( PDF ) Caracterização da resposta de defesa local e sistêmica, induzida por lesão mecânica em plântulas de feijão-de-corda

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Caracterização da resposta de defesa local e sistêmica, induzida

por lesão mecânica em plântulas de feijão-de-corda.

Márcio dos Santos Teixeira Pinto

Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro – UENF

Campos dos Goytacazes – RJ

Abril – 2008

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Caracterização da resposta de defesa local e sistêmica, induzida

por lesão mecânica em plântulas de feijão-de-corda.

Márcio dos Santos Teixeira Pinto.

“Tese de Doutorado apresentada ao Centro de Biociências e Biotecnologia da

Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro, como parte das

exigências para a obtenção do título de Doutor em Biociências e

Biotecnologia.”

Campos dos Goytacazes – RJ

Abril - 2008

Caracterização da resposta de defesa local e sistêmica, induzida por lesão

mecânica em plântulas de feijão-de-corda.

Márcio dos Santos Teixeira Pinto.

“Tese de Doutorado apresentada ao Centro de Biociências e

Biotecnologia da Universidade Estadual do Norte Fluminense Darcy Ribeiro,

como parte das exigências para a obtenção do título de Doutor em Biociências

e Biotecnologia.”

Aprovada em 09 / 04 / 2008

Comissão Examinadora:

César Luis Siqueira Junior - CEFET/ RJ

Valdirene Moreira Gomes – LFBM; UENF / RJ

Olga Lima Tavares Machado – LQFPP; UENF / RJ

Kátia Valevski Sales Fernandes (Orientadora) LQFPP; UENF / RJ

À minha irmã Rose, por nunca ter

desistido dos seus sonhos. E mesmo

tendo a morte em seu futuro, lutou pela

a alegria de sua vida.

Agradecimentos

Ofereço um agradecimento especial a minha orientadora, a professora Dra

Kátia. Por ter aceitado me orientar por tanto tempo, muitas vezes em assuntos que

vão além do âmbito acadêmico. Sendo agora, mais do que uma mestra, uma grande

amiga.

Agradeço à Nathália pela ajuda indireta, mas essencial, na conclusão da

minha tese, pela paciência em conviver com meus defeitos, e pela sua amizade

incondicional.

Agradeço ao Fabrício pela ajuda na conclusão deste trabalho. E lamento que

esta ação não o tenha ajudado tão bem como deveria.

Agradeço à Lucilene pela mútua ajuda e boa convivência no laboratório, e

pelos momentos de humor proporcionados pela sua presença.

Agradeço à Elaine, aluna da professora Elenir, pela boa convivência e ajuda

durante minha permanência.

Agradeço à Dra Elenir, pelo esforço de aceitar revisar esta tese, em tão pouco

tempo, e pela grande colaboração dada. Algo que não seria possível se não

houvesse um elo de amizade.

Agradeço a minha banca: Dr(s) Olga Machado, Valdirene Moreira e César

Siqueira, pela preciosa contribuição, e por aceitarem avaliar esta tese, em tempo tão

limitado.

Agradeço a minha irmã Rosana, pelo sacrifício em manter a integridade da

minha família durante momentos tão difíceis da minha vida. Coisa que não poderia

ter feito, eu mesmo.

Agradeço a minha mãe pelo imenso esforço em continuar existindo, e assim

poder me ajudar e me admirar naquilo que eu faço.

Agradeço a Deus por poder ajudar os meus amigos quando possível. E por

poder ter esperança em viver um futuro melhor.

INDICE

LISTA DE FIGURAS..................................................................................................IV

LISTA DE TABELAS..................................................................................................VI

LISTA DE ABREVIATURAS.................................................................................... VII

Resumo....................................................................................................................VIII

Abstract…………………………………………………………………………..…………IX

1 – INTRODUÇÃO.......................................................................................................1

1.1 - Estudo de respostas de plantas a ferimento...................................................1

1.1.2 – O papel do ácido jasmônico e seus derivados............................................9

1.1.3 – O estresse de ferimento mecânico como ativador de defesa e suas

limitações em comparação ao estímulo da herbivoria.........................................10

1.2 – Detecção da indução de proteínas de defesa como indicação de resposta

a estresses................................................................................................................11

1.2.1- Polifenol oxidases – PFOs............................................................................12

1.2.2- Inibidores de proteinases serínicas.............................................................14

1.2.3 - Inibidores de proteinases cisteínicas - cistatinas .....................................15

1.3 – O esxudado de floema como fonte de hormônios vegetais.......................16

1.4- A espécie Vigna unguiculata no estudo de defesa vegetal..........................18

2 – OBJETIVOS GERAIS..........................................................................................20

2.1 – Objetivos específicos......................................................................................20

3 – MATERIAIS..........................................................................................................21

3.1 – Material biológico............................................................................................21

3.1.1 – Sementes.......................................................................................................21

3.2 – Reagentes........................................................................................................21

3.3 – Equipamentos..................................................................................................21

4 – METODOLOGIA……………………………………………………...………………..23

4.1 – Detecção, isolamento e caracterização de polifenol oxidases induzidas

por ferimento............................................................................................................23

4.1.1 – Condições de cultivo de plantas.................................................................23

4.1.2 – Tratamento por ferimento e obtenção de extratos protéicos..................23

4.1.3 – Quantificação da atividade polifenol oxidásica.........................................24

4.1.4 – Quantificação protéica.................................................................................25

4.1.5 – Eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições semi-

desnaturantes (SDS-PAGE).....................................................................................25

4.1.6 – Ensaio de atividade enzimática em gel......................................................26

4.1.7 – Isolamento de PFO induzida por ferimento...............................................26

4.1.8 – Parâmetros cinéticos da F- 0,2....................................................................27

4.1.8.1 - Ativação com SDS e estabilidade. ...........................................................27

4.1.8.2 – Medição de estabilidade térmica.............................................................27

4.1.8.3 - Determinação de pH ótimo de atividade .................................................28

4.1.8.4. – Especificidade a substratos e determinação de Km e Vmax .............28

4.1.8.5 – Ensaio de inibição de atividade polifenol oxidásica.............................28

4.2 – Detecção e caracterização de cistatinas induzidas por ferimento e

análises de parâmetros relacionadas.....................................................................29

4.2.1 – Condições de cultivo de plantas.................................................................29

4.2.2 – Tratamento por ferimento e obtenção de extrato protéico......................29

4.2.3 – Determinação da curva de atividade enzimática ......................................30

4.2.4 – Ensaio de inibição de atividade de proteinase cisteínica (dosagem de

cistatinas) .................................................................................................................30

4.2.5 – Eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes e

redutoras (SDS-PAGE) ............................................................................................31

4.2.6 – Detecção de proteínas imunologicamente relacionadas a cistatinas por

Western Blotting.......................................................................................................31

4.2.7 – Ensaio enzimático para proteases cisteínicas totais................................32

4.2.8 - Eletroforese semi-desnaturante em gel de poliacrilamida com gelatina

(SDS-PAGE-Gelatina) ..............................................................................................32

4.2.9 – Ensaio de ativação de senescência............................................................33

4.3 – Análise do efeito eliciador de esxudado de floema. ...................................33

4.3.1 - Extração de esxudado de floema................................................................33

4.3.2 – Teste de atividade indutora.........................................................................34

4.3.3 – Análise de esxudado de floema por espectrometria de massas.............35

5 – RESULTADOS ....................................................................................................36

5.1 - Quantificação e caracterização da atividade polifenol oxidásica induzida

por ferimento. ..........................................................................................................36

5.2 – Visualização de proteínas totais e polifenol oxidases em unifoliatos de

feijão-de-corda..........................................................................................................36

III

5.3 – Purificação parcial de PFOs induzidas por ferimento. ...............................37

5.4 – Ensaios de cinética enzimática da fração F- 0,2..........................................43

5.4.1 - Ativação e estabilidade com SDS. ..............................................................43

5.4.2 – Medição de estabilidade térmica................................................................43

5.4.3 - Determinação de pH ótimo de atividade de F- 0,2.....................................43

5.4.4 - Especificidade a substratos e determinação de Km e Vmax....................47

5.4.5 - Ensaio de inibição de atividade...................................................................49

5.5 – Detecção e caracterização de cistatinas induzidas por ferimento.............49

5.5.1 – SDS-PAGE e Western blot de cistatinas induzidas por ferimento. ........50

5.5.2 – Atividade proteinásica do tipo cisteínica em unifoliatos de feijão-de-

corda submetidos ou não a lesão mecânica.........................................................50

5.5.3 – Proteinases cisteínicas em unifoliatos de feijão-de-corda submetidos ou

não a lesão mecânica...............................................................................................50

5.5.4- Ensaio de ativação de senescência............................................................50

5.6– Análise da atividade indutora e caracterização de esxudado de floema....55

5.6.1 - Teste de indução de PFOs por esxudado de floema ................................55

5.6.2 – Detecção da presença de AJ em esxudado de floema por

espectrometria de massas......................................................................................55

6- Discussão....................................................... .....................................................58

6.1 – Análise da indução e caracterização de PFOs ............................................58

6.2 – Análise da indução, caracterização e efeito de cistatinas em unifoliatos de

V. unguiculata ..........................................................................................................62

6.3 – Análise da composição e efeito eliciador de defesa de esxudado de

floema........................................................................................................................65

7 - CONCLUSÕES..................... ...............................................................................68

8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................................70

LISTA DE FIGURAS

Figura 1 – Indução sistêmica hipotética de genes de inibidores de proteinases do

tipo 2 (pin2) estimulada por um sinal elétrico de propagação (Adaptado de Roberts,

1992) AJ – Ácido Jasmônico, ABA - Ácido Abscísico..................................................4

Figura 2 – Modelo do efeito sistêmico da liberação e transporte de sistemina sobre a

ativação de genes de defesa (Ryan, 2000)……………………………………………… 5

Figura 3 – Teste do potencial do mutante Spr1 para resposta sistêmica a ferimento.

…………......………............................................................….......................................7

Figura 4 – Modelo de sinalização sistêmica de defesa vegetal, evidenciando a ação

do AJ como sinalizador sistêmico de defesa................................................................8

Figura 5 – Interferência de diversos hormônios vegetais e moléculas sinalizadoras

sobre a sinalização de defesa causada por ferimento.................................................9

Figura 6 - Análise eletroforética mostrando variação de proteínas obtidas de floema

provocada por diferentes métodos de extração.........................................................18

Figura 7 - Esquema de tratamento por lesão mecânica e coleta das regiões de

plantas de feijão-de-corda..........................................................................................24

Figura 8 - Esquema de coleta de esxudado de floema de plantas de feijão-de-

corda...........................................................................................................................34

Figura 9 – Procedimento para teste de atividade indutora de PFO dos exsudados de

floema de feijão-de-corda...........................................................................................35

Figure 10 – Atividade de polifenol oxidase de extratos protéicos obtidos de

unifoliatos feridos (barras brancas), e laterais aos feridos (barras cinzas) de plantas

de feijão-de-corda.......................................................................................................39

Figura 11 – SDS-PAGE (I) e gel de atividade para PFO na ausência (II) e na

presença de tropolona 1mM (III)...............................................................................40

Figura 12 – Cromatograma de troca iônica em DEAE-celulose da fração 30-80%

clarificada de unfoliatos ferido de feijão-de-corda......................................................41

Figura 13 - Efeito do SDS sobre ativação da atividade de F-0,2. o ensaio foi feito

com 5 mM de 4-metil-catecol.....................................................................................44

Figura 14 - Estabilidade térmica de F-0,2 extraída de V. unguiculata.......................44

Figura 15 - Efeito da variação de pH sobre a atividade de F-0,2..............................46

Figura 16 - Gráfico de Lineweaver-Burk, mostrando dois diferentes perfis de cinética

enzimática..................................................................................................................48

Figura 17 - Indução de cistatinas em unifoliatos de V.unguiculata............................51

Figura 18 – A, SDS-PAGE dos extratos protéicos clarificados obtidos de unifoliatos

V.unguiculata............................. ...........................................................................52

Figura 19- Atividade total de proteases cisteínicas em unifoliatos de plantas de V.

unguiculata 24 horas após ferimento.........................................................................53

Figura 20 - Visualização eletroforética de proteases cisteínicas totais de uniofoliatos

de plantas de

V. unguiculata, 24 horas após ferimento.............................................54

Figura 21 - Unifoliatos de plantas de feijão-de-corda, submetidos a estresse de

senescência. ..............................................................................................................54

Figura 22- Teste de indução de atividade de PFOs por exsudados de floema.........56

Figura 23 – Espectrograma obtido a partir da análise por espectrometria de massas

de amostras de esxudados de feijão-de-corda..........................................................57

LISTA DE TABELAS

Tabela 1 - Perfil de atividade de PFOs de unifoliatos de feijão-de-

corda..................38

Tabela 2 - Etapas de purificação de F-0,2 de V.

unguiculata....................................42

Tabela 3 - Valores de atividade especifica de PFO de Vigna unguiculata, sobre 6

diferentes substratos comumente usados para caracterização de PFOs..................47

Tabela 4 - Valores de parâmetros de cinéticos medidos para F-0,2 de V.

unguiculata

.................................................................................................................49

Tabela 5 - Inibição percentual de PFO parcialmente purificada de V. unguiculata..49

VII

LISTA DE ABREVIATURAS

AOS - Aleno Oxido Sintase

AOC - Aleno Óxido Ciclase

ABA - Ácido Abscísico

AJ - Ácido Jasmônico

EDTA - Ácido Etileno Diamino Tetracetico

IP - Inibidor de Proteinase.

IPs - Inibidores de Proteinases.

Ja1 - Mutante insensível a AJ – 1

MeJa - Metil-Jasmonato.

MAPK - Proteína Quinase Ativadora de Mitose

LOX - Lipoxigenase.

α-LeA - Ácido Linolenico.

OPDA - Ácido 12-oxofitodienoico.

OPR - OPDA redutase.

PFOs - Polifenol oxidases.

PM - Membrana Plasmática

PMSF - Fenilmetil-sulfonil fluoreto

PLA - Fosfolipase A

spr1 - Supressor de sistemina 1

spr2 - Supressor de sistemina 2

R - Receptor

V - Vacúolo

VIII

Resumo

A espécie Vigna unguiculata foi amplamente estudada a respeito de proteínas

de proteção constitutiva, porém a indução de proteínas de defesa nesta espécie vem

sendo estudada só recentemente. Neste trabalho, plantas de V. unguiculata, quando

feridas, aumentaram os níveis de polifenol oxidases (PFOs) e cistatinas, proteínas

classicamente relacionadas com defesa, tanto local como sistemicamente. PFOs

induzidas em unifoliatos de Vigna unguiculata foram purificadas por cromatografia de

troca iônica (DEAE-celulose) e vistas como sendo proteínas solúveis e inativas,

sendo otimamente ativadas por SDS 5 mM. A enzima é altamente termo-estável e

seu pH ótimo foi 6,0. Maiores atividades específicas foram direcionadas aos

substratos 4-4-metil-catecol e catecol, além de ser fortemente inibida pelo inibidor

específico de polifenol oxidases, tropolona. Os parâmetros cinéticos de constante de

afinidade e velocidade máxima contra 4-metil-catecol e catecol foram Km = 9,86 mM,

Vmax = 24,66 UE [A min

-1

] e Km = 3,44 mM e Vmax = 6,64 EU [A min

-1

respectivamente. Também foram constatados aumentos nos níveis de cistatinas

(cerca de 33 %), 24 horas após o ferimento, em relação a plantas controle e

cistatinas de 22 kDa e 29 kDa foram vistas como induzidas, por técnica de Western

blotting. Atividade total de proteinases cisteínicas, por sua vez, foi inibida em plantas

feridas, e uma forma minoritária de protease cisteínica de 50 kDa, observada em gel

semi-desnaturante de gelatina-PAGE, foi a principal atividade inibida em unifoliatos

feridos. Interessantemente, tais unifoliatos de plântulas de feijão-de-corda feridas

foram vistos como mais resistentes à senescência promovida por escuridão, que os

de plantas controle. Uma correlação positiva entre a indução de cistatinas, inibição

específica de protease cisteínica e resistência à senescência é inferida a partir de

tais dados. Solução de exsudado de floema de plantas feridas de feijão-de-corda

mostrou-se capaz de induzir o aumento da atividade de PFO em plantas não feridas

ao nível de unifoliatos e a análise dessa fração por espectrometria de massas

revelou a presença de AJ nesta mesma fração, sugerindo que esta molécula atue

como um sinal sistêmico de resposta à lesão mecânica em plantas de V.

unguiculata.

Abstract

The species Vigna unguiculata (cowpea) has been widely studied in respect to

constitutive defense proteins, but the induction of defensive proteins has only

recently received some attention. At the present work,

V. unguiculata seedlings,

when injured, have increased their levels of polyphenol oxidases (PPO) and

cystatins, classical defense-related proteins, both locally and systemically. Unifoliate

induced PPOs were purified by ion-exchange chromatography (DEAE-cellulose) and

were seen to be soluble inactive proteins better activated at 5 mM SDS. The enzyme

was highly thermostable and optimum pH was 6.0. Highest specific activities were

directed towards the substrates 4-methyl-catechol and catechol, besides being

strongly inhibited by the PPO-specific inhibitor, tropolone. The affinity constant and

maximum velocity kinetic parameters towards methyl-catechol and catechol were

= 9.86 mM, Vmax = 24.66 EU [A min

-1

], and Km = 3.44 mM, Vmax = 6.64 EU [A

min

-1

], respectively. We have also detected increases at the levels of cystatins (ca.

33 %), 24 hours after the injury, when compared to control plants, and 22 kDa and 29

kDa cystatins were seen as induced forms, by Western blotting technique. Total

cysteine proteinase activity, by its turn, was inhibited in wounded plants, and a less

predominant 50 kDa cysteine protease form, detected in semi-denaturing gelatin-

PAGE gels, was the major inhibited activity in wounded unifoliates. Interestingly, such

unifoliates of wounded cowpea plants were seen to be more resistant to darkness-

promoted senescence than those of control plants. A positive correlation between

cystatin induction, specific cysteine protease inhibition and higher senescence

resistance in wounded plants is inferred from these data. A solution of phloem

exudates from wounded cowpea plants was shown to be able of inducing increase of

PPO activity when injected in plants of the same species, not-wounded at unifoliates

and the analysis of this exudate by mass spectrometry revealed the presence of JA,

suggesting that this molecule may act as a systemic signal during wounding

response in V. unguiculata.

1 - INTRODUÇÃO

1.1 - Estudo de respostas de plantas a ferimento.

Plantas, quando feridas, possuem a capacidade de mudarem a sua

constituição protéica, como um mecanismo de resposta a esse tipo de estresse.

Muitas dessas alterações podem estar diretamente relacionadas com defesa e

proteção. Entretanto outras modificações estão relacionadas com aspectos

diferentes do metabolismo vegetal, que deve adaptar-se a tal condição de estresse

(Ryan, 2000).

O trabalho que deu inicio aos estudos da resposta de defesa induzida em

plantas foi desenvolvido por Green & Ryan, quando em 1972, detectaram uma forte

indução, local e sistêmica, de um inibidor de quimiotripsina em folhas de plantas de

tomate, quando predadas pelo besouro da batata do Colorado (Leptinotarsa

decemlineata) ou quando mecanicamente injuriadas. A partir deste estudo pioneiro,

diversos trabalhos foram direcionados para o estudo de proteínas de defesa,

expressas, em plantas, frente não somente ao estresse de ferimento, como também

a resposta a pragas e patógenos. Porém havia uma importante questão a ser

respondida desde 1972: Qual seria o agente de sinalização responsável pela

transmissão do sinal, iniciado com o ferimento, para o restante da planta, uma vez

que a indução de defesa não se limitava ao sítio da lesão? Tal agente, antes mesmo

de ser descoberto, já era nomeado com a sigla PIIF, que quando traduzida significa

“Fator Indutor de Inibidores de Proteinases” (Ryan, 1974). Nesta mesma época,

também se constatou que plantas de tomate não eram as únicas que induziam a

expressão de inibidores de proteinases (IPs), quando estimuladas com extrato

vegetal contendo PIIF. Extratos foliares de mais 37 espécies de 20 famílias vegetais

também apresentaram esta mesma propriedade indutora de defesa (McFarland &

Ryan, 1974). Na época os autores atribuíram estes dados a possível presença de

substâncias similares a PIIF (PIIF-like) nos extratos protéicos testados, uma vez que

ainda não se conhecia nada a respeito da natureza dos eliciadores de indução

possivelmente presentes nestes extratos brutos, apesar de sugeridos vários

candidatos tais como o ácido jasmônico (AJ) e seu éster, metil jasmonato (MeJa).

Por algum tempo vários estudos concentraram-se na tentativa de identificação de tal

fator. Alguns trabalhos sugeriram que agentes de natureza não química, tais como

diferenças de potencial elétrico de membranas (Wildon et al. 1992; Volkov & Haack,

1995) e de potenciais hidráulicos (Tyree, 1970) fossem responsáveis pela

sinalização e aumento da expressão de proteínas de defesa. No entanto, a

descoberta de um componente protéico funcionando como ativador e sinalizador de

resposta sistêmica de defesa em plantas foi uma extraordinária conquista de Dr.

Clarence Ryan e seu grupo de pesquisa, da Washington State University (Pullman-

EUA). A descoberta de uma molécula capaz de aumentar intensamente a síntese de

inibidores de proteinases, denominada sistemina, um dos primeiros hormônios

peptídicos vegetais descobertos, foi publicada por Pearce

et al. (1991). Roberts

apresentou, em sua revisão (figura 1), um modelo de ativação de defesa no qual o

estimulo de ferimento promoveria um sinal elétrico, que atingiria em áreas vizinhas,

interferindo na ação dos hormônios de defesa ABA, AJ e sistemina. Além disso, essa

via também é inibida por ácido salicílico (aspirina) e auxina. Posteriormente foi visto

que sistemina poderia ser conduzida pelo floema após a lesão (Ryan et al., 1995),

induzindo assim a síntese de inibidores de proteinases em células de tecidos

distantes do ponto lesionado, mediando respostas de defesa sistêmica em plantas

(Ryan, 2000). Confirmavam-se, pois, as suspeitas dos pesquisadores sobre a

existência de um fator molecular responsável pela transmissão de um sinal, iniciado

por injúria mecânica, anteriormente descrito como PIIF.

No início dos anos 90, o PIIF foi identificado e caracterizado como sendo um

hormônio peptídico, encontrado por Pearce

et al. (1991) em folhas de tomate, e

assim denominado sistemina. A sistemina foi o primeiro sinalizador peptídico

descrito em plantas, e estudos posteriores revelaram que este peptídeo origina-se

de um precursor de 200 aminoácidos denominado pró-sistemina (Ryan

et al., 1995),

que é clivada quando o tecido vegetal é ferido, liberando o peptídeo de 18

aminoácidos (sistemina), via tecido condutor (floema) para todo o organismo vegetal.

Os dados obtidos, desde então, mostram que a indução de proteínas de

defesa é um processo complexo que segue um determinado cronograma. Estudos

feitos com tomate mostram que o ferimento inicial induz a liberação de sistemina

logo nos primeiros minutos (Ryan, 2000). Este hormônio migra via floema, até ligar-

se a seu respectivo receptor em células vegetais de várias regiões da planta,

induzindo a síntese de metil-jasmonato que, por sua vez, induz a produção de

proteínas relacionadas com defesa, tais como inibidores de proteinases (Farmer &

Ryan, 1992). Uma longa cascata de sinalização iniciada pela sistemina torna este

hormônio muito potente, bastando lembrar que foram necessários 30 kg de folha

para o isolamento de 1g do material, mas que apenas essa quantidade deste

peptídeo foi capaz de induzir a produção máxima de inibidores de proteinases

serínicas em 4 x 10

plantas de tomate (Pearce et al., 1991).

Após a descoberta da sistemina não houve grandes avanços no sentido de

estudar outras formas protéicas relacionadas com indução de proteínas de defesa.

Em 2000, Pearce conseguiu isolar, de plantas de tabaco, dois peptídeos capazes de

induzir a expressão de inibidores de proteinases serínicas nesta espécie vegetal.

Curiosamente, assim como a sistemina não é capaz de induzir expressão de IPs em

plantas de tabaco, os hormônios “sistemina-like” de tabaco, denominados

tobsistemina 1 e tobsistemina 2, não são capazes de exercer qualquer atividade

indutora em plantas de tomate, mesmo sendo estas duas espécies vegetais

pertencentes à mesma família (Solanaceae). Além desse fato, as seqüências

peptídicas destes hormônios não apresentam qualquer homologia com a sistemina

de tomate, o que evidencia que a sistemina de tomate não é um hormônio universal

de indução de defesa, e que diferentes espécies podem ter suas defesas induzidas

por diferentes agentes eliciadores (Pearce et al., 2000). Tal sugestão foi confirmada

com a descoberta e caracterização de hormônios peptídicos, em diferentes espécies

da família das solanáceas, tais como batata, petúnia e beladona, apresentando as

mesmas diferenças estruturais e semelhanças de atividade biológica mencionadas

entre sisteminas de tomate e tabaco. Com base nestes dados foi criada uma nova

classificação para estes hormônios denominada família das sisteminas que é

constituída por peptídeos de baixa massa molecular, entre 15 e 20 resíduos de

aminoácidos, e um elevado efeito de indução de resposta a ferimento, podendo

atuar em concentrações abaixo da ordem de nanomolar (Pearce et al., 2006).

Este trabalho, bem como outros do mesmo grupo, nos quais experimentos

indicativos também haviam revelado a participação do fitohormônio ácido jasmônico,

e seu éster volátil, metil-jasmonato (MeJa), reproduziram-se de forma similar em

várias espécies vegetais (Ryan, 2000), sendo um modelo para os estudos deste tipo.

Neste novo modelo de indução de defesa, o ferimento causado em uma área da

planta causaria a liberação de sistemina, que migraria e se ligaria ao seu respectivo

receptor ativando uma cascata de sinalização, iniciada por despolarização de

membrana, e cujos eventos subseqüentes acreditam-se sejam: efluxo de cálcio do

vacúolo (V); ativação de enzima MAPK (Proteína quinase ativadora de mitose);

ativação de uma fosfolipase A2 (PLA2) pela MAPK; liberação de ácido linoléico da

membrana plasmática por ação da PLA2; aumento da síntese de ácido jasmônico,

que atuaria diretamente na ativação de genes de defesa (figura 2).

Figura 1 – Indução sistêmica hipotética de genes de inibidores de proteinases do

tipo 2 (pin2) estimulada por um sinal elétrico de propagação (Adaptado de Roberts,

1992) AJ – Ácido Jasmônico, ABA - Ácido Abscísico.

Em 2003, foi publicado um trabalho (Lee & Howe, 2003) no qual um elegante

experimento foi feito com enxertos entre plantas do tipo selvagem e o mutante spr1 -

recessivo ao gene que codifica o receptor para sistemina SR160. Na figura 3

mostram-se os seguintes detalhamentos experimentais: (a) Um porta-enxerto do tipo

selvagem gera um sinal, quando ferido, que é percebido por um enxerto do mesmo

tipo inserido, resultando em um alto nível de transcrição de IPs. (b) A transcrição de

IPs em porta-enxertos spr1 é forte, porém drasticamente reduzida na parte

enxertada do mesmo tipo. (c) No híbrido de enxerto em que o tipo selvagem é

inserido sobre um porta-enxerto do tipo spr1, o porta-enxerto responde ao ferimento

como em (b). Entretanto, níveis de transcrição de IPs são fortemente reduzidos na

inserção do tipo selvagem. Porém como visto em (d), em uma condição recíproca

(spr1 - tipo selvagem), IPs acumulam-se em ambas as partes, indicando que

Ferim ento

Fusicocina

Aspirina

C aule

Aux ina

[D ]

pin 2

[

Sistem ina

]

[A B A ]

C otil

done

P rim eira folha

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Sina l e l

étrico propaga d o

Ferim ento

usicocina

Aspirina

C aule

A ux ina

pin 2

S is tem ina

AB A

C otil

done

P rim eira folha

verdadeira

Sina l e l

étrico propaga d o

incisões de enxertos spr1 podem perceber um sinal sistêmico iniciado por ferimento

em um porta-enxerto do tipo selvagem (adaptado de Stratmann, 2003).

Figura 2 – Modelo do efeito sistêmico da liberação e transporte de sistemina sobre a

ativação de genes de defesa (Adaptado de Ryan, 2000). O aumento de Ca

citossólico e a ativação de MAPK são considerados como intermediários do

processo. MAPK - Proteína quinase ativadora de mitose; PLA2 - Fosfolipase A – 2;

PDA – Ácido fitodienóico; R – Receptor; V – Vacúolo.

O resultado do trabalho descrito acima revelou que a indução de proteínas de

defesa (IPs) ocorre mesmo em mutantes de plantas incapazes de reconhecer

sistemina (spr1). Por outro lado, em mutantes spr2 (recessivos para síntese de ácido

jasmônico) e Jai1 (recessivo para o reconhecimento do sinal AJ) a defesa sistêmica

foi totalmente extinta (figura 4). Tais dados mostraram que, diferentemente do que

Prosistemina

Liberação

Sistemina

Transporte

Etileno

Acido

Jasmônico

Acido

Linoleico

Ativação de Genes

de Defesa

Pró-sistemina

Liberação

Sistemina

Transporte

Etileno

Ácido

Jasmônico

Ácido

Linolênico

Ativação de Genes

de Defesa

se cogitava, o ácido jasmônico, e não a sistemina, teria um papel de indutor

sistêmico da resposta de defesa vegetal (Lee & Howe, 2003; Stratmann, 2003).

Neste novo paradigma, novamente estímulos elétricos e hidráulicos liberados

durante o ferimento poderiam estar afetando a produção de AJ, mas de uma forma

ainda desconhecida, deixando margem a novas pesquisas sobre o assunto

(Stratmann, 2003). Neste mesmo trabalho constata-se que a sistemina tem um papel

central na sinalização sistêmica, onde agiria como um estimulador local da produção

de AJ, controlando sua produção por um sistema de “feedback” positivo, e atuando,

assim, como um hormônio parácrino na defesa vegetal. Porém a sua ação mais

importante estaria em estimular o envio de AJ para outras partes não feridas. A falta

de resposta ao hormônio sistemina em mutantes

spr1 não afeta a indução local de

inibidores de proteinases (Stratmann, 2003) (figura 3). Isto porque a produção local

de AJ pode também estar sendo aumentada por outros estímulos oriundos do

ferimento, em um processo ainda não bem caracterizado.

Consta na literatura que uma diversidade de hormônios agem juntamente

com a sistemina no estímulo das enzimas da via de síntese de ácido jasmônico em

plantas de tomate, espécie vegetal que representa o modelo inicial deste tipo de

estudo (Wasternack

et al., 2006) (figura 4). Sabe-se hoje que enzimas responsáveis

pela via de síntese do ácido jasmônico tais como aleno óxido sintase (AOS), aleno

óxido ciclase (AOC) e lipoxigenase (LOX) têm suas expressões e atividades

intrinsecamente ligadas à ativação da via de defesa, representada pela liberação de

sistemina e aumento de vários hormônios, que antes estavam apenas relacionados

com outras vias (figura 4). Ocorreria assim o aumento da síntese de ácido jasmônico

e de seus precursores, quase que exclusivamente em elementos de tubo crivado e

células companheiras dos tecidos condutores do floema (Hause et al., 2003).

No final da primeira década do século XXI ainda restam muitas questões

acerca da ocorrência mútua e interferência entre diferentes vias de sinalização

reguladas por diferentes hormônios. Porém já é estabelecido que o processo de

sinalização de defesa acionado por ferimento não é algo linear, mas sim ocorrendo

em uma complexa rede hormonal (Wasternack et al., 2006) (figura 5). Outra questão

importante é reconsiderada a partir dos dados recém obtidos: AJ é considerado o

candidato atualmente mais evidente para sinalizador sistêmico de defesa, mas seria

este o único? Embora estudos feitos com mutantes acx1 (recessivos para enzima

Acil–CoA oxidase, responsável pela oxidação de ácidos graxos relacionados com a

via do AJ) mostrem uma forte evidência de que AJ ou compostos relacionados

tenham tal papel, uma dúvida permanece: Como um sinal produzido no floema pode

ativar a expressão de IPs que ocorrem exclusivamente em células do mesófilo? Por

outro lado, ainda não é conhecido o mecanismo pelo qual a sistemina, presente no

mesófilo, atua na ativação da síntese de AJ no floema (Wasternack et al., 2006).

Outro dado marcante do modelo atual é que a concentração de AJ em folhas não

feridas é muito inferior à encontrada em folhas feridas de tomate (Laudert & Weiler,

1998; Bowles, 1998; Rojo et al. 1999), a ponto de somente este hormônio não

exercer todo efeito indutor predito, o que leva a hipótese da existência de elementos

auxiliares ainda desconhecidos nesta rota de sinalização. Peróxido de hidrogênio

tem sido considerado como uma importante molécula sinalizadora; é um bom

candidato, pois apresenta alta mobilidade entre tecidos migrando inclusive via

apoplasto, e tem forte potencial de ativação sobre a via de formação de AJ (Orozco-

Cárdena et al. 2001). No entanto, são necessários estudos adicionais a respeito do

envio deste sinal em processo de resposta sistêmica a ferimento.

Figura 3 – Teste do potencial do mutante Spr1 para resposta sistêmica a ferimento.

Plantas foram enxertadas em quatro combinações distintas. Linhas horizontais

paralelas representam o ferimento e retângulos no caule representam a junção do

Tipo selvagem

Porta-

enxerto

enxerto. Folhas verde claro e verde escuro indicam níveis baixos e altos de acúmulo

de transcrição de Ips, respectivamente (adaptado de Stratmann, 2003).

Figura 4 – Modelo de sinalização sistêmica de defesa vegetal, evidenciando a ação

do AJ como sinalizador sistêmico de defesa. Dados de trabalhos com mutantes de

plantas insensíveis à ação de sistemina (spr1 e spr2), e ao efeito do AJ (jai1) foram

usados (adaptado de Stratmann, 2003).

Figura 5 – Interferência de diversos hormônios vegetais e moléculas sinalizadoras

(Ácido salicílico - SA; Ácido abscísico – ABA; Etileno; Peróxido de hidrogênio –

; Óxido nítrico - NO; Oligogalacturonídeos – OGAs; e F Sintase AOC - Aleno

Óxido Ciclase; α-LeA - Ácido Linolênico, OPR3 - Ácido 12-Oxofitodienóico Redutase

– 3 (Wasternack et al., 2006).

1.1.2 – O papel do ácido jasmônico e seus derivados

O primeiro trabalho demonstrando o efeito do ácido jasmônico como um

hormônio de ação vegetal foi publicado em 1971. Neste, o ácido jasmônico isolado

de culturas do fungo Lasiodiplodia theobromae mostrou efeito inibitório sobre o

desenvolvimento de calos de plantas (Adridge et al., 1971). Este hormônio vegetal é

sintetizado a partir do ácido linoléico, um ácido graxo tri-insaturado, através de uma

rota metabólica, conhecida como rota octadecanóide. Seu derivado mais conhecido

é o metil-jasmonato, um éster volátil capaz de induzir defesa em outras plantas

próximas a de origem (Farmer & Ryan, 1990). Foi descrito como um componente de

M esófilo

Sistêm ica

Prosistem ina

Sistem ina

IP2

G en es de

defesa

IP2

G en es de

defesa

M esófilo

Sistêm ica

Prosistem ina

Sistem ina

IP2

G en es de

defesa

IP2

G en es de

defesa

óleos essenciais de Jasminum grandiflorum (jasmim), o que deu origem ao seu

nome. A primeira evidência mostrando a participação do AJ como hormônio de

defesa foi descrita em 1990, quando seu éster foi capaz de induzir a expressão de

inibidores de proteinases em espécies de fabáceas e solanáceas, em uma câmara

fechada (Farmer & Ryan, 1990). Embora tenha sido mostrado que metil-jasmonato

era capaz de induzir a expressão de IP em plantas de tomate dentro de câmaras

fechadas, em ambiente aberto, este efeito somente ocorre quando plantas de tomate

estão próximas a plantas da espécie

Artemisia tridentata, que produz grande

quantidade de MeJa. A produção e liberação desse hormônio em plantas de tomate

feridas não ocorre em quantidade suficiente para estimular a indução de IPs em

plantas vizinhas (De Bruxelles & Roberts, 2001). Por outro lado, a importância do AJ

como molécula sinalizadora foi vista desde 1992 quando o seu acúmulo foi capaz de

modular genes relacionados com defesa estimulados por ferimento (Greelman et al.,

1992). Os níveis de AJ atingem o pico de formação logo nas primeiras horas após o

ferimento (Ryan, 2000). Muitos destinos metabólicos foram identificados para o AJ

após esse momento, além da formação de MeJa; AJ pode sofrer sulfatação,

glicosilação, metilação, além de reação com etileno (Wasternack et al., 2006). Tais

destinos refletem a importância da degradação deste, como um controle da

sinalização, evitando-se um estímulo excessivamente prolongado. Porém,

conjugados de jasmonatos com os aminoácidos isoleucina e leucina apresentaram

um poder de ativação de genes de defesa em plantas de

Phaseolus lunatus cinco

vezes maior que ácido jasmônico não conjugado (Krumm

et al., 1995). Tais dados

reforçam a importância da busca por novas moléculas sinalizadoras de defesa.

1.1.3 – O estresse de ferimento mecânico como ativador de defesa e suas

limitações em comparação ao estímulo da herbivoria

A técnica de exercer um ferimento mecânico em plantas como uma mímica à

ação de insetos mastigadores é estratégia que muito contribuiu para o estudo do

processo de sinalização de defesa em plantas (Ryan, 2000). No entanto, é evidente

que há distintas diferenças entre estes dois estresses de indução; primeiramente, o

ferimento mecânico não consegue imitar a liberação de FACs (aminoácidos

conjugados a ácidos graxos), comumente liberados pela saliva de insetos

mastigadores e que são importantes indutores da via octadecanóide (Turlings et al.,

1995). Além disso, um dos dados mais conflitantes entre estes dois estresses vem

de experimentos com plantas de

Arabidopsis thaliana (Reymond et al., 2000), as

quais foram tratadas com três diferentes estresses: hídrico, ferimento e mastigação

por inseto. Neste trabalho a expressão de genes de defesa foi analisada por técnica

de “microarrays” e foram constatadas as ativações de mais de 150 genes

relacionados com ferimento mecânico e mastigação de insetos, sendo mais da

metade destes genes também dependentes da via do AJ. Porém, neste mesmo

trabalho foi visto que apenas um gene, dos 150 examinados, foi induzido por ação

de insetos e não por ferimento mecânico. Um outro intrigante trabalho feito com

plantas de tomate revelou que a expressão de uma RNase era aumentada frente ao

tratamento por ferimento mecânico, mas não sob o efeito da aplicação de sistemina

ou AJ. Esta enzima teve a sua expressão rapidamente aumentada nas primeiras dez

horas, somente a nível local do ferimento. Os estudos feitos a respeito de sua função

revelaram que ela estava envolvida no processo de senescência, sugerindo-se que

uma nova via de sinalização provocada por ferimento, independente de sistemina e

AJ, poderia estar atuando (Groβ et al., 2004). Tais informações são muito úteis, por

validarem o estimulo ferimento mecânico como tratamento para o estudo da defesa

vegetal em comparação à ação de insetos. Ao mesmo tempo, evidencia a clara

limitação de um tratamento, quando comparado aos demais mencionados acima.

1.2 – Detecção da indução de proteínas de defesa como indicação de resposta

a estresses

Plantas submetidas a estresses, como durante o ato de herbivoria,

desenvolveram estratégias de proteção específicas. Dentre estas se destacam:

formação de inibidores de proteinases; aumento da produção de compostos tóxicos

do metabolismo secundário, tais como nicotina ou outros fenóis ou alcalóides; e

emissão de compostos voláteis que atraem predadores dos insetos herbívoros

(Wasternack et al., 2006). Dentre muitas proteínas de defesa sistemicamente

induzidas em resposta a herbivoria, foram tomados, como parâmetros de análise, o

aumento de inibidores de proteases e o aumento da expressão de polifenol

oxidases, ambas selecionadas como proteínas indicadoras de resposta de defesa

induzida, no presente trabalho.

1.2.1- Polifenol oxidases – PFOs

Polifenol oxidases são enzimas que catalisam a oxidação dependente de

oxigênio de monofenóis (ex. L-tirosinases ou cresolases) ou orto-difenóis (ex.

catecolases, lacases) a ο-diquinonas (Steffens et al., 1994). Em plantas elas estão

fracamente aderidas à face lumenal da membrana interna ou no lúmen de tilacóides

(Steffens

et al. 1994) e são encontradas em múltiplas isoformas. Atuam produzindo

ο-diquinonas, que são compostos altamente reativos que se ligam a aminoácidos

livres ou em resíduos de aminoácidos de moléculas protéicas, tornando-as

insolúveis e com baixo potencial nutritivo (Matheis & Whitaker, 1984; Garcia-

Carmona

et al., 1988). Muitas polifenol oxidases de plantas apresentam latência,

identificada por um aumento de atividade quando em pH 6,0, ou pela ativação por

tratamento com proteases (tripsina ou protease K) ou concentrações milimolares de

SDS (Sellés-Marchart

et al., 2006).

Vários genes de PFOs de plantas codificam proteínas maduras entre 52-65

kDa, e um peptídeo de endereçamento de 8 a 12 kDa, que são responsáveis pelo

transporte da enzima para dentro do lúmen dos tilacóides de cloroplastos (Demeke &

Morris, 2002). Embora PFOs já tenham sido encontradas em plantas há mais de um

século (Bertrand, 1896), um conhecimento completo sobre seu papel nesses

organismos ainda não foi alcançado. Funções distintas foram atribuídas a PFOs, tais

como: pigmentação e enegrecimento do tecido vegetal (Boonsiri

et al., 2007;

Valentines

et al., 2005); ação na reação de Mehler, uma vez que atua transferindo

elétrons de um substrato fenólico para o oxigênio, em uma cadeia transportadora de

elétrons, aumentando o consumo deste durante a foto-respiração (Thipyapong et al.,

2004); e proteção de plantas contra pragas e patógenos (Constabel & Ryan, 1998).

Este amplo espectro de idéias sobre os papéis de PFOs reflete o parcial

entendimento das funções de PFOs em plantas (Mayer, 2006). A habilidade natural

de PFOs de oxidarem fenóis ou polifenóis reflete seu mecanismo de ação como

proteína de defesa, já que as -diquinonas originadas têm maior capacidade de

ligação e precipitação de proteínas e são mais tóxicas aos predadores de plantas do

que os fenóis originais (Felton et al., 1992). Já foi relatada a presença de PFOs

latentes em diversas espécies de plantas (Sellés-Marchart et al., 2007; Laveda et al.,

2002; Chazarra et al., 1997; Moore & Flurkey, 1988). Tal estado latente de algumas

PFOs reforça mais ainda a sugestão de um papel de defesa atuando posteriormente

ao ato de herbivoria em plantas, ao contrário do que é visto em formas ativas de

PFOs presentes em frutos maduros ou tecidos vegetais pigmentados. Por esse

raciocínio, PFOs latentes poderiam ser alvo de processos acionados pela injúria de

tecidos, através dos quais seriam ativadas por proteólise, conduzindo a ação da

enzima sobre os seus substratos, e evidenciando uma função protetora somente

durante o ataque de predadores (Mazzafera & Robinson, 2000). Dado que reforça

esta idéia é o fato de que PFOs se encontram em tilacóides, enquanto seus

substratos fenólicos estão presentes no vacúolo, de forma que estas moléculas

entram em contato somente após o ato de ferimento mecânico ou mastigação dos

tecidos por um herbívoro (Whitaker & Lee, 1995).

PFO é a proteína de defesa mais intensamente induzida em plantas de

tomate submetidas a ferimento ou a tratamento com vapor de metil-jasmonato. De

modo ainda mais geral, o aumento dos níveis de PFOs em plantas, causado por

ferimento ou por borrifações de MeJa, parece ser uma estratégia de defesa induzida

muito difundida entre diversas espécies vegetais, tal como foi visto em plantas de

tomate, tabaco, soja, ervilha dentre outras (Constabel & Ryan, 1998). No entanto a

resposta de indução desta enzima frente a estas duas formas de ativação é, na

maioria das vezes, diferente (Constabel et al., 1995; Constabel & Ryan, 1998).

A própria habilidade de PFOs de oxidarem fenóis ou polifenóis reflete seu

mecanismo de ação como uma proteína de defesa, já que as quinonas originadas

ligam-se e precipitam proteínas, sendo mais tóxicas ao predador que os fenóis

inicialmente encontrados nos tecidos da planta. Estas moléculas derivadas de fenóis

conferem características antinutricionais aos tecidos vegetais, inibindo, por exemplo,

a digestão de insetos roedores (Doan et al., 2004; Felton et al., 1992). O aumento da

resistência da parede celular é um outro aspecto da ação defensiva de PFOs, uma

vez que estas enzimas colaboram com a formação de lignina (Yuan et al., 2002;

Aquino-bolaño & Mercado-Silva, 2004). PFOs também têm um marcante papel de

defesa contra patógenos, sendo a ação destas enzimas uma das principais

respostas de defesa à infecção fúngica (Mohammadi & Kazemi, 2002), através de

sua participação no processo de síntese de melanina, a qual forma complexos

insolúveis com os fenóis oxidados pelas próprias PFOs, gerando uma barreira

resistente a entrada e espalhamento de patógenos. Inclusive a própria resposta de

hipersensibilidade e formação de área pigmentada durante o processo de resistência

sistêmica adquirida (SAR), é decorrente da indução e ação de PFOs. Aliando-se às

informações mencionadas acima, é certo destacar que a hipótese do papel

defensivo desta classe de proteínas foi marcantemente reforçada pela confirmação

da regulação da sua expressão, através da via octadecanóide, estando vinculada à

síntese de AJ e do sinal de defesa a ferimento, a sistemina (Pearce et al. 1991;

Constabel et al., 1995; Constabel & Ryan., 1998; Ryan, 2000). Além destes dados, o

seu efetivo efeito de proteção contra a lagarta militar (

Spodoptera litura) em plantas

de tomate geneticamente modificadas para superexpressão de PFO, reforça essa

idéia (Mahanil

et al., 2008).

1.2.2 - Inibidores de proteinases serínicas

Os inibidores de proteinases são potentes inativadores de enzimas

proteolíticas, mas também podem ativar mecanismos de “feedback” causando

superexpressão de proteases digestivas e perda de apetite em insetos herbívoros

(Ryan, 1990). No reino vegetal, a maioria dos inibidores de proteinases estudados é

das famílias Leguminosae, Solanaceae e Gramineae (Richardson, 1991).

Inibidores de proteinases serínicas são proteínas de defesa há muito tempo

estudadas. Este grupo representa o mais estudado entre todos os outros inibidores

de proteases conhecidos e se divide em dois grandes subgrupos: inibidores do tipo

Kunitz e do tipo Bowman–Birk. O marco deste estudo foi o trabalho de Mickel &

Standish, de 1947, no qual foi visto que larvas de alguns insetos não eram capazes

de se desenvolver em produtos derivados de soja. Posteriormente, essas proteínas

de defesa também representaram uma referência inicial nos estudos de indução de

defesa vegetal por ferimentos (Green & Ryan, 1972), onde foi vista a indução local e

sistêmica destes inibidores em plantas de tomate quando predadas pelo besouro

colorado da batata. Nesta mesma ocasião também foi constatado que o ferimento

mecânico nas folhas do tomateiro causava um efeito similar de indução. O primeiro

trabalho de transformação de plantas com inibidores de proteinases serínicas foi

desenvolvido em 1987 (Hilder

et al., 1987), onde o gene codificante destes

inibidores, originário de sementes de Vigna unguiculata, foi transferido para plantas

de tabaco, conferindo, a estas, resistência contra diversas pragas, incluindo

lepidópteros dos gêneros Heliothis e Spodoptera, coleópteros dos gêneros

Diabrotica e Anthonomus e ortópteros do gênero Locust (Lawrence & Koundal,

2002).

Embora inibidores de proteinases serínicas tenham grande potencial para

inibir proteinases serínicas, o besouro da batata do Colorado é capaz de induzir a

expressão de enzimas digestivas do tipo cisteínicas, quando alimentado com altos

níveis desses inibidores (Michaud et al., 1995). Fenômenos de adaptação similares

a esse põem em cheque a utilização destas proteínas e de seu potencial inseticida

em programas de melhoramento vegetal via engenharia genética.

1.2.3 - Inibidores de proteinases cisteínicas - cistatinas

O termo cistatina foi atribuído pela primeira vez por Barrett & Kirschke (1981)

a uma proteína de clara de ovo de galinha, dando origem ao nome dessa classe de

inibidores (“cisto = ovo”). Tais inibidores apresentam a propriedade de inibir

proteinases cisteínicas. Outras proteínas que apresentavam propriedades biológicas

e estruturais semelhantes a esta cistatina foram agrupadas (Barrett et al., 1987) e

desta forma, a superfamília das cistatinas foi dividida em três famílias constituintes:

família 1, com cistatinas A e B; família 2, com cistatinas C, D, E/M, F, S, SN e AS; e

família 3, com os cininogênios de alto e baixo peso molecular. Embora tenham sido

inicialmente encontradas em animais, também foram encontradas em plantas, não

muito tempo depois (Abe et al., 1987). As cistatinas de todos os grupos são

caracterizadas por apresentarem em comum, uma resíduo de glicina na porção N-

terminal, um “motif” constituído da seqüência QxVxG, que interage diretamente com

o sitio catalítico da enzima, e um resíduo de triptofano na porção carboxi-terminal

(Machleidt et al., 1989). Porém, todas as fitocistatinas diferem das demais por uma

seqüência específica de cistatinas de plantas (LVI]-[AGT]-[RKE]-[FY]-[AS]-[VI]-x-

[EDQV]-[HYFQ]-N), presente na porção amino-terminal e com estrutura em α-hélice

prevista (Margis et al., 1998).

Muitos coleópteros possuem proteinases cisteínicas como principais enzimas

proteolíticas em seu trato digestivo. Outros, como o besouro da batata do Colorado,

podem induzir proteinases cisteínicas em resposta a uma alimentação rica em

inibidores de proteinases serínicas (Jongsma et al., 1995; Cloutier et al., 2000; Zhu-

Salzman et al., 2003). A produção de plantas transgênicas com genes de cistatinas

vem sendo uma boa alternativa para proteção contra insetos que utilizam

proteinases cisteínicas em sua digestão protéica (Michaud et al., 1993). Entretanto, o

fenômeno de adaptação, anteriormente citado para o caso de inibidores de

proteinases serínicas, põe em cheque a utilização destas proteínas e de seu

potencial inseticida em programas de melhoramento vegetal via engenharia

genética. Por outro lado, não há evidências de que cistatinas atuem contra

mamíferos, sendo este um ponto positivo para sua utilização (Lawrence & Koundal,

2002). Além disso, trabalhos feitos com plantas transformadas com essas proteínas,

evidenciaram significativa proteção contra nematóides e patógenos (Haq

et al.,

2004). Isto porque proteinases cisteínicas estão presentes em grande quantidade

nestes organismos. Também é constatado, na literatura, o aumento da resistência

aos vírus TEV e TVY de plantas de tabaco e batata, respectivamente, transformadas

com genes exógenos de orizacistatinas (Gutierrez-Campos

et al., 1999). No entanto

fatos como os casos de adaptação acima destacados preocupam os cientistas

envolvidos em pesquisas direcionadas a estratégia de transformação de plantas

(Fernandes et al., 1993; Flores et al., 2001).

Além desta função direta de defesa contra pragas e patógenos, há trabalhos

recentes apontando para o papel desta proteína como atuante no processo de morte

celular programada em plantas (Belenghi et al., 2003). Segundo estes, cistatinas de

massa molecular em torno de 10 kDa estariam, juntamente com proteinases

cisteínicas, fazendo parte de uma cascata de sinalização ainda não bem elucidada,

na qual as cistatinas estariam reprimindo o desencadeamento de morte celular

programada em células vegetais, via liberação de óxido nítrico (NO). Estes trabalhos

citados apontam uma retomada ao estudo de transformações com estas proteínas,

porém com um enfoque não tão limitado, quando comparado ao de uma década

atrás, onde cistatinas eram vistas somente como biopesticidas.

1.3 – O esxudado de floema como fonte de hormônios vegetais

Em 1991, Pearce et al. idealizaram um experimento com o intuito de

investigar a natureza do processo de indução sistêmica em plantas de tomates,

bem como identificar a molécula sinalizadora responsável pelas respostas

sistêmicas destas plantas. Submergiram folhas de tomate destacadas da planta

íntegra em solução contendo diferentes frações protéicas obtidas de plantas de

tomate, e observaram a indução (ou não) de inibidores de proteinases serínicas

nos extratos protéicos obtidos destas folhas. A indução destes inibidores serviu

como constatação para a presença de um agente eliciador de defesa, na fração

testada como positiva, e que mais tarde seria caracterizada como sendo o

hormônio peptídico sistemina, que atualmente tem sua via de transporte muito

bem elucidada, sendo um hormônio conduzido pelo floema.

A via do floema é conhecida há muito tempo como a principal via de

transporte de nutrientes elaborados (fotoassimilatos) pelo organismo vegetal.

Recentes trabalhos mostram que o floema não está limitado apenas ao transporte

de sacarose; aminoácidos estão entre seus principais componentes sólidos,

dentre outros nutrientes. Existe uma verdadeira rede de comunicação molecular

fluindo dentro do floema, ativando e desativando diversos processos metabólicos

inclusive aqueles relacionados com defesa (Ryan, 2000). Sistemina, por exemplo,

flui do ponto de lesão para todo o organismo vegetal pela via do floema. A

principal vantagem do fluxo de moléculas sinalizadoras por esta via é a alta

velocidade de transporte, podendo chegar a cem centímetros por hora. Outra

característica importante desse fluxo é que este ocorre nos dois sentidos pelo

caule, o que permite uma melhor comunicação entre folhas (Buchanan et al.,

2000), diferentemente do fluxo do xilema que só ocorre no sentido raiz  folha.

Apesar da sistemina e outros hormônios peptídicos serem transferidos via floema,

o conteúdo deste é muito pobre em componentes de constituição protéica e

peptídica, podendo chegar a valores de 0,2 a 2 mg / L, na maioria das espécies

vegetais, exceto em cucurbitáceas, onde os valores atingem de 40 a 100 mg / L

(Buchanan et al., 2000). Uma característica marcante da composição do floema é

a sua alta variação de componentes protéicos, frente à ação de um ferimento,

como visto na figura 5, onde é possível perceber que o perfil protéico do

esxudado coletado diretamente de ferimento impingido ao tecido vegetal é muito

diferente daquele coletado via extração por estilete de um inseto sugador. Tal

diferença é atribuída ao fato que insetos sugadores, afídios de um modo geral,

não disparam nenhuma cascata de sinalização de defesa uma vez que seu

aparelho de sucção não atravessa nenhuma célula do mesófilo, apenas

perfurando e sugando células do floema (Buchanan et al., 2000). Apesar das

baixas concentrações mencionadas, o esxudado de floema pode ser um

excelente meio para o isolamento de hormônios vegetais por apresentar uma

baixa variedade de compostos, de toda natureza, quando comparados a extratos

vegetais brutos, cuja diversidade protéica ultrapassa facilmente a faixa de

dezenas de milhares de proteínas diferentes. Em floema estas se restringem a

poucas centenas. Lembrando-se que a principal via de formação e condução de

AJ são elementos de tubo crivado do floema, a análise deste material traria uma

grande vantagem de se obter um meio enriquecido com as moléculas hormonais

eliciadoras de defesa sistêmica, facilitando assim o isolamento e, principalmente,

a quantificação destas.

Figura 6 - Análise eletroforética mostrando variação de proteínas, obtidas de

floema, provocada por diferentes métodos de extração: “wound exudate” -

obtenção por corte com lâmina no caule antes da coleta. “Stylet exudate” -

esxudado produzido pela drenagem por um estilete de um afídio (adaptado de

Buchanan et al., 2000). B – a composição da seiva do floema de mamona

(Ricinus communis), coletado como esxudado de cortes no floema (Taiz & Zeiger,

2004).

Componentes Concentração

mg/mL

Açucares 80,0 - 106

Aminoácidos 5,2

Ácidos Orgânicos 2,0 – 3,2

Proteínas 1,45 – 2,2

Potássio 2,3 –4,4

Cloreto 0,355 -0,675

Fosfato 0,350- 0,550

Magnésio 0,109 – 0,122

1.4- A espécie Vigna unguiculata no estudo de defesa vegetal

O presente projeto visa o estudo da ação do ferimento como indutor de defesa

vegetal em plantas de feijão-de-corda, investigando tanto a presença e

características de proteínas induzidas por tal estímulo, como a presença de um

agente eliciador de resposta sistêmica de defesa, fazendo uso da estratégia

descrita por Pearce

et al. (1991). Tendo em vista que PFOs são enzimas

expressas em resposta a ferimento por diversas espécies de plantas (Constabel &

Ryan, 1998), esta enzima foi selecionada como marcadora de indução por

ferimento em plantas de feijão-de-corda, a exemplo dos inibidores de proteinases

serínicas induzidos em tomates.

A planta modelo do nosso estudo, o feijão-de-corda (Vigna unguiculata) é uma

leguminosa originária da África, e consiste em uma espécie cultivada de grande

importância nutricional para muitos povos africanos, asiáticos e para o nordeste

brasileiro (May

et al., 1982). Esta espécie de fabácea já foi extensivamente estudada

no que se refere às suas formas constitutivas de defesa. Dentre estas estão os

inibidores de proteinases serínicas em frutos em formação (Carasco & Xavier-Filho,

1981), cistatinas (Fernandes et al., 1993), quitinases e ,1-3-glucanases (Gomes et

al., 1995; Ye et al., 2000), em sementes. Recentemente foi detectada em sementes

a presença constitutiva de proteínas de defesa pouco estudadas, tais como

defensinas e LTPs (Carvalho et al., 2001), bem como a forma mais particular e

característica de defesa constitutiva dessa espécie - formas variantes de vicilinas.

Vicilinas são a principal forma de proteínas de reserva de sementes de feijão-de-

corda (Xavier-Filho et al., 1989) e uma série de trabalhos do grupo (Gomes et al.,

1998; Sales et al.,1992; Firmino et al., 1996; Macedo et al.,1995; Fernandes &

Xavier-Filho, 1993), demonstram que tais proteínas possuem função dual, de

estocagem de aminoácidos e defesa contra predadores, assim como o são os

inibidores de proteases serínicas (Haq et al., 2004).

A participação de proteínas induzidas nos processos de defesa em V.

unguiculata, no entanto, é ainda muito pouco relatada. Simões-Araújo et al. (2002),

trabalhando com uma biblioteca de cDNAs de nódulos de V. unguiculata

termicamente estressados, encontraram transcritos homólogos a uma proteína

induzida por ferimento em Medicago sativa. Porém nenhum papel de defesa foi

associado a este produto de expressão gênica. Outro trabalho recente mostrou

indução de cistatinas, proteínas que são classicamente relacionadas com proteção

vegetal, frente à ação de estresse hídrico (Diop et al., 2004).

2 – OBJETIVOS GERAIS

- Investigar a indução de proteínas de defesa, em níveis local e sistêmico, em

plantas de feijão-de-corda, quando submetidas a ferimento.

- Investigar a variação da composição do esxudado do floema de plantas de

feijão-de-corda após o tratamento por lesão mecânica.

2.1 – Objetivos específicos

- Detectar e caracterizar polifenol oxidases induzidas, local e sistemicamente,

em plantas jovens de feijão-de-corda (V. unguiculata) mecanicamente injuriadas ao

nível de unifoliatos;

- Detectar e caracterizar a indução de cistatinas, local e sistemicamente, em

plantas jovens de feijão-de-corda (V. unguiculata) mecanicamente injuriadas ao nível

de unifoliatos;

- Investigar lesão mecânica, na prevenção de senescência decorrente de morte

celular programada;

- Comparar o potencial indutor de exsudatos de floema de plantas de feijão-de-

corda feridas e não feridas ao nível de unifoliato sobre a indução de polifenol

oxidases.

- Analisar por espectrometria de massas a presença de AJ no esxudado do

floema de plantas submetidas ao estresse de ferimento.

3 – MATERIAIS

3.1 – Material biológico

3.1.1 – Sementes

As sementes de feijão-de-corda (Vigna unguiculata L. Walp.), variedade

EPACE-10, foram fornecidas pelo Departamento de Fitotecnia do Centro de Ciências

Agrárias, Fortaleza – Ceará e posteriormente propagadas na cidade de Campos dos

Goytacazes.

3.2 – Reagentes

 Ácido clorogênico (Sigma)  L-Dopa (Sigma)

 Azida sódica (Vetec)  4-metil-catecol (Sigma)

 Azocaseína (Sigma)  Papaína (Merck)

 Acrilamida (Sigma)  PMSF (Sigma)

 Bis-acrilamida (Sigma)  PVPP (Sigma)

 -mercaptoetanol – (Sigma)  Persulfato de amônio (Merck)

 Catecol (Sigma)  Pirogalol (Sigma)

 Catequina (Sigma)  Resorcinol (Vetec)

 Coomassie Brilhante Blue G (Amersham)  TEMED (Sigma)

 Coomassie Brilhante Blue R (Sigma)  L-Tirosina (Sigma)

 DAB (Amersham)  Triton X 100 – (Sigma)

 DTT (sigma)  Tropolona (Fluka)

 EDTA (Vetec)  Uréia (Vetec)

 Gelatina (Sigma)  L-Dopa (Sigma)

Outros reagentes utilizados foram de grau analítico e obtidos comercialmente.

3.3 - Equipamentos

 Balança analítica AX 200 (Shimadzu)

 Centrífuga refrigerada 5417 R (Eppendorf)

 Espectrofotômetro UVMini 1240 (Shumadzu)

 Ultracentrífuga CP 85 (Hitachi)

 Mini-sistema de eletroforese vertical (Bio-Rad)

 Espectrômetro de massas Q-TOF (Micromass)

 Sistema de eletrotransferência CE (Amersham)

4 – METODOLOGIA

4.1 – Detecção, isolamento e caracterização de polifenol oxidases (PFOs)

induzidas por ferimento

4.1.1 – Condições de cultivo de plantas

Substrato orgânico para o cultivo de plantas foi tratado com aquecimento a

100

C por 3 minutos para fazer assepsia, e usado no cultivo das plantas de V.

unguiculata. O solo foi posto em potes plásticos de 120 mL previamente limpos com

solução alcoólica 70 %. As sementes de

Vigna unguiculata usadas eram novas, não

ultrapassando os 6 meses de idade após a colheita, e livres de contaminações

aparentes por bruquídeos ou patógenos. Estas tiveram suas superfícies previamente

desinfetadas com solução de hipoclorito de sódio 0,2%, por 1 minuto. Depois da

assepsia, as sementes foram plantadas, em número de 6 por pote contendo

substrato orgânico, a uma profundidade de 1 cm, devidamente adubado com

fertilizante líquido completo “Ouro verde” (6 gotas por pote), para supressão de

carências de macro e microelementos. Os potes foram levados para estufa onde as

plantas desenvolveram-se em condições de iluminação de 100 mM de fótons / cm

s, seguindo um fotoperíodo de 18 horas de luz e 6 horas de escuro, ocorrendo uma

variação de temperatura de 25 a 30 ºC. A hidratação do substrato foi feita no início

do plantio, e regas diárias foram feitas mantendo-o úmido. Plantas foram submetidas

ao ensaio de indução por ferimento ao atingirem a idade de 7 dias após emergência

do substrato, estágio em que podiam ser visualizados o primeiro par de unifoliatos.

4.1.2 – Tratamento por ferimento e obtenção de extratos protéicos

O tratamento por ferimento foi feito usando-se um hemostato para fazer

injúrias, circulando somente um dos unifoliatos (figura 7). Após o tratamento, plantas

foram submetidas à luz com intensidade igual a 100 mM de fótons / cm

/ s e

unifoliatos foram coletados nos tempos de 0, 3, 8, 24, 48 e 72 horas após o

ferimento. Além de unifoliatos feridos (F), foram também coletados, nestes tempos,

unifoliatos laterais aos feridos (LF) e de plantas não feridas, considerados unifoliatos

controle (C). Os unifoliatos foram macerados em gral resfriado em gelo (0°C), com

tampão fosfato de sódio 10 mM, EDTA 5 mM, pH 6, na proporção de 1:2, obtendo-se

um extrato bruto que foi centrifugado a 20.000 x g, a 4

C, por 20 minutos, seguindo

um protocolo adaptado de Shin

et al. (1997), obtendo-se assim a primeira fração

com proteínas solúveis. O sedimento da primeira centrifugação foi ressuspenso e

homogeneizado em tampão com a mesma composição descrita na primeira

extração, diferindo somente na presença de 1 % de Triton X 100. O material foi

centrifugado (20.000 x g, a 4

C, por 20 minutos) e o sobrenadante definido como

fração insolúvel protéica.

Figura 7 - Esquema de tratamento por lesão mecânica e coleta das regiões de

plantas de feijão-de-corda. F – unifoliato ferido; LF – unifoliato lateral ao ferido. Nas

plantas controles a região LF é considerada igual à região F, já que nenhum

ferimento foi provocado à planta.

4.1.3 – Quantificação da atividade polifenol oxidásica

As frações solúveis e insolúveis obtidas no item 4.1.2 foram dosadas em

relação à presença de polifenol oxidases (PFO), seguindo-se um protocolo adaptado

de Shin et al. (1997), sendo tomada por ensaio alíquotas de 300 l para plantas

controles, com o tempo de 0 horas após ferimento, e 50 l para os extratos das

demais plantas. O teste de atividade foi feito usando-se como substrato 4-metil-

catecol, em meio de ensaio apresentando a seguinte composição: tampão fosfato de

sódio 100 mM pH 6,0, catecol 5 mM, em um volume total de ensaio de 1000 l. A

leitura espectrofotométrica foi feita, medindo-se a variação de absorbância em um

comprimento de onda de 410 nm, durante os primeiros minutos de reação. Todas as

medidas foram feitas em temperatura ambiente, sendo estabelecido como 1 UE o

aumento de absorbância em leitura de atividade correspondente a 0,01 por minuto.

4.1.4 – Quantificação protéica

Os ensaios de quantificação protéica dos extratos vegetais obtidos foram

feitos segundo metodologia descrita por Bradford (1976), usando-se albumina

bovina como padrão, fazendo-se leitura espectrofotométrica a 595 nm.

4.1.5 – Eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições semi-

desnaturantes (SDS-PAGE)

As amostras de proteínas extraídas conforme descrito no item 4.1 foram

analisadas por eletroforese em gel de poliacrilamida, segundo método de Laemmli

(1970) com diversas modificações, a fim de proporcionar uma condição semi-

desnaturante, na qual uréia e -mercaptoetanol não foram usados, além do fato das

amostras não serem fervidas. Extratos protéicos de plantas controle e feridas, 48

horas após a lesão do unifoliato, foram equilibrados na proporção de 1:2 em tampão

de amostra, submetidos a uma corrida de duas horas e meia em um sistema

descontínuo de gel de poliacrilamida, aplicando-se 40 g de proteína por poço, sob

uma voltagem constante de 200 V a uma temperatura de 8

C. Após o processo, o

gel foi corado com Coomassie Brilliant Blue R e então descorado com uma solução

de metanol:ácido acético:água (40:10:50).

4.1.6 – Ensaio de atividade enzimática em gel

O ensaio de atividade em gel foi feito usando-se um protocolo adaptado de

Shin et al. (1997), onde foi adicionado tampão de amostra (Tris-HCl 0,5 M, pH 6,8,

SDS 2 % e azul de bromofenol 1 %) na proporção de 1:2 (v/v) aos extratos obtidos

no item 5.1.2. Foi feita então uma SDS-PAGE conforme descrito no item 4.1.5 e o

gel obtido foi submetido à revelação para PFO, por submersão em tampão fosfato

100 mM, catecol 10 mM, até o aparecimento de bandas de atividade, o que ocorreu

no período de 3 a 5 minutos de incubação. O efeito inibitório de tropolona, um

inibidor especifico para PFOs, também foi testado. Para isso uma incubação prévia

com tropolona a 1 mM foi feita por 10 minutos, antes da visualização da atividade de

PFO sobre catecol.

4.1.7 – Isolamento de PFO induzida por ferimento

O extrato bruto protéico da fração solúvel, obtida de unifoliatos feridos após

48 horas desde a lesão, conforme o item 4.1.2, foi submetido à precipitação com

sulfato de amônio até uma concentração de saturação de 30 %. O material foi então

guardado a 4

C por uma noite a fim de otimizar a precipitação. Após essa etapa o

material foi centrifugado a 10.000 g por 30 minutos a 4

C. O sedimento foi

descartado e o sobrenadante foi re-precipitado com sulfato de amônio até uma

saturação de 80%, seguindo um protocolo estabelecido por Shi et al. (2002). A

fração 30-80 % obtida foi dessalinisada através de sua suspensão em solução

gelada de etanol 30% (0

C) por 30 minutos, e centrifugada a 20.000 g por 10

minutos a 4

C. O sedimento obtido foi seco a 8

C por 24 horas e ressuspendido em

tampão fosfato 100 mM pH 7,0, Triton X-100 0,1 % , também empregado como

tampão de equilíbrio durante a fase de purificação por cromatografia de troca iônica.

O extrato clarificado foi estão submetido à separação cromatográfica em

coluna de troca iônica em DEAE-celulose. A cromatografia de troca iônica foi

efetuada usando-se concentrações crescentes de NaCl (0,0; 0,1; 0,2 e 0,5) no

tampão de eluição (tampão fosfato 100 mM pH 7,0 Triton X-100 0,1 %), sendo o

volume de 50 mL usado em cada concentração de sal no tampão de eluição. A

atividade das frações foi identificada por ensaio enzimático conforme descrito em

4.1.6. O pico de maior atividade obtido foi dialisado exaustivamente contra água,

liofilizado e guardado a -20

C. Tal material foi definido como fração F-0,2, por ser

eluído na concentração de 0,2 M de NaCl, tendo elevado nível de atividade polifenol

oxidásica e tendo sido, portanto, usado posteriormente nas etapas de caracterização

enzimática.

4.1.8 – Parâmetros cinéticos da fração F-0,2

Todos os parâmetros cinéticos foram determinados usando-se o volume de

20 l da fração F-0,2, que corresponde a valor de atividade de 15 UE, sendo

estabelecido como 1 UE o aumento de absorbância em leitura de atividade

correspondente a 0,01 por minuto.

4.1.8.1 - Ativação com SDS e estabilidade

O efeito ativador de SDS sobre F-0,2 foi testado usando-se 5 mM de 4-metil-

catecol como substrato em tampão fosfato de sódio 100 mM, pH 6,0 e uma variação

de concentrações de SDS de 0 a 140 mM, sendo o volume total do ensaio de 1000

l. As demais condições para medição de atividade foram executados conforme o

protocolo descrito o item 4.1.3.

4.1.8.2 – Medição de estabilidade térmica

A energia de ativação para desnaturação de F-0,2 foi determinada por

medição da atividade enzimática, em banho circular, sobre um intervalo de

tratamentos térmicos variando de 30 a 100

C, com um intervalo de 10

C de

aumento em cada tratamento. O tempo de incubação de todos os tratamentos foi de

5 minutos. Após incubação, o material foi rapidamente resfriado em gelo. As

incubações foram efetuadas na presença e ausência de SDS 10 mM. As

concentrações de substrato e SDS usadas no ensaio foram as mesmas descritas no

item 4.1.3.

4.1.8.3 - Determinação de pH ótimo de atividade

O pH ótimo de atividade para F-0,2 foi determinado usando tampão citrato-

fosfato 100mM para um intervalo de medições de pH de 3 a 6,5 e tampão fosfato

100 mM para o intervalo de pH de 7 a 9. As demais condições de ensaio usadas

foram as mesmas descritas no item 4.1.3.

4.1.8.4. – Especificidade a substratos e determinação de Km e Vmax

A determinação da especificidade da fração F-0,2 a diferentes substratos foi

feita usando-se diferentes substratos comumente empregados para PFOs. Sendo

estes: 4-metil-catecol (M-catecol), pirogalol, catecol, ácido clorogênico e L-

dioxifenilalanina (L-DOPA). Todas as determinações foram efetuadas usando 100

mM de tampão fosfato pH 6,0, SDS 5 mM, sendo cada substrato ensaiado na

concentração de 5 mM. Foram tiradas medições no intervalo de tempo de cada

minuto até 5 minutos de reação.

Os valores de Km e Vmax foram calculados a partir do gráfico duplo recíproco

de Lineweaver & Burke, com os dados obtidos dos ensaios feitos com os substratos

catecol e 4-M-catecol usando-se concentrações crescentes de 1, 2, 4, 6, 8, 12 e 16

mM.

4.1.8.5 – Ensaio de inibição de atividade polifenol oxidásica

Quatro inibidores foram usados para determinação do perfil de inibição

enzimática da fração F-0,2: EDTA, resorcinol, azida sódica e tropolona. As

concentrações de inibidores usadas em ensaio foram 0,1; 1 e 10 mM, exceto para

tropolona (0, 01; 0,1 e 1 mM). As concentrações de substrato e SDS usadas no

ensaio, bem como outros parâmetros, foram os mesmos descritos no item 4.1.3

4.2 – Detecção e caracterização de cistatinas induzidas por ferimento e

análises de parâmetros relacionadas

4.2.1 – Condições de cultivo de plantas

As mesmas empregadas no item 4.1.1, com algumas modificações; as plantas

desenvolveram-se em condições de iluminação de valores iguais ou superiores a

300 mM de fótons / cm

/ s, seguindo um fotoperíodo de 12 horas de luz e 12 horas

de escuro.

4.2.2 – Tratamento por ferimento e obtenção de extrato protéico

O tratamento por ferimento foi feito usando-se um hemostato para fazer

injúrias em somente um dos unifoliatos das plantas teste plantas controle não foram

feridas. Após o tratamento plantas foram submetidas à luz com intensidade superior

ou igual a 300 mM de fótons / cm

/ s e unifoliatos foram coletados no tempo de 24

horas após ferimento. Logo após a coleta os unifoliatos foram macerados em

nitrogênio líquido e extraídos com tampão Tris-HCl 100 mM pH 6,8; PMSF 2 mM,

PVPP 5% na proporção de 1:1. O material foi centrifugado a 20.000 g por 20

minutos a 4

C, o sobrenadante (extrato total) foi então fervido a 100

C por 3

minutos. Após fervura o material foi centrifugado nas mesmas condições descritas

acima. O sobrenadante foi precipitado, adicionando-se um volume de solução de

TCA 50 % suficiente para se obter uma concentração final de 10 %. O material

permaneceu em gelo por 2 horas e foi centrifugado nas mesmas condições descritas

acima. Após centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o sedimento re-

suspenso em metanol 100 %, para remoção do excesso de TCA. Após uma nova

centrifugação a 20.000g por 10 minutos e 4

C, a amostra permaneceu secando por

16 horas a 8

C. Após ter sido seco, o material foi re-extraído em tampão citrato

fosfato 100 mM pH 5,0, DTT 2 mM, e Triton X-100 0,1 %, o mesmo usado em ensaio

enzimático, na proporção de 60 μl por amostra, considerando-se uma quantidade

inicial de 1 g de tecido vegetal fresco. Após re-extração com vigorosa agitação do

material este foi centrifugado a 20000 por 30 minutos a 4

C. O sobrenadante final foi

usado em medições de concentração protéica, segundo o item 4.1.4 e análise da

presença de cistatinas segundo o item 4.2.4.

4.2.3 – Determinação da curva de atividade enzimática

O ensaio de inibição de atividade cisteínica foi feito segundo Michaud et al.

(1987). Inicialmente foi estabelecida uma curva de atividade proteolítica com a

enzima modelo papaína, com o intuito de se estabelecer uma concentração ótima da

enzima no ensaio de inibição. A curva de atividade foi feita usando-se concentrações

crescentes de papaína na ordem de 1, 2, 4, 8 e 16 μg de papaína a partir de uma

solução estoque de 1 mg / mL, diluída em tampão citrato/fosfato de sódio

monobásico 100 mM pH 5,0, DTT 1,5 mM, e Triton X-100 0,1 %, mais a adição de

l de azocaseína 1% até um volume total de incubação de 120 μl, o material foi

então incubado em temperatura ótima de reação para papaína (37

C) por uma hora,

e a reação foi interrompida com a adição de 300 μl de TCA 10 %, aguardando por

meia hora para otimizar precipitação protéica. O material foi então centrifugado a

15000 g por 5 minutos à temperatura ambiente (25

C). Posteriormente uma alíquota

de 350 μl do sobrenadante foi transferida para outro tubo e adicionados 350 μl de

solução NaOH 1 M. Paralelamente ao procedimento de medição de atividade, foram

feitos brancos de leitura nos quais foram repetidos todos os procedimentos, diferindo

apenas na ordem de aplicação da azocaseína 1%, sendo esta adicionada somente

após a adição do TCA 10 %. O produto de reação de hidrólise formado foi

mensurado por espectrofotometria a um comprimento de onda de 440 nm.

4.2.4 – Ensaio de inibição de atividade de proteinase cisteínica (dosagem de

cistatinas)

Uma concentração de papaína de 8 g por ensaio, foi escolhida uma vez que a

medição de seus produtos de hidrólise indicou valores de absorbância superiores a

0,45, O ensaio de inibição foi feito usando-se 10 μl de papaína mais 20 μl de

amostras tratadas para cistatinas, completando o volume com tampão de atividade

(citrato fosfato de sódio monobásico 100 mM pH 5,0, DTT 1,5 mM, e Triton X-100

0,1 %) até o valor de 40 μl. Todos os procedimentos posteriores foram feitos como

no item 4.2.3 (Michaud et al., 1987).

4.2.5 – Eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes e

redutoras (SDS-PAGE)

As amostras proteínas extraídas conforme item 4.2.4 foram analisadas por

eletroforese em gel de poliacrilamida, sob condições desnaturantes, e redutoras

usando-se uréia na 8 M e -mercaptoetanol 4% no tampão de amostra, com

aquecimento a 100

C, adaptado do método de Laemmli (1970). Foram aplicados 50

g de proteína em cada poço, e a amostras foram submetidos a uma corrida de

duas horas e meia em um sistema descontínuo sob uma voltagem constante de 200

V a uma temperatura de 8

C. Após o processo, o gel foi corado e descorado

conforme o item 4.1.5.

4.2.6 – Detecção de proteínas imunologicamente relacionadas a cistatinas por

Western Blotting

A metodologia de Western Blotting utilizada baseou-se em Towbin et al.

(1979). Os extratos protéicos obtidos segundo o item 4.2.2, foram submetidos a

eletroforese segundo item 4.2.5, as amostras foram corridas em duplicatas, sendo

uma gel corado para proteínas segundo item 4.2.5, e o outro transferido para

membrana de nitrocelulose com um tamanho de poro de 0,45 m. A transferência foi

feita num sistema semi-seco. O sanduíche consistia de 3 papéis de filtro embebidos

em tampão de transferência (Tris-HCl 25 mM, glicina 192 mM, metanol 20 % pH

8,3), a membrana de nitrocelulose, o gel contendo as proteínas a serem transferidas

e mais 6 papéis de filtro embebidos no mesmo tampão. A membrana e o gel foram

também previamente embebidos na mesma solução de transferência por 20

minutos. Quanto às condições de transferência foi empregada uma corrente elétrica

de 0,8 mA/cm

de membrana durante aproximadamente 1 hora. Após transferência

foi feito coramento reversível com corante Ponceau para conferir a eficiência da

transferência.

Posteriormente, a membrana foi imersa em tampão bloqueador (gelatina 1%

em PBS [tampão fosfato 0,1 M NaCl 0,5 M pH 7,6, Tween 20 0,2 %]) por 1 hora. As

alíquotas dos anticorpos primários anti-cistatina de sementes de Vigna unguiculata

foi diluído 1:2000 no tampão bloqueador e a membrana foi imersa (16 horas) neste

tampão. Após este tempo lavou-se a membrana por 6 vezes com PBS, durante 10

minutos a cada lavagem, sendo a ultima feita com PBS sem a adição de Tween 20.

A membrana foi incubada por 3 horas com anticorpo anti-IgG de coelho, conjugado a

peroxidase, diluído 1:2000 em tampão bloqueador. Uma nova série de 6 lavagens de

10 minutos cada, com PBS, foi feita. A revelação para peroxidase foi feita

dissolvendo-se 5 mg de DAB (Diaminobenzidina) em uma mistura de 100 μl de

tampão Tris-HCl, 2 M pH 7,5, 300 l de imidazol 0,1 M e 4,9 mL de água destilada.

Após solubilização do DAB, 5 l de peróxido de hidrogênio 20 % foram adicionados

à mistura, sendo esta vertida sobre a membrana, cobrindo-a completamente. Após

rápida e leve agitação, o material permaneceu no escuro por 15 minutos, até

completar revelação que foi interrompida lavando-se a membrana com água

destilada em abundancia. A membrana foi seca e guardada em papel de filtro no

escuro.

4.2.7 – Ensaio enzimático para proteases cisteínicas totais

A medição da atividade total de proteinases cisteínicas foi feita a partir de

extratos brutos, obtidos de unifoliatos de plantas controle e feridas. Plantas foram

crescidas conforme o item 4.2.1, e plantas testes foram feridas em um dos

unifoliatos, e submetidas a 24 horas de luz constante; plantas controles foram

submetidas às mesmas condições, diferindo somente na ausência do tratamento por

ferimento. A extração protéica foi feita com tampão Tris-HCl 0,1 M, pH 6,8, PVPP

5%, EDTA 1 mM, na proporção de 1:1 (m / v), em gelo (0

C), e procedeu-se por 2

horas. A suspensão foi centrifugada a 20000 x g por 10 min e o sobrenadante foi

usado para detecção de cistatinas. A análise de atividade foi feita usando-se 20 l

de extrato total de unifoliatos de plantas controle e testes, seguindo a mesma

metodologia descrita no item 4.2.3. Foram feitas 3 repetições para cada medição.

4.2.8 - Eletroforese semi-desnaturante em gel de poliacrilamida com gelatina

(SDS-PAGE-Gelatina)

Este gel foi preparado aplicando-se 1ml de gelatina (1%) ao volume da água,

deixando-o em uma concentração final de gelatina de 0,1% (para 10 ml de gel 12%).

Esta eletroforese correu utilizando-se uma voltagem constante de 150 V por 2 horas,

C, aplicando-se 50 g de proteína por poço, com as amostras de extrato total

obtidas conforme o item 4.2.2. Após a corrida, o gel foi lavado com Triton X-100

2,5% por 2 vezes, durante 30 minutos cada vez, e incubado em um banho-maria a

30°C em tampão citrato fosfato de sódio monobásico 100 mM pH 5,0, DTT 1,5 mM,

e Triton X-100 0,1 % durante 16 horas, com o intuído de detectar bandas de

atividade de proteinases cisteínicas. Após o processo, o gel foi corado e descorado

segundo item 4.2.5. A revelação das bandas de atividade consiste no aparecimento

de bandas brancas em um fundo azul.

4.2.9 – Ensaio de ativação de senescência

Plantas foram crescidas como em 4.2.1, até 5 dias de idade. Foram feridas

como em 4.3.7 e submetidas à iluminação constante, por 24 h. Visando induzir

senescência foliar, plantas foram deixadas no escuro por 5 dias a 28

C, segundo

metodologia de Giridhar & Thimann (1984), com modificações.

4.3 – Análise do efeito eliciador de esxudado de floema

4.3.1 - Extração de esxudado de floema

A extração do esxudado de floema foi feita segundo Narváez-Vasquéz et al.

(1995). As plantas foram previamente feridas nos unifoliatos, e cortadas abaixo do

par de unifoliatos, no caule, com uma lâmina virgem bem afiada; foram colocadas

em microtubos com água destilada por 10 min, para eliminação de restos celulares e

foram transferidas para outros microtubos contendo 0,5 mL de uma solução tampão

de EDTA 1mM, Hepes 5 mM pH 7,0 (figura 8). Os experimentos foram conduzidos

no escuro, em câmara úmida (100% umidade relativa), a 25

C. Após 24 h de

esxudação, as plantas foram removidas e o esxudado de floema foi obtido. Também

foram extraídos esxudados de plantas não feridas no unifoliato para obtenção de um

controle. Os esxudados foram liofilizados, sendo então concentrados dez vezes.

4.3.2 – Teste de atividade indutora

Os esxudados de floema (4.3.1) foram submetidos a teste de sua capacidade

de induzirem a síntese de PFOs, segundo metodologia adaptada de Ryan (1974). O

teste consiste na inoculação de solução contendo as amostras testes através de

uma seringa hipodérmica de aplicação de insulina, no pecíolo de unifoliatos de

plantas de feijão-de-corda (figura 9). Após inoculação as plantas foram mantidos sob

luminosidade de 90 mM fótons/cm

/s por 24 horas. Posteriormente os unifoliatos

foram submetidos à extração protéica e determinação dos níveis de PFO conforme

os itens 4.1.2 e 4.1.3, respectivamente. O esquema abaixo (figura 9) resume o

procedimento para detecção do efeito eliciador de esxudado de floema.

Figura 8 - Esquema de coleta de esxudado de floema de plantas de feijão-de-corda.

A – Ferimento no unifoliato. B - caule cortado. C – Solução contendo tampão de

extração de esxudado (EDTA 1mM, Hepes 5 mM pH 7,0).

Figura 9 – Procedimento para teste de atividade indutora de PFO dos exsudados de

floema de feijão-de-corda.

4.3.3 – Análise de esxudado de floema por espectrometria de massas

Uma alíquota de 10 μl de esxudado de floema concentrada por liofilização foi

transferida para um microtubo, sendo diluída em 100 μl de solução de acetonitrila

50 % / ácido fórmico 0,1%. A solução resultante foi então submetida a análise por

espectrometria de massas em um espectrômetro do tipo Q-Tof (“Electrospray”) da

marca Micromass. A solução de acetonitrila / ácido fórmico, pura, foi usada como

branco na análise do aparelho.

Extração protéica

Verificação da

indução de PFO por

ensaio de atividade

enzimática.

Amostra sendo

testada ou tampão

no controle

24 h

5 – RESULTADOS

5.1 - Quantificação e caracterização da atividade polifenol oxidásica induzida

por ferimento

A análise da atividade polifenol oxidásica dos extratos protéicos obtidos

conforme item 5.1.2 foram feitas na presença e na ausência de SDS (tabela 1).

Frações solúveis de PFOs apresentaram grande diferença de atividade entre

extratos de plantas controles e plantas teste (unifoliatos feridos e laterais aos

feridos), somente quando ativadas com SDS. Nenhuma diferença é evidenciada

entre frações insolúveis de PFO, incubadas ou não com SDS 5 mM. As atividades

de todos os extratos PFOs solúveis representaram somente 5 % da atividade

polifenol oxidásica, total quando medida na ausência de SDS. Porém este

percentual atinge os 50 % somente em extratos de plantas feridas (unifoliato ferido e

lateral ao ferido) em incubação com SDS 5mM.

Os ensaios enzimáticos revelaram um significativo aumento da atividade de

PFOs solúveis no tempo de 24 horas após ferimento, em ambos unifoliatos feridos e

laterais aos feridos de plantas testes, quando comparados aos controles de 0 horas.

A indução máxima de atividade foi atingida 48 horas após o tratamento em ambos

unifoliatos feridos (13 vezes os valores de 0 horas) e laterais aos feridos (15 vezes).

No tempo de 72 horas ambos unifoliatos feridos e laterais ainda mantinham altos

níveis quando comparados aos unifoliatos de plantas controles de 0 horas (figura 8).

5.2 – Visualização de proteínas totais e polifenol oxidases em unifoliatos de

feijão-de-corda

A análise de extratos protéicos por SDS-PAGE semi-desnaturante foi feita

usando-se plantas controle e feridas no estágio de maior diferença dos níveis de

expressão de PFOs (48 horas, figura 10). Não foi observada nenhuma diferença

visível entre os perfis das amostras de unifoliatos controles, feridos e laterais aos

feridos (figura 11 I). Entretanto, quando o gel foi incubado com catecol para

detecção de atividade de PFO, foi facilmente observada a indução de bandas de

atividade, com massas de 58, 73 e superior a 200 kDa respectivamente. Estas

estavam presentes em amostras de unifoliatos feridos e laterais aos feridos de

plantas testes (figura 11 II - setas). Incubação do gel com tropolona (1mM), um

inibidor de PFOs, seguida de revelação com catecol conforme descrito acima,

mostrou inibição das bandas de atividade anteriormente observadas (figura 11 III).

5.3 – Purificação parcial de PFOs induzidas por ferimento

A purificação parcial e caracterização da PFOs induzidas por ferimento foi

processada a partir de unifoliatos feridos de 48 horas, tempo relativo à sua indução

máxima. O extrato clarificado (EC) obtido após precipitação com sulfato de amônio e

clarificação com etanol foi separado através de cromatografia de troca iônica em

DEAE-celulose. A figura 12 mostra o perfil de separação do EC onde se observa que

o maior pico de atividade (frações 34, 35 e 36) ficaram retidos na matriz. Embora

tenham sido detectados quatro picos de proteína, a maior atividade de PFO foi

associada ao terceiro, eluído com 0,2 M de NaCl. Devido ao elevado nível de

enriquecimento deste pico, este foi usado para caracterização de parâmetros

cinéticos e identificado como PFO de feijão-de-corda induzida por ferimento (F-0,2).

Uma atividade residual foi detectada em frações eluídas com 0,1 M de NaCl, as

quais não foram usadas neste tipo de análise.

O processo de purificação de PFOs de feijão-de-corda teve um rendimento de

purificação máximo de 11,18, como mostrado na tabela 2. A etapa de cromatografia

por DEAE-celulose foi a responsável pelo maior nível de purificação alcançado.

Tabela 1 - Perfil de atividade de PFOs de unifoliatos de plantas feijão-de-corda.

Atividade mostrada em UE/mg de proteína, entre parêntese o correspondente

percentual da soma das atividades das frações PFO solúvel e insolúvel. Uma

unidade de atividade (UE) é definida como a variação de absorbância de 0,01 por

minuto, a 410 nm.

UE/mg (% de atividade Total)

Sem SDS

Controle Ferido Lateral ao ferido

PFO Solúvel 0,46+/-0,02 (4,80) 0,28+/-0,07 (2,96) 0,66+/-0,36

(7,51)

PFO Insolúvel 9,22+/-0,59 (95,20) 9,22+/-0,88

(97,04)

8,14+/-1,80

(92,49)

Com 5 mM SDS

PFO Solúvel 0,86+/-0,05

(10,64)

8,72+/-1,04

(56,41)

10,83+/-1,50

(60,96)

PFO Insolúvel 7,26+/-1,85

(89,36)

6,74+/-0,22

(43,59)

6,93+/-0,14

(39,04)

Figura 10 – Atividade de polifenol oxidase de extratos protéicos de unifoliatos feridos

(barras brancas), e laterais aos feridos (barras cinza) de plantas de feijão-de-corda.

Uma unidade de atividade enzimática foi definida como aumento de 0,01 unidade de

absorbância por minuto. Letras diferentes indicam diferenças significativas com

valores de p< 0,05, segundo teste t de Student. n = 4.

100

120

140

160

0 horas 3 horas 8horas 24 horas 48 horas 72 horas

UE/mg

Figura 11 – SDS-PAGE (I) e gel de atividade para PFO na ausência (II) e na

presença de tropolona 1mM (III), referente às frações protéicas totais de unifoliatos

controle (C), feridos (F) e laterais aos feridos (LF) de plantas de feijão-de-corda, 48 h

após lesão. As setas indicam duas bandas de atividade com mobilidades relativas de

58 e 73 kDa respectivamente, e a ponta da seta indica uma atividade com massa

molecular superior a 200 kDa. As massas foram calculadas através da curva de

migração eletroforética, feita com base na mobilidade de marcadores de massas

moleculares conhecidas (IV) .

y = -0,2903x + 2,4589

= 0,9794

1,5

1,7

1,9

2,1

2,3

2,5

0 1 2 3 4

M obilidade re lativa

Log Mr

PPO2

PPO1

kDa

200

116

C F LF C F LF C F LF

kDa

200

116

I II III

Figura 12 – Cromatograma de troca iônica em DEAE-celulose da fração 30-80%

clarificada de unifoliatos feridos (48h) de feijão-de-corda. Linha cheia indica

medições protéicas a 280 nm; linha tracejada indica medições de atividade polifenol

oxidásica e linha pontilhada indica patamares de concentração molar de NaCl no

tampão de eluição.

0,5 M

0,1 M

0,2 M

Tabela 2 – Etapas de purificação de F-0,2 de V. unguiculata. Uma unidade de

atividade (UE) é definida como a variação de absorbância de 0,01 por minuto, a 410

nm.

Etapas de

purificação

Volume

(mL)

Concentra

ção protéica

(mg/mL)

Proteína

total

(mg)

Atividade

total (UE)

Atividade

específica

(UE/mg)

Rendi

mento

Purific

ção

Extrato

bruto

110 4,9 539,22 56100 1,04 100 1

35-80%

(NH4)

7,5 1,57 11,80 4050 3,43 7,22 3,3

F-0,2 4 0,62 2,48 2880 11,63 5,4 11,18

5.4 – Ensaios de cinética enzimática da fração F-0,2

5.4.1 - Ativação e estabilidade com SDS.

A fração F-0,2 foi usada para a investigação da influência do SDS como

ativador de PFOs de feijão-de-corda. SDS é um importante agente ativador para

varias PFOs. Tal habilidade está relacionada com a interação deste detergente com

o centro de reação da enzima, sendo intrinsecamente dependente do pH (Jiménez &

García-Carmona, 1996). A polifenol oxidase aqui estudada é uma enzima latente é

foi otimamente ativada em uma concentração de SDS de 10 mM. Aproximadamente

60 % da atividade foi mantida mesmo em concentrações de SDS tão elevadas

quanto 140 mM (figura 13). Esta característica é responsável pela manutenção de

sua atividade em eletroforese (SDS-PAGE) sob condições semi-desnaturantes.

5.4.2 – Medição de estabilidade térmica

A determinação de estabilidade térmica, da fração F-0,2, foi feita na presença

e ausência de SDS (figura 14). A atividade na ausência de SDS foi altamente

conservada, mantendo-se em 84 % do inicial, mesmo após 5 minutos a 80

reduzindo-se drasticamente a 13,4 % da atividade inicial, em 90

C de incubação. Na

presença de SDS 10 mM, a estabilidade térmica foi diminuída; a redução da

atividade enzimática foi de 31 %, quando observada a 70

C, e a total perda de

atividade foi detectada a 80

5.4.3 - Determinação de pH ótimo de atividade de F- 0,2

Para determinação do pH ótimo de atividade. A atividade de F-0,2 foi medida

na presença de 10 mM de SDS e 5 mM de 4-metil-catecol, e foram usados dois tipos

de tampões: tampão citrato-fosfato 100 mM para variação de pH de 3,0 a 6,0 e

tampão fosfato para a variação de pH entre 7,0 e 9,0. A fração F-0,2 apresentou

nenhuma atividade em pH 3,0 ocorrendo uma significativo aumento de atividade até

os valores de pH 5,5 e tendo o valor 6,0 como o valor ótimo de pH para atividade

desta enzima. Entre os valores de 7,0 a 9,0, a atividade reduziu e se manteve em

torno de 60% do valor máximo (figura 15).

100

120

0 10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110 120 130 140 150

SDS (mM)

Atividade relativa (%

)

Figura 13 - Efeito do SDS sobre ativação da atividade de F-0,2. Ensaio foi feito com

4-metil-catecol 5 mM.

100

120

30 40 50 60 70 80 90 100 110

Temperature (

)

Atividade relativa (%)

Figura 14 - Estabilidade térmica de F-0,2 extraída de V. unguiculata. Incubações

foram feitas com 4-metil-catecol 5 mM, na presença (traço pontilhado) ou na

ausência (traço cheio) de SDS 10 mM.

Figure 15 – Efeito da variação de pH sobre a atividade de F-0,2. Incubações foram

feitas com 4-metil-catecol 5 mM. O valor de pH ótimo encontrado foi 6,0.

100

120

3 4 5 6 7 8 9

Atividade Relativa (%)

5.4.4 - Especificidade a substratos e determinação de Km e Vmax

A especificidade de F-0,2 foi analisada em relação a seis diferentes tipos de

substratos (tabela 3). A maior atividade de oxidação foi contra o substrato 4-metil-

catecol, seguida de catecol. Com os outros substratos, F-0,2 apresentou um valor de

oxidação muito reduzido. Nenhuma atividade foi detectada quando o substrato L-

tirosina foi usado.

O cálculo de determinação das constantes cinéticas Km e Vmax aparentes foi

efetuado a partir do gráfico de Lineweaver-Burk (figura 16), usando-se os dois

substratos mais eficientemente oxidados pela F-0,2, 4-metil-catecol e catecol.

Embora o Km da enzima sobre catecol tenha sido de 3,44 e 9,89 contra o substrato

4-metil-catecol, uma maior eficiência catalítica foi medida em relação ao substrato 4-

metil-catecol (Vmax/Km = 2,5) o que pode ser visto nos dados apresentados na

tabela 4.

Tabela 3. Valores de atividade específica de PFO (F –0,20) de Vigna unguiculata,

sobre 7 diferentes substratos comumente usados para caracterização de PFOs.

Substrato Comprimento de

Onda (nm)

Unidade de

Atividade

Atividade relativa a

4-metil-catecol (%)

4-Metil-catecol 410 0,013 100

Catecol 410 0,0113 87

Pirogalol 400 0,0012 9,24

Ácido clorogênico 400 0,0008 6,15

L-Dopa 475 0,00015 1,15

(-)-Catequina 380 0,0001 0,77

L-Tirosina 475 0 0

-200

200

400

600

800

1000

1200

1400

-0,5 0 0,5 1 1,5 2 2,5

1/S

1/Vmax

Figura 16 - Gráfico de Lineweaver-Burk, mostrando dois diferentes perfis de cinética

enzimática. Curvas de saturação foram feitas para os substratos catecol (linha cheia)

e 4-metil-catecol (linha tracejada).

Tabela 4. Valores de parâmetros de cinéticos medidos para F-0,2 de V. unguiculata.

Substrato Km Vmax Vmax/Km

4-metil-catecol 9,86 24,66 2,50

Catecol 3,44 6,64 1,93

5.4.5 - Ensaio de inibição de atividade

O perfil de inibição de F-0,2 foi caracterizado usando-se 4 diferentes

inibidores em 4 diferentes concentrações (0,01; 0,1; 1,0 e 10 mM). Sendo usado

como substrato 4-metil-catecol, numa concentração de 5 mM (tabela 5). Os dados

revelaram que tropolona foi o mais potente inibidor encontrado.

Tabela 5. Inibição percentual de PFO (F –0,20) parcialmente purificada de V.

unguiculata.

Percentual de inibição (%)

Inibidores/concentração 0,01 0,1mM 1 10

Resorcina nd 20 20 40

EDTA nd 15 15 15

Tropolona 50 70 77 nd

Azida sódica nd 20 20 100

5.5 – Detecção e caracterização de cistatinas induzidas por ferimento

O ferimento a nivel de unifoliato induziu um aumento do nível de cistatinas em

plantas de V. unguiculata, porém em patamares mais modestos. Na figura 17 nota-

se um aumento médio de 33 % nos níveis destes inibidores, em plantas feridas, 24 h

após lesão, comparando-se aos de plantas controle. Os dados indicam que, sob o

aspecto quantitativo, os níveis de cistatinas aumentam na mesma proporção, tanto a

nível local no unifoliato ferido, quanto a nível sistêmico, no lateral ao ferido,

evidenciando que a indução de cistatinas em feijão-de-corda ocorre a nível local e

sistêmico, frente ao estimulo de lesão mecânica.

5.5.1 – SDS-PAGE e Western blot de cistatinas induzidas por ferimento.

A análise por SDS-PAGE das frações protéicas de unifoliatos, 24 horas após

lesão mecânica (item 4.2.2), é vista na figura 18 A. A análise por Western blot dos

perfis protéicos foi feita usando-se anticorpos policlonais contra cistatina de

sementes de V. unguiculata, e mostrou um grande aumento de uma banda de 22

kDa em unifoliato ferido, e o aparecimento de outra de 29 kDa, em unifoliatos laterais

aos feridos, quando comparadas à amostra controle (figura 18 B)

5.5.2 – Atividade proteinásica do tipo cisteínica em unifoliatos de feijão-de-

corda submetidos ou não a lesão mecânica

Os dados da medição da atividade proteinásica do tipo cisteínica em extratos

de unifoliatos mostram uma ligeira redução de atividade em unifoliatos feridos

quando comparados à atividade de extratos obtidos de unifoliatos controle, redução

esta que corresponde a aproximadamente 20% enquanto que nos unifoliatos laterais

aos feridos unifoliatos não houve diferença significativa em relação ao controle

(figura 19).

5.5.3 – Proteinases cisteínicas em unifoliatos de feijão-de-corda submetidos ou

não a lesão mecânica

Análise de atividades de proteases cisteínicas por gel SDS-PAGE-gelatina

mostrou que uma banda de massa molecular de 50 kDa, que representa uma fração

minoritária da atividade total, foi fortemente inibida em unifoliatos ferido e lateral ao

ferido. Uma outra banda de atividade de 70 kDa foi parcialmente inibida em

unifoliatos feridos (figura 20).

5.5.4 - Ensaio de ativação de senescência

A análise do efeito de ferimento sobre a senescência foliar mostrou que

unifoliatos de plantas feridas apresentaram maior resistência à senescência

promovida por escuridão do que os de plantas controle, sendo os unifoliatos feridos

aparentemente ainda mais resistentes que os laterais aos feridos (figura 21).

C F LF

UI/ug proteina

O horas

24 horas

Figura 17 - Indução de cistatinas em unifoliatos de V.unguiculata. C- unifoliatos de

plantas controle, F – unifoliatos feridos de plantas teste, LF – unifoliatos laterais aos

feridos de plantas teste. Os tempos usados foram de 0 horas (barras em branco) e

24 horas (barras em cinza). 1 UI representa a redução de absorbância de 0,01 a 440

nm. Letras diferentes indicam diferenças significativas com valores de p< 0,05,

segundo teste t de Student. n = 3

Figura 18 – A -SDS-PAGE dos extratos protéicos clarificados, de unifoliatos de V.

unguiculata. C - unifoliatos de plantas controle, F – unifoliatos feridos, LF –

unifoliatos laterais aos feridos. B - Western blot feito com as mesmas frações vistas

em A. As letras (α) e (β) indicam proteínas imunologicamente relacionadas à

cistatina, apresentando a menor uma Mr de cerca de 22 kDa e a maior, 29 kDa.

C F LF

Figura 19 - Atividade total de proteases cisteínicas em unifoliatos de plantas de V.

unguiculata, 24 horas após ferimento. C - unifoliatos de plantas controle, F –

unifoliatos feridos, LF – unifoliatos laterais aos feridos. 1 UE representa o aumento

de 0,01 de absorbância a 440 nm. n = 3.

100

120

140

160

controle ferido lateral

UE/mg de proteina

Figura 20 – Visualização eletroforética de proteases cisteínicas totais de uniofoliatos

de plantas de V. unguiculata, 24 horas após ferimento. A – SDS-PAGE. B - Atividade

gelatinolítica das amostras mostradas em A, em pH 5,0.  indica uma banda de

protease cisteínica de cerca de 70 kDa, reduzida parcialmente em unifoliatos feridos;

 mostra uma banda de 50 kDa, fortemente presente em unifoliatos controle, mas

quase ausente em unifoliatos feridos e laterais aos feridos.

Figura 21 - Unifoliatos de plantas de feijão-de-corda, submetidos a estresse de

senescência. C - unifoliatos de plantas controle, F – unifoliatos feridos, LF –

unifoliatos laterais aos feridos.

C F LF

5.6– Análise da atividade indutora e caracterização de esxudado de floema

5.6.1 - Teste de indução de PFOs por esxudado de floema

As medições do potencial do esxudado de floema em induzir atividade/síntese

de PFOs foram feitas, tendo-se três parâmetros de comparação. O primeiro é

representado como o controle, onde plantas de feijão-de-corda foram inoculadas

inicialmente com um meio contendo apenas o tampão de esxudação. O segundo

onde plantas foram inoculadas com esxudado de floemas de plantas não feridas, no

intuito de verificar se o floema extraído destas plantas era capaz de induzir alguma

resposta de defesa. Por fim a terceira medição foi feita a partir da inoculação de

plantas com esxudado de floema de plantas lesionadas. Os resultados obtidos em

tais ensaios são apresentados na figura 22, onde é mostrado que ocorreu um

aumento de indução de PFOs em plantas inoculadas com esxudado de plantas

controle (ExuNfer) e de plantas feridas (Exufer), quando comparadas a plantas

somente inoculadas com tampão de extração de floema. Além disso, não houve

diferença significativa entre as respostas para os inóculos de esxudados de plantas

submetidas às duas condições ExuNfer ou Exufer.

5.6.2 – Detecção da presença de AJ em esxudado de floema por

espectrometria de massas

A análise da composição molecular do esxudado de floema extraído de

plantas de feijão-de-corda, por espectrometria de massas (Figura 23), revelou a

existência de componentes moleculares que diferem em ocorrência entre esxudados

de plantas feridas (Exufer) e não feridas (ExuNfer). No entanto foi detectável a

possível ocorrência de ácido jasmônico AJ em esxudado de ambas plantas, feridas

e não feridas ao nível dos unifoliatos.

Figura 22 - Teste de indução de atividade de PFOs por exsudados de floema.

Tampão-Controle – Plantas injetadas com 5 l de tampão para esxudação de

floema. ExuNfer - Plantas injetadas com 5 l de esxudado extraído de plantas cujos

unifoliatos não foram feridos. Exufer - Plantas injetadas com 5 l de esxudado

extraído de plantas cujos unifoliatos foram feridos. 1 UE corresponde à variação de

absorbância de 0,01 por minuto. Letras diferentes indicam diferenças significativas

com valores de p< 0,1, segundo teste t de Student. n = 4.

100

120

140

Tampão-controle ExuNfer Exufer

Inoculados

UE/mg de proteína

Figura 23 – Análise comparativa entre dados de espectrometria de massas obtidos

a partir de amostras de esxudados de unifoliatos de feijão-de-corda. Tamp - Tampão

de extração de exsudato, considerado branco de leitura; ExuNfer - esxudado

extraído de plantas cujos unifoliatos não foram feridos; Exufer - esxudado extraído

de plantas cujos unifoliatos foram feridos. A seta indica sinais relativos às massas

moleculares iguais a do ácido jasmônico (AJ).

modo positivo tampao e solvente mais amostra

211 212

212.6356

210.7310

210.6531

212.3618211.7915211.2063

210.7933

210.7154

210.6765

210.6609

210.6298

210.6142

210.5519

210.7388

212.6277

211.7056

210.7544

211.0193

210.7699

210.9179

211.6744

211.4247

211.0738

211.7525

212.5261

212.4557211.9477

210.6531

210.6375

212.3462212.2837211.8930210.7544

Tamp

ExuNfer

Exufer

6- Discussão

6.1 – Análise da indução e caracterização de PFOs

Plantas de V. unguiculata, quando submetidas a injuria mecânica, são

capazes de aumentar a atividade de PFOs tanto a nível local como sistemicamente.

Os dados mostrados na figura 8 revelaram que o perfil de indução por ferimento de

PFOs em unifoliatos de feijão-de-corda apresentou uma estreita similaridade com a

de plantas de

Lycopersicum esculentum, quando submetidas ao mesmo tratamento,

sendo a atividade destas aumentada em aproximadamente 18 vezes (Constabel

al., 1995). Em contraste, o ferimento de batata, em folhas do 6

ao 8

nodo, resultou

em um menor aumento de apenas 1,7 vezes na atividade polifenol oxidásica, 48

horas após o estímulo (Thipyapong et al., 1995). Em ambas as folhas feridas e não

feridas de plantas de tabaco, a atividade de PFO aumentou em 4 e 6 vezes,

respectivamente, após 24 horas, e mais de 10 vezes em ambos unifoliatos, no

tempo de 48 horas após a lesão. Resultados similares foram obtidos em plantas

híbridas de choupo com dois meses de idade, onde se ferindo as folhas inferiores

houve um aumento de duas e quatro vezes na atividade de PFOs nos tempos de 48

e 96 horas, respectivamente, em ambas as folhas feridas e não feridas (Constabel &

Ryan, 1998). Nos resultados desta tese, os níveis de atividade solúvel de PFO foram

significativamente aumentados, enquanto nenhuma diferença foi detectada em

fração insolúvel de proteínas tanto de unifoliatos feridos como laterais aos feridos

(tabela 1). Uma vez que mais de 90 % da atividade total de PFO dos unifoliatos está

concentrada na fração insolúvel (quando consideradas frações sem ativação por

SDS), a qual foi resultante da re-extração do precipitado obtido da primeira extração

com solução de Triton X-100 1%, este trabalho alerta para os métodos empregados

quando se investigando a indução de PFOs em tecidos vegetais submetidos a

estresses. O aumento de atividade de PFO restrito a frações de proteínas solúveis

levanta questionamentos sobre análises de indução de PFOs de trabalhos

previamente publicados, como por exemplo a sondagem desenvolvida por Constabel

& Ryan (1998), na qual foi empregado 0,1% de Triton X-100, para extração protéica.

Como PFOs são proteínas fracamente aderidas a membranas, estas são facilmente

liberadas por soluções de detergente (Triton X-100) e quantificação de atividade total

(atividade de PFO solúveis somadas a PFO insolúveis) poderia mascarar variações

de isoformas que apresentam diferentes solubilidades.

Isoformas de PFO de muitas espécies de plantas apresentam uma variação

de tamanho de 32 a mais de 200 kDa, sendo que a maioria apresenta Mr entre 35-

70 (Flurkey, 1986; Sherman

et al., 1991; Steffens et al., 1994; Fraignier et al., 1995;

Van Gelder

et al., 1997; Yang et al., 2000). Estas massas diferem entre as formas

imaturas e maduras e ativas da enzima. Uma PFO de massa equivalente a 67 kDa

foi definida como a forma madura de uma enzima que perdeu seu peptídeo de

importação para o lúmen do cloroplasto (Anderson & Morris, 2003). Neste caso, uma

proteína de 83 kDa foi considerada como uma pró-PFO imatura, não processada,

contendo ainda um fragmento transitório de 14-16 kDa. Em adição, sementes

imaturas de trigo contêm múltiplas isoformas de PFOs mas estas aparentam estar

inibidas (inativas) a menos que sejam tratadas com SDS ou pelo envelhecimento.

Após sofrer clivagem proteolítica e processamento, uma enzima de 40 kDa foi

observada como a forma ativa e madura de uma PFO de uva, originária de uma

proteína precursora completa de 67 kDa, a qual é composta por uma seqüência de

10,6 kDa de um peptídeo transitório de direcionamento para cloroplasto, uma

unidade catalítica de 40,5 kDa contendo duas ligações a cobre e uma extensão C-

terminal de 16,2 kDa (Dry & Robinson, 1994). Outro trabalho tem definido PFOs com

massas moleculares tão baixas quanto 35 a 40 kDa, as quais seriam produtos de

degradação proteolítica, ocorrida durante a extração, ou até mesmo durante o

processamento fisiológico vegetal (Shin et al., 1997). De acordo com Yoruk &

Marshall (2003) e os dados dos trabalhos aqui citados, é relevante mencionar que a

atribuição da multiplicidade de PFOs baseada em estimativas de massa molecular

deve ser interpretada com cautela, uma vez que interconversões de várias formas de

PFOs, sob condições eletroforéticas desnaturantes ou parcialmente desnaturantes,

têm sido amplamente publicadas na literatura (Flurkey, 1990; Cary et al., 1992;

Robinson & Dry, 1992; Fraignier et al., 1995; Marques et al., 1995).

Como pode ser visto na Tabela 2, os procedimentos de isolamento de PFO

resultaram em enriquecimento de atividade de 11,18 vezes, indo de uma atividade

específica de 1,04 do extrato bruto até 11,63 do pico eluído com 0,2 M NaCl via

cromatografia. Similar eficiência de purificação (11,59 vezes) também foi vista em

outro trabalho descrito por Gandia-Herrero et al. (2004) para uma PFO solúvel de

beterraba. Estes resultados mostram que apesar do processo de purificação não ter

atingido um rendimento tão grande quanto o de outros mencionados na literatura, o

material estava suficientemente enriquecido em sua atividade polifenol oxidásica por

cromatografia em DEAE-celulose, tendo sido possível a caracterização cinética

desta enzima.

A estabilidade e ativação de F-0,2 por SDS foram muito similares às

observadas para uma PFO purificada de uma variedade de uva (uva Napoleão),

descrito por Núñez-Delicado

et al. (2007). Os níveis de ativação de PFOs por SDS é

algo que varia enormemente, dependendo da espécie em estudo: em Vicia faba

aumentam de 65 a 119 vezes (Sanchez-Ferrer et al., 1990; Jiménez & García-

Carmona, 1996); 19 vezes para PFO de uva (Sanchez-Ferrer et al., 1989a); 25

vezes para PFO de pêssego (Laveda

et al. 2000); dez vezes para PFO de banana

(Sojo et al., 1998); 4 vezes para PFO de folhas de batata (Sanchez-Ferrer et al.,

1993); 7 vezes para PFO de manga (Robinson et al., 1993). Todas estas atividades

foram medidas sob condições experimentais similares as aqui descritas. Entretanto,

concentrações mais altas deste detergente inibiram significativamente a atividade

desta classe de enzimas (Robb et al., 1964; Sanchez-Ferrer et al., 1989b, 1993). A

PFO de V. unguiculata aqui observada aumentou sua atividade em 10 vezes em

relação a seu estado latente e manteve a atividade em patamares próximos a 50 %,

mesmo em concentrações superiores a 140 mM de SDS (figura 13). Tal

característica sugere que a enzima em estudo apresenta um comportamento

incomum em relação a outras, visto que a maioria das enzimas deste tipo não possui

grande resistência térmica.

Além da elevada resistência a SDS, esta enzima também mostrou ter uma

alta estabilidade térmica. Consta na literatura uma infinidade de trabalhos relatando

sobre a energia de desnaturação de PFO, e um grande leque de valores de

estabilidade foi revisado por Yoruk & Marshall (2003). De forma similar aos dados

obtidos acerca de ativação por SDS e estabilidade da enzima em presença deste

detergente, a estabilidade térmica de F-0,2 foi muito similar a encontrada para PFO

de uvas da variedade Napoleão (Núñez-Delicado et al., 2007), embora esta

apresente uma estabilidade um pouco inferior a encontrada aqui para V. unguiculata

(80 % de atividade residual a 70

C) (figura 14).

Em relação ao efeito do pH sobre a atividade enzimática, o perfil encontrado

para atividade de F-0,2 de

V. unguiculata foi muito similar ao visto para PFO de

frutos de nespereiras (Sellés-Marchart

et al., 2006), uma PFO latente de raízes de

beterraba (Gandía-Herrero et al., 2004) e uma extraída de flores de brócolis (Gawlik-

Dziki et al., 2007). O pH ótimo de PFOs é algo que varia amplamente de acordo

com cada espécie vegetal, mas em geral a variação fica entre os valores 4,0 e 8,0

(Yoruk & Marshall, 2003), o que está de acordo com os dados apresentados para F-

0,2, com pH ótimo de 6,0, evidenciando que esta enzima tem um perfil de atividade

comum comparada as demais da mesma classe enzimática (figura 15).

Os dados referentes à afinidade por substratos indicam que a enzima é

pertence a família das catecolases, uma característica comum de muitas PFOs de

folhas de plantas. Além deste fato, uma maior especificidade contra os substratos 4-

metil-catecol, catecol e pirogalol (tabela 3) indica uma melhor afinidade para

moléculas pequenas de substratos. Este tipo de preferência por substratos

encontrada para F-0,2 também foi encontrada em PFOs de híbridos de choupo

(Populus trichocarpa e P. deltoides) que é induzida por ferimento e por metil-

jasmonato (Constabel et al., 2000; Wang & Constabel, 2003). Tal maior afinidade

contra os substratos catecol e 4-metil-catecol também foi detectada para PFO de

cloroplasto de folhas de Vigna radiata (Shin et al., 1997), uma espécie do mesmo

gênero Vigna aqui pesquisado. No entanto, os valores de atividade, encontrados

para L-DOPA e ácido clorogênico, diferem em muito dos encontrados nesta tese

para F-0,2. Acrescentando a este fato, diferentemente da enzima aqui descrita, a

PFO de Vigna radiata (Shin et al., 1997) não é uma enzima latente.

Os valores de Km aparentes encontrados aqui para o substrato 4-metil-

catecol diferem significativamente dos medidos para PFO de V. radiata (Shin et al.,

1997). No entanto a atividade relativa contra 4-metil-catecol, neste caso, também é

maior que a encontrada contra catecol, sugerindo uma origem cloroplastídica similar

para ambas, embora a PFO de V. radiata seja diferente por se encontrar em seu

estado ativo. Outra observação é a de que tal enzima foi purificada a partir de

frações de cloroplastos, extraídas com tampão contendo Triton X-100, ou seja,

provavelmente trata-se de enzima contida na fração não solúvel, diferentemente da

F-0,2 extraída de frações solúveis.

Consta na literatura uma infinidade de trabalhos caracterizando a cinética de

inibição de atividade de PFOs, usando-se diversos tipos de inibidores para isto.

Nesta tese foram escolhidos os inibidores: Resorcinol, EDTA, tropolona e azida

sódica. Resorcinol é um inibidor que age diretamente sobre o centro ativo desta

enzima, formando uma inibição do tipo competitiva. Porém o uso deste inibidor

reduziu somente 40% da atividade inicial de F-0,2. O agente quelante EDTA e a

azida sódica reduziram a 15 e 100 % da atividade inicial, respectivamente, quando

usados na concentração máxima de 10 mM. Estes dados, especialmente quanto a

inibição por EDTA sugerem uma forte ligação do íons Cu

no centro ativo da

enzima. Tropolona, um competidor de Cu

descrito como um dos mais potentes

inibidores específicos para PFOs (Khan & Andrawis, 1985), reduziu em 50 % a

atividade de F-0,2, quando usado na baixa concentração de 0,01 mM (tabela 5), a

menor concentração efetiva, dentre todos os inibidores testados.

6.2 – Análise da indução, caracterização e efeito de cistatinas em unifoliatos de

V. unguiculata

Consta na literatura a detecção de cistatinas constitutivas de uma enorme

variedade de espécies vegetais, como por exemplo: as cistatinas I e II de arroz (Abe

et al., 1987;1989; Kondo et al., 1991), das cistatinas I e II de milho (Abe e Whitaker,

1988; Abe e Arai, 1991; Abe et al., 1996; Irie et al., 1996), cistatina de sementes de

feijão–de-corda (Fernandes et al., 1993), cistatinas de frutos de abacate (Kimura et

al.,

1995), cistatinas de botões florais de Brassica campetris (Lim et al., 1996),

cistatina de sementes de soja (Hines

et al., 1991; Misaka et al., 1996), de sementes

de Phaseolus vulgaris (Santino et al., 1998; Brzin et al., 1998), além de muitas

outras. No entanto, ainda se conhece pouco a respeito do papel destas proteínas

nos mecanismos induzidos de defesa em plantas, frente à ação de estresses

bióticos ou abióticos, apesar terem sido detectadas há algum tempo (Barrett &

Kirschke,1981). A detecção, purificação, seqüenciamento e caracterização de

cistatinas expressas de forma constitutiva, em sementes de plantas de feijão-de-

corda, são alvos perseguidos há muito tempo (Flores et al., 2001). Recentemente a

indução de uma multicistatina foi detectada em folhas desta mesma espécie, frente

ao estresse de desidratação (Diop et al. 2004). Neste trabalho uma seqüência de

cDNA codificadora para cistatinas foi isolada de uma biblioteca de cDNA produzida a

partir de plantas de feijão-de-corda sob estímulo de estresse hídrico. Após clonagem

e seqüenciamento foi possível constatar que esta cistatina apresentava um duplo

domínio, sendo uma proteína de massa molecular de 22 kDa, e outra suspeita de ter

um triplo domínio com 39 kDa aproximadamente, diferente da cistatina de baixo

peso, de um único domínio, previamente descrita em sementes desta espécie

(Flores et al., 2001). Foi constatado também neste trabalho que só ocorreu a

indução dessas proteínas quando as plantas estavam submetidas a estresse hídrico,

e a expressão de seus RNAm não foi muito aumentada pela ação de ABA. Foi

proposto pelos autores que tais cistatinas induzidas pudessem apresentar um papel

protetor contra as proteases endógenas, evitando a autólise em período de estresse,

relembrando inclusive um papel multifuncional sugerido para cistatinas de variadas

massas moleculares, descrito anteriormente (Flores et al., 2001). Em nossos

estudos foi visto que uma cistatina de massa molecular de 22 kDa, muito similar à

encontrada no trabalho de Diop

et al. (2004), é induzida em plantas de feijão-de-

corda tratadas com estresse de ferimento, principalmente em unifoliato ferido (figura

18 B), mas observando-se também a presença de cistatinas constitutivas, que não

mudaram seu perfil de indução, e uma de cistatina de 29 kDa induzida somente em

unifoliatos que sofreram a ação sistêmica do ferimento. A diferente expressão de

cistatinas frente à ação de ferimento também foi vista em soja (Zhao

et al. 1996),

onde duas cistatinas tiveram sua expressão aumentada somente em plantas feridas

e mostravam KIs de 500 e 1000 vezes menores que o apresentado por uma cistatina

constitutiva, cuja expressão não foi alterada com o tratamento, mostrando que a

afinidade de cistatinas por suas proteinases-alvo pode variar amplamente de acordo

com seu papel. Tais dados evidenciam a participação destes inibidores em funções

bem diferenciadas no corpo vegetal, não se limitando a um papel de defesa.

Proteinases cisteínicas são as principais enzimas proteolíticas envolvidas com

a senescência de pétalas de flor de íris, podendo inclusive, ser possível prevenir ou

adiar os sintomas de senescência fazendo-se uso de um tratamento a base de

inibidores de proteinases sintéticos (Pak & van Doorn, 2004). Em pétalas de cravo

foi evidenciado que o aumento da expressão de um inibidor de caspases,

proteinases cisteínicas envolvidas com morte celular programada, promovia a

proteção da flor ao processo de senescência e murchamento. Além disso, foi

destacado que a atividade proteolítica estava presente de forma uniforme, durante

todo o período de senescência em diferentes partes da flor, sendo que a proteção

contra os efeitos deletérios das caspases de partes vitais, como, por exemplo,

tecidos ovarianos, foi atribuída à expressão de inibidores destas proteinases, ou

seja, cistatinas (Sugawara et al., 2002). Neste sentido, buscamos correlacionar

nossos resultados de detecção de cistatina induzida por ferimento, com um provável

papel de regulação de proteólise endógena nestes tecidos. A detecção do aumento

de expressão da cistatina de 22 kDa majoritariamente em unifoliatos feridos, chama

a atenção ao papel desta em processos fisiológicos não relacionados com defesa,

uma vez que a expressão de proteínas de defesa ocorre tão intensamente a nível

local como de forma sistêmica (Ryan, 2000), sendo em muitos casos, induzida mais

intensamente a nível sistêmico do que em nível local (Thypiapong

et al., 1996).

Complementando estes dados também foi visto, neste trabalho, que uma protease

cisteínica minoritária, com Mr de 50 kDa aproximadamente, teve sua atividade

fortemente reduzida somente em unifoliatos de plantas feridas, a nível local e

sistêmico enquanto outra protease majoritária mostrou sua atividade levemente

reduzida somente em unifoliatos feridos. Os dados indicam uma possível

especificidade da cistatina induzida contra proteases endógenas de uniofoliatos de

V. unguiculata, caso esta esteja mesmo exercendo inibição in vivo (figura 20). Um

outro dado complementar mostrado na figura 21, é a perceptível redução do efeito

de senescência, promovida pelo ferimento de unifoliatos, tanto a nível local como

sistêmico. Todos os dados obtidos em relação à indução de cistatinas, redução de

atividade proteolítica cisteínica e inibição de senescência apontam para uma estreita

correlação entre estes, fundamentada por outros anteriores, descritos na literatura.

Baseando-se nos dados aqui mencionados, é proposta a idéia de cistatinas estarem

participando na redução ou supressão de senescência em unifoliatos de plântulas de

feijão-de-corda. No entanto, a idéia não é nova. Há mais de vinte anos, um trabalho

feito com plântulas de aveia revelou que a senescência era inibida por ferimento

(Giridhar & Thimann, 1984). Os autores destacaram a possibilidade de inibidores de

proteases estarem atuando sobre a inibição de proteases envolvidas no processo.

Porém, não seriam os mesmos induzidos como resposta de defesa, uma vez que a

inibição enzimática por eles atribuída, não necessitava de luz, fator que para Ryan e

seu grupo de pesquisa, era imprescindível para indução de inibidores de proteases

relacionados com defesa (Green & Ryan, 1973).

Recentemente foi registrado, na literatura, que plantas de Phaseolus vulgaris

aumentam seus níveis de proteases serínicas, em folhas senescentes, frente à ação

de estresse hídrico (Hieng et al., 2004). Cultivares resistentes desta espécie não

apresentaram aumento da atividade proteásica. Embora as proteases neste caso

tenham sido serínicas, também observa-se, como foi acima mencionado para

proteases cisteínicas, a estreita relação entre a redução da atividade proteolítica, e o

aumento da resistência à senescência foliar causada por estresse hídrico.

Medições diretas da expressão de cistatinas são muitas vezes dificultadas

pelas suas baixas concentrações em tecidos foliares, tal como o que ocorre em

trabalhos semelhantes ao de Diop

et al. (2004), no qual foi claramente possível

observar uma grande diferença entre os níveis de mRNA de cistatinas e os seus

respectivos perfis de expressão protéica, justificada por eles como decorrente de

processos pós-transcricionais. O protocolo desenvolvido nesta tese permitiu a

detecção de cistatinas, não somente por eliminar contaminantes indesejáveis ao

ensaio (pigmentos, fenóis), mas também por permitir concentrar as proteínas alvo de

análise nos extratos finais clarificados. É sugerido aqui que este método poderia ser

útil inclusive na detecção da cistatinas em tecido foliar, em outras espécies de

plantas.

6.3 – Análise da composição e efeito eliciador de defesa de esxudado de

floema

Com os dados apresentados na figura 22 é possível observar um aumento dos

níveis de atividade de PFOs em plantas inoculadas com esxudado de floema obtido

de plantas de feijão-de-corda cujos unifoliatos não foram feridos; um efeito indutor

menos pronunciado também é visto quando se inoculou o esxudado de floema de

plantas cujos unifoliatos haviam sido previamente feridos. Estes resultados podem

parecer paradoxais, uma vez que não era esperada a indução de PFO por um

esxudado de floema de plantas não feridas nos unifoliatos. No entanto tal com foi

citado por Buchannan et al. (figura 4), somente o fato da coleta de esxudado ser

feita via corte do tecido vegetal, no caule, seria suficiente para promover uma grande

alteração dos seus componentes. Tais alterações devem ter ocorrido em nossos

experimentos, e um fator de indução de defesa pode ter sido liberado em nossas

amostras. Quanto à menor indução de atividade via inoculação de esxudado de

plantas feridas ao nível de unifoliatos, acredita-se que como foi visto na análise de

espectrometria de massas (figura 23), um sinal correspondente ao ácido jasmônico

aparece em esxudados de plântulas feridas ao nível de unifoliatos, e em plantas

controle, contendo apenas o ferimento no caule, feito para exudação do floema.

Estes dados indicam que aparentemente apenas o ferimento do caule é suficiente

para liberação do hormônio AJ, e consequentemente para indução de PFOs, como

foi constatada na figura 22. Tais informações são contrárias aos dados apresentados

em um trabalho anterior similar, feito com plantas de tomate (Ryan,1974), onde foi

visto que em plantas de tomate, feridas ao nível do pecíolo foliar ou caule, a

expressão de inibidores de proteinases serínicas (a proteína de defesa teste em

questão na época) era fracamente estimulada. Entretanto, diante dos dados obtidos

para feijão-de-corda, o ferimento feito no caule promoveu uma considerável

alteração na expressão de PFOs. Pelo menos para a espécie V. unguiculata, nas

definidas condições de estudo, a premissa de que ferimento no caule não induziria

resposta de defesa não é verdadeira. A análise por espectrometria de massas,

portanto, revelou a possível presença de AJ como componente somente presente

em esxudado de plantas feridas ao nível de unifoliatos e caule e plantas controle

feridas somente ao nível de caule, o qual pode ter sido responsável pela indução de

PFO em plantas de feijão-de-corda. A medição do aparecimento de AJ em floema de

plantas feridas é um dado que está de acordo com os mencionados previamente na

literatura e apontam para um uso promissor da técnica mencionada, no intuito de

detectar e caracterizar fitormônios circulantes no floema. Além disso, o esxudado de

unifoliatos de plantas não feridas também foi capaz de induzir a atividade de PFO

quando inoculado (figura 22), o que está de acordo com a análise de espectrometria

de massas (figura 23) onde o AJ também pode estar presente em plantas que não

tiveram os unifoliatos feridos. No entanto, a presença de outras possíveis moléculas

sinalizadoras de defesa, liberadas somente pela lesão feita no caule durante o

processo de sua extração (figura 8), também deve ser considerada.

Além deste sinal, vários outros revelaram a ocorrência de substâncias

presentes em esxudado de plantas feridas, mas não em plantas controle. A análise

de componentes minoritários em esxudado de floema, tais como hormônios

vegetais, ou até mesmo proteínas de defesa, é dificultada não somente pela baixa

concentração destes neste meio vegetal (figura 6), como também pela própria

dificuldade de coleta de esxudado de floema da maioria das espécies, já que ocorre

formação de calose no local do ferimento, pouco tempo após o corte dos elementos

de tubo crivados. Esta é uma defesa natural do organismo vegetal ao

extravasamento deste componente. Para obtenção de quantidade maiores de

exsudato, emprega-se um tampão de extração de pH próximo a 7,0, contendo um

agente quelante de cálcio (EDTA) para evitar a formação de calose (Narváez-

Vasquéz

et al.,1995). Em poucas espécies, como Ricinus comunis e Curcubita

maxima,

é possível a fácil extração e análise do conteúdo floemático. Isto ocorre

porque a concentração de proteínas no floema destas espécies é bem superior às

demais, podendo em certos casos chegar a níveis 10 vezes maiores (Taiz & Zeiger,

2004). Estas características permitiram a execução de uma análise do proteoma de

defesa da espécie

C. maxima (Walz et al. 2004). A utilização da espectrometria de

massa na busca de um hormônio vegetal liberado em floema não é inédita.

Hoffmann-Benning

et al. (2002) já a utilizaram para identificação de um hormônio

peptídico, responsável por ativar o florescimento de Perilla ocymoides, denominado

florígeno. Esta tese utilizou-se de tal metodologia, pela primeira vez, para estudo

sobre de moléculas sinalizadoras direcionadas à defesa vegetal. Os dados obtidos

até o momento apontam a possível presença destas substâncias em uma fração de

esxudado de floema de plantas de feijão-de-corda; no entanto, esta fração necessita

de etapas posteriores de purificação, para ser possível qualquer outra conclusão a

respeito da natureza molecular deste agente indutor de defesa.

7 - CONCLUSÕES

Plantas de feijão-de-corda aumentam seus níveis de atividade de PFOs quando

submetidas a estresse por lesão mecânica.

O aumento de atividade de PFOs em plantas de feijão-de-corda é um processo

sistêmico, ou seja, também foi observado em folhas laterais às feridas.

O aumento de atividade de PFOs só foi observado na fração solúvel desta

enzima; a atividade de frações insolúveis de PFOs não variou como resposta ao

ferimento.

O aumento máximo de atividade de PFOs ocorreu em unifoliatos de plantas, 48

horas após o ferimento mecânico, tanto em unifoliatos feridos quanto em unifoliatos

laterais a estes.

PFOs induzidas em plantas de feijão-de-corda são enzimas latentes, ativadas na

presença de SDS, sendo a concentração de 5mM determinada como ótima para

suas atividades. Apresentaram Mrs de 58 e 73 respectivamente, são termo-

resistentes perdendo a atividade apenas em temperaturas maiores que 70

possuem pH ótimo em torno de 6,0; melhores substratos catecol e 4-metil-catecol e

são inibidas por tropolona.

Plantas de feijão-de-corda aumentam seus níveis de cistatinas quando

submetidas a estresse por lesão mecânica tanto localmente como de forma

sistêmica.

Diferentes isoformas de cistatinas são expressas frente a ação de ferimento,

sendo uma proteína de massa molecular de 22 kDa, com expressão aumentada

local e sistemicamente, e outra de 29 kDa, induzida somente em unifoliatos laterais

aos feridos.

Uma protease cisteínica de 50 kDa tem sua atividade reduzida em unifoliatos de

plântulas feridas de feijão-de-corda.

Plântulas de feijão-de-corda feridas são mais resistentes à senescência que

plântulas controle, não lesionadas.

Indução de cistatinas, redução de atividade proteinásica do tipo cisteínica

específica e a resistência à senescência são eventos correlacionados à resposta a

ferimento em plântulas de feijão-de-corda.

Esxudatos de floema de plantas feridas ao nível de unifoliatos e ao nível de caule

foram capazes de aumentar a expressão de PFOs quando inoculados em plantas

teste, evidenciando a presença de moléculas indutoras de defesa nestas amostras.

Através de espectrometria de massas foi observada a possível presença de ácido

jasmônico em esxudado de plântulas feridas de feijão-de-corda.

8- REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXO

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