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Universidade de São Paulo
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Química
Programa de Pós-Graduação em Química
Caracterização cinética da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de
tecido branquial do siri Callinectes danae aclimatado
a salinidade de 15‰
Douglas Chodi Masui
Tese apresentada à Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo, como
parte das exigências para obtenção do título
de Doutor em Ciências, Área: Química.
RIBEIRÃO PRETO - SP
2006
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Universidade de São Paulo
Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto
Departamento de Química
Programa de Pós-Graduação em Química
Caracterização cinética da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de
tecido branquial do siri Callinectes danae aclimatado
a salinidade de 15‰
Douglas Chodi Masui
Orientador: Prof. Dr. Francisco de Assis Leone
Tese apresentada à Faculdade de
Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão
Preto da Universidade de São Paulo, como
parte das exigências para obtenção do título
de Doutor em Ciências, Área: Química.
RIBEIRÃO PRETO - SP
2006
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Masui, Douglas Chodi.
Caracterização cinética da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração
microsomal de tecido branquial do siri Callinectes danae
aclimatado a salinidade de 15‰. Ribeirão Preto, 2006.
107 pág.
Tese de Doutorado, apresentada à Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras
de Ribeirão Preto/USP – Área de concentração: Quimica.
Orientador: Leone, Francisco de Assis.
1.(Na
+
,K
+
)-ATPase. 2.Callinectes danae. 3.Aclimatação a salinidade de
15‰. 4. Osmorregulação.
Se eu pudesse...
Se eu pudesse deixar algum presente a você,
deixaria aceso o sentimento de amar
a vida dos seres humanos.
A consciência de aprender tudo
o que foi ensinado pelo tempo a fora.
Lembraria os erros que foram cometidos
para que não mais se repetissem.
A capacidade de escolher novos rumos.
Deixaria para você, se pudesse,
o respeito àquilo que é indispensável:
Além do pão, o trabalho.
Além do trabalho, a ação.
E, quando tudo mais faltasse,
um segredo:
O de buscar no interior de si mesmo
a resposta e a força para
encontrar a saída."
(Mahatma Gandhi)
Aos meus pais, João e Sonia,
Que desde o inicio desta caminhada sempre estiveram ao meu lado... apoiando e
me incentivando a sempre alcançar meus ideais.
Minha irmã, Deise,
Mostrando sempre que nós podemos vencer todos os obstáculos.
AGRADECIMENTOS
Ao Prof. Dr. Francisco de Assis Leone, que acreditando em meu potencial,
tornou possível o desenvolvimento e a realização deste trabalho, cultivando tanto o
espírito crítico e científico, como também a amizade, o respeito e o crescimento
pessoal, lapidados ao longo desta longa jornada.
A Profa. Dra. Rosa dos Prazeres Melo Furriel-Inocentes, pela amizade
construída ao longo desses anos, de presença marcante e cativante, dando sempre o
apoio e o incentivo para alcançar todos os objetivos.
Ao Prof. Dr. João Atílio Jorge, pela oportunidade de contribuir tanto para
meu desenvolvimento profissional, como também pelos laços de amizade criados
desde longe.
Ao Prof. Dr. Fernando Luís Medina Mantelatto, e seus alunos Renata,
Andrea, Ivana, Mariana e outros, pela amizade e colaboração científica na
realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. John Campbell McNamara, e seus alunos Antônio, Alessandra
e outros, pela amizade e discussões científicas para realização deste trabalho.
Ao Prof. Dr. Roy Edward Larson, e seus alunos, por disponibilizar seu
laboratório para realização de alguns experimentos essenciais para realização
deste trabalho.
A Profa Dra. Maria Elisabete Darbello Zaniquelli e seu aluno Luciano
Caseli, pela amizade confiança, permitindo-me ampliar meus conhecimentos.
A Luciana Rezende, pela incondicional prova de amizade e confiança, dada
durante todos esses anos de caminhada.
Aos colegas e amigos, especialmente a Daniela P. Garçon, Sérgio, Rubia,
Flávio H., Carlos, Lílian, Kelly, Adriana, Kátia Perez, Tony, Ana Maria, Carolina
R., Carolina F., Arthur, Roberto, Elisangela, Luis H., Renata Andrade C., e outras
que, de alguma forma, sempre estiveram comigo, apoiando e incentivando para
que este trabalho fosse realizado.
A Ivana Ap. Borin, Nilton R. Alves e a Domingos E. Pitta, tanto pela
dedicação e suporte técnico, quanto pela profunda prova de amizade recebida
durante esse período.
A Lâmia, Isabel, Emerson, André, Sonia O., Maria Inês, Sonia M. e Denise
pela eficiência, atenção e paciência dedicadas.
A todos os Docentes e Funcionários da Universidade de São Paulo:
Departamento de Química e Departamento de Biologia da Faculdade de Filosofia,
Ciências e Letras de Ribeirão Preto e do Departamento de Biologia Celular e
Molecular e Bioagentes Patogênicos da Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto.
A FAPESP, pela bolsa concedida (Proc. No: 02/13063-6) e ao CNPq, que
tornaram possível a realização deste trabalho.
E a todas as pessoas que contribuíram para minha formação e realização
deste trabalho, mesmo que indiretamente.
i
ABREVIATURAS
ADP: adenosina 5’difosfato
ATP: adenosina 5’ trifosfato
ATPase: adenosina 5’ trifosfatase
BCIP: 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato
Da: Dalton
DMSO: dimetilsulfóxido
DTT: ditiotreitol
EDTA: ácido etilenodiamino-tetra acidoacético
FEP: fosfoenolpiruvato
FGQ: fosfoglicerato quinase
GAF: 3-fosfogliceraldeído
GAFDH: gliceraldeído-3-fosfato-desidrogenase
Hepes: ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-etanolsulfônico
K
M
: constante de Michaelis-Menten
K
i
: constante de inibição
K
0,5
: constante de dissociação aparente
LDH: lactato desidrogenase
n
H
: número de Hill
NADH: nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma reduzida)
NAD
+
: nicotinamida adenina dinucleotídeo (forma oxidada)
NBT: nitroblue tetrazolium
Pi: fosfato inorgânico
PQ: piruvato quinase
PNFF: p-nitrofenilfosfato
PNFFase: p-nitrofenilfosfatase
Tris: tris-(hidroxietil)aminometano
U: Unidade de atividade enzimática (1 nmol de substrato hidrolisado/minuto).
v: velocidade inicial
v
c
: velocidade inicial corrigida
V: velocidade máxima
ii
RESUMO
As propriedades bioquímicas da (Na
+
,K
+
)-ATPase branquial do siri eurialino
Callinectes danae aclimatado à salinidade de 15‰ foram estudadas.
A análise do gradiente de centrifugação em sacarose revelou a presença de um
único pico entre 30–35% de sacarose, com uma boa correlação entre as atividades
PNFFase a ATPase totais e (Na
+
,K
+
)-ATPase. A atividade residual observada na
presença de ouabaína 3 mM sugere a presença de outros sistemas de enzimas atuantes.
A eletroforese em condições desnaturantes nos microsomas de brânquias de C.
danae em animais recém-coletados em salinidade de 33 ‰ (não aclimatados) e de
aclimatados a salinidades de 15 e 33‰ por um período de 10 dias mostrou a presença de
pequenas diferenças nos padrões eletroforéticos das diferentes amostras. A análise por
Western blot mostrou um aumento significativo da proporção relativa da subunidade α
da (Na
+
,K
+
)-ATPase em relação à proteína total na fração microsomal do tecido
branquial de animais aclimatados à salinidade de 15‰ quando comparados aos animais
aclimatados a 33‰. Entretanto, proporções similares de subunidade α foram observadas
para amostras de animais recém-coletados a salinidade de 33‰ e aclimatados a 15‰.
A estimulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase pelo ATP ocorreu através de uma
curva de saturação monofásica apresentando interações sítio-sítio (n
H
=1,2), com V=
298,8 ± 16,7 U/mg, com K
0,5
de 174,2 ± 9,8 µM. A estimulação da atividade ATPase da
(Na
+
,K
+
)-ATPase por íons Mg
2+
(V= 299,16 ± 14,06 U/mg; K
0,5
= 767,31 ± 36,06 µM),
íons Na
+
(V= 309,0 ± 15,8 U/mg; K
0,5
= 7,8 ± 0,4 mM), íons K
+
(V= 300,6 ± 15,3 U/mg;
K
0,5
= 1,63 ± 0,08 mM) e íons NH
4
+
(V= 345,1 ± 19,0 U/mg; K
0,5
= 6,0 ± 0,3 mM)
ocorreu através de interações sítio-sítio.
A atividade da enzima foi modulada sinergisticamente pelos íons K
+
com
atividade máxima variando de 300,6 ± 15,3 U/mg para 514,6 ± 26,2 U/mg, na ausência
e na presença 50 mM de íons NH
4
+
, respectivamente. Além disso, foi observado um
significativo aumento na afinidade aparente da enzima pelo íon K
+
da ordem de 10
vezes (diminuiu de 1,6 ± 0,08 mM para 0,157 ± 0,008 mM).
Similarmente ao observado para os íons K
+
, o íon NH
4
+
estimulou
sinergisticamente a atividade da enzima na presença de diferentes concentrações de íons
K
+
. A estimulação da atividade da enzima pelo íon NH
4
+
também ocorreu através de
interações cooperativas entre os sítios. Embora tenha sido observado um aumento da
atividade específica da enzima de 345,1 ± 19,0 U/mg para 516,8 ± 27,9 U/mg, não
iii
foram observadas variações significativas nos valores de n
H
e K
0,5
com o aumento da
concentração de íons K
+
.
A ouabaína inibiu cerca de 90% da atividade ATPase total. A inibição pela
ouabaína apresentou valor de K
I
de 45,09 ± 2,51 µM. O ortovanadato também inibiu
atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase na mesma faixa (90%) através de uma curva de inibição
monofásica, com valor de K
I
da ordem de 1,31 ± 0,06 µM. O emprego de bafilomicina
A
1
, tapsigargina e teofilina, juntamente com a ouabaína, na atividade ATPase total
descartam a presença de V-ATPase, Ca
2+
-ATPase ou fosfatase, respectivamente. Apesar
da inibição por oligomicina corresponder a menos de 3,7%, esse valor aparentemente
sugere a presença de uma F
0
F
1
-ATPase. Além disso, a inibição por ácido etacrínico, em
conjunto com os experimentos de estimulação por da atividade ATPase da enzima por
íons Na
+
sugere fortemente a presença de uma K
+
-ATPase.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase hidrolisou o substrato PNFF obedecendo à cinética
Michaeliana com velocidade de V= 102,9 ± 4,3 U/mg e K
M
= 1,7 ± 0,1 mM. Já a
estimulação da atividade K
+
-fosfatase da enzima por íons Mg
2+
(V= 93,7 ± 2,3 U/mg;
K
0,5
= 1,40 ± 0,03 mM), K
+
(V= 94,9 ± 3,5 U/mg; K
0,5
= 2,9 ± 0,1 mM) e NH
4
+
(V=
106,2 ± 2,2 U/mg; K
0,5
= 9,8 ± 0,2 mM) seguiu uma cinética cooperativa, sugerindo a
presença de múltiplos sítios de ligação. Entretanto, a atividade K
+
-fosfatase não foi
estimulada sinergísticamente na presença de íons K
+
mais NH
4
+
.
Os íons sódio (K
I
= 22,7 ± 1,7 mM) e ortovanadato (K
I
= 28,1 ± 1,4 nM) inibiram
completamente a atividade fosfatase total através de uma única curva de inibição.
iv
ABSTRACT
The biochemical properties of the (Na
+
,K
+
)-ATPase from the gill microsomal
tissue of the euryhaline, marine, swimming crab Callinectes danae, acclimated to 15‰
salinity, were investigated.
Sucrose gradient centrifugation analyses revealed a unique peak, between 30–
35% sucrose, coincident with the total PNPPase, ATPase, and (Na
+
,K
+
)-ATPase
activities. The residual activity observed in the presence of 3 mM ouabain suggests the
existence of other enzyme systems.
Electrophoresis under denaturing conditions, using material from fresh-caught
crabs (33 ‰ salinity, not acclimated), and from crabs acclimated to 15 or 33‰ salinity,
for 10 days, revealed differences in migration pattern. Western blot analyses showed a
significant increase in the amount of (Na
+
,K
+
)-ATPase α-subunit relative to total
protein, for crabs acclimated to 15‰ compared to those acclimated to 33‰ salinity.
However, the proportion of α-subunit in samples from fresh-caught crabs acclimated to
33‰ and those acclimated to 15‰ salinity was similar.
(Na
+
,K
+
)-ATPase activity was stimulated by ATP and showed a single
saturation curve, exhibiting site-site interactions (n
H
=1.2), with V= 298.8 ± 16.7 U/mg,
and K
0.5
= 174.2 ± 9.8 µM. Stimulation of the ATPase activity by Mg
2+
(V= 299.16 ±
14.06 U/mg; K
0.5
= 767.31 ± 36.06 µM), Na
+
(V= 309.0 ± 15.8 U/mg; K
0.5
= 7.8 ± 0.4
mM), K
+
(V= 300.6 ± 15.3 U/mg; K
0.5
= 1.63 ± 0.08 mM) and NH
4
+
ions (V= 345.1 ±
19.0 U/mg; K
0.5
= 6.0 ± 0.3 mM) occurred through site-site interactions.
(Na
+
,K
+
)-ATPase activity was synergistically modulated by K
+
ions, maximum
activity varying from 300.6 ± 15.3 U/mg to 514.6 ± 26.2 U/mg, in the absence and
presence of 50 mM NH
4
+
ions, respectively. K
+
ions induced a 10-fold increase in
enzyme apparent affinity (from 1.6 ± 0.08 mM to 0.157 ± 0.008 mM).
As for K
+
ions, NH
4
+
synergistically stimulated enzyme activity in the presence
of variable K
+
concentrations. The stimulation by NH
4
+
ions exhibited cooperative, site-
site interactions. Although an increase in specific activity from 345.1 ± 19.0 U/mg to
516.8 ± 27.9 U/mg was seen, no significant changes in n
H
and K
0.5
were observed.
Ouabain inhibited total ATPase activity by about 90%, showing a K
I
= 45.09 ±
2.51 µM. Orthovanadate also inhibited the (Na
+
,K
+
)-ATPase with a K
I
of 1.31 ± 0.06
µM. Although the inhibitory effect of oligomycin was minimal (<3.7%), this inhibition
v
may suggest F
0
F
1
-ATPase activity. The inhibition by ethacrynic acid, in association
with Na
+
ion stimulation of the ATPase activity, suggests the presence of a K
+
-ATPase.
The (Na
+
,K
+
)-ATPase hydrolyzed PNPP (K
+
-phosphatase activity) obeying
Michaelian kinetics, with V= 102.9 ± 4.3 U/mg and K
M
= 1.7 ± 0.1 mM. The stimulation
of K
+
-phosphatase activity by Mg
2+
(V= 93.7 ± 2.3 U/mg; K
0.5
= 1.4 ± 0.03 mM), K
+
(V= 94.9 ± 3.5 U/mg; K
0.5
= 2.9 ± 0.1 mM), and NH
4
+
ions (V= 106.2 ± 2.2 U/mg; K
0.5
=
9.8 ± 0.2 mM) following cooperative kinetics, suggests multiple binding sites. K
+
-
phosphatase activity, however, was not synergistically stimulated by K
+
and NH
4
+
.
Sodium ions (K
I
= 22.7 ± 1.7 mM), and orthovanadate (K
I
= 28.1 ± 1.4 nM) totally
inhibited the total phosphatase activity.
vi
ÍNDICE
Pág.
1.0 INTRODUÇÃO
1
1.1 A (Na
+
,K
+
)-ATPase. 1
1.2 A osmorregulação nos crustáceos. 16
1.2.1 A (Na
+
,K
+
)-ATPase e a osmorregulação. 16
1.2.2 O siri Callinectes danae. 23
1.2.3 Contribuições do projeto em relação ao tema em estudo. 25
1.5 Objetivos. 29
1.5.1 Objetivos gerais. 29
1.5.2
Objetivos específicos. 30
2.0 MATERIAIS E MÉTODOS
31
2.1 Coleta e aclimatação dos animais. 31
2.2 Dissecção das brânquias. 31
2.3 Preparação da fração microsomal do tecido branquial. 32
2.4 Centrifugação em gradiente de densidade de sacarose. 32
2.5 Eletroforese em condições desnaturantes e análise por Western blot. 32
2.6 Determinação da atividade ATPase da fração microsomal. 33
2.7 Determinação da atividade p-nitrofenilfosfatase da fração microsomal. 34
2.8 Tratamento dos sistemas de associação PQ/LDH e FGQ/GAFDH. 35
2.9 Preparação da solução de gliceraldeído 3-fosfato. 35
2.10 Preparação da solução de ortovanadato. 35
2.11 Preparação da solução de Oligomicina. 35
2.12 Preparação da solução de Bafilomicina A
1.
35
2.13 Preparação da solução de Tapsigargina. 36
2.14 Dosagem de proteína. 36
2.15
Tratamento dos dados cinéticos. 36
3.0 RESULTADOS
37
3.1 Estudo da fração microsomal. 37
3.2 Caracterização da atividade ATPase da (Na
+
,K
+
)-ATPase. 42
3.3 Caracterização da atividade K
+
-fosfatase da (Na
+
,K
+
)-ATPase. 60
vii
4.0 DISCUSSÃO
73
4.1 Estudo da fração microsomal. 72
4.2 Caracterização da atividade ATPase da (Na
+
,K
+
)-ATPase. 74
4.3
Caracterização da atividade K
+
-fosfatase da (Na
+
,K
+
)-ATPase. 83
5.0
BIBLIOGRAFIA
86
6.0 CURRICULUM VITAE
105
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
1
1.0 – INTRODUÇÃO
1.1 – A (Na
+
,K
+
)-ATPase.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase (E.C.3.6.1.37) é uma enzima pertencente à família das
ATPases do tipo P, transportadoras de cátions caracterizadas pela formação de um
intermediário fosforilado através da transferência do fosfato γ da molécula do ATP para
o resíduo de aspartato na molécula da enzima durante o seu ciclo catalítico (Post, 1999;
Crambert et al., 2000; Geering, 2000; Kaplan et al., 2001; Glynn, 2002; Kaplan, 2002;
Jorgensen et al., 2003; Apell, 2004; Horisberger, 2004; Toustrup-Jensen & Vilsen,
2005; Dempski et al., 2005). Ela é uma proteína integral, presente na membrana
plasmática de praticamente todas as células animais e acopla a hidrólise de uma
molécula de ATP ao transporte de 2 íons K
+
para dentro e 3 íons Na
+
para fora da
célula, contra seus respectivos gradientes eletroquímicos. Desta forma, a concentração
do íon K
+
no meio intracelular permanece alta enquanto a do íon Na
+
, baixa, o que é
crucial para a atividade excitável dos músculos e do tecido nervoso, bem como para a
regulação do volume celular. Além disso, o gradiente de íons Na
+
criado pela (Na
+
,K
+
)-
ATPase é capaz de energizar a atividade de muitos transportadores secundários, que
suprem a célula de diversos nutrientes e regulam o pH e as concentrações intracelulares
de outros íons (Jorgensen et al., 1998a, b, 2003; Skou, 1998; Blanco & Mercer, 1998;
Blostein, 1999; Therien & Blostein, 2000; Crambert et al., 2000; Kaplan et al., 2001;
Kaplan, 2002; Horisberger, 2004; Capendeguy & Horisberger, 2005; Dempski et al.,
2005).
A (Na
+
,K
+
)-ATPase é um heterodímero, constituída por duas subunidades,
denominadas α e β. A subunidade α, considerada a subunidade catalítica da enzima,
contém cerca de 1000 resíduos de aminoácidos e Mr da ordem de 110 kDa, e nela estão
presentes os sítios de ligação de ATP e de fosforilação, além dos aminoácidos essenciais
para a coordenação dos íons Na
+
e K
+
(Lingrel et al., 1998; Blostein, 1999; Hu &
Kaplan, 2000; Blanco & Mercer, 1998; Kaplan, 2002; Jorgensen et al., 2003; Jorgensen,
2003; Sanchez & Blanco, 2004; Su & Scheiner-Bobis, 2004; Horisberger, 2004;
Toustrup-Jensen & Vilsen, 2005). Desde seu sequenciamento e clonagem, os estudos
sobre a subunidade α da (Na
+
,K
+
)-ATPase sugerem a presença de 10 segmentos
transmembrana (Geering, 2000; Mobasheri et al., 2000; Rice et al., 2001; Donnet et al.,
Douglas Chodi Masui
2
Painel 1 – Topologia de membrana proposta para as subunidades α, β e γ (FXYD)
da (Na
+
,K
+
)-ATPase.
O modelo proposto mostra a presença de dez segmentos transmembrana para
subunidade α da enzima apresentando os domínios citoplasmáticos “A”, “N” e “P”. A
seqüência “TGES” localizada no domínio citoplasmático “A” da subunidade α está
envolvida na desfosforilação da enzima. Na subunidade β, estão representadas três
glicosilações localizadas na porção extracelular da proteína. A subunidade γ está
representada pela família de proteínas denominadas “FXYD”. (Modificado de
Horisberger, 2004).
Cito
p
lasma
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
3
2001; Kaplan, 2002; Jorgensen et al., 2003; Horisberger, 2004; Toustrup-Jensen &
Vilsen, 2005; Capendeguy & Horisberger, 2005), onde suas extremidades N-terminal e
C-terminal (Painel 1) estão voltadas para o citoplasma (Felsenfeld & Sweadner, 1988;
Ning et al., 1993; Rice et al., 2001; Donnet et al., 2001; Sweadner & Donnet, 2001;
Feraille & Doucet, 2001; Kaplan, 2002; Horisberger, 2004). Grande parte da
subunidade α está localizada no citoplasma sob a forma de alças que dão origem a 3
domínios: o domínio “N” ou de ligação de nucleotídeos, o domínio “P” ou de
fosforilação, formados pela alça citoplasmática entre os segmentos M4-M5 da
subunidade α que contém o sítio de ligação do ATP e de fosforilação da enzima
(Blostein et al., 1998; Goldshleger & Karlish, 1999; Toyoshima et al., 2000; Jorgensen
& Pedersen, 2001; Salgado-Comissariat et al., 2001; Kaplan, 2002; Jorgensen et al.,
2003; Hebert et al., 2003; Hakansson, 2003; Horisberger, 2004; Toustrup-Jensen &
Vilsen, 2005; Capendeguy & Horisberger, 2005). Um terceiro domínio, denominado
“A” (ou domínio atuador), é formado pela união entre o segmento N-terminal e a alça
citoplasmática entre os segmentos transmembrana M2 e M3 (Painel 1) (Kaplan, 2002;
Jorgensen et al., 2003; Hebert et al., 2003; Horisberger, 2004; Toustrup-Jensen &
Vilsen, 2005; Capendeguy & Horisberger, 2005). Os estudos a respeito dos domínios
citoplasmáticos da subunidade α da enzima se baseiam na grande similaridade estrutural
com os domínios já identificados para a Ca
2+
-ATPase de retículo sarcoplasmático
(Toyoshima et al., 2000; Sweadner & Donnet, 2001; MacLennan & Green, 2000;
Hebert et al., 2001; Kaplan, 2002; Jorgensen et al., 2003; Toustrup-Jensen & Vilsen,
2005; Cohen et al., 2005; Dempski et al., 2005). Estes domínios citoplasmáticos estão
arranjados de maneira a se conectar por uma haste estreita a um domínio
transmembrana formando uma estrutura aproximadamente cilíndrica e compacta onde
se localizam os sítios de ligação dos íons Na
+
e K
+
(Rice et al., 2001; Sweadner &
Donnet, 2001; Hebert et al., 2001; Kaplan, 2002; Jorgensen et al., 2003; Toustrup-
Jensen & Vilsen, 2005).
A subunidade β, composta por cerca de 300 resíduos de aminoácidos e Mr da
ordem de 50 kDa, apresenta apenas um domínio transmembrana cuja extremidade N-
terminal está voltada para o citoplasma (Painel 1). Ela é altamente glicosilada e está
praticamente voltada para o meio extracelular (Bar-Shimon et al., 1998; Geering, 2000,
2001; Hasler et al., 2001; Rice et al., 2001; Hebert et al., 2001; Kaplan, 2002; Laughery
et al., 2003; Horisberger, 2004; Deane & Woo, 2005; Cohen et al., 2005; Dempski et
Douglas Chodi Masui
4
al., 2005). A presença de três pontes dissulfeto na subunidade β da enzima é necessária
para o direcionamento na membrana plasmática e são resistentes a redução (Lutsenko &
Kaplan, 1993; Geering, 2001; Kaplan, 2002; Laughery et al., 2003; Dempski et al.,
2005). A redução das pontes S-S pode afetar a interação entre a subunidade β e a alça
formada entre os segmentos M7 e M8 da subunidade α da enzima, resultando em perda
da atividade (Kawamura & Nagano, 1984; Kirley, 1990; Lutsenko & Kaplan, 1993;
Geering, 2001; Kaplan, 2002; Cohen, 2005).
A subunidade γ é um proteolipídeo de cerca de 60 resíduos de aminoácidos e Mr
ao redor de 7 kDa que se associa à (Na
+
,K
+
)-ATPase de maneira tecido-específica nos
vertebrados (Therien & Blostein, 2000; Arystarkhova et al., 2002a, b; Fuzesi et al.,
2005). Ele faz parte de uma família de proteínas denominadas FXYD (Béguin et al.,
2002; Crambert et al., 2002, 2003, 2004; Geering et al., 2003; Sweadner et al., 2003;
Cornelius & Mahmmoud, 2003; Garty et al., 2003; Feschenko et al., 2003; Li et al.,
2004; Horisberger, 2004; Frasen et al., 2005; Fuzesi et al., 2005; Jones et al., 2005;
Zouzoulas et al., 2005), caracterizadas por apresentar apenas um único segmento
transmembrana (Painel 1). Sua extremidade N-terminal está voltada para o meio
extracelular e considera-se que essa subunidade seja uma terceira subunidade da enzima
(Béguin et al., 1997; Blanco & Mercer, 1998). Evidências recentes indicam que ela não
é um componente essencial da (Na
+
,K
+
)-ATPase, embora atue como um regulador,
modulando a afinidade da enzima pelo ATP, e os íons K
+
e Na
+
(Therien et al., 1999;
Therien & Blostein, 2000; Wetzel & Sweadner, 2001; Crambert et al., 2002, 2004;
Arystarkhova et al., 2002a, b; Blostein et al., 2003; Farman et al., 2003; Geering et al.,
2003; Li et al., 2004; Horisberger, 2004; Fuzesi et al., 2005; Zouzoulas et al., 2005).
O heterodímero αβ é necessário para a enzima funcionalmente ativa e, já está
bem estabelecido que a subunidade β atua como uma chaperona específica,
estabilizando o enovelamento correto da subunidade α, facilitando o direcionamento do
dímero para a membrana plasmática (Noguchi et al., 1990; Béguin et al., 1998, 2000;
Abriel et al., 1999; Martin et al., 2000; Geering, 2000, 2001; Mobasheri et al., 2000;
Hasler et al., 2001; Jorgensen et al., 2003; Laughery et al., 2003). Além disso, a
subunidade β pode modular a atividade catalítica da enzima e o transporte pelos íons K
+
e Na
+
(Kaplan et al., 1998; Abriel et al., 1999; Mobasheri et al., 2000; Hasler et al.,
1998, 2001; Kaplan et al., 2001; Geering, 2001; Kaplan, 2002; Jorgensen et al., 2003).
Estruturalmente, a porção extracelular da subunidade β em sua porção mais próxima à
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
5
superfície da membrana interage com a alça extracelular da subunidade α entre os
segmentos M7 e M8, estabilizando-a (Or et al., 1998; Bar Shimon et al., 1998; Wang &
Farley, 1998; Béguin et al., 2000; Rice et al., 2001; Hasler et al., 2001; Jorgensen et al.,
2003; Laughery et al., 2003; Horisberber, 2004; Cohen et al., 2005). Além disso, a outra
porção maior desta subunidade, mais próxima da extremidade C-terminal,
aparentemente interage com a alça M3-M4 da subunidade α, recobrindo a cavidade que
leva aos sítios de coordenação de cátions e modulando a interação entre estes e a
molécula da enzima (Rice et al., 2001). As cadeias α e β também interagem através de
seus segmentos transmembrana e domínios citoplasmáticos e estas interações parecem
ter relevância estrutural e funcional, embora ainda pouco compreendidas (Ivanov et al.,
2000; Shainskaya et al., 2000; Hasler et al., 2000, 2001; Horisberger, 2004).
Está bem estabelecido que o protômero αβ é capaz de hidrolisar ATP e realizar
transporte ativo (Ward & Cavieres, 1993; Martin & Sachs, 1999; Martin et al., 2000;
Takeda & Kawamura, 2001; Donnet et al., 2001; Kaplan, 2002; Jorgensen et al., 2003).
Entretanto, existem controvérsias quanto ao fato da enzima existir normalmente na
membrana na forma de um protômero αβ (Martin et al., 2000; Takeda & Kawamura,
2001; Jorgensen et al., 2003), de um diprotômero (αβ)
2
(Linnertz et al., 1998a;
Antolovic et al., 1999; Laughery et al., 2003; Homareda & Ushimaru, 2005) ou um
tetrâmero (αβ)
4
(Yamazaki et al., 1994; Tsuda et al., 1998a, b; Yokoyama et al., 1999;
Donnet et al., 2001; Taniguchi et al., 2001; Teramachi et al., 2002; Hayashi et al.,
2003).
Quatro isoformas para a subunidade α e três para a subunidade β para a
(Na
+
,K
+
)-ATPase de vertebrados foram identificadas, sendo que cada subunidade é
codificada por diferentes famílias de genes (Levenson, 1994; Blanco & Mercer, 1998;
Blanco et al., 1999; Woo et al., 1999; Crambert et al., 2000; Mobasheri et al., 2000;
Kaplan, 2002; Jorgensen et al., 2003; Lingrel et al., 2003; Horisberger, 2004). Seu
padrão de expressão é tecido e espécie-específicos, está sujeito à regulação hormonal e
também depende do estágio de diferenciação celular (Blanco & Mercer, 1998; Sweeney
& Klip, 1998; Mobasheri et al., 2000). Cada isoforma da subunidade α apresenta
propriedades cinéticas distintas em relação à estimulação por Na
+
, K
+
, ATP e à inibição
por ouabaína (Blanco & Mercer, 1998; Sweeney & Klip, 1998; Crambert et al., 2000;
Segall et al., 2000; Mobasheri et al., 2000; Lingrel et al., 2003). Homólogos diretos das
isoformas da subunidade α dos vertebrados ainda não foram descritos nos invertebrados
Douglas Chodi Masui
6
(Emery et al., 1998; Okamura et al., 2003). Embora duas isoformas da subunidade α
tenham sido identificadas nos camarões Artemia salina e Artemia franciscana, nenhuma
delas corresponde diretamente as isoformas encontradas nos vertebrados (Cortas &
Edelman, 1988; Baxter-Lowe et al., 1989; Cortas et al., 1989; Macías et al., 1991;
GarciaSaez et al., 1997; Jorgensen & Pedersen, 2001). Além disso, somente uma
isoforma da subunidade β foi relatada para a (Na
+
,K
+
)-ATPase de crustáceos e nenhuma
isoforma da subunidade γ foi relatada para esses animais (Lucu & Towle, 2003). Nos
insetos foi relatada a existência de uma única isoforma de α, similar as isoformas α
1
e
α
3
dos mamíferos (Lebovitz et al., 1989; Reeves & Yamanaka, 1993; Emery et al.,
1995, 1998) e três isoformas da subunidade β que apresentam uma grande similaridade
com as equivalentes dos vertebrados (Emery et al., 1998; Sun et al., 1998; Xu et al.,
1999; Sun & Salvaterra, 1995a, b; Lucu & Towle, 2003; Okamura et al., 2003).
O mecanismo da reação de hidrólise do ATP acoplada ao transporte de íons pela
(Na
+
,K
+
)-ATPase envolve grandes mudanças conformacionais entre duas formas da
enzima (Painel 2): a primeira, denominada E
1
, é caracterizada por apresentar uma alta
afinidade por íons Na
+
citoplasmáticos; enquanto a outra, E
2
, é caracterizada pela alta
afinidade por íons K
+
extracelulares (Jorgensen et al., 1998a, 2003; Post, 1999; Vilsen,
1999; Jorgensen & Pedersen, 2001; Béauge, 2001; Kaplan., 2002; Scheiner-Bobis,
2002; Apell, 2004; Horisberger, 2004). De acordo com esse modelo, a etapa inicial do
ciclo reacional consiste na ligação de uma molécula de ATP (etapa 1) à forma E
2
(2K),
com uma baixa afinidade aparente. Nesta conformação, os dois íons K
+
estão ocluídos
no interior da enzima (Nielsen et al., 1998; Jorgensen et al., 1998a, 2003; Post, 1999;
Kaplan, 2002; Horisberger, 2004). A ligação do ATP ao seu sítio acelera a mudança
conformacional E
2
ATP(2K) para a forma E
1
ATP2K (etapa 2), em que os íons K
+
estão
desocluídos, ocorrendo simultaneamente a reorientação dos sítios de ligação de cátions
do lado extracelular para o citoplasma. A liberação dos íons K
+
(etapa 3) para o
citoplasma e a sua substituição por dois íons Na
+
dá origem à forma E
1
ATP2Na (não
mostrado). A ligação de um terceiro íon Na
+
citoplasmático a enzima dá origem à forma
E
1
ATP3Na (etapa 4) provocando um rearranjo dos segmentos transmembrana da
subunidade α (Domaszewicz & Apell, 1999; Schneeberger & Apell, 1999; Kaplan,
2002) que é propagado para os domínios citoplasmáticos induzindo o posicionamento
adequado do resíduo de aspartato que será fosforilado pelo ATP já ligado à enzima
(Jorgensen et al., 1998; Apell et al., 1998; Schneeberger & Apell, 1999; Rice et al.,
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
7
Painel 2 – Modelo proposto para o mecanismo da reação de hidrólise do ATP pela
(Na
+
,K
+
)-ATPase.
Os estados (Na) e (K) indicados no modelo correspondem as formas ocluídas
dos íons Na
+
e K
+
na enzima. A seta circular no centro da figura indica a direção do
mecanismo de reação (Modificado de Kaplan, 2002).
Douglas Chodi Masui
8
2001; Kaplan, 2002; Horisberger, 2004). A fosforilação da enzima, bem como a
liberação de ADP (etapa 5), provoca uma transição para a forma E
1
P(3Na), na qual os
íons Na
+
permanecem ocluídos. A enzima sofre então uma rápida isomerização
passando para a forma E
2
P2Na liberando simultaneamente um íon Na
+
(etapa 6) para o
meio extracelular (Apell et al., 1998; Vilsen, 1999; Domaszewicz & Apel, 1999;
Holmgren et al., 2000; Kaplan, 2002; Horisberger, 2004). As etapas de fosforilação e
isomerização ocorrem de maneira acoplada à reorientação dos sítios de ligação de
cátions do meio citoplasmático para o meio extracelular. A desoclusão dos dois íons
Na
+
(etapa 7) restantes provoca a passagem para a forma E
2
P e a liberação dos íons
para fora da célula. Finalmente, a ligação de dois íons K
+
(etapa 8) extracelulares à
forma E
2
P catalisa a desfosforilação da enzima (etapa 9), que volta à forma E
2
(K),
reiniciando assim o ciclo catalítico.
Os resíduos de aminoácidos que interagem diretamente com o ATP ou
desempenham um papel importante para sua ligação à (Na
+
,K
+
)-ATPase estão
localizados na alça citoplasmática entre os segmentos M4-M5 da subunidade α da
enzima (Jorgensen et al., 1998a, 2003; Scheiner-Bobis & Schreiber, 1999; Ettrich et al.,
2001; Jorgensen & Pedersen, 2001; Rice et al., 2001; Kaplan et al., 2001; Jacobsen et
al., 2002; Hofbauerova et al., 2002; Kaplan, 2002; Costa et al., 2003; Kubala et al.,
2002, 2004). Além do resíduo de aspartato que sofre a fosforilação durante o ciclo
catalítico, um resíduo de arginina também parece ser essencial para a ligação do ATP à
enzima (Ettrich et al., 2001; Jorgensen & Pedersen, 2001; Jacobsen et al., 2002; Kubala
et al., 2002, 2003; Jorgensen et al., 2003; Hilge et al., 2003). Resíduos de lisina,
fenilalanina, glicina, serina, aspartato, cisteína e glutamato localizados na mesma região
da molécula parecem contribuir para essa ligação (Tsuda et al., 1998a; Linnertz et al.,
1998, 1999; Gatto et al., 1999; Scheiner-Bobis & Schreiber, 1999; Ettrich et al., 2001;
Jorgensen & Pedersen, 2001; Kaplan, 2002; Kubala et al., 2003; Hofbauerova et al.,
2003; Jorgensen et al., 2003; Lansky et al., 2004; Su & Scheiner-Bobis, 2004).
Entretanto, as características das estruturas secundária e terciária envolvidas na
coordenação de nucleotídeos permanecem ainda a ser esclarecidas (Linnertz et al.,
1999; Tran & Farley, 1999; Rice et al., 2001; Kaplan, 2002; Costa et al., 2003).
Nos segmentos transmembrana M4, M5 e M6 da subunidade α da (Na
+
,K
+
)-
ATPase estão localizados os sítios de ligação dos cátions (Lingrel et al., 1998; Vilsen &
Andersen, 1998; Vilsen, 1999; Shainskaya et al., 2000; Feraille & Doucet, 2001;
Jorgensen & Pedersen, 2001; Kaplan et al., 2001; Guennoun & Horisberger, 2000,
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
9
2002; Kaplan, 2002; Mikhailova et al., 2002; Ogawa & Toyoshima, 2002; Jorgensen et
al., 2003; Sanchez & Blanco, 2004; Horisberger, 2004). Acredita-se que estes
segmentos transmembrana compõem um domínio móvel e flexível que fica sujeito às
mudanças conformacionais associadas ao transporte dos cátions através da membrana
(Lutsenko et al., 1995; Geering, 2000; Kaplan et al., 2001; Mikhailova et al., 2002;
Ogawa & Toyoshima, 2002; Li et al., 2005; Gatto et al., 2005). Existem controvérsias a
respeito dos resíduos de aminoácidos que estariam diretamente envolvidos na
coordenação de cátions, mas um número crescente de evidências sugere que dois
resíduos de aspartato, localizados na região mediana de M6, e dois resíduos de
glutamato, um em M4 e outro em M5, bem como um resíduo de glutamina em M8, são
essenciais para a ligação de dois íons K
+
e dois íons Na
+
(Lingrel et al., 1998; Jorgensen
et al., 1998a, b, 2003; Nielsen et al., 1998; Jorgensen & Pedersen, 2001; Kaplan et al.,
2001; Arguello et al., 1999a, b; Koenderink et al., 2000, 2003; Ogawa & Toyoshima,
2002; Kaplan, 2002; Jorgensen, 2003). Aparentemente, a enzima não apresenta sítios
separados com especificidades diferentes para a ligação destes dois íons ligados à
enzima, embora alguns autores destaquem que resíduos de asparagina, glutamato,
aspartato, serina, tirosina e treonina localizados principalmente em M4 e M5, o resíduo
de leucina localizado na alça entre os segmentos M3 e M4 e o resíduo de treonina
localizado em M8 parecem estar envolvidos na seletividade entre os cátions nas
conformações E
1
e E
2
da enzima (Lingrel et al., 1998; Jorgensen et al., 1998a, b;
Pedersen et al., 1998; Vilsen, 1999; Arguello et al., 1999a; Mense et al., 2000, 2002;
Jorgensen & Pedersen, 2001; Ogawa & Toyoshima, 2002; Jorgensen, 2003; Sanchez &
Blanco, 2004; Eguchi et al., 2005). Em relação ao terceiro íon Na
+
transportado por
molécula de ATP hidrolisada, há evidências de que ele interage com a forma
E
1
ATP2(Na)
em um sítio diferente, exclusivamente seletivo e que contém apenas
grupos não carregados (Apell et al., 1998; Schneeberger & Apell, 2001; Jorgensen et al.,
2003; Hakansson & Jorgensen, 2003). Estudos recentes têm proposto que um resíduo de
glutamato localizado em M9, outro de tirosina localizado em M5, resíduos de glicina e
de treonina em M6 e um resíduo de valina localizado em M8 seriam cruciais na ligação
e estabilização do terceiro íon Na
+
na enzima (Ogawa & Toyoshima, 2002; Horisberger,
2004; Imagawa et al., 2005; Li et al., 2005).
A oclusão dos cátions na (Na
+
,K
+
)-ATPase é um passo importante para a
eficiência do transporte iônico, garantindo o transporte de 3 íons Na
+
e 2 íons K
+
através
da membrana para cada molécula de ATP hidrolisada (Scheiner-Bobis, 1998; Vilsen &
Douglas Chodi Masui
10
Andersen, 1998; Apell et al., 1998; Post, 1999; Schneeberger & Apell, 1999, 2001;
Kaplan, 2002; Ogawa & Toyoshima, 2002; Jorgensen et al., 2003; Apell, 2003;
Horisberger, 2004; Li et al., 2005) seguido de reconhecimento do íon acompanhado de
uma mudança conformacional para o estado ocluído (Jorgensen et al., 1998; Post, 1999;
Schneeberger & Apell, 1999; Shainskaya et al., 2000; Holmgren et al., 2000;
Horisberger, 2004). Somente após a oclusão dos dois primeiros íons Na
+
, o sítio de
ligação do terceiro ion Na
+
torna-se acessível (Schneeberger & Apell, 2001; Ogawa &
Toyoshima, 2002; Apell, 2003), o que representa um ponto chave no processo de
oclusão e transporte dos íons eficientes, garantindo o transporte de 3 íons Na
+
e 2 íons
K
+
através da membrana para cada molécula de ATP hidrolisada (Scheiner-Bobis, 1998;
Vilsen & Andersen, 1998; Apell et al., 1998; Post, 1999; Schneeberger & Apell, 1999,
2001; Kaplan, 2002; Jorgensen et al., 2003). A estrutura e localização dos sítios de
reconhecimento de íons bem como a natureza das transições conformacionais
envolvidas na sua oclusão/desoclusão permanecem a serem esclarecidas (Jorgensen et
al., 1998a; Post, 1999; Schneeberger & Apell, 1999, 2004; Shainskaya et al., 2000;
Holmgren et al., 2000; Apell, 2004; Horisberger, 2004; Li et al., 2005; Gatto et al.,
2005; Imagawa et al., 2005).
As estruturas secundária e terciária dos domínios da (Na
+
,K
+
)-ATPase ainda
permanecem a serem esclarecidas (Donnet et al., 2001; Sweadner & Donnet, 2001; Rice
et al., 2001; Kaplan, 2002; Jorgensen et al., 2003). Entretanto, estudos da estrutura
tridimensional dos domínios citoplasmáticos da subunidade α da Ca
2+
-ATPase de
retículo sarcoplasmático nas conformações E
1
e E
2
(Toyoshima et al., 2000, 2003;
MacLennan & Green, 2000; Toyoshima & Nomura, 2002; Ogawa & Toyoshima, 2002)
mostraram uma grande similaridade com a subunidade α da (Na
+
,K
+
)-ATPase (Rice et
al, 2001; Sweadner & Donnet, 2001; Kaplan, 2002; Jorgensen et al., 2003; Hakansson,
2003; Hebert et al., 2003; Karlish, 2003; Sanchez & Blanco, 2004; Apell, 2004;
Horisberger, 2004). Apesar da estrutura tridimensional da (Na
+
,K
+
)-ATPase ainda não
estar estabelecida com alta resolução (Rice et al., 2001; Jorgensen et al., 2003; Kaplan,
2002), os dados comparativos obtidos entre essas enzimas sugerem uma semelhança
entre suas mudanças de conformação, sugerindo um mecanismo comum para todas as
ATPases do tipo P (MacLennan & Green, 2000; Rice et al., 2001; Kaplan, 2002;
Jorgensen et al., 2003; Karlish, 2003; Apell, 2004; Horisberger, 2004).
O mecanismo pelo qual a hidrólise do ATP é acoplada ao transporte de íons está
intimamente associado às modificações conformacionais que ocorrem na transição entre
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
11
as formas E1 e E2 da enzima (Post, 1999; Goldshleger & Karlish, 1999; Patchornik et
al., 2000; Jorgensen & Pedersen, 2001; Kaplan, 2002; Jorgensen et al., 2003; Toustrup-
Jensen & Vilsen, 2003; Horisberger, 2004). A ligação do ATP ao seu sítio bem como a
fosforilação/desfosforilação da cadeia α desencadeiam modificações conformacionais
que são transmitidas aos sítios de ligação/oclusão de cátions no interior da membrana
(Goldshleger & Karlish, 1999; Pedersen et al., 2000; Rice et al., 2001; Kaplan et al.,
2001; Toustrup & Vilsen 2005). Da mesma maneira, a ligação dos íons aos seus sítios
provoca modificações conformacionais que são transmitidas ao sítio de ligação de ATP
(Apell et al., 1998; Kaplan et al., 1998; Goldshleger & Karlish, 1999; Rice et al., 2001;
Kaplan et al., 2001). Assim, a transmissão destas mudanças conformacionais à distância
permite que a energia química liberada pela hidrólise do ATP seja usada para alterar a
orientação e a especificidade dos sítios para Na
+
e K
+
, propiciando o transporte dos íons
através da membrana (Jorgensen et al., 1998a, 2003; Post, 1999; Gatto et al., 1999;
Schneeberger & Apell, 1999; Pedersen et al., 2000; Jorgensen & Pedersen, 2001;
Kaplan et al., 2001; Kaplan, 2002; Toustrup-Jensen & Vilsen, 2003; Horisberger, 2004).
Contudo, o exato mecanismo de acoplamento ainda não está bem estabelecido
(Jorgensen et al., 2003; Mandal et al., 2003; Horisberger, 2004).
Em relação à movimentação dos domínios citoplasmáticos, na conformação E
2
,
eles estão aparentemente organizados de forma compacta (Rice et al., 2001, Kaplan,
2002; Jorgensen et al., 2003; Karlish, 2003; Toustrup-Jensen & Vilsen, 2003). A ligação
do ATP à forma E
2
2K provoca movimentos de rotação e inclinação dos domínios “N”,
“P” e “A”, que induzem o afastamento do domínio citoplasmático “A” em relação aos
outros domínios. De acordo com o modelo proposto por Horisberger (2004), a enzima
na forma E
1
ATP (Painel 3) apresenta os domínios citoplasmáticos “A”, “N” e
“P”afastados entre si (etapa c). Os domínios “N” e “P” se rearranjam de forma a
interagir fortemente entre si e estabilizam a conformação E
1
ATP (Kaplan, 2002;
Patchornik et al., 2002; Jorgensen et al., 2003; Pedersen et al., 2000; Toustrup-Jensen &
Vilsen, 2003). Simultaneamente ao afastamento do domínio “A”, ocorre uma
reorientação dos sítios de ligação de cátions do meio extracelular para o meio
intracelular, com a desoclusão dos íons K
+
para o citoplasma e ligação de dois íons Na
+
(Goldshleger & Karlish, 1999; Kaplan, 2002; Jorgensen et al., 2003; Toustrup-Jensen &
Vilsen, 2003; Horisberger, 2004). A ligação do terceiro íon Na
+
à forma E
1
provoca
mudanças conformacionais onde o domínio “N” sofre rotação em relação ao domínio
“P” posicionando o resíduo de aspartato e o fosfato γ do ATP (etapa c), favorecendo a
Douglas Chodi Masui
12
Painel 3 – Esquema integrado do ciclo funcional da (Na
+
,K
+
)-ATPase.
A seta circular no centro mostra a direção do ciclo fisiológico dirigido por uma alta
razão ATP/ADP, mas todas as etapas são reversíveis e sob condições apropriadas o
ciclo pode caminhar na direção reversa. O estado E
1
Na corresponde ao estado da
SERCA cristalizada. (Modificado de Horisberger, 2004).
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
13
fosforilação da conformação E
1
, induzindo posteriormente a mudança de conformação
para E
2
(Apell et al., 1998; Schneeberger & Apell, 1999; Kaplan, 2002; Jorgensen et al.,
2003; Ogawa & Toyoshima, 2002; Horisberger, 2004). A fosforilação do resíduo de
aspartato na molécula da enzima, através da hidrólise do ATP, dá origem a forma
E
1
P(3Na) (etapa e). O domínio “A” sofre simultaneamente um movimento de rotação
de 30º, propagando uma mudança conformacional para a interface transmembrana da
enzima resultando no fechamento do canal e oclusão dos íons Na
+
ligados à enzima
(Toyoshima & Mizutani, 2004; Sorensen et al., 2004), durante a etapa e. Durante o
ciclo catalítico, este estado de alta energia E
1
P(3Na) é rapidamente convertido na forma
E
2
P(2Na) (etapa f). Na mudança dos estados E
1
para E
2
ocorre a abertura dos sítios de
ligação de cátions para o meio extracelular e a redistribuição dos grupos importantes
diminuindo a afinidade pelo Na
+
. Além disso, após a liberação do primeiro Na
+
para o
meio extracelular ocorre o rearranjo do canal levando à liberação dos dois íons Na
+
restantes (etapa g)(Mikhailova et al., 2002; Patchornik et al., 2000, 2002; Jorgensen et
al., 2003; Goldshleger & Karlish, 1999; Kaplan, 2002; Toustrup-Jensen & Vilsen, 2003;
Horisberger, 2004). Dessa forma, dois ions K
+
podem ocupar o sítio de ligação de
cátions da forma E
2
P (etapa h), catalisando a desfosforilação do domínio “P” e a
oclusão dos íons K
+
, que rearranja a molécula da enzima fechando o canal de acesso
para o meio extracelular (etapa i) (Goldshleger & Karlish, 1999; Kaplan, 2002;
Jorgensen et al., 2003; Toustrup-Jensen & Vilsen, 2003; Horisberger, 2004). A ligação
de uma nova molécula de ATP ao domínio “N” (etapa 8) promove o afastamento dos
domínios “N” e “P”, induzindo a movimentação dos segmentos transmembrana da
molécula. Esse movimento resulta em abertura do canal de acesso aos sítios de ligação
de cátions para o meio intracelular. Um rearranjo dos grupos importantes para a
coordenação dos cátions, que se traduz numa diminuição da afinidade da enzima por
íons K
+
, caracteriza a transição conformacional da forma E
2
ATP(2K) para a forma
E
1
ATP2K (etapa 9). Finalmente, ocorre a liberação dos íons K
+
para o citosol (etapa
), finalizando o ciclo (Horisberger, 2004). Entretanto, ainda existem detalhes acerca
deste mecanismo que permanece a ser esclarecido (Jorgensen & Pedersen, 2001; Kaplan
et al., 2001; Hebert et al., 2001 Apell, 2003; Horisberger, 2004; Li et al., 2005; Gatto et
al., 2005).
A (Na
+
,K
+
)-ATPase é especificamente inibida por esteróides cardiotônicos, dos
quais a ouabaína é o mais representativo (Emery et al., 1998; Kasturi et al., 1998;
Koenderink et al., 2000b; Crambert et al., 2004; Paula et al., 2005). Já está bem
Douglas Chodi Masui
14
estabelecido que ela interage com a porção extracelular da enzima ligando-se com maior
afinidade à forma E
2
P (Lingrel & Kuntzweiler, 1994; Croyle et al., 1997; Lingrel et al.,
1998; Middleton et al 2000; Farr et al., 2002; Crambert et al., 2004; Keenan et al.,
2005). Vários resíduos de aminoácidos, localizados nas alças extracelulares da cadeia α
bem como nos segmentos transmembrana são importantes para a interação enzima-
ouabaína (Feng & Lingrel, 1994; Askew & Lingrel, 1994; Palasis et al., 1996; Croyle et
al., 1997; Keenan et al., 2005). Aparentemente, a cadeia β também está envolvida na
interação da enzima com a ouabaína (Hasler et al., 1998). Entretanto, o sítio de ligação
da ouabaína ainda não é conhecido (Kasturi et al., 1998; Coppi et al., 1999; Koenderink
et al., 2000b; Middleton et al., 2000; Kaplan, 2002; Paula et al., 2005). Como
característica compartilhada por todas as ATPases do tipo P, a (Na
+
,K
+
)-ATPase
também é fortemente inibida por vanadato, que mimetiza o estado de transição para a
fosforilação/desfosforilação da enzima na forma E
2
e E
2
(K), formando uma ligação
estável entre o inibidor e a molécula da enzima bloqueando dessa forma seu ciclo
catalítico (Cantley et al., 1978; McGregor & Walker, 1993; Dafnis & Sabatini, 1994;
Boxenbaum et al., 1998; Fedosova et al., 1998; Rice et al., 2001; Toustrup-Jensen &
Vilsen, 2003, 2005).
A (Na
+
,K
+
)-ATPase dos vertebrados está sujeita a uma complexa regulação, capaz
de conferir às células a habilidade de coordenar precisamente a atividade da enzima
com as suas necessidades fisiológicas num determinado instante (Blanco & Mercer,
1998; Therien & Blostein, 1999; Pedemonte & Bertorello, 2001; Cornelius &
Mahmmoud, 2003). Entretanto, os mecanismos pelos quais esta regulação ocorre ainda
não estão bem estabelecidos (Blanco & Mercer, 1998; Therien & Blostein, 2000;
Mobasheri et al., 2000; Cornelius, 2001). A expressão de diferentes isoformas com
características cinéticas intrínsecas distintas e em abundâncias relativas apropriadas é
capaz de suprir parcialmente a necessidade de comportamentos específicos da enzima
em diferentes tecidos e células (Blanco & Mercer, 1998; Sweeney & Klip, 1998;
Crambert et al., 2000; Segall et al., 2000, 2001; Mobasheri et al., 2000; Lingrel et al.,
2003). Por outro lado, os fatores que modulam mais diretamente a atividade da
(Na
+
,K
+
)-ATPase são as concentrações intra e extracelulares de ATP, Na
+
e K
+
(Blanco
& Mercer, 1998; Therien & Blostein, 1999, 2000; Efendiev et al., 2002; Kaplan, 2002).
Embora ainda não estejam bem estabelecidos, outros fatores tecido-específicos, como
diferenças no microambiente constituído pela membrana, parecem também modular a
afinidade relativa da enzima por K
+
e Na
+
, embora de maneira pouco compreendida
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
15
(Else & Wu, 1999; Therien & Blostein, 1999; Cornelius, 2001; Wu et al., 2001; Else et
al., 2003).
Nos vertebrados, a (Na
+
,K
+
)-ATPase está sujeita a mecanismos de regulação de
curto e longo prazo mediados por hormônios, tais como aldosterona, dopamina,
norepinefrina e insulina (Sweeney & Klip, 1998; Blanco & Mercer, 1998; Therien &
Blostein, 2000; Mobasheri et al., 2000; Dunbar & Caplan, 2001; Vasilets, 2002; Summa
et al., 2001 Teixeira et al., 2003; Feraille et al., 2003). A regulação de curto prazo
envolve efeitos diretos sobre o comportamento cinético da enzima ou sobre a
translocação de moléculas da enzima entre a membrana plasmática e reservatórios
intracelulares, enquanto os mecanismos de regulação de longo prazo geralmente afetam
a síntese de novo ou a degradação da enzima (Seok et al., 1998; Therien & Blostein,
2000; Dunbar & Caplan, 2001; Vasilets, 2002; Budu et al., 2002; Cornelius &
Mahmmoud, 2003; Feraille et al., 2003). As cascatas de sinalização envolvidas na
regulação hormonal são variadas, complexas e as alterações da atividade da enzima
resultam muitas vezes de modificações postraducionais, tais como a
fosforilação/desfosforilação da subunidade α, o que envolve a ação de diferentes
proteínas quinases e proteínas fosfatases (Therien & Blostein, 2000; Sweadner &
Feschenko, 2001; Kazanietz et al., 2001; Dunbar & Caplan, 2001; Lopina, 2001;
Vasilets, 2002; Cornelius & Mahmmoud, 2003; Duran et al., 2004; Wang & Yu, 2005).
Além disso, a regulação hormonal ocorre através de mecanismos isoforma específicos
(Blanco & Mercer, 1998; Pfeiffer et al., 1999; Therien & Blostein, 2000; Mobasheri et
al., 2000). Resta mencionar que a atividade da (Na
+
,K
+
)-ATPase também pode ser
modulada por alguns inibidores endógenos homólogos da ouabaína (Doris & Bagrov,
1998; Kramer et al., 1998; Therien & Blostein, 2000; Lichtstein & Rosen, 2001;
Schoner, 2002; Hansen, 2003; Keenan et al., 2005).
Nos invertebrados, os mecanismos osmorregulatórios e de neurossecreção estão
associados na modulação da regulação da (Na
+
,K
+
)-ATPase dos crustáceos com a
participação do sistema neuroendócrino como órgão X da glândula do sino, o cérebro e
o gânglio torácico, atuando na manutenção osmo-iônica (Mantel & Farmer, 1983;
Sommer & Mantel, 1988; Kamemoto, 1991; Morris & Edwards, 1995; Mo et al., 1998;
Dircksen et al., 2001; Lucu & Towle, 2003). Fatores do gânglio torácico, cAMP,
monoaminas, dopamina, octopamina, bem como ação de proteína quinase, regulam a
concentração de sais na hemolinfa dos crustáceos afetando a osmorregulação, ainda de
maneira pouco compreendida no âmbito da identificação dos fatores reguladores e seu
Douglas Chodi Masui
16
modo de ação na (Na
+
,K
+
)-ATPase, bem como outros transportadores atuantes no
processo osmorregulatório (Bianchini & Gilles, 1990; Kamemoto, 1991; Sommer &
Mantel, 1988, 1991; Riestenpatt et al ., 1994; Eckhardt et al., 1995; Lucu & Flik, 1999;
Spanings-Pierrot et al., 2000; Dircksen et al., 2001; Towle et al., 2001; Lucu & Towle,
2003).
1.2 – A osmorregulação nos crustáceos.
1.2.1 – A (Na
+
,K
+
)-ATPase e a osmorregulação.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase presente no tecido branquial dos crustáceos desempenha um
papel fundamental para a regulação osmótica nesses animais, formando uma interface
seletiva entre o meio ambiente externo e o meio interno (Péqueux, 1995; Towle &
Weihrauch, 2001; Lucu & Towle, 2003; Martinez et al., 2005). O processo de
osmorregulação nos crustáceos aquáticos, intimamente ligado às respostas à salinidade
do meio ambiente, envolve vários sistemas de controle que regulam o teor de água e de
osmólitos intra e extracelulares (Péqueux, 1995; Lucu & Towle, 2003).
A colonização de ambientes de salinidade variável, tais como estuários e regiões
sujeitas à ação das marés, representa um desafio particular; implicando no
desenvolvimento de características fisiológicas muito adaptadas. Uma característica
particularmente essencial desses animais é a capacidade de manter a concentração
osmótica dos fluidos extracelulares relativamente constantes, independentemente da
salinidade do meio externo. Com isso, o animal preserva os tecidos internos da
exposição a mudanças drásticas e bruscas de salinidade, que poderiam inviabilizar os
seus processos celulares vitais (Péqueux, 1995; Mo & Greenaway, 2001; Castilho et al.,
2001).
Fundamentalmente, a regulação osmótica (ou osmorregulação) compreende o
conjunto das estratégias desenvolvidas pelas diversas espécies animais para controlar o
teor de água e osmólitos (orgânicos e inorgânicos) a nível intra e extracelular. Nos
animais aquáticos, inclui um conjunto de respostas à salinidade do meio externo,
variável ou não (Péqueux, 1995). A maioria das espécies aquáticas de crustáceos habita
o ambiente marinho e, grande parte delas são osmoconformadoras (não apresentam
nenhum mecanismo de osmorregulação dos fluidos extracelulares). Esses animais
mantêm a osmolalidade de sua hemolinfa praticamente igual à da água do mar,
diminuindo a difusão de íons e água aos quais são altamente permeáveis (Péqueux,
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
17
1995; Lucu et al., 2000). A nível celular, apresentam reduzida capacidade de adaptação
a mudanças na composição dos fluidos extracelulares, o que resulta em baixa tolerância
a alterações de salinidade do meio externo resultando em sensível redução de sua
sobrevivência em ambientes diluídos ou de salinidade variável (Péqueux, 1995; Lucu et
al., 2000; Lucu & Towle, 2003; Kirschner, 2004; Tsoi et al., 2005).
Entretanto, ao longo da evolução, diversos grupos de crustáceos têm invadido
ambientes de salinidades inferiores à da água do mar (estuários, águas salobras, rios e
lagos) e o sucesso do seu estabelecimento nesses ambientes está condicionado ao
desenvolvimento de mecanismos fisiológicos eficientes, que permitem manter o volume
celular e a concentração iônica e osmótica dos fluidos intra e extracelular em níveis
compatíveis com as funções vitais desses animais (Péqueux, 1995; McLusky & Elliott,
2004).
As espécies de crustáceos habitantes de águas salobras e estuarinas possuem uma
grande capacidade osmorregulatória, são eurialinas (toleram a exposição a salinidades
variáveis) e hiperosmorreguladoras, pois mantém a concentração osmótica da hemolinfa
maior que a do meio circundante diluído, às custas de energia (Moreira et al., 1983;
Péqueux, 1995; Rathmayer & Siebers, 2001; Guerin & Stickle, 1997; Lovett et al.,
2001; Henry et al., 2002; Genovese et al., 2004). O desafio evolutivo dos crustáceos que
habitam os ambientes de salinidade variável, como os estuários, foi o desenvolvimento
de mecanismos fisiológicos muito adaptados para sobrevivência neste habitat (Péqueux,
1995; Mo & Greenaway, 2001; Onken & McNamara, 2002; Lucu & Towle, 2003). Uma
das estratégias mais relevantes é a capacidade de manter a concentração osmótica dos
fluidos extracelulares relativamente constantes, independentemente da salinidade do
meio externo e dessa maneira preservar os tecidos internos da exposição a mudanças
drásticas e bruscas de salinidade que poderiam inviabilizar os seus processos celulares
vitais (Péqueux, 1995; Mo & Greenaway, 2001; Castilho et al., 2001; Lucu & Towle,
2003).
Por serem hiperosmóticos em relação ao meio externo, os crustáceos que
invadem habitats diluídos tendem a sofrer hidratação e perda de íons por difusão. Em
função disso, uma capacidade osmorregulatória eficiente representa para estes animais,
um mecanismo fisiológico fundamental, preservando seus fluidos intra e extracelulares
hiperosmóticos em relação ao meio externo (Péqueux, 1995; Mo & Greenaway, 2001;
Onken & McNamara, 2002; Weihrauch et al., 2004b). Ao longo do processo evolutivo,
os crustáceos melhor adaptados ao ambiente de água doce diminuíram o custo
Douglas Chodi Masui
18
energético envolvido na hiperregulação osmótica reduzindo o gradiente osmótico
hemolinfa/meio externo bem como a permeabilidade da superfície corporal à água e/ou
íons (Péqueux, 1995; Lucu & Towle, 2003; Weihrauch et al., 2004b). Paralelamente,
certas espécies de camarões e lagostins desenvolveram sistemas de excreção capazes de
compensar o ganho de água através da eliminação de grandes volumes de urina
hiposmótica, reduzindo assim a perda de sais envolvida no controle do volume celular
(Péqueux, 1995; Onken & Riestenpatt, 1998; Lucu et al., 2000; Onken & McNamara,
2002; Lucu & Towle, 2003; Thurman, 2003; Weihrauch et al., 2004b). Do ponto de
vista adaptativo-evolutivo estas características parecem ser extremamente importantes
na conquista do ambiente de água doce por certas espécies de crustáceos. De modo
geral, em ambientes de menor salinidade, a concentração iônica e a osmolalidade da
hemolinfa dos crustáceos refletem um equilíbrio dinâmico entre a perda de sais por
difusão e pela urina e a sua absorção do meio externo. A perda de eletrólitos é
compensada pela captura de íons por um epitélio transportador presente nas brânquias
(Péqueux, 1995; Towle, 1997; Lima et al., 1997; Onken & Riestenpatt, 1998, 2002;
Rathmayer & Siebers, 2001; Towle & Weihrauch, 2001; Mo & Greenaway, 2001;
Lovett et al., 2001; Henry et al., 2002).
A micro-anatomia e a ultraestrutura das brânquias de várias espécies de
caranguejos braquiúros já são bem conhecidas (Painel 4) e, embora existam detalhes
que variam de uma espécie para outra, essencialmente consistem de estruturas
multilamelares onde cada lamela forma um envelope cuticular banhado externamente
pela água do ambiente e com o seu interior preenchido pela hemolinfa, que flui através
de uma câmara formada por células epiteliais uniestratificadas que, dependendo da
espécie, apresenta um septo intralamelar completo ou parcial (Copeland & Fitzjarrell,
1968; Mantel & Farmer, 1983; Barra et al., 1983; Towle & Kays, 1986; Goodman &
Cavey, 1990; Maina, 1990; Taylor & Taylor, 1992; Péqueux, 1995; Onken &
Riestenpatt, 1998). As superfícies apicais das células epiteliais estão voltadas para o
meio externo e são amplificadas por microvilos, enquanto as membranas basolaterais,
altamente invaginadas, associadas a numerosas mitocôndrias e onde está localizada a
(Na
+
,K
+
)-ATPase, são banhadas pela hemolinfa (Copeland & Fitzjarrell, 1968; Towle &
Kays, 1986; Péqueux, 1995; Onken & Riestenpatt, 1998). Estas invaginações de
membrana associadas a mitocôndrias, denominadas "bombas mitocondriais", são
características de epitélios transportadores de íons (Copeland & Fitzjarrell, 1968; Cioffi,
1984; Towle, 1984; McConnell, 1987; Péqueux, 1995; Onken & Riestenpatt, 1998).
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
19
Painel 4 – Representação esquemática geral da morfologia das brânquias dos
caranguejos.
Estão representados na figura: 1. Cutícula; 2. Célula principal; 3. Célula pilastra; 4.
Espaço da hemolinfa. 5. Septo intralamelar. A figura é baseada em estudos de
microscopia em Uca sp. (Modificado de Onken & Riestenpatt, 1998).
Douglas Chodi Masui
20
A maior contribuição para a osmolalidade da hemolinfa dos crustáceos provém
do cloreto de sódio. Desse modo, a regulação dos fluxos de Na
+
e Cl
-
é fundamental
para a capacidade osmorregulatória desses animais (Towle, 1997; Péqueux, 1995;
Castilho et al., 2001; Henry et al., 2002; Kirschner, 2004). O processo de captura ativa
de íons Na
+
que ocorre nas brânquias dos crustáceos hiperreguladores em meios
diluídos tem sido intensamente estudado, particularmente nos caranguejos e lagostins
(Péqueux, 1995; Onken & Riestenpatt, 1998, 2002;; Zare & Greenaway, 1998; Castilho
et al., 2001; Wilder et al., 2000; Towle & Weihrauch, 2001; Towle et al., 2001; Schleich
et al., 2001; Mo & Greenaway, 2001; Luquet et al., 2002a, b; Henry et al., 2002; Onken
et al., 2003; Lucu & Towle, 2003; Weihrauch et al., 2004b). Aparentemente, este
processo envolve a participação coordenada de vários sistemas transportadores,
distribuídos assimetricamente na membrana das células do epitélio branquial, voltados
para o meio externo ou para a hemolinfa (Péqueux, 1995; Zare & Greenaway, 1998;
Onken & Riestenpatt, 1998; Ahearn et al., 1999; Towle & Weihrauch, 2001; Henry et
al., 2002; Grosell et al., 2002; Lucu & Towle, 2003; Kirschner, 2004). Já está bem
estabelecido que a (Na
+
,K
+
)-ATPase, presente no tecido branquial da maioria das
espécies de crustáceos, desempenha um papel central nesse mecanismo de captura
iônica, transportando os íons sódio das células do epitélio branquial para a hemolinfa,
diminuindo localmente a sua concentração. Nesse sentido, existe uma estreita relação
entre a atividade específica da enzima e a magnitude do transporte ativo transepitelial de
sódio (Péqueux, 1995; Onken & Riestenpatt, 1998; Ahearn et al., 1999; Towle &
Weihrauch, 2001; Schleich et al., 2001; Mo & Greenaway, 2001). O mecanismo pelo
qual os íons sódio são retirados do meio ambiente através da membrana apical das
células do epitélio branquial dos crustáceos hiperreguladores permanece a ser
esclarecido. Entretanto, uma das forças que dirigem a passagem destes íons para o
interior das células é, inequivocamente, o seu transporte ativo subseqüente para a
hemolinfa pela (Na
+
,K
+
)-ATPase (Péqueux, 1995; Onken & Riestenpatt, 1998; Ahearn
et al., 1999; Furriel et al., 2000; Towle & Weihrauch, 2001; Luquet et al., 2002b; Henry
et al., 2002; Grosell et al., 2002; Lucu & Towle, 2003; Tresguerres et al., 2003;
Kirschner, 2004; Lignot et al., 2005). Existem evidências da participação de diversos
transportadores apicais neste processo, como trocadores dos tipos 2Na
+
/H
+
(ou
2Na
+
/NH
4
+
) e Na
+
,K
+
/2Cl
-
, um canal de Na
+
e uma V-ATPase (Péqueux, 1995; Ahearn
et al., 1999; Zare & Greenaway, 1998; Onken & Riestenpatt, 1998; Weihrauch et al.,
2001, 2004b; Towle & Weihrauch, 2001; Onken et al., 2003; Kirschner, 2004).
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
21
Aparentemente, a afinidade pelos íons sódio é o parâmetro cinético mais
variável entre as (Na
+
,K
+
)-ATPases de tecido branquial de diferentes espécies de
crustáceos hiperreguladores e está diretamente relacionada ao grau de adaptação do
animal à salinidade do meio que habita.
Assim, afinidades maiores para os íons Na
+
têm sido relatadas para as enzimas
de animais bem adaptados à água doce enquanto para animais que habitam os estuários
ou águas salobras tem sido relatada uma afinidade menor (Harris & Bayliss, 1988;
Furriel et al., 2000; Castilho et al., 2001; Lucu & Towle, 2003). Entretanto, os valores
das afinidades por íons K
+
e Mg
2+
e pelo ATP variam pouco entre as espécies estudadas
e não parecem apresentar nenhuma correlação com a salinidade do habitat do animal
(Furriel et al., 2000; Masui et al., 2002; Lucu & towle, 2003). Além disso, a afinidade
da enzima pela ouabaína nos crustáceos é menor em relação aos vertebrados (Lucu &
Towle, 2003; Furriel et al., 2000; Masui et al., 2002). Por outro lado, já está bem
estabelecido que a resposta osmorregulatória dos crustáceos é modulada, a curto e longo
prazo, por fatores neuroendócrinos (McNamara et al., 1990, 1991; Freire & McNamara,
1992; Péqueux, 1995; Santos & McNamara, 1996; Spanings-Pierrot et al., 2000; Lovett
et al., 2001; Mo & Greenaway, 2001).
As informações sobre a estrutura da (Na
+
,K
+
)-ATPase branquial dos crustáceos
ainda são escassas. Contudo, igualmente às outras (Na
+
,K
+
)-ATPases, a enzima dos
crustáceos possui uma subunidade α com Mr entre 95 e 104 KDa e uma subunidade β
de peso molecular de 38 a 40 KDa (Lucu & Flik, 1999; Furriel et al., 2000; Towle et
al., 2001; Masui et al., 2002, 2005a; Lignot et al., 2005). Ainda permanece a ser
esclarecida a presença de proteínas reguladoras da família FXYD nos crustáceos e do
papel da subunidade β para a estrutura e a atividade da enzima (Lucu & Towle, 2003).
Os estudos da estrutura primária da (Na
+
,K
+
)-ATPase revelaram uma grande homologia
entre as subunidades α de A. franciscana, C. sapidus e H. americanus e que apresentam
também uma grande homologia com a isoforma α
3
dos vertebrados; os genes para a
expressão das duas isoformas desta subunidade nos crustáceos foram descritos somente
em camarões do gênero Artemia (Baxter-Lowe et al., 1989; Macías et al., 1991;
Pressley, 1992; Towle et al., 2001; Parrie & Towle, 2002). Para Artemia, a subunidade
α apresenta somente 8 segmentos transmembrana, com a enzima nativa sob a forma de
um diprotômero (αβ)
2
(Peterson & Hokin, 1981; Lucu & Towle, 2003). Somente uma
Douglas Chodi Masui
22
sequência homóloga às subunidades β dos vertebrados foi relatada para a subunidade β
desses animais (Bhattacharyya et al., 1990).
A fim de esclarecer o papel da (Na
+
,K
+
)-ATPase branquial na resposta
osmorregulatória dos crustáceos a longo prazo, bem como a regulação desta resposta, a
atividade desta enzima tem sido intensivamente estudada em animais
experimentalmente aclimatados a salinidades diferentes. Apesar de alguns resultados
contraditórios (Wilder et al., 2000), geralmente tem sido relatada uma atividade
significativamente menor em animais adaptados a meios de maior salinidade (Harris &
Bayliss, 1988; Piller et al., 1995; Corotto & Holliday, 1996; Mo et al., 1998; Zare &
Greenaway, 1998; Lucu & Flik, 1999; Lucu & Devescovi, 1999; Flik & Haond, 2000;
Castilho et al., 2001; Mo & Greenaway, 2001; Towle et al., 2001; Towle & Weihrauch,
2001; Lucu & Towle, 2003). A diminuição da atividade da (Na
+
,K
+
)-ATPase branquial
em resposta à aclimatação a meios de salinidades mais elevadas é um componente
importante da resposta osmorregulatória a longo prazo nos crustáceos, induzindo a
captura ativa de íons sódio e o gasto energético a ela associado (Péqueux, 1995; Lima et
al., 1997; Lucu & Towle, 2003). Entretanto, esses mecanismos ainda são pouco
compreendidos (Lovett et al., 2001; Mo & Greenaway, 2001; Towle et al., 2001; Towle
& Weihrauch, 2001; Lucu & Towle, 2003). Tem sido proposto que esta resposta
envolva a regulação da atividade da enzima preexistente, a degradação e/ou remoção de
moléculas da enzima das membranas das células do epitélio branquial, mudança da
composição lipídica da membrana ou ainda uma redução na sua taxa de síntese através
de mecanismos mediados por neurohormônios (Chapelle & Zwingelstein, 1984;
Péqueux, 1995; Lima et al., 1997; Mo et al., 1998, 2002; Lucu & Flik, 1999; Spanings-
Pierrot et al., 2000; Mo & Greenaway, 2001; Lovett et al., 2001; Towle et al., 2001;
Towle & Weihrauch, 2001; Lucu & Towle, 2003). Para o tecido branquial de peixes,
todavia, foi relatada a expressão de duas isoformas diferentes da subunidade α da
(Na
+
,K
+
)-ATPase em proporções relativas que variam em resposta à salinidade do meio
externo (Pagliarani et al., 1991; Lee et al., 1998). Nas brânquias posteriores e anteriores
do caranguejo estuarino Chasmagnatus granulata (Castilho et al., 2001) também foi
identificada a presença de duas isoformas da enzima com diferentes afinidades por ions
Na
+
sugerindo que nos crustáceos, a expressão de isoformas diferentes da enzima
também possa estar envolvida na resposta osmorregulatória a longo prazo. Num sentido
mais amplo, a expressão de diferentes isoformas da (Na
+
,K
+
)-ATPase no tecido
branquial, em resposta à exposição a meios de diferentes salinidades, poderia
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
23
representar um importante mecanismo evolutivo envolvido na invasão de ambientes
mais diluídos por estes animais.
Embora seja indiscutível a importância do estudo do papel da (Na
+
,K
+
)-ATPase
do tecido branquial de diversas espécies de crustáceos osmorreguladores na resposta à
aclimatação a diferentes salinidades, somente alguns poucos relatos descrevem a
caracterização cinética da enzima expressa em animais mantidos em diferentes
condições de salinidade. Segundo Furriel et al. (2000, 2001), muitos dos resultados da
literatura foram obtidos sem uma prévia caracterização cinética da enzima, empregando
condições iônicas arbitrariamente escolhidas, o que pode ter levado a conclusões
errôneas. Desse modo, a caracterização cinética da (Na
+
,K
+
)-ATPase do tecido
branquial de crustáceos osmorreguladores aclimatados a diferentes salinidades é
relevante para o esclarecimento do papel desta enzima na resposta osmorregulatória
desses animais, particularmente nas espécies encontradas na costa brasileira, ainda
pouco estudadas. Estes estudos podem contribuir também para uma maior compreensão
dos mecanismos que estão envolvidos na regulação da atividade da enzima a longo
prazo, podendo evidenciar a expressão de isoformas diferentes da enzima em resposta à
adaptação dos animais a salinidades diferentes, contribuindo assim para uma melhor
caracterização da (Na
+
,K
+
)-ATPase do tecido branquial desses animais.
1.2.2 – O siri Callinectes danae.
Callinectes danae Smith, 1869 é um caranguejo portunídeo eurialino de grande
valor comercial que está distribuído desde a Flórida até o sul da costa brasileira (Melo,
1996; Chacur, 1998; Weber & Levy, 2000; Chacur & Negreiros-Fransozo, 2001). Esta
espécie pode ser encontrada em estuários lodosos, mangues, praias arenosas e lodosas e
até mesmo em mar aberto até 75 metros de profundidade, habitando biótopos cuja
salinidade varia desde a água salobra até a água do mar (Williams, 1974; Gaspar, 1981;
Guerin & Stickle, 1997). Embora C. danae tolere a exposição a uma ampla faixa de
salinidades, semelhantemente a outros membros do gênero, sua capacidade osmótica e
osmorregulatória tem sido pouco investigada (Guerin & Stickle, 1997). Espécies
relacionadas como C. sapidus e C. similis hiperregulam bem acima da linha de
isosmoticidade em meio de baixa salinidade, e hiporregulam fracamente ou
hipoconformam acima da salinidade da água do mar (Guerin & Stickle, 1997; Aguilar et
al., 2005; Rome et al., 2005). Na baía de Ubatuba (SP), aproximadamente 95% dos
animais adultos são encontrados em áreas de salinidade média ao redor de 33 ‰ ao
Douglas Chodi Masui
24
longo de todo o ano, mas que sofrem influência da água doce proveniente dos rios que
desembocam na região (Mantelatto & Fransozo, 1999, 2000).
Os animais do gênero Callinectes têm seu ciclo reprodutivo associado à
migração entre ambientes de salinidade variável. Embora certos estudos mostrem que
machos e fêmeas de C. sapidus são freqüentemente encontrados em áreas de baixa a alta
salinidade respectivamente (Aguilar et al., 2005). Em C. danae foram relatados apenas a
presença de um movimentos migratórios de fêmeas adultas ovígeras para águas mais
salinas para a desova (Costa & Negreiros-Fransozo, 1998; Chacur & Negreiros-
Fransozo, 2001), e dessa forma, a falta de um estudo completo do seu ciclo de vida.
Além disso, não está bem estabelecida a sua dependência em relação tanto aos estuários
quanto à água do mar para a reprodução e a sobrevivência dos estágios larvais e juvenis
(Weber & Levy, 2000; Chacur & Negreiros-Fransozo, 2001).
Estudos da morfologia das brânquias de C. danae demonstraram a presença de
oito pares de brânquias, dispostos lateralmente e apresentando uma grande semelhança
com as estruturas já descritas para espécies de crustáceos relacionadas (Copeland &
Fitzjarell, 1968; Onken & Riestenpatt, 1998). As brânquias são compostas basicamente
por estruturas multilamelares onde cada lamela forma um envelope cuticular com o seu
exterior em contato com a água do ambiente e o seu interior preenchido pela hemolinfa
que circula através de uma câmara formada por células epiteliais uniestratificadas que,
dependendo da espécie, apresenta um septo intralamelar completo ou parcial (Copeland
& Fitzjarrell, 1968; Mantel & Farmer, 1983; Barra et al., 1983; Towle & Kays, 1986;
Goodman & Cavey; 1990; Maina, 1990; Taylor & Taylor, 1992; Péqueux, 1995; Onken
et al., 1995; Onken & Riestenpatt, 1998). Nas membranas apicais, as células do tecido
epitelial branquial apresentam um grande número invaginações, que aumentam a
superfície de contato com o meio ambiente. Já a superfície basolateral dessas células,
onde está localizada a (Na
+
,K
+
)-ATPase, é banhada pela hemolinfa e apresenta um
grande número de invaginações associadas a mitocôndrias (Copeland, 1968; Barra et al.,
1983; Copeland & Fitzjarell, 1968; Cioffi, 1984; Towle, 1984; Gilles & Péqueux, 1985;
Towle & Kays, 1986; McConnell, 1987; Maina, 1990; Taylor & Taylor, 1992; Péqueux,
1995; Onken & Riestenpatt, 1998). Estas invaginações de membrana associadas a
mitocôndrias, denominadas "bombas mitocondriais", são características de epitélios
transportadores de íons (Copeland & Fitzjarrel, 1968; Cioffi, 1984; Towle, 1984;
McConnell, 1987; Péqueux, 1995; Onken & Riestenpatt, 1998).
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
25
Embora esteja bem estabelecida a importância adaptativa da (Na
+
,K
+
)-ATPase
branquial dos crustáceos osmorreguladores, existem poucos estudos relacionados com
sua caracterização bioquímica (Péqueux, 1995; Furriel et al., 2000). Dentro do gênero
Callinectes, algumas características cinéticas da (Na
+
,K
+
)-ATPase branquial foram
relatadas para C. sapidus (Neufeld et al., 1980; Savage & Robinson, 1983; Towle &
Holleland, 1987; Lucu, 1990; Towle, 1993; Piller et al., 1995), entretanto, para a enzima
do siri C. danae, apenas alguns dados cinéticos e estruturais foram relatados
recentemente (Masui et al., 2002, 2003, 2005a, b).
1.2.3 – Contribuições do projeto em relação ao tema em estudo.
O projeto (Na
+
,K
+
)-ATPase de microsoma de brânquias de crustáceos: um
marcador molecular para avaliar a adaptação a biótopos de diferentes salinidades
(Painel 5), começou a ser desenvolvido em 1997 com a caracterização bioquímica da
(Na
+
,K
+
)-ATPase do tecido branquial do camarão de água doce Macrobrachium
olfersii, e os resultados foram reunidos na tese de doutorado de Rosa P. M. Furriel,
intitulada “Caracterização Bioquímica da (Na
+
,K
+
)-ATPase da Fração Microsomal do
Tecido Branquial do Camarão de Água Doce Macrobrachium olfersii (Crustacea,
Decapoda)”. Esse estudo sistemático, usando ATP como substrato, mostrou que as
características cinéticas da enzima são consistentes com o modelo proposto para a
captura de íons Na
+
através do epitélio branquial deste animal em água doce e que, a
baixa afinidade aparente da enzima por Na
+
pode refletir a recente invasão desse
ambiente por este animal (Furriel et al., 2000). Ficou evidente também que, além da
(Na
+
,K
+
)-ATPase, está presente no tecido branquial de M. olfersii uma V-ATPase, que
corresponde à cerca de 18% da atividade ATPase total. Recentemente, baseados em
evidências moleculares e fisiológicas, outros autores confirmaram a presença desta V-
ATPase no tecido branquial de certos caranguejos (Towle & Weihrauch, 2001)
sugerindo que ela desempenharia um papel crucial para a captura de ions a partir do
meio externo nos crustáceos capazes de adaptar-se à água doce, o que é coerente com os
resultados encontrados por nós para M. olfersii. Entretanto, resultados recentes de nosso
laboratório mostraram que uma V-ATPase também está presente no tecido branquial do
camarão marinho Xiphopenaeus kroyeri, correspondendo a 18% da atividade ATPase
total da fração microsomal do tecido branquial deste animal (Rezende, 2006). Este fato
sugere que nos camarões, essa V-ATPase pode apresentar uma função distinta
aparentemente daquela proposta para os caranguejos.
Douglas Chodi Masui
26
Painel 5 – Representação do ambiente aquático e a distribuição de algumas
espécies de crustáceos aquáticos encontrados no estado de São Paulo.
O estudo comparativo-evolutivo entre o processo osmorregulatório nas diversas
espécies de crustáceos aquáticos e a participação da (Na
+
,K
+
)-ATPase do tecido
branquial de cada espécie está sendo realizado, a fim de estabelecer o papel dessa
enzima na adaptação desses animais a ambientes de diferentes salinidades. A seta
amarela indica a variação de salinidade do habitat aquático: do ambiente menos salino
(água doce) para o ambiente mais salino (mar).
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
27
Além dos resultados obtidos com o ATP, o substrato sintético p-nitrofenilfosfato
foi usado para caracterizar a atividade K
+
-fosfatase da (Na
+
,K
+
)-ATPase do tecido
branquial de M. olfersii (Furriel et al., 2001), demonstrando que ele pode ser usado em
estudos comparativos de osmorregulação apresentando uma excelente correlação com a
atividade ATPase da enzima.
Alguns resultados deste trabalho com C. danae já foram publicados por se tratar
de informações inéditas na literatura. Assim, foi mostrado pela primeira vez que a
enzima desse animal, ao contrário do que tem sido relatado para as (Na
+
,K
+
)-ATPases
dos invertebrados, apresenta um sítio de alta afinidade para o ATP, similarmente à
enzima dos mamíferos (Masui et al., 2002). Outro aspecto relevante e inédito na
literatura é que essa (Na
+
,K
+
)-ATPase é estimulada sinergisticamente pelos íons K
+
e
NH
4
+
(Masui et al., 2005b). Estudos posteriores mostraram que a enzima de M. olfersii
apresenta um comportamento similar (Furriel et al., 2004). Esta característica pode ter
um importante significado fisiológico do ponto de vista do processo de excreção de
amônio pelos crustáceos, que ocorre através das brânquias, e é coerente com o modelo
recentemente proposto por Weihrauch et al. (2001, 2002, 2004) para o caranguejo
estuarino Carcinus maenas. Masui et al. (2005b) propuseram um modelo hipotético
para a excreção ativa de amônia através das brânquias do siri eurialino Callinectes
danae baseado dos resultados obtidos na caracterização cinética da (Na
+
,K
+
)-ATPase
desse animal com as observações realizadas por Weihrauch et al. (2002). Neste modelo
(Painel 6), o processo de excreção ativa de amônia através das brânquias ocorre via
participação direta da (Na
+
,K
+
)-ATPase localizada na membrana basolateral das células
que compõem o tecido branquial. Existem evidências da presença de uma força extra-
bombeadora da (Na
+
,K
+
)-ATPase inibida por magnésio para a excreção de NH
4
+
está
representada por um segundo sítio de NH
4
+
, aparecendo quando a enzima está
completamente saturada por íons K
+
. Além disso, canais de K
+
sensíveis a Cs
+
localizados na membrana basolateral não distinguem entre os íons K
+
e NH
4
+
e acabam
contribuindo para entrada de NH
3
para dentro da célula. Conseqüentemente, a NH
3
citoplasmática é difundida para dentro das vesículas contendo uma bomba de prótons
(V-ATPase), o qual acidifica seu interior levando a formação de NH
4
+
. O íon NH
4
+
é
excretado para o espaço subcuticular via exocitose. Uma proteína tipo rhesus, um
suposto transportador de amônia de localização desconhecida pode sustentar o
mecanismo vesicular de captura ácida.
Douglas Chodi Masui
28
Painel 6 - Modelo hipotético para a excreção ativa de amônia através das
brânquias do siri eurialino Callinectes danae.
1 A principal força bombeadora para o transporte de íon NH
4
+
para fora da célula é a
(Na
+
,K
+
)-ATPase localizada na membrana basolateral. Em adição, uma forca extra-
bombeadora inibida por magnésio para a excreção de NH
4
+
está representada por um
segundo sítio de NH
4
+
, o qual aparece quando a bomba é completamente saturada por
íons K
+
. 2 Canais de K
+
sensíveis a Cs
+
localizados na membrana basolateral não
distinguem entre os íons K
+
e NH
4
+
. 3 Junção Septada. 4 Transportador
Na
+
/NH
4
+
(H
+
), particularmente ativo durante a excreção transcelular de NH
4
+
. 5
Presumivelmente, estruturas semelhantes a canais, sensíveis a amiloride e permeáveis a
cátions na cutícula permitem a difusão de NH
4
+
para o meio externo. h
A NH
3
citoplasmática é difundida para dentro das vesículas contendo uma bomba de
prótons (V-ATPase), o qual acidifica seu interior levando a formação de NH
4
+
. A NH
3
é
excretada para o espaço subcuticular via exocitose. i Uma proteína tipo rhesus, um
suposto transportador de amônia de localização desconhecida pode sustentar o
mecanismo vesicular de captura ácida. Modificado de Masui et al. (2005b).
Célula do epitélio
branquial
Hemolinfa
Água costeira diluída/
Sedimento marinho
NH
4
+
NH
4
+
/K
+
Cs
+
e
NH
3
Metabólica
H
+
+ NH
3
Na
+
NH
4
+
/K
+
ATP
ADP + Pi
NH
4
+
Mg
2+
c
Bombeamento
Extra
d
NH
3
f
Na
+
NH
4
+
/ H
+
NH
3
/ NH
4
+
Exocitose
NH
4
+
H
+
Captura
NH
4
+
Vesícula
Intracelular
NH
3
i
ATP
ADP + Pi
NH
3
+ H
+
NH
4
+
NH
3
h
i
g
Cutícula
[NH
4
+
]
[NH
4
+
]
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
29
A (Na
+
,K
+
)-ATPase também pode hidrolisar o p-nitrofenilfosfato (PNFF) sem
estar associado ao transporte de cátions ou fosforilação da enzima (Glynn, 1985;
Robinson & Pratap, 1991; Berberian & Beaugé, 1992). Interessantemente, o efeito
sinergístico observado entre os íons potássio e amônio, não foi observado para a
atividade K
+
-fosfatase da (Na
+
,K
+
)-ATPase de C. danae (Masui et al., 2003). A
explicação para o mecanismo de hidrólise do PNFF através da (Na
+
,K
+
)-ATPase é que
aparentemente, a forma E
2
é a principal conformação envolvida na hidrólise do PNFF,
que é estimulada por íons K
+
e inibida por íons Na
+
. O uso do substrato sintético PNFF
confere vantagens para os estudos cinéticos uma vez que a hidrólise desse substrato
pode ser facilmente determinada, além de apresentar menos complicações em estudos
mecanísticos. Entretanto, uma desvantagem do PNFF é a impossibilidade de
caracterizar a afinidade da enzima pelos íons Na
+
(Furriel et al., 2001, 2004; Masui et
al., 2003). Mais recentemente foram iniciados estudos de caracterização da (Na
+
,K
+
)-
ATPase expressa no tecido branquial de C. danae aclimatado por um período de 10 dias
a uma salinidade relativamente baixa (15‰) em relação àquela do seu habitat natural
(33‰). Estes estudos, realizados empregando o substrato sintético PNPP, mostraram
que a aclimatação a baixas salinidades estimula a expressão da subunidade α da enzima.
Além disso, estão presentes no tecido branquial dos animais aclimatados outras
ATPases, diferentes da (Na
+
,K
+
)-ATPase, em contraste com o observado anteriormente
para o caranguejo não aclimatado (Masui et al., 2004). Este fato pode ser relevante para
uma melhor compreensão das enzimas envolvidas na aclimatação dos crustáceos
eurialinos a baixas salinidades.
Atualmente diferentes espécies de crustáceos (ermitão, siris e camarões) estão
sendo estudadas comparativamente a fim de se tentar estabelecer um modelo para o
mecanismo de adaptação a ambientes de diferentes salinidades (Leone et al., 2005).
1.3 – Objetivos
1.3.1 – Objetivos gerais
O projeto tem como objetivo o estudo sistemático e comparativo das
propriedades estruturais e cinéticas da (Na
+
,K
+
)-ATPase do tecido branquial de
Callinectes danae aclimatado a uma salinidade de 15‰.
Douglas Chodi Masui
30
1.3.2 – Objetivos específicos
A fim de se obter informações que permitam contribuir para uma melhor
compreensão das adaptações fisiológicas e bioquímicas associadas à ocupação desses
diferentes ambientes foram realizados os seguintes estudos: 1) preparação da (Na
+
,K
+
)-
ATPase do tecido branquial de animais mantidos a salinidade de 15‰. 2) caracterização
cinética da atividade da enzima em relação aos ligantes ATP, sódio, potássio, magnésio
e amônio. 3) caracterização cinética da atividade da enzima em relação aos ligantes
PNFF, sódio, potássio, magnésio e amônio. 4) caracterização da existência de isoformas
da enzima através de imunoblotting.
Além disso, espera-se que esses estudos possam elucidar importantes aspectos
sobre a evolução, relação filogenética e a conquista do ambiente dulcícola/terrestre bem
como contribuir para o estabelecimento de um modelo dos mecanismos de regulação
osmótica, a longo prazo, que atuam nos crustáceos.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
31
2.0 – MATERIAIS E MÉTODOS
Tris, ATP (sal de Tris), p-nitrofenilfosfato (PNFF), ouabaína, ortovanadato de sódio,
ácido etacrínico, imidazol, ácido N-2-hidroxietilpiperazina-N’-etanolsulfônico (Hepes),
fosfoenolpiruvato (FEP), NAD
+
, NADH, piruvato quinase (PQ), lactato desidrogenase
(LDH), fosfoglicerato quinase (FGQ), gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAFDH),
3-fosfogliceraldeído dietil acetal e alameticina foram adquiridos da Sigma Chem. Co
(USA). Trietanolamina, ácido etilenodiamino tetracético (EDTA), dimetilsulfóxido
(DMSO) e ácido clorídrico foram adquiridos da Merck. Bafilomicina A
1
, tapsigargina,
oligomicina e os inibidores de protease (benzamidina 1 mM, antipaína 5 µM, leupeptina
5 µM
e pepstatina A 1 µM) foram adquiridos da Calbiochem. Todos os demais
reagentes empregados foram de grau analítico. O anticorpo monoclonal α-5 para
subunidade α da (Na
+
,K
+
)-ATPase foi obtido do Developmental Studies Hybridoma
Bank/University of Iowa, Department of Biological Sciences, Iowa City, IA 52242.
Todas as soluções foram preparadas utilizando-se água ultrapura apirogênica tratada em
equipamentos MilliRO e MilliQ (Millipore Co., USA).
2.1 - Coleta e aclimatação dos animais.
Os animais, de ambos os sexos, foram coletados na baía de Ubatuba (23°26’S,
45°02’W) e transportados para o laboratório em tanques contendo 100 L de água do
local da coleta, permanentemente aerada. Para a aclimatação, os animais permaneceram
durante um período de pelo menos 10 dias nos tanques, a 25°C, contendo água de
salinidade 15‰ e expostos a um fotoperíodo natural de luminosidade. A salinidade da
água dos tanques foi ajustada pela diluição da água do mar (33‰) com água deionizada
e monitorada periodicamente usando-se um refratômetro PZO-RL3 (Warszawa,
Poland). Os animais foram alimentados em dias alternados com pedaços de camarão.
2.2 - Dissecção das brânquias.
Para cada homogeneizado preparado, 2 a 5 animais foram anestesiados por
resfriamento em gelo picado, imediatamente antes da dissecção. A dissecção foi
realizada através de remoção completa da carapaça dorsal. As brânquias foram
dissecadas rapidamente, colocadas em 10 mL de tampão de homogeneização (tampão
imidazol 20 mM, pH 6,8, contendo sacarose 250 mM, EDTA 6 mM e um coquetel de
Douglas Chodi Masui
32
inibidores de proteases contendo benzamidina 1 mM, antipaína 5 µM, leupeptina 5 µM
e pepstatina A 1 µM) e mantidas em gelo picado.
2.3 - Preparação da fração microsomal do tecido branquial.
Após a retirada do excesso de tampão, as brânquias foram pesadas, rapidamente
cortadas em pequenos pedaços e homogeneizadas com o tampão de homogeneização
(20 mL do tampão/g de tecido úmido) em um homogeneizador Potter. O
homogeneizado foi centrifugado a 20000 g durante 35 min, a 4
o
C, em uma centrífuga
Sorval RC5C Plus. O sobrenadante foi mantido em gelo picado e o pellet, ressuspendido
em um volume de tampão de homogeneização igual aquele inicialmente empregado, e
finalmente submetido a nova centrifugação nas mesmas condições. Os sobrenadantes
resultantes das duas centrifugações foram misturados e a suspensão centrifugada a
100000 g durante 2 h, a 4
o
C. O pellet resultante (fração microsomal) foi ressuspendido
em tampão imidazol 20 mM, pH 6,8, contendo sacarose 250 mM (15 mL de tampão/g
de tecido úmido). Alíquotas de 0,5 mL foram congeladas em nitrogênio líquido ou
mistura gelo seco/acetona e armazenadas a -20
o
C. Não foram observadas perdas
significativas na atividade da enzima durante pelo menos 4 meses.
2.4 - Centrifugação em gradiente de densidade de sacarose.
Uma alíquota da fração microsomal contendo 900 µg de proteína foi aplicada a
um gradiente contínuo de sacarose de 10 a 50% (p/p) em tampão Imidazol 20 mM, pH
6,8. Após centrifugação a 180000 g em uma centrífuga Hitachi 55P-72 usando um rotor
vertical (PV50T2), durante 2 h, a 4°C, frações de 0,5 mL foram coletadas a partir do
fundo do tubo com o auxílio de uma bomba peristáltica sendo imediatamente analisadas
quanto a suas atividades ATPase e PNFFase totais e (Na
+
,K
+
)-ATPase, concentração
protéica e índice de refração.
2.5 – Eletroforese em condições desnaturantes e análise por Western blot.
A eletroforese em condições desnaturantes (SDS-PAGE) e a análise por Western
blot foram realizadas coforme descrito por Furriel et al. (2000). Após eletroforese, o gel
foi seccionado em duas partes: a primeira contendo aproximadamente 4 µg de proteína
foi revelada com nitrato de prata e a segunda parte do gel, contendo 45 µg de proteína
foi eletrotransferida para membrana de nitrocelulose usando o sistema Hoefer SE200. A
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
33
membrana de nitrocelulose foi incubada por 1 h, a 25ºC, com anticorpo monoclonal α-5
na diluição de 1:10. Após lavagem (3 vezes) em tampão Tris.HCl 50 mM, pH 8,0,
contendo NaCl 150 mM e Tween 20 0,1 %, a membrana foi incubada por 1 hora a 25ºC
com anticorpo antimouse IgG, conjugado com fosfatase alcalina diluído 1:7500. A
incorporação anticorpo específica foi revelada em Tris.HCl 100 mM, pH 9,5, contendo
NaCl 100 mM, MgCl
2
5 mM, NBT 0,2 mM e BCIP 0,8 mM. Os padrões de proteína
utilizados foram: miosina (200 KDa), β-galactosidase (116 KDa), fosforilase b (97
KDa), albumina bovina (66 KDa), ovoalbumina (45 KDa) e anidrase carbônica (29
KDa).
2.6 – Determinação da atividade ATPase da fração microsomal.
A atividade ATPase foi determinada continuamente, a 25
o
C, empregando-se o
sistema de associação piruvato quinase/lactato desidrogenase (PQ/LDH), onde a
hidrólise do ATP é acoplada a oxidação do NADH (Masui et al., 2003).
Piruvato quinase
Lactato desidrogenase
ADP
ATP
N
ADH
AD
+
Fosfoenolpiruvato
Piruvato
Lactato
A oxidação do NADH foi acompanhada a 340 nm (ε
340nm, pH 7,5
= 6200 M
-1
cm
-1
),
em um espectrofotômetro Hitachi U-3000 equipado com células termostatizadas. As
condições padrão dos ensaios foram: tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo ATP 2
mM, MgCl
2
5 mM, KCl 10 mM, NaCl 100 mM, NADH 0,14 mM, FEP 2 mM, 49 U de
PQ e 94 U de LDH, em um volume final de 1 mL. A atividade também foi determinada
nas mesmas condições na presença de ouabaína 3 mM. A diferença entre os valores
obtidos para a atividade ATPase na ausência e na presença de ouabaína representa a
atividade da (Na
+
,K
+
)-ATPase.
A atividade enzimática também foi medida continuamente, a 25
o
C, utilizando o
sistema de associação gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase/fosfoglicerato quinase
(GAFDH/FGQ), onde a hidrólise do ATP é acoplada à redução do NAD
+
.
ADP
ATP
N
ADH
N
AD
+
Gliceraldeído-3-P-
Fosfogliceratoquinase
desidrogenase
Gliceraldeído-3P + Pi Glicerato-1,3-PP Glicerato-3-P
Douglas Chodi Masui
34
A formação do NADH foi acompanhada a 340 nm (ε
340nm, pH 7,5
= 6200 M
-1
cm
-1
).
As condições padrão dos ensaios foram: tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo ATP
2 mM, MgCl
2
5 mM, e KCl 10 mM, NaCl 100 mM, NAD
+
1 mM, gliceraldeído-3-
fosfato 1mM, fosfato de sódio 0,5 mM, 12 U de GAFDH e 9 U de FGQ em um volume
final de 1 mL. A atividade também foi determinada nas mesmas condições na presença
de ouabaína 3 mM. A diferença entre os valores obtidos para a atividade ATPase na
ausência e na presença de ouabaína representa a atividade da (Na
+
,K
+
)-ATPase.
A reação sempre foi iniciada pela adição de enzima ao meio de reação e
controles sem adição de enzima foram empregados com a finalidade de se determinar a
hidrólise espontânea do substrato nas condições dos ensaios. Uma unidade (U) de
enzima foi definida como a quantidade de enzima que hidrolisa 1,0 nmol de substrato
por minuto, em condições padrões. Todos os experimentos foram realizados em
duplicata usando-se três diferentes homogeneizados de brânquias (N= 3). As figuras
apresentadas correspondem à curvas representativas de um dos homogeneizados de
brânquias. A atividade ATPase também foi medida após 10 min de pré-incubação da
preparação com alameticina (1 mg/mg de proteína), a 25
o
C (Bonnafous et al., 1982).
Este ensaio foi realizado com o objetivo de verificar se na fração microsomal existem
vesículas seladas.
2.7 –Determinação da atividade p-nitrofenilfosfatase da fração microsomal.
A hidrólise do p-nitrofenilfosfato (PNFF) foi determinada continuamente, a
25
o
C, acompanhando-se a liberação do íon p-nitrofenolato (ε
410nm, pH 7,5
=13160 M
-1
cm
-1
)
em um espectrofotômetro Hitachi U-3000 equipado com células termostatizadas (Masui
et al., 2003). As condições padrão foram: tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo
PNFF 10 mM, MgCl
2
10 mM e KCl 15 mM em um volume final de 1 mL. A atividade
também foi determinada nas mesmas condições na presença de ouabaína 3 mM. A
diferença entre os valores obtidos para a atividade PNFFase na ausência e na presença
de ouabaína representa a atividade da K
+
-fosfatase. Todos os experimentos foram
realizados em duplicata usando-se três diferentes homogeneizados de brânquias (N= 3).
As figuras apresentadas correspondem à curvas representativas de um dos
homogeneizados de brânquias. A atividade PNFFase também foi medida após 10 min
de pré-incubação da preparação com alameticina (1 mg/mg de proteína), a 25
o
C
(Bonnafous et al., 1982). Este ensaio foi realizado com o objetivo de verificar se na
fração microsomal existem vesículas seladas
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
35
2.8 – Tratamento dos sistemas de associação PQ/LDH e FGQ/GAFDH.
Suspensões cristalinas de LDH e PQ em sulfato de amônio foram centrifugadas
a 14000 rpm, a 4
o
C, por 15 min, numa centrífuga refrigerada Eppendorf modelo 5810.
O pellet foi ressuspendido em 500 µL de tampão Hepes 50 mM pH 7,5, e transferidos
para filtros micrones Microcon-Amicon YM-10 e lavados 5 vezes com o mesmo tampão
a 10.000 rpm a 4
o
C para completa eliminação dos íons amônio (testado com reagente de
Nessler). Finalmente, o pellet foi ressuspendido no seu volume original. Para o sistema
de associação FGQ/GAFDH, a suspensão foi tratada conforme descrito acima utilizando
a solução tampão trietanolamina 50 mM pH 7,5 contendo ditiotreitol 1 mM.
2.9 –Preparação da solução de gliceraldeído 3-fosfato.
O gliceraldeído 3-fosfato foi preparado a partir do 3-fosfogliceraldeído dietil
acetal, sal de bário (12,5 mg/mL), tratado inicialmente com 150 µL de HCl concentrado
(d= 1,18 g/mL) em banho fervente durante 2 min. Em seguida, o pH da solução foi
acertado em 6,0 empregando trietanolamina (d= 1,12 g/mL). A solução resultante foi
tratada com resina trocadora de íons Biorad AG50W-X8, e após centrifugação a 5000g
o pH do sobrenadante foi ajustado em 7,5 com trietanolamina.
2.10 –Preparação da solução de ortovanadato.
A solução estoque de ortovanadato de sódio foi preparada de acordo com
Gordon (1991). Alíquotas de 1 mL foram congeladas em frascos plásticos e
descongeladas no momento do uso.
2.11 – Preparação da solução de Oligomicina.
A solução estoque de oligomicina (100 µg/mL) foi preparada através de
dissolução em etanol. A solução resultante foi estocada a -20º C em frascos plásticos e
descongeladas no momento do uso.
2.12 - Preparação da solução de Bafilomicina A
1
.
Uma solução estoque de bafilomicina (20,07 µM) foi preparada através de
dissolução de 10 µg do inibidor em 0,8 mL de DMSO. A solução resultante foi
aliquotada e estocada a -20º C em frascos plásticos e descongeladas no momento do
uso.
Douglas Chodi Masui
36
2.13 - Preparação da solução de Tapsigargina.
A solução estoque de tapsigargina (2,0 mM) foi preparada através de dissolução
de 1,0 mg do inibidor em 0,75 mL de DMSO. A solução resultante foi aliquotada e
estocada a -20º C em frascos plásticos e descongeladas no momento do uso.
2.14 - Dosagem de proteína.
A concentração de proteína foi determinada através do procedimento descrito
por Read & Northcote (1981), usando soroalbumina bovina como padrão.
2.15 - Tratamento dos dados cinéticos.
Os parâmetros cinéticos V (velocidade máxima), K
M
(constante de Michaelis-
Menten), K
0,5
(constante de dissociação aparente) e n
H
(coeficiente de Hill) foram
calculados empregando-se o software SigrafW (Leone et al., 2005a). As constantes de
dissociação do complexo enzima-inibidor (K
I
) foram determinadas graficamente de
acordo com Dixon (1953). Os valores dos parâmetros cinéticos mostrados nas tabelas
representam a média ± desvio padrão e foram calculados a partir de dados de três
preparações diferentes (N= 3). As curvas apresentadas são aquelas onde se obteve o
melhor ajuste dos dados e cada figura é uma curva representativa de uma preparação
microsomal de brânquias.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
37
3.0 – RESULTADOS
3.1 – Estudo da fração microsomal.
Os microsomas obtidos dos pares de brânquias posteriores do siri eurialino
Callinectes danae aclimatado à salinidade de 15‰ mostraram uma atividade ATPase
total de aproximadamente 319,78 ± 17,68 U/mg. Para a atividade PNFFase total esse
valor foi cerca de 2,4 vezes menor (131,8 ± 75,7 U/mg). A atividade ATPase residual ao
redor de 10% (29,99 ± 1,77 U/mg) determinada em presença de ouabaína 3,0 mM,
sugere que aproximadamente 90% da atividade medida (289,79 ± 16,02 U/mg)
corresponde à (Na
+
,K
+
)-ATPase. Os 10% restantes, representando a diferença entre as
atividades ATPase total e ATPase insensível à ouabaína, sugerem a presença de outras
ATPases. A análise da atividade PNFFase da preparação de membrana na presença de
ouabaína 3,0 mM mostrou uma atividade residual de 32,97 ± 1,4 U/mg, mostrando que
a atividade K
+
-fosfatase da (Na
+
,K
+
)-ATPase corresponde a aproximadamente 75% da
atividade PNFFase total medida, sugerindo a presença de outras fosfatases na fração
microsomal de tecido branquial de C. danae.
A análise da atividade ATPase da fração microsomal de animais aclimatados à
salinidade de 15 ‰, por centrifugação em gradiente contínuo de sacarose (10 a 50%),
revelou a presença de um único pico protéico, coincidente com as atividades (Na
+
,K
+
)-
ATPase e ATPase insensível à ouabaína (Figura 1). A inibição parcial da atividade
ATPase total por ouabaína indica de fato que além da (Na
+
,K
+
)-ATPase estão presentes
outras ATPases.
Na Figura 2, está mostrado o resultado da centrifugação em gradiente contínuo
de sacarose (10 a 50%) da fração microsomal de animais aclimatados a 15 ‰. Em
condições saturantes de PNFF e de íons Mg
2+
e K
+
, a atividade PNFFase da enzima
revelou também a presença de um único pico de proteína com atividade fosfatase total
da ordem de 17,8 ± 0,89 U/mL. A inibição pela ouabaína sugere fortemente que este
pico corresponde a atividade K
+
-fosfatase da enzima. Além disso, a presença de uma
atividade PNFFase insensível a ouabaína sugere a presença de fosfatases contaminantes
na preparação.
Douglas Chodi Masui
38
Figura 1 – Centrifugação em gradiente contínuo de sacarose de 10 a 50% da
fração microsomal de tecido branquial de Callinectes danae.
A fração microsomal (0,9 mg de proteína) foi aplicada a um gradiente contínuo
de sacarose de 10 a 50% (p/p), em tampão Imidazol 20 mM, pH 6,8. Após centrifugação
a 180000g durante 2 h, a 4ºC, frações de 0,5 mL foram coletadas a partir do fundo do
tubo e analisadas em relação à atividade ATPase total (); atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase
(); atividade ATPase insensível à ouabaína (); concentração de proteína () e
concentração de sacarose (U). A atividade da enzima foi medida continuamente a 25ºC,
em tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo MgCl
2
5 mM, NaCl 100 mM, KCl 10 mM,
NADH 0,14 mM, FEP 2 mM, 49 U PQ e 94 U LDH, num volume final de 1,0 mL. Os
experimentos foram realizados em duplicata usando-se três diferentes homogeneizados
de brânquias (N= 3). A figura apresentada corresponde a uma curva representativa de
um dos homogeneizados de brânquias.
0 10203040506070
10
20
30
40
U/mL
Tubo
10
20
30
40
50
% Sacarose (p/p)
150
300
450
600
[Proteína] (µg/mL)
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
39
Figura 2 – Centrifugação em gradiente contínuo de sacarose de 10 a 50% da
fração microsomal de tecido branquial de Callinectes danae.
A fração microsomal (0,9 mg de proteína) foi aplicada a um gradiente contínuo
de sacarose de 10 a 50% (p/p), em tampão Imidazol 20 mM, pH 6,8. Após centrifugação
a 180000g durante 2 h, a 4ºC, frações de 0,5 mL foram coletadas a partir do fundo do
tubo e analisadas em relação à atividade PNFFase total (); atividade K
+
-fosfatase
(); atividade insensível à ouabaína (U); concentração de proteína () e concentração
de sacarose (). A atividade de cada alíquota foi medida continuamente a 25ºC, em
tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo PNFF 10 mM, MgCl
2
10 mM e KCl 15 mM,
num volume final de 1,0 mL. Os experimentos foram realizados em duplicata usando-se
três diferentes homogeneizados de brânquias (N=3). A figura apresentada corresponde a
uma curva representativa de um dos homogeneizados de brânquias.
0 1020304050
10
20
30
40
50
4
8
12
5
10
15
Sacarose (%)
Tubo
[Proteína] mg/mL
U/mL
Douglas Chodi Masui
40
Figura 3 – Eletroforese em gel de poliacrilamida sob condições desnaturantes
(SDS-PAGE) e Western blot de frações microsomais do tecido branquial de
Callinectes danae.
A eletroforese foi realizada em gradiente de gel de poliacrilamida (5% a 20%)
usando 4 µg de proteína para revelação com nitrato de prata e 45 µg de proteína para
eletrotransferência em papel de nitrocelulose. Após a corrida, metade do gel foi corada
com nitrato de prata e a outra submetida a eletrotransferência para membrana de
nitrocelulose. A membrana de nitrocelulose foi incubada com o anticorpo monoclonal
alfa-5 (diluição 1:10) durante 1h, a 25
o
C, e com o anticorpo secundário anti IgG de
camundongo, acoplado a fosfatase alcalina (diluição 1:7500) durante 1h, a 25
o
C. A-
coloração com nitrato de prata. B- Western blot de animais. 1) Recém-coletados. 2)
aclimatados a 15 ‰. 3) aclimatados a 33 ‰.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
41
A Figura 3 mostra a eletroforese em gel de poliacrilamida em condições
desnaturantes (Figura 3A) e o Western blot (Figura 3B) das frações microsomais de
brânquias de C. danae obtidas a partir de animais recém-coletados em salinidade de 33
‰ (não aclimatados) e aclimatados a salinidades de 15 e 33‰ por um período de 10
dias. Além de pequenas diferenças nos padrões eletroforéticos, observa-se um aumento
significativo da proporção relativa da subunidade α da (Na
+
,K
+
)-ATPase em relação à
proteína total na fração microsomal do tecido branquial de animais aclimatados à
salinidade de 15‰ quando comparados aos animais aclimatados a 33‰. Entretanto,
proporções similares de subunidade α foram observadas no tecido branquial de animais
recém-coletados a salinidade de 33‰ e aclimatados a 15‰.
Douglas Chodi Masui
42
3.2 – Caracterização da atividade ATPase da (Na
+
,K
+
)-ATPase
O efeito da concentração de ATP sobre a atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase
microsomal de brânquias de C. danae aclimatado à salinidade de 15‰ está apresentado
na Figura 4. A estimulação da atividade da enzima pelo ATP, em condições saturantes
de Mg
2+
, Na
+
e K
+
, ocorre através de uma curva de saturação monofásica apresentando
interações sítio-sítio (n
H
= 1,2). Concentrações de ATP variando de 10
-5
a 5.10
-3
M
estimularam a atividade da enzima até valores da ordem de 298,8 ± 16,7 U/mg, e com
K
0,5
de 174,2 ± 9,8 µM. Nesse caso, a atividade basal foi da ordem de 12,9 ± 0,7 U/mg.
A atividade ATPase insensível à ouabaína também foi estimulada pelo substrato na
mesma faixa de concentrações (inserção da Figura 4), indicando a presença de ATPases
diferentes da (Na
+
,K
+
)-ATPase na preparação, em perfeita concordância com o
resultado da análise em gradiente de sacarose (ver Figura 1).
A Figura 5 mostra o efeito da concentração dos íons Mg
2+
sobre a atividade
(Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de tecido branquial de C. danae aclimatado à
salinidade de 15‰. Na presença de ATP e de íons Na
+
e K
+
em concentrações
saturantes, os íons Mg
2+
estimularam a atividade da enzima numa faixa de
concentrações entre 10
-4
M e 10
-3
M, com V= 299,2 ± 14,1 U/mg e K
0,5
= 767,3 ± 36,1
µM. A estimulação ocorreu através de uma simples curva de saturação, que obedece a
uma cinética cooperativa (n
H
= 1,8). Concentrações de Mg
2+
acima de 7 mM inibiram a
atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase (resultado não mostrado). É importante destacar que a
atividade insensível à ouabaína também foi estimulada 9,4 % por íons Mg
2+
, na mesma
faixa de concentrações (inserção da Figura 5).
A modulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase branquial de C. danae aclimatado à
salinidade de 15‰ por íons Na
+
está mostrada na Figura 6. Em condições saturantes de
íons Mg
2+
e K
+
e de ATP, a estimulação da atividade da enzima ocorreu através de uma
simples curva de saturação, sendo observados efeitos cooperativos (n
H
= 1,4). A
atividade específica determinada foi de 308,9 ± 15,7 U/mg, com uma constante de
afinidade aparente para os íons Na
+
de K
0,5
= 7,8 ± 0,4 mM. Interessantemente, a
atividade insensível à ouabaína não foi estimulada por íons Na
+
, mantendo-se constante
em torno de 20,8 ± 0,9 U/mg (inserção da Figura 6), o que aparentemente descarta a
presença de Na
+
-ATPases na preparação microsomal de brânquias de C. danae.
O efeito da concentração dos íons potássio sobre a atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase
branquial de C. danae aclimatado à salinidade de 15‰ está representado na Figura 7.
Na presença de concentrações saturantes de ATP e de íons Mg
2+
e Na
+
, o íon K
+
estimu-
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
43
Figura 4 – Modulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de
tecido branquial de Callinectes danae pelo ATP em animais aclimatados a
salinidade de 15‰.
A atividade da enzima foi medida continuamente a 25ºC, em tampão Hepes 50
mM, pH 7,5, contendo MgCl
2
5 mM, NaCl 100mM, KCl 10 mM, NADH 0,14 mM,
FEP 2 mM, 49 U PQ e 94 U LDH. A reação foi iniciada pela adição de 17,4 µg de
proteína, conforme descrito em Materiais e Métodos. Os experimentos foram realizados
em duplicata usando-se três diferentes homogeneizados de brânquias (N= 3). A figura
apresentada corresponde a uma curva representativa de um dos homogeneizados de
brânquias. Inserção: atividade ATPase total () e insensível à ouabaína ().
100
200
300
4
35
U/mg
-Log [ATP] (M)
100
200
300
54
3
6
U/mg
-Log [ATP] (M)
Douglas Chodi Masui
44
Figura 5 – Modulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de
tecido branquial de Callinectes danae pelos íons magnésio em animais aclimatados
a salinidade de 15‰.
A atividade da enzima foi medida continuamente a 25ºC, em tampão Hepes 50
mM, pH 7,5, contendo ATP
2 mM, NaCl 100mM, KCl 10 mM, NADH 0,14 mM, FEP 2
mM, 49 U PQ e 94 U LDH. A reação foi iniciada pela adição de 17,4 µg de proteína,
conforme descrito em Materiais e Métodos. Os experimentos foram realizados em
duplicata usando-se três diferentes homogeneizados de brânquias (N= 3). A figura
apresentada corresponde a uma curva representativa de um dos homogeneizados de
brânquias. Inserção: atividade ATPase total () e insensível à ouabaína ().
100
200
300
4
3
5
U/mg
-Log [MgCl
2
] (M)
100
200
300
4
35
U/mg
-Log [MgCl
2
] (M)
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
45
Figura 6 – Modulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de
tecido branquial de Callinectes danae pelos íons sódio em animais aclimatados a
salinidade de 15‰.
A atividade da enzima foi medida continuamente a 25ºC, em tampão Hepes 50
mM, pH 7,5, contendo ATP
2 mM, MgCl
2
5 mM, KCl 10 mM, NADH 0,14 mM, FEP 2
mM, 49 U PQ e 94 U LDH. A reação foi iniciada pela adição de 17,4 µg de proteína,
conforme descrito em Materiais e Métodos. Os experimentos foram realizados em
duplicata usando-se três diferentes homogeneizados de brânquias (N= 3). A figura
apresentada corresponde a uma curva representativa de um dos homogeneizados de
brânquias. Inserção: atividade ATPase total () e insensível à ouabaína ().
100
200
300
213
U/mg
-Log [NaCl] (M)
100
200
300
2
1
3
U/mg
-Log [NaCl] (M)
Douglas Chodi Masui
46
lou a atividade da enzima através de interações sítio-sítio (n
H
= 1,6) através de uma
simples curva de saturação até valores da ordem de 300,6 ± 15,3 U/mg, com K
0,5
= 1,6 ±
0,08 mM. Ao contrário dos íons Na
+
, os íons K
+
estimularam 9,8 % a atividade ATPase
insensível à ouabaína no intervalo de concentração entre 1 e 10 mM (inserção da Figura
7), sugerindo portanto a presença de atividade de K
+
-ATPases contaminantes.
A modulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal do tecido
branquial de C. danae aclimatado à salinidade de 15‰ pelos íons NH
4
+
na presença de
concentrações saturantes de ATP e de íons Mg
2+
e Na
+
é mostrada na Figura 8. A
estimulação ocorreu através de uma curva de saturação monofásica apresentando efeitos
cooperativos (n
H
= 1,3), com valores máximos de atividade específica de 345,1 ± 19,0
U/mg, e valor de K
0,5
= 6,0 ± 0,3 mM. A atividade insensível à ouabaína não foi
estimulada pelos íons NH
4
+
, e a atividade específica permaneceu constante, em torno de
8,64 ± 0,47 U/mg em toda a faixa de concentrações estudada.
Na Tabela 1 estão resumidos os parâmetros cinéticos obtidos para a estimulação
da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal do tecido branquial de C. danae
aclimatado a salinidade de 15 ‰ por ATP e pelos íons Mg
2+
e Na
+
.
Tabela 1 - Parâmetros cinéticos obtidos para a estimulação da atividade (Na
+
,K
+
)-
ATPase da fração microsomal de tecido branquial de C. danae aclimatado à
salinidade de 15‰ por ATP e íons magnésio, sódio, potássio e amônio.
A atividade da enzima foi medida usando 17,4 µg de proteína em tampão Hepes 50
mM, pH 7,5, num volume final de 1,0 mL. Os dados representam a média ± desvio
padrão e foram calculados usando-se três preparações diferentes (N= 3).
Efetor V (U/mg) K
0,5
n
H
ATP 298,8 ± 16,7
174,2 ± 9,8 µM
1,2
Mg
2+
299,2 ±14,0
767,3 ±36,1 µM
1,8
Na
+
308,9 ± 15,7 7,8 ± 0,4 mM 1,4
K
+
300,6 ± 15,3 1,6 ± 0,08 mM 1,6
NH
4
+
345,1 ± 19,0 6,0 ± 0,3 mM 1,3
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
47
Figura 7 – Modulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de
tecido branquial de Callinectes danae pelos íons potássio em animais aclimatados a
salinidade de 15‰.
A atividade da enzima foi medida continuamente a 25ºC, em tampão
trietanolamina 50 mM, pH 7,5, contendo ATP
2 mM, MgCl
2
5mM, NaCl 100mM,
NAD
+
1 mM, fosfato de sódio 0,5 mM, gliceraldeído-3-fosfato 1 mM, 12 U GAFDH e
9 U FGQ. A reação foi iniciada pela adição de 17,4 µg de proteína, conforme descrito
em Materiais e Métodos. Os experimentos foram realizados em duplicata usando-se três
diferentes homogeneizados de brânquias (N= 3). A figura apresentada corresponde a
uma curva representativa de um dos homogeneizados de brânquias. Inserção: atividade
ATPase total () e insensível à ouabaína ().
100
200
300
3
2
4
U/mg
-Log [KCl] (M)
100
200
300
3
2
4
U/mg
-Log [KCl] (M)
Douglas Chodi Masui
48
Figura 8 – Modulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de
tecido branquial de Callinectes danae pelos íons amônio em animais aclimatados a
salinidade de 15‰.
A atividade da enzima foi medida continuamente a 25ºC, em tampão
trietanolamina 50 mM, pH 7,5, contendo ATP
2 mM, MgCl
2
5mM, NaCl 100mM,
NAD
+
1 mM, fosfato de sódio 0,5 mM, gliceraldeído-3-fosfato 1 mM, 12 U GAFDH e
9 U FGQ. A reação foi iniciada pela adição de 17,4 µg de proteína, conforme descrito
em Materiais e Métodos. Os experimentos foram realizados em duplicata usando-se três
diferentes homogeneizados de brânquias (N= 3). A figura apresentada corresponde a
uma curva representativa de um dos homogeneizados de brânquias. Inserção: atividade
ATPase total () e insensível à ouabaína ().
100
200
300
324
U/mg
-Log [NH
4
Cl] (M)
100
200
300
2
3
4
U/mg
-Log [NH
4
Cl] (M)
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
49
Na Figura 9 é mostrada a estimulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase dos
microsomas de tecido branquial de C. danae aclimatado à salinidade de 15‰ por íons
K
+
em presença de íons NH
4
+
. Na presença de concentrações saturantes de íons Na
+
e
Mg
2+
e de ATP, e na presença de íons NH
4
+
(0 a 50 mM), o aumento da concentração
dos íons K
+
estimulou a atividade da enzima em até 44%. A estimulação da atividade
pelo íon K
+
, modulada pela presença de íons NH
4
+
ocorreu através de curvas de
saturação monofásicas, tendo sido observados efeitos cooperativos (Figura 9). É
interessante notar que a atividade da enzima foi modulada sinergisticamente pelos íons
K
+
na presença de diferentes concentrações fixas de íons NH
4
+
e que a atividade
específica aumentou de 300,6 ± 15,3 U/mg para 514,6 ± 26,2 U/mg (Figura 9). Além
disso, foi observado um significativo aumento na afinidade aparente da enzima pelo íon
K
+
da ordem de 10 vezes (diminuiu de 1,6 ± 0,08 mM para 0,157 ± 0,008 mM) (Figura
10). As atividades ouabaína insensíveis não foram estimuladas por íons NH
4
+
(resultados não mostrados). Concentrações crescentes do cloreto de colina até 50 mM
não exerceram nenhum efeito estimulatório sobre a atividade da enzima, o que descarta
a possibilidade da estimulação da atividade da enzima por íon K
+
em presença de
concentrações fixas de íons NH
4
+
ser devida a efeitos de força iônica (resultados não
mostrados).
O efeito de concentrações crescentes de íons NH
4
+
sobre a atividade (Na
+
,K
+
)-
ATPase dos microsomas de tecido branquial de C. danae aclimatado a 15‰ de
salinidade na presença de íons K
+
é mostrado na Figura 11. Similarmente ao observado
para os íons K
+
, observa-se uma estimulação da atividade da enzima pelo íon NH
4
+
mesmo em condições saturantes de ATP e de íons Mg
2+
, Na
+
com a utilização de
diferentes concentrações de íons K
+
. A estimulação da atividade da enzima pelo íon
NH
4
+
também ocorreu através de curvas de saturação monofásicas bem como foram
observadas interações cooperativas entre os sítios. Embora tenha sido observado um
aumento da atividade específica da enzima de 345,1 ± 19,0 U/mg para 516,8 ± 27,9
U/mg, não foram observadas variações significativas nos valores de n
H
e K
0,5
com o
aumento da concentração de íons K
+
(Figura 12). Não foram observados efeitos
estimulatórios do íon NH
4
+
sobre a atividade insensível à ouabaína. Além disso, a
utilização de cloreto de colina em substituição aos íons NH
4
+
descartam a possibilidade
da estimulação da enzima ser resultante de efeitos da força iônica (dados não
mostrados).
Douglas Chodi Masui
50
Figura 9 – Modulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de
tecido branquial de Callinectes danae pelos íons potássio na presença de íons
amônio em animais aclimatados a salinidade de 15‰.
A atividade da enzima foi medida continuamente a 25ºC, em tampão
trietanolamina 50 mM, pH 7,5, contendo ATP
2 mM, MgCl
2
5mM, NaCl 100mM,
NAD
+
1 mM, fosfato de sódio 0,5 mM, gliceraldeído-3-fosfato 1 mM, 12 U GAFDH e
9 U FGQ. A reação foi iniciada pela adição de 17,4 µg de proteína, conforme descrito
em Materiais e Métodos. Os experimentos foram realizados em duplicata usando-se três
diferentes homogeneizados de brânquias (N= 3). A figura apresentada corresponde a
uma curva representativa de um dos homogeneizados de brânquias. Concentrações de
NH
4
Cl empregadas: 0 mM (), 5 mM (), 10 mM (S), 30 mM () e 50 mM ().
100
200
300
400
500
4
3
2
5
U/mg
-Log [KCl](M)
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
51
Figura 10 – Variação dos parâmetros cinéticos para a modulação da atividade
(Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de tecido branquial de Callinectes danae
pelos íons potássio na presença de íons amônio em animais aclimatados a
salinidade de 15‰.
A atividade da enzima foi medida continuamente a 25ºC, em tampão
trietanolamina 50 mM, pH 7,5, contendo ATP
2 mM, MgCl
2
5 mM, NaCl 100 mM,
NAD
+
1 mM, fosfato de sódio 0,5 mM, gliceraldeído-3-fosfato 1 mM, 12 U GAFDH, 9
U FGQ e de concentrações fixas de íons amônio. A reação foi iniciada pela adição de
17,4 µg de proteína, conforme descrito em Materiais e Métodos. Todos parâmetros
cinéticos foram obtidos de experimentos realizados em duplicata usando-se três
diferentes homogeneizados de brânquias (N= 3). Os dados correspondem a uma curva
representativa de um dos homogeneizados de brânquias.
1
2
0,4
0,8
1,2
1,6
0 1020304050
200
400
600
n
H
K
0,5
(mM)
U/mg
[NH
4
Cl] (mM)
Douglas Chodi Masui
52
Figura 11 – Modulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de
tecido branquial de Callinectes danae pelos íons amônio na presença de íons
potássio em animais aclimatados a salinidade de 15‰.
A atividade da enzima foi medida continuamente a 25ºC, em tampão
trietanolamina 50 mM, pH 7,5, contendo ATP
2 mM, MgCl
2
5mM, NaCl 100mM,
NAD
+
1 mM, fosfato de sódio 0,5 mM, gliceraldeído-3-fosfato 1 mM, 12 U GAFDH e
9 U FGQ. A reação foi iniciada pela adição de 17,4 µg de proteína, conforme descrito
em Materiais e Métodos. Os experimentos foram realizados em duplicata usando-se três
diferentes homogeneizados de brânquias (N= 3). A figura apresentada corresponde a
uma curva representativa de um dos homogeneizados de brânquias. Concentrações de
KCl empregadas: 0 mM (), 2 mM (), 3 mM (S), 5 mM () e 10 mM ().
100
200
300
400
500
32
4
U/mg
-Log [NH
4
Cl] (M)
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
53
Figura 12 – Variação dos parâmetros cinéticos para a modulação da atividade
(Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de tecido branquial de Callinectes danae
pelos íons amônio na presença de íons potássio em animais aclimatados a
salinidade de 15‰.
A atividade da enzima foi medida continuamente a 25ºC, em tampão
trietanolamina 50 mM, pH 7,5, contendo ATP
2 mM, MgCl
2
5mM, NaCl 100mM,
NAD
+
1 mM, fosfato de sódio 0,5 mM, gliceraldeído-3-fosfato 1 mM, 12 U GAFDH, 9
U FGQ e de concentrações fixas de íons potássio. A reação foi iniciada pela adição de
17,4 µg de proteína, conforme descrito em Materiais e Métodos. Todos parâmetros
cinéticos foram obtidos de experimentos realizados em duplicata usando-se três
diferentes homogeneizados de brânquias (N= 3). Os dados correspondem a uma curva
representativa de um dos homogeneizados de brânquias.
1
2
5
10
0246810
200
400
600
n
H
K
0,5
(mM)
U/mg
[KCl] (mM)
Douglas Chodi Masui
54
Os parâmetros cinéticos obtidos para a estimulação da atividade (Na
+
,K
+
)-
ATPase da fração microsomal do tecido branquial de C. danae aclimatado a salinidade
de 15 ‰ pelos íons K
+
e NH
4
+
estão reunidos na Tabela 2.
Tabela 2 - Parâmetros cinéticos obtidos para a estimulação da atividade (Na
+
,K
+
)-
ATPase da fração microsomal de tecido branquial de C. danae aclimatado à
salinidade de 15‰ por íons potássio e amônio.
A atividade da enzima foi medida usando 17,4 µg de proteína em tampão
trietanolamina 50 mM, pH 7,5, contendo ATP 2 mM, MgCl
2
100 mM, NaCl 100 mM,
num volume final de 1,0 mL. Os dados representam a média ± desvio padrão e foram
calculados usando-se três preparações diferentes (N= 3).
[KCl] (mM) [NH
4
Cl] (mM) V (U/mg) K
0,5
(mM) n
H
Variável 0 300,6 ± 15,3 1,6 ± 0,1 1,7
Variável 5 398,7 ± 19,1 1,7 ± 0,1 1,5
Variável 10 426,7 ± 21,2 0,469 ± 0,023 1,3
Variável 30 480,9 ± 22,9 0,355 ± 0,017 2,0
Variável 50
514,6 ± 26,2 0,157 ± 0,008
1,1
0 Variável 345,1 ± 19,0 6,0 ± 0,3 1,3
2 Variável 384,5 ± 18,3 7,6 ± 0,36 1,5
3 Variável 448,9 ± 22,3 9,6 ± 0,5 1,7
5 Variável 496,9 ± 24,7 7,2 ± 0,4 1,3
10 Variável
516,8 ± 27,9 6,4 ±0,3
1,4
A Figura 13 mostra o efeito da concentração de ouabaína sobre a atividade
ATPase total da fração microsomal do tecido branquial de C. danae aclimatado à
salinidade de 15 ‰. Concentrações de ouabaína da ordem de 3 mM inibiram cerca de
90% da atividade ATPase. O padrão de inibição corresponde ao modelo de um único
sítio de ligação do inibidor à enzima e o valor de K
I
, estimado graficamente, foi de 45,1
± 2,5 µM (inserção da Figura 13). Na presença de 50 mM de íons NH
4
+
, o valor de K
I
foi de 22,7 ± 1,1 µM (dados não mostrados).
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
55
Figura 13 – Efeito da concentração de ouabaína na atividade ATPase da (Na
+
,K
+
)-
ATPase da fração microsomal de tecido branquial de Callinectes danae aclimatado
a salinidade de 15‰.
A atividade da enzima foi determinada continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes
50 mM, pH 7,5, contendo ATP 2 mM, MgCl
2
5 mM, NaCl 100 mM, KCl 10 mM,
NADH 0,14 mM, FEP 2 mM, 49 U PQ e 94 U LDH. A reação foi iniciada pela adição
de 17,4 µg de proteína, conforme descrito em Materiais e Métodos. A atividade
específica correspondente a 100% foi de 319,8 ± 17,7 U/mg. O experimento foi
realizado empregando-se três diferentes homogeneizados de brânquias (N= 3). A figura
apresentada corresponde a uma curva representativa de um dos homogeneizados.
Inserção: representação de Dixon.
20
40
60
80
100
5
4
3
6
Atividade Residual (%)
-Log [Ouabaína] (M)
10
20
30
40
200
300 400 500
100
1/v
C
(U/mg)
-1
.10
3
[Ouabaína] (mM)
Douglas Chodi Masui
56
Figura 14 – Efeito da concentração de ortovanadato na atividade ATPase da
(Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de tecido branquial de Callinectes danae
aclimatado a salinidade de 15‰.
A atividade da enzima foi determinada continuamente a 25
o
C, em tampão Hepes
50 mM, pH 7,5, contendo ATP 2 mM, MgCl
2
5 mM, NaCl 100 mM, KCl 10 mM,
NADH 0,14 mM, FEP 2 mM, 49 U PQ e 94 U LDH. A reação foi iniciada pela adição
de 17,4 µg de proteína, conforme descrito em Materiais e Métodos. A atividade
específica correspondente a 100% foi de 319,78 ± 17,68 U/mg. O experimento foi
realizado empregando-se três diferentes homogeneizados de brânquias (N= 3). A figura
apresentada corresponde a uma curva representativa de um dos homogeneizados.
Inserção: representação de Dixon.
20
40
60
80
100
7
6
5
4
8
Atividade Residual (%)
-Log [Ortovanadato] (M)
5
10
15
20
2
3
4
5
1
1/v
C
(U/mg)
-1
.10
3
[Ortovanadato] (µM)
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
57
A inibição da atividade ATPase total dos microsomas de tecido branquial de C.
danae aclimatado a salinidade de 15 ‰ por concentrações crescentes de ortovanadato é
mostrada na Figura 14. Concentrações de ortovanadato da ordem de 100 µM inibiram a
atividade em cerca de 90%, similarmente ao observado para a ouabaína. O valor de K
I
calculado a partir da representação de Dixon (inserção da Figura 14) foi da ordem de
1,31 ± 0,06 µM.
A fim de se estimar a porcentagem relativa dos diferentes tipos de
contaminações presentes, a preparação microsomal foi ensaiada na presença de
diferentes inibidores. Na Tabela 3 está representado o efeito desses vários inibidores
sobre a atividade ATPase total dos microsomas de tecido branquial de Callinectes
danae aclimatado à salinidade de 15 ‰.
Tabela 3 - Efeito de diversos inibidores sobre a atividade ATPase da fração
microsomal de tecido branquial de C. danae aclimatado a salinidade de 15‰
A atividade da fração microsomal foi realizada usando-se 17,4 µg de proteína em
tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo ATP 2 mM, MgCl
2
5 mM, NaCl 100 mM e KCl
10 mM num volume final de 1,0 mL. Os dados obtidos representam a média ± desvio
padrão e foram calculados a partir de três preparações diferentes (N= 3).
Inibidor Atividade residual
(%)
V (U/mg)
Controle 100
319,8 ± 17,7
Ouabaína (3 mM) 9,4
29,9 ± 1,8
Ortovanadato (0,1 mM) 10,0
31,9 ± 1,5
Ouabaína (3 mM) + Ortovanadato (0,1 mM) 9,4
30,9 ± 2,1
Ouabaína (3 mM) + Teofilina (5mM) 8,8
28,2 ± 1,4
Ouabaína (3 mM) + Ácido etacrínico (2 mM) 2,5
7,9 ± 0,43
Ouabaína (3 mM) + Oligomicina (1 µg/mL)
6,2
19,9 ± 1,2
Ouabaína (3 mM) + Tapsigargina (0,5 µM)
8,1
25,9 ± 1,3
Ouabaína (3 mM) + Bafilomicina A
1
(0,4 µM)
8,7
27,9 ± 1,7
Ouabaína (3 mM) + Etanol 8,1
25,9 ± 1,4
Ouabaína (3 mM) + DMSO 9,4
29,9 ± 1,7
Douglas Chodi Masui
58
Em condições saturantes de ATP e de íons Mg
2+
, Na
+
e K
+
e na ausência de
inibidores, a atividade da enzima foi de 319,78 ± 17,68 U/mg. Comparado com o valor
da atividade residual obtida na presença de 100 µM de ortovanadato (31,98 ± 1,91
U/mg), sugere que aproximadamente 90% da atividade ATPase medida corresponde a
uma ATPase do tipo P. Por outro lado, a atividade insensível à ouabaína (atividade
residual em presença de ouabaína 3 mM) corresponde a 29,99 ± 1,77 U/mg, sugerindo
fortemente que a atividade P-ATPase inibida por ortovanadato corresponde à atividade
da própria (Na
+
,K
+
)-ATPase. Já os inibidores bafilomicina A
1
, a tapsigargina, a teofilina
e a oligomicina não apresentaram efeitos significativos sobre a atividade insensível a
ouabaína, sugerindo que a fração de membranas não apresenta atividade V-ATPase,
(Ca
2+
)-ATPase, fosfatases ou F
0
F
1
-ATPase, respectivamente. Embora a inibição de
cerca de 7,5% da atividade insensível a ouabaína pelo ácido etacrínico 2,0 mM, sugere a
presença de uma (Na
+
)-ATPase e/ou (K
+
)-ATPase, os dados das figuras 6 e 7, descartam
inequivocamente a possibilidade da preparação estar contaminada por uma atividade
ATPase estimulada por Na
+
.
A Figura 15 resume de uma maneira bastante clara os efeitos dos diferentes
inibidores na preparação microsomal de brânquias de C. danae aclimatado a salinidade
de 15 ‰.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
59
Oua + Teo
Oua + Baf**
Oua + Tap**
Oua + DMSO**
Oua + Oli*
Oua + Etanol*
Oua + Eta
Oua + Van
Van
Oua
Ctl
0255075
100
% Atividade Residual
(Na
+
,K
+
)-ATPase
Figura 15 – Efeito de diversos inibidores sobre a atividade ATPase da fração
microsomal de tecido branquial de C. danae aclimatado a salinidade de 15‰.
A atividade da fração microsomal foi realizada usando-se 17,4 µg de proteína em
tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo 2 mM de ATP, 5 mM de MgCl
2
, 100 mM NaCl e
10 mM KCl num volume final de 1,0 mL. Os dados obtidos representam a média ± desvio
padrão e foram calculados a partir de três preparações diferentes (N= 3). Atividade
ATPase total ( ); Atividade residual relativa ao(s) inibidor(es) ( ); Atividade ATPase
contaminante ( ) e Atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase ( ). Ctl: controle, Oua: ouabaína,
Van: ortovanadato, Eta: ácido etacrínico, Oli: oligomicina, DMSO: dimetilsulfóxido,
Tap: tapsigargina, Baf: bafilomicina e Teo: teofilina.
Douglas Chodi Masui
60
3.1 –Caracterização da atividade K
+
-fosfatase da (Na
+
,K
+
)-ATPase.
A Figura 16 mostra o efeito da concentração do PNFF sobre a atividade
PNFFase da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de tecido branquial de C. danae.
Em condições saturantes de íons Mg
2+
e K
+
, a estimulação da atividade da enzima pelo
PNFF ocorreu através de simples curva de saturação que apresentou características
cooperativas (n
H
= 1,2). A atividade especifica observada foi de 102,9 ± 4,3 U/mg e o
valor de K
M
foi 1,7 ± 0,1 mM. A atividade basal para estimulação da atividade K
+
-
fosfatase pelo PNFF foi desprezível (< 1 %). Na inserção é mostrado o efeito do
aumento da concentração de PNFF na atividade PNFFase total e na atividade insensível
a ouabaína.
A modulação da atividade PNFFase da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal
de tecido branquial de C. danae pelos íons magnésio é mostrada na Figura 17. Em
condições saturantes de PNFF e KCl, concentrações de íons Mg
2+
variando entre 10
-4
M
e 10
-2
M estimularam a atividade K
+
-fosfatase da preparação. A curva de saturação
monofásica, apresentando interações sítio-sítio (n
H
= 1,2) resultou em uma atividade
especifica de 93,7 ± 2,3 U/mg e o valor de K
M
foi 1,4 ± 0,03 mM. Na inserção é
mostrado o efeito do aumento da concentração de íons magnésio na atividade PNFFase
total e na atividade insensível a ouabaína.
A figura 18 mostra a modulação da atividade PNFFase da (Na
+
,K
+
)-ATPase da
fração microsomal de tecido branquial de C. danae pelos íons potássio. Em condições
saturantes de PNFF e íons Mg
2+
, na ausência de íons amônio, a estimulação da atividade
da enzima pelos íons K
+
ocorreu de acordo com uma cinética cooperativa (n
H
= 1,8). O
valor de K
0,5
estimado nessas condições foi de 2,9 ± 0,1 mM, e a atividade especifica foi
94,9 ± 3,5 U/mg. Concentrações superiores a 20 mM em íons K
+
provocaram inibição
da atividade da enzima. A atividade basal encontrada foi de aproximadamente 0,6 ±
0,022 U/mg. Na inserção é mostrado o efeito do aumento da concentração dos íons
potássio na atividade PNFFase total e na atividade insensível a ouabaína.
O efeito da concentração dos íons amônio sobre a atividade PNFFase da
(Na
+
,K
+
)-ATPase dos microsomas de brânquias de Callinectes danae é mostrado na
figura 19. No intervalo de concentração de íon NH
4
+
entre 10
-3
M a 10
-1
M, a enzima
apresentou interações sitio-sitio (n
H
= 2,9) e a atividade especifica máxima foi 106,2 ±
2,2 U/mg com K
0,5
da ordem de 9,8 ± 0,2 mM. Concentrações de íons NH
4
+
superiores a
60 mM provocaram inibição da atividade da enzima (resultados não mostrados). A ati-
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
61
Figura 16 – Modulação da atividade PNFFase da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração
microsomal de tecido branquial de Callinectes danae pelo PNFF.
A atividade da enzima foi medida continuamente a 25ºC, em tampão Hepes 50
mM, pH 7,5, contendo MgCl
2
10 mM e KCl 15 mM. A reação foi iniciada pela adição
de 16,4 µg de proteína, conforme descrito em Materiais e Métodos. Os experimentos
foram realizados em duplicata usando-se pelo menos três diferentes homogeneizados de
brânquias (N= 3). A figura apresentada corresponde a uma curva representativa de um
dos homogeneizados de brânquias. Inserção: atividade PNFFase total () e insensível
à ouabaína ().
20
40
60
80
100
3
2
4
U/mg
-Log [PNFF] (M)
40
80
120
3
2
4
U/mg
-Log [PNFF] (M)
Douglas Chodi Masui
62
Figura 17 – Modulação da atividade PNFFase da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração
microsomal de tecido branquial de Callinectes danae pelos íons magnésio.
A atividade da enzima foi medida continuamente a 25ºC, em tampão Hepes 50
mM, pH 7,5, contendo PNFF 10 mM e KCl 15 mM. A reação foi iniciada pela adição
de 16,4 µg de proteína, conforme descrito em Materiais e Métodos. Os experimentos
foram realizados em duplicata usando-se menos três diferentes homogeneizados de
brânquias (N= 3). A figura apresentada corresponde a uma curva representativa de um
dos homogeneizados de brânquias. Inserção: atividade PNFFase total () e insensível
à ouabaína ().
20
40
60
80
100
3
2
4
-Log [MgCl
2
] (M)
U/mg
40
80
120
3
2
4
U/mg
-Log [MgCl
2
] (M)
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
63
Figura 18 – Modulação da atividade PNFFase da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração
microsomal de tecido branquial de Callinectes danae pelos íons potássio.
A atividade da enzima foi medida continuamente a 25ºC, em tampão Hepes 50
mM, pH 7,5, contendo PNFF 10 mM e MgCl
2
10 mM. A reação foi iniciada pela
adição de 16,4 µg de proteína, conforme descrito em Materiais e Métodos. Os
experimentos foram realizados em duplicata usando-se pelo menos três diferentes
homogeneizados de brânquias (N= 3). A figura apresentada corresponde a uma curva
representativa de um dos homogeneizados de brânquias. Inserção: atividade PNFFase
total () e insensível à ouabaína ().
20
40
60
80
100
3
2
4
U/mg
-Log [KCl] (M)
40
80
120
32
4
U/mg
-Log [KCl] (M)
Douglas Chodi Masui
64
Figura 19 – Modulação da atividade PNFFase da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração
microsomal de tecido branquial de Callinectes danae pelos íons amônio.
A atividade da enzima foi medida continuamente a 25ºC, em tampão Hepes 50
mM, pH 7,5, contendo PNFF 10 mM e MgCl
2
10 mM. A reação foi iniciada pela
adição de 16,4 µg de proteína, conforme descrito em Materiais e Métodos. Os
experimentos foram realizados em duplicata usando-se pelo menos três diferentes
homogeneizados de brânquias (N= 3). A figura apresentada corresponde a uma curva
representativa de um dos homogeneizados de brânquias. Inserção: atividade PNFFase
total () e insensível à ouabaína ().
20
40
60
80
100
2
3
U/mg
- Log [NH
4
Cl] (M)
40
80
120
2
3
U/mg
-Log [NH
4
Cl] (M)
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
65
vidade basal foi considerada desprezível (3,11 ± 0,06 U/mg) . Na inserção é mostrado o
efeito do aumento da concentração dos íons amônio na atividade PNFFase total e na
atividade insensível a ouabaína.
A figura 20 mostra a modulação da atividade PNFFase da (Na
+
,K
+
)-ATPase da
fração microsomal de tecido branquial de C. danae pelos íons potássio. Em condições
saturantes de PNFF e íons Mg
2+
e NH
4
+
, não foi observada nenhuma estimulação da
atividade da enzima pelos íons K
+
. Observa-se que entre 10
-4
M e 10
-2
M para os íons
NH
4
+
a atividade máxima foi de 103,6 ± 4,6 U/mg, uma vez que a enzima já está
totalmente saturada pelos íons NH
4
+
. Concentrações superiores a 20 mM de íons K
+
provocaram inibição da atividade da enzima. Na inserção é mostrado o efeito do
aumento da concentração dos íons potássio na atividade PNFFase total e na atividade
insensível a ouabaína.
O efeito da concentração dos íons amônio sobre a atividade PNFFase da
(Na
+
,K
+
)-ATPase dos microsomas de brânquias de Callinectes danae é mostrado na
figura 21. Similarmente, os íons NH
4
+
não provocaram nenhuma estimulação da
atividade da enzima, em condições saturantes de PNFF, e de íons Mg
2+
e K
+
. No
intervalo entre 10
-4
M e 10
-2
M, a atividade máxima foi 102,6 ± 3,8 U/mg e esse valor é
justificado uma vez que a enzima está saturada pelos íons K
+
. Concentrações de íons
amônio superiores a 80 mM provocaram inibição da atividade da enzima. Na inserção é
mostrado o efeito dos íons amônio nas atividades PNFFase total e insensível à ouabaína.
O efeito da concentração dos íons sódio sobre a atividade PNFFase da fração
microsomal de tecido branquial de C. danae é mostrado na Figura 22. Na presença de
condições saturantes de PNFF e de íons magnésio e potássio, os íons Na
+
atuaram como
inibidores da atividade da enzima para concentrações superiores a 10
-2
M.
Concentrações de íons sódio da ordem de 100 mM inibiram completamente a atividade
da enzima. Na inserção é mostrada a representação de Dixon para a determinação de K
I
,
que é da ordem de 22,7 ± 1,7 mM.
A tabela 4 resume os valores dos parâmetros cinéticos estimados para a
atividade K
+
-fosfatase da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de tecido branquial de
C. danae em relação aos diferentes efetores.
Douglas Chodi Masui
66
Fig 20 – Modulação da atividade PNFFase da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração
microsomal de tecido branquial de Callinectes danae pelos íons potássio, na
presença de ions amônio.
A atividade da enzima foi medida continuamente a 25ºC, em tampão Hepes 50
mM, pH 7,5, contendo PNFF 10 mM, MgCl
2
10 mM e NH
4
Cl 50 mM. A reação foi
iniciada pela adição de 16,4 µg de proteína, conforme descrito em Materiais e Métodos.
Os experimentos foram realizados em duplicata usando-se pelo menos três diferentes
homogeneizados de brânquias (N= 3). A figura apresentada corresponde a uma curva
representativa de um dos homogeneizados de brânquias. Inserção: atividade PNFFase
total () e insensível à ouabaína ().
20
40
60
80
100
3
2
4
U/mg
-Log [KCl] (M)
40
80
120
3
2
4
U/mg
-Log [KCl] (M)
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
67
Figura 21 – Modulação da atividade PNFFase da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração
microsomal de tecido branquial de Callinectes danae pelos íons amônio na
presença de íons potássio.
A atividade da enzima foi medida continuamente a 25ºC, em tampão Hepes 50
mM, pH 7,5, contendo PNFF 10 mM, MgCl
2
10 mM e KCl 15 mM. A reação foi
iniciada pela adição de 16,4 µg de proteína, conforme descrito em Materiais e Métodos.
Os experimentos foram realizados em duplicata usando-se pelo menos três diferentes
homogeneizados de brânquias (N= 3). A figura apresentada corresponde a uma curva
representativa de um dos homogeneizados de brânquias. Inserção: atividade PNFFase
total () e insensível à ouabaína ().
20
40
60
80
100
32
4
U/mg
-Log [NH
4
Cl] (M)
40
80
120
3
2
1
4
U/mg
-Log [NH
4
Cl] (M)
Douglas Chodi Masui
68
Figura 22 – Efeito da concentração de íons sódio sobre a atividade PNFFase da
(Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de tecido branquial de Callinectes danae.
A atividade da enzima foi medida continuamente a 25ºC, em tampão Hepes 50
mM, pH 7,5, contendo PNFF 10 mM, MgCl
2
10 mM e KCl 15 mM. A reação foi
iniciada pela adição de 16,4 µg de proteína, conforme descrito em Materiais e Métodos.
A atividade na ausência de inibidor corresponde a 132,8 ± 9,94 U/mg. Os experimentos
foram realizados em duplicata usando-se pelo menos três diferentes homogeneizados de
brânquias (N= 3). A figura apresentada corresponde a uma curva representativa de um
dos homogeneizados de brânquias. Inserção: representação de Dixon.
20
40
60
80
100
3
2
1
4
Atividade Residual (%)
-Log [NaCl] (M)
5
10
15
20 3010
1/V
C
(U/mg)
-1
x10
3
[NaCl] (mM)
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
69
Tabela 4 - Parâmetros cinéticos estimados para a atividade K
+
-fosfatase da
(Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de tecido branquial de C. danae em
relação a diferentes efetores.
A atividade da fração microsomal foi estimada usando-se 16,4 µg de proteína em
tampão Hepes 50 mM, pH 7,5, contendo 10 mM de PNFF, e os diferentes efetores num
volume final de 1,0 mL. Os dados obtidos representam a média ± desvio padrão e foram
calculados a partir de pelo menos três preparações diferentes (N= 3).
Efetor V (U/mg) K
0,5
(mM) n
H
PNFF
102,9 ± 4,3 1,7 ± 0,1
1,2
Mg
2+
93,7 ± 2,3 1,4 ± 0,03
1,2
K
+
94,9 ± 3,5 2,9 ± 0,1
1,8
NH
4
+
106,2 ± 2,2 9,8 ± 0,2
2,9
A Figura 23 mostra o efeito da concentração de ouabaína sobre a atividade
PNFFase da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de tecido branquial de Callinectes
danae. Na presença de concentrações saturantes de PNFF e de íons magnésio e potássio,
uma única curva foi observada no intervalo de concentração de ouabaína entre 10
-4
e 10
-
3
M. Concentrações da ordem de 3 mM de ouabaína inibiram aproximadamente 75% da
atividade K
+
-fosfatase. Na inserção é mostrada a representação de Dixon para a
determinação do valor de K
I
, que foi da ordem de 142,0 ± 7,1 µM.
O efeito da concentração de ortovanadato sobre a atividade PNFFase da
(Na
+
,K
+
)ATPase da fração microsomal de tecido branquial de C. danae está mostrado
na figura 24. Em condições saturantes de PNFF e de íons Mg
2+
e K
+
, o ortovanadato
inibiu a totalmente a atividade fosfatase da enzima. Na inserção é mostrada a
representação de Dixon para a determinação do K
I
, que é da ordem de 28,1 ± 1,4 nM.
Douglas Chodi Masui
70
Figura 23 – Efeito da concentração de íons ouabaína sobre a atividade PNFFase da
(Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de tecido branquial de Callinectes danae.
A atividade da enzima foi medida continuamente a 25ºC, em tampão Hepes 50
mM, pH 7,5, contendo PNFF 10 mM, MgCl
2
10 mM e KCl 15 mM. A reação foi
iniciada pela adição de 16,4 µg de proteína, conforme descrito em Materiais e Métodos.
A atividade na ausência de inibidor corresponde a 131,8 ± 5,7 U/mg. Os experimentos
foram realizados em duplicata usando-se pelo menos três diferentes homogeneizados de
brânquias (N= 3). A figura apresentada corresponde a uma curva representativa de um
dos homogeneizados de brânquias. Inserção: representação de Dixon.
20
40
60
80
100
5
43
2
6
Atividade Residual (%)
-Log [Ouabaína] (M)
10
20
30
0,40,2
1/V
C
(U/mg)
-1
x10
3
[Ouabaina] (mM)
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
71
Figura 24 – Efeito da concentração de ortovanadato sobre a atividade PNFFase da
(Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal de tecido branquial de Callinectes danae.
A atividade da enzima foi medida continuamente a 25ºC, em tampão Hepes 50
mM, pH 7,5, contendo PNFF 10 mM, MgCl
2
10 mM e KCl 15 mM. A reação foi
iniciada pela adição de 16,4 µg de proteína, conforme descrito em Materiais e Métodos.
A atividade na ausência de inibidor corresponde a 131,8 ± 5,7 U/mg. Os experimentos
foram realizados em duplicata usando-se pelo menos três diferentes homogeneizados de
brânquias (N= 3). A figura apresentada corresponde a uma curva representativa de um
dos homogeneizados de brânquias. Inserção: representação de Dixon.
20
40
60
80
100
8
7
6
9
Atividade Residual (%)
- Log [Ortovanadato] (M)
20
40
80
40
1/V
C
(U/mg)
-1
x10
3
[Ortovanadato] (nM)
Douglas Chodi Masui
72
4.0 – DISCUSSÃO
4.1 – Estudo da fração microsomal.
A relação existente entre a atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase branquial medida em
diferentes espécies de crustáceos e o processo de regulação osmótica e iônica desses
animais em relação à exposição desses organismos a ambientes de salinidade variável
tem sido objeto de estudo de vários autores (Harris & Bayliss, 1988; Péqueux, 1995;
Piller et al., 1995; Corotto & Holliday, 1996; Lima et al., 1997; Lucu & Flik, 1999;
Lucu & Devescovi, 1999; Flik & Haond, 2000; Towle & Weihrauch, 2001; Lucu &
Towle, 2003; Furriel et al., 2004; Leone et al., 2005b). Contudo, pouco se conhece a
respeito das características cinéticas da enzima obtida nesses animais (Furriel et al.,
2001). Além de participar do processo de captura ativa de íons Na
+
para a homeostase
osmo-iônica, a (Na
+
,K
+
)-ATPase encontrada no epitélio branquial também pode
desempenhar um papel crucial na excreção de compostos nitrogenados nos crustáceos
(Péqueux, 1995; Weihrauch et al, 1999, 2002, 2004; Towle & Weihrauch, 2001; Masui
et al., 2002, 2003; Furriel et al., 2004; Kirschner, 2004; Leone et al., 2005b).
O único pico protéico obtido para os microsomas analisados em gradiente
contínuo de sacarose (pico entre 30 e 40 % de sacarose) foi similar ao encontrado para
Callinectes danae recém-capturado à salinidade de 33 ‰ (Masui et al., 2003) e também
para o camarão de água doce Macrobrachium olfersii (Furriel et al., 2001).
Similarmente ao observado para C. danae recém-capturado a 33 ‰ de salinidade
(Masui et al., 2002, 2003), a análise das atividades PNFFase total (Masui et al., 2005a) e
ATPase total do animal aclimatado à salinidade de 15‰ mostraram a presença de um
pico único de atividade. A inibição parcial das atividades ATPase total e PNFFase total
por ouabaína sugere a presença de outras ATPases e/ou fosfatases. Isto também foi
observado por Furriel et al. (2000) em M. olfersii, mas difere dos resultados obtidos
para a enzima de C. danae em animais recém-capturados a 33 ‰ de salinidade em que
se observou inibição total pela ouabaína (Masui et al., 2002, 2003).
Os microsomas de tecido branquial obtidos de C. danae aclimatado à salinidade
de 15 ‰ apresentaram uma atividade ATPase insensível à ouabaína correspondente a
aproximadamente 10% da atividade ATPase total. Atividades ATPase insensíveis à
ouabaína também foram demonstradas para microsomas provenientes do tecido
branquial de outros caranguejos braquiúros, sendo freqüentemente descrita a presença
de outras enzimas tais como Ca
2+
-ATPase (Wheatly, 1999), Na
+
-ATPase e/ou K
+
-
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
73
ATPase (Proverbio et al., 1991) além de fosfatases (Lovett et al., 1994). Entretanto, para
C. danae recém-capturado a salinidade de 33 ‰, as atividades ATPase e PNFFase
medidas correspondem unicamente à (Na
+
,K
+
)-ATPase (Masui et al., 2002, 2003).
A presença de uma única banda imunoespecífica, com Mr da ordem de 110 kDa
dos microsomas de tecido brânquial de C. danae obtidos a partir de animais recém-
capturados na salinidade de 33 ‰ e de animais aclimatados às salinidades de 15‰ e
33‰ sugere a presença de uma única isoforma da subunidade α da (Na
+
,K
+
)-ATPase
em cada uma dessas condições. Valores de Mr semelhantes foram relatados para a
enzima de várias fontes (Pressley, 1996; Furriel et al., 2000; Donnet et al., 2001; Towle
et al., 2001; Masui et al., 2002, 2005a; Lucu & Towle, 2003). É importante destacar que
mesmo empregando quantidades semelhantes de proteína (30µg) foi observada uma
diferença significativa de marcação o que sugere mudanças quantitativas na expressão
da enzima do tecido branquial em cada condição de aclimatação específica. Medidas da
atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase de tecido branquial de Carcinus maenas realizadas por
Henry et al. (2002) mostraram atividades específicas similares em animais aclimatados
às salinidades de 32 ‰ e a 10 ‰, o que poderia indicar a ocorrência de mecanismos de
resposta rápida a flutuações constantes de salinidade do ambiente modulando a
atividade da enzima já presente no tecido branquial e portanto a captura ativa de íons. Já
os dados relatados para Callinectes sapidus mostram aparentemente que animais
aclimatados as salinidades de 35‰ e 5‰ não apresentam mudanças notáveis nas
proporções relativas de mRNA e de proteína da subunidade α da (Na
+
,K
+
)-ATPase das
brânquias posteriores (Towle et al., 2001). Em Pachgrapsus marmoratus e
Chasmagnathus granulatus, respondem a um aumento nas proporções relativas de
mRNA durante a aclimatação a mudança para uma menor salinidade (Lucu & Towle,
2003; Luquet et al., 2005).
4.2 – Caracterização da atividade ATPase da (Na
+
,K
+
)-ATPase.
A atividade específica da (Na
+
,K
+
)-ATPase encontrada em crustáceos estuarinos
ou de água doce varia desde valores de aproximadamente 100 até 600 U/mg (Neufeld et
al., 1980; D´Orazio & Holliday, 1985; Holliday, 1985; Lucu & Pavicic, 1995; Piller et
al., 1995; Corotto & Holliday, 1996; Furriel et al., 2000, 2004). A atividade (Na
+
,K
+
)-
ATPase encontrada em C. danae aclimatado à salinidade de 15‰ (V= 298,83 ± 16,73
U/mg) foi semelhante à observada para os animais recém-capturados a 33‰ de
Douglas Chodi Masui
74
salinidade (Masui et al., 2002). Esse valor é relativamente menor quando comparado ao
obtido para a atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase de C. sapidus (Neufeld et al., 1980; Lovett &
Watts, 1995; Lucu et al., 2000; Lucu & Towle, 2003). Curiosamente, esse valor de
atividade é muito similar aos obtidos para outras espécies aclimatadas à água do mar
(Harris & Bayliss, 1988; D’Orazio & Holliday, 1985; Lucu et al., 2000). Estudos
realizados em outras espécies de caranguejos mostraram que a atividade (Na
+
,K
+
)-
ATPase branquial aumenta em resposta a aclimatação a baixa salinidade (Holliday,
1985; D’Orazio & Holliday, 1985; Harris & Bayliss, 1988; Corotto & Holliday, 1996;
Henry et al, 2002). Apesar dessas medidas mostrarem claramente a relação entre a
adaptação à salinidade do meio e a atividade da (Na
+
,K
+
)-ATPase branquial, as
diferenças entre os valores relatados por diferentes autores podem estar associadas aos
procedimentos empregados para obtenção da enzima, bem como para a determinação da
atividade, ou ainda a características específicas de cada espécie. Deve-se considerar
também que muitos dos valores citados representam determinações de atividade
realizadas em condições de concentração de substrato e de íons arbitrariamente
escolhidas sem a prévia caracterização cinética da enzima.
A modulação da atividade da (Na
+
,K
+
)-ATPase dos vertebrados pelo ATP é
caracterizada pela presença de uma família de sítios de alta afinidade com valores de
K
0,5
compreendidos entre 0,1 e 1 µM, e outra família de sítios de baixa afinidade, com
valores de K
0,5
entre 0,01 e 0,4 mM (Neufeld & Levy, 1969; Kanazawa et al., 1970;
Robinson, 1976; Glynn, 1985; Ward & Cavieres; 1993). No entanto, a caracterização
desses sítios de alta afinidade ainda permanece controversa (Martin & Sachs, 2000), já
que as atividades encontradas correspondem a menos de 10% da atividade total medida
(Glynn, 1985; Ward & Cavieres, 1998; Masui et al., 2002). A ausência de sítios de alta
afinidade para o ATP na enzima obtida de C. danae aclimatado a salinidade de 15 ‰
está de acordo com o encontrado para enzima de outros crustáceos (Gache et al., 1977;
D'Orazio & Holliday, 1985; Holliday, 1985; Tentes & Stratakis, 1991; Corotto &
Holliday, 1996; Furriel et al., 2000; Lucu & Towle, 2003), mas contrasta com o relatado
para a enzima obtida de C. danae recém-capturado, para a qual foi observada a presença de
um sítio de alta afinidade para o ATP (Masui et al., 2002). O valor de K
0,5
encontrado para
a estimulação da atividade da enzima obtida de C. danae aclimatado a salinidade de 15 ‰
pelo ATP mostrou para sítio de baixa afinidade foi da ordem de K
0,5
de 174,20 ± 9,75 µM.
A atividade basal da enzima, dos animais aclimatados a salinidade de 15 ‰, correspondeu
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
75
a menos de 5,0 % da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase. O emprego de técnicas mais sensíveis
pode contribuir para elucidar da presença ou não de sítios de alta afinidade para o ATP na
enzima obtida de C. danae aclimatado. O valor de K
0,5
para o ATP foi cerca de 3,17
vezes maior que o encontrado para a enzima obtida de animais recém-capturados
(Masui et al, 2002), o que pode indicar a presença de uma isoforma diferente da enzima.
Por outro lado, o valor de K
0,5
para o ATP de C. danae aclimatado à salinidade de 15 ‰
mostrou-se semelhante aos valores obtidos para outras espécies de crustáceos
aclimatados a água doce, como o encontrado nos microsomas de brânquias de M.
olfersii (Furriel et al., 2000) e no homogeneizado de brânquias de Macrobrachium
rosenbergii (Wilder et al., 2000), sugerindo a presença de uma mesma isoforma entre
essas espécies em ambiente menos salino. Todavia, valores da mesma ordem de
grandeza também foram observados para a enzima de membrana axonal do caranguejo
marinho Cancer pagurus (Balerna et al., 1975; Gache et al., 1977). Interessantemente, o
valor de K
0,5
encontrado em homogeneizado de brânquias de C. sapidus aclimatado a
água do mar (Neufeld et al., 1980; Lucu & Towle, 2003) foi da mesma magnitude.
Constantes de afinidade para o ATP com valores 9,0 vezes maiores foram encontrados
nos homogeneizados de brânquias de Potamom potamios aclimatados a água doce
(Tentes & Stratakis, 1991), de Uca minax (Wanson et al., 1984) e glândulas renais de
Procambarus clarkii (Sarver et al., 1994). Valores de K
0,5
para o ATP de
aproximadamente 600 µM foram observados para a enzima obtida de homogeneizados
de brânquias de U. pugnax (Holliday, 1985), de Uca pugilator (D’Orazio & Holliday,
1985) e de Hemigrapsus nudus (Corotto & Holliday, 1996) aclimatados a 100% de água
do mar. Estudos realizados empregando frações de membrana do tecido branquial de
Eriocheir sinensis, mostraram que aparentemente não ocorreram diferenças
significativas entre os valores de K
0,5
para o ATP em animais aclimatados a água doce
ou água do mar (Péqueux, et al., 1984).
O complexo Mg-ATP é o verdadeiro substrato da enzima, e a presença dos íons
Mg
2+
é essencial para a hidrolise do ATP (Glynn, 1985; Furriel et al., 2000; Masui et al.,
2002). Ainda não está estabelecido qual é o número de sítios de ligação para os íons
magnésio na molécula da enzima e nem os passos da reação de hidrólise que são afetados
por estes íons (Glynn, 1985; Jorgensen & Pedersen, 2001). Aparentemente, os íons
magnésio atuam de forma crucial nas mudanças conformacionais envolvidas na hidrólise
do ATP e no transporte dos íons sódio e potássio (Grisham & Mildvan, 1974; Jorgensen et
al., 1998a, 2001, 2003; Patchornik et al., 2002). O valor de K
0,5
para os íons magnésio
Douglas Chodi Masui
76
obtido para enzima de C. danae aclimatado a 15 ‰ (767,31 ± 36,06 µM) é semelhante ao
encontrado para a enzima dos animais recém-capturados (Masui et al., 2002). Esse valor
de K
0,5
foi similar ao encontrado para enzima obtida do tecido branquial de M. olfersii
(Furriel et al., 2000) e é semelhante ao obtido para C. sapidus aclimatado a 100% de
água do mar (Neufeld et al., 1980) e para a enzima de membrana axonal de C. pagurus
(Gache et al., 1976). Entretanto, contrasta com o valor obtido para enzima do
caranguejo de água doce P. potamios (Tentes & Stratakis, 1991), com K
0,5
de 4,0 mM.
Valores elevados de K
0,5
para os íons Mg
2+
foram encontrados para H. nudus (Corotto
& Holliday, 1996), U. pugilator (D’Orazio & Holliday, 1985) e U. pugnax (Holliday,
1985), e também para a enzima do tecido renal de P. clarkii (Sarver et al., 1994),
quando os animais foram aclimatados à água do mar. Da mesma forma que observado
para enzima dos microsomas de brânquias de C. danae recém-capturado (Masui et al.,
2002, 2005b) e para a enzima de membrana axonal de C. pagurus (Gache et al., 1976), a
modulação da atividade ATPase da enzima pelos íons Mg
2+
sugere a presença de
múltiplos sítios ligantes.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase dos vertebrados apresenta diferentes isoformas para a
subunidade α que apresentam afinidades distintas pelos íons Na
+
e K
+
(Levenson, 1994;
Therien et al., 1996; Blanco & Mercer, 1998; Sweeney & Klip, 1998; Crambert et al.,
2000; Segall et al 2001; Lopez et al., 2002). Além disso, as isoenzimas constituídas pela
mesma isoforma da subunidade α em associação com diferentes isoformas da
subunidade β também apresentam diferentes afinidades por estes íons (Blanco et al.,
1998; Therien et al., 1996; Geering, 2001). As diferenças nas afinidades da enzima
pelos íons Na
+
e K
+
aparentemente são dependentes do tecido e do organismo em que
são expressas, sugerindo que fatores da membrana ou pós-traducionais participam da
regulação das propriedades cinéticas da enzima (Sweadner, 1989; Levenson, 1994;
Therien et al., 1996; Lopez et al., 2002).
Os crustáceos aquáticos bem adaptados a meios diluídos desenvolveram várias
estratégias para manter a osmolalidade de seus fluidos extracelulares relativamente
constante frente a mudanças de salinidade do meio (Péqueux, 1995; Lucu & Towle,
2003; Kirschner, 2004). Dentre essas estratégias destaca-se o aumento da afinidade por
íons sódio na (Na
+
,K
+
)-ATPase importante para a captura ativa desses íons em
ambientes menos salinos (Péqueux, 1995; Lucu & Towle, 2003). A (Na
+
,K
+
)-ATPase
dos crustáceos de água doce apresenta maior afinidade aparente por íons Na
+
que
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
77
aquelas dos crustáceos de água salobra; essa afinidade é ainda menor para a enzima dos
crustáceos marinhos (Lucu & Towle, 2003). A constante de afinidade aparente obtida
para estimulação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase pelo íon Na
+
, para enzima obtida de
frações de membrana do tecido branquial de C. danae aclimatado a 15 ‰ de salinidade,
é semelhante ao valor da constante de afinidade observado para a enzima de C. danae
recém-capturado a 33 ‰ de salinidade (Masui et al., 2002). Resultados análogos foram
encontrados por Genovese et al. (2004) em Chasmagnathus granulata, onde os valores
de K
0,5
para os íons Na
+
foram aproximadamente iguais para as enzimas de animais
aclimatados a 10, 30 ou 45 ‰ de salinidade. Além disso, o valor de K
0,5
encontrado
para C. danae aclimatado a salinidade de 15 ‰ foi similar ao encontrado para M.
olfersii (Furriel et al., 2000) e M. rosenbergii (Wilder et al., 2000). Curiosamente,
Harris & Bayliss (1988) encontraram para a enzima branquial de C. maenas um valor de
K
0,5
para os íons Na
+
menor em animais aclimatados a 100 % de água do mar em
relação aos animais aclimatados a 40%. Siebers et al. (1983), relataram, porém, para a
mesma espécie, um aumento da afinidade da enzima por esses íons quando os animais
foram aclimatados a salinidade de 10‰. Afinidades para os íons Na
+
variando de 0,06 a
0,26 mM foram também relatados para outras espécies de crustáceos (Harris & Bayliss,
1988).
A (Na
+
,K
+
)-ATPase dos vertebrados apresenta constantes de afinidade para os
íons K
+
que variam muito pouco entre as isoenzimas, e que oscilam entre 0,5 a 2,5 mM
(Robinson & Pratap, 1991; Levenson, 1994; Vilsen, 1995; Therien et al., 1996; Specht
et al., 1997). O valor de K
0,5
observado para os íons K
+
para a enzima de C. danae
aclimatado a 15 ‰ de salinidade foi similar ao encontrado para animais recém-
capturados a 33 ‰ (Masui et al., 2002, 2005b) e está em concordância com aqueles
encontrados para a enzima branquial de P. potamios (Tentes & Stratakis, 1991) e M.
olfersii (Furriel et al., 2000). Valores similares foram observados para a enzima das
brânquias de C. sapidus (Neufeld et al., 1980) e para a enzima de membranas axonais de
C. pagurus (Gache et al., 1976). Constantes de afinidades para os íons K
+
elevadas
também foram encontrados para animais mantidos em 100 % de água do mar (Neufled
et al., 1980; Corotto & Holliday, 1996; Holliday, 1985; D'orazio & Holliday, 1985;
Winkler, 1986; Wanson et al., 1984). A presença de múltiplos sítios de ligação para os
íons potássio (n
H
= 1,7) também foi relatada para membrana axonal de caranguejo (Gache
et al., 1976). Estes resultados contrastam com o comportamento “Michaeliano” observado
Douglas Chodi Masui
78
para a (Na
+
,K
+
)-ATPase obtida de U. pugnax (Holliday, 1985) e de U. pugilator
(D´Orazio & Holliday, 1985).
A substituição dos íons K
+
por NH
4
+
na estimulação da atividade da (Na
+
,K
+
)-
ATPase encontrada nos vertebrados foi descrita por vários autores (Robinson, 1970,
Kurtz & Balaban, 1986; Skou & Esmann, 1992; Wall, 1996,1997; Wilkie, 1997; Wall et
al.,1999). Estudos realizados para a enzima obtida do tecido branquial de varias
espécies de crustáceos mostraram resultados similares (Holliday, 1985; Towle et al.,
1976; Towle & Weihrauch, 2001; Lucu & Towle, 2003; Weihrauch et al., 2002,2004;
Masui et al., 2002; Furriel et al., 2004). Por outro lado, a participação dos íons NH
4
+
como contra-íons no transporte de íons Na
+
mediado pela (Na
+
,K
+
)-ATPase (Towle &
Holleland, 1987) foi demonstrada empregando vesículas de membrana obtidas a partir
do tecido brânquial de C. sapidus. Estudos de perfusão de brânquias isoladas de C.
maenas confirmam esses resultados (Lucu et al., 1989). O valor de K
0,5
para os íons
NH
4
+
encontrado para a enzima de C. danae aclimatado a 15 ‰ de salinidade (6,04 ±
0,333 mM) é similar àquele encontrado para a enzima do animal recém-capturado à
salinidade de 33 ‰ (Masui et al., 2002) e para M. olfersii (Furriel et al., 2004). Valores
semelhantes também foram observados para a enzima obtida de membrana axonal de
caranguejo (Skou, 1960; Rossi et al., 1978). Já para a enzima de vertebrados, o valor da
afinidade aparente para os íons NH
4
+
varia entre 3,3 mM (Landon & Norris, 1963) e 6,1
mM (Robinson, 1970). Uma menor afinidade da enzima pelos íons NH
4
+
em relação aos
íons K
+
(cerca de 3,7 vezes) também foi observada para os animais recém-capturados
(Masui et al., 2002), para M. olfersii (Furriel et al., 2004), além da enzima de
membranas axonais de caranguejo (Skou, 1960; Rossi., 1978). Nos vertebrados, a
relação entre as afinidades para NH
4
+
e K
+
variou de 8,1 a 5,0 (Landon & Norris, 1963;
Robinson, 1970). A presença de múltiplos sítios de ligação para o íon NH
4
+
(n
H
= 1,3)
encontrada para enzima dos animais aclimatados a 15 ‰ de salinidade também foi
descrita para membranas axonais de C. pagurus (Rossi et al., 1978), mas difere do
observado para enzimas obtidas de C. danae recém-capturado (Masui et al., 2002) e
também de M. olfersii (Furriel et al., 2004), em que se observou a presença um único
sítio de ligação para esses íons. Além disso, uma maior estimulação da atividade
(Na
+
,K
+
)-ATPase pelos íons NH
4
+
em relação aos íons K
+
foi observada também em C.
danae recém-capturado a salinidade de 33 ‰ (Masui et al., 2002), P. potamios (Tentes
& Stratakis, 1991), M. olfersii (Furriel et al., 2004), U. pugnax (Holliday, 1985) e para a
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
79
enzima de outras fontes (Robinson, 1970; Landon & Norris, 1963; Skou, 1962; Schoner
et al., 1967).
Desde os primeiros estudos cinéticos da (Na
+
,K
+
)-ATPase branquial nesta
espécie (Masui et al., 2002, 2003, 2005a,b) foi observou-se a presença de uma
estimulação sinergística na atividade ATPase pelos íons K
+
e NH
4
+
nos animais recém
capturados (Masui et al., 2002). Essa característica sugere um possível papel fisiológico
da enzima no processo de excreção ativa de compostos nitrogenados que, nos
crustáceos, ocorre em grande parte através das brânquias na forma de amônia.
Resultados similares foram observados para o camarão de água doce M. olfersii (Furriel
et al., 2004). Os resultados obtidos para C. danae aclimatado a salinidade de 15 ‰ no
presente trabalho mostram também essa estimulação sinergística na atividade da enzima
entre íons K
+
e NH
4
+
(Figuras 9, 10 e 11 e 12). O valor da afinidade aparente pelos íons
NH
4
+
na presença de íons K
+
(Figura 11) foi bastante próximo do obtido para C. danae
recém-capturado a salinidade de 33 ‰ (Masui et al., 2002) e também para a enzima de
M. olfersii (Furriel et al., 2004). Entretanto, a estimulação da atividade (Na
+
,K
+
)-
ATPase por íons K
+
em presença de concentrações saturantes de íons NH
4
+
(Figura 9)
mostrou um aumento da afinidade aparente da enzima de cerca de 35 vezes quando
comparada à enzima obtida de animais recém-capturados à salinidade de 33 ‰ (Masui
et al., 2002). Já em M. olfersii, essa modulação sinergística da atividade da enzima por
íons K
+
em presença de íons NH
4
+
em concentração saturante não foi observada (Furriel
et al., 2004). Experimentos complementares se fazem necessários para estabelecer os
mecanismos que regem este aumento de afinidade da enzima para os íons K
+
e sua
possível importância para a excreção ativa de compostos nitrogenados nesses animais.
A maioria dos crustáceos aquáticos são amoniotélicos, excretando compostos
nitrogenados na forma de amônia (NH
3
+ NH
4
+
) (Kormanik & Cameron, 1981
Weihrauch et al., 1998, 1999, 2004). A urina primária nos caranguejos aquáticos é
formada via ultrafiltracao nas glândulas antenais e contribui para a regulação do teor de
água e de cátions divalentes no animal (Mantel & Farmer, 1983), mas não exerce um
papel significativo na excreção de compostos nitrogenados que ocorre principalmente
via epitélio branquial (Regnault, 1987; Weihrauch et al., 1999,2004). Em C. sapidus
menos de 2% do total de amônia é eliminada como urina via glândula antenal (Cameron
& Batterton, 1978; Weihrauch et al., 2004). Inicialmente, foi sugerido que a excreção
de amônia através das brânquias de crustáceos ocorreria por simples difusão de NH
3
, a
favor de seu gradiente. Outros autores, porém, sugerem fortemente que uma parte da
Douglas Chodi Masui
80
amônia produzida é excretada sob a forma de íons NH
4
+
(Lucu et al., 1989; Pressley et
al., 1981; Siebers et al., 1985; Weihrauch et al., 1998, 1999). Estudos de transporte
transepitelial de íons NH
4
+
através de brânquias isoladas e perfundidas de C. maenas, C.
pagurus e E. sinensis mostraram sensibilidade a ouabaína, sugerindo a participação da
(Na
+
,K
+
)-ATPase neste processo (Lucu et al., 1989; Péqueux & Gilles, 1981;
Weihrauch et al., 1998, 1999, 2002, 2004). Acredita-se que os íons NH
4
+
podem ser
ativamente excretados contra seu gradiente de concentração, no epitélio branquial
substituindo os íons K
+
na (Na
+
,K
+
)-ATPase, em certos caranguejos braquiúros
(Weihrauch et al., 1998, 1999). Em C. maenas, a extrusão de íons NH
4
+
para o meio
externo pode envolver seqüestro em vesículas de membrana acidificadas por uma H
+
-
ATPase tipo-V (Weihrauch et al., 2002). Aparentemente, os íons NH
4
+
também podem
ser trocados por íons H
+
e levados ao meio externo por um trocador Na
+
/H
+
localizado
na membrana apical (Morris, 2001; Weihrauch et al., 1998, 1999, 2002, 2004).
Nesse sentido, os resultados obtidos até o presente momento permitem propor o
seguinte modelo para a excreção de íons amônio através das brânquias de C. danae
(Painel 6) (Masui et al., 2005b). Canais de K
+
, sensíveis a Cs
+
, (Riestenpatt et al., 1996)
seriam incapazes de discriminar entre os íons K
+
e NH
4
+
, e dessa forma, translocariam
os íons NH
4
+
da hemolinfa para o citoplasma (Weihrauch et al., 2002,2004; Lucu et al.,
1989; Towle & Holleland, 1987). Sugere-se ainda a participação de um transportador de
amônia (RhCM) identificado nessa espécie de crustáceo neste processo (Marini et al.,
2000; Weihrauch et al., 2004). Os íons NH
4
+
dissociam-se em NH
3
e H
+
no citoplasma,
e a NH
3
resultante se difunde para o interior de vesículas acidificadas por uma H
+
-
ATPase tipo V. Essas vesículas contendo NH
4
+
são transportadas via microtúbulos até o
lado apical da célula, onde se fundem com a membrana liberando os íons NH
4
+
no
espaço subcuticular via exocitose, e finalmente através de estruturas sensíveis a
amiloride na cutícula (Weihrauch et al., 1998, 2002, 2004).
Os caranguejos bênticos podem encontrar concentrações de amônia no ambiente
que excedem os valores de íons NH
4
+
normalmente encontrados em sua hemolinfa, o
que pode levar a um influxo de íons NH
4
+
(Rebelo et al., 1999; Masui et al., 2002,
2003). Callinectes danae é um caranguejo bêntico que freqüentemente se enterra no
sedimento podendo estar sujeito a altas concentrações de amônia, da ordem de 2 a 3
mM (Weihrauch et al., 1999; Rebelo et al., 1999). Assim, um mecanismo eficiente de
excreção de íons NH
4
+
via (Na
+
,K
+
)-ATPase contra seu gradiente de concentração, ativo
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
81
mesmo em presença de concentrações saturantes de íons K
+
, pode ser fisiologicamente
relevante para os animais desta espécie.
Segundo Mantelatto & Fransozo (2000), animais da espécie C. danae são
freqüentemente encontrados em locais da baia de Ubatuba sujeitos à influência de água
doce e apresentando grandes quantidades de matéria orgânica no substrato, o que sugere
que freqüentemente ficam expostos a altas concentrações de amônia. Assim, a presença
de um mecanismo eficiente para sua excreção ativa no tecido branquial se faz
necessária, sugerindo que a seleção de uma (Na
+
,K
+
)-ATPase que seja modulada
diretamente por íons NH
4
+
poderia contribuir evolutivamente para a sobrevivência desta
e de outras espécies de caranguejos bênticos. A excreção de amônia contra seu gradiente
de concentração aparentemente é afetada pela permeabilidade do epitélio branquial,
sendo maior nos animais marinhos e estuarinos como C. pagurus e C. maenas, se
comparados a animais tolerantes a água doce como E. sinensis (Weihrauch et al., 1999,
2004).
O valor de K
I
calculado para a inibição da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase de
microsomas de brânquias de C. danae aclimatado à salinidade de 15 ‰, pela ouabaína,
na ausência de íons NH
4
+
é cerca de 3,3 vezes menor que o determinado para a enzima
do animal recém-capturado, e é aproximadamente 2 vezes menor se comparado na
presença de íons NH
4
+
(Masui et al., 2002). As diferenças encontradas nos valores de K
I
em C. danae podem sugerir a expressão de um isoenzima diferente. A expressão de
diferentes isoformas da subunidade α da (Na
+
,K
+
)-ATPase em brânquias de peixes em
proporções relativas que se alteram em reposta a aclimatação a diferentes salinidades
(Pagliarani et al., 1991; Lee et al., 1998; Feng, et al., 2002; Richards, et al., 2003), assim
como a presença de duas isoformas mostrando diferentes afinidades para os íons sódio
nas brânquias de C. granulata (Castilho et al., 2001) suportam esta hipótese.
Comparações entre as enzimas de C. danae aclimatado a 15 ‰ e de animais recém-
capturados (Masui et al., 2002) não mostraram diferenças significativas na afinidade da
enzima pelos íons Na
+
. Contudo, o aumento significativo na afinidade aparente da
enzima para íons K
+
na presença de NH
4
+
(37 vezes maior) em animais aclimatados a 15
‰ de salinidade, quando comparado com a afinidade aparente observada nos animais
recém-capturados (Masui et al., 2002), sugere que a expressão de uma isoforma
diferente pode estar mais relacionada com os mecanismos de excreção de amônia nessas
condições. Valores maiores de K
I
para a inibição da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase pela
ouabaína foram relatados por Neufeld et al. (1980) para enzima do tecido branquial de
Douglas Chodi Masui
82
C. sapidus, e também para a enzima dos caranguejos braquiúros adaptados à água do
mar (Corotto & Holliday, 1996; Holliday,1985; D'orazio & Holliday, 1985). Entre os
crustáceos de água doce, valores similares foram relatados para M. rosenbergii (Stern et
al., 1984), embora valores discrepantes tenham sido observados para M. olfersii (Furriel
et al., 2002). Em P. potamios, o K
I
para ouabaína foi de 0,5 mM (Tentes & Stratakis,
1991) e para enzima de C. maenas, o valor foi de 0,29µM em animais aclimatados a 10
‰ (Postel et al., 1998). A constante de inibição por ortovanadato para C. danae
aclimatado a 15 ‰ de salinidade foi cerca de 8,5 vezes menor em relação à enzima dos
animais recém-capturados (Masui et al., 2002). Contudo, este valor foi semelhante ao
observado por Furriel et al. (2000) para M. olfersii e também para a enzima de outras
fontes (Holleland & Towle, 1990; Skou & Esmann, 1992).
A ausência de inibição da atividade ATPase insensível à ouabaína por teofilina
descartou a presença de fosfatases na fração microsomal do tecido branquial de C.
danae, embora elas tenham sido encontradas em preparações de (Na
+
,K
+
)-ATPases
descritas por Lovett et al. (1994) para o tecido branquial de outros crustáceos. A
aparente ausência de uma ATPase tipo-V está em concordância com o obtido para a os
animais recém-capturados (Masui et al., 2002, 2003, 2005a). Aparentemente, uma V-
ATPase poderia desempenhar um papel importante na captura de íons Na
+
através do
epitélio branquial de espécies mais tolerantes ou bem adaptadas a meios diluídos, mas
não em espécies eurialinas com moderada capacidade osmorregulatória (Zare &
Greenaway, 1998; Weihrauch et al., 2001; Towle & Weihrauch, 2001). A ausência de
inibição por tapsigargina contrasta com o observado para preparações de tecido braquial
de outros caranguejos, que apresentam atividade Ca
2+
-ATPase (Wheatly, 1999). Por
outro lado, a inibição parcial da atividade insensível à ouabaína por oligomicina sugere
fortemente a presença de uma F
0
F
1
-ATPase na fração microsomal, o que é coerente com
o fato deste epitélio apresentar uma grande quantidade de mitocôndrias (Copeland &
Fitzjarrell, 1968; Towle & Kays, 1986). Por outro lado, a inibição por acido etacrínico
sugere a presenca de uma Na
+
-ATPase e/ou K
+
-ATPase (Proverbio et al., 1991). A
estimulação da atividade insensível à ouabaína por íons K
+
e não por íons Na
+
sugere
que esta atividade possa ser atribuída a uma K
+
-ATPase.
4.3 – Caracterização da atividade K
+
-fosfatase da (Na
+
,K
+
)-ATPase.
O processo de regulação osmótica e iônica nos crustáceos
hiperosmorreguladores tem sido objeto de estudo de vários autores, que estabeleceram
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
83
uma relação estreita entre esse processo com o aumento da atividade da (Na
+
,K
+
)-
ATPase (Péqueux, 1995; Towle, 1997; Lucu & Towle, 2003). A identificação e a
determinação da atividade (Na
+
,K
+
)-ATPase em animais expostos a ambientes de
salinidade variável tem sido realizada através de medidas empregando o substrato
fisiológico ATP (Harris & Bayliss, 1988; Piller et al., 1995; Corotto & Holliday, 1996;
Lima et al., 1997; Lucu & Flik, 1999; Lucu & Devescovi, 1999; Flik & Haond, 2000;
Lucu & Towle, 2003).
A capacidade da (Na
+
,K
+
)-ATPase também poder hidrolisar o p-nitrofenilfosfato
(PNFF) tem sido estudada por vários autores (Gache et al., 1977; Glynn, 1985;
Robinson & Pratap, 1991; Berberian & Beaugé, 1992; Specht et al., 1997; Furriel et al.,
2001; Masui et al., 2003, 2005a; Homareda & Ushimaru, 2005). Existem controvérsias
a respeito do papel do PNFF em não estar associado ao transporte de cátions ou
fosforilação da enzima (Glynn, 1985; Robinson & Pratap, 1991; Berberian & Beaugé,
1992), ou ainda que esse substrato não fisiológico possa realmente promover os passos
de fosforilação e de transporte na enzima (Yamazaki et al., 1994; Homareda &
Ushimaru, 2005). Acredita-se que, aparentemente, na ausência de íons Na
+
, os íons K
+
aparentemente ativam a reação dos sítios citoplasmáticos no qual os íons Na
+
usualmente ativam a reação da (Na
+
,K
+
)-ATPase (Glynn, 1985; Robinson & Pratap,
1991; Jorgensen et al., 1998a, b). Estudos de caracterização das propriedades cinéticas
da enzima nesses animais empregando o PNFF como substrato são muito escassos
(Furriel et al., 2001; Masui et al., 2003, 2005a). O estudo da atividade K
+
-fosfatase da
(Na
+
,K
+
)-ATPase realizado em frações de membrana do tecido branquial do siri
Callinectes danae e do camarão Macrobrachium olfersii proporcionaram novos
enfoques para utilização do substrato PNFF na caracterização cinética da (Na
+
,K
+
)-
ATPase como uma forte ferramenta para ser empregada em estudos mecanísticos bem
como para estudos comparativos da atividade da enzima nos tecidos branquiais dos
crustáceos em condições normais ou aclimatados a diferentes salinidades (Furriel et al.,
2001, 2004; Masui et al., 2003, 2005a).
A atividade específica da (Na
+
,K
+
)-ATPase do tecido branquial de C. danae
aclimatado a 15 ‰ com respeito à hidrólise do PNFF (102,9 U/mg) é um pouco menor
(1,2 vezes) se comparada com a mesma atividade da fração microsomal do animal
capturado a 33 ‰, da ordem de 125,4 U/mg (Masui et al., 2003). O valor de K
0,5
= 1,7
mM encontrado para a estimulação da atividade da enzima pelo PNFF bem como a
presença de uma única família de sítios de hidrólise para esse substrato, são semelhantes
Douglas Chodi Masui
84
ao relatado para enzima do animal capturado a salinidade de 33 ‰ (Masui et al., 2002).
Além disso, valores similares de afinidade da enzima para o PNFF foram também
observados para enzima do tecido branquial de M. olfersii (Furriel et al., 2001),
membranas axonais de Cancer pagurus (Gache et al., 1977; 1979) e outros tecidos de
vertebrados (Beaugé & Berberian, 1983; Davis & Robinson, 1988).
Os íons magnésio são reconhecidamente essenciais para ambas as atividades
ATPase e K
+
-fosfatase da (Na
+
,K
+
)-ATPases obtida de diferentes fontes (Rossi et al.,
1978; Gache et al., 1979; Glynn, 1985; Robinson & Pratap, 1991; Berberian & Beaugé,
1992; Furriel et al., 2000, 2001; Masui et al., 2002, 2003). A estimulação da atividade
K
+
-fosfatase pelos íons magnésio revelou um K
0,5
de aproximadamente 1,4 mM
semelhante ao observado para enzima obtida das frações de membrana de brânquias do
camarão de água doce M. olfersii (Furriel et al., 2001), do tecido branquial de C. danae
(Masui et al., 2003), das membranas axonais de Cancer pagurus (Gache et al., 1976,
1979) e da enzima obtida de vertebrados (Robinson, 1981; Beaugé & Berberian, 1983).
Já está bem estabelecido que a conformação E
2
da (Na
+
,K
+
)-ATPase é a
principal conformação associada na hidrólise do PNFF (Glynn, 1985; Robinson &
Pratap, 1991; Berberian & Beaugé, 1992 Jorgensen et al., 1998). Na ausência de íons
sódio, os íons potássio são capazes de ativar a reação de hidrólise (Glynn, 1985;
Robinson & Pratap, 1991). A inibição da atividade K
+
-fosfatase por altas concentrações
de íons sódio resultam aparentemente da competição entre os íons Na
+
e K
+
pelos sítios
citosólicos dos íons (Glynn, 1985). Dessa forma, a inibição da atividade K
+
-fosfatase da
enzima do tecido branquial de C. danae por elevadas concentrações de íons Na
+
está de
acordo com os dados relatados para enzima obtida de várias fontes (Gache et al., 1976;
Glynn, 1985; Furriel et al., 2001).
A estimulação da atividade K
+
-fosfatase da (Na
+
,K
+
)-ATPase do tecido
branquial de C. danae pelos íons potássio revelou um K
0,5
semelhante ao observado
para enzima obtida do tecido branquial de M. olfersii (Furriel et al., 2001; 2004), C.
danae (Masui et al., 2003), membranas axonais de caranguejo (Gache et al., 1976,
1979), e tecidos de vertebrados (Robinson, 1981; Glynn, 1985). Os íons potássio podem
ser substituídos pelos íons amônio na atividade K
+
-fosfatase da enzima encontrada nos
vertebrados (Robinson, 1970; Kurtz & Balaban, 1986; Skou & Esmann, 1992) com
também para a enzima dos crustáceos (Holliday, 1985; Towle et al., 1976; Wall, 1996;
Masui et al., 2002, 2003; Furriel et al., 2004). O valor de K
0,5
= 9,8 mM para a
estimulação da atividade K
+
-fosfatase da (Na
+
,K
+
)-ATPase do tecido branquial de C.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
85
danae aclimatado a salinidade de 15 ‰ pelos íons amônio é semelhante ao relatado para
enzima de C. danae encontrado a 33 ‰ (Masui et al., 2003), para o camarão M. olfersii
(Furriel et al., 2004), para enzima de membranas axonais de caranguejo (Skou, 1960;
Rossi et al., 1978) e cérebro de rato (Robinson, 1970). Semelhantemente ao observado
para a atividade K
+
-fosfatase e atividade ATPase de C. danae capturado a 33 ‰ (Masui
et al., 2002, 2003) a presença dos íons K
+
e NH
4
+
não provocou estimulação sinergística
da enzima do animal aclimatado a 15 ‰. Isto sugere os íons amônio podem substituir
os íons potássio ligando-se ao mesmo sítio na estimulação da atividade K
+
-fosfatase da
(Na
+
,K
+
)-ATPase (Robinson, 1970). Além disso, a inibição da atividade da enzima de
várias fontes, por excesso de íons potássio ou amônio, provavelmente resulta de uma
competição entre cátions monovalentes e divalentes (Robinson, 1970; Gache et al.,
1976).
A inibição parcial da atividade da enzima pela ouabaína sugere a presença de
outras enzimas na preparação de membranas. Alguns estudos (Robinson 1981; Gache et
al., 1976) mostraram valores de K
I
para a ouabaína de 3 µM até valores de
aproximadamente 200 µM. O valor de K
I
encontrado para inibição da atividade K
+
-
fosfatase de C. danae aclimatado a 15 ‰ (142,0 µM) contrasta aos valores
aproximadamente 6 vezes menores relatados para enzima de tecido branquial de C.
danae recém-capturado (Masui et al., 2003) e M. olfersii (Furriel et al., 2002), da ordem
de 830,3 µM e 762,4 µM respectivamente. Contudo, o valor de K
I
para atividade K
+
-
fosfatase obtida do animal aclimatado a 15 ‰ é similar ao encontrado para enzima da
membrana axonal de C. pagurus (Gache et al., 1976) e também coincide com os valores
relatados para enzima de vertebrados (Skou & Esmann, 1992). O valor para constante
de inibição da atividade K
+
-fosfatase pelo vanadato na atividade K
+
-fosfatase foi de
aproximadamente 28,06 nM e é semelhante ao observado para a enzima do mesmo
animal recém-capturado (Masui et al., 2003). Esse valor de K
I
é similar ao relatado para
enzima de vertebrados (Beaugé &.Berberian, 1983; Skou & Esmann, 1992). Todavia, o
valor de K
I
para o vanadato da enzima de C. danae aclimatado a 15‰ é relativamente
menor em relação ao encontrado para a atividade K
+
-fosfatase da fração de membrana
de brânquias do camarão de água doce M. olfersii (Furriel et al., 2001). Entretanto, os
resultados não permitem descartar a possibilidade que em uma menor salinidade, novas
fosfatases possam ser expressas.
Douglas Chodi Masui
86
5.0 – BIBLIOGRAFIA.
Abriel H, Hasler U, Geering K & Horisberger JD (1999) Role of the intracellular domain of the
β subunit in Na,K pump function. Biochim Biophys Acta 1418: 85-96.
Aguilar R, Hines AH, Wolcott TG, Wolcott DL, Kramer MA & Lipcius RN (2005) The timing
and route of movement and migration of post-copulatory female blue crabs, Callinectes
sapidus Rathbun, from the upper Chesapeake Bay. J Exp Mar Biol Ecol 319: 117-128.
Ahearn GA, Duerr JM, Zhuang Z, Brown RJ, Aslamkhan A & Killebrew DA (1999) Ion
transport processes of crustacean epithelial cells. Physiol Biochem Zool 72: 1-18.
Antolovic R, Hamer E, Serpersu EH, Kost H, Linnertz H, Kovarik Z & Schoner W (1999)
Affinity labelling with MgATP analogues reveals coexisting Na
+
and K
+
forms of the alpha-
subunits of Na
+
/K
+
-ATPase. Eur J Biochem 261: 181-189.
Apell HJ (2004) How do P-type ATPases transport ions? Bioelectrochem 63: 149-156.
Apell HJ, Schneeberger A & Sokolov VS (1998) Partial reactions of the NaK-ATPase: kinetic
analysis and transport properties. Acta Physio Scand 163: 235-245.
Arato-Oshima T, Matsui H, Wakizaka H & Homareda H (1996) Mechanism responsible for
oligomycin-induced occlusion of Na+ within Na/K-ATPase. J Biol Chem 271:
25604-25610.
Arguello JM, Whitis J & Lingrel JB (1999b) Alanine scanning mutagenesis of oxygen-
containing amino acids in the transmembrane region of the Na,K-ATPase. Arch Biochem
Biophys 367: 341-347.
Arguello JM, Whitis J, Cheung MC & Lingrel JB (1999a) Functional role of oxygen-containing
residues in the fifth transmembrane segment of the Na,K-ATPase α-subunit. Arch Biochem
Biophys 364: 254-263.
Arystarkhova E, Donnet C, Asinovski NK & Sweadner KJ (2002a) Differential regulation of
renal Na,K-ATPase by splice variants of the γ-subunit. J Biol Chem 277: 10162-10172.
Arystarkhova E, Wetzel RK & Sweadner KJ (2002b) Distribution and oligomeric association of
splice forms of Na
+
-K
+
-ATPase regulatory γ-subunit in rat kidney. Am J Physiol 282: F393-
F407.
Askew GR & Lingrel JB (1994) Identification of all amino-acid substitution in human α-1
Na,K-ATPase which confers differentially reduced affinity for 2 related cardiac-glycosides.
J biol chem 269: 24120-24126.
Balerna M, Fosset M, Chicheportiche R, Romey G & Lazdunski M (1975) Constitution and
properties of axonal membranes of crustacean nerves. Biochemistry 14: 5500-5511.
Bar Shimon M, Goldshleger R & Karlish SJD (1998) Specific Cu
2+
-catalyzed oxidative
cleavage of Na,K-ATPase at the extracellular surface. J Biol Chem 273: 34190-34195.
Barra JA, Péqueux AJR & Humbert W (1983) A morphological study on gills of a crab
acclimated to fresh water. Tissue Cell 15: 583-596
Baxter-Lowe LA, Guo JZ, Bergstrom EE & Hokin LE (1989) Molecular cloning of the
(Na
+
,K
+
)-ATPase α-subunit in developing brine-shrimp and sequence comparison with
higher organisms. FEBS Lett 257: 181-187.
Beaugé L & Berberian G (1983) The effects of several ligands on the potassium-vanadate
interaction in the inhibition of the (Na
+
,K
+
)-ATPase and the Na
+
,K
+
pump. Biochim Biophys
Acta 7127:336-350.
Beaugé L (2001) Breakdown of Na
+
/K
+
-exchanging ATPase phosphoenzymes formed from
ATP and from inorganic phosphate during Na
+
-ATPase activity - Response to Na
+
and K
+
ions. Eur J Biochem 268: 5627-5632.
Béguin P, Crambert G, Monnet-Tschudi F, Uldry M, Horisberger JD, Garty H, Geering K
(2002) FXYD7 is a brain-specific regulator of Na,K-ATPase alpha 1-beta isozymes. EMBO
J 21: 3264-3273.
Béguin P, Hasler U, Beggah A, Horisberger JD & Geering K (1998) Membrane integration of
Na,K-ATPase α-subunits and β-subunit assembly. J Biol Chem 273: 24921-24931.
Béguin P, Hasler U, Staub O & Geering K (2000) Endoplasmic reticulum quality control of
oligomeric membrane proteins: Topogenic determinants involved in the degradation of the
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
87
unassembled Na,K-ATPase α-subunit and in its stabilization by β-subunit assembly Mol
Biol Cell 11: 1657-1672.
Béguin P, Wang X, Firsov D, Puoti A, Claeys D, Horisberger JD & Geering K (1997) The γ-
subunit is a specific component of the Na,K-ATPase and modulates its transport function.
EMBO J 16: 4250-4260.
Berberian G & Beaugé L (1992) Phosphatase-activity and potassium-transport in liposomes
with Na
+
,K
+
-ATPase incorporated. Biochim Biophys Acta 1103: 85-93.
Bhattacharyya KK, Bergstrom EE & Hokin LE (1990) Molecular-cloning of the β-subunit of
the Na,K-atpase in the brine shrimp, Artemia - the cdna-derived aminoacid-sequence shows
low homology with the β-subunits of vertebrates except in the single transmembrane and the
carboxy-terminal domains FEBS Lett 269: 233-238.
Bianchini A & Gilles R (1990) cyclic-AMP as a modulator of NaCl transport in gills of the
euryhaline chinese crab Eriocheir sinensis. Mar Biol 104: 191-195.
Blanco G & Mercer RW (1998) Isozymes of the Na,K-ATPase: heterogeneity in structure,
diversity in function. Am J Physiol - Renal Physiol 44: F633-F650.
Blanco G, Melton RJ, Sanchez G & Mercer RW (1999) Functional characterization of a testes
specific alpha-subunit isoforma of the sodium/potassium adenosine triphosphatase.
Biochemistry 38: 13661-13669
Blanco G, Sanchez G & Mercer RW (1998) Differential regulation of Na,K-ATPase isozymes
by protein kinases and arachidonic acid. Arch Biochem Biophys 359: 139-150.
Blostein R (1999) Structure-function studies of the sodium pump. Biochem Cell Biol 77: 1-10.
Blostein R, Daly SE, Boxenbaum N, Lane LK, Arguello M, Lingrel JB, Karlish SDJ, Caplan
MJ & Dunbar L (1998) Conformational alterations resulting from mutations in
cytoplasmatic domains of the α-subunit of the Na,K-ATPase. Acta Physiol Scand 163: 275-
281.
Blostein R, Pu HX, Scanzano R & Zouzoulas A (2003) Structure/function studies of the γ-
subunit of the Na,K-ATPase. Ann NY Acad Sci 986: 420-427.
Boxenbaum N, Daly SE, Javaid ZZ, Lane LK & Blostein R (1998) Changes in the steady-state
conformational equilibrium resulting from cytoplasmic mutations of the Na,K-ATPase α-
subunit. J. Biol. Chem. 273: 23086-23092.
Budu CE, Efendiev R, Cinelli AM, Bertorello AM & Pedemonte CH (2002) Hormonal-
dependent recruitment of Na
+
,K
+
-ATPase to the plasmalemma is mediated by PKC β and
modulated by [Na
+
](i). British J Pharmacol 137: 1380-1386.
Cameron JN & Batterton CV (1978) Antennal gland-function in freshwater blue crab,
Callinectes sapidus - water, electrolyte, acid-base and ammonia excretion. J Comp Physiol
123: 143-148.
Cantley LC, Cantley LG & Josephson L (1978) A characterization of vanadate interactions with
the (Na
+
,K
+
)-ATPase. Mechanistic and regulatory implications. J Biol Chem 253: 7361-
7368.
Capendeguy O & Horisberger JD (2005) The role of the third extracellular loop of the Na
+
,K
+
-
ATPase α-subunit in a luminal gating mechanism. J Physiol 565: 207-218.
Castilho PC, Martins IA & Bianchini A (2001) Gill Na
+
,K
+
-ATPase and osmoregulation in the
estuarine crab, Chasmagnathus granulata Dana, 1851 (Decapoda, Grapsidae). J Exp Mar
Biol Ecol 256: 215-227.
Chacur MM & Negreiros-Fransozo ML (2001) Spatial and seasonal distributions of Callinectes
danae (Decapoda, Portunidae) in Ubatuba Bay, Sao Paulo, Brazil. J Crustacean Biol 21:
414-425.
Chacur MM (1998) Distribuição ecológica do siri azul Callinectes danae Smith, 1863
(Crustacea, Decapoda, Portunidae) na enseada de Ubatuba (SP). Tese de Mestrado.
ICB/UNESP-Botucatu. 104 pp.
Chapelle S & Zwingelstein G (1984) Phospholipid-composition and metabolism of crustacean
gills as related to changes in environmental salinities - relationship between Na
+
-K
+
-ATPase
activity and phospholipids. Comp Biochem Phys 78B: 363-372.
Douglas Chodi Masui
88
Cioffi M (1984) Comparative ultrastructure of arthropod transporting epithelia. Amer Zool 24:
139-156.
Cohen E, Goldshleger R, Shainskaya A, Tal DM, Ebel C, le Maire M ,& Karlish SJD (2005)
Purification of Na,K-ATPase expressed in Pichia pastoris reveals an Essential role of
phospholipid-protein interactions. J Biol Chem 280: 16610-16618.
Copeland DE & Fitzjarrell AT (1968) The salt absorbing cells in the gills of the blue crab
(Callinectes sapidus, Rathbun) with notes on modified mitochondria. Zeitschrift für
Zellforschung und Mikroskopische Anatomie 92: 1-22.
Coppi MV, Compton LA & Guidotti G (1999) Isoform-specific effects of charged residues at
borders of the M1-M2 loop of the Na,K-ATPase α-subunit. Biochemistry 38: 2494-2505.
Cornelius F & Mahmmoud YA (2003) Direct activation of gastric H,K-ATPase by N-terminal
protein kinase C phosphorylation. Comparison of the acute regulation mechanisms of H,K-
ATPase and Na,K-ATPase. Biophys J 84: 1690-1700.
Cornelius F (2001) Modulation of Na,K-ATPase and Na-ATPase activity by phospholipids and
cholesterol. I. Steady-state kinetics. Biochemistry 40: 8842-8851.
Corotto FS & Holliday CW (1996) Branchial Na,K-ATPase and osmoregulation in the purple
shore crab Hemigrapsus nudus (Dana). Comp Biochem Physiol 113A: 361-368.
Cortas N & Edelman IS (1988) Isolation of two isoforms of Na,K-ATPase from Artemia salina:
kinetic characterization. Prog Clin Biol Res 268A: 287-292.
Cortas N, Arnaout M, Salon J & Edelman IS (1989) Isoforms of Na,K-ATPase in Artemia
salina: II. Tissue distribution and kinetic characterization. J Membr Biol 108: 187-195.
Costa CJ, Gatto C & Kaplan JH (2003) Interactions between Na,K-ATPase alpha-subunit ATP-
binding domains. J Biol Chem 278: 9176-9184.
Costa TM & Negreiros-Fransozo ML (1998) The reproductive cycle of Callinectes danae
Smith, 1869 (Decapoda, Portunidae) in the Ubatuba Region, Brazil. Crustaceana 71: 615-
627.
Crambert G, Beguin P, Uldry M, Monnet-Tschudi F, Horisberger JD, Garty H & Geering K
(2003) FXYD7, the first brain- and isoform-specific regulator of Na,K-ATPase -
Biosynthesis and function of its post-translational modifications. Ann NY Acad Sci 986:
444-448.
Crambert G, Fuzesi M, Garty H, Karlish S & Geering K (2002) Phospholemman (FXYD1)
associates with Na,K-ATPase and regulates its transport properties. Proc Natl Acad Sci USA
99: 11476-11481
Crambert G, Hasler U, Beggah AT, Yu CL, Modyanov NN, Horisberger JD, Lelievre L &
Geering K (2000) Transport and pharmacological properties of nine different human
isozymes. J Biol Chem 275: 1976-1986.
Crambert G, Li CM, Swee LK & Geering K (2004) FXYD7, mapping of functional sites
involved in endoplasmic reticulum export, association with and regulation of (Na
+
,K
+
)-
ATPase. J Biol Chem 279: 30888-30895.
Croyle ML, Woo AL & Lingrel JB (1997) Extensive random mutagenesis analysis of the
(Na
+
,K
+
)-ATPase α-subunit identifies known and previously unidentified amino acid
residues that alter ouabain sensitivity. Implications for ouabain binding. Eur J Biochem 248:
488-495.
Dafnis E & Sabatini S (1994) Biochem and pathophysiol of vanadium. Nephron 67: 133-143.
Davis RL & Robinson JD (1988) Substrate sites of the (Na
+
,K
+
)-ATPase: pertinence of the
adenine and fluorescein binding sites. Biochim Biophys Acta 953: 26-36.
Deane EE & Woo NYS (2005) Cloning nad characterization of sea-bream (Na
+
,K
+
)-ATPase
alpha and beta subunit genes: in vitro effects of hormones on transcriptional and
translational expresson. Biochem Biophys Res Commun 331: 1229-1238.
Dempski RE, Friedrich T & Bamberg E (2005) The β-subunit of the Na
+
/K
+
-ATPase follows
the conformational state of the holoenzyme. J Gen Physiol 125: 505-520.
Dircksen H, Böcking D, Heyn U, Mandel C, Chung JS, Baggerman G, Verhaert P, Daufeldt S,
Plösch T, Jaros PP, Waelkens E, Keller R & Webster SG (2001) Crustacean hyperglycaemic
hormone (CHH)-like peptides and CHH-precursor-related peptides from pericardial organ
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
89
neurosecretory cells in the shore crab, Carcinus maenas, are putatively spliced and modified
products of multiple genes. Biochem J 356: 159-170.
Dixon M (1953) The determination of enzyme inhibitor constants. Biochem J 55: 170-171.
Domaszewicz W & Apell HJ (1999) Binding of the third Na
+
ion to the cytoplasmic side of the
Na,K-ATPase is electrogenic. FEBS Lett 458: 241-246.
Donnet C, Arystarkhova E & Sweadner KJ (2001) Thermal denaturation of the Na,K-ATPase
provides evidence for alpha-alpha oligomeric interation and γ-subunit association with the
C-terminal domain. J Biol Chem 276: 7357-7365.
D'Orazio SE & Holliday CW (1985) Gill Na,K-ATPase and osmoregulation in the sand fiddler
crab Uca pugilator. Physiol Zool 58: 364-373.
Doris PA & Bagrov AY (1998) Endogenous sodium pump inhibitors and blood pressure
regulation: an update on recent progress. Proceedings Soc Exp Biol Med 218: 156-165.
Dunbar LA & Caplan MJ (2001) Ion pumps in polarized cells: Sorting and regulation of the
Na
+
,K
+
- and H
+
,K
+
-ATPases. J Biol Chem 276: 29617-29620.
Duran MJ, Pierre SV, Carr DL & Pressley TA (2004) The isoform-specific region of the Na,K-
ATPase catalytic subunit: role in enzyme kinetics and regulation by protein kinase C.
Biochemistry 43: 16174-16183.
Eckhardt E, Pierrot C, Thuet P, VanHerp F, Charmantier-Daures M, Trilles JP & Charmantier G
(1995) Stimulation of osmoregulating processes in the perfused gill of the crab
Pachygrapsus marmoratus (Crustacea Decapoda) by a sinus gland peptide. Gen Comp
Endocrinol 99: 169-177.
Efendiev R, Bertorello AM, Zandomeni R, Cinelli AR & Pedemonte CH (2002) Agonist-
dependent regulation of renal Na
+
,K
+
-ATPase activity is modulated by intracellular sodium
concentration. J Biol Chem 277: 11489-11496.
Eguchi H, Takeda K, Schwarz W, Shirahata A & Kawamura M (2005) Involvement in K
+
access of Leu
318
at the extracellular domain flanking M3 and M4 of the Na
+
,K
+
-ATPase α-
subunit Biochem Biophys Res Comm 330: 611-614.
Else PL & Wu BJ (1999) What role for membranes in determining the higher sodium pump
molecular activity of mammals compared to ectotherms? J Comp Physiol 169B: 296-302.
Else PL, Wu BJ, Storlien LH & Hulbert AJ (2003) Molecular activity of (Na
+
,K
+
)-ATPase
relates to the packing of membrane lipids. Ann NY Acad Sci 986: 525-526.
Emery AM, Billingsley PF, Ready PD, & Djamgoz MBA (1998) Insect Na
+
/K
+
-ATPase. J
Insect Physiol 44: 197-209.
Emery AM, Ready PD, Billingsley PF & Djamgoz MBA (1995) A single isoform of the
(Na
+
,K
+
)-ATPase α-subunit in insects: evidence from characterization of the first
extracellular domain. Insect Mol Biol 4: 179-192.
Ettrich R, Melichercik M, Teisinger J, Ettrichova O, Krumscheid R, Hofbauerova K, Kvasnicka
P, Schoner W & Amler E (2001) Three-dimensional structure of the large cytoplasmic H
4
-H
5
loop of Na
+
/K
+
-ATPase deduced by restraint-based comparative modeling shows only one
ATP binding site. J Mol Model 7: 184-192.
Farman N, Fay M & Cluzeaud F (2003) Cell-specific expression of three members of the FXYD
family along the renal tubule. Ann NY Acad Sci 986: 428-436.
Farr C D, Burd C, Tabet MR, Wang X, Welsh WJ & Ball Jr WJ (2002) Three-dimensional
quantitative structure activity relationship study of the inhibition of Na/K-ATPase by
cardiotonic glycosides. Biochemistry 41: 1137-1148.
Fedosova NU, Cornelius F & Klodos I (1998) E
2
P phosphoforms of (Na
+
,K
+
)-ATPase. I.
Comparison of phosphointermediates formed from ATP and Pi by their reactivity toward
hydroxylamine and vanadate. Biochemistry 37: 13634-13642.
Felsenfeld, DP & Sweadner KJ (1988) Fine specificity mapping and topography of an isozyme-
specific epitope of the (Na
+
,K
+
)-ATPase catalytic subunit. J Biol Chem 263: 10932-10942.
Feng J & Lingrel JB (1994) Analysis of amino acid residues in the H5-H6 transmembrane and
extracelular domains of (Na
+
,K
+
)-ATPase α-subunit identifies threonine 797 as a
determinant of ouabain sensitivity. Biochemistry 33: 4218-4224.
Douglas Chodi Masui
90
Feng SH, Leu JH, Yang CH, Fang MJ, Huang CJ & Hwang PP (2002) Gene expression of
Na
+
,K
+
-ATPase α1 and α3 subunits in gills of the teleost Oreochromis mossambicus,
adapted to different environmental salinities. Mar Biotechnol 4: 379-391.
Feraille E & Doucet A (2001) Sodium-potassium-adenosinetriphosphatase-dependent sodium
transport in the kidney: Hormonal control. Physiol Rev 81: 345-418.
Feraille E, Mordasini D, Gonin S, Deschenes G, Vinciguerra M, Doucet A, Vandewalle A,
Summa V, Verrey F & Martin PY (2003) Mechanism of control of Na,K-ATPase in
principal cells of the mammalian collecting duct. Ann NY Acad Sci 986: 570-578.
Feschenko MS, Donnet C, Wetzel RK, Asinovski NK, Jones LR & Sweadner KJ (2003)
Phospholemman, a single-span membrane protein, is an accessory protein of Na,K-ATPase
in cerebellum and choroid plexus. J Neurosci 23: 2161-2169.
Flik G & Haond C (2000) Na
+
and Ca
2+
pumps in the gills, epipodites and branchiostegites of
the European lobster Homarus gammarus: Effects of dilute sea water. J Exp Biol 203: 213-
220.
Frasen P (2005) Phospholemman, a chaperone of Na
+
,K
+
-ATPase? Cardiovascular Res 65: 13-
15.
Freire CA & McNamara JC (1992) Involvement of the central nervous system in
neuroendocrine mediation of osmotic and ionic regulation in the freshwater shrimp
Macrobrachium olfersii (Crustacea, Decapoda). Gen Comp Endocrinol 88: 316-327.
Furriel RPM, Masui DC, McNamara JC & Leone FA (2004) Modulation of gill (Na
+
,K
+
)-
ATPase activity by ammonium ions: Putative coupling of nitrogen excretion and ion uptake
in the freshwater shrimp Macrobrachium olfersii. J Exp Zool 301A: 63-74.
Furriel RPM, McNamara JC & Leone FA (2000) Characterization of (Na
+
,K
+
)-ATPase in gill
microsomes of the freshwater shrimp Macrobrachium olfersii. Comp Biochem Physiol
126B: 303-315.
Furriel RPM, McNamara JC & Leone FA (2001) Nitrophenylphosphate as a tool to characterize
gill (Na
+
,K
+
)-ATPase activity in hyperregulating Crustacea. Comp Biochem Physiol 130A:
665-676.
Füzesi M, Gottschalk KE, Lindzen M, Shainskaya A, Küster B, Garty H & Karlish SJD (2005)
Covalent Cross-links between the γ Subunit (FXYD
2
) and α and β-Subunits of Na,K-
ATPase J Biol Chem 280: 18291-18301.
Gache C, Rossi B & Lazdunski M (1976) (Na
+
,K
+
)-Activated adenosinetriphosphatase of axonal
membranes, cooperativity and control. Eur. J. Biochem. 65: 293-306.
Gache C, Rossi B & Lazdunski M (1977) Mechanistic analysis of the (Na
+
,K
+
)-ATPase using
new pseudosubstrates. Biochemistry 16: 2957-2965.
Gache C, Rossi B, Leone FA & Lazdunski M (1979) Pseudo-substrates to analyze the reaction
mechanism of the Na,K-ATPase. In: JC Skou (Ed) & JG Norby (Ed) Na,K-ATPase,
Structure and Kinetics. Academic Press, NY 301-314.
GarciaSaez A, Perona R & Sastre L (1997) Polymorphism and structure of the gene coding for
the alpha subunit of the Artemia franciscana. Biochem J 321: 509-518.
Garty H, Lindzen M, Fuzesi M, Aizman R, Goldshleger R, Asher C & Karlish SJD (2003) A
specific functional interaction between CHIF and (Na
+
,K
+
)-ATPase - Role of FXYD proteins
in the cellular regulation of the pump. Ann NY Acad Sci 986: 395-400.
Gaspar MH (1981) Contribuição ao estudo biológico do “siri” Callinectes danae Smith, 1869
(Decapoda-Portunidae) do rio Itiberé (Paranaguá-Paraná) 150 pp. Universidade Federal do
Paraná.
Gatto C, Helms JB, Prasse MC, Arnett KL & Milanick MA (2005) Kinetic characterization of
tetrapropylammonium inhibition reveals how ATP and Pi alter access to the (Na
+
,K
+
)-
ATPase transport site. Am J Physiol 289: C302-C311.
Gatto SJ, Thornewell JP, Holden JP & Kaplan JH (1999) Cys(577) is a conformationally mobile
residue in the ATP-binding domain of the NaK-ATPase alpha-subunit. J Biol Chem 274:
24995-25003
Geering K (2000) Topogenic motifs in P-type ATPases. J Membr Biol 174: 181-190.
Geering K (2001) The functional role of beta subunits in oligomeric P-type ATPases. J
Bioenerg Biomemb 33: 425-438.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
91
Geering K, Beguin P, Garty H, Karlish S, Fuzesi M, Horisberger JD & Crambert G (2003)
FXYD proteins: New tissue- and isoform-specific regulators of (Na
+
,K
+
)-ATPase. Ann. NY
Acad Sci 986: 388-394.
Genovese G, Luchetti CG & Luquet CM (2004) Na
+
/K
+
-ATPase activity and gill ultrastructure
in the hyper-hypo-regulating crab Chasmagnathus granulatus acclimated to dilute, normal,
and concentrated seawater. Mar Biol 144: 111-118.
Glynn IM (1985) The (Na
+
,K
+
)-transporting adenosine triphosphatase. In: AN Martonosi (Ed)
The enzymes of biological membranes. Plenum Press NY 3: 35-114.
Glynn IM (2002) A hundred years of sodium pumping. Ann Rev Physiol 64: 1-18.
Goldshleger R & Karlish SJD (1999) The energy transduction mechanism of Na,K-ATPase
studied with iron-catalyzed oxidative cleavage. J Biol Chem 274: 16213-16221.
Goodman SH & Cavey MJ (1990) Organization of a phyllobranchiate gill from the green shore
crab Carcinus maenas (Crustacea, Decapoda). Cell Tissue Res 260: 495-505.
Gordon JA (1991) Use of vanadate as protein-phosphotyrosine phosphatase inhibitor. Methods
Enzymol 201: 477-482.
Grisham CM & Mildvan AS (1974) Magnetic resonance and kinetic studies of the mechanism
of sodium and potassium ion activated adenosine triphosphatase. J Biol Chem 249: 3187-
3197.
Grosell M, Nielsen C & Bianchini A (2002) Sodium turnover rate determines sensitivity to
acute copper and silver exposure in freshwater animals. Comp Biochem Physiol 133C: 287-
303.
Guennoun S & Horisberger JD (2000) Structure of the 5th transmembrane segment of the Na,K-
ATPase alpha subunit: a cysteine-scanning mutagenesis study. FEBS Lett 482: 144-148.
Guennoun S & Horisberger JD (2002) Cysteine-scanning mutagenesis study of the sixth
transmembrane segment of the Na,K-ATPase alpha subunit. FEBS Lett 513: 277-281.
Guerin JL & Stickle WB (1997) A comparative study of two sympatric species within the genus
Callinectes: osmoregulation, long-term acclimation to salinity and the effects of salinity on
growth and moulting. J Exp Mar Biol Ecol 218: 165-186.
Hakansson KO & Jorgensen PL (2003) Homology modeling of Na,K-ATPase - A putative third
sodium binding site suggests a relay mechanism compatible with the electrogenic profile of
Na
+
translocation. Ann NY Acad Sci 986: 163-167.
Hakansson KO (2003) The crystallographic structure of Na,K-ATPase N-domain at 2.6 A
resolution. J Mol Biol 332: 1175-1182.
Hansen O (2003) No evidence for a role in signal-transduction of Na
+
/K
+
-ATPase interaction
with putative endogenous ouabain. Eur J Biochem 270: 1916-1919.
Harris RR & Bayliss D (1988) Gill (Na
+
,K
+
)-ATPases in decapod crustaceans: distribution and
characteristics in relation to Na
+
regulation. Comp Biochem Physiol 90A: 303-308.
Hasler U, Crambert G, Horisberger JD & Geering K (2001) Structural and functional features of
the transmembrane domain of the Na,K-ATPase β-subunit revealed by tryptophan scanning.
J Biol Chem 276: 16356-16364.
Hasler U, Greasley PJ, von Heijne G & Geering K (2000) Determinants of topogenesis and
glycosylation of type II membrane proteins - Analysis of Na,K-ATPase β(1) and β(3)
subunits by glycosylation mapping. J Biol Chem 275: 29011-29022
Hasler U, Wang XY, Crambert G, Beguin P, Jaisser F, Horisberger JD & Geering K (1998)
Role of the β-subunit domains in the assembly, stable expression, intracellular routing, and
functional properties of Na,K-ATPase. J Biol Chem 273: 30826-30835.
Hayashi Y, Shinji N, Tahara Y, Hagiwara E & Takenaka H (2003) Isolation of (alpha,beta)(4)-
tetraprotomer having half-of-sites ATP binding from solubilized dog kidney Na
+
/K
+
-
ATPase. Ann NY Acad Sci 986: 232-234.
Hebert H, Purhonen P, Thomsen K, Vorum H & Maunsbach AB (2003) Renal Na,K-ATPase
structure from cryo-electron microscopy of two-dimensional crystals. Ann NY Acad Sci
986: 9-16.
Hebert H, Purhonen P, Vorum H, Thomsen K & Maunsbach AB (2001) Three-dimensional
structure of renal Na,K-ATPase from cryo-electron microscopy of two-dimensional crystals.
J Mol Biol 314: 479-494.
Douglas Chodi Masui
92
Henry RP, Garrelts EE, McCarty MM & Towle DW (2002) Differential induction of branchial
carbonic anhydrase and (Na
+
,K
+
)-ATPase activity in the euryhaline crab, Carcinus maenas,
in response to low salinity exposure. J Exp Zool 292: 595-603.
Hilge M, Siegal G, Vuister GW, Guntert P, Gloor SM & Abrahams JP (2003) ATP-induced
conformational changes of the nucleotide-binding domain of Na,K-ATPase. Nat Struct Mol
Biol 10: 468-474.
Hofbauerova K, Kopecky V, Ettrich R, Ettrichova O & Amler E (2002) Secondary and tertiary
structure of nucleotide-binding domain of α-subunit of Na+/K+-ATPase. Biopolymers 67:
242-246.
Holleland T & Towle DW (1990) Vanadate but not ouabain inhibits (Na
+
,K
+
)-ATPaseand
sodium transport in tight inside-out native membrane vesicles from crab gill (Carcinus
maenas). Comp Biochem Physiol 96B: 177-181.
Holliday CW (1985) Salinity-induced changes in gill Na,K-ATPase activity in the mud fiddler
crab, Uca pugnax. J Exp Zool 233: 199-208.
Holmgren M, Wagg J, Bezanilla F, Rakowski RF, De Weer P & Gadsby DC (2000) Three
distinct and sequential steps in the release of sodium ions by the Na
+
/K
+
-ATPase. Nature
403: 898-901.
Homareda H & Ushimaru M (2005) Stimulation of p-nitrophenylphosphatase activity of
Na
+
⁄K
+
-ATPase by NaCl with oligomycin or ATP. FEBS J 272: 673-684.
Horisberger JD (2004) Recent insights into the structure and mechanism of the sodium pump.
Physiology 19: 377-388.
Hu YK & Kaplan JH (2000) Site-directed chemical labeling of extracellular loops in a
membrane protein - The topology of the Na,K-ATPase α-subunit. J Biol Chem 275: 19185-
19191.
Imagawa T, Yamamoto T, Kaya S, Sakaguchi K & Taniguchi K (2005) Thr-774
(Transmembrane Segment M5), Val-920 (M8), and Glu-954 (M9) Are Involved in Na
+
Transport, and Gln-923 (M8) Is Essential for Na,K-ATPase Activity. J Biol Chem 280:
18736–18744.
Ivanov A, Zhao H & Modyanov NN (2000) Packing of the transmembrane helices of Na,K-
ATPase: Direct contact between beta-subunit and H8 segment of alpha-subunit revealed by
oxidative cross-linking. Biochemistry 39: 9778-9785.
Jacobsen MD, Pedersen PA & Jorgensen PL (2002) Importance of Na,K-ATPase residue
alpha1-Arg
(544)
in the segment Arg
(544)
-Asp
(567)
for high-affinity binding of ATP, ADP, or
MgATP. Biochemistry 41: 1451-1456.
Jones DH, Li TY, Arystarkhova E, Barr KJ, Wetzel RK, Peng J, Markham K, Sweadner KJ,
Fong GH & Kidder GM (2005) Na,K-ATPase from mice lacking the γ-subunit (FXYD2)
exhibits altered Na
+
affinity and decreased thermal stability. J Biol Chem 280: 19003–
19011.
Jorgensen PL & Pedersen PA (2001) Structure-function relationships of Na
+
, K
+
, ATP, or Mg
2+
binding and energy transduction in (Na
+
,K
+
)-ATPase. Biochim Biophys Acta Bioenerg
1505: 57-74.
Jorgensen PL (2003) Transmission of E
1
-E
2
structural changes in response to Na
+
or K
+
binding
in Na,K-ATPase. Ann NY Acad Sci 986: 22-30.
Jorgensen PL, Hakansson KO & Karlish SJD (2003) Structure and mechanism of Na,K-
ATPase: Functional sites and their interactions.Ann Rev Physiol 65: 817-849.
Jorgensen PL, Jorgensen JR & Pedersen PA (2001) Role of conserved TGDGVND-loop in
Mg
2+
binding, phosphorylation, and energy transfer in Na,K-ATPase. J Bioenerg Biomemb
33: 367-377.
Jorgensen, P.L.; Nielsen, J.M.; Rasmussen, J.H. & Pedersen, P.A. (1998b) Structure-function
relationships based on ATP binding and cation occlusion at equilibrium in Na,K-ATPase.
Acta Physiol Scand 163, Suppl 643: 79-87.
Jorgensen, PL, Nielsen JM, Rasmussen JH & Pedersen PA (1998a) Structure-function
relationships of E
1
-E
2
transitions and cation binding in Na,K-pump protein. Biochim
Biophys Acta 1365: 65-70.
Kamemoto FI (1991) Neuroendocrinology of osmoregulation in crabs. Zool Sci 8: 827-833.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
93
Kanazawa T, Saito M & Tonomura Y (1970) Formation and decomposition of a phosphorylated
intermediate in the reaction of Na
+
,K
+
dependent ATPase. J Biol Chem 67: 693-711.
Kaplan JH (2002) Biochemistry of (Na
+
,K
+
)-ATPase. Ann Rev Biochem 71: 511-535.
Kaplan JH, Gatto C, Holden JP & Thornewell SJ (1998) Structural changes associated with the
coupling of ATP hydrolysis and cation transport by the Na pump. Acta Physiol Scand 163,
Suppl 643: 99-105.
Kaplan JH, Hu YK & Gatto C (2001) Conformational coupling: The moving parts of an ion
pump. J Bioenerg Biomembr 33: 379-385.
Karlish SJD (2003) Investigating the energy transduction mechanism of P-type ATPases with
Fe
2+
-catalyzed oxidative cleavage. Ann NY Acad Sci 986: 39-49.
Kasturi R, Yuan J, McLean LR, Margolies MN & Ball Jr WJ (1998) Identification of a model
cardiac glycoside receptor: comparisons with (Na
+
,K
+
)-ATPase. Biochemistry 37: 6658-
6666.
Kawamura M & Nagano K (1984) Evidence for essential disulfide bonds in the beta-subunit of
(Na
+
,K
+
)-ATPase.Biochim Biophys Acta 774: 188–192.
Kazanietz MG, Caloca MJ, Aizman O & Nowicki S (2001) Phosphorylation of the catalytic
subunit of rat renal Na
+
,K
+
-ATPase by classical PKC isoforms. Arch Biochem Biophys 388:
74-80
Keenan SM, DeLisle RK, Welsh WJ, Paula S & Ball Jr. WJ (2005) Elucidation of the Na
+
,K
+
-
ATPase digitalis binding site. J Mol Graphics Modelling 23: 465-475.
Kirley TL (1990) Inactivation of (Na+,K+)-ATPase by beta-mercaptoethanol. Differential
sensitivity to reduction of the three beta subunit disulfide bonds. J Biol Chem 265: 4227-
4232.
Kirschner LB (2004) The mechanism of sodium chloride uptake in hyperregulating aquatic
animals. J Exp Biol 207: 1439-1452.
Koenderink JB, Geibel S, Grabsch E, De Pont JJHHM, Bamberg E & Friedrich T (2003)
Electrophysiological analysis of the mutated Na,K-ATPase cation binding pocket. J Biol
Chem 278: 51213-51222.
Koenderink JB, Hermsen HPH, Swarts HGP, Willems PHGM & De Pont JJHHM (2000b)
High-affinity ouabain binding by a chimeric gastric H
+
,K
+
-ATPase containing
transmembrane hairpins M3-M4 and M5-M6 of the alpha(1)-subunit of rat Na
+
,K
+
-ATPase.
Proc Natl Acad Sci USA 97: 11209-11214.
Koenderink JB, Swarts HGP, Hermsen HPH, Willems PHGM & De Pont JJHHM (2000)
Mutation of aspartate 804 of Na
+
,K
+
-ATPase modifies the cation binding pocket and thereby
generates a high Na
+
-ATPase activity. Biochemistry 39: 9959-9966.
Kormanik GA & Cameron JN (1981) Ammonia excretion in the seawater blue crab
(Callinectes sapidus) occurs by diffusion, and not Na
+
/NH
4
+
exchange. J Comp Physiol
141B: 457-462.
Kramer HJ, Krampitz G, Backer A & Meyer-Lehnert H (1998) Ouabain-like factors in human
urine: identification of a Na-K-ATPase inhibitor as vanadium-diascorbate aduct. Clin Exp
Hyperten 20: 557-571.
Kubala M, Hofbauerova K, Ettrich R, Kopecky V, Krumscheid R, Plasek J, Teisinger J,
Schoner W & Amler E (2002) Phe
(475)
and Glu
(446)
but not Ser
(445)
participate in ATP-binding
to the alpha-subunit of Na
+
/K
+
-ATPase. Biochem Biophys Res Commun 297: 154-159.
Kubala M, Plasek J & Amler E (2004) Fluorescence competition assay for the assessment of
ATP binding to an isolated domain of Na
+
,K
+
-ATPase. Physiol Res 53: 109-113.
Kubala M, Teisinger J, Ettrich R, Hofbauerova K, Kopecky V, Baumruk V, Krumscheid R,
Plasek J, Schoner W & Amler E (2003) Eight amino acids form the ATP recognition site of
Na
+
/K
+
-ATPase. Biochemistry 42: 6446-6452.
Kurtz I & Balaban, R.S. (1986) Ammonium as a substrate for Na
+
/K
+
-ATPase in rabbit
proximal tubules. Am J Physiol 250: F497-F502.
Landon EJ & Norris JL (1963) Sodium- and potassium-dependent adenosine triphosphatase
activity in a rat-kidney endoplasmic reticulum fraction. Biochim Biophys Acta 71: 266-276.
Lansky Z, Kubala M, Ettrich R, Kuty M, Plasek J, Teisinger J, Schoner W & Amler EE (2004)
The hydrogen bonds between Arg
(423)
and Glu
(472)
and other key residues, Asp
(443)
, Ser
(477)
,
Douglas Chodi Masui
94
and Pro
(489)
, are responsible for the formation and a different positioning of TNP-ATP and
ATP within the nucleotide-binding site of Na
+
/K
+
-ATPase. Biochemistry 43: 8303-8311.
Laughery MD, Todd ML, Kaplan JH (2003) Mutational analysis of alpha-beta subunit
interactions in the delivery of Na,K-ATPase heterodimers to the plasma membrane. J Biol
Chem 278: 34794-34803.
Lebovitz, RM, Takeyasu K & Fambrough DM (1989) Molecular characterization of the
(Na
+
/K
+
)-ATPase α-subunit in Drosophila melanogaster. EMBO J 8: 193-202.
Lee TH, Tsai JC, Fang MJ, Yu MJ & Hwang PP (1998) Isoform expression of Na
+
/K
+
-ATPase
α-subunit in gills of the teleost Oreochromis mossambicus. Am J Physiol 44: R926-R932.
Leone FA, Baranauskas JA, Furriel RPM, Borin IA (2005b) SigrafW: An Easy-to-use Program
for Fitting Enzyme Kinetic Data. Biochem Mol Biol Edu 33: 399-403.
Leone FA, Furriel RPM, McNamara JC, Mantelatto FLM, Masui DC, Alves LR, Gonçalves RR
& Garçon DP (2005a) (Na
+
,K
+
)-ATPase from crustacean gill microsomes: a molecular
marker to evaluate adaptation to biotopes of different salinity. Trends Comp Biochem
Physiol 11: 1-15.
Levenson R (1994) Isoforms of the Na,K-ATPase: family members in search of function. Rev
Physiol Biochem Pharmacol 123: 1-45.
Li C, Capendeguy O, Geering K & Horisberger JD (2005) A third Na
+
-binding site in the
sodium pump Proc Natl Acad Sci USA 102: 12706–12711.
Li CM, Grosdidier A, Crambert G, Horisberger JD, Michielin O & Geering K (2004) Structural
and functional interaction sites between Na,K-ATPase and FXYD proteins. J Biol Chem
279: 38895-38902.
Lichtstein D & Rosen H (2001) Endogenous digitalis-like Na
+
/K
+
-ATPase inhibitors, and brain
function. Neurochem Res 26: 971-978.
Lignot JH, Susanto GN, Charmantier-Daures M & Charmantier G (2005) Immunolocalization
of Na
+
/K
+
-ATPase in the branchial cavity during the early development of the crayfish
Astacus leptodactylus (Crustacea, Decapoda). Cell Tissue Res 319: 331-339.
Lima AG, McNamara JC & Terra WR (1997) Regulation of hemolymph osmolytes and gill
(Na
+
,K
+
)-ATPase activities during acclimation to saline media in the freshwater shrimp
Macrobrachium olfersii (Wiegmann 1836) (Decapoda Palaemonidae). J Exp Mar Biol Ecol
215: 81-91.
Lingrel J, Moseley A, Dostanic I, Cougnon M, He SW, James P, Woo A, O'Connor K &
Neumann J (2003) Functional roles of the α-isoforms of the (Na
+
,K
+
)-ATPase. Ann NY
Acad Sci 986: 354-359.
Lingrel JB & Kuntzweiler T (1994) Na
+
,K
+
-ATPase. J Biol Chem 269: 19659-19662.
Lingrel JB, Croyle ML, Woo AL & Arguello JM (1998) Ligand Binding sites of Na,K-ATPase.
Acta Physiol Scand 163, Suppl 643: 69-77.
Linnertz H, Kost H, Obsil T, Kotyk A, Amler E & Schoner W (1998) Erythrosin 5'-
isothiocyanate labels Cys(549) as part of the low-affinity ATP binding site of Na+/K+-
ATPase. FEBS Lett 441: 103-105.
Linnertz H, Lanz E, Gregor M, Antolovic R, Krumscheid R, Obsil T, Slavik J, Kovarik Z,
Schoner W & Amler E (1999) Microenvironment of the high affinity ATP-binding site of
Na
+
/K
+
-ATPase is slightly acidic. Biochem Biophys Res Commun 254: 215-221
Linnertz H, Urbanova P, Obsil T, Herman P, Amler E & Schoner W (1998a) Molecular distance
measurements reveal an (alpha-beta)(2) dimeric structure of Na
+
/K
+
-ATPase–High affinity
ATP binding site and K
+
-activated phosphatase reside on different alpha-subunits. J Biol
Chem 273: 28813-28821.
Lopez LB, Quintas LEM & Noel F (2002) Influence of development on Na
+
/K
+
-ATPase
expression: isoform- and tissue-dependency. Comp Biochem Physiol 131A: 323-333.
Lopina OD (2001) Interaction of Na,K-ATPase catalytic subunit with cellular proteins and other
endogenous regulators. Biochemistry (Mosc) 66:1122-1131.
Lovett DL & Watts SA (1995) Changes in polyamine levels in response to acclimation salinity
in gills of the blue crab Callinectes sapidus Rathbun. Comp Biochem Physiol 110B: 115-
119.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
95
Lovett DL, Towle DW & Faris JE (1994) Salinity-sensitive alkaline phosphatase activity in gills
of the blue crab, Callinectes sapidus Rathbun. Comp Biochem Physiol 109B: 163-173.
Lovett DL, Verzi MP, Clifford PD & Borst DW (2001) Hemolymph levels of methyl farnesoate
increase in response to osmotic stress in the green crab, Carcinus maenas. Comp Biochem
Physiol 128A: 299-306.
Lucu C & Devescovi M (1999) Osmoregulation and branchial Na,K-ATPase in the lobster
Homarus gammarus acclimated to dilute seawater. J Exp Mar Biol Ecolology 234: 291-304.
Lucu C & Flik G (1999) (Na
+
,K
+
)-ATPase and Na
+
, Ca
2+
exchange activities in gills of
hyperregulating Carcinus maenas. Am J Physiol 276: R490-R499.
Lucu C & Pavicic D (1995) Role of seawater concentration and major ions in oxygen
consumption rate of isolated gills of the shore crab Carcinus mediterraneus Csnr. Comp
Biochem Physiol 112A: 565-572.
Lucu C & Towle DW (2003) (Na
+
,K
+
)-ATPase in gills of aquatic crustacea. Comp Biochem
Physiol 135A: 195-214.
Lucu C (1990) Ionic regulatory mechanisms in crustacean gill epithelia. Comp Biochem Physiol
97A: 297-306.
Lucu C, Devescovi M & Siebers D (1989) Do amiloride and ouabain affect ammonia fluxes in
perfused Carcinus gill epithelia? J Exp Zool 249: 1-5.
Lucu C, Devescovi M, Skaramuca B & Kozul V (2000) Gill NaK-ATPase in the spiny lobster
Palinurus elephas and other marine osmoconformers. Adaptiveness of enzymes from
osmoconformity to hyperregulation. J Exp Mar Biol Ecol 246: 163-178.
Luquet CM, Genovese G, Rosa GA & Pellerano GN (2002a) Ultrastructural changes in the gill
epithelium of the crab Chasmagnathys granulatus (Decapoda: Grapsidae) in diluted and
concentrated seawater. Mar Biol 141: 753-760.
Luquet CM, Postel U, Halperin J, Urcola MR, Marques R & Siebers D (2002b) Transepithelial
potential differences and Na
+
flux in isolated perfused gills of the crab Chasmagnathus
granulatus (Grapsidae) acclimated to hyper- and hypo-salinity. J Exp Biol 205: 71-77.
Luquet CM, Weihrauch D, Senek M & Towle DW (2005) Induction of branchial ion transporter
mRNA expression during acclimation to salinity change in the euryhaline crab
Chasmagnathus granulatus. J Exp Biol 208: 3627-3636.
Lutsenko S, Anderko R & Kaplan JH (1995) Membrane disposition of the M5-M6 hairpin of
the (Na
+
,K
+
)-ATPase alpha subunit is ligand dependent. Proc Natl Acad Sci USA 92: 7936-
7940.
Lutsenko S, Kaplan JH (1993) An essential role for the extracellular domain of the NaK-
ATPase beta-subunit in cation occlusion. Biochemistry 32: 6737-43.
Macías MT, Palmero I & Sastre L (1991) Cloning of a cDNA encoding an Artemia franciscana
α-subunit. Gene 105: 197-204.
MacLennan DH & Green NM (2000) Structural biology - Pumping ions. Nature 405: 633-634
Maina JN (1990) The morphology of gills of the freshwater African crab Potamon niloticus
(Crustacea: Brachyura: Potamonidae): A scanning and transmissíon electron microscopic
study. J Zool (London) 221: 499-515.
Mandal AK, Mikhailova L & Arguello JM (2003) The Na,K-ATPase S5-H5 helix - Structural
link between phosphorylation and cation-binding sites. Ann NY Acad Sci 986: 224-225.
Mantel LH & Farmer LL (1983) Osmotic and ionic regulation. In: LH Mantel (Ed) & DE Bliss
(Ed) The biology of crustacean. Internal anatomy and physiological regulation. Academic
Press, NY 5: 53-161.
Mantelatto FLM & Fransozo A (1999) Characterization of the physical and chemical
parameters of Ubatuba bay, Northern coast of São Paulo State, Brazil. Rev Brasil Biol 59:
23-31.
Mantelatto FLM & Fransozo A (2000) Brachyuran community in Ubatuba Bay, northern coast
of Sao Paulo State, Brazil. J Shellfish Res 19: 701-709.
Martin DW & Sachs JR (1999) Preparation of Na
+
/K
+
-ATPase with near maximal specific
activity and phosphorylation capacity: Evidence that the reaction mechanism involves all of
the sites. Biochemistry 38: 7485-7497.
Douglas Chodi Masui
96
Martin DW & Sachs JR (2000) Ligands presumed to label high affinity and low affinity ATP
binding sites do not interact in an (αβ)(2) diprotomer in duck nasal gland (Na
+
,K
+
)-ATPase,
nor do the sites coexist in native enzyme. J Biol Chem 275: 24512-24517.
Martin DW, Marecek J, Scarlata S & Sachs JR (2000) alpha beta protomers of Na
+
,K
+
-ATPase
from microsomes of duck salt gland are mostly monomeric: Formation of higher oligomers
does not modify molecular activity. Proc Natl Acad Sci USA 97: 3195-3200.
Martinez AS, Charmantier G, Compère P & Charmantier-Daures M (2005) Branchial chamber
tissues in two caridean shrimps: the epibenthic Palaemon adspersus and the deep-sea
hydrothermal Rimicaris exoculata. Tissue Cell 37: 153–165.
Masui DC, Furriel RPM, Mantelatto FLM, McNamara JC & Leone FA (2003) Gill (Na
+
,K
+
)-
ATPase from the blue crab Callinectes danae: modulation of K
+
-phosphatase activity by
potassium and ammonium íons. Comp Biochem Physiol 134B: 631-640.
Masui DC, Furriel RPM, Mantelatto FLM, McNamara JC & Leone FA (2005a) K
+
-phosphatase
activity of gill (Na
+
,K
+
)-ATPase from the blue crab, Callinectes danae: low-salinity
acclimation and expression of the α-subunit. J Exp Zool 303A: 294-307.
Masui DC, Furriel RPM, McNamara JC, Mantelatto FLM & Leone FA (2002) Modulation by
ammonium ions of gill microsomal (Na
+
,K
+
)-ATPase in the swimming crab Callinectes
danae: a possible mechanism for regulation of ammonia excretion. Comp Biochem Physiol
132C: 471-482.
Masui DC, Furriel RPM, Silva EC, Mantelatto FLM, McNamara JC, Barrabin H, Scofano HM,
Fontes CF & Leone FA (2005b) Gill microsomal (Na
+
,K
+
)-ATPase from the blue crab
Callinectes danae: Interactions at cationic sites. Int J Biochem Cell Biol 37: 2521-2535.
McConnell FM (1987) Morphometry of transport tissues in a freshwater crustacean. Tissue Cell
19: 319-349.
McGregor SE & Walker JM (1993) Inhibitors of the Na
+
,K
+
-ATPase. Comp Biochem Physiol
105C: 1-9.
McLusky DS & Elliott M (2004) The Estuarine Ecosystem : Ecology, Threats, and
Management. 3
rd
edition. Oxford University Press, NY. 224 pp.
McNamara JC, Salomão LC & Ribeiro EA (1990) The effect of eyestalk ablation on
haemolymph osmotic and ionic concentrations during acute salinity exposure in the
freshwater shrimp Macrobrachium olfersii (Wiegmann) (Crustacea, Decapoda).
Hydrobiologia 199: 193-199.
McNamara JC, Salomão LC & Ribeiro EA (1991) Neuroendocrine regulation of osmotic and
ionic concentrations in the hemolymph of the freshwater shrimp Macrobrachium olfersii
(Wiegman) (Crustacea, Decapoda) Gen Comp Endocrinol 84: 16-26.
Melo GAS (1996) Manual de identificação dos Brachyura (Caranguejos e siris) do litoral
brasileiro. Plêiade, São Paulo 1-603.
Mense M, Dunbar LA, Blostein R & Caplan MJ (2000) Residues of the fourth transmembrane
segments of the Na,K-ATPase and the gastric H,H-ATPase contribute to cation selectivity. J
Biol Chem 275: 1749-1756.
Mense M, Rajendran V, Blostein R & Caplan MJ (2002) Extracellular domains, transmembrane
segments, and intracellular domains interact to determine the cation selectivity of Na,K- and
gastric H,K-ATPase. Biochemistry 41: 9803-9812.
Middleton DA, Rankin S, Esmann M & Watts A (2000) Structural insights into the binding of
cardiac glycosides to the digitalis receptor revealed by solid-state NMR. Proc Natl Acad Sci
USA 97: 13602-13607.
Mikhailova L, Mandal AK & Arguello JM (2002) Catalytic phosphorylation of Na,K-ATPase
drives the outward movement of its cation-binding H5-H6 Hairpin. Biochemistry 41: 8195-
8202.
Mo JL & Greenaway P (2001) cAMP and sodium transport in the freshwater crayfish, Cherax
destructor. Comp Biochem Physiol 129A: 843-849.
Mo JL, Devos P & Trausch G (1998) Dopamine as a modulator of ionic transport and
Na
+
/K
+
-ATPase activity in the gills of the chinese crab Eriocheir Sinensis. J Crustacean Biol
18: 442-448.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
97
Mo JL, Devos P & Trausch G (2002) Dopamine D-1 receptors in the gills of Chinese crab
Eriocheir sinensis. Comp Biochem Physiol 131C: 433-438.
Mobasheri A, Avila J, Cozar-Castellano I, Brownleader MD, Trevan M, Francis MJO, Lamb JF
& Martin-Vasallo P (2000) (Na
+
,K
+
)-ATPase isozyme diversity comparative biochemistry
and physiological implications of novel functional interactions. Biosci Reports 20: 51-91.
Moreira GS, McNamara JC, Shumway SE & Moreira PS (1983) Osmoregulation and
respiratory metabolism in brazilian Macrobrachium (Decapoda Palaemonidae) Comp
Biochem Physiol 74A: 57- 62.
Moretti R, Martín M, Provérbio T, Provérbio F & Marín R (1991) Ouabain-insensitive Na
+
-
ATPase activity in homogenates from different animal tissues. Comp Biochem Physiol 98:
623-626.
Morris S & Edwards T (1995) Control of osmoregulation via regulation of Na
+
/K
+
-ATPase
activity in the amphibious purple shore crab Leptograpsus variegatus. Comp Biochem
Physiol 112C: 129-136.
Morris S (2001) Neuroendocrine regulation of osmoregulation and the evolution of air-
breathing in decapod crustaceans. J Exp Biol 204: 979-989.
Neufeld AH & Levy HM (1969) A second ouabain-sensitive sodium-dependent adenosine
triphosphate in brain microsomes. J Biol Chem 244: 6493-6497.
Neufeld GJ, Holliday CW & Pritchard JB (1980) Salinity adaptation of gill Na,K-ATPase in the
blue crab, Callinectes sapidus. J Exp Zool 211: 215-224.
Nielsen JM, Pedersen PA, Karlish SJD & Jorgensen PL (1998) Importance of intramembrane
carboxylic acids for occlusion of K
+
ions at equilibrium in renal Na,K-ATPase.
Biochemistry 37: 1961-1968.
Ning G, Maunsbach AB, Lee YJ & Moller JV (1993) Topology of (Na
+
,K
+
)-ATPase alpha
subunit epitopes analyzed with oligopeptide-specific antibodies and double-labeling
immunoelectron microscopy. FEBS Lett 336: 521-524.
Noguchi S, Higashi K & Kawamura M (1990) A possible role of the bsubunit of (Na
+
,K
+
)-
ATPase in facilitating correct assembly of the α-subunit into the membrane. J Biol Chem
265: 15991-15995.
Ogawa H & Toyoshima C (2002) Homology modeling of the cation binding sites of Na
+
K
+
-
ATPase. Proc Natl Acad Sci USA 99: 15977-15982.
Okamura H, Denawa M, Ohniwa R & Takeyasu K (2003) P-type ATPase superfamily -
Evidence for critical roles for kingdom evolution. Ann NY Acad Sci 986: 219-223.
Onken H & McNamara JC (2002) Hyperosmoregulation in the red freshwater crab Dilocarcinus
pagei (Brachyura, Trichodactylidae): structural and functional asymmetries of the posterior
gills. J Exp Biol 205: 167-175.
Onken H & Riestenpatt S (1998) NaCl absorption across split gill lamellae of hyperegulating
crabs: transport mechanisms and their regulation. Comp Biochem Physiol 119A: 883-893.
Onken H & Riestenpatt S (2002) Ion transport across posterior gills of hyperosmoregulating
shore crabs (Carcinus maenas): amiloride blocks the cuticular Na
+
conductance and induces
current-noise. J Exp Biol 205: 523-531.
Onken H, Tresguerres M & Luquet CM (2003) Active NaCl absorption across posterior gills of
hyperosmoregulating Chasmagnathus granulatus. J Exp Biol 206: 1017-1023.
Or E, Goldshleger R, Shainskaya A & Karlish SJD (1998) Specific cross-links between
fragments of proteolyzed Na,K-ATPase induced by o-phthalaldehyde. Biochemistry 37:
8197-8207.
Pagliarani A, Ventrella V, Ballestrazzi R, Trombetti F, Pirini M & Trigari G (1991) Salinity-
dependence of the properties of gill (Na
+
/K
+
)-ATPase in rainbow-trout (Oncorhynchus
mykiss). Comp Biochem Physiol 100B: 229-236.
Palasis M, Kuntzweiler TA, Arguello JM & Lingrel JB (1996) Ouabain interactions with the
H5-H6 hairpin of the Na,K-ATPase reveal a possible inhibition mechanism via the cation
binding domain. J Biol Chem 271: 14176-14182.
Parrie L & Towle DW (2002) Induction of (Na
+
,K
+
)-ATPase α-subunit mRNA in branchial
tissues of the American lobster Homarus americanus. Integr Comp Biol 42: 1291-1291.
Douglas Chodi Masui
98
Patchornik G, Goldshleger R & Karlish SJD (2000) The complex ATP-Fe
2+
serves as a specific
affinity cleavage reagent in ATP-Mg
2+
sites of a Na,K-ATPase: Altered ligation of Fe
2+
(Mg
2+
) ions accompanies the E
1
P -> E
2
P conformational change. Proc Natl Acad Sci USA
97: 11954-11959.
Patchornik G, Munson K, Goldshleger R, Shainskaya A, Sachs G & Karlish SJD (2002) The
ATP-Mg
2+
binding site and cytoplasmic domain interactions of Na
+
,K
+
-ATPase investigated
with Fe
2+
-catalyzed oxidative cleavage and molecular modeling. Biochemistry 41: 11740-
11749.
Paula S, Tabet MR & Ball Jr WJ (2005) Interactions between Cardiac Glycosides and
Sodium/Potassium-ATPase: Three-Dimensional Structure-Activity Relationship Models for
Ligand Binding to the E
2
-Pi Form of the Enzyme versus Activity Inhibition. Biochemistry
44: 498-510.
Pedemonte CH & Bertorello AM (2001) Short-term regulation of the proximal tubule Na
+
,K
+
-
ATPase: Increased/decreased Na
+
,K
+
-ATPase activity mediated by protein kinase C
isoforms. J Bioenerg Biomemb 33: 439-447.
Pedersen PA, Jorgensen JR & Jorgensen PL (2000) Importance of conserved alpha-subunit
segment
(709)
GDGVND for Mg
2+
binding, phosphorylation, and energy transduction in Na,K-
ATPase. J Biol Chem 275: 37588-37595.
Pedersen PA, Nielsen JM, Rasmussen JH & Jorgensen PL (1998) Contribution to Tl
+
, K
+
, and
Na
+
binding of Asn
(776)
, Ser
(775)
, Thr
(774)
, Thr
(772)
, and Tyr
(771)
in cytoplasmic part of fifth
transmembrane segment in alpha-subunit of renal Na,K-ATPase. Biochemistry 37: 17818-
17827.
Péqueux A & Gilles R (1981) Na
+
fluxes across isolated perfused gills of the Chinese crab
Eriocheir sinensis. J Exp Biol 92: 173-186.
Péqueux A (1995) Osmotic regulation in crustaceans. J Crust Biol 15: 1-60.
Péqueux A, Marchal A, Wanson S & Gilles R (1984) Kinetic characteristics and specific
activity of gill Na
+
,K
+
-ATPase in the euryhaline chinese crab, Eriocheir sinensis during
salinity acclimation. Mar Biol Lett 5: 35-45.
Peterson GL & Hokin LE (1981) Molecular weight and stoichiometry of the sodium- and
potassium- activated adenosine triphosphatase subunits. J Biol Chem 256: 3751-3761.
Pfeiffer R, Beron J & Verrey F (1999) Regulation of Na
+
pump function by aldosterone is alpha-
subunit isoform specific. J Physiol (London) 516: 647-655.
Piller SC, Henry RP, Doeller JE & Kraus DW (1995) A comparison of the gill physiology of
two euryhaline crab species, Callinectes sapidus and Callinectes similis: energy production,
transport-related enzymes and osmorregulation as a function of acclimation salinity. J Exp
Biol 198: 349-358.
Post RL (1999) Active transport and pumps. Current Topics in Membranes 48: 397-417.
Postel U, Petrausch G, Riestenpatt S, Weihrauch D, Malykh J, Becker W & Siebers D (1998)
Inhibition of Na
+
,K
+
-ATPase and of active ion-transport functions in the gills of the shore
crab Carcinus maenas induced by cadmium. Mar Biol 130: 407-416.
Pressley TA (1992) Phylogenetic conservation of isoform-specific regions within α-subunit of
(Na
+
,K
+
)-ATPase. Am J Physiol 262: C743-C751.
Pressley TA (1996) Structure and function of the Na,K pump: ten years of molecular biology.
Miner Electrolyte Metab 22: 264-271.
Pressley TA, Graves JS & Krall AR (1981) Amiloride-sensitive ammonium and sodium ion
transport in the blue crab. Am J Physiol 241: R370-R378.
Proverbio F, Marin R & Proverbio T (1991) The ouabain-insensitive sodium pump. Comp
Biochem Physiol 99A: 279-83.
Proverbio T, Zanders IP, Marín, R Rodriguez, JM & Provérbio F (1990) Effects of Na
+
and/or
K
+
on the Mg
2+
-dependent ATPase activities in shrimp (Macrobrachium amazonicum) gill
homogenates. Comp Biochem Physiol 97B: 383-390.
Rathmayer M & Siebers D (2001) Ionic balance in the freshwater-adapted Chinese crab,
Eriocheir sinensis. J Comp Physiol 171B: 271-281.
Read SM & Northcote DH (1981) Minimization of variation in the response to different
proteins of the coomassie blue-g dye-binding assay for protein. Analyt Biochem 116: 53-64.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
99
Rebelo MF, Santos EA & Monserrat JM (1999) Ammonia exposure of Chasmagnathus
granulata (Crustacea, Decapoda) Dana, 1851: accumulation in haemolymph and effects on
osmoregulation. Comp Biochem Physiol 122A: 429-435.
Reeves SA & Yamanaka MK (1993) Cloning and sequence analysis of the α-subunit of the cat
flea sodium pump. Insect Biochem. Mol Biol 23: 809-814.
Regnault M (1987) Nitrogen excretion in marine and freshwater crustacea. Biol Rev 62: 1-24.
Rezende, LA (2005) Caracterização cinética da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração microsomal do
tecido branquial do camarão marinho Xiphopenaeus kroyeri (Crustacea, Decapoda). Tese de
Doutorado. FFCLRP-Química/USP-Ribeirão Preto. 123 pp.
Rice WJ, Young HS, Martin DW, Sachs JR & Stokes DL (2001) Structure of Na
+
,K
+
-ATPase at
11-angstrom resolution: Comparison with Ca
2+
-ATPase in E
1
and E
2
states. Biophys J 80:
2187-2197
Richards JG, Semple JW, Bystriansky JS & Schulte PM (2003) Na
+
/K
+
-ATPase (alpha-isoform
switching in gills of rainbow trout (Oncorhynchus mykiss) during salinity transfer. J Exp
Biol 206: 4475-4486.
Riestenpatt S, Onken H & Siebers D (1996) Active absorption of Na
+
and Cl
-
across the gill
epithelium of the shore crab Carcinus maenas: voltage-clamp and ion-flux studies. J Exp
Biol 199: 1545-1554.
Riestenpatt S, Zeiske W & Onken H (1994) Cyclic AMP stimulation of electrogenic uptake of
Na
+
and Cl
-
across the gill epithelium of the Chinese crab Eriocheir sinensis. J Exp Biol 188:
159-174.
Robinson JD & Pratap PR (1991) (Na
+
,K
+
)-ATPase: modes of inhibition by Mg
2+
. Biochim
Biophys Acta 1061: 267-78.
Robinson JD (1970) Interactions between monovalent cations and the (Na
+
,K
+
)- dependent
adenosine triphosphatase. Arch Biochem Biophys 139: 17-27.
Robinson JD (1976) Substrate sites for the (Na
+
,K
+
) dependent ATPase. Biochim. Biophys.
Acta 429: 1006-1019.
Robinson JD (1981) Substituting manganese for magnesium alters certain reaction properties of
the Na,K-ATPase. Biochim Biophys Acta 642: 405-417.
Rome MS, Young-Williams AC, Davis GR & Hines AH (2005) Linking temperature and
salinity tolerance to winter mortality of Chesapeake Bay blue crabs (Callinectes sapidus) J
Exp Mar Biol Ecol 319: 129-145.
Rossi B, Gache C & Lazdunski M (1978) Specificity and interactions at the cationic sites of the
axonal (Na
+
,K
+
)-activated adenosinetriphosphatase. Eur J Biochem 85: 561-570.
Salgado-Commissariat D, Zandomeni R & Pedemonte CH (2001) Cytoplasmic segment
interactions in the alpha(1)-subunit of the rat Na
+
,K
+
-ATPase. Clin Exp Hypertension 23:
479-488.
Sanchez G & Blanco G (2004) Residues within transmembrane domains 4 and 6 of the Na,K-
ATPase alpha subunit are important for Na
+
selectivity. Biochemistry 43: 9061-9074.
Santos FH & McNamara JC (1996) Neuroendocrine modulation of osmoregulatory parameters
in the freshwater shrimp Macrobrachium olfersii (Wiegmann) (Crustacea, Decapoda). J Exp
Mar Biol Ecol 206: 109-120.
Sarver RG, Flynn MA & Holliday CW (1994) Renal Na,K-ATPase and osmoregulation in the
crayfish, Procambarus clarkii. Comp Biochem Phys 107A: 349-356.
Savage JP & Robinson GD (1983) Inducement of increased gill (Na
+
,K
+
)-ATPase activity by a
hemolymph factor in hyperosmoregulating Callinectes sapidus. Comp Biochem Physiol 75:
65-69.
Scheiner-Bobis G & Schreiber S (1999) Glutamic acid 472 and lysine 480 of the sodium pump
alpha 1 subunit are essential for activity. Their conservation in pyrophosphatases suggests
their involvement in recognition of ATP phosphates. Biochemistry 38: 9198-9208.
Scheiner-Bobis G (1998) lon-transporting ATPases as ion channels. Naunyn-Schmiedeberg's
Arch Pharmacol 357: 477-482.
Scheiner-Bobis G (2002) The sodium pump - Its molecular properties and mechanics of ion
transport. Eur J Biochem 269: 2424-2433.
Douglas Chodi Masui
100
Schleich CE, Goldemberg LA & Mananes AAL (2001) Salinity dependent Na,K-ATPase
activity in gills of the euryhaline crab Chasmagnathus granulata. Gen Physiol Biophys 20:
255–266.
Schneeberger A & Apell HJ (2001) Ion selectivity of the cytoplasmic binding sites of the Na,K-
ATPase: II. Competition of various cations. J Membrane Biol 179: 263-273
Schneeberger A & Apell HJ (1999) Ion selectivity of the cytoplasmic binding sites of the Na,K-
ATPase: I. Sodium binding is associated with a conformational rearrangement. J Membr
Biol 168: 221-228.
Schoner W (2002) Endogenous cardiac glycosides, a new class of steroid hormones. Eur J
Biochem 269: 2440-2448.
Schoner W, von Ilberg C, Kramer R & Seubert W (1967) On the mechanism of Na
+
- and K
+
-
stimulated hydrolysis of adenosine triphosphate. 1. Purification and properties of a Na
+
- and
K
+
-activated ATPase from ox brain. Eur J Biochem 1: 334-343.
Segall L, Daly SE & Blostein R (2001) Mechanistic basis for kinetic differences between the rat
α(1), α(2), and α(3) isoforms of the (Na
+
,K
+
)-ATPase. J Biol Chem 276: 31535-31541.
Segall L, Daly SE, Boxenbaum N, Lane LK & Blostein R (2000) Distinct catalytic properties of
the α(1), α(2) and α(3) isoforms of the rat (Na
+
,K
+
)-ATPase. Biophys J 78: 456.
Seok JH, Kim JB, Hong JH, Sung JY, Hur GM, Lim K & Lee JH (1998) Regulation of Na,K-
ATPase activity in renal basolateral membrane of 1-clip-1-kidney hypertensive rat. Biochem
Mol Biol Int 46: 667-672.
Shainskaya A, Schneeberger A, Apell HJ & Karlish SJD (2000) Entrance port for Na
+
and K
+
ions on Na
+
,K
+
-ATPase in the cytoplasmic loop between transmembrane segments M6 and
M7 of the alpha subunit - Proximity of the cytoplasmic segment of the beta subunit. J Biol
Chem 275: 2019-2028.
Siebers D, Winkler A, Leweck K & Madian A (1983) Regulation of sodium in the shore crab
Carcinus maenas, adapted to environments of constant and changing salinities. Helgolander
Meeresunters 36: 303–312.
Siebers D, Winkler A, Lucu C, Thedens G & Weichart D (1985) Na,K-ATPase generates an
active-transport potential in the gills of the hyperregulating shore crab Carcinus maenas.
Mar Biol 87: 185-192.
Skou JC & Esmann M (1992) The Na,K-ATPase. J Bioenerg Biomemb 24: 249-261.
Skou JC (1960) Further investigations on a Mg
2+
+Na
+
-activated adenosine triphosphatase,
possibly related to the active, linked transport of Na
+
and K
+
across the nerve membrane.
Biochim Biophys Acta 42: 6-23.
Skou JC (1962) Preparation of mammalian brain and kidney of the enzyme system involved in
active transport of Na
+
and K
+
. Biochim Biophys Acta 58: 314-325.
Skou JC (1998) The identification of the sodium-potassium pump (Nobel Lecture). Angew
Chem Int Ed 37: 2320-2328.
Sommer MJ & Mantel LH (1988) Effect of dopamine cyclic AMP and pericardial organs on
sodium uptake and Na/K-ATPase activity in gills of the green crab Carcinus maenas (L). J
Exp Zool 248: 272-277.
Sommer MJ & Mantel LH (1991) Effects of dopamine and acclimation to reduced salinity on
the concentration of cyclic AMP in the gills of the green crab, Carcinus maenas (L). Gen
Comp Endocrinol 82: 364-368.
Sorensen TLM, Moller JV & Nissen P (2004) Phosphoryl transfer and calcium ion occlusion in
the calcium pump. Science 304: 1672–1675.
Spanings-Pierrot C, Soyez D, Van Herp F, Gompel M, Skaret G, Grousset E & Charmantier G
(2000) Involvement of crustacean hyperglycemic hormone in the control of gill ion transport
in the crab Pachygrapsus marmoratus. Gen Comp Endocrinol 119: 340-350.
Specht SC, Rodriguez C, Quiñones L & Velazquez S (1997) Effect of high ionic strength and
inhibitors of H,K-ATPase on the ouabain-sensitive K-p-Nitrophenylphosphatase activity in
the sea anemone Stichodactyla helianthus. Comp Biochem Physiol 117B: 217-224.
Stern S, Borut A & Cohen D (1984) Characterization of (Na
+
,K
+
)-ATPase from the gills of the
freshwater prawn Macrobrachium rosenbergii (De Man). Comp Biochem Physiol 79B: 47-
50.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
101
Su P & Scheiner-Bobis G (2004) Lys
(691)
and Asp
(714)
of the Na
+
/K
+
-ATPase alpha subunit are
essential for phosphorylation, dephosphorylation, and enzyme turnover. Biochemistry 43:
4731-4740.
Summa V, Mordasini D, Roger F, Bens M, Martin PY, Vandewalle A, Verrey F & Feraille E
(2001) Short term effect of aldosterone on Na,K-ATPase cell surface expression in kidney
collecting duct cells. J Biol Chem 276: 47087-47093.
Sun BH & Salvaterra PM (1995a) Characterization of nervana, a Drosophila melanogaster
neuron-specific glycoprotein antigen recognized by anti-horseradish peroxidase antibodies. J
Neurochem 65: 434-443.
Sun BH & Salvaterra PM (1995b) 2 Drosophila nervous system antigens, Nervana-1 and
Nervana-2, are homologues to the beta subunit of (Na
+
,K
+
)-ATPase. Proc Natl Acad Sci
USA 92: 5386-5400.
Sun BH, Wang WY & Salvaterra PM (1998) Functional analysis and tissue-specific expression
of Drosophila Na
+
,K
+
-ATPase subunits. J Neurochem 71: 142-151.
Sweadner KJ & Donnet C (2001) Structural similarities of Na,K-ATPase and SERCA, the
Ca2+-ATPase of the sarcoplasmic reticulum. Biochem J 356: 685-704.
Sweadner KJ & Feschenko MS (2001) Predicted location and limited accessibility of protein
kinase A phosphorylation site on Na-K-ATPase. Am J Physiol 280: C1017-C1026.
Sweadner KJ (1989) Isozymes of the Na,K-ATPase. Biochim Biophys Acta 988: 185-220.
Sweadner KJ, Arystarkhova E, Donnet C & Wetzel RK (2003) FXYD proteins as regulators of
the (Na
+
,K
+
)-ATPase in the kidney. Ann NY Acad Sci 986: 382-387.
Sweeney G & Klip A (1998) Regulation of the (Na
+
,K
+
)-ATPase by insulin: Why and how?
Mol Cell Biochem 182: 121-133.
Takeda K & Kawamura M (2001) The functional unit of Na,K-ATPase is a monomeric alpha
beta protomer. Biochem Biophys Res Commun 280: 1364-1366.
Taniguchi K, Kaya S, Abe K & Mardh S (2001) The oligomeric nature of Na/K-transport
ATPase. J Biochem 129: 335-342.
Taylor HH & Taylor EW (1992) Gills and lungs: The exchange of gases and íons. In: F.W.
Harrison and A.G. Humas (Eds.), Microscopic anatomy of invertebrates, Vol 10, Decapoda,
Crustacea, pp.203-293, Wiley-liss, New York.
Teixeira VL, Katz AI, Pedemonte CH & Bertorello AM (2003) Isoform-specific regulation of
(Na
+
,K
+
)-ATPase endocytosis and recruitment to the plasma membrane. Ann NY Acad Sci
986: 587-594.
Tentes I & Stratakis E (1991) Partial purification and properties of Na,K-ATPase from Potamon
potamios. Comp Biochem Physiol 100C: 619-624.
Teramachi S, Imagawa T, Kaya S & Taniguchi K (2002) Replacement of several single amino
acid side chains exposed to the inside of the ATP-binding pocket induces different extents of
affinity change in the high and low affinity ATP-binding sites of rat Na/K-ATPase. J Biol
Chem 277: 37394-37400.
Therien AG & Blostein R (1999) K
+
/Na
+
antagonism at cytoplasmic sites of (Na
+
,K
+
)-ATPase:
a tissue-specific mechanism of sodium pump regulation. Am J Physiol 277C: 891-898.
Therien AG & Blostein R (2000) Mechanisms of sodium pump regulation. Am J Physiol 279C:
541-566.
Therien AG, Karlish SJD & Blostein R (1999) Expression and Functional Role of the γ-Subunit
of the Na,K-ATPase in Mammalian Cells. J Biol Chem 274: 12252–12256.
Therien AG, Nestor NB, Ball WJ & Blostein R (1996) Tissue-specific versus isoform-specific
differences in cation activation kinetics of the (Na
+
,K
+
)-ATPase. J Biol Chem 272: 32628-
32634.
Thurman C (2003) Osmoregulation in fiddler crabs (Uca) from temperate Atlantic and Gulf of
Mexico coasts of North America. Mar Biol 142: 77-92.
Toustrup-Jensen M & Vilsen B (2003) Importance of conserved Thr
(214)
in domain A of the
Na
+
,K
+
-ATPase for stabilization of the phosphoryl transition state complex in E2P
dephosphorylation. J Biol Chem 278: 11402-11410.
Douglas Chodi Masui
102
Toustrup-Jensen M & Vilsen B (2005) Interaction between the Catalytic Site and the A-M3
Linker Stabilizes E2/E2P Conformational States of Na,K-ATPase. J Biol Chem 280: 10210-
10218.
Towle DW & Holleland T (1987) Ammonium ion substitutes for K
+
in ATP-dependent Na
+
transport by basolateral membrane-vesicles. Am J Physiol 252: R479- R489.
Towle DW & Holleland T (1987) Ammonium ion substitutes for K
+
in ATP-dependent Na
+
transport by basolateral membrane-vesicles. Am Journal Physiol 252: R479-R489.
Towle DW & Kays WT (1986) Basolateral localization of (Na
+
,K
+
)-ATPase in gill epithelium
of 2 osmoregulating crabs, Callinectes sapidus and Carcinus maenas. J Exp Zool 239: 311-
318.
Towle DW & Weihrauch D (2001) Osmoregulation by gills of euryhaline crabs: Molecular
analysis of transporters. Am Zool 41: 770-780.
Towle DW & Weihrauch D (2001) Osmoregulation by gills of euryhaline crabs: Molecular
analysis of transporters. Am Zool 41: 770-780.
Towle DW (1984) Membrane-bound ATPases in arthropod íon-transporting tissues. Amer Zool
24: 177-185.
Towle DW (1993) Ion transport systems in membrane vesicles isolated from crustacean tissues.
J Exp Zool 265: 387-396.
Towle DW (1997) Molecular approaches to understanding salinity adaptation of estuarine
animals. Amer Zool 37: 575-584.
Towle DW, Palmer GE & Harris JL (1976) Role of gill Na
+
,K
+
-dependent ATPase in
acclimation of blue crabs (Callinectes sapidus) to low salinity. J Exp Zool 196: 315-321.
Towle DW, Paulsen RS, Weihrauch D, Kordylewski M, Salvador C, Lignot JH & Spanings-
Pierrot C (2001) (Na
+
,K
+
)-ATPase in gills of the blue crab Callinectes sapidus: cDNA
sequencing and salinity-related expression of α-subunit mRNA and protein. J Exp Biol 204:
4005-4012.
Toyoshima C & Mizutani T (2004) Crystal structure of the calcium pump with a bound ATP
analogue. Nature 430: 529-535.
Toyoshima C & Nomura H (2002) Structural changes in the calcium pump accompanying the
dissociation of calcium. Nature 418: 605-611.
Toyoshima C, Nakasako M, Nomura H & Ogawa H (2000) Crystal structure of the calcium
pump of sarcoplasmic reticulum at 2.6 angstrom resolution. Nature 405: 647-655.
Toyoshima C, Nomura H & Sugita Y (2003) Crystal structures of Ca
2+
-ATPase in various
physiological states. Ann NY Acad Sci 986: 1-8.
Tran CM & Farley RA (1999) Catalytic activity of an isolated domain of Na,K-ATPase
expressed in Escherichia coli. Biophys J 77: 258-66.
Tresguerres M, Onken H, Perez AF & Luquet CA (2003) Electrophysiology of posterior, NaCl-
absorbing gills of Chasmagnathus granulatus: rapid responses to osmotic variations. J Exp
Biol 206: 619-626.
Tsoi KH, Chiu KM & Chu KH (2005) Effects of temperature and salinity on survival and
growth of the amphipod Hyale crassicornis (Gammaridea, Hyalidae). J Nat Hist 39: 325-
336.
Tsuda T, Kaya S, Yokoyama T, Hayashi Y & Taniguchi K (1998a) Half-site modification of
Lys-480 of the Na
+
,K
+
-ATPase α-chain with pyridoxal 5’-diphospho-5’-adenosine reduces
ATP-dependent phosphorylation stoichiometry from half to a quarter. J Biol Chem 273:
24334-24338.
Tsuda T, Kaya S, Yokoyama T, Hayashi Y & Taniguchi K (1998b) ATP and acetyl phosphate
induces molecular events near the ATP binding site and the membrane domain of Na
+
,K
+
-
ATPase. J Biol Chem 273: 24339-24345.
Vasilets LA (2002) Mechanisms of short-term regulation of the (Na
+
,K
+
)-ATPase by protein
kinases. Biol Memb 19: 77-82.
Vilsen B & Andersen JP (1998) Mutation to the glutamate in the fourth membrane segment of
Na
+
,K
+
-ATPase and Ca
2+
-ATPase affects cation binding from both sides of the membrane
and destabilizes the occluded enzyme forms. Biochemistry 37: 10961-10971.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
103
Vilsen B (1995) Mutant Glu781→Ala of the rat kidney (Na
+
,K
+
)-ATPase displays low cation
affinity and catalyzes ATP hydrolysis at a high rate in the absence of potassium ions.
Biochemistry 34: 1455-1463.
Vilsen B (1999) Mutant Phe788→Leu of the Na
+
,K
+
-ATPase is inhibited by micromolar
concentrations of potassium and exhibits high Na
+
-ATPase activity at low sodium
concentrations. Biochemistry 38: 11389-11400.
Wall SM (1996) Ammonium transport and the role of the Na,K-ATPase Miner Electrol Metab
22: 311-317.
Wall SM (1997) Ouabain reduces net acid secretion and increases pH(i) by inhibiting NH
4
+
uptake on rat tIMCD Na
+
,K
+
-ATPase. Am J Physiol 42: F857-F868.
Wall SM, Davis BS, Hassell KA, Mehta P & Park SJ (1999) In rat tIMCD, NH
4
+
uptake by
Na
+
,K
+
-ATPase is critical to net acid secretion during chronic hypokalemia. Am J Physiol
Physiol 277: F866-F874.
Wang SG & Farley RA (1998) Valine 904, tyrosine 898, and cysteine 908 in Na,K-ATPase
alpha subunits are important for assembly with beta subunits. J Biol Chem 273: 29400-
29405.
Wang XQ & Yu SP (2005) Novel regulation of Na
+
,K
+
-ATPase by Src tyrosine kinases in
cortical neurons. J Neurochem 93: 1515-1523.
Wanson S, Pequeux A & Roer R (1984) Na
+
regulation and (Na
+
,K
+
)-ATPase activity in the
euryhaline fiddler crab Uca minax (Le Conte) Comp Biochem Physiol 79A: 673-678.
Ward DG & Cavieres JD (1993) Solubilized αβ Na,K-ATPase remains protomeric during
turnover yet shows apparent negative cooperativity toward ATP. Proc Natl Acad Sci USA
90: 5332-5336.
Ward DG & Cavieres JD (1998) Affinity labeling of two nucleotide sites on Na,K-ATPase
using 2’(3’)-O-(2,4,6-trinitrophenyl) 8-azidoadenosine 5’-[alpha-P-32]diphosphate (TNP-
8N(3)-[alpha-P-32]ADP) as a photoactivatable probe - Label incorporation before and after
blocking the high affinity ATP site with fluorescein isothiocyanate. J Biol Chem 273:
33759-33765.
Weber LI & Levy JA (2000) Genetic population structure of the swimming crab Callinectes
danae (Crustacea: Decapoda) in southern Brazil. Hydrobiologia 420: 203-210.
Weihrauch D, Becker W, Postel U, Luck-Kopp S & Siebers D (1999) Potential of active
excretion of ammonia in three different haline species of crabs. J Comp Physiol 169B: 25-
37.
Weihrauch D, Morris S & Towle DW (2004) Ammonia excretion in aquatic and terrestrial
crabs. J Exp Biol 207: 4491-504.
Weihrauch D, Ziegler A, Siebers D & Towle DW (2001) Molecular characterization of V-type
H
+
-ATPase (β-subunit) in gills of euryhaline crabs and its physiological role in
osmoregulatory ion uptake. J Exp Biol 204: 25-37.
Weihrauch D, Ziegler A, Siebers D & Towle DW (2002) Active ammonia excretion across the
gills of the green shore crab Carcinus maenas: participation of (Na
+
,K
+
)-ATPase, V-type H
+
-
ATPase and functional microtubules. J Exp Biol 205: 2765-2775.
Weihrauch Dirk, McNamara JC, Towle DW& Onken H (2004b) Ion-motive ATPases and
active, transbranchial NaCl uptake in the red freshwater crab, Dilocarcinus pagei
(Decapoda, Trichodactylidae). J Exp Biol 207: 4623-4631.
Wetzel RK & Sweadner KJ (2001) Immunocytochemical localization of Na-K-ATPase alpha-
and gamma-subunits in rat kidney. Am J Physiol 281: F531-F545.
Wheatly MG (1999) Calcium homeostasis in crustacea: The evolving role of branchial renal
digestive and hypodermal epithelia. J Exp Zool 283: 620-640.
Wilder MN, Huong DTT, Atmomarsono M, Tran TTH, Phu TQ & Yang WJ (2000)
Characterization of Na/K-ATPase in Macrobrachium rosenbergii and the effects of
changing salinity on enzymatic activity. Comp Biochem Physiol 125A: 377-388.
Wilkie MP (1997) Mechanisms of ammonia excretion across fish gills. Comp Biochem Physiol
118A: 39-50.
Williams AB (1974) Swimming crabs of genus Callinectes (Decapoda-Portunidae) Fish Bull
72: 685-768
Douglas Chodi Masui
104
Winkler A (1986) Effects of inorganic sea-water constituents on branchial Na,K-ATPase
activity in the shore crab Carcinus maenas. Mar Biol 92: 537-544.
Woo AL, James PF & Lingrel JB (1999) Characterization of the fourth alpha isoform of the
NaK-ATPase. J Membr Biol 169: 39-44.
Wu BJ, Else PL, Storlien LH & Hulbert AJ (2001) Molecular activity of Na
+
/K
+
-ATPase from
different sources is related to the packing of membrane lipids. J Exp Biol 204: 4271-4280.
Xu PZ, Sun BH & Salvaterra PM (1999) Organization and transcriptional regulation of
Drosophila Na
+
,K
+
-ATPase beta subunit genes: Nrv1 and Nrv2. Gene 236: 303-313.
Yamazaki A, Kaya S, Tsuda T, Araki Y, Hayashi Y & Taniguchi K (1994) An extra
phosphorylation of (Na
+
,K
+
)-ATPase by para-nitrophenylphosphate (pNPP): evidence for
the oligomeric nature of the enzyme. J Biochem (Tokyo) 116: 1360-1369.
Yokoyama T, Kaya S, Abe K, Taniguchi K, Katoh T, Yazawa M, Hayashi Y & Mardh S (1999)
Acid-labile ATP and/or ADP/P-i binding to the tetraprotomeric form of Na/K-ATPase
accompanying catalytic phosphorylation-dephosphorylation cycle. J Biol Chem 274: 31792-
31796.
Zare S & Greenaway P (1998) The effect of moulting and sodium depletion on sodium transport
and the activities of and V-ATPase in the freshwater crayfish Cherax destructor (Crustacea
Parastacidae). Comp Biochem Physiol 119A: 739-745.
Zouzoulas A, Dunham PB & Blostein R (2005) The Effect of the Gamma Modulator on Na/K
Pump Activity of Intact Mammalian Cells. J Membr Biol 204: 49-56.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
105
CURRÍCULO VITAE
Douglas Chodi Masui
Natural de Ribeirão Preto, SP (21/08/1975).
Formação:
Graduação: Departamento de Biologia – Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de
Ribeirão Preto – USP.
-Bacharel em Ciências Biológicas, 1999.
-Licenciado em Ciências Biológicas, 1999.
Mestrado: Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP – Mestre
em Ciências, área de concentração: Biologia Comparada.
Título da Dissertação: Caracterização cinética da (Na
+
,K
+
)-ATPase da fração
microsomal de tecido branquial de Callinectes danae (Crustacea, Portunidae).
Setembro, 2002.
Orientador: Prof. Dr. Francisco de Assis Leone.
Artigos publicados em revistas de circulação internacional:
1.Masui DC, Furriel RPM, Silva ECC, Mantelatto FLM, McNamara JC, Barrabin H,
Scofano H, Fontes CFL & Leone FA (2005) Gill microsomal (Na
+
,K
+
)-ATPase from
the blue crab Callinects danae: Interactions at cationic sites. Int. J. Biochem. Cell.
Biol. 37: 2521–2535.
2.Masui DC, Furriel RPM, Mantelatto FLM, McNamara JC & Leone FA (2005) K
+
-
phosphatase activity of gill (Na
+
,K
+
)-ATPase from the swimming crab, Callinectes
danae: low-salinity acclimation and expression of the alpha-subunit. J. Exp. Zool.
303A: 294-307.
3.Leone FA, Furriel RPM, McNamara JC, Mantelatto FLM, Masui DC, Rezende LA,
Gonçalves RR & Garçon DP (2005) (Na
+
,K
+
)-ATPase from crustacean gill
microsomes: a molecular marker to evaluate adaptation to biotopes of different
salinity. Trends Comp. Biochem. Physiol. 11: 1-15.
Douglas Chodi Masui
106
4.Mendonça NN, Masui DC, McNamara JC, Leone FA & Furriel RPM (2005) Long-
term exposure of the freshwater shrimp Macrobrachium olfersii to elevated salinity:
effects on gill (Na
+
,K
+
)-ATPase α-subunit expression and K
+
-phosphatase activity
Comp. Biochem. Physiol. (no prelo).
5.Bogo KR, Masui DC, Leone FA, Jorge JA & Furriel RPM (2006) Purification and
characterization of a conidial alkaline phosphatase from an osmotic-sensitive mutant
(os-1) of Neurospora crassa. Folia Microbiol. (no prelo).
6.Caseli L, Masui DC, Furriel RPM, Leone FA & Zaniquelli MED (2005) Adsorption
kinetics and dilatational rheological studies for the soluble and anchored forms of
alkaline phosphatase at the air/water interface. J. Brazilian Chem. Soc. 16: 969 –
977.
7.Caseli L, Oliveira RG, Masui DC, Furriel RPM, Leone FA, Maggio B & Zaniquelli
MED (2005) Effect of molecular surface packing on enzymatic activity modulation
of an anchored protein on phospholipid Langmuir monolayers. Langmuir. 21: 4090 –
4095.
8.Caseli L, Masui DC, Furriel RPM, Leone FA & Zaniquelli MED (2005) Incorporation
conditions guiding the aggregation of a glycosylphosphatidyl inositol (GPI)-
anchored protein in Langmuir monolayers.
Colloid Surface B 46: 248 – 254.
9.Furriel RPM, Masui DC, McNamara JC & Leone FA (2004) Modulation of gill
(Na
+
,K
+
)-ATPase activity by ammonium ions: Putative coupling of nitrogen
excretion and ion uptake in the freshwater shrimp Macrobrachium olfersii. J. Exp.
Zool. 301A: 63 – 74.
10.Masui DC, Furriel RPM, Mantelatto FLM, McNamara JC & Leone FA (2003) Gill
(Na
+
,K
+
)-ATPase from the blue crab Callinectes danae: modulation of K
+
-
phosphatase activity by potassium and ammonium ions.. Comp. Biochem. Physiol.
134B: 631 – 640.
A (Na
+
,K
+
)-ATPase de Callinectes danae
107
11.Masui DC, Furriel RPM, McNamara JC, Mantelatto FLM & Leone FA (2002)
Modulation by ammonium ions of microsomal (Na
+
,K
+
)-ATPase in the swimming
crab Callinectes danae: a possible mechanism for regulation of ammonia excretion.
Comp. Biochem. Physiol. 132C: 71 - 482.
Artigos resumidos publicados em revistas de circulação internacional:
1.Silva ECC, Masui DC, Furriel RPM, Leone FA, Barrabin H, Scofano H & Fontes
CFL (2005) Polyamines as regulators of Callinectes danae gill (Na
+
,K
+
)-ATPase J.
Gen. Physiol. 126: 57A - 57A.
2.Caseli L, Zaniquelli MED, Masui DC, Leone FA, Furriel RPM, Orbulescu J &
Leblanc RM (2004) Lagmuir film study of rat osseous alkaline phosphatase.
Abstracts of Papers of the American Chem. Soc. 228: U290 - U290.
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