em pelo
menos dez diferentes classes, sendo que as principais são os flavonóides, taninos e
ácidos fenólicos e derivados (RAMALHO; JORGE, 2006).
Os mesmos constituem compostos de baixo peso molecular contendo um
esqueleto comum de difenilpiranos (C
6
-C
3
-C
6
), composto por anéis de fenil (A e B)
ligados através de um anel C pirano (heterocíclico). Os átomos de carbono nos
anéis C e A se numeram de 2 a 8, e os do anel B desde o carbono 2 ao carbono 6,
conforme figura 2 (MARTÍNEZ- FLORES et al., 2002).
Entre suas funcionalidades mais interessantes está à capacidade de proteger
as plantas contra patógenos e predadores herbívoros (alguns compostos podem
atuar como toxinas naturais ou conferir sabor indesejado ao alimento tornando-o
menos palatável) (BRAVO, 1998) e principalmente contra estresse fotossintético e
formação de espécies reativas de oxigênio (YANG et al., 2001).
Nos últimos anos, se tem descrito uma série crescente de compostos que
demonstram emergente potencial antioxidante, entre estes, os polifenólicos como
ácidos fenólicos, polifenóis e flavonóides.
Vários efeitos benéficos à saúde têm sido atribuídos aos compostos fenólicos
presentes nos alimentos. Estudos realizados correlacionam aos mesmos,
propriedades antioxidantes, anti-inflamatória, anti-microbiana e anti-carcinogênica
(ABE, 2007).
A atividade antioxidante dos compostos fenólicos contribui significativamente
para a saúde humana (MUÑOZ et al., 2007). Além das propriedades citadas
anteriormente, estudos relatam também que os polifenóis, em especial a classe dos
flavonóides, exibem atividade antiviral, principalmente contra vírus envelopados,
além de agirem melhorando a permeabilidade capilar, podendo auxiliar no
tratamento de alguns distúrbios circulatórios.
18
Os flavonóides e outros derivados fenólicos são conhecidos por atuarem na
captura e neutralização de espécies oxidantes, podendo atuar em sinergismo com
outros antioxidantes como as vitaminas C e E. Essa atividade antioxidante é o
resultado de um conjunto de propriedades, tais como atividade quelante do ferro,
atividade seqüestrante de radicais livres, inibição de enzimas cicloxigenase,
lipoxigenase, NADPH-oxidase, xantina-oxidase e fosfolipase, e estimulação de
enzimas com atividade antioxidante como a catalase e a superóxido-dismutase
(SIMÕES et al., 2003).
Os flavonóides com grupamentos hidroxila no anel B são eficientes inibidores
da glicação do colágeno, uma das vias que podem desencadear processos
ateromatosos, por haver liberação de radicais livres devido à oxidação de moléculas
de lipoproteínas de baixa densidade (LDL) (LIMA; OLIVEIRA; NAGEM, 2003).
Estudos demonstram também que os compostos fenólicos possuem atividade
antiviral contra o vírus da imunodeficiência em humanos, herpes simples e
poliomielite. Cita-se ainda que, flavonóides podem induzir um aumento do
crescimento celular, diminuindo a peroxidação dos lipídeos em níveis de membrana.
Além disso, podem também inibir a proliferação celular, sendo úteis na inibição de
proliferações tumorais ((LIMA; OLIVEIRA; NAGEM, 2003). Estima-se que o valor
médio diário do consumo humano seja em torno de 30 mg/dia de flavonóides na
dieta, sendo os flavonóis os predominantes. A sua excreção ocorre principalmente
pela urina, dada a sua solubilidade em água (MARTINÉZ-FLORES et al., 2002).
2.3 Classificação dos compostos fenólicos
2.3.1 Flavonóides
Os flavonóides são compostos largamente distribuídos no reino vegetal, e
encontram-se presentes em frutas, folhas, sementes e em outras partes de plantas
na forma de glicosídios ou agliconas. São compostos de baixo peso molecular,
consistindo de 15 átomos de carbono, organizados na configuração C
6
–C
3
–C
6
(ANGELO; JORGE, 2007).
19
A atividade dos flavonóides como antioxidantes depende da propriedade
redox de seus grupos hidroxifenólicos e da relação estrutural entre as diferentes
partes da estrutura química (BORS et al., 1990). Esta estrutura básica permite uma
magnitude de padrões de substituições e variações no anel C.
Essas variações em substituição do anel C padrão resultam em importantes
classes de flavonóides, como flavonóis, flavonas, flavanonas, flavanóis (ou
catequinas), isoflavonas e antocianidinas. Substituições dos anéis A e B originam
diferentes compostos dentro de cada classe de flavonóides. Estas substituições
podem incluir oxigenação, alquilação, glicosilação, acilação e sulfação (HOLLMAN;
KATAN, 1999). Na figura 2, encontra-se a estrutura básica e alguns tipos de
flavonóides.
Estudos utilizando sistema modelo de produtos alimentícios têm demonstrado
eficiência de compostos flavonóides como antioxidantes. A quercetina, ramnetina,
canferol, rutina e quercitrina têm sido reconhecidos como os mais efetivos
antioxidantes dentre os flavonóides. A quercetina apresentou efetiva inibição da
oxidação catalisada por cobre em gordura suína e em produtos lácteos
desidratados. O composto identificado como 2”(3”)-O-glicosilisovetexina, um C-
glicosil flavonóide, que foi isolado de folhas verdes da cevada. Este composto
apresentou atividade antioxidante quase equivalente ao α-tocoferol (MELO;
GUERRA, 2002).
20
FIGURA 2- Estrutura básica e tipo de flavonóides (fonte: MARTINÉZ-FLORES et al., 2002).
2.3.2 Taninos
Os taninos possuem o peso molecular relativamente alto, constituem uma
classe de polifenóis e, segundo a estrutura química, são classificados em taninos
hidrolisáveis e taninos condensáveis (WANASUNDARA; AMAROWICZ; SHAHIDI,
1994).
Os taninos condensáveis, denominados proantocianidinas, são oligômeros e
polímeros de flavan-3-ol (catequina) e/ou flavan-3,4-diol (leucocianidina), produtos
do metabolismo do fenilpropanol (figura 3). As proantocianidinas, assim
denominadas, provavelmente pelo fato de apresentarem pigmentos avermelhados
da classe das antocianidinas, como cianidina e delfinidina, apresentam uma rica
diversidade estrutural, resultante de padrões de substituições entre unidades
21
flavânicas, diversidade de posições entre suas ligações e estereoquímica de seus
compostos (OSZMIANSKI et al., 2007).
Os taninos podem formar complexos insolúveis com carboidratos e proteínas,
inclusive as proteínas salivares, sendo esta a razão de sua característica
adstringente ao paladar. Um composto de especial interesse no que diz respeito à
capacidade antioxidante é o ácido tânico (AT), que demonstrou possuir efeito em
reações oxidativas mediadas por íons metálicos (LOPES; SCHULMAN; HERMES-
LIMA, 1999).
.
FIGURA 3- Estrutura química de flavan-3-ol e flavan-3,4-diol (fonte: ANGELO; JORGE, 2007).
2.3.3 Ácidos fenólicos
Os ácidos fenólicos caracterizam-se por terem um anel benzênico, um
grupamento carboxílico e um ou mais grupamentos de hidroxila e/ou metoxila na
molécula, conferindo propriedades antioxidantes para os vegetais (SOARES, 2002).
22
Os ácidos fenólicos consistem em dois grupos, derivados do ácido
hidroxibenzóico e derivados do ácido hidroxicinâmico. Os ácidos hidroxibenzóicos
incluem os ácidos gálico, p-hidroxi-benzóico, סּ-hidroxi-benzóico, gentísico,
protocatéquico, vanílico e siríngico, que têm estrutura comum, C
6
–C
1
(BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006) enquanto os ácidos
hidroxicinâmicos, são compostos aromáticos com três carbonos que formam uma
cadeia lateral (C
6
–C
3
), como os ácidos caféico, ferúlico, p-cumárico e sinápico,
sendo os mais comuns (BRAVO, 1998). Nas plantas usualmente ocorrem na forma
de ésteres os quais podem ser ambos solúveis (acumulando-se em vacúolos) ou
insolúveis (componentes da parede celular) (MAAS; GALLETTA, 1991).
Os ácidos sinápico, ferúlico e p-cumárico são antioxidantes mais ativos do
que os derivados do ácido benzóico, tais como ácido protocatéquico, siríngico e
vanílico (BALASUNDRAM; SUNDRAM; SAMMAN, 2006). Isso se deve à dupla
ligação presente na molécula dos derivados do ácido cinâmico, que participa da
estabilidade do radical por ressonância de deslocamento do elétron
desemparelhado, enquanto os derivados do ácido benzóico não apresentam essa
característica (MANCINI-FILHO et al., 2003).
Os representantes mais importantes dos ácidos hidroxicinâmicos em cevada
são o ácido caféico (AC) e o ácido ferúlico (AF) estando também presentes no café,
grãos de cereais e em diversas frutas.
FIGURA 4- Estrutura química dos ácidos hidroxibenzóicos (a) e hidroxicinâmicos (b) (fonte: ANGELO;
JORGE, 2007).
23
2.4 Radicais livres e estresse oxidativo
Os radicais livres são classificados como moléculas orgânicas e inorgânicas e
átomos que contêm um ou mais elétrons não pareados. (HALLIWELL, 1994;
BIANCHI; ANTUNES, 1999). Essa configuração faz dos radicais livres moléculas
altamente instáveis, com meia vida curta e quimicamente muito reativas. A presença
dos mesmos é crítica para a manutenção de muitas funções fisiológicas normais
(POMPELLA, 1997).
A produção de radicais livres é controlada nos seres vivos por diversos
compostos antioxidantes, os quais podem ter origem endógena (por exemplo,
superóxido dismutase), ou são provenientes da dieta alimentar e outras fontes.
Destas últimas destacam-se tocoferóis (vitamina E), ácido ascórbico (vitamina C),
polifenóis, selênio e carotenóides. Quando ocorre limitação na disponibilidade de
antioxidantes, podem ocorrer lesões oxidativas de caráter cumulativo. Os
antioxidantes são as substâncias capazes de estabilizar ou desativar os radicais
livres antes que os mesmos ataquem os alvos biológicos nas células (SOUSA et al.,
2007)
Estes podem ser então classificados como substâncias que quando presentes
em baixas concentrações, comparadas ao substrato oxidável, retardam
significativamente ou inibem a oxidação do substrato. Os radicais então formados a
partir deles não são reativos para propagar a reação em cadeia, sendo neutralizados
por reação com outro radical, formando produtos estáveis que podem ser reciclados
por outro antioxidante (SOUSA et al., 2007).
Os mesmos podem ser gerados no citoplasma, nas mitocôndrias ou na
membrana e o seu alvo celular (proteínas, lipídeos, carboidratos e DNA) está
relacionado com o seu sítio de formação (ANDERSON, 1996; YU; ANDERSON,
1997). Entre as principais formas reativas de oxigênio o O
2
apresenta uma baixa
capacidade de oxidação, o -OH mostra uma pequena capacidade de difusão e é o
mais reativo na indução de lesões nas moléculas celulares. O H
2
O
2
não é
considerado um radical livre verdadeiro, mas é capaz de atravessar a membrana
nuclear e induzir danos na molécula de DNA por meio de reações enzimáticas
(ANDERSON, 1996).
24
A formação de radicais livres in vivo ocorre via ação catalítica de enzimas,
durante os processos de transferência de elétrons que ocorrem no metabolismo
celular e pela exposição a fatores exógenos, tais como medicamentos, dieta, fumo,
radiações gama e ultravioleta, entre outros. Contudo, na condição de pró-oxidante a
concentração desses radicais pode aumentar devido à maior geração intracelular ou
pela deficiência dos mecanismos antioxidantes (CERUTTI, 1991, 1994). O
desequilíbrio entre moléculas oxidantes e antioxidantes que resulta na indução de
danos celulares pelos radicais livres tem sido chamado de estresse oxidativo (SIES,
1993).
O estresse oxidativo é uma condição celular ou fisiológica de elevada
concentração de espécies reativas de oxigênio (ROS) e espécies reativas de
nitrogênio (RNS), que causa danos moleculares às estruturas celulares, com
consequente alteração funcional e prejuízo das funções vitais, em diversos tecidos e
órgãos, tais como músculo, fígado, tecidos adiposo, vascular e cerebral. O efeito
deletério do estresse oxidativo, no entanto, varia consideravelmente de um ser vivo
para outro, de acordo com a idade, estado fisiológico e dieta (VANCINI, 2005).
Hábitos de vida inapropriados tais como, fumo, álcool, dieta inadequada,
condições ambientais impróprias como a exposição à radiação não ionizante UV e
ondas curtas, poluição, alta umidade relativa e temperatura alta, estados
psicológicos associados a um elevado estresse emocional, envelhecimento, e o
exercício físico exaustivo, também estão associados ao estresse oxidativo
(VANCINI, 2005).
2.5 Compostos fenólicos em cevada
A identificação e quantificação dos níveis de compostos fenólicos em cevada
é a etapa inicial de qualquer investigação de funcionalidade fisiológica para posterior
estímulo ao consumo desse cereal, bem como sua utilização com fins
farmacológicos e a nível industrial. A capacidade redutora dos compostos presentes
pode ser uma das propriedades utilizadas para nortear a quantificação inicial, porém,
a presença de carboidratos e outros interferentes, requer metodologias confiáveis
para tais avaliações. Para esse estudo o método analítico baseado na cromatografia
25
líquida de alta eficiência (HPLC) em fase reversa com detecção UV-Vis a 254nm foi
utilizado na detecção dos compostos fenólicos em grãos de cevada e o método de
Folin-Ciocalteu na quantificação dos fenólicos totais presentes, visando uma
comparação frente ao método anterior na quantificação dos fenólicos identificados.
Essas metodologias são utilizadas na quantificação e identificação dos
compostos fenólicos presentes em diferentes alimentos, como mostra a tabela 1.
TABELA 1- Conteúdo de polifenóis em diferentes alimentos. (Dados expressos em mg/100g do
produto).
Flavonóides FT
Flavanóis
Produtos AF FLAVONÓIS CATEQ PROCIAN FLAVANO FLAVONAS ANTO HPLC FC
Vegetais
batata 14 14 28,5
tomate 8 0,5 8 37
alface 8 1 9 23
cebola 35 35 90
Frutas
maçã 5,5 3,5 10,5 100 119,5 220
cereja 74 2 6 70 400 552 552
Outros
alimentos
trigo 500 500 500
chocolate 80 510 840
cevada 1-8 1-42 2-45 75-156
Bebidas
suco de
laranja 22 22 75
vinho tinto 9,6 1,6 27,2 36 3,2 77,6 180
café 75 75 89,5
chá preto 4 65 69 100
Legenda: AF (ácidos fenólicos), CATEQ (catequinas), PROCIAN (procianidinas), FLAVANO
(flavanonas), ANTO (antocianidinas), FT (fenólicos totais), HPLC (quantificação por cromatografia
líquida), FC (quantificação por Folin-Ciocalteu). Fonte: Adaptado de RAMÍREZ, 2005.
26
2.5.1 Rutina
A rutina (3-O-rutinosídeo-quercetina - figura 5) é um composto fenólico
pertencente, a classe dos flavonóis, sendo tradicionalmente empregada como
potente antioxidante, na prevenção ou tratamento da insuficiência venosa ou linfática
e da fragilidade ou permeabilidade capilar, e também na prevenção aos danos
causados pela radiação ultravioleta (BRUNETON, 1991; GUARDIA et al., 2001).
Recentemente, a permeabilidade cutânea da rutina foi estudada in vitro em
células de difusão vertical, empregando como modelo alternativo de biomembrana a
muda de pele de Crotalus durissus. Neste estudo, a rutina foi veiculada em um
sistema emulsionado e, partindo-se dos resultados, o flavonóide não apresentou
tendência para a absorção cutânea em um período de 52 horas de experimento.
Portanto, foi possível interpretar que a atividade do flavonóide é exercida na
superfície ou nas camadas superficiais da pele, atuando topicamente, ação essa
desejada para os filtros solares químicos. Esse perfil de comportamento da rutina
quanto à ação tópica também foi observado para sua aglicona (BABY, 2007; BABY
et al., 2008).
A suplementação nutricional com rutina tem demonstrado também um
importante papel na prevenção da aterosclerose, segundo um estudo conduzido por
Rodrigues et al. (2003), pois induziu a uma elevação significativa da lipoproteína de
alta densidade (HDL-colesterol) de 35,82 ± 2,31mg/dL para 44,40 ± 3,11mg/dL.
Neste estudo, foi possível demonstrar que os efeitos benéficos da rutina, com
elevação do colesterol-HDL e diminuição dos fatores de risco para a aterosclerose e
doença cardiovascular (DCV), estão associados à elevação na atividade da enzima
antioxidante superóxido-dismutase. Foi evidente a atuação da rutina como ativadora
desta importante enzima antioxidante.
A rutina tem sido considerada também um antilipoperoxidante, pois pode
neutralizar radicais hidroxil e superóxido (METODIEWA; KOCHMAN; KAROLCZAK,
1997). Segundo relataram Cotelle et al. (1992), comparando o efeito do α-tocoferol,
do ácido ascórbico e da rutina no processo de peroxidação, a rutina é o mais potente
inibidor de radicais livres.
27
FIGURA 5- Estrutura química da rutina (fonte: PubChem Publi Chemical Database).
2.5.2 Ácido Caféico
Dentre os ácidos hidroxicinâmicos, aquele mais comumente encontrado e de
maior representatividade na dieta é o ácido caféico (AC), composto sensível ao calor
(DIMBERG et al.,1996) e produzido a partir da L-fenilalanina ou L-tirosina.
Os estudos acerca dos efeitos fisiológicos do AC (figura 6) incluem relatos
sobre a sua capacidade de atuar como anti-inflamatório (CHEN; TSAI; WU, 1995),
inibidor da xantina oxidase (CHIANG; LO; LU, 1994), ligante metálico (NARDINI et
al., 1995) e como agente protetor contra citotoxicicidade induzida por peróxido de
hidrogênio (NAKAYAMA, 1994).
Estudos com AC em sistemas lipídicos indicaram um potencial deste polifenol
em atenuar na oxidação de lipoproteínas de baixa densidade (CASTELLUCIO et al.,
1995; 1996) e mesmo inibir a oxidação de LDL catalisada por íons metálicos
(NARDINI et al., 1995).
28
FIGURA 6- Estrutura química do ácido caféico (fonte: PubChem Publi Chemical Database).
2.5.3 Ácido Ferúlico
O ácido ferúlico (AF) é um polifenol natural pertencente à classe dos ácidos
hidrocixinâmicos, extraído de grãos de alguns cereais como o arroz e a cevada o
qual exerce efeito antioxidante, hipotensivo e anti-inflamatório de acordo com alguns
estudos publicados na literatura (YAGI; OHISHI, 1979; HIRABAYASHI et al., 1995;
UCHIDA et al.,1996; SUZUKI et al., 2002).
Segundo Fujita et al. (2008) o ácido ferúlico (figura 7) pode exercer também
um efeito benéfico na prevenção da neuropatia diabética em ratos, efeito esse muito
mais exacerbado quando comparado ao do α-tocoferol. De acordo com os autores,
isso pode ser possível em função do efeito exercido pelo mesmo na redução do
stress oxidativo gerado por este processo.
29
FIGURA 7- Estrutura química do ácido ferúlico (fonte: PubChem Publi Chemical Database).
2.5.4 Miricetina
A miricetina (5,7,3’,4’,5’-penta-OH - figura 8) é um flavonóide pertencente à
classe dos flavonóis, sendo encontrado em frutas, vegetais, ervas, bem como em
outras plantas e apresenta um caráter antioxidante mais efetivo que a quercitina,
vitamina C e vitamina E (SOUSA; SILVA, 2005). É comumente encontrada na forma
de glicosídeos, tal como miricetina.
In vitro, estudos sugerem que miricetina em altas concentrações, pode
modificar o LDL-colesterol, bem como aumentar os leucócitos sangüíneos. O
consumo de altas concentrações em ratos, segundo Knekt et al. (2002), foi
correlacionado com baixos níveis de câncer de próstata.
Um estudo conduzido durante oito anos por Nöthlings et al. (2007), verificou
que três flavonóis dentre eles o canferol, quercitina e miricetina reduziram o risco de
câncer pancreático em 23%.
30
FIGURA 8- Estrutura química da miricetina (fonte: PubChem Publi Chemical Database).
2.5.5 Quercitrina
A quercitrina (3-O-ram-quercetina - figura 7) é um flavonóide pertencente à
classe dos flavonóis, a qual segundo Meyre-Silva et al. (2001), apresenta potente
atividade analgésica frente ao teste do ácido acético, sendo esta ação dose
dependente.
Estudos têm mostrado também sua ação como anti-inflamatório (FERMIN et
al.,1996), hipotensivo (NOVOA et al., 1985) e antiviral contra o vírus do herpes
(MUSCI; GYULAI; BELADI, 1992).
31
FIGURA 9- Estrutura química da quercitrina (fonte: PubChem Publi Chemical Database).
2.6 Métodos analíticos utilizados para a determinação de compostos fenólicos
2.6.1 Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC)
A Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (HPLC) é uma técnica de
separação que, em menos de trinta anos, passou a ser um dos métodos analíticos
mais utilizados para fins qualitativos e quantitativos. As razões para este
crescimento estão relacionadas à sua adaptabilidade para determinações
quantitativas com boa sensibilidade, a possibilidade de separar espécies não
voláteis e termicamente instáveis, com destaque para a indústria farmacêutica, bem
como as suas aplicações em determinações ambientais e em muitos outros campos
da ciência, como o da medicina (TONHI et al., 2002).
A cromatografia líquida de alta eficiência (abreviatura em inglês HPLC) usa
pressões elevadas para forçar a passagem do solvente através de colunas fechadas
que contêm partículas muito finas capazes de proporcionar separações muito
eficientes (HARRIS, 2005).
32
Os dispositivos de HPLC consistem em um sistema de distribuição de
solvente, uma válvula de injeção de amostra, uma coluna de alta pressão, um
detector e um computador para controlar o sistema e apresentar os resultados.
Sistemas de cromatografia líquida de alta eficiência em fase reversa (RP-
HPLC) consistem de uma fase estacionária de menor polaridade e uma fase móvel
de maior polaridade, enquanto que a fase normal tem as polaridades invertidas.
Estas fases apresentam várias vantagens, tais como: uso de fases móveis menos
tóxicas e de menor custo, como metanol e água; fases estacionárias estáveis de
muitos tipos diferentes; rápido equilíbrio da coluna após a mudança da fase móvel;
facilidade de empregar eluição por gradiente; maior rapidez em análises e boa
reprodutibilidade dos tempos de retenção. Além disso, são muito aplicadas à
separação de solutos de diferentes polaridades, massas molares e funcionalidades
químicas (TONHI et al., 2002).
Detectores de ultravioleta que usam célula de fluxo são os mais utilizados em
HPLC, pois muitos solutos absorvem radiação ultravioleta. A maioria dos
instrumentos possui lâmpada de deutério, xenônio ou tungstênio e um
monocromador, de modo que possibilita a escolha de um ou mais comprimentos de
onda, no ultravioleta ou no visível, mais adequado para o analito em questão.
Em grãos, essa técnica de separação tem sido utilizada com o propósito de
se quantificar polifenóis em cultivares de café (MENDONÇA et al., 2007; VIGNOLI;
BASSOLI, 2007), na identificação de polifenóis em cevada e cerveja (WHITTLE et
al., 1999), na determinação de antioxidantes no trigo sarraceno (DANILA et al., 2007)
entre outros.
2.6.2 Método de Folin-Ciocalteu
A quantificação espectrométrica de compostos fenólicos é realizada por meio
de uma variedade de técnicas, todavia, a que utiliza o reagente de Folin-Ciocalteu
figura entre as mais extensivamente utilizadas (HOU et al., 2003; NACZK; SHAHIDI,
2004; BONOLI et al., 2004; OMONI; ALUKO, 2005; ROGINSKY; LISSI, 2005;
SOUSA et al., 2007;).
33
Atualmente esse método tem sido utilizado para mensurar a capacidade
antioxidante de uma amostra o que aparentemente pode não estar refletido na sua
característica de “ensaio de fenóis total”. Porém, um crescente número de
publicações está aplicando o ensaio de fenóis total e um ensaio baseado na
transferência de elétrons (exemplos: TEAC, FRAP, etc.) encontrando entre estes
excelentes correlações lineares entre o perfil de fenóis total e a atividade
antioxidante. Esta correlação está presente devido à similaridade química presente
entre estes ensaios (TOMEI; SALVADOR, 2007).
O reagente de Folin-Ciocalteu consiste da mistura dos ácidos fosfomolibídico
e fosfotunguístico, no qual o molibdênio e o tungstênio encontram-se no estado de
oxidação 6
+
porém, em presença de certos agentes redutores, como os compostos
fenólicos, formam-se os chamados molibdênio azul e tungstênio azul, nos quais a
média do estado de oxidação dos metais está entre 5 e 6 e cuja coloração permite a
determinação da concentração das substâncias redutoras, que não necessariamente
possuam natureza fenólica (IKAWA et al., 2003; NACZK; SHAHIDI, 2004; .SOUSA
et al., 2007). Conseqüentemente, essa reação não é específica para taninos. Uma
forma de contornar essa falta de especificidade é retirando os taninos do meio
mediante adsorção com substratos protéicos (VERZA et al., 2007).
34
3 ARTIGOS CIENTÍFICOS
35
ARTIGO 1
(Configuração conforme normas da Revista Química Nova - Anexo 1)
Otimização na determinação de compostos polifenólicos em grãos de cevada
por cromatografia líquida de alta eficiência com detecção UV
Optimization of the determination polyphenolic compounds in grains of barley by high
performance liquid chromatography with UV detection
Resumo
Objetivo: Este estudo teve como objetivo a determinação dos compostos
polifenólicos presentes em grãos de cevada por cromatografia líquida de alta
eficiência em fase reversa (RP-HPLC) com detecção UV, a partir da otimização das
condições experimentais. Metodologia: Foi utilizada a cultivar de cevada MN 743
ano 2006. Determinadas concentrações de farinha de cevada foram misturadas em
diferentes solventes para comparação das extrações. Resultados: O método de
extração ultra-sônico durante 30 minutos utilizando solvente hidroetanólico e
etanólico provou ser o mais adequado e eficiente. O polifenólicos encontrados
foram: rutina, ácido caféico, ácido ferúlico e quercitrina. Conclusão: O método
cromatográfico é um passo fundamental na classificação das variedades de cevada
Brasileira.
Palavras-chave: antioxidantes, Hordeum vulgare L., HPLC.
36
Abstract
Objective: This study aimed at determining the polyphenolic compounds present in
barley grains by high performance liquid chromatography in reversed phase (RP-
HPLC) with UV detection, from optimization of experimental conditions.
Methodology: We used to grow barley NM 743 year 2006. Certain concentrations of
barley meal were mixed in different solvents to compare the extractions. Results:
The method of ultrasonic extraction for 30 minutes using hydroethanolic and ethanol
solvent proved to be the most appropriate and efficient. The polyphenolic were: rutin,
caffeic acid, ferulic acid and quercitrin. Conclusion: The chromatographic method is
a crucial step in the classification of Brazilian varieties of barley.
Key words: antioxidants, Hordeum vulgare L., HPLC.
37
INTRODUÇÃO
Os grãos de cereais contribuem com quantidades significativas de energia,
proteína, minerais e vitaminas na dieta humana, e representam a maioria dos
alimentos consumidos e contribuem para a saúde e nutrição humana.
Os cereais de importância primária econômica incluem o trigo, milho, arroz,
cevada, aveia, sorgo e centeio. Estudos recentes têm mostrado que os mesmos
contêm uma larga variedade de substâncias biologicamente ativas, incluindo
antioxidantes, fibra alimentar, fitosteróis e lignanas
1
.
A cevada é considerada uma cultura milenar e foi muito difundida no passado,
sendo classificada como o quarto cereal mais cultivado no mundo. É basicamente
utilizada pela indústria cervejeira e na alimentação animal, e tem sido muito
consumida em países como Rússia, Canadá, Estados Unidos da América e outros
países como um “alimento funcional”, rico em fibra alimentar, constituído
principalmente por fibra solúvel, da qual as β-glucanas são os constituintes
principais, estando associadas à redução do risco de doenças cardíacas
2
.
Atualmente, muitos compostos fenólicos têm sido identificados e quantificados
em variedades de cevada (Hordeum vulgare L.) e alguns já foram isolados
3
. Dentre
eles pode-se citar os ácidos hidroxibenzóico e hidroxicinâmico, como formas livres e
como ésteres glicosídicos. O ácido trans-ferúlico tem sido o composto encontrado
em maior quantidade, seguido dos ácidos p-cumarínico e vanílico, também
identificados
4,5
.
Esses compostos estão principalmente presentes na camada de aleurona e
no endosperma do grão. Já os ésteres de glicosídios foram detectados na casca,
tegumento da semente e nas células da aleurona
6
.
Para quantificar e identificar os flavonóides tem sido usado a Cromatografia
Líquida de Alta Eficiência
7,8
(HPLC), os quais podem ser analisados em fase reversa
utilizando um detector UV ajustado em um determinado comprimento de onda.
Esse estudo teve por objetivo determinar os compostos fenólicos presentes
em grãos da cultivar de cevada MN 743 por HPLC, decorrente de uma otimização
das condições experimentais, visando o melhor solvente, concentração do extrato e
o melhor processo extrativo para a análise. O método validado será utilizado no
decorrer do estudo para a identificação e quantificação de compostos fenólicos em
38
grãos de cevada recomendadas para cultivo no Brasil, utilizando os métodos
analíticos de Folin-Ciocalteu e Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em fase
reversa (RP-HPLC) com detecção UV-Vis, visando à comparação entre essas
metodologias.
MATERIAL E MÉTODOS
Grãos de cevada
Utilizou-se na otimização do método, a cultivar de cevada MN 743 do ano de
2006. A partir da metodologia validada, visando à quantificação e identificação dos
polifenólicos, foram utilizadas as cultivares MN 743 de 2005 e 2006 e BRS Lagoa de
2005 e 2006. As amostras foram fornecidas pelo Centro de Pesquisa da
Embrapa/Trigo de Passo Fundo e cultivadas no município de Ibiaçá/Rio Grande do
Sul.
Preparo da amostra
Foram pesados 1,0 g, 2,5 g e 3,0 g de farinha de cevada integral para se
verificar qual seria a melhor concentração do extrato, sendo os grãos previamente
secos em estufa a 55º C e moídos em micro-moinho a 27.000 rpm, a fim de se obter
tamanho de partículas (<1mm) apropriadas.
A farinha de cevada foi misturada em água, etanol, etanol-água (50:50, 80:20,
95:5 v/v), metanol, metanol-água (50:50, 80:20, 95:5 v/v), hexano (5 mL) e acetona
(5 mL). A otimização das condições experimentais (tabela 1) foi realizada visando
identificar qual seria a melhor solução extratora e o melhor processo extrativo. As
soluções foram levadas ao banho ultra-sônico, à temperatura ambiente (25ºC ± 1),
pelos tempos 15, 30, 45, 60, 90, 120 e 150 minutos. Sob maceração, a amostra
permaneceu por 5, 7, 10 e 14 dias. Sob refluxo por 1 hora em temperatura de 80º C
39
e sob agitação mecânica por 60, 120, 360 e 1440 minutos. Após esses
procedimentos, as soluções foram filtradas em papel filtro para a remoção do
resíduo. As amostras que foram misturadas em hexano e em acetona, após a
filtração, foram evaporadas e redissolvidas em metanol. Após esses procedimentos
os extratos foram filtrados em membranas de acetato de celulose de 0,45 µm e
posteriormente foram analisados por HPLC (figura 1).
Solvente
Remoção do resíduo
sólido
FIGURA 1- Esquema de operação e processo analítico empregado no estudo.
Reagentes
Acetonitrila (CH
3
CN) (Vetec®) foi usado no preparo da fase móvel. A água
usada nas análises cromatográficas foi a Milli-Q. Etanol, metanol grau analítico
(Vetec®), hexano e acetona, foram usados no preparo dos extratos. Rutina, ácido
ferúlico, ácido caféico, miricetina e quercetrina dihidratada (Sigma®), em soluções
contendo 5,0, 10,0, 15,0 mg/L em metanol foram utilizados como padrões externos.
Método extrativo
Filtração (1)
Extrato
de cevada
Grãos de cevada
moídos
Filtração (2)
0,45µm
Análise HPLC
Análise
Espectrofotométrica
(Folin-Ciocalteu)
Adição das soluções
de carbonato e Folin
Incubação/1 hora
40
Foram também utilizados o reagente de Folin-Ciocalteu (Merck) e padrão de ácido
gálico (Sigma®).
TABELA 1- Otimização das condições experimentais dos métodos de extração utilizados na análise
de compostos fenólicos em cevada.
Método de
extração
Solvente usado Temperatura Tempo de extração
Sonicação Etanol, metanol, água, hexano,
acetona e combinações de
água:etanol e água:metanol
25º C 15, 30, 45, 60, 90,
120, 150 minutos
Maceração Etanol, metanol, água, hexano,
acetona e combinações de
água:etanol e água:metanol
25º C 5, 7, 10, 14 dias
Sob refluxo Etanol, metanol, água, hexano,
acetona e combinações de
água:etanol e água:metanol
80
0
C 1 hora
Agitação mecânica Etanol 25º C 60, 120, 360, 1440 minutos
Cromatógrafo líquido e condições experimentais
As análises foram realizadas em cromatógrafo líquido, modelo Dionex,
acoplado com detector UV – Vis (UVD 170U). O software Chromeleon, versão 6.70,
foi usado para registrar os cromatogramas e medir as áreas dos picos. A separação
dos flavonóides foi executada usando uma coluna C18 (4,6 mm x 150 mm x 5 μm).
Os solventes foram desgazeificados em banho ultrassônico (Ultrasonic Cleaner
Unique). A cromatografia foi realizada à temperatura de 25°C ±1°C. A eluição foi
realizada com acetonitrila 30%: água 70%, pH ajustado em 4,0 ± 0,5 com H
3
PO
4
, em
vazão de 0,5 mL/min. Alíquotas de 20 μL das amostras foram injetadas em duplicata
com seringa Hamilton de 1 mL e a detecção dos picos foi registrada a 254 nm. O
tempo de análise foi de 40 minutos.
41
Determinação espectrofotométrica dos fenólicos totais
A determinação do teor de fenóis totais presentes nas amostras de extrato
hidroetanólico das espécies estudadas foi realizada pelo método de Folin-Ciocalteu,
com modificações
10
. As medidas de absorção foram realizadas por meio de
espectroscopia na região do visível utilizando espectrofotômetro Hewlett Packard
(HP) UV-VIS com arranjo de diodos.
O extrato de cevada (100 µL) foi transferido quantitativamente para um tubo
de ensaio no qual foi adicionado 2,5 mL do reagente de Folin-Ciocalteu diluído em
água destilada (1:10). Após 5 minutos foram adicionados 2 mL de solução aquosa
de carbonato de sódio (7,5%). Após 1 h, a absorbância das amostras foi medida a
740 nm utilizando-se cubetas de vidro, tendo como "branco" etanol: água (80%, v/v)
e todos os reagentes, menos o extrato.
O teor de fenóis totais (FT) foi determinado por interpolação da absorbância
das amostras contra uma curva de calibração construída com padrões de ácido
gálico (0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 0,9 mg/mL) e expressa como mg de ácido gálico por g
de cevada (mg AG/g). A equação da curva de calibração do ácido gálico foi C =
1,7833A+0,0523, onde C é a concentração do ácido gálico, A é a absorbância a 740
nm e o coeficiente de correlação R = 0,9999. Todas as análises foram realizadas em
triplicata.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Com relação à concentração do extrato, observou-se que extratos mais
concentrados obtiveram picos cromatográficos mal resolvidos e os polifenóis
coeluiram durante a análise. O extrato de cevada a 12,5% (m/v) mostrou-se o mais
adequado durante a otimizacão. Quanto aos solventes, observou-se uma maior
extração dos compostos fenólicos nos solventes metanol e etanol, principalmente da
rutina. Os solventes hexano e acetona não se mostraram adequados na extração
dos fenólicos em cevada. Observou-se também que a água, quando associada ao
42
metanol ou etanol, aumentou significativamente a extração do flavonóide rutina,
evidenciando também uma separação do ácido caféico.
Dos métodos extrativos, o banho ultra-sônico (30 minutos), à temperatura
ambiente, foi o que apresentou os melhores perfis cromatográficos com relação aos
demais métodos. A exposição do extrato a altas temperaturas e o exaustivo
processo extrativo pode ter ocasionado uma possível oxidação dos compostos
fenólicos no extrato de cevada dos outros métodos de extração avaliados.
Durante todo o processo, observou-se que os extratos hidroetanólico (80%, v/
v) e etanólico (100%) foram os que apresentaram os melhores resultados quando
comparados aos outros solventes utilizados, e que a sonicação, no tempo de 30 min,
foi o processo extrativo que demonstrou os melhores perfis cromatográficos.
Em extrato etanólico 100%, foram identificados e quantificados os compostos
polifenólicos rutina (81,70 mg/kg), seguida da quercitrina (28,10 mg/kg) e do ácido
ferúlico (11,30 mg/kg), com tempos de retenção de 5,49 minutos, 7,46 minutos e
8,27 minutos, respectivamente. Na figura 2 pode-se observar o perfil cromatográfico
característico da cultivar de cevada MN 743 de 2006 em um extrato etanólico
sonicado por 30 minutos.
-5
0
5
10
15
20
0 10 20 30 40 50
FIGURA 2- Cromatograma típico de um extrato etanólico (100%) da cultivar MN 743 ano 2006 a 20%
(m/v). Condições cromatográficas: coluna de separação C18 (4,6 mm x 150 mm x 5 μm), temperatura
de análise 25°C ±1°C, fase móvel: acetonitrila 30%: água 70%, pH 4,0 ± 0,5 (H
3
PO
4
), vazão 0,5 ml
min
-1
, detecção: UV em 254 nm.
Rutina
Quercitrina
Ácido ferúlico
43
Na análise cromatográfica do extrato hidroetanólico, foi identificada e
quantificada a rutina (101,93 mg/kg) como um dos principais compostos polifenólicos
da cultivar MN 743 de 2006, seguida do ácido caféico (50,54 mg/kg) com tempo de
retenção médio de 4,57 minutos para a rutina e 5,24 minutos para o ácido caféico
(figura 3). Não foram identificados nesse extrato o ácido ferúlico, comumente
encontrado em estudos com cevada
6,9
e a quercitrina, ambos identificados e
quantificados no extrato etanólico de cevada.
0
20
40
60
80
100
120
0 5 10 15 20
FIGURA 3- Cromatograma típico do extrato hidroetanólico (80%, v/v) da cultivar MN 743 ano 2006 a
12,5% (m/v). Condições cromatográficas: coluna de separação C18 (4,6 mm x 150 mm x 5 μm),
temperatura de análise 25°C ±1°C, fase móvel: acetonitrila 30%: água 70%, pH 4,0 ± 0,5 (H
3
PO
4
),
vazão 0,5 ml min
-1
, detecção: UV em 254 nm.
Diante desses resultados, extratos elaborados com 12,5% (m/v) de farinha de
cevada em extrato hidroetanólico (80%, v/v) das cultivares MN 743 e BRS Lagoa de
2005 e BRS Lagoa de 2006, identificaram e quantificaram os compostos fenólicos
rutina e ácido caféico em concentrações que variaram de 48,67 a 334,52 mg/kg de
rutina, 3,11 a 50,54 mg/kg de ácido caféico. O ácido ferúlico foi identificado e
quantificado somente no extrato hidroetanólico da cultivar BRS Lagoa de 2006 em
uma concentração de 0,77 mg/kg. Os fenólicos totais, realizado pelo método de
Rutina
Ácido caféico
44
Folin-Ciocalteu, apresentaram conteúdos de 982,08 a 1564,37mg/kg (mg de ácido
gálico por kg de cevada), conforme resultados observados na tabela 2.
A análise percentual dos fenólicos totais quantificados pelo método de Folin-
Ciocalteu e compostos fenólicos quantificados por HPLC, variou em concentração
entre o ano de cultivo e entre as espécies. Entre as cultivares BRS Lagoa e MN 743
de 2005, o percentual dos polifenólicos identificados (rutina e ácido caféico) foi de
6% (90,88 mg/kg) e 25% (360,59%) entre os fenóis totais quantificados pelo método
de Folin-Ciocalteu. Já nas cultivares BRS Lagoa e MN 743 de 2006, o conteúdo
encontrado foi de 5% (52,55 mg/kg) e 16% (152,47 mg/kg) dos compostos rutina,
ácido caféico e ácido ferúlico. Conforme observado na figura 4, os compostos
fenólicos diferiram em quantidades entre as cultivares de diferentes safras,
diferenciando assim as espécies. A comparação das duas metodologias (HPLC e
Folin-Ciocalteu) permitiu então a diferenciação das cultivares da mesma espécie e
de diferentes anos de cultivo.
Cabe ressaltar que o conteúdo de polifenólicos em relação aos fenóis totais
entre as cultivares teria seu conteúdo modificado tendo em vista a identificação de
outros compostos que porventura não foram detectados e quantificados pela
metodologia de detecção estudada e/ou pelo método extrativo. Compostos fenólicos
são instáveis e facilmente oxidáveis. Os derivados do ácido cinâmico podem se
isomerizar em solução aquosa sob influência de luz UV
11
.
TABELA 2- Compostos fenólicos (CF) detectados e quantificados nas cultivares de cevada por RP-
HPLC e por Folin-Ciocalteu (espectrofotometria) em extrato hidroetanólico de cevada (80%, v/v).
Cultivares
Quantificação por
espectrofotometria
(mg/kg)
Rutina
(mg/kg)
Ácido
Caféico
(mg/kg)
Ácido
Ferúlico
(mg/kg)
Σ CF por
HPLC
(mg/kg)
BRS LAGOA
(2005)
1564,37 76,35 14,57 nd* 90,88
MN 743 (2005) 1427,38 334,52 26,07 nd 360,59
BRS LAGOA
(2006)
1025,28 48,67 3,11 0,77 52,55
MN 743 (2006) 982,08 101,93 50,54 nd 152,47
Legenda: Σ CF (somatório dos compostos fenólicos rutina, ácido caféico e ácido ferúlico
quantificados por HPLC).
45
Cultivar BRS Lagoa 2005
6%
94%
% Polifenólicos % Fenóis Totais
Cultivar BRS Lagoa 2006
5%
95%
% Polifenólicos % Fenóis Totais
Cultivar MN 743 2005
25%
75%
% Polifenólicos % Fenóis Totais
Cultivar MN 743 2006
16%
84%
% Polifenólicos % Fenóis Totais
FIGURA 4- Percentuais de compostos fenólicos identificados (rutina, ácido caféico, ácido ferúlico) por
HPLC e quantificados por Folin-Ciocalteu entre as cultivares MN 743 e BRS Lagoa dos anos de 2005
e 2006.
CONCLUSÃO
O método analítico de RP-HPLC consistiu um sistema eficiente para a
separação de compostos fenólicos em extrato de cevada. O método de extração
ultra-sônico e os solventes etanólico e hidroetanólico, ambos aplicados neste
estudo, mostraram-se adequados e eficientes para a análise do extrato de cevada.
No extrato etanólico foram identificados os polifenóis rutina, ácido ferúlico e
quercitrina (MN 743 2006) e no extrato hidroetanólico rutina, ácido caféico e ácido
ferúlico (BRS Lagoa 2006) em diferentes concentrações entre as cultivares, sendo a
rutina o composto fenólico mais quantificado.
O solvente hidroetanólico (80%, v/v) foi o escolhido na avaliação das
variedades de cevada pela maior extração de polifenólicos e pela sua baixa
toxicidade diante dos demais solventes. Os polifenólicos rutina, ácido caféico e ácido
46
ferúlico foram os compostos identificados por HPLC, e quantificados em maior
concentração na MN 743 de 2005 totalizando 360,59 mg/kg de cevada.
Pelo método de Folin-Ciocalteu o maior conteúdo de fenólicos foi detectado
na BRS Lagoa de 2005 totalizando 1564,37 mg/kg de cevada.
A HPLC e o método de Folin-Ciocalteu, mostraram-se adequados na
diferenciação das cultivares da mesma espécie e de diferentes safras em grãos de
diferentes variedades de cevada Brasileira.
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Food and Agriculture, v. 79, n. 12, p.1625-1634, 1999.
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47
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heterosídicos. In: SIMÕES, C. M. O. et al (Org.). Farmacognosia: da planta ao
medicamento. 5 ed. Porto Alegre/Florianópolis: UFRGS/UFSC, 2004. cap. 20,
p.519-535.
48
ARTIGO 2
(Configuracão conforme normas do Journal of Chromatography Science - Anexo 2).
Compostos polifenólicos em extratos hidroetanólicos de cultivares de cevada
Brasileira
Polyphenolic compounds in the extracts hydroethanolics of Brazilian barley cultivars
Resumo
O objetivo deste estudo foi de identificar e quantificar compostos polifenólicos
em extratos hidroetanólicos de grãos de diferentes variedades de cevada brasileira
pelo sistema de cromatografia líquida de alta eficiência (HPLC) com detecção UV-
VIS e também, quantificar em paralelo, os fenóis totais pelo método de Folin-
Ciocalteu. Os compostos fenólicos identificados foram a rutina, o ácido caféico, o
ácido ferúlico e a miricetina, com concentrações variando entre 26,41-420,50,
3,61-74,04, 0,48-7,78 e 0,20-5,86, expressos em mg/kg, respectivamente. O
conteúdo de fenóis totais variou de 752,50-1564,37mg/kg entre as diferentes
variedades. Os métodos utilizados permitiram uma diferenciação química das
cultivares com relação à presença de compostos polifenólicos.
Palavras- chave: antioxidantes, Folin-Ciocalteu, Hordeum vulgare L., HPLC.
49
Abstract
This study aimed to identify and quantify polyphenolic compounds in
hydroethanolics extracts of grains of different Brazilian varieties of barley by the
system of high performance liquid chromatography (HPLC) with UV-VIS detection
and also to quantify in parallel, the total phenols by the method Folin-Ciocalteu. The
phenolic compounds identified were the rutin, the caffeic acid, ferulic acid and the
myricetin, with concentrations ranging from 26,41-420,50, 3,61-74,04, 0,48-7,78 and
0,20-5.86, expressed as mg/kg, respectively. The content of total phenols ranged
from 752,50-1564,37 mg/kg among different varieties. The methods used have a
chemical differentiation of cultivars with respect to the presence of polyphenolic
compounds.
Key words: antioxidants, Folin-Ciocalteu, Hordeum vulgare L., HPLC.
50
Introdução
A cevada é uma gramínea amplamente distribuída e cultivada com fins
alimentícios, sendo um cereal de grande importância econômica e por esta razão, a
mesma tem sido alvo de estudos sob diferentes pontos.
Atualmente, a análise do conteúdo de fenólicos (flavonóides e ácidos
hidroxicinâmicos) tem sido descritas em pesquisas com cevada e malte, com relação
à atividade antioxidante dos mesmos. O ácido ferúlico e o p-cumárico têm sido
identificados como os mais encontrados nas diferentes variedades [5].
Esses constituintes têm sido considerados como a mais importante fonte de
antioxidantes em cereais, existindo tanto na forma livre como também na forma
conjugada. A maioria dos fenólicos livres encontrados em cevada são flavonóis, ao
passo que dos fenólicos conjugados são principalmente os ácidos fenólicos [1,7].
Muitas propriedades têm sido associadas com a presença de compostos
fenólicos em plantas, as quais são essenciais para o desenvolvimento da planta e
por atuarem como importante mecanismo de defesa. Esses compostos presentes
em uma dieta normal podem ser benéficos para a saúde humana por reduzir a
incidência de câncer e doenças cardiovasculares [2,6]. Eles podem também ser
empregados em alimentos processados como antioxidantes naturais de maneira a
prevenir a peroxidação lipídica, considerada uma das causas de deterioração de
alimentos [3-4].
Os alimentos que contêm altas concentrações de substâncias prooxidantes
(como metais de transição, proteína heme) e grandes quantidades de ácidos graxos
poliinsaturados, são facilmente atacados pelos radicais livres e sofrem oxidação, a
qual pode causar rancidez, diminuindo a aceitabilidade e reduzindo o valor
nutricional do alimento. Por esse motivo, para prevenir ou retardar a oxidação
lipídica, antioxidantes sintéticos como o butil-hidroxi-anisol (BHA) e butil-hidroxi-
tolueno (BHT) são geralmente empregados pela indústria de alimentos como
conservadores. A substituição dos antioxidantes sintéticos por extratos de plantas
como fonte de antioxidantes naturais é uma preocupação para a saúde pública e
objeto de vários projetos de pesquisa [3-4].
Dessa forma e considerando a importância dos compostos polifenólicos como
antioxidantes naturais, o presente trabalho teve como objetivo a sua determinação
51
pelos métodos de Folin-Ciocalteu e por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência em
fase reversa (RP-HPLC) com detecção UV-VIS em extrato hidroetanólico de
cultivares de cevada recomendadas para cultivo no Brasil.
Experimento
Material utilizado
Nesse estudo foram utilizados grãos integrais de cevada, recomendadas pela
Comissão Nacional de Cevada, provenientes do Centro de Pesquisas da Empresa
Brasileira de Pesquisa Agropecuária (Embrapa), Passo Fundo, do ano agrícola de
2005, cultivadas no Município de Ibiaçá/ Rio Grande do Sul (RS). As cultivares
analisadas foram: Embrapa 128, MN 716, PFC 99199, BRS Marciana, BRS Lagoa,
BRS Mariana, BRS 225, BRS 195, MN 743, PFC 200048, Embrapa 127, MN 698,
BRS Borema, MN 721, MN 610 e PFC 2001052.
A região de plantio localiza-se a uma latitude de 28°03’25’’ e a uma longitude
51°51’17’’ oeste, estando a uma altitude de 620m. A semeadura foi realizada,
mecanicamente sob plantio direto, em Latossolo Vermelho distrófico, no mês de
junho e a colheita em outubro de 2005. A adubação foi realizada de acordo com a
análise química do solo, utilizando-se 250 kg de adubo da fórmula 5-25-20 de NPK
(Nitrogênio, Fósforo e Potássio). O controle de pragas e doenças foi realizado
sempre que necessário. A colheita foi mecanizada e, os grãos foram submetidos à
secagem para redução do teor de umidade em torno de 13% e, em seguida, foi
realizada a limpeza para remoção de impurezas.
Preparação da amostra e extração dos compostos polifenólicos em cevada
Os grãos previamente secos a 55º
C foram triturados em micro-moinho a
27.000 rpm, a fim de se reduzir o tamanho de partículas (<1mm). Logo após este
52
processamento, as amostras foram armazenadas em sacos plásticos, devidamente
identificadas, sob congelamento até o processamento extrativo.
Os extratos foram preparados em uma concentração de 12,5% (m/v) de
farinha de cevada misturada em uma solução hidroetanólica (80%, v/v). Esta
condição experimental, previamente validada pelos autores [8], mostrou que o
solvente extrator hidroetanólico (80%, v/v) e o extrato a 12,5% (m/v), teve um
significante impacto na extração de polifenólicos em cevada, bem como uma baixa
toxicidade, sendo assim utilizado nesse estudo.
A mistura foi então sonicada durante 30 minutos à temperatura ambiente,
filtrada em filtro de papel 12,5 mm e em filtro de acetato de celulose 0,45 µm. Os
extratos foram mantidos a 5
o
C até o momento da análise.
Validação do método
A identificação e quantificação dos compostos fenólicos em cevada foi
realizada após a validação de um método que possibilitasse a determinação
simultânea de oito compostos polifenólicos (rutina, ácido caféico, quercitrina, ácido
ferúlico, miricetina, resveratrol, quercetina e canferol) por cromatografia líquida de
fase reversa (RP-HPLC).
A otimização das condições experimentais para a análise cromatográfica foi
realizada em coluna C-18 e detecção UV em 254 nm. Nas condições experimentais
testaram-se diversas proporções dos eluentes acetonitrila, água e metanol, vazão da
fase móvel (de 1,0 mL/min até 0,5 mL/min) e o pH (de 2,0-7,0).
Durante o processo de validação, verificou-se que a combinação de 70% de
água e 30% de acetonitrila com pH ajustado em 4,0 e vazão de 0,5 mL/min, foi a que
resultou na melhor resolução dos picos cromatográficos e evitou a coeluição dos
picos dos compostos fenólicos mais polares.
Os tempos de retenção obtidos foram de 4,45 min para a rutina; 5,16 min para
o ácido caféico; 5,97 min para a quercitrina; 7,30 min para o ácido ferúlico; 9,25 min
para miricetina; 12,86 min para resveratrol; 16,82 min para quercetina e 32,78 min
para canferol. Os limites de detecção e quantificação (em mg/L) foram: rutina:
0,2909 e 0,9698; ácido caféico: 0,1938 e 0,6458; quercitrina: 0,2057 e 0,6856; ácido
53
ferúlico: 0,2695 e 0,8983; miricetina: 0,1851 e 0,6169; resveratrol: 0,7151 e 2,3837;
quercetina: 0,1522 e 0,5073; canferol: 0,2406 e 0,8020, respectivamente.
O método apresentou repetibilidade superior a 92% e uma taxa de
recuperação de 85,7-107,1%. O tempo de análise aceitável do ponto de vista
analítico para a identificação de todos os flavonóides analisados foi de 40 minutos.
Cromatógrafo líquido e condições experimentais
As análises foram realizadas em cromatógrafo líquido, modelo Dionex,
acoplado com detector UV – VIS (UVD 170U). O software Chromeleon, versão 6.70,
foi usado para registrar os cromatogramas e medir as áreas dos picos. A separação
dos flavonóides foi executada usando uma coluna C18 (4,6 mm x 150 mm x 5 μm).
Os solventes foram desgazeificados em banho ultrassônico (Ultrasonic Cleaner
Unique). A cromatografia foi realizada à temperatura de 25°C ±1°C. A eluição foi
realizada com acetonitrila 30%: água 70%, pH ajustado em 4,0 ± 0,5 com H
3
PO
4
, em
vazão de 0,5 mL/min. Alíquotas de 20 μL das amostras foram injetadas em duplicata
com seringa Hamilton de 1 mL. O tempo de análise foi otimizado em 15 minutos, em
virtude da identificação dos compostos fenólicos de interesse durante esse tempo.
Na identificação dos compostos fenólicos, adicionou-se ao extrato de cevada
uma mistura dos padrões em uma concentração de 20 mg/L, sendo cada composto
então identificado a partir da correlação do seu tempo de retenção com o do padrão
adicionado.
Para a quantificação dos teores dos compostos fenólicos por RP-HPLC,
utilizaram-se as áreas dos picos dos compostos detectados a 254 nm, com as áreas
dos picos dos padrões injetados em três diferentes concentrações (5,0, 10,0 e 15,0
mg/L).
54
Determinação espectrofotométrica dos fenólicos totais
A determinação do teor de fenóis totais presentes nas amostras de extrato
hidroetanólico das espécies estudadas foi realizada pelo método de Folin-Ciocalteu,
com modificações [9]. As medidas de absorção foram realizadas por meio de
espectroscopia na região do visível utilizando espectrofotômetro Hewlett Packard
(HP) UV-VIS com arranjo de diodos.
O extrato de cevada (100 µL) foi transferido quantitativamente para um tubo
de ensaio no qual foi adicionado 2,5 mL do reagente de Folin diluído em água
destilada (1:10). Após 5 minutos foram adicionados 2 mL de solução aquosa de
carbonato de sódio (7,5%). Após 1 h, a absorbância das amostras foi medida a 740
nm utilizando-se cubetas de vidro, tendo como "branco" etanol: água (80%, v/v) e
todos os reagentes, menos o extrato.
O teor de fenóis totais (FT) foi determinado por interpolação da absorbância
das amostras contra uma curva de calibração construída com padrões de ácido
gálico (0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 0,9 mg/mL) e expressa como mg de ácido gálico por g
de cevada (mg AG/g). A equação da curva de calibração do ácido gálico foi C =
1,7833A+0,0523, onde C é a concentração do ácido gálico, A é a absorbância a 740
nm e o coeficiente de correlação R = 0,9999. Todas as análises foram realizadas em
triplicata.
Resultados e discussão
A partir dos tempos de retenção quando comparados com os cromatogramas
dos padrões comerciais, foram identificados os seguintes compostos: a) flavonóis:
rutina e miricetina; b) ácidos hidroxicinâmicos: caféico e ferúlico. A ordem de eluição
foi: rutina<ácido caféico<ácido ferúlico<miricetina.
Entre as cultivares, observou-se que a quantidade de rutina variou de 10,76
mg/kg na cultivar BRS Borema a 420,50mg/kg na cultivar Embrapa 128. A
concentração de ácido caféico variou de 3,62 mg/kg na cultivar MN 610 a 74,04 mg/
kg na cultivar MN 721. Já o conteúdo de ácido ferúlico variou de 0,48 mg/kg na
55
cultivar MN 610 a 7,78 mg/kg na cultivar BRS Mariana e de miricetina entre 0,21 mg/
kg na cultivar MN 721 a 5,86 mg/kg na cultivar BRS 225 (tabela 1).
TABELA 1- Relação dos compostos fenólicos quantificados e identificados em extrato hidroetanólico
de cevada safra 2005 pelos métodos de Folin-Ciocalteu e HPLC (*nd: composto não detectado).
Cultivar FT
(mg/kg)
RUT
(mg/kg)
AC
(mg/kg)
AF
(mg/kg)
MIR
(mg/kg)
Σ POLIFEN
(mg/kg)
BRS 195 1483,16 26,41 35,59 nd* nd 61,84
BRS Lagoa 1564,37 76,35 14,57 nd nd 90,88
BRS Borema 752,50 10,76 51,84 nd nd 62,53
BRS Mariana 1396,75 78,89 nd 7,78 nd 86,59
BRS Marciana 1019,03 14,69 56,33 5,18 1,91 78,16
BRS 225 1008,26 33,41 4,27 5,72 5,86 49,10
MN 721 1156,00 89,12 74,04 5,34 0,21 168,71
MN 716 1186,45 193,98 29,46 nd nd 223,44
MN 743 1427,38 334,52 26,07 nd nd 360,59
MN 698 1137,83 120,59 47,98 2,58 1,47 171,12
MN 610 1084,19 80,00 3,62 0,48 4,74 88,84
PFC 200048 908,13 nd 25,26 0,78 2,33 28,37
PFC 99199 936,24 nd 36,88 nd nd 36,88
PFC 2001052 1337,55 419,00 37,72 nd nd 456,72
Embrapa 127 1072,19 12,48 38,50 nd nd 50,98
Embrapa 128 1121,80 420,50 14,64 nd nd 435,14
Legenda: FT (fenólicos totais quantificados por Folin-Ciocalteu); RUT (rutina); AC (ácido caféico); AF
(ácido ferúlico); MIR (miricetina); Σ POLIFEN (somatório dos polifenólicos rutina, ácido caféico, ácido
ferúlico e miricetina quantificados por HPLC).
Na quantificação dos fenóis totais pelo método de Folin-Ciocalteu, foi
observado um menor teor na cultivar BRS Borema de 752,50 mg/kg (0,75 mg/g) e
um maior teor na MN 743 de 1564,37 mg/kg (1,56 mg/g). Esses resultados estão de
acordo com o encontrado em variedades de cevada e malte, registrado em 0,93 a
1,14 mg/g [10], mostrando assim uma correlação positiva com o conteúdo
encontrado.
Com relação ao conteúdo de polifenólicos quantificados por HPLC, a cultivar
PFC 200048 apresentou o menor conteúdo (28,37 mg/kg - 3%) em relação às
demais cultivares. Em contrapartida na Embrapa 128 esse percentual atingiu 39%
(435,14 mg/kg) de polifenóis. Na figura 1 observa-se o cromatograma típico dessas
cultivares.
56
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Figura 1 Cromatograma típico do extrato hidroetanólico (80%, v/v) de cevada (12,5%, m/v).
Condições cromatográficas: coluna de separação C18 (4,6 mm x 150 mm x 5 μm), temperatura de
análise 25°C ±1°C, fase móvel: acetonitrila 30%: água 70%, pH 4,0 ± 0,5 (H
3
PO
4
), vazão 0,5 ml min
-1
,
detecção: UV em 254 nm. (a) Cultivar PFC 200048 (b) Cultivar Embrapa 128.
Ácido caféico
Ácido ferúlico
Miricetina
Rutina
Ácido caféico
(a)
(b)
57
O conteúdo de polifenólicos em relação aos fenóis totais (figura 2) entre as
cultivares teria seu conteúdo modificado tendo em vista a identificação de outros
compostos que porventura não foram detectados e quantificados pela metodologia
de detecção estudada e/ou pelo método extrativo. Compostos fenólicos são
instáveis e facilmente oxidáveis. Os derivados do ácido cinâmico podem se
isomerizar em solução aquosa sob influência de luz UV [11].
Cultivar PFC 200048 - Percentual de polifenólicos
entre fenóis totais
3%
97%
% Polifenólicos % Fenóis Totais
Cultivar Embrapa 128 - Percentual de polifenólicos
entre fenóis totais
39%
61%
% Polifenólicos % Fenóis Totais
Figura 2 Teores em percentual dos polifenólicos rutina, ácido caféico, ácido ferúlico e miricetina
quantificados por HPLC e fenóis totais quantificados por Folin-Ciocalteu nas cultivares PFC 200048 e
Embrapa 128.
Conclusão
O método de HPLC utilizado no estudo dos compostos fenólicos contidos em
grãos de cultivares de cevada permitiu a identificação dos polifenólicos rutina, ácido
caféico, ácido ferúlico e miricetina em concentrações que variaram de 28,37 a
456,72 mg de polifenólicos/kg de cevada, sendo as cultivares PFC 200048 e PFC
2001052 as que exibiram valores extremos quantificados por HPLC. A rutina foi o
composto fenólico identificado e quantificado em maior quantidade por HPLC, com
exceção das cultivares BRS 195, BRS Borema, BRS Marciana, PFC 200048, PFC
99199 e Embrapa 127, as quais exibiram uma maior concentração do ácido caféico.
O método de Folin-Ciocalteu quantificou os fenóis totais entre as cultivares
com valores entre 752,50 a 1564,37 mg de ácido gálico/kg de cevada, sendo as
58
cultivares BRS Borema e BRS Lagoa as variedades que quantificaram valores
extremos de fenóis totais de 752,50 e 1564,37 mg/kg de cevada, respectivamente.
A partir da metodologia aplicada, pode-se proceder a diferenciação química
entre as espécies avaliadas. No entanto, sugere-se a utilização de outras
metodologias de detecção e extração visando à identificação de outros compostos
que porventura não foram detectados.
Referências Bibliográficas
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p.519-535.
60
ARTIGO 3
(Configuracão conforme normas da Revista Ciência Rural - Anexo 3).
Avaliação de fatores climáticos na concentração de polifenólicos em grãos de
cevada
Assessment of climatic factors in the concentration of polyphenolic in grain of barley
Resumo:
Este trabalho teve como objetivo quantificar os compostos fenólicos em
extrato hidroetanólico de grãos de duas cultivares de cevada (BRS Lagoa e MN 743)
em dois anos consecutivos de cultivo (2005 e 2006), avaliando a influência dos
fatores climáticos nesse conteúdo. Os compostos fenólicos totais foram
quantificados pelo método de Folin-Ciocalteu e os teores de rutina e ácidos caféico e
ferúlico por HPLC em fase reversa. Os resultados mostraram que o conteúdo de
fenóis totais pelo método de Folin Ciocalteu variou de 0,98 a 1,56 mg/g de cevada e
que fatores climáticos durante o período de plantio e colheita influenciaram no
conteúdo dos polifenóis. Os compostos fenólicos identificados nessas cultivares
foram a rutina que variou de 48,67 a 334,52 mg/kg entre as cultivares, o ácido
caféico variando de 3,11 a 50,54 mg/kg e o ácido ferúlico, quantificado somente na
BRS Lagoa (2006) em uma concentração de 0,77 mg/kg. A avaliação dos fatores
climáticos no conteúdo de compostos fenólicos em cevada é de grande interesse
visando sua importância nutricional e recomendação de cultivares com conteúdos
expressivos de compostos bioativos.
Palavras-chave: condições climáticas, Folin-Ciocalteu, HPLC.
61
Abstract:
This study aimed to quantify the phenolic compounds in hydroethanolic extract
of grains of two cultivars of barley (BRS Lagoa and NM 743) in two consecutive
years of cultivation (2005 and 2006), assessing the influence of climatic factors such
content. The total phenolic compounds were quantified using the Folin-Ciocalteu and
the content of rutin and caffeic acid and ferulic reverse-phase HPLC. The results
showed that the content of total phenols using the Folin-Ciocalteu ranged from 0.98
to 1.56 mg/g for barley and that climatic factors during the planting and harvesting
influenced the content of polyphenols. The phenolic compounds identified in these
cultivars were rutin that ranged from 48.67 to 334.52 mg/kg among cultivars, the
caffeic acid ranging from 3.11 to 50.54 mg/kg and ferulic acid, measured only in BRS
Lagoa (2006) in a concentration of 0.77 mg/kg. The assessment of the climatic
factors in the content of phenolic compounds in barley is of great interest seeking
their nutritional importance and recommendations of cultivars with expressive content
of bioactive compounds.
Key words: weather conditions, Folin-Ciocalteu, HPLC.
62
INTRODUÇÃO
Atualmente, evidências indicam os radicais livres e outros oxidantes como
grandes responsáveis por doenças degenerativas associadas ao envelhecimento,
câncer, doenças cardiovasculares, entre outros. Todavia, estudos demonstram que
o consumo de substâncias antioxidantes naturais na dieta diária pode produzir uma
ação protetora efetiva contra os processos oxidativos gerados por esses compostos
(DEGÁSPARI; WASZCZYNSKYJ, 2004).
Das diversas classes de substâncias antioxidantes de ocorrência natural, os
compostos fenólicos têm recebido muita atenção nos últimos anos, sobretudo por
inibirem a peroxidação lipídica e a lipooxigenase in vitro (HASLAM, 1996; SOARES,
2002). Estes se enquadram em diversas categorias, como fenóis simples, ácidos
fenólicos (derivados dos ácidos benzóico e cinâmico), cumarinas, flavonóides,
estilbenos, taninos condensados e hidrolisáveis, lignanas e ligninas (NASCK;
SHAHIDI, 2004).
A inibição da peroxidação lipídica e a lipooxigenase desempenhadas por
esses compostos, tem um papel importante na neutralização ou no seqüestro de
radicais livres e na quelação de metais de transição, agindo tanto na etapa de
iniciação como na propagação do processo oxidativo. Os intermediários formados
pela ação dos antioxidantes fenólicos são relativamente estáveis, devido à
ressonância do anel aromático presente na estrutura destas substâncias (SOUSA et
al., 2007).
Em grãos de cevada têm sido identificados derivados dos ácidos
hidroxibenzóico e hidroxicinâmico, como o ácido trans-ferúlico, encontrado em maior
quantidade no grão, seguido dos ácidos p-cumarínico e vanílico (MC MURROUGH
et al., 1992; SHAHIDI; NACZK, 2003). Os mesmos são conhecidos por atuarem
como antioxidantes primários na recepção de radicais livres e interrompendo a
reação em cadeia e encontram-se presentes na camada de aleurona e no
endosperma do grão (GOUPY et al., 1999).
Em pesquisas recentes, foram identificados e quantificados em diferentes
cultivares de cevada brasileira os compostos polifenólicos rutina, ácido caféico,
ácido ferúlico e quercitrina (BEZERRA et al., 2008) por cromatografia líquida de alta
eficiência (HPLC). Conforme reportado por HIRABAYASHI et al. (1995); CHEN et al.
63
(1995); KNEKT et al. (2002) e RODRIGUES et al. (2003), estes compostos têm
exercido efeito cardioprotetor, hipolipídico, hipotensivo, antiviral e anti-inflamatório.
Dessa forma, como parte do estudo sobre a identificação e quantificação dos
compostos polifenólicos em cevada e considerando a importância desses compostos
como antioxidantes naturais, o presente trabalho teve como objetivo avaliar a
influência das condições climáticas (temperatura média anual, índice pluviométrico e
insolação) entre as épocas de plantio e colheita na quantificação dos polifenóis pelos
métodos de Folin-Ciocalteu e HPLC em extrato hidroetanólico de duas variedades
de cevada cultivadas nos anos agrícolas de 2005 e 2006, recomendadas para
cultivo no Brasil: MN 743 e BRS Lagoa,
MATERIAL E MÉTODOS
Foram utilizados grãos integrais de cevada (BRS Lagoa e MN 743)
provenientes do Centro de Pesquisas da Empresa Brasileira de Pesquisa
Agropecuária (Embrapa), Passo Fundo, do ano agrícola de 2005 e 2006, cultivadas
no Município de Ibiaçá/ Rio Grande do Sul (RS).
A região localiza-se a uma latitude de 28°03’25’’ e a uma longitude 51°51’17’’
oeste, estando a uma altitude de 620m. A semeadura foi realizada, mecanicamente
sob plantio direto, em Latossolo Vermelho distrófico, no mês de junho e a colheita
em outubro. A adubação foi realizada de acordo com a análise química do solo,
utilizando-se 250 kg de adubo da fórmula 5-25-20 de NPK (Nitrogênio, Fósforo e
Potássio). O controle de pragas e doenças foi realizado sempre que necessário. A
colheita foi mecanizada e, os grãos foram submetidos à secagem em estufa com
ventilação a 55º C, para redução do teor de umidade em torno de 13% e, em
seguida, foi realizada a limpeza para remoção de impurezas.
Os grãos, previamente secos, foram triturados em micro-moinho a 27.000
rpm, a fim de se obter tamanho de partículas (<1mm) apropriadas para as análises.
Logo após este procedimento, as amostras foram armazenadas em sacos plásticos,
devidamente identificadas, sob congelamento até o processo extrativo.
Para o preparo dos extratos foram utilizados como solvente água destilada e
etanol 95% grau analítico. Acetonitrila (CH
3
CN) (Vetec®) foi usada no preparo da
64
fase móvel. A água usada nas análises cromatográficas foi água Milli-Q. Rutina,
ácido ferúlico, ácido caféico, miricetina e quercitrina dihidratada (Sigma®), em
soluções contendo 5,0, 10,0, 15,0 mg/L em metanol foram utilizados como padrões
externos. O reagente de Folin-Ciocalteu foi adquirido da Merck e o ácido gálico da
Vetec®.
Os extratos foram preparados em concentrações de 12,5% (m/v) de farinha
de cevada misturada em uma solução hidroetanólica (80%, v/v). A mistura foi
sonicada durante 30 minutos à temperatura ambiente, filtrada em filtro de papel
12,5mm e em filtro de acetato de celulose 0,45µm. Os extratos foram mantidos a
5ºC até o momento da análise. Esta condição experimental foi previamente validada
(BEZERRA et al., 2008).
A determinação de fenóis totais foi realizada pelo método de Folin-Ciocalteu,
segundo SOUSA et al. (2007), com modificações. As medidas de absorção foram
realizadas por meio de espectroscopia na região do visível utilizando
espectrofotômetro Hewlett Packard (HP) UV-Vis com arranjo de diodos. O extrato de
cevada (100 µL) foi transferido quantitativamente para um tubo de ensaio no qual foi
adicionado 2,5 mL do reagente de Folin-Ciocalteu diluído em água destilada (1:10).
Após 5 minutos foram adicionados 2 mL de solução aquosa de carbonato de sódio
(7,5%). Após 1 h, a absorbância das amostras foi medida a 740 nm utilizando-se
cubetas de vidro, tendo como "branco" etanol: água (80%, v/v) e todos os reagentes,
menos o extrato.
O teor de fenóis totais (FT) foi determinado por interpolação da absorbância
das amostras contra uma curva de calibração construída com padrões de ácido
gálico (0,075, 0,15, 0,3, 0,6, 0,9 mg/mL) e expressa como mg de ácido gálico (AG)
por grama de cevada. A equação da curva de calibração do ácido gálico foi C =
1,7833A+0,0523, onde C é a concentração do ácido gálico, A é a absorbância a 740
nm e o coeficiente de correlação R = 0,9999. Todas as análises foram realizadas em
triplicata.
As análises de identificação e quantificação foram realizadas em
cromatógrafo líquido, modelo Dionex, acoplado com detector UV–Vis (UVD 170U). O
software Chromeleon, versão 1997, foi usado para registrar os cromatogramas e
medir as áreas dos picos. A separação dos flavonóides foi executada usando uma
coluna C18 (4,6 mm x 150 mm x 5 μm). Os solventes foram desgazeificados em
banho ultrassônico (Ultrasonic Cleaner Unique). A cromatografia foi realizada à
65
temperatura de 25°C ±1°C. A eluição foi realizada com acetonitrila 30%: água 70%,
pH ajustado em 4,0 ± 0,5 com H
3
PO
4
, num fluxo de 0,5 mL/min. Alíquotas de 20 μL
das amostras foram injetadas com seringa Hamilton de 1 mL e a detecção dos picos
foi registrada em 254 nm. O tempo de análise foi otimizado em 15 minutos.
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Nas cultivares analisadas, o menor teor de fenóis totais (FT) foi registrado no
extrato hidroetanólico (hidroEtOH) da cultivar MN 743 de 2006 (982,08 mg/kg de
cevada) e o maior teor, no extrato hidroEtOH da cultivar BRS Lagoa 2005 (1564,37
mg/kg de cevada). Com relação aos polifenólicos pode-se identificar e quantificar por
HPLC os seguintes compostos nesta ordem de eluição: rutina<ácido caféico<ácido
ferúlico (tabela 1).
TABELA 1- Fenólicos totais expressos em mg de ácido gálico por kg de cevada e polifenólicos
identificados expressos em mg por kg de cevada (*nd:não detectado).
Cultivares FT
(mg/kg)
RUT
(mg/kg)
AC
(mg/kg)
AF
(mg/kg)
BRS LAGOA (2005) 1564,37 76,35 14,57 nd*
BRS LAGOA (2006) 1025,28 48,67 3,11 0,77
MN 743 (2005) 1427,38 334,52 26,07 nd
MN 743 (2006) 982,08 101,93 50,54 nd
Legenda: FT (fenóis totais quatificados por Folin-Ciocalteu), RUT (rutina), AC (ácido caféico), AF
(ácido ferúlico).
O maior teor de rutina foi registrado na cultivar MN 743 do ano de 2005 em
uma concentração de 334,52 mg/kg de cevada, sendo o menor teor registrado na
cultivar BRS Lagoa de 2006 com 48,67 mg/kg de cevada. O ácido caféico foi
quantificado em maior quantidade na cultivar MN 743 de 2006 com 50,54 mg/kg e o
menor teor registrado na cultivar BRS Lagoa de 2006 com 3,11 mg/kg. Já o ácido
66
ferúlico foi quantificado somente na cultivar BRS Lagoa (2006) em uma
concentração de 0,77 mg/kg. De acordo com CARVALHO; GOSMANN; SCHENKEL
(2004), os compostos fenólicos são instáveis e facilmente oxidáveis e podem se
isomerizar em solução aquosa sob influência de luz UV. Esse fato pode explicar a
razão da não detecção e da baixa quantificação do ácido ferúlico nas cultivares,
tendo em vista que, este seria o composto encontrado em maior quantidade em
grãos de cevada (MAILLARD et al., 1996).
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0 5 10 15 20
Figura 1- Cromatograma típico do extrato hidroetanólico (80%, v/v) de cevada (12,5%, m/v). Condições
cromatográficas: coluna de separação C18 (4,6 mm x 150 mm x 5 μm), temperatura de análise 25°C ±1°C,
fase móvel: acetonitrila 30%: água 70%, pH 4,0 ± 0,5 (H
3
PO
4
), vazão 0,5 ml min
-1
, detecção: UV em 254
nm. (a) Cultivar BRS Lagoa 2005 (b) Cultivar BRS Lagoa 2006 (c) Cultivar MN 743 2005 (d) Cultivar MN
743 2006.
(a)
(b)
Rutina
Rutina
Ácido caféico
Ácido caféico
Ácido ferúlico
(c)
(d)
Rutina
Ácido caféico
Rutina
Ácido caféico
67
Os dados disponibilizados pela EMBRAPA/TRIGO (2008) de Passo Fundo/RS
(tabela 2), mostram que nos anos de 2005 e 2006, a insolação em horas durante a
época do plantio e colheita da cevada (junho a outubro) foi de 839 horas em 2005 e
de 982,6 horas em 2006. A precipitação pluvial foi de 1029,7 mm em 2005 e 655,3
mm em 2006 e a temperatura média de 14,58º
C em 2005 e de 15,48º
C em 2006.
TABELA 2- Temperatura media anual, precipitação pluvial e insolação nos anos de 2005 e 2006.
Temperatura média (
o
C) Precipitação pluvial (mm) Insolação (horas)
Ano
Meses
2005 2006 2005 2006 2005 2006
Junho 15,6 14,3 273,1 167,5 130,2 169,6
Julho 11,9 14,6 83,7 147,9 216,4 181,4
Agosto 14,9 14 135,4 132,2 187,1 209,4
Setembro 12,6 14,8 152,7 112,8 142,6 192,6
Outubro 17,9 19,7 384,8 94,9 162,7 229,6
Total 1029,7 655,3 839 982,6
Média 14,58 15,48
Fonte: EMBRAPA/TRIGO, Passo Fundo, Rio Grande do Sul.
Com relação à variação química de plantas da mesma espécie, parâmetros
como clima, radiação solar, nutrição mineral, entre outros, podem interferir no
conteúdo de praticamente todas as classes de metabólitos secundários como os
flavonóides e ácidos fenólicos, conforme reportado por SANTOS & BLATT (1998).
As baixas temperaturas têm influências significantes nos níveis de metabólitos
secundários e uma correlação positiva tem sido relatada entre a intensidade e a
duração do frio imposto à mudas de milho (Zea mays) e a abundância de
antocianinas e mRNA (CHRISTIE et al., 1994). A cevada é uma gramínea
cerealífera típica de clima frio (KENDALL, 1994), que se adapta bem em
temperaturas extremas (STEPHEN & EISENDRATH, 1986) e de acordo com os
resultados encontrados no presente trabalho, apresentou uma maior concentração
de fenóis totais entre variedades de cevada cultivadas em temperatura média em
torno de 14,58º
C (figura 2).
As plantas frequentemente são capazes de existir em uma considerável faixa
de temperatura, devido ao processo de adaptação da espécie ao seu habitat. A faixa
em que ocorrem as variações anuais, mensais e diárias na temperatura é um dos
fatores que exerce maior influência em seu desenvolvimento, afetando, portanto, a
68
produção de metabólitos secundários. No entanto, pelo fato da temperatura ser, de
modo geral, uma conseqüência de outros fatores, como altitude e sazonalidade, não
existem muitos estudos sobre sua influência isoladamente na produção de
metabólitos secundários (GOBBO-NETO & LOPES, 2007).
FIGURA 2- Temperatura e teor de fenóis totais quantificados por Folin-Ciocalteu entre as variedades
de cevada.
Com relação à radiação ultravioleta, existe uma correlação positiva bem,
estabelecida entre intensidade de radiação solar e produção de compostos fenólicos
(WATERMAN & MOLE, 1994), tais como taninos (DUSTIN & COOPER-DRIVER,
1992; DUDT & SHURE, 1994), antocianinas (PARÉ & TUMLINSON, 1997; GRACE
et al., 1998; JEONG et al., 2004), flavonóides (MARKHAM et al., 1998; CUADRA et
al., 1997; TATTINI
et al., 2004), e isso pode ser explicado, principalmente no caso de
flavonóides e fenilpropanóides correlatos, pela proteção contra a foto destruição
proporcionada por estes metabólitos ao absorver e/ou dissipar a energia solar,
dificultando assim a danificação dos tecidos mais internos pela radiação UV-B
(WATERMAN & MOLE,1994; ÅLENIUS et al.,1995; GRACE & LOGAN, 2000). Esse
fato, no entanto, não se aplica aos taninos e compostos fenólicos simples, os quais
BRS LAGOA (2005) MN 743 (2005) BRS LAGOA (2006) MN 743 (2006)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
14
14,2
14,4
14,6
14,8
15
15,2
15,4
15,6
Temperatura e teor de fenóis totais
Fenóis totais (mg/kg)
Temperatura média (oC)
Cultivares
Fenóis
69
têm absorção máxima em comprimentos de onda consideravelmente mais curtos
que os da UV-B, conforme reportado por WATERMAN & MOLE (1994). Nas
variedades de cevada, avaliadas no presente trabalho, uma maior insolação (982,6
horas) recebida pela planta durante os períodos de plantio e colheita, refletiu em
uma menor concentração de fenóis totais, enquanto que uma menor insolação (839
horas) exibiu uma maior concentração de fenóis totais quantificados por Folin-
Ciocalteu entre as variedades. (figura 3).
FIGURA 3- Insolação e teor de fenóis totais quantificados por Folin-Ciocalteu entre as variedades de
cevada.
Os efeitos da chuva na vegetação também devem ser considerados visto que,
conforme observado em estudos com Hypericum perforatum, houve um aumento
significativo na concentração de flavonóides, hipericinas e ácido clorogênico nas
flores sob condições de estresse hídrico; porém, com um decréscimo na
concentração de hiperforinas (GRAY et al., 2003).
O estresse hídrico frequentemente tem consequências significantes nas
concentrações de metabólitos secundários em plantas, e há vários relatos de que
BRS LAGOA (2005) MN 743 (2005) BRS LAGOA (2006) MN 743 (2006)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
750
800
850
900
950
1000
Insolação e teor de fenóis totais
Fenóis totais (mg/kg)
Insolação (horas)
Cultivares
Fenóis totais
70
estas condições geralmente levam a um aumento na produção de vários tipos de
metabólitos secundários (GERSHENZON, 1984), como glicosídeos cianogênicos,
glucosinolatos (BLUA et al.,1988), alguns terpenóides (LOKAR et al., 1987),
antocianinas (JUNG et al., 2004) alcalóides (HÖFT et al., 1993; BRISKE & CAMP,
1982). Com relação aos metabólitos fenólicos, estudos realizados apresentam
resultados conflitantes e parece não ser possível estabelecer uma correlação clara
entre sua concentração e estresse osmótico (GOBBO-NETO & NETO, 2007). Nesse
trabalho, foi observado que no ano de maior índice pluviométrico, houve uma maior
concentração de rutina (334,52 e 76,35 mg/kg) entre as cultivares MN 743 e BRS
Lagoa e de fenóis totais quantificados por Folin-Ciocalteu (1427,38 e 1564,37 mg/kg)
(figura 4).
FIGURA 4- Índice pluviométrico e teor de fenóis totais quantificados por Folin-Ciocalteu entre as
variedades de cevada.
BRS LAGOA (2005) MN 743 (2005) BRS LAGOA (2006) MN 743 (2006)
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
1,6
1,8
0
200
400
600
800
1000
1200
Índice pluviométrico e teor de fenóis totais
Fenóis totais (mg/kg)
Índice pluviométrico
(mm)
Cultivares
Fenóis totais
71
CONCLUSÕES
Considerando os resultados descritos pela literatura e os observados nesse
trabalho, conclui-se que, uma menor incidência solar, maior índice pluviométrico e
uma menor temperatura média, observados entre as épocas de plantio e colheita da
cevada do ano de 2005, foram considerados fatores favoráveis no aumento do
conteúdo de fenóis totais quantificados pelo método de Folin-Ciocalteu e do
composto fenólico rutina nas cultivares de cevada de diferentes safras agrícolas.
AGRADECIMENTOS
Os autores agradecem ao suporte técnico e material recebido nas análises
pela equipe do Laboratório de Análises Químicas (Lachem) do Departamento de
Química Analítica da Universidade Federal de Santa Maria/RS, em especial ao
Professor Leandro Machado de Carvalho e sua equipe e a Embrapa/Trigo de Passo
Fundo pela amostras de cevada.
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76
4 CONSIDERAÇÕES GERAIS
Durante o estudo de caracterização de compostos fenólicos em grãos de
diferentes cultivares de cevada, foram identificados e quantificados por HPLC os
compostos fenólicos rutina, seguida do ácido caféico, ácido ferúlico e miricetina.
Esses compostos foram detectados no extrato hidroetanólico (80%, v/v) de farinha
de cevada a 12,5% (m/v) pelo método extrativo ultra-sônico durante 30 minutos de
extração à temperatura ambiente (25º C ± 1º C). Esse solvente foi o mais adequado
em virtude de uma maior extração dos fenólicos e pela melhor resolução dos picos
cromatográficos.
As cultivares que exibiram a maior quantidade de compostos fenólicos
identificados por HPLC foram a Embrapa 128 e PFC 2001048, cujo somatório dos
fenólicos rutina e ácido caféico foi quantificado em 435,14 e 456,72 mg/kg,
respectivamente. O maior conteúdo de rutina foi detectado na cultivar Embrapa 128
(420,50 mg/kg), de ácido caféico na MN 721 (74,04 mg/kg), de ácido ferúlico na BRS
Mariana (7,78 mg/kg) e de miricetina na BRS 225 (5,86 mg/kg).
Os fenóis totais quantificados pelo método de Folin-Ciocalteu exibiram seus
maiores valores nas cultivares BRS Lagoa (1564,37 mg/kg) e MN 743 (1427,38
mg/kg) do ano de 2005. Nesses valores podem estar presentes outros compostos
que porventura não foram detectados pelo método extrativo e solvente escolhido
durante as análises.
Já na avaliação dos fatores climáticos (temperatura média, índice
pluviométrico e insolação) entre as épocas de plantio e colheita das cultivares MN
743 e BRS Lagoa dos anos de 2005 e 2006, pode-se observar que o conteúdo de
fenóis totais quantificados por Folin-Ciocalteu e do flavonóide rutina identificado e
quantificado por HPLC foi maior entre as variedades cultivadas no ano de 2005, cuja
temperatura média entre o plantio e colheita foi mais baixa, cujo índice pluviométrico
foi mais elevado e cuja insolação recebida pela planta foi menor que a observada no
ano de 2006. Através desses dados, pode-se concluir que o conteúdo de fenóis
totais quantificados por Folin-Ciocalteu e do teor de rutina em cultivares de cevada é
influenciado pelos fatores temperatura média, índice pluviométrico e insolação.
77
Dessa forma, a análise cromatográfica e espectrofotométrica, ambas
aplicadas nesse estudo de caracterização de grãos de cultivares de cevada
Brasileira foram importantes na identificação de variedades com elevada quantidade
de compostos fenólicos, conforme mostra a tabela 2. Esses compostos são
importantes para a saúde humana e para a indústria alimentícia, conforme estudos
reportados, tendo em vista suas ações como antioxidantes, anticancerígenos,
cardioprotetores, antiviral, entre outras.
TABELA 2- Conteúdo de polifenóis em grãos de diferentes variedades de cevada ano 2005 e 2006
expressa em mg/g.
Legenda: FT (fenólicos totais quantificados por Folin-Ciocalteu), AC (ácido caféico), MIREC
(miricetina), AF (ácido ferúlico), TOTAL AF (somatório dos ácidos fenólicos: ácido caféico e ácido
ferúlico), HPLC (somatório dos polifenólicos: rutina, miricetina, ácido ferúlico e ácido caféico
encontrados por HPLC).
CULTIVAR FT (mg/g)
RUTINA AC MIREC AF TOTAL AF
HPLC (mg/g)
BRS 195 1,48
0,02 0,03 nd nd 0,03
0,06
BRS LAGOA (2005) 1,56
0,07 0,01 nd nd 0,01
0,09
BRS BOREMA 0,75
0,01 0,05 nd nd 0,05
0,06
BRS MARIANA 1,4
0,07 nd nd 0,01 0,01
0,08
BRS MARCIANA 1,02
0,01 0,05 0 0,01 0,06
0,07
BRS 225 1,01
0,03 0 0,01 0,01 0,01
0,05
MN 721 1,16
0,08 0,07 0 0,01 0,08
0,16
MN 716 1,19
0,19 0,02 nd nd 0,02
0,22
MN 743 (2005) 1,43
0,33 0,02 nd nd 0,02
0,36
MN 698 1,14
0,12 0,04 0 0 0,04
0,17
MN 610 1,08
0,08 0 0 0 0
0,09
PFC 200048 0,91
nd 0,02 0 0 0,02
0,02
PFC 99199 0,94
nd 0,03 nd nd 0,03
0,03
PFC 2001052 1,34
0,41 0,03 nd nd 0,03
0,45
EMBRAPA 127 1,07
0,01 0,03 nd nd 0,03
0,05
EMBRAPA 128 1,12
0,42 0,01 nd nd 0,01
0,43
BRS LAGOA (2006) 1,03 0,05 0 nd 0 nd 0,05
MN 743 (2006) 0,98 0,1 0,05 nd nd nd 0,15
78
5 CONCLUSÕES
As metodologias utilizadas (HPLC e Folin-Ciocalteu) permitiram a
identificação e quantificação de compostos polifenólicos de diferentes cultivares
de cevada;
observou-se que o método de extração ultra-sônico (30 min) e os solventes
etanólico e hidroetanólico, ambos aplicados neste estudo, mostraram-se
adequados e eficientes para a análise do extrato de cevada. No entanto, optou-
se nas análises pelo solvente hidroetanólico a 80% (m/v) pela maior extração dos
compostos detectados;
os compostos fenólicos identificados entre as cultivares pelo sistema de
HPLC em extrato hidroetanólico (80%, m/v) foram a rutina (10,76- 420,50 mg/kg),
o ácido caféico (3,11-74,04 mg/kg), o ácido ferúlico (0,48-0,77 mg/kg) e a
miricetina (0,21-5,86 mg/kg). No extrato etanólico da cultivar de cevada MN 743
de 2006, foi quantificada a quercitrina (28,10mg/kg), além da rutina (81,7 mg/kg)
e do ácido ferúlico (11,7 mg/kg);
o somatório dos polifenóis identificados e quantificados por HPLC, exibiu o
menor valor na cultivar PFC 200048 (28,37 mg/kg) e maiores valores entre as
cultivares Embrapa 128 (435,14 mg/kg) e PFC 2001052 (456,72 mg/kg);
o método de Folin-Ciocalteu, permitiu uma quantificação com relação aos
fenóis totais das cultivares de cevada, com teores que variaram de 752,50 a
1564,37 mg/kg de cevada entre as variedades BRS Borema e BRS Lagoa do ano
de 2005, respectivamente;
observou-se que os fatores climáticos (temperatura média, índice
pluviométrico e insolação) influenciaram no aumento do conteúdo de fenóis totais
e do polifenólico rutina quando as cultivares foram expostas a uma menor
insolação, maior índice pluviométrico e a uma menor temperatura média durante
as épocas de plantio e colheita;
diante da carência de informações e estudos a respeito dos compostos
antioxidantes em grãos de cultivares de cevada, o presente trabalho contribuiu
na geração de um banco de dados frente ao estudo da identificação e
quantificação de compostos fenólicos entre as diferentes variedades analisadas
79
cultivadas no Brasil e na validação de uma metodologia de extração capaz de
detectar diferentes polifenóis entre as mesmas;
no entanto, sugere-se mais estudos para se avaliar a utilização de outras
metodologias de detecção e extração, visando contribuir para a identificação de
outros compostos que porventura não foram detectados e na avaliação dos
fatores climáticos no conteúdo de compostos fenólicos em espécies de cevada
Brasileira.
80
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modification: a chemical investigation. Mutation Research, v. 379, n.2, p.201-210,
1997.
89
ANEXO 1 – Manual de publicação da Revista Química Nova
GERAL: Serão considerados para publicação na Revista Química Nova manuscritos
que cubram as áreas tradicionais da Química bem como artigos sobre Ensino de
Química, História da Química, Política Científica, etc, além de artigos de áreas afins,
desde que tenham acentuado conteúdo químico. Os trabalhos devem se encaixar
dentro de uma das modalidades abaixo:
Artigos Originais (em português, inglês ou espanhol): refere-se a trabalhos inéditos
de pesquisa. Devem seguir a forma usual de apresentação, contendo Introdução,
Resultados e Discussão, Parte Experimental etc, de acordo com as peculiaridades
de cada trabalho. Deverão ter no máximo 25 páginas, incluindo figuras, tabelas,
esquemas, etc e todas as páginas deverão ser numeradas.
Artigos de Revisão destinados à apresentação do progresso em uma área
específica de Química, com o objetivo de dar uma visão crítica do estado da arte do
ponto de vista do especialista altamente qualificado e experiente. Deverão ter no
máximo 40 páginas, incluindo figuras, tabelas, esquemas, etc e todas as páginas
deverão ser numeradas.
É imprescindível que, na referida área, o autor tenha publicações que
comprovem a sua experiência e qualificação. Antes do envio do manuscrito, o
autor deverá submeter à editoria, por e-mail, um resumo da revisão pretendida,
acompanhado de uma carta explicativa da pertinência do trabalho. O material
será analisado pelos Editores e, uma vez aprovado, será solicitado ao autor o
envio do manuscrito completo, dentro das normas de QN, e só então será
dado início ao processo de avaliação pelos assessores.
O Corpo Editorial de QN poderá, eventualmente, convidar pesquisadores
qualificados para submeter artigo de revisão.
Artigos sobre Educação (em português ou espanhol): trabalhos de pesquisas
relacionadas ao ensino de Química e divulgação de experiências inovadoras no
ensino de graduação e pós-graduação. Deverão ter no máximo 25 páginas, incluindo
figuras, tabelas, esquemas, etc e todas as páginas deverão ser numeradas.
Notas Técnicas (em português, inglês ou espanhol): trabalhos de comunicação de
métodos, validação de métodos, técnicas, aparelhagens ou acessórios
90
desenvolvidos no laboratório de origem do autor do manuscrito. Deverão ter no
máximo 25 páginas, incluindo figuras, tabelas, esquemas, etc e todas as páginas
deverão ser numeradas.
Assuntos Gerais (em português, inglês ou espanhol): abordagem de
assuntos de interesse geral dos químicos, tais como política científica, programas de
graduação e pós-graduação, história da química. etc. Deverão ter no máximo 40
páginas, incluindo figuras, tabelas, esquemas etc. e todas as páginas deverão ser
numeradas.
PREPARAÇÃO DE MANUSCRITOS - Todos os trabalhos deverão ser
digitados em espaço duplo, utilizando somente Microsoft Word. A seguir, deve ser
gerado um único arquivo no formato .pdf, do trabalho todo, para ser submetido
através do sistema on line de QN. A revista não aceita mais a submissão de
trabalhos por outra forma.
A primeira página deverá conter o título do trabalho, nome e endereço dos
autores. Havendo autores com diferentes endereços, estes deverão vir
imediatamente após o nome de cada autor. Os autores deverão ser agrupados por
endereço. O autor para correspondência, que deverá ser o mesmo que submete o
artigo on line, deverá ser indicado com asterisco (*) e seu e-mail colocado no rodapé
da página (um só e-mail).
A segunda página deverá conter o título e o resumo do trabalho em inglês
(abstract), com no máximo 100 (cem) palavras, e a indicação de 3 palavras-chave
(keywords), também em inglês.
As figuras (gráficos, esquemas, etc) deverão ter qualidade gráfica adequada
(usar somente fundo branco). As figuras, tabelas, esquemas, etc deverão ser
colocadas após as referências e devidamente identificadas pelo respectivo número.
Se escaneadas, deverão ser em alta resolução (800 dpi/bitmap para traços).. No
caso particular de esquemas contendo estruturas químicas, estas deverão ter
sempre a mesma dimensão, para que possam ser reduzidas uniformemente, além
de boa qualidade gráfica. Considerar que as figuras deverão ter largura máxima de
uma coluna (8,5 cm)
Figuras coloridas terão custo de publicação repassado aos autores, quando
da publicação. Esse valor só poderá ser informado aos autores quando o trabalho
estiver previsto para ser publicado, ocasião em que a gráfica fornece o orçamento.
91
Para figuras, gráficos, esquemas, tabelas, etc idênticos aos já publicados
anteriormente na literatura, os autores deverão pedir permissão para publicação
junto à empresa/sociedade científica que detenha os direitos autorais e enviá-la à
editoria de QN junto com a versão final do manuscrito.
As referências deverão ser numeradas consecutivamente no texto, na forma de
expoentes, após a pontuação (se houver). A lista de referências deverá ser colocada
no final do texto. As legendas das figuras, gráficos e esquemas deverão ser
colocadas em uma única folha à parte, separadas das figuras. A seguir, deverão ser
colocadas as figuras, os gráficos, os esquemas, as tabelas e os quadros. No texto,
deverá ser indicada apenas indicar a inserção de cada um(a).
REFERÊNCIAS
Revistas:
Será utilizada a abreviatura da revista como definida no Chemical Abstracts Service
Source Index (ver http://www.cas.org/sent.html). Caso a abreviatura autorizada de
uma determinada revista não puder ser localizada e não for óbvio como o título deve
ser abreviado, deve-se citar o título completo.
Varma, R. S.; Singh, A. P.; J. Indian Chem. Soc. 1990, 67, 518.
No caso especial da revista citada não ser de fácil acesso, é recomendado citar o
seu número de Chemical Abstract, como segue:
Provstyanoi, M. V.; Logachev, E. V.; Kochergin, P. M.; Beilis, Y. I.; Izv. Vyssh.
Uchebn. Zadev.; Khim. Khim. Tekhnol. 1976, 19, 708. (CA 85:78051s).
Caso o trabalho tenha doi, mas não a referência completa, citar doi da seguinte
maneira:
Vidotti, M.; Silva, M. R.; Salvador, R. P.; de Torresi, S. I. C.; Dall'Antonia, L. H.;
Electrochimica Acta (2007), doi:10.1016/j.electacta.2007.11.029.
É recomendado o uso de referências compostas na medida do possível, em lugar de
uma lista de referências individuais. O estilo das referências compostas é o seguinte:
Varela, H.; Torresi, R. M.; J. Electrochem. Soc. 2000, 147, 665; Lemos, T. L. G.;
Andrade, C. H. S.; Guimarães, A. M.; Wolter-Filho, W.; Braz-Filho, R.; J. Braz.
Chem. Soc. 1996, 7, 123; Ângelo, A. C. D.; de Souza, A.; Morgon, N. H.; Sambrano,
J. R.; Quim. Nova 2001, 24, 473. Patentes:
Devem ser identificadas da seguinte forma (na medida do possível o número do
Chemical Abstracts deve ser informado entre parênteses).
92
Hashiba, I.; Ando, Y.; Kawakami, I.; Sakota, R.; Nagano, K.; Mori, T.; Jpn. Kokai
Tokkyo Koho 79 73,771 1979. (CA 91:P193174v)
Kadin, S.B.; US pat. 4,730,004 1988. (CA 110:P23729y)
Eberlin, M. N.; Mendes, M. A.; Sparrapan, R.; Kotiaho, T.; Br PI 9.604.468-3, 1999.
Livros:
Regitz, M. Em Multiple Bonds and Low Coordination in Phosphorus Chemistry;
Regitz, M.; Scherer, O. J., eds.; Georg Thieme Verlag: Stuttgart, 1990, cap. 2.
Cotton, F.A.: Wilkinson, G.; Advanced Inorganic Chemistry, 5th ed., Wiley: New York,
1988.
Programas de computação (Softwares):
Sheldrick, G. M.; SHELXL-93; Program for Crystal Structure Refinement;
Universidade de Göttingen, Alemanha, 1993.
Teses:
Velandia, J. R.; Tese de Doutorado, Universidade Federal Rural do Rio de Janeiro,
Brasil, 1997.
Material apresentado em Congressos:
Ferreira, A. B; Brito, S. L.; Resumos da 20a Reunião Anual da Sociedade Brasileira
de Química, Poços de Caldas, Brasil, 1998.
Páginas Internet:
http://jbcs.sbq.org.br, acessada em Junho 2001.
Material não publicado:
Para material aceito para publicação: Magalhães, U. H.; J. Braz. Chem. Soc., no
prelo. Para material submetido mas ainda não aceito: Magalhães, U. H.; J. Braz.
Chem. Soc., submetido. Para trabalho não publicado ou comunicação pessoal:
Magalhães, U. H.; trabalho não publicado ou Magalhães, U. H., comunicação
pessoal. Os resultados não publicados só poderão ser citados com a permissão
explícita das pessoas envolvidas na sua obtenção.
Os autores devem procurar seguir, naquilo que for possível, as normas
recomendadas pela IUPAC, inclusive o Sistema Internacional de Unidades. Sobre a
nomenclatura de compostos (orgânicos e inorgânicos) já há traduções para a língua
portuguesa publicadas em Q.N. Quanto aos Símbolos e Terminologias, onde não há
tradução, espera-se que adaptação seja feita pelos autores, criando então,
paulatinamente, um conjunto de normas em português.
93
SUBMISSÃO DOS ARTIGOS - A QN oferece aos autores a submissão on line, que
pode ser acessada através do registro de Login e Senha. É possível registrar-se em
nossa home page (http://quimicanova.sbq.org.br) usando a opção Novo
Usuário.Usuários da plataforma do JBCS, já estão cadastrados na base (pois ela é
comum às duas revistas), devendo utilizar o mesmo Login e Senha. Após estar
cadastrado no sistema, o autor pode facilmente seguir as instruções fornecidas na
tela. Será solicitada a submissão de um único arquivo do manuscrito completo,
em formato PDF. Está disponível uma ferramenta para gerar o arquivo .pdf, a partir
de arquivo .doc ou .rtf, com envio automático para o e-mail do autor. Tão logo seja
completada a submissão, o sistema informará automaticamente, por e-mail, o código
temporário de referência do manuscrito, até que este seja verificado pela editoria.
Então será enviado e-mail com o número de referência do trabalho.
Se não for recebido o e-mail com código de submissão temporária, por algum
motivo, a submissão não foi completada e o autor terá prazo máximo de 5 (cinco)
dias para completá-la. Depois desse prazo, o sistema não permite o envio, devendo
ser feita nova submissão.
O autor poderá acompanhar, diretamente através do sistema, a situação de
seu manuscrito.
Ao fazer a submissão, solicita-se uma carta de apresentação, que deverá ser
digitada no local indicado, sendo obrigatória a apresentação dos e-mails de todos
os autores. Além disso, devem ser enviados também os nomes e e-mails de três ou
quatro possíveis assessores, que não podem pertencer à(s) mesma(s)
instituição(ões) dos autores.
Material Suplementar - Esta modalidade foi criada para que na versão
impressa da revista apareça o número estritamente necessário de figuras e tabelas
(6 a 7 figuras simples). Ressalta-se que, como este material ficará disponível apenas
na versão on line, figuras, tabelas e ilustrações coloridas apresentadas na forma de
material suplementar não terão custo repassado aos autores, nem limite de páginas.
Porém, devem ter boa qualidade gráfica
O material suplementar deverá ser colocado no final do trabalho, com
indicação clara. Deverá ser submetido um único documento .pdf, incluindo o
material suplementar.
Os Editores poderão solicitar aos autores, em qualquer fase da tramitação, a
separação de Material Suplementar.
94
MANUSCRITOS REVISADOS - Manuscritos enviados aos autores para revisão
deverão retornar à Editoria dentro de prazo máximo de três meses ou serão
considerados retirados, sendo que o sistema encerra o processo, não permitindo
que seja reaberto. Vencido o prazo, deverá ser feita nova submissão, dando início a
um novo processo.
A submissão do manuscrito revisado deverá ser feita pelo mesmo autor, usando o
Login e a Senha registrados anteriormente. O autor deve seguir as instruções
fornecidas na tela, para envio do documento .pdf completo da versão revisada e das
respostas aos assessores, detalhando as alterações feitas na nova versão e
justificando as alterações sugeridas nos pareceres e que não foram aceitas pelos
autores. Esses dois arquivos devem ser enviados através da seção Envio de Nova
Versão, na Página do Autor, no sistema de submissão on line de QN.
Tão logo seja completada a submissão o sistema informará automaticamente, por
e-mail, o código temporário de referência do manuscrito, até que ele seja verificado
pela editoria. Então será enviado e-mail contendo o número de referência do
trabalho.
Se não receber o e-mail com código de submissão temporária, por algum motivo, a
submissão não foi completada e o autor terá prazo máximo de 5 (cinco) dias para
completá-la. Depois desse prazo, o sistema não permite o envio, devendo ser feita
nova submissão.
O autor poderá acompanhar, diretamente através do sistema, o status de seu
manuscrito.
VERSÃO FINAL - Quando for solicitada a versão final, o autor receberá instruções
específicas quanto a programas para envio de arquivos (texto, figuras, tabelas, etc) .
Arquivos em formato .pdf não são mais solicitados nessa fase.
Se as Figuras forem escaneadas, deverão ser em alta resolução (800
dpi/bitmap para traços) com extensão tif ou jpg, desde que nas dimensões
especificadas pelos Editores. As fotos ou desenhos com cor (300
dpi/grayscale) deverão ser enviadas com extensão tif/jpg, com largura máxima
total de 8,5 cm para não haver problemas ao aplicá-las no padrão da Revista.
Outras extensões possíveis: cdr, eps, cdx ou opj. No caso particular de
esquemas contendo estruturas químicas, estas deverão ter sempre a mesma
dimensão, para que possam ser reduzidas uniformemente.
95
A Editoria de QN reserva-se o direito de efetuar, quando necessário, pequenas
alterações nos manuscritos, de modo a adequá-los às normas da revista ou tornar
seu estilo mais claro, respeitando, naturalmente, o conteúdo do trabalho. Qualquer
que seja a natureza do manuscrito submetido, ele deve ser original em nível de
metodologia, informação, interpretação ou crítica. A qualificação do trabalho será
atestada por dois consultores, indicados pela Editoria.
Copyright © 2008 Sociedade Brasileira de Química
Para publicação, requer-se que os manuscritos submetidos a esta revista não
tenham sido publicados anteriormente e não sejam submetidos ou publicados
simultaneamente em outro periódico. Ao submeter o manuscrito, os autores
concordam que o copyright de seu artigo seja transferido à Sociedade Brasileira de
Química (SBQ), se e quando o artigo for aceito para publicação. O copyright
abrange direitos exclusivos de reprodução e distribuição dos artigos, inclusive
separatas, reproduções fotográficas, microfilmes ou quaisquer outras reproduções
de natureza similar, inclusive traduções. Nenhuma parte desta publicação pode ser
reproduzida, armazenada em bancos de dados ou transmitida sob qualquer forma
ou meio, seja eletrônico, eletrostático, mecânico, por fotocópia, gravação, mídia
magnética ou algum outro modo, sem permissão por escrito da detentora do
copyright. Embora todo esforço seja feito pela SBQ, Editores e Conselho Editorial
para garantir que nenhum dado, opinião ou afirmativa errada ou enganosa apareçam
nesta revista, deixa-se claro que o conteúdo dos artigos e propagandas aqui
publicados são de responsabilidade, única e exclusiva, dos respectivos autores e
anunciantes envolvidos. Conseqüentemente, a SBQ, o Conselho Editorial, os
Editores e respectivos funcionários, diretores e agentes isentam-se, totalmente, de
qualquer responsabilidade pelas conseqüências de quaisquer tais dados, opiniões
ou afirmativas erradas ou enganosas.
96
ANEXO 2 – Manual de publicação do Journal of Chromatography
Science
Subject links within this page:
Scope | Languages | Submission of Manuscripts | Form and Style | Review
Procedure | Notification | Requests for Revision | Author's Proofs | Publication Time |
Chromatography Problem Solving & Troublshooting | Copyrights
Scope
The Journal of Chromatographic Science is devoted to the dissemination of
information concerning all methods of chromatographic analysis. The standard
manuscript is a description of recent original research that covers any or all phases
of a specific separation problem, principle, or method. In addition to regular research
papers, “Technical Notes” are published. These are brief disclosures of new
chromatographic concepts or practices or brief descriptions of novel apparatuses or
techniques. “Expedited Papers” are those determined by our reviewers to be of
interest to most chromatographers and requiring minimal revision. They are
published in the next available issue. General comments on the content of the
Journal are appropriate for “Letters to the Editor,” as are comments on the work of
specific authors, in which case the authors will be allowed to reply. The editors
encourage readers to communicate questions and criticisms inspired by the Journal.
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Languages
The Journal accepts manuscripts in English only.
Submission of Manuscripts
The Journal of Chromatographic Science prefers to receive all manuscript
submissions electronically. To submit a manuscript, please follow the instructions
below:
Getting Started :Please print out this page for future reference.
1. Launch your web browser (Internet Explorer 5 or higher or Netscape 6 or higher)
and go to the JCS Manuscript Central homepage
(http://mc.manuscriptcentral.com/jcs).
97
2. Log-in or click the “Create Account” option if you are a first-time user of Manuscript
Central.
3. If you are creating a new account:
After clicking on “Create Account” enter your name and e-mail information and click
“Next”. Your e-mail information is very important.
Enter your institution and address information as prompted then click “Next.”
Enter a user ID and password of your choice (we recommend using your e-mail
address as your user ID) and then select your area of expertise. Click “Finish” when
done.
4. Log-in and select “Author Center.”
Submitting Your Manuscript
5. After you have logged in, click the “Submit a Manuscript” link in the menu bar.
6. Enter data and answer questions as prompted
7. Click on the “Next” button on each screen to save your work and advance to the
next screen.
8. You will be prompted to upload your files:
Click on the “Browse” button and locate the file on your computer.
Select the description of the file in the drop down next to the Browse button.
When you have selected all files you wish to upload, click the “Upload” button.
a. NOTE: you have a limit of 100 MB combined for all files you upload.
9. Review your submission (in both PDF and HTML formats) before sending to the
Editors. Click the “Submit” button when you are done reviewing.
You may stop a submission at any phase and save it to submit later. After
submission, you will receive a confirmation via e-mail. You can also log-on to
Manuscript Central any time to check the status of your manuscript. The Editors will
information you via e-mail once a decision has been made.
Authors who are unable to submit their manuscripts electronically may call or write to:
Managing Editor, Journal of Chromatographic Science, Post Office Box 48312,
Niles, Illinois 60714, U.S.A; phone (847) 647-2900 ext. 1300; fax (847) 647-1155; e-
submissions will be processed using the JCS manuscript central website. Unless
otherwise requested, editorial correspondence will be directed to the person who
submitted the manuscript, whether or not this is the first author. Submission implies
98
that the material has not been published in, or submitted to, any other journal.
Previous oral presentation should be mentioned in the Acknowledgment section.
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Form and Style
The American Chemical Society’s ACS Style Guide is generally used to determine
spelling, hyphenation, style, usage, and abbreviation. Standardized, universally
recognized terms and abbreviations should be used. Special nomenclature should be
defined at the point of first use or listed in an appendix. Use consistent, SI-
recommended units of measurement and give definitions for all terms. Define trade
names and special symbols.
Abstract
Abstracts are required for all manuscripts. State the objectives of the study, the
techniques used, and what was accomplished. The length should reflect the content
of the manuscript, but should not exceed 200 words. Present tense should be used
throughout the abstract.
Text
CConsult the publication for general format. Indicate sections with side headings.
Keep all information pertinent to a particular section—e.g., do not present results in
the Experimental section. Avoid repetition. Do not use footnotes for descriptive or
explanatory information that can be incorporated into the text. Equipment and
methods should be described in sufficient detail to permit other chromatographers to
duplicate the results, but information that is common knowledge to others in the field
should not be included.
Figures
Figures All figures should be cited in order in the text. Figures will be reproduced in
the Journal exactly as submitted and must be professionally rendered original
drawings or sharp, glossy prints. If structures are given in the manuscript, original
drawings must be provided. All lines, lettering, and numbering must be sharp and
unbroken. Use black text for all letters, numbers, and symbols. Do not use a
typewriter to letter illustrations. Dot matrix printing is also unacceptable. Illustrations
should be designed to fit the width of one journal column (8.3 cm). The width of
original drawings should be twice the final published size to allow for 50% reduction.
Letters and symbols should be approximately 4-mm tall on the original art. See the
The ACS Style Guide for more detailed information on the preparation of figures. All
99
graphs, diagrams, chromatograms, and photographs must be numbered
consecutively on the front with Arabic numerals in the order of citation. Include all
figure legends together on a separate page.
Tables
Prepare tables in a consistent form, each appropriately titled and numbered
consecutively with Roman numerals in the order of citation in the text. Type each
table on a separate page, and collate at the end of the text in front of the figures.
Equations
Number equations consecutively using Arabic numerals. Place superscripts and
subscripts accurately, indicate capital letters and italics, and distinguish between
characters that may be confused—e.g., number one and lower-case “L” or zero and
upper-case “O”. Avoid superscripts that may be confused with exponents. Variables
should be in italics.
References
All references should appear at the end of the paper and should be cited in numerical
order in the text. Reference numbers in the text should be enclosed within
parentheses and placed on the line. Descriptive or explanatory (footnote) material is
not given a reference number. Use abbreviations as given in The ACS Style Guide or
the International Serials Catalogue. Include titles with all journal articles. The
following are forms and examples for citing references:
• Journals: first author’s initials followed by the last name; additional authors (listed
as they appear in the original work) with initials followed by last names; title of article
without quotation marks, only the first letter of the first word capitalized; abbreviated
title of journal, underscored for italics; volume number, followed by a colon; beginning
and ending page numbers; and year of publication in parentheses.
Example:
19. K. Jinno and M. Kuwajima. Microcomputer-assisted liquid chromatographic
separation system: application to toxic compounds identification in poisoned human
fluids. J. Chromatogr. Sci. 27: 57–62 (1989).
• Books: first author’s initials followed by the last name; additional authors; title of
book, underscored for italics; volume and/or edition number; editor’s initials followed
by last name and the abbreviation Ed. publisher; city and state or country of
publication; year of publication; and page numbers or chapter.
Example:
100
22. L.R. Snyder and J.J. Kirkland. Introduction to Modern Liquid Chromatography,
2nd ed. R.H. Thompson, A.S. Pereira, and N.D. Meyer, Eds. John Wiley & Sons,
New York, NY, 1980, pp. 143–44.
• Unpublished works: This type of reference includes material “in press” (that is,
formally accepted for publication), theses, and dissertations. Do not include material
submitted for publication but not formally accepted.
Example:
8. E.J. Levy and J.Q. Walker. Model molecular thermometer: a standardization
method, Part II. J. Chromatogr. Sci., in press.
• Patents: initials and last name of person who applied for the patent; country where
application was filed; patent number; and year in parentheses.
Example:
1. S.T. Preston, U.S. Patent 123456 (1987).
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Review Procedure
All submissions except those sent as “Letters to the Editor” are subject to review by
two or more independent reviewers selected by the editor(s). Authors may suggest
reviewers. The reviewers are asked to indicate the paper’s degree of interest to JCS
readers and whether the manuscript should be published without change; with major
or minor revision; or not at all. A request for a revised re-submission of a rejected
manuscript may also be made by the editor.
Notification
Manuscripts are acknowledged upon receipt. Each author is kept informed of delays
in the review process and receives formal notification of the status of his or her
submission after reviewers have commented upon it. If a manuscript is deemed
unsuitable for publication, the author will be promptly notified and the original copy of
the paper returned. The author of an accepted manuscript is notified of the schedule
for publication and the approximate date galley proofs will be mailed.
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Requests for Revision
Authors are often asked to submit revised manuscripts incorporating the suggestions
and recommendations of the reviewers. The editors reserve the right to submit a
revision to the original reviewers for approval before accepting it for publication.
Changes made in accordance with the reviewers, as well as reasons for not
101
incorporating suggestions, should be outlined in detail in the cover letter
accompanying the revised manuscript.
Author’s Proofs
Preliminary page proofs are sent to the corresponding authors. The author should
correct only typographical or factual errors and fax, email, or telephone his or her
corrections (or approval to publish without corrections) by the deadline date, which is
usually 3 to 5 days after receipt of proofs. Failure to respond will delay publication of
the article. Final page proofs are not customarily sent to the authors. Responsibility
for accuracy of the published manuscript lies solely with the author.
Page Charges
There are no page charges. Authors receive complimentary copies of the issues in
which their articles appear. Reprints, in quantities of 100 or more, can also be
purchased through the Journal.
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Publication Time
Manuscripts requiring only minor revision may be published within six months of
submission. The average time before publication is two months after a manuscript or
its revision is deemed acceptable. If possible, manuscripts accepted as “Expedited
Papers” are published within eight weeks.
Chromatography Problem Solving and Troubleshooting
The editors welcome questions from readers regarding equipment and application
techniques. Questions should be sent to Managing Editor, Journal of
Chromatographic Science, P.O. Box 48312, Niles, IL 60714; or e-mailed to
[email protected], and should include a name and affiliation.
Copyright
The Journal secures copyright protection on each issue, and any reproduction of
articles or parts thereof requires publisher’s permission as well as the authors’. As a
matter of policy, the Journal generally grants written permission to reproduce
illustrations and/or parts of articles. However, printing or photocopying of any
substantial part of the Journal requires compensation.
For more information, call or write: Managing Editor, Journal of Chromatographic
Science P.O. Box 48312 Niles, IL 60714 phone (847) 647-2900 ext. 1300 fax (847)
647-1155 www.j-chrom-sci.com
102
ANEXO 3 – Manual de publicação da Revista Ciência Rural
Diretrizes para Autores
1. CIÊNCIA RURAL - Revista Científica do Centro de Ciências Rurais da
Universidade Federal de Santa Maria publica artigos científicos, revisões
bibliográficas e notas referentes à área de Ciências Agrárias que deverão ser
destinados com exclusividade.
2. Os artigos científicos, revisões e notas devem ser encaminhados via
eletrônica editados em Word, idioma Português ou Inglês, todas as linhas deverão
ser numeradas e paginados no lado inferior direito. O trabalho deverá ser digitado
em tamanho A4 210 x 297mm, com no máximo, 28 linhas em espaço duplo, as
margens superior, inferior, esquerda e direita em 2,5cm, fonte Times New Roman,
tamanho 12. O máximo de páginas será 15 para artigos científicos, 20 para
revisão bibliográfica e 8 para nota, incluindo tabelas, gráficos e ilustrações.
Cada figura e ilustração deverá ser enviado em arquivos separados e constituirá
uma página (cada tabela também constituirá uma página). Ciência Rural não aceita
mais trabalhos com tabelas, gráficos e figuras no formato paisagem devido
dificuldades de formatação mas principalmente pela péssima visualização que
as mesmas apresentam no trabalho final.
3. O artigo científico deverá conter os seguintes tópicos: Título (Português e
Inglês); Resumo; Palavras-chave; Abstract; Key words; Introdução com Revisão de
Literatura; Material e Métodos; Resultados e Discussão; Conclusão e Referências.
Agradecimento(s) ou Agradecimento (s) e Apresentação; Fontes de Aquisição e
Informe Verbal, quando for necessário o uso deve aparecer antes das referências.
Antes das referências deverá também ser descrito quando apropriado que o
trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética e Biossegurança da instituição e
que os estudos em animais foram realizados de acordo com normas éticas.
4. A revisão bibliográfica deverá conter os seguintes tópicos: Título (Português e
Inglês); Resumo; Palavras-chave; Abstract; Key words; Introdução;
Desenvolvimento; Conclusão; e Referências. Agradecimento(s) ou Agradecimento
(s) e Apresentação; Fontes de Aquisição e Informe Verbal, devem aparecer antes
103
das referências. Antes das referências deverá também ser descrito quando
apropriado que o trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética e
Biossegurança da instituição e que os estudos em animais foram realizados de
acordo com normas éticas.
5. A nota deverá conter os seguintes tópicos: Título (Português e Inglês); Resumo;
Palavras-chave; Abstract; Key words; Texto (sem subdivisão, porém com introdução;
metodologia; resultados e discussão e conclusão; podendo conter tabelas ou
figuras); Referências. Agradecimento(s) ou Agradecimento (s) e Apresentação;
Fontes de Aquisição e Informe Verbal, caso existam devem aparecer antes das
referências. Antes das referências deverá também ser descrito quando
apropriado que o trabalho foi aprovado pela Comissão de Ética e
Biossegurança da instituição e que os estudos em animais foram realizados de
acordo com normas éticas.
6. Não serão fornecidas separatas. Os artigos estão disponíveis no formato pdf no
endereço eletrônico da revista (www.scielo.br/cr).
7. Descrever o título em português e inglês (caso o artigo seja em português) - inglês
português (caso o artigo seja em inglês). Somente a primeira letra do título do artigo
deve ser maiúscula exceto no caso de nomes próprios. Evitar abreviaturas e nomes
científicos no título. O nome científico só deve ser empregado quando estritamente
necessário. Esses devem aparecer nas palavras-chave e resumo e demais seções
quando necessários.
8. As citações dos autores, no texto, deverão ser feitas com letras maiúsculas
seguidas do ano de publicação, conforme exemplos: Esses resultados estão de
acordo com os reportados por MILLER & KIPLINGER (1966) e LEE et al. (1996),
como uma má formação congênita (MOULTON, 1978).
9. As Referências deverão ser efetuadas no estilo ABNT (NBR 6023/2000) conforme
normas próprias da revista.
9.1. Citação de livro:
JENNINGS, P.B. The practice of large animal surgery. Philadelphia : Saunders,
1985. 2v.
TOKARNIA, C.H. et al. (Mais de dois autores) Plantas tóxicas da Amazônia a
bovinos e outros herbívoros. Manaus : INPA, 1979. 95p.
9.2. Capítulo de livro com autoria:
104
GORBAMAN, A. A comparative pathology of thyroid. In: HAZARD, J.B.; SMITH, D.E.
The thyroid. Baltimore : Williams & Wilkins, 1964. Cap.2, p.32-48.
9.3. Capítulo de livro sem autoria:
COCHRAN, W.C. The estimation of sample size. In: ______. Sampling techniques.
3.ed. New York : John Willey, 1977. Cap.4, p.72-90.TURNER, A.S.; McILWRAITH,
C.W. Fluidoterapia. In: ______. Técnicas cirúrgicas em animais de grande porte.
São Paulo : Roca, 1985. p.29-40.
9.4. Artigo completo:
Sempre que possível o autor deverá acrescentar a url para o artigo referenciado e o
número de identificação DOI (Digital Object Identifiers) conforme exemplos abaixo:
MEWIS, I.; ULRICHS, CH. Action of amorphous diatomaceous earth against different
stages of the stored product pests Tribolium confusum (Coleoptera:
Tenebrionidae), Tenebrio molitor (Coleoptera: Tenebrionidae), Sitophilus
granarius (Coleoptera: Curculionidae) and Plodia interpunctella (Lepidoptera:
Pyralidae). Journal of Stored Product Research, v.37, p.153-164, 2001. Disponível
em: <http://dx.doi.org/10.1016/S0022-474X(00)00016-3>. Acesso em: 20 nov. 2008.
doi: 10.1016/S0022-474X(00)00016-3.
PINTO JUNIOR, A.R. et al (Mais de 2 autores). Resposta de Sitophilus oryzae (L.),
Cryptolestes ferrugineus (Stephens) e Oryzaephilus surinamensis (L.) a
diferentes concentrações de terra de diatomácea em trigo armazenado a granel.
Ciência Rural, Santa Maria, v. 38, n. 8, nov. 2008 . Disponível em:
<http://www.scielo.br/scielo.php?
script=sci_arttext&pid=S0103-84782008000800002&lng=pt&nrm=iso>. Acesso em:
25 nov. 2008. doi: 10.1590/S0103-84782008000800002.
9.5. Resumos:
RIZZARDI, M.A.; MILGIORANÇA, M.E. Avaliação de cultivares do ensaio nacional
de girassol, Passo Fundo, RS, 1991/92. In: JORNADA DE PESQUISA DA UFSM, 1.,
1992, Santa Maria, RS. Anais... Santa Maria : Pró-reitoria de Pós-graduação e
Pesquisa, 1992. V.1. 420p. p.236.
9.6. Tese, dissertação:
COSTA, J.M.B. Estudo comparativo de algumas caracterísitcas digestivas entre
bovinos (Charolês) e bubalinos (Jafarabad). 1986. 132f. Monografia/Dissertação/
Tese (Especialização/ Mestrado/Doutorado em Zootecnia) - Curso de Pós-
graduação em Zootecnia, Universidade Federal de Santa Maria.
105
9.7. Boletim:
ROGIK, F.A. Indústria da lactose. São Paulo : Departamento de Produção
Animal, 1942. 20p. (Boletim Técnico, 20).
9.8. Informação verbal:
Identificada no próprio texto logo após a informação, através da expressão entre
parênteses. Exemplo: ... são achados descritos por Vieira (1991 - Informe verbal).
Ao final do texto, antes das Referências Bibliográficas, citar o endereço completo do
autor (incluir E-mail), e/ou local, evento, data e tipo de apresentação na qual foi
emitida a informação.
9.9. Documentos eletrônicos:
MATERA, J.M. Afecções cirúrgicas da coluna vertebral: análise sobre as
possibilidades do tratamento cirúrgico. São Paulo : Departamento de Cirurgia,
FMVZ-USP, 1997. 1 CD.
GRIFON, D.M. Artroscopic diagnosis of elbow displasia. In: WORLD SMALL ANIMAL
VETERINARY CONGRESS, 31., 2006, Prague, Czech Republic. Proceedings…
Prague: WSAVA, 2006. p.630-636. Acessado em 12 fev. 2007. Online. Disponível
em: http://www.ivis.org/proceedings/wsava/2006/lecture22/Griffon1.pdf?LA=1
UFRGS. Transgênicos. Zero Hora Digital, Porto Alegre, 23 mar. 2000. Especiais.
Acessado em 23 mar. 2000. Online. Disponível em:
http://www.zh.com.br/especial/index.htm
ONGPHIPHADHANAKUL, B. Prevention of postmenopausal bone loss by low and
conventional doses of calcitriol or conjugated equine estrogen. Maturitas, (Ireland),
v.34, n.2, p.179-184, Feb 15, 2000. Obtido via base de dados MEDLINE. 1994-2000.
23 mar. 2000. Online. Disponível em: http://www. Medscape.com/server-
java/MedlineSearchForm
MARCHIONATTI, A.; PIPPI, N.L. Análise comparativa entre duas técnicas de
recuperação de úlcera de córnea não infectada em nível de estroma médio. In:
SEMINARIO LATINOAMERICANO DE CIRURGIA VETERINÁRIA, 3., 1997,
Corrientes, Argentina. Anais... Corrientes : Facultad de Ciencias Veterinarias -
UNNE, 1997. Disquete. 1 disquete de 31/2. Para uso em PC.
10. Desenhos, gráficos e fotografias serão denominados figuras e terão o número de
ordem em algarismos arábicos. A revista não usa a denominação quadros. As
figuras devem ser enviadas à parte, cada uma sendo considerada uma página. Os
desenhos figuras e gráficos (com largura de no máximo 16cm) devem ser
106
feitos em editor gráfico sempre em qualidade máxima com pelo menos 800 dpi
em extensão .tiff. As tabelas devem conter a palavra tabela, seguida do número de
ordem em algarismo arábico e não devem exceder uma lauda.
11. Os conceitos e afirmações contidos nos artigos serão de inteira responsabilidade
do(s) autor(es).
12. Será obrigatório o cadastro de todos autores nos metadados de submissão. O
artigo não tramitará enquanto o referido item não for atendido. Excepcionalmente,
mediante consulta prévia para a Comissão Editorial outro expediente poderão ser
utilizados.
13. Lista de verificação (Checklist .pdf ou .doc).
14. A taxa de tramitação é de US$ 15,00 (dólares) e a de publicação de US$ 20,00
(dólares) por página impressa. Os pagamentos deverão ser feitos em reais (R$),
de acordo com a taxa de câmbio comercial do dia. Essas taxas deverão ser
pagas no Banco do Brasil, Agência 1484-2, Conta Corrente 250945-8 em nome da
FATECIENS - Projeto 96945. Os pagamentos poderão ser por cartão de crédito
VISA (.pdf ou .doc) ou ainda por solicitação de fatura (.pdf ou .doc). A submissão
do artigo obrigatoriamente deve estar acompanhada da taxa de tramitação,
podendo ser enviada via fax (55 32208695), ou anexando o comprovante de
depósito bancário escaneado ou ainda enviado por email
([email protected]) para que se possa fazer a verificação e prosseguir com
a tramitação do artigo (Em ambos os casos o nome e endereço completo são
obrigatórios para a emissão da fatura). A taxa de tramitação é obrigatória para todos
os trabalhos, independentemente do autor ser assinante da Revista. A taxa de
publicação somente deverá ser paga (e o comprovante anexado) após a
revisão final das provas do manuscrito pelos autores. Professores do Centro de
Ciências Rurais e os Programas de Pós-graduação do Centro têm os seus artigos
previamente pagos pelo CCR, estando isentos da taxa de publicação. Trabalhos
submetidos por esses autores, no entanto, devem pagar a taxa de tramitação. No
caso de impressão colorida, todos os trabalhos publicados deverão pagar um
adicional de US$ 120,00 por página colorida impressa, independentemente do
número de figuras na respectiva página. Este pagamento também deverá ser
realizado até a publicação do artigo rubricado obedecendo uma das formas
previamente mencionadas.
15. Os artigos serão publicados em ordem de aprovação.
107
16. Os artigos não aprovados serão arquivados havendo, no entanto, o
encaminhamento de uma justificativa pelo indeferimento.
17. Em caso de dúvida, consultar artigos de fascículos já publicados antes de dirigir-
se à Comissão Editorial.
Itens de Verificação para Submissão
1) Quanto ao artigo
O trabalho é original?
O trabalho representa uma contribuição científica para a área de Ciências Agrárias?
O trabalho está sendo enviado com exclusividade para a Ciência Rural?
O idioma usado está de acordo com as normas?
As normas da revista foram seguidas rigorosamente (lembre-se que caso as
mesmas não tenham sido seguidas seu trabalho não irá tramitar. Retarde o envio
mais alguns dias, mas confira as normas várias vezes e, principalmente, visite
modelos de trabalhos (artigo, nota ou revisão) na página da revista www.ufsm.br/ccr/
revista. Existem também trabalhos que já foram publicados que podem ser visitados.
Lembre-se, os mesmos estão disponíveis com acesso sem custos no site do
SCIELO (www.scielo.br/cr). A lista foi elaborada com base nas normas da revista.
São perguntas diretas. Respostas AFIRMATIVAS estabelecem uma concordância
com as normas possibilitando que o trabalho seja enviado à revista.
2) Quanto ao arquivo
O arquivo deverá estar formatado com o tamanho de folha A4 (210x297mm), com
margens superior, inferior, direita e esquerda de 2,5cm não devendo ultrapassar 28
linhas por página (as tabelas e figuras não devem ultrapassar as margens da
página). Tabelas devem ser enviada junto com o artigo texto após as referências.
O trabalho está de acordo com as normas da revista, 20 páginas para revisão, 15
para artigo científico e 8 para nota (o texto não está em colunas, lembre-se cada
figura ou tabela será uma página, o equivalente a uma lauda)?
Todas as páginas estão numeradas, inclusive a primeira, preferencialmente no canto
inferior direito?
O nome dos autores está por extenso (ex.: Venancio Aires Cruz e não V. A.
CRUZ.)? O endereço do autor de correspondência está completo (inclusive Cep e e-
mail)?
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Todas as afiliações estão corretamente identificadas, o departamento, a instituição,
a cidade o estado e o país para todos os autores? Veja modelos (artigo, nota e
revisões).
O arquivo para submissão está em ".doc" e com tamanho inferior a 2MB? As tabelas
estão no arquivo ".doc"?
Os gráficos e figuras estão em extensão ".tiff" e com tamanho inferior a 2MB?
3) Quanto as referências, taxa de tramitação e termo de compromisso
Todas as referências citadas ao longo do texto estão corretamente descritas,
conforme as normas da Ciência Rural, e aparecem listadas (grande parte dos
trabalhos enviados apresentam problemas no referido item e a aprovação é
retardada por isso retenha o trabalho por mais alguns dias e confira as mesmas por
duas ou mais vezes)? A taxa de tramitação do trabalho foi enviada? Vide normas da
revista. O envio da taxa de tramitação pode ser por documento anexado, correio ou
fax. Vide normas
4) Quanto as normas
O trabalho está nas normas? Caso seja verificado pela Revista que o trabalho não
foi preparado conforme as normas, o mesmo será rejeitado. Para uma
reapresentação do trabalho outra taxa de submissão precisará ser paga.
Universidade Federal de Santa Maria
Centro de Ciências Rurais
Avenida Roraima, 1000
Prédio 42, Sala 3104
97105-900, Santa Maria, RS, Brasil.
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