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Universidade de São Paulo
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Química
Programa de Pós-Graduação em Química
Caracterização cinética da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal
do tecido branquial do ermitão intertidal Clibanarius vittatus
(CRUSTACEA, DECAPODA)
Rubia Regina Gonçalves Sivieri
Tese apresentada à Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, como parte das
exigências para obtenção do título de Doutor em
Ciências, Área: Química.
RIBEIRÃO PRETO – SP
2007
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Universidade de São Paulo
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Química
Programa de Pós-Graduação em Química
Caracterização cinética da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal
do tecido branquial do ermitão intertidal Clibanarius vittatus
(CRUSTACEA, DECAPODA)
Rubia Regina Gonçalves Sivieri
Orientador: Prof. Dr. Francisco de Assis Leone
Tese apresentada à Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto da
Universidade de São Paulo, como parte das
exigências para obtenção do título de Doutor em
Ciências, Área: Química.
RIBEIRÃO PRETO – SP
2007
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Gonçalves, Rubia Regina
Caracterização cinética da (Na
+
,K
+
)-
ATPase da fração microsomal do
tecido branquial do ermitão intertidal
Clibanarius vittatus
(CRUSTACEA, DECAPODA). Ribeirão Preto, 2007.
114 pág.
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e
Letras de Ribeirão Preto/USP - Área de concentração: Química.
Orientador: Leone, Francisco de Assis.
1. (Na
+
,K
+
)-ATPase, 2. Clibanarius vittatus, 3. brânquias de crustáceos,
4. caracterização cinética.
DEDICO
Ao meu marido Disney
Realmente você foi um presente de Deus, meu maior tesouro.
Se tive dificuldades ao longo desse caminho, você com certeza,
suavizou grande parte dele... sua dedicação, compreensão, amizade
e amor são alicerces seguros para o nosso convívio. Estou
imensamente feliz, pois nossos objetivos e metas estão sendo pouco
a pouco alcançados com merecido sucesso pelo grande esforço e
dedicação por nós dedicados.
Obrigada por me dar forças, quando achava não mais possuí-las,
obrigada por me ensinar a voar, quando minhas asas já não batiam
mais...
Eu o amo, muito além do que consigo escrever ou expressar!!!
Aos meus pais, Rubens e Leila,
Difícil defini-los,...tão pouco escrever em poucas palavras meus sinceros
sentimentos...Talvez eu passe toda minha existencia sem conhecer pessoas melhores...São
para mim um exemplo de vida, de amor, de perseverança e acima de tudo de moralidade.
Vocês renunciaram a muitos de seus sonhos em prol aos meus, nem que eu quisesse poderia
recompensá-los por completo. Tenho por vocês imensa gratidão por tudo que me doaram
com muito amor e carinho. É com muita alegria que divido com vocês mais uma conquista.
Eu sempre vou amar vocês por aquilo que são, pelo que sempre fizeram e pelo o que ainda
fazem por mim.
Obrigado e que Deus os abençoe.
A minha irmã Rudilea,
Acima de tudo uma amiga. Sem trasmitir com clareza muitas vezes o que
sente ou pensa, é uma pessoa repleta de sentimentos. Sei que torce por mim,
e eu sei que posso contar com você sempre...
Com amor e carinho
Ao meu orientador, Prof. Dr. Francisco de Assis Leone,
A você que confiou e me proporcionou a chance de dar o
primeiro passo, meu muito obrigado!
Constantemente pessoas passam pelo nosso caminho deixando
sua marca, provocando reações, sentimentos e comportamentos
antes não percebidos ou adormecidos. Espero ter lhe deixado o
que há de melhor em mim!
Que Deus o ilumine sempre, que seu caminho seja sempre
repleto de saúde, alegrias, amigos, família e amor, pois essas
são com certeza nossas verdadeiras riquezas.
Sonhe
Clarice Lispector
”Sonhe com aquilo que você quiser.
Vá para onde você queira ir.
Seja o que você quer ser, porque você possui apenas uma vida e nela só temos
uma chance de fazer aquilo que queremos.
Tenha felicidade bastante para fazê-la doce.
Dificuldades para fazê-la forte.
Tristeza para fazê-la humana. E esperança suficiente para fazê-la feliz.
As pessoas mais felizes não têm as melhores coisas. Elas sabem fazer o
melhor das oportunidades que aparecem em seus caminhos.
A felicidade aparece para aqueles que choram. Para aqueles que se machucam.
Para aqueles que buscam e tentam sempre.
E para aqueles que reconhecem a importância das pessoas que passam por
suas vidas.
O futuro mais brilhante é baseado num passado intensamente vivido.
Você só terá sucesso na vida quando perdoar os erros e as decepções do
passado.
A vida é curta, mas as emoções que podemos deixar, duram uma eternidade.
A vida não é de se brincar porque em pleno dia se morre.”
AGRADECIMENTOS
Agradeço sobretudo a Deus que me permitiu chegar até aqui e viver e aprender com
muita intensidade todas as fases desse trabalho.
A minha tia Neli que com carinho, paciência e muita compreensão têm estado a
meu lado nos momentos de tristezas, alegrias e conquistas, sempre com gestos e palavras
de conforto.
Aos meus familiares tia D’arc, avó Therezinha, Thaila, Maira, Valdirene, Toninho,
Vanderlei, Rosângela, Gigio, tia Nair, tio Natalino e tantos outros que com amor me
incentivaram e torceram por mim durante o percurso de mais um trabalho.
Aos amigos do Centro Universitário Barão de Mauá, Silvia Zucchi, Silvio Cecchi,
Carmito, Margareth, Orivaldo, Marcelo Zini, Mônica Zini, Ana Rosa, Omar Cozac (in
memorian), Maria Helena, Lucimara, Adalberto Gonçalves, Jorge Nunes, Silvana S.
Nunes, Jorge Abud, Cristina, Luis Augusto, Luis Henrique, Tânia, Tokico, Regilene, Ilka,
Celso, Dulce do Val, Dulce, Sara, Renata, Andréia, Kátia e tantos outros que nessa longa
caminhada compartilharam comigo doando companheirismo e incentivo durante a
realização desse trabalho.
Aos amigos Profa. Dra. Fernanda Anibal “amiga e companheira de viagem e
trabalho”, Luis Bispo, Orlando Mesquita, Douglas Masui, Arthur Oliveira, Luciana
Rezende pelo apoio e amizade durante a realização desse trabalho.
Aos colegas do laboratório da USP, Ivana, Daniela, Lílian, Carlos, Nara, Hérica,
Kátia, Prislaine, e a todos os outros que conviveram comigo durante a realização deste
trabalho.
Ao Prof. Dr. Fernando Luis Medina Mantelatto e seus alunos, que contribuíram de
forma inestimável para a realização deste trabalho na coleta dos animais.
A Prof
a
. Dra. Rosa dos P. I. Furriel, por sua amizade e seus conhecimentos
indispensáveis para o sucesso desse trabalho.
Aos docentes e funcionários dos Departamentos de Química e Biologia da
Faculdade de Filosofia Ciências e Letras de Ribeirão Preto-USP.
A todos que contribuíram mesmo que indiretamente para a minha formação e para a
realização deste trabalho.
À FAPESP e CNPq pelos auxílios recebidos.
RESUMO
GONÇALVES-SIVIERI. R.R. Caracterização cinética da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração
microsomal do tecido branquial do ermitão intertidal Clibanarius vittatus
(CRUSTACEA, DECAPODA). 2007. Tese (Doutorado). – Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2007.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase presente no tecido branquial dos crustáceos osmorreguladores é um
componente essencial do sistema de regulação iônica e osmótica e de excreção ativa de
NH
4
+
. Dessa forma, a caracterização cinética da (Na
+
,K
+
)-ATPase branquial de
Clibanarius vittatus pode fornecer dados importantes para a compreensão dos mecanismos
bioquímicos desses processos. Nesse sentido, foram realizados ensaios cinéticos com a
fração microsomal obtida do tecido branquial de C. vittatus. Os dados obtidos revelaram a
presença de um único pico com atividade ATPase. Os dados obtidos a partir da hidrólise
do substrato ATP revelaram a presença de dois sítios, um de alta afinidade que apresenta
interação sítio-sítio (n
H
=1,9; K
0,5
= 63,8 ± 2,9 nM e V= 19,1 ± 0,8 U/mg) e outro de baixa
afinidade, com características Michaelianas (n
H
=1,0; K
M
= 44,1 ± 2,6 µM e V
M
= 123,5 ±
6,1 U/mg). Além disso, foi observada interação do tipo sítio-sítio (n
H
= 1,8) para
estimulação dos íons magnésio (V= 132,0 ± 5,3 U/mg e K
0,5
= 0,36 ± 0,02 mM). Por outro
lado, as interações dos íons sódio (K
0,5
= 7,4 ± 0,4 mM), potássio (K
0,5
= 1,51 ± 0,05 mM) e
amônio (K
0,5
= 4,5 ± 0,2 mM) obedeceram a uma cinética Michaeliana. Os dados obtidos
mostraram que em condições saturantes de íons potássio, a atividade enzimática aumenta
de maneira concentração-dependente quando na presença de íons amônio (V= 290,8 ±
14,4 U/mg e K
M
= 2,9 ± 0,1 mM). A presença da ouabaína no meio reacional acarretou
66% de inibição (K
I
= 117,3 ± 3,5 µM), indicando a presença de outras ATPases. A
atividade K
+
-fosfatase, medida usando o substrato sintético PNFF revelou a presença de
um único sítio de hidrólise (V= 47,4 ± 1,9 U/mg e K
M
=
1,0 ± 0,04 mM) com características
Michaelianas (n
H
= 1,1). Entretanto, para os íons Mg
2+
(n
H
= 2,6 e K
0,5
= 0,6 ± 0,1 mM), K
+
(n
H
= 1,4 e K
0,5
= 3,7 ± 0,1 mM) e NH
4
+
(n
H
= 1,9 e K
0,5
= 19,3 ± 0,7 mM) foram
observadas interações sítio-sítio. Em conjunto, os resultados cinéticos obtidos para a
(Na
+
,K
+
)-ATPase branquial de C. vittatus, reforçam a possibilidade de que essa enzima
contribui eficientemente com o mecanismo adaptativo desencadeado em resposta à
exposição a altas concentrações externas de amônia. É importante ressaltar que o presente
trabalho representa o primeiro estudo de caracterização cinética da enzima (Na
+
,K
+
)-
ATPase no ermitão C. vittatus, um animal inserido em um microambiente constituído pela
concha. Finalmente, este trabalho agrega informações relevantes relacionadas ao grupo dos
Decapoda, em relação ao papel da (Na
+
,K
+
)-ATPase nos processos metabólicos e de
osmorregulação nos crustáceos.
Palavras chave: (Na
+
,K
+
)-ATPase, Clibanarius vittatus, brânquias de crustáceos,
caracterização cinética.
ABSTRACT
GONÇALVES-SIVIERI. R.R. Kinetic characterization of gill microsomal (Na
+
,K
+
)-
ATPase from intertidal hermit crab Clibanarius vittatus (CRUSTACEA,
DECAPODA). 2007. Thesis (Doctoral) – Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de
Ribeirão Preto, Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto, 2007.
(Na
+
,K
+
)-ATPase is an essential component of osmotic and iono-regulatory system of
crustacean gill and plays a relevant role in NH
4
+
excretion. Thus, the kinetic
characterization of Clibanarius vittatus gill microsomal (Na
+
,K
+
)-ATPase, can provide
crucial data to the understanding of osmoregulating and excretion processes of these
animals in different environments, especially the shell microenvironment. In this way,
kinetic assays were performed with gill microsomal fraction. The results showed a single
protein peak with ATPase activity. The results from ATP hydrolysis revealed the presence
of two different sites. One of them is related to the high-affinity with site-site interaction
(n
H
=1.9; K
0.5
= 63.8 ± 2.9 nM and V= 19.1 ± 0.8 U/mg) and the other shows low-affinity,
obeying Michaelis-Menten kinetics (n
H
=1.0; K
M
= 44.1 ± 2.6 µM and V
M
= 123.5 ± 6.1
U/mg). Moreover, site-site interaction (n
H
= 1.8) was observed to the magnesium ions
stimulation (V= 132.0 ± 5.3 U/mg and K
0.5
= 0.36 ± 0.02 mM). On the other hand, the
stimulations of Na
+
(K
0.5
= 7.4 ± 0.4 mM), K
+
(K
0.5
= 1.51 ± 0.05 mM) and NH
4
+
(K
0.5
= 4.5
± 0.2 mM), followed Michaelis-Menten kinetics. At saturating concentrations of potassium
ions, the enzyme activity was increased in a dependent-concentration manner with
increasing ammonium ions concentration (V= 290.8 ± 14.4 U/mg and K
M
= 2.9 ± 0.1 mM).
Ouabain inhibited 66% of (Na
+
,K
+
)-ATPase activity (K
I
= 117.3 ± 3.5 µM) of the gill
microsomal enzyme, indicating the presence of other ATPase activities. The K
+
-fosfatase
activity was also measured using PNPP, a synthetic substrate. PNPP hydrolysis resulted in
single site hydrolysis site, obeying the Michaelis-Menten kinetics (n
H
= 1.1). However, it
was observed site-site interactions for Mg
2+
(n
H
= 2.6; K
0.5
= 0.6 ± 0.1 mM), K
+
(n
H
= 1.4;
K
0.5
= 3.7 ± 0.1 mM) and NH
4
+
(n
H
= 1.9; K
0.5
= 19.3 ± 0.7 mM) ion estimulations. Taken
together, these results provide important informations on the kinetic properties of gill
(Na
+
,K
+
)-ATPase of C. vittatus, emphasizing the synergiistic stimulation induced by K
+
and NH
4
+
, which appear to contribute to the efficient adaptive mechanism triggered by
exposure of high external ammonia concentrations. It is important to emphasize that this is
the first study on the kinetic properties of (Na
+
,K
+
)-ATPase enzyme of the hermit crab C.
vittatus. Finally, this study provide information concerning the (Na
+
,K
+
)-ATPase role in
the metabolic and osmoregulating mechanisms of this Decapoda group
Key words: (Na
+
,K
+
)-ATPase, Clibanarium vittatus, crustacean gill, kinetic
characterization.
ABREVIATURAS
ADP: adenosina 5’difosfato
ATP: adenosina 5’ trifosfato
ATPase: adenosina 5’ trifosfatase
BCIP: 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato
Da: Dalton
DMSO: dimetilsulfóxido
DTT: ditiotreitol
EDTA: ácido etilenodiamino-tetra acidoacético
FEP: fosfoenolpiruvato
FGQ: fosfoglicerato quinase
GAF: 3-fosfogliceraldeído
GAFDH: gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase
Hepes: ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-etanolsulfônico
K
M
: constante de Michaelis-Menten
K
i
: constante de inibição
K
0,5
: constante de dissociação aparente
LDH: lactato desidrogenase
n
H
: número de Hill
NADH: nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma reduzida)
NAD
+
: nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma oxidada)
NBT: nitroblue tetrazolium
Pi: fosfato inorgânico
PQ: piruvato quinase
PNFF: p-nitrofenilfosfato
PNFFase: p-nitrofenilfosfatase
Tris: tris-(hidroximetil)aminometano
v: velocidade inicial
v
c
: velocidade inicial corrigida
V: velocidade máxima
SUMÁRIO
1. INTRODUÇÃO .........................................................................11
1.1 A (Na
+
,K
+
)-ATPase......................................................................12
1.2 O crustáceo Clibanarius vittatus...................................................24
1.3 Caracterização branquial..............................................................27
1.4 Objetivos gerais ...........................................................................32
1.5 Objetivos específicos ...................................................................33
2. MATERIAL E MÉTODOS .......................................................34
2.1 Coleta de animais.........................................................................35
2.2 Remoção de brânquias .................................................................36
2.3 Preparação da fração microssomal do tecido branquial..................36
2.4 Centrifugação em gradiente de densidade de sacarose....................37
2.5 Determinação da atividade ATPase...............................................37
2.6 Determinação da atividade PNFFase.............................................39
2.7 Preparação do gliceraldeído-3-fosfato...........................................39
2.8 Preparação da solução de ortovanadato.........................................40
2.9 Tratamento das enzimas dos sistemas de acoplamento...................40
2.10 Dosagem de proteína....................................................................41
2.11 Eletroforese em gel de poliacrilamida...........................................41
2.12 Western blotting ..........................................................................41
2.13 Tratamento dos resultados............................................................42
3. RESULTADOS..........................................................................43
4. DISCUSSÃO..............................................................................80
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................96
1. INTRODUÇÃO
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
12
1. INTRODUÇÃO
1.1. A (Na
+
,K
+
)-ATPase
O transporte dos íons sódio e potássio pela (Na
+
,K
+
)-ATPase foi
descrito pela primeira vez por Skou (1957) e essa descoberta lhe rendeu o
prêmio Nobel 40 anos mais tarde. Post & Jolly (1957) demonstraram em
eritrócitos um transporte eletrogênico de 3 íons Na
+
para o exterior da célula e
dois íons K
+
para o interior da célula, e que era inibido por um esteróide
cardíaco (Pedersen, 2005).
A (Na
+
,K
+
)-ATPase (E.C.3.6.1.37), também conhecida como bomba de
sódio, é uma proteína integral localizada na membrana plasmática da maioria
das células animais. Participa do transporte de três íons sódio para o meio
extracelular em troca de dois íons potássio para o meio intracelular através
das membranas plasmáticas. A energia para esse trabalho, resulta da hidrólise
da ligação do fosfato terminal do ATP que se liga a um resíduo de aspartato
na proteína, permitindo então o transporte desses íons (Lingrel &
Kuntzweiller, 1994; Beaugé et al., 1997; Emery et al., 1998; Sweeney & Klip,
1998; Skou, 1998; Hu & Kaplan, 2000; Jorgensen & Pedersen, 2001;
Horisberger, 2004). Esse transporte é responsável pelo estabelecimento de um
gradiente eletroquímico através da membrana, essencial para o balanceamento
iônico, regulação do volume celular, manutenção dos potenciais de membrana
e transporte de substâncias vitais para o meio intracelular (Crambert et al.,
2000; Jorgensen & Pedersen, 2001).
Post & Jolly (1957) mostraram que no curso da sua reação a (Na
+
,K
+
)-
ATPase é covalentemente fosforilada, uma propriedade única dessa classe de
ATPases de transporte, conhecida como ATPase do tipo P, para designar seu
estado de fosforilação em uma etapa do ciclo catalítico (Lutsenko & Kaplan,
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
13
1993; Crambert et al., 2000; Geering, 2000; Kaplan, 2002; Horisberger, 2004;
Pedersen, 2005).
A (Na
+
,K
+
)-ATPase é constituída por duas subunidades, denominadas α
e β (Painel 1). A subunidade α, contém cerca de 1000 resíduos de
aminoácidos e Mr da ordem de 110 kDa. Contém os sítios de ligação para o
substrato da enzima e existe na forma de um intermediário fosforilado durante
o ciclo catalítico (Lingrel & Kuntzweiler, 1994; Pressley et al., 2005). A
heterogeneidade da subunidade α, foi primeiramente detectada por Sweadner
(1979) que observou diferenças de mobilidade eletroforética e esta
diversidade tem sido confirmada repetidamente por métodos de clonagem
molecular. Quatro isoformas da subunidade α já foram identificadas em
mamíferos e estão correlacionadas com genes diferentes (Shull et al., 1986;
Herrera et al., 1987; Shamraj & Lingrel, 1994), apresentando diferenças na
afinidade por potássio, sódio, ATP e na sensibilidade à ouabaína (Blanco &
Mercer, 1998; Crambert et al., 2000; Mobasheri et al., 2000; Segall et al.,
2001; He et al., 2001).
Essas isoformas possuem padrões diferentes de expressão em tecidos
específicos e são classificadas como subunidades α1, α2, α3 e α4, sendo que
a isoforma α1 é expressa praticamente em todos os tecidos. A isoforma α2 é
expressa principalmente nos tecidos nervoso e adiposo, coração e músculo
esquelético. A isoforma α3 é encontrada primariamente no tecido nervoso,
embora também tenha sido detectada em outros locais, incluindo macrófagos
multinucleados, glândula pineal e endotélio da córnea (Shyjan et al., 1990;
Vignery et al., 1991; Huang et al., 2003). Estudos relacionados com a
expressão da isoforma α4 têm sugerido que a sua expressão está restrita a
tecidos reprodutivos (Blanco et al., 2000; Duran et al., 2004). Homólogos
diretos das diferentes isoformas da subunidade α dos vertebrados ainda não
foram descritos nos invertebrados e as duas isoformas encontradas nos
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
14
crustáceos Artemia salina e Artemia franciscana não correspondem
diretamente a nenhuma das isoformas dos vertebrados (Cortas & Edelman,
1988; Baxter-Lowe et al., 1989; Cortas et al., 1989; Macías et al., 1991;
Escalante et al., 1995; GarciaSaez et al., 1997; Emery et al., 1998; Jorgensen
& Pedersen, 2001).
Painel 1. Topologia de membrana proposta para as subunidades α e β da (Na
+
,K
+
)-
ATPase. O modelo mostra as subunidades α e β e que podem estar associadas a
subunidade γ. . Modificado de Horisberger (2004).
Os estudos de clonagem molecular da subunidade α da (Na
+
,K
+
)-
ATPase sugerem a presença de 10 segmentos transmembrana (Geering, 2000;
Mobasheri et al., 2000; Rice et al., 2001; Donnet et al., 2001; Kaplan, 2002;
Jorgensen et al., 2003).
A subunidade α pode ser dividida em 3 domínios globulares distintos
que estão voltados para o citoplasma e que são conectados por uma haste
estreita a um domínio transmembrana de forma aproximadamente cilíndrica e
compacta (Rice et al., 2001; Kaplan, 2002; Jorgensen et al., 2003;
Horisberger, 2004). Estes domínios foram denominados P (domínio de
fosforilação), domínio A (atuador) e N (domínio de ligação de nucleotídeos).
Similarmente ao domínio transmembrana, apresentam grande similaridade
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
15
estrutural com os domínios identificados para a Ca
2+
-ATPase de retículo
sarcoplasmático (Toyoshima et al., 2000; Sweadner & Donnet, 2001;
MacLennan & Green, 2000; Kaplan, 2002; Jorgensen et al., 2003).
Resumidamente, o domínio A da (Na
+
,K
+
)-ATPase é constituído pela região
N-terminal e a alça citoplasmática da cadeia polipeptídica localizada entre os
segmentos transmembrana M2 e M3 (Kaplan, 2002; Jorgensen et al., 2003;
Horisberger, 2004). Já os domínios N e P estão co-localizados na alça
citoplasmática formada entre os segmentos transmembrana M4 e M5 da
subunidade α, formada aproximadamente por 430 resíduos de aminoácidos, e
contém o sítio de ligação do ATP e de fosforilação da enzima,
respectivamente (Goldshleger & Karlish, 1999; Toyoshima et al., 2000;
Jorgensen & Pedersen, 2001; Kaplan, 2002; Jorgensen et al., 2003;
Horisberger, 2004).
A subunidade β, contém cerca de 300 resíduos de aminoácidos,
apresenta Mr da ordem de 50 kDa e apenas um domínio transmembrana cuja
extremidade N-terminal está voltada para o citoplasma. Esta subunidade é
altamente glicosilada e está praticamente voltada para o meio extracelular
(Bar Shimon et al., 1998; Geering, 2000; Hasler et al., 2001; Rice et al., 2001;
Geering, 2001; Kaplan, 2002; Horisberger, 2004). Estudos de clonagem
molecular têm identificado a heterogeneidade da subunidade β, mostrando as
isoformas β1, β2 e β3. Originalmente a isoforma β1 foi isolada a partir do
tecido renal, enquanto as outras isoformas têm sido identificadas em vários
tecidos (Martin-Vasallo et al., 1989; Malik et al., 1996).
A estabilização do complexo da (Na
+
,K
+
)-ATPase ocorre através da
interação da região extracelular da subunidade β com a alça extracelular da
subunidade α entre os segmentos M7 e M8 (Or et al., 1998; Bar Shimon et al.,
1998; Wang & Farley, 1998; Béguin et al., 2000; Rice et al., 2001; Hasler et
al., 2001; Jorgensen et al., 2003; Horisberger, 2004).
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
16
A subunidade β apresenta três sítios de ligação de oligossacarídeos (N-
ligados) no domínio extracelular, além de seis resíduos de cisteína que
formam três pontes dissulfeto intracadeia, aparentemente essenciais para a
atividade da enzima (Kirley, 1989; Miller & Farley, 1990; Bar Shimon et al.,
1998). A redução destas pontes dissulfeto com β-mercaptoetanol ou
ditiotreitol resulta na perda da atividade catalítica, atribuída a uma
desestabilização da oclusão dos íons potássio pela enzima, (Kawamura &
Nagano, 1984; Kirley, 1990; Lutsenko & Kaplan, 1993). Entretanto, vários
estudos têm sugerido que a glicosilação da subunidade β não é importante
para as propriedades de transporte ou de hidrólise da enzima (Zamofing et al.,
1989). Por outro lado, Beggah et al. (1997) mostraram que a N-glicosilação
possui papel importante no enovelamento das subunidades de proteínas
oligoméricas. Além disso, há evidencias de que a subunidade β é essencial
para a atividade catalítica, pois a separação das subunidades α e β resulta na
inativação da enzima (Xie et al., 1996; Gatto et al., 2001).
A atividade da (Na
+
,K
+
)-ATPase está diretamente ligada à
heterodimerização das subunidades αβ, na qual a subunidade β atua como
uma chaperona específica, estabilizando o enovelamento correto da
subunidade α, favorecendo o direcionamento do dímero para a membrana
plasmática (Béguin et al., 1998a; Abriel et al., 1999; Béguin et al., 2000;
Martin et al., 2000; Geering, 2000; Mobasheri et al., 2000; Hasler et al., 2001;
Geering, 2001; Jorgensen et al., 2003; Horisberger, 2004). Além disso, têm
sido relatado que a subunidade β pode modular a atividade catalítica da
enzima bem como o transporte pelos íons potássio e sódio (Kaplan et al.,
1998; Abriel et al., 1999; Mobasheri et al., 2000; Hasler et al., 1998, 2001;
Kaplan et al., 2001; Geering, 2001).
Recentemente, Horisberger (2004) propôs um modelo elegante para
descrever o acoplamento entre a hidrólise do ATP (domínios citoplasmáticos)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
17
e o transporte dos cátions pela (domínio transmembrana). Esse modelo,
mostrado no Painel 2, descreve a presença dos domínios A, N e P, chamados
de “centro motor” das ATPases do tipo P. Devido ao alto grau de conservação
da seqüência nesses domínios, acredita-se que o mecanismo existente nesta
parte da proteína pode ser muito semelhante em todas as P-ATPases.
Entretanto, as alterações estéricas que definem os sítios dos cátions são
específicas para cada P-ATPase. Na etapa inicial do ciclo reacional a enzima
no estado E1, com o ATP presente em seu sítio de ligação, liga três íons sódio
em seu sítio interno de alta afinidade provocando uma alteração
conformacional onde o domínio N sofre uma rotação e posiciona o fosfato γ
do ATP fechando o sítio de fosforilação. Nesta posição, o ATP parece realizar
uma ponte entre os domínios P e o N (Toyoshima & Mizutami, 2004). Essa
ponte pode ser rompida permitindo a transferência do fosfato γ para o resíduo
de aspartato D369 presente no sítio de fosforilação. Em seguida, o domínio A
também sofre uma rotação de 30° em torno do eixo horizontal (Toyoshima &
Mizutami, 2004), produzindo um movimento de translação do primeiro
segmento transmembrana do lado intracelular e 90° na terceira volta interna
desta α-hélice. Esses autores propõem que esse movimento do primeiro
segmento transmembrana provoca o fechamento do portão interno que é
responsável pela entrada dos íons sódio. Essa etapa é acompanhada pela
liberação do ADP, resultando no estado E1~P da enzima. Durante o ciclo
catalítico, este estado E1~P de alta energia muda para a conformação E2-P
abrindo o portão para o lado extracelular e provocando uma alteração
conformacional no sítio de ligação dos cátions, com a subseqüente liberação
dos íons sódio. A conformação E2, agora com os sítios dos cátions vazios está
pronta para a entrada dos íons potássio. A ocupação dos sítios da enzima no
estado E2P por dois íons potássio vindos do meio extracelular resulta em duas
mudanças: a defosforilação do resíduo D369 e a oclusão do potássio pelo
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
18
fechamento do portão extracelular. O domínio N agora possui um sítio
acessível ao ATP intracelular. Durante o ciclo do transporte dos cátions, o
ATP (ou outros nucleotídeos como ADP ou análogos não hidrolisáveis do
ATP) liga-se a esse sítio intracelular de baixa afinidade (da ordem de 10-100
µM) provocando uma mudança conformacional da forma E2K para a
conformação E1
resultando na abertura do portão intracelular, com a
subseqüente liberação do potássio do lado citoplasmático. Essas etapas podem
ocorrer na ausência do nucleotídeo no sítio de alta afinidade, mas com uma
velocidade menor (Horisberger, 2004).
Painel 2. Modelo proposto para o transporte dos cátions pela (Na
+
,K
+
)-ATPase. P, A e N
correspondem aos domínios de fosforilação, atuador e de ligação de nucleotídeos,
respectivamente. Modificado de Horisberger (2004).
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
19
Já está estabelecido que a hidrólise catalítica do ATP e o transporte de
cátions monovalentes ocorrem em diferentes regiões da (Na
+
,K
+
)-ATPase e
que os grupos importantes para a interação com o ATP estão na alça
citoplasmática entre M4 e M5 (Kaplan et al., 1997, 2001; Jorgensen et al.,
1998a; Scheiner-Bobis & Schreiber, 1999; Jorgensen & Pedersen, 2001; Rice
et al., 2001).
Alguns autores têm sugerido que na coordenação dos cátions, dois
resíduos de aspartato localizados no segmento M6 e dois resíduos de
glutamato, um em M4 e outro em M5, são essenciais tanto para a ligação dos
íons sódio como dos íons potássio na enzima (Lingrel, 1997, 1998; Jorgensen
et al., 1997, 1998a; Karlish, 1997; Nielsen et al., 1998; Jorgensen & Pedersen
2001; Horisberger, 2004). Da mesma forma, resíduos de glutamato, aspartato,
serina, treonina, tirosina e asparagina localizados na mesma região da
subunidade α aparentemente participam da coordenação de cátions, embora
alguns interajam preferencialmente com íons sódio e outros com íons potássio
(Jorgensen et al., 1997, 1998a, b; Karlish, 1997; Lingrel et al., 1997, 1998;
Vilsen, 1999; Arguello et al., 1999a; Mense et al., 2000; Jorgensen &
Pedersen, 2001).
Tem sido sugerido que dois íons potássio e dois íons sódio se ligam aos
mesmos resíduos em um sítio comum, formado pelos segmentos M4 e M5-
M6 da subunidade α, onde os grupos hidrofóbicos estariam voltados para a
fase lipídica enquanto os grupos carregados negativamente ou ricos em
oxigênio estariam localizados em uma cavidade central e desempenhariam
papel importante na ligação, na especificidade e no transporte dos cátions
(Jorgensen et al., 1997, 1998a, b; Shainskaya et al., 2000; Geering, 2000;
Jorgensen & Pedersen, 2001; Kaplan et al., 2001). O terceiro íon sódio
transportado poela molécula de ATP, aparentemente interage com a
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
20
conformação E
1
ATP[Na
+
]
2
em um sítio distinto do mencionado anteriormente
e que apresenta apenas grupos polares não carregados (Goldshleger et al.,
1987; Glynn & Karlish, 1990; Or et al., 1996; Karlish, 1997; Apell et al.,
1998).
As mudanças conformacionais entre as formas E
1
e E
2
da (Na
+
,K
+
)-
ATPase estão intimamente associadas ao transporte dos cátions e acopladas à
hidrólise do ATP (Gatto et al., 1997; Post, 1999; Goldshleger & Karlish,
1999; Jorgensen & Pedersen, 2001). Aparentemente, a ligação do ATP ao seu
sítio e a conseqüente fosforilação/desfosforilação da subunidade α,
desencadeiam modificações conformacionais que são transmitidas aos sítios
de ligação/oclusão de cátions no interior da membrana (Goldshleger &
Karlish, 1999; Pedersen et al., 2000; Rice et al., 2001). Analogamente, a
ligação dos íons aos seus sítios provoca modificações conformacionais
transmitidas aos sítios de ligação de ATP e fosforilação (Gatto et al., 1997;
Apell et al., 1998; Kaplan et al., 1998; Goldshleger & Karlish, 1999; Rice et
al., 2001). Desse modo, mudanças conformacionais transmitidas à distância
permitem a utilização da energia química liberada pela hidrólise do ATP para
alteração da orientação e especificidade dos sítios para os íons sódio e
potássio, realizando o transporte deles através da membrana (Jorgensen et al.,
1997, 1998a; Post, 1999; Gatto et al., 1999; Schneeberger & Apell, 1999;
Pedersen et al., 2000; Jorgensen & Pedersen, 2001).
Na conformação E
2
os domínios citoplasmáticos (N, P e A) da
(Na
+
,K
+
)-ATPase encontram-se num arranjo hidrofóbico (Rice et al., 2001).
Acredita-se que a transição para a conformação E
1
envolveria movimentos de
inclinação e rotação destes domínios, resultando na sua dissociação, tal como
descrito para a Ca
2+
-ATPase do retículo sarcoplasmático, sugerindo um
mecanismo de acoplamento comum para as ATPases do tipo P (Toyoshima et
al., 2000; Rice et al., 2001; Jacobsen et al., 2002; Horisberger, 2004). Embora
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
21
as bases moleculares do mecanismo de acoplamento ainda não estejam bem
estabelecidas (Jorgensen et al., 1998a; Goldshleger & Karlish, 1999;
Scheiner-Bobis & Schreiber, 1999; Pedersen et al., 2000; Jorgensen &
Pedersen, 2001) existem evidências de que a ligação do ATP à forma E
2
[2K]
induz a dissociação dos domínios citoplasmáticos, associada a um rearranjo
nos segmentos transmembrana, resultando na transição para a forma E
1
ATP e
na liberação dos íons potássio para o citosol. Já a ligação do terceiro íon sódio
à forma E
1
ATP induz mudanças conformacionais no domínio P, que
permitem a sua fosforilação pelo fosfato γ do ATP, já ligado ao domínio N.
Essa fosforilação induz novas mudanças conformacionais tanto nos domínios
citoplasmáticos, que se reassociam com a passagem da enzima para a forma
E
2
, quanto no domínio transmembrana, como o transporte e a extrusão dos
íons sódio para o meio extracelular. A ligação dos íons potássio à forma E
2
P
catalisa a hidrólise de fosfato ligado à enzima, associada à oclusão dos íons
potássio reiniciando o ciclo de catálise e transporte (Jorgensen et al., 2003;
Kaplan, 2002; Horisberger, 2004).
A atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase é inibida especificamente por glicosídeos
cardiotônicos dos quais a ouabaína é o mais representativo (Doris, 1994;
Lingrel et al., 1997; Emery et al., 1998; Kasturi et al., 1998; Schoner, 2000;
Middleton et al., 2000; Koenderink et al., 2000). É bem conhecido que a
ouabaina e outros glicosídeos cardíacos similares interagem com a porção
extracelular da enzima (Hoffman, 1996), ligando-se seletivamente e com
maior afinidade à forma E
2
P da proteína, bloqueando o transporte de íons e a
hidrólise de ATP (Erdmann & Schoner, 1973; Yoda & Yoda, 1982; Askari et
al., 1988; Asami et al., 1995; Pressley, 1996; Lingrel et al., 1997; Kasturi et
al., 1998).
Diversos resíduos de aminoácidos localizados nas alças extracelulares da
subunidade α e também nos segmentos transmembrana são importantes para a
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
22
interação enzima-ouabaína (Feng & Lingrel, 1994; Askew & Lingrel, 1994;
Palasis et al., 1996; Karlish, 1997; Croyle et al., 1997). A cadeia β também
parece estar envolvida nessa interação (Hansen, 1984; Pressley, 1996; Hasler
et al., 1998). Entretanto, apesar dos avanços obtidos, o sítio de ligação desse
inibidor ainda não está perfeitamente conhecido (Feng & Lingrel, 1994;
Lingrel & Kuntzweiller, 1994; Palasis et al., 1996; Karlish, 1997; Croyle et
al., 1997; Kasturi et al., 1998; Coppi et al., 1999; Koenderink et al., 2000;
Middleton et al., 2000).
A (Na
+
,K
+
)-ATPase também é inibida por vanadato, um inibidor das
ATPases do tipo P e que é análogo do estado de transição do fosfato ligado à
enzima (Nechay, 1984; Dafnis & Sabatini, 1994; Boxenbaum et al., 1998;
Fedosova et al., 1998; MacGregor & Walker, 1993; Rice et al., 2001). A
ligação do vanadato ao sítio de fosforilação interrompe o ciclo catalítico da
enzima, dando origem a uma forma covalente E-V (MacGregor & Walker,
1993; Dafnis & Sabatini, 1994; Boxenbaum et al., 1998; Fedosova et al.,
1998).
A (Na
+
,K
+
)-ATPase nos vertebrados está sujeita a uma complexa
regulação, que acaba conferindo às células a capacidade de coordenar
precisamente a atividade da enzima com as suas necessidades fisiológicas
(Blanco & Mercer, 1998; Therien & Blostein, 2000). Todavia, os
mecanismos que atuam nesta regulação ainda não estão bem estabelecidos
(Blanco & Mercer, 1998; Therien & Blostein, 2000; Mobasheri et al., 2000).
As características cinéticas intrínsecas das isoformas, sua distribuição e
localização distintas conferem uma variedade de respostas específicas nos
diferentes tecidos e células (Moller et al., 1996; Blanco & Mercer, 1998;
Sweeney & Klip, 1998; Crambert et al., 2000; Mobasheri et al., 2000).
Contudo, os principais fatores que agem na modulação da atividade da
(Na
+
,K
+
)-ATPase são as concentrações intra e extracelulares de ATP, sódio e
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
23
potássio
(Ewart & Klip, 1995; Blanco & Mercer, 1998; Therien & Blostein,
1999, 2000).
Outro fator importante, embora ainda pouco conhecido, é o
microambiente constituído pela membrana, que também parece modular a
afinidade relativa da enzima pelos íons sódio e potássio (Therien et al., 1996;
Therien & Blostein, 1999, 2000). Além disso, um proteolipídeo que se associa
especificamente ao dímero αβ, denominado peptídeo γ, foi identificado e
caracterizado em alguns tecidos de vertebrados (Mercer et al., 1993; Scheiner-
Bobis & Farley, 1994; Arystarkhova et al., 1999; Therien & Blostein, 2000;
Donnet et al., 2001). Composto por um único segmento transmembrana, com
a extremidade N-terminal voltada para o meio extracelular, possui peso
molecular em torno de 7 kDa (Béguin et al., 1997; Therien et al., 1997;
Blanco & Mercer, 1998; Minor et al., 1998). Embora não seja um componente
essencial da enzima, vários estudos sugerem que o peptídio γ atua na
regulação das propriedades cinéticas da (Na
+
,K
+
)-ATPase modulando sua
afinidade pelos íons potássio e sódio e pelo ATP e com ouabaina (Béguin et
al., 1997, 1998; Arystarkhova et al., 1999; Therien & Blostein, 2000). Ela faz
parte de uma família de proteinas denominadas FXYD (Beguin et al., 2002;
Geering et al., 2003; Horisberger, 2004)
A atividade da (Na
+
,K
+
)-ATPase de vertebrados está sujeita a regulação
de curto e longo prazo atrav´s da ação de vários hormônios tais como a
aldosterona, norepinefrina, dopamina e insulina. A primeira delas envolve
efeitos diretos sobre o comportamento cinético da enzima ou a translocação
de moléculas da enzima entre a membrana plasmática e os locais de estoques
intracelulares (Ewart & Klip, 1995; Middleton, 1996; Pedemonte et al., 1997;
Blanco et al., 1998; Therien & Blostein, 2000). Já a regulação de longo prazo
geralmente afeta a síntese de novo da enzima ou a sua degradação
(McDonough & Farley, 1993; Ewart & Klip, 1995; Middleton, 1996; Seok et
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
24
al., 1998; Bonvalent, 1998; Sweeney & Klip, 1998; Therien & Blostein,
2000). A atividade da (Na
+
,K
+
)-ATPase também pode ser regulada por
cAMP, proteínas quinases e fosfatases (Therien & Blostein, 2000; Mo &
Greenaway, 2001) bem como pela presença de inibidores endógenos
semelhantes à ouabaína (Doris & Bragrov, 1998; Kramer et al., 1998;
Ferrandi & Manunta, 2000; Therien & Blostein, 2000; Kaplan 2002).
1.2. O crustáceo Clibanarius vittatus
Os Decapoda constituem a maior e mais diversa ordem entre os
Crustacea, composta por aproximadamente 10.000 espécies descritas,
distribuídas entre os ambientes marinho, de água-doce e terrestre (Abele,
1982). No grupo Decapoda, encontra-se a infraordem Anomura, que engloba,
entre outros, os ermitões. Estes se encontram reunidos nas famílias
Parapaguridae, Paguridae e Diogenidae, que junto às famílias Lithodidae e
Pylochelidae compõem a superfamília Paguroidea (Melo, 1999). De acordo
com Ingle (1993), os ermitões apresentam mais de 800 espécies descritas no
mundo todo, e embora desperte a atenção de pesquisadores devido ao seu
elevado e variado grau de comportamento evolutivo, ainda são pouco
estudadas.
Os ermitões diferenciam-se dos demais crustáceos decápodos pela
presença de um abdômen não-calcificado e não-segmentado, usualmente
curvado para a direita, possuindo o 4
?
e 5
?
par de pereiópodos reduzidos
(Painel 3). Este crustáceo utiliza conchas desabitadas de moluscos para
proteção de seu corpo. Este comportamento incomum faz desse animal um
alvo interessante para estudos do ponto de vista evolutivo, uma vez que há a
necessidade da ocupação de uma carapaça de outro animal. Este envoltório
possui propriedades protetoras tanto contra predadores naturais bem como na
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
25
locomoção do ermitão no substrato marinho, já que seu abdômen pode ser
facilmente rompido por não apresentar calcificação. Além disso, a concha
evita a dessecação do animal quando este fica fora do ambiente marinho. Esta
situação normalmente ocorre em períodos de maré baixa, expondo o animal à
luz solar e altas temperaturas. As conchas também desempenham outra
função importante relacionada à proteção dos ovos que ficam aderidos no
lado externo do abdômen da fêmea.
Painel 3. Ermitão Clibanarius vittatus – Foto do crustáceo sem a presença da concha,
indicando as principais características morfológicas da espécie.
De acordo com Coelho & Ramos (1972) e Melo (1999), a família
Diogenidae está representada no litoral brasileiro por 23 espécies. Entre elas
encontram-se oito gêneros, entre eles o Clibanarius danae e Clibanarius
vittatus. O ermitão Clibanarius vittatus, descrito pela primeira vez por Bosc
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
26
(1802), é o pagurídeo mais comum e abundante na zona intertidal da região de
São Vicente (SP, Brasil), comumente encontrado em praias e mangues
(Coelho & Ramos, 1972; Williams, 1984), principalmente nas regiões
relacionadas à alta deposição de matéria orgânica e sujeita a influência de
água doce (Lowery & Nelson, 1988). Entretanto, esta espécie apresenta ampla
distribuição, ocorrendo desde a costa Atlântica oeste dos Estados Unidos até o
estado de Santa Catarina no Brasil (Coelho & Ramos, 1972; Young, 1978;
Lowery & Nelson, 1988; Williams, 1984). Os ermitões também podem ser
encontrados em estuários, recifes de coral, areia do fundo e águas rasas de até
22 metros (Melo, 1999).
O C. vittatus é um paguro de tamanho mediano, encontrado comumente
habitando conchas de diversos gêneros, entre elas Strombus, Stramonita,
Auricularia, Polinices, Littorina, Canthaurus, Busycon, Terebra e Murex
(Fransozo et al., 1991). São animais onívoros detritivos e a quela esquerda
geralmente é usada para a captura do alimento (Narchi, 1973).
A utilização das conchas dos gastrópodos é, sem dúvida, um importante
recurso na biologia populacional dos ermitões (Provenzano, 1960; Childress,
1972; Vance, 1972; Kellog, 1976; Spight, 1985). De acordo com
Fotheringham (1976) e Spight (1985) a concha desempenha papel central no
crescimento e proteção desses crustáceos, bem como para a reprodução
(Childress, 1972; Bach et al., 1976; Hazlett & Baron, 1989). O padrão
comportamental destes animais associado ao fato de viverem em conchas,
constitui sua maior adaptação, tornando-os capazes de explorar o ambiente
intertidal com eficiência (Fransozo et al., 1991).
Como conseqüência à exposição às marés, o C. vittatus enfrenta
grandes mudanças sazonais e variação de salinidade (Fotheringham, 1975), e
apesar do interessante padrão de comportamento, existem poucos relatos
descrevendo a distribuição e a biologia desse animal (Melo, 1999), bem como
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
27
pouca disponibilidade de dados para esclarecer os comportamentos
fisiológicos e bioquímicos.
1.3. Caracterização Branquial
Os ermitões apresentam trico- ou filobrânquias, sendo que o gênero
Clibanarius apresenta filobrânquias (McLaughlin & Lemaitre, 1997). O C.
vittatus possui 14 pares de brânquias dispostas lateralmente no cefalotórax
presentes nas regiões dos pereiópodos 1 a 4 (Forest & Saint Laurent, 1968),
arranjadas em pares de dez artrobrânquias e quatro pleurobrânquias (Forest &
Saint Laurent, 1968). No entanto, até o presente momento, pouco é conhecido
sobre as características histológicas e ultraestruturais das brânquias desse
crustáceo. Por outro lado, já está estabelecido que nas brânquias de
caranguejo braquiúra, a (Na
+
,K
+
)-ATPase está localizada na superfície
basolateral das células epiteliais (Towle & Kays, 1986).
As brânquias de crustáceos possuem papel central nos processos
regulatórios ativos iônico e osmótico (Péqueux, 1995), na troca gasosa
respiratória (Böttcher & Siebers, 1993), na regulação ácido-base da hemolinfa
(Henry & Wheatly, 1992) e na excreção de produtos metabólicos
nitrogenados finais (Cameron & Batterton, 1978; Weihrauch et al., 1998;
1999, 2004). Já está bem estabelecido que a (Na
+
,K
+
)-ATPase presente no
tecido branquial dos crustáceos osmorreguladores é uma enzima fundamental
para a regulação osmótica e iônica da hemolinfa (Péqueux, 1995; Towle,
1997; Furriel et al., 2000). Estudos recentes sugerem que a atividade desta
enzima pode também ser importante no processo de excreção através das
brânquias (Lucu, 1993; Weihrauch et al., 1998, 1999; Masui et al., 2002;
Masui et al., 2005).
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
28
O C. vittatus possui capacidade de hiperosmoregulação muito eficiente
em salinidade entre 5 e 25‰; contudo, em altas salinidades é um fraco
osmoregulador (Young, 1979a; Sharp & Neff, 1980; Sabourin & Stickle,
1980).
As informações sobre o ciclo de vida do C. vittatus não estão bem
definidas, entretanto, foi descrito que a água salgada é necessária para o
desenvolvimento do ovo e da larva, com a metamorfose para a fase juvenil
ocorrendo em salinidades de 25 a 30‰ (Young & Hazlett, 1978).
Os crustáceos, como os outros animais, apresentam um conjunto de
respostas adaptativas ao meio ambiente. Uma resposta adaptativa importante
está relacionada com o controle osmoiônico intra- e extracelular, fundamental
para a adaptação à salinidade a qual o animal está exposto (Péqueux, 1995).
Dos crustáceos que ocupam o ambiente marinho, grande parte são
osmoconformadores, isto é, possuem osmolalidade e concentração salina da
hemolinfa semelhantes às da água do mar (Lucu, 1990; Péqueux, 1995). Esses
animais não apresentam nenhum mecanismo de osmorregulação dos fluidos
extracelulares, o que os torna pouco tolerantes a mudanças da salinidade do
meio externo (Péqueux, 1995). A capacidade de regular a osmolalidade da
hemolinfa pode ser estimada comparando-se a concentração de um
determinado soluto na hemolinfa com aquela encontrada no ambiente numa
ampla faixa de salinidade (Castille & Laurence, 1981).
Com raras exceções, os crustáceos são animais amoniotélicos,
excretando seus resíduos metabólicos nitrogenados principalmente na forma
de amônia (NH
3
+ NH
4
+
), sendo que a maior proporção da excreção de
amônia ocorre através das brânquias (Kormanick & Cameron, 1981;
Regnault, 1987; Weihrauch et al., 1999). Tradicionalmente acreditava-se que
a liberação de amônia através das brânquias ocorreria por simples difusão de
NH
3
a favor do seu gradiente de concentração. Entretanto, evidências recentes
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
29
indicam claramente que pelo menos parte da amônia é excretada ativamente
na sua forma iônica, isto é, na forma de NH
4
+
(Lucu et al., 1989; Weihrauch et
al., 1998, 1999). Além disso, estudos empregando brânquias isoladas e
perfundidas de alguns caranguejos braquiuros revelaram a ocorrência de
transporte ativo transepitelial de NH
4
+
sensível a ouabaina, o que sugere
fortemente o envolvimento da (Na
+
,K
+
)-ATPase nesse processo, até o
momento pouco compreendido (Lucu et al., 1989; Péqueux & Gilles, 1981;
Weihrauch et al., 1998, 1999). Aparentemente, este transporte ativo
transepitelial parece ocorrer tanto em animais osmoconformadores quanto em
osmorreguladores (Weihrauch et al., 1998, 1999).
Os raios iônicos similares dos íons K
+
e NH
4
+
hidratados sugerem que o
NH
4
+
pode interagir com os sítios de ligação do K
+
(Knepper et al., 1989),
como de fato ocorre na estimulação da atividade hidrolítica da (Na
+
,K
+
)-
ATPase em vertebrados (Robinson, 1970; Kurtz & Balaban, 1986; Skou &
Esmann, 1992) e em tecidos branquiais de crustáceos (Towle et al., 1976;
Holliday, 1985; Towle & Holleland, 1987; Lucu et al., 1989, Masui et al.,
2003; Furriel et al., 2004; Leone et al., 2005). Existem também evidências de
que este íon pode ser transportado através da membrana, em substituição ao
K
+
, pela enzima de vertebrados (Kurtz & Balaban, 1986; Wall, 1996) e pelo
tecido branquial de crustáceos (Towle & Holleland, 1987). O controle osmo-
iônico e a participação da (Na
+
,K
+
)-ATPase nesse processo são de
fundamental importância. Estudos relacionados com a captação e regulação
da concentração de íons sódio e cloreto na hemolinfa têm sido realizados em
várias espécies de crustáceos (Péqueux, 1995; Towle, 1993, 1997; Onken &
Riestenpatt, 1998; Zare & Greenaway, 1998; Lignot et al., 2000; Furriel et al.,
2000). Aparentemente, os processos de transporte transepitelial de íons sódio
e cloreto em baixa salinidade envolvem a ação coordenada de vários sistemas
de transporte localizados nas regiões apical e basolateral da lamela do tecido
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
30
branquial (Péqueux, 1995; Towle, 1997; Zare & Greenaway, 1998; Onken &
Riestenpatt, 1998). Vários estudos sugerem a presença de diversos
transportadores de íons, tais como trocadores Na
+
/H
+
ou Na
+
/NH
4
+
, canais de
sódio e co-transportadores Na
+
/K
+
/2Cl
-
localizados na região apical das
células do tecido branquial (Zeiske et al., 1992; Péqueux, 1995; Towle 1997;
Towle et al., 1997). Além disso, existem evidências que suportam a existência
de canais de potássio na região basolateral, que permitiriam a manutenção de
níveis de K
+
intracelulares compatíveis com a funcionalidade da célula
(Péqueux, 1995; Onken & Riestenpatt, 1998). Acredita-se que a (Na
+
,K
+
)-
ATPase, presente na região basolateral do epitélio branquial dos crustáceos,
tenha um papel fundamental nesse processo, transportando ativamente íons
sódio do meio intracelular para a hemolinfa contribuindo para a manutenção
do equilíbrio osmo-iônico (Painel 4) desses animais em ambientes de baixa
salinidade e constituindo assim a principal força motriz para o
estabelecimento de um gradiente eletroquímico que energizaria uma
variedade de outros transportadores (Barra & Péqueux, 1986; Towle &
Kays, 1986; Towle, 1993, 1997, 1999; Onken & Puntzenlechner, 1995;
Péqueux, 1995; Masui et al., 2005).
Por ser um grupo morfológico e ecologicamente diverso, apresentando
muitas espécies que habitam grande variedade de biótopos, os Anomura
representam um grupo interessante e promissor para estudos que objetivam a
compreensão das estratégias adaptativas necessárias para o estabelecimento
desses animais em diferentes ambientes (Mantelatto & Sousa, 2000;
Greenaway, 2003). Além disso, as estratégias adaptativas, fisiológicas e/ou
bioquímicas, empregadas pela classe Crustácea, para confrontar as mudanças
osmóticas da vida na água doce e habitats estuarinos, podem ser melhor
compreendidas através de estudos comparativos e sistemáticos das
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
31
características bioquímicas da (Na
+
,K
+
)-ATPase branquial em inúmeras
espécies de diferentes habitats.
Painel 4. Modelo hipotético para a excreção ativa das brânquias dos caranguejos
osmorreguladores. • a principal força que dirige o transporte do NH
4
+
para fora da célula
é a (Na
+
,K
+
)-ATPase localizada na membrana basolateral. Além disso, uma força extra-
bombeadora inibida por magnésio para a excreção de NH
4
+
está representada por um
segundo sítio de NH
4
+
, o qual aparece quando a bomba está completamente saturada por
íons K
+
. ‚ Canais de K
+
, sensíveis a Cs
+
localizados na membrana basolateral não
distiguem entre os íons potássio e amônio. ƒ junção septada. „ transportador
Na
+
/NH
4
+
(H
+
), particularmente ativo durante a excreção transcelular do amônio. …
Presumivelmente, estrutras semelhantes a canais, sensíveis a amiloride e permeáveis a
cátions na cutícula permitem a difusão dos íons para o meio externo. † A NH
3
citoplasmática é difundida para dentro das vesículas intracelulares contendo uma bomba de
prótons (V-ATPase), que acidifica seu interior levando a formação de NH
4
+
. NH
3
é levado
para o espaço subcuticular via exocitose. ‡ Uma proteína transportadora de amônia
semelhante a encontrada em rhesus (RhCM), um suposto transportador de amônia de
localização desconhecida pode suportar o mecanismo de captura ácida. Modificado de
Masui et al. (2005b).
Célula do epitélio
branquial
Hemolinfa
Água costeira diluída/
Sedimento marinho
NH
4
+
NH
4
+
/K
+
Cs
+
ƒ
NH
3
Metabólica
H
+
+
NH
3
Na
+
NH
4
+
/K
+
ATP
ADP + Pi
NH
4
+
Mg
2+
•
Bombeamento
Extra
‚
NH
3
„
Na
+
NH
4
+
/ H
+
NH
3
/ NH
4
+
Exocitose
NH
4
+
H
+
Captura
NH
4
+
Vesícula
Intracelular
NH
3
‡
ATP
ADP + Pi
NH
3
+ H
+
NH
4
+
NH
3
†
‡
…
Cutícul
a
[NH
4
+
]
[NH
4
+
]
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
32
1.4. Objetivos Gerais
Esta linha de pesquisa começou a ser desenvolvida em 1997 com a
caracterização bioquímica da (Na
+
,K
+
)-ATPase do tecido branquial do
camarão de água doce Macrobrachium olfersii. Atualmente sete diferentes
espécies de caranguejos, siris e camarões estão sendo estudadas
comparativamente a fim de se tentar estabelecer um modelo para o
mecanismo de adaptação a ambientes de diferentes salinidades (Painel 5).
Essa pesquisa envolve o estudo das características cinéticas (em relação à
hidrólise do ATP e PNFF, e a inibição pela ouabaína), bem como a
caracterização das possíveis isoformas da enzima preparada de animais
coletados em seu ambiente natural bem como aclimatados a diferentes
salinidades.
Painel 5. Habitat das espécies estudadas.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
33
1.5. Objetivos Específicos
O presente trabalho teve como objetivo isolar membranas ricas em
(Na
+
,K
+
)-ATPase a partir do tecido branquial do ermitão Clibanarius vittatus
e caracterizar cinética e estruturalmente essa enzima. Além disso, pretende-se
estudar o efeito do NH
4
+
sobre a atividade da enzima, procurando contribuir
para uma maior compreensão de seu papel no processo de excreção de
amônio que ocorre nas brânquias dos crustáceos ainda pouco compreendido.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
34
2. MATERIAL E MÉTODOS
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
35
2. MATERIAL E MÉTODOS
Todas as soluções foram preparadas utilizando-se água ultrapura
apirogênica tratada em equipamentos Milli RO e Milli Q (Millipore Co.,
USA). Tris, ATP sal de Tris, fosfoenolpiruvato (FEP), NAD
+
, NADH, lactato
desidrogenase (LDH), piruvato quinase (PK), gliceraldeído-3-fosfato-
desidrogenase (GAPDH), fosfoglicerato quinase (PGK), ditiotreitol (DTT), p-
nitrofenilfosfato (PNPP), 3-fosfogliceraldeído dietil acetal, ouabaina,
ortovanadato de sódio, imidazol, nitroblue tetrazolium, 5-bromo-4-cloro-3-
indolil fosfato (BCPI) e ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-etanolsulfônico
(HEPES) foram adquiridos da Sigma Chem. Co. (USA). Trietanolamina,
ácido etilenodiamino tetracético e ácido clorídrico foram adquiridos da Merck
(Alemanha). O anticorpo monoclonal alfa-5 contra a subunidade alfa da
(Na
+
,K
+
)-ATPase (todas as isoformas) foi adquirido do Hybridoma Bank da
Universidade de Iowa (USA).
2.1. Coleta dos animais
Ermitões Clibanarius vittatus adultos, de ambos os sexos, foram
coletados durante a maré baixa na Praia do Araçá, São Sebastião (23
o
48’
86”S/ 45
o
24’ 52”W) no litoral norte de São Paulo. Os animais foram
transportados e mantidos vivos no laboratório (de 2 a 7 dias), em tanques
contendo água do mar com a mesma salinidade do local de coleta (31
o
/
oo
), a
25 ± 2
o
C, e alimentados em dias alternados com pedaços de camarão marinho.
2.2. Remoção das brânquias
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
36
O ermitão foi retirado da concha, quebrando-se a mesma com o auxílio
de uma morsa. Os animais foram anestesiados através de choque térmico, em
freezer a –20
o
C, e imediatamente as brânquias posteriores (pleurobrânquias)
foram removidas e transferidas rapidamente para 25 mL de tampão de
homogeneização (tampão imidazol 20 mM, pH 6,8, EDTA 6 mM, Tris 6 mM
e sacarose 250 mM), gelado e mantidas em banho de gelo até a
homogeneização.
2.3. Preparação da fração microsomal do tecido branquial
Após a remoção do excesso de tampão de homogeneização, as
brânquias foram pesadas (peso úmido), picotadas em pequenos pedaços e
homogeneizadas no tampão de homogeneização (20 mL/g de tecido úmido)
em um homogeneizador Potter ajustado para 600 rpm. O homogeneizado foi
centrifugado a 20.000 g, durante 35 min, a 4
o
C, em uma centrífuga Sorvall
RC5C Plus. O sobrenadante foi coletado e mantido em banho de gelo. O
pellet obtido foi ressuspenso no mesmo volume inicial de tampão de
homogeneização, e manipulado conforme descrito acima. O sobrenadante
resultante da segunda centrifugação foi coletado, adicionado ao primeiro
sobrenadante e após misturar gentilmente, a solução resultante foi
centrifugada a 100.000g, durante 2h, a 4
o
C, em uma ultra-centrífuga Hitachi
55P-72. Finalmente, o pellet resultante foi ressuspenso com tampão imidazol
20 mM, pH 6,8, contendo Tris.HCl 6 mM e sacarose 250 mM (10 mL de
tampão/g de tecido úmido) e fracionado em alíquotas de 0,5 mL, que foram
rapidamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas a –20
o
C por um
período não superior a 4 meses, sem perda significativa da atividade da
enzima.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
37
2.4. Centrifugação em gradiente de densidade de sacarose
Uma alíquota da fração microsomal contendo 2,9 mg de proteína/0,7
mL, foi aplicada a um gradiente contínuo de 10 a 50% (p/v) de sacarose em
tampão imidazol 20 mM, pH 6,8, e centrifugada a 180.000g em uma
centrífuga Hitachi 55P-72, usando o rotor vertical PV50T2, durante 2 h, a
4
o
C. Frações de 0,5 mL foram coletadas a partir do fundo do tubo com
auxílio de uma bomba peristáltica e em seguida analisadas em relação às
atividades PNFFase, ATPase total e ATPase insensível a ouabaína (medida na
presença de 3 mM de ouabaína), concentração de proteína e concentração de
sacarose.
2.5. Determinação da atividade ATPase
A atividade ATPase foi determinada continuamente, a 25
o
C,
empregando-se o sistema de associação PK/LDH, onde a hidrólise do ATP é
acoplada a oxidação do NADH (Furriel et al., 2000).
Piruvato quinase
Lactato desidrogenase
ADP
ATP
NADH
NAD
+
Fosfoenolpiruvato
Piruvato
Lactato
A oxidação do NADH foi acompanhada em 340 nm (ε
340nm,pH 7,5
= 6.200
M
-1
cm
-1
), em um espectrofotômetro Hitachi U-3000 equipado com células
termostatizadas. As condições padrões dos ensaios foram: tampão Hepes 50
mM, pH 7,5, contendo ATP 1 mM, MgCl
2
2 mM, KCl 20 mM, NaCl 50 mM,
NADH 0,14 mM, FEP 2 mM, 49 U de PQ e 94 U de LDH, em um volume
final de 1 mL.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
38
A atividade enzimática também foi medida utilizando o sistema de
associação GAFDH/FGK, onde a hidrólise do ATP é acoplada à redução do
NAD
+
. A formação do NADH foi acompanhada em 340 nm (ε
340nm, pH 7,5
=
6200 M
-1
cm
-1
). As condições padrão dos ensaios foram: tampão Hepes 50
mM, pH 7,5, contendo ATP 1 mM, MgCl
2
2 mM, KCl 20 mM, NaCl 50mM,
NAD
+
1 mM, gliceraldeído-3-fosfato 1 mM, fosfato de sódio 0,5 mM, 12 U
de GAFDH e 9 U de FGQ em um volume final de 1 mL.
ADP
ATP
NADH
NAD
+
Gliceraldeído-3-P-
Fosfogliceratoquinase
desidrogenase
Gliceraldeído-3P
+ Pi
Glicerato-1,3-PP
Glicerato-3-P
A atividade ATPase também foi medida na presença de ouabaína 3 mM
ouabaína. A diferença entre a atividade medida na ausência e presença de
ouabaína foi considerada como sendo a atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase.
A reação sempre foi iniciada pela adição de enzima ao meio de reação e
controles sem adição de enzima foram empregados para se determinar a
hidrólise espontânea do substrato nas condições dos ensaios. Uma unidade
(U) de enzima foi definida como sendo a quantidade de enzima que hidrolisa
1,0 nmol de substrato/min, em condições padrões. Todos os experimentos
foram realizados em duplicata usando-se três preparações diferentes (N=3). A
atividade ATPase também foi medida após 10 min. de pré-incubação da
preparação com alameticina (1 mg/mg de proteína), a 25
o
C. Este ensaio foi
realizado com o objetivo de verificar a presença de vesículas seladas na
preparação (Bonnafous et al., 1982).
2.6. Determinação da atividade PNFFase
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
39
A atividade PNFFase foi determinada continuamente, a 25
o
C, através
da hidrólise do PNFF em 410 nm (ε
410nm, pH 7,5
= 13160 M
-1
cm
-1
), em um
espectrofotômetro Hitachi U-3000 equipado com células termostatizadas. As
condições padrões dos ensaios foram: tampão Hepes 50 mM, pH 7,5,
contendo PNFF 10 mM, MgCl
2
10 mM, e KCl 15 mM, em um volume final
de 1 mL.
A reação foi iniciada pela adição de enzima ao meio de reação e
controles sem adição de enzima foram empregados com a finalidade de se
determinar a hidrólise espontânea do substrato nas condições dos ensaios.
Uma unidade (U) de enzima foi definida como sendo a quantidade de enzima
que hidrolisa 1,0 nmol de substrato/min, em condições padrões. Todos os
experimentos foram realizados em duplicata usando-se três preparações
diferentes (N=3). A atividade PNFFase também foi medida após 10 minutos
de pré-incubação da preparação com alameticina (1 mg/mg de proteína), a
25
o
C.
2.7. Tratamento das enzimas dos sistemas de acoplamento
Suspensões cristalinas (500 µL) de LDH e PQ foram
centrifugadas a 14.000 rpm, durante 15 min., a 4
o
C, em uma centrífuga
refrigerada Eppendorf 5810. O pellet foi ressuspenso em 500 µL Hepes 50
mM, pH 7,5 e, após ser transferido para um filtro Microcon YM-10 foi lavado
5 vezes com o mesmo tampão através de centrifugação a 14.000 rpm, a 4
o
C,
durante 15 min. para completar a remoção de íons amônio (testada com
reagente de Nessler). Finalmente, o pellet foi ressuspenso em 500 µL de
tampão Hepes 50 mM pH 7,5 e usado imediatamente para dosar a atividade
da (Na
+
,K
+
)-ATPase. Para o sistema FGQ e GAFDH, a suspensão foi tratada
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
40
exatamente como descrito acima exceto que o tampão utilizado foi
trietanolamina 50 mM, pH 7,5, contendo DTT 1 mM.
2.8. Preparação do gliceraldeído-3-fosfato
A solução de gliceraldeído-3-fosfato 20 mM, foi preparada
imediatamente antes do uso, através da hidrólise de 12,5 mg de 3-
fosfogliceraldeído dietil acetal em 1 mL de água ultrapura, com 75 µL de HCl
concentrado (d= 1,18 g/mL). A mistura foi mantida em banho de água em
ebulição durante 2 min. e finalmente neutralizada até pH 7,5 com 25 µL de
trietanolamina (d= 1,12 g/mL).
2.9. Preparação da solução de ortovanadato
A solução estoque de ortovanadato (1 mM) foi preparada conforme
descrito por Gordon (1991). O pH de uma solução de concentração
aproximadamente 1 mM foi acertado em 10,0 e em seguida a solução foi
fervida em banho-maria até tornar-se translúcida. Após o resfriamento, o pH
da solução foi novamente ajustado em 10,0 e a concentração final corrigida
espectrofotometricamente (ε
260nm, pH 10,0
= 3.550 M
-1
cm
-1
). Alíquotas da
solução resultante foram congeladas em tubos plásticos e estocadas a –20
o
C
até o momento do uso.
2.10. Dosagem de proteína
A concentração de proteína da fração microsomal foi determinada
conforme descrito por Read & Northcote (1981), empregando-se soralbumina
bovina como padrão.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
41
2.11. Eletroforese em gel de poliacrilamida
A eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE) foi realizada
em gradiente de poliacrilamida de 5 a 20%, conforme descrito por Laemmli
(1970) e a proteína foi corada com nitrato de prata. Como padrões de peso
molecular foram utilizados: miosina (205 kDa), β-galactosidase (116 kDa),
fosforilase b (97 kDa), soralbumina bovina (68 kDa), ovoalbumina (43 kDa) e
anidrase carbônica (29 kDa).
2.12. Western blotting
Após a eletroforese em condições desnaturantes, o gel foi cortado em
duas partes. Uma das metades do gel foi submetida a uma eletrotransferência
para membranas de nitrocelulose (Towbin et al., 1979). Em seguida, a
membrana foi incubada com anticorpo monoclonal alfa-5 (diluído 1:10) a
25°C, durante 1 h. Após 3 lavagens com Tris.HCl 50 mM, pH 8,0, contendo
NaCl 150 mM e Tween20 0,1% (TBS/Tween), a membrana foi incubada com
o anticorpo secundário anti IgG de camundongo, conjugado com fosfatase
alcalina (diluído 1:7500), a 25
o
C, durante 1 h. A incorporação específica do
anticorpo foi revelada em Tris.HCl 100 mM, pH 9,5, contendo NaCl 100 mM,
MgCl
2
5 mM, NBT 0,2 mM e BCIP 0,8 mM. Foram usados como padrões:
miosina (205 kDa), β-galactosidase (116 kDa), fosforilase b (97 kDa),
soralbumina bovina (68 kDa), ovoalbumina (43 kDa) e anidrase carbônica (29
kDa).
2.13. Tratamento dos resultados
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
42
Os parâmetros cinéticos V (velocidade máxima), K
M
(constante de
Michaelis-Menten), K
0,5
(constante de dissociação aparente) e n
H
(coeficiente
de Hill) foram calculados usando-se o software Sigrafw (Leone et al., 2005a).
As constantes de dissociação do complexo enzima-inibidor (K
I
) foram
determinadas conforme descrito por Dixon (1953). Todos os experimentos
foram realizados em duplicata empregando três (N=3) diferentes preparações
de (Na
+
,K
+
)-ATPase de brânquias. Os parâmetros cinéticos apresentados no
texto e nas tabelas são valores calculados e representam a média ± desvio
padrão. Cada figura apresentada neste trabalho corresponde a uma curva
representativa de cada experimento realizado.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
43
3. RESULTADOS
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
44
3. RESULTADOS
A metodologia empregada na obtenção da fração microsomal do tecido
branquial de Clibanarius vittatus revelou a presença de atividade ATPase
total da ordem de 183,7 U/mg e uma atividade PNFFase total da ordem de
70,5 U/mg. Não foram detectadas perdas significativas destas atividades, que
permaneceram estáveis quando a enzima foi mantida por até 6 horas a 4
o
C ou
por um período de cerca de quatro meses a –20
o
C (dados não mostrados).
Além disso, a utilização da alameticina nos ensaios de atividade sugere que as
frações de membrana obtidas não estão na forma de vesículas seladas no meio
reacional (não mostrado).
A ultracentrifugação da preparação da fração microsomal de tecido
branquial de Clibanarius vittatus em gradiente contínuo de sacarose de 10 a
50% está mostrada na Figura 1 e mostra um único pico de atividade entre 25 –
35% sacarose, empregando como substrato o ATP. Na presença de ouabaína
1 mM a atividade ATPase, correspondente às frações compreendidas entre
25-35% de sacarose, foi parcialmente inibida, mostrando cerca de 40% de
atividade residual na presença do inibidor.
Na Figura 2 está mostrado o resultado da ultracentrifugação da fração
microsomal do tecido branquial de Clibanarius vittatus em gradiente contínuo
de sacarose para a atividade PNFFase. Observa-se a presença de um único
pico de atividade PNFFase entre a faixa de 25-30% de sacarose. Da mesma
forma, na presença de ouabaína 1 mM a atividade PNFFase, correspondente
às frações compreendidas entre 25-30% de sacarose, foi parcialmente
inibidas, mostrando cerca de 40% de atividade residual na presença do
inibidor, o que sugere a presença de outras ATPases diferentes da Na,K-
ATPase.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
45
Figura 1. Distribuição da atividade ATPase da fração microsomal do tecido branquial
de Clibanarius vittatus, após centrifugação em gradiente contínuo de sacarose. Uma
amostra de 2,9 mg de proteína microsomal foi aplicada no gradiente de sacarose (10-50%)
em tampão imidazol 20 mM pH 6,8 e centrifugada a 180000g durante 3 h, a 4
o
C.
Alíquotas de 0,5 mL foram coletadas a partir do fundo do tubo e analisadas em relação a
atividade (Na
+
, K
+
)-ATPase (¨); atividade ATPase total (p); atividade ATPase
insensível a ouabaína (¢); concentração de sacarose (˜) e concentração de proteína (∆). A
figura apresentada corresponde a uma curva representativa de um dos homogeneizados
(N= 3).
0 10 20 30 40 50 60
1
2
3
4
5
6
7
10
20
30
40
50
0,1
0,2
% Sacarose (p/p)
U/mL
Tubo
[Proteina] (µg/ml)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
46
Figura 2. Distribuição da atividade K
+
-fosfatase da fração microsomal do tecido
branquial de Clibanarius vittatus, após centrifugação em gradiente contínuo de
sacarose. Uma amostra de 1,9 mg de proteína microsomal foi aplicada no gradiente de
sacarose (10-50%) em tampão imidazol 20 mM pH 6,8 e centrifugada a 180000g durante 3
h, a 4
o
C. Alíquotas de 0,5 mL foram coletadas a partir do fundo do tubo e analisadas em
relação a atividade K
+
-fosfatase (¨); PNFFase total (p); atividade PNFFase insensível a
ouabaína (¢); concentração de sacarose (˜) e concentração de proteína (∆). A figura
apresentada corresponde a uma curva representativa de um dos homogeneizados (N= 3).
0 10 20 30 40 50 60 70
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
U/mL
Tubos
10
20
30
40
50
% Sacarose (p/p)
0,05
0,10
0,15
Proteína µg/mg
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
47
Figura 3. Eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS-PAGE)
e Western blot da fração microsomal do tecido branquial de Clibanarius vittatus. A
eletroforese foi realizada em gradiente de gel de poliacrilamida de 5% a 20%. Após a
corrida, o gel foi dividido em duas partes. Uma metade (contendo 4 µg de proteína) foi
corada com nitrato de prata e a outra metade (40 µg de proteína) foi submetida a uma
eletrotransferência em membrana de nitrocelulose. A membrana de nitrocelulose foi
incubada com o anticorpo monoclonal alfa-5 (diluição 1:10) durante 1 h, a 25
o
C, lavada
com TBS/Tween, seguido de incubação com o anticorpo secundário anti IgG de
camundongo conjugado a fosfatase alcalina (1:7500) durante 1 h, lavado novamente com
TBS/Tween e finalmente revelado com solução contendo NBT/BCIP. A - Coloração com
nitrato de prata. B - Western blotting.
200
116
97
66
45
29
A
B
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
48
A Figura 3 mostra a eletroforese em gradiente de gel de poliacrilamida
(5 a 20%) da amostra purificada em condições desnaturantes (SDS-PAGE) e
o Western blotting da fração microsomal do tecido branquial de Clibanarius
vittatus. A Figura 2A , onde o gel foi corado com nitrato de prata (usando 4
µg de proteína) mostra várias bandas protéicas indicando a presença de
diferentes proteínas. A análise por Western blotting (usando 45 µg de
proteína) com o anticorpo monoclonal alfa-5 para a subunidade α da
(Na
+
,K
+
)-ATPase identificou uma única banda com baixa intensidade que
apresentou Mr da ordem de 105 kDa (2B).
A Figura 4 mostra o efeito da concentração do ATP sobre a atividade
(Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal do tecido branquial de Clibanarius
vittatus. Em concentrações saturantes de íons magnésio, sódio e potássio, a
modulação da enzima pelo ATP resultou na presença duas famílias de sítios
de hidrólise para o ATP. A interação da enzima com o substrato ATP mostra
interações sítio-sítio (n
H
= 1,9) para a família de sítios de alta afinidade (10
-9
M – 10
-6
M) enquanto a de baixa afinidade (10
-6
M – 10
-3
M) obedeceu a uma
cinética Michaeliana (n
H
=1,0). Os sítios de alta afinidade apresentaram K
0,5
=
63,8 ± 2,9 nM e V= 19,1 ± 0,8 U/mg enquanto para os de baixa afinidade
foram estimados K
M
= 44,1 ± 2,6 µM e V
M
= 123,5 ± 6,1 U/mg
respectivamente. Concentrações de ATP superiores a 2 mM provocaram
efeitos inibitórios na atividade da enzima (dados não mostrados). É
importante notar que a atividade ATPase insensível à ouabaína corresponde a
cerca de 37% da atividade ATPase total e é estimulada até valores de 76,8 ±
3,1 U/mg nessa mesma faixa de concentrações (inserção da Figura 3). Isso
sugere a presença de outras ATPases e/ou fosfatases na preparação.
O efeito da concentração dos íons magnésio na atividade (Na
+
,K
+
)-
ATPase é mostrado na Figura 5. Em condições saturantes de ATP, sódio e
potássio, foi observado um aumento da atividade da enzima para
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
49
concentrações de Mg
2+
entre 3 µM – 3 mM. A estimulação da atividade da
enzima ocorreu através de uma única família de sítios que apresentou
interações sítio-sítio (n
H
= 1,8) sugerindo o envolvimento de múltiplos sítios
de ligação, V= 132,0 ± 5,3 U/mg e K
0,5
= 0,36 ± 0,02 mM. Os resultados
mostrados na inserção da figura também sugerem a presença de outras
ATPases e/ou fosfatases, estimuladas pelos íons magnésio. A atividade
insensível à ouabaína presente na fração microsomal foi também estimulada
até 62 U/mg para a mesma concentração de Mg
2+
(inserção figura 5).
O efeito da concentração dos íons sódio sobre a atividade (Na
+
,K
+
)-
ATPase da fração microsomal das brânquias de Clibanarius vittatus é
mostrado na Figura 6. Na presença de concentrações saturantes de ATP e íons
magnésio e potássio, os íons sódio estimularam a atividade da enzima através
de uma cinética “michaeliana”. Na faixa de concentração de sódio entre 0,3
mM e 1 mM, a hidrólise do ATP ocorreu com V= 149,0 ± 7,4 U/mg e K
M
=
7,4 ± 0,4 mM. Diferentemente do Mg
2+
e ATP, para o Na
+
os resultados
mostrados na inserção da figura sugerem que a preparação microsomal das
brânquias não apresenta Na
+
-ATPases.
A modulação da atividade da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal
do tecido branquial de C. vittatus pelos íons potássio está representada na
Figura 7. Em condições saturantes de ATP, íons magnésio e sódio, e na
ausência de íons NH
4
+
, a enzima foi estimulada por potássio através de
cinética “michaeliana”, apresentando valores máximos de V= 140,0 ± 4,9
U/mg e K
M
= 1,51 ± 0,05 mM. Os resultados mostrados na inserção da figura
sugerem que a preparação microsomal das brânquias não apresenta K
+
-
ATPases, pois a atividade da ATPase total insensível à ouabaína não foi
estimulada pelo potássio em várias concentrações diferentes.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
50
Figura 4. Modulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal do tecido
branquial do Clibanarius vittatus pelo ATP. A atividade da enzima foi determinada
continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo MgCl
2
2 mM, NaCl 30
mM, KCl 10 mM, NADH 0,14 mM, FEP 2 mM, 49 U de PQ e 94 U de LDH, num volume
final de 1 mL. A reação foi iniciada pela adição de 17 µg de proteína. Inserção: Efeito da
concentração do ATP sobre a atividade ATPase total na ausência (l) e presença (¡) de
ouabaína 1 mM. As figuras apresentadas correspondem a curvas representativas de um dos
homogeneizados (N=3).
30
60
90
120
150
345
67
89
U/mg
- Log [ATP] (M)
50
100
150
200
2345
5
6789
U/mg
- Log [ATP] (M)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
51
Figura 5. Modulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal do tecido
branquial do Clibanarius vittatus pelos íons magnésio. A atividade da enzima foi
determinada continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo ATP 1
mM, NaCl 30 mM, KCl 10 mM, NADH 0,14 mM, FEP 2 mM, 49 U de PQ e 94 U de
LDH, num volume final de 1 mL. A reação foi iniciada pela adição de 17 µg de proteína.
Inserção: Efeito da concentração do MgCl
2
sobre a atividade ATPase total na ausência (l)
e presença (¡) de ouabaína 1 mM. As figuras apresentadas correspondem a curvas
representativas de um dos homogeneizados (N=3).
30
60
90
120
34
5
U/mg
- Log [MgCl
2
] (M)
50
100
150
3
4
5
U/mg
-Log [MgCl
2
] (M)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
52
Figura 6. Modulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal do tecido
branquial de Clibanarius vittatus pelos íons sódio. A atividade da enzima foi
determinada continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo ATP 1
mM, MgCl
2
2 mM, KCl 10 mM, NADH 0,14 mM, FEP 2 mM, 49 U de PQ e 94 U de
LDH, num volume final de 1 mL. A reação foi iniciada pela adição de 17 µg de proteína.
Inserção: Efeito da concentração do NaCl sobre a atividade ATPase total na ausência (l)
e presença (¡) de ouabaína 1 mM. As figuras apresentadas correspondem as curvas
representativas de um dos homogeneizados (N=3).
30
60
90
120
U/mg
2
34
- Log [NaCl] (M)
50
100
150
2
34
U/mg
- Log [NaCl] (M)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
53
Figura 7. Modulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal do tecido
branquial de Clibanarius vittatus pelos íons potássio na ausência de amônio. A
atividade da enzima foi determinada continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes 50 mM, pH
7,5, contendo ATP 1 mM, MgCl
2
2 mM, NaCl 30 mM, NAD
+
1 mM, fosfato de sódio 0,5
mM, gliceraldeído-3-fosfato 1 mM, 12 U de GAFDH e 9 U de FGQ, num volume final de
1 mL. A reação foi iniciada pela adição de 17 µg de proteína. Inserção: Efeito da
concentração do KCl sobre a atividade ATPase total na ausência (l) e presença (¡) de
ouabaína 1 mM. A figura apresentadas corresponde a curva representativa de um dos
homogeneizados (N=3).
30
60
90
120
U/mg
234
5
- Log [KCl] (M)
40
80
120
160
U/mg
12345
- Log [KCl] (M)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
54
A modulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal do
tecido branquial de C. vittatus pelos íons potássio na presença de
concentrações fixas de amônio está representada na Figura 8.
Interessantemente, na presença de concentrações fixas de NH
4
+
(10 e 30 mM)
a atividade total da enzima foi V= 155,2 ± 4,7 U/mg e 236,6 ± 9,4 U/mg,
respectivamente. Entretanto, a adição de K
+
entre 10
-5
M e 10
-2
M, não
provocou nenhuma estimulação adicional.
A modulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal do
tecido branquial de C. vittatus pelos íons amônio é mostrada na Figura 9.
Observa-se que na presença de concentrações saturantes de ATP e dos íons
magnésio e sódio, e na ausência de potássio, a enzima apresentou uma única
família de sítios com características Michaelianas. O aumento da
concentração de NH
4
+
entre 10
-5
M e 5.10
-2
M provocou um aumento na
atividade até valores máximos de V= 245,6 ± 9,8 U/mg e com K
0,5
= 4,5 ±
0,2 mM. A inserção da figura 9 mostra que a preparação também não
apresenta outras atividades fosfohidrolíticas estimuladas por NH
4
+
.
Na presença de concentrações saturantes de potássio (20 mM), o
aumento na concentração de NH
4
+
(de 10
-5
M a 50 mM) resultou em uma
estimulação sinergística com perfil “Michaeliano” (Figura 10). Valores
máximos de V= 240,8 ± 14,4 U/mg e K
M
= 2,9 ± 0,1 mM foram calculados. O
efeito sinergístico observado na presença de potássio mais amônio sugere que
esses íons se ligam em sítios diferentes. É possível observar na inserção da
figura 10 que a atividade insensível à ouabaína não foi estimulada pelo
amônio no mesmo intervalo de concentração.
Na Tabela 1 estão resumidos os valores dos parâmetros cinéticos
calculados para a modulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase pelo ATP e íons
magnésio, sódio, potássio e amônio.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
55
Figura 8. Modulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal do tecido
branquial de Clibanarius vittatus pelos íons potássio na presença de amônio. A
atividade da enzima foi determinada continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes 50 mM, pH
7,5, contendo ATP 1 mM, MgCl
2
2 mM, NaCl 30 mM, NH
4
Cl 30 mM, NAD
+
1 mM,
fosfato de sódio 0,5 mM, gliceraldeído-3-fosfato 1 mM, 12 U de GAFDH e 9 U de FGQ,
num volume final de 1 mL. A reação foi iniciada pela adição de 17 µg de proteína. Efeito
da concentração do KCl sobre a atividade a atividade ATPase total na ausência (l,¢) e
presença (¡,o ) de ouabaína 1 mM; com 30 mM de NH
4
Cl (círculos); e com 10 mM
NH
4
Cl (quadrados) A figura apresentadas corresponde a curva representativa de um dos
homogeneizados (N=3).
80
160
240
U/mg
2
3
4
5
-Log [KCl] (M)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
56
Figura 9. Modulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal do tecido
branquial de Clibanarius vittatus pelos íons amônio na ausência de íons potássio. A
atividade da enzima foi determinada continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes 50 mM, pH
7,5, contendo ATP 1 mM, MgCl
2
2 mM, NaCl 30 mM, NAD
+
1 mM, fosfato de sódio 0,5
mM, gliceraldeído-3-fosfato 1 mM, 12 U de GAFDH e 9 U de FGQ, num volume final de
1 mL. A reação foi iniciada pela adição de 17 µg de proteína. Inserção: Efeito da
concentração do NH
4
Cl sobre a atividade ATPase total na ausência (l) e presença (¡) de
ouabaína 1 mM. As figuras apresentadas correspondem as curvas representativas de um
dos homogeneizados (N=3).
50
100
150
200
250
U/mg
12
34
5
- Log [NH
4
Cl] (M)
60
120
180
240
300
4 3 25
U/mg
- Log [NH
4
Cl] (M)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
57
Figura 10. Modulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal do tecido
branquial de Clibanarius vittatus pelos íons amônio na presença de íons potássio. A
atividade da enzima foi determinada continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes 50 mM, pH
7,5, contendo ATP 1 mM, MgCl
2
2 mM, NaCl 30 mM, KCl 20 mM, NAD
+
1 mM, fosfato
de sódio 0,5 mM, gliceraldeído-3-fosfato 1 mM, 12 U de GAFDH e 9 U de FGQ, num
volume final de 1 mL. A reação foi iniciada pela adição de 17 µg de proteína. Inserção:
Efeito da concentração do NH
4
Cl sobre a atividade ATPase total na ausência (l) e
presença (¡) de ouabaína 1 mM. As figuras apresentadas correspondem as curvas
representativas de um dos homogeneizados (N=3).
80
160
240
U/mg
4
3 25
-Log [NH
4
Cl] (M)
100
200
300
4
3 2
5
U/mg
- Log [NH
4
Cl] (M)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
58
Tabela 1. Parâmetros cinéticos calculados para a modulação da atividade
(Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal do tecido branquial de
Clibanarius vittatus pelo ATP e íons magnésio, sódio, potássio e amônio.
Efetor V
(U/mg) K
0,5
K
M
n
H
ATP 19,1 ± 0,8
123,5 ± 6,1
63,8 ± 2,9 nM
44,1 ± 2,6 µ
M
1,9
1,0
Mg
2+
132,0 ± 5,3 0,36 ± 0,02 mM
- 1,8
Na
+
149,0 ± 7,4 - 7,4 ± 0,4 mM 1,0
K
+
140,0 ± 4,9
- 1,51 ± 0,05 mM
1,0
K
+
(na presença de
NH
4
+
30 mM)
236,6 ± 9,8 - - -
NH
4
+
245,6 ± 9,8 - 4,51 ± 0,18 mM 1,1
NH
4
+
(na presença de
KCl 20 mM)
240,8 ± 14,5
2,9 ± 0,1 mM 1,0
O efeito da concentração da ouabaína sobre a atividade ATPase total da
fração microsomal do tecido branquial de C. vittatus é mostrado na Figura 11.
Em condições saturantes de ATP e de íons magnésio, sódio
e potássio, e na
ausência de NH
4
+
, a atividade ATPase total é inibida cerca de 66%. A curva
de inibição simples sugere a existência de um único sítio de fixação para a
ouabaína. A constante de dissociação calculada para o complexo enzima-
ouabaina é da ordem de 117,3 ± 3,5 µM (inserção da Figura 11).
A Figura 12 mostra o efeito da concentração da ouabaína sobre a
atividade ATPase total da fração microsomal do tecido branquial de C.
vittatus em condições saturantes de ATP e de íons magnésio, sódio, potássio,
e NH
4
+
(30 mM). Da mesma forma, na presença de concentrações saturantes
de NH
4
+
, a atividade ATPase total é inibida cerca de 87% através de uma
curva simples que sugere a existência de um único sítio de fixação para a
ouabaína. A constante de dissociação calculada para o complexo enzima-
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
59
ouabaina é da ordem de 56,4 ± 3,4 µM (inserção da Figura 12) para a inibição
da ouabaina na presença de NH
4
+
. Observa-se também que concentrações de
ouabaína da ordem de 1,0 mM independente da ausência (Figura 11) ou
presença de NH
4
+
(Figura 12) provocaram uma inibição da atividade ATPase
da ordem de 66%, o que sugere a presença de cerca de 34% de contaminações
de outras ATPases e/ou fosfatases na preparação microsomal das brânquias.
A inibição da atividade ATPase total da fração microsomal do tecido
branquial de Clibanarius vittatus por ortovanadato está mostrada na Figura
13. De acordo com a curva de inibição, observa-se também que concentrações
da ordem de 0,1 mM provocaram uma inibição da atividade ATPase da
ordem de 61%. Os resultados são coerentes com os estimados na presença de
ouabaína.
A Figura 14 mostra o efeito da concentração de ortovanadato sobre a
atividade ATPase total da fração microsomal do tecido branquial de
Clibanarius vittatus na presença de concentrações saturantes de ATP e de
íons magnésio, sódio, potássio e amônio. Observa-se que a atividade ATPase
total foi inibida cerca de 83% por ortovanadato 0,1 mM e a inibição ocorreu
através de uma simples curva. A atividade residual, da ordem de 39%,
observada na presença e ausência de íons amônio, sugere que a preparação
está contaminada por outras fosfohidrolases.
O efeito de diversos inibidores sobre a atividade ATPase total da fração
microsomal do tecido branquial do Clibanarius vittatus está apresentado na
Figura 15. Na presença de ATP 1 mM, MgCl
2
2 mM, KCl 20 mM e NaCl 50
mM foi observada uma atividade residual de cerca de 36% na presença
de ouabaína 1 mM. Esse resultado sugere que 64% da atividade ATPase total
corresponde à (Na
+
,K
+
)-ATPase. A atividade ATPase residual de cerca de
33% obtida na presença de vanadato 50 µM e também na presença
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
60
Figura 11. Efeito da concentração de ouabaína na atividade ATPase total da fração
microsomal do tecido branquial de Clibanarius vittatus na ausência de íons amônio. A
atividade da enzima foi determinada continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes 50 mM, pH
7,5, contendo 1 mM ATP, 2 mM MgCl
2
, NaCl 30 mM, KCl 10 mM, NADH 0,14 mM,
FEP 2 mM, 49 U de PQ e 94 U de LDH, num volume final de 1 mL. A reação foi iniciada
pela adição de 17 µg de proteína. A atividade ATPase total correspondente a 100% foi de
183,9 U/mg. Inserção: representação de Dixon, onde v
c
representa a velocidade corrigida
para a atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase. A figura apresentada corresponde a uma curva
representativa de um dos homogeneizados (N=3).
50
100
150
2
3
4
56
U/mg
-Log [Ouabaína] (M)
10
20
30
654
321
1/v
c
(U/mg)
-1
x10
3
[Ouabaína] (mM)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
61
Figura 12. Efeito da concentração de ouabaína na atividade ATPase total da fração
microsomal do tecido branquial de Clibanarius vittatus na presença de íons amônio. A
atividade da enzima foi determinada continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes 50 mM, pH
7,5, contendo 1 mM ATP, MgCl
2
2 mM, NaCl 30 mM, KCl 10 mM, NH
4
Cl 30 mM,
NADH 0,14 mM, FEP 2 mM, 49 U PQ e 94 U LDH, num volume final de 1 mL. A reação
foi iniciada pela adição de 17 µg de proteína. A atividade total correspondente a 100% foi
de 302,4 U/mg. Inserção: representação de Dixon, onde v
c
representa a velocidade
corrigida para a atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase. A figura apresentada corresponde a uma curva
representativa de um dos homogeneizados (N=3).
100
200
300
2
3
4
5
6
U/mg
-Log [Ouabaína] (M)
5
10
15
200
150100
50
1/v
c
(U/mg)
-1
x10
3
[Ouabaína] (µM)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
62
Figura 13. Efeito da concentração de ortovanadato na atividade ATPase total da
fração microsomal do tecido branquial de Clibanarius vittatus na ausência de íons
amônio. A atividade da enzima foi determinada continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes
50 mM, pH 7,5, contendo 1 mM ATP, 2 mM MgCl
2
, 30 mM NaCl, 10 mM KCl, 0,14 mM
NADH, 2 mM FEP, 49 U PQ e 94 U LDH, num volume final de 1 mL. A reação foi
iniciada pela adição de 17 µg de proteína. A atividade ATPase total correspondente a
100% foi de 169,0 U/mg. Inserção: representação de Dixon, onde v
c
representa a
velocidade corrigida para a atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase. A figura apresentada corresponde
a uma curva representativa de um dos homogeneizados (N=3).
50
100
150
6
5
4 3
78
U/mg
-Log [Ortovanadato] (M)
15
20
0,6
1,8
1,2
1/v
c
(U/mg)
-1
x10
3
[Ortovanadato] (µM)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
63
Figura 14. Efeito da concentração de ortovanadato na atividade ATPase total da
fração microsomal do tecido branquial de Clibanarius vittatus na presença de NH
4
+
30
mM. A atividade da enzima foi determinada continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes 50
mM, pH 7,5, contendo ATP 1 mM, MgCl
2
2 mM, NaCl 30 mM, KCl 10 mM, NH
4
Cl 30
mM, NADH 0,14 mM, FEP 2 mM, 49 U de PQ e 94 U de LDH, num volume final de 1
mL. A reação foi iniciada pela adição de 17 µg de proteína. A atividade ATPase total
correspondente a 100% foi de 291,2 U/mg. Inserção: representação de Dixon, onde v
c
representa a velocidade corrigida para a atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase. A figura apresentada
corresponde a uma curva representativa de um dos homogeneizados (N=3).
50
100
150
200
250
300
45
6
78
U/mg
-Log [Ortovanadato] (M)
5
10
15
1,5
3,0 4,5
1/v
c
(U/mg)
-1
x10
3
[Ortovanadato] (µM)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
64
Figura 15 – Efeito de diversos inibidores sobre a atividade ATPase total da fração
microsomal de tecido branquial de Clibanarius vittatus. A atividade da fração
microsomal foi realizada em tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo 1 mM de ATP, 2 mM
de MgCl
2
, 30 mM NaCl e 10 mM KCl, num volume final de 1,0 mL. A reação foi iniciada
pela adição de 17 µg de proteína. Os dados obtidos representam a média ± desvio padrão e
foram calculados a partir de três preparações diferentes (N=3). Atividade ATPase total ( );
Atividade residual relativa ao(s) inibidor(es) ( ); Atividade ATPase contaminante ( ) e
Atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase ( ). Ctl= controle; Oua= ouabaína; Azi= azida de sódio; Eta=
Etanol; Oli= oligomicina; Tap = tapsigargina; Baf= bafilomicina; Van= ortovanadato; Eta=
ácido etacrínico; Teo= teofilina; DMSO: dimetilsulfóxido.
Oua + Teo
Oua + Azi
Oua + Baf
Oua + Tap
Oua + DMSO
Oua + Oli
Oua + Etanol
Oua + Eta
Oua + Van
Van
Oua
Ctl
0 25 50 75 100
% Atividade Residual
(Na
+
,K
+
)-ATPase
F
0
F
1
-ATPase
Ca
2+
-ATPase
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
65
de ouabaína 1 mM mais vanadato 50 µM, confirmam os dados apresentados
acima. A ausência de uma inibição adicional na presença de ouabaína mais
ácido etacrínico, consistente com os resultados pelos resultados apresentados
nas figuras 6 e 7, exclui a presença de Na
+
e/ou K
+
-ATPases. Valores de
atividade na presença de ouabaína mais azida de sódio e a ouabaína mais
oligomicina sugerem que a preparação apresenta cerca de 20% de F
0
F
1
-
ATPase. A inibição da atividade ATPase por ouabaína mais bafilomicina A
1
indica 7% de atividade V-ATPase. Finalmente a inibição por teofilina (8%) e
por tapsigargina (20%) devem ser observadas com cautela, desde que estes
dados obtidos contrastam com os resultados obtidos para a ouabaína mais
orto-vanadato (atividade residual de aproximadamente 33%), sugerindo que
somente 6% da atividade corresponderia a fosfatases neutras e/ou P-ATPases,
diferente da (Na
+
, K
+
)-ATPase, como por exemplo, uma atividade Ca
2+
-
ATPase. A (Na
+
, K
+
)-ATPase pode ser inibida não especificamente pelos
inibidores empregados. A Tabela 2 resume o efeito de diversos inibidores
sobre a atividade ATPase total (na ausência de amônio) da fração microsomal
do tecido branquial de Clibanarius vittatus.
Na Figura 16 está mostrada a modulação da atividade K
+
-fosfatase da
fração microsomal do tecido branquial de Clibanarius vittatus pelo PNFF. Em
condições saturantes de íons potássio e magnésio, o aumento da concentração
do PNFF resultou em uma única curva de saturação que apresenta n
H
= 1,1,
sugerindo a ocorrência de um efeito cooperativo. A atividade específica
máxima foi estimada da ordem de V= 47,4 ± 1,9 U/mg e o valor do K
0,5
da
ordem de 1,0 ± 0,04 mM. A inserção da figura mostra que na preparação
existe uma atividade residual de fosfohidrolase da ordem de 28% que é
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
66
Tabela 2. Efeito de diversos inibidores sobre a atividade ATPase total na
fração microsomal do tecido branquial de Clibanarius vittatus.
Inibidor V (%) V (U/mg)
Controle 100 184,2 ± 5,5
Ouabaína (1 mM) 36 66,3 ± 2,9
Orto-vanadato (50 µM) 33 60,7 ± 1,5
Ouabaína (1 mM) + Orto-vanadato (50 µM) 30 55,0 ± 2,2
Ouabaína (1 mM) + Azida de Sódio (100 µM) 16 29,5 ± 0,9
Ouabaína (1 mM) + Bafilomicina A
1
(0,4 µM) 29 53,0 ± 2,4
Ouabaína (1 mM) + Tapsigargina (0,5 µM) 16 30,8 ± 1,5
Ouabaína (1 mM) + Ácido Etacrínico (2 mM) 33 61,1 ± 2,1
Ouabaina (1 mM) + Oligomicina (1µg / mL) 13 23,6 ± 1,4
Ouabaina (1 mM) + DMSO 34 63,0 ± 2,5
Ouabaina (1 mM) + Etanol 31 56,2 ± 2,2
estimulada pelo aumento da concentração de PNFF, na mesma faixa de
concentração.
O efeito da concentração dos íons magnésio sobre a atividade K
+
-
fosfatase da fração microsomal do tecido branquial de Clibanarius vittatus
está mostrado na Figura 17. Em concentrações saturantes de PNFF e íons
potássio, os íons magnésio estimularam a atividade da enzima até valores
máximos de V= 43,9 ± 1,5 U/mg, através de uma simples curva de saturação
que apresentou interações sítio-sítio (n
H
= 2,6). O valor de K
0,5
calculado foi
da ordem de 0,6 ± 0,1 mM. A inserção da figura mostra que na preparação
existe uma atividade residual de fosfohidrolase da ordem de 25% que é
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
67
estimulada pelo aumento da concentração dos íons magnésio, nessa mesma
faixa de concentração.
A modulação da atividade K
+
-fosfatase da fração microsomal do tecido
branquial de Clibanarius vittatus pelos íons potássio está representada na
Figura 18. Em condições saturantes de PNFF e íons magnésio a estimulação
máxima da atividade da enzima pelos íons potássio é da ordem de V= 48,9 ±
2,4 U/mg com K
0,5
= 3,7 ± 0,1 mM. A inserção da figura mostra que na
preparação existe uma atividade residual de fosfohidrolase da ordem de 60%
que é estimulada pelo aumento da concentração dos íons potássio.
O efeito da concentração dos íons potássio sobre a atividade K
+
-
fosfatase do tecido branquial de Clibanarius vittatus, na presença de
concentração saturante de íons amônio é mostrado na Figura 19. Na presença
de concentrações saturantes de amônio (100 mM), a atividade PNFFase
permaneceu praticamente constante (V= 43,9 ± 1,1 U/mg) com o aumento da
concentração dos íons potássio até 10 mM. Acima de 10 mM os íons potássio
provocaram uma inibição da atividade. Observa-se também que a atividade
PNFFase insensível à ouabaína também não foi estimulada pelos íons potássio
(inserção da Figura 19).
A Figura 20 mostra a modulação da atividade K
+
-fosfatase da fração
microsomal do tecido branquial de Clibanarius vittatus pelos íons amônio.
Em condições saturantes de PNFF e íons magnésio a estimulação máxima da
atividade da enzima pelos íons amônio é da ordem de V= 42,1 ± 1,3 U/mg
através de uma simples curva de saturação que apresentou interações sítio-
sítio (n
H
= 1,9), com K
0,5
= 19,3 ± 0,7 mM. A inserção da figura mostra que
na preparação existe uma atividade residual de fosfohidrolase da ordem de
28% que é estimulada pelo aumento da concentração dos íons amônio.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
68
Figura 16. Modulação da atividade K
+
-fosfatase da fração microsomal de tecido
branquial do Clibanarius vittatus pelo PNFF. A atividade da enzima foi medida
continuamente em tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo MgCl
2
10 mM e KCl 15 mM,
num volume final de 1 mL. A reação foi iniciada pela adição de 26,4 µg de proteína. A
figura apresentada corresponde a uma curva representativa de um dos homogeneizados
(N=3). Inserção: Efeito da concentração do PNFF sobre a atividade PNFFase total na
ausência (l) e presença (¡) de ouabaina 1 mM.
10
20
30
40
50
4
3 2
5
U/mg
-Log [PNFF] (M)
20
40
60
80
2345
U/mg
-Log [PNFF] (M)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
69
Figura 17. Modulação da atividade K
+
-fosfatase da fração microsomal do tecido
branquial de Clibanarius vittatus pelos íons magnésio. A atividade foi determinada
continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo PNFF 10 mM e KCl
15 mM, num volume final de 1 mL. A reação foi iniciada pela adição de 26,4 µg de
proteína. A figura apresentada corresponde a uma curva representativa de um dos
homogeneizados (N=3). Inserção: Efeito da concentração do MgCl
2
sobre a atividade
PNFFase total na ausência (l) e presença (¡) de ouabaína 1 mM.
10
20
30
40
50
4
3
2
5
U/mg
-Log [MgCl
2
] (M)
20
40
60
80
2345
U/mg
-Log[MgCl
2
] (M)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
70
Figura 18. Modulação da atividade K
+
-fosfatase da fração microsomal do tecido
branquial de Clibanarius vittatus pelos íons potássio. A atividade foi determinada
continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo PNFF 10 mM e MgCl
2
10 mM, num volume final de 1 mL. A reação foi iniciada pela adição de 26,4 µg de
proteína. A figura apresentada corresponde a uma curva representativa de um dos
homogeneizados (N=3). Inserção: Efeito da concentração do KCl sobre a atividade
PNFFase total na ausência (l) e presença (¡) de ouabaína 1 mM.
10
20
30
40
50
4
3 2
5
U/mg
-Log [KCl] (M)
20
40
60
80
2
3
4
5
U/mg
-Log[KCl] (M)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
71
Figura 19. Modulação da atividade K
+
-fosfatase da fração microsomal do tecido
branquial de Clibanarius vittatus pelos íons potássio na presença de íons amônio. A
atividade foi determinada continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes 50 mM, pH 7,5,
contendo PNFF 10 mM, MgCl
2
10 mM e NH
4
Cl 100 mM, num volume final de 1 mL. A
reação foi iniciada pela adição de 26,4 µg de proteína. A figura apresentada corresponde a
uma curva representativa de um dos homogeneizados (N=3). Inserção: Efeito da
concentração do KCl sobre a atividade PNFFase total na ausência (l) e presença (¡) de
ouabaína 1 mM.
10
20
30
40
50
4
3
2
5
U/mg
-Log [KCl] (M)
20
40
60
80
12345
U/mg
-Log [KCl] (M)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
72
Figura 20. Modulação da atividade K
+
-fosfatase da fração microsomal do tecido
branquial de Clibanarius vittatus pelos íons amônio. A atividade da enzima foi medida
continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo PNFF 10 mM e MgCl
2
10 mM, num volume final de 1 mL. A reação foi iniciada pela adição de 26,4 µg de
proteína. A figura apresentada corresponde a uma curva representativa de um dos
homogeneizados (N=3). Inserção: Efeito da concentração do NH
4
Cl sobre a atividade
PNFFase total na ausência (l) e presença (¡) de ouabaína 1 mM.
10
20
30
40
50
4
3 2 1
5
U/mg
-Log [NH
4
Cl] (M)
20
40
60
80
12345
U/mg
-Log[NH
4
Cl] (M)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
73
A Figura 21 mostra a modulação da atividade K
+
-fosfatase pelos íons
potássio e amônio. Na presença de concentrações saturantes de íons potássio
(15 mM) o aumento da concentração dos íons amônio não provoca nenhum
efeito adicional na atividade da enzima V= 41,3 ± 0,8 U/mg até
concentrações de amônio de 10 mM.
A combinação dos resultados obtidos das Figuras 19 e 21 sugere que,
diferentemente do observado para a hidrólise do ATP, os íons potássio e
amônio não apresentam efeitos sinérgicos em relação à atividade K
+
-fosfatase
da enzima da fração microsomal do tecido branquial de Clibanarius vittatus.
Na Figura 22 é mostrado o efeito da concentração dos íons sódio sobre
a atividade PNFFase total da fração microsomal de tecido branquial de
Clibanarius vittatus. Em condições saturantes de PNFF e de íons potássio e
magnésio, os íons sódio atuam como inibidores da atividade da enzima.
A Figura 23 mostra o efeito de concentrações crescentes de ouabaína
sobre a atividade PNFFase total da fração microsomal do tecido branquial de
Clibanarius vittatus. Em condições saturantes de PNFF e de íons potássio e
magnésio a atividade PNFFase total foi inibida cerca de 67% por
concentrações de ouabaína da ordem de 10 mM. O valor calculado para K
I
para a inibição da atividade K
+
-fosfatase pela ouabaína foi da ordem de
352,9 ± 14,1 µM (inserção da Figura 23).
O efeito da concentração de ouabaína sobre a atividade PNFFase total
da fração microsomal do tecido branquial de Clibanarius vittatus na presença
de amônio é mostrado na Figura 24. Em condições saturantes de PNFF, de
íons potássio, magnésio e amônio a atividade PNFFase total foi inibida cerca
de 66% por concentrações de ouabaína da ordem de 10 mM. O valor
calculado para K
I
para a inibição da atividade PNFFase pela ouabaína foi da
ordem de 167,0 ± 8,3 µM na presença de íons amônio 100 mM (inserção da
Figura 24).
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
74
O efeito da concentração da ortovanadato sobre a atividade PNFFase
total da fração microsomal do tecido branquial de C. vittatus é mostrado na
Figura 25. Em condições saturantes de PNFF, de íons potássio e magnésio, a
atividade PNFFase total é inibida cerca de 44% através de uma curva simples.
A Tabela 3 resume os valores dos parâmetros cinéticos calculados para
a modulação da atividade PNFFase da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração
microsomal do tecido branquial de Clibanarius vittatus pelo PNFF, íons
magnésio, potássio e amônio.
Tabela 3. Parâmetros cinéticos calculados para a modulação da atividade
K
+
-fosfatase da fração microsomal de tecido branquial de Clibanarius
vittatus pelo PNFF e íons magnésio, potássio e amônio.
Efetor V
(U/mg) K
0,5
(mM) n
H
PNFF 47,4 ± 1,9
1,0 ± 0,01 1,1
Mg
2+
43,9 ± 1,5
0,6 ± 0,1 2,6
K
+
48,9 ± 2,4
3,7 ± 0,1 1,4
K
+
(na presença de NH
4
+
100 mM) 43,9 ± 1,1
- -
NH
4
+
42,1 ± 1,3
19,3 ± 0,7 1,9
NH
4
+
(na presença de KCl 15 mM) 41,3 ± 0,8
- -
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
75
Figura 21. Modulação da atividade K
+
-fosfatase da fração microsomal do tecido
branquial de Clibanarius vittatus pelos íons amônio na presença de íons potássio. A
atividade da enzima foi medida continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes 50 mM, pH 7,5,
contendo PNFF 10 mM, MgCl
2
10 mM e KCl 15 mM, num volume final de 1 mL. A
reação foi iniciada pela adição de 26,4 µg de proteína. A figura apresentada corresponde a
uma curva representativa de um dos homogeneizados (N=3). Inserção: Efeito da
concentração do NH
4
Cl, com íons potássio saturante, sobre a atividade PNFFase total na
ausência (l) e presença (¡) de ouabaína 1 mM.
10
20
30
40
50
4 3 2 1
5
U/mg
-Log [NH
4
Cl] (M)
20
40
60
80
1
2
345
U/mg
-Log [NH
4
Cl] (M)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
76
Figura 22. Efeito da concentração de íons sódio sobre a atividade PNFFase total da
fração microsomal do tecido branquial de Clibanarius vittatus. A atividade da enzima
foi determinada continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo PNFF
10 mM, MgCl
2
10 mM e KCl 15 mM, num volume final de 1 mL. A reação foi iniciada
pela adição de 26,4 µg de proteína. A atividade específica correspondente a 100% é 70,54
U/mg. A figura apresentada corresponde a uma curva representativa de um dos
homogeneizados (N=3).
20
40
60
80
2
1
3
U/mg
-Log [NaCl] (M)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
77
Figura 23. Efeito da concentração de ouabaína sobre a atividade PNFFase total da
fração microsomal do tecido branquial de Clibanarius vittatus na ausência de íons
amônio. A atividade da enzima foi determinada continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes
50 mM, pH 7,5, contendo PNFF 10 mM, MgCl
2
10 mM e KCl 15 mM, num volume final
de 1 mL. A reação foi iniciada pela adição de 26,4 µg de proteína. A atividade fosfatase
total correspondente a 100% foi de 70,54 U/mg. Inserção: representação de Dixon para o
efeito da ouabaína, onde v
c
representa a velocidade corrigida para a atividade K
+
-fosfatase.
A figura apresentada corresponde a uma curva representativa de um dos homogeneizados
(N=3).
20
40
60
80
2
3
45
6
U/mg
-Log [Ouabaína] (M)
40
80
120
1200800400
1/v
c
(U/mg)
-1
x10
3
[Ouabaína] (µM)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
78
Figura 24. Efeito da concentração de ouabaína sobre a atividade PNFFase total da
fração microsomal do tecido branquial de Clibanarius vittatus na presença de íons
amônio. A atividade da enzima foi determinada continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes
50 mM, pH 7,5, contendo PNFF 10 mM, MgCl
2
10 mM, KCl 15 mM e NH
4
Cl 100 mM. A
reação foi iniciada pela adição de 26,4 µg de proteína. A atividade PNFFase total
correspondente a 100% foi de 70,54 U/mg. Inserção: representação de Dixon para o efeito
da ouabaína na presença de íons amônio, onde v
c
representa a velocidade corrigida para a
atividade K
+
-fosfatase. A figura apresentada corresponde a uma curva representativa de um
dos homogeneizados (N=3).
20
40
60
80
23
4
5
6
U/mg
-Log [Ouabaína] (M)
20
40
60
80
800
1200
400
1/v
c
(U/mg)
-1
x10
3
[Ouabaína] (µM)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
79
Figura 25. Efeito da concentração de ortovanadato sobre a atividade PNFFase total
da microsomal do tecido branquial de Clibanarius vittatus. A atividade da enzima foi
determinada continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo PNFF 10
mM, MgCl
2
10 mM e KCl 15 mM. A reação foi iniciada pela adição de 26,4 µg de
proteína. A atividade específica correspondente a 100% é 70,54 U/mg. As figuras
apresentadas correspondem à curvas representativas de um dos homogeneizados (N=3).
20
40
60
80
7
6 5
4
8
U/mg
-Log [Ortovanadato] (M)
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
80
4. DISCUSSÃO
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
81
4. DISCUSSÃO
Os principais desafios enfrentados pelos Crustacea estuarinos e/ou
intertidais são as variações de temperatura e salinidade resultantes dos ciclos
de marés, dessecação pela exposição ao ar e a disponibilidade de oxigênio. As
adaptações fisiológicas à salinidade, incluindo a regulação osmótica e iônica,
têm sido frequentemente investigadas (Mantel & Farmer, 1983; Péqueux,
1995), incluindo análises das adaptações comportamentais dos ermitões
intertidais e o papel protetor das suas conchas (Reese, 1969). Entretanto,
pouco se conhece sobre os processos de regulação osmótica e iônica
realizados pelos Anomura (Young, 1979a, b; Sabourin & Stickle, 1980). Nos
crustáceos, os processos de excreção e osmoregulação são realizados
principalmente via epitélio branquial, exercendo, desta maneira, papel
fundamental na manutenção dos processos metabólicos do animal (Péqueux,
1995; Weinhrauch et al., 1999; Lovett et al., 2001; Lin et al., 2002). O epitélio
branquial desses animais é um tecido multifuncional composto por várias
enzimas envolvidas no transporte de íons. Entretanto, comparações das
propriedades cinéticas da (Na
+
,K
+
)-ATPase, enzima alvo do presente estudo,
retirada de brânquias de C. vittatus, um típico ermitão pagurideo intertidal,
com aquelas de outras espécies de crustáceos poderiam fornecer melhor
compreensão dos mecanismos bioquímicos envolvidos nos processos de
osmorregulação e excreção desempenhados por esta enzima.
Os resultados obtidos a partir das análises realizadas por eletroforese e
Western blotting da fração microsomal do tecido branquial do C. vittatus
mostraram que a enzima (Na
+
,K
+
)-ATPase isolada deste tecido possui massa
molecular de 105 kDa, equivalente às isoformas encontradas em outros
crustáceos decápodes (Lucu & Towle, 2003), incluindo Callinectes danae
(Masui et al., 2002) e Macrobrachium olfersii (Furriel et al., 2000). Estudos
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
82
conduzidos por Masui et al (2002), sugerem a existência de uma única
isoforma da subunidade α da (Na
+
,K
+
)-ATPase isolada do tecido branquial de
Callinectes danae.
Embora já tenha sido relatada a presença de mais de uma isoforma da
subunidade α em um mesmo tecido de diferentes organismos (Cortas &
Edelman, 1988; Cortas et al., 1989; Sweadner, 1989; Levenson, 1994;
Pressley, 1996; Escalante et al., 1995; Schmalzing et al., 1997; Garcia Saez et
al., 1997), até o presente momento não foi observada a presença de mais de
uma isoforma da subunidade α no tecido branquial dos crustáceos.
Os ensaios de atividade específica da (Na
+
,K
+
)-ATPase branquial do C.
vittatus (V= 142,6 ± 4,3 U/mg), mostraram que a atividade desta enzima é 2,2
e 1,7 vezes menor que a observada para a enzima obtida dos tecidos
branquiais de Callinectes danae e C. sapidus, respectivamente, embora muito
similar àquela retirada das brânquias do C. ornatus (Leone et al., 2005b). Esta
atividade enzimática menor observada no tecido branquial de C. vittatus é
coerente com a hiperosmoregulação modesta mostrada por este animal em
salinidades acima de 25‰ (Young, 1979a; Sharp & Neff, 1980). Em
salinidade de 30‰, por exemplo, o C. vittatus mantém a concentração
isosmótica de Na
+
da sua hemolinfa em torno de 344 mM contra uma
concentração de Na
+
externa de 349 mM (Sabourin & Stickle, 1980),
justificando a baixa atividade específica (Na
+
,K
+
)-ATPase branquial.
Nas espécies de crustáceos como Callinectes danae e C. sapidus, que
estão expostos à variação contínua da salinidade, mantém níveis elevados de
atividade da (Na
+
,K
+
)-ATPase branquial como conseqüência dessa condição
ambiental a qual estão submetidos (Masui et al., 2005). Do mesmo modo, por
C. vittatus habitar zonas intertidais que são suscetíveis à influência da água
doce, está sujeito a grandes variações sazonais e salinidades das marés
(Coelho & Ramos, 1972; Fotheringham, 1975; Williams, 1984; Lowery &
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
83
Nelson, 1988). Sendo assim, poderia se esperar que a atividade da (Na
+
,K
+
)-
ATPase também seria alta por causa dessas condições. Entretanto, C. vittatus
é uma espécie que habita conchas de gastrópodes, as quais possuem um papel
protetor contra as interferências do meio ambiente. Esta proteção, além de
diminuir o estresse físico, diminui também as interferências das flutuações de
salinidade e temperatura, proporcionando ao animal um microambiente
favorável, protegendo os ermitões das conseqüências metabólicas geradas por
essas alterações (Reese, 1969; Wernick & Moreira, 1985). Esses dados podem
explicar os baixos valores de atividade da (Na
+
,K
+
)-ATPase encontrados nos
tecidos branquiais desses animais. Em crustáceos como por exemplo, o
Pagurus bernhardus e Isocheles sawayai, quando estudados fora de suas
conchas, a concentração de suas hemolinfas tornam-se muito mais diluídas
durante a exposição a baixas salinidades quando comparadas à dos mesmos
ermitões protegidos por suas conchas (Shumway, 1978; Wernick et al., 1984).
Deste modo, a variação de salinidade na água retida na concha ocupada é
atenuada comparada ao ambiente aquático externo, os níveis de atividade
enzimática são correspondentemente baixos comparados à atividade
enzimática observada em decápodes exclusivamente marinhos.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase pode apresentar mais de um sítio de ligação para o
ATP, mas existem controvérsias relacionadas à caracterização desses sítios de
ligação (Beaugé et al., 1997; Martin & Sachs, 2000). Enquanto os sítios de
alta (K
M
entre 0,1 e 1,0 µM) e baixa afinidade (K
M
entre 0,07 e 0,4 mM) para
a hidrólise do ATP são conhecidos para a enzima dos vertebrados (Glynn,
1985; Ward & Cavieres, 1998; Thoenges et al., 1999), as suas localizações
específicas dentro da molécula da enzima permanecem a serem determinadas
(Krumscheid et al., 2004). A estimulação da atividade da enzima do tecido
branquial pelo ATP tem sido investigada em várias espécies de crustáceos
(Lucu & Towle, 2003; Leone et al., 2005b). Entretanto, sítios de ligação de
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
84
baixa e alta afinidade do ATP foram descritos somente para C. danae (Masui
et al., 2002). Os resultados obtidos a partir da hidrólise do ATP pela (Na
+
,K
+
)-
ATPase branquial do C. vittatus indicaram, assim como o observado no tecido
branquial do C. danae, que esta enzima possui dois sítios de ligação para o
ATP. Os resultados mostraram que o ATP hidrolisado pela (Na
+
,K
+
)-ATPase,
no sítio de baixa afinidade (K
M
= 44,1 ± 3,0 µM), obedeceu à cinética
Michaeliana, enquanto que para o sítio de alta afinidade (K
0,5
= 0,064 ± 0,003
µM), apresentou cinética cooperativa. Além disso, os sítios de alta afinidade
da enzima no C. vittatus representam 13% da velocidade máxima, similar à
enzima obtida do tecido branquial de C. danae (Masui et al., 2002) e da
enzima obtida nos vertebrados (Glynn, 1985; Ward & Cavieres, 1998).
Está bem estabelecido que os íons magnésio são essenciais para a
hidrólise do ATP pela (Na
+
,K
+
)-ATPase de várias fontes (Glynn, 1985;
Furriel et al., 2000; Masui et al., 2002) e, da mesma forma, foi observado que
para a (Na
+
,K
+
)-ATPase branquial de C. vitttatus esta condição também é
essencial para a hidrólise do ATP. A estimulação da atividade (Na
+
,K
+
)-
ATPase pelo Mg
2+
ocorre de maneira cooperativa (n
H
= 1,8), como observado
para as enzimas da brânquia de C. danae (Masui et al., 2002) e no axônio do
caranguejo Cancer pagurus (Gache et al., 1976). Estes dados sugerem a
presença de múltiplos sítios de ligação para o íon Mg
2+
na (Na
+
,K
+
)-ATPase
branquial de C. vitttatus.
A afinidade aparente da enzima branquial de C. vittatus observada para
os íons Mg
2+
(K
0,5
= 0,36 ± 0,02 mM) é similar àquela encontrada nas enzimas
de M. olfersii (Furriel et al., 2000), de C. danae (Masui et al., 2002), da
membrana axonial de caranguejo (Gache et al., 1976) e vertebrados (Glynn,
1985; Robinson & Pratap, 1991). Entretanto, valores dez vezes maiores têm
sido observados para enzimas de alguns caranguejos eurialinos (Leone et al.,
2005b).
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
85
A afinidade aparente da (Na
+
,K
+
)-ATPase branquial de C. vittatus pelos
íons Na
+
(K
M
= 7,4 ± 0,4 mM), situa-se na mesma faixa de concentração
determinada para a enzima obtida de vários caranguejos eurialinos (Lucu &
Towle, 2003). Entretanto, certos osmoconformadores marinhos apresentam
valores de K
0,5
7 a 10 vezes maiores se comparados a enzima obtida de C.
vittatus, enquanto que valores de K
0,5
de 0,06 a 0,9 mM têm sido relatados
para espécies de crustáceos bem estabelecidos em água doce (Lucu & Towle,
2003; Leone et al., 2005b). O comportamento Michaeliano observado para a
estimulação da atividade da enzima por Na
+
em C. vittatus contrasta com a
cooperatividade positiva relatada paras enzimas obtidas das brânquias de C.
danae (Masui et al., 2002) e M. olfersii (Furiel et al., 2000) e para enzimas de
mamíferos de várias fontes (Blanco et al., 1998; Koster et al., 1996).
A afinidade aparente da enzima branquial de C. vitatus para os íons K
+
(K
M
= 1,5 ± 0,1 mM) são similares àquelas encontradas para o C. ornatus, C.
danae e C. sapidus, situando-se na mesma faixa de concentração observadas
para enzimas de outros crustáceos eurialinos (Lucu & Towle, 2003; Leone et
al., 2005b). A modulação da (Na
+
,K
+
)-ATPase branquial de crustáceos pelo
K
+
é bastante similar entre diferentes espécies, independente do biótopo
habitado.
Na hidrólise do ATP pela (Na
+
,K
+
)-ATPase, em tecidos de vertebrados,
o K
+
pode ser substituído pelo íon NH
4
+
(Robinson, 1970; Mallery, 1983;
Skou & Esmann, 1992; Wall, 1996), ocorrendo da mesma forma nos tecidos
branquiais de crustáceos (Holliday, 1985). Tanto o K
+
quanto o
NH
4
+
, podem
ser transportados ativamente pela enzima de vertebrados (Mallery, 1983;
Wall, 1996). O NH
4
+
também pode substituir o K
+
como um contra-ion no
transporte de Na
+
nas vesículas de membrana de C. sapidus (Towle &
Holleland, 1987). A atividade da (Na
+
,K
+
)-ATPase pode apresentar diferenças
importantes quando são associados os íons NH
4
+
e K
+
. Os resultados obtidos
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
86
no presente trabalho sugerem que a (Na
+
,K
+
)-ATPase branquial de C. vittatus
seja estimulada sinergicamente pela associação de NH
4
+
e K
+
, assim como
observado para as enzimas de C. danae (Masui et al., 2002) e M. olfersii
(Furiel et al. 2000). É importante ressaltar que a concentração de um íon é
sempre constante enquanto que a concentração do outro é variável. Os
resultados encontrados a partir da determinação do coeficiente de Hill (n
H
=
1,1) para a estimulação enzimática pelo K
+
, na ausência de NH
4
+
, no tecido
branquial de C. vittatus é similar ao comportamento de Michaeliano
observado para a atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase de M. olfersii (Furriel et al.,
2000), U. pugnax (Holliday, 1985) e U. pugilator (D’Orazio e Holliday,
1985). Entretanto, estes resultados contrastam com os múltiplos sítios de
ligação para os K
+
conhecidos para as enzimas da membrana axonial do
caranguejo (Gache et al., 1976) e do tecido branquial de C. danae (Masui et
al., 2002). Interessantemente, o K
M
(4,51 ± 0,18 mM) estimado para a
modulação por NH
4
+
da enzima branquial do C. vittatus, na ausência de K
+
, é
muito similar àquela do nervo do caranguejo (Skou, 1960), do tecido
branquial do C. danae (Masui et al., 2002) e da enzima de vertebrados
(Robinson, 1970).
A utilização de inibidores específicos em preparações enzimáticas se
torna uma ferramenta essencial para a avaliação da presença ou não de
enzimas contaminantes no meio reacional. Sabidamente, glicosídeos
cardiotônicos, como a ouabaína, são inibidores da enzima (Na
+
,K
+
)-ATPase.
O processo inibitório ocorre através da ligação do glicosídeo com a porção
extracelular da enzima (Hoffman, 1996), ligando-se com maior afinidade com
a forma E
2
P da proteína, bloqueando, dessa maneira, o transporte de íons e a
hidrólise do ATP (Erdmann & Schoner, 1973; Asami et al., 1995; Pressley,
1996; Lingrel et al., 1997; Kasturi et al., 1998). No presente trabalho, foi
observado que a inibição induzida pela ouabaína, sobre a atividade total no
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
87
tecido branquial de C. vittatus, foi de aproximadamente 64%. Além disso, a
inibição induzida pela ouabaína foi do tipo monofásica, como ocorre na
enzima obtida de C. danae (Masui et al., 2002), C. ornatus (Leone et al.,
2005b) e no camarão M. olfersii (Furriel et al., 2001). Por outro lado, estes
resultados contrastam com a resposta bifásica observada na enzima dos
caranguejos U. pugnax (Holliday, 1985) e C. sapidus (Neufeld et al., 1980), e
em Potamon potamios (Tentes & Stratakis, 1991). Ainda, os resultados
obtidos com a presença da ouabaína indicaram que na preparação microsomal
do tecido branquial de C. vittatus apresentam atividades enzimáticas
insensíveis à ouabaína. De fato, a utilização de outros inibidores, em
associação com a ouabaína, sugerem a presença de enzimas como, por
exemplo, fosfatases neutras, Ca
+
-ATPase, a FoF
1
-ATPase e V-ATPases
(Tabela 2).
O valor de K
I
para a ouabaína encontrado para a (Na
+
,K
+
)-ATPase de
tecido branquial de C. vittatus (K
I
= 56,4 ± 3,4 µM) é similar à enzima de C.
ornatus e outros crustáceos (Leone et al., 2005b), mas é em torno de 3 vezes
menor quando comparado ao valor de K
I
da enzima obtida do tecido branquial
de C. danae (Masui et al., 2002) e de C. sapidus (Neufeld et al., 1980).
Outro inibidor utilizado nos ensaios com a fração microsomal de tecido
branquial de C. vittatus foi o ortovanadato, o qual é capaz de inibir as todas
ATPases do tipo-P. Os resultados obtidos na presença deste inibidor
indicaram que 67% da atividade presente na preparação analisada corroboram
os resultados obtidos para a medida da atividade ATPase total na presença de
ouabaína. Os resultados mostraram também que a inibição induzida pelo
ortovanadato é do tipo monofásica, assim como observado para a ouabaína.
Além disso, a atividade residual observada (37%) na presença deste inibidor
confirma a presença de outras atividades hidrolizantes de ATP no
homogenizado de brânquias do ermitão C. vittatus.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
88
No presente trabalho também foi utilizado o substrato sintético PNFF
que permite a hidrólise pela enzima (Na
+
,K
+
)-ATPase, sendo bastante útil
para as determinações cinéticas da enzima (Furriel et al., 2001; Masui et al.
2003, 2005a). A atividade específica da (Na
+
,K
+
)-ATPase do tecido branquial
de C. vittatus em relação à hidrólise do PNFF (V= 47,4 ± 1,9 U/mg) foi de
aproximadamente 2,6 vezes menor que a observada para a hidrólise do ATP.
Os resultados obtidos com o substrato PNFF contrastam com os da hidrólise
do ATP, pois não foram identificados sítios de alta e baixa afinidade e sim
uma única família de sítios de hidrólise, com afinidade aparente de 1,0 ± 0,04
mM.
As atividades (Na
+
,K
+
)-ATPase e K
+
-fosfatase presentes no tecido
branquial de C. vittatus apresentam uma relação similar entre atividades
máximas de hidrólise considerando os substratos ATP e PNFF. Essa
similaridade também pode ser observada para as atividades (Na
+
,K
+
)-ATPase
e K
+
-fosfatase obtidas dos tecidos branquiais de M. olfersii (Furriel et al.,
2001) e de C. danae (Masui et al., 2002, 2003), nas membranas axoniais do
caranguejo C. pagurus (Gache et al., 1977) e outros tecidos de vertebrados
(Beaugé & Berberian, 1983; Davis & Robinson, 1988). Entretanto, esta
característica observada para a enzima pode estar mais intimamente
relacionada aos tecidos obtidos de crustáceos, pois usualmente as relações
entre as atividades (Na
+
,K
+
)-ATPase e K
+
-fosfatase observadas para a enzima
de vertebrados estão em torno de 5 a 6 vezes (Esmann, 1988; Robinson,
1981).
Os íons magnésio são reconhecidamente essenciais para ambas as
atividades (Na
+
,K
+
)-ATPase e K
+
-fosfatase obtida de diferentes fontes (Rossi
et al., 1978; Glynn, 1985; Robinson & Pratap, 1991; Berberian & Beaugé,
1992; Furriel et al., 2000, 2001; Masui et al., 2002, 2003). A análise da
atividade da (Na
+
,K
+
)-ATPase, sobre a hidrólise do ATP, pode ser
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
89
influenciada quando da presença dos íons magnésio, pois esses íons podem
formar um complexo ATP-Mg
2+
que interfere na atividade catalítica da
(Na
+
,K
+
)-ATPase. Ainda, os íons magnésio podem se fixar em um sítio de
reconhecimento que existe na enzima que está situado na face interna da
membrana, prejudicando ainda mais a análise da atividade enzimática
(Grisham & Mildvan, 1974). Por outro lado, a utilização do substrato sintético
PNFF é vantajosa quando se considera o fato de que esse composto não forma
complexo com os íons magnésio nas condições experimentais utilizadas.
Portanto, a análise da interação dos íons magnésio com a enzima, através da
atividade PNFFase, favorece interpretações mais claras e simples relacionadas
à atividade enzimática per si.
O valor de K
0,5
observado para a estimulação da atividade K
+
-fosfatase
da enzima do tecido branquial de C. vittatus pelos íons magnésio foi de
aproximadamente 0,6 ± 0,1 mM. Este valor encontrado é muito similar ao
observado para a (Na
+
,K
+
)-ATPase do tecido branquial de M. olfersii (Furriel
et al., 2001), C. danae (Masui et al., 2002), membranas axoniais de
caranguejo (Gache et al., 1976) e diferentes tecidos de vertebrados (Robinson,
1981; Beaugé & Berberian, 1983).
Outra semelhança observada a partir dos resultados obtidos referentes à
atividade K
+
-fosfatase da enzima do tecido branquial de C. vittatus está
relacionada à afinidade aparente da enzima aos íons potássio (K
0,5
= 3,7 ± 0,1
mM), a qual é similar à encontrada para as enzimas do tecido branquial de C.
danae (Masui et al., 2003), M. olfersii (Furriel et al., 2001, 2004), tecidos de
vertebrados (Robinson, 1981; Glynn, 1985) e membrana axonial de
caranguejo (Gache et al., 1976).
Os experimentos para avaliar a atividade K
+
-fosfatase da enzima a
partir da substituição dos íons potássio pelos íons amônio, indicaram que estes
últimos são capazes de estimular a atividade da enzima. Entretanto, os
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
90
resultados revelaram que a enzima possui menor afinidade pelos íons amônio
(K
0,5
= 19,3 ± 0,7 mM) quando comparada a enzimas do tecido branquial de C.
danae (Masui et al., 2002, 2003), das membranas axoniais de caranguejo
(Rossi et al., 1978) e cérebro de rato (Robinson, 1970).
Os coeficientes de Hill calculados para a estimulação da enzima pelos
íons potássio e amônio foram 1,4 e 1,9, respectivamente. Estes resultados
sugerem a existência de múltiplos sítios de ligação para estes íons da mesma
forma como observado para enzimas de diferentes fontes (Robinson, 1970;
Rossi et al., 1978, Masui et al., 2002, 2003). A presença simultânea dos íons
potássio e amônio no meio de reação, não promoveu alteração na atividade
K
+
-fosfatase do tecido branquial de C. vittatus, sugerindo que a estimulação
da atividade K
+
-fosfatase da enzima pelos dos íons amônio, quando utilizados
em substituição aos íons potássio, ocorra através da interação com os mesmos
sítios de ligação como proposto anteriormente por Robinson (1970). Além
disso, foi observado que em concentrações acima de 100 mM, tanto os íons
potássio quanto os íons amônio promoveram inibição parcial da atividade K
+
-
fosfatase da enzima (Na
+
,K
+
)-ATPase do tecido branquial de C. vittatus. Esta
observação pode ser explicada baseada na competição entre cátions
monovalentes, como descrito em estudos anteriores (Robinson, 1970; Gache
et al., 1976).
Os perfis de análise da cinética enzimática, utilizando o substrato
sintético PNFF e o substrato natural da enzima, o ATP, fornecem resultados
consistentes quando comparados entre si em preparações a partir de tecidos de
diferentes espécies de crustáceos estudados (Painel 05). Dessa maneira, a
utilização do substrato sintético para a avaliação da atividade K
+
-fosfatase da
enzima (Na
+
,K
+
)-ATPase do tecido branquial de C. vittatus, fornece
parâmetros confiáveis diretamente relacionáveis ao monitoramento da
atividade da enzima. Ainda, o PNFF pode ser utilizado como ferramenta útil
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
91
em estudos que envolvem processos osmorregulatórios comparativos com
outras enzimas presentes em tecidos de vertebrados (Furriel et al., 2001).
Estudos conduzidos anteriormente sugerem que a hidrólise do PNFF
pela (Na
+
,K
+
)-ATPase seja realizada principalmente quando a enzima está no
seu estado conformacional E
2
, ocorrendo na presença dos íons potássio, mas é
inibida pela presença dos íons sódio. Ainda, nesta conformação não é
observado o transporte acoplado dos íons sódio ou potássio através da
membrana (Garrahan & Rega, 1972) ou a fosforilação da enzima durante o
ciclo catalítico (Glynn, 1985; Robinson & Pratap, 1991; Berberian & Beaugé,
1992; Jorgensen et al., 1998).
A inibição da atividade K
+
-fosfatase induzida pela presença dos íons
sódio observada para a enzima do tecido branquial do C. vittatus (K
I
= 12,6
mM) concorda com achados já descritos anteriormente para enzimas de outras
fontes (Gache et al., 1976; Glynn, 1985; Furriel et al., 2001; Masui et al.,
2003). Este efeito inibitório pode ser explicado baseado nos estudos
conduzidos por Robinson e Pratap (1991), os quais mostraram que os íons
sódio podem competir pelos mesmos sítios de ligação do magnésio e, dessa
forma, contribuindo para a inibição da atividade K
+
-fosfatase da enzima.
Da mesma forma como observado para a atividade ATPase, a presença
da ouabaína no meio reacional induziu inibição de cerca de 67% da atividade
K
+
-fosfatase total observada para a fração microssomal do tecido branquial de
C. vittatus, indicando a presença de outras atividades enzimáticas presentes no
homogenato. A inibição induzida pela ouabaína sobre a atividade PNFFase,
assim como para a atividade ATPase, foi do tipo monofásica, indicando o
mesmo comportamento quando comparada às inibições observadas sobre as
atividades enzimáticas de C. danae (Masui et al., 2003) e M. olfersii (Furriel
et al., 2001).
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
92
O K
I
aparente determinado para a inibição da atividade K
+
-fosfatase da
(Na
+
,K
+
)-ATPase das brânquias de C. vittatus pela ouabaína foi de V= 352,9
± 14,1 µM. Estes dados indicam que a atividade PNFFase é mais resistente à
ação da ouabaína quando compara à atividade ATPase da enzima (Na
+
,K
+
)-
ATPase do tecido branquial de C. vittatus. Entretanto, vários estudos mostram
diferentes valores de K
I
para ouabaína sobre as atividades PNFFase de outros
crustáceos (Gache et al., 1976; Furriel et al., 2002) e vertebrados (Robinson,
1981), sugerindo que o comportamento da enzima na presença do mesmo
inibidor pode variar dependendo do animal estudado.
A atividade PNFFase também foi estimada na presença do inibidor de
ATPases do tipo P, o ortovanadato. Os resultados obtidos foram similares aos
observados para a ouabaína, ou seja, a inibição induzida pelo ortovanadato foi
da ordem de 66% do total da atividade do homogenato, também confirmando
a presença de atividades insensíveis ao inibidor de ATPases do tipo P. A
presença do ortovanadato no meio reacional também induziu inibição do tipo
monofásica como observado para a ouabaína, mantendo o mesmo
comportamento quando comparada com a inibição observada para a enzima
obtida de outras espécies de crustáceos (Furriel et al., 2001; Masui et al.,
2003).
A concentração de amônia no ambiente aquático é usualmente baixa
devido à nitrificação bacteriana, raramente excedendo 5 µM na água do mar
despoluída e oxigenada (Koroleff, 1983; Weihrauch et al., 1999). Entretanto,
concentrações de amônia em torno de 100 µM na hemolinfa têm sido
observadas em várias espécies de caranguejos braquiúros adaptados a
diferentes salinidades (Weihrauch et al., 1999). Este gradiente químico
favorável facilita a excreção da amônia principalmente por difusão passiva,
particularmente em animais pelágicos. Em contraste, crustáceos bênticos
enterrados no sedimento podem enfrentar concentrações muito maiores de
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
93
amônia (em torno de 2,8 mM), particularmente em áreas com grande
deposição de matéria orgânica (Weihrauch et al., 1999; Rebelo et al., 1999).
Assim, sob circunstâncias específicas, tais animais podem ser expostos a
concentrações de amônia que geralmente excedem os níveis da hemolinfa,
facilitando o influxo de amônia (Weihrauch et al., 1999). A excreção ativa de
NH
4
+
através do epitélio branquial contra elevadas concentrações externas de
amônia ocorre em Carcinus maenas, Eriocheir sinensis e C. pagurus
(Weihrauch et al., 1999). De acordo com modelos recentes, a principal
atividade de direção para o transporte de NH
4
+
para o espaço extracelular é a
(Na
+
,K
+
)-ATPase basolateral. Uma atividade de bombeamento adicional,
inibida por íons magnésio, utilizada para a extrusão do NH
4
+
,
é constituída
pelo segundo sítio de ligação do NH
4
+
, o qual pode aparecer quando a bomba
está completamente saturada pelos íons K
+
(Masui et al., 2002, 2005). Além
da (Na
+
,K
+
)-ATPase, canais de K
+
sensíveis ao Cs
+
, localizados na membrana
basolateral (Riestenpatt et al., 1996), os quais não discriminam entre K
+
e
NH
4
+
, podem translocar NH
4
+
da hemolinfa para dentro do citoplasma (Towle
& Holleland, 1987; Lucu et al., 1989; Weihrauch et al., 2002). Um
transportador de amônio semelhante à proteína transportadora de amônio
encontrada em rhesus de localização desconhecida, também pode mediar à
transferência dos íons NH
4
+
através da membrana celular (Marini et al., 2000;
Weihrauch et al., 2004). A difusão metabólica de NH
4
+
da hemolinfa para
dentro das células epiteliais também contribui para o conjunto de amônia
citoplasmática, o qual pode entrar nas vesículas intracelulares tanto por
difusão quanto através de transportadores de amônio semelhante à proteína
transportadora de amônio. Uma V-ATPase acidifica o interior da vesícula, por
meio de uma bomba de próton, induzindo a formação de NH
4
+
, o qual é
aparentemente expulso para o espaço subcuticular por exocitose dependente
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
94
de motores citoesqueléticos (Weihrauch et al., 2002, 2004; Masui et al.,
2005).
A exposição a elevadas concentrações de amônia pode constituir um
problema para o ermitão C. vittatus. A excreção contínua de amônia para
dentro do ambiente restrito, constituído pela água da concha, em conjunto
com a exposição prolongada a temperaturas elevadas e o represamento de
sedimentos ricos em matéria orgânica pode levar a níveis perigosos de
amônia. Estas condições extremas podem ter conduzido à seleção natural de
um mecanismo particularmente eficiente da excreção de NH
4
+
contra seu
gradiente. A estimulação sinérgica da (Na
+
,K
+
)-ATPase branquial pelo NH
4
+
e
K
+
pode constituir um importante componente da resposta fisiológica do C.
vittatus a estes elevados níveis externos de amônia, permitindo a excreção de
NH
4
+
contra um gradiente de concentração quando a enzima é saturada com
K
+
. Considerando que em salinidade de 30‰, C. vittatus mantém a
concentração de K
+
na hemolinfa em torno de 20 mM (Sabourin & Stickle,
1980), e que a hemolinfa banha os sítios de ligação externos de alta afinidade
para o K
+
da (Na
+
,K
+
)-ATPase, a enzima trabalharia completamente saturada
pelo K
+
. Além disso, mesmo em salinidades baixas como 10‰, a
concentração de K
+
na hemolinfa diminui até limites de 13 mM (Sabourin &
Stickle, 1980). Considerando este grau de salinidade, e os parâmetros
estimados aqui, parece provável que a enzima é saturada pelo K
+
, aumentando
a atividade específica à medida que aumenta a concentração de NH
4
+
. Dessa
maneira, estes achados reforçam a importância da estimulação sinérgica da
(Na
+
,K
+
)-ATPase branquial de C. vittatus pelos íons K
+
e NH
4
+
,
aparentemente contribuindo no eficiente mecanismo adaptativo desencadeado
em resposta à exposição a altas concentrações externas de amônia.
Finalmente, é importante ressaltar que o presente trabalho é o primeiro
estudo que realizou a caracterização cinética da enzima (Na
+
,K
+
)-ATPase no
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
95
ermitão C. vittatus, e que esta enzima possui particularidades específicas
quando comparadas às outras enzimas obtidas de tecidos branquiais
provenientes de diferentes espécies de crustáceos (Leone et al., 2005), pois C.
vittatus está inserido em um microambiente completamente diferenciado dos
outros crustáceos, o qual é constituído pela concha. Este microambiente faz
com que a enzima tenha um comportamento específico frente às condições
proporcionadas pela concha.
Além disso, este trabalho agrega informações relevantes relacionadas
ao grupo dos Decapoda, que em conjunto com os resultados obtidos pelo
nosso grupo (Leone et al., 2005), fornece dados essenciais sobre o papel da
(Na
+
,K
+
)-ATPase nos processos metabólicos e de osmorregulação nos
crustáceos.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
96
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
97
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ABRIEL, H. et al. Role of the intracellular domain of the β subunit in NaK pump function.
Biochim. Biophys. Acta. 1999,1418: 85-96.
APELL, H.J.; SCHNEEBERGER, A. & SOKOLOV, V.S. Partial reactions of the Na,K-
ATPase: kinetic analysis and transport properties. Acta Physiol. Scand. 1998, 163:
235-245.
ARGUELLO, J.M. et al. Functional role of oxygen-containing residues in the fifth
transmembrane segment of the Na,K-ATPase alpha subunit. Arch. Biochem. Biophys.
1999a, 364: 254-263.
ARYSTARKHOVA, E. et al. The gamma subunit modulates Na+ and K+ affinity of the
renal (Na
+
,K
+
)-ATPase. J. Biol. Chem. 1999, 274: 33183-33185.
ASAMI, M. et al. Quantification of the Na
+
/K
+
-pump in solubilized tissue by the ouabain
binding method coupled with high-performance gel chromatography. Biochim.
Biophys. Acta 1995, 1240: 55-64.
ASKARI, A.; KAKAR, S.S. & HUANG, W. Ligand binding sites of the ouabain-
complexed (Na
+
,K
+
)-ATPase. J. Biol. Chem. 1988, 263: 235-242.
ASKEW, G.R. & LINGREL, J.B. Identification of an amino acid substitution in human
alpha 1 (Na
+
,K
+
)-ATPase which confers differentially reduced affinity for two related
cardiac glycosides. J. Biol. Chem. 1994, 269: 24120-24126.
BACH, C.; HAZLETT, B. and RITTSCHOF, D. Effects of interspecific competition on
fitness of the hermit crab Clibanarius tricolor. Ecology 1976, 57: 579-586.
BAR SHIMON, M.; GOLDSHLEGER, R. & KARLISH, S.J.D. Specific Cu
2+
-catalyzed
oxidative cleavage of (Na
+
,K
+
)-ATPase at the extracellular surface. J. Biol. Chem.
1998, 273: 34190-34195.
BARRA, J.A. & PÉQUEUX, A.J.R. Ultrastructural and biochemical localization of
(Na
+
,K
+
)-ATPase in salt-transporting gills of the Chinese crab. In: Comparative
physiology of environmental adaptations. Abstracts of the 8
th
Conference ESCPB,
1986, p.21, ESCPB Publ. Strasbourg, France.
BAXTER-LOWE, L. A. et al. Molecular cloning of the (Na
+
,K
+
) – ATPase α-subunit in
developing brine-shrimp and sequence comparison with higher organisms. FEBS Lett
1989, 257:181-187.
BEAUGÉ, L. & BERBERIAN, G. The effects of several ligands on the potassium-
vanadate interaction in the inhibition of the (Na
+
,K
+
)-ATPase and the Na+ K+ pump.
Biochim. Biophys. Acta 1983, 727: 336-50.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
98
BEAUGÉ, L.A.; GADSBY, D.C. & GARRAHAN, P.J. (Na
+
,K
+
)-ATPase and related
transport ATPases. Structure, mechanism, and regulation. Ann. N. Y. Acad. Sci. USA,
1997, 834: XV-XVIII.
BEGGAH, A. T.; JAUNIN, P. & GEERING, K. Role of glycosylation and disulfide bond
formation in the beta subunit in the folding and functional expression of (Na
+
,K
+
)-
ATPase. J. Biol. Chem. 1997, 272:10318-26.
BÉGUIN, P. et al. The γ subunit is a specific component of the (Na
+
,K
+
)-ATPase and
modulates its transport function. EMBO J. 1997, 16: 4250-4260.
BÉGUIN, P. et al. Membrane integration of (Na
+
,K
+
)-ATPase α-subunits and β-subunit
assembly. J. Biol. Chem. 1998a, 273: 24921-24931.
BÉGUIN, P. et al. Endoplasmic reticulum quality control of oligomeric membrane
proteins: topogenic determinants involved in the degradation of the unassembled
(Na
+
,K
+
)-ATPase alpha subunit and in its stabilization by beta subunit assembly. Mol
Biol Cell. 2000 May; 11(5):1657-72.
BÉGUIN, P, et al. FXYD7 is a brain-specific regulator of Na,K-ATPase alpha1-beta-
isoenzymes. EMBO J. 2002, 21: 3264-3273.
BERBERIAN, G. & BEAUGÉ, L. Phosphatase-activity and potassium-transport in
liposomes with (Na
+
,K
+
)-ATPase incorporated. Biochim. Biophys. Acta 1992, 1103:
85-93.
BLANCO, G. & MERCER, R.W. Isozymes of the (Na
+
,K
+
)-ATPase: heterogeneity in
structure, diversity in function. Am. J. Physiol. - Renal Physiol. 1998, 44: F633-F650.
BLANCO, G.; SANCHEZ, G. & MERCER, R.W. Differential regulation of (Na
+
,K
+
)-
ATPase isozymes by protein kinases and arachidonic acid. Arch. Biochem. Biophys.
1998, 359: 139-150.
BLANCO, G. et al. The alpha 4 isoform of the (Na
+
,K
+
)-ATPase is expressed in the germ
cells of the testes. J Histochem. Cytochem. 2000, 48: 1023-1032.
BONNAFOUS, J.C.; DORNAND, J. & MANI, J.C. Alamethicin or detergent
permeabilization of the cell membrane as a tool for adenylate cyclase determination.
Biochim. Biophys. Acta 1982, 720: 235-241.
BONVALET, J.P. Regulation of sodium transport by steroid hormones Kidney Int. Suppl.
1998, 65: S49-S56.
BORGATTI, A.R. et al. Ouabain-insensitive Na
+
stimulation of a microsomal Mg
+
-
ATPase in gills of sea bass (Dicentrarchus labrax L.) Comp. Biochem. Physiol. 1985,
81A: 127-135.
BÖTTCHER, K. & SIEBERS, S. Biochemistry, localization, and physiology of carbonic
anhydrase in the gills of euryhaline crabs. J. Exp. Zool. 1993, 265: 398-409.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
99
BOXENBAUM, N. et al. Changes in the steady-state conformational equilibrium resulting
from cytoplasmic mutations of the (Na
+
,K
+
)-ATPase α-subunit. J. Biol. Chem. 1998,
273: 23086-23092.
CAMERON, J.N. & BATTERTON C.V. Antennal gland function in the freshwater crab
Callinestes sapidus: water, electrolyte acid-base and ammonia excretion. J. Comp.
Physiol. B 1978, 123:143-148.
CASTILLE, F.L. & LAWRENCE A.L. The effect of salinity on the osmotic, sodium and
chloride concentrations in the hemolymph of euryhaline shrimp of the genus Penaeus.
Comp. Biochem. Physiol. 1981, 68A: 75-80.
COELHO, P.A. & RAMOS, R.A. A constituição e a distribuição da fauna de decápodos do
liteoral leste da América do Sul entre as latitudes 5
ο
N e 39
ο
S. Trabls. Oceanogr.
Univ. Fed.PE. 1972, 13: 133-326.
COPPI, M.V.; COMPTON, L.A. & GUIDOTTI, G. Isoform-specific effects of charged
residues at borders of the M1-M2 loop of the (Na
+
,K
+
)-ATPase alpha subunit.
Biochemistry. Feb 1999, 23;38(8):2494-505.
CORTAS, N. & EDELMAN, I.S. Isolation of two isoforms of (Na
+
,K
+
)-ATPase from
Artemia salina: kinetic characterization. Prog. Clin. Biol. Res. 1988, 268A: 287-292.
CORTAS, N. et al. Isoforms of (Na
+
,K
+
)-ATPase in Artemia salina: II. Tissue distribution
and kinetic characterization. J. Membr. Biol. 1989, 108: 187-195.
CRAMBERT, G. et al. Transport and pharmacological properties of nine different human
(Na
+
,K
+
)-ATPase isozymes. J. Biol. Chem. 2000, 275: 1976-1986.
CROYLE, M.L.; WOO, A.L. & LINGREL, J.B. Extensive random mutagenesis analysis of
the (Na
+
,K
+
)-ATPase α-subunit identifies known and previously unidentified amino
acid residues that alter ouabain sensitivity. Implications for ouabain binding. Eur. J.
Biochem. 1997, 248: 488-495.
D’ORAZIO, S.E. & HOLLIDAY, C.W. Gill (Na
+
,K
+
)-ATPase and osmoregulation in the
sand fiddler crab, Uca pugilator. Physiol. Zool. 1985, 58: 364-373.
DAFNIS, E. & SABATINI, S. Biochemistry and pathophysiology of vanadium. Nephron
1994, 67: 133-143.
DAVIS, R.L. & ROBINSON, J.D. Substrate sites of the (Na
+
,K
+
)-ATPase: pertinence of
the adenine and fluorescein binding sites. Biochim. Biophys. Acta 1988, 953: 26-36.
DIXON, M. The determination of enzyme inhibitor constants. Biochem. J. 1953, 55: 170-
171.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
100
DONNET, C.; ARYSTARKHOVA, E. & SWEADNER, K.J. Thermal denaturation of the
(Na
+
,K
+
)-ATPase provides evidence for alpha-alpha oligomeric interation and γ subunit
association with the C-terminal domain. J. Biol. Chem. 2001, 276: 7357-7365.
DORIS, P.A. Regulation of (Na
+
,K
+
)-ATPase by endogenous ouabain-like materials. Proc.
Soc. Exp. Biol. Med. 1994, 205:202-212.
DORIS, P.A. & BAGROV, A.Y. Endogenous sodium pump inhibitors and blood pressure
regulation: an update on recent progress. Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 1998, 218: 156-
165.
DURAN, M.J. et al. The isoform-specific region of the (Na
+
,K
+
)-ATPase catalytic subunit:
role in enzyme kinetics and regulation by protein kinase C. Biochemistry. Dec 2004,
28;43(51):16174-83.
EMERY, A.M. et al. Insect (Na
+
,K
+
)-ATPase. J. Insect Physiol. 1998, 44:197-209.
ERDMANN, E. & SCHONER, W. Ouabain-receptor interactions in (Na
+
,K
+
)-ATPase
preparations. II Effects of cations and nucleotides on rate constants and dissociation
constants. Biochim. Biophys. Acta 1973, 330: 302-315.
ESCALANTE, R.; GARCIA-SAEZ, A. & SASTRE, L. In situ hybridization analyses of
(Na
+
,K
+
)-ATPase alpha-subunit expression during early larval development of Artemia
franciscana. J. Histochem. Cytochem. 1995, 43: 391-399.
ESMANN, M. ATPase and phosphatase activity of (Na
+
,K
+
)-ATPase: Molar and specific
activity, protein determination. Methods Enzymol. 1988, 156: 105-115.
EWART, H.S. & KLIP, A. Hormonal regulation of the (Na
+
,K
+
)-ATPase: mechanisms
underlying rapid and sustained changes in pump activity. Am. J. Physiol. 1995, 269:
C295-311.
FEDOSOVA, N.U.; CORNELIUS, F. & KLODOS, I. E
2
P phosphoforms of (Na
+
,K
+
)-
ATPase. I. Comparison of phosphointermediates formed from ATP and Pi by their
reactivity toward hydroxylamine and vanadate. Biochem. 1998, 37:13634-13642.
FENG, J. & LINGREL, J.B. Analysis of amino acid residues in the H5-H6 transmembrane
and extracelular domains of (Na
+
,K
+
)-ATPase alpha subunit identifies threonine 797 as
a determinant of ouabain sensitivity. Biochem. 1994, 33: 4218-4224.
FERRANDI, M. & MANUNTA, P. Ouabain-like factor: is this the natriuretic hormone?
Curr. Opin. Nephrol. Hypertens. 2000, 9: 165-171.
FOREST, J. & SAINT LAURENT, M.; Campagne de la “Calypso” au large des cotes
atlantiques de l’Amérique du Sud (1961-1962). 6. Crustacés Décapodes: Pagurides.
Ann. Inst. Océanogrph. 1968, 45: 47-169.
FOTHERINGHAM, N. Structure of seasonal migrations of the littoral hermit crab
Clibanarius vittatus (Bosc). J. Exp. Mar. Biol. Ecol. 1975, V.18, p 47-53.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
101
FOTHERINGHAM, N. Effects of shell stress on the growth of hermit crabs. J. exp. Mar.
Biol. Ecol. 1976, 23: 655-671.
FRANSOZO, M.L.N.; FRANSOZO, A. & HEBLING, N.J. Estrutura populacional e
determinação do tamanho da concha em 4 espécies de ermitões (CRUSTACEA,
DECAPODA, ANOMURA) do litoral paulista. Biotemas, 1991, 4: 135-148.
FURRIEL, R.P.M.; MCNAMARA, J.C. & LEONE, F.A. Characterization of (Na
+
,K
+
)-
ATPase in gill microsomes of the freshwater shrimp Macrobrachium olfersii. Comp.
Biochem. Physiol. 2000, 126B: 303-315.
FURRIEL, R.P.M.; MCNAMARA, J.C & LEONE, F.A. Nitrophenylphosphate as a tool to
characterize gill (Na
+
,K
+
)-ATPase activity in hyperegulating crustacea. Comp.
Biochem. Physiol. 2001, 130A: 665-676.
FURRIEL, R. P. M. et al. Modulation of gill (Na
+
,K
+
)-ATPase activity by ammonium ions:
putative coupling of nitrogen excretion and ion uptake in the freshwater shrimp
Macrobrachium olfersii. Journal of experimental Zoology 2004, 301A:63-74.
GACHE, C.; ROSSI, B. & LAZDUNSKI, M. (Na
+
,K
+
)-Activated adenosinetriphosphatase
of axonal membranes, cooperativity and control. Eur. J. Biochem. 1976, 65: 293-306.
GACHE, C.; ROSSI, B. & LAZDUNSKI, M. Mechanistic analysis of the (Na
+
,K
+
)-
ATPase using new pseudosubstrates. Biochem. 1977, 16: 2957-2965.
GACHE, C. et al. Pseudo-substrates to analyze the reaction mechanism of the Na,K-
ATPase. In: JC Skou (Ed) & JG Norby (Ed) Na,K-ATPase, Structure and Kinetics.
Academic Press. 1979, NY 301-314.
GARCIA SAEZ, A.; PERONA, R. & SASTRE, L. Polymorphism and structure of the
gene coding for the alpha subunit of the Artemia franciscana. Biochem. J. 1997,
321:509-518.
GARRAHAN, P. J. & REGA, A. F. Potassium ativated phosphatase from human red blood
cells. The effects of p-nitrophenylphosphate on cation fluxes. J. Physiol. 1972,
233:595-617.
GATTO, C.; LUTSENKO, S. & KAPLAN, J.H. Chemical modification with dihydro-4,4’-
didsothiocyanostilbene-2,2’-disulfonate reveals the distance between K 480 and K 501
in the ATP-binding domain of the (Na
+
,K
+
)-ATPase. Arch. Biochem. Biophys. 1997,
340: 90-100.
GATTO, C. et al. Cys(577) is a conformationally mobile residue in the ATP-binding
domain of the (Na
+
,K
+
)-ATPase alpha-subunit. J. Biol. Chem. 1999, 274: 24995-
25003.
GATTO, C.; MCLOUD, S. M. & KAPLAN, J. H. Am. J. Physiol. Cell. Physiol. 2001,
281C: 982-92.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
102
GEERING, K. Topogenic motifs in P-type ATPases. J. Membr. Biol. 2000, 174: 181-190.
GEERING, K. The functional role of beta subunits in oligomeric P-type ATPases. J.
Bioenerg. Biomemb. 2001, 33: 425–438.
GEERING, K et al. FXYD proteins: new tissue- and isoform-specific regulators of Na,K-
ATPase. Ann. N.Y. Acad. Sc. USA, 2003, 986: 388-394.
GLYNN, I.M. The (Na
+
,K
+
)-transporting adenosine triphosphatase. In: A.N. Martonosi
(Ed), The enzymes of biological membranes. 1985, Vol 3, pp 35-114, Plenum Press,
New York.
GLYNN, I.M. & KARLISH, S.J.D. Occluded cations in active transport. Annu. Rev.
Biochem. 1990, 59: 171-205.
GOLDSHLEGGER, R. et al. The effect of membrane potential on the mammalian sodium-
potassium pump reconstituted into phospholipid vesicles. J. Physiol. 1987, 387: 331-
355.
GOLDSHLEGER, R. & KARLISH, S.J.D. The energy transduction mechanism of
(Na
+
,K
+
)-ATPase studied with iron-catalyzed oxidative cleavage. J. Biol. Chem. 1999,
274: 16213-16221.
GORDON, J.A. Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor.
Methods Enzymol. 1991, 201: 477-482.
GREENAWAY, P.; Terrestrial adaptations in the Anomura (Crustacea: Decapoda).
Memoirs of Museum Victoria 2003, 60, 13-26.
GRISHAM, C.M. & MILDVAN, A.S. Magnetic resonance and kinetic studies of the
mechanism of sodium and potassium ion activated adenosine triphosphatase. J. Biol.
Chem. 1974, 249: 3187-3197.
HANSEN, O. Interaction of cardiac glycosides with (Na
+
,K
+
)-activated ATPase. A
biochemical link to digitalis-induced inotropy. Pharmacol. Rev. 1984, 36:143-163.
HASLER, U. et al. Role of the beta-subunit domains in the assembly, stable expression,
intracellular routing, and functional properties of (Na
+
,K
+
)-ATPase. J. Biol. Chem.
1998, 273: 30826-30835.
HASLER, U. et al. Structural and functional features of the transmembrane domain of the
(Na
+
,K
+
)-ATPase beta subunit revealed by tryptophan scanning. J. Biol. Chem. 2001,
276: 16356-16364.
HAZLETT, B.A. & BARON, L.C. Influence of shells on mating behavior in the hermit
crab Calcinus tibicen Behav. Ecol. Sociobiol. 1989, 24: 369-376.
HE, S.W. et al. The alpha(1)- and alpha(2)-isoforms of (Na
+
,K
+
)-ATPase play different
roles in skeletal muscle contractility. Am. J. Physiol. 2001, 281: R917-R925.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
103
HENRY, R.P. & WHEATLY, M.G. Interaction of respiration, ion regulation, and acid-
base balance in the everyday life of aquatic crustaceans. Amer. Zool. 1992, 32: 407-
416.
HERRERA V.L. et al. Three differentially expressed (Na
+
,K
+
)-ATPase alpha subunit
isoforms: structural and functional implications. J. Cell. Biol. 1987, Oct; 105:1855-65.
HOFFMAN, J.F. The red cell membrane and the transport of sodium and potassium. Am.
J. Med. 1966, 41: 666-680.
HOLLIDAY, C.W. Salinity-induced changes in gill (Na
+
,K
+
)-ATPase activity in the mud
fiddler crab, Uca pugnax. J. Exp. Zool. 1985, 233: 199-208.
HORISBERGER, J.D. Recent insights into the structure and mechanism of the sodium
pump. Physiology 2004, 19:377-387.
HU, Y.K. & KAPLAN, J.H. Site-directed chemical labeling of extracellular loops in a
membrane protein - The topology of the (Na
+
,K
+
)-ATPase alpha-subunit. J. Biol.
Chem. 2000, 275: 19185-19191.
HUANG, B. et al. Human corneal endothelial cell expression of Na+,K+-adenosine
triphosphatase isoforms. Arch. Ophthalmol. 2003 Jun;121:840-845.
JACOBSEN, M.D.; PEDERSEN, P.A. & JORGENSEN, P.L. Importance of (Na
+
,K
+
)-
ATPase Residue R1-Arg544 in the Segment Arg544-Asp567 for High-Affinity
Binding of ATP, ADP, or MgATP. Biochem. 2002, 41: 1451-1456.
JORGENSEN, P.L. et al. Transport-linked conformational changes in (Na
+
,K
+
)-ATPase.
Structure-function relationships of ligand binding and E1-E2 conformational
transitions. Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 1997, 834: 161-174.
JORGENSEN, P.L. & PEDERSEN, P.A. Structure-function relationships of Na(+), K(+),
ATP, or Mg(2+) binding and energy transduction in (Na
+
,K
+
)-ATPase. Biochim.
Biophys. Acta. 2001 May 1;1505(1):57-74.
JORGENSEN, P.L. et al. Structure-function relationships of E1-E2 transitions and cation
binding in Na,K-pump protein. Biochim. Biophys. Acta 1998a, 1365: 65-70.
JORGENSEN, P.L. et al. Structure-function relationships based on ATP binding and
cation occlusion at equilibrium in (Na
+
,K
+
)-ATPase. Acta Physiol. Scand. 163, Suppl
1998b, 643: 79-87.
JORGENSEN, P.L; HAKANSSON, K.O. & KARLISH, S.J.D. Structure and mechanism
of (Na
+
,K
+
)-ATPase: functional sites and their interactions. Annu. Rev. Physiol. 2003,
65: 817–849.
KAPLAN, J.H., HU, Y.K. & GATTO, C. Conformational coupling: The moving parts of
an ion pump. J. Bioenerg. Biomembr. 2001, 33: 379-385.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
104
KAPLAN, J.H. Biochemistry of (Na
+
,K
+
)-ATPase. Annu. Rev. Biochem. 2002, 71:511-
535.
KARLISH, S.J.D. Organization of the membrane domain of the Na,K-pump. Ann. N.Y.
Acad. Sci. (USA) 1997, 834: 30-44.
KASTURI, R. et al. Identification of a model cardiac glycoside receptor: comparisons with
(Na
+
,K
+
)-ATPase. Biochem. 1998, 37: 6658-6666.
KAWAMURA, M. & NAGANO, K. Evidence for essential disulfide bonds in the beta-
subunit of (Na
+
,K
+
)-ATPase. Biochim. Biophys. Acta 1984, 774:188-92.
KELLOG, C.W. Gastropod shells: a potentially limiting resource for hermit crabs. J. Exp.
Mar. Biol. Ecol. 1976, 22: 101-111.
KIRLEY, T.L. Determination of three disulfide bonds and one free sulphydryl in the β
subunit of (Na
+
,K
+
)-ATPase. J. Biol. Chem. 1989, 264: 7185-7192.
KIRLEY, T. L. Inactivation of (Na
+
,K
+
)-ATPase by beta-mercaptoethanol. Differential
sensitivity to reduction of the three beta subunit disulfide bonds. J. Biol. Chem. 1990, 265:
4227-32.
KOENDERINK, J.B. et al. High-affinity ouabain binding by a chimeric gastric H
+
,K
+
-
ATPase containing transmembrane hairpins M3-M4 and M5-M6 of the alpha(1)-
subunit of rat (Na
+
,K
+
)-ATPase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 2000, 97: 11209-11214.
KORMANIK, G.A. & CAMERON, J.N. Ammonia excretion in the seawater bluecrab
(Callinectes sapidus) occurs by diffusion and not Na
+
/NH
4
+
exchange. J. Comp. Physiol.
1981, 141B: 457-462.
KOROLEFF, F. Determination of ammonia, Methods of seawater analysis, K. Grasshoff, M.
Ehrhart, K. Kremling (eds.), Verlag Chemie, Weinheim, 1983, pp 150-151.
KOSTER J.C. et al. Substitutions of glutamate 781 in the (Na
+
,K
+
)-ATPase alpha subunit
demonstrate reduced cation selectivity and an increased affinity for ATP. J. Biol.
Chem. 1996, 271:2413-21.
KNEPPER, M.A.; PACKER, R.; GOOD, D.W. Ammonium transport in the Kidney.
Physiol. Ver. 1989, 69: 179-249.
KRAMER, H.J. et al. Ouabain-like factors in human urine: identification of a (Na
+
,K
+
)-
ATPase inhibitor as vanadium-diascorbate aduct. Clin. Exp. Hyperten. 1998, 20: 557-
571.
KRUMSCHEID, R. et al. The phosphatase activity of the isolated H4-H5 loop of (Na
+
,K
+
)-
ATPase resides outside its ATP binding site. Eur. J. Biochem. Oct; 2004, 271: 3923-
36.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
105
KURTZ, I. & BALABAN, R.S. Ammonium as a substrate for (Na
+
,K
+
)-ATPase in rabbit
proximal tubules. Am. J. Physiol. 1986, 250: F497-F502.
LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4. Nature 1970, 227: 680-685.
LEONE, F.A. et al. SigrafW: an easy-to-use program for fitting enzyme kinetic data.
Biochem. Mol. Biol. Ed. 2005a, 33: 399-403.
LEONE, F.A. et al. (Na+,K+)-ATPase from crustacean gill microsomes: a molecular
marker to evaluate adaptation to biotopes of different salinity.Trends Comp.
Biochem. Physiol. 2005b, 11: 1-15.
LEVENSON, R. Isoforms of the (Na
+
,K
+
)-ATPase: family members in search of function.
Rev. Physiol. Biochem. Pharmacol. 1994, 123: 1-45.
LIGNOT, J.H.; SPANINGS-PIERROT, C. & CHARMANTIER, G. Osmoregulatory
capacity as a tool in monitoring the physiological condition and the effect of stress in
crustaceans. Aquaculture 2000, 191: 209-245.
LIN H.C.; SU Y.C. & SU S.H. A comparative study of osmoregulation in four fiddler
crabs (Ocypodidae: Uca). Zoolog Sci. Jun; 2002, 19(6):643-50.
LINGREL, J.B. & KUNTZWEILER, T. (Na
+
,K
+
)-ATPase. J. Biol. Chem. 1994, 269:
19659-19662.
LINGREL, J.B. et al. Cation and cardiac glycoside binding sites of the (Na
+
,K
+
)-ATPase.
Ann. N.Y. Acad. Sci. USA 1997, 834: 194-206.
LINGREL, J.B. et al. Ligand Binding sites of (Na
+
,K
+
)-ATPase. Acta Physiol. Scand.
1998, 163: 69-77.
LOVETT, D.L. et al. Hemolymph levels of methyl farnesoate increase in response to
osmotic stress in the green crab Carcinus maenas. Comp. Biochem. Physiol. 2001,
128A: 299-306.
LOWERY, W.A. & NELSON, W.G. Population ecology of the hermit crab Clibanarius
vittatus (Decapoda: Diogenidae) at Sebastian Inlet, Florida. J. Crust. Biol. 1988, 8:
548-556.
LUCU, C. Ionic regulatory mechanisms in crustacean gill epithelia. Comp. Biochem.
Physiol. 1990, 97A: 297-306.
LUCU, C. Ion transport in the gill epithelium of aquatic crustacea. J. Exp. Zool. 1993,
265: 378-386.
LUCU, C.; DEVESCOVI, M. & SIEBERS, D. Do amiloride and ouabain affect ammonia
fluxes in perfused Carcinus gill epithelia? J. Exp. Zool. 1989, 249: 1-5.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
106
LUCU, C. & TOWLE, D.W. (Na
+
,K
+
)-ATPase in gills of aquatic crustacean. Comp.
Biochem. Physiol. 2003, 135A: 195-214.
LUTSENKO, S.; ANDERKO, R. & KAPLAN, J.H. Membrane disposition of the M5-M6
hairpin of (Na
+
,K
+
)-ATPase alpha subunit is ligand dependent. Proc. Natl. Acad. Sci.
USA 1995, 92: 7936-40.
MACLENNAN, D. H. & GREEN, N. M. Structural biology. Pumping ions. Nature 2000,
405: 633-634.
MALLERY, C.H. A carrier enzyme basis for ammonium excretion in teleost gill. NH
+
4-
stimulated Na-dependent ATPase activity in Opsanus beta. Comp. Biochem. Physiol.
1983, 74A: 889-897.
MALIK, N. et al. Identification of the mammalian (Na
+
,K
+
)-ATPase β
3
subunit. J. Biol.
Chem. 1996, 271: 22754-22758.
MANTEL, L.H. & FARMER, L.L. (1983) Osmotic and ionic regulation. In: LH Mantel
(Ed.) and DE Bliss (Ed.) The biology of crustacea Vol. 5 Internal anatomy and
physiological regulation 1983, pp. 53-161 Academic Press New York New York.
MANTELATTO, F.L.M. & SOUSA, L.M., Population biology of the hermit crab
Paguristes tortugae Schmitt, 1933 (Anomura, Diogenidae) from Anchieta Island,
Ubatuba, Brazil. Nauplius 2000, 8: 185-193.
MARINI, A.M. et al. The human Rhesus-associated RhAG protein and a kidney
homologue promote ammonium transport in yeast. Nat. Genet. 2000, 26: 341-344.
MARTIN, D.W. & SACHS, J.R. Ligands presumed to label high affinity and low affinity
ATP binding sites do not interact in an (alpha beta)(2) diprotomer in duck nasal gland
(Na
+
,K
+
)-ATPase, nor do the sites coexist in native enzyme. J. Biol. Chem. 2000, 275:
24512-24517.
MARTIN, D.W. et al. Alpha beta protomers of (Na
+
,K
+
)-ATPase from microsomes of
duck salt gland are mostly monomeric: Formation of higher oligomers does not modify
molecular activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2000, 97: 3195-3200.
MARTIN-VASALLO, P. et al. Identification of a putative isoform of the (Na
+
,K
+
)-ATPase
beta subunit. Primary structure and tissue-specific expression. J. Biol. Chem. 1989,
264:4613-8.
MASUI, D.C. et al. Modulation by ammonium ions of gill microsomal (Na
+
,K
+
)-ATPase
in the swimming crab Callinectes danae: a possible mechanism for the regulation of
ammonia excretion. Comp. Biochem. Physiol. 2002, 132C: 471-482.
MASUI, D. C. et al. Gill (Na
+
,K
+
)-ATPase from the blue crab Callinectes danae:
modulation of K
+
-phosphatase activity by potassium and ammonium ions. Comp.
Biochem. Physiol. B. 2003, 134:631-640.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
107
MASUI, D. C. et al. K
+
- phosphatase activity of gill (Na
+
,K
+
)-ATPase from the blue crab
Callinectes danae: low-salinity acclimation and expression of the a-subunit. J. Exp.
Zool. 2005a, 303A: 294-307.
MASUI, D. C. et al. Gill microsomal (Na
+
,K
+
)-ATPase from the blue crab Callinectes
danae: Interactions at cationic sites. Int. J. Biochem. Cell. Biol. 2005b, 37: 2521-2535.
MCDONOUGH, A.A. & FARLEY, R.A. Regulation of (Na
+
,K
+
)-ATPase activity. Curr.
Opin. Nephrol. Hyper. 1993, 2: 725-734.
MACGREGOR, S.E. & WALKER, J.M. Inhibitors of the Na
+
,K
+
-ATPase. Comp.
Biochem. Physiol. 1993, 105C: 1-9.
MCLAUGHLIN, P.A. and LEMAITRE, R. The hermit crabs. Contributions to Zoology,
1997, 67(2): 79-123.
MELO, G.A.S. Manual de Identificação dos Crustacea Decapoda do Litoral Brasileiro,
1999, 56-57.
MENSE, M. et al. Residues of the fourth transmembrane segments of the (Na
+
,K
+
)-ATPase
and the gastric H,H-ATPase contribute to cation selectivity. J. Biol. Chem. 2000, 275:
1749-1756.
MERCER, R.W. et al. (1993) Molecular cloning and immunological characterization of
the gamma polypeptide, a small protein associated with the (Na
+
,K
+
)-ATPase. J. Cell.
Biol. 1993, 121: 579-586.
MIDDLETON, J.P. Direct regulation of the Na,K pump by signal transduction
mechanisms. Miner. Electrolyte Metab. 1996, 22: 293-302.
MIDDLETON, D.A. et al. Structural insights into the binding of cardiac glycosides to the
digitalis receptor revealed by solid-state NMR. PNAS 2000, 97: (25) 13602-13607.
MILLER, R.P. & FARLEY, R.A. β-subunit of (Na
+
,K
+
)-ATPase contains three disulfide
bonds. Biochem. 1990, 29: 1524-1532.
MINOR, N.T. et al. The gamma subunit of the (Na
+
,K
+
)-ATPase induces cation channel
activity. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998, 95: 6521-6525.
MO, J.L. & GREENAWAY, P. cAMP and sodium transport in the freshwater crayfish,
Cherax destructor. Comp. Biochem. Physiol. 2001, 129A: 843-849.
MOBASHERI, A. (Na
+
,K
+
)-ATPase isozyme diversity; Comparative biochemistry and
physiological implications of novel functional interactions. Biosci. Reports 2000, 20:
51-91.
MOLLER, J.V.; JUUL, B. & LE MAIRE, M. Structural organization, ion transport, and
energy transduction of P-type ATPases. Biochim. Biophys. Acta 1996, 1286: 1-51.
NARCHI, W. Estudos Práticos – Crustáceos I. 1973, 105-116.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
108
NECHAY, B.R. Mechanisms of action of vanadium. Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol.
1984, 24: 501-524.
NEUFELD, G.J.; HOLLIDAY, C.W. & PRITCHARD, J.B. Salinity adaptation of gill
(Na
+
,K
+
)-ATPase in the blue crab, Callinectes sapidus. J. Exp. Zool. 1980, 211: 215-
224.
NIELSEN, J.M. Importance of intramembrane carboxylic acids for occlusion of K
+
ions at
equilibrium in renal (Na
+
,K
+
)-ATPase. Biochem. 1998, 37: 1961-1968.
ONKEN, H. & PUTZENLECHNER, M. A V-ATPase drives active, electrogenic and Na
+
-
independent Cl
-
absorption across the gills of Eriocheir sinensis. J. Exp. Biol. 1995,
198: 767-774.
ONKEN, H. & RIESTENPATT, S. NaCl absorption across split gill lamellae of
hyperegulating crabs: Transport mechanisms and their regulation. Comp. Biochem.
Physiol. 1998, 119A: 883-893.
OR, E. et al. Specific cross-links between fragments of proteolyzed (Na
+
,K
+
)-ATPase
induced by o-phthalaldehyde. Biochem. 1998, 37: 8197-8207.
PALASIS, M. et al. Ouabain interactions with the H5-H6 hairpin of the (Na
+
,K
+
)-ATPase
reveal a possible inhibition mechanism via the cation binding domain. J. Biol. Chem.
1996, 271: 14176-14182.
PEDEMONTE, C.H. Regulation of (Na
+
,K
+
)-ATPase transport activity by protein kinase
C. J. Memb. Biol. 1997, 155: 219-227.
PEDERSEN, P.A.; JORGENSEN, J.R. & JORGENSEN, P.L. Importance of conserved
alpha-subunit segment (709) GDGVND for Mg2+ binding, phosphorylation, and
energy transduction in (Na
+
,K
+
)-ATPase. J. Biol. Chem. 2000, 275: 37588-37595.
PEDERSEN, P.L. Transport ATPases: structure, motors, mechanism and medicine: a brief
overview. J. Bioenerg. Biomembr. 2005 37:349-357.
PÉQUEUX, A. & GILLES, R. Na
+
fluxes across isolated perfused gills of the Chinese crab
Eriocheir sinensis. J. Exp. Biol. 1981, 92: 173-186.
PÉQUEUX, A. Osmotic regulation in crustaceans. J. Crust. Biol. 1995, 15: 1-60.
POST, R.L. Active transport and pumps. Current Topics in Membranes 1999, 48: 397-
417.
POST, R.L. & JOLLY P.C. The linkage of sodium, potassium, and ammonium active
transport across the human erythrocyte membrane. Biochim. Biophys. Acta. 1957,
25:118-28.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
109
PRESSLEY, T.A. Structure and function of the Na,K pump: ten years of molecular
biology. Miner. Electrolyte Metab. 1996, 22: 264-271.
PRESSLEY, T.A.; DURAN, M.J. & PIERRE, S.V. Regions conferring isoform-specific
function in the catalytic subunit of the Na,K-pump. Front. Biosci. 2005, Sep
1;10:2018-26.
PROVENZANO, A.J.Jr. Notes on Bermuda hermit crabs (Crustacea: Anomura). Bull.
Mar. Sci. 1960, 10: 117-124.
READ, S.M. & NORTHCOTE, D.H. Minimization of variation in the response to different
proteins of the Coomassie blue G dye-binding assay for protein. Analyt. Biochem.
1981, 116: 53-64.
REBELO, M.F.; SANTOS, E.A. & MONSERRAT, J.M. Ammonia exposure of
Chasmagnathus granulata (Crustacea, Decapoda) Dana, 1851: accumulation in
haemolymph and effects on osmoregulation. Comp. Biochem. Phys. 1999, 122 A:
429-435.
REGNAULT, M. Nitrogen excretion in marine and fresh-water crustacea. Biol. Rev. 1987,
62: 1-24.
REESE, E.S. Behavioral adaptations of intertidal hermit crabs. Am. Zool. 1969, 9: 343-355.
RICE, W.J. et al. Structure of (Na
+
,K
+
)-ATPase at 11-angstrom resolution: Comparison
with Ca
2+
-ATPase in E-1 and E-2 states. Biophys. J. 2001, 80: 2187-2197.
RIESTENPATT, S., ONKEN, H., SIEBERS, D. Active absorption of Na+ and Cl- across
the gill epithelium of the shore crab Carcinus maenas: Voltage-clamp and ion-flux
studies. J. Exp. Biol. 1996, 199: 1545-1554.
ROBINSON, J.D. Interactions between monovalent cations and the (Na
+
+ K
+
)- dependent
adenosine triphosphatase. Arch. Biochem. Biophys. 1970, 139: 17-27.
ROBINSON, J.D. Substituting manganese for magnesium alters certain reaction properties
of the (Na
+
,K
+
)-ATPase. Biochim. Biophys. Acta 1981, 642: 405-417.
ROBINSON, J.D. & PRATAP, P.R. (Na
+
,K
+
)-ATPase: modes of inhibition by Mg
2+
.
Biochim. Biophys. Acta 1991, 1061: 267-278.
ROSSI, B.; GACHE, C. & LAZDUNSKI, M. Specificity and interactions at the cationic
sites of the axonal (Na
+
,K
+
)-activated adenosinetriphosphatase. Eur. J. Biochem.
1978, 85: 561-570.
SABOURIN, T.D. & STICKLE, W.B. Respiratory and osmoregulatory responses of the
hermit crab, Clibanarius vittatus (Bosc), to salinity changes. J. Exp. Mar. Biol. Ecol.
1980, 46: 241.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
110
SCHMALZING, G.; RUHL, K. & GLOOR, S.M. Isoform-specific interactions of
(Na
+
,K
+
)-ATPase subunits are mediated via extracellular domains and carbohydrates.
Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1997, 94: 1136-1141.
SCHNEEBERGER, A. & APELL, H.J. Ion selectivity of the cytoplasmic binding sites of
the (Na
+
,K
+
)-ATPase: I. Sodium binding is associated with a conformational
rearrangement. J. Membr. Biol. 1999, 168: 221-228.
SCHEINER-BOBIS, G. & FARLEY, R.A. Subunit requirements for expression of
functional sodium pumps in yeast cells. Biochim. Biophys. Acta 1994, 1193: 226-
234.
SCHEINER-BOBIS, G. & SCHREIBER, S. Glutamic acid 472 and lysine 480 of the
sodium pump alpha 1 subunit are essential for activity. Their conservation in
pyrophosphatases suggests their involvement in recognition of ATP phosphates.
Biochem. 1999, 38: 9198-9208.
SCHONER, W. Ouabain, a new steroid hormone of adrenal gland and hypothalamus. Exp.
Clin. Endocrinol. Diabetes 2000, 108: 449-454.
SEGALL, L.; DALY, S.E. & BLOSTEIN, R. Mechanistic basis for kinetic differences
between the rat alpha 1, alpha 2, and alpha 3 isoforms of the (Na
+
,K
+
)-ATPase. J. Biol.
Chem. 2001, 276: 31535-31541.
SEOK, J.H. et al. Regulation of (Na
+
,K
+
)-ATPase activity in renal basolateral membrane of
1-clip-1-kidney hypertensive rat. Biochem. Mol. Biol. Int. 1998, 46: 667-672.
SHAINSKAYA, A. et al. Entrance port for Na
+
and K
+
ions on (Na
+
,K
+
)-ATPase in the
cytoplasmic loop between transmembrane segments M6 and M7 of the alpha subunit -
Proximity of the cytoplasmic segment of the beta subunit. J. Biol. Chem. 2000, 275:
2019-2028.
SHAMRAJ, O.I. & LINGREL, J.B. A putative fourth (Na
+
,K
+
)-ATPase α-subunit gene is
expressed in testis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1994, 91: 12952-12956.
SHARP, M.S. & NEFF, J.M. Steady state hemolymph osmotic and chloride ion regulation
and percent body water in Clibanarius vittatus (Decapoda, Anomura) from the Texas
Gulf coast. Comp. Biochem, Physiol. 1980, 66A: 455.
SHULL, G.E.; LANE, L.K. & LINGREL, J.B. Amino-acid sequence of the β subunit of
the (Na
+
,K
+
)-ATPase deduced from a cDNA. Nature 1986, 321: 429-431.
SHUMWAY, S.E. Osmotic balance and respiration in the hermit crab Pagurus
bernhardus, exposed to fluctuating salinities. J. Mar. Biol. Ass. UK 1978, 58: 869-
876.
SHYJAN, A.W. et al. Differential expression and enzymatic properties of the (Na
+
,K
+
)-
ATPase alpha 3 isoenzyme in rat pineal glands. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A. 1990,
87: 1178-82.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
111
SKOU, J.C. The influence of some cations on an adenosine triphosphatase from peripheral
nerves. Biochim Biophys Acta. 1957, 23:394-401.
SKOU, J.C. Further investigations on a Mg
2+
+Na
+
-activated adenosine triphosphatase,
possibly related to the active, linked transport of Na
+
and K
+
across the nerve
membrane. Biochim. Biophys. Acta 1960, 42: 6-23.
SKOU, J.C. & ESMANN, M. The (Na
+
,K
+
)-ATPase. J. Bioenerg. Biomemb. 1992, 24:
249-261.
SKOU, J.C. The identification of the sodium-potassium pump (Nobel Lecture). Angew.
Chem. Int. Ed. 1998, 37: 2320-2328.
SPIGHT, T.N. Why small hermit crabs have large shells. Res. Pop. Ecol. 1985, 27: 39-54.
SWEADNER, K.J. Two molecular forms of (Na
+
+ K
+
)-stimulated ATPase in brain.
Separation, and difference in affinity for strophanthidin. J. Biol. Chem. 1979
254:6060-6067.
SWEADNER, K.J. Isozymes of the Na,K-ATPase. Biochim. Biophys. Acta 1989, 988:
185-220.
SWEADNER, K. J. & DONNET, C. Structural similanties of (Na
+
,K
+
)-ATPase and
SERCA the Ca
2
-ATPase of the sarcoplasmic reticulum. Biochem. J. 2001, 356: 685-
704.
SWEENEY, G. & KLIP, A. Regulation of the (Na
+
,K
+
)-ATPase by insulin: Why and how?
Mol. Cell. Biochem. 1998, 182: 121-133.
TENTES, I. & STRATAKIS, E. Partial purification and properties of (Na
+
,K
+
)-ATPase
from Potamon potamios. Comp. Biochem. Physiol. 1991, 100C: 619-624.
THERIEN, A.G. & BLOSTEIN, R. Na
+
/K
+
antagonism at cytoplasmic sites of (Na
+
,K
+
)-
ATPase: a tissue-specific mechanism of sodium pump regulation. Am. J. Physiol.
1999, 277: C891-C898.
THERIEN, A.G. & BLOSTEIN, R. (2000) Mechanisms of sodium pump regulation. Am.
J. Physiol. 2000, 279: C541-C566.
THERIEN, A.G. et al. Tissue-specific versus isoform-specific differences in cation
activation kinetics of the (Na
+
,K
+
)-ATPase. J. Biol. Chem. 1996, 271: 7104-7112.
THERIEN, G. et al. Tissue-specific distribution and modulatory role of the gamma subunit
of the (Na
+
,K
+
)-ATPase. J. Biol. Chem. 1997, 272: 32628-32634.
THOENGES, D. Tight binding of bulky fluorescent derivatives of adenosine to the low
affinity E2ATP site leads to inhibition of (Na
+
,K
+
)-ATPase. Analysis of structural
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
112
requirements of fluorescent ATP derivatives with a Koshland-Nemethy-Filmer model
of two interacting ATP sites. J. Biol. Chem. 1999, 274: 1971-1978.
TOWBIN, H.; STAEHELIN, T. & GORDON, J. Electrophoretic transfer of proteins from
polyacrylamide gels to nitrocellulose sheets: procedure and some applications. Proc. Natl.
Acad. Sci. USA 1979, 76: 4350-4354.
TOWLE, D.W. & KAYS, W.T. Basolateral localization of (Na
+
,K
+
)-ATPase in gill
epithelium of two osmoregulating crabs, Callinectes sapidus and Carcinus maenas. J.
Exp. Zool. 1986, 239: 311-318.
TOWLE, D.W. & HOLLELAND, T. Ammonium ion substitutes for K+ in ATP-dependent
Na+ transport by basolateral membrane-vesicles. Am. J. Physiol. 1987, 252: R479-
R489.
TOWLE, D.W. Ion transport systems in membrane vesicles isolated from crustacean
tissues. J. Exp. Zool. 1993, 265: 387-396.
TOWLE, D.W. Molecular approaches to understanding salinity adaptation of estuarine
animals. Amer. Zool. 1997, 37: 575-584.
TOWLE, D.W. Osmoregulation by gills of aquatic animals. Amer. Zool. 1999, 39: 35.
TOWLE, D.W.; PALMER, G.E. & HARRIS, J.L. Role of gill (Na
+
,K
+
)-dependent ATPase
in acclimation of blue crabs (Callinectes sapidus) to low salinity. J. Exp. Zool. 1976,
196: 315-321.
TOWLE, D.W. et al. Sodium/proton antiporter in the euryhaline crab Carcinus maenas:
Molecular cloning, expression, and tissue distribution. J. Exp. Biol. 1997, 200: 1003-
1014.
TOYOSHIMA, C. et al. Crystal structure of the calcium pump of sarcoplasmic reticulum
at 2.6 angstrom resolution. Nature 2000, 405: 647-655.
TOYOSHIMA, C. & MIZUTANI, T. (2004) Crystal structure of the calcium pump with a
bound ATP analogue. Nature 2004, 430: 529–535.
VANCE, R.R. Competition and mechanism of coexistence in three sympatric species of
intertidal hermit crabs. Ecology 1972, 53: 1062-1074.
VIGNERY, A. et al. Detection of the (Na
+
,K
+
)-ATPase alpha 3-isoform in multinucleated
macrophages. Am. J. Physiol. 1991, 260: F704-F709.
VILSEN, B. Mutant Phe788 -> Leu of the (Na
+
,K
+
)-ATPase is inhibited by micromolar
concentrations of potassium and exhibits high Na
+
-ATPase activity at low sodium
concentrations. Biochem. 1999, 38: 11389-11400.
XIE, Z. L. et al. Similarities and differences between the properties of native and
recombinant Na+/K+-ATPases. Arch. Biochem. Biophys. 1996, 330: 153-62.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
113
WALL, SM. Ammonium transport and the role of the (Na
+
,K
+
)-ATPase Miner. Electrol.
Metab. 1996, 22: 311-317.
WANG, S.G. & FARLEY, R.A. Valine 904, tyrosine 898, and cysteine 908 in (Na
+
,K
+
)-
ATPase alpha subunits are important for assembly with beta subunits. J. Biol. Chem.
1998 Nov 6; 273(45): 29400-29405.
WARD, D.G. & CAVIERES, J.D. Photoinactivation of fluorescein isothiocyanate-
modified (Na
+
,K
+
)-ATPase by 2’(3’)-O-(2,4,6-trinitrophenyl) 8-azidoadenosine 5’-
diphosphate. J. Biol. Chem. 1998a, 273: 14277-14284.
WARD, D.G. & CAVIERES, J.D. Affinity labeling of two nucleotide sites on (Na
+
,K
+
)-
ATPase using 2’(3’)-O-(2,4,6-trinitrophenyl) 8-azidoadenosine 5’-[alpha-P-32]
diphosphate (TNP-8N(3)-[alpha-P-32]ADP) as a photoactivatable probe. Label
incorporation before and after blocking the high affinity ATP site with fluorescein
isothiocyanate. J. Biol. Chem. 1998b, 273: 33759-33765.
WEIHRAUCH, D. et al. Potential of active excretion of ammonia in three different haline
species of crabs. J. Comp. Physiol. 1999, 169B: 25-37.
WEIHRAUCH, D. et al. Active excretion of ammonia across the gills of the shore crab
Carcinus maenas and its relation to osmoregulatory ion uptake. J. Comp. Physiol.
1998, 168B: 364-376.
WEIHRAUCH, D. Active ammonia excretion across the gills of the green shore crab
Carcinus maenas: participation of (Na
+
,K
+
)-ATPase, V-type H
+
-ATPase and functional
microtubules. J. Exp. Biol. 2002, 205: 2765-2775.
WEIHRAUCH, D.; MORRIS, S. & TOWLE, D. W. Ammonia excretion in aquatic and
terrestrial crabs. J. Exp. Biol. 2004, 207, 4491-4504.
WERNICK, A.M.; Mcnamara, J.C.; MOREIRA, G.S. Variation in hemolymph and shell
water osmotic concentrations during low salinity exposure in the hermit crab Isocheles
sawayai (Decapoda, Anomura). Braz. J. Med. Biol. Res. 1984, 17,492-492.
WERNICK, A.M. & MOREIRA, G.S. Osmoregulatory and respiratory responses of the
hermit crab Isocheles sawayai to salinity changes. Braz. J. Med. Biol. Res. 1985, 18:
A751- A751.
WILLIAMS, A.B. Shrimps, lobsters and crabs of the Atlantic Coast of the Eastern United
State, Maine to Florida. Smithsonian Institute Press, Washington, EUA, 1984,
550pp.
YODA, A. & YODA, S. Interaction between ouabain and the phosphorylated intermediate
of (Na
+
,K
+
)-ATPase. Mol. Pharmacol. 1982, 22: 700-705.
(Na
+
,K
+
)-ATPase de Clibanarius vittatus
114
YOUNG, A.M. & HAZLETT, T.L Effect of salinity and temperature on larval
development of Clibanariu -vittatus (Bosc) (Crustacea-Decapoda-Diogenidae). J Exp.
Mar. Biol. Ecol. 1978, 34: 131-141.
YOUNG, A.M. Osmoregulation in three hermit crab species, Clibanarius vittatus (Bosc),
Pagurus longicarpus Say and P. pollicaris Say (Crustacea: Decapoda; Anomura).
Comp. Biochem. Physiol. 1979a, 63A: 377-382.
YOUNG, A.M. Osmoregulation in larvae of the striped hermit crab Clibanarius vittatus
(Bosc) (Decapoda, Anomura; Diogenidae). Estuarine Coastal Mar. Sc. 1979b, 9:
595-601.
ZAMOFING, D.; ROSSIER, B.C. & GEERING, K. Role of the (Na
+
,K
+
)-ATPase β-
subunit in the cellular accumulation and maturation of the enzyme as assessed by
glycosilation inhibitors. J. Membr. Biol. 1988, 104: 69-79.
ZAMOFING, D.; ROSSIER, B.C. & GEERING, K. Inhibition of N-glycosylation affects
transepithelial Na
+
but not (Na
+
,K
+
)-ATPase transport. Am. J. Physiol. 1989 May;
256(5 Pt 1):C958-66.
ZARE, S. & GREENAWAY, P. The effect of moulting and sodium depletíon on sodium
transport and the activities of (Na
+
,K
+
)-ATPase, and V-ATPase in the freshwater
crayfish Cherax destructor (Crustacea: Parastacidae). Comp. Biochem. Physiol. 1998,
119A: 739-745.
ZEISKE, W. et al. Invertebrate epithelial Na
+
channels: Amiloride-induced current noise in
crab gill. Biochim. Biophys. Acta. 1992, 1105: 245-252.
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