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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA VETERINÁRIA
CARACTERIZAÇÃO DA CALRETICULINA DO Rhipicephalus (Boophilus)
microplus (Acari: Ixodidae) NA INTERAÇÃO PARASITA HOSPEDEIRO
Dissertação de Mestrado
HERBERT RECH
Porto Alegre
2007
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE VETERINÁRIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA VETERINÁRIA
CARACTERIZAÇÃO DA CALRETICULINA DO Rhipicephalus (Boophilus)
microplus (Acari: Ixodidae) NA INTERAÇÃO PARASITA HOSPEDEIRO
Herbert Rech
Dissertação submetida ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências
Veterinárias, como requisito parcial
para obtenção do grau de Mestre em
Ciências Veterinárias.
Orientador: Dr. Itabajara da Silva Vaz Jr.
Porto Alegre
Fevereiro, 2007.
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Este trabalho foi realizado no Laboratório de
Imunologia Aplicada à Sanidade Animal do
Centro de Biotecnologia do Estado do Rio
Grande do Sul - UFRGS, com apoio
financeiro do CNPq, PRONEX, FINEP,
CAPES e FAPERGS.
DEDICATÓRIA
A minha família por me dar quando necessário o que ninguém pode comprar,
Amor e carinho!
A porta da verdade estava aberta,
Mas só deixava passar
Meia pessoa de cada vez.
Assim não era possível atingir toda a verdade,
Porque a meia pessoa que entrava
Só trazia o perfil de meia verdade.
E sua segunda metade
Voltava igualmente com meio perfil.
E os meios perfis não coincidiam.
Arrebentaram a porta. Derrubaram a porta.
Chegaram ao lugar luminoso
Onde a verdade esplendia seus fogos.
Era dividida em metades
Diferentes uma das outras.
Chegou-se a discutir qual a metade mais bela.
Nenhuma das duas era totalmente bela.
E carecia optar. Cada um optou conforme
Seu capricho, sua ilusão, sua miopia.
(Carlos Drummond de Andrade)
AGRADECIMENTOS
Ao Dr. Itabajara da Silva Vaz Jr, por orientar e mostrar os caminhos do
aprendizado.
A Dra. Sandra Estrazula Farias, Dra. Aoi Masuda, Dr. Carlos Alexandre e Dr.
Carlos Termignoni, pela colaboração e pelos conhecimentos repassados.
A minha “mana” Malu pelo carinho, amizade, alegria e incentivo diário, enfim por
tudo que enfrentamos juntos.
Aos colegas do Laboratório de Imunologia Aplicada à Sanidade Animal e outros
laboratórios: Fernanda Klein (a Fê), Carolina, Leonara, Paula, Josiane, Caroline, Luiz
Fernando, Roberta, Juliana, Dani, Alexandre, Filipe, Raquel, Andréia, Juliana Ceolatto,
Adriana Seixas, Andréia Estrela, Antônio Pinto e Renata Terra, Daniel, Alexandre
Heimmer, Kiyoko, Letícia, Ana Paula, Matheus, Gabriel, Maurício, Isis Abel e Pedro entre
outros; obrigado pelo convívio e cooperação.
Agradeço a todos os colegas dos diferentes laboratórios que participaram nos
experimentos de infestação. E aos colegas de outros laboratórios do Centro de
Biotecnologia.
A Universidade Federal do Rio Grande do Sul e Faculdade de Veterinária.
ÍNDICE
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES................................... 8
RESUMO................................................................................................................... 9
ABSTRACT ............................................................................................................ 10
INTRODUÇÃO....................................................................................................... 11
Carrapato Riphicephalus (Boophilus) microplus..................................................... 11
Ciclo de vida........................................................................................................ 12
Métodos de controle ............................................................................................ 13
Controle químico ............................................................................................. 13
Controle biológico ........................................................................................... 14
Controle imunológico...................................................................................... 16
A proteína calreticulina ........................................................................................... 20
OBJETIVOS............................................................................................................ 23
Objetivos Gerais ...................................................................................................... 23
Objetivos Específicos .............................................................................................. 23
MATERIAIS E MÉTODOS.................................................................................... 24
Análise Filogenética das seqüências de CRT.......................................................... 24
Predição de epítopos com potencial antigênico e sítios de ligação a C1q............... 24
Expressão da rBmCRT ............................................................................................ 25
Purificação da rBmCRT e rHlCRT ......................................................................... 25
SDS-PAGE, Western e Dot blot.............................................................................. 26
Imunização de camundongos................................................................................... 26
Análise de antigenicidade da rBmCRT 400 e rBmCRT 500................................... 27
Imunização e desafio dos bovinos........................................................................... 27
Hipersensibilidade cutânea em bovinos .................................................................. 28
Análise da antigenicidade da rBmCRT e rHlCRT com soros de bovinos infestados
e vacinados .......................................................................................................................... 28
Identificação de CRT em extrato de larvas ............................................................. 28
Titulação por ELISA das IgGs anti-CRT dos soros bovinos................................... 29
ELISA de competição dos soros bovinos................................................................ 29
Inibição da coagulação ............................................................................................ 30
7
Atividade da trombina sobre o substrato S2238 após adição de rBmCRT e
rHlCRT ............................................................................................................................ 30
Efeito da rBmCRT ou rHlCRT na atividade da trombina sobre o fibrinogênio.. 30
Influência da rBmCRT sobre o tempo de recalcificação plasmática................... 30
Influência da rBmCRT e rHlCRT sobre o tempo de protrombina ...................... 31
Análises estatísticas................................................................................................. 31
RESULTADOS ....................................................................................................... 32
Análise Filogênica das seqüências de CRT............................................................. 32
Predição dos sítios de ligação de C1q em seqüências de CRT................................ 33
Estrutura 3D das CRT.............................................................................................. 33
Epitopos antigênicos da rBmCRT e rHlCRT .......................................................... 33
Expressão e purificação da rBmCRT ...................................................................... 37
Imunogenicidade da BmCRT em camundongos..................................................... 39
Imunogenicidade da rBmCRT e rHlCRT................................................................ 40
ELISA de competição dos soros bovinos................................................................ 43
Hipersensibilidade cutânea em bovinos .................................................................. 43
Inibição da coagulação ............................................................................................ 44
Tempo de recalcificação plasmática.................................................................... 44
DISCUSSÃO........................................................................................................... 46
CONCLUSÕES....................................................................................................... 54
PERSPECTIVAS..................................................................................................... 55
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .................................................................... 56
LISTA DE ABREVIATURAS, SÍMBOLOS E UNIDADES
ºC graus Celsius
h hora
min minuto
s segundo
g grama
mg miligrama
μg micrograma
ng nanograma
l litro
ml mililitro
μl microlitro
kDa quilodalton = 1000 dalton
M molar
mM milimolar
μM micromolar
nM nanomolar
nm nanômetro
g gravidade
MHz megahertz
qsp quantidade suficiente para
BCIP 5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato
NBT tretazolio nitroazul
OPD o-phenilenediamino
rBmCRT Calreticulina de Rhipicephalus (Boophilus) microplus recombinante
rHlCRT Calreticulina de Haemaphysalis longicornis recombinante
HuCRT Calreticulina humana
DNA ácido desoxirribonucléico
ELISA ensaio imunoabsorvente de ligação enzimática
IgG imunoglobulina G
IPTG isopropionil-B-D-tiogalactopiranosídio
LPS lipopolissacarídeo
PAGE eletroforese com gel de poliacrilamida
SDS dodecilsulfato de sódio
PBS solução salina tamponada com fosfato
PBMC células mononucleares do sangue periférico
RESUMO
O carrapato Riphicephalus (Boophilus) microplus é um ectoparasito hematófago
que infesta os rebanhos bovinos de regiões tropicais e subtropicais, causando grandes
prejuízos à pecuária. O principal método de controle baseia-se nos acaricidas. No entanto,
o uso de vacinas tem sido estudado como um método de controle alternativo. A
calreticulina (CRT) é uma proteína multifuncional presente em quase todas as células de
animais. A secreção da CRT durante a alimentação pode estar relacionada a modulação da
interação parasita hospedeiro. No presente estudo, as CRTs de R. microplus (rBmCRT) e
do Haemophisalis longicornis (rHlCRT) foram expressas em Escherichia coli e purificadas
por cromatografia. As propriedades imunogênicas e antigênicas da BmCRT e HlCRT
foram analisadas por diferentes métodos. In silico, foram comparandos os epítopos das
CRTs pelo índice de Jamerson-Wolf, que mostrou 6 regiões com potenciais epítopos
antigênicos diferentes entre as CRTs. Enquanto, a análise in silico, da rBmCRT e rHlCRT
mostraram 6 regiões que podem interagir com a proteína C1q. In vitro, por Western blot, a
rBmCRT, mas não a rHlCRT, foi reconhecida pelo soro de bovino infestado
experimentalmente com R. microplus. Em Western blot de extrato de larvas, os soros do
coelho imunizado com rBmCRT e bovinos imunizados com rBmCRT ou rHlCRT
reconheceram a BmCRT, sugerindo que os anticorpos direcionados às proteínas
recombinantes também reconhecem a proteína nativa BmCRT. Também a rBmCRT
mostrou um efeito anticoagulante no teste de recalcificação plasmática. In vivo, a rBmCRT
e rHlCRT induziram reações de hipersensibilidade cutânea imediata em bovinos
imunizados com rBmCRT ou rHlCRT, mas não foi possível detectar alterações na análise
histopatológica. Juntos, estes resultados sugerem, que a rBmCRT e rHlCRT são
imunogênicas e pode ter funções imunomoduladoras sobre o sistema imune do hospedeiro,
mas não suficiente para prevenir o desenvolvimento da imunidade humoral.
Palavras-chave: Rhipicephalus (Boophilus) microplus, rBmCRT, rHlCRT,
anticoagulante, sistema complemento, carrapato, bovinos.
ABSTRACT
The tick Riphicephalus (Boophilus) microplus is a blood-sucking ectoparasite of
bovines from tropical and subtropical regions, causing serious damages to the livestock
production. The main method of control is based on the acaricides. However, the use of
vaccines has been studied as a promising control method. The calretirulin (CRT) is a
multifunctional protein present in almost all cells of animals. The secretion of CRT during
feeding might be linked to the modulation of the parasite-host interaction. In the present
study, recombinant CRTs of R. microplus (rBmCRT) and of Haemaphysalis longicornis
(rHlCRT) were expressed in Escherichia coli and purified by ion exchange
chromatography. The immunogenic and antigenic capacities of BmCRT e HlCRT were
analyzed by different methods. In silico, were comparisons of the CRTs epitopes,
identified by Jameson-Wolf antigenic index, indicates that there are three different regions
between the tick CRTs. While, in silico analysis showed 6 regions in rBmCRT and in
rHlCRT that could interact with C1q protein. In vitro, by Western blot, rBmCRT, but not
rHlCRT, was recognized by the serum of bovine experimentally infested with R.
microplus. In Western blot with extracts of larvae, the sera of a rabbit immunized with
rBmCRT and bovines immunized with rBmCRT or rHlCRT recognized BmCRT; this
suggests that antibodies directed to recombinant proteins also recognize native BmCRT.
Also, the rBmCRT showed an anticoagulant effect in recalcification time. In vivo, the
rBmCRT and rHlCRT induced reactions of immediate cutaneous hypersensitivity in
bovines immunized with rBmCRT and rHlCRT, but it was not possible to detect alterations
in histopathologic test. Together, these results suggest that the rBmCRT and rHlCRT are
immunogenic and could have immunomodulatory functions on the immunity system of the
host, but not enough to prevent the development of humoral immunity.
Keywords: Rhipicephalus (Boophilus) microplus, rBmCRT, rHlCRT,
anticoagulant, complement system, tick, bovine.
INTRODUÇÃO
Carrapato Riphicephalus (Boophilus) microplus
O Boophilus microplus (CANESTRINI, 1887), popularmente conhecido no Brasil
como carrapato do boi ou carrapato sul americano do boi, é um ectoparasito hematófago
originário da Ásia que parasita praticamente somente bovinos. É esporadicamente
encontrado em outras espécies. Atualmente classificado como Rhipicephalus (Boophilus)
microplus (HORAK, et al 2002), este carrapato pertence ao filo Arthropoda, classe
Arachnida, ordem Acari, Sub-ordem Ixodida e família Ixodidae, conhecida como família
dos carrapatos duros. Os membros da ordem Acari diferem de outros aracnídeos, não tendo
o corpo segmentado, peças bucais modificadas e as larvas tendo três pares de patas,
enquanto as ninfas e adultos tem quatros pares (URQUHART et al., 1998; IACET, 2006).
O R. microplus é um dos principais parasitos que afetam a pecuária entre os paralelos 32
o
N
e 32
o
S, abrangendo os rebanhos da América, África, Ásia e Oceania (JOHNSTON et al.,
1986). O parasitismo causado pelo carrapato bovino acarreta significativo dano econômico
à pecuária bovina (HORN & ARTECHE, 1985), causando grandes perdas na produção de
leite e carne (SUTHERST et al., 1983), danos ao couro causados pelas lesões e reações
inflamatórias nos pontos de fixação do carrapato (SEIFERT et al., 1968), além de ser vetor
de protozoários do gênero Babesia e da riquétsia Anaplasma marginale (McCOSKER,
1981; YOUNG & MORZARIA, 1986). Estima-se que, anualmente, as perdas decorrentes
da infestação pelo R. microplus cheguem a 1 bilhão de dólares americanos no Brasil
(GOMES, 2000). Estudos recentes indicam a possibilidade de estimar a infestação de
carrapatos e atribuir seu efeito, sugerindo que cada carrapato ingurgitado seja responsável
por perdas de mais de um grama de peso vivo (JONNSON, 2006).
Atualmente o Brasil é um dos maiores produtores de carne bovina do mundo,
possui um rebanho bovino de aproximadamente 200 milhões de cabeças, sendo o sétimo
maior produtor mundial de leite, com 23.320 toneladas em 2005 e exportando
aproximadamente 2,1 bilhões de dólares em carne no primeiro semestre de 2006
(EMBRAPA, 2006; CNPC, 2006). Neste contexto, o controle do carrapato bovino é
fundamental para a manutenção da sanidade do rebanho nacional e o desenvolvimento da
bovinocultura.
12
Ciclo de vida
As teleóginas (fêmeas completamente ingurgitadas) ao desprenderem-se do
hospedeiro caem ao solo, dando início à fase de vida livre que pode variar
aproximadamente 20 dias, quando há boas condições climáticas, até vários meses em
condições adversas de temperatura e umidade. As teleóginas possuem geotropismo
positivo e buscam abrigo no solo e vegetação para iniciar o processo de postura, logo após
o período de pré-postura que, em temperatura ideal, dura de 2 a 3 dias podendo se estender
por muitos dias em épocas de frio. A ovoposição pode chegar a 3.000 ovos/teleógina, em
temperatura de 27 ºC e umidade superior a 70% que são condições ideais para o
desenvolvimento do R. microplus (GONZALES, 1995). Nestas condições, o período de
postura dura aproximadamente de 12 a 15 dias. Aproximadamente sete dias após o final da
postura, inicia-se a eclosão dos ovos, que dura em torno de 5 dias. Após um período de
aproximadamente 7 dias as neolarvas transformam-se em larvas infestantes, aptas a iniciar
a fase de vida parasitária. Em baixas temperaturas as larvas podem sobreviver por vários
meses, mas a capacidade infestante restringe-se aos primeiros 90 dias (GONZALES,
1995).
No início da fase de vida parasitária, a larva infestante se fixa no hospedeiro e esta
fase de vida parasitária dura em média 21 dias. As larvas migram para determinadas
regiões corporais, como a região posterior das coxas e as regiões perianal e perivulvar, as
quais são mais propícias para o seu desenvolvimento em virtude da espessura,
vascularização e temperatura da pele, bem como pela dificuldade de autolimpeza do
hospedeiro (WAGLAND, 1978; CORDOVÉS, 1996). Durante a fase parasitária, o
carrapato passa por vários instares até atingir a fase adulta. Os instares e seus respectivos
períodos de duração são: larva a metalarva (4 dias, em média); metalarva à ninfa (4 dias);
ninfa a metaninfa (3 dias); a partir desta etapa ocorre à diferenciação sexual; metaninfa a
neandro (3 dias) e gonandro (1-2 dias) – macho adulto; metaninfa a neógina (4 dias);
neógina a partenógina (3 dias) e partenógina a teleógina (3-4 dias) – fêmea adulta
(GONZALES, 1995).
13
Métodos de controle
Controle químico
Ao longo do tempo foram utilizados, seqüencialmente, acaricidas baseados em
compostos arsenicais, organoclorados, organofosforados, carbamatos, formamidinas,
piretróides e avermectinas (GEORGE et al., 2004). Os acaricidas químicos, se
corretamente aplicados, são eficientes e de custo efetivo, no entanto, freqüentemente são
utilizados incorretamente, selecionando populações de carrapatos resistentes aos princípios
ativos utilizados e causando acúmulo de resíduos em alimentos (WILLADSEN, 2006).
Com a finalidade de determinar o melhor momento de aplicação dos acaricidas em Bos
indicus e seus cruzamentos JONSSON, (2006) utilizaram a fórmula n = C x 10
3
/Pdkt,
desenvolvida por SUTHERST et al., (1983) onde “n” é o menor número de carrapatos que
a aplicação de acaricida é viável, “C” o custo de aplicação do acaricida por cabeça ($), “P”
o preço do boi vivo ($), “d” a perda (g) de peso vivo por carrapato ingurgitado, “k” a
proporção de carrapatos mortos a cada banho e “t” é o número médio em dias que o
carrapato parasita o hospedeiro (21 dias para R. microplus). Foi determinado que acima de
100 carrapatos é a quantidade mais econômica de carrapatos parasitando um bovino para
realização de banho com acaricida. No entanto, o uso freqüente e disseminado de
acaricidas também favorece a seleção de populações de carrapatos resistentes
(RODRIGUEZ-VIVAS, 2006). Na década de 30, foram descritos os primeiros casos de
resistência aos compostos arsenicais. A partir disso, novos casos de resistência, para as
diferentes drogas introduzidas, foram descritos ao longo do século XX (SEDDON, 1967;
WHARTON et al., 1980; MARTINS et al., 2001; GEORGE et al., 2004). O R. microplus
pode apresentar resistência mais rapidamente que outros carrapatos, presumivelmente, pelo
menor período de tempo entre as gerações (KOCAN, 1995). Novos acaricidas, como os
inibidores de desenvolvimento fluazuron e fipronil, estão sendo avaliados para serem
utilizados contra carrapatos, não sendo detectado nenhum caso relevante de resistência até
o momento (SABATINI et al., 2001; GEORGE et al., 2004).
14
Controle biológico
No campo, o R. microplus encontra inúmeras adversidades, que o dificultam ou
impedem de completar o ciclo biológico. O estudo dos inimigos naturais dos carrapatos
amplia as alternativas de utilização de métodos de controle individual ou associado. Várias
formas de controle podem ser citadas como a garça vaqueira Egretta ibis (ALVES-
BRANCO et al., 1983) e as formigas que podem reduzir o nível de infestação em uma
determinada área (GONZALES, 1995), além de alternativas como a seleção de raças
menos sensíveis ao carrapato (JONSSON, 2006), o manejo do rebanho (WHARTON et al.,
1980), a rotação de pastagens (ELDER et al., 1980), o cultivo de forrageiras que dificultam
o desenvolvimento das fases livres do carrapato (SUTHERST et al., 1982; FARIAS et al.,
1986; BASSO et al, 2005) e as condições climáticas (SUTHERST, et al., 2006)
influenciam no ciclo de desenvolvimento dos carrapatos.
O tipo de vegetação é um dos fatores capazes de influenciar o ciclo do carrapato,
pastagens nativas com vegetação arbustiva proporcionam abrigo para as teleóginas em
postura, enquanto que algumas pastagens, por serem tóxicas, repelentes ou por
imobilizarem as larvas através de secreções ou estruturas da planta, podem limitar bastante
o número de carrapatos. Em especial, o plantio de gramíneas do gênero Stylosanthes
(SUTHERST et al., 1982) e do capim gordura (Melinis minutiflora) (FARIAS et al., 1986)
podem contribuir consideravelmente para o controle do carrapato. Estudos demonstraram
que M. minutiflora, S. scabra e S. viscosa possuem ação repelente e podem causar a morte
de larvas do carrapato (FARIAS et al., 1986). A rotação de pastagens é outra prática de
manejo que comprovadamente reduz o nível de infestação pelo R. microplus,
especialmente nas épocas de pico parasitário (ELDER et al., 1980, NORTON et al., 1983).
Vários patógenos tem sido estudados no controle biológico de pestes, SAMISH et
al. (2004) relataram a existência de 96 formulações baseadas em microorganismos. Porém,
apenas algumas espécies foram avaliadas contra carrapatos, sendo que os fungos
Metarhizium anisopliae e Beauveria bassiana tem sido os mais estudados e parecem os
mais promissores (SAMISH et al., 2004). O M. anisopliae, um deuteromiceto
entomopatogênico, é altamente patogênico para carrapatos Ixodes scapularis (ZHIOUA et
al., 1997) e R. microplus (FRAZZON et al., 2000). No Brasil, já foram encontrados
isolados de M. anisopliae infectando naturalmente o R. microplus (DA COSTA et al.,
15
2002). Avaliação in vitro de 12 isolados de M. anisopliae sobre fêmeas ingurgitadas de R.
microplus mostraram que existem isolados mais patogênicos e que podem causar morte de
até 100% dos carrapatos infectados in vitro, dependendo da concentração de esporos na
suspensão utilizada (FRAZZON et al., 2000). Outros estudos demonstraram que os fungos
B. bassiana e M. anisopliae induziram uma taxa de mortalidade de aproximadamente 30%
em Rhipicephalus appendiculatus adultos alimentados em coelhos, enquanto que M.
anisopliae induziu mortalidade de 37% em Amblyomma variegatum adultos. É interessante
ressaltar que estes fungos não perdem sua capacidade de infecção sobre o carrapato quando
são incubados com acaricida por mais de 5 dias, mantendo o crescimento e suas
características morfológicas normais (KAAYA et al., 1996, BAHIENSE, 2006). BASSO et
al. (2005) avaliaram o efeito de M. anisopliae na população de B. microplus e a influência
das pastagens Brachiaria brizantha e Tifton 85 (Cynodon spp.) nessa interação,
evidenciando menor número de larvas no Tifton, indicando que o tipo de pastagem
favoreceu a ação do fungo. Esse resultado demonstra que a associação de medidas de
controle pode potencializar o resultado do controle biológico. Bactérias, como Escherichia
coli, Cedecea lapagei e Enterobacter agglomerans são naturalmente encontradas no
aparelho reprodutor feminino do carrapato e também têm sido estudadas no controle
biológico. Existem relatos de uma diminuição de até 47% na ovoposição quando teleóginas
de R. microplus foram submersas em suspensão de C. lapagei (BRUM, 1988). Outros
organismos parasitas, tais como nematódeos, tem sido também avaliados como ferramentas
no controle biológico de carrapatos, já que têm se mostrado eficientes no controle de
insetos (SAMISH et al., 2001).
Outra estratégia envolvendo controle biológico é a utilização de compostos naturais
como pesticidas. DAVEY et al. (2001) testaram em bovinos diferentes concentrações de
“spinosad”, um acaricida natural de Sacharopolyspora spinosa (actinomiceto), obtendo
uma drástica redução no número de fêmeas ingurgitadas, na massa de ovos e no índice de
fecundidade do R. microplus. O extrato de Sapindus saponaria, uma árvore rica em
saponinas e encontrada nos EUA, México, Argentina e Brasil, foi testado in vitro contra
larvas de R. microplus, demonstrando excelente ação larvicida (FERNANDES et al.,
2005). Resultado semelhante foi obtido com óleo essencial extraído de 3 espécies de
Eucalyptus (CHAGAS et al., 2002). A utilização de ferormônios para captura e controle
16
dos carrapatos apresenta alguns resultados promissores, mas ainda precisam ser melhor
estudados (SONENSHINE, 2004).
Controle imunológico
São reconhecidas as condições de resistência imune ao carrapato em bovinos e que
sua origem não é inata, e sim adquirida durante as sucessivas infestações pelo parasita
(ALLEN, 1994). A diferença na habilidade do B. taurus e B. indicus em desenvolver
imunidade protetora naturalmente adquirida foi reconhecida em 1918 por JOHNSTON &
BRANCOFT que publicaram o primeiro artigo que relata o fenômeno (BROWN, 1988). A
imunidade é observada após a primeira infestação por carrapatos e mediada por dois tipos
de respostas imunológicas: a resposta inata e a resposta adquirida (WIKEL et al., 1997),
que envolvem células apresentadoras de antígenos, citocinas, anticorpos, linfócitos B e T,
granulócitos, entre outras células e moléculas (WIKEL, 1996). Os primeiros trabalhos de
controle de carrapatos pelo sistema imunológico foram fundamentados pela transferência
passiva de imunidade de animais resistentes para animais suscetíveis. Apesar do limitado
grau de proteção, ROBERTS et al., (1976) demonstraram transferência passiva de
imunidade através da transferência de soro de bovinos resistentes ao R. microplus para
bovinos sensíveis, confirmando o envolvimento de anticorpos na resistência adquirida.
WIKEL & ALLEN, (1976) demonstraram a importância dos linfócitos na resposta
adquirida contra Dermacentor andersoni, através da transferência de células de linfonodos
de cobaias resistentes para suscetíveis. Bovinos infestados naturalmente com carrapatos
desenvolvem linfócitos T e B de memória, que permitem uma resposta mais eficiente em
futuras infestações (WIKEL, 1996). Apesar da importância dos linfócitos T na indução e
manutenção de uma resposta eficaz ser bem definida, ainda não foi elucidado qual a
importância de cada tipo de resposta (celular ou humoral) para a proteção contra o
carrapato (WIKEL et al., 1997; WILLADSEN, 2004; RUIZ, et al., 2006). Acredita-se que
a resistência imunológica ao carrapato seja pela ação de anticorpos, complemento ou
reações de hipersensibilidade (VALENZUELA, 2004).
As células inflamatórias liberam histamina que inibem a salivação do carrapato e
sua alimentação (PAINE, 1983). MUKAI et al., (2002) induziram hipersensibilidade
cutânea imediata administrando extrato de ninfas não alimentadas em cães infestados
repetidas vezes, sugerindo que em cães a imunidade celular é um importante mecanismo de
17
resistência aos carrapatos. No entanto, reações celulares nos locais de fixação do carrapato
variam entre indivíduos susceptíveis e resistentes (WIKEL, 1996).
A avaliação do padrão de resposta humoral em bovinos parcialmente resistentes
(raças zebuínas) e suscetíveis (raças européias) à infestação por R. microplus foi
determinada por KASHINO et al. (2005), encontrando maiores níveis de IgG anti-saliva
em animais da raça Nelore (zebuínos) comparado a bovinos da raça Holandesa e Abeerden
(européias).
A administração de imunossupressores inibe a resistência a carrapatos tornando os
indivíduos susceptíveis (WIKEL et al., 1976b; WILLADSEN, 2004). Ao longo da
evolução, os carrapatos desenvolveram maneiras de suprimir ou evadir as respostas imunes
do hospedeiro. Um exemplo dessa adaptação é a saliva dos artrópodes hematófagos, que
contém moléculas anti-hemostáticas, vasodilatadoras, antiinflamatórias e
imunomoduladoras, que facilitam o processo de alimentação e transmissão de patógenos
(RIBEIRO, 1989; NUTTALL et al., 2004). Essa imunomodulação é particularmente
importante para os carrapatos, inclusive o R. microplus, que permanece se alimentando em
um único hospedeiro por vários dias (WIKEL et al., 1997). O R. microplus consegue inibir
a resposta humoral, a ativação do sistema complemento, a proliferação de linfócitos T,
produção de citocinas e mediadores químicos como histamina e serotonina
(VALENZUELA, 2004; BROSSARD et al., 2004).
Apesar das substâncias imunomoduladoras do carrapato o bovino adquire
resistência através da produção de anticorpos contra substâncias da saliva do carrapato
(KASHINO et al., 2005). Segundo WILLADSEN (1987), o repertório de antígenos em
potencial, ou seja, moléculas do parasita que possam ser encontradas pelo sistema imune
do hospedeiro durante a alimentação é bastante limitado, enquanto que a variedade de
moléculas do parasita que é exposta aos componentes do sangue do hospedeiro durante a
ingurgitação é grande. Surgindo assim o conceito de “antígenos ocultos”, ou seja, aqueles
que nunca são diretamente expostos ao sistema imune do hospedeiro durante uma
infestação por carrapatos. A utilização de "antígenos ocultos" sugere que possam aumentar
a resposta protetora, tendo em vista que são moléculas desconhecidas do sistema imune do
hospedeiro e portanto os parasitas não desenvolveram mecanismos de evasão para a
resposta imune. No entanto, há necessidade de revacinação para manutenção da proteção,
porque na infestação natural não ocorre o estímulo do sistema imune do hospedeiro
18
(WILLADSEN, 2004). A identificação da glicoproteína Bm86 (antígeno oculto), isolada
de intestino no R. microplus por WILLADSEN et al., (1988) estimulou a pesquisa de
outras proteínas capazes de induzir resposta imunológica em bovinos imunizados.
Baseados neste antígeno, duas vacinas comerciais foram lançadas no mercado: a
“TickGard”, desenvolvida na Austrália pela Divisão de Ciências Animais Tropicais do
CSIRO, e a “Gavac” desenvolvida no Centro de Engenharia Genética e Biotecnologia de
Cuba. As duas vacinas são produzidas em sistema heterólogo, porém, a proteína da
TickGard é obtida em E. coli e a da Gavac em Pichia pastoris. Embora essas vacinas
estejam comercialmente disponíveis, elas não asseguram o grau de proteção necessário
para suprimir o uso de acaricidas (WILLADSEN et al., 1996, JONSSON et al., 2000).
Portanto, novos antígenos continuam sendo estudados como o antígeno oculto denominado
Bm91, identificado pelo grupo Australiano, que em associação com a Bm86 aumenta a
eficácia da vacinação (RIDING et al., 1994, WILLADSEN et al.,1996). Resultados de
proteção parcialmente efetiva com diferentes antígenos geraram confiança sobre a
viabilidade técnica de desenvolvimento de uma vacina. Todavia, mesmo diante do
lançamento no mercado de vacinas contra carrapato é consenso a necessidade da busca de
novos antígenos ocultos e naturalmente expostos ao sistema imune do hospedeiro para
aprimorar a eficiência da imunização.
LOGULLO et al. (1998) purificaram um precursor de proteinase aspártica de R.
microplus, a BYC (Boophilus Yolk Cathepsin). Esse antígeno demonstrou degradação da
vitelina durante a embriogênese. Experimentos de inoculação de anticorpos monoclonais
anti-BYC em teleóginas, no inicio da postura, demonstraram redução no peso de ovos e na
sobrevivência das teleóginas durante a postura (DA SILVA VAZ Jr. I., et al., 1998). Além
disso, bovinos imunizados com BYC recombinante e desafiados com 20.000 larvas de
carrapatos apresentaram proteção global de 25,24% (LEAL, et al., 2006). Esta proteção
parcial obtida com a BYC recombinante foi similar aos descritos com a BYC nativa (da
SILVA VAZ Jr., et al., 1998).
As pesquisas estão voltadas à descoberta de novos antígenos que possam compor
uma vacina anticarrapatos. Para isso, são investigadas diversas moléculas envolvidas em
vias metabólicas importantes para a sobrevivência dos parasitas. Para exemplificar
descreveremos alguns antígenos com potencial vacinal:
19
Uma Glutationa S-transferase (GST) foi isolada de larvas (HE et al., 1999) e de
glândula salivar de R. microplus (ROSA DE LIMA et al., 2002). Altos níveis de expressão
de GST têm sido relacionados à resistência a inseticidas em vários organismos
(KAWALEK et al., 1984), além de estar associada a reações alérgicas mediadas por IgE
(O’NEILL et al., 1994). O aumento da expressão de GST é altamente correlacionado com
resistência, particularmente a compostos organofosforados (WEI et al., 2001). Embora,
ainda não tenha sido comprovado correlação entre expressão de GST em R. microplus e a
resistência frente aos acaricidas, DA SILVA VAZ JR, I. et al., (2004) descreveram o efeito
de alguns acaricidas sobre a atividade enzimática de GST.
BRAZ et al. (1999), demonstraram que o R. microplus não sintetiza heme, obtendo
o heme necessário para o seu desenvolvimento da hemoglobina do hospedeiro. O carrapato
bovino desenvolveu, ao longo da sua evolução, mecanismos para obtenção e reciclagem de
heme. A THAP (Tick Heme-binding Aspartic proteinase) foi à primeira enzima descrita
com a capacidade de ligar heme e ter sua atividade regulada por esta molécula. Existem
indícios que o substrato natural dessa proteína é a vitelina, que no caso do carrapato é uma
hemeproteína. Experimentos in vitro para mensurar a capacidade de ligação de heme à
vitelina, demonstraram que cada molécula de vitelina é capaz de ligar até 31 moléculas de
heme, impedindo a formação de radiais livres (LOGULLO et al., 2002).
Uma cisteíno endopeptidase degradadora de vitelina (VTDCE) foi purificada e
caracterizada a partir de ovos de R. microplus (SEIXAS et al., 2003). Essa enzima é
naturalmente associada à vitelina, sendo ativada por acidificação. Foi demonstrado
atividade em larvas não alimentadas, ovários e ovos de fêmeas ingurgitadas, sugerindo um
papel na embriogênese do carrapato bovino (SEIXAS et al., 2003). Assim como a BYC, o
envolvimento na embriogênese associado à capacidade imunogênica faz dessa cisteíno
endopeptidase um antígeno potencial, que poderia ser utilizado em associação com a BYC
(SEIXAS et al., 2003).
Outras proteínas com potencial vacinal podem ser descobertas, com maior
facilidade, com o seqüenciamento do genoma do R. microplus (ULLMANN et al., 2005;
GUERREIRO et al., 2006). Os estudos realizados, até o momento, para confecção de uma
vacina contra carrapatos não possibilitam substituir totalmente o uso de acaricidas, sendo
indispensável a identificação de novos antígenos para obter uma vacina eficiente contra R.
microplus.
20
A proteína calreticulina
A calreticulina (CRT) é uma proteína secretada na saliva do carrapato que se liga a
cálcio. Foi primeiramente localizada no retículo endoplasmático de músculo esquelético
(OSTWALD et al., 1974), depois sendo identificada em um grande número de espécies e
em todas as células nucleadas de mamíferos, demonstrando sua participação em uma ampla
gama de funções celulares (MICHALAK et al., 1999). Em SDS-PAGE, a CRT apresenta
massa molecular de aproximadamente 55 kDa (OSTWALD, 1974), devido à migração
anômala causada pelo domínio C que é altamente ácido. No entanto, a massa molecular
predita através da seqüência de cDNA é de 46 kDa para a CRT madura de R. microplus
(FERREIRA et al., 2002).
A CRT apresenta três domínios. O domínio N-terminal (domínio N) corresponde à
região mais conservada entre as proteínas das diferentes espécies e é somente encontrada
nesta família de proteínas até o momento (KRAUSE et al., 1997). A porção N-terminal da
calreticulina humana, denominada vasostatina, mostrou-se capaz de inibir a proliferação de
células endoteliais sem afetar outras linhagens, suprimir angiogênese in vivo, além de
reduzir significantemente o linfoma de Burkitt e o carcinoma de cólon humano (PIKE et
al., 1998; CHENG et al., 2001). Foi demonstrado posteriormente que a calreticulina
completa apresenta as mesmas atividades anti-angiogênica, que foram mapeadas na região
entre os aminoácidos 120 a 180 da porção N-terminal, confirmando seu potencial como
inibidor da angiogênese patológica e na supressão de tumores (PIKE et al., 1999). O
domínio N liga Zn
2+
envolvendo 4 resíduos de histidina, mas não liga Ca
2+
, (MICHALAC
et al., 1999; TAN et al., 2006), o domínio N interage com o domínio ligante de DNA dos
receptores de glicocorticóides in vitro (BURNS et al., 1994), com α–integrinas
(COPPOLINO et al., 1997), com as proteínas disulfato-isomerase e a proteina 57 do
retículo endoplasmático (ERp57) (KIMURA et al., 2005). Estas interações proteína-
proteína são reguladas por Ca
2+
ligado ao domínio P da calreticulina (CORBETT et al.,
1999).
O domínio P é o domínio interno, o qual apresenta um sítio de ligação de cálcio
com alta afinidade e baixa capacidade e um sinal de localização nuclear que é encontrado
em outras proteínas como a calnexina (BAKSH et al., 1991; KRAUSE et al., 1997). Com
três repetições da seqüência PXXIXDPDAXKPEDWDE seguidas por três repetições da
21
seqüência GXWXPPXIXNPXYX, estas repetições são importantes para a atividade
chaperona de lectina (MICHALAK et al., 1999).
O domínio C-terminal (domínio C) é composto majoritariamente por resíduos de
ácido aspártico e ácido glutâmico, sendo altamente acídico. Apresenta alta capacidade e
baixa afinidade de ligação de cálcio (25 mol de Ca
2+
/mol de proteína), se liga a fatores de
coagulação sanguínea e este domínio também é encontrado em outras proteínas
(MICHALAK et al., 1999).
A inibição da via alternativa do complemento foi demonstrada com extrato de
glândula salivar de Ixodes ricinus inibindo fortemente a geração de C3a e a clivagem do
fator B no soro, mas não tendo efeito significativo sob a formação, estabilidade ou
atividade da C3 convertase (C3bBb) no soro (LAWRIE et al., 2004). No carrapato A.
americanum foi demonstrado a secreção de calreticulina na saliva diretamente no
hospedeiro, sendo sugerido que atue modulando o sistema imune e/ou a hemostase do
hospedeiro (JAWORKI et al.,1995). Também foi sugerido que nestes carrapatos a
calreticulina pode ser utilizada como biomarcador e que os níveis de anticorpos contra esta
proteína podem estar diretamente relacionados com índices de ingurgitação do parasita
(SANDERS et al., 1998; SANDERS et al., 1999).
As secreções da glândula salivar do carrapato são descritas como moduladoras da
relação carrapato hospedeiro (RIBEIRO, 1989), sendo a CRT uma das proteínas secretadas
na saliva durante a alimentação (JAWORSKI, 1995). No entanto, a purificação e
caracterização de suas atividades são difíceis devido à pequena quantidade secretada na
saliva. A clonagem da região codificante do gene e a expressão da BmCRT em sistema
heterólogo (rBmCRT) possibilita o estudo de suas funções biológicas na interação parasito
hospedeiro. O uso da calreticulina como potencial imunógeno em parasitas já foi sugerido
a Necator americanum (PRITCHARD et al., 1999), Schistosoma spp (HAWN et al., 1993;
KHALIFE et al., 1994; HUGGINS et al., 1995; GENGEHI et al., 2000), além do carrapato
A. americanum (JAWORSKI et al., 1995). Além disso, reatividade cruzada de anticorpos
anti-CRT tem sido demonstrado entre carrapatos (SANDERS et al., 1998, 1999). Estes
dados sugerem que a secreção de CRT na saliva tenha uma função comum a todos os
carrapatos.
O Haemaphysalis longicornis, igualmente ao R. microplus, é classificado como
uma carrapato duro. Pode ser encontrado no oeste da Ásia e Oceania, parasitando bovinos.
22
No entanto, ao inverso do R. microplus, também é encontrado parasitando outras espécies.
Na Ásia, é um importante vetor de Theileria sp a bovinos (ONUMA et al., 1998) e no
Japão, de Babesia sp a humanos e animais (HOMER et al., 2000). Embora, ainda não
tenha sido mostrada a secreção de CRT junto à saliva de H. longicornis, baseado em
estudos que demonstram a reatividade cruzada de anticorpos anti-CRT entre carrapatos
(SANDERS et al., 1998, 1999), formulamos a hipótese a CRT de H. longicornis (HlCRT),
fosse capaz de estimular uma resposta humoral cruzada contra a BmCRT. Portanto, neste
trabalho comparamos o potencial imunogênico da BmCRT e da HlCRT e caracterizamos
algumas funções modulatórias da BmCRT.
OBJETIVOS
Objetivos Gerais
Análise do potencial imunogênico da rHlCRT e da rBmCRT.
Caracterização das funções da rBmCRT relacionadas com a evasão do sistema
imune do hospedeiro.
Objetivos Específicos
Comparação da imunogenicidade da rBmCRT e rHlCRT em bovinos imunizados e
infestados com o R. microplus.
Predição da interação da rBmCRT e rHlCRT com o fator do sistema complemento
C1q.
Avaliação do efeito a rBmCRT sobre o sistema de coagulação do plasma bovino.
MATERIAIS E MÉTODOS
Análise Filogenética das seqüências de CRT
Uma árvore filogenética foi gerada pelo método Bootstrap neighbor-joining e
testada com 1000 repetições através do programa MEGA versão 3.1 (KUMAR, 2004). As
seqüências de aminoácidos deduzidos para as seqüências de CRT foram acessados do
GenBank com os seguintes números de acesso: Homo sapiens, AAH02500; Macaca
mulatta isoforma 1, XP_001110174; Mus musculus, AAH03453; Rattus norvegicus,
AAH62395; Bos taurus, BAB86913; Oryctolagus cuniculus, AAB20096; Gallus gallus,
AAS49610; Haemaphysalis longicornis, (não depositada); Amblyomma americanum,
AAR29932; Dermacentor variabilis, AAR29944; Rhipicephalus (Boophilus) microplus,
AAN03709 e Rhipicephalus sanguineus, AAR29961.
Predição de epítopos com potencial antigênico e sítios de ligação a C1q
Utilizou-se o índice de Jamerson-Wolf com o programa LASERGENE versão 7.0.0
(DNASTAR, 2006) para predição de regiões com potencial determinante antigênico por
combinação de métodos de predição de estrutura protéica. Foram utilizadas, para a
predição, as seqüências BmCRT com 411 aminoácidos (GenBank AAN03709) e HlCRT
com 410 aminoácidos (não depositada).
Para a predição dos sítios ligantes de C1q semelhantes aos da CRT humana, foram
alinhadas pelo algoritmo CLUSTALW usando o programa MEGA versão 3.1 (KUMAR et
al., 2004) as seqüências protéicas de CRT de: Homo sapiens, (AAH02500), Bos taurus,
(BAB86913), Haemaphysalis longicornis, (não depositada); Rhipicephalus (Boophilus)
microplus, (AAN03709), Necator americanus (CAA07254), Haemonchus contornus,
(AAR99585). O programa GeneDoc versão 2.6.003 (NICHOLAS et al., 1997) foi utilizado
para avaliar as características físico-químicas conservadas dos aminoácidos.
A predição das estruturas tridimensionais das seqüências das proteínas CRT: Homo
sapiens, (AAH02500), Haemaphysalis longicornis, (não depositada); Rhipicephalus
(Boophilus) microplus, (AAN03709), foram submetidas ao ESyPred3D Web Server 1.0
(http://www.fundp.ac.be/sciences/biologie/urbm/bioinfo/esypred/). As seqüências com
potencial ligante de C1q foram localizadas e avaliadas quanto a sua exposição da superfície
25
das moléculas dos modelos protéicos em comparação com a CRT humana, com auxílio do
software PyMOL
™
v.0.99.
Expressão da rBmCRT
O plasmídio recombinante pET-5b/BmCRT, previamente clonado, foi transformado
em E. coli, linhagem AD494 DE pLysS (Novagen), e plaqueado em agar SOB contendo os
antibióticos canamicina, cloranfenicol e ampicilina. Uma colônia isolada foi inoculada em
25 ml de meio SOB contendo ampicilina (100 μg.ml
-1
), canamicina (50 μg.ml
-1
) e
cloranfenicol (3,4 μg.ml
-1
) e crescidas 16 horas a 37
o
C sob agitação de 180 rpm. Após o
cultivo, as células foram coletadas por centrifugação a 10.000 g por 10 min e ressuspensas
em meio fresco sem antibiótico e usado para inocular em 500 ml de meio SOB em frascos
de 2 litros. Estes frascos foram incubados a 37
o
C sob agitação de 180 rpm até alcançar
densidade ótica 0,8 no comprimento de onda de 600 nm. Para indução da expressão da
proteína, isopropiltio-β-D-galactosida (IPTG) foi adicionado para concentração final de 1
mM e o cultivo incubado por 16 h a 23
o
C. As células cultivadas foram centrifugadas a
10.000 g por 10 min a 4
o
C e o sedimento ressuspenso em tampão fosfato de sódio 10 mM,
300 mM de NaCl, pH 6,5. Para lisar as células, essas foram congeladas e descongeladas 3
vezes e sonicadas 5 vezes com ultra-som por 30 s, com intervalo de 1 min e amplitude de
40 Mhz. A fração solúvel e insolúvel foi separada por centrifugação a 10.000 g por 10 min
a 4
o
C e o sobrenadante armazenado a -20
o
C até o uso.
Purificação da rBmCRT e rHlCRT
A rHlCRT clonada em pET-43a/HlCRT com cauda de histidina foi produzida nas
mesmas condições descritas para a rBmCRT, com exceção da temperatura de expressão
que foi a 30
o
C (rHlCRT, gentilmente cedida por PARIZI, L. F). Depois do cultivo, o
sobrenadante do lisado das células com pET-43a/HlCRT ou pET-5b/BmCRT foram
submetidos a cromatografia de troca iônica HiTrap Mono Q (Amersham Biosciences)
equilibrada com o tampão 10 mM fosfato de sódio, 300 mM de NaCl, pH 6,5 e eluídas
com o tampão 10 mM de fosfato de sódio, 400 mM de NaCl, pH 6,5 e tampão 10 mM de
fosfato de sódio, 500 mM de NaCl, pH 6,5. As frações eluídas foram dialisadas em PBS e
concentradas por filtração com Centricon YM10 (Millipore) e utilizadas para imunização
dos animais. As amostras utilizadas para os testes in vitro, após concentradas, foram
26
purificadas por cromatografia de gel filtração. Aplicando 500 μg das amostras em coluna
de cromatografia de gel filtração (Superdex 75, Amersham Biosciences, de 30 ml)
equilibrada com PBS.
SDS-PAGE, Western e Dot blot
As amostras protéicas para SDS-PAGE foram preparadas com tampão Tris 250
mM pH 6,8, 2% SDS, 0,025% azul de bromofenol, 5% de glicerol, 1,0% de β-
mercaptoetanol e 5 M uréia e separadas por eletroforese em gel SDS-PAGE 12%. Para
avaliação do SDS-PAGE, o gel foi corado com azul de Coomassie por 1 h e depois
descorado por fervura por 5 min com água.
Para os Western blot, após a realização do SDS-PAGE as proteínas foram
transferidas para membrana de nitrocelulose 0,45 μm, 70 V por 1 h a 4
o
C em tampão
carbonato 12 mM, pH 9,9, 20% metanol (DUNN, 1986).
Para a imunodetecção por dot blot das frações separadas por cromatografia de gel
filtração, as amostras foram adsorvidas em membrana de nitrocelulose 0,45 μm por 1 h
(aproximadamente 0,5 μg de proteína por amostra).
Os sítios de ligação inespecíficos para proteínas das membranas de nitrocelulose
foram bloqueados com blotto 5% (fosfato de sódio 10 mM, 150 mM de NaCl, 5% leite
desnatado) por 1 h a temperatura ambiente. Para a adsorção dos anticorpos não específicos
para CRTs, todos os soros (anticorpos primário) utilizados para sondagem, foram diluídos
e incubados previamente por 1 h a temperatura ambiente com lisado de E. coli AD494 DE
pLysS cultivado (as bactérias foram ressuspensas em PBS com 10% do volume de cultivo)
como descrita no item expressão protéica. Para sondagem do Western blot da expressão de
rBmCRT foi utilizado soro de coelho anti-rHlCRT, já disponível no laboratório, diluindo
1:1000. Os conjugados anti-IgG de coelho (1:5.000), anti-IgG de camundongo (1:10.000) e
anti-IgG de bovino (1:20.000) foram incubados por 1 h. A revelação foi feita pela adição
de NBT/BCIP em tampão 100 mM Tris, 100 mM NaCl, 5 mM MgCl
2
, pH 9,5.
Imunização de camundongos
Para comparar a imunogenicidade das CRTs recombinantes, as frações eluídas com
400 mM ou 500 mM de NaCl foram inoculadas em camundongos. Os animais foram
divididos em três grupos com dois camundongos, inoculados três vezes por via
27
intraperitoneal com intervalos de 14 dias. O grupo controle recebeu emulsão composta por
50 μl de PBS com 50 μl de adjuvante incompleto de Freund por dose. Os grupos
tratamentos receberam 50 μl da emulsão de rBmCRT 400 ou 500 (100 μg/dose) com 50 μl
de adjuvante incompleto de Freund.
Análise de antigenicidade da rBmCRT 400 e rBmCRT 500
As frações de rBmCRT eluídas com 400 mM ou 500 mM de NaCl (rBmCRT 400 e
rBmCRT 500, respectivamente), foram aplicadas em SDS-PAGE 12% com redução, com
3,33 μg de proteína por centímetro linear de gel e transferidas para membrana de
nitrocelulose como descrito anteriormente. Fitas de 3 mm com 0,1 μg de rBmCRT 400 ou
rBmCRT 500 foram sondadas por uma hora com os soros dos camundongos diluídos 1:200
e reveladas como descrito anteriormente.
Imunização e desafio dos bovinos
Para comparar a imunogenicidade e capacidade de indução de uma resposta imune
protetora, a calreticulina de R. microplus e de Haemaphysalis longicornis, foram utilizados
três bovinos fêmeas da raça Hereford (Bos taurus taurus) de 18 meses de idade, oriundos
de área livre de carrapatos. Os bovinos foram alojados em baias a prova de carrapatos com
assoalho ripado e alimentados duas vezes por dia com feno e concentrado, com água
disponível ad libidum. Os animais foram alocados em controle (bovino 1), tratamento
rBmCRT (bovino 2) e tratamento rHlCRT (bovino 3), inoculados três vezes por via
subcutânea no pescoço com intervalos de duas semanas. O bovino controle recebeu
emulsão composta por 1 ml de PBS com 1 ml de adjuvante oleoso (Montanide 888 e
Marcol 52) por dose. Os bovinos tratamento receberam a emulsão de rBmCRT eluída com
500 mM de NaCl ou rHlCRT eluída com 500 mM de NaCl (100 μg/dose) com 1 ml de
adjuvante. Vinte dias após a última inoculação, os bovinos foram desafiados com 2.000
larvas de R. microplus da linhagem Porto Alegre com 10 dias de idade, livres de Babesia
spp e Anaplasma spp.
28
Hipersensibilidade cutânea em bovinos
A região escapular dos bovinos foi tricotomizada para inoculação de 2 μg de
rBmCRT e rHlCRT por via intradérmica. Foram utilizados como controles 2 μg BYC
nativa (gentilmente cedida por Leal, A.), previamente caracterizadas como produtora de
reação de hipersensibilidade cutânea imediata em bovinos vacinados com BYC (LEAL, A.
comunicação pessoal), e extrato de bactéria E. coli AD494 DE pLysS expressando as
proteínas do vetor pET-43a. Foi observada a presença ou ausência de alterações
macroscópicas como edema e eritema 30, 60 e 120 min, 24 e 48 horas após inoculação.
Foram coletados fragmentos de pele nos pontos de inoculação 2 e 48 horas após a
inoculação, com auxilio de Punch e anestesia local com lidocaína 2%. As amostras foram
acondicionadas em formol 10% tamponado até avaliação histopatológica. As amostras
foram coradas com hematoxicilina-eosina e avaliadas quanto a presença de eosinófilos,
neutrófilos e monócitos pelo Laboratório de Patologia Animal da Faculdade de Veterinária
da UFRGS.
Análise da antigenicidade da rBmCRT e rHlCRT com soros de bovinos infestados e
vacinados
Utilizando os soros coletados após cada infestação de outros dois bovinos (bovinos
4 e 5) infestados experimentalmente 12 vezes repetidas (6 vezes com 18.000 e 6 vezes com
800 larvas de R. microplus) (FERREIRA, C.A.S., comunicação pessoal) e soros de bovinos
imunizados com rBmCRT ou rHlCRT foi feita a caracterização da capacidade antigênica
das CRTs. Foi feito SDS-PAGE 12% com redução e aplicado as proteínas rBmCRT e
rHlCRT na quantidade de 3,33 μg de proteína por centímetro linear de gel e a seguir
transferidas para membrana de nitrocelulose e cortadas em fitas de 3 mm com 0,1 μg de
rBmCRT ou rHlCRT. Foram testados os soros pré-infestação, da segunda e décima
infestação diluídos 1:50 e soros dos bovinos imunizados com rBmCRT e rHlCRT diluídos
1:200. A revelação foi realizada como descrito no item SDS-PAGE, Western e Dot blot.
Identificação de CRT em extrato de larvas
Larvas de R. microplus de 20 dias foram maceradas sobre o gelo em PBS,
centrifugadas por 15 min a 12.000 g a 4
o
C e o sobrenadante sonicado 5 vezes com ultra-
29
som por 30 s, com intervalo de 1 min e amplitude de 40 Mhz. Depois de centrifugado por
40 min a 32.000 g a 4
o
C, foi adicionado solução de inibidores de proteases (7 ml de Tris-
HCl 10 mM pH 8,2, 1.000 μl de deoxicolato 1%, 20 μl Pepstatina A 1mg/ml, 20 μl
Leupeptina A 8 mg/ml, 20 μl TPCK 0,1 mM) a 300 μl da fração solúvel. A concentração
de proteínas do extrato de larvas obtido foi determinado pelo método de BRADFORD
(BRADFORD, 1976) e submetido a uma eletroferese SDS-PAGE 12% com redução.
Foram aplicados 118 μg de proteína por centímetro linear de gel. Depois de transferidas
para membrana de nitrocelulose, como previamente descrito, foram feitas fitas de 3 mm
contendo 35,4 μg de extrato de larvas e os sítios de ligação inespecíficos para proteínas das
membranas foram bloqueadas com blotto 5% por 1 h. Após sondadas por 16 horas com
soro dos bovinos imunizados com rBmCRT e rHlCRT e com o soro do coelho imunizado
com rBmCRT, diluídos 1:50. A revelação foi realizada como descrito no item SDS-PAGE,
Western e Dot blot.
Titulação por ELISA das IgGs anti-CRT dos soros bovinos
O soro coletado dos bovinos, após duas semanas de cada imunização, foi utilizado
para titulação das IgGs por ELISA. Placas de polietileno foram sensibilizadas com 100
ng/poço dos antígenos rBmCRT ou rHlCRT por 16 horas a 4ºC em tampão carbonato-
bicarbonato 50 mM, pH 9,6. Os dois antígenos foram sondados com os soros dos bovinos
imunizados com rBmCRT e rHlCRT previamente incubados por 1 h com 10% de extrato
de bactéria E. coli AD494 DE pLysS. Detectado com conjugado peroxidase anti-IgG
bovino, diluído 1:20.000 incubado por 1 h e revelado com uma solução de 3,2 mg de OPD
e 5 μl de H
2
O
2
em 10 ml tampão fosfato-citrato 0,1 M pH 5,0, por 20 min e após
interrompida a reação com H
2
SO
4
12,5%. A densidade ótica utilizada para leitura foi 490
nm. Foram realizados dois experimentos independentes em duplicata.
ELISA de competição dos soros bovinos
Para verificar a competição entre os anticorpos dos soros e as proteínas solúveis
rBmCRT ou rHlCRT foi realizado ELISA de competição com os soros dos bovinos. Na
placa foram fixadas as proteínas rBmCRT ou rHlCRT (como descrito no item anterior).
Foram adicionadas aos poços rBmCRT e rHlCRT solúveis em quantidades crescentes de
50 a 800 ng, juntamente com os soros e incubados por 1 hora. Os soros testados foram
30
anteriormente diluídos 1:200 e incubados para adsorção por 1 h com 10% de extrato de
bactéria E. coli AD494 DE pLysS. Os procedimentos de incubação do anticorpo
secundário e revelação foram idênticos aos descritos no item acima. Foram realizados dois
experimentos independentes e em duplicata.
Inibição da coagulação
Atividade da trombina sobre o substrato S2238 após adição de rBmCRT e
rHlCRT
Os efeitos da rBmCRT ou rHlCRT sobre a atividade de trombina foram
mensurados por ensaio de cinética com o substrato cromogênico específico para trombina
(H-D-Phe-Pip-Arg-pNA, Chromogenix™), sendo quantificados por espectrofotometria
com densidade ótica de 405 nm. Em placa de 96 poços, 0,4 μM de trombina bovina foi
incubada por 15 min a 37
o
C com 0,55 ou 1,1 μM de rBmCRT ou rHlCRT. Depois foi
adicionado 0,2 mM do substrato S2238 e tampão (Tris 50 mM pH 7,5 com NaCl 150 mM e
CaCl
2
10 mM), qsp 100 μl. A reação foi analisada com leituras a cada 15 s durante 30 min.
Foram realizados três experimentos independentes e em duplicata.
Efeito da rBmCRT ou rHlCRT na atividade da trombina sobre o fibrinogênio
O efeito da presença da rBmCRT ou rHlCRT na atividade da trombina sobre o seu
substrato natural (fibrinogênio) foi analisado pela formação de rede de fibrina. Em placa de
96 poços, 0,4 μM de trombina bovina e 0,36 ou 0,73 μM de rBmCRT ou rHlCRT, foram
incubados por 15 min a 37
o
C. Após foi adicionado 200 μg de fibrinogênio bovino e tampão
(Tris 20 mM, pH 7,5), qsp 150 μl. A reação foi analisada com leituras a cada 15 s durante
20 min com densidade ótica de 650 nm. Foram realizados três experimentos independentes
e em triplicata.
Influência da rBmCRT sobre o tempo de recalcificação plasmática
O tempo de recalcificação plasmática foi mensurado pela adição de cálcio. Para a
obtenção de plasma, foi respeitada a proporção de 9 partes de sangue bovino para 1 parte
de citrato de sódio 3,8% (0,11 mol/l) e centrifugado 1.000 g por 10 min. O plasma obtido
foi congelado -20ºC até o uso. Em placa de 96 poços, 0,8 ou 3,1 μM de rBmCRT e 6 mM
31
de CaCl
2,
foram incubados por 15 min a 37
o
C. Após foi adicionado 50 μl plasma bovino e
tampão (Tris 20 mM, pH 7,5), qsp 150 μl. A coagulação foi analisada com leituras a cada
15 s durante 20 min com densidade ótica de 650 nm. Foram realizados três experimentos
independentes e em triplicata.
Para verificar a influência das imunoglobulinas do bovino vacinado sobre a
rBmCRT no sistema de recalcificação plasmática (descrito acima), IgGs do soro dos
bovinos vacinados com rBmCRT foram purificadas por cromatografia de afinidade com
coluna HiTrap G (Amersham Biosciences) equilibrada com tampão fosfato 20 mM pH 7,0.
Cada 1 ml das proteínas eluídas com tampão glicina 100 mM pH 2,7 foram imediatamente
adicionadas a 60 μl de tampão Tris 1 M, pH 9,0. As frações eluídas foram dialisadas contra
tampão fosfato de sódio 10 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4 por 24 horas e purificadas por
cromatografia de gel filtração com coluna Superose 12 (Amersham Biosciences)
equilibrada com tampão fosfato de sódio 10 mM, 150 mM NaCl, pH 7,4. O ensaio foi
realizado como descrito a cima, acrescendo um período de incubação da rBmCRT com 1,5
μg de IgG por 15 min, antes da adição do CaCl
2
. Foram realizados três experimentos
independentes e em triplicata.
Influência da rBmCRT e rHlCRT sobre o tempo de protrombina
O ensaio de tempo de protrombina foi realizado adicionando 200 μl de fator tissular
cálcico (extrato de cérebro de coelho, Dade Behring
®
) a 37
o
C sobre 100 μl plasma bovino
previamente incubado com 1,52 ou 3 μM de rBmCRT ou rHlCRT por 5 min. O tempo para
a formação do coágulo (em segundos) e a consistência da coagulação foi classificado em
coágulo firme e frouxo e rede de fibrina firme e frouxa baseados nos resultados obtidos da
curva de referência com plasma sem CRT. As formações dos coágulos foram avaliadas
visualmente. Os experimentos foram realizados em triplicata.
Análises estatísticas
As médias dos tempos de recalcificação foram testados por One-Way AOV e a
comparação das médias pelo teste LSD com intervalo de confiança de 0,05.
RESULTADOS
Análise Filogênica das seqüências de CRT
A construção filogenética Neighbor-joining com as seqüências protéicas de CRT é
mostrada na Figura 1. Os ramos da árvore referentes às seqüências de CRT de carrapatos
(seqüências sublinhadas) mostram altos valores de bootstrap com exceção do Amblyoma
americanum. As seqüências de rBmCRT e rHlCRT apresentam proximidade nos ramos,
indicando, com forte suporte estatístico, uma provável origem em comum. (Figura 1).
Figura 1 Dendrograma de seqüências protéicas de CRTs. A barra de escala indica 0,05 substituições
por sítio. As proporções de bootstrap indicadas dos braços ilustram a quantidade de vezes (em porcentagem)
que as seqüências se repetiram neste arranjo. As seqüências sublinhadas são de artrópodes.
33
Predição dos sítios de ligação de C1q em seqüências de CRT
Foram identificados 6 sítios com potencial ligante de C1q nas regiões 38-46, 59-65,
149-155, 160-167, 220-228, 274-280, em todas as seqüências analisadas (Figura 2). Todas
as seqüências apresentam em três sítios (38-46, 59-65 e 220-228) um aminoácido não
conservado. A região 59-65 do H. longicornis é conservada quando comparada com H.
sapiens e a de R. microplus é conservada nas seqüências de N. americanus e H. contornus.
A região 220-228 apresenta todos aminoácidos conservados entre as seqüências, com
exceção das seqüências de N. americanus e H. contornus, que possuem somente um
resíduo de glutamina (E) que não é conservado.
Estrutura 3D das CRT
Para a predição das estruturas tridimensionais, as seqüências de aminoácidos de
CRT humana, rBmCRT e rHlCRT foram submetidas ao ESyPred3D, utilizando como
molde a estrutura tridimensional da calnexina (1JHN) apresentando respectivamente, 33,4,
31,6 e 31,5% de resíduos idênticos com as seqüências de CRTs. Nas estruturas
tridimensionais preditas foram observadas 7 regiões formando fitas β antiparalelas e uma
região formando α-hélice na porção globular e 1 região formando fitas β antiparalelas no
domínio P, que se apresenta na forma de um braço estendido (Figura 3).
Epitopos antigênicos da rBmCRT e rHlCRT
A utilização do índice de Jamerson-Wolf para a predição de regiões com potencial
antigênico demonstrou múltiplas regiões positivas em comum e 6 regiões positivas
diferentes entre as proteínas rBmCRT e rHlCRT, com valor maior que 1. Estes dados
indicam que as duas proteínas apresentam potencial antigênico semelhantes e 6 prováveis
epítopos antigênicos diferentes (Figura 4).
34
10 20 30 40 50 60 70 80 90 100 110
| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
B. microplus -MRLLCILLPLVGLISADPTVYFKEEFNDGDAWKDRWVESTKGDNLGKFVLSAGKFYGDAEKSKGLQTSEDARFYGISAKF-EPFSNEDKTLVIQFTVKHEQNIDCGGGY
H. longicornus -...........AVA....N...........G...........................E.....IK.........L.S..-T....DG....V................
N. americanus -..S.VA...VLCIAV.E--.......L.-.S..E...Q.KHKSDY.E.......YF...TRDQ.MK..Q..K..SRA...PKA...KG..V..........G.......
H. contortus ---------------------------------GI...Q.KHK.DY.A.K.....Y.D..KRDQ..R..Q..K..SLA...PKK.T.KG..V...Y......G.......
B. taurus -----------------........Q.L...G.TE..I..KHKPDF......S......Q..D......Q.....AL..R.-.....KGQ...V................
H. sapiens MLLSVPL..G.L..AV.E.A.....Q.L...G.TS..I..KHKSDF......S......E..D......Q.....AL..S.-.....KGQ...V................
120 130 140 150 160 170 180 190 200 210 220
| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
B. microplus VKLFDCSLDQTQMHGESPYLIMFGPDICGPGTKKVHAIFNYKGKNHLINKEVRCKDDVFSHLYTLIVKPDNTYQIKIDNEVVEKGELEKDWSFLPPKKIKDPDAKKPEDW
H. longicornus ....................................V..............I......YT.............VV......A..............Q.....A.......
N. americanus ..VMSSDV.LSDF...T..NV.........-.....D..S........K.DI.....ELT......LN.....EVQ..G.K..S....S..DL.................
H. contortus ..VMSSDV.LKDF...T..NV.........-.....V..S........K.DI.....ELT......LN.....EV...G.K..S....A..DM.................
B. taurus ....PAG....D...D.E.N................V........V....DI.....E.T.......R.N...EV....SQ..S.S..D..D............A.....
H. sapiens ....PN.....D...D.E.N................V........V....DI.....E.T.......R.....EV....SQ..S.S..D..D............S.....
230 240 250 260 270 280 290 300 310 320 330
| | | | | | | | | | | | | | | | | | | | | |
B. microplus DDRAKIDDPDDKKPEDWDKPEYIPDPDATKPEDWDDDMDGEWEPPQINNPEYKGEWKPKQIDNPAYKGAWVHPEIDNPEYTPDPKLYRYKEICKIGFDLWQVKSGTIFDN
H. longicornus .........E............................................................................HA.....TV...............
N. americanus .E.EY...A............H......K..D....E........M.D.............K......K.I............DE..L..DWGA................
H. contortus .E.EY...A............H......K..D....E........M.D.............K..D...K.I............DE..L..DWGA................
B. taurus .........T.S.........H......K......EE........V.Q..........R.....E...I.I.........S..SNI.A.ENFAVL.L.............
H. sapiens .E.......T.S.........H......K......EE........V.Q..........R.....D...T.I.........S...SI.A.DNFGVL.L.............
340 350 360 370 380 390 400 410
| | | | | | | | | | | | | | | | |
B. microplus ILITDDEEYARVHGEETWAALKDEEKKMKDKQEEEEDAKSKKEDD-AKDEDEFGDDEDKDEDKKDEEETTPAP-EDDED----HKHEEL
H. longicornus L.................G.I..A............E..N.....-.......D.....K.E--E..A.....S.E.D.----......
N. americanus V.VS.SVDE.KA.AA..FEK..PV..EL.E.AD..NRK.MEE.AK--.Q.E.EKKKKE.E.KEEK.D.D-----.EKA.----EG....
H. contortus ..V..SVDD.KA.AA..FEK..AV..EK...AD...RK.IEE.AK--.R.E.DKKKKEAK.KEEK.D.D-----..K.E----EA.D..
B. taurus F...N..A..EEF.N...GVT.AA..Q.....D..QRLHEEE.EKKG.E.E.AD-KD.DEDKDE...DEDEKEE.EE..AAAGQAKD..
H. sapiens F...N..A..EEF.N...GVT.AA..Q.....D..QRL.EEE..KKR.E.E.AE.K..DEDKDE...DEEDKEEDEE..-VPGQAKD..
Figura 2 - Identificação das regiões de ligação de C1q nas seqüências de CRT. As regiões com potenciais de ligação de C1q estão sombreadas, as áreas cinza
escuro são grupos idênticos, as cinza claro são grupos conservados. As seqüências de calreticulina de Riphicephalus (Boophilus) microplus, Haemaphysalis
longicornis, Necator americanus, Haemonchus contornus, Bos Taurus isoforma 1 do cérebro, Homo sapiens foram alinhadas pelo algoritmo CLUSTALW e após
identificados os sítios de C1q.
35
Figura 3 – Estrutura 3D predita da rBmCRT, rHlCRT e CRT humana. “A” calreticulina de R. microplus; “B” calreticulina de H. sapiens, “C” calreticulina de
H. longicornis. Em amarelo estão selecionadas as regiões com potencial ligante de C1q.
36
Figura 4 – Predição do potencial de antigenicidade para BmCRT e HlCRT pelo índice de Jamerson-Wolf (1988). Os resultados deste índice aparecem como
picos múltiplos com potencial determinante antigênico, onde os picos com índice positivo e maior que 1 são mais antigênicos. Na figura “A” o gráfico branco
representa a rBmCRT sobre-posto pelo gráfico da rHlCRT (gráfico preto). Na figura “B” o gráfico da rHlCRT (gráfico preto) foi sobreposto pelo gráfico da rBmCRT
(gráfico branco). As setas indicam regiões com potencial antigênico diferente entre as seqüências.
..
37
Expressão e purificação da rBmCRT
A expressão da rBmCRT na forma solúvel em E. coli AD494 DE pLysS foi
induzida com 1 mM de IPTG e cultivada por 16 horas a 23ºC. A expressão foi confirmada
por SDS-PAGE e Western blot (Figura 6), com uma banda com 55 a 60 kDa reconhecida
por anticorpo policlonal de coelho contra rHlCRT.
As purificações da rBmCRT e rHlCRT foram realizadas por cromatografia de troca
iônica, obtendo o mesmo padrão de eluição para as duas proteínas com tampão fosfato 10
mM, 400 ou 500 mM de NaCl (Figura 7), as quais foram utilizadas para imunização dos
animais. Enquanto, para os testes in vitro, as duas proteínas eluídas com 400 e 500 mM de
NaCl foram submetidas a cromatografia por gel filtração com Superdex 75. Apresentando
dois picos entre o 8º e 9º ml após a aplicação da rBmCRT 400 ou rHlCRT 400 e um pico
único e estreito no 9º ml após a aplicação da rBmCRT 500 ou rHlCRT 500.
A
Gel filtração em coluna Superdex 75
rBmCRT400
Volume (ml)
0 5 10 15 20 25 30 35
OD
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
B
Gel filtração em coluna Superdex 75
rBmCRT500
Volume (ml)
0 5 10 15 20 25 30 35
OD
-0.1
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
0.5
0.6
0.7
C
Gel filtração em coluna Superdex 75
rHlCRT400
Volume (ml)
0 5 10 15 20 25 30 35
O.D.
-0,1
0,0
0,1
0,1
0,2
0,2
0,3
0,3
0,4
D
Gel filtração em coluna Superdex 75
rHlCRT500
Volume (ml)
0 5 10 15 20 25 30 35
O.D.
-0,1
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
Figura 5 – Cromatografia de gel filtração em coluna Superdex 75. As amostras rBmCRT 400 e
rHlCRT 400 apresentam dois picos no 8º e 9º ml (gráfico A e C) e a rBmCRT 500 e rHlCRT 500 apresentam
no 9º ml um pico estreito (gráfico B e D).
38
As frações foram testadas por dot blot com soro de coelho anti-rHlCRT
confirmando a presença de rBmCRT predominantemente no 8º e 9º ml para a rBmCRT
400 e rHlCRT 400 e para a rBmCRT 500 e rHlCRT 500 predominantemente no 9º ml
(dados não mostrados), sendo confirmada por SDS-PAGE 12% a presença de banda
compatível com a rBmCRT e rHlCRT (Figura 7).
1
2
3
4
5
6
7
55
70
100
130
40
35
25
15
10
170
Figura 6 - Western blot mostrando a expressão da rBmCRT. As amostras foram resolvidas por SDS-
PAGE 12% com redução e sondada com anticorpo de coelho anti-rHlCRT diluído 1:1000 e detectados com
conjugado fosfatase anti-IgG de coelho diluído 1:5000. Linha 1, sobrenadante do extrato de bactéria
pET5b/BmCRT antes da indução; linha 2, sobrenadante do extrato de bactéria pET5b/BmCRT 4 horas após
indução; linha 3, sobrenadante do extrato de bactéria pET5b/BmCRT 16 horas após a indução; linha 4,
sobrenadante do extrato de bactéria pET5b antes da indução; linha 5, sobrenadante do extrato de bactéria
pET5b 4 horas após indução; linha 6, sobrenadante do extrato de bactéria pET5b 16 horas após a indução;
linha 7, controle positivo (sobrenadante de extrato de bactéria pET43a/HlCRT após 16 horas de indução). As
setas indicam a posição esperada para a rBmCRT. O padrão de massa molecular é expresso em kDa
(Fermentas).
Figura 7 - SDS-PAGE 12% com redução corados com Coomassie blue G-250, das amostras de
rBmCRT e rHlCRT purificadas por cromatografia de troca iônica e concentrados com Centricon Ym10.
Linha 1, rBmCRT 400; linha 2, rBmCRT 500; linha 3, rHlCRT 400; linha 4, rHlCRT 500; linhas 5 a 8, 1,
2,4 e 6 μg de BSA bovino, respectivamente; linha 9, IgG suína.
39
Imunogenicidade da BmCRT em camundongos
O padrão de reconhecimento entre os soros dos camundongos imunizados com as
proteínas rBmCRT 400 e rBmCRT 500 avaliadas por Western blot, mostraram um padrão
de reconhecimento diferente. Por tanto, o padrão de reconhecimento não foi influenciado
pela fração protéica sondada, mas pelo soro utilizado. O padrão de reconhecimento foi
muito semelhante quando as proteínas rBmCRT 400 e rBmCRT 500 foram sondadas com
soros de camundongos imunizados com rBmCRT 500. Diferindo deste padrão, quando as
proteínas rBmCRT 400 e rBmCRT 500 foram sondadas com os soros dos camundongos
imunizados com rBmCRT 400. Estas variações podem estar relacinadas com diferenças no
grau de purificação das proteínas eluidas. No entanto, todos os soros reconhecem um
intensa banda na posição esperada para a migração da rBmCRT, mostrando que ambas
frações eluídas são capazes de estimular uma resposta imune humoral (Figura 8).
Figura 8 - Western blot da rBmCRT 400 e rBmCRT 500. As fitas foram sondadas com soro de
camundongos após terceira imunização com rBmCRT 400 ou rBmCRT 500. Os soros foram diluídos 1:200 e
adsorvido com 10% extrato de bactéria E. coli AD494 DE pLysS e detectado com conjugado fosfatase
alcalina anti-IgG de camundongo diluído 1:5.000. A seta indica a posição esperada para a rBmCRT. O
padrão de massa molecular é expresso em kDa (Fermentas).
40
Imunogenicidade da rBmCRT e rHlCRT
Os soros de bovinos imunizados com rBmCRT e rHlCRT foram utilizados para
sondar, por Western blot, extrato de larva de R. microplus de 20 dias. Os quais
reconheceram uma proteína de massa molecular prevista para a migração da BmCRT.
Enquanto o soro do bovino utilizado como controle negativo não reconheceu nenhuma
proteína com esta massa molecular (Figura 9). Confirmando os resultados, o soro do
coelho imunizado com rBmCRT reconheceu uma proteína de massa molecular prevista
para a migração da BmCRT.
Figura 9 - Análise por Western blot de extrato de larva de 20 dias de carrapatos R. microplus,
sondado com soros de animais imunizados com rBmCRT e rHlCRT. Linha 1, soro pré-imune do bovino 3;
Linha 2, soro do bovino 3 após terceira imunização; Linha 3, soro pré-imune do bovino 1; Linha 4,soro do
bovino 1 após terceira imunização; Linha 5, soro pré-imune do bovino 2; Linha 6, soro do bovino 2 após
terceira imunização Linha 7, soro pré-imune do coelho; Linha 8, soro de coelho após quarta imunização. As
setas indicam a posição esperada para a BmCRT. O padrão de massa molecular é expresso em kDa
(Fermentas).
Os soros dos dois bovinos na 10ª infestação experimental não reconheceram por
Western blot o antígeno rBmCRT. Foi identificada com o soro do bovino 4 na quarta
infestação uma proteína de massa molecular prevista para a migração da rBmCRT (Figura
10b). Enquanto, com os soros dos bovinos 4 e 5 não foi identificada a proteína rHlCRT em
41
nenhuma das sondagens (Figura 10a). Foram utilizados como controles positivos os soros
dos bovinos 2 e 3 imunizados com rBmCRT ou rHlCRT, respectivamente.
Figura 10 - Análise por Western blot de “a” e “b” (rHlCRT e rBmCRT respectivamente) com os
soros de animais infestados com R. microplus ou imunizados contra rHlCRT e rBmCRT. Linha 1, soro do
bovino 4 antes das infestações; Linha 2, soro do bovino 4 após a quarta infestação; Linha 3, soro do bovino
4 após a décima infestação; Linha 4, soro do bovino 5 antes das infestações; Linha 5, soro do bovino 5 após
a quarta infestação; Linha 6, soro do bovino 5 após a décima infestação; Linha 7, soro de bovino 2
imunizado após a 3ª dose de rBmCRT; Linha 8, soro do bovino 3 imunizado após a 3ª dose de rHlCRT. As
setas indicam a posição esperada para a CRTs. O padrão de massa molecular é expresso em kDa (Fermentas).
A titulação por ELISA dos soros dos bovinos vacinados mostrou capacidade de
produção de anticorpos contra as proteínas rBmCRT ou rHlCRT. Os títulos foram de 1.500
para o bovino 2 (imunizado com rBmCRT) testado contra a rBmCRT ou rHlCRT e título
de 6.000 e 1.500 para o bovino 3 (imunizado com rHlCRT) testado contra rHlCRT e
rBmCRT, respectivamente (
Figura 11). A cinética de produção de anticorpos mostrou
aumento dos títulos após a segunda dose de rBmCRT ou rHlCRT, diminuindo 40 dias após
a última dose para os dois bovinos (
Figura 12). O bovino 1 inoculado com PBS, não
desenvolveu título para rBmCRT ou rHlCRT durante o período de imunização e mesmo
após a infestação (dados não mostrados).
42
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0,35
1000 10000 100000
Log
O.D.
rHlCRT anti-rHlCRT rHlCRT anti-rBmCRT rBmCRT anti-rBmCRT rBmCRT anti-rHlCRT
Figura 11 - Titulação por ELISA dos soros dos bovinos imunizados com rBmCRT ou rHlCRT. Os
soros dos bovinos foram detectados com conjugado peroxidase anti-IgG bovino diluído 1:20.000. A média
dos valores obtidos com os soros pré-imunes foram utilizados para determinar o ponto de corte de 0,05. O
bovino 1 inoculado com PBS manteve os mesmos valores dos soros pré-imunes (dados não mostrados).
Foram realizados dois experimentos independentes em duplicata.
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0 20406080
Tempo (dias)
O.D.
rHlCRT rBmCRT
Figura 12 - Cinética por ELISA dos soros dos bovinos imunizados com rBmCRT ou rHlCRT. O
eixo das abscissas está representando os dias de vacinação, sendo 0 dias soro pré-imune, 14 dias primeira
dose, 28 dias segunda dose, 42 dias terceira dose e 80 dias após a terceira dose. Os soros dos bovinos foram
diluídos 1:500 e detectados com conjugado peroxidase anti-IgG bovino diluído 1:20.000. A média dos
valores obtidos com os soros pré-imunes foram utilizados para determinar o ponto de corte de 0,05. O bovino
1 inoculado com PBS manteve os mesmos valores dos soros pré-imunes. Foram realizados dois experimentos
independentes em duplicata.
43
ELISA de competição dos soros bovinos
A presença de epítopos diferentes entre rBmCRT e rHlCRT foi analisada por
ELISA de competição com soro de bovinos imunizados com rBmCRT e rHlCRT (Figura
13). As rBmCRT ou rHlCRT incubada com os soros dos bovinos 2 e 3 (vacinados
respectivamente, com rBmCRT ou rHlCRT) apresentaram acentuada competição
comparada à competição com a rHlCRT ou rBmCRT, respectivamente. A competição da
rBmCRT incubada com o soro do bovino 3 ocorreu com menor intensidade que a rHlCRT
incubada com o soro do bovino 2. Atingindo um platô de competição de 400 a 800 ng de
antígeno solúvel, sugerindo a presença de epitopos antigênicos diferentes entre as
proteínas.
0,000
0,100
0,200
0,300
0,400
0,500
0 100 200 300 400 500 600 700 800
CRT solúvel (ng)
O.D.
Bm (Hl) Hl (Bm) Hl (Hl) Bm (Bm)
Figura 13 - ELISA de competição das proteínas solúveis rBmCRT ou rHlCRT com os soros dos
bovinos 2 ou 3 detectados com conjugado peroxidase anti-IgG bovino diluído 1:20.000. O eixo das abscissas
indica a diluição do antígeno solúvel e o eixo das ordenadas à absorbância obtida. As abreviações Bm e Hl
fora dos parênteses indicam os soros dos bovinos 2 e 3, respectivamente e (Bm) e (Hl) as proteínas solúveis
incubadas para competição com os soros. Foram realizados dois experimentos independentes em duplicata.
Hipersensibilidade cutânea em bovinos
Os bovinos 2 e 3 imunizados com rBmCRT e rHlCRT, respectivamente,
desenvolveram edema local 30 a 120 min após a inoculação intradérmica de 2 μg dos
antígenos. O bovino 3 desenvolveu edema de 12 mm, 30 min após inoculação intradérmica
com rBmCRT e rHlCRT, enquanto o bovino 2 apresentou edema de 18 mm após 120 min
44
na área inoculada com rHlCRT e um nódulo discreto na área inoculada com rBmCRT. A
inoculação do controle de purificação desenvolveu edema de 6 mm no bovino 3, não sendo
observada alterações nos outros animais. No bovino 1 (imunizado com PBS) não foi
observado alterações macroscópicas em nenhuma área de inoculação. Nas amostras de pele
coletadas 2 horas após administração dos antígenos e analisadas por histopatologia,
apresentaram no bovino 1 (bovino controle) infiltrado perivascular e de parede de vasos
moderado, na derme superficial e profunda, constituído por neutrófilos e eosinófilos,
enquanto, nos bovinos 2 e 3 (imunizados com rBmCRT e rHlCRT, respectivamente), foi
observado infiltrado perivascular e de parede de vasos discreto ou leve, na derme
superficial e profunda constituído por neutrófilos e eosinófilos. Nas amostras coletadas 48
horas após administração dos antígenos foi observado infiltrado perivascular discreto ou
leve na derme superficial, constituído por células mononucleares e eosinófilos nos três
bovinos.
Inibição da coagulação
Tempo de recalcificação plasmática
O tempo de recalcificação plasmática foi 78,01 ±9,61 (p < 0,04) e 105,25 ±24,19 (p
< 0,005) segundos maior em relação ao controle, quando adicionado 0,8 e 3,1 μM de
rBmCRT, respectivamente (
Figura 14). Não ocorrendo alterações significativas entre o
tempo de recalcificação do controle positivo e o controle de purificação das rCRTs
(purificação do extrato de bactéria E. coli AD494 DE pLysS expressando as proteínas do
vetor pET-43a) ou com a BYC. Com a intenção de testar a possibilidade de inibir o efeito
anticoagulante da CRT sobre o plasma foi adicionada IgG purificada dos soros dos bovinos
imunizados com rBmCRT ou rHlCRT, não sendo observado efeito inibitório sobre o
aumento do tempo de recalcificação plasmática causado pela CRT.
Quando foi adicionado rBmCRT ou rHlCRT, nos testes de atividade de trombina
bovina sobre fibrinogênio ou substrato sintético S2238, não foi observado efeito inibitório
da atividade de trombina. Para testar o efeito da rBmCRT e rHlCRT na via extrínseca da
cascata de coagulação plasmática foi utilizado o teste do tempo de protrombina, não sendo
observadas alterações em comparação com a curva de referência com soro bovino sem
adição de rBmCRT ou rHlCRT.
45
0
0,05
0,1
0,15
0,2
0,25
0,3
0 200 400 600 800 1000 1200 1400
Tempo (s)
O. D.
Controle positivo 0,8 uM rBmCRT 3,1 uM rBmCRT Branco
Figura 14 - Efeito da rBmCRT sobre o tempo de recalcificação plasmática. O tempo de formação
dos coágulos foram determinados à absorbância atingiu 0,075 com densidade ótica de 650 nm. Foram
realizados três experimentos independentes em triplicata.
DISCUSSÃO
A utilização de extratos brutos em vacinas comerciais contra carrapatos é inviável
por motivos econômicos e sanitários. Uma alternativa é a identificação, clonagem e
expressão em sistema heterólogo de antígenos com potencial vacinal. Entre eles, se
destacam a Bm86 (WILLADSEN et al., 1988) e a Bm91 (RIDING et al., 1994), ambos
descritos como antígenos protetores contra carrapatos. Quando os antígenos ocultos Bm86
e Bm91 foram associados, houve aumento da eficiência da vacinação (RIDING et al.,
1994, WILLADSEN et al.,1996), no entanto, não assegurando um grau de proteção
necessário para suprimir o uso de acaricidas (WILLADSEN et al., 1996, JONSSON et al.,
2000). Recentemente a investigação voltou-se para os antígenos expostos, tendo como alvo
moléculas envolvidas na interação parasito-hospedeiro (WILLADSEN, 2004; NUTTALL
& LABUDA, 2004).
A capacidade do R. microplus de parasitar o hospedeiro, entrando em contato com
moléculas envolvidas na imunidade inata e adquirida, pode ser melhor compreendido com
o estudo dos componentes da saliva. Estas substâncias da saliva são possíveis moléculas
alvo para o desenvolvimento de vacinas e para melhor entender como a resposta imune do
hospedeiro pode ser alterada ou direcionada para uma resposta efetiva contra o parasito
(REED et al., 2003; WILLADSEN, 2004). Alguns componentes da saliva e glândula
salivar dos carrapatos foram identificados com funções de inibir ou inativar moléculas do
sistema imune (LAWRIE et al., 2005) e da coagulação (CIPRANDI et al., 2006).
JAWORSKI et al., (1995) demonstraram que a CRT é um dos componentes secretados da
saliva do carrapato Amblyomma americanum e que entram em contato com o sistema
imune do hospedeiro durante a alimentação, sendo sugerido que atue modulando o sistema
imune e/ou hemostase do hospedeiro. Em outros parasitas como o Haemonchus contortus
(SUCHITRA et al., 2005) e Trypanosoma cruzi (FERREIRA et al., 2004), também foi
identificada a secreção de CRT com funções imunomodulatórias e anticoagulantes.
As regiões codificantes dos genes da CRT da glândula salivar de R. microplus
(FERREIRA et al., 2002) e HlCRT foram clonadas. Mas, a caracterização das funções das
proteínas recombinantes rBmCRT e rHlCRT na interação parasito hospedeiro e o potencial
imunogênico ainda não tinham sido estudadas. Nesse contexto, objetivamos verificar o
potencial imunomodulador da rBmCRT e rHlCRT.
47
Uma das funções atribuídas à calreticulina é a capacidade de inibir a via clássica do
sistema complemento por ligação ao C1q (KISHORE et al., 1997; KOVACS et al., 1998).
Esta característica foi sugerida para A. americanum (JAWORSKI et al. 1995), N.
americanus (PRITTCHARD et al. 1999), Trypanosoma cruzi (FERREIRA et al, 2004) e
H. contortus (SUCHITRA, 2005). Sendo que a CRT de H. sapiens, H. contornus, N.
americanus tem efeito inibitório da via clássica do complemento já documentado
(KOVACS et al., 1998; SUCHITRA, 2005; JAWORSKI et al. 1995).Analisando as
características físico-químicas dos resíduos das regiões de ligação de C1q, descritos por
KOVACS et al., (1998), identificamos 6 regiões ligantes de C1q em todas as seqüências
avaliadas. No entanto, foram localizadas 3 regiões de ligação de C1q parcialmente
conservadas entre as seqüências., Resumidamente, podemos concluir que a BmCRT e
HlCRT apresentam, respectivamente, 4 e 5 motivos de ligação de C1q com todos resíduos
conservados em comparação a CRT humana (HuCRT). Assim, podemos inferir que a
BmCRT e HlCRT também poderiam ter a capacidade de inibir a ativação da via clássica do
sistema complemento durante a alimentação do R. microplus e H. longicornis,
respectivamente. A predição da disposição espacial das regiões de ligação de C1q das
seqüências de HuCRT, BmCRT e HlCRT se mostraram semelhantes; ratificando a
inferência de que a BmCRT e HlCRT também poderia se ligar a C1q. Reforçando a
hipótese da BmCRT se ligar a C1q, foram descritas três frações protéicas com atividade
anticomplementar para via clássica do complemento em extrato de glândulas salivares do
R. microplus purificado com gel filtração (FERREIRA et al. 1998, 2002).
Recentemente tem aumentado o interesse no estudo de proteínas naturalmente
expostas envolvidas na interação parasito-hospedeiro (WILLADSEN, 2004; NUTTALL et
al., 2004). A proteína ligante de IgG encontrada na saliva de carrapatos -IGBPs (WANG et
al., 1999), proteínas do cemento (MULENGA et al., 1999; TRIMNNEL et al., 2005) são
exemplos de proteínas naturalmente expostas ao hospedeiro e que têm sido propostas como
alvo vacinal. Neste contexto, pode ser incluída a calreticulina, também encontrada na
saliva dos carrapatos. No entanto, necessitando mais estudos para verificar sua função na
interação parasito-hospedeiro e seu potencial vacinal.
No presente trabalho, as regiões codificantes dos genes BmCRT e HlCRT foram
clonadas, respectivamente, nos vetores pET-5b e pET-43a e expressas em E. coli AD494
DE pLysS, produzindo proteínas solúveis. Sendo que a rHlCRT possue cauda de histidina.
48
A obtenção das frações, de ambas proteínas, eluídas da cromatografia de troca iônica com
os tampões fosfato de sódio 10 mM, 400 mM de sódio, pH 6,5 (rBmCRT 400) e tampão
fosfato de sódio 10 mM, 500 mM de sódio, pH 6,5 (rBmCRT 500) mostram a existência de
duas proteícas com cargas iônicas diferentes da rBmCRT ou rHlCRT, necessitando
concentrações de sais diferentes para a eluição da matriz da coluna. Para identificar
diferenças imunogênicas entre as frações protéicas eluídas, estas proteínas após dialisadas
contra tampão PBS, foram inoculadas em camundongos. Foi mostrado por Western blot,
que existe um padrão de reconhecimento diferente entre os soros, independente do
antígeno sondado (rBmCRT 400 ou rBmCRT 500), sugerindo que os epítopos
reconhecidos entre as duas frações protéicas eluídas provavelmente sejam idênticos
imunogenicamente. Além disso, uma banda intensa na posição prevista para rBmCRT é
observada em todos as fitas sondadas com os soros imunes (Figura 8). As demais bandas
possivelmente sejam proteínas truncadas ou degradadas e alguns contaminantes
bacterianos. Este padrão de bandas também foi observado na calreticulina recombinante de
T. cruzi (FERREIRA et al., 2005).
Os bovinos imunizados com rBmCRT e rHlCRT desenvolveram resposta imune
humoral contra as calreticulinas. A imunogenicidade observada no bovino 2 se opõem aos
resultados de FERREIRA et al., (2002) com a rBmCRT, que mostraram ausência de
resposta imune humoral em bovinos vacinados ou infestados. Foi possível detectar IgG
contra CRT nos bovinos, após a segunda dose com rBmCRT ou rHlCRT, mostrando que
ambas são imunogênicas a bovinos. Algumas diferenças da nossa metodologia com a
utilizada por FERREIRA et al., (2002), para a obtenção dos antígenos e na imunização dos
animais, podem ter auxiliado o reconhecimento da rBmCRT pelo bovino. No entanto,
RODRIGUEZ et al., (1995) relataram 6% de animais que não responderam à imunização,
de um total de 98 bovinos vacinados com proteína recombinante Bm86. O bovino
imunizado com rHlCRT mostrou título de 6.000 enquanto o bovino imunizado com
rBmCRT mostrou título de 1.500, estas diferenças no título podem ser variações
individuais, que é freqüentemente observada em vacinação de animais não isogênicos e
tem sido descrita em outros experimentos de vacinação (DA SILVA VAZ et al., 1998;
ANDREOTTI et al., 2002; LEAL et al., 2006). Os títulos de anticorpos se mantiveram por
40 dias após a última dose com redução de 33% e 36% para os bovinos imunizados com
rBmCRT e rHlCRT, respectivamente. Resultados semelhantes foram obtidos por
49
ANDREOTTI et al., (2002), após imunização de bovinos com inibidores de tripsina de R.
microplus (BmTIs) e desafio com carrapatos, atingindo 50% do título máximo 3 meses
após o desafio.
Em humanos, os níveis de anticorpos contra a calreticulina de Amblyomma
americanum e Ixodes scapularis estão diretamente relacionados com os índices de
ingurgitamento dos carrapatos (SANDERS et al., 1998; SANDERS et al., 1999).
Entretanto, os resultados da recuperação e peso de teleóginas, peso e fertilidade dos ovos
de R. microplus dos bovinos imunizados e desafiados, não apresentaram resultados
conclusivos (dados não mostrados). Devido ao pequeno número de animais avaliados e a
grande variação individual que ocorre em animais heterogênicos. Será necessário testar um
número maior de animais para observar a existência de diferença entre os tratamentos.
Os soros dos bovinos imunizados com rBmCRT ou rHlCRT e do coelho com
rBmCRT reconheceram, em extrato de larvas de R. microplus de 20 dias, uma proteína na
posição prevista para a migração da BmCRT. Mostrando que as rBmCRT e rHlCRT
induzem a produção de anticorpos contra BmCRT. Adicionalmente, foi identificado por
Western blot uma proteína com posição prevista para migração da rBmCRT utilizando soro
de um bovino com 4 infestações consecutivas com R. microplus, no entanto, com o soro
pré-imune e da 10ª infestação, não foi possível a identificação desta proteína. Estes
resultados são um indício que a BmCRT estimula o sistema imune do hospedeiro; porém,
alguns mecanismos de proteção dos carrapatos, como o fator inibidor de células B (BIF)
identificado na saliva de Hyalomma asiaticum asiaticum (Yu et al., 2006), podem modular
a resposta do sistema imune do hospedeiro causando imunotolerância e/ou
imunossupressão. Associado a adquisição de resistência dos bovinos, com redução do
título de anticorpos anti-CRT, poderiam justificar a ausência da identificação da rBmCRT
no soro da 10ª infestação.
A diferença no reconhecimento da BmCRT e HlCRT, pelos soros dos bovinos
infestados, podem ser resultante de epítopos diferentes entre essas proteínas. A predição da
antigenicidade gerado através do índice de Jamerson-Wolf confirma a existência de
somente 6 regiões com potencial antigênico diferentes entre a rBmCRT e rHlCRT.
Podemos inferir, avaliando os resultados da predição das regiões com potenciais
antigênicos e do ELISA de competição, que a rBmCRT e rHlCRT desenvolvem resposta
imunogênica a diferentes epítopos entre as proteínas. A identificação de epítopos
50
antigênicos de CRT específicos somente para algumas doenças hepáticas e de cólon
(SÁNCHEZ et al., 2003), reforça a hipótese de anticorpos específicos para rBmCRT ou
rHlCRT, embora ocorra a predominância de anticorpos em comum. Os resultados do
ELISA de competição ratificam a predição de antigenicidade da BmCRT e HlCRT,
sugerindo que ocorre a formação de anticorpos específicos para cada CRT e também de
anticorpos comuns para as duas proteínas. Estes dados sugerem que a resposta gerada pelo
sistema imune dos bovinos é parcialmente diferente para as duas proteínas, ocorrendo
maior especificidade (melhor reconhecimento) para a proteína que estimulou o sistema
imune. Permitindo-nos supor que a não identificação da rHlCRT pelos soros dos bovinos
infestados possa ser devido a uma menor especificidade em relação aos anticorpos
produzidos contra a BmCRT.
A rBmCRT e rHlCRT induzem hipersensibilidade imediata em bovinos
imunizados. A hipersensibilidade imediata consiste em uma seqüência típica de eventos
com exposição do antígeno, ativação de células Th2 específica para o antígeno, produção
de anticorpos IgE, ligação do anticorpo ao receptor de mastócitos e degranulação dos
mastócitos e eosinófilos liberando fatores vasoativos, espasmódicos e quimiotáticos que
causaram permeabilidade dos vasos sanguíneos conseqüentemente edema e taxia de
PBMC, macrófagos e neutrófilos (ABBAS et al., 2005). Testes de hipersensibilidade
cutânea têm sido utilizados para determinar antígenos responsáveis por reações alérgicas.
HLATSHWAYO et al., 2004 inocularam extrato de Amblyomma cajennense na orelha de
coelhos induzindo hipersensibilidade cutânea em indivíduos previamente infestados. A
inoculação de antígenos purificados de larvas de R. microplus produziram reações de pele
relacionados com o nível de resistência do hospedeiro (WILLADSEN et al., 1978).
Cobaias vacinados com o antígeno 64TRP apresentaram lesões papulares eritematosas e
necrose da pele, com abandono do local de alimentação pelo R. sanguineus. Na
histopatologia, foi visualizada hiperplasia de epitélio com fissuras epidérmicas, infiltrados
de eosinófilos e basófilos (TRIMNNEL et al., 2005). Quanto ao tipo de reação de
hipersensibilidade cutânea induzida no local de fixação dos carrapatos R. sanguineus em
hospedeiros infestados, observou-se uma forte reação de hipersensibilidade imediata em
cães e camundongos (hospedeiros susceptíveis), enquanto que cobaias (hospedeiros
resistentes) desenvolveram uma pequena reação imediata, e forte reação de
hipersensibilidade tardia (SZABÓ et al., 1995; FERREIRA et al., 2003). Estes resultados
51
sugerem uma imunossupressão causada pela saliva de carrapatos sobre células de
linfonodos de cães e camundongos. O mesmo não ocorrendo para células de linfonodos de
cobaias infestadas sucessivamente, sugerindo que esses hospedeiros demonstram
diferenças significativas na elaboração da resposta imune contra carrapatos (FERREIRA et
al., 2003). FRANZIN (2005), verificou a predominância de um perfil de citocinas de
padrão Th1 na resistência a carrapatos em cobaias, enquanto diversos trabalhos sugerem
uma resposta Th2 para cães, camundongos e coelhos infestados por R. sanguineus ou A.
cajennense (HLATSHWAYO et al., 2004; MUKAI et al., 2002; SZABÓ et al., 2005). Em
bovinos a resistência natural adquirida contra o carrapato desenvolve linfócitos T e B de
memória, que permitem uma resposta de hipersensibilidade imediata mais eficiente contra
o estágio de larva, a ativação do sistema complemento e a produção de anticorpos contra
substâncias secretadas pelos carrapatos. Pouco se sabe a respeito do tipo de produtos
secretados pelas larvas nos hospedeiros; porém, seriam estas secreções que provavelmente
estariam envolvidos no desenvolvimento da resistência induzida por infestações
sucessivas. A saliva, secretada durante a alimentação do carrapato, possui um “coquetel”
de substâncias com atividade moduladora das reações imunes (WIKEL et al., 1999)
auxiliando a permanência do carrapato no bovino. A função imunomoduladora descrita
para a CRT em outras espécies de carrapatos sugere que a BmCRT e HlCRT estejam
envolvidas no controle das reações inflamatórias e de hipersensibilidade local. A
administração de rBmCRT e rHlCRT em bovinos imunizados com estas proteínas causou
hipersensibilidade imediata 30 a 120 minutos após a inoculação intradérmica, não sendo
identificado alterações histopatológicas entre os tratamentos e controles. A presença de
edema com a metade do diâmetro dos tratamentos, quando inoculado o controle de
purificação (expressão com vetor selvagem), indica que a purificação realizada por
cromatografia de troca iônica seguida de gel filtração não foi capaz de remover totalmente
os contaminantes bacterianos, como o LPS, que são abundantes em E. coli e são
conhecidas moléculas pró-inflamatórias (GWAKISA et al., 2001). A discreta reação
observada no bovino 2 (imunizado com rBmCRT) pode estar relacionada a diferenças de
sensibilidade individuais ao antígeno (HLATSHWAYO et al., 2004). Estes resultados
sugerem que os bovinos desenvolveram uma resposta imune Th2 contra a rBmCRT e
rHlCRT, resultando no aumento de mastócitos e eosinófilos, estimulando a produção de
anticorpos. Embora em algumas espécies susceptíveis a carrapatos a resposta Th2
52
(humoral) é predominante, em bovinos a reposta humoral está relacionada com indivíduos
mais resistentes (WIKEL et al., 1976). A saliva de I. ricinus inibe a proliferação de células
B estimuladas e a secreção de IL-10 por células B ativadas (HANNIER et al., 2003;
HANNIER et al., 2004), sendo outro indicativo que o envolvimento de anticorpos seja
importante para a proteção. Outro estudo, avaliou o padrão de imunoglobulinas anti-saliva
de R. microplus, em bovinos com diferentes graus de resistência natural ao carrapato,
encontrando maiores níveis de IgG em animais resistentes (KASHINO et al., 2005). Além
da correlação entre título de anticorpos e proteção, outros achados experimentais sugerem
que os anticorpos sejam a principal linha de defesa contra os carrapatos. Moléculas de IgG
intactas foram observadas na hemolinfa de diferentes carrapatos, como Ixodes ricinus
(BROSSARD et al., 1984), Hyalomma excavatum, Rhipicephalus sanguineus (BEM-
YAKIR, 1989) e R microplus (Da SILVA VAZ Jr. et al., 1996). A identificação de uma
proteína ligante de IgG (immunoglobulin G-Binding Proteins – IGBPs) na saliva de R.
appendiculatus é outro achado que demonstra a importância dos anticorpos na resposta
contra carrapatos (WANG et al., 1994). Em R. microplus foi identificado um gene similar
a IGBP sendo abundantemente expresso na glândula salivar de machos (KASHINO et al.,
2005). Estes autores sugerem que a presença de uma IGBP na saliva de R. microplus é um
forte indicativo de que os anticorpos exercem um efeito deletério sobre o carrapato. Apesar
das evidências experimentais, ainda não foi obtida uma prova definitiva de como os
anticorpos atuam contra os carrapatos e da sua verdadeira importância no controle da
parasitose.
Para que os carrapatos se alimentem de sangue, por vários dias, sem que ocorra a
coagulação, um coquetel de substâncias anticoagulantes são secretados junto com a saliva
do carrapato, permitindo que o sangue estocado não coagule em seu intestino e seja
metabolizado de forma gradativa durante o período de ovoposição. A saliva dos carrapatos
contem algumas substâncias com função anticoagulante, como a microfilina (CIPRANDI
et al., 2006) e a BmAP (HORN et al., 2000). Estas proteínas com atividade inibitória da
trombina, presentes na saliva do R. microplus, impedem a hidrólise do fibrinogênio.
Alguns trabalhos mostram que a CRT desempenha funções anticoagulantes (OSTWALD et
al., 1974; SUCHITRA et al., 2005; TAN et al., 2006), permitindo-nos supor que a CRT
encontrada na saliva do R. microplus também possa desempenhar funções anticoagulantes.
A primeira função descrita da calreticulina humana foi como proteína ligante de cálcio no
53
reticulo endoplasmático (OSTWALD et al., 1974). O domínio C-terminal (domínio C)
apresentando alta capacidade / baixa afinidade de ligação a cálcio (25 μM) e o domínio P,
que é um domínio interno, o qual apresenta um sítio de ligação de cálcio de alta afinidade e
baixa capacidade (1 μM) de cálcio (OSTWALD et al., 1974). A incubação de 0,8 ou 3,1
μM rBmCRT com 6 mM de cálcio retardaram a recalcificação plasmática. O efeito
anticoagulante foi observado incubando a rBmCRT com cálcio previamente. Não
ocorrendo alteração do tempo de recalcificação plasmática quando incubado a rBmCRT
previamente com plasma e após adicionando cálcio; em comparação com controle sem
adição de rBmCRT. Sugerindo que a rBmCRT está com sua estrutura tridimensional
correta dos sítios de ligação para o cálcio. É importante lembrar que, a CRT recombinante
de N. americanus não ligou cálcio (KASPER et al., 2001). Os efeitos inibitórios da
rBmCRT sobre trombina bovina não foram observados (dados não mostrados). Ainda, é
descrita a capacidade da CRT modular a produção de óxido nítrico pelos vasos endoteliais,
bloqueando adesão e ativação plaquetária e a liberação de serotonina (KUWABARA et al.,
1995), evitando a formação de trombos em vasos lesionados, reduzindo o tempo
coagulação do sangue total e de formação de coágulos dependentes de plaquetas (DAI et
al., 1997)
CONCLUSÕES
A BmCRT é imunogênica a bovinos.
As frações rBmCRT 400 e rBmCRT 500 que foram utilizadas para imunização de
camundongos, produziram anticorpos a epítopos comuns.
A análise, in silico, com o modelo de predição de potenciais antigênicos de
Jamerson-Wolf e in vitro, por ELISA de competição, com a rBmCRT e a rHlCRT sugerem
a presença de epítopos diferentes e em comum.
A capacidade de ligação de cálcio das CRTs é mantida na rBmCRT, a qual é capaz
de aumentar o tempo de recalcificação plasmática; no entanto, não são observados efeitos
sobre a trombina bovina.
O mesmo número predito de sítios com potencial ligante de C1q são encontrados na
rBmCRT e na rHlCRT. Estando todos os sítios dispostos de formas semelhantes nas
superfícies das moléculas preditas, quando comparadas à HuCRT, que possui potencial
inibidor do complemento e ligante de C1q já conhecidos. Portanto, sugerimos que a
rBmCRT e rHlCRT também desempenhem estas funções.
PERSPECTIVAS
A caracterização de algumas funções da calreticulina do R. microplus e seu
potencial imunogênico a bovinos foi realizado neste trabalho, no entanto, para melhor
entendermos a interação parasito-hospedeiro ainda é necessário ser avaliada:
- a predominância de estímulo a Th1 ou Th2 do sistema imune de bovinos.
- testar o potencial alergênico e ou imunossupressor da calreticulina livre de
contaminantes pró-inflamatórios.
- verificar a ocorrência de IgE contra BmCRT no soro e na pele de animais
infestados e imunizados.
- realizar desafio com R. microplus com um número suficiente de bovinos
imunizados para realizar análise estatística sobre a sobrevivência dos carrapatos e
fertilidade dos ovos.
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