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FLÁVIO VIEIRA LOURES
CARACTERIZAÇÃO DA FUNÇÃO DOS LIPÍDIOS DO
PARACOCCIDIOIDES BRASILIENSIS E DO RECEPTOR TLR-4 NA
INTERAÇÃO FUNGO-HOSPEDEIRO.
Dissertação apresentada ao Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade de
São Paulo para obtenção do título de
Mestre em Ciências (Imunologia).
São Paulo
2007
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AGRADECIMENTOS
À minha família que me proporcionou condições para que eu alcançasse meus objetivos, apoiando e
incentivando o meu trabalho.
Ao Professor Júlio Aquino da Faculdade de Educação da Universidade de São Paulo, pelo
comprometimento ético-político que norteia sua fala, que certamente contribuiu de forma grandiosa
para determinar a forma que eu conduzi este trabalho e, principalmente, pela forma que conduzo
minha vida.
À Professora Dra. Vera Calich por confiar e acreditar na minha capacidade intelectual. Agradeço
todos os seus ensinamentos e todas as suas orientações que contribuíram para meu crescimento
acadêmico.
À toda equipe do laboratório: Adriana Pina, Celina Arruda, Laura Raquel Rios Ribeiro, Maíra
Felonato, Marlene Bernardes, Rita de Cássia Valente Ferreira, Simone Bernardino e Tânia Alves da
Costa . Pelo convívio, pela amizade e pela força que sempre me deram. Obrigado a todas vocês pela
ajuda, em especial à Adriana, por estar sempre disposta a ajudar quando precisei, à Celina, pela
paciência (desculpe a bagunça!), `a Maíra pela ajuda com a informática, à Simone, por me salvar com
seu rico inglês, e à Tânia, por tornar possível a execução deste trabalho mantendo tudo sempre a mão.
Obrigado à vocês!!!
Ao Dr. Igor Almeida por preparar as frações lipídicas e pelas valiosas recomendações que propiciaram
a execução deste trabalho.
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À Heleni Stroeder, do Departamento de Parasitologia do ICB –USP, pela ajuda sempre solícita
durante o desenvolvimento deste projeto.
Aos pessoal do Laboratório de Imunopatologia das micoses, à Dra, Eva Burger, Renata Scavone,
Claudinha e Angelinha. Pela força e por estarem sempre dispostas a ajudar.
À equipe do Biotério de Experimentação, em especial à Silvia Massironi e a Regina De Lucca, pela
gentileza e competência com que sempre me atenderam.
Às secretárias do departamento Jotelma e Valéria, pela paciência que sempre tiveram com nossos
atrasos e esquecimentos.
Aos amigos Demétrius, Luciano, Luís, Nilton, Rodrigo, Valmir por me aturarem falar sobre
Imunologia, por estarem sempre presentes e pelos momentos de descontração que passamos juntos.
Às amigas Elaine, Gisele e Keyla, novas, porém sinceras e verdadeiras amigas. Agradeço pelos
momentos de enorme alegria que me proporcionaram, sem elas o caminho seria bem mais difícil.
À Fundação de Apoio a Pesquisa do Estado de São Paulo – FAPESP pelo auxílio finaceiro
fornecido.
4
RESUMO
LOURES, F. V. Caracterização da função dos lipídios de Paraccocidioides brasiliensis
e do Receptor TLR-4 na interação fungo-hospedeiro. 2007. 116 f. Dissertação
(Mestrado em Imunologia) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São
Paulo, São Paulo, 2007.
Os macrófagos são as primeiras células do hospedeiro que entram em contato com o P.
brasiliensis, entretanto, os mecanismos moleculares que governam a interação entre o
fungo e este fagócito têm sido pouco estudados. Tanto os componentes do P.
brasiliensis como os receptores dos fagócitos envolvidos nesta interação são pouco
conhecidos. Baseados nestes fatos, nosso trabalho teve por objetivo caracterizar o efeito
da interação entre os lipídios extraídos da parede do P. brasiliensis e macrófagos
peritoneais de camundongos susceptíveis ao fungo (B10.A), assim como avaliar in vitro
e in vivo o envolvimento do TLR-4, um receptor de fagócito que reconhece
lipopolissacarides, na infecção de hospedeiros pelo P. brasiliensis. Para tanto,
utilizamos macrófagos peritoneais de camundongos que expressam os receptores TLR-4
não funcionais (C3H/HeJ) e camundongos que expressam os receptores funcionais
(C3H/HePas). Demonstramos que todas as frações lipídicas do P. brasiliensis são
capazes de ativar macrófagos com relação à produção de NO e regular a síntese de
algumas citocinas. A interação in vitro entre macrófagos e as frações F1 (fosfolipíos e
lipídios neutros) e F2 (glicolipídios de cadeia curta) levou a uma maior recuperação de
fungos viáveis, assim como estimulou uma maior fagocitose de fungos por macrófagos
murinos. Ao contrário, as frações F3a (glicoproteínas que se ancoram à membrana
plasmática por agrupamentos glicosilfosfatidilinositol) e F3b (glicolipídios de cadeia
longa) levaram a um comportamento oposto em relação ao controle do fungo, ou seja, a
5
interação entre macrófagos e estas frações levou a menor recuperação de fungos viáveis,
assim como permitiu uma menor fagocitose de fungos pelos macrófagos. As diversas
frações lipidicas também regulam a síntese de citocinas. De modo, geral todas as
frações inibiram a produção de IL-10, IL-12 e GM-CSF. A fração F2, entretanto, não
inibiu a síntese de GM-CSF e estimulou a produção de MCP-1. Estudos com
macrófagos TLR-4 normais e deficientes demonstraram que o este receptor ao interagir
com o P. brasiliensis leva à ativação do macrófago, induzindo maior síntese de NO e
maior atividade fagocitica o que resultou em um maior numero de fungos viáveis
recuperados. Além disso, a presença do TLR-4 resulta na produção de altos níveis de
IL-12 e MCP-1. Os resultados in vivo mostraram que na fase aguda da infecção a
presença do TLR-4 induz uma infecção mais grave, com maior número de fungos
viáveis recuperados e maior produção de NO e IL-12 no homegenato de pulmão. Na
fase crônica, a infecção permanece com maior carga fúngica nos animais que expressam
o TLR-4 funcional, associada com maior produção de IL-12, e maiores títulos de
anticorpos séricos (IgG total e IgM). Em conclusão, nosso trabalho demonstrou, pela
primeira vez, que o P. brasiliensis possui lipídios com capacidade de modular a
atividade de macrófagos e que a presença do receptor TLR-4, apesar de induzir a
ativação do macrófago, induz infecções mais graves.
6
ABSTRACT
LOURES, F. V. The role of lipids from Paracoccidioides brasiliensis and receptor
TLR-4 in the interaction fungus-host. 2007. 116 f.. Dissertação (Mestrado em
Imunologia) – Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade de São Paulo, São Paulo,
2005.
The macrophages are the first host cell that interact with fungus P. brasiliensis, but the
molecular mechanisms between the phagocytes and fungus interaction is not well
understood. Both components of the P. brasiliensis and the phagocytes receptors
involved in this interaction are not well known. In these facts, the aim of our work
characterized the effect of the interaction between the lipids from P. brasiliensis wall
and peritoneal macrophages from susceptible mice (B10.A), as well as analyze the
TLR-4 involvement in vitro and in vivo. Furthermore, we used peritoneal macrophages
from mice that have non-functinal TLR-4 (C3H/HeJ) and the normal mice witch
express those functional receptors (C3H/HePas). We demonstrated that all lipids from
P. brasiliensis are potent in activated macrophages, with higher levels of NO, and can
regulate the cytokines synthesis. The in vitro interaction between macrophages and lipid
F1 (phospholipids and neutral lipids) and F2 (glycolipids with short chain) resulted in
higher recuperation of viable fungus, and stimulated the more potent phagocytosis of
fungus from murine macrophages. On the other hand, the lipids F3a
(glycosylphosphatidylinositol-anchored glycoproteins) and F3b (glycolipids with long
chain) resulted in the opposite behavior in the growth of fungus control. Thus, the
interaction between macrophages and these lipids resulted in a lower recuperation of
viable fungus, as well as decreased phagocytosis. The diverse lipids can regulate the
cytokines synthesis. All lipids inhibited the IL-10, IL-12 and GM-CSF production.
7
However, the lipids F2 not only inhibited the GM-CSF synthesis, but also stimulated the
MCP-1 production. Studies with TLR-4 normal and deficient macrophages
demonstrated that this receptor can interact with P. brasiliesis and result in a
macrophages activation with higher level of NO and higher phagocytes activity,
resulting in higher number of recuperated viable fungus. In addition, the TLR-4
presence resulted in higher levels of IL-12 and MCP-1. The in vivo results showed that
in acute phase of infection, the presence of TLR-4 resulted in a more severe disease,
with higher number of viable fungus and higher NO and IL-12 production in lungs
homogenate. Moreover, during in the chronic phase of infection, was also seen the
higher fungal burden in the lung from mice that express TLR-4 functional, associated
with higher IL-12 production, as well as higher titles of antibodies (total IgG and
IgM). In conclusion, our wok demonstrated that P. brasiliensis has lipids witch regulate
the macrophage activity and in the presence of TLR-4, despite of activating
macrophages, develop a more severe diseases.
8
ABREVIATURAS
AcM Anticorpo Monoclonal
Ag Antígeno
CD14 “Cluster” de diferenciação 14
CFA “Cell-free antigen”
CTLA-4 “Cytotoxic T-lymphocyte-associated protein 4”
DNA Àcido desoxirribonucléico
BHI “Brain Heart Infusion”
DMEM “Dulbecco's Modified Eagle's Médium”
D.O. Densidade óptica
E.P. Erro padrão
ELISA “Ensyme-linked immunosorbent assay”
F1a Fração lipídica 1a
F1b Fração lipídica 1b
F1c Fração lipídica 1c
F2 Fração lipídica 2
F3a Fração lipídica 3a
F3b Fração lipídica 3b
HTT Hipersensibilidade do tipo tardio
IFN-γ “Interferon – γ”
GIPC Glicoinositol-fosforilceramida
GIPL Glicoinositolfosfolipídio
GlcCer β-glucosilceramidas
GM-CSF “Granulocyte macrophage colony-stimulating factor”
GPI Glicosilfosfatidilinositol
9
GSL Glicoesfingolipídios
Ig Imunoglobulina
IgA Imunoglobulina A
IgE Imunoglobulina E
IgG Imunoglobulina G
IgG1 Imunoglobulina G isótipo 1
IgG2a Imunoglobulina G isótipo 2a
IgG2b Imunoglobulina G isótipo 2b
IgG3 Imunoglobulina G isótipo 3
IgG4 Imunoglobulina G isótipo 4
IgM Imunoglobulina M
IL-2 Interleucina 2
IL-4 Interleucina 4
IL-5 Interleucina 5
IL-6 Interleucina 6
IL-10 Interleucina 10
IL-12 Interleucina 12
iNOS “Inducible nitric oxide synthase”
i.p. Intraperitoneal
IP-10 “Interferon-inducible protein 10”
i.t. Intratraqueal
KO “Knockout”
LP Lavado peritoneal
LPS Lipopolissacáride
MCP-1 “Monocyte chemoattractant protein-1”
10
MHC “Major histocompatibility complex”
MIP-1α “Macrophage inflammatory protein 1 alpha”
Mo “Macrófagos”
MyD88 “Myeloid differentiation primary response gene (88)”
NF-kB “Nuclear factor-kappa B”
NO “nitric oxide”
NOS2 “Nitric oxide synthase 2”
OPD Ortofenilenodiamina
Pb Paracoccidioides brasiliensis
Pb 18 Paracoccidioides brasiliensis isolado 18
P. brasiliensis Paracoccidioides brasiliensis
PBS Solução salina em tampão fosfato
PCM Paracoccidioidomicose
PMN Polimorfonucleares
SFB Soro fetal bovino
SPF “Specific pathogen free”
TCB Tampão carbonato-bicarbonato
T CD4
+
Linfócito T auxiliar
T CD8
+
Linfócito T citotóxico
TGF-β “Transforming growth factor β”
Th1 Linfócitos T “helper” classe 1
Th2 Linfócitos T “helper” classe 2
TLR “Toll-Like receptor”
TLR-2 “Toll-Like receptor 2”
TLR-3 “Toll-Like receptor 3”
11
TLR-4 “Toll-Like receptor 4”
TLR-5 “Toll-Like receptor 5”
TLR-9 “Toll-Like receptor 9”
TNF-α “Tumor necrosis factor α”
12
1) INTRODUÇÃO...............................................................................................
01
2) OBJETIVOS................................................................................................... 15
3) MATERIAL E MÉTODOS........................................................................... 16
3.1) Experimentos in vitro..
.........................................................................
16
3.1.1) Animais...................................................................................... 16
3.1.2) Frações lipídicas ..........
.............................................................
16
3.1.3) Fungo......................................................................................... 18
3.1.4) Lavado Peritoneal......................................................................
18
3.1.5) Tratamento com IFN-
19
3.1.6) Tratamento com frações lipídicas................................
..............
19
3.1.7) Infecção com P. brasiliensis......................................................
20
3.1.8) Determinação de UFC .........
.....................................................
20
3.1.9) Dosagem de NO ........................................................................
21
3.2) Experimentos in vivo............................................................................ 21
3.2.1) Animais...................................................................................... 21
3.2.2) Infecção intra-
traqueal...............................................................
21
3.2.3) Avaliação do grau de infecção....
...............................................
22
3.2.4) Avaliação do tempo de sobrevida .............................................
22
3.2.5) Determinação do nível de anticorpos específicos......................
23
3.2.5.1) Antígeno....................................................................... 23
3.2.5.2) Anti-
soros ....................................................................
23
3.2.5.3) Ensaio imunoenzimático..........................................
.....
24
3.2.6) Dosagem de NO......................................................................... 25
3.3) Caracterização das citocinas e quimiocinas por ELISA.....................
.
25
3.4) Análise estatística................................................................................
28
13
4) RESULTADOS............................................................................................... 29
4.1) Frações Lipídicas.................................................................................
30
4.1.1) Fosfolipídios e lipídios neutros –
F1a........................................
30
4.1.1.1) Avaliação da atividade fungicida............................
......
30
4.1.1.2) Ensaio da fagocitose 30
4.1.1.3) Dosagem de NO..................................................
..........
34
4.1.1.4) Dosagem de citocinas................................................... 36
4.1.2) Glicolipídios de cadeia curta – F2......................
.......................
40
4.1.2.1) Avaliação da atividade fungicida..................................
40
4.1.2.2) Ensaio
da fagocitose....................................................
40
4.1.1.3) Dosagem de NO............................................................
43
4.1.2.4) Dosagem de citocinas................................................... 43
4.1.3)
Glicoproteínas que se ancoram à membrana plasmática
por GPIs –
F3a.........................................................................
49
4.1.3.1) Avaliação da atividade fungicida..................................
49
4.1.3.2) Ensaio da fagocitose 49
4.1.3.3) Dosagem de NO............................................................
52
4.1.3.4) Dosagem de citocinas................................................... 54
4.1.4) Glicolipídios de cadeia lonfa – F3b.......................................
....
58
4.1.4.1) Avaliação da atividade fungicida..................................
58
4.1.4.2) Ensaio da fagocitose....
................................................
58
4.1.4.3) Dosagem de NO............................................................
61
4.1.4.4) Dosagem de citocinas................................................... 61
4.2) TLR-
4 na paracoccidioidomicose.........................................................
67
14
4.2.1) In vitro....................................................................................... 67
4.2.1.1) Avaliação da atividade fungicida.................
.................
67
4.2.1.2) Ensaio da Fagocitose....................................................
67
4.2.1.3)
Dosagem de NO............................................................
70
4.2.1.4) Dosagem de citocinas ..................................................
70
4.2.2) In vivo........................................................................................ 75
4.2.2.1) Avaliação do grau de infecção – fase aguda.........
......
75
4.2.2.2) Dosagem de NO –
fase aguda......................................
75
4.2.2.3) Dosagem de citocinas –
fase aguda.............................
77
4.2.2.4) Avaliação do grau de infecção –
fase crônica..............
77
4.2.2.5) Dosagem de NO –
fase crônica...................................
77
4.2.2.6) Dosagem de citocinas-
fase crônica..............................
80
4.2.2.7) Dosagem de anticorpo................................................. 80
4.2.2.8) Avaliação do tempo de sobrevida................................ 82
5) DISCUSSÃO................................................................................................... 84
6) CONCLUSÕES............................................................................................... 104
7) REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................
105
8) ANEXOS.......................................................................................................... 117
15
Introdução
A paracoccidioidomicose (PCM), causada pelo Paracoccidioides brasiliensis, é
uma micose sistêmica do homem e geograficamente está confinada à América Latina.
Sua área de endemicidade se estende da América Central à Argentina, prevalecendo
principalmente na Argentina, Colômbia, Venezuela e Brasil (RESTREPO et al., 2001).
No Brasil, é encontrada principalmente na região central do Estado de São Paulo,
caracterizando uma extensa área endêmica (BLOTTA et al., 1999).
A PCM afeta principalmente as comunidades rurais, sendo uma das micoses
profundas de maior prevalência destas regiões. Foi estimado em uma região endêmica
da América do Sul, onde vivem aproximadamente 90 milhões de pessoas, que 10
milhões estão em eminente risco de infecção. A doença apresenta grande magnitude e
baixa visibilidade, sendo a oitava causa de morte por enfermidades crônicas, entre as
doenças infectos-parasitárias, e a mais letal entre as micoses sistêmicas (McEWEN et
al., 1995).
Estudo epidemiológico relata 3181 óbitos pela PCM no Brasil entre 1980 e 1995
e taxa de mortalidade média anual 1,45/milhão de habitantes. As regiões Sul e Centro-
Oeste apresentam as maiores taxas de mortalidade regional. O Sudeste apresentou a taxa
mais baixa e com tendência de queda. O trabalho apresenta dados que indicam a
prevalência da doença em áreas rurais e mortalidade predominante no sexo masculino
em uma proporção de 562 homens/100 mulheres (COUTINHO et al., 2002).
A PCM ocorre com maior incidência em homens com idade entre 30 e 50 anos,
trabalhadores rurais, que apresentam baixo nível sócio-econômico e exibem um alto
grau de desnutrição, alcoolismo e tabagismo crônico. A doença raramente é encontrada
em crianças e jovens (SANTOS et al., 2003; BRUMMER et al., 1993; ARISTIZABAL
Introdução
16
et al., 1998).
Estudos sugerem que a não progressão da doença nas mulheres esteja
relacionado com fatores hormonais. O hormônio β-estradiol inibe a transformação do
bolor para a fase de levedura do P. brasiliensis. Outros hormônios também estudados,
como testosterona e corticosterona, não inibiram a transição para a fase de levedura do
P. brasiliensis (RESTREPO et al., 1984).
Na ma
ioria dos casos a infecção é adquirida pela via respiratória,
pela inalação de propágulos aéreos do fungo, os conídios (McEWEN et al., 1987). In
vitro e provavelmente na natureza, o fungo dimórfico P. brasiliensis é encontrado como
bolor ou esporo à temperatura ambiente, ou na forma de levedura em temperaturas a
37
o
C
sendo esta a forma predominante em tecidos de pacientes (RESTREPO, 1998 e
1985).
A PCM apresenta-se em diferentes formas no hospedeiro. A grande maioria dos
indivíduos usualmente desenvolve infecção pulmonar assintomática, porém reações de
hipersensibilidade do tipo tardio (HTT) positiva, enquanto que alguns indivíduos
apresentam manifestações clínicas da doença. As formas polares da PCM são a
hiperérgica ou localizada e anérgica ou disseminada. Características tanto do homem,
como patrimônio genético, sexo, idade, integridade do sistema imunológico, como do
fungo, grau de virulência, isolado, composição antigênica, assim como características da
interação fungo-hospedeiro, como número de partículas infectantes e via de infecção,
são determinantes da evolução da infecção pelo P. brasilensis (MONTENEGRO &
FRANCO, 1994).
17
Introdução
Estudos recentes têm demonstrado que a resposta imune celular tem
papel fundamental na defesa dos hospedeiros contra a infecção pelo P. brasiliensis,
enquanto que as formas mais graves da doença estão associadas a níveis altos de
anticorpos e ativação policlonal de linfócitos B (ARANGO et al., 1982; CASTANEDA
et al., 1988; FAZIOLI, 1997; SINGERS-VERMES et al., 1993). Estas características
indicam que a resposta imune relacionada com a produção de anticorpos, tais como as
respostas imunes governadas por linfócitos T-helper 2 (Th2), preferencialmente
conduzem para a doença mais grave e aquelas associadas com a ativação da imunidade
celular, comandada pelos linfócitos T helper 1 (Th1), levam a uma patologia mais
branda.
Trabalhos recentes têm demonstrado claramente que pacientes com a forma
grave da PCM produzem níveis de IgE, IgG4 (regulados por IL-4) e IgA (regulada pelo
TGF-β, IL-5 e IL-10), mais altos do que aqueles com a forma branda da doença
(BAIDA et al.,1999; MAMONI et al., 2002). Além disso, a secreção de níveis mais
altos de citocinas do tipo 2 (IL-4, IL-5, IL-10) e TGF-β, bem como a presença de
eosinofilia, foi detectada em pacientes com infecção mais disseminada do que aqueles
com a doença menos grave (OLIVEIRA et al., 2002). Em pacientes com a doença ativa,
foi encontrada baixa secreção de IFN-γ (OLIVEIRA et al., 2002; KARHAWI et al.,
1999) e aumento da expressão de CTLA-4 em células mononucleares do sangue
periférico, aumento este que pode estar relacionado com a anergia dos linfócitos T
(CAMPANELLI et al., 2003). Em conjunto, estes dados indicam um padrão de resposta
imune Th1/Th2 na PCM, isto é, as células Th2 estão preferencialmente associadas com
a doença progressiva e grave e as células Th1 associadas com a forma benigna da
18
Introdução
infecção. Alternativamente, a anergia de células T poderia ser a responsável pela
resposta imune inadequada de pacientes com a forma grave.
Utilizando um modelo de infecção intraperitoneal (i.p.) de PCM, CALICH et al.
(1985), demonstraram que havia diferenças significantes entre resistência e
susceptibilidade ao fungo, entre várias linhagens isogênicas de camundongo. Foram
caracterizadas como as mais resistentes as linhagens A/Sn e A/J, enquanto que animais
B10.A mostraram-se altamente susceptíveis à infecção pelo P. brasiliensis.
Estudos mais recentes desenvolvidos em nosso laboratório têm utilizado um
modelo de PCM pulmonar empregando as mesmas linhagens de camundongos,
utilizando, porém, a via intra-traqueal (i.t.) de infecção. Foi observado que
camundongos A/Sn desenvolvem PCM crônica, benigna e restrita aos pulmões.
Animais B10.A desenvolvem doença disseminada e progressiva. Os resultados obtidos
sugeriram que a resistência à PCM estava associada à atividade de linfócitos T,
macrófagos e linfócitos mediados por IFN-γ (CANO et al., 1995). Estudos in vivo
demonstraram ainda que o IFN-γ tem efeito protetor na PCM pulmonar. A depleção de
IFN-γ por anticorpos monoclonais agravou a doença, tanto em animais susceptíveis,
como em animais resistentes ao fungo. Nesses animais depletados houve aumento da
carga fúngica pulmonar e anergia da resposta imune celular (CANO et al., 1998).
SOUTO et al. (2000) ao estudarem o papel do IFN-γ e fator de necrose tumoral-alfa
(TNF-α) na resistência à infecção, demonstraram que o IFN-γ atua no mecanismo de
resistência à doença e induz a produção de óxido nítrico (NO) que determina anergia de
células T. Outros estudos revelam que a produção de quimiocinas e o recrutamento de
leucócitos para os pulmões em camundongos infectados por P. brasiliensis são
19
Introdução
modulados por IFN-γ. SOUTO et al. (2003) evidenciaram isto ao estudar a produção de
quimiocinas em camundongos C57Bl/6 comparados a animais da mesma linhagem,
porém com o gene para IFN-γ nocauteado. Estes últimos produziram baixos níveis de
quimioatraentes para células mononucleares como IP-10, Mig e MCP-1, e níveis altos
de quimioatraentes de neutrófilos como KC e MIP-1α.
Estudos realizados com o modelo intra-peritoneal (i.p.) e com o modelo
pulmonar da PCM demonstraram que a infecção pelo P. brasiliensis leva a diferentes
graus de ativação macrofágica, que dependem do padrão genético da linhagem de
camundongo empregada (KASHINO et al., 1995). O óxido nítrico (NO), um dos mais
importantes intermediários reativos do nitrogênio, é um dos principais responsáveis pela
atividade microbicida dos macrófagos. O NO é gerado pela oxidação de um dos
nitrogênios do aminoácido L-arginina (HIBBS et al., 1987). A enzima óxido-nítrico-
sintetase induzida (iNOS ou NOS2) é a responsável pela produção de NO e está
amplamente envolvida em processos inflamatórios e infecciosos (McMICKING et al.,
1997). Vários estudos demonstraram a participação do NO em várias infecções por
microrganismos, inclusive pelo P. brasiliensis. BOCCA et al. (1988) demonstraram
que o tratamento in vivo com um inibidor de NO agravava a doença em camundongos
(C57Bl/6) infectados pelo P. brasiliensis, porém revertia a anergia dos linfócitos T a
antígenos do fungo.
NASCIMENTO et al. (2002) relatam que macrófagos de animais resistentes
produzem baixos níveis de NO e altos de TNF-α, enquanto que camundongos
susceptíveis estimulados por leveduras vivas do fungo produzem níveis elevados de NO
e baixos de TNF-α. Além disso, em animais depletados in vivo de NO , e em
camundongos deficientes do gene de iNOS a doença foi mais grave, com lesões
20
Introdução
disseminadas e ricas em fungos.
Trabalhos desenvolvidos em nosso laboratório demonstraram que a citocina IL-
4, a mais típica citocina Th2, tem uma função dupla na PCM: dependendo do padrão
genético do hospedeiro pode ser protetora ou exacerbadora da doença pulmonar
(ARRUDA et al., 2004; PINA et al., 2004). Os leucócitos PMN têm ação evidente na
imunidade protetora de camundongos susceptíveis embora protejam camundongos
resistentes somente ao início da infecção. Fato interessante observado neste trabalho foi
o de que a depleção de leucócitos PMN induzia doença muito grave nos camundongos
susceptíveis em concomitância com níveis elevados de citocinas pró-inflamatórias.
Assim, a atuação excessiva do sistema imune pode ser deletéria ao hospedeiro (PINA et
al., 2006).
Diferentemente do que se supunha na doença humana, experimentos de depleção
in vivo e com camundongos nocaute (KO) para genes de subpopulações linfocitárias
(CD4
+
e CD8
+
) têm demonstrado que os linfócitos T CD8
+
são fundamentais para o
controle da PCM pulmonar e podem se apresentar sob os padrões do tipo 1 (secretor de
IFN-γ) ou tipo 2 (secretor de IL-4) de ativação. Além disso, estes linfócitos parecem ser
fundamentais para o controle da carga fúngica pulmonar (CANO et al., 2000;
CHIARELLA, 2003; CALICH & BLOTTA, 2005). Os linfócitos T CD4
+
do tipo 1 são
ativados ao início da resposta imune de camundongos resistentes que mais tardiamente
ativam subpopulações Th2. Esta ativação parece contribuir para o padrão resistente,
talvez regulando negativamente processo inflamatório lesivo para tecidos do
hospedeiro. A subpopulação T CD4
+
de camundongos susceptíveis é completamente
21
Introdução
anérgica e a doença destes animais não se altera pela depleção seletiva de linfócitos T
CD4
+
. Assim, em camundongos susceptíveis outros mecanismos imunorregulatórios
parecem estar associados à susceptibilidade genética à doença. Neste aspecto, recentes
trabalhos realizados com pacientes têm demonstrado que a imunossupressão na PCM
está associada à expressão aumentada de moléculas CTLA-4 por linfócitos de pacientes
(CAMPANELLI et al., 2003), à apoptose de células T (CACERE et al., 2002) e à ação
de células T-reguladoras de fenótipo T CD4
+
CD25
+
Foxp3
+
(CAVASSANI, 2006).
No nosso modelo experimental, várias observações indicam que o paradigma
Th1/Th2 de ativação da resposta imune adaptativa não explica completamente os
fenômenos de resistência e susceptibilidade ao fungo. Assim, a IL-4 é protetora para
camundongos susceptíveis (ARRUDA et al., 2004), o tratamento com IL-12 exógena
leva à menor disseminação do fungo, mas induz intensa patologia pulmonar associada
com exuberante influxo de células inflamatórias (ARRUDA et al. 2002), a depleção de
células T CD4
+
não altera o curso da doença (CHIARELLA, 2003) e a produção
excessiva de óxido nítrico induz anergia da imunidade celular (NASCIMENTO et al.,
2002).
O macrófago é a célula central da imunidade contra várias infecções; a sua
ativação e a modulação de suas funções muitas vezes determina o curso da doença.
Diferentes estudos in vitro apóiam o conceito de que para ativação de macrófagos e
conseqüente produção de oxido nítrico (NO) são necessários dois diferentes sinais
(TUEHR & MARLETTA, 1987, GREEN et al., 1990, AMBER et al., 1991). Estes
sinais incluem o interferon-gama (IFN-γ), o fator de necrose tumoral-alfa (TNF-α) e
lipopolissacarídios (LPS). Contudo, recentemente, outros estudos estão sugerindo que
22
Introdução
outros compostos biológicos ancorados à membrana celular dos organismos patogênicos
funcionam como um dos sinais necessário para ativação dos macrófagos. Diversas
pesquisas enfocam o papel de moléculas ancoradas à membrana plasmática
(glicolipídios, lipopeptídios e glicoproteínas) de diversos parasitas na ativação e
modulação do estado funcional dos macrófagos (CAMARGO et al., 1997; ALMEIDA
et al., 2000; ALMEIDA & GAZZINELLI, 2001; PROUDFOOT et al., 1995).
CAMARGO et al. (1997) demonstram que glicoproteínas ancoradas à
membrana plasmática por glicosilfosfatidilinositol (GPI), isoladas de Trypanosoma
cruzi, operam como o segundo sinal pela indução de NO por macrófagos pré-ativados
com IFN-γ, além de desencadear a síntese de citocinas pró-inflamatórias. Estudos
recentes demonstram que alguns compostos contendo GPI derivados do Plasmodium
falciparum potencializam a síntese de NO por macrófagos (TACHADO et al., 1996).
Tem sido demonstrado que as GPIs atuam como as moléculas de grande importância na
ativação de macrófagos em diversas infecções (SCHOFIELD et al., 2005). Contudo, os
trabalhos não se limitam a estudar os compostos contendo GPIs; CARLOS et al. (2003)
relatam que lipídios derivados da parede celular de Sporothrix schenki, fungo causador
de uma micose granulomatosa, podem inibir a fagocitose e potencializar a síntese de
NO por macrófagos.
Na resposta imune ao fungo P. brasiliensis, entretanto, o papel dos componentes
da membrana do fungo, não foi estudado. O que sabemos atualmente é que a
composição química da membrana celular do P. brasiliensis muda durante a transição
morfológica de bolor para levedura. Em particular, há mudanças na composição
química dos glicoesfingolípidios (GSL) (TOLEDO et al., 1998 e 1999). Os principais
23
Introdução
GSLs de P. brasiliensis são β-glucosilceramidas (GlcCer), com ou sem ligações
insaturadas no carbono 18 do ácido graxo da ceramida, e duas diferentes glicoinositol-
fosforilceramidas (GIPC), com a diferença que uma contém β-galactofuranose. As
diferentes formas de GlcCer e GIPC estão presentes em níveis equivalentes na
membrana micelial, entretanto, na membrana de leveduras predominam GlcCer com
ligações saturadas, e GIPC contendo β-galactofuranose. É importante salientar que o
GIPC contendo β-galactofuranose é reativo com anticorpos de pacientes com
paracoccidioidomicose (TOLEDO, 1995). Essas modificações e diferenças poderiam
indicar o envolvimento dos glicoesfingolipídios na patogenicidade do P. brasiliensis e
conseqüentemente na resposta imune dos hospedeiros, uma vez que após a infecção
com conídios ou fragmentos de micélio há a formação de leveduras, que interagem com
os mecanismos gerais da resposta imune inata do hospedeiro. Além disso, os diversos
componentes lipídicos do fungo poderão ter atividade diferente na imunomodulação dos
macrófagos.
Os componentes lipídicos do fungo assim como outros componentes de sua
membrana podem ser reconhecidos pelos macrófagos através dos Toll-Like Receptors
(TLRs). Cada vez mais vem sendo demonstrada a importância dos receptores da família
Toll-Like no reconhecimento de diversos patógenos. Eles são responsáveis por conferir
certa especificidade à imunidade inata. Esta especificidade reside no fato dos TLRs
reconhecerem padrões moleculares de componentes biológicos associados à membrana
ou outros compostos biológicos de patógenos (HOFFMANN et al., 1999; ADEREM &
ULEVITH, 2000). Hoje, sabemos que a importância dos TLRs vai além disso, pois
podem também participar da resposta humoral através da ativação do linfócito B
(MEDZHITOV & PASARE, 2005). Também estão expressos nos linfócitos T, nestas
24
Introdução
células os TLR-2, TLR-3, TLR-5 e TLR9 atuam como receptores co-estimulatórios e
propiciam o aumento da produção de citocinas e/ou profilereção do linfócito T ativado.
Em adição, os TLR-2, TLR-5 e TLR-9 modulam a atividade supressora de linfócitos T
reguladores CD25
+
CD4
+
(KABELITZ, 2007). Dentre estes receptores há o TLR-4 que
interage com o receptor CD14 e media a sinalização citoplasmática induzida por LPS
microbiano (CHOW et al., 1999). Os receptores TLR foram encontrados inicialmente
em Drosophila melanogaster e denominados de “tipo Toll” e associados com a defesa
contra parasitas (KOPP & MEDZHITOV, 1999; TAKEDA et al., 2003). A seguir,
foram descritos receptores homólogos em mamíferos e foram então denominados de
Toll-Like Receptors. Hoje, conhecemos cerca de 10 diferentes TLRs e todos eles
apresentam pequenas diferenças nas cadeias de aminoácidos que compõe as proteínas
que os formam. Decorrente destas diferenças, cada TLR é capaz de reconhecer classes
diferentes de moléculas biológicas presentes em diversos microorganismos, como por
exemplo, LPS, lipoproteínas, flagelina, peptideoglicana, DNA entre outras (TAKEDA
et al., 2003).
Quando ativados, os TLRs desencadeiam uma sinalização intracelular que
geralmente culmina com a ativação do macrófago e síntese de compostos que venham a
eliminar o patógeno, ou até mesmo, a ativação macrofágica via TLRs culmina com o
aumento da fagocitose do patógeno e possível crescimento e proliferação intracelular
(VAN DER GRAAF et al., 2005); esta ativação ocorre através da ativação do fator de
transcrição NFkB que ativa genes a produzirem citocinas que estão ligadas à inflamação
como o TNF-α e IL-1, proliferação celular (IL-2) e apoptose. A ativação final do NFkB
pode ser desencadeada por um sinal proveniente de um TLR e a via de sinalização pode
25
Introdução
ser dependente ou independente do Fator 88 de diferenciação mielóide (MyD88). Se a
via de ativação for independente de MyD88, o sinal proveniente do TLR ativa o NFkB
através da via dependente do fator induzido por IFN-β (TRIF). Se for dependente de
MyD88, está proteína desencadeará uma cascata de ativação de proteínas citosólicas que
culminará com a ativação do fator de transcrição NFkB (AKIRA & UEMATSU, 2006;
DOYLE & ONEILL, 2006).
A literatura é vasta em trabalhos relatando a importância dos diferentes TLRs
nas infecções: CAMPOS et al. (2001) sugerem que glicosilfosfatidilinositol (GPI)
isolada de Trypanosoma cruzi ativa o início da produção de IL-12, TNF-α e NO por
macrófagos de camundongos via TLR-2. Assim, a ativação do TLR-2 talvez possa
iniciar um mecanismo de defesa inata e uma resposta inflamatória durante o processo de
infecção pelo protozoário.
THOMA–USZYNSKI et al. (2001) demonstraram que lipoproteínas de
Mycobaterium tuberculosis ativam macrófagos de camundongos e humanos via TLR-2.
Por outro lado, CAMPOS et al. (2004) relatam que LPS derivado de Brucella abortus
ativa macrófagos via TLR-4. Este fato foi facilmente demonstrado utilizando um
camundongo que tem uma mutação no gene que codifica TLR-4 (C3H/HeJ) e uma
linhagem normal (C3H/HePas) que expressa o receptor inalterado. Macrófagos de
ambas as linhagens foram desafiados com LPS, porém os deficientes para TLR-4
produziram níveis menores de IL-12 e TNF-α, o que sugere a participação do TLR-4 na
imunomodulação dos macrófagos.
CAMARGO et al. (1997) mostram que as mucinas, glicoproteínas ancoradas à
membrana plasmática por GPI, isoladas de Trypanosoma cruzi são responsáveis pela
26
Introdução
iniciação da síntese de citocinas pró-inflamatórias (IL-12, TNF-α) por macrófagos de
hospedeiros, além de ser potentes indutores da síntese de NO. Em seguida, foi
demonstrado que a atividade pró-inflamatória das mucinas estava localizada
exclusivamente na sua porção de GPI (ALMEIDA et al., 2000 e 2001). Ao contrário,
PROUDFOOT et al. (1995) relatam que o glicoinositolfosfolipídio (GIPL), glicolipídio
predominante de membrana de Leishmania major, inibe a síntese de NO e reduz a
atividade leishmanicida dos macrófagos de camundongos infectados. Em camundongos
geneticamente resistentes à leishmaniose, existe uma preferência pela ativação de
células Th1 seguida à infecção por L. major. Células Th1 ativadas produzem IFN-γ que
pode levar macrófagos a sintetizar NO, contribuindo para eliminação do parasita
intracelular (LIEW et al., 1990). Por outro lado, em camundongos geneticamente
suscetíveis, células Th2 são preferencialmente ativadas pelo parasita (SCOTT et al.,
1988). Células Th2 ativadas, tipicamente produzem IL-4 e IL-10, que podem inibir a
síntese de NO por macrófagos ativados, contribuindo para sobrevivência do parasita
(LIEW et al., 1991). Estas informações sugerem que o parasita talvez tenha
desenvolvido uma habilidade para garantir sua sobrevivência, usando GIPL para inibir a
síntese de NO.
Em relação às infecções fúngicas, BELOCHIO et al. (2004) demonstraram que a
resposta imune inata e adaptativa às infecções por Candida albicans e Aspergillus
fumigatus é coordenada por diferentes TLRs, particularmente por TLR-2, TLR-4 e
TLR-9. Neste trabalho as diferentes formas do fungo, hifa e conídeos, são reconhecidas
por diferentes Tolls. Estes autores demonstraram também que a presença do TLR-2 e do
TLR-9 levou a uma doença mais grave, com níveis altos TNF-
α e de UFC nos animais
27
Introdução
que possuem os receptores funcionais, comprando-se com os TLR-2 KO e TLR-9 KO.
Em outro trabalho com Aspergillus fumigatus, demonstrou-se que macrófagos
peritoneais de camundongos deficientes para o TLR-4 produzem menores níveis de
TNF-α, IL-1α e IL-1β, comparando-se com macrófagos provenientes de animais que
expressam o TLR-4 funcional, quando estimulados com conídeos do fungo (NETEA et
al., 2003).
VIRIYAKOSOL et al. (2004) relataram que a ativação de macrófagos
peritoneais por Coccidioides posadassi é dependente do TLR-2 e independente do TLR-
4. Ao desafiar macrófagos de camundongos TLR-2 KO com o fungo, observaram níveis
menores de TNF-α e MIP-2 em comparação àqueles produzidos por com macrófagos de
animais que apresentam o receptor funcional. Contudo, o mesmo desafio não resultou
em diferenças na produção destas citocinas quando macrófagos de animais TLR-4 KO
foram comparados a macrófagos de animais que apresentam o TLR-4 funcional.
Trabalhando com hifas e leveduras de Cândida albicans GOZALBO et al.,
2006 demonstraram que TLR-4 e TLR-2 participam da defesa do hospedeiro frente a
este fungo. Ambas as formas dos fungos foram capazes de ativar os receptores que são
responsáveis pela ativação de macrófagos e produção de citocinas pró-inflamatórias
como o TNF-α. Esta interpretação contrasta com os achados in vivo de BELOCHIO et
al. (2004), que demonstraram que a presença de TLR-4 leva a candidíase mais grave.
São poucos os trabalhos até o momento que estudaram os receptores envolvidos
no reconhecimento de P.brasiliensis por macrófagos. Jimenez et al. (2006), realizaram
um estudo com macrófagos de medula óssea de camundongos congênicos das linhagens
B10R que expressavam o gene Nramp1, característico do padrão de susceptibilidade à
28
Introdução
M. tuberculosis, e B10S que não expressavam esse gene, para avaliar a capacidade
fagocítica destas células sobre conídios (opsonizados ou não) de P. brasiliensis. Foi
observada uma alta porcentagem de fagocitose para as duas linhagens de macrófagos
(B10R e B10S); no entanto, os macrófagos B10R apresentaram maior porcentagem de
células associadas aos conídios e altos números de conídios por macrófagos. Realizaram
também experimentos de opsonização com soro inativado e realizaram o tratamento dos
macrófagos com o anticorpo anti-CR3. Ocorreu uma diminuição da fagocitose para
ambas as linhagens, e mais ainda, o bloqueio de receptores de manose também levou à
redução da fagocitose.
Assim, o estudo da interação Toll – P. brasiliensis pretende esclarecer se o
receptor em questão está envolvimento no reconhecimento deste fungo e se contribiu
também para a eliminação do P. brasiliensis, conferindo assim um caráter protetor na
PCM.
29
objetivos
1) Investigar o papel dos lipídios de P. brasiliensis na atividade fungicida e
secretora de macrófagos peritoneais. Para tanto, investigamos inicialmente a influência
da presença de diversas frações lipídicas de P.brasiliensis na atividade fungicida de
macrófagos de camundongos susceptíveis ao fungo (B10.A). Foi também estudada a
produção de NO, citocinas pró-inflamatórias (IL-12, TNF-α, GM-CSF), anti-
inflamatórias (IL-10) e da quimiocina MCP-1 após a infecção in vitro de macrófagos
com o fungo;
2) estudar in vitro o envolvimento do TLR-4 (que reconhece LPS de patógenos)
na interação entre macrófagos peritoneais de camundongos e P.brasiliensis. Para tanto,
foram usados macrófagos de camundongos C3H/HeJ (mutante para uma proteína que
codifica o TLR-4) e da linhagem normal C3H/HePas. Nestes ensaios foi caracterizada a
atividade fungicida, secretora de NO e de citocinas;
3) investigar o papel do TLR-4 na infecção pulmonar pelo P.brasiliensis.
Estudamos comparativamente o grau de infecção em camundongos deficientes e
normais (C3H/HeJ e C3H/HePas, respectivamente) quanto à expressão de TLR-4. Além
do grau de infecção determinado pela contagem do número de fungos viáveis nos
pulmões, baço e fígado, foram também caracterizadas a imunidade humoral e celular.
Foram também caracterizadas algumas citocinas pulmonares.
30
Material e Métodos
3.1) Experimentos in vitro:
3.1.1)Animais
Camundongos isogênicos machos da B10.A susceptíveis ao P. brasiliensis,
camundongos isogênicos da linhagem C3H/HeJ deficiente para TLR4 e camundongos
isogênicos da linhagem C3H/HePas (selvagem) foram utilizados quando atingiram entre
8 a 10 semanas de idade. Para induzir a presença de macrófagos, foram injetados 3 ml
de meio Tioglicolato Brewer (DIFCO) 72 horas antes da lavagem do peritônio.
3.1.2) Frações lipídicas
Foram utilizadas frações lipídicas isoladas de Pb 18 (virulento) do P.
brasiliensis. Os lipídeos totais (fosfolipídios e lipídios neutros) e outros lipoconjugados
(glicolipídios e proteínas GPI-ancoradas) foram extraídos utilizando um protocolo
previamente descrito para T. cruzi (Almeida et al., 2000). As frações foram gentilmente
preparadas e cedidas pelo Dr. Igor Almeida, anteriormente do Laboratório de
Glicobiologia de Parasitas, Departamento de Parasitologia do Instituto de Ciências
Biomédicas/USP, hoje na Universidade do Texas.
As frações foram extraídas a partir de fungos mantidos em repiques semanais em
meio Fava-Neto; após 7 dias de cultivo, 3 tubos de fungos foram lavados com PBS por
3 vezes, o extrato foi centrifugado e ressuspenso em 5 mL de PBS, o número de
leveduras foi acertado para 1 x 10
10
fungos por mL e retirados 5 mL desta suspensão.
O material foi novamente centrifugado, o sobrenadante desprezado e o sedimento
liofilizado. Do sedimento liofilizado foram extraídas as frações. Para a extração da
fração F1a, o sedimento inicial foi ressuspenso com 10 mL de clorofórmio-metanol na
31
Material e Métodos
proporção 2:1 (C:M; 2:1); o material foi agitado em Vórtex (VWR- Scientific) por 1
minuto e centrifugado por 15 minutos em 1000 g e o sobrenadante obtido representa a
fração F1a. O sedimento resultante foi ressuspenso em 10 mL de C:M; 1:1, agitado em
Vórtex por 1 minuto e centrifugado 15 minutos em 1000 g; o sobrenadante respresenta a
fração F1b. O sedimento resultante foi ressuspenso em 10 mL de clorofómio-metanol-
água (C:M:W; 1:2:0,8), agitado em Vórtex por 1 minuto e centrifugado por 15 minutos
a 1000 g; o sobrenadante obtido representa a fração F2. O sedimento resultante foi seco
sob pressão de N
2
a 45°C e adicionado 10 mL de 1-butanol a 9% (v/v); o material foi
agitado 4 por horas a temperatura ambiente e centrifugado por 15 minutos a 1000 g e o
sobrenadante obtido representa a fração F3. Os extratos F1a, F1b, F1c, F2 e F3 foram
filtrados em lã de vidro e secos no Rota-Vapor. As frações F1a, F1b, F1c e F2 foram
ressuspensas em 4mL da solução que as originou e estocadas em frascos tipo eppendorf
a -20ºC.
A fração F3 foi então fracionada em F3a e F3b. Para tanto, a fração F3 foi
ressuspensa numa solução contendo 5 mL de água e 5 mL de 1-butanol, a solução foi
agitada em Vórtex por 1 minuto e centrifugada por 20 minutos a 1000 g. O material foi
centrifugado e separado em duas fases: a fase superior é chamada de fase butanólica e a
fase inferior chamada de aquosa. Da fase aquosa foi preparada a fração F3a; para tanto,
a solução foi seca no Rota-Vapor e ressuspensa em 2 mL de água; a fase butanólica foi
lavada 2 vezes com igual volume de água, agitada em Vórtex por 1 minuto, centrifugada
por 20 minutos a 250 g e então separada em 2 fases: a fase inferior foi descartada e o
volume descardato foi substituído por butanol. A solução foi seca em Rota Vapor e
ressuspensa em 1 mL de 1-propanol 50%, dando origem então à fração F3b.
32
Material e Métodos
3.1.3) Fungo
Foi utilizado o isolado Pb 18 (virulento) do P. brasiliensis, (KASHINO et al.,
1985). O fungo foi mantido em meio sólido de Fava Netto (FAVA NETTO, 1955) a
36ºC, por repiques semanais. Suspensões celulares foram obtidas na fase exponencial de
crescimento leveduriforme, ou seja, após uma semana de cultivo, e lavadas três vezes
em solução salina estéril. A concentração de células fúngicas foi ajustada após
contagem em câmara hemocitométrica (Neubauer). A viabilidade da suspensão foi
avaliada utilizando o corante Trypan Blue, e a viabilidade foi sempre superior a 80 %.
3.1.4) Lavado peritoneal e contagem de células
Os animais previamente (72h) inoculados com meio tioglicolato foram
submetidos, em períodos determinados, a um processo de obtenção de lavado peritoneal
(LP). Para isto, os animais foram sacrificados por excesso do anestésico hidrato de
cloral seguido de deslocamento cervical, a pele abdominal rebatida, e exposta a
musculatura abdominal. O peritônio foi lavado com injeção de 5-6 mL de PBS estéril ou
meio de cultura não suplementado (DMEM-Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium). O
número total de células do LP foi determinado por contagem em câmara de Neubauer,
após a mistura de 90 µL do diluente Turk e 10 µL da suspensão celular. A viabilidade
da suspensão celular foi avaliada utilizando-se o corante Trypan Blue, e foi sempre
superior a 80 %.
As suspensões celulares foram mantidas em gelo para contagem diferencial de
33
Material e Métodos
células e então centrifugadas a 350 g, a 4ºC por 10 minutos e ressuspensas em 1,0 ml de
meio de cultura (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal bovino
A células foram ajustadas para 2x10
6/
mL
e utilizadas nos ensaios de atividade
fungicida, produção de citocinas e NO. Um volume de 500 µL (1x10
6
) de células foi
dispensado em cada poço de placas de cultivo de 24 poços. As culturas foram incubadas
a 37ºC em estufa contendo 5 % CO
2
-95% de ar por duas horas. As células não aderentes
foram removidas por aspiração e a monocamada foi lavada com o meio de cultura não
suplementado (DMEM). O número de células não aderentes foi determinado por
contagem em câmara hemocitométrica, sendo subtraído do número de células
peritoneais incubadas.
3.1.5) Tratamento das culturas de macrófagos por IFN-γ
γγ
γ
Monocamadas de macrófagos peritoneais de camundongos foram incubadas
durante a noite a 37ºC em estufa de CO
2
tendo sido tratados previamente com 500 µL
de meio de cultura suplementado contendo IFN-γ (20.000 pg/ml).
3.1.6) Tratamento das culturas de macrófagos por frações lipídicas de P.
brasiliensis
Em monocamadas de macrófagos tratadas e não tratadas com IFN-γ foram adicionadas
frações lipídicas. Inicialmente foram utilizadas duas diluições diferentes (1:100, 1:1000)
de cada uma das frações. As frações foram adicionadas diluídas em meio de cultura no
cultivo de macrófagos 24 horas antes da infecção com P. brasiliensis.
34
Material e Métodos
3.1.7) Infecção dos macrófagos
As leveduras do Pb foram suspensas em 2 mL de DMEM contendo 30%
(vol/vol) de soro fresco de camundongos (os mesmos camundongos usados para
obtenção do lavado peritoneal). Os macrófagos foram infectados com a suspensão de
leveduras, em uma relação levedura-macrófago de 1:50 (CANO et al., 1992 e 1994).
Foi realizado co-cultivo por 2 horas, as culturas foram lavadas e novamente incubadas
por 48 horas. Após o período de incubação, os sobrenadantes foram retirados, o NO foi
dosado imediatamente e o restante foi armazenado a – 70º C para determinar a presença
de citocinas.
3.1.8) Determinação de Unidades Formadoras de Colônias (UFC)
Após o co-cultivo de macrófagos e fungos a 37ºC em estufa contendo 5% CO
2
–
95% de ar e retirada dos sobrenadantes, as monocamadas foram tratadas por duas ou
três vezes com água destilada para lisar os macrófagos. A suspensão de cada lavagem
foi recolhida em tubos FALCON de 15 ml, um para cada poço da placa.
Este material foi centrifugado, ressuspenso em 1ml de DMEM e a suspensão
obtida plaqueada (100 µL/placa) em meio BHI-ágar com 5% de “fator de crescimento
do fungo” e 4% de soro eqüino, especial para recuperação de P. brasiliensis viáveis
(SINGER-VERMES et al., 1992). As placas foram incubadas a 36º C e as colônias
contadas diariamente até que nenhum aumento em UFC fosse observado.
35
Material e Métodos
3.1.9) Dosagem de NO
A concentração de óxido nítrico nos sobrenadantes das culturas de macrófagos
foi medida com o reagente de Griess (1% sulfanilamida, 0,1% diidrocloreto de
naftiletilenodiamina, 2,5% H
3
PO
4
), sendo utilizado um volume de 50 µL do
sobrenadante da cultura e igual volume do reagente de Griess. Foram incubados em
temperatura ambiente por 15 minutos e então determinada a absorbância em
equipamento Labsystems Multiskan MCC/340 (leitor). A concentração de óxido nítrico
foi determinada utilizando-se curva padrão padronizada com diferentes concentrações
de nitrito de sódio (DING et al.,1988 ).
3.2) Experimentos in vivo:
3.2.1) Animais
Foram utilizados camundongos isogênicos da linhagem C3H/HeJ (deficiente
para TLR-4) e camundongos isogênicos da linhagem C3H/HePas (TLR-4 normal)
quando atingiram entre 8 e 12 semanas de idade. Os animais foram criados em
condições livres de (SPF) no Biotério de camundongos Isogênicos do Departamento de
Imunologia do ICB-USP e manuseados de acordo com as normas do comitê de ética do
mesmo departmento.
3.2.2) Infecção intra-traqueal (i.t.)
Os animais foram infectados por injeção intratraqueal de 1x10
6
leveduras viáveis
de P. brasiliensis contidas em 50µl de PBS. O procedimento foi realizado com os
36
Material e Métodos
animais sob anestesia. Primeiro foi administrado 10ml/Kg de peso de solução de
cloridrato de 2-(2,6-xilidino) 5,6 dihidro – 4 H – 1,3-tiazina (ROMPUN, Bayer do
Brasil) a 0,4% pela via i.p. (0,2 ml de ROMPUN). Após 10 minutos , administração de
10ml/Kg de peso de hidrato de cloral (Reagen do Brasil) a 2,5% pela via i.p. ( 0,2 ml de
Hidrato de cloral).
Quando o animal estava insensível à dor (após 10 minutos), foi feita uma
pequena incisão longitudinal na pele do pescoço e a traquéia exposta. O fungo foi
administrado em um volume total de 50µl. Após a inoculação, a incisão foi suturada e
os animais colocados sob uma fonte moderada de calor para controlar a hipotermia
transitória produzida pela anestesia, até acordarem (CANO et al., 1995).
3.2.3) Avaliação do grau de infecção através da determinação de UFC.
O grau da infecção foi avaliado em todos os animais através da recuperação de
fungos viáveis do pulmão, fígado e baço, após 48h, 96h e 11 semanas após a infecção,
usando meio BHI suplementado da mesma forma que o experimento in vitro.
3.2.4) Avaliação do tempo de sobrevida
Grupos de 8-12 animais foram infectados com P. brasiliensis via intra-traqueal e
foram acompanhados quanto ao tempo de sobrevida.
37
Material e Métodos
3.2.5) Determinação do nível de anticorpos específicos
Para determinar a resposta imune humoral dos animais infectados intra-
traquealmente com leveduras viáveis de P. brasiliensis, amostras de sangue foram
obtidas dos diversos camundongos. Os anticorpos totais específicos anti-P. brasiliensis
e seus isótipos IgM, IgA, IgG1, IgG2a, IgG2b e IgG3 foram detectados pelo método
imunoenzimático (ELISA) previamente preconizado para este sistema antígeno-
anticorpo por Mendes-Giannini et al. (1984) e modificado por Vaz et al. (1998).
3.2.5.1) Antígeno
Foi utilizado o exoantígeno ou CFA (Cell-Free-Antigen) descrito por Camargo
et al. (1991), constituído da mistura de antígenos individuais obtidos de 6 isolados
distintos do P. brasiliensis (Pb 339, Pb 265, Pb 18 REI, Pb 18 BIREI e Pb18 TRIREI).
Para a obtenção do antígeno, as células foram lavadas em tampão fosfato 0,1 M, pH 7,2.
3.2.5.2) Anti-soros
Foram utilizados anti-soros contra imunoglobulinas murinas produzidos em
cabra não marcadas (anti-Ig total, anti-IgM, anti-IgA, anti-IgG1, anti-IgG2a, anti-
IgG2b, anti-IgG3) e anti-IgG de cabra marcada com peroxidade (Shouthern
Biotecnologies).
Cada anti-soro foi utilizado de acordo com titulação previamente estabelecida
por padronização feita em nosso laboratório.
38
Material e Métodos
3.2.5.3) Ensaio imunoenzimático
O ensaio consiste na sensibilização de microplacas de 96 poços de fundo chato
(COSTAR) com 100µL do antígeno CFA diluído em tampão carbonato-bicarbonato
(TCB) 0,1 M pH 9,5 por poço para uma concentração de 39,3 µg/mL de proteína (3,93
µg/poço). As placas foram incubadas por uma hora à 37
o
C e mantidas overnight à 4
o
C.
Após a incubação foram feitas 5 lavagens com 200µL/poço com uma solução de
PBS contendo Tween 20 a 0,05%, processo este repetido a cada etapa. Os sítios livres
foram bloqueados com 200µL de gelatina a 0,5% em TCB e as placas foram novamente
incubadas à 37
o
C/1hora. Os controles positivos e negativos e as amostras foram
adicionados à placa em diluições iniciais de 1/40 em PBS/T20 e diluídas
seqüencialmente na base 2 em volume de 100µL e incubadas por 1 hora à 37
o
C.
Após a lavagem das placas foram adicionados os anti-soros marcados em
diluições adequadas determinadas por titulações prévias e novamente as placas foram
mantidas sob incubação por 1hora à 37
o
C. Após nova lavagem o anti-soro conjugado a
peroxidade foi adicionado à placa e incubado. A reação com o substrato foi realizada
com a adição de 25ml de tampão citrato de sódio a 0,1M, pH 5,0 na presença de OPD
(10mg de ortofenilenodiamina) e 10µL de H
2
0
2
a 30% em temperatura ambiente e ao
abrigo da luz por 15 minutos.
A reação enzimática foi interrompida pela adição de 50µL ácido sulfúrico 4,0 N.
A leitura das placas feita em leitor automático no comprimento de onda de 490nm. O
cut-off da reação foi determinado em cada placa, pela média das densidades ópticas
obtidas para um pool de soros controles negativos dosados em quadruplicata. As DO de
cada diluição dos soros experimentais foram comparadas frente ao respectivo cut-off,
39
Material e Métodos
determinando assim que o título de cada amostra for expresso como a recíproca da
maior diluição do soro experimental apresentando DO superior à leitura do soro
negativo.
3.2.6) Dosagem de NO
A concentração de nitritos nos homogenatos dos pulmões foi utilizada como
indicador de síntese de NO através do reativo de Griess, seguindo a mesma técnica
descrita para o experimento in vitro.
3.3) Caracterização das citocinas e quimiocinas: ELISA para quantificação de IL-
2, IFN-γ
γγ
γ, IL-12, TNF-α
αα
α, IL-10, IL-4, IL-5, MCP-1 e GM-CSF.
Foram obtidos sobrenadantes nas diversas condições experimentais e a presença
de citocinas analisadas por ELISA de captura utilizando-se pares de AcM para cada
citocina murina (Pharmingen). As concentrações previamente determinadas para cada
um dos AcM primário e secundário no ELISA, contra cada citocina, estão demonstradas
na tabela abaixo.
40
Material e Métodos
Citocina AcM de captura AcM de detecção biotinilado
IFN-γ R4-6A2 (4 µg/mL) XMG-31G6 (1µg/mL)
GM-CSF
MP1-22E9 (6 µg/mL) MPI-31G6 (3µg/mL)
TNF-α G281-2626 (8 µg/mL) MP6-XT3 (2µg/mL)
IL-10
JESS-2A5 (4 µg/mL) SXC-1 (2µg/mL)
IL-12
C 15.6 (6 µg/mL) C 17,8 (4µg/mL)
MCP-1
2H5 (9 µg/mL) 4E2-MCP (1µg/mL)
IL-4
JESS-2A5 (4 µg/mL) SXC-1 (2µg/mL)
IL-5
C 15.6 (4 µg/mL) C 17,8 (2µg/mL)
IL-2
2H5 (4 µg/mL) 4E2-MCP (2µg/mL)
As condições ótimas para o ELISA, comuns a todas as interleucinas e
previamente testadas em nosso laboratório, estão descritas a seguir:
a) Sensibilizar as placas (fundo chato, Difco) com 50µL/poço do AcM primário
na concentração determinada, diluído em solução de bicarbonato de sódio
0,1 M, pH 5,0. As placas foram incubadas por 24 horas a 4 ºC.
b) Bloqueio dos sítios livres com 200µL/poço de gelatina (Difco) a 1% (m/v)
em PBS, pH 7,0, por duas horas à temperatura ambiente.
c) Adição da citocina recombinate (Pharmingen) seguindo uma diluição seriada
em meio DMEM com 10% de SFB v/v para obtenção de uma curva-padrão,
e adição das amostras, em triplicata, nos demais poços.
41
Material e Métodos
d) Adição 50µL/poço do AmC secundário biotilinilado na concentração
desejada, diluído em meio PBS com 10% de SFB e incubação da placa por
45 minutos a temperatura ambiente.
e) Incubação com o complexo estreptoavidina-biotina-peroxidase (Vectastain
ABC Elite, Vector Lab.) diluído em tampão PBS (pH 7,5) e 0,1% de Tween
20 vol/vol (Sigma).
Cada um das etapas acima mencionado foram intercaladas por cinco lavagens
dos poços com tampão PBS (pH 7,0) e Tween 20 a 0,05% vol/vol.
f) Acrescentar o substrato (50µL/poço) constituído de 5 mL de H
2
O
2
a 30%
(Merck) diluídos em solução composta por 2,8 mL de tampão fosfato de
sódio 0,2 M, 2,2 mL de ácido cítrico 0,1 M (pH 5,0) e 10 mL de H
2
O,
adicionado de 10 mg de ortofenilenodimina (OPD) (Merck). Incubar a placa
por 45 minutos a temperatura ambiente e protegida da luz.
g) A reação enzimática foi parada pela adição de ácido sulfúrico 4 N
(50µL/poço).
h) Realizar a leitura das densidades ópticas em leitor automático (VERSAmax
– Molecular Devices Corporation) em comprimento de onda de 492 nm.
As concentrações de cada citocina foram determinadas tendo como base a reta
de regressão linear feita para a curva-padrão obtida com o padrão adequado de citocina
recombinante (Pharmingen).
42
Material e Métodos
3.4) Análise Estatística
Os números de UFC/g de tecido foram transformados em unidades
logarítmicas (log10) antes da análise estatística e expressos em média ± erro padrão. Os
resultados (in vivo e in vitro) com animais das diferentes linhagens foram analisados
pelo test T de Student, método não pareado.
Os resultados da dosagem de anticorpo por ELISA também foram transformados
em unidades logarítmicas na base 2 e expressos como média ± erro padrão.
Os dados referentes às citocinas (pg/mL) foram apresentados como média ± erro
padrão.
O tempo de sobrevida dos animais foi analisado pelo Teste de Long-rank..
Os testes foram realizados utilizando o Software Prisma Versão 3.1.
Os resultados de P<0,05 (*), P<0,01 (**) e P<0,001(***) foram considerados
significativos.
43
Resultados
4.1)
Experimento com as frações lipídicas de P. brasiliensis.
Algumas culturas de macrforam desafiadas com as diferentes frações
lipídicas de P. brasiliensis que contém:
o F1a, F1b e F1c: fosfolipídios e lipídios neutros;
o F2: glicolipídios de cadeia curta;
o F3a: glicoproteínas que se ancoram à membrana plasmática por
agrupamentos glicosilfosfatidilinositol (GPI);
o F3b: glicolipídios de cadeia longa.
Os resultados a seguir, com os dados de UFC, citocinas e NO produzidos
pelo co-cultivo, serão apresentados de acordo com cada fração lipídica, devido à
heterogeneidade dos dados obtidos com cada fração. É importante ressaltar que as
frações F1a, F1b e F1c possuem os mesmo componentes lipídicos, foram, apenas,
preparadas com 3 diferentes soluções. Contudo, nos experimentos iniciais observamos
que as 3 frações desta família produziam fenômenos idênticos, por isso, nos
experimentos posteriores, focamos apenas na fração F1a.
Serão apresentados os resultados com as frações lipidicas diluídas a 1/100;
diluições maiores (1/1000) não foram capazes de provocar fenômenos como a síntese de
NO, citocinos, assim como, não foram capazes de alterar a atividade fungicida dos
macrófagos.
Os resultados dos experimentos com as Frações Lipídicas estão resumidos
em tabelas nos anexos.
44
Resultados Fosfolipídios e lipídios neutros
4.1.1) F1a: fosfolipídios e lipídios neutros.
4.1.1.1) Avaliação da atividade fungicida de macrófagos peritoneais através de
Unidades Formadoras de Colônia (UFC).
A figura 1 representa o número de fungos viáveis recuperados após lise dos
macrófagos tratados com a fração lipídica F1a do P. brasiliensis diluída a 1/100.
Algumas culturas foram tratadas com IFN-γ (20.000 pg/mL). Após 24h de cultivo as
monocamadas foram infectadas com o fungo na proporção 1 fungo para 50 macrófagos.
Nesta figura percebe-se que ao tratar os macrófagos com a fração F1a houve um
aumento do número de fungos recuperados em comparação ao grupo de macrófagos não
tratados com a fração. Contudo, após ativação com IFN-γ o mesmo fenômeno não
ocorreu.
4.1.1.2) Ensaio de fagocitose.
Os macrófagos peritoneais de animais B10.A, cultivados sobre lamínulas
redondas em placa de cultura de 24 poços, foram tratados com a fração lipídica F1a
1/100 e após 24 horas infectados com leveduras viáveis do fungo (relação Pb/Mo de
1/50). Após 4 horas de incubação a 37ºC em estufa a 5% de CO
2
o sobrenadante foi
removido e as lamínulas foram coradas e examinadas ao microscópio óptico comum.
Uma média de 1000 macrófagos foi contada em cada lamínula para determinar o
número de fungos aderidos e/ou ingeridos após as 4 horas de incubação.
Os resultados expressos na figura 02 mostram que macrófagos de animais B10.A
que foram tratados com a fração F1a têm a mesma capacidade de aderir e/ou ingerir as
45
Resultados Fosfolipídios e lipídios neutros
leveduras do P. brasiliensis comparando-se com os macrófagos de animais B10.A que
não foram tratados com a fração. O fenômeno foi confirmado quando as culturas foram
pré-tratadas com IFN-γ (20.000 pg/mL).
46
Resultados Fosfolipídios e lipídios neutros
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
*
F1a
UFC/mL
Mo + + + +
P. b. + + + +
F1a - + - +
IFN-γ - - + +
Figura 01. Avaliação da atividade fungicida de macrófagos peritoneais através da recuperação de
Unidades Formadoras de Colônia (UFC)/mL após 48h de co-cultivo. Algumas monocamadas foram
previamente tratadas com IFN-γ (20.000 pg/mL) e com a fração F1a (1/100) por 24h e infectadas
com o P. brasiliensis. As barras representam as médias ±
±±
± EP de 4 poços por grupo ensaiado. O
asterisco representa diferença estatisticamente significante entre os grupos ligados pela barra
(*P<0,05).
47
Resultados Fosfolipídios e lipídios neutros
0.0
2.5
5.0
7.5
10.0
12.5
F1a
*
Macrófagos contendo
Pb
Mo + + + +
P. b. + + + +
F1a - + - +
IFN-γ - - + +
Figura 02: Atividade fagocítica de macrófagos tratados com a fração F1a. Foram feitas culturas de
macrófagos peritoneais de animais B10.A (1x10
6
células/poço) sobre lamínulas em placas de 24
poços. Algumas monocamadas foram previamente tratadas com IFN-γ (20.000 pg/mL) e com a
fração F1a (1/100) por 24h e infectadas com o P. brasiliensis. Após 4 horas de incubação o
sobrenadante do cultivo foi desprezado e as lamínulas foram coradas e examinadas em microscópio
óptico. Uma média de 1000 Mo foi contada e analisado o número de Mo com leveduras aderidas
e/ou ingeridas.
As barras representam as médias ±
±±
± EP de 5 poços por grupo ensaiado.
48
Resultados Fosfolipídios e lipídios neutros
4.1.1.3) Dosagem de NO.
A dosagem de NO foi feita antes e depois da adição do P. brasiliensis aos
macrófagos. A produção de NO antes da adição do fungo visava saber se as frações por
si mesmas poderiam funcionar como segundo sinal desencadeador da síntese de NO
(primeiro:IFN-γ).
A figura 03 mostra que a síntese de NO foi maior nas culturas que
receberam a fração lipídica F1a (1/100) e IFN-γ, comparando-se com o tratamento que
recebeu apenas IFN-γ. No grupo onde havia somente macrófagos e F1a não houve
produção detectável de NO. Quando houve adição de P. brasiliensis às culturas a
produção de NO foi maior, contudo, foi mais elevada nos grupos tratados com a fração
F1a + IFN-γ comparando-se ao grupo tratado apenas com IFN-γ. Este resultado nos
indica que lipídios neutros e fosfolipídios podem potencializar a síntese de NO por
macrófagos pré-ativados com IFN-γ.
49
Resultados Fosfolipídios e lipídios neutros
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
F1a
*
***
Nitrito (
µ
µ
µ
µ
M)
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - - + + +
F1a - - + + - - + +
IFN-γ - + - + - + - +
Figura 03. Quantificação de NO no sobrenadante de cultura de macrófagos peritoneais de animais
B10.A. Macrófagos foram cultivados com IFN-γ (20.000 pg./mL) e algumas monocamadas de
macrófagos receberam a fração lipídica F1a (1/100). Após uma noite de incubação a cultura foi
infectado por P. brasiliensis, após 48h a produção de NO foi avaliada no sobrenadante do cultivo.
O grupo controle de macrófagos foi mantido sem tratamento. Os dados representam a média ±
±±
± EP
de 4 poços por grupo. O asterisco representa diferença estatisticamente significante (***P<0,001 e *
P<0,05).
50
Resultados Fosfolipídios e lipídios neutros
4.1.1.4) Dosagem de citocinas.
As culturas de macrófagos tratadas ou não com IFN-γ receberam a fração
lipídica F1a (1/100). Após 48 horas de cultivo o sobrenadante foi retirado e dosadas
algumas citocinas como: IL-12, IL-10, o fator de crescimento GM-CSF e a quimiocina
MCP-1.
Como representado na figura 04, após 48 horas de cultivo observamos que
houve uma menor produção de IL-10 nos grupos tratados somente com IFN-γ, somente
com a fração F1a ou com ambas. Porém, a produção foi menor nos grupos tratados
somente com a fração comparando-se com o grupo tratado somente com IFN-γ. Nos
grupos onde houve a infecção pelo P. brasiliensis o efeitor inibidor da síntese de IL-10
foi mais uma vez evidenciado; isso ocorreu nas culturas tratadas somente com IFN-γ,
somente com a fração ou com ambos. Contudo, quando os macrófagos são tratados
somente com a fração F1a a produção desta citocina foi menor comparando-se com
qualquer outro tratamento. O mesmo potencial inibidor da síntese de citocinas pela
fração F1a foi repetido na produção de IL-12. Mais uma vez temos o IFN-γ e fração F1a
inibindo a produção da citocina , porém a inibição é mais acentuada na cultura que
recebeu apenas a fração. O mesmo fenômeno repetiu-se quando as culturas foram
infectadas com P. brasiliensis.
51
Resultados Fosfolipídios e lipídios neutros
IL -1 0 F 1 a
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
5 0 0
6 0 0
7 0 0
8 0 0
9 0 0
* *
* * *
* * *
*
*** **
* *
* *
* *
pg/mL
Figura 04. Quantificação de IL-10 e IL-12 no sobrenadante de cultura de macrófagos peritoneais de
animais B10.A. Macrófagos foram cultivados com IFN-γ (20.000 pg./mL) e algumas monocamadas
receberam a fração lipídica F1a (1/100) e após 24h infectadas com P. brasiliensis . Após 48 horas de
incubação a produção desta citocina foi avaliada no sobrenadante do cultivo. O grupo controle de
macrófagos foi mantido sem tratamento. Os dados representam a média ±
±±
± EP de 4 poços por grupo.
O asterisco representa diferença estatisticamente significante (***P<0,001, **P<0,01 e *P<0,05).
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - + + + +
F1a - + - + - + - +
IFN-γ - - + + - - + +
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - + + + +
F1a - + - + - + - +
IFN-γ - - + + - - + +
IL -1 2 F 1 a
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
3 0 0
3 5 0
** *
**
*
***
**
*
pg/mL
52
Resultados Fosfolipídios e lipídios neutros
Além de IL-12 e IL-10 a fração F1a apresentou potencial inibidor da produção
da quimiocina MCP-1 e do fator de crescimento celular GM-CSF. Na figura 05
observamos o potencial inibidor tanto do IFN-γ quanto da fração F1a sobre a produção
de MCP-1; o fenômeno repetiu-se quando o fungo foi adicionado à cultura, porém,
curiosamente, o efeito inibidor foi potencializado quando as culturas foram pré-tratadas
com IFN-γ e F1a simultaneamente. Quanto à produção de GM-CSF o efeito inibidor
exercido pela fração F1a fica bastante evidenciado, uma vez que somente nos
tratamentos que receberam esta fração houve diminuição da produção, ou seja, nas
culturas tratadas somente com IFN-γ não houve diferenças na produção deste fator em
relação ao grupo controle. A figura 05 ilustra este fenômeno, assim como também
representa a inibição da produção de GM-CSF pelos macrófagos tratados com a fração
F1a e infectados pelo P. brasiliensis.
53
Resultados Fosfolipídios e lipídios neutros
MC P -1 F 1a
0
2 5 0
5 0 0
7 5 0
1 0 0 0
1 2 5 0
***
*
*
**
**
pg/mL
Figura 05. Quantificação de MCP-1 e GM-CSF no sobrenadante de cultura de macrófagos
peritoneais de animais B10.A. Macrófagos foram cultivados com IFN-γ (20.000 pg./mL) e algumas
monocamadas s receberam a fração lipídica F1a (1/100) e após 24h infectadas com P. brasiliensis .
Após 48 horas de incubação a produção desta quimiocina foi avaliada no sobrenadante do cultivo.
O grupo controle de macrófagos foi mantido sem tratamento. Os dados representam a média ±
±±
± EP
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - + + + +
F1a - + - + - + - +
IFN-γ - - + + - - + +
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - + + + +
F1a - + - + - + - +
IFN-γ - - + + - - + +
G M -C S F F 1 a
0
5 0 0
1 0 0 0
***
*
***
***
***
**
**
**
pg/mL
54
de 4 poços por grupo. O asterisco representa diferença estatisticamente significante (***P<0,001,
**P<0,01 e *P<0,05).
Resultados Glicolipídios de cadeia curta
4.1.2) F2: glicolipídios de cadeia curta.
4.1.2.1) Avaliação da atividade fungicida de macrófagos peritoneais através de
Unidades Formadoras de Colônia (UFC).
A figura 06 representa o número de fungos viáveis recuperados após lise dos
macrófagos tratados com a fração lipídica F2 de P. brasiliensis diluída a 1/100.
Algumas camadas foram tratadas com IFN-γ (20.000 pg/mL). Após 24h de cultivo as
monocamadas foram infectadas com o fungo na proporção 1 fungo para 50 macrófagos.
Nesta figura percebe-se que ao tratar os macrófagos com a fração F2 houve um aumento
do número de fungos recuperados em comparação ao grupo de macrófagos não tratados
com a fração. Contudo, ao ser ativado com IFN-γ o mesmo fenômeno não ocorreu.
4.1.2.2) Ensaio de fagocitose.
Os resultados expressos na figura 07 mostram que macrófagos de animais
B10.A que foram tratados com a fração F2 têm a mesma capacidade de aderir e/ou
ingerir as leveduras do P. brasiliensis comparando-se com os macrófagos de animais
B10.a que não foram tratados com a fração. O fenômeno foi confirmado quando as
culturas foram pré-tratadas com IFN-γ (20.000 pg/mL).
55
Resultados Glicolipídios de cadeia curta
F2
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
7000
8000
*
UFC/mL
Mo + + + +
P. b. + + + +
F2 + - - +
IFN-γ
- + - +
Figura 06. Avaliação da atividade fungicida de macrófagos peritoneais através da recuperação de
Unidades Formadoras de Colônia (UFC) /mL após 48h de co-cultivo. Algumas monocamadas
foram previamente tratadas com IFN-γ (20.000 pg/mL) e com a fração F2 diluída a 1/100 por 24h e
infectadas com o P. brasiliensis. As barras representam as médias ±
±±
± EP de 4 poços por grupo
ensaiado. O asterisco representa diferença estatisticamente significante entre os grupos ligados pela
barra (*P<0,05).
56
Resultados Glicolipídios de cadeia curta
F2
0
10
20
Macrófagos contendo
Pb
*
Mo + + + +
P. b. + + + +
F2 - + - +
IFN-γ - - + +
Figura 07: Atividade fagocítica de macrófagos tratados com a fração F2. Foram feitas culturas de
macrófagos peritoneais de animais B10.A (1x10
6
células/poço) sobre lamínulas em placas de 24
poços. Algumas monocamadas foram previamente tratadas com IFN-γ (20.000 pg/mL) e com a
fração F2 (1/100) por 24h e infectadas com o P. brasiliensis. Após 4 horas de incubação o
sobrenadante do cultivo foi desprezado e as lamínulas foram coradas e examinadas em microscópio
óptico. Uma média de 1000 Mo foi contada e analisado o número de Mo com leveduras aderidas
e/ou ingeridas.
As barras representam as médias ±
±±
± EP de 5 poços por grupo ensaiado. (*P<0,05).
Resultados Glicolipídios de cadeia curta
57
4.1.2.3) Dosagem de NO.
A figura 08 mostra que a síntese de NO foi maior nos tratamentos que
receberam a fração lipídica F2 (1/100) e IFN-γ, comparando-se com o tratamento que
recebeu apenas IFN-γ. No grupo onde havia somente macrófagos ou somente
macrófagos e F2 não houve produção de NO detectável. Quando houve adição de P.
brasiliensis à cultura a produção de NO foi maior, ocorrendo aqui o mesmo fenômeno
desencadeado pela fração F1a, ou seja, a produção do gás foi mais elevada nos grupos
tratados com a fração F1a + IFN-γ comparando-se ao grupo tratado apenas com IFN-γ.
Este resultado nos indica que glicolipídios de cadeia curta, assim como os fosfolipídios
e lipídios neutros podem potencializar a síntese de NO por macrófagos pré-ativados
com IFN-γ.
4.1.2.4) Dosagem de citocinas:
As colônias de macrófagos tratadas ou não com IFN-γ receberem a fração
lipídica F2 (1/100). Após 48 horas de cultivo o sobrenadante foi retirado e dosadas
algumas citocinas como: IL-12, IL-10, o fator de crescimento GM-CSF e a quimiocina
MCP-1.
A produção de IL-10 por macrófagos tratados com a fração F2 apresentou-se de
forma semelhante à produção desta citocinas por macrófagos tratados com a fração F1a,
ou seja, após 48 horas de cultivo observamos, conforme ilustra a figura 09, houve uma
menor produção de IL-10 nos grupos tratados somente com IFN-γ ou somente com a
fração F1a.
58
Resultados Glicolipídios de cadeia curta
0
10
20
30
40
50
60
F2
**
***
Nitrito (
µ
µ
µ
µ
M)
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - - + + +
F2 - - + + - - + +
IFN-γ - + - + - + - +
Figura 08. Quantificação de NO no sobrenadante de cultura de macrófagos peritoneais de animais
B10.A. Macrófagos foram cultivados com IFN-γ (20.000 pg./mL) e algumas monocamadas de
macrófagos receberam a fração lipídica F2 (1/100). Após uma noite de incubação a cultura foi infectado
por P. brasiliensis, após 48h a produção de NO foi avaliada no sobrenadante do cultivo. O grupo
controle de macrófagos foi mantido sem tratamento. Os dados representam a média ±
±±
± EP de 4 poços por
grupo. O asterisco representa diferença estatisticamente significante (***P<0,001 e ** P<0,01).
59
Resultados Glicolipídios de cadeia curta
Da mesma forma, a produção foi menor nos grupos tratados somente com a fração
comparando-se com o grupo tratado somente com IFN-γ. Nos grupos onde houve a
infecção pelo P. brasiliensis o efeitor inibidor da síntese de IL-10 é mais uma vez
evidenciado; isso ocorreu nas culturas tratadas somente com IFN-γ, somente com a
fração ou com ambos. Contudo, neste caso a produção de IL-10 é consideravelmente
menor nas culturas tratadas com o IFN-γ e a fração F2.
Surpreendentemente, o mesmo fenômeno provocado pela fração F2 na síntese
de IL-10 não é repetido na síntese de IL-12, como havia ocorrido com a fração F1a.
Aqui, como está representada na figura 09, a produção desta citocina manteve-se em
concentrações semelhantes em todos os tratamentos.
Em relação à MCP-1 observamos que a produção desta quimiocina foi maior
pelos macrófagos tratados com a fração F2. Temos aqui, pela primeira vez, um
composto lipídico estimulando a produção de um produto celular e não inibindo-o,
como mostrado na figura 10. Curiosamente, ao adicionar o P. brasiliensis à cultura, a
produção de MCP-1 eleva-se, porém foi consideravelmente maior nos grupos que foram
tratados com a fração F2. Contudo, nos grupos onde houve a pré-ativação com IFN-γ e
nos grupos que além do IFN-γ houve adição da fração, a produção de MCP-1 foi menor,
indicando neste caso um forte potencial da inibição síntese de MCP-1 exercida pelo
IFN-γ.
60
Resultados Glicolipídios de cadeia curta
IL-10 F2
0
5 00
1 00 0
***
**
**
*
*
*
*
**
***
***
pg/mL
IL-1 2 F 2
0
5 0
1 0 0
1 5 0
2 0 0
2 5 0
3 0 0
3 5 0
4 0 0
4 5 0
pg/mL
Figura 09. Quantificação de IL-10 e IL-12 no sobrenadante de cultura de macrófagos peritoneais de
animais B10.A. Macrófagos foram cultivados com IFN-γ (20.000 pg./mL) e algumas monocamadas
s receberam a fração lipídica F2 (1/100) e após 24h infectadas com P. brasiliensis . Após 48 horas de
incubação a produção desta citocina foi avaliada no sobrenadante do cultivo. O grupo controle de
macrófagos foi mantido sem tratamento. Os dados representam a média ±
±±
± EP de 4 poços por grupo.
O asterisco representa diferença estatisticamente significante (***P<0,001, **P<0,01 e *P<0,05).
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - + + + +
F2 - + - + - + - +
IFN-γ - - + + - - + +
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - + + + +
F2 - + - + - + - +
IFN-γ - - + + - - + +
61
Resultados Glicolipídios de cadeia curta
Quanto à produção de GM-CSF o efeito inibidor exercido pela fração F2 ficou
bastante evidenciado, uma vez que, somente nos tratamentos que receberam esta fração
houve diminuição da produção, ou seja, nas culturas tratadas somente com IFN-γ não
houve diferença na produção deste fator em relação ao grupo controle. A figura também
representa a inibição da produção de GM-CSF pelos macrófagos tratados com a fração
F2 e infectados pelo P. brasiliensis. Neste caso houve inibição, porém não foi
estatisticamente significante nos tratamentos simples; somente nas culturas pré-ativadas
com IFN-γ e tratadas com a fração F2 é que a produção de GM-CSF foi
significativamente menor comparando-se ao grupo não tratado e apenas infectado pelo
fungo.
62
M C P -1 F 2
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
2 5 0 0
3 0 0 0
3 5 0 0
4 0 0 0
4 5 0 0
5 0 0 0
*
*
**
**
**
**
pg/mL
Figura 10. Quantificação de MCP-1 e GM-CSF no sobrenadante de cultura de macrófagos
peritoneais de animais B10.A. Macrófagos foram cultivados com IFN-γ (20.000 pg./mL) e algumas
monocamadas s receberam a fração lipídica F2 (1/100) e após 24h infectadas com P. brasiliensis .
Após 48 horas de incubação a produção desta quimiocina foi avaliada no sobrenadante do cultivo.
O grupo controle de macrófagos foi mantido sem tratamento. Os dados representam a média ±
±±
± EP
de 4 poços por grupo. O asterisco representa diferença estatisticamente significante (***P<0,01 e
**P<0,05).
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - + + + +
F2 - + - + - + - +
IFN-γ - - + + - - + +
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - + + + +
F2 - + - + - + - +
IFN-γ - - + + - - + +
G M -C S F F 2
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
** *
** *
*
***
***
pg/mL
63
Glicoproteínas que se ancoram à membrana plasmática por agrupamentos
Resultados
glicosilfosfatidilinositol (GPI)
4.1.3) F3a: glicoproteínas que se ancoram à membrana plasmática por
agrupamentos glicosilfosfatidilinositol (GPI).
4.1.3.1) Avaliação da atividade fungicida de macrófagos peritoneais através de
Unidades Formadoras de Colônia (UFC).
A figura 11 representa o número de fungos viáveis recuperados após a lise dos
macrófagos tratados com a fração lipídica F3a de P. brasiliensis diluída a 1/100.
Algumas culturas das foram tratadas com IFN-γ (20.000 pg/mL). Aqui observamos um
menor número de fungos recuperados nos tratamentos que receberam a fração F3a.
Contudo, nos tratamento onde os macrófagos foram pré-ativados com IFN-γ o mesmo
fenômeno não ocorreu.
4.1.3.2) Ensaio de fagocitose.
Os resultados expressos na figura 12 mostram que macrófagos de animais B10.A
que foram tratados com a fração F3a têm uma menor capacidade de aderir e/ou ingerir
as leveduras do P. brasiliensis comparando-se com os macrófagos de animais B10.a que
não foram tratados com a fração. Contudo, o mesmo fenômeno não se repetiu quando as
culturas foram pré-tratadas com IFN-γ (20.000 pg/mL).
64
Glicoproteínas que se ancoram à membrana plasmática por agrupamentos
Resultados
glicosilfosfatidilinositol (GPI)
F3a
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
**
UFC/mL
F
igura 11. Avaliação da atividade fungicida de macrófagos peritoneais através da recuperação de
Unidades Formadoras de Colônia (UFC) /mL após 48h de co-cultivo. Algumas monocamadas
foram previamente tratadas com IFN-γ (20.000 pg/mL) e com a fração F3a diluída a 1/100 por 24h
e infectadas com o P. brasiliensis. As barras representam as médias ±
±±
± EP de 4 poços por grupo
ensaiado. O asterisco representa diferença estatisticamente significante entre os grupos ligados pela
barra (**P<0,01).
Mo + + + +
P. b. + + + +
F3a - + - +
IFN-γ - - + +
65
Glicoproteínas que se ancoram à membrana plasmática por agrupamentos
Resultados
glicosilfosfatidilinositol (GPI)
Mo + + + +
P. b. + + + +
F3a - + - +
IFN-γ
- - + +
Figura 12: Atividade fagocítica de macrófagos tratados com a fração F3a. Foram feitas culturas de
macrófagos peritoneais de animais B10.A (1x10
6
células/poço) sobre lamínulas em placas de 24
poços. Algumas monocamadas foram previamente tratadas com IFN-γ (20.000 pg/mL) e com a
fração F3a (1/100) por 24h e infectadas com o P. brasiliensis. Após 4 horas de incubação o
sobrenadante do cultivo foi desprezado e as lamínulas foram coradas e examinadas em microscópio
óptico. Uma média de 1000 Mo foi contada e analisado o número de Mo com leveduras aderidas
e/ou ingeridas.
As barras representam as médias ±
±±
± EP de 5 poços por grupo ensaiado. (*P<0,05).
F3a
0
10
20
*
Macrófagos contendo
Pb
66
Glicoproteínas que se ancoram à membrana plasmática por agrupamentos
Resultados
glicosilfosfatidilinositol (GPI)
4.1.3.3) Dosagem de NO.
A figura 13 mostra que a síntese de NO foi maior nos tratamentos que receberam
a fração lipídica F3a (1/100) e IFN-γ, comparando-se com o tratamento que recebeu
apenas o IFN-γ. No grupo onde havia somente macrófagos ou somente macrófagos e
F3a não houve produção de NO detectável. Quando houve adição de P. brasiliensis à
cultura, a produção de NO foi maior comparando-se ao grupo não infectado, entretanto,
a produção de NO foi ainda maior nos grupos que tratados com a fração F3a e IFN-γ
comparando-se com o grupo que recebeu apenas o IFN-γ. Este resultado nos indica que
glicoproteínas que se ancoram à membrana plasmática por agrupamentos
glicosilfosfatidilinositol podem potencializar a síntese de NO por macrófagos pré-
ativados com IFN-γ.
67
Glicoproteínas que se ancoram à membrana plasmática por agrupamentos
Resultados
glicosilfosfatidilinositol (GPI)
0
10
20
30
40
50
F 3 a
**
***
Nitrito (
µ
µ
µ
µ
M)
Figura 13. Quantificação de NO no sobrenadante de cultura de macrófagos peritoneais de animais
B10.A. Macrófagos foram cultivados com IFN-γ (20.000 pg./mL) e algumas monocamadas de
macrófagos receberam a fração lipídica F3a (1/100). Após uma noite de incubação a produção de
NO foi avaliada no sobrenadante do cultivo. O grupo controle de macrófagos foi mantido sem
tratamento. Os dados representam a média ±
±±
± EP de 4 poços por grupo. O asterisco representa
diferença estatisticamente significante (***P<0,001 e ** P<0,01).
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - - + + +
F3a - - + + - - + +
IFN-γ - + - + - + - +
68
Glicoproteínas que se ancoram à membrana plasmática por agrupamentos
Resultados
glicosilfosfatidilinositol (GPI)
4.1.3.4) Dosagem de citocinas:
As colônias de macrófagos tratadas ou não com IFN-γ receberam a fração
lipídica F3a (1/100). Após 48 horas de cultivo o sobrenadante foi retirado e dosadas
algumas citocinas como: IL-12, IL-10, TNF-α, o fator de crescimento GM-CSF e a
quimiocina MCP-1.
A figura 14 demonstra que, após 48 horas de cultivo, houve uma menor
produção de IL-10 nos grupos tratados somente com IFN-γ, somente com a fração F3a
ou com ambos. Contudo, a produção foi menor nos grupos tratados somente com a
fração comparando-se com o grupo tratado somente com IFN-γ. Nas culturas onde
houve a infecção pelo P. brasiliensis o efeitor inibidor da síntese de IL-10 foi mais uma
vez evidenciado, isso ocorreu nas culturas tratadas somente com IFN-γ, somente com a
fração ou com ambos. É interessante ressaltar que o potencial de inibição dado pela
fração F3a foi maior que o dado pelo IFN-γ. O potencial inibidor da síntese de citocinas
pela fração F3a não foi repetido na produção de IL-12, como representado na figura 14.
Neste caso, a produção desta citocina foi semelhante em todos os tratamentos.
69
Glicoproteínas que se ancoram à membrana plasmática por agrupamentos
Resultados
glicosilfosfatidilinositol (GPI)
IL-1 2 F 3 a
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
pg/mL
Figura 14. Quantificação de IL-10 e IL-12 no sobrenadante de cultura de macrófagos peritoneais de animais
B10.A. Macrófagos foram cultivados com IFN-γ (20.000 pg./mL) e algumas monocamadas s receberam a
fração lipídica F3a (1/100) e após 24h infectadas com P. brasiliensis . Após 48 horas de incubação a produção
desta citocina foi avaliada no sobrenadante do cultivo. O grupo controle de macrófagos foi mantido sem
tratamento. Os dados representam a média ±
±±
± EP de 4 poços por grupo. O asterisco representa diferença
estatisticamente significante (***P <0,001,**P<0,01 e *P<0,05).
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - + + + +
F3a - + - + - + - +
IFN-γ - - + + - - + +
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - + + + +
F3a - + - + - + - +
IFN-γ - - + + - - + +
IL-10 F3a
0
20 0
40 0
60 0
80 0
10 0 0
***
**
***
**
***
***
***
***
*
pg/mL
70
Glicoproteínas que se ancoram à membrana plasmática por agrupamentos
Resultados
glicosilfosfatidilinositol (GPI)
A produção de MCP-1 permaneceu inalterada nos tratamentos sem infecção pelo
fungo como mostra a figura 15 e, ao adicionar o P.brasiliensis, houve diminuição dos
níveis de MCP-1 apenas nos grupos de macrófagos pré-ativados com IFN-γ, sugerindo
que a fração F3a não exerça atividade biológica sobre a síntese de MCP-1. A figura
também ilustra a produção de GM-CSF. O efeito inibidor exercido pela fração F3a fica
evidenciado uma vez que somente nos tratamentos que receberam esta fração houve
diminuição da produção, ou seja, nas culturas tratadas somente com IFN-γ não houve
diferenças em relação ao grupo controle, temos aqui o mesmo fenômeno produzido
pelas frações F1a e F2. Observamos também que houve inibição da produção de GM-
CSF pelos macrófagos tratados com a fração F3a e infectados pelo P. brasiliensis e esta
inibição foi significativamente maior nos grupos tratados previamente com IFN-γ e
fração F3a antes da infecção pelo fungo.
71
Glicoproteínas que se ancoram à membrana plasmática por agrupamentos
Resultados
glicosilfosfatidilinositol (GPI)
M C P -1 F 3 a
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
2 0 0 0
2 5 0 0
3 0 0 0
3 5 0 0
* * *
*
***
pg/mL
G M -C S F F 3 a
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
* * *
* * *
* * *
* * *
* * *
* * *
* * *
***
pg/mL
Figura 15. Quantificação de MCP-1 e GM-CSF no sobrenadante de cultura de macrófagos
peritoneais de animais B10.A. Macrófagos foram cultivados com IFN-γ (20.000 pg./mL) e algumas
monocamadas s receberam a fração lipídica F3a (1/100) e após 24h infectadas com P. brasiliensis .
Após 48 horas de incubação a produção desta quimiocina foi avaliada no sobrenadante do cultivo.
O grupo controle de macrófagos foi mantido sem tratamento. Os dados representam a média ±
±±
± EP
de 4 poços por grupo. O asterisco representa diferença estatisticamente significante (***P <0,001,
**P<0,01 e *P<0,05).
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - + + + +
F3a - + - + - + - +
IFN-γ - - + + - - + +
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - + + + +
F1a - + - + - + - +
IFN-γ - - + + - - + +
72
Resultados Glicolipídios de cadeia longa
4.1.4) F3b: Glicolipídios de cadeia longa.
4.1.4.1) Avaliação da atividade fungicida de macrófagos peritoneais através de
Unidades Formadoras de Colônia (UFC).
A figura 16 representa o número de fungos viáveis recuperados após lise dos
macrófagos tratados com a fração lipídica F3b de P. brasiliensis diluída a 1/100.
Algumas camadas foram tratadas com IFN-γ (20.000 pg/mL). Nesta figura percebe-se
que ao tratar os macrófagos com a fração F3b houve uma diminuição do número de
fungos recuperados em comparação ao grupo de macrófagos não tratados com a fração.
Contudo, ao ser ativado com IFN-γ o mesmo fenômeno não ocorreu.
4.1.4.2) Ensaio de fagocitose.
Os resultados expressos na figura 17 mostram que macrófagos de animais
B10.A que foram tratados com a fração F3b têm uma menor capacidade de aderir e/ou
ingerir as leveduras do P. brasiliensis comparando-se com os macrófagos de animais
B10.A que não foram tratados com a fração. Contudo, o mesmo fenômeno não se
repetiu quando as culturas foram pré-tratadas com IFN-γ (20.000 pg/mL).
73
Resultados Glicolipídios de cadeia longa
F3b
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
**
UFC/mL
Mo + + + +
P. b. + + + +
F3b - + - +
IFN-γ - - + +
F
igura 16. Avaliação da atividade fungicida de macrófagos peritoneais através da recuperação de
Unidades Formadoras de Colônia (UFC) /mL após 48h de co-cultivo. Algumas monocamadas
foram previamente tratadas com IFN-γ (20.000 pg/mL) e com a fração F3b diluída a 1/100 por 24h
e infectadas com o P. brasiliensis. As barras representam as médias ±
±±
± EP de 4 poços por grupo
ensaiado. O asterisco representa diferença estatisticamente significante entre os grupos ligados pela
barra (**P<0,01).
74
Resultados Glicolipídios de cadeia longa
F3b
0
10
20
30
*
Macrófagos contendo
Pb
Mo + + + +
P. b. + + + +
F3b - + - +
IFN-γ - - + +
Figura 17: Atividade fagocítica de macrófagos tratados com a fração F3b. Foram feitas culturas de
macrófagos peritoneais de animais B10.A (1x10
6
células/poço) sobre lamínulas em placas de 24
poços. Algumas monocamadas foram previamente tratadas com IFN-γ (20.000 pg/mL) e com a
fração F3b (1/100) por 24h e infectadas com o P. brasiliensis. Após 4 horas de incubação o
sobrenadante do cultivo foi desprezado e as lamínulas foram coradas e examinadas em microscópio
óptico. Uma média de 1000 Mo foi contada e analisado o número de Mo com leveduras aderidas
e/ou ingeridas.
As barras representam as médias ±
±±
± EP de 5 poços por grupo ensaiado. (*P<0,05).
75
Resultados Glicolipídios de cadeia longa
4.1.4.3) Dosagem de NO:
A figura 18 mostra que a síntese de NO foi maior nos tratamentos que
receberam a fração lipídica F3b (1/100) e IFN-γ, comparando-se com o tratamento que
recebeu apenas IFN-γ. No grupo onde havia somente macrófagos ou somente
macrófagos e F1a não houve produção de NO detectável. Quando houve adição de P.
brasiliensis à cultura a produção de NO foi maior comparando-se ao grupo não
infectado, porém não houve diferenças entre os grupos tratados somente com a fração
F3b e o grupo tratado com a fração mais IFN-γ. Este resultado nos indica que
glicolipídios de cadeia longa podem potencializar a síntese de NO por macrófagos pré-
ativados com IFN-γ, contudo este efeito não é potencializado pela adição do fungo,
resultado este semelhante àquele obtido com glicolipídios de cadeia curta.
4.1.4.4) Dosagem de citocinas:
As colônias de macrófagos tratadas ou não com IFN-γ receberem a fração
lipídica F3b (1/100). Após 48 horas de cultivo o sobrenadante foi retirado e dosadas
algumas citocinas como: IL-12, IL-10, a quimiocina MCP-1. A produção de IL-10 por
macrófagos tratados com a fração F3b apresentou-se de forma semelhante à produção
desta citocina por macrófagos tratados com as frações anteriores, ou seja, após 48 horas
de cultivo observamos uma menor produção de IL-10 nos grupos tratados somente com
IFN-γ, somente com a fração F3b ou com ambos.
76
Resultados Glicolipídios de cadeia longa
0
10
20
30
40
F3b
**
Nitrito (
µ
µ
µ
µ
M)
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - - + + +
F3b - - + + - - + +
IFN-γ - + - + - + - +
Figura 18. Quantificação de NO no sobrenadante de cultura de macrófagos peritoneais de animais
B10.A. Macrófagos foram cultivados com IFN-γ (20.000 pg./mL) e algumas monocamadas de
macrófagos receberam a fração lipídica F3b (1/100). Após uma noite de incubação a produção de
NO foi avaliada no sobrenadante do cultivo. O grupo controle de macrófagos foi mantido sem
tratamento. Os dados representam a média ±
±±
± EP de 4 poços por grupo. O asterisco representa
diferença estatisticamente significante. ( **P <0,01).
77
Resultados Glicolipídios de cadeia longa
Da mesma forma, a produção foi menor nos grupos tratados somente com a
fração comparando-se com o grupo tratado somente com IFN-γ. Nos grupos onde houve
a infecção pelo P. brasiliensis o efeitor inibidor da síntese de IL-10 é mais uma vez
evidenciado, porém aqui o potencial inibidor foi observado de forma mais eficaz no
cultivo tratado somente com IFN-γ, comparando-se com o cultivo tratado somente com
a fração ou com ambos, conforme ilustra a figura 19.
Em relação a síntese de IL-12, representada na figura 19, não houve diferença
na produção desta citocina entre os diferentes tratamentos.
Na figura 20 observamos que a produção da quimiocina MCP-1 foi menor
macrófagos tratados com a fração F3b e pré-ativados com IFN-γ. Ao adicionar o P.
brasiliensis à cultura, a produção de MCP-1 foi encontrada em níveis mais baixos nas
culturas que receberam somente a fração F3b, somente o IFN-γ ou ambos, indicando
que quando tratados com quaisquer destes dois estímulos e infectados pelo fungo, os
macrófagos produzem níveis menores de MCP-1 comprado-se ao grupo de macrófagos
apenas infectado.
Em relação à produção de GM-CSF o efeito inibidor exercido por frações
lipidicas do P. brasiliensis fica bastante evidenciado. Mais uma vez, somente nos
tratamentos que receberam esta fração houve diminuição da produção, ou seja, nas
culturas tratadas somente com IFN-γ não houve diferenças na produção deste fator em
relação ao grupo controle, temos aqui o mesmo fenômeno produzido pela fração F1a,
F2 e F3a.
A figura também representa a inibição da produção de GM-CSF pelos
macrófagos tratados com a fração F3b e infectados pelo P. brasiliensis. Neste caso, a
78
Resultados Glicolipídios de cadeia longa
produção foi menor nos grupos tratados apenas IFN-γ ou somente com a fração F3b, ou
com ambos, comparando-se com o grupo de macrófagos que apenas foi infectado. Aqui,
ambos os estímulos foram capazes de inibir a síntese de GM-CSF.
79
Resultados Glicolipídios de cadeia longa
IL -1 0 F 3 b
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
* *
* * *
* *
* *
***
*
***
***
*
pg/mL
IL -1 2 F 3 b
0
1 0 0
2 0 0
3 0 0
4 0 0
pg/mL
Figura 19. Quantificação de IL-10 e IL-12 no sobrenadante de cultura de macrófagos peritoneais de
animais B10.A. Macrófagos foram cultivados com IFN-γ (20.000 pg./mL) e algumas monocamadas
s receberam a fração lipídica F3b (1/100) e após 24h infectadas com P. brasiliensis . Após 48 horas
de incubação a produção desta citocina foi avaliada no sobrenadante do cultivo. O grupo controle
de macrófagos foi mantido sem tratamento. Os dados representam a média ±
±±
± EP de 4 poços por
grupo. O asterisco representa diferença estatisticamente significante (*P<0,05, **P <0,01 e
***P<0,001).
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - + + + +
F3b - + - + - + - +
IFN-γ - - + + - - + +
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - + + + +
F3b - + - + - + - +
IFN-γ - - + + - - + +
80
Resultados Glicolipídios de cadeia longa
M C P -1 F 3 b
0
2 5 0
5 0 0
7 5 0
1 0 0 0
1 2 5 0
1 5 0 0
* * *
* * *
*
***
pg/mL
Figura 20. Quantificação da quimiocina MCP-1 e GM-CSF no sobrenadante de cultura de
macrófagos peritoneais de animais B10.A. Macrófagos foram cultivados com IFN-γ (20.000
pg./mL) e algumas monocamadas s receberam a fração lipídica F3b (1/100) e após 24h infectadas
com P. brasiliensis . Após 48 horas de incubação a produção deste produto foi avaliada no
sobrenadante do cultivo. O grupo controle de macrófagos foi mantido sem tratamento. Os dados
representam a média ±
±±
± EP de 4 poços por grupo. O asterisco representa diferença estatisticamente
significante (***P<0,001 e *P<0,05).
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - + + + +
F3b - + - + - + - +
IFN-γ - - + + - - + +
Mo + + + + + + + +
P.b. - - - - + + + +
F3b - + - + - + - +
IFN-γ - - + + - - + +
G M -C S F F 3 b
0
2 0 0
4 0 0
6 0 0
8 0 0
1 0 0 0
* * *
* * *
* * *
* *
******
***
pg/mL
81
Resultados TLR-4 in vitro
4.2) TLR-4 na Paracocciodiodomicose.
4.2.1) Experimentos in vitro:
4.2.1.1) Avaliação da atividade fungicida de macrófagos peritoneais através da
determinação de Unidades Formadoras de Colônia (UFC).
A figura 21 mostra um número menor de fungos recuperados dos
macrófagos dos camundongos que expressam proteína não funcional do TLR4. Pode-se
também observar um número significativamente menor de fungos recuperados em
relação ao grupo que não recebeu IFN-γ (20.000 pg/mL). Além disso, mais uma vez um
número menor de fungos foi recuperado de macrófagos de camundongos deficientes
para TLR4.
4.2.1.2) Ensaio de fagocitose.
Os macrófagos peritoneais de animais C3H/HeJ e C3H/HePas foram infectados
com leveduras viáveis do fungo (relação Pb/Mo de 1/50) sobre lamínulas redondas em
placa de cultura de 24 poços. Após 4 horas de incubação a 37ºC em estufa contendo 5%
de CO2 o sobrenadante foi removido e as lamínulas foram coradas e examinadas ao
microscópio óptico comum. Uma média de 1000 macrófagos foi contada em cada
lamínula para determinar o número de fungos aderidos e/ou ingeridos após as 4 horas de
incubação. Os resultados expressos na figura 22 mostram que macrófagos de animais
C3H/HePas têm maior capacidade de aderir e/ou ingerir as leveduras do P. brasiliensis
comparando-se com os macrófagos de animais C3h/HePas. O fenômeno foi confirmado
quando as culturas foram pré-tratadas com IFN-
γ (20.000 pg/mL).
82
Resultados TLR-4 in vitro
0
100
200
300
400
500
600
C3H/HeJ
C3H/HePas
UFC TLR-4
*
**
M+Pb M+Pb+IFN-γ
γγ
γ
UFC/mL
*
*
Figura 21. Avaliação da atividade fungicida de macrófagos peritoneais através da recuperação de
Unidades Formadoras de Colônia (UFC) /mL após 48h de co-cultivo. As monocamadas de
macrófagos de ambas as linhagens foram tratadas ou não com IFN-γ (20.000pg/mL) e infectadas
com o P. brasiliensis na proporção 1 fungo para 50 macrófagos após 24h. As barras representam as
médias ±
±±
± EP de 5 poços por grupo ensaiado. O asterisco representa diferença estatisticamente
significante entre os grupos ligados pela barra (**P< 0,01 e *P< 0,05).
83
Resultados TLR-4 in vitro
0
5
10
15
C3H/HeJ
C3H/HePas
**
*
Mo + Pb Mo + Pb + IFN
Macrófagos contendo Pb
Figura 22: Avaliação de atividade fagocítica de macrófagos de animais normais e deficientes para o
TLR-4. Os mcrófagos peritoneais de animais C3H/HeJ e C3H/HePas (1x10
6
células/poço) ativados
ou não com IFN-γ (20.000 pg/mL) foram co-cultivados com leveduras viáveis do P. brasiliensis em
uma relação fungo/Mo de 1:50 sobre lamínulas redondas em uma placa de cultura de 24 poços.
Após 4 horas de incubação o sobrenadante do cultivo foi desprezado e as lamínulas foram coradas e
examinadas em microscópio óptico. Uma média de 1000 Mo foi contada e analisada o número de
Mo com leveduras aderidas e/ou ingeridas.
As barras representam as médias ±
±±
± EP de 5 poços por
grupo ensaiado. O asterisco representa diferença estatisticamente significante entre os grupos
ligados pela barra (**P< 0,01 e *P< 0,05).
84
Resultados TLR-4 in vitro
4.2.1.3) Dosagem de NO.
A figura 23 mostra que o camundongos C3H/HeJ deficiente para o TLR-4
produzem concentrações menores de NO em comparação com os camundongos
selvagens da linhagem C3H/HePas. Porém, a adição de P. brasiliensis levou a um
aumento significativo na síntese de NO. Para ambas as linhagens a adição de IFN-γ
levou a menor recuperação de fungos e maior síntese de NO. Assim, pode-se sugerir
que o TLR-4 é um dos receptores envolvidos no reconhecimento do P. brasiliensis por
parte dos macrófagos peritoneais e é capaz de desencadear a síntese de NO. Contudo, é
conveniente ressaltar que na linhagem, C3H/HePas, que produz maiores concentrações
de NO recuperamos um número maior de fungos, comparando-se com a linhagem
C3H/HeJ.
4.2.1.4) Produção de citocinas
A figura 24 mostra que, sem estímulos, macrófagos peritoneais de
camundongos C3H/HeJ deficiente para o TLR-4 produzem concentrações semelhantes
de IL-12. Contudo, ao receber um estimulo, quer seja dado pelo IFN-γ ou dado pelo P.
brasiliensis, a produção de IL-12 é aumentada apenas nos macrófagos que possuem
TLR-4. A produção de TNF-α apresentou-se de forma bastante heterogênea o que gerou
grandes desvios nos resultados e ausência de diferença entre os grupos.
85
Resultados TLR-4 in vitro
N O T L R -4
0
5 0
1 0 0
1 5 0
* * *
*
* * *
* * *
C 3 H / H e J
C 3 H / H e P a s
Nitrit
ο
ο
ο
ο
(
µ
µ
µ
µ
M)
Mo + + + + + + + +
P.b.
- - + + - - + +
IFN-γ - - - - + + + +
Figura 23. Quantificação de NO no sobrenadante de cultura de macrófagos peritoneais de animais
C3H/HeJ e C3H/HePas. Macrófagos foram cultivados com IFN-γ (20.000pg./mL) durante a noite.
Algumas monocamadas de macrófagos foram infectadas com o P.brasiliensis em uma proporção de
50 macrófagos para 1 fungo. Após 48 horas de incubação a produção de NO foi avaliada no
sobrenadante do cultivo. O grupo controle de macrófagos foi mantido sem tratamento, onde não
houve produção de NO. Os dados representam a média ±
±±
± EP de 5 poços por grupo. O asterisco
representa diferença estatisticamente significante (*P<0,05 e ***P<0,001).
86
Resultados TLR-4 in vitro
A produção de IL-10 foi menor nas culturas de macrófagos provenientes de
animais que expressam o TLR-4 funcional, o mesmo fenômeno permaneceu quando os
macrófagos destes animais foram estimulados com IFN-γ ou quando foram desafiado
com o P. brasiliensis, como demonstrado na figura 25. Entretanto, nos grupos de
macrófagos pré-ativados com IFN-γ e desafiados com o fungo, a produção de IL-10 foi
semelhante nas culturas de macrófagos das duas linhagens. A produção da quimiocina
MCP-1 apresentou-se em concentrações baixas nas culturas de macrófagos de animais
C3H/HeJ, comparando-se com a produção por macrófagos provenientes de animais
C3H/HePas. A produção deste produto celular foi maior quando os macrófagos foram
pré-ativados com IFN-γ, quando desafiados pelo fungo ou quando foram pré-ativados
com IFN-γ e desafiados pelo P. brasiliensis. Contudo, esta maior produção ocorreu
apenas nas culturas de macrófagos dos animais que apresentam o TLR-4 funcional.
Assim, pode-se sugerir que o Toll-Like receptor 4 é um dos receptores envolvidos no
reconhecimento do P. brasiliensis por parte dos macrófagos peritoneais e é capaz de
desencadear a síntese de citocinas.
87
Resultados TLR-4 in vitro
IL -1 2
0
5 0 0
1 0 0 0
1 5 0 0
* * *
* * *
* *
pg/mL
C 3 H /H e J
C 3 H /H e P a s
T N F -α
αα
α
0
2 5
5 0
7 5
1 0 0
1 2 5
pg/mL
Figura 24. Quantificação de IL-12 e TNF no sobrenadante de cultura de macrófagos peritoneais de
animais normais e deficientes para o TLR-4. Os macrófagos foram cultivados com IFN-γ
(20.000pg./mL) durante a noite. Algumas monocamadas de macrófagos foram infectadas com o
P.brasiliensis em uma proporção de 50 macrófagos para 1 fungo. Após 48 horas de incubação a
produção de citocinas foi avaliada no sobrenadante do cultivo. O grupo controle de macrófagos foi
mantido sem tratamento. Os dados representam a média ±
±±
± EP de 5 poços por grupo. Os asteriscos
representam diferenças estatisticamente significante (***P<0,001 e ** P<0,01).
Mo
+ + + + + + + +
P.b.
- - + + - - + +
IFN - - - - + + + +
Mo
+ + + + + + + +
P.b.
- - + + - - + +
IFN
- - - - + + + +
88
Resultados TLR-4 in vitro
IL -1 0
0
2 5 0
5 0 0
7 5 0
* *
*
pg/mL
C 3 H /H e J
C 3 H /H e P a s
M C P -1
0
1 0 0 0
2 0 0 0
3 0 0 0
4 0 0 0
5 0 0 0
* * *
* * *
* * *
* * *
pg/mL
Figura 25. Quantificação de IL-10 e MCP-1 no sobrenadante de cultura de macrófagos peritoneais
de animais normais e deficientes para o TLR-4. Os macrófagos foram cultivados com IFN-γ
(20.000pg./mL) durante a noite. Algumas monocamadas de macrófagos foram infectadas com o
P.brasiliensis em uma proporção de 50 macrófagos para 1 fungo. Após 48 horas de incubação a
produção de citocinas foi avaliada no sobrenadante do cultivo. O grupo controle de macrófagos foi
mantido sem tratamento. Os dados representam a média ±
±±
± EP de 5 poços por grupo. Os asteriscos
representam diferenças estatisticamente significante (***P<0,001 e ** P<0,01).
Mo
+ + + + + + + +
P.b.
- - + + - - + +
IFN
-
γ
- - - - + + + +
Mo
+ + + + + + + +
P.b.
- - + + - - + +
IFN
-
γ
- - - - + + + +
89
Resultados TLR-4 in vivo
4.2.2) Experimentos in vivo:
4.2.2.1) Avaliação do grau de infecção através de UFC obtidas do macerado de pulmão
em tempo curto de infecção.
A figura 26A mostra a média de UFC/g de tecido (log
10
) no pulmão dos animais
C3H/HeJ e C3H/HePas obtidos após 48 horas de infecção. O número de fungos
recuperados foi muito semelhante para as duas linhagens. Observamos, entretanto, que
após 96 horas de infecção as diferenças no controle da carga fúngica se estabelecem
entre as duas linhagens: houve um maior número de fungos recuperados a partir do
macerado do pulmão dos animais que possuem o TLR-4 funcional.
4.2.2.2) Dosagem de NO.
Na figura 26B temos a quantificação de NO presentes no macerado dos pulmões
dos animais C3H/HeJ e C3H/HePas após 48 e 96 horas de infecção. A dosagem foi feita
imediatamente após a coleta do sobrenadante do macerado. A concentração de NO
encontrada, foi maior no grupo de animais que expressa o TLR-4 funcional
comparando-se com o grupo que apresenta o receptor não funcional. O mesmo
fenômeno ocorre em 96 horas de infecção.
90
Resultados TLR-4 in vivo
A
0
1
2
3
4
5
6
7
C3H/HeJ
C3H/HePas
**
UFC log
10
/g tecido
48h
96h
B
NO Pulmão
0
10
20
30
40
50
60
70
*
**
48h
96h
C3H/HeJ
C3H/HePas
Nitrito (
µ
µ
µ
µ
M)
Figura 26. A: Avaliação do grau de infecção através de Unidades Formadoras de Colônia (UFC).
Os camundongos C3H/HeJ e C3H/HePas foram infectados com 1x10
6
de leveduras do P. brasiliensis
pela via i.t. O grau de infecção foi determinado após 48 e 96 horas de infecção pela contagem de
UFC. B: Quantificação de NO no macerado do pulmão de animais C3H/HeJ e C3H/HePas. Os
animais foram infectados com 1x10
6
leveduras de P.brasiliensis inoculadas pela via i.t. e sacrificados
após 48 e 96 horas de infecção. Os dados representam a média ±
±±
± EP de 6 animais por grupo. O
asterisco representa diferença estatisticamente significante (*P<0,05 e **P<0,01).
91
Resultados TLR-4 in vivo
4.2.2.3) Dosagem de citocinas no homogenato do pulmão em tempo curto de infecção.
A figura 27A mostra a produção de algumas citocinas no homogenato do
pulmão de camundongos após 48 horas de infecção com o P. brasiliensis. Pode-se
verificar que camundongos TLR-4 normal produzem maiores quantidades de IL-12,
GM-CSF e TNF-α que os camundongos TLR-4 deficiente. Contudo, após 96 horas de
infecção apenas a produção de IL-12 e IL-4 apresentou diferença entre as duas
linhagens, conforme ilustra a figura 27B. A produção de GM-CSF também apresenta
diferenças, porém, neste tempo de infecção é a linhagem deficiente em TLR-4 que
produz maiores concentrações deste fator de crescimento. Não foi feita a dosagem de
TNF- α devido a problemas na proteína recombinante.
4.2.2.4) Avaliação do grau de infecção através de UFC no macerado de pulmão em
tempo longo de infecção.
A figura 28A mostra a média de UFC/g de tecido (log
10
) no pulmão dos animais
C3H/HeJ e C3H/HePas obtidas após 11 semanas de infecção. Não houve disseminação
de fungos para fígado e baço. O número de fungos recuperados foi significativamente
maior no pulmão de animais C3H/HePas comprando-se com o pulmão do animal
C3H/HeJ.
4.2.2.5) Dosagem de NO no homogenato de pulmões em tempo longo de infecção.
Diferente dos outros tempos de infecção e dos experimentos in vitro, não houve
diferenças nas concentrações de NO em homogenatos de pulmão após 11 semanas de
infecção com o P. brasiliensis, como mostra a figura 28B.
92
Resultados TLR-4 in vivo
Pulmão 48 horas
0
1000
2000
3000
4000
***
***
IL 4 IL 5 IL 10 IL12 TNF IFN
pg/mL
*
GM-CSF
MCP-1
A
Pulmão 96 horas
0
1000
2000
3000
IL 4 IL 5 IL 10 IL 2 IL 12 IFN
pg/mL
**
**
GM-CSF
**
C3H/HeJ
C3H/HePas
MCP-1
B
Figura 27. Quantificação de IL-4, IL-5, IL-10, IL-12, TNF-α, MCP-1 eGM-CSF e a partir do
macerado de pulmão de animais C3H/HeJ e C3H/HePas após 48 (A) e 96 (B) horas de infecção
(***P<0,001 , **P< 0,01* e *P<0,05).
93
Resultados TLR-4 in vivo
Pulmão 11 semanas
C3H/HeJ C3H/HePas
3
4
5
6
7
**
CFU log
10
/g tissue
A
Pulmão 11 semanas
C3H/HeJ C3H/HePas
0
5
10
15
20
25
30
35
B
Nitrito (
µ
µ
µ
µ
M)
Figura 28. Avaliação do grau de infecção através de Unidades Formadoras de Colônia (A) e
quantificação de NO (B) a partir do macerado do pulmão de animais C3H/HeJ e C3H/HePas. Os
animais foram infectados com 1x10
6
leveduras de P.brasiliensis inoculadas pela via i.t. e sacrificados
após 11 semanas de infecção . O grau de infecção foi determinado após 11 semanas de infecção pela
contagem de UFC. Os dados representam a média ±
±±
± EP de 6 animais por grupo (**P<0,01).
94
Resultados TLR-4 in vivo
4.2.2.6) Dosagem de citocinas no homogenato de pulmões em tempo longo de infecção.
A figura 29A mostra a produção de algumas citocinas a partir do homogenato de
pulmão após 11 semanas de infecção com o P. brasiliensis. Animais que expressam o
TLR-4 funcional apresentam níveis maiores de IL-12 e GM-CSF comprando-se com a
produção de animais que não expressam o TLR-4 funcional, resultado este semelhante
ao encontrado no tempo curto de infecção. A produção de IL-10, IL-4, IL-5, IL-2 e
MCP-1 foi semelhante nas duas linhagens; a produção de IFN-γ foi oposta à produção
de IL-12, ou seja, foi maior nos animais C3H/HeJ comparando-se com os animais
C3H/HePas.
4.2.2.7) Dosagem de anticorpos no soro de camundongos após 11 semanas de infecção.
A resposta imune humoral dos animais C3H/HeJ e C3H/HePas infectados com o
fungo foi avaliada pela produção de anticorpos anti P. brasiliensis (Ig total e os
diferentes isótipos). Assim, após 11 semanas de infecção, os animais foram
anestesiados, suas artérias e veias axilares seccionadas e coletadas amostras do sangue
para obtenção do soro; as amostras foram estocadas a -20°C até o momento da detecção
dos níveis de anticorpos por ELISA.
Como o indicado na figura 29B os animais que expressam o TLR-4 não
funcional (C3H/HeJ) apresentaram menor títulos de IgG total, IgG1, IgG2b e IgM
comparando-se com os títulos de anticorpos encontrados no soro de animais que
apresentam o TLR-4 funcional (C3H/HePas).
95
Resultados TLR-4 in vivo
Pulmão 11 semanas
0
1000
2000
3000
4000
5000
6000
**
IL 4 IL 5 IL 10 IL 2 IL 12 IFN TNF
pg/mL
**
GM -CSF
**
A
MCP 1
IgG IgG1 IgG2a IgG2b IgG3 IgM IgA
0
3
6
9
12
15
18
C3H/HeJ
C3H/HePas
Título de Anticorpos (Log2)
**
**
*
**
B
Figura 29. Quantificação de citocinas pulmonares e anticorpos séricos após 11 semanas de infecção
de camundongos C3H/HeJ e C3H/HePas . A: Os animais foram infectados com 1x10
6
leveduras de
P.brasiliensis inoculadas pela via i.t. e sacrificados. B: Níveis de anticorpos séricos anti-P.
brasiliensis (IgG total, IgG1, IgG2a, IgG2b, IgG3, IgM e IgA) em camundongos C3H/HeJ e
C3H/HePas. Os animais foram infectados com 1x10
6
leveduras de P.brasiliensis inoculadas pela via
i.t. e sacrificados. Os dados representam a média ±
±±
± EP de 5 animais por grupo. O asterisco
representa diferença estatisticamente significante. (**P<0,01 e * P<0,05).
96
Resultados TLR-4 in vivo
4.2.2.8) Sobrevida.
Grupos de 12 animais C3H/HeJ e 12 animais C3H/HePas foram infectados com
leveduras viáveis do P. brasiliensis e observados durante um período de 400 dias, sendo
registrado o tempo de sobrevida (em dias) para cada animal.
Como observado na figura 30 mortalidade dos animais C3H/HePas inicia-se no
dia 99 e após 400 dias 4 animais continuavam vivos, enquanto que a mortalidade dos
animais C3H/HeJ inicia-se no dia 134 e após 400 dias 5 animais ainda estavam vivos. A
análise estatística destes dos dados de sobrevida (método de comparação de curvas de
sobrevida pelo teste de Logrank) demonstrou não haver diferenças estatísticas entre as
linhagens C3H/HeJ e C3H/HePas.
97
Resultados TLR-4 in vivo
Sobrevida
0 100 200 300 400 500
0
20
40
60
80
100
C3H/HePas
C3H/HeJ
Dias
% Sobrevida
Figura 30: Tempo de sobrevida de camundongos C3H/HeJ e C3H/HePas infectados pela via i.t. com
1x106 leveduras viáveis do P. brasiliensis (n = 10-12 camundongo/linhagem). A sobrevida dos
animais foi acompanhada por 420 dias. O experimento foi repetido duas vezes com resultados
semelhantes.
98
Discussão
A ativação do macrófago é essencial para o início da resposta imune inata;
uma vez ativado, haverá produção de vários compostos que podem eliminar o parasita.
Esta ativação também leva à produção de citocinas que modulam a resposta imune
inata, recrutando outras células, ativando-as, assim como, regula a resposta imune
adaptativa. Alguns estudos recentes realizados com modelos in vitro sustentam o
conceito de que para a ativação de macrófagos e conseqüente produção de compostos
microbicidas, dentre eles o oxido nítrico (NO), são necessários dois diferentes sinais
(STUEHR, et al., 1987; GREEN, et al., 1990; AMBER, et al.,1991). Estes sinais
incluem o IFN-γ, o TNF-α e o LPS. Estudos posteriores sugerem que outros compostos
biológicos ancorados à membrana celular dos organismos patogênicos podem funcionar
como um dos dois sinais necessários para a ativação dos macrófagos.
GPI é um importante componente de proteínas de membrana de
microorganismos envolvidas na indução da resposta imune. Camargo et al. (1997)
demonstraram que as glicoproteínas ancoradas à membrana plasmática por
glicosilfosfatidilinositol (GPI), isoladas de Trypanosoma cruzi, operam como o segundo
sinal para a indução de NO por macrófagos pré-ativados com IFN-γ, além de
desencadear a síntese de citocinas pró-inflamatórias, como o TNF-α.
Recentemente, SCHOREY & SWEET, 2006, demonstraram que
glicopeptidiolipídios extraídos de Mycobacterium avium promovem a ativação de
macrófagos com produção de altos neveis de TNF-α. Esta complexa molécula orgânica
é um dos fatores que determinam a potogenecidade de linhagens de Mycobacterium
avium; é capaz de liga-se ao TLR-2 e ativar o fator de transcrição como NFkB, assim
99
Discussão
como a proteína quinase p38, promovendo então a ativação macrofágica com a síntese
de citocinas pró-inflamatórias.
Em nossos estudos verificamos que todas as frações lipídicas extraídas do P.
brasiliensis são capazes de desencadear a síntese de NO por macrófagos peritoneais
quando estes foram pré-estimulados com IFN-γ. Comportam-se, assim, como o segundo
sinal necessário para a síntese de NO.
Os resultados com macrófagos normais sugerem que as frações lipídicas de
P. brasiliensis podem ter algum envolvimento na defesa do hospedeiro. Embora
tenhamos apresentado os resultados obtidos com a fração F1a, todas as frações da
família F1, compostas basicamente por lipídios neutros e fosfolipídios, assim como a
fração F2 (glicolipidios de cadeia curta) comportaram-se similarmente. Nas culturas de
macrófagos infectadas com o fungo que foram antes tratadas com estas frações houve
um maior número de fungos recuperados. Tais resultados podem sugerir que houve uma
inibição da atividade fungicida dos macrófagos, que culminou com um maior número
de fungos viáveis recuperados; entretanto, os resultados com a dosagem de NO fala
contra esta hipótese: nas culturas tratadas com a fração F1a ou F2 houve a produção de
maiores níveis de NO comparando-se com as culturas não tratadas, indicação um
potencial ativador da atividade fungicida dos macrófagos. Os resultados com o ensaio
da fagocitose demonstraram que a presença da fração F1a ou F2 na cultura aumentou a
capacidade do macrófago de ingerir e/ou aderir ao fungo. Desta forma, temos mais um
resultado indicando o potencial da fração F1a ou F2 em ativar o macrófago. Assim, é
possível que a maior carga fúngica encontrada nos experimentos de UFC seja
conseqüência de uma ativação mais eficiente, como também, de uma
100
Discussão
fagocitose/aderência mais eficiente por parte dos macrófagos tratados com a fração F1a
ou F2. Entretanto, a maior produção de NO por estes macrófagos, não foi suficiente
para inibir o crescimento e reprodução do fungo. Esta hipótese parece ser a mais
coerente, principalmente se olharmos os valores numéricos da produção de NO e
desconsiderar a analise estatística. A produção de NO foi estatisticamente maior nas
culturas tratadas com a fração lipídica, porém a diferença foi pequena em valores
numéricos, isso é possível graças à pequena variabilidade do experimento, que
apresentou valores de concentração de NO muito próximos entre si nas triplicatas
ensaiadas. Este fato contribuiu para um erro pequeno e a diferença significante
observada nos dados estatísticos; entretanto, é possível que biologicamente, essas
diferenças sejam pequenas demais para serem capazes de inibir o crescimento fúngico e
provocar diferenças no número de fungos recuperados.
A fração F3a, composta basicamente por glicoprotéinas que se ancoram à
membrana por agrupamentos glicosilfosfatilinositol e a fração F3b, composta por
glicolipídios de cadeia longa, comportaram-se de modo semelhante entre si e de
maneira oposta àquela observada com as frações F1 e F2. Nas culturas de macrófagos
infectadas com o fungo que foram pré-tratadas com estas frações, houve um menor
número de fungos recuperados. Tais resultados podem sugerir que houve um aumento
da atividade fungicida dos macrófagos, que culminou com um menor número de fungos
viáveis recuperados, dados que estão de acordo com a maior produção de NO
desencadeada por esta fração. Alternativamente, pode-se considerar que os macrófagos
pré-tratados pelas frações F3a ou F3b e infectados pelo fungo dispunham de um menor
número de receptores disponíveis em sua membrana. Isso conduziria a um menor
101
Discussão
número de fungos reconhecidos e fagocitados e, conseqüentemente, menor número de
fungos recuperados (UFC). Esta hipótese é sustentada pelos dados do ensaio de
fagocitose de ambas as frações, onde observamos que macrófagos tratados com as
frações F3a ou F3b tiveram uma menor capacidade de ingerir e/ou aderir ao fungo. Se
as frações lipídicas são reconhecidas e interagem com os receptores macrofágicos, é
plausível que após 24h, quando os macrófagos foram infectados pelo fungo, um número
menor de receptores estivesse disponível, ou ainda, é possível que as frações F3a e F3b
tenham bloqueado a fagocitose assim que ligadas aos receptores dos macrófagos. Este
seria um mecanismo de evasão de parasitas ao sistema imune, pois ao interagir com
receptores de macrófagos, compostos do patógeno poderiam causar uma perturbação na
membrana celular que culminaria com a inibição da fagocitose.
Em conclusão, verificamos que todas as frações lipídicas do P. brasiliensis
são capazes de estimular a síntese de NO na presença de IFN-γ, e que, após a adição do
fungo às culturas, a produção de NO foi maior comparando-se ao grupo não infectado,
porém foi maior ainda nos grupos que receberam previamente as diferentes frações.
Contudo, nos experimentos de UFC, observamos que a diferença dos níveis de NO nas
culturas pré-tratadas com IFN-γ não resultou em diferenças quanto ao número de fungos
recuperados. A síntese de NO foi maior nas culturas pré-ativadas com o IFN-γ e com as
diferentes frações, comparando-se com o grupo apenas tratado com IFN-γ, porém os
números de UFC foram semelhantes, ou seja, a maior produção de NO desencadeada
pela fração não foi suficiente para conter a carga fúngica. Deste modo, observamos
diferenças nos experimentos de UFC somente quando as culturas não eram pré-ativadas
com o IFN-γ; neste caso, não houve produção de NO em nenhuma das culturas,
102
Discussão
entretanto as diferenças de UFC se estabeleceram. Este fato reforça os dados que
sugerem a fagocitose aumentada pela ação dos lipídios F1a e F2 e, além disso,
sugeremque o P. brasiliensis talvez possa ser morto por mecanismos independentes de
NO. Assim, faremos experimentos futuros onde a produção de NO será inibida e
avaliaremos se as diferenças de UFC se estabelecem nos tratamentos com IFN-γ.
Um fato curioso é que as frações de cadeia longa como a F3a e F3b
produziram resultados de UFC semelhantes entre si e opostos aos resultados obtidos
com a frações de cadeia curta, F1a e F2. Com as frações de cadeia longa (F3a e 3b)
houve um menor número de fungos viáveis recuperados a partir de macrófagos tratados
com elas, se comparado aos macrófagos não tratados. Uma hipótese para este
comportamento é que as frações grandes, como foram adicionadas às culturas antes do
fungo, ocuparam os receptores de membrana dos macrófagos e inibiram a interação
entre o macrófago e o fungo, de modo que os macrófagos ficaram com a sua capacidade
fagocítica comprometida. Já com as frações de cadeia curta (F1a e F2) houve um maior
número de fungos recuperados nos macrófagos tratados com elas se comparado aos
macrófagos não tratados. Aqui, talvez o macrófago tenha sido ativado, como indicam os
dados de NO, e também tenha fagocitado um grande número de fungo, uma vez que o
pequeno tamanho destas frações não interferiram de modo especial na interação fungo-
macrófago e o macrófago pôde exercer sua fagocitose normalmente.
Outra alternativa para os dados é que a interação de lipídios pequenos com
seus receptores ocorra com pequena afinidade e o complexo receptor-lipídio se dissocie
com facilidade. Com os lipídios maiores esta associação dar-se-ia com maior afinidade,
ocorrendo baixa dissociação que bloquearia a posterior interação com o fungo. Além
103
Discussão
disso, não temos dados sobre o processo de ativação celular mediado pelos dois grupos
antagônicos de lipídios. Talvez os lípides componentes das frações F1a e F2 induzam o
macrófago a expressar maior número de outros receptores (receptor de manose,
receptores de iC3b) que induzam maior interação fungo-macrófago e
consequentemente, maior fagocitose. A ativação mediada pelas frações F3a e F3b não
induziriam uma maior expressão destes receptores. Estas hipóteses serão posteriormente
estudadas em nosso laboratório.
Em relação à síntese de citocinas, verificamos que cada fração comporta-se
de uma maneira diferente na imumodulação do macrófago. Foram dosadas as citocinas
IL-10, IL-12, TNF-α, a quimiocina MCP-1 e o fator de crescimento GM-CSF. Contudo,
devido a problemas em nossa proteína recombinate padrão (Pharmingem) não podemos
detectar o TNF-α. Dosaremos em futuros experimentos esta citocina, uma vez que a
literatura indica que compostos lipídicos são potentes desencadeadores da síntese desta
citocinas pró-inflamatórias por macrófagos primados com IFN-γ (SCHOFIEL et al.,
2005).
A fração lipídica F1a, diluída a 1/100, composta por fosfolípideos e lipídeos
neutros inibiu a síntese de IL-10, IL-12, MCP-1 e GM-CSF pelos macrófagos. A
produção de IL-10 foi menor nos grupos tratados somente com a fração F1a, somente
com o IFN-γ ou nos grupos tratados com ambos; ao adicionar P. brasiliensis às culturas,
a produção desta citocina foi menor também nas culturas tratadas somente com a fração
F1a, com IFN-γ ou com ambos, comparando-se com grupo de macrófagos apenas
infectados pelo fungo. Estes resultados indicam que tanto a fração F1a como o IFN-γ
são capazes de inibir a síntese de IL-10. Em relação à IL-12, também houve inibição da
104
Discussão
sua produção, porém, neste caso apenas quando houve a adição da fração F1a na cultura
é que esta inibição ocorreu, ou seja, diferente da IL-10, o IFN-γ não interferiu na
produção desta citocina. Para a quimiociona MCP-1, temos um fenômeno semelhante
ao ocorrido com a IL-10, porém, nos tratamentos com fungo, a inibição da síntese de
MCP-1 foi mais potente nos grupos tratados com dois estímulos (F1a + IFN-γ),
comparando-se aos grupos tratados com os estímulos separadamente.
Para o fator de crescimento GM-CSF temos um resultado semelhante ao da
citocina IL-12, ou seja, somente quando houve adição da fração F1a à cultura é que
ocorreu inibição da síntese deste produto, contudo, da mesma forma que ocorreu com a
MCP-1, nas culturas tratadas infectadas com o fungo, a inibição foi menor quando elas
foram estimuladas com IFN-γ e com a fração, comparando-se com as culturas tratadas
com estímulos separados. Tais resultados indicam que o composto lipídico e o IFN-γ
são também capazes de inibir a síntese de GM-CSF, porém, quando encontrados na
mesma cultura, são capazes de exercer efeito sinérgico na inibição da síntese de GM-
CSF e de MCP-1.
Um fenenômeno parecido ocorreu também no trabalho desenvolvido por
Pina (2005) em nosso laboratório. Neste caso, ao trabalhar com macrófagos alveolares
de camundongos B10.A, verificou-se que os mesmos produziam níveis baixos de MCP-
1 e IL-10 quando primados com IFN-γ em altas concentrações (20.000 pg/mL),
comparando-se com a produção dos macrófagos não primados.
A quimiocina MCP-1 (do inglês, monocyte chemotactic protein) é
produzida por uma variedade de células que estimulam o recrutamento de monócitos e
células T para um compartimento inflamatório, contribuindo, desta forma, para a
105
Discussão
formação de granulomas (FLORY et al., 1993). Em relação à citocina IL-10 sabemos
que foi originalmente descrita como “fator inibidor da produção de citocinas”. É um
potente inibidor da função microbicida de macrófagos ativados e leva à supressão da
produção de NO (GAZZINELLI et al., 1992). A diminuição de IL-10, entretanto, talvez
esteja correlacionada com a síntese elevada de NO por macrófagos primados por IFN-γ.
Nos grupos tratados com a fração lipídica F2, verificamos que não houve
diferenças na produção de IL-12; mais uma vez, nos grupos tratados somente com IFN-
γ, somente com a fração ou com ambos, a produção de IL-10 foi menor comparando-se
com os grupos não tratados. Contudo, notamos que o potencial de inibir a síntese de IL-
10 foi maior nos grupos tratados somente com a fração comparando-se com o grupo
tratado apenas o IFN-γ, e também, quando os dois estímulos estavam juntos, a produção
de IL-10 foi ainda menor. Isso nos indica que tanto o IFN-γ quanto a fração F2 podem
inibir a síntese de IL-10, porém o composto lipídico foi mais eficiente nesta atividade.
Além disso, quando em conjunto com o IFN-γ, o poder inibidor da fração F2 foi
potencializado.
Em relação à quimiocina MCP-1 temos pela primeira vez, um composto
lipídico estimulando a síntese de um produto celular. Aqui, a produção de MCP-1 foi
maior nos grupos tratados apenas com a fração F2, comparando-se com o grupo não
tratado e com o grupo tratado apenas com IFN-γ. Ao adicionar o fungo nas culturas
notamos que onde havia IFN-γ a produção de MCP-1 foi menor comparando-se ao
grupo de macrófagos apenas infectados, e onde havia apenas a fração F2 a produção de
MCP-1 foi maior comparando-se com o grupo de macrófagos apenas infectado. Temos
então, o IFN-
γ e a fração F2 induzindo fenômenos opostos nas culturas, o primeiro
106
Discussão
inibindo, e o segundo estimulando a síntese da quimiocina. Para o fator de crescimento
GM-CSF a fração F2 inibiu a produção nos grupos tratados apenas com a fração e nos
grupos tratados com a fração e o IFN-γ; quando adicionado o fungo às culturas houve
diminuição da produção de GM-CSF apenas nos grupos tratados com os dois estímulos.
Temos então, mais uma fração lipídica inibindo a síntese de GM-CSF.
Em relação à fração F3a, que é composta por glicoproteínas que se ancoram
à membrana plasmática por agrupamentos glicosilfosfatidilinositol, verificamos que
tanto o IFN-γ como a fração F3a, na presença ou ausência do fungo, foram capazes de
inibir a síntese de IL-10. Para esta fração não encontramos diferenças na produção de
IL-12 com nenhum dos tratamentos. Com a quimiocina MCP-1, observamos a
diminuição da produção nos grupos de macrófagos primados com IFN-γ e infectados
com o fungo e também nos grupos tratados com a fração e o IFN-γ e infectados com o
fungo. Temos aqui, um resultado que nos indica que esta menor produção de MCP-1 foi
ocasionada pelo IFN-γ e pelo fungo, não havendo, portanto, a participação da fração
F3a. Para o GM-CSF observamos fenômeno semelhante ao ocorrido com as demais
frações, ou seja, a fração é capaz de inibir a síntese deste fator de crescimento.
Por fim, verificamos que a fração lipídica F3b, que é formada por
glicolipídios grandes, não provocou alteração na produção de IL-12, mas induziu a
diminuição de IL-10. Mais uma vez, nos grupos tratados somente com IFN-γ, somente
com a fração ou com ambos ocorre redução da produção de IL-10, comparando-se com
a produção por macrófagos não primados. Aqui, quando as culturas são tratadas
somente com a fração, a inibição da produção é maior em relação às culturas tratadas
somente com IFN-
γ, e é ainda maior quando tratadas com os dois estímulos. Temos,
107
Discussão
mais uma vez, uma fração inibindo a produção de IL-10 de uma forma mais eficaz que
o IFN-γ.
Para a quimiocina MCP-1, houve redução dos níveis desta quimiocina
somente nas culturas que foram estimuladas com IFN-γ e F3b e o mesmo ocorreu
quando as culturas foram infectadas com o fungo. Em relação ao GM-CSF, observamos
uma diminuição da produção deste fator de crescimento nas culturas de macrófagos
tratados com a fração F3b ou com a fração F3b mais IFN-γ, comparando-se com a
produção dos macrófagos não tratados com nenhum dos dois produtos. Quando
infectados com o fungo, houve uma diminuição em níveis semelhantes nos 3 diferentes
tratamentos, comparado-se ao grupo de macrófagos apenas infectado com o fungo.
Deste modo, a fração F3b parece ser capaz de inibir a síntese de GM-CSF.
A atividade de componentes lipídicas do P. brasiliensis ainda não foi
estudada, porém em outras infecções é rica a literatura demonstrando que frações
lipídicas de patógenos podem imunomodular a ação de macrófagos. Tachado et al.
(1996) e VIRIYAKOSOL et al. (2005) demonstraram que GPIs de P. falciparum e T.
brucei induzem a produção de TNF-α e ativam a iNOS em macrófagos primados com
IFN-γ, dados conformados em 2000 por Almeida et al. (2000), desta vez trabalhando
com GPIs de T. cruzi purificadas. Nossos dados estão de acordo com tal literatura
apenas em relação a indução da enzima iNOS, uma vez que vimos que as diversas
frações lipídicas do P. brasiliensis induzem a síntese de NO. Contudo, em relação à
síntese de citocinas, nossos lipídios inibiram sua síntese, com exceção à fração F2 que
estimulou a síntese da quimiocina MCP-1.
Daremos seqüência ao estudo das frações lipídicas do P. brasiliensis,
seguindo o modelo experimental do nosso laboratório. Pretendemos avaliar se os
108
Discussão
resultados obtidos com os macrófagos de animais susceptíveis à PCM (B10.A) são
semelhantes ou não com aqueles obtidos com macrófagos de animais resistentes a PCM
(A/J). Seria também interessante analisar o efeito das diferentes frações lipídicas do P.
brasiliensis na expressão de receptores de macrófagos que reconhecem padrões
moleculares de patógenos tais como o TLR-2, TLR-4, receptores de manose etc.
Na segunda etapa de nosso trabalho avaliamos o envolvimento do TLR-4 na
interação macrófago-P.brasiliensis. Cada vez mais vem sendo demonstrada a
importância dos receptores da família Toll-like no reconhecimento de diversos
patógenos. Os TLRs reconhecerem padrões moleculares de componentes biológicos
associados ou não à membrana de patógenos e conferem certa especificidade à
imunidade inata (HOFFMANN, 1999; ADEREM et al., 2000). Os diferentes TLRs
podem ter um diferente grau de importância no curso de uma infecção. Em infecções
fúngicas, por exemplo, o TLR-2 é essencial para a imunidade inata frente ao
Coccidiodes posadassi (VIRIYAKOSOL et al., 2004), por induzir a síntese de citocinas
pró-inflamatórias como IL-12, IL-6 e TNF-α por macrófagos peritoneais. Em outro
trabalho com Aspergillus fumigatus, os autores demonstraram que macrófagos
peritoneais de camundongos deficientes para o TLR-4 produzem menores níveis de
TNF-α, IL-1α e IL-1β, comparando-se com macrófagos provenientes de animais que
expressam o TLR-4 funcional, quando estimulados com conídeos do fungo (NETEA et
al., 2003).
Quando ocupados, os TLRs desencadeiam uma sinalização intracelular que
geralmente culmina com a ativação do macrófago e síntese de citocinas que estimulam a
síntese de compostos que venham eliminar o patógeno. VIRIYAKOSOL et al. (2004)
109
Discussão
relataram que a ativação de macrófagos peritoneais por Coccidioides posadassi é
dependente do TLR-2 e independente do TLR-4. Ao desafiar macrófagos de
camundongos TLR-2 KO com o fungo, observaram níveis menores de TNF-α e MIP-2
em comparação àqueles produzidos por macrófagos de animais que apresentam o
receptor funcional. Contudo, o mesmo desafio não resultou em diferenças na produção
destas citocinas quando macrófagos de animais TLR-4 KO foram comparados a
macrófagos de animais que apresentam o TLR-4 funcional.
Trabalhando com camundongos deficientes para TLR-4 (C3H/HeJ) e sua
linhagem selvagem (C3H/HePas) obtivemos resultados que sugerem a participação do
TLR-4 no reconhecimento e ativação de macrófagos peritoneais perante o P.
brasiliensis. A síntese de NO foi consideravelmente menor nas culturas de macrófagos
peritoneais de camundongos da linhagem C3H/HeJ em relação ao C3H/HePas. Este
comportamento repetiu-se tanto nas culturas tratadas somente com IFN-γ quanto nas
culturas infectadas com o fungo. Não era esperada uma concentração tão alta de NO nas
culturas não infectadas com fungo, uma vez que nesta cultura temos apenas um dos dois
sinais necessários para ativação do macrófago. Contudo, a alta concentração de IFN-γ
(20.000 pg./mL) utilizada ou uma possível contaminação por pequenas quantidades de
LPS (abaixo do limite de detecção do Limmulus assay, Sigma) no meio de cultura
podem ter contribuído para essa produção de NO. É conveniente ressaltar que nas
culturas tratadas com o fungo a quantidade de NO foi maior, conforme esperado.
Se macrófagos de camundongos deficientes para TLR4 têm menor
quantidade de receptores para o fungo em sua membrana e os mesmos produziram
níveis menores de NO em relação aos macrófagos de camundongos normais, pode-se
110
Discussão
sugerir que houve, no primeiro grupo, uma menor interação receptor-fungo e
consequentemente, estímulos menos eficientes para induzir a síntese de NO. Hoje
sabemos que TLRs não estão ligados diretamente com a síntese de NO, contudo, é
conhecida uma cooperação entre receptores de membrana de várias famílias, entre eles
os TLRs. Esta cooperação poderia ativar a atividade microbicida dos macrófagos, assim
como a síntese de NO.
Os dados de UFC e ensaio de fagocitose apóiam está hipótese. O número de
fungos recuperados foi consideravelmente menor nas culturas de macrófagos de
camundongos deficientes, assim como foi menor o numero de macrófagos com fungos
fagocitados e/ou aderidos. Mais uma vez, pode-se sugerir que houve uma menor
interação receptor-fungo devido a menor oferta de receptores na membrana e,
conseqüentemente, menor foi o número de fungos reconhecidos e fagocitados. Nas
culturas pré-ativadas com IFN-γ e infectadas com o fungo, o número de fungos
recuperados foi significativamente menor em relação às culturas tratadas somente com
IFN-γ. Estes dados sugerem que houve um aumento da atividade fungicida por parte dos
macrófagos, que pode ser explicada pela maior concentração de NO e eventualmente
alguma outra substância fungicida produzida pelos macrófagos. Este número menor de
fungos era esperado, pois os macrófagos estavam estimulados com os dois sinais
necessários para sua ativação.
Na PCM há trabalhos (CANO et al., 1998; GONZALEZ, et al., 2000) que
demonstram que o NO é molécula essencial e importante para a atividade fungicida de
macrófagos de camundongos. Nossos resultados parecem estar de acordo com estes
estudos. Porém, os níveis mais elevados de NO produzidos por macrófagos TLR-4
111
Discussão
normais não foram suficiente para conter o fungo, comparando-se aos macrófagos
deficientes, que produzem menos NO, mas apresentam um número de menor de fungos
recuperados. Este dado fala a favor da hipótese de que os macrófagos deficientes são
menos ativados e por isso fagocitam números menores de leveduras.
Como maiores níveis de NO não foram suficientes para conter o fungo, em
futuros experimentos, inibiremos a síntese deste gás e avaliaremos o comportamento
dos macrófagos de ambas as linhagens em relação ao número de UFC. Mais uma vez
fica evidenciado que mecanismos independentes de NO são capazes de controlar o
crescimento do P. brasiliensis. Em trabalho realizado em nosso laboratório
BERNARDINO (2005) demonstra que camundongos iNOS-KO apresentam doença
menos grave na segunda semana de infecção, comparando-se com camundongos que
expressam iNOS funcional. Temos então, outro trabalho que sugere outros mecanismos
capazes de controlar o fungo.
Os níveis de algumas das citocinas foram diferentes entre as duas linhagens
estudadas. A produção de IL-12 e MCP-1 foi ausente ou muito baixa no sobrenadante
das culturas de macrófagos de animais deficientes para o TLR-4, comparada à produção
das culturas de macrófagos que expressam o TLR-4 funcional.
A IL-12 é uma importante citocina na resposta imune inata, é capaz de
ativar células inflamatórias e induzir a produção de IFN-γ. É essencial na defesa contra
patógenos intracelulares (TRINCHIERI et al., 2003). Estudos in vivo realizados em
nosso laboratório demonstram que a IL-12 exerce uma função protetora na PCM; o
tratamento de animais susceptíveis com IL-12 recombinante leva a uma doença menos
grave, com síntese de níveis mais elevados de IFN-γ no inicio da infecção e produção de
112
Discussão
anticorpos específicos, assim como a produção de citocinas Th1 e Th2 em quantidades
menores em fases mais tardias da doença. Além disso, a IL-12 exógena foi capaz de
diminuir a carga fúngica nos órgãos de disseminação (fígado e baço). Em outro
trabalho, a depleção de IL-12 endógena por anticorpos monoclonais específicos levou a
uma doença mais grave tanto nos animais susceptíveis como nos animais resistentes. O
efeito protetor da IL-12 foi confirmado utilizando camundongos IL-12 KO, onde a
doença é extremamente grave e leva a morte precoce dos animais (DEEP et al., 2000;
MENDES-GIANINNI et al., 2000).
A menor produção de IL-12 e de MCP-1, quimiocina envolvida no
recrutamento de células mononucleadas para o local da infecção, aliada a maior síntese
de IL-10 (citocina desativadora de macrófagos) por animais TLR-4 deficientes, leva a
supor que talvez a presença destas citocinas possa ser associada a uma doença mais
grave. Entretanto, verificamos que houve maior recuperação de UFC de macrófagos
TLR-4 normais, sugerindo que a ativação por estas citocinas e a maior produção de NO
não foi suficiente para matar os fungos em co-cultivo com macrófagos in vitro. É bem
possível que existam outros mecanismos que controlem o número de fungos ou uma
outra hipótese é que a presença do TLR-4 possa culminar em ingestão de grande
número de fungos, comparado com a ingestão de fungos por macrófagos TLR-4
deficientes, hipótese esta corroborada pelo ensaio de fagocitose. Deste modo, mesmo
produzindo maiores quantidades de citocinas ativadoras e de NO, o macrófago do
animal TLR-4 normal não foi capaz de controlar o número de fungos ingeridos.
Os experimentos de UFC feitos a partir do macerado do pulmão em tempo
curto de infecção (48 horas) não estão de acordo com os dados obtidos in vitro, uma vez
113
Discussão
que não houve diferenças entre os fungos recuperados após 48 horas de infecção. Tal
discrepância poderia ser explicada pelo pequeno tempo de infecção. Hoje sabemos que
o fungo vive bem tanto no meio intracelular como no meio extracelular (BRUMMER,
1994); desta forma, o fungo não fagocitado, parece ter continuado viável no interior das
vias aéreas. Imaginamos que em 48 horas os fungos que não haviam aderido aos
macrófagos alveolares não haviam ainda sido expelidos e aí permaneceram. Quando
aumentamos o tempo de infecção para 96 horas, o número de fungos recuperados foi
maior nos pulmões dos animais C3H/HePas, confirmando assim os experimentos in
vitro.
Curiosamente, mesmo não havendo diferenças nos números de UFC
recuperados em 48 horas de infecção, as concentrações de NO encontradas no
homogenato de pulmão dos animais foram diferentes, os animais que apresentam o
TLR-4 funcional apresentaram maiores níveis de NO, semelhantes aos resultados
obtidos in vitro.
Em relação à síntese de citocinas, observamos que animais deficientes para
o TLR-4 produziram níveis mais baixos de citocinas pró-inflamatórias como TNF-α e a
IL-12, e também níveis menores de GM-CSF. Em relação à IL-12 os dados são
semelhantes aos resultados obtidos nos experimentos in vitro. A menor concentração
destes produtos no pulmão dos animais C3H/HeJ não levou a uma infecção mais grave,
o que pode ser explicado pelo curto tempo de infecção de infecção como já discutidos
anteriormente com os dados de UFC. Ao trabalhar com 96 horas de infecção a produção
de citocinas no pulmão apresentou-se de forma semelhante. Contudo, a produção de
GM-CSF foi oposta, sendo maior nos animais TLR-4 deficientes.
114
Discussão
Ao trabalhar com tempo longo de infecção (11 semanas), encontramos uma
doença menos grave nos animais deficientes para o TLR-4, que apresentaram uma carga
fúngica pulmonar consideravelmente menor que os animais TLR-4 normais. Estes
dados reproduzem os resultados de UFC obtidos em experimentos in vitro e em tempo
curto de infecção: um número menor de fungos foi recuperado de macrófagos de
animais TLR-4 deficientes. Mais uma vez, estes animais continuaram a produzir níveis
menores da citocina pró-inflamatória IL-12. Os níveis de TNF-α não foram dosados
neste experimento por problemas no padrão-recombinante. Assim, surge uma
divergência entre estes dados e os dados da literatura da PCM, onde, como já discutido,
níveis menores de IL-12 levam a uma doença mais grave, o oposto do que ocorre aqui.
Entretanto, como a ativação macrofágica depende do balanço de citocinas
ativadoras e não ativadoras é possível que tenha havido um desbalanceamento com
predomínio de TGF-β, por exemplo. Deve-se também considerar que números
diferentes de fungos levam a processos e intensidades diferentes de ativação celular.
Assim, a produção de IL-12 não somente reflete a maior capacidade de síntese dos
animais TLR-4 como também o maior estímulo mediado pela carga fúngica.
O IFN-γ apresentou-se em níveis em níveis significativamente maiores nos
animais TLR-4 deficientes (C3H/HeJ) associado a níveis menores de IL-12 e menor
carga fúngica. Assim, talvez o IFN-γ possa estar associado a mecanismos
imunoprotetores desenvolvidos pelos camundongos C3H/HeJ.
Trabalhos realizados em vários laboratórios (CANO et al., 1998; SOUTO et
al., 2000) demonstraram que o IFN-γ exerce papel protetor na PCM através do controle
da multiplicação de fungos por fagócitos. Esta citocina parece ser o principal mediador
115
Discussão
da resistência contra infecções causados pelo P. brasiliensis, e sua ação pode ser
exercida através da ativação da produção de NO. Além disso, o IFN-γ pode também
ativar e aumentar a atividade fungicida dos leucócitos PMN, que, entretanto, exercem
sua atividade através de radicais reativos do oxigênio (BRUMMER, 1994).
Os dados obtidos com a dosagem de anticorpo também indicam uma doença
menos grave nos animais que expressam o TLR-4 deficiente. Encontramos títulos
menores (IgG total e IgM) nos animais C3H/HeJ comparando-se com os animais
C3H/HePas. Este é mais um dado que está de acordo com os dados da literatura para a
paracoccidioidomicose, onde é relatado que a doença mais grave apresenta altos títulos
de anticorpos.
Estudos realizados por KASHINO et al. (1995) demonstraram que a resistência
ao P. brasilensis estava relacionada a níveis elevados de IFN-γ e IgG2a, e a
susceptibilidade associada a níveis elevados de IgG2b e IgA. Resultados semelhantes
aos nossos, onde encontramos também níveis elevados de IFN-γ associado à resistência
e níveis elevados de IgG2b associado à susceptibilidade.
Desta forma, nossos dados indicam que a presença do TLR-4 funcional leva a
uma infecção mais grave, associada com maior carga fúngica, concentrações maiores de
citocinas no homogenato do pulmão e a altos títulos de anticorpos séricos.
Surpreendentemente, estes dados não estão de acordo com as informações encontradas
na literatura, onde a presença dos TLRs levam a uma doença menos grave, geralmente,
pela produção de citocinas pró-inflamatórias que culminam com o aumento de
imunidade celular e produção de compostos que venham eliminar ou conter o parasita
(CAMPOS et al., 2004; BELOCCHIO et al., 2004; VIRIYAKOSOL et al., 2005;
116
Discussão
OLIVEIRA et al., 2004). A presença de TLRs associada a uma doença mais grave foi
demonstrado pelo por BELOCCHIO et al. (2004) do grupo da Dr. Luigina Romani. Ao
trabalhar com leveduras e hifas de Cândida albicans, estes autores demonstraram que a
presença do TLR-2 e do TLR-9 levou a uma doença mais grave, com níveis altos TNF-
α e de UFC nos animais que possuem os receptores funcionais, comprando-se com os
TLR-2 KO e TLR-9 KO.
Em conclusão, podemos demonstrar que frações lipídicas do P. brasiliensis
são capazes de ativar macrófagos com relação à produção de NO e regular a síntese de
algumas citocinas. A interação in vitro entre macrófagos e as frações F3a e F3b levou a
menor recuperação de fungos viáveis seja por aumento da atividade fungicida seja por
menor ingestão por bloqueio de receptores que reconhecem lipídeos, enquanto que as
frações F1 e F2 levaram a um comportamento oposto em relação ao controle do fungo,
quer seja por ativação da fagocitose quer seja por inibição dos mecanismos microbicidas
dos macrófagos.
Com relação à função do TLR-4 na paracoccidiodomicose nossos resultados
sugerem que o TLR-4 ao interagir com o P. brasiliensis leva à ativação do macrófago,
maior fagocitose e maior produção de IL-12 e NO. Contudo, estes mecanismos não são
suficientes para controlar o crescimento fúngico. Talvez a menor interação inicial que
ocorre nos animais TLR-4 deficientes permita uma maior estimulação da resposta T-
dependente, seja ela TCD4 (Th1) ou mediada por linfócitos TCD8 produtores de IFN-γ.
Ao contrário, a presença de TLR-4 permitiria uma maior interação com o P.
brasiliensis, inibição da imunidade celular e doença mais grave.
117
Discussão
Daremos seqüência ao estudo da função do TLR-4 na PCM; para tanto
pretendemos avaliar a influxo de células no pulmão em tempo curto de infecção;
faremos uma análise comparativa da histopatologia dos pulmões após 11 semanas de
infecção, assim como será imprescindível caracterizar o fenótipo e grau de ativação das
populações celulares infiltrantes no pulmão, como, por exemplo, linfócitos TCD4,
TCD8, B e macrófagos. Além disso, pretendemos avaliar se as frações lipídicas
utilizadas na primeira parte deste projeto, são capazes de ativar os macrófagos, quer seja
com a produção de NO quer seja pela produção de citocinas, através do TLR-4 e do
TLR-2 utilizando camundongos nocauteados para os genes destes receptores. Como em
nossos resultados observamos que as diversas frações lipídicas do P. brasiliensis são
capazes de ativar os macrófagos e os macrófagos são ativados via TLR, é possível que
as frações lipídicas estudadas sejam capazes de ligarem-se aos TLRs e ativar os
macrófagos.
118
Conclusões
1. Pudemos demonstrar que as diversas frações lipídicas do P. brasiliensis
são capazes de ativar macrófagos com relação à produção de NO e regular a síntese de
algumas citocinas. A interação in vitro entre macrófagos e as frações F3a e F3b levou a
menor recuperação de fungos viáveis seja por aumento da atividade fungicida seja por
menor ingestão devido ao bloqueio de receptores que reconhecem lipídeos, enquanto
que as frações F1 e F2 levaram a um comportamento oposto em relação ao controle do
fungo, quer seja por ativação da fagocitose quer seja por inibição dos mecanismos
microbicidas dos macrófagos.
2. Com relação à função do TLR-4 na paracoccidiodomicose nossos resultados
sugerem que o TLR-4 ao interagir com o P. brasiliensis leva à ativação do macrófago,
maior fagocitose e maior produção de IL-12, e NO. Contudo, estes mecanismos não
foram suficientes para controlar o crescimento fúngico. A infecção in vivo de
camundongos normais e deficientes para o TLR-4 indicaram que a presença do TLR-4
funcional leva a uma infecção mais grave, associada com maior carga fúngica,
concentrações maiores de citocinas no homogenato do pulmão e a altos títulos de
anticorpos séricos.
119
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