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ALICIA VIVIANA PINTO
Caracterização bioquímica e genética da proteína MutS2 de
Helicobacter pylori
Tese apresentada ao Curso de Pós-Graduação em
Ciências do Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
da Universidade Federal do Rio de Janeiro, como
requisito para a obtenção do título de Doutor em
Ciências.
Orientadores: Prof. Dr. Alvaro Augusto da Costa Leitão
Dr. Juan Pablo Radicella.
RIO DE JANEIRO
2007
I
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II
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PINTO, Alicia Viviana.
Caracterização bioquímica e genética da proteína MutS2
de Helicobacter pylori. Rio de Janeiro, UFRJ, Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Biologia Molecular e
Estrutural, 2007.
XVII, 212 f.
Orientadores: Dr. Alvaro Augusto da Costa Leitão e Dr. Juan
Pablo Radicella.
Tese (doutorado). UFRJ/IBCCF/Programa de Biologia Molecular
e Estrutural. 2007.
1. Helicobacter pylori. 2. proteína MutS2. 3. Diversidade gênica.
4. Integração de DNA exógeno.
I. Dr. Alvaro Augusto da Costa Leitão
II. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Instituto de
Biofísica Carlos Chagas Filho. Programa de Biologia
Molecular e Estrutural.
III. Título.
III
O presente trabalho foi desenvolvido no Laboratório de Radiobiologia Molecular do
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal de Rio de Janeiro, sob a
orientação do Dr. Alvaro Augusto da Costa Leitão, e no Laboratório de Recherche sur
l'Instabilité Génétique do Institut de Radiobiologie Cellulaire et Moléculaire,
Commissariat a l'Energie Atomique, França, sob a orientação do Dr. Juan Pablo Radicella e
desenvolvido em colaboração com a Unité de Pathogenèse Bactérienne des Muqueuses do
Institut Pasteur, França (Dra. Agnès Labigne) e com o Departamento de Genética da
Univesidad de Sevilla, Espanha (Dr. Josep Casadesus).
Este trabalho foi realizado, em parte, dentro do projeto de colaboração internacional
CAPES-COFECUB e contou com os auxílios das seguintes agências de fomento: CNPq,
CAPES e FAPERJ.
IV
AGRADECIMENTOS
Aos meus orientadores: Alvaro Leitão e Pablo Radicella. Obrigada pelas oportunidades,
pela disponibilidade irrestrita, apoio, liberdade e enorme confiança, que fizeram possível a minha
formação tanto acadêmica como pessoal.
A Agnès Labigne, pour m’avoir accueilli dans son labo a l’Institut Pasteur, pour sa
crédibilité dans mon travail et son soutien pendant ces années.
A Marcelo de Pádula pela segurança, conhecimento e confiança. Obrigada por ter me
dado a oportunidade de admirá-lo não só pela sua capacidade profissional.
À Serge Boiteux, pour sa dedication à la science. Merci d’avoir partagé avec moi un peux
de expérience e connaissance cientifique.
A Josep Casadesús, por la oportunidad de ser parte de su grupo de trabajo, por las
conversaciones e ideas. Muchas gracias también, a todos los integrantes del laboratório de
Genética Bacteriana de la Universidad de Sevilla, especialmente a Meritxell, por su interes y
disponibilidad para discusiones.
A mis queridos amigos y compañeros del Instituto Leloir en Buenos Aires, experiencia
esencial para mi vida académica. A Eyleen O’Rourke por haberme transmitido gran parte de su
excelente conocimiento con enorme y desinteresada generosidad y a Patricia Abdian por su
amistad y compañerismo a prueba de tiempo y distancia.
À mes collègues de l´Unité de Pathogénie Bacteriènne des Muqueuses de l’Institut
Pasteur, spécialement à Chantal et Monica pour l´accueil chaleureux et pour l’enorme aide avec
les manips sur des Helicobacters.
À mes collègues du labo de la Réparation de l’ADN et du labo de Recherche sur
l’Instabilité Génétique. Spécialement a Claudine, Patricia, Guenaëlle et Marie du LRD et
Stephanie, Anne T, Thierry et Rachel du LRIG. Mes chères amis, depuis septembre 2001 j’ai
V
votre soutien que m’a accompagné à travers des manips, des labos, des pays et des langues. Je
tiens bien à vous remercier enormement!
Aos meus companheiros do laboratório de Radiobiologia Molecular do IBCCF pela
grande ajuda, o fácil convívio e pelos momentos descontraídos no dia-a-dia. Obrigada a Janine e
Rita pela inestimável ajuda em todo momento.
Ao Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, aos coordenadores do curso de Pós-
Graduação em Ciências Biológicas –Biofísica- e a seus professores pelo conhecimento
compartilhado. A Sra Sandra Brito pela ajuda dispensada.
Ao CNPq e CAPES/COFECUB pelo suporte financeiro.
A mi familia Edelweis, Vicente y Marcelo que son mi inspiración y estímulo. GRACIAS
por el amor constante, el apoyo inquestionable y el respeto indiscutible a mis decisiones.
GRACIAS por soportar mis ausencias y compartir mis tristezas. GRACIAS por alimentar mis
sueños y darme las fuerzas necesárias para alcanzarlos. A ellos les dedico este trabajo.
VI
A mis padres Edelweis y Vicente.
A mi marido Marcelo
A la memória de mis abuelos Marcelina, Luis, Natalia y Florentino.
Flectere si nequeo superos, acheronta movebo
(Si no puedo doblegar a los dioses del cielo, conmoveré a los poderes del infierno)
Virgílio (ÆNEIS 7. 312)
VII
Sumário.
LISTA DE FIGURAS.............................................................................................................XI-XII
LISTA DE TABELAS.................................................................................................................XIII
ABREVIATURAS E SÍMBOLOS......................................................................................XIV-XV
RESUMO....................................................................................................................................XVI
ABSTRACT...............................................................................................................................XVII
1. Introdução...................................................................................................................................1
1.1. H. pylori como organismo patógeno.........................................................................................1
1.2. H. pylori e variabilidade gênica.................................................................................................3
1.2.1. Vantagens da variabilidade gênica?........................................................................................5
1.2.2. Origens da variabilidade gênica.............................................................................................7
1.3. Transformação Natural..............................................................................................................8
1.3.1. Incorporação de DNA.............................................................................................................9
1.3.2. Integração do DNA no cromossomo (por recombinação homóloga)..................................11
1.4. Sistemas de Reparação do DNA..............................................................................................15
1.4.1. Reparação por Excisão de Nucleotídeos (NER)...................................................................15
1.4.2. Reparação por Excisão de Bases (BER)...............................................................................17
1.4.3. Reparação de Emparelhamentos Errôneos (MMR)..............................................................20
1.4.3.1. Singularidades do MMR em H. pylori..............................................................................22
1.4.3.2. MutS de H. pylori..............................................................................................................23
2. Objetivos....................................................................................................................................28
3. Material e Métodos...................................................................................................................30
3.1. Cepas, plasmídeos e fagos.......................................................................................................30
3.2. Meios e condições de cultura...................................................................................................34
3.3. Construção de cepas mutantes mutS2 em H. pylori.................................................................35
3.4. Construção dos substratos utilizados nos ensaios in vivo........................................................36
3.5. Procedimentos genéticos em H. pylori....................................................................................37
3.5.1. Taxa de mutagenêse espontânea em H. pylori......................................................................37
3.5.2. Integração de DNA em H. pylori..........................................................................................37
3.6. Procedimentos genéticos em E. coli........................................................................................38
3.6.1. Mutagenêse...........................................................................................................................38
3.6.2. Conjugação...........................................................................................................................38
3.7. Clonagens para superprodução de proteínas...........................................................................39
3.7.1. Mutagenêse sítio-dirigida.....................................................................................................40
3.8. Purificação das proteínas recombinantes.................................................................................41
3.8.1. Resinas..................................................................................................................................41
3.8.2. Tampões................................................................................................................................42
3.8.3. Procedimentos em FPLC......................................................................................................44
3.8.4. Superprodução e purificação de HpMutS a partir da fusão GST-HpMutS..........................44
3.8.5. Superprodução e purificação de HpMutS a partir da fusão MBP-HpMutS.........................45
3.8.6. Superprodução e purificação de HpMutS sem proteína de fusão.........................................46
3.8.7. Superprodução e purificação de HpMutS, HpMutSG338R e HpMutSΔSmr a partir
das fusões proteína de interesse·His.....................................................................................46
VIII
3.9. Substratos utilizados nos ensaios in vitro................................................................................47
3.10. Hidrólise de ATP...................................................................................................................48
3.10.1. Análise de parâmetros pelo método da dupla recíproca de Lineweaver-Burk...................49
3.10.2. Análise de parâmetros pelo método de Hanes-Wolf..........................................................49
3.11. Análise de multimerização de HpMutS.................................................................................49
3.11.1. Filtração molecular.............................................................................................................49
3.11.2. Gradiente de sacarose.........................................................................................................50
3.12. Ensaios de ligação ao DNA...................................................................................................50
3.12.1. Análise dos complexos HpMutS/DNA por retardo em gel................................................51
3.12.2. Análise dos complexos HpMutS/DNA por retenção em filtro...........................................51
3.12.3. Análise de Scatchard..........................................................................................................52
3.13. Troca de fitas de DNA...........................................................................................................52
3.14. Construção de cepas mutantes smr em H. pylori...................................................................54
3.15. Superprodução e purificação de HpSmr a partir da fusão His·HpSmr..................................55
3.16. Superprodução e purificação de EcYdaL e EcYfcN a partir das fusãoes
His·proteína de interesse.......................................................................................................56
3.17. Superprodução e purificação de ScSMR a partir da fusão His·SMR....................................57
3.18. Atividade Nucleásica.............................................................................................................57
3.18.1. Ensaios utilizando DNA plasmidial como substrato..........................................................57
3.18.2. Ensaios utilizando oligonucleotídeos como substratos......................................................58
3.19. Construção de cepas mutantes ydaL e yfcN em S. typhimurium...........................................58
3.20. Procedimentos genéticos em S. typhimurium........................................................................59
3.20.1. Segregação de duplicações cromossômicas.......................................................................59
3.20.2. Sensibilidade a agentes genotóxicos...................................................................................60
3.20.3. Mutagenêse espontânea e induzida.....................................................................................60
3.21. Construção de cepas mutante YPL199c em S. cerevisiae......................................................61
3.22. Procedimentos genéticos em S. cerevisiae............................................................................62
3.22.1. Mutagenêse e reversão espontânea.....................................................................................62
3.22.2. Sensibilidade a UVC e radiação γ.......................................................................................62
3.22.3. Sensibilidade a MMS..........................................................................................................63
3.22.4. Análise de viabilidade e distribuição de esporos................................................................63
4. Resultados..................................................................................................................................64
4.1. Estudo de HpMutS...................................................................................................................64
4.1.1. Caracterização genética de hpmutS......................................................................................64
4.1.1.1. Avaliação do fenótipo de MMR em cepas mutS...............................................................64
4.1.1.2. Avaliação da função de HpMutS na recombinação..........................................................67
4.1.2. Caracterização bioquímica de HpMutS................................................................................73
4.1.2.1. Purificação de HpMutS recombinante...............................................................................73
4.1.2.2. Atividade de hidrólise de ATP de HpMutS.......................................................................80
4.1.2.3. Grau de oligomerização de HpMutS.................................................................................84
4.1.2.3.1. Filtração molecular.........................................................................................................84
4.1.2.3.2. Sedimentação em gradiente de sacarose.........................................................................86
4.1.2.4. Substratos de HpMutS.......................................................................................................89
4.1.2.4.1. Geles de retardo..............................................................................................................89
4.1.2.4.2. Retenção em filtro..........................................................................................................92
4.1.2.5. Atividade de HpMutS in vitro...........................................................................................94
IX
4.2. Estudo da proteína HpMutSΔSmr...........................................................................................96
4.2.1. Caracterização bioquímica de HpMutSΔSmr.......................................................................96
4.2.1.1. Purificação de HpMutSΔSmr............................................................................................96
4.2.1.2. Atividade de hidrólise de ATP de HpMutSΔSmr..............................................................98
4.2.1.3. Atividade de HpMutSΔSmr in vitro..................................................................................99
4.2.1.4. Afinidade de HpMutSΔSmr.............................................................................................100
4.2.2. Caracterização genética de HpMutSΔSmr.........................................................................103
4.3. Estudo dos smr (“small mutS related”).................................................................................105
4.3.1. Características gerais dos smr de H. pylori, E. coli, S. typhimurium, e S.cerevisiae..........105
4.3.2. Caracterização bioquímica das proteínas codificadas pelos domínios smr........................108
4.3.2.1. Purificação de HpSmr......................................................................................................108
4.3.2.2. Purificação de EcYdaL e EcYfcN...................................................................................109
4.3.2.3. Purificação de ScSMR.....................................................................................................111
4.3.2.4. Avaliação da atividade nucleásica das proteínas Smr.....................................................112
4.3.2.5. Atividade das proteínas Smr na transferência de fita mediada por RecA.......................113
4.3.2.6. Afinidade das proteínas Smr por diferentes substratos de DNA.....................................114
4.3.3. Caracterização genética dos smr.........................................................................................116
4.3.3.1. Avaliação da função do smr de H. pylori........................................................................116
4.3.3.2. Avaliação da função de ydaL e yfcN em S. typhimurium................................................116
4.3.3.2.1. Recombinação intracromossômica...............................................................................116
4.3.3.2.2. Recombinação intercromossômica...............................................................................118
4.3.3.2.3. Recombinação de fago..................................................................................................119
4.3.3.2.4. Reparação de DNA.......................................................................................................121
4.3.3.3. Avaliação da função do SMR em S. cerevisiae................................................................124
4.3.3.3.1. Reparação do DNA.......................................................................................................125
4.3.3.3.2. Recombinação meiótica................................................................................................128
5. Discussão e Perspectivas........................................................................................................130
5.1. HpMutS não está envolvida na reparação dos erros de emparelhamento (MMR)................130
5.2. HpMutS modula negativamente a integração de DNA exógeno...........................................132
5.3. HpMutS: proteína pura e multimérica...................................................................................133
5.4. HpMutS possui atividade ATPásica......................................................................................135
5.5. HpMutS bloqueia a troca de fitas de DNA in vitro ligando preferencialmente estruturas
de DNA que mimetizam intermediários de recombinação....................................................138
5.6. HpMutSΔSmr: proteína pura e ativa.....................................................................................140
5.7. In vitro, a atividade anti-recombinogênica de HpMutSΔSmr é menos eficiente que
a de HpMutS..........................................................................................................................141
5.8. O fenótipo de HpMutSΔSmr ainda é uma incógnita.............................................................143
5.9. Smr: atividade diferenciada em cada organismo ou cicatriz evolutiva ?...............................144
5.10. Modelo proposto para a função de HpMutS........................................................................147
6. Bibliografia..............................................................................................................................151
7. Anexo I.....................................................................................................................................164
8. Anexo II...................................................................................................................................172
X
Lista de Figuras.
Figura 1. Esquema do sistema de secreção tipo IV de A. tumefaciens...................................9
Figura 2. Modelo geral da recombinação homóloga (E. coli)...............................................12
Figura 3. Representação esquemática do sistema NER........................................................16
Figura 4. Representação esquemática do sistema BER........................................................18
Figura 5. Detalhes do mecanismo de MMR bidirecional de E. coli.....................................21
Figura 6. Comparação por alinhamento de seqüência de uma proteína MutS1 (de E. coli)
e de uma MutS2 (de H. pylori)..............................................................................24
Figura 7. Alinhamento de seqüência múltiplo entre as proteínas MutS2 e Smr...................25
Figura 8. Localização e sentido do gene hpmutS no cromossomo de H. pylori 26695........26
Figura 9. Representação esquemática das construções de DNA utilizadas para a
transformação das cepas de H. pylori...................................................................37
Figura 10. Representação esquemática da estrutura dos substratos de DNA utilizados
para os ensaios in vitro (ligação e estimulação)..................................................47
Figura 11. Representação gráfica dos substratos de transferência de fita.............................53
Figura 12 Integração de DNA heterólogo em X47-2AL.................................................67-68
Figura 13. Integração de DNA homólogo em X47-2AL......................................................69
Figura 14. Complementação do fenótipo de hpmutS............................................................70
Figura 15. Integração de DNAs com diferentes graus de heterologia em X47-2AL............71
Figura 16. Incorporação de DNA com heterologia de 1 base...............................................72
Figura 17. Purificação da GST-HpMutS...............................................................................74
Figura 18. Purificação da MBP-HpMutS..............................................................................76
Figura 19. Purificação da HpMutS-His.................................................................................79
Figura 20. Atividade ATPásica de HpMutS.........................................................................81
Figura 21. Estimulação da atividade ATPásica de HpMutS por DNA.................................82
Figura 22. Determinação do estado de associação de HpMutS através de filtração
molecular.............................................................................................................85
Figura 23: Perfil de sedimentação de HpMutS em gradiente de sacarose a 200 mM
de NaCl................................................................................................................87
Figura 24. Perfil de sedimentação de HpMutS em gradiente de sacarose a 200 mM
de NaCl e na presença de 1 mM ATP e 3 mM Mg
2+
..........................................88
Figura 25. Perfil de sedimentação de HpMutS em gradiente de sacarose a 500 mM
de NaCl.................................................................................................................88
Figura 26. Interação de HpMutS com diferentes estruturas de DNA em geles de
retardo TBE....................................................................................................89-90
Figura 27. Interação de HpMutS /DNA em geles de retardo TAM......................................91
Figura 28. Análise de competição de HpMutS ligada à estrutura de Holliday (FWJ)..........92
Figura 29. Análise da especificidade de HpMutS por diferentes estruturas de DNA...........93
Figura 30. Transferência de fita mediada por RecA em presença de HpMutS................94-95
Figura 31. Purificação de HpMutSΔSmr-His..................................................................96-97
Figura 32. Atividade de hidrólise de ATP de HpMutSΔSmr................................................98
Figura 33. Transferência de fita mediada por RecA em presença de HpMutS e
HpMutSΔSmr......................................................................................................99
Figura 34. Afinidade de HpMutS e HpMutSΔSmr pela estrutura FWJ a 10 mM
de KCl................................................................................................................100
XI
Figura 35. Afinidade de HpMutS e HpMutSΔSmr pela estrutura FWJ a 150 mM
de KCl................................................................................................................101
Figura 36. Afinidade da HpMutSΔSmr por DNA simples fita a 10 mM e
150 mM de KCl..................................................................................................102
Figura 37. Afinidade de HpMutSΔSmr por DNA dupla fita a 150 mM de KCl.................102
Figura 38. Eficiência de integração do DNA em cepas de H. pylori selvagem,
mutante total e parcial no gene mutS.................................................................103
Figura 39. Expressão de HpMutS e HpMutSΔSmr in vivo.................................................104
Figura 40. Localização gênica do gene contendo o domínio smr de S. cerevisiae.............106
Figura 41. Localização gênica dos genes contendo os domínios smr de E. coli
e S. typhimurium................................................................................................107
Figura 42. Purificação da proteína HpSmr..................................................................108-109
Figura 43. Purificação de EcYdaL e EcYfcN.....................................................................110
Figura 44. Ensaio de Purificação de ScSMR……………………………………….…….111
Figura 45. Teste de atividade nucleásica das proteínas Smr com distintos substratos…...112
Figura 46. Transferência de fita mediada por RecA na presença das proteínas Smr……..113
Figura 47. Afinidade das proteínas Smr por diferentes substratos de DNA a 10 mM
de KCl…………………………………………………………………………114
Figura 48. Afinidade da HpSmr pelo DNA simples fita a 10 mM e 150 mM de KCl……115
Figura 49. Duplicações cromossômicas………………………………………..…………117
Figura 50. Determinação da segregação nas cepas mutantes em stydaL e styfcN………..118
Figura 51. Esquema explicativo das distintas etapas da iniciação da infecção pelo
fago P22............................................................................................................120
Figura 52. Avaliação do fenótipo espontâneo e induzido em S. typhimurium na
ausência de stydaL/styfcN..........................................................................121-123
Figura 53. Avaliação do fenótipo de mutagênese espontânea e induzida dos
mutantes em levedura................................................................................125-126
Figura 54. Padrão de esporos viáveis nas tétrades dos diplóides isogênicos em
RKY3109...........................................................................................................129
Figura 55. Fontes de variabilidade em H. pylori e modelo proposto para a função
de HpMutS………………………………………………………………….....149
Figura 56. Comparação das seqüências protéicas de MutS de E. coli (EG10625)
e HpMutS (HP0621) pelo EMBOSS Pairwise Alignment Algorithms.....164-165
Figura 57. Comparação das seqüências protéicas de MutS de E. coli (EG10625) e
HpMutS (HP0621) pelo EMBOSS Pairwise Alignment Algorithms................166
Figura 58. Cromatogramas da purificação de HpMutS·His……………………...……….167
Figura 59. Linearização de dados para o cálculo dos parâmetros da atividade ATPásica
de HpMutS·His...................................................................................................168
Figura 60. Cromatogramas da purificação de HpMutSΔSmr·His……………..………….169
Figura 61. Cromatogramas da purificação de EcYdaL………………..………………….170
Figura 62. Cromatogramas da purificação de EcYfcN……………………………...……171
XII
Lista de Tabelas.
Tabela 1. Comparação das variações na seqüência de 6 loci entre E. coli e H. pylori ....................5
Tabela 2. Genes envolvidos na incorporação de DNA em H. pylori.............................................10
Tabela 3. Genes de H. pylori com provável função em recombinação (e reparo
recombinacional)............................................................................................................13
Tabela 4. Genes de H. pylori com função no reparo por excisão de nucleotídeos (NER).............16
Tabela 5. Genes de H. pylori com possíveis funções no reparo por excisão de bases (BER)........19
Tabela 6. Genes relacionados ao sistema MMR em H. pylori.......................................................22
Tabela 7. Material Genético utilizado nesta tese.......................................................................29-32
Tabela 8. Oligonucleotídeos utilizados para a construção e verificação do mutante hpmutS........35
Tabela 9. Oligonucleotídeos utilizados para a ampliação das regiões hiper-variáveis s e m
do gene hpvacA.............................................................................................................36
Tabela 10. Oligonucleotídeos utilizados para a amplificação dos genes estudados.......................40
Tabela 11. Tampões utilizados na purificação da GST-HpMutS...................................................42
Tabela 12. Tampões utilizados na purificação da MBP-HpMutS..................................................42
Tabela 13. Tampões utilizados na purificação das proteínas HpMutS·His, HpMutSG338R·His
e HpMutSΔSmr.............................................................................................................42
Tabela 14. Tampões utilizados na purificação da HpSmr..............................................................43
Tabela 15. Tampões utilizados na purificação das proteínas EcYdaL e EcYfcN..........................43
Tabela 16. Tampão utilizado na purificação da ScYPL199c.........................................................43
Tabela 17. Oligonucleotídeos utilizados para a construção de diferentes estruturas de DNA.......47
Tabela 18. Oligonucleotídeos utilizados para a construção e verificação do mutante
hpmutSΔsmr..................................................................................................................54
Tabela 19. Oligonucleotídeos utilizados para a construção e verificação dos mutantes
em S. typhimurium........................................................................................................59
Tabela 20. Oligonucleotídeos utilizados para a construção e verificação dos mutantes
em levedura...................................................................................................................61
Tabela 21. Taxa de mutação espontânea para Rif
R
(A) e para resistência a metronidazol (B)
de cepas de H. pylori selvagens e mutantes mutS.........................................................64
Tabela 22. Freqüência de mutação de cepas de E. coli selvagens e mutantes para mutS
complementadas com a ORF hp0621...........................................................................66
Tabela 23. Freqüência de mutação espontânea para cepas E. coli selvagens e mutantes para
mutL e mutH, e complementadas com a ORF hp0621.................................................66
Tabela 24. Conjugação em E. coli na presença de HpMutS...........................................................73
Tabela 25. Valores aparentes dos parâmetros cinéticos de HpMutS em presença e ausência
de diversas estruturas de DNA.....................................................................................83
Tabela 26. Percentagens da formação do produto final (dfca) da transferência de fita, em
presença de HpMutS e HpMutSΔSmr..........................................................................99
Tabela 27. Comparação das características dos genes ydaL e yfcN de E. coli e de
S. typhimurium............................................................................................................107
Tabela 28. Cepas utilizadas nos experimentos de recombinação intracromossômica..................116
Tabela 29. Determinação da freqüência de incorporação de DNA exógeno em
S. typhimurium............................................................................................................119
Tabela 30. Título do fago P22......................................................................................................120
Tabela 31. Valores de Km, Vmáx e Kcat de diferentes MutS1....................................................136
XIII
Abreviaturas e Símbolos.
Å: angstrom
ADP: 5’ difosfato de adenosina
Amp: ampicilina
AP: sítio abásico (apurinic/apirimidinic site)
ATP: 5’ trifosfato de adenosina
BAB: meio de cultura para H. pylori (Blood Agar Base Nº2)
BER: sistema de reparação do DNA por excisão de bases (base excision repair)
Bp: pares de bases (bases pair)
BSA: albumina de soro bovino
Cm: cloranfenicol (antibiótico)
cm: centímetro
CO2: dióxido de carbono
Cs: césio
DES: dietilsulfato
DNA: ácido desoxiribonucleico
D.O. :densidade óptica
DTT: ditiotreitol
EDTA: ácido etileno diamino-tetra-acético
FD: fita dupla (DNA)
Fmoles: femtomoles
FPLC: cromatografia líquida de performance rápida (Fast Performance Liquid Chromatography)
FRT: seqüência específica de DNA (34 bp) alvo da recombinase FLP de S. cerevisiae
FS: fita simples (DNA)
FWJ: junção de Holliday (four way junction)
Gm: gentamicina
Gy: Gray (quantidade de energia de radiação ionizante absorvida por unidade de massa: 1J.kg
-1
)
HCl: ácido clorídrico
His: cauda terminal contendo 6 resíduos de histidinas
IPTG: β-D-isopropil-tiogalactopiranosídeo
J: Joules (unidade de energia e trabalho: 1 kg.m²/s² = 1 N.m = 1 W.s)
kb: kilo base
kDa: kilo Dalton
Km: kanamicina
L: litro
LB: meio de cultura para E. coli e S. typhimurium (lysogenic broth)
MBP: proteína ligadora de maltose (maltose-binding-protein)
μg: micrograma
mg: miligrama
min: minuto
μL: microlitro
mL: mililitro
MMR: sistema de reparação de erros de emparelhamento no DNA (mismatch repair)
MMS: metil metano sulfonato
Mpb: mega pares de bases
XIV
Mtz: metronidazol
mW: miliWatts
NaCl: cloreto de sódio
nCi: nanoCurie
nm: nanômetro
NEB: New England Biolabs
NER: sistema de reparação do DNA por excisão de nucleotídeos (nucleotide excision repair)
ng: nanograma
nt: nucleotídeos
ON: período de 16 horas (over night)
ORF: referencial de leitura (open reading frame)
PEG: polietileno glicol
PCR: reação em cadeia da polimerase (polymerase chain reaction)
Rif: rifampicina
ROS: espécies reativas de oxigênio (reactive oxigen species)
rpm: rotações por minuto
SDS: dodecil sulfato de sódio
SDS-PAGE: eletroforese em gel de poliacrilamida em condições desnaturantes (SDS
polyacrylamide gel electrophoresis)
Sp: spectinomicina (antibiótico)
SSB: proteína ligadora de ssDNA (single-stranded binding protein)
TAE: tampão Tris-ácido acético-EDTA
TAM: tampão Tris-acetato de sódio-acetato de magnésio
TE: tampão Tris-EDTA
TBE: tampão Tris-ácido bórico-EDTA
Tet: tetraciclina
Tris: trizma base
UFC: unidade formadora de colônia
URA3: gene da decarboxilase de orotinida 5’-fosfato (OMP)
UV: ultravioleta
V: volts
YNB: meio mínimo de cultura para levedura (Yeast Nitrogen Base)
YPD: meio rico de cultura para leveduras (Bacto
Yeast extract, BactoPeptone, Dextrose)
XV
Resumo.
Helicobacter pylori é um patógeno humano cujo genoma apresenta um nível de
diversidade alélica maior que o descrito para qualquer outra espécie. Estas variantes se
correlacionam com diferentes graus de virulência e/ou resistência a antibióticos utilizados nos
tratamentos clínicos. A transformação natural e as mutações são a fonte da variabilidade alélica.
Por análise de seqüência foi encontrada somente uma das proteínas que integram o sistema de
reparo de erros de emparelhamento: o ortólogo de MutS. Este representante pertence à subfamília
das MutS2, cuja atividade é desconhecida. As MutS2 também possuem no seu C-terminal um
domínio Smr com aparente atividade nucleásica. Foi postulado que, ante a ausência dos demais
parceiros protéicos, HpMutS (com sua possível atividade nucleásica) seria a única encarregada do
reparo dos emparelhamentos errôneos.
Neste trabalho de tese foi caracterizada bioquímica e geneticamente a proteína MutS2 de
H. pylori. Através de uma abordagem genética se determinou o não envolvimento desta proteína
no sistema de reparo de erros de emparelhamento. Por outro lado, foi possível evidenciar uma
atividade anti-recombinogênica da HpMutS, nunca antes descrita para uma proteína MutS.
Mediante uma abordagem bioquímica se comprovou a funcionalidade do motivo conservado de
ligação a ATP, a estrutura multimérica da proteína, a sua afinidade seletiva por estruturas de
DNA que mimetizam os intermediários de recombinação (forquilha e junção de Holliday) e a sua
função no bloqueio da transferência de fitas de DNA num evento de recombinação. No que tange
ao domínio Smr, este não apresenta atividade nucleásica. Estas evidências são respaldadas pela
ausência da atividade nucleásica nos Smr de organismos procarióticos com E. coli e S.
typhimuriun e do organismo eucariótico S. cerevisiae. Os resultados deste trabalho apontam para
uma possível atividade controladora da variabilidade gênica de H. pylori por parte de HpMutS.
Alguns dos resultados obtidos foram incluídos na seguinte publicação:
A. Viviana Pinto, Mathieu, A., Marsin, S., Veaute, X., Ielpi, L., Labigne, A., and J. Pablo
Radicella. 2005. “Suppression of homologous and homeologous recombination by the bacterial
MutS2 protein”. Molecular Cell, vol. 17, pp. 113-120.
XVI
Abstract
Helicobacter pylori is a well-recognized human pathogen whose genome revealed
the highest degree of genetic diversity reported for any bacterial species. This diversity
correlates with the severity of pathologies and / or resistance to useful antibiotics. Natural
transformation and mutations are the sources of H. pylori diversity. By sequence homology
analysis, it was identified only one of the mismatch repair system genes: the MutS
homolog. This ortholog codifies a MutS2 protein, whose activity is still unknown. The
MutS2 proteins also have a Smr domain in the C-terminal region with a putative nucleasic
activity. It was postulated that HpMutS (with the nucleasic activity associated) is the only
responsible for repairing DNA mismatches in H. pylori.
In the present thesis, the MutS2 of H. pylori was biochemically and genetically
characterized. The genetic approach established that HpMutS has no function in the
mismatch repair system. Furthermore, this approach unveiled an antirecombinogenic
activity from HpMutS, never described before for the MutS protein. The biochemical
approach proved that HpMutS has a blocking role in the transfer of DNA during
recombination. These data are supported by the HpMutS selective affinity for DNA
structures like forks and four way junctions. HpMutS also possesses ATP hydrolysis
activity and a multimeric structure. The study of the Smr from H. pylori revealed that this
protein has no nucleasic activity. These evidences are supported by experimental data
obtained from E. coli, S. typhimuriun and S. cerevisiae. The results of this work suggest
that HpMutS probably has a function in controlling the genetic variability of H. pylori.
Some of the results obtained were included in the following publication:
A. Viviana Pinto, Mathieu, A., Marsin, S., Veaute, X., Ielpi, L., Labigne, A., and J.
Pablo Radicella. 2005. “Suppression of homologous and homeologous recombination by
the bacterial MutS2 protein”. Molecular Cell, vol. 17, pp. 113-120.
XVII
1. Introdução
1.1. H. pylori como organismo patógeno.
Em 1982 foi isolada pela primeira vez, a partir da mucosa gástrica humana, uma
bactéria pertencente ao gênero Helicobacter: Helicobacter pylori (Marshall & Warren, 1984.
Premio Nobel de Medicina em 2005). H. pylori é uma bactéria gram-negativa, espiralada e
microaerófila. Seu hospedeiro natural é o ser humano (Marshal & Warren, 1984). A bactéria
possui de dois a seis flagelos que lhe permitem movimentar-se em sentido contrário às
contrações gástricas e penetrar, assim, na mucosa do estômago. Ela possui também uma
enzima com forte atividade ureásica que aumenta o pH do meio (conversão de uréia em
amônia e dióxido de carbono) permitindo sua sobrevivência na acidez do estômago e a
protegendo de mudanças repentinas do pH neste ambiente
(Brown, 2000).
A distribuição de H. pylori é mundial, com maior incidência nos países em
desenvolvimento. O modo de transmissão ainda não é claro, mas considera-se que as vias são,
na sua maioria, fecal-oral e oral-oral
(Velazquez & Feirtag, 1999). Também existem fortes
evidências de que a água é uma importante via de disseminação da bactéria, particularmente
nos países em desenvolvimento, onde o tratamento da água é limitado
(Klein e col., 1991).
Em média, 50% da população mundial está infectada com H. pylori (Carroll e col., 2004).
O período de incubação de H. pylori é desconhecido e, segundo dados de infectividade
obtidos a partir de macacos rhesus, são necessárias pelo menos 10
4
bactérias para causar
infecção
(Solnick e col., 2001). A maioria das infecções por H. pylori são crônicas e resultam
em gastrite superficial assintomática. Uma vez que a bactéria se estabelece, persiste na
maioria dos indivíduos por anos. Com relação à saúde das pessoas infectadas, H. pylori está
associada à ocorrência de 90% das úlceras gástricas e a 100% das úlceras duodenais
(Ernst &
Gold, 2000).
1
A fisiopatologia das doenças associadas a H. pylori não foi completamente
esclarecida. Porém, a hipótese mais aceita postula que essas doenças são o resultado dos
efeitos colaterais das respostas imunes do hospedeiro à infecção
(Ernst & Gold, 2000). H.
pylori vive num micro ambiente neutro que se encontra entre o muco e a capa epitelial da
superfície do estômago humano. A partir da capa epitelial superficial do estômago, H. pylori
estimula a produção de citocinas por parte das células epiteliais
(El-Omar e col., 2001). As
citocinas, por sua vez, recrutam e ativam as células inflamatórias e imunes que residem sob a
própria lâmina. Como parte da resposta ativam-se os linfócitos auto-reativos, mastócitos,
neutrófilos e macrófagos. Os neutrófilos podem migrar através do epitélio e no seu caminho
destroem a barreira constituída pelas células epiteliais, expondo os tecidos subjacentes ao
conteúdo estomacal
(Obst e col., 2000; Nagata e col., 1998). Os neutrófilos e macrófagos, por
sua vez, liberam espécies reativas de oxigênio e de nitrogênio induzindo dano oxidativo no
DNA do hospedeiro
(Obst e col., 2000; Farinati e col., 1998).
H. pylori infecta aos humanos principalmente na infância e a infecção persiste por
décadas. Deste modo, o tecido estomacal encontra-se exposto, durante todo esse tempo, às
células inflamatórias ativadas e a seus mediadores. Essa exposição permanente promove a
acumulação do dano celular no epitélio gástrico
(Ernst & Gold, 2000). Como conseqüência, as
infecções com H. pylori estão diretamente associadas às doenças gástricas malignas. Além
das úlceras gástricas e duodenais, as infecções são associadas com linfoma non-Hodgkin
(Parsonnet e col., 1996), com MALT (mucosa-associates lymphoid tissue lymphoma –
Parsonnet e col., 1996-), e com adenocarcinoma
(Peek & Crabtree, 2006). Dado que mais de
15% dos indivíduos infectados desenvolvem carcinoma ou linfoma
(Jones e col., 2001), o
grupo de trabalho da Agência Internacional para a Pesquisa em Câncer da Organização
Mundial da Saúde (OMS) classificou a infecção de H. pylori como carcinogênica
(Forman,
1996).
2
Existem também numerosos registros que associam a infecção de H. pylori a doenças
não gastrintestinais. Estas incluem diabetes mellitus (Oldenburg e col., 1996; de Luis & Aller,
2001), cefalalgia crônica (Gasbarrini & Cammarota, 1997; Realdi e col., 1999), doenças da
pele (Murakami e col., 1996), desordens autoimunes (de Luis e col., 1998) e desordens
imunológicas (Gasbarrini e col., 1998). Existem vários outros estudos epidemiológicos que
avaliam a possibilidade da relação entre a infecção de H. pylori com doenças cardíacas
isquêmicas (Realdi e col., 1999; Gasbarrini e col., 1998; Strachan, 1998; Danesh e col., 1997),
com a síndrome da morte infantil repentina (Pattison & Marshall, 1997; Rowland & Drumm,
2001; Elitsur e col., 2000; Ho e col., 2001) e com indivíduos soro-positivos para HIV (Danesh
e col., 1997).
1.2. H. pylori e variabilidade gênica.
Pela sua importância médica e em saúde publica, o genoma de H. pylori foi um dos
primeiros a ser completamente seqüenciado a partir de duas cepas independentes: 26695
(Tomb e col., 1997) e J99
(Alm e col., 1999). O genoma da cepa 26695 possui 1,7 Mpb e o da
cepa J99 1,6 Mpb. Ambas apresentam aproximadamente 1.600 marcos abertos de leitura
(ORF) ou seja, quase três vezes a menos que os apresentados por E. coli (Sundararaj e col.,
2004). Aproximadamente 89% dos ORF preditos são comuns em ambas cepas, o que
confirma a H. pylori como uma única espécie (Wang e col., 1999). A publicação dessas
seqüências confirmou a diversidade, detectada em estudos anteriores, no que tange à
organização gênica (macro diversidade) e à variabilidade nucleotídica (micro diversidade)
entre cepas. Uma análise mais recente da seqüência evidenciou que, com poucas exceções,
cada isolado de H. pylori possui uma seqüência única de DNA (Suerbaum e col., 1998;
Achtman e col., 1999; Falush e col., 2003) e, também, uma significativa especificidade
geográfica (Achtman e col., 1999). Isto é explicado pelo isolamento genético devido ao
3
isolamento geográfico de seus hospedeiros (Cann e col., 1987). As diferenças geográficas em
H. pylori, por sua vez, podem constituir-se em marcadores das antigas migrações humanas
(Achtman e col., 1999; Covacci e col., 1999).
Os rearranjos cromossômicos (inversões e transposições) são os principais fatores da
divergência na ordem gênica (Marshall e col., 1998). Estudos em populações de H. pylori
originárias de um mesmo lugar revelaram uma estrutura de mosaico para os genes estudados
(Atherton e col., 1995); situação acentuada entre isolados de H. pylori provenientes de
diferentes países e/ou continentes (Wang e col., 1999). A conservação na ordem dos genes é
quase inexistente entre cepas não relacionadas (Jiang e col., 1996).
Por sua vez, a micro diversidade freqüentemente observada na maioria dos loci entre
cepas não relacionadas é, em média, de aproximadamente 5% (Tomb e col., 1997; Alm e col.,
1999; Suerbaum e col., 1998; Achtman e col., 1999). Essa variabilidade nucleotídica é
caracterizada principalmente pela alteração de nucleotídeos na terceira posição do triplete
codificante (Alm e col., 1999; Suerbaum e col., 1998; Achtman e col., 1999). Exemplos
extremos são os genes vacA, flaA e flaB cuja variabilidade se encontra entre 15% e 21%
(Suerbaum e col., 1998). Ocorrem também, no entanto com menor grau de incidência,
alterações nucleotídicas em posições não sinônimas. Tem-se demonstrado que para os genes
do exemplo anterior, a diversidade não sinônima é de 0,3% a 2,5% (Suerbaum e col., 1998).
Como a maioria das substituições é sinônima, a seqüência protéica se mantém relativamente
conservada. Porém, a microdiversidade apresentada por diferentes cepas de H. pylori é
claramente superior às variações encontradas no estudo de numerosas cepas de E. coli (vide
tabela 1)
4
Diferença média (%)
entre múltiplos isolados
Diferença média (%)
entre dois isolado s
mundiais de E. coli (USA e UK) de H. pylori
locus nucleotídeos aminoácidos nucleotídeos Aminoácidos
putP 2,37 0,34 3,7 1,2
pabB 2,03 1,87 6,3 7,4
sppA 1,32 0,53 4,9 2,7
zwf 1,17 0,11 4,5 4,2
trpB 1,29 0,11 6,4 3,3
trpC 1,51 0,69 6,3 5,8
Tabela 1. Comparação das variações na seqüência de 6 loci entre E. coli e H. pylori. Os loci correspondem a genes
do metabolismo básico. No caso de E. coli se apresenta a média de pelo menos 10 isolados para cada locus. Adaptado de
ecol
., 1999.
1.2.1. Vantagens da variabilidade gênica?
Em um típico processo de colonização, H. pylori deve apresentar respostas ao estresse
imediato e também deve resistir aos desafios ambientais que são gerados através do tempo.
Aparentemente, H. pylori não possui algumas das respostas indutíveis presentes em E. coli
devido a ausência de diversos genes tais como: oxyR (estresse oxidativo), crp (utilização de
carbono), rpoH (estresse por calor), fnr (regulação de fumarato e nitrato) e lexA (resposta
SOS a dano no DNA) (Tomb e col., 1997; Alm e col., 1999). Isso sugere que, pelo menos
nesses fenômenos, a regulação da expressão gênica em termos de transcrição não acontece
(Wang e col., 1999).
H. pylori, além de infectar humanos, pode também infectar outras espécies animais
como porcos, ratos, camundongos, cães, gatos, gerbils (conhecidos no Brasil como ratos do
deserto), e uma grande variedade de macacos. A diversidade de hospedeiros é diretamente
proporcional à diversidade anatômica, fisiológica e dietária do ambiente de H. pylori
(Kodama e col., 2005). Isto implica que o patógeno, além de apresentar as respostas
ambientais típicas para lograr a infecção no seu hospedeiro natural, também apresenta outras
respostas (desconhecidas até o momento) que permitem a sua eficiente adaptação em
ambientes significativamente diferentes.
5
Como parte das respostas aos desafios ambientais enfrentados por H. pylori,
numerosas observações clínicas evidenciaram a rápida seleção de variantes resistentes aos
antibióticos utilizados na terapia contra a infecção do patógeno e para outros, também
administrados por via oral, utilizados para o tratamento de outras infecções (Gottke e col.,
2000). Além disso, existem evidências experimentais sobre a variação fenotípica da expressão
dos antígenos Lewis de H. pylori. Os antígenos Lewis (incluindo Le
X
e Le
Y
na maioria das
cepas e em algumas Le
A
e Le
B
) são partes de estruturas de lipopolisacarídeos (LPS) da
superfície bacteriana que mimetizam os antígenos Lewis sanguíneos da superfície celular do
hospedeiro (Appelmelk e col., 1998; Wirth e col., 1999).
Na procura de explicações para a compreensão desses fenômenos observou-se que o
desenvolvimento da resistência de H. pylori aos antibióticos é resultado de mutações em
genes cromossômicos (pré-existentes) como rdxA e frxA (resistência a metronidazol) (Paul e
col., 2001), arn 23S (resistência a claritromicina) (Pina e col., 1998), arn 16S (resistência a
tetraciclina) (Gerris e col., 2002) e rpoB (resistência a rifampicina) (Bjorkholm e col., 2001) e
não da aquisição de plasmídeos ou transposons. Em outras palavras, a significativa
plasticidade do conteúdo genético é devida, principalmente, a trocas alélicas e não à perda ou
aquisição de genes. Uma vez mais, a análise dos genomas seqüenciados evidenciou a
estratégia de adaptabilidade da bactéria. Em H. pylori foram identificados 27 genes que
contém repetições nucleotídicas simples (Tomb e col., 1997; Alm e col., 1999; Berg e col.,
1997; Saunders e col., 1998) incluindo genes de componentes da membrana externa,
envolvidos na síntese de LPS e sistemas de modificação/restrição (M/R) de DNA. Essas
seqüências constituem “hotspots” onde mutações que trocam a fase de leitura são facilmente
geradas através do deslizamento (“slippage”) de replicação. Isto concede a H. pylori um
mecanismo para a regulação da sua expressão gênica através da capacidade de expressar ou
reprimir certos genes, outorgando-lhe, em forma direta, vantagens seletivas (pela variação
6
fenotípica) durante as interações entre parasita e hospedeiro. A partir do exposto
anteriormente, resulta evidente ponderar que as diferenças genéticas se correlacionam com
maior capacidade de adaptabilidade.
1.2.2. Origens da Variabilidade Gênica.
Os mecanismos pelos quais se gera a diversidade alélica em H. pylori têm sido objeto
de intensos estudos durante as últimas duas décadas. A utilização de testes de homoplasia e de
modelos matemáticos como matrizes de compatibilidade permitiram determinar que a
estrutura populacional de H. pylori é de panmixia (Go e col., 1996; Smith & Smith 1998,
Suerbaum e col., 1998). Panmixia é o estabelecimento de fluxo gênico total numa população
que não se encontra separada, o que significa que não se pode distinguir uma herança
monoclonal de genes na população. Este tipo de estrutura é pouco habitual em espécies que
não possuem reprodução sexual já que os mecanismos de deriva genética e efeito fundador
homogeneizam as populações. No entanto, para H. pylori determinou-se que a freqüência com
a qual os alelos se misturam nos diferentes loci, através de transferência horizontal, é
suficiente para anular os possíveis grupos monoclonais (Suerbaum e col., 1998). Igualmente a
outras poucas espécies de bactéria como N. gonorrhoeae (Smith e col., 1993) e B. subtilis
(Istock e col., 1992) que possuem estrutura de panmixia, H. pylori é naturalmente competente
para a incorporação de DNA exógeno, tanto cromossômico como plasmidial (Nedenskov-
Sorensen e col., 1990). Considerando estes fenômenos, a explicação atual mais aceita para a
ocorrência da variabilidade gênica em H. pylori é a existência de uma alta freqüência de
transformação natural (incorporação + recombinação) associada a uma elevada taxa de
mutação.
7
Em seguida detalham-se as particularidades da transformação natural e dos sistemas de
reparação do DNA em H. pylori, para melhor compree nsão da contribuição de cada um deles
na plasticidade gênica deste patógeno.
1.3. Transformação Natural
Transformação natural é a habilidade da bactéria para incorporar e integrar
eficientemente DNA. H. pylori é uma das 44 espécies conhecidas de bactérias naturalmente
competentes para a transformação genética (Lorenz & Wackernagel, 1994) com uma
freqüência estimada em 5 x 10
-4
transformantes/células viáveis (Haas e col., 1993).
Embora H. pylori, igualmente a outras bactérias, regule sua competência segundo a
fase de crescimento (Baltrus & Guillemin, 2006), diferentemente destas, não possui
seqüências de incorporação de DNA (US – uptake sequences-) que permitam um fácil
reconhecimento do DNA exógeno (Saunders e col., 1999).
H. pylori é capaz de diferenciar entre DNA homólogo e heterólogo não integrando a
seu cromossomo um DNA originário de outras espécies de Helicobacter, nem de outros
gêneros (Kraft & Suerbaum, 2005). A única exceção conhecida é a transformação de H. pylori
com DNA de H. acinonychis, que é a espécie filogeneticamente mais próxima (Pot e col.,
2001).
Por outro lado, as coinfecções num único hospedeiro com diferentes cepas de H.
pylori e os eventos de transferência horizontal entre elas são muito freqüentes na natureza
(Kersulyte e col., 1999). A incorporação de DNA genômico procedente de outra cepa é de 10
a 100 vezes menos eficiente que a ocorrida a partir de DNA correspondente do mesmo
isolado, uma vez que esta é afetada pelo nível de metilação (Israel e col., 2000). A maioria das
cepas de H. pylori possui muitos sistemas de modificação/restrição (M/R) (Kong e col.,
2000). Embora alguns deles sejam pseudogenes e, portanto, preditos como inativos, a barreira
8
de transformação com DNA plasmidial heterólogo se correlaciona tanto com o número como
com a atividade dos sistemas M/R presentes na bactéria hospedeira (Aras e col., 2002).
Em geral, a transformação natural pode ser dividida em duas grandes etapas: a
incorporação do DNA transformante e a integração no cromossomo via recombinação
homóloga (Dubnau, 1999).
1.3.1. Incorporação de DNA
A maioria das bactérias naturalmente transformáveis, tanto Gram-positivas como
Gram-negativas, utiliza um pili “tipo IV” ou um aparato similar (“type IV pilus-like”) para a
incorporação do DNA exógeno (Chen & Dubnau, 2004). Apesar de não estar completamente
esclarecido o processo de incorporação de DNA em H. pylori, este é realizado através de um
sistema tipo IV codificado pelo locus comB. Este sistema apresenta similaridade com o
sistema de secreção tipo IV do plasmídeo de exportação Ti (T4SS) de Agrobacterium
tumefaciens (Hofreuter e col., 1998; Smeets & Kusters, 2002) (fig1). Porém, o sistema ComB
atua em sentido inverso ao sistema T4SS já que a sua função é incorporar o DNA e não
exportá-lo.
Membrana Interna
Membrana Externa
Figura 1. Esquema do sistema de
secreção tipo IV de A. tumefaciens. A
função de cada proteína está detalhada
na tabela 2. Imagem adaptada do Centro
de Bioinformática do Instituto de
Pesquisa Química da Universidade de
Kyoto (http://www.genome.jp).
9
Uma grande parte dos genes comB (homólogos ao T4SS de A. tumefaciens) e outros
que, do mesmo modo, estão envolvidos na competência de transformação, porém, não
possuem homólogos conhecidos já foram identificados em H. pylori (tabela 2).
Gene HP nº JHP nº Atividade / Função
1089 336 Gene hipotéti co, função descon heci da (Chang e col., 2001).
A
1424 1319 Gene hipotéti co, função descon heci da (Chang e col., 2001).
1473 1366 Gene hipotéti co, função descon heci da (Chang e col., 2001).
comL 1378 1292 Homólogo a hidrolase de mureina envolvida na transformação natural de
Neisseira gonorrhoeae. Os mutantes em H. pylori seriam letais. Função d e
virB1? (Fussenegger e col., 1996; Smeets e col., 2000a)
comB2 15 13 Homólogo a virB2, componente estrutur al do transp ortador tipo IV (Karnholz
e col., 2006).
comB3 16 14 Homólogo a virB3, componente estrutur al do transp ortador tipo IV (Karnholz
e col., 2006).
B
comB4 17 15 Homólogo a virB4, componente estrutural do tr ansp or tador tip o IV (Ho freu ter
e col., 1998).
comB6 37 33 Homólogo a virB6, componente estrutur al do transp ortador tipo IV (Karnholz
e col., 2006).
comB7 38´ 33? Homólogo a virB7, componente estrutural do tran sp ortador tip o IV (Hofr euter
e col., 1998).
comB8 38 34 Homólogo a virB8, componente estrutural do tr an spor tador tip o IV (Hofr euter
e col., 1998).
comB9 39/40 35 Homólogo a virB9, componente estrutural do transp or tador tipo IV (Ho freuter
e col., 1998).
comB10 41/42 36 Homólogo a virB10, componente estrutural do transportador tipo IV
(Hofreuter e col., 1998).
comE3 1361 1279 Ligação e incorporação do DNA. Homólogo a comB6 com função
independente (Yeh e col., 2003).
C
comH 1527 1416 Essencial para transformação, função desconhecida (Smeets e col.,2000b).
dprA 333 316 Processamento do DNA (Smeets e col., 2000a).
nucT 323 306 Endonuclease ancorada em membrana (O’Rourke e col., 2004).
Tabela 2. Genes envolvidos na incorporação de DNA em H. pylori. Resumo das últimas informações dos genes
envolvidos na transformação natural. Em A estão listados os genes identificados por mutagênese, não se descarta um possível
efeito polar do transposon. Em B estão listados os homólogos aos genes virB de A. tumefaciens. Em C esta listada a serie de
genes descritos como imprescindíveis para a transformação, porém, não possuem homólogos no T4SS tradicional. A
localização dos homólogos ao sistema de transporte tipo IV na figura 1 auxilia na compreensão do modelo de incorporação
proposto para o transportador tipo IV de H. pylori. Note-se que ainda não foram encontrados os homólogos para os genes
virB5 e virB11. HP: gene da cepa 26695, JHP: gene da cepa J99.
Tabela originada a partir da revisão bibliográfica, esta
tese.
Além do sistema de translocação comB, que está universalmente presente em todas as
cepas de H. pylori, um subgrupo de cepas está equipado com um segundo sistema de secreção
tipo IV: a ilha de patogeneicidade cag (cag-PAI). A sua função é a de codificar um sistema de
secreção que conduz a proteína bacteriana CagA às células eucarióticas (Asahi e col., 2000;
Odenbreit e col., 2000). Os sistemas cag e com são funcionalmente independentes (Israel e
col., 2000). A título ilustrativo também se menciona que algumas cepas de H. pylori possuem
10
um terceiro sistema de secreção tipo IV que se denomina tfs3 (Kersulyte e col., 2003). Este
cluster encontra-se localizado na zona de plasticidade cag-PAI, mas nenhuma função lhe foi
atribuída até o momento.
1.3.2. Integração do DNA no cromossomo (por recombinação homóloga).
Após a entrada da molécula de DNA doadora no citoplasma, esta é integrada por
recombinação em regiões homologas do cromossomo do organismo receptor (Lorenz &
Wackernagel, 1994).
Os mecanismos de recombinação homóloga têm sido intensamente estudados em E.
coli (Kuzminov, 2001). Para esse organismo considera-se que a recombinação homóloga
apresenta quatro passos (fig. 2). Eles são: iniciação ou pré-sinapse, transferência de fita ou
sinapse, processamento do heteroduplex ou pós-sinapse e resolução das estruturas formadas.
A iniciação envolve o processamento de quebra da fita dupla (DNA invasor) para produzir
DNA simples fita 3´terminal. Esse processo é dependente, na sua maioria, do complexo
protéico RecBCD em conjunção com os sítios χ (Chi de Crossover Hotspot Instigators).
Entretanto, na ausência de RecBCD a quebra pode ser processada por RecJ em cooperação
com RecQ (Lovett & Kolodner, 1989). No segundo passo de recombinação, o
emparelhamento homólogo e troca de DNA são efetuados por RecA. Para isso, a proteína
RecA tem que se associar em forma filamentosa sobre o DNA invasor simples fita, na
presença da competidora SSB (single strand binding protein). Esta associação é facilitada
pelas proteínas RecF, RecO e RecR (Umezu e col., 1993). A extensão do heteroduplex é
mediada por RuvAB. O processo de recombinação é completado pela resolução da união
catalisada pela endonuclease RuvC (West, 1996). A migração da fita e a resolução da
estrutura de Holliday também podem ser feitas pela RecG (Whitby e col., 1993).
11
Figura 2. Modelo geral da recombinação homóloga (E. coli). Estão representados, em forma simplificada, os passos gerais
que constituem o processo de recombinação homóloga (iniciação,troca de fitas, extensão do heteroduplex e resolução) e as
proteínas envolvidas em cada um deles. Adaptado de Michel e col., 2007
A análise de diferentes isolados de H. pylori permitiu demonstrar que os processos de
recombinação são extremamente freqüentes nesta bactéria (Suerbaum e col., 1998; Go e col.,
1996). Numerosas seqüências de DNA, altamente repetitivas, constituem “hotspot” de
recombinação que facilitam a plasticidade genômica (Aras e col
Na anotação dos dois genomas de H. pylori foi detectado um número limitado de
genes relacionados aos processos de recombinação, que estão listados na tabela 3.
Gene HP nº JPH nº Atividade e/ou Função Provável
lig 615 558 DNA ligase
polA 1470 1363 DNA polimerase I. Síntese r eparativa do DNA.
topA 116 108 Topoisomerase I
gyrA 701 641 Subunidade da topoisomerase II
gyrB 501 453 Subunidade da topoisomerase II
priA 387 994 Fator de replicação primosomal. Helicase 3’ – 5’.
dnaB 1362 1280 Componente de repartida do primosoma.
dnaG 12 10 Componente de repartida do primosoma.
recA 153 141 Recombinase, ligação do DNA, emparelhamento e troca de fita.
recG 1523 1412 Ligação de DNA, helicase 3´- 5´
recJ 348 322 Exonuclease 5´- 3´ de DNA simples fita
recN 1393 1434 Proteína com ligação ao ATP, liga e protege o DNA 3´simples fita.
recR 925 859 Proteína com ligação ao ATP, ajuda à construção do filamento de RecA
rep 911 84 7 Helicase dependente de ATP
pcrA 1553 1446 DNA helicase I I
ruvA 883 815 Proteína de ligação ao DNA, reconhecimento da estrutura de Holliday
ruvB 1059 366 Helicase 5´- 3´
ruvC 877 811 Endonuclease, reso lução das estruturas de Holliday.
ssb 1245 1166 Proteína de ligação ao DNA simples fita
uvrD 1478 1371 DNA helicase I I
xseA 259 243 Exonuclease VII, degradação de DNA simples fita .
Tabela 3. Genes de H. pylori com provável função em recombinação (e reparação recombinacional).
Tabela originada a partir da revisão bibliográfica, esta tese.
Em H. pylori, os homólogos de RecBCD não estão presentes, porém, existe uma ORF
(HP1553) que codifica uma proteína com domínio nuclease tipo RecB e é homóloga a helicase
II (PcrA) de Staphylococcus aureus. Possivelmente, na ausência de RecBCD a exposição dos
extremos livres das fitas simples de DNA seria realizada por RecJ juntamente com RecN e a
helicase UvrD (Mendonça e col., 1995) ou com a helicase Rep/PcrA já que não existe
ortólogo para a helicase RecQ. Das proteínas da sinapse, RecF e RecO estão ausentes. Esses
ortólogos também faltam em muitos outros genomas, enquanto que o ortólogo de recR está
quase sempre presente (Fernández e col., 2000). Os quatro genes relacionados à pós-sinapse
estão presentes no genoma de H. pylori, indicando que tanto a migração de fitas como as
resoluções das estruturas de Holliday podem ser processadas de forma similar ao descrito para
E. coli (Kowalczykowski, 2000).
13
Poucos homólogos Rec foram experimentalmente caracterizados até o momento.
Dentre eles RecA, cujos mutantes não são capazes de serem transformados com DNA
cromossômico, entretanto, mantêm uma diminuída capacidade de transformação com DNA
plasmidial (Schmitt e col., 1995). Isto sugere que a incorporação de plasmídeos ocorre
independentemente de RecA, porém, com menor eficiência. A cepa mutante recA também
apresenta tolerância reduzida ao meio ácido, sensibilidade à radiação ultravioleta (UV) e
aumento na sensibilidade ao metronidazol (Thompson & Blaser, 1995). Este homólogo de
RecA é o único conhecido até o momento que é modificado logo após a tradução,
provavelmente por glicosilação (Fischer & Haas, 2004). Por outro lado, foi descrito que o
homólogo de RecG intervém na recombinação, mas não está envolvido no reparo do DNA
(Kang e col., 2004).
A presença de um sistema completamente especializado de incorporação de DNA
conjuntamente com o sistema de recombinação (embora pouco conhecido) fundamenta a
teoria que aponta a transformação natural como uma importante fonte de variabilidade gênica
em H. pylori.
Independentemente da transformação natural, deve-se salientar que as proteínas
relacionadas com a integração de DNA exógeno também fazem parte da denominada
reparação recombinacional. Este processo resgata as forquilhas de replicação colapsadas
por danos, complexos protéicos bloqueados e estruturas secundárias de DNA, entre outros
(Kowalczykowski,. 2000; McGlynn & Lloyd, 2000). É desconhecida a proporção de
forquilhas de replicação que precisam de reparo recombinacional em H. pylori. Contudo,
devido à exposição a radicais livres e outros agentes que danificam o DNA (O’Rourke e col.,
14
2003) se pode considerar que esta seja a via principal que H. pylori utiliza para prevenir
colapsos letais na sua replicação.
Por outro lado, a proteína RecA também está associada à resposta SOS e síntese
translesão. Em H. pylori a inesperada ausência de alguns genes SOS como lexA, polII, polIV e
umuC/umuD (PolV),como também a das seqüências (“box”) de união do repressor LexA na
região promotora de RecA (Tomb e col., 1997; Alm e col., 1999) sugere que não existe
resposta SOS nem síntese translesão neste patógeno; porém, estes fatos ainda não foram
estabelecidos experimentalmente.
1.4. Sistemas de Reparação do DNA.
1.4.1. Reparação por Excisão de Nucleotídeos (NER).
O sistema de excisão de nucleotídeos remove principalmente os danos que geram uma
grande deformidade na dupla fita de DNA (Friedberg e col., 2006). O NER em procariotos é
composto por endonucleases específicas como o complexo UvrABCD de E. coli (fig 3). A
função das mesmas é: I) o reconhecimento da deformação (dano) no DNA, II) a incisão de
uma das fitas da dupla hélice e, III) a remoção do dano contido num fragmento de 12-13
nucleotídeos. A integridade da dupla fita é restabelecida pela ação da DNA polimerase I e da
DNA ligase (Van Houten, 1990).
Os danos comumente reparados pelo complexo UvrABC são os produtos da ação
genotóxica da radiação ultravioleta, como dímeros de pirimidinas e fotoprodutos 6-4
(pirimidina (6-4) pirimidona), entretanto, os componentes do NER também foram implicados
na resistência das bactérias aos danos produzidos pelo pH ácido (Raja e col., 1991).
15
13 mer
1
1
2
2
3
3
13 mer
1
1
2
2
3
3
Figura 3. Representação esquemática do sistema NER. Na figura apreciam-se, em forma simplificada, os processos
realizados por este sistema. Um dano é reconhecido por um complexo composto de um dímero de UvrA e uma unidade de
UvrB (1). Após o reconhecimento, UvrC se associa com UvrB e após as incisões, UvrD catalisa a excisão de um oligo de
12-13 nucleotídeos (2). O resultado é uma lacuna que é preenchida pela DNA polimerase e selada pela DNA ligase (3).
A análise da seqüência gênica de H. pylori permitiu identificar todos os genes
envolvidos neste sistema que são mostrados na tabela 4 (Tomb e col., 1997; Alm e col.,
1999).
Gene HP nº JPH nº Atividade e Função
uvrA 705 644 Subunidade A do NER
uvrB 1114 1041 Subunidade B do NER
uvrC 821 760 Subunidade C do NER
uvrD 1478 1371 Helicase II
lig 615 558 DNA ligase
polA 1470 1363 DNA poli merase I
Tabela 4. Genes de H. pylori com função no reparo por excisão de nucleotídeos (NER). Tabela or iginada a partir
da revisão bibl i o
g
ráfica, esta tese.
A funcionalidade dos genes uvrA e uvrB foi demonstrada em estudos com cepas
mutantes. Os mutantes uvrA apresentam sensibilidade a pH ácido (Bijlsma e col., 2000). Os
mutantes uvrB apresentaram maior sensibilidade a UV e também a agentes alquilantes e pH
ácido quando comparados com a cepa selvagem (Thompson e col., 1998). Considerando o
habitat de H. pylori (o estômago humano) os alvos principais para o complexo UvrABC
seriam os danos ocasionados preferencialmente por metilação e por pH ácido e não pela
16
radiação UV. Assim, o NER pode ser relevante na manutenção da informação genética em H.
pylori.
A demonstração de que H. pylori possui um sistema ativo de reparação por excisão de
nucleotídeos não permite especular que a sua deficiência seja uma fonte de variabilidade
gênica.
1.4.2. Reparação por Excisão de Bases (BER).
O sistema mais especializado no reparo de danos pontuais é o BER (Friedberg e col.,
2006). As principais enzimas do BER são as DNA glicosilases que reconhecem as bases com
lesões específicas e cortam a ligação N-glicosídica que as une às desoxirriboses (fig. 4). O
produto desse corte é um sitio abásico (AP) que, por sua vez, constitui uma outra lesão a ser
reparada. Essa nova lesão é substrato para uma AP endonuclease que começa a remoção do
açúcar a 5´ do sitio AP. Logo após, uma 3´fosfodiesterase corta a ligação que mantém unido o
açúcar no 3´. Uma vez que o nucleotídeo foi completamente removido, a DNA polimerase I
preenche o espaço e a DNA ligase sela a parte reparada (Krokan e col., 1997).
Algumas DNA glicosilases (denominadas bifuncionais) possuem também uma
atividade AP liase associada que catalisa a quebra da ligação fosfodiéster no lado 3´do sitio
AP. As lesões que constituem substrato para o BER são: bases que sofreram danos
espontâneos (tautomerização, desaminação), perda da base, incorporação de uracil no DNA,
etc, ou lesões provocadas por agentes genotóxicos endógenos e/ou exógenos (oxidação,
metilação, hidratação, etc) (Friedberg e col., 2006).
17
o
P
o
P
o
P
P
o
o
P
P
5´
3´
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3´
DNA
glicosilase
1
1
A
A
AP-endonuclease
B
B
AP-liase
2
2
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3´
3
3
DNA polimerase I
DNA ligase
o
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DNA polimerase I
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o
P
O cromossomo de H. pylori possui alguns dos genes pertencentes ao mecanismo BER
(Tomb e col., 1997; Alm e col., 1999) que estão listados na tabela 5. Entretanto homólogos de
vários outros importantes genes como tag, alkA, e fpg que protegem o cromossomo de E. coli
das lesões mutagênicas estão ausentes.
Gene HP nº JHP nº Atividade e Função
mutY 142 130 Glicosilase específica para adenina em A/G e AP liase.
nth 585 532 Glicosilase com ativ id ade AP liase associada
magIII 602 549 Glicosilase específica para 3-metil adenina.
ung 1347 1266 Glicosilase específica para retirar uracilo do DNA.
ogt/dat1 676 618 O
6
-G metil-transferase / Cys metil-transferase.
xth 1526 Endonuclease de sítio Ap
polA 1470 1363 DNA polimerase I
lig 615 558 DNA ligase.
Tabela 5. Genes de H. pylori com possíveis funções no reparo por excisão de bases (BER). Tabela originad a a partir
da revisão bibl i ográfi ca, est a tese.
Quatro desses genes já foram caracterizados. Note-se que o gene nth de H. pylori
codifica a endonuclease III (EndoIII) que remove pirimidinas oxidadas e também possui
atividade de AP liase. A cepa mutante em nth apresenta deficiência no estabelecimento de
colonização em longo prazo nos estômagos de camundongos (O’Rourke e col., 2003). O gene
magIII foi inicialmente classificado como uma endonuclease III. Posteriormente foi
demonstrado que codifica uma DNA glicosilase rara, cuja atividade é específica para 3-
metiladenina. Essa glicosilase protege a H. pylori dos efeitos de agentes alquilantes, porém,
carece de atividade AP liase (O’Rourke e col, 2000). O gene mutY codifica uma DNA
glicosilase com alta atividade. A deficiência deste gene em H. pylori provoca um aumento de
325 vezes na freqüência de mutação e estes mutantes são 70 % menos eficientes na
colonização de estômago de camundongos (Eustsey e col., 2007). O gene xth codifica uma AP
endonuclease, atividade que é anulada nas cepas H. pylori xth
-
(Mathieu e col., 2006).
Consistentemente com a falta, por homologia de seqüência, de um gene fpg, a atividade desta
importante DNA glicosilase parece estar ausente (Mathieu e col., 2006). A funcionalidade dos
outros genes enumerados na tabela 5 ainda deve ser investigada.
19
A ausência de componentes fundamentais do sistema BER, como o homólogo de Fpg
permite especular que sua deficiência pode ser uma fonte de variabilidade gênica. Porém, essa
falha não justifica completamente a alta freqüência de mutação de H. pylori.
1.4.3. Reparação de Emparelhamentos Errôneos (MMR).
Durante a replicação do DNA em E. coli, a atividade de “proofreading” da polimerase
permite a incorporação errônea de um nucleotídeo a cada 10
7
- 10
8
bases sintetizadas. Porém,
a freqüência de mutação espontânea encontrada é de 1x10
-10
ou 1x10
-11
pb, sendo os
componentes do sistema MMR os responsáveis por esse grau final de precisão. O sistema
MMR é o encarregado de corrigir os emparelhamentos errôneos de bases assim como
pequenas deleções e/ou inserções (Jun e col., 2006). Existem vários motivos para esses erros
serem ocasionados. Entre eles, o mais importante é (e como foi descrito no início do
parágrafo) a falha da DNA polimerase no processo de replicação. Outro é a formação de
heteroduplex entre dois DNAs homólogos durante a recombinação. Deve-se destacar também
uma outra forma especializada de gerar emparelhamentos errôneos, é a desaminação da 5-
metil-citosina. Esta base modificada encontra-se presente no DNA dos organismos e a sua
desaminação converte um par G•5-mC em um par G•T. Nesse caso, o produto da
desaminação, a T, é uma base normal do DNA e não pode ser corrigida por nenhuma DNA
glicosilase (Friedberg e col., 2006).
O emparelhamento errado entre bases pode resultar em uma mutação puntiforme onde
uma base é trocada, ou em um deslocamento na fase de leitura. Em conseqüência, considera-
se o sistema MMR essencial para a manutenção da estabilidade genética durante os ciclos de
replicação e, assim, atrav és das gerações (Friedberg e col., 2006).
Para o sistema MMR manter a fidelidade gênica, a base correta tem que ser distinguida
da incorreta. Uma vez que ambas bases são componentes normais do DNA, essa
20
discriminação não pode ser feita por uma enzima que identifica lesão ou estrutura anormal da
dupla fita.
A enzimologia do MMR é muito similar em todos os organismos, tanto em procariotos
como eucariotos (Jiricny, 1998). Os componentes essenciais do sistema MMR foram
inicialmente identificados em E. coli (fig 5). A proteína MutS é a responsável pela iniciação
da reparação. Esta, em forma de dímero, reconhece o emparelhamento errôneo. A proteína
MutL é direcionada ao heteroduplex de uma forma MutS/ATP dependente. O complexo
ternário MutL•MutS•heteroduplex ativa a MutH, uma endonuclease específica que reconhece
seqüências GATC metiladas e cliva a fita não modificada.
Figura 5. Detalhes do mecanismo de MMR bidirecional de E. coli. Embora não seja mostrado, a DNA ligase
restaura covalentemente a continuidade da fita logo após a DNA polimerase preencher o segmento degradado. As
setas verdes indicam uma sinalização dependente de MutS e MutL entre os dois sítios de DNA envolvidos na reação.
Adaptado de Iyer e col. 2006
A incisão pode acontecer tanto a 5´como a 3´do emparelhamento errôneo, o que
caracteriza esse sistema como bidirecional. Logo após a incisão, a DNA helicase II e uma
exonuclease catalisam a degradação do DNA além do erro de emparelhamento. A lacuna
21
resultante é preenchida pela DNA polimerase III e a nova fita é ligada completando o reparo
(Iyer e col., 2006).
O genoma de H. pylori apresenta, por homologia de seqüência, vários homólogos dos
componentes do MMR descritos na tabela 6.
Gene HPnº JHPnº Atividade/Função Provável
mutS 621 565 Reconhecimento de emparelhamento errado.
uvrD 821 760 Helicase II
recJ 348 322 Exonuclease 5´-3´de DNA simples fita
xseA 259 243 Subunidade maior da exonuclease VII
Tabela 6. Genes relacionados ao sistema MMR em H. pylori. Essa relação foi determinada por homologia de
seqüência.
Tabela originada a partir da revisão bibliográfica, esta tese.
Apesar da presença da maioria dos homólogos que compõem o MMR, a taxa de
mutação espontânea da maioria das cepas de H. pylori é de 10
-5
a 10
-7
. Esta é maior, em várias
ordens de magnitude, que a média da taxa de mutação de E. coli e, por sua vez, é similar
àquela apresentada por cepas E. coli deficientes em MMR. (Kraft & Suerbaum, 2005). Esse
fato direcionou a atenção para análises adicionais, que revelaram detalhes imprevistos sobre
este sistema que é notavelmente caracterizado pela alta conservação das proteínas MutS e
MutL através do tempo e das espécies.
1.4.3.1. Singularidades do MMR em H. pylori.
Existem numerosas singularidades desse sistema em H. pylori que atraem a atenção e
que são enumeradas a seguir:
I) A ausência da proteína MutH. Isto não constitui um fato isolado, já que foi
verificado que poucos genomas codificam homólogos de MutH (Eisen, 1998).
Aparentemente, tanto a proteína MutH como a DNA adenina metilase (Dam) seriam
representantes remanescentes de um antigo sistema MR que foi incorporado por uma
22
eubactéria para a reparação do DNA (Ban & Yang, 1998). Na maioria dos organismos a
atividade de MutH seria desempenhada por outras endonucleases (Malik & Henikoff, 2000).
II) A ausência de MutL. Em quase todos os sistemas conhecidos MutS sempre atua em
associação com MutL (Malik & Henikoff, 2000).
III) A predominância em H. pylori de mutações que originam transições sobre as que
originam transversões. Estudos in vivo sobre a especificidade do sistema MMR demonstraram
que algumas trocas nucleotídicas são reparadas mais eficientemente que outras. Em particular
G·T e A·C que originam mutações de transição. Uma das principais características do sistema
MMR é a reparação específica de mutações de transição (Wang e col., 2001).
IV) A natureza da MutS presente, já que esta proteína não é um homólogo
convencional das MutS conhecidas. (Eisen, 1998).
1.4.3.2. MutS de H. pylori.
A família de proteínas MutS está amplamente distribuída e muito bem conservada na
maioria dos organismos conhecidos. Numerosos estudos que têm focalizado a análise de
seqüência, diversidade e função das proteínas MutS, dividiram-nas em duas subfamílias:
MutS1 ou MutS e MutS2 ou MSP (MutS Paralog) (Culligan e col., 2000). Estas apresentam
diferenças claras no seu contexto gênico e na sua organização de estrutura primária (fig 6).
A respeito do contexto gênico cabe destacar que os representantes das duas
subfamílias podem estar presentes em forma exclusiva (ex: MutS1 em E. coli e MutS2 em H.
pylori) ou de maneira conjunta num mesmo organismo (ex: Bacillus subtilis). Todos os
organismos que possuem genomas contendo mutS1, porém com ausência de mutL, contêm o
gene que codifica para a MutS2 (Eisen & Hanawalt, 1999; Moreira & Philippe, 1999). Nos
casos onde estão presentes os genes que codificam para as duas subfamílias de MutS no
mesmo genoma, existe somente um gene para mutL.
23
Na organização da estrutura protéica primária, a similaridade entre todos os
integrantes da família é um domínio conservado de ligação de ATP (fig 6). Entretanto, as
proteínas que pertencem à subfamília MutS1 são também altamente similares nos seus
domínios médio e N-terminal (o de reconhecimento do emparelhamento errôneo). A
subfamília MutS1 é a mais ampla e a ela pertencem, entre outras, a MutS da maioria das
bactérias (entre elas a de E. coli), de archaea e os homólogos eucarióticos MSH1/3 e MSH6 de
S. cerevisiae e hMSH2/3 e hMSH6 presentes no ser humano, todos eles envolvidos no MMR.
Também pertencem a ela os homólogos eucarióticos MSH4 e MSH5 envolvidos em
recombinação meiótica (Culligan e col., 2000). Uma vez que estes homólogos não possuem o
domínio N-terminal das MutS1, a análise filogenética postula que o seu predecessor teria
perdido esse domínio ao evoluir e especializar-se em funções meióticas (Culligam e col.,
2000).
As proteínas da subfamília MutS2 estão presentes só em algumas eubactérias e plantas
(Culligan e col., 2000). As MutS2 são menores que as MutS1 (entre 760 e 820 aminoácidos
para MutS2 e entre 810 e 910 resíduos para MutS1) e não possuem o domínio de
reconhecimento dos erros de emparelhamento (N-terminal das MutS1). Porém, a região C-
terminal dessas proteínas apresenta um domínio com um alto grau de conservação. Este
domínio foi chamado de smr (por
small mutS related).
2 115 561 790 853
Domínio de ligação
aos erros de
emparelhamento
Domínio de
ligação ao
ATP
288 506 663 762
E. coli
H. pylori
Domínio smr
2 115 561 790 853
Domínio de ligação
aos erros de
emparelhamento
Domínio de
ligação ao
ATP
288 506 663 762
E. coli
H. pylori
Domínio smr
Figura 6. Comparação por alinhamento de seqüência de uma proteína MutS1 (de E. coli) e de uma MutS2 (de H.
pylori). A parte central corresponde à região homóloga entre as duas subfamílias, incluindo o domínio de ligação ao ATP. O
domínio de reconhecimento do emparelhamento errôneo e o smr estão representados em verde e em azul, respectivamente.
24
O domínio smr, por sua vez, possui três características que merecem ser ressaltadas: a
conservação, a ubiqüidade e o contexto gênico. Na maioria dos organismos estudados, tanto
procariotos como eucariotos, o domínio smr está presente e com um alto grau de conservação
(fig. 7). Nos procariotos que possuem um membro da subfamília MutS2, seja sozinho ou
conjuntamente com um membro da subfamília MutS1, o smr encontra-se no C-terminal da
proteína MutS2 (fig 7). Entretanto, o smr encontra-se em um gene independente nos
procariotos que só possuem genes para a subfamília MutS1 (fig. 7). Nos eucariotos, a
presença do smr foi verificada em genes independentes com a exceção em humanos, onde o
único smr homólogo encontrado até o momento está associado à parte C-terminal da proteína
B3BP (BCL-3 binding protein).
Segundo o banco de dados do “The Institute for Genomic Research - Comprehensive
Microbial Resource” (TIGR-CMR http://cmr.tigr.org) que disponibiliza as informações da
cepa H. pylori 26695, o gene hpmutS
1
está presente na ORF
HP0621
(fig 8), localizado nas
coordenadas 668698 a 666410 do cromossomo é composto por 2289 nucleotídeos com uma
1
GeneBank ID: AAD07685.1
Figura 7. Alinhamento de seqüência múltiplo entre as proteínas MutS2 e Smr. Os núme ros na esquerda e direita
correspondem às distancias desde o N e o C-terminal respectivamente. Os números entre colchetes indicam a quantidade
de inserções presentes em várias seqüências. As posições que possuem uma identidade maior ao 80% na seqüência se
apresentam em vermelho. O verde indica o caráter químico conservado (hidrofóbico ou polar) em, pelo menos, 60% das
seqüências. O azul indica a presença de resíduos pequenos conservados em, pelo menos, 60% das seqüências. Os motivos
estatisticamente significativos são mostrados como I-IV. a: número de acesso ao NCBI. b: número de acesso ao WIT.
Adaptado de Moreira & Philippe, 1999.
25
percentagem de CG de 38,5%. O hpmutS codifica a proteína MutS2 de H. pylori (de agora em
diante HpMutS) de 762 aminoácidos com um peso molecular calculado em 86752,67 Daltons
e um ponto isoelétrico calculado igual a 9,3.
Figura 8. Localização e sentido do gene hpmutS no cromossomo de H. pylori 26695. Região c omp re endida
entre as coordenadas 661117 e 673897. O hpmutS está destacado por um círculo vermelho. Adaptado de
http://cmr.tigr.org/
O alinhamento das seqüências protéicas de MutS de E. coli com HpMutS revela que
entre estas proteínas existe uma identidade de 13,7 % e uma similaridade de 22,5 % quando
comparada a totalidade das suas seqüências (modalidade “needle” –vide Anexo I-). Quando se
comparam somente as regiões de maior similiaridade entre as proteínas, estes valores
aumentam para 22,1 % de identidade e 38,2 % de similaridade (modalidade “water” -vide
Anexo I-). Na maior região de homologia está incluído o motivo conservado de ligação a ATP
(entre os aminoácidos 333 e 340 de HpMutS).
Como conseqüência da recente identificação das MutS2, as pesquisas experimentais
sobre a função dessas proteínas encontram-se nas suas primeiras etapas. Dados genéticos já
evidenciaram que a MutS2 de B. subtilis não previne a acumulação de mutações diretas de
resistência a rifampicina nem os erros gerados pela recombinação. Também não apresenta
interação funcional com MutS1 nem com MutL, ambas presentes nesse organismo (Rossolillo
& Albertini, 2001). Ensaios bioquímicos com MutS2 de Pyrococcus furiosus (Vijayvargia &
Biswas, 2002) e Thermus thermophilus (Fukui e col., 2004) mostraram que ambas proteínas
possuem atividade ATPásica e afinidade pelo DNA, porém não discriminam entre
26
emparelhamento certo ou errôneo. Apesar da importância desses dados, até o momento, não
existe nenhuma evidência da atividade biológica exercida pelas proteínas MutS2, portanto, a
sua função ainda é uma incógnita.
A função do domínio smr também é praticamente desconhecida. Atualmente, a
hipótese mais aceita, sustentada por duas evidências experimentais, propõe que as proteínas
Smr possuem atividade nucleásica (Watanabe e col., 2003; Fukui e col., 2007). Esta atividade
é requerida por vários tipos de processos biológicos, tais como o reparo do DNA e a
retrotransposição dos introns self-splicing. Também é relacionada com a conversão gênica e
outros eventos durante o crossing-over e os processos de segregação.
Por outro lado, como o domínio smr faz parte das proteínas MutS2, foi proposto que
estas proteínas teriam a capacidade de reconhecer e processar os erros do DNA sem
necessidade dos homólogos MutH e MutL (Malik & Henikoff, 2000). Esta hipótese pode
conduzir à especulação sobre a ausência dos genes mutH e mutL em outras espécies e também
sobre a função do domínio smr no C-terminal das MutS2 ou independente como uma ORF
simples.
Na tentativa de compreender a macro e micro diversidade características de H. pylori
têm-se procurado as suas origens nos principais sistemas responsáveis pela manutenção da
estabilidade genética. Surpreendentemente, o aporte do sistema de reparação de erros de
emparelhamento é desconhecido. De toda sorte, diante deste impasse torna-se necessária a
determinação da função do único ortólogo possivelmente relacionado a este tipo de reparo, a
proteína MutS2.
27
2. Objetivos.
O objetivo principal desta tese foi a caracterização bioquímica e genética da proteína
MutS2 de H. pylori para evidenciar, assim, a contribuição do sistema de Reparação de
Emparelhamentos Errôneos na manutenção da estabilidade gênica neste patógeno.
Para isso, foram realizadas as seguintes etapas experimentais:
Abordagem genética:
• Construção de cepas de H. pylori mutantes, por deleção, do gene mutS2 (hpmutS).
• Determinação do envolvimento da proteína MutS2 de H. pylori (HpMutS) na reparação dos
erros de emparelhamento.
• Determinação do envolvimento da proteína HpMutS na integração de DNA exógeno.
Abordagem bioquímica:
• Clonagem do gene hpmutS em vetores de expressão.
• Expressão e purificação da proteína HpMutS.
• Avaliação da funcionalidade do domínio conservado de ligação de ATP.
• Determinação da afinidade da proteína HpMutS por diferentes estruturas de DNA.
• Determinação do efeito da proteína HpMutS na transferência de fitas mediada por RecA.
• Determinação do grau de oligomerização de HpMutS.
Do mesmo modo, foi avaliado o papel do smr. Para isso, foram realizadas as seguintes
etapas experimentais:
• Clonagem dos genes hpmutS2Δsmr, smr de E. coli, smr de S. cerevisiae, e do domínio smr de
H. pylori em vetores de expressão.
• Expressão e purificação das distintas proteínas Smr e da proteína HpMutSΔSmr.
28
• Avaliação da funcionalidade do domínio conservado de ligação de ATP na proteína
HpMutSΔSmr.
• Determinação da afinidade das proteínas HpMutSΔSmr e Smr por diferentes estruturas de
DNA.
• Determinação do efeito das proteínas HpMutSΔSmr e Smr na transferência de fitas mediada por
RecA.
• Construção de cepas de H. pylori mutantes, por deleção, do domínio smr (hpmutSΔsmr) do gene
mutS2.
• Determinação do envolvimento da proteína HpMutSΔSmr na integração de DNA exógeno.
• Construção de cepas de S. typhimurium mutantes, por deleção, dos genes smr (stydaL e styfcN).
• Construção de cepas de S. cerevisiae mutantes, por deleção, dos genes SMR, MSH4 e MSH5.
• Determinação do envolvimento das proteínas Smr de S. typhimurium e de S. cerevisiae nos
diferentes processos de recombinação.
• Determinação do envolvimento das proteínas Smr de S. typhimurium e de S. cerevisiae nos
diferentes processos de reparação do DNA.
29
3. Material e Métodos.
3.1. Cepas, plasmídeos e fagos.
Todas as cepas assim como os plasmídeos e fagos empregados neste trabalho estão
listados na tabela 7 abaixo.
Material
Genético
Características Relevantes
Origem/
Referencia
Cepas de
H. pylori
X47-2AL
Cepa parental, adaptada a camundongo.
Londoño-
Arcila e col.,
2002.
X47-2ALmutS mutS::Kan (ou mutS::Gm quando for indicado). Cepa
derivada de X47-2AL
Esta tese
X47-2ALsmr smr::Gm, derivada de X47-2AL Esta tese
X47-2ALslt slt::Gm, derivada de X47-2AL. slt é codificada pela ORF
HP0645.
Viala e col.,
2004.
X47-2ALcahA cahA::Gm, derivada de X47-2AL. cahA é codificada pela
ORF HP1186.
Bury-Moné e
col., 2004.
ADM1 Cepa parental, isolamento clínico. O’Rourke e
col., 2000.
ADM1mutS mutS::Kan, derivada de ADM1 Esta tese
26695 Cepa parental Tomb e col.,
1997.
26695mutS mutS::Kan, derivada de 26695 Esta tese
J99 Cepa parental Alm e col.,
1999.
J99mutS mutS::Kan, derivada de J99 Esta tese
N6 Cepa parental Ferrero e col.,
1992.
N6mutS mutS::Kan, derivada de N6 Esta tese
N6slt slt::Gm, derivada de N6. slt é codificada pela ORF HP0645 Lab. Agnès
Labigne.
N6cahA cahA::Gm, derivada de N6. cahA é codificada pela ORF
HP1186.
Lab. Agnès
Labigne.
F8 Cepa parental Ng e col.,
1999
Tabela 7. Material Genético utilizado nesta tese.
30
Material
Genético
Características Relevantes
Origem/
Referencia
Cepas de
E. coli
MC1061 araD139, ∆(ara, leu)7697, ∆lacX74, galU, galK, hsr, strA.
Padrão de metilação-restrição compatível com H. pylori
Casadaban &
Cohen, 1980.
BL21 F
-
ompT hsdSB(rB
-
mB
-
) gal dcm Amersham
TB1 F ara Δ(lac-proAB) [Φ80dlac Δ(lacZ)M 15] rpsL(Str ) thi
hsdR
- R
New England
Biolabs
BL21 Rosetta
BL21 + pRARE (Cm
R
). O plasmídeo pRARE contém os
tRNA para argU, argW, ileX, glyT, leuW, proL, metT, thrT,
tyrU e thrU, suplementando assim os codons raros AGG,
AGA, AUA, CUA, CCC e GGA
Novagen
Top10
F
-
mcrA Δ(mrr-hsdRMS-mcrBC) F80lacZΔM15 ΔlacX74
recA1 araD139 Δ(ara-leu)7697 galU galK rpsL endA1
nupG.
Invitrogen
M182
∆lac
Casadaban &
Cohen, 1980.
MM384 F
-
lacZ53(Am), LAM
-
thyA36, IN(rrnD-rrnE)1, rpsL151
(Str
R
), rha
-
5, deoC2.
E. coli Genetic
Stock Center
ES1301 mutS201::Tn5 Kan, derivada de MM384. E. coli Genetic
Stock Center
ES1484 mutL::Tn10 Tet, derivada de MM384. E. coli Genetic
Stock Center
AB1157
F
-
thr-1, ara-14, leuB6, ∆(gpt-proA)62, lacY1, tsx33,
supE44, galK2, rac-, hisG4(Oc), rfbD1, mgl51, rpsL31,
kdgK51, xyl-5, mtl-1, argE3 (Oc), thi-1, qsr
E. coli Genetic
Stock Center
AB1157mutS mutS215::Tn10 Tet, derivada de AB1157 Lab. Miroslav
Radman
GW3773 mutH471::Kan, derivada de AB1157. E. coli Genetic
Stock Center
KL227 HfrP4x, metB1, relA1, spoT1 Lab. Miroslav
Radman
ED1032
HfrPO201, ∆(gpt-lac)5, relA1, rpsE2123, thi-1, supE44,
TP3. (TP3: transposição do lac à região próxima da
terminação da transferência)
Lab. Miroslav
Radman
BW25113 F
-
, λ
-
, lacI
q
rrnB
T14
∆lacZ
WJ16
hsdR514 ∆araBAD
AH33
∆rhaBAD
LD78
.
Datsenko &
Wanner, 2000.
Cepas de
S. typhimurium
SA 965 HfrK17, leuBCD39, ara-7. Lab. Miroslav
Radman
SA 486 HfrK3, serA13, rfa-3058. Lab. Miroslav
Radman
Tabela 7
(
continua
ç
ão
)
. Material Genético utilizado nesta tese.
31
Material
Genético
Características Relevantes
Origem/
Referencia
LT2 Cepa parental Lab. Josep
Casadesus
SV1601
Duplicação cysG1573*MudP*ilvA 2642, derivada de LT2
Camacho &
Casadesús,
2001
SV1603
Duplicação proA 692*MudQ*purE 2164, derivada de LT2
Camacho &
Casadesús,
2001.
LT2ydaLyfcN ∆ydaL ∆yfcN, derivada de LT2 Esta tese
LT2flhC flhC::Tn 10 Cm, derivada deLT2 Lab Josep
Casadesús
ATCC14028 Cepa parental Lab. Josep
Casadesús
SV5137 Duplicação cysG 1573*MudP*ilvA 2642, derivada de ATCC
14028
Esta tese
SV5131 ∆yfcN ydaL::Kan, derivada de SV 5137 Esta tese
SV5138 Duplicação proA 692*MudQ*purE 2164, derivada de ATCC
14028
Esta tese
SV5132 ∆yfcN ydal::Kan, derivada de SV 5138 Esta tese
Cepas de
S. cerevisiae
RKY3109
Mat a, ura3-52, leu2∆1, trp1∆63, his3∆200, lys2∆Bgl,
hom3-10, ade2∆1, ade8
Ni e col.,
1999.
RKYMSH4 MSH4::kanMX6, derivada de RKY 3109 Esta tese
RKYMSH5 MSH5::kanMX6, derivada de RKY 3109 Esta tese
RKYYPL YPL199c::ura, derivada de RKY 3109 Esta tese
RKYMSH4YPL MSH4::kanMX6, YPL199c:: ura, derivada de RKY 3109 Esta tese
RKYMSH5YPL MSH5::kanMX6, YPL199c:: ura, derivada de RKY 3109 Esta tese
RKY’
Como RKY3109, portanto Mat α
Lab. Serge
Boiteux.
RKYMSH4’ Como RKYMSH4, portanto Mat α Esta tese
RKYYPL’ Como RKYYPL, portanto Mat α Esta tese
RKYMSH4YPL’
Como RKYMSH4YPL, portanto Mat α
Esta tese
Tabela 7
(
continua
ç
ão
)
. Material Genético utilizado nesta tese.
32
Material
Genético
Características Relevantes
Origem/
Referencia
Plasmídeos
pGEX 4T1 Glutation-S-transferase no N-terminal, promotor tac. Amersham
pMALc-2X Maltose Binding Protein no N-terminal, promotor tac. New England
Biolabs
pMALp-2X Maltose Binding Protein no N-terminal com peptídeo sinal
para expressão no periplasma. Promotor tac.
New England
Biolabs
pTrc 99A Plasmídeo sem proteína de fusão, promotor trc Amersham
pET 3b Plasmídeo sem proteína de fusão, promotor T7 New England
Biolabs
pET 15 6 His-tag no N-terminal, promotor T7 Novagen
pETM 11 6 His-tag no N-terminal, promotor T7 Lab. G. Stier
pBAD A 6 His-tag no N-terminal, promotor araBAD Invitrogen
pILL570 ori ColE1, suicida em H. pylori Lab. Agnès
Labigne
pILL570∆ ∆oriT + 800bp a jusante, derivado de pILL 570 Lab Agnès
Labigne
pUC 18K-2 pUC 18 + cassete Kan não polar Lab. Agnès
Labigne
pUC 18 Gm pUC 18 + cassete Gm não polar Lab Agnès
Labigne
pHel 2 Plasmídeo autoreplicante em H. pylori, Cm
R
. Lab. Agnès
Labigne.
pKD3 pANTSγ + cassete Cm flanqueado por sítios FRT Datsenko &
Wanner, 2000.
pKD4 pANTSγ + cassete Kan flanqueado por sítios FRT Datsenko &
Wanner, 2000.
pKD46 pINT-ts + araC-P
araB
γ β exo (Red helper) Datsenko &
Wanner, 2000.
pCP20 Indução térmica da síntese da FLP recombinase. Datsenko &
Wanner, 2000.
pBlueScript Derivado dos pUC. Alto número de copias. Amp
R
. Stratagene
pRS316 Plasmídeo centromérico de levedura com marcador URA3 New England
Biolabs.
Fagos
P 22 DNA linear dupla fita, infecta S. typhimurium Lab. Josep
Casadesús
Tabela 7. Material Genético utilizado nesta tese.
33
3.2. Meios e Condições de Cultura.
H. pylori foi cultivada em meio agar sangue base n° 2 (Oxoid) suplementado com 10% de
sangue de cavalo (BAB) e os seguintes antibióticos: vancomicina 10 mg/L (Lederle), polimixina
B 5 mg/L (Pfizer), trimetroprima 5 mg/L (Sigma) e amfotericina B 5 mg/L (Squibb). As bactérias
foram cultivadas a 37°C em jarras OXOID durante 1 a 5 días, com umidade à saturação e
atmosfera enriquecida com 5% CO
2
(campylobacter system # BR56”). Os antibióticos (Sigma)
utilizados como agentes seletivos foram: kanamicina 20 μg/L (Kan), spectinomicina 100 μg/L
(Sp), gentamicina 5 μg/L (Gm), rifampicina 20 μg/L (Rif), metronidazol 8 μg/L (Mtz) e
cloranfenicol 8 μg/L (Cm).
E. coli e S. typhimurium foram cultivadas em meio LB (lysogenic broth; Bertani, 1951)
com ou sem 15 g/L de agar (Difco). Os antibióticos utilizados como agentes seletivos foram:
ampicilina 200 mg/L (Amp), Kan 40 mg/L, Rif 200 mg/L, Cm 35 mg/L e Tetraciclina 100 mg/L
(Tet) (Sigma). As bactérias foram cultivadas a 37°C, com agitação (200 rpm/min) no caso de
culturas líquidas.
S. cerevisiae foi cultivada em meio YPD (Difco) com ou sem 20 g/L de agar. Os
experimentos de mutagênese foram realizados em meio mínimo YNB (base de levedura
nitrogenada sem aminoácidos –Difco-) com 20 g/L de Agar. O YNB foi complementado com
glicose 0,2% e adenina 4g/L, L-histidina 20 g/L, L-leucina 10 g/L, L-lisina 4 g/L, L-metionina 15
g/L, L-treonina 10 g/L, L-triptofano 2 g/L e uracil 2 g/L (Sigma). Como agente seletivo se
utilizou canavavina 60 mg/L (Can) (Sigma). A pré-esporulação foi realizada no meio SPS: 0,5 %
extrato de levedura, 1 % peptona, 0,17 % YNB, 0,05 M ptalato (pthalate) de potássio, 1 % acetato
de potássio, 0,5% sulfato de amônia e 10 μg/mL Tet. A esporulação foi realizada em meio KAC:
1% acetato de potássio, 10 mg/mL Tet e complementado com 1/5 da concentração dos
34
aminoácidos requeridos (vide complemento do meio YNB).As leveduras foram cultivadas a 30°C
durante 1 a 5 días, com agitação de 150 rpm/min no caso das culturas líquidas.
3.3. Construção de cepas mutantes mutS2 (HP0621) em H. pylori.
A partir do plasmídeo pILLhpmutS (Lab. Agnès Labigne, Instituto Pasteur, França) foram
amplificadas por PCR as 300 bp no extremo 5’ e 3’ terminal do gene mutS2 juntamente com o
plasmídeo inteiro, mediante a utilização de oligos cujos extremos 3’ foram direcionados para fora
do gene mutS (tabela 8). Logo após, o cassete Kan proveniente do
pUC 18K-2 foi adicionado a
esse produto de PCR por restrição/ligação utilizando os sítios KpnI e BamHI presentes nos
extremos, tanto do cassete quanto do produto de PCR (oligo sublinhado). O produto de ligação
foi introduzido na cepa MC1061 de E. coli. A troca alélica da deleção do gene mutS2 foi
verificada por PCR utilizando os oligos Hp0621-3 e 4 em combinação com os oligos H50 e H17
do cassete Kan. O novo plasmídeo contendo hpmutS::Kan foi introduzido por transformação
natural (500 ng DNA/10
6
células) em diferentes cepas de H. pylori. As bactérias mutantes foram
selecionadas em Kan 20 μg/mL. Idêntico procedimento se realizou para gerar os mutantes
mutS2::Gm, onde a seleção foi com 5 μg/mL de Gm.
Oligo Seqüência nucleotídica (5’→3’)
Hp0621-1 CGGGGTACCAATT TCATCATAATGGAGCGTCCC
Hp0621-2 CGCGGATCCCTTGGCATGCGTTTAAAAGCGCATG
Hp0621-3 ATGTCAGACGCTCCAAAAA
Hp0621-4 CAATTTAACGATTTTAACCCCAC
H50 CCGGTGATATTCTCATTTTAGCC
H17 TTTGACTTACTGGGGATCAAGCCTG
Tabela 8 . Oligonucleotídeos utilizados para a construção e verificação do mutante hpmutS.
35
3.4. Construção dos substratos utilizados nos ensaios in vivo.
O DNA genômico das cepas de H. pylori X47-2AL mutantes em slt
(HP0645)
e cahA
(HP1186)
,
e N6 mutantes em slt e cahA foi preparado utilizando o protocolo do kit Qiamp (Quiagen). Para a
construção dos plasmídeos foram amplificadas, por PCR, duas regiões hiper-variáveis
(denominadas s e m) do gene vacA (HP0887) (Van Doorn e col., 1999). Isto foi feito a partir de
três cepas de H. pylori originárias de pontos geograficamente distantes (X47-2AL do Japão,
26695 da Inglaterra e F8 da África). Os oligos 3’ da região s e 5’ da região m também possuíam
seqüências homólogas às regiões 5’ e 3’, respectivamente, do cassete que confere resistência a
Gm. Os produtos da amplificação dos fragmentos s e m foram utilizados como oligos para a
amplificação do cassete Gm gerando como produto final vacAs-Gm-vacAm (fig. 9). Os produtos
foram clonados no plasmídeo pILL570D. Para facilitar essa clonagem, as extremidades dos
oligos extremos do produto vacAs-Gm-vacAm foram desenhadas com uracil no lugar de timina
(ver tabela 9). O plasmídeo pILL570Δ também foi amplificado por PCR utilizando oligos com
uracil nos extremos. Estas características substituíram o corte com enzimas de restrição por um
curto tratamento com Uracil DNA Glicosilase (UDG). Após a incubação de ambos produtos de
PCR (pILL570Δ e vacAs-Gm-vacAm) com 1 U de UDG durante 30 minutos a 37°C a mistura foi
diretamente transformada (CaCl
2
) em E. coli MC1061. Os clones positivos foram selecionados
por resistência a 100 μg/mL Sp, e seqüenciados para determinar o grau de heterologia entre eles.
Oligo Seqüência nucleotídica (5’→3’)
vacA 5’ S CAUCAUCAUAT GGAAATACAACAAACACCA
vacA 3’ S CGCCATTCGTATTGCACGACATTTATTCCTCCT CTTCAAGCTTG
TTCCATTGCCC
vacA 5’ M CUACUACUACGTCAAAATAATTCCAAGGG
vacA 3’ M CTCGCCAGTCGATTGGCTGATACCT GGGCAGGATCAAGCGCG AA
Tabela 9. Oligonucleotídeos utilizados para a ampliação das regiões hiper-variáveis s e m do gene hpvacA. Em
verde e azul: extremos contendo uracil no lugar de timina. Em vermelho: regiões homólogas aos extremos do cassete
Gm.
36
Cassete Gm (850 bp)
100 % 100 %
85,5 % 85 % 74 %
93,7 % 94,1 %
vacA s (~ 400 bp) vacA m (~ 400 bp)
X47-2AL
F8
26695
Figura 9. Representação esquemática das construções de DNA utilizadas para a transformação das
cepas de H. pylori. Cada fragmento apresenta a percentagem de identidade quando comparadas com a X47-
2AL. Em lilás está representada uma inserção de 57 nucleotídeos
As diferentes clonagens (VacA·X47-2AL, VacA·F8 e VacA·26695) foram amplificadas
por propagação das bactérias hospedeiras e preparadas utilizando um kit Maxiprep (Quiagen).
3.5. Procedimentos Genéticos em H. pylori.
3.5.1. Taxa de Mutagenêse Espontânea.
Dez culturas independentes de diferentes cepas H. pylori selvagens, e de seus respectivos
mutantes isogênicos foram cultivadas durante 24 horas em meio BAB e os correspondentes
antibióticos. Alíquotas de diluições seriadas foram plaqueadas em BAB com 20 μg/mL Rif e/ou 8
μg/mL Mtz. Para determinar a taxa de mutagênese (expressada como mutações Rif
S
→Rif
R
ou
Mtz
S
→Mtz
R
por locus e por geração) se utilizou o método da mediana de Lea & Coulson (1949).
3.5.2. Integração de DNA.
Os substratos VacA·X47-2AL, VacA·F8 e VacA·26695 (descritos no ponto 3.12) foram
introduzidos nas cepas X47-2AL e X47-2ALmutS por transformação natural (simples contacto).
Para cada experimento foram realizadas, pelo menos, dez transformações independentes
37
utilizando 1 μg de DNA para cada 10 μL de bactérias (5.10
6
bactérias) em meio BAB. Após 24
horas de incubação, as bactérias foram colhidas e após diluições seriadas, alíquotas foram
plaqueadas em BAB com 5 μg/mL Gm ou 20 μg/mL Rif. Cada colônia resistente (unidade
formadora de colônia –UFC-) é considerada como um evento de incorporação. Os resultados
destes experimentos foram expressos como UFC/μg de DNA.
3.6. Procedimentos Genéticos em E. coli.
3.6.1. Mutagênese.
As cepas MM348, ES1301, M182, ES1484, AB1157 e GW3773 foram transformadas
com plasmídeos vazios, ou contendo o gene hpmutS (como se detalha na tabela 22 e 23). Para
determinar a freqüência do aparecimento de bactérias resistentes a rifampimicina (Rif
R
), pelo
menos dez colônias de cada cepa foram resuspensas em 5 mL de LB e cultivadas ON a 37°C com
agitação constante. No caso da presença de plasmídeos foram adicionadas, ao meio de cultura, as
quantidades apropriadas do agente seletivo. As bactérias foram diluídas de modo a apresentar 2-
5.10
3
células/mL e cultivadas novamente a 37°C. O baixo número de bactérias inoculadas
aumenta a probabilidade de começar sem mutantes. Após 16 horas de incubação, foram efetuadas
diluições seriadas que foram plaqueadas em LB rifampicina para determinar o número de
mutantes Rif
R
. As colônias foram contadas 24-48 horas após o plaqueamento. A freqüência de
mutantes resistentes a rifampicina foi determinada como a razão entre o número de células
resistentes a Rif e o título da cultura.
3.6.2. Conjugação.
Células cultivadas ON foram diluídas 50x em LB (bactérias doadoras) ou LB
suplementado com 1 mM IPTG e 100 μg/mL Amp (para as bactérias receptoras) e cultivadas até
38
D.O
600nm
1 (aproximadamente 10
8
bactérias/mL). A conjugação começou com a incubação por 2
horas a 37°C das misturas de bactérias doadoras e receptoras (2 mL de cada uma). Depois desse
período, a conjugação foi interrompida por forte agitação, e alíquotas de diluições seriadas foram
plaqueadas em meio M9 suplementado com 10 mg/mL vitamina B1, 40 μg/mL prolina, 40
μg/mL histidina, 40 μg/mL leucina e 40 μg/mL treonina ou arginina (Sigma). Para determinar o
número de receptoras, as células foram plaqueadas em LB Amp. As bactérias foram incubadas
durante 24 horas a 37°C. A freqüência foi calculada como número de recombinantes sobre
número de receptoras.
3.7. Clonagens para superprodução de proteínas em E. coli.
Todos os genes foram amplificados por PCR utilizando as seqüências específicas dos seus
extremos 5´e 3´, obtidas a partir dos genomas de H. pylori (Tomb e col., 1997), E. coli (Rudd,
2000) e S. cerevisiae (Cherry e col., 1997) e utilizando DNA genômico das cepas X47-2AL (hp),
AB1157 (ec) e RKY3109 (sc) como molde. Cada oligonucleotídeo (oligo) foi desenhado com
uma seqüência alvo para uma enzima de restrição específica no seu extremo 5´. Os oligos e as
enzimas empregadas para as clonagens estão listados na tabela 10. Logo após a restrição, os
produtos de PCR e plasmídeos foram misturados numa proporção de 10:1, numa concentração
final de 50 ng/μL de DNA e ligados com 10 U de T
4
DNA ligase (NEB) durante a noite toda
(ON) a 16°C ou durante 2 h à temperatura ambiente. Os produtos de ligação foram usados para
transformar E. coli selvagens e/ou mutantes. Os clones positivos foram confirmados por
seqüenciamento de nucleotídeos.
39
ORF
amplificado
Ordem dos oligos: direto e reverso.
Seqüências dos oligos 5’→3’.
Enzimas
(5´e 3´)
hpmutS
para pGEX
CGGGATCCTTGTCAGACGCTCCAAAAAGATCCC
CGCGGATCC
TCACAATTTAACGATTTTAACCCCAC
BamHI
EcoRI
hpmutS para
pMAL
CGGGATCCTTGTCAGACGCTCCAAAAAGATCCC
TGCGCAGCTG
TCACAATTTAACGATTTTAACCCCAC
BamHI
XmaI/SmaI
hpmutS para
pTrc 99A
CGGGATCCTTGTCAGACGCTCCAAAAAGATCCC
ACGCGTCGACTCACAATTTAACGATTTTAACCCCAC
BamHI
Sal I
hpmutS para
pET 3b
GGGAATTCCATATGTCAGACGCTCCAAAAAG
CGCGGATCCTCAGTGGTGGTGGTGGTGCAATTTAACGATTTTA
ACCCCAC
NdeI
BamHI
hpmutS∆smr
para pET 3b
GGGAATTCCATATGTCAGACGCTCCAAAAAG
CGCGGATCCTCAGTGGTGGTGGTGGTGGCGCAAGCTCGCTTCTTTA
GG
NdeI
BamHI
hpsmr para
pETM 11
CATGCCATGGCGAGCTTGCGCC
CGGGATCCT
TACAATTTAACG
NcoI
BamHI
ecydaL para
pET 15
GGGAATTCCATATGAACCTTGACGACAAATCGCTG
CGCCTAGGTCAACGACTGCGCTTAGCGTGG
NdeI
BamHI
ecydaL para
pBAD
CCGCTCGAGATGAACCTTGACGACAAATCGCTG
GGGGTACC
TCAACGACTGCGCTTAGCGTGG
XhoI
KpnI
ecyfcN para
pET 15
GGGAATTCCATATGAAAAAGAAAACA ACACTTAGCGAGG
CGCCTAGGTCAGGGCAACTCCGGCGG
NdeI
BamHI
ecyfcN para
pBAD
CCGCTCGAGATGAAAAAGAAAACAA CACTTAGCGAGG
GGGGTACCTCAGGGCAACTCCGGCGG
XhoI
KpnI
scSMR para
pET 15
GGGAATTCCATATGAAAGGAACAGGTGGAGTAGTAG
CGCCTAGG
TCACGCCAAACTTTGTATACAATTACAAAAG
NdeI
BamHI
scSMR para
pBAD
CCGCTCGAGATGAAAGGAACAGGTG GAGTAGTAG
GGGGTACCTCACGCCAAACTTTGTATACAATTACAAAAG
XhoI
KpnI
Tabela 10. Oligonucleotídeos utilizados para a amplificação dos genes estudados.
3.7.1. Mutagenêse sítio dirigida.
O plasmídeo pET3hpmutSG338R foi obtido por mutagenêse sítio dirigida a partir do
plasmídio pET3bhpmutS
+
, utilizando o kit QuikChange System (Novagem). Para isso foram
desenhados oligos contendo a mutação GGX→CGX (glicina→arginina) . Estes oligos for am
empregados para realizar uma reação de PCR com a DNA polimerase PfuI (NEB), a qual
replicou integralmente ambas fitas do plamídeo com a troca das bases desejada. A enzima DpnI
(NEB), adicionada à mistura de reação após a amplificação, digeriu o DNA molde
(pET3bhpmutS
+
) por ser o único a apresentar sítios metilados. O produto de PCR foi digerido
40
enzimaticamente (BamHI-NEB) e ligado (T4DNA ligase-NEB). O produto da ligação foi
utilizado para transformar a cepa MC1061 e, posteriormente, introduzido na cepa X47-2AL por
transformação natural.
3.8. Purificação das proteínas recombinantes.
Todas as proteínas utilizadas nos ensaios in vitro foram purificadas usando o equipamento
FPLC (GE Healthcare Life Sciences). O grau de pureza das proteínas foi determinado por
densitometria a partir de geles SDS-PAGE corados com solução de azul de Coomasie.
3.8.1. Resinas.
Cromatografia por afinidade.
A cromatografia por afinidade separa proteínas pelas interações reversíveis entre a
proteína e o ligante específico acoplado à matriz cromatográfica. Essa reversão pode ser obtida
através de troca de pH, das condições de adstringência e de eluição competitiva, entre outras.
Glutation Sepharose 4B e Resina Amilose. A Glutationa Sefarose 4B é formada por
matriz de sefarose ligada à glutationa. A estrutura da glutationa é complementar ao sítio de
ligação da glutationa-S-transferase (utilizada como “tag” das proteínas recombinantes). Por sua
vez, a Amilose encontra-se covalentemente associada à matriz de agarose e de maneira idêntica à
glutationa, é complementar ao sítio de ligação da “maltose-binding-protein” (MBP).
Chelating-Ni
+
. Esta resina é formada por matriz de sefarose unida covalentemente a um
quelante de cátions divalentes (ácido iminodiacético) que, por sua vez, está unido ao metal
divalente (neste caso Ni
2+
). Na interação, as histidinas se complexam aos íons de Ni
+
imobilizados, obtendo-se assim, a retenção específica por afinidade.
Heparina. Esta resina opera como um ligante de afinidade, porém, quando interage com
proteínas ligadoras de DNA, mimetiza a estrutura polianiônica dos ácidos nucléicos e funciona
41
como um trocador catiônico de grande capacidade devido aos seus grupos sulfatos. A heparina é
um glicosaminoglicano altamente sulfatado acoplado à matriz de sefarose (método N-
hidroxisuccinamido).
Tampão I Tampão J Tampão K Tampão L
Fosfato-Na
+
20 mM,
pH 7,4
Fosfato-Na
+
20 mM,
pH 7,4
Fosfato-Na
+
20 mM,
pH 7,4
Fosfato-Na
+
20 mM,
pH 7,4
NaCl 500 mM NaCl 500 mM NaCl 100 mM NaCl 100 mM
DTT 1mM
β−mercaptoetanol
1 mM
β−mercaptoetanol
1 mM
β−mercaptoetanol
1mM
Imidazol 20 mM Imidazol 500 mM
Tabela 13. Tampões utilizados na purificação das proteínas HpMutS·His, HpMutSG338R·His e
HpMutSΔSmr.
Tampão M Tampão N Tampão O Tampão P
Fosfato·Na
+
50 mM
pH 7,5
Fosfato·Na
+
50 mM
pH 7,5
Fosfato·Na
+
50 mM
pH 7,5
Tris·HCl 50 mM pH
8,0
NaCl 500 mM NaCl 50 mM NaCl 50 mM EDTA 0,5 mM
β−mercaptoetanol
1mM
β−mercaptoetanol
1mM
β−mercaptoetanol
1mM
Imidazol 20 mM Imidazol 350 mM
Tabela 14. Tampões utilizados na purificação da HpSmr.
Tampão Q Tampão R Tampão S Tampão T
Fosfato·Na
+
50 mM
pH 7,5
Fosfato·Na
+
50 mM
pH 7,5
Fosfato·Na
+
50 mM
pH 7,5
Tris·HCl 50 mM pH 8
Glicerol 10% Glicerol 10% Glicerol 10% CaCl
2
1 mM
NaCl 500 mM NaCl 50 mM NaCl 50 mM Tween 20 (v/v) 1%
βmercaptoetanol
1mM
βmercaptoetanol
1mM
DTT 1 mM
Imidazol 20 mM Imidazol 500 mM
Tabela 15. Tampões utilizados na purificação das proteínas EcYdaL e EcYfcN.
Tampão U
Tris·HCl 50 mM pH 8
Glicerol 10 %
NaCl 500 mM
β−mercaptoetanol 1mM
Imidazol 20 mM
Tabela 16. Tampão utilizado na purificação da ScYPL199c.
43
3.8.3. Procedimentos em FPLC.
O sistema FPLC e as colunas utilizadas foram preparados como se descreve a seguir. Os:
circuitos A e B do sistema FPLC foram lavados com 20 mL de H
2
O MilliQ e posteriormente com
20 mL do tampão correspondente para cada circuito dependendo de cada corrida. As colunas
foram lavadas com 10 volumes de coluna (10VC) de H
2
O MilliQ e posteriormente, em conjunto
com o “loop” de carga das proteínas, com 10VC do primeiro tampão a utilizar na corrida. Para
cada passagem por FPLC as proteínas foram aplicadas à coluna e posteriormente foi feita a
lavagem da mesma com 10VC do primeiro tampão de corrida. As proteínas foram eluídas com
aproximadamente 15 VC de gradiente crescente em concentração do segundo tampão. A
velocidade de fluxo durante a carga na coluna foi mantida em 0,5 mL/minuto, sendo
posteriormente aumentado para 1 mL/minuto. As frações coletadas foram analisadas por SDS-
PAGE e quantificadas pelo método de Bradford.
3.8.4. Superprodução e purificação de HpMutS a partir da fusão GST-HpMutS.
As bactérias E. coli JM109 transformadas com o plasmídeo pGEXhpmutS
+
foram
cultivadas até alcançar uma DO
600nm
de 0,8 e induzidas com 1mM de IPTG durante 3 horas a
37°C, em agitação constante de 100 rpm para uma cultura de 1 L em um Erlenmeyer de 5 L. As
bactérias foram colhidas por centrifugação e resuspensas em tampão A. A lise se realizou por
tratamento com 0,1 mg/mL de lisozima em gelo e posterior ultra-som. Os extratos totais foram
centrifugados a 100.000 x g durante 1 hora a 4°C. O sobrenadante foi incubado durante toda a
noite (ON) a 4°C com a resina sefarose 4B-GSH (Pharmacia) pré-equilibrada com o tampão B.
Após a interação, a resina foi lavada com pelo menos 50 volumes de tampão B e a eluição foi
realizada com a adição de 30 mM de glutationa reduzida no tampão B. A proteína obtida da
eluição foi concentrada até 1 mg/mL (Concentrador Ultrafree-15, Millipore) e dialisada a 4 °C
contra 5000 volumes de tampão C. A proteína de fusão GST-HpMutS equilibrada em tampão C
44
foi digerida com 10 U/μg de trombina (ICN) durante 40 minutos a 25°C. A digestão foi
finalizada mediante diálise contra 5000 volumes do tampão D a 4°C. A separação da GST e
HpMutS se realizou mediante passagem pela coluna MonoS (Amersham Biosciences) num
sistema de cromatografia FPLC-SMART (Fast Performance Liquid Chromatography –
Amersham Biosciences). Para isso, utilizou-se um gradiente escalonado dos tampões D e E,
sendo: primeiro passo: 100 % D/ 0 % E; segundo passo: 93,25 % D/ 6,75 % E; terceiro passo:
82,5 % D/ 17,5 % E e, último passo: 0 % D/ 100 % E. As distintas etapas de purificação foram
seguidas mediante geles de 10% SDS-PAGE.
3.8.5. Superprodução e purificação de HpMutS a partir da fusão MBP-HpMutS.
Células de E. coli TB1 contendo o plasmídeo pMALchpmutS
+
foram cultivadas a 37°C e
150 rpm até atingirem uma D.O.
600nm
de aproximadamente 1. Posteriormente, as culturas foram
transferidas para a temperatura de 20°C, seguido de 30 a 45 minutos de incubação antes da
adição de 0,3 mM de IPTG. As culturas foram incubadas por mais 12 horas nessa temperatura.
As bactérias foram colhidas por centrifugação (5.000 x g, a 4°C por 10 minutos), ressuspensas
em tampão F e, após congelamento, submetidas a ultra-som até a completa lise. Logo após 30
minutos de centrifugação a 100.000 x g e a 4°C, o sobrenadante foi submetido a interação com
uma matriz de amilose, da qual a fusão MBP-HpMutS foi eluida pela adição de 10 mM de
malt ose a o tampã o F. Foram escolhidas as frações que apresentaram uma concentração igual ou
maior que 1 mg/mL de MBP-HpMutS para serem expostas à protease (factor Xa) durante 3 horas
a 23°C. Uma vez realizada a digestão, a separação da HpMutS da MBP foi ensaiada pela
passagem por uma coluna HiTrap Heparina (Amersham, conectada a um sistema FPLC). Para
isso, a proteína foi diluída com o tampão G até apresentar uma condutividade equivalente ao
tampão H (com 100 mM de NaCl e utilizado para a carga das proteínas na coluna de heparina). A
45
eluição foi realizada através de um gradiente linear de NaCl chegando até uma concentração de 2
M. Todas as etapas de purificação foram seguidas por SDS-PAGE a 10%.
3.8.6. Superprodução e purificação de HpMutS sem proteína de fusão.
Os procedimentos experimentais foram os seguintes: 1) Indução a DO de 1 com 1mM
IPTG (ON, 20°C). 2) Lise por ultra-som e centrifugação a 100.000 x g durante 30 minutos a 4°C.
3) Precipitação com 50 % (NH
4
)
2
SO
4
. 4)Passagem por coluna de heparina, eluição por gradiente
linear de 100 mM a 2 M NaCl. 5) Passagem por coluna MonoS, eluição por gradiente linear de
100 mM a 2 M NaCl.
3.8.7. Superprodução e purificação de HpMutS, HpMutSG338R e HpMutSΔSmr a
partir das fusões proteína de interesse·His.
Para a superprodução, células de E. coli BL21 Rosetta transformadas com pET3bmutS
+
,
pET3bmutSG338R
+
e pET3bmutSΔsmr
+
foram cultivadas a 37°C até uma DO
600nm
de 0,6 e
induzidas pela adição de 0,5 mM de IPTG seguido de 3 horas de incubação a 37°C. As bactérias
foram colhidas por centrifugação (5,000 x g à temperatura ambiente) e ressuspensas em tampão I.
A lise foi realizada por ultra-som, e após centrifugação (100.000 x g, 20 minutos a 4°C) a fração
solúvel foi aplicada a uma coluna HiTrap Chelating Ni
2+
(Amersham) previamente equilibrada
com tampão J. A eluição foi efetuada com um gradiente linear de relação inversa entre os
tampões J e K (de 100 % a 0 % de tampão J e de 0 % a 100 % de tampão K) (fig 21A). As
frações contendo HpMutS·His foram aplicadas numa coluna HiTrap Heparina equilibrada com
tampão L. A eluição foi realizada por um gradiente linear de 100 mM a 1 M de NaCl. Para
concentrar a proteína, a HpMutS-His foi aplicada numa coluna Ressouce S (Amersham) e eluida
com um gradiente linear de 100 mM a 500 mM de NaCl em tampão I. As diferentes etapas de
purificação foram seguidas por SDS-PAGE a 10%.
46
3.9. Substratos utilizados nos ensaios in vitro.
Os substratos utilizados estão descritos na tabela 17 e na figura 10.
Seqüência (5’→3’) Origem ou
Referência
Estrutura
*GTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTGTG
Esta tese
Fita
Simples
(FS)
*GGCTTCATCGTTGTCGCAGACCTGGTGGATACCG
CCGAAGTAGCAACAGCGTCTGGACCACCTATGGC
Lab. Serge
Boiteux
(CEA, França)
Fita Dupla
(FD)
*GGCTTCATCGTTGTCGCAGACCTGGTGGATACCG
CCGAAGTAGCAACAGTGTCTGGACCACCTATGGC
Esta tese
Fita dupla
com erro
de
emparelha
mento
(MM)
GACGCTGCCGAATTCTACCAGTGCCTTGCTAGGACATCTTTGC
CCACCTGCAGGTTCACCC
*TGGGTGAACCTGCAGGTGGGCAAAGATGTCCTAGCAATGTA
ATCGTCAAGCTTTATGCCGTT
Harmon &
Kowalczykowski
Forquilha
(F)
GACGCTGCCGAATTCTACCAGTGCCTTGCTAGGACATCTTTGC
CCACCTGCAGGTTCACCC
TCGATAGTCGGATCCTCTAGACAGCATGTCCTAGCAAGGCAC
TGGTAGAATTCGGCAGCG T
*TGGGTGAACCTGCAGGTGGGCAAAGATGTCCTAGCAATGTA
ATCGTCAAGCTTTATGCCGTT
CAACGGCATAAAG CTTGACGATTACATTG CTAGGACATGCTG
TCTAGAGGATCCGACTATCGA
Harmon &
Kowalczykowski
Estrutura
de
Holliday
(four way
junction –
FWJ-)
Tabela 17. Oligonucleotídeos utilizados para a construção de diferentes estruturas de DNA. Os oligos foram
adquiridos em Sigma-Genosys. O asterisco vermelho representa a marcação radioativa.
FS
FD
MM
F
FWJ
*
*
*
*
*
Figura 10. Representação esquemática da
estrutura dos substratos de DNA utilizados
para os ensaios in vitro (li
g
ação e
estimulação).
47
Um oligo de cada estrutura foi marcado radiativamente no extremo 5’ (em 20 μL finais:
20 pmoles de oligo, 100 μCi [γ-
32
P]ATP, 10 unidades de T4 polinucleótido cinase (PNK) e 2 μL
de tampão PNK (10x), 1 hora a 37°C). Logo após a marcação, os oligos foram purificados em
filtros G-25 (Amersham) e emparelhados com as fitas complementares [em 70 μL finais: 7
pmoles de cada oligo, 7 μL de tampão 10x (20 mM Tris·HCl pH 8, 150 mM NaCl e 10 mM
MgCl
2
); 6 minutos a 100°C e deixando chegar à temperatura ambiente em forma natural]. A
integridade das estruturas foi verificada em gel de poliacrilamida (6%) não desnaturante.
3.10. Hidrólise de ATP.
Os ensaios de hidrólise de ATP foram realizados na presença de tampão V (25 mM
Tris·HCl pH 7,6, 150 mM NaCl, 1 mM EDTA, 5 mM MgCl
2
, 5% v/v glicerol, 1 mM DTT e 50
μg/mL BSA). A reação (20 μL) contendo 2 μL de tampão V (10x), 13,3 nCi [γ-
32
P]ATP, 200 μM
de ATP (ou como apresentado na fig. 21 onde se utilizou uma faixa de concentração
compreendida entre 25 μM a 1000 μM), na presença ou ausência de 100 nM de distintas
estruturas de DNA (especificado para cada caso), começou com a adição de 25 nM de HpMutS,
(concentração estabelecida no primeiro ensaio –fig. 20A- que corresponde a 350 ng de proteína)
ou como mencionado para cada caso. As reações foram paradas após 30 minutos de incubação
pela adição de 2 μL de 500 mM EDTA pH 8. Os produtos das reações foram precipitados pela
adição de 300 μL de carvão ativado (7 % carvão ativado, 50 mM HCl, e 5 mM H
3
PO
4
) e
centrifugados a 12.000 rpm durante 20 minutos a 4°C. Alíquotas de 100 μl foram misturadas com
líquido de cintilação e o [γ-
32
P] livre foi detectado através de um contador de cintilação (Iggo &
Lane, 1989).
48
3.10.1. Análise de parâmetros pelo método da dupla recíproca de Lineweaver-Burk.
O cálculo da dupla recíproca de Lineweaver-Burk é uma representação gráfica de 1/V
vesus 1/[S] que permite a análise da equação da cinética enzimática de Michaelis-Menten
(Lineweaver & Burk, 1934). Os parâmetros Km e Vmáx foram obtidos pelo cálculo dos seus
valores recíprocos como mostrado a seguir:
V = Vmáx
[S]
Km + [S]
V = Vmáx
[S]
Km + [S]
Equação de Michaelis-Menten:
1
V
=
Km + [S]
Vmáx [S]
=
Km
Vmáx
1
[S]
+
1
Vmáx
1
V
=
Km + [S]
Vmáx [S]
=
Km
Vmáx
1
[S]
+
1
Vmáx
Cálculo da dupla recíproca:
Onde V é a velocidade de reação, Km é a constante de Michaelis-Menten, Vmáx é a
velocidade máxima de reação e [S] é a concentração de substrato.
3.10.2. Análise de parâmetros pelo método de Hanes-Wolf.
O método de Hanes-Wolf utiliza a relação de S
0
/V
0
versus [S], onde só um dos eixos
precisa de transformação, o que limita a propagação dos erros das medições (Le Maire e col.,
1990). A relação dos parâmetros para Hanes-Wolf é: 1/Vmáx · [S] + Km/Vmáx.
3.11. Análise de Multimerização de HpMutS.
3.11.1. Filtração molecular.
Alíquotas de 60 mg (25 μL) de MBP·HpMutS foram aplicadas numa coluna Superdex
200 PC 3.2/30 conectada a um sistema FPLC-SMART (Amersham) previamente equilibrada com
tampão de filtração (20 mM Tris·HCl pH 8, 1 mM EDTA, 1 mM DTT e 100 mM NaCl). O
volume de exclusão (Vex) foi determinado pelo azul dextrano (peso molecular 2.000 kDa) e o
volume total (Vt) foi determinado com acetona. A coluna foi calibrada com os seguintes padrões
49
moleculares: tireoglobulina (85 Å), ferritina (61 Å), aldolase (48,1 Å), albumina (35,5 Å),
ovoalbumina (30,5 Å) e ribonuclease (16,4 Å). O Kav (coeficiente de distribuição) para cada pico
foi calculado como Kav: Ve-Vex/Vt-Vex, sendo Ve o volume de eluição.
Após calculo de Kav para HpMutS foi determinado o seu raio de Stokes (raio da molécula
em solução que considera os aspectos de hidratação e forma da mesma), e assim, o seu peso
molecular.
3.12.2. Gradiente de Sacarose.
Mediante a utilização de um sistema misturador de soluções e uma bomba peristáltica
foram gerados gradientes de 5% a 25% de sacarose em tampão constituído por 50 mM de Tris
HCl pH 8, 1 mM EDTA, 0,01% triton, e 200 mM NaCl (ou como mencionado para cada caso).
Quando utilizados, as concentrações dos co-fatores foram: 3 mM MgCl
2
, 1mM ATP, e 1 mM
ADP. Após a formação do gradiente, a camada mais pesada (25 %) ficou na base e a mais leve (5
%) na superfície do tubo, de modo contínuo. Trabalhou-se com separação zonal, a qual,
diferentemente da separação isopícnica (equilíbrio em gradiente), aproveita o tamanho e a massa
da partícula para a sua sedimentação. As amostras de 200 μg de HpMutS (His-tag), equilibradas
com os tampões correspondentes, foram colocadas acima da camada mais leve. Os gradientes
foram submetidos a ultracentrifugação em rotor de ângulo livre (SW 40 Ti –Beckman)) durante
16 horas a 40.000 rpm e 4°C. Frações de 425 μL (10 gotas) foram recuperadas para a sua
posterior análise por Bradford (BioRad) e SDS-PAGE.
3.12. Ensaios de ligação ao DNA.
Os ensaios de ligação ao DNA (20 μL) foram realizados em presença de tampão V
incubando 10 fmoles de
32
P-DNA (DNA*) com a proteína HpMutS. As concentrações da mesma
50
foram especificadas, para cada caso, na apresentação dos resultados. A presença e concentração
de estruturas de DNA não marcadas também foram especificadas nos resultados (ensaios de
competição). Em todos os casos, as reações foram iniciadas com a adição da proteína de
interesse. As incubações foram realizadas durante 30 minutos a 4°C e paradas com a adição de 2
μl de tampão de amostra (10x). Para a análise das proteínas HpMutSΔSmr, HpSmr, EcYdaL e
EcYfcN (juntamente com HpMutS como controle) foi utilizado o tampão W (50 mM Tris·HCl
pH 7,5, 150 mM KCl, 5 mM MgCl
2
,.1mM DTT e 50 μg/mL BSA). As concentrações das
proteínas utilizadas foram especificadas nos resultados. As incubações começaram com a adição
da proteína de interesse e, após 30 minutos a 4°C (ou à temperatura indicada para cada caso)
foram paradas com a adição de 2 μL de tampão de amostra e imediatamente submetidas a
eletroforese.
3.12.1 Análise dos complexos proteína/DNA por retardo em gel.
Os complexos proteína/DNA* foram analisados por eletroforese em gel de poliacilamida
(6 % ou como mencionado) em condição nativa (ausência de SDS). Os geles foram submetidos a
pré-corrida de 50 V por 30 minutos em TBE (1x) ou como indicado, antes da aplicação da
amostra. A eletroforese foi realizada a 150 V durante aproximadamente 4 horas a 4°C.
Posteriormente os geles foram secos (sistema de secagem BioRad), visualizados e analisados
utilizando um sistema Storm Phosphorimager (Amersham).
3.12.2. Análise dos complexos proteína /DNA por retenção em filtro.
Os produtos das reações HpMutS/DNA* foram aplicados em membranas de nitrocelulose
Hybond-C (Amersham) previamente tratadas com 0.4 M KOH (Wong & Lohman, 1993). Logo
após a aplicação, as membranas foram lavadas, secas (sistema de slot blot), e quantificadas em
um sistema Storm Phosphorimager (Amersham).
51
3.12.3. Análise de Scatchard.
O tratamento dos dados pelo método de Scatchard foi utilizado para a análise da
especificidade, num estado de saturação, da proteína pelos seus possíveis substratos (Scatchard,
1949). A representação da relação substrato unido/substrato livre versus substrato unido permitiu
estabelecer (através do valor do inverso da inclinação da curva) o deslocamento de um substrato
radioativamente marcado (FWJ*) na presença de concentrações crescentes dos competidores não
marcados (FWJ, FD e FS). Neste caso, quanto maior a inclinação da curva, menor a
especificidade.
3.13. Troca de Fitas de DNA.
Os ensaios de troca de fitas de DNA foram realizados segundo o descrito por Lavery &
Kowalczykowski (Lavery & Kowalczykowski, 1992). Num volume final de 15 μl, pré-incubando
4,5 μM de M13CEF3 (DNA si mples fita circular) em 30 mM Tris·HCl pH 7,6, 9 mM MgCl
2
, 1,8
mM DTT, 1,1 mM ATP, na presença do sistema de regeneração de ATP (7,2 mM fosfocreatina e
9 U/mL fosfocreatina cinase) durante 3 minutos a 37°C. As proteínas RecA (1,5 μM) e SSB (0,26
μM) foram então adicionadas e as misturas foram incubadas por mais 10 minutos a 37°C.
Quantidades variáveis de HpMutS (ou HpMutSΔSmr, HpSmr, EcYdaL e EcYfcN) foram
adicionadas, seguido da adição de 4,5 μM de M13CEF3 dupla fita (linearizado pelas enzimas
PacI, ou AatII ou StuI) ou M13CEF4 dupla fita (linearizado com PacI, ou AatII ou StuI). Após 90
minutos de incubação a 37°C, as reações foram desproteinizadas (5 mg/mL Proteinase K, 10 %
SDS, e 250 mM EDTA) e analisadas por eletroforese em gel de agarose (0,8 % em tampão TAE).
Os geles foram corados com SybrGold (Molecular Probes) e quantificados utilizando o programa
ImageQuant. Na figura 11 é mostrado o M13CEF3 e suas regiões de heterologia.
52
►
►
◄
Figura 11. Representação gráfica dos substratos de transferência de fitas de DNA. M13CEF3 dupla fita
circular (e linear). Os fragmentos ressaltados em verde são aqueles que apresentam diferentes graus de heterologia.
Notem-se as heterologias de seqüência nos sítios de corte de Aat II e Stu I utilizadas para a linearização do DNA
circular.
53
3.14. Construção de cepas mutantes smr em H. pylori.
Utilizando DNA genômico da cepa X47-2AL foram amplificados, por PCR, dois produtos
correspondentes às 300 bp a montante (região A) e 300 bp a jusante (região B) do domínio smr
de H. pylori. Os oligos 3’ da região A (em negrito) e 5’ da região B (em negrito) contêm também
regiões homólogas complementares aos extremos 5’e 3’, respectivamente, do cassete que confere
resistência a Gm (tabela 18). Os produtos da amplificação da região A e B foram utilizados como
oligos para a amplificação do cassete Gm, a partir do pUC18Gm, obtendo assim o produto final
regiãoA-Gm-regiãoB. Este último foi introduzido, mediante restrição/ligação dos sítios KpnI e
BamHI (sublinhado), no plasmídeo pILL570, que por sua vez, foi introduzido por eletroporação
na cepa MC1061. Os mutantes por deleção do domínio smr foram verificados por PCR utilizando
os oligos internos H121 e H122 do cassete Gm em combinação com o 5’A smr e o 3’B smr. O
novo plasmídeo foi introduzido na cepa X47-2AL por transformação natural (500 ng DNA/10
6
células). Os mutantes foram selecionadas com Gm 5 μg/mL.
Oligo Seqüência nucleotídica (5’→3’)
5’A smr CGCGGTACCAGCGAAGTCGCTTCAAAAGATACTAGCTCCATGC
3’A smr CGCCATTCGTATTGCACGACATTTATTCCTCCTTC AGCGCAAGC
TCGCTTCTTTAGG
5’B smr CTCGCCAGTCGATTGGCTGATACCTGGTTGGCACTTTTTATGGGG
3’B smr CCGGTACCATCCCA CGCATTCCTATGACAAAGAT ATTGATG
H121 GAGCTCGGCTTTTCGCCATTCGTATT
H122 GGGATGCGAAGAATGCGATGCCGC
Tabela 18. Oligonucleotídeos utilizados para a construção e verificação o mutante hpmutS
Δ
smr.
54
3.15. Superprodução e purificação de HpSmr a partir da fusão His·HpSmr.
Para a superprodução, as células de E. coli BL21 Rosetta contendo o plasmídeo
pETM11hpsmr
+
foram cultivadas a 37°C até alcançar uma DO
600nm
de 0,5. Posteriormente, as
culturas foram transferidas para a temperatura de 20°C, seguido de 10 a 15 minutos de incubação
antes da adição de 1 mM de IPTG. As culturas foram incubadas por mais 12 horas nessa
temperatura, com agitação constante de 100 rpm para uma cultura de 1 L em um Erlenmeyer de 5
L. As bactérias foram colhidas por centrifugação e ressuspensas em tampão M. As culturas foram
expostas a ultra-som seguido de ultracentrifugação a 30.000 rpm durante 20 minutos a 4°C. O
sobrenadante foi submetido a troca por afinidade numa coluna de Ni
+
(Chelating Trap –
Amersham-), onde foi feita a eluição aplicando um gradiente linear de imidazol (20 mM a 350
mM) c om t ampã o N. As frações que apresentaram maior concentração de HpSmr foram
submetidas a troca iônica numa coluna Mono Q (Amersham) e eluidas com um gradiente linear
de NaCl (50 mM a 1500 mM) em tampão O. Após este passo de purificação e de diálise com
tampão P (da TEV), a HpSmr foi submetida à ação da proteinase TEV durante três horas a 30°C,
para eliminação da fusão (resíduos histidina). Como ultima etapa e para excluir os resíduos de
histidinas e a proteinase TEV da proteína HpSmr purificada,
a preparação foi submetida
novamente à interação com a resina de Ni
+
(em tampão M, porém com 50 mM de NaCl). Tanto
os resíduos histidinas quanto a proteinase ficaram ligadas por afinidade à coluna (TEV: proteína
recombinante gerada no mesmo vetor pEMT 11 e que tem atividade sem necessidade de corte do
tag). A HpSmr foi recuperada completamente limpa como material não associado da interação.
55
3.16. Superprodução e purificação de EcYdaL e EcYfcN a partir das fusões
His·proteína de interesse.
Para a superprodução das proteínas de fusão, as células de E. coli Top 10 contendo os
plasmídeos pBADecydaL e pBADecyfcN, respectivamente, foram cultivadas em LB glicose 0,2%
a 37°C até uma DO
600nm
de 0,5. Logo após a passagem a LB sem glicose, as células foram
induzidas pela adição de arabinose 0,002% final e foram cultivadas a 37°C durante 4 horas. Ao
término da indução, as bactérias foram colhidas por centrifugação, ressuspensas em tampão Q e
lisadas por ultra-som. Os lisados foram ultracentrifugados a 30.000 rpm (100.000 x g) durante 20
minutos a 4°C, dos quais se recuperaram os sobrenadantes que foram submetidos à interação com
uma resina Ni
+
(Histrap Chelating Column, em sistema Akta Prime –Amersham Biosciences-).
Logo após da eluição das proteínas com um gradiente crescente de imidazol (10 mM a 500 mM)
com t ampã o R, as proteínas foram submetidas à troca iônica numa coluna de heparina (50 mM a
2 M em tampão S). Logo após o terceiro passo de purificação, as proteínas EcYdaL e EcYfcN
foram dialisadas com tampão T e tratadas com 0,01 unidades de enterocinase K/20 μg de
proteína para separar a fusão de resíduos histidina. Este procedimento foi realizado a 13°C ON.
Após o corte, as proteínas foram submetidas novamente à troca iônica com heparina (tampão S,
gradiente linear de 50 mM a 2 M de NaCl), desta vez, para concentrar as proteínas após as
diálises necessárias para realizar o corte e também para eliminar as histidinas e a enterocinase K.
As proteínas foram guardadas em 50% glicerol a –20°C e também em alíquotas com 10%
glicerol a –80°C. Todas as etapas de purificação da EcYdaL e EcYfcN foram seguidas por SDS-
PAGE 10%.
56
3.17. Superprodução e purificação de ScSMR a partir da fusão His·ScSMR.
A melhor condição de superprodução da ScSMR foi lograda com a adição de 0,00002%
de arabinose final a uma cultura de bactérias (E. coli Top 10 contendo o plasmídeo
pBADYPL199c) a DO
600nm
0,2 e posterior cultivo a 37°C durante 5 horas. Logo após a
superprodução, as bactérias foram colhidas por centrifugação, ressuspensas em tampão U e
lisadas por ultra-som. O lisado foi submetido a ultracentrifugação (100.000 x g) onde foi
verificado que a proteína recombinante não apresentava solubilidade. Apesar de todas as
tentativas realizadas (diferentes condições de superprodução: percentagens de arabinose e
temperatura, densidade ótica e tempos de indução) não foi possível solubilizar a proteína
recombinante.
3.18. Atividade Nucleásica.
3.18.1. Ensaios utilizando DNA plasmidial como substrato.
Um total de 120 ng de DNA plasmidial (pT7Blue superenovelado ou linear com extremos
5’ ou 3’ livres) foram incubados na presença ou na ausência de HpSmr, EcYdaL e EcYfcN (as
concentrações das proteínas são mostradas nas legendas das figuras) em tampão X (50 mM Tris–
HCl pH 7,5, 100 mM KCl, 1 mM DTT e 2 mM MgCl
2
) a 37°C. As reações (15 μL) foram
paradas com a adição de tampão de amostra (5 mM EDTA, 1% SDS, 50% glicerol e 0.05% azul
de bromofenol) e os produtos foram submetidos a eletroforese em gel de agarose (1 % agarose
em tampão 0,5x TAE) durante 2 horas a 80 V. O DNA foi corado com 10 μg/mL de brometo de
etídio, visualizado com luz UV (325 nm) e quantificado utilizando o programa ImageQuant.
57
3.18.2. Ensaios utilizando oligonucleotídeos como substrato.
Dez fmoles de oligos compostos por 34 pb dupla e simples fita (marcados com
32
γ
P)
foram incubados com várias concentrações das proteínas HpSmr, EcYdaL e EcYfcN em tampão
X. As reações (15 μL) foram realizadas a 37°C e paradas pela adição de um volume equivalente
de tampão de amostra (5 mM EDTA, 80 % formamida deionizada, 10 mM NaOH, 0,1 % azul de
bromofenol e 0,1% xileno cianol). Os produtos das reações foram submetidos a eletroforese em
gel (25 % acrilamida, 8 M uréia e tampão TBE 1x) com tampão TBE 1x. Os geles foram
analisados num sistema Storm Phosphorimager (Amersham).
3.19. Construção de cepas mutantes ydaL e yfcN em S. typhimurium.
Na construção desses mutantes foi empregado o método descrito por Datsenko e Wanner
(2000). Brevemente, foram utilizados oligos quimeras para a amplificação de cassetes que
codificam a resistência a Kan e Cm, a partir dos plasmídeos pKD4 e pKD3 respectivamente. Os
oligos direto (P1) e reverso (P2) para cada gene foram desenhados com homologia de 40 bp do
cromossomo (da região a montante do códon de iniciação para o P1 e da região a jusante do
códon de terminação para o P2) e, com homologia de 20 bp dos cassetes utilizados (da região 5’
para o P1 e da região 3’ para o P2). Os produtos de PCR foram digeridos com DpnI (NEB),
purificados (kit Amersham) e introduzidos na cepa BW25113 por eletroporação. As bactérias que
incorporaram, por dupla recombinação homóloga, os genes interrompidos foram selecionadas em
Kan 20 mg/mL e Cm 35 mg/mL para ydaL e yfcN respectivamente. A verificação dos mutantes
foi feita por PCR mediante a utilização dos oligos 5’R1/3’R1 e 5’R2/3’R2 correspondentes a um
sítio 500 bp fora do gene de interesse (5’) e 500 bp no interior do cassete (3’) (tabela 19). Os
mutantes confirmados foram transduzidos para outras bactérias pelo fago P22. A transdução pelo
58
fago P22 foi utilizada para a obtenção dos duplos mutantes. Quando foi necessário, os mutantes
foram submetidos à ação da recombinase Flp (transformação e expressão do plasmídeo pCP20)
para a eliminação da resistência ao antibiótico
Oligo Seqüência nucleotídica (5’→3’)
ydaL-P1 CGGCAATATTTGGAACTTATTACTGGAAATTTGGGTAAGTGTGTAGGC
TGGAGCTGCTTC
ydaL-P2 GGCGCATCACGAAGGAAATGAAAGCATCGATGAACTGTTT CATATGAA
TATCCTCCTTAG
yfcN-P1 CTAGTTTGCCATGAAGATGACGATAAATCAGCATT CACGTGTGTAGGC
TGGAGCTGCTTC
yfcN-P2 CAGCCAATCGATTCTACTTGCCGGTTCCAGTACAT ACTGAACATATGAA
TATCCTCCTTAG
5’ydaL-R1 GCTGCAATCCTTCCCGACG
3’ydaL-R2 GTTACGCCAGCCGGTCG
5’yfcN-R1 GGCCCTTCCGTATTGAGCAGCCGG
3’yfcN-R2 GCGACTATTCGCCGGAACTGTTTCTG
3’pKD3-R1 GCGTGTTACGGTGAAAACCTGGCCT
5’pKD3-R2 ATTCCGGATGAGCATTCATCAGGC G
3’pKD4-R1 TGCAGTTCATTCAGGGCACCGG
5’pKD4-R2 GGCGAAGTGCCGGGGCAGGA
Tabela 19. Oligonucleotídeos utilizados para a construção e verificação dos mutantes em S. typhimurium.
3.20. Procedimentos Genéticos em S. typhimurium.
3.20.1. Segregação de Duplicações Cromossômicas.
Dez clones independentes de cada cepa foram cultivados a 37°C durante 16 horas na
presença de 20 μg/mL Cm. Depois do crescimento, o antibiótico foi retirado mediante
centrifugação e duas lavagens com LB. As culturas foram ressuspensas no volume inicial de LB
sem antibiótico. A partir destas culturas foram realizados inóculos de 2-5.10
3
bactérias/mL num
volume final de 5 mL de LB sem antibiótico, que foram crescidos a 37°C com agitação constante
durante 6 horas (fase estacionária). Alíquotas das diluições seriadas de cada cultura foram
plaqueadas em LB e incubadas durante 24 horas a 37°C. Pelo menos 3 mil colônias de cada cepa
59
foram repicadas, individualmente, em placas LB Cm (20 μg/mL) e incubadas a 37 °C durante 24-
48 horas. A segregação das duplicações cromossômicas foi calculada como a percentagem de
bactérias Cm
R
sobre o seu título.
3.20.2. Sensibilidade a Agentes Genotóxicos.
As bactérias foram cultivadas em LB a 37°C até uma D.O
600nm
0,5 (1.10
8
bactérias/mL).
As células foram colhidas por centrifugação, lavadas duas vezes e ressuspensas em M9. As
bactérias foram irradiadas com UVC (254 nm) e com UVB (312 nm) segundo mencionado para
cada caso. Foram plaqueadas alíquotas de diluições seriadas e as colônias formadas foram
contadas após 24 horas de incubação a 37°C. Estes experimentos foram realizados três vezes de
forma independente.
No caso dos agentes químicos foram realizados tapetes bacterianos (culturas em fase
estacionária) em placas de LB. A sensibilidade foi calculada pela inibição do crescimento
conferida por 10 μL de dietilsulfato, 10 μL de H
2
O
2
(30 % w/v), e 9 μg de ácido nalidixico.
3.20.3. Mutagenêse espontânea e induzida.
Os procedimentos realizados para o cálculo da mutagenêse espontânea em cepas de
Salmonella foram similares aos descritos anteriormente para E. coli.
O cálculo da mutagenêse induzida pelos agentes físicos UVB e UVC foi feito a partir das
culturas irradiadas com a DL
10
(UVB: 1 kJ/m
2
, e UVC: 20 J/m
2
). A partir destas culturas foram
retirados inóculos que foram cultivados em LB a 37°C com agitação constante durante 16 horas.
Alíquotas de diluições seriadas das novas culturas foram plaqueadas e as colônias foram contadas
após 48 horas de incubação a 37°C. A freqüência de mutantes Rif
R
foi calculada como a razão
entre o número de células resistentes a rifampicina e o número total de células viáveis por cultura.
Estes experimentos foram realizados duas vezes de forma independente.
60
3.21. Construção de mutantes YPL199c em S. cerevisiae.
Para a obtenção dos mutantes em S. cerevisiae também se utilizaram oligos quimeras.
Cada oligo foi desenhado com 40 bp homólogas às seqüências a montante do códon de iniciação,
ou a jusante do códon terminação, e 20 bp que amplificam o cassete KanMX6 para o caso de
MSH4 e MSH5, e o cassete que codifica para uracil no caso de YPL199c (ver tabela 19). Os
produtos de PCR foram incorporados à cepa RKY3109 por transformação com acetato de lítio
(solução A: acetato de lítio 100 mM, e TE 1x; solução B: acetato de lítio 100 mM, TE 1x e PEG
40%). Os mutantes foram confirmados por PCR com a utilização de um oligo no interior do
cassete (5’Ura e 5’kanMX6) e outro no exterior do gene (ver tabela 20). Os duplos mutantes
foram obtidos por transformação com DNA genômico mutante.
Oligo Seqüência Nucleotídica
5’YPL GCAACCATGTTTTTACGCAACCATGAGTCAGTTTGAAGCTGAGCAGAT
TGTACTGAGAGTGCACC
3’YPL CTATAAAAAAAATACAGTCTT AGGATTATTCTCTATTTATCCCTCCTTA
CGCATCTGTGCGGTATTTC
5’MSH4 ATAGCATTGAAATCTGTAGCTGATC AACGCCAAACTATATGCACGGAT
CCCCGGGTAAATTAA
3’MSH4 ACTCTGTACAGAAATAATGGATTATAGTTTTAAGCTAAGCGGGAAT TC
GAGCTCGTTTAAAC
5’MSH5 TCAAAATAACTTACTCATT CATATACTGCCACCAAATGGAATCGGATC
CCCGGGTAAATTAA
3’MSH5 GCTTGACATTTATTAACTTAAATATGTTACAAGTAAGCGTGAATTCGA
GCTCGTTTAAAC
5’Ura GAGCAGATTGTACTGAGAGTGCACC
3’ext. YPL GAACTAAATTCATTGATAAT
5’kanMX6 ACGGAATTTATGCCTCTTCCG
3’ext MSH4 AAATCATTCATAAATATCAAT GCAT
3’ext MSH5 TTATTCTGGTGGTCAATCTGG
Tabela 20. Oligonucleotídeos utilizados para a construção e verificação de mutantes em levedura.
61
3.22. Procedimentos Genéticos em S. cereviase.
3.22.1. Mutagênese e Reversão Espontânea.
As leveduras (10 colônias independentes de cada cepa) foram cultivadas a 30°C até a fase
estacionária em meio rico. Após, foram colhidas por centrifugação, lavadas, ressuspensas e
diluídas com água estéril até obter 10
5
células/mL. Inóculos de 1000 células/mL foram cultivados
em meio rico a 30°C durante 16 horas. Alíquotas de diluições seriadas foram plaqueadas em meio
mínimo para obter o título da viabilidade e, em meio YNB suplementado com Canavanina (60
mg/L –Sigma-) para detectar os mutantes totais, ou em meio YNB sem treonina para detectar os
deslocamentos em -1 da fase de leitura (Thr
-
→Thr
+
pela reversão A7 para A6 no gene da
aspartocinase hom3-10). As colônias foram contadas depois de 120 horas de incubação a 30°C.
Todos os experimentos foram realizados três vezes de maneira independente. A freqüência de
mutação foi determinada como a o número de colônias Can
R
ou Thr
+
e o número de células
viáveis por cultura.
3.22.2. Sensibilidade a UVC e radiação γ.
As cepas de levedura foram cultivadas em meio YPD a 30°C até uma D.O
600nm
1 (1.10
7
células/mL). As células foram colhidas por centrifugação, lavadas duas vezes com água estéril e
ressuspensas em água estéril. As leveduras foram irradiadas com UVC (254 nm) utilizando uma
dose de 0,12 mW/cm
2
. No caso da irradiação γ, as células foram expostas a uma fonte de
137
Cs
com uma taxa de dose de 63,7 Gy/min. Para todos os experimentos, o material tratado e não
tratado foi diluído imediatamente e plaqueado em Agar YPD. As colônias foram contadas depois
de 72 horas de incubação a 30°C. Todos os experimentos foram realizados três vezes em forma
independente.
62
3.22.3. Sensibilidade a MMS.
As leveduras foram cultivadas a 30°C até a fase estacionária em meio mínimo. Após,
foram colhidas por centrifugação, lavadas com água e ressuspensas em tampão fosfato (100 mM,
pH 7) até D.O
600nm
4 (4.10
7
células/mL). As células foram tratadas com várias doses de MMS –
Sigma- (vide Resultados) a 30°C por 30 minutos em agitação contínua. As reações foram
concluídas pela adição de 1 volume de tiosulfato de sódio 10 %. Após diluição, as células foram
plaqueadas em meio mínimo. As colônias sobreviventes foram contadas depois de 48-96 horas de
incubação a 30°C.
3.22.4. Análise de viabilidade e distribuição de esporos.
As cepas diplóides utilizadas foram obtidas a partir dos entrecruzamentos gênicos entre
RKY3109a/RKY3109α, RKY3109YPLa/RKY3109YPLα, RKY3109MSH4a/ RKY3109MSH4α,
e RKY3109YPLMSH4a/RKY3109YPLMSH4α. Os diplóides congênicos foram inoculados em
meio de pré-esporulação suplementado (SPS) e incubados em agitação a 30°C. Para induzir a
meiose, 3-4.10
7
células/mL foram lavadas (2x) com meio de esporulação (KAC) pré-aquecido.
Logo após, as células foram ressuspensas em meio KAC, sonicadas brevemente e ajustadas até
uma quantidade final de 2.10
7
células/mL. Após 90 minutos, o meio foi ajustado a pH 6 com HCl
(0,25 M). A micro-manipulação e disseção dos asci foi realizada num sistema MSM Singer. Os
esporos provenientes das tétrades foram germinados e cultivados em meio YPD a 30°C durante
72-96 horas. As colônias visíveis foram consideradas como viáveis.
63
4. Resultados.
4.1. Estudo da HpMutS.
4.1.1. Caracterização Genética de hpmutS.
4.1.1.1. Avaliação do fenótipo de MMR em cepas mutS.
Para avaliar a hipótese da presença de um mecanismo de reparo de emparelhamentos
errôneos mediado pela HpMutS foi medida a taxa de mutação espontânea em cepas deficientes
no gene hpmutS. Para isso, foram construídas em diferentes cepas de H. pylori (26695, ADM1,
J99 e X47-2AL) mutantes em mutS2 por deleção da ORF
HP0621
. Rifampicina e metronidazol
foram utilizados como agentes seletivos. A maioria das mutações que geram resistência a
rifampicina são substituição de base e ocorrem no gene essencial rpoB, que codifica a subunidade
β da RNA polimerase (Jin & Gross, 1988). Esse sistema é ideal para detectar erros simples de
emparelhamento. Por outro lado, a resistência a metronidazol acontece quando se inativa o gene
não essencial rdxA (nitro-redutase) (Jeong e col., 2001). Como conseqüência, esse sistema pode
evidenciar qualquer tipo de troca que gere a inativação da RdxA, incluindo deslocamento da fase
de leitura por inserção e/ou deleção, também substrato do MMR. Na tabela 21 é apresentada a
taxa de mutação espontânea das cepas mutantes em hpmutS e suas respectivas cepas parentais.
Cepa
26695
A
ADM 1
A
J99
A
X47-2AL
A
Cepa
26695
B
Selvagem 9,7 (2,5) 1,4 (0,4) 9,2 (2,1) 3,6 (0,9) Selvagem 1293 (264)
mutS
2,6 (0,4) 2,0 (0,4) 9,1 (2,2) 1,4 (0,4)
mutS
526 (100)
Tabela 21: Taxa de mutação espontânea para Rif
R
(A) e para resistência a metronidazol (B) de cepas de
H
.
pylori selvagens e mutantes mutS. As taxas foram determinadas como o número de mutantes espontâneos por locus
e por geração (x10
8
) em dez experimentos independentes. O desvio padrão para cada valor é mostrado entre
parênteses. A 26695 é a ún ica cepa dispon ív el com sensibilidade a metronidazol.
64
A disrrupção do gene hpmutS não aumentou a taxa de mutação espontânea para
resistência a rifampicina nem para metronidazol. Esses resultados demonstram que HpMutS não
participa na reparação dos emparelhamentos errôneos [troca de base, inserção, deleção
(deslocamento da fase de leitura)].
Para confirmar este resultado foi apurado o fenótipo de complementação em E. coli. A
cepa mutS de E. coli apresenta uma freqüência de mutação pelo menos 1000 vezes maior que a
cepa selvagem. A expressão do gene selvagem num mutante mutS restabelece o fenótipo
selvagem (Parker & Marinus, 1992; Pang e col., 1985). Entretanto, o restabelecimento do
fenótipo pode não acontecer com a expressão de certas proteínas heterólogas como no caso da
HexA de Streptococcus pneumoniae. Nesse caso a expectativa seria observar um efeito de
complementação negativa na E. coli selvagem resultando num fenótipo típico mutador tipo Mut
-
(Prudhomme e col., 1991; Biswas & Hsieh, 1996). Para testar as duas prováveis alternativas a
ORF
HP0621
foi clonada em fusão à glutationa-S-transferase (a partir da cepa ADM1) e sem fusão
(a partir da cepa X47-2AL). A clonagem sem proteína de fusão foi realizada para descartar
qualquer possível efeito (inibição alostérica, enovelamento errado e outros) por parte da proteína
fusionada à HpMutS. As construções pGEXhpmutS
+
e pTrc99ahpmutS
+
foram seqüenciadas
confirmando a clonagem correta. As cepas MM348, ES1301 e M182 de E. coli foram
transformadas com o plasmídeo vazio ou contendo o inserto. As bactérias transformadas foram
cultivadas até uma D.O.
600nm
~1 e induzidas com IPTG. A superprodução de uma proteína de 115
kDa e outra de 86 kDa foi confirmada por SDS-PAGE. Uma vez verificada a superprodução
foram realizados os ensaios de complementação e os resultados estão representados na tabela 22.
65
Cepa
Freqüência de
mutação
espontânea Rif
R
Cepa
Freqüência de
mutação
espontânea Rif
R
MM348 pGEX 6,6 x 10
-9
M182 pTrc99a 8,31 x 10
-9
MM348 pGEXhpmutS 2,1 x 10
-9
M182 pTrc99ahpmutS 1,13 x 10
-8
ES1301 pGEX 3,9 x 10
-7
ES1301 pGEXhpmutS 2,5 x 10
-7
Tabela 22: Freqüência de mutação de cepas de E. coli selvagens (MM348 e M182) e mutante para mutS
(ES1301) complementadas com o gene hpmutS. Os valores apresentados correspondem a quatro experimentos
independentes.
Como se observa na tabela a presença da ORF
HP0621
não complementa o fenótipo mutador
da cepa ES1301 e também não gera uma complementação negativa nas cepas selvagens.
Apesar da superprodução de HpMutS não ter conferido fenótipo de complementação e/ou
negativo em E. coli deficientes em MutS, para completar a verificação foram também avaliados
os fenótipos de complementação nas cepas AB1157, GW3773 e ES1484. Os resultados estão
mostrados na tabela 23.
Cepas
Freqüência de
mutação espontânea
Rif
R
Cepas
Freqüência de
mutação espontânea
Rif
R
MM348 pGEX 6,6 x 10
-9
AB1157 pGEX 3,3 x 10
-9
MM348 pGEXhpmutS 2,1 x 10
-9
AB1157 pGEXhpmutS 3,8 x 10
-9
ES1484 pGEX 3,9 x 10
-7
GW3773 pGEX 2,4 x 10
-7
ES1484 pGEXhpmutS 1,8 x 10
-7
GW3773 pGEXhpmutS 3,5 x 10
-7
Tabela 23. Freqüência de mutação espontânea para cepas E. coli selvagens (MM348 e AB1157) e mutantes
para mutL (ES1484) e mutH (GW3773), e complementadas com o gene hpmutS. Os valores apresentados
correspondem a dois experimentos independentes.
Como se apresenta na tabela 23, nenhum efeito de complementação e/ou fenótipo
negativo foi observado nesses experimentos.
66
4.1.1.2. Avaliação da função de HpMutS na recombinação.
Pesquisas científicas têm demonstrado que nas proteínas MutS as funções de reparo de
erros pós-replicativos e de recombinação estão intimamente relacionadas (Friedberg e col., 2006).
Embora HpMutS não reconheça os erros de emparelhamento, se decidiu ponderar a possibilidade
de que influencie a recombinação homóloga. Para avaliar esse efeito, se comparou a eficiência de
recombinação das cepas X47-2ALmutS e selvagem medindo suas respectivas capacidades de
integração de um marcador, num gene não essencial. Para isso foi utilizado DNA genômico total
derivado da cepa H. pylori N6 no qual a ORF
HP0645
está interrompida por um cassete que confere
resistência a gentamicina. Para descartar resultados artefactuais induzidos pela localização da
ORF em questão também foi testada a integração do mesmo marcador derivado do mesmo DNA
cromossômico, mas, desta vez, substituindo um outro gene não essencial, a ORF
HP1186
. Os
resultados obtidos nesses experimentos podem ser vistos na figura 12.
selvagem hpmutS
1
UFC / μg de DNA
0
2e+2
4e+2
6e+2
8e+2
hpmutS / selv agem: 5
selvagem hpmutS
1
UFC / μg de DNA
0
2e+2
4e+2
6e+2
8e+2
hpmutS / selv agem: 5
A
selvagem
hpmutS
selvagem
hpmutS
Fi
g
ura 12. Inte
g
ração de DNA heterólo
g
o em X47-2AL. O hi s to gr am a apr e s e nt a as m é di as das i nt e gr aç õe s
nas cepas selvagem e mutante, o que po de ser visualizado nas fo tografías das placas. As integrações foram
c al c ul adas c o mo o número de co lô ni as r es is te nt es a Gm por m ic ro gr am a de DNA. Os val o re s co rr es po nde m a
de z t r ans f or m açõ es i nde pe n de nte s e os er ro s per te nce m ao s v a l o r es de des vi o padr ão ( p < 0 , 001 e n t re se l vag e m e
hpmutS -te ste não paramétrico Mann-Whitney-) B) O marc ador seleti vo está interrompendo a ORF HP06 45. As
s e t a s i ndi c am as co lô ni as .
67
B
1
UFC /
μ
g de DNA
0
2e+2
4e+2
6e+2
8e+2
selvag em
hpmutS
hpmutS / selvagem: 21
1
UFC /
μ
g de DNA
0
2e+2
4e+2
6e+2
8e+2
selvag em
hpmutS
hpmutS / selvagem: 21
selvagem
hpmutS
selvagem
hpmutS
Figura 12 (Continuação). Integração de DNA heterólogo em X47-2AL. O histograma apresenta as médias
das integrações nas cepas selvagem e mutante, o que pode ser visualizado nas fotografías das placas. As
integrações foram calculadas como o número de colônias resistentes a Gm por micrograma de DNA. Os valores
correspondem a dez transformações independentes e os erros pertencem aos valores de desvio padrão (p < 0,001
entre selvagem e hpmutS -teste não paramétrico Mann-Whitney-) B) O marcador seletivo está interrompendo a
ORF HP1186. As setas indicam as colônias.
A freqüência de recombinação revelou que a integração do agente seletivo e, por
conseqüência, do DNA derivado da cepa N6 foi maior na cepa mutante que na selvagem. As
proporções foram 5 vezes a mais para a ORF
HP0645
e 21 vezes a mais para a OFR
HP1186
. Esse
resultado inesperado tornou-se mais significativo ainda quando comparado com seus respectivos
controles que foram as integrações dos mesmos marcadores derivados de um “background”
isogênico, isto é, derivados da cepa X47-2AL (figura 13).
68
selvagem
hpmutS
selvagem
hpmutS
1
UFC /
μ
g de DNA
0
2e+4
4e+4
6e+4
8e+4
selvagem
hpmutS
hpmutS / selvagem: 3
1
UFC /
μ
g de DNA
0
2e+4
4e+4
6e+4
8e+4
selvagem
hpmutS
hpmutS / selvagem: 3
A
selvagem
hpmutS
selvagem
hpmutS
1
UFC /
μ
g de
Figura 13. Integração de DNA homólogo em X47-2AL. Os histogramas apresentam as médias das
integrações na cepa selvagem e mutante, o que também pode ser visualizado nas fotografias. Os eventos de
integração foram calculados como o número de colônias resistentes por micrograma de DNA. Os valores
correspondem à média de dez transformações independentes e os erros pertencem aos valores de desvio
padrão. A) O marcador seletivo está na ORF HP0645 p < 0,01 entre selvagem e mutante pelo teste Mann-
Whitney. B) O marcador seletivo está interrompendo a ORF HP1186, p < 0,001 entre selvagem e mutante pelo
teste Mann-Whitney. As setas vermelhas indicam as colônias.
DNA
0
2e+4
4e+4
6e+4
8e+4
selvagem
hpmutS
hpmutS / selvagem:13
B
1
UFC /
μ
g de A
0
2e+4
4e+4
6e+4
8e+4
DN
selvagem
hpmutS
hpmutS / selvagem:13
69
Como se observa na figura 13, a ausência de HpMutS facilita também a integração de
DNA 100% homólogo. O resultado foi um aumento de 3 vezes e 13 vezes da integração das
ORFs
HP0645
e
HP1186
interrompidas pelo cassete gentamicina. Também foi observado, como
conseqüência da falta do efeito dos sistemas de restrição, que as frequências de integração do
DNA da cepa X47-2AL foram de duas ordens de grandeza maiores que para a transformação com
N6. Os resultados acima descritos indicam que HpMutS inibe a recombinação.
O fenômeno do aumento da recombinação pela ausência do gene hpmutS foi confirmado
por experimentos de complementação (fig 14)
1
UFC / μg de DNA
1e+2
1e+3
1e+4
1e+5
1e+6
selvagem
Δ
hpmutS
Δ
hpmutS + pADChpmutS
clone 1
clone 2 clone 3
Δ
hpmutS / selvagem: 318
clone 1 / selvage m: 1, 9
clone 2 / selvage m: 2, 0
clone 3 / selvage m: 2, 6
+
Figura 14. Complementação do
fenótipo de hpmutS. Foram utilizados
três clones independentes da cepa
muta nt e e m mutS transformada com o
plasmídeo pADChpmutS
+
para medir a
incorporação de DNA cromossômico
homólogo. Os valores correspondem a
cinco transformações independentes. A
barra de erros mostra o desvio padrão
Para determinar se a inibição da recombinação por parte da HpMutS estaria relacionada
com o grau de divergência entre as seqüências a serem incorporadas foram criados três substratos
de recombinação diferentes, projetados para a integração num outro gene não essencial, vacA
(vide Material e Métodos). Os substratos foram clonados no plasmídeo integrativo pILL570Δ e
70
todos eles foram amplificados na cepa MC1061 de E. coli (onde é replicativo) para evitar
qualquer possível efeito correspondente à restrição. Os resultados podem ser vistos na figura 15.
0
UFC/
μ
g de DNA
0
2e+4
4e+4
6e+4
selvagem hpmutS selvagem hpmutS selvagem hpmutS
Substrato F8 Substrato 26695 Substrato X47- 2A
R
(F8)
: 5
R
(26695)
: 6
R
(X47-2AL)
: 8
Gm
100 % 100 %
Gm
100 % 100 %
93,7 % 94,1 %
Gm
93,7 % 94,1 %
Gm
85,5 %
85 %
74 %
57 bp
Gm
85,5 %
85 %
74 %
57 bp
Gm
0
UFC/
μ
g de DNA
0
2e+4
4e+4
6e+4
selvagem hpmutS selvagem hpmutS selvagem hpmutS
Substrato F8 Substrato 26695 Substrato X47- 2A
R
(F8)
: 5
R
(26695)
: 6
R
(X47-2AL)
: 8
Gm
100 % 100 %
Gm
100 % 100 %
93,7 % 94,1 %
Gm
93,7 % 94,1 %
Gm
85,5 %
85 %
74 %
57 bp
Gm
85,5 %
85 %
74 %
57 bp
Gm
0
UFC/
μ
g de DNA
0
2e+4
4e+4
6e+4
selvagem hpmutS selvagem hpmutS selvagem hpmutS
Substrato F8 Substrato 26695 Substrato X47- 2A
R
(F8)
: 5
R
(26695)
: 6
R
(X47-2AL)
: 8
Gm
100 % 100 %
Gm
100 % 100 %
93,7 % 94,1 %
Gm
93,7 % 94,1 %
Gm
85,5 %
85 %
74 %
57 bp
Gm
85,5 %
85 %
74 %
57 bp
Gm Gm
100 % 100 %
Gm
100 % 100 %
93,7 % 94,1 %
Gm
93,7 % 94,1 %
Gm
85,5 %
85 %
74 %
57 bp
Gm
85,5 %
85 %
74 %
57 bp
Gm
Figura 15. Integração de DNAs com diferentes graus de heterologia em X47-2AL. As integrações (colônias
resistentes/ μg de DNA) correspondem à media de dez transformações independentes. A heterologia de cada
substrato está mostrada na parte superior da figura (vide material é métodos, seção 5.12). A razão (R) das
eficiências de incorporação de cada substrato (X) entre o mutante e a selvagem está assinalada à direita da figura.
Para a diferença na incorporação de F8 entre o selvagem e o mutante p < 0,001; e para 26695 e X47-2AL p <
0,01 segundo o teste não paramétrico Mann-Whitney
A deficiência da HpMutS funcional causou um aumento entre 5 e 8 vezes na freqüência
de incorporação do agente seletivo. Por outro lado, apesar do alto grau de divergência entre as
seqüencias integradas, não se observaram diferenças significativas na eficiência de incorporação
de DNA, mesmo na cepa X47-2AL selvagem.
Para determinar se a inibição da recombinação por parte da HpMutS está relacionada com
o tamanho do fragmento do DNA a ser incorporado foi medida a integração de uma seqüência
71
divergente em somente um nucleotídeo. Para isso, isolou-se DNA genômico a partir de uma cepa
X47-2AL resistente a rifampicina (obtida por pressão seletiva) o qual foi utilizado para
transformar as cepas X47-2AL selvagem e mutante sensíveis a rifampicina (figura 16).
1
UFC / μg de DNA
0
2e+5
4e+5
6e+5
8e+5
selvagem
hpmutS
hpmutS / selvagem: 25
Figura 16. Incorporação de
DNA com heterologia de 1 base.
O DNA cromossômico de uma
cepa X47-2AL resistente a
rifampicina foi utilizado para o
teste de incorporação em cepas
sensíveis a esse antibiótico (X47-
2AL selv agem e hpmutS). A
diferença entre selvagem e
mutante apresenta um valor p <
0,001 pelo teste Mann-Whitney.
A inativação da HpMutS resultou num incremento de 25 vezes no número de clones
resistentes a rifampicina na cepa mutante. Este resultado demonstra também, que a função de
HpMutS não depende do tamanho de DNA divergente a ser integrado no cromossomo.
Logo após a determinação da função de hpmutS em H. pylori decidiu-se analisar se existe
uma equivalência do fenômeno em E. coli. Para isso se realizaram experimentos de conjugação
com uma combinação de cepas de E. coli receptoras: selvagem e mutS, complementadas com
pTrc99ahpmutS
+
ou com plasmídeo vazio. As cepas doadoras foram SA965 e SA486 de S.
typhimurium e KL227 e ED1032 de E. coli para avaliar, respectivamente, a recombinação
homeóloga (ou heteróloga) e homóloga. Os resultados obtidos são mostrados na tabela 24.
72
Doadoras
Receptoras
SA965 SA486 KL227 ED1032
AB1157 pTrc99a 1,5 x 10
-7
4,0 x 10
-7
4,5 x 10
-2
5,0 x 10
-2
AB1157 pTrc99ahpmutS
+
1,3 x 10
-7
1,0 x 10
-7
5,5 x 10
-2
2,0 x 10
-2
AB1157mutS pTrc99a 8,6 x 10
-4
7,0 x 10
-4
5,7 x 10
-2
1,4 x 10
-2
AB1157mutS pTrc99ahpmutS
+
7,0 x 10
-4
3,4 x 10
-4
4,0 x 10
-2
1,3 x 10
-2
Tabela 24. Conjugação em E. coli na presença de HpMutS. Os valores correspondem a 3 experimentos
independentes. Os marcador es de auxotrofia utilizados fo ram treonina (localizado no minuto 1 do cromosso mo), e
arginina (localizado no minuto 77 do cromossomo). As cepas Hfr KL227 e SA965 transferem em sentido anti-
horário (origem de transferência: minuto 7 e minuto 10, respectivamente). As Hfr ED1032 e SA486 transferem em
sentido horário (origem de transferência: minuto 55 e minuto 60, respectivamente.)
Os dados apresentados na tabela 24 demonstraram que a presença de HpMutS não possui
nenhum efeito na conjugação em E. coli. Outra vez foi evidente a falta de complementação e/ou
fenótipo negativo em E. coli pela presença de HpMutS.
4.1.2. Caracterização Bioquímica de HpMutS.
4.1.2.1. Purificação de HpMutS recombinante.
O gene hpmutS foi clonado em vários plasmídeos para expressão em E. coli (segundo
descrito em Material e Métodos) a partir dos quais foram ensaiadas as condições de
superprodução. Para a purificação de HpMutS foram selecionadas as clonagens que apresentaram
as melhores superproduções de proteína (em qualquer das condições testadas e segundo o
verificado por SDS-PAGE). Elas foram: pGEXhpmutS
+
, pMALchpmutS
+
e pET3bhpmutS
+
.
A primeira estratégia de purificação foi desenvolvida utilizando a proteína de fusão GST-
HpMutS. Como descrito em Material e Métodos, as bactérias E. coli JM109 transformadas com o
plasmídeo pGEXhpmutS
+
, após indução com 1mM de IPTG durante 3 horas a 37°C foram lisadas
mediante tratamento de lisozima e posterior ultra-som. Os extratos totais foram
ultracentrifugados e o sobrenadante foi incubado ON a 4°C com a resina sefarose 4B-GSH.
73
Apósa eluição ( com 30 mM de glutationa reduzida -fig. 17A-) a proteína de fusão GST-HpMutS
foi concentrada (concentrador ultrafree-15) e digerida com 10 U/μg de trombina. A digestão foi
finalizada mediante diálise. A separação da GST e HpMutS se realizou mediante passagem pela
coluna MonoS (fig 17B) com um gradiente escalonado de tampões contendo diferentes
concentrações de NaCl. As distintas etapas de purificação foram seguidas mediante geles de
SDS-PAGE (10%).
A purificação da HpMutS a partir da fusão com a GST apresentou vários problemas,
alguns dos quais podem ser visualizados na figura 17. Os principais foram: retenção da proteína
de fusão na resina de sefarose 4B-GSH (mesmo elevando a quantidade de NaCl até 200 mM e
com a adição de detergente não iônico –fig 17A-)), pouca quantidade de proteína obtida da
primeira eluição (concentração insuficiente); retenção da proteína na membrana do concentrador
(passo que não podia ser evitado já que a digestão com trombina exige uma concentração mínima
175
83
62
47
32
25
16
kDa PM
pc pdc nu
NaCl
6,75%
17,5%
175
83
62
47
32
25
16
kDa PM
pc pdc nu
NaCl
6,75%
17,5%
A B
30 mM glutationa reduzida30 mM glutationa reduzida
116
205
66
45
29
PM useissukDa us usee
150 mM
NaCl
0,1 %
triton
116
66
45
29
PM useissukDa us usee
205
150 mM
NaCl
0,1 %
triton
Figura 17. Purificação da GST-HpMutS. As figuras apresentam o produto resultante dos passos de purificação de
HpMutS fusionada com GST. A) Distintas condições de eluição da GST-HpMutS a partir da GST-sefarose. su:
sobrenadante da ultracentrifugação, is: interação com sefarose (proteína-resina), e: eluição com 30 mM de glutationa
reduzida, us: unido a sefarose depois da eluição. A seta indica a posição da proteína de fusão GST-HpMutS. B) Corte
e passagem pela coluna MonoS. p c: proteín a concen trada, pdc: p roteína d epois do corte co m trombina, n u: não un ido
à MonoS. Na parte direita do gel se visualiza a eluição a partir da MonoS com o gradiente escalonado de NaCl. A
seta superior indica a posição da proteína de fusão GST-HpMutS e a seta inferior indica a posição da proteína
HpMutS nativa.
74
de proteína de fusão); e precipitação da MutS na diálise logo após a digestão com trombina,
sendo este o maior problema encontrado dentre os já citados. Como parte dos paliativos contra
esses problemas foi aprimorada a etapa da superprodução e se testou a digestão da proteína de
fusão com esta ainda retida na matriz de sefarose 4B-GSH (antes da eluição com glutationa
reduzida). No entanto e apesar das modificações introduzidas, a retenção da HpMutS nativa na
matriz de sefarose, assim como a desnaturação da proteína no momento do corte foram
inevitáveis.
A qualidade da HpMutS purificada foi boa, porém, a eficiência não foi satisfatória. Os
melhores rendimentos foram próximos a 115 μg totais de HpMutS a partir de 4 litros de cultura
induzida. Esse rendimento não foi representativo de uma purificação satisfatória e não seria
suficiente para realizar a caracterização bioquímica prevista para este trabalho. Contudo,
alíquotas tanto da fusão GST-HpMutS como da HpMutS nativa foram conservadas com 50 % de
glicerol a -20°C.
A segunda estratégia de purificação foi desenvolvida pela obtenção da proteína de fusão
MBP-HpMutS (fig 18). Como descrito em Material e Métodos, a superexpressão da proteína de
fusão MBP-HpMutS foi lograda pela adição de 0,3 mM de IPTG ás células de E. coli TB1
contendo o plasmídeo pMALchpmutS
+
. As bactérias foram submetidas a ultra-som até a completa
lise e após ultracentrifugação, o sobrenadante foi submetido a interação em com uma matriz de
amilose. A proteína de fusão MBP-HpMutS foi eluida pela adi ção de 10 mM de maltose (fig
18A) e foram escolhidas as frações com concentração de proteína igual ou maior que 1 mg/mL
para a digestão com factor Xa. Após a digestão, a separação da HpMutS da MBP foi ensaiada
pela passagem por uma coluna de Heparina conectada a um sistema FPLC. A eluição foi
75
realizada através de um gradiente linear de NaCl chegando até uma concentração de 2 M (fig
18B). Todas as etapas de purificação foram seguidas por SDS-PAGE (10%). Alíquotas da
proteína de fusão e da HpMutS nativa foram guardadas a -20°C com 50 % de glicerol e utilizadas
para alguns dos ensaios bioquímicos.
PM
nu lava gem
mM de Na Cl
Fusão
HpMutS
MBP
kDa
94
67
43
30
PM
nu lava gem
mM de Na Cl
Fusão
HpMutS
MBP
kDa
94
67
43
30
PM ci
lava ge m
10 mM mal tos e
kDa
94
67
43
30
MBP-HpMutS
PM ci
lava ge m
10 mM mal tos e
kDa
94
67
43
30
MBP-HpMutS
A
B
C D
94
67
43
kDa PM A B C
Fusão
HpMutS
MBP
94
67
43
kDa PM A B C
Fusão
HpMutS
MBP
ac pp sdte
Centrifugação
depois do corte
ac pp sdte
Centrifugação
depois do corte
Figura 18. Purificação da MBP-HpMutS. A) Primeira etapa cromatográfica: MBP-HpMutS em resina de
amilose. ci: cultura induzida. Posteriormente, estão indicados os passos de lavagem da coluna de amilose e a
eluição da proteína de fusão (~130kDa) com 10 mM de maltose. B) Segunda etapa cromatográfica: HpMutS e
MBP (imediatamente após a digestão) na coluna de heparina. nu: não unido (MBP ~43kDa), em seguida estão
mostrados os passos de lavegem da coluna de heparina e a eluição da HpMutS (~87kDa) com o gradiente de NaCl.
C) HpMutS precipitada depois do corte com Factor Xa. ac: proteína antes do corte, pp: proteína precipitada depois
do corte (leve centrifugação), sdte: sobrenadante da centrifugação posterior ao corte. D). Corte parcial com fator
Xa em presença de 5 % glicerol e 0,01 % nonidet. A: proteína antes do corte. B: 1 % Fator Xa durante 4 horas a
30°C. C: 1 % Fator Xa durante 16 horas a 25°C seguido de 4 horas a 30°C. PM: peso molecular das proteínas
padrão.
76
O rendimento final aproximado da purificação foi de 8 mg/L. A superprodução (fig 18A -
ci-) e purificação da fusão da MBP à HpMutS (fig 18B)foi muito satisfatória pela grande
quantidade de proteína solúvel gerada. Foram necessárias, somente, três etapas de purificação
para a MBP·HpMutS apresentar uma pureza de aproximadamente 95 %. Entretanto, a
precipitação da HpMutS no momento da separação da sua proteína de fusão voltou a acontecer
(fig 18C. Note-se que apesar da HpMutS eluir com NaCl da coluna de heparina –fig18B- a
proteína encontrava-se precipitada na saída da coluna). Para contornar este fato foram ensaiados
cortes a diferentes temperaturas (4°C, 13°C, 20°C, 23°C, 25°C, 30°C e 37°C), com diferentes
percentagens de protease (0,05 %, 0,1 %, 0,5%, 1% e 2,5 %), com diferentes tempos de digestão
(1 h, 2 h, 3 h, 4 h e 16 h), em presença e ausência de 2 mM de CaCl
2
, e SDS (0,005 % e 0,05 %),
mas a precipitação foi inevitável (dados não mostrados). Diferente foi o resultado quando, para
realizar toda a purificação, se adicionou ao tampão F 5 % de glicerol e 0,01 % de nonidet
(detergente não iônico – BIORAD-). Neste caso, a precipitação não aconteceu, porém, o corte da
fusão foi no máximo de 50 %, mesmo depois de 16 h a 25°C seguido de mais 4 h a 30°C (fig
18D). Para recuperar a proteína nativa ainda não precipitada, os produtos da digestão parcial
foram carregados novamente nas colunas de heparina e MonoS. Em ambas colunas, a eluição da
MBP-HpMutS e a HpMutS foi conjunta (dados não mostrados). A alternativa foi realizar uma
nova cromatografia de afinidade com a resina amilose. Nesta oportunidade não somente a MBP-
HpMutS foi retida na amilose, mas também a HpMutS e ambas eluiram com a mesma
concentração de maltose (dado não mostrado).
Para evitar os problemas de precipitação da proteína ocorridos pela separação da fusão no
N-terminal duas alternativas são válidas: a superprodução da proteína sem fusão, ou uma fusão
no C-terminal.
77
Uma das tentativas de purificação da proteína HpMutS foi pela obtenção da proteína sem
nenhuma fusão (vide Material e Métodos) a partir do plasmídeo pTrc99ahpmutS
+
. O resultado
desta tentativa não foi satisfatório devido a pouca superprodução da HpMutS combinado com
complicadas etapas de purificação, já que a maior parte das proteínas do extracto total após
ultracentrifugação (incluída HpMutS) precipita em 50 % de (NH
4
)
2
SO
4
, e as passagens pelas
colunas heparina, Mono S e Mono Q não foram eficientes para purificar HpMutS. Por essas
razões esta estratégia foi descartada rapidamente.
Para superproduzir HpMutS com uma fusão no C-terminal se escolheu o plasmídeo
pET3b, pelas suas características (promotor T7) e pelas características da cepa de E. coli onde
pode ser introduzido (BL 21 Rosetta). Embora este plasmídeo não possua nenhuma proteína de
fusão, a mesma foi criada no oligonucleotídeo reverso pela adição de uma seqüência que codifica
seis resíduos de histidina (vide Material e Métodos). Como descrito na Seção 3.8.7 de Material e
Métodos a superprodução da proteína de fusão HpMutS·His foi obtida pela indução das bactérias
E. coli BL21 Rosetta transformadas com pET3bmutS
+
com 0,5 mM de IPTG. A lise foi realizada
por ultra-som, e após ultracentrifugação, a fração solúvel foi aplicada a uma coluna HiTrap
Chelating Ni
2+
. A eluição foi efetuada com um gradiente linear de NaCl (fig 19A). As frações
contendo HpMutS·His foram aplicadas numa coluna de heparina e a eluição foi realizada por um
gradiente linear de NaCl (fig 19B e cromatograma em Anexo I). Para concentrar a proteína, a
HpMutS-His foi aplicada numa coluna Ressouce S e eluida com um gradiente linear de NaCl (fig
19C e cromatograma em Anexo I). As diferentes etapas de purificação foram seguidas por SDS-
PAGE (10%). Alíquotas da proteína HpMutS-His foram guardadas a -80°C e -20°C com a adição
de 50 % de glicerol, e utilizadas nos ensaios in vitro.
78
A
PM A B C D E
mM Im idazol
kDa
94
67
43
30
20
10
HpMutS-His
PM A B C D E
mM Im idazol
kDa
94
67
43
30
20
10
HpMutS-His
B
PM C NU
mM NaCl
kDa
94
67
43
30
20
10
HpMutS-His
PM C NU
mM NaCl
kDa
94
67
43
30
20
10
HpMutS-His
C
PM C NU
mM NaCl
HpMutS-His
kDa
175
83
62
47
16
PM C NU
mM NaCl
HpMutS-His
kDa
175
83
62
47
16
Figura 19. Purificação da HpMutS-His. A) superexpressão, ultracentrifugação e eluição da coluna Ni
+
. A:
cultura não induzida, B: cultura induzida, C: sobrenadante da ultracentrifugação (carga da coluna), D: material
não ligado à coluna, e E: lavagem. Seguidamente estão apresentadas as frações correspondentes à eluição da
HpMutS·His com concentrações crescentes de imidazol. B) Troca iônica na coluna heparina. C: carga na
heparina, NU: material não ligado à coluna, e eluição com concentrações crescentes de NaCl. C) Troca iônica
na coluna MonoS. C: carga na heparina, NU: material não ligado à coluna, e eluição com concentrações
crescentes de NaCl. PM: padrão de peso molecular.
79
Esta estratégia de purificação foi muito satisfatória: boa superprodução de proteína
solúvel, procedimentos de purificação simples e rápidos que não põem em risco a integridade da
proteína. Não se observou precipitação e se conseguiu uma ótima eficiência de purificação (95-97
% da proteína pura). O rendimento final aproximado foi de 12mg/L. Por tudo isso, este protocolo
foi o seleccionado para a obtenção da HpMutS.
Uma vez que as condições para a purificação da HpMutS foram determinadas (sistema de
expressão e etapas de purificação), as mesmas foram repetidas para a obtenção da proteína
HpMutSG338R(His). A diferença desta proteína em relação à selvagem é a substituição de um
resíduo glicina por arginina na posição 338 (G338R) realizada através de uma mutação sítio
dirigida (vide Material e Métodos, Seção 3.7.1). Esta substituição modifica um dos resíduos do
motivo de ligação de ATP tipo Walker A (P-loop) conservado em HpMutS, sendo assim, a
HpMutSG338R(His) seria incapaz de ligar e, possivelmente, de metabolizar ATP. O rendimento
obtido da purificação de HpMutSG338R foi similar ao obtido para HpMutS (aproximadamente
11 mg/L de cultura) apresentando uma pureza de 94-96 %. Alíquotas das frações com maior
concentração foram guardadas a -80°C e a -20°C, estas últimas com a adição de 50 % de glicerol,
para a sua utilização nos ensaios in vitro.
4.1.2.2. Atividade de hidrólise de ATP de HpMutS.
As proteínas MutS 1 apresentam uma baixa atividade de hidrólise de ATP gerada a partir
do seu sítio Walker A (Habert & Walker, 1991). A presença deste domínio no produto do hpmutS
sugeriu a possibilidade da HpMutS apresentar atividade ATPásica. Considerando também que
algumas proteínas MutS são estimuladas pela presença de DNA (Blackwell e col., 1998;
Bjornson e col., 2000) se analisou tanto a capacidade de hidrólise de ATP da HpMutS, como
80
também a estimulação da mesma pela presença de DNA. Os resultados destes experimentos são
mostrados abaixo.
ng de HpMutS
0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600
pmoles de ATP/min
0
5
10
15
20
25
Os resultados observados na figura 20 demonstraram que o motivo Walker A da HpMutS
é funcional, apresentando uma moderada atividade de hidrólise de ATP [fig. 20A (a partir destes
dados se determinou em 25 a 35 nM – que correspondem a 350 e 500 ng- a quantidade de
HpMutS·His a utilizar nos experimentos realizados a posteriori)]. A hidrólise de ATP é
pmoles de ATP hidrolisados
0
100
200
300
400
HpMutS
HpMutS
- Mg
2+
+ Mg
2+
B
A
nM DNA FWJ
0 50 100 15 0 200 250
pmoles de ATP/min
0
5
10
15
20
25
pmoles de ATP hidrolisado
0
200
400
600
800
- DNA
+ DN A
HpMutS
G338R
HpMutS
HpMutS
G338R
HpMutS
D
C
Figura 20. Atividade ATPásica de HpMutS·His. A) Atividade ATPásica em função à quantidade de
proteína. B) Comprovação da dependência de Mg
2+
como principal cofator da atividade ATPásica de
HpMutS·His (35 nM). C) Atividade ATPásica de HpMutS·His (35 nM) em função de diferentes concentrações
(de estrutura) d e DNA do tipo junç ão de Holliday (FWJ -“four way junction”-). D) Atividade de hidrólise de
ATP de HpMutS·His (35 nM) selvagem e do mutante no motivo Walker A (HpMutSG338R) na presença e
ausência de 100 nM de FWJ.
81
dependente de magnésio (fig. 20B) e estimulada pela presença de DNA [fig 20C (a partir destes
dados se determinou a concentração de 100 nM de “estrutura de DNA” como quantidade de
cofator a acrescentar nos experimentos seguintes)]. O fato do mutante puntiforme
HpMutSG338R não apresentar atividade de hidrólise (D) dissipou as dúvidas sobre uma possível
co-purificação de alguma outra proteína com atividade ATPásica durante as etapas de purificação
de HpMutS·His mostrada na figura 19.
Como foi verificado que a hidrólise de ATP é potencializada pela presença de DNA,
decidiu-se explorar se diferentes estruturas de DNA poderiam ocasionar diferenças nessa
estimulação. Estes resultados podem ser vistos na figura 21.
0
5
10
15
20
25
30
0 1 00 20 0 3 00 400 50 0 6 00 70 0 80 0 9 00 100 0
μ
M de ATP
n ole A miTP/
se m D N A
s de
FS
FD
p m
MM
F
FWJ
Figura 21. Estimulação da atividade ATPásica de HpMutS·His por distintas estruturas de DNA. 25 nM de
HpMutS foram incubados com γ32P ATP e diferentes concentrações de ATP não marcado, sem DNA e com 100
nM de DNA fita simples (FS), fita dupla (FD), fita dupla com um G/T (MM), forquilha (F) e junção de Holliday
(FWJ).
Segundo pode se observar, HpMutS apresenta três níveis “gerais” de hidrólise de ATP
que estão diretamente relacionados com a presença e tipo de estrutura de DNA. Estes níveis
poderiam dividir-se em: basal (proteína sem DNA e com DNA fita simples), médio (presença de
82
duplas fitas) e superior, onde a atividade de hidrólise é maximizada pelos substratos que são
encontrados no momento da recombinação (forquilha e junção de Holliday). Além disso,
HpMutS·His apresentou uma cinética do tipo Michaelis-Menten, de forma que foi possível
calcular os valores aparentes de Vmáx, Km, Kcat e a Kcat/Km e, assim, classificar essa diferença
na estimulação. Estes valores foram obtidos de duas formas diferentes: através da representação
da dupla recíproca de Lineweaver-Burk e da transformação de Hanes-Woolf (Cornish-Bowden,
2001), Os resultados são apresentados na tabela 25 e no anexo I.
Lineweaver-Burk Hanes-Woolf
DNA Km
(
μ
M de
ATP)
Vmáx
(
μ
M de
ATP
hidrolisado
/ min)
Kcat
(
μ
M de ATP
hidrolisado/
μ
M de
HpMutS/
min)
Kcat/Km
(min
-1
μ
M
-1
)
Km
(
μ
M de
ATP)
Vmáx
(
μ
M de
ATP
hidrolisado
/ min)
Kcat
(
μ
M de ATP
hidrolisado/
μ
M de
HpMutS/
min)
Kcat/Km
(min
-1
μ
M
-1
)
(-) 128,20 0,767 30,02 0,238 69,61 0,617 24,68 0,356
FS 135,14 0,828 33,12 0,245 120,20 0,774 30,96 0,258
FD 119,05 1,042 41,68 0,350 100,02 0,973 38,92 0,389
MM 101,32 1,102 44,08 0,435 62,28 0,959 38,36 0,616
F 198,41 1,961 78,44 0,395 137,37 1,679 67,17 0,489
FWJ 200,00 1,831 73,24 0,366 138,80 1,536 61,44 0,443
Tabela 25. Valores aparentes dos parâmetros cinéticos de HpMutS em presença e ausência de diversas
estruturas de DNA. Os valores foram calculados pela dupla recíproca de Lineweaver-Burk, e pela transformação de
Hanes-Woolf.
Os parâmetros calculados por ambos métodos apresentaram, na sua maioria, forte
equivalência. Os valores de Vmáx e Kcat não só validam, como ainda permitem quantificar os
três níveis de estimulação da atividade ATPásica de HpMutS mencionados anteriormente.
Observa-se também que, apesar do aumento na velocidade máxima e da capacidade catalítica
83
gerada pela presença de forquilhas e junções de Holliday, a constante de especificidade
(Kcat/Km) permanece inalterada. Isto se deve a um incremento nos valores de Km quando estas
estruturas estão presentes na reação (a presença de DNA em fitas simples e duplas não
modificaria significativamente a afinidade da HpMutS pelo ATP). Esta situação será discutida
posteriormente.
4.1.2.3. Grau de oligomerização de HpMutS.
As dificuldades encontradas na purificação das HpMutS recombinantes (GST-HpMutS e
MBP-HpMutS), especificamente no momento do corte da proteína de fusão, foram consideradas
como indicativas de uma estrutura quaternária singular; portanto, decidiu-se analisar o grau de
oligomerização da HpMutS.
4.1.2.3.1. Filtração Molecular.
A proteína, tanto na sua forma associada com MBP como naquela obtida logo após o
corte com fator Xa, foi submetida a filtração molecular numa coluna Superdex 200 (Amersham).
Esta coluna permite determinar o peso molecular de proteínas num intervalo ótimo de 10.000 a
600.000 Daltons (vide Material e Métodos, Seção 3.11.1). Os resultados das filtrações são
mostrados na figura 22.
84
MBP-HpMutS
MBP-HpMut S
MBP
Absorçã o a 280 nm
Fracções
Volume de Eluição
mL
A
Absorçã o a 280 nm
Fracções
MBP-HpMutS
MBP-HpMut S
MBP
Volume de Eluição
mL
Absorção a 280 nm
0.30
0.20
0.10
0.00
Volume de eluição
Fracções
Tireoglobulina
669 kDa, 85 Ǻ
Ferritina
440 kDa, 61 Ǻ
Aldolase
158 kDa, 48.1 Ǻ
Albumi na
67 kDa, 35.5 Ǻ
Ovoalbumina
43 kDa, 30.5 Ǻ
Ribonuclease A
13.7 kDa, 16.4 Ǻ
MBP-HpMutS
MBP-HpMutS
MBP
Absorção a 280 nm
0.30
0.20
0.10
0.00
Volume de eluição
Fracções
Tireoglobulina
669 kDa, 85 Ǻ
Ferritina
440 kDa, 61 Ǻ
Aldolase
158 kDa, 48.1 Ǻ
Albumi na
67 kDa, 35.5 Ǻ
Ovoalbumina
43 kDa, 30.5 Ǻ
Ribonuclease A
13.7 kDa, 16.4 Ǻ
B
MBP-HpMutS
MBP
MBP-HpMutS
Figura 22. Determinação do estado de associação de HpMutS através de filtração molecular. A-
Sobreposição das corridas efetuadas com MBP-HpMutS e dos produtos obtidos depois da separação da
p
roteína
fusionada por digestão com fator Xa. Em vermelho indica-se o perfil obtido para a proteína de fusão e em azul o
perfil do substrato e produto da digestão. Em verde aponta-se o volume de exclusão da coluna (0,910 mL) obtido
com azul-dextran. B- Sobreposição da figura A com a filtração das proteínas padrão, cuja identificação encontra-
se no gráfico. Destaca-se em vermelho a fusão MBP-HpMuts, em azul os produtos do corte e em verde o volume
de exclusão (0,910 mL).
85
O perfil obtido na coluna de filtração molecular mostra que a proteína de fusão MBP-
HpMutS elui praticamente no volume de exclusão da coluna (Figura 22A). Considerando-se o
cume do pico (eluição com aproximadamente 920 μL) é possível determinar o Raio de Stokes em
183,3 Ǻ o que corresponde a um peso molecular calculado é de 1.220 kDa. Uma vez que a massa
molecular estimada para o monômero de MBP-HpMutS é aproximadamente 130 kDa, esse dado
mostra a presença de um oligômero de 9 a 10 subunidades de MBP·HpMutS. No perfil obtido na
filtração dos produtos da digestão da fusão MBP-HpMutS, onde deveria encontrar-se a HpMutS
(87 kDa) e a MBP (43 kDa) separadas, observa-se ainda a presença da proteína de fusão (grande
oligômero). Também se visualiza um pico identificado como pertencente à proteína MBP
(eluição com 1,55 mL, Raio de Stokes determinado em 29,2 Ǻ e peso molecular calculado em
41,88 kDa). A ausência da HpMutS no perfil protéico foi inesperada. Adicionalmente foi possível
observar a presença de uma grande quantidade de proteína com baixo peso molecular (Raio de
Stockes calculado entre 13 a 10 Ǻ o que corresponde a proteínas entre 5 e 2 kDa).
A técnica de filtração molecular na Superdex 200 aclarou algumas questões originadas
durante a purificação de HpMutS como, por exemplo, a dificuldade do corte da proteína de fusão
(vide fig. 17 e 18). Mesmo assim, a presença de associações de proteínas que supere os 600 kDa
não pode ser determinada já que excede o limite de detecção da coluna. Outra limitação é a baixa
eficiência desta técnica na identificação do grau de agregação de proteínas filamentosas.
4.1.2.3.2. Sedimentação em Gradiente de Sacarose.
Devido às restrições mencionadas anteriormente e, como ainda o estado de
oligomerização da HpMutS não tinha sido estabelecido, se procedeu à determinação desta
condição através de gradientes de sacarose. Para isso, o grau de associação de HpMutS·His foi
86
determinado em gradientes contínuos de sacarose entre 5% e 25%. O primeiro se realizou com
200 mM de NaCl e o resultado pode ser apreciado na figura 23.
kDa P M
94
67
43
30
HpMutS
(87 kDa)
BSA
(67 kDa)
Aldolase
(158 kDa)
Percentagem d e sacar os e
22,13 %
12,74 %
monóm eros
multím eros
kDa P M
94
67
43
30
HpMutS
(87 kDa)
BSA
(67 kDa)
Aldolase
(158 kDa)
Percentagem d e sacar os e
22,13 %
12,74 %
monóm eros
multím eros
Figura 23: Perfil de sedimentação de HpMutS em gradiente de sacarose a 200 mM de NaCl. 100
μ
gde
HpMutS·His foram utilizados nesta sedimentação, quantidade limitada devido à adição das proteínas padrões
BSA e a Aldolase (225 μg de cada uma e visualizadas igualmente neste SDS-PAGE de 10%). Foram
analisadas por SDS-PAGE somente as frações que apresentaram reação positiva pelo método de Bradford para
detecção de proteínas. PM: peso molecular padrão para proteínas.
As proteínas utilizadas como padrão foram: catalase, sedimentação média em 17,07% de
sacarose; ovoalbumina, sedimentação média em 12,74% de sacarose (ambas não mostradas);
aldolase, sedimentação média em 15,63% de sacarose; e BSA, sedimentação média em 13,46%
de sacarose. A proteína HpMutS está presente em fracções de elevada concentração de sacarose
(desde 22,13% até 17,07%). Segundo a relação obtida a partir das proteínas controles, HpMutS
está presente como pentâmero (22,13% sacarose, 448 kDa estimado), tetrâmero e trímero
(17,07% de sacarose, 227,3 kDa estimado) e, segundo a análise densitométrica das bandas do
SDS-PAGE, em quantidades praticamente equivalentes.
Considerando como possibilidade que a presença de possíveis cofatores beneficiem a
correta conformação quaternária da proteína, outorgando assim uma idéia mais concreta do seu
grau de oligomerização, foram realizados novos gradientes, mas desta vez, em presença de 1 mM
ATP e 3 mM Mg
2+
(fig 24).
87
kDa PM
94
67
Percentag em de s acarose
25 %
5 %
17,8 %
17,07 %
kDa PM
94
67
Percentag em de s acarose
25 %
5 %
17,8 %
17,07 %
Figura 24. Perfil de sedimentação de HpMutS em gradiente de sacarose a 200 mM de NaCl e na presença
de 1 mM ATP e 3 mM Mg
2+
. 200 μg de HpMutS·His foram utilizados nesta sedimentação. Foram analisadas
por SDS-PAGE (10%) todas as frações do gradiente. A figura foi construída a partir da união de dois geles SDS-
PAGE para facilitar a interpretação. Os pesos moleculares padrões (PM) estão repetidos na metade da figura
devido a que pertencem ao segundo gel.
Nestas condições, a HpMutS sedimentou entre 21,41 % e 14,18 % de sacarose o que
corresponde a pentâmeros até monômeros de proteína. Segundo a análise densitométrica do SDS-
PAGE (não mostrada) o trímero é a forma ligeiramente mais abundante (entre 17 e 18 % de
sacarose). A HpMutS também foi submetida a gradientes contendo 1mM ADP e 3 mM Mg
2+
. Os
resultados obtidos foram exatamente iguais (sedimentação, distribuição e abundância) aos obtidos
na presença de 1 mM de ATP e 3 mM MgCl
2
.(dados não mostrados).
Como última tentativa para determinar o menor grau de associação entre as HpMutS,
decidiu-se anular as interacções tipo ponte hidrogênio. Para isso, novos gradientes foram
realizados elevando a força iônica a 500 mM de NaCl. O gradiente completo de HpMutS é
apresentado na figura 25.
kDa PM
94
67
Percentagem de sacarose
25
Figura 25. Perfil de sedimentação de HpMutS em gradiente de sacarose a 500 mM de NaCl. 300
μ
g de
HpMutS·His foram utilizados nesta sedimentação A figura foi construída a partir da união de dois geles SDS-
PAGE (10%) para facilitar a interpretação. Os pesos moleculares padrões (PM) estão repetidos na metade da figura
devido a que pertencem ao segundo gel.
%
5%
As proteínas utilizadas como padrão foram: tireoglobulina (660 kDa) com sedimentação
média em 19,96% de sacarose; BSA, com sedimentação média em 10,57% de sacarose; e
ovoalbumina, sedimentação média em 9,85% de sacarose (não mostradas).
A 500 mM de NaCl, HpMutS renova o comportamento de ampla distribuição em altas
concentrações de sacarose (de 24,3% a 12,74%). Para esta sedimentação podem-se estimar
associações que variam de undecâmeros até dímeros, com uma ligeira maioria de heptâmeros
(18,52 % de sacarose) a tetrâmeros (14,9 % de sacarose). Mesmo utilizando uma elevada força
iônica, HpMutS não apresenta uma forma multimérica definida.
4.1.2.4. Substratos de HpMutS.
Os dados experimentais obtidos até esse momento sugeriram a possibilidade de que
HpMutS poderia reconhecer, preferencialmente, estruturas de DNA presentes no momento da
recombinação. Esta capacidade foi avaliada pela determinação da afinidade da HpMutS por
diferentes estruturas de DNA marcadas radioativamente no extremo 5’ de uma de suas fitas (vide
Material e Métodos, Seção 3.9).
4.1.2.4.1. Geles de Retardo.
A interação da HpMutS·His com diferentes estruturas de DNA foi analisada através de
geles de retardo (vide Material e Métodos, Seção 3.12.1). Nos ensaios apresentados na figura 26
se utilizaram diferentes concentrações da proteína HpMutS e 10 fmoles de estrutura de DNA.
-
ng de HpMutS
FS l i vr e
Complexo
HpM u t S - D N A
Ini ci o
do gel
-
ng de HpMutS
FS l i vr e
Complexo
HpM u t S - D N A
Ini ci o
do gel
A
Figura 26. Interação de HpMutS com
diferentes estruturas de DNA em geles
de retardo TBE. Concentrações
decrescentes de HpMutS·His (1.235 ng,
412 ng, 137 ng, 45 ,8 ng, e 15,3 ng) foram
incubadas com 10 fmoles de DNA fita
simples durante 15 minutos a 37°C. Após a
interação, as amostras foram carregadas
num gel nativo 6 % e submetidas a
eletroforese durante 2,30 h a 4°C.
89
B
Estes resultados mostram claramente que HpMutS possui uma grande afinidade pelo
DNA em todas as formas estudadas. Entretanto, a especificidade de HpMutS não pode ser
determinada porque os complexos de proteína/DNA ficaram no topo do gel
1
. Nesta condição não
se deve descartar a possibilidade da perda dos complexos durante os procedimentos
experimentais. Como conseqüência desta situação e, para evitar erros artefatuais, se decidiu tentar
outras condições de trabalho que possibilitem o esclarecimento da interação HpMutS/DNA.
As variáveis testadas na interação (com estruturas de fita simples, fita dupla e de
Holliday) foram:
1- A temperatura de interação (4°C, 20°C e 37°C)
2- pH da reação (6,8, 7,0, 7,6, 8,0, 8,5, e 8,8)
3- Concentração de NaCl (50, 100, 150 e 200 mM)
4- Concentração de Mg
2+
(0, 5, 10, e 15 mM)
1
Naquele momento ainda não existiam anticorpos anti-MutS disponíveis para confirmar a posição real da proteína
(dentro ou fora do gel).
Figura 26 (Continuação). Interação de HpMutS com diferentes estruturas de DNA em geles de retardo
TBE. Concentraçõ es decrescentes de HpMutS·His (1.235 n g, 412 ng, 137 ng, 45,8 ng, e 15,3 ng) foram
incubadas com 10 fmoles d e forquilha ou junção de Holliday (FWJ) durante 15 minutos a 3 7°C. Após a
interação, as amostras foram submetidas a eletroforese num gel nativo 6%durante 2,30 hs a 4°C, como descrito
em Material e Métodos.
Inicio
do gel
Comple xo
HpM u t S - D N A
FWJ l i vr e
Forquilha
livre
--
ng de HpMutS
ng de HpMutS
Inicio
do gel
Comple xo
HpM u t S - D N A
FWJ l i vr e
Forquilha
livre
--
ng de HpMutS
ng de HpMutS
90
5- Presença de possíveis cofatores (1 mM ATP / 5mM Mg
2+ 2+
e, 1 mM ADP / 5 mM Mg ,
ambas testadas a 4°C e 37°C).
6- Tratamento prévio da HpMutS com DNAse I (apesar da utilização de 500 mM de NaCl
na lise até a coluna de heparina). Devido à grande afinidade da HpMutS pelo DNA, a proteína
poderia carrear o DNA presente no extrato bacteriano desde o momento da lise.
Também foram testadas modificações na composição de geles e nas técnicas de migração
como se descreve a seguir:
1- Percentagens do gel nativo (6%, 4%, 2,5%)
2- Adição de gel stacking 5% (5:1 acrilamida: bis)
3- Adição de glicerol (5%) no gel
4- Diferentes percentagens de acrilamida:bis (150:1 em 20 % e gel de 5 %; 80:1 em 40%
e gel de 5%, 29:1 em 40% e gel de 5%; 1:4 em 5% e gel de 2,5%)
5- Gel e tampão de migração Tris/glicina e TAM (vide composição na fig 27).
6- Inversão de eletrodos.
Apesar de todas as modificações realizadas, nenhuma destas condições modificou o
comportamento, nem a localização no gel, de HpMutS (resultados não apresentados, exceto para
a condição TAM como exemplo).
Figura 27. Interação de HpMutS /DNA em
geles de retardo TAM. Duas concentrações
de HpMutS·His (412 ng, 137 ng ) foram
incubadas com 10 fmoles de DNA fita
simples (FS), forquilha e junção de Hollid ay
(FWJ) durante 15 minutos a 37°C em tampão
TAM (6 mM Tris pH 7.8, 5 mM NaOAc, 2
mM MgOAc) suplementado com 10 μM
ATP, e 1mM DTT. Após a interação, as
amostras foram carregadas num gel nativo
5% (acri:bis 80:1, 20%, suplementado com
100 μM de ATP) e foram submetidas a
eletroforese (voltagem constante de 7 V/cm)
durante 4 hs a 4°C em tampão TAM
(
su
p
lementado com 10 mM EDTA
)
.
ng de HpMutS
---
Complexo
HpMutS /DNA
In ic i o
do gel
FS li vre
ng de HpMutS
---
Complexo
HpMutS /DNA
In ic i o
do gel
FWJ l i vre
Forquilha livre
FWJ l i vre
Forquilha livre
FS li vre
91
4.1.2.4.2. Retenção em Filtro.
A capacidade de ligação/interação de HpMutS·His a diferentes estruturas de DNA foi
analisada, então, mediante retenção em filtro. Desta vez, visando também definir a especificidade
de HpMutS através da medida das afinidades relativas pelos diferentes substratos. Para isso,
realizaram-se ensaios de competição onde uma determinada estrutura de DNA marcada
radiotivamente (DNA*) foi posta em concorrência de disponibilidade crescente de outras
estruturas de DNA (FWJ, F, FD, MM e FS, vide Material e Métodos Sessão 3.9). A
radioatividade relativa à quantidade de proteína/DNA* retidas nas membranas de nitrocelulose
foram quantificadas em um sistema Storm Phosphoimager. Na figura 28 se apresenta o
comportamento de HpMutS quando se utilizou a FWJ*
0
25
50
75
10 0
0 100 200 300 400
fmoles de DNA em excesso
% de DNA ligado
F
FWJ
FD
MM
FS
Figura 28. Análise de competição de HpMutS ligada à estrutura de Holliday (FWJ). Em cada reação (20
μL) foram incubados 400 nM de HpMutS·His, 10 fmoles de FWJ*, e quantidades crescentes de competidor não
marcado. FWJ: estrutura de Holliday , F: forquilha, FD: fita dupla, MM: fita dup la com um erro de
emparelhamento (G/T), e FS: fita simples. As reações começaram no momento da adição de HpMutS. As barras
de erro indicam o desvio padrão de três experimentos independentes.
92
Nas curvas apresentadas na figura 28 pode observar-se que as quantidades crescentes de
FWJ não marcada (fria) deslocaram fortemente a FWJ*. Entretanto, outros tipos de estruturas
como a fita simples, a fita dupla e a fita dupla com um erro de emparelhamento (G/T)
praticamente não afectaram a interação HpMutS/FWJ*. Porém, a forquilha, como competidor
frio, foi tão eficiente quanto a FWJ no deslocamento da FWJ*. Através da análise de Scatchard
(Scatchard, 1949) (fig. 29) se calcularam as constantes de dissociação (Kd) da proteína para as
estruturas FWJ, dupla e simples fita. Estas constantes, quando comparadas, validam a afinidade
seletiva de HpMutS pelas estruturas que possuem transições simples fita/dupla fita.
Kd: 57,5 nM
Kd: 15,9 nM
Kd: 17,2 nM
0
0,003
0,006
0,009
0,012
0 0,0 5 0,1 0,15 0,2 0,25
DNA ligado (fmol)
DNA ligado (fmol)/DNA livre (fmol) /
HpMutS (nM)
FWJ
FD
FS
Figura 29. Análise da especificidade de HpMutS por diferentes estruturas de DNA. Análise de Scatchard de
três competições representativas apresentadas na figura 29. FWJ: junção de Holliday, FD: fita dupla, FS: fita
simples.
Os resultados obtidos nos deslocamentos de outras estruturas marcadas (dados não
mostrados) ratificaram o exposto anteriormente.
93
4.1.2.5. Atividade de HpMutS in vitro.
Para determinar se HpMutS inibe a recombinação in vitro se analisou o seu efeito na
transferência de fita mediada por RecA. Para isso, se utilizou o sistema descrito por Lavery &
Kowalczykowski (Lavery & Kowalczykowski, 1992. Fig. 30A) onde RecA intermedeia a
transferência de uma fita a partir de um DNA dupla fita linear (dfl) a um DNA simples fita
circular (sfc). O resultado é mostrado na figura 30B e 30C.
A
Simples fita
circular (sfc)
Dupla fit a
linea r (dfl)
+
Produto intermediário (pi)
-joint molecules, jm-
Dupla fita circular
“aberto” (dfca)
Simples fita
linea r (sfl)
+
Simples fita
circular (sfc)
Dupla fit a
linea r (dfl)
+
Produto intermediário (pi)
-joint molecules, jm-
Dupla fita circular
“aberto” (dfca)
Simples fita
linea r (sfl)
+
B
+
+
nM de HpMutS
+
+
nM de HpMutS
Figura 30. Transferência de fita mediada por RecA em presença de HpMutS. A) Esquema explicativo da
reação. B) Concentrações crescentes de HpMutS·His (119, 178, 267, 401, 601 e 834 nM) foram adicionadas no
começo da reação de transferência de fita e incubadas a 37°C durante 90 minutos. O DNA resultante da reação
foi submetido a eletroforese em gel de agarose 0,8 % durante 4 h. +: controle positivo (reação só na presença de
RecA).
94
0
25
50
75
10 0
0 200 400 600 800
nM de H p M ut S
% de dfca (produto final)
C
Figura 30 (Continuação). Transferência de fita mediada por RecA em presença de HpMutS. C)
Quantificação da inibição de formação de produto final em presença de HpMutS·His. Valores obtidos em três
experimentos independentes.
Como se aprecia na figura 30B e 30C a quantidade de produto final (dfca) é inversamente
proporcional à quantidade de HpMutS presente na reação, indicando um efeito inibitório desta na
transferência de fita. Estes resultados foram igualmente obtidos para a transferência de fitas
heterólogas em 8 % e 21 % (dados não mostrados, vide Material e Métodos).
Estes resultados, juntamente com os resultados obtidos in vivo, demonstram claramente
que a HpMutS possui atividade “anti-recombinogênica” e que esta é independente do grau de
heterologia das seqüências.
95
4.2. Estudo da proteína HpMutSΔSmr
4.2.1. Caracterização Bioquímica de HpMutSΔSmr.
4.2.1.1. Purificação de HpMutSΔSmr.
O gene hpmutS
Δ
smr (sem os últimos 225 nucleotídeos) foi clonado no vetor pET3b com a
adição da seqüência codificante de seis resíduos histidina no 3’ do oligo reverso. Uma vez que os
clones foram verificados por seqüenciamento, a superprodução e purificação foram realizadas
seguindo os mesmos procedimentos empregados para HpMutS (vide Material e Métodos, seção
3.8.7 e Resultados, seção 4.1.2.1). Na figura 31 podem ser visualizados os diferentes passos de
purificação da proteína mutante, e no Anexo I os cromatogramas.
A
PM cni ci sc pc nu
mM Imidazol
HpMutSΔSmr
kDa
175
83
47
32
16
PM cni ci sc pc nu
mM Imidazol
HpMutSΔSmr
kDa
175
83
47
32
16
175
83
47
32
16
62
25
PM c nu
kDa
mM NaCl
HpMutSΔSmr
175
83
47
32
16
62
25
PM c nu
kDa
mM NaCl
HpMutSΔSmr
B
Figura 31. Purificação de HpMutSΔSmr·His. A) Superprodução, ultracentrifugação do lisado e cromatografia
na coluna de Ni+. cni: cultura não induzida, ci: cultura induzida, sc: sobrenadante da ultracentrifugação, pc:
p
recipitado da ultracentrifugação. A carga da coluna de Ni+ foi o sobrenadante do ultracentrifugado. B)
Passagem pela coluna heparina. c: carga na coluna, nu: material não unido à coluna. PM: peso molecular padrão.
96
C
PM c nu
mM NaCl
25
32
47
62
83
175
16
6,5
kDa
HpMutSΔSmr
PM c nu
mM NaCl
25
32
47
62
83
175
16
6,5
kDa
HpMutSΔSmr
Figura 31 (Continuação). Purificação de HpMutS
Δ
Smr·His. C) Passagem pela coluna MonoS. c: carga na
coluna (frações eluidas da heparina). nu: material não unido à MonoS. PM: peso molecular padrão.
Esta estratégia de purificação foi escolhida para poder comparar as atividades da proteína
mutante com a selvagem. Na figura 31A (linha pc) se observa que uma boa parte da proteína
recombinante não é solúvel. Entretanto, o rendimento final aproximado (9 mg/L) e a eficiência de
purificação (95-97 % da proteína pura) foram similares aos da selvagem.
97
4.2.1.2. Atividade de hidrólise de ATP de HpMutSΔSmr.
Uma vez a HpMutSΔSmr purificada, foi testado se a ausência do domínio Smr afeta a
capacidade de hidrólise de ATP, como também a estimulação da mesma pela presença de DNA
(fig 32).
1
pmoles de ATP hidrolisado
0
50
100
150
200
HpMutS
HpMutSΔSmr
- DNA
- DNA
+ DNA
+ DNA
Figura 32. Atividade de hidrólise de ATP de HpMutS
Δ
Smr. Atividade ATPásica de 150 nM de
HpMutSΔSmr·His e 150 nM de HpMutS·His em presença e ausência de 267 nM de forquilha durante 30 minutos
de incubação a 37°C.
Como se observa na figura 32, a deleção do domínio Smr não modificou a atividade de
hidrólise de ATP da proteína mutante e também não interferiu na estimulação da mesma pelo
DNA.
98
4.2.1.3. Atividade de HpMutSΔSmr in vitro.
A atividade in vitro de HpMutSΔSmr foi determinada da mesma forma que para a
proteína selvagem, isto é, através do ensaio de transferência de fita mediada por RecA (fig 33 e
tabela 26).
-
+
nM HpMutS
nM HpMutSΔSmr
+
-
+
nM HpMutS
nM HpMutSΔSmr
++
Figura 33. Transferência de fita mediada por RecA em presença de HpMutS e HpMutS
Δ
Smr. As
concentrações de proteína utilizadas foram 210, 430 e 850 nM. (-): controle negativo (sem RecA). (+) controle
positivo.
Concentração de proteína Percentagem de formação de produto final
HpMutS HpMutS
Δ
Smr
210 nM
430 nM
56,0 % ± 2,0 %
48,5 % ± 0,7 %
65,0 % ± 1,5 %
58,0 % ±1,0 %
850 nM 40,5 % ± 2,1 % 49,5 % ± 1,7 %
Tabela 26. Percentagens da formação do produto final (dfca) da transferência de fita, em presença de HpMutS
e HpMutSΔSmr. A quantificação dos ensaios de transferência de fita foi realizada através do sofware Kodak image.
Os valores a
p
resentados corres
p
ondem à média
(
e aos desvios
p
adrão
)
das
p
ercenta
g
ens de dois ex
p
erimentos.
No que diz respeito à atividade in vitro, a proteína HpMutSΔSmr, de modo igual à
proteína selvagem, inibiu a transferência de fita. Entretanto, como é observado na figura 33 e nas
percentagens da formação do produto final por ambas proteínas (tabela 26), a eficiência de
inibição da proteína mutante foi menor em, aproximadamente, 10 %.
99
4.2.1.4. Afinidade de HpMutSΔSmr.
Devido à redução da inibição de transferência de fita in vitro, se decidiu examinar a
afinidade de HpMutSΔSmr pela estrutura de Holliday. Para isso, as interações entre
HpMutSΔSmr e FWJ* foram analisadas através de geles de retardo
1
.
Na figura 34A se observa que, apesar da utilização do mesmo protocolo que Wang e col,
2005, a posição da HpMutS nos geles não desnaturantes não foi a mesma que os autores
1
Wang e col, 2005, apresentaram geles de retardo com a proteína HpMutS, pelo que se decidiu adotar os seus
protocolos para o estudo da afinidade da HpMutSΔSmr.
0
25
50
75
100
0 100 200 300
nM de proteína
% de FWJ* livre
Selvagem
Mutante
Figura 34. Afinidade de HpMutS e HpMutS
Δ
Smr pela estrutura FWJ a 10 mM de KCl. A- Gel de retardo
onde foram utilizadas iguais concentrações de HpMutS·His e HpMutSΔSmr·His (50, 100, 150 e 300 nM). B-
Quantificação indireta da retenção da FWJ* pelas duas proteínas. Valores de dois experimentos independentes.
B
A
HpMutS
HpMutSΔSmr
Complexo
proteína/DNA
FWJ livre
-
HpMutS
HpMutSΔSmr
Complexo
proteína/DNA
FWJ livre
-
100
apresentaram
2
. Por outro lado, a capacidade de reconhecimento da estrutura de Holliday por parte
da HpMutSΔSmr foi levemente menor que a da proteína selvagem (fig 34B). Porém, apesar de
que as reações de interação proteína/DNA a 10 mM de KCl permitiram estabelecer afinidades,
estas foram questionáveis na medida de que não necessariamente refletiram o comportamento
“fisiológico” destas interações, por isso, se decidiu examiná-las, em paralelo, a 150 mM de KCl
(fig 35).
2
Entretanto, anticorpos anti-MutS disponíveis nesse momento confirmaram a entrada da proteína HpMutS no gel de
retardo (dados não mostados).
0
25
50
75
100
0 100 200 300
nM de proteína
% de FWJ* livre
Selvagem
Mutante
Figura 35. Afinidade de HpMutS e HpMutSΔSmr pela estrutura FWJ a 150 mM de KCl. A- Gel de retardo
onde foram utilizadas iguais concentrações de HpMutS·His e HpMutSΔSmr·His (50, 100, 150 e 300 nM). B-
Quantificação indireta da retenção da FWJ* pelas duas proteínas. Valores de dois experimentos independentes.
B
A
-
HpMutS
HpMutSΔSmr
Complexo
proteína/DNA
FWJ livre
-
HpMutS
HpMutSΔSmr
Complexo
proteína/DNA
FWJ livre
101
Como se apresenta na figura 35A e B, a ligeira diferença de afinidade entre as proteínas
selvagem e mutante a 10 mM de KCl se intensificou quando as condições de adstringência se
aproximaram das fisiológicas (150 mM de KCl).
Para determinar se a redução de afinidade da proteína mutante foi específica para o
melhor substrato (FWJ) da proteína selvagem se examinou a interação da HpMutSΔSmr com
DNA fita dupla e simples. Os resultados obtidos são mostrados nas figuras 36 e 37.
B
A
Figura 36. Afinidade da HpMutSΔSmr por DNA simples fita (60 mer) a 10 mM e 150 mM de KCl. A) Gel
de retardo. As concentrações da proteína foram: 50, 150 e 450 nM respectivamente. (-) controle negativo (sem
proteína), (+) controle positivo: 450 nM (33% e 45% de FS* livre a 10 mM e 150 mM de KCl respectivamente).
B) Quantificação indireta de dois experimentos independentes.
Figura 37. Afinidade de HpMutSΔSmr por DNA dupla fita (60 mer) a 150 mM de KCl. A) Gel de retardo.
As concentrações de HpMutS e HpMutSΔSmr foram 50, 100 e 150 nM. (-) controle negativo (sem proteína). B)
Quantificação indireta da afinidade das proteínas selvagem e mutante pelo DNA dupla fita. Valores
corres
p
ondentes a dois ensaios inde
p
endentes.
--
++
HpMutSΔSmr HpMutSΔSmr
10 mM KCl 150 mM KCl
Complexo
proteína/DNA
FS livre
--
++
HpMutSΔSmr HpMutSΔSmr
10 mM KCl 150 mM KCl
Como se observa nas figuras 36 e 37, a diminuição do reconhecimento da FWJ por parte
da proteína mutante foi extensiva a outras estruturas de DNA, indicando que a ausência do
domínio Smr não afeta especificamente o reconhecimento de estruturas com transição
simples/dupla fita, senão que afeta a afinidade da proteína pelo DNA de forma geral.
4.2.2. Caracterização Genética de HpMutSΔSmr.
A fim de verificar o impacto fenotípico da ausência do domínio Smr na proteína HpMutS
se mediu a integração de DNA homólogo nas cepas mutantes para o domínio smr, construídas
como se descreveu em Material e Métodos, seção 3.14.
1
UFC/
μ
g de DNA
0
500
1000
hpmutS A/selvagem: 5,8
hpmutS B/selvagem: 5,1
hpmutS
Δ
smr A/selvagem: 9,9
hpmutS
Δ
smr B/selvagem: 2,8
hpmutS
Δ
smr C/selvagem: 7,1
3000
2500
2000
1500
selvagem
A B A B C
hpmutS
hpmutS
Δ
smr
Figura 38. Eficiência de integração do DNA em cepas de H. pylori selva
g
em, mutante total e parcial no
gene mutS. A, B, e C correspondem a distintos clones das cepas mutantes. Os eventos de integração foram
calculados como colônias resistentes a kanamicina por micrograma de DNA. Os valores correspondem à media
de três transformações independentes, e as barras de erros correspondem ao desvio padrão.
103
Na figura 38 se observa o resultado do teste de integração de DNA homólogo nas cepas
selvagem, hpmutS, e hpmutS
Δ
smr. Inesperadamente, o valor da integração de DNA na cepa
hpmutS
Δ
smr, que se esperava intermediário entre a cepa selvagem e a mutante completa, foi
muito variável, não permitindo esclarecer o verdadeiro fenótipo na ausência do domínio smr.
O motivo desta grande variação na integração de DNA possivelmente esteve relacionado
a problemas na expressão da proteína mutante (fig 39). Como conseqüência desta situação, novas
estratégias estão em andamento para verificar o impacto in vivo que causa a ausência do domínio
smr na proteína HpMutS (vide Discussão).
PM 1 2 3 4 5 6 7 8
kDa
175
83
62
47
PM 1 2 3 4 5 6 7 8
kDa
175
83
62
47
PM 9 10 11 12 13 14
kDa
175
83
62
47
PM 9 10 11 12 13 14
kDa
175
83
62
47
PM 9 10 11 12 13 14
kDa
175
83
62
47
Figura 39. Expressão de HpMutS e HpMutS
Δ
Smr in vivo. As proteínas foram detectadas nas diferentes cepas
de H. pylori X47-2AL com anticorpo policlonal anti-HpMutS. As diferentes linhas identificadas com números
correspondem a: 1/9: HpMutS purificada, 2/10: extrato total da cepa selvagem, 3: extrato total da cepa hpmutS A,
4/5: extrato total da cepa hpmutS
Δ
smr A 1 e 2, 6/7: extrato total da cepa hpmutS
Δ
smr B 1 e 2, 8/14: HpMutSΔSmr
purificada, 11: extrato total da cepa hpmutS B, 12/13: extrato total da cepa hpmutS
Δ
smr C 1 e 2. PM: proteínas
padrões. A localização das distintas formas de HpMutS está indicada com uma seta.
104
4.3. Estudo dos smr (“small mutS related”).
Com o propósito de esclarecer a importância do domínio smr na proteína HpMutS e,
como forma alternativa encontrada para contornar as dificuldades encontradas na caracterização
genética da mutante HpMutSΔSmr, se analisou o papel deste domínio individualmente. Como se
mencionou na introdução, existem três características notáveis dos smr que são a conservação, a
ubiqüidade e o contexto gênico. Por isto, se decidiu estudar a proteína Smr nas suas duas formas
existentes: como fusão do C-terminal, neste caso da HpMutS, e como uma proteína simples,
utilizando os representantes de E. coli, S. typhimurium, e S. cerevisiae (fig 7).
4.3.1. Características gerais dos smr de H. pylori, E. coli, S. typhimurium, e S.
cerevisiae.
Como foi descrito, o domínio smr de H. pylori encontra-se na região C-terminal da
proteína HpMutS (vide fig 6), a qual pertence à subfamília das MutS2. Este domínio é composto
por 225 nucleotídeos que codificam 75 aminoácidos, totalizando uma massa molecular de 8,1
kDa, com um ponto isoelétrico calculado em 6,05. De agora em diante se fará referencia ao
domínio como hpsmr, e à proteína como HpSmr.
A proteína SMR de S. cerevisiae (ScSMR) é codificada pelo gene YPL199c
1
, localizado
no cromossomo XVI (fig 40). Está formada por 240 aminoácidos, com um peso molecular
estimado em 26,8 kDa e um ponto isoelétrico calculado de 7,1.
1
GeneBank ID: CCA97913.1
105
Os smr de E. coli e S. typhimurium também se encontram em ORFs simples, mas, neste
caso, os genes estão duplicados nestes dois organismos (fig 41). Tanto em E. coli como em S.
typhimurium estas cópias se denominam ydaL e yfcN, por isso, neste trabalho serão denominados
ecydaL
2
, ecyfcN
3
, EcYdaL, e EcYfcN para genes e proteínas de E. coli, e stydaL
4
, styfcN
5
,
StYdaL, e StYfcN para os genes e as proteínas de S. typhimurium. Além do nome, os genes, em
um e outro organismo, compartilham outras características em comum que podem ser
visualizadas na tabela 27.
2
GeneBank ID: AAC74422
3
GeneBank ID: AAC75391
4
GeneBank ID: AAL20576.1
5
GeneBank ID: AAL21287.1
Figura 40. Localização gênica do gene contendo o domínio smr de S. cerevisiae. Em vermelho os genes na
fita Watson, e em azul os genes na fita Crick. Em verde o fragmento do cromossomo XVI que inclui o
centrômero (preto). O gene YPL199c está sinalizado. Figura adaptada a partir de
http://www.yeastgenome.org/
106
E. coli S. typhimurium
Total de nucleotídeos: 564 Total de nucleotídeos: 564
Total de aa: 187 Total de aa: 187
Massa molecular: 21,5 kDa Massa molecular: 21,64 kDa
Ponto isoelétrico: 9,33 Ponto isoelétrico: 9,57
ydaL
Posicionamento (min): 30,26 Posicionamento (min): 35,40
Total de nucleotídeos: 552 Total de nucleotídeos: 552
Total de aa: 183 Total de aa: 183
Massa molecular: 21,01 kDa Massa molecular: 21,17 kDa
Ponto isoelétrico: 8,59 Ponto isoelétrico: 8,30
yfcN
Localização (min): 52,73 Localização (min): 50,43
Domínios smr
de E. coli
Domínios smr
de E. coli
Domínios smr de
S. typhimurium
Domínios smr de
S. typhimurium
Figura 41. Localização gênica dos genes contendo os domínios smr de E. coli e S. typhimurium. Os genes
estão marcados com um círculo vermelho. Figuras adaptadas a partir de
http://ecogene.org/ e
http://cmr.tigr.org/tigr-scripts/CMR/GenomePage.cgi
Tabela 27. Comparação das características dos genes ydaL e yfcN de E. coli e de S. typhimurium. Dados
obtidos a partir da descrição das seqüências (
http://ecogene.org/ e http://cmr.tigr.org/tigr-
scripts/CMR/GenomePage.cgi?org=ntst01) e mediante a utilização do programa MWCALC
(
http://bioinfo.hku.hk/services/analyseq/cgi-bin/mwcalc_in.pl)
107
4.3.2. Caracterização Bioquímica das proteínas Smr.
4.3.2.1. Purificação de HpSmr.
O domínio hpsmr foi clonado no plasmídeo pETM 11 (vide Material e Métodos, seção
3.7) a partir do qual foram ensaiadas diferentes condições de superprodução. Como descrito em
Material e Métodos (seção 3.15), após a indução da superprodução de His·HpSmr, as bactérias
foram submetidas a ultra-som seguido de ultracentrifugação. O sobrenadante foi submetido a
troca por afinidade em coluna de Ni
+
, onde foi feita a eluição aplicando um gradiente linear de
imidazol (fig 42A). As frações com maior concentração de His·HpSmr foram submetidas a troca
iônica em coluna Mono Q e eluidas com um gradiente linear de NaCl (fig. 42B). Após diálise, a
proteína de fusão His·HpSmr foi digerida com a protease TEV [(fig. 42C-2-) para eliminação dos
resíduos histidina]. Finalmente, os produtos desta digestão foram submetidos novamente à
interação com a resina de Ni
+
. Neste passo, tanto os resíduos histidinas quanto a protease ficaram
ligados à coluna (His·TEV, proteína recombinante). A HpSmr foi recuperada completamente
limpa como material não associado da interação (fig. 42C).
A
175
83
62
47,5
32
25
16,5
6,5
PM i sd nu kDa
mM Imidazol
A
A
175
83
62
47,5
32
25
16,5
6,5
PM i sd nu kDa
mM Imidazol
A
Figura 42. Purificação da proteína HpSmr. A) Primeira Etapa: Interação por afinidade. I: cultura induzida, Sd:
carga na coluna, nu: material não associado à coluna. PM: peso molecular padrão
108
B
175
83
62
47,5
32
25
16,5
6,5
mM NaCl
PM
kDa
B
B
175
83
62
47,5
32
25
16,5
6,5
mM NaCl
PM
kDa
B
TEV-
C
175
83
62
47,5
32
25
16,5
6,5
PM 1 2 3 4 5 6 7 8
kDa
TEV-His
C
TEV-
C
175
83
62
47,5
32
25
16,5
6,5
PM 1 2 3 4 5 6 7 8
kDa
TEV-His
C
Figura 42 (Continuação). Purificação da proteína HpSmr.. B) Segunda Etapa: troca iônica na coluna Mono Q.
C) Terceira Etapa: segunda afinidade pela coluna de Ni
+
. 1: proteína antes do corte com a TEV, 2: proteína depois
do corte, 3: proteína depois da diálise, 4 e 5: material que não interagiu com a coluna (neste caso a HpSmr,
indicado por uma seta), 6: lavagem da coluna, e 7 e 8: eluição com imidazol. PM: peso molecular padrão.
4.3.2.2. Purificação de EcYdaL e EcYfcN.
Em alguns dos vetores ensaiados para a clonagem os genes ecydaL e ecyfcN (pGEX-4T,
pMALc e pMALp, repressor laqI
Q
) nenhum clone foi obtido e em outros como o pET 15b, os
clones obtidos apresentaram importantes rearranjos cromossômicos. As clonagens foram obtidas
somente quando se testou um sistema de expressão com promotor de arabinose (vetores pBAD).
Como descrito em Material e Métodos (seção 3.16) a superprodução das proteínas de fusão foi
109
realizada pela adição de arabinose 0,002% final
6
. Ao término da indução, as bactérias foram
lisadas por ultra-som e submetidas a ultracentrifugação. Os sobrenadantes foram submetidos à
interação com a resina Ni
+
. Logo após da eluição com gradiente crescente de imidazol (fig. 43 -3-
), as proteínas foram submetidas à troca por afinidade em coluna de heparina (fig. 43 -4-). Após
diálise, as proteínas His·EcYdaL e His·EcYfcN foram digeridas com 0,01 unidades de
enterocinase K/20 μg de proteína de fusão. Os produtos das digestões foram novamente
submetidos à coluna de heparina (fig. 43 -5-), desta vez, para concentrar as proteínas após as
diálises e para eliminar as histidinas e a enterocinase K. As proteínas foram guardadas em 50%
glicerol a –20°C e também em alíquotas com 10% glicerol a –80°C. Todas as etapas de
purificação da EcYdaL (fig 43A) e EcYfcN (fig 43B) foram seguidas por SDS-PAGE 10%.
175
83
62
47,5
32
25
16,5
6,5
PM 1 2 3 4 5 kDa
A
175
83
62
47,5
32
25
16,5
6,5
PM 1 2 3 4 5 kDa
A
175
83
62
47,5
32
25
16,5
6,5
PM 1 2 3 4 5kDa
B
175
83
62
47,5
32
25
16,5
6,5
PM 1 2 3 4 5kDa
B
Figura 43. Purificação de EcYdaL e EcYfcN. A) Purificação de EcYdaL. 1: cultura não induzida, 2: cultura
induzida, 3: eluição da coluna de Ni
+
, 4: eluição da coluna de heparina, 5: eluição da segunda coluna de
heparina (após o corte do “tag” de histidina). B) Purificação de EcYfcN. 1: cultura não induzida, 2: cultura
induzida, 3: eluição da coluna de Ni
+
, 4: eluição da coluna de heparina e 5: eluição da segunda coluna de
heparina (após corte com enterocinase)
6
As condições de indução para EcYdaL e EcYfcN foram determinadas anteriormente e foi escolhida a melhor para
cada proteína, que coincidentemente foi a mesma para as duas (dados não mostrados).
110
Devido à significativa semelhança dos genes smr de E. coli e S. typhimurium (fig 7 e fig.
41), as proteínas StYdaL e StYfcN são consideradas equivalentes às EcYdaL e EcYfcN
respectivamente, razão pela qual, as proteínas Smr de S. typhimurium não foram purificadas.
4.3.2.3. Purificação de ScSMR.
A clonagem da ORF YPL199c foi obtida somente através do sistema de expressão
arabinose, indicando, como para as proteínas de E. coli, uma grande toxicidade. Como descrito
em Material e Métodos (seção 3.17) a melhor condição de superprodução da proteína His·ScSMR
foi lograda com a adição de 0,00002% de arabinose final (fig 44A). Logo após a superprodução,
as bactérias foram lisadas por ultra-som e o lisado foi submetido a ultracentrifugação. Neste
primeiro passo de purificação foi verificado que a proteína His·ScSMR não apresentava
solubilidade (fig 44B). Apesar de todas as tentativas realizadas (vide Material e Métodos, seção
3.17) não foi possível solubilizar a proteína recombinante. Uma possibilidade para este fenômeno
acontecer pode ser um defeito no enovelamento, ou alta toxicidade da proteína recombinante,
razão pela qual ela é dirigida para os corpos de inclusão por parte da célula hospedeira. A partir
destes resultados se optou por deixar de lado a caracterização bioquímica deste domínio.
Figura 44. Ensaio de
purificação de ScSMR.
A) Teste de superprodução
com arabinose. As
concentrações de arabinose
utilizadas foram: 0,2 %, 0,02
%, 0,002 %, 0,0002 % e
0,00002 %. cni: cultura não
induzida.
B) Resultado da
ultracentrifugação. Ci: cultura
induzida com 0,00002% de
arabinose, s: sobrenadante, e
p: “pellet”. PM: peso
molecular padrão.
PM cni
% arabinose
kDa
83
62
47
32
25
A
PM cni
% arabinose
kDa
83
62
47
32
25
A
PM ci s pkDa
175
83
62
47
32
25
16
B
PM ci s pkDa
175
83
62
47
32
25
16
B
111
4.3.2.4. Avaliação da atividade nucleásica das proteínas Smr.
Como se mencionou na introdução, existe a hipótese de que as proteínas codificadas pelos
smr possuam atividade nucleásica (Malik & Henikoff, 2000). Essa hipótese foi verificada no caso
do domínio Smr do C-terminal da proteína humana B3BP (Watanabe e col, 2003) e para o
domínio Smr do C-terminal da proteína MutS2 de Thermus thermophilus (Fukui e col., 2007).
Apesar de não se ter detectado essa atividade em nenhum ensaio realizado com a HpMutS·His, se
decidiu verificar esta possibilidade com a utilização de HpSmr e analisar, igualmente, a
existência dessa atividade nas proteínas EcYdaL e EcYfcN (fig. 45).
PM
(1 Kb)
1 2 3 4 5
PM
(1 Kb)
2 3 4 51
3’
5’
- + 1 2 3 4 5 6
3’3’
5’5’
- + 1 2 3 4 5 6
A
B
-
HpSmr EcYdaL EcYfcN
-
HpSmr EcYdaL EcYfcN
-
HpSmr EcYdaL EcYfcN
-
HpSmr EcYdaL EcYfcN
-
HpSmr EcYdaL EcYfcN
-
HpSmr EcYdaL EcYfcN
C
Figura 45. Teste de atividade nucleásica das proteínas Smr com distintos substratos. A) pBlueScript
superenovelado. 1: controle com plasmídeo linear, 2: controle negativo (sem proteína), 3: 650 nM de HpSmr, 4:
650 nM de EcYdaL, e 5: 650 nM de EcYfcN. B) pBlueScript lineal com extremos 5’ livres (linhas 1, 2 e 3) e 3’
livres (linhas 4, 5 e 6). (-): controle negativo, (+): controle positivo, 1 e 4: 650 nM de HpSmr, 2 e 5: 650 nM de
EcYdaL, e 3 e 6: 650 nM de EcYfcN. C) DNA simples e dupla fita de 34 bp com 650 nM de proteína incubado a
37°C durante 45 minutos. Todos os ensaios foram realizados a 37°C com 5 mM Mg
+
durante 45 minutos.
112
Como se observa na figura 45, nenhuma das três proteínas Smr (HpSmr, EcYdaL e
EcYfcN) demonstrou possuir atividade nucleásica (endo ou exo) nas condições ensaiadas.
Inclusive, mesmo com variações de tipo e quantidade de sal (NaCl e KCl; 50 mM, 100 mM e 150
mM), e pH do tampão (6.8, 7.5, 8, 8.5, e 8.8) -dados não mostrados- não se detectou nenhuma das
atividades descritas para o homólogo presente no homem e em Thermus thermophilus.
4.3.2.5. Atividade das proteínas Smr na transferência de fita mediada por RecA.
Considerando que, a proteína HpMutS inibe a transferência de fita catalisada por RecA e
que na proteína mutante HpMutSΔSmr esta atividade encontra-se diminuída, se examinou a
atividade das proteínas Smr na transferência de fita in vitro ( fig 46).
-
+ 1 2 3
+
-
+ 1 2 3
++
Fi
g
ura 46. Transferência de fita
mediada por RecA na presença
das proteínas Smr.
(-) controle negativo (sem RecA).
(+) controle positivo. 1: 850 nM
de HpSmr, 2: 850nM de EcYdaL,
e 3: 850 nM de EcYfcN.
Segundo o apresentado na figura 46, a proteína codificada somente pelo domínio hpsmr,
assim como as ortólogas EcYdaL e EcYfcN, não possuem atividade direta sobre a transferência
de fita in vitro. (quantificação não mostrada).
113
4.3.2.6. Afinidade das proteínas Smr por diferentes substratos de DNA.
As proteínas Smr estudadas não apresentaram atividade nucleásica, nem ação direta na
transferência de fita in vitro. Entretanto, uma delas, a HpSmr está intimamente relacionada com a
proteína HpMutS anteriormente descrita, por esse motivo se analisaram as prováveis afinidades
pelas diferentes estruturas de DNA. Para isso, se levaram a cabo experimentos de retardo em gel
utilizando os substratos descritos em Material e Métodos (seção 3.12.1) e cujos resultados podem
ser vistos na figura 47.
-
FWJ*
livre
EcYdaL EcYfcN HpSmr
-
FWJ*
livre
EcYdaL EcYfcN HpSmr
A
EcYdaL
EcYfcN HpSmr
-
DF*
livre
EcYdaL
EcYfcN HpSmr
-
DF*
livre
B
EcYdaL EcYfcN
HpSmr
-
FS*
livre
Complexo
HpSmr/FS*
EcYdaL EcYfcN
HpSmr
-
FS*
livre
Complexo
HpSmr/FS*
C
Figura 47. Afinidade das proteínas Smr por diferentes substratos de DNA a 10 mM de KCl. As
concentrações de proteínas foram 50 nM, 250 nM e 500 nM respectivamente. A) Substrato: junção de
Holliday. B) Substrato: dupla fita de 34 mer. C) Substrato: fita simples de 34 mer
114
Através dos experimentos apresentados na figura 47 foi possível comprovar que mesmo
nas condições mais favoráveis de adstringência (10 mM KCl) as distintas Smr de E. coli não
interagem com nenhuma das estruturas ensaiadas, além de ratificar a ausência da atividade
nucleásica proposta para as três proteínas. Entretanto, a HpSmr mostrou uma leve interação com
o DNA fita simples o que só ocorre a 10 mM de KCl (fig. 47C). Foram realizados também
experimentos com DNA FS* 60 mer, cujos resultados foram iguais ao apresentado na figura 48.
--
HpSmr HpSmr
FS*
livre
10 mM KCl 150 mM KCl
Complexo
HpSmr/FS*
--
HpSmr HpSmr
FS*
livre
10 mM KCl 150 mM KCl
Complexo
HpSmr/FS*
Figura 48. Afinidade da HpSmr pelo DNA simples fita a 10 mM e 150 mM de KCl. Gel de retardo. As
concentrações de HpSmr utilizadas foram 50 nM, 150 nM, 450 nM e 1350 nM respectivamente. O substrato
utilizado foi DNA fita simples de 34 mer.
115
4.3.3. Caracterização Genética dos smr.
4.3.3.1. Avaliação da função do smr em H. pylori.
O domínio smr em H. pylori encontra-se formando parte do C-terminal da proteína MutS2
e, por isso, a análise da função específica deste domínio se realizou através de estudos com cepas
deficientes no C terminal (vide Caracterização Genética de hpmutS
Δ
smr, seção 4.2.2).
4.3.3.2. Avaliação da função de ydaL e yfcN em S. typhimurium.
Para analisar a importância fisiológica das proteínas Smr em Salmonella foi construída
uma série de duplos mutantes stydaL/styfcN (vide Material e Métodos, seção 3.19). Deve-se
destacar que nenhum destes duplos mutantes (nem os mutantes simples) apresentou diferença de
crescimento quando comparados com as respectivas cepas selvagens (dados não apresentados).
Diferentes combinações de duplos mutantes e cepas selvagens foram utilizadas nos experimentos
detalhados a seguir, segundo se indica em cada um deles.
4.3.3.2.1. Recombinação Intracromossômica.
Para determinar se a ausência das proteínas StYdaL e StYfcN causa algum efeito sobre a
recombinação intracromossômica foi determinada a perda, nas cepas listadas na tabela 28, da
resistência a cloranfenicol (Camacho & Casadesus, 2001; Youderian e col., 1988).
Cepa/Deficiência Duplicação
SV 5137 (selvagem) cysG 1573*Mud P*ilvA 2642
SV 5131 (ΔydaL, yfcN::Kan)
cysG 1573*Mud P*ilvA 2642
SV 5138 (sevagem) proA 692*Mud Q*purE 2164
SV 5132 (ΔydaL, yfcN::Kan)
proA 692*Mud Q*purE 2164
Tabela 28. Ce
p
as utilizadas nos ex
p
erimentos de recombina
ç
ão intracromossômica.
116
Os elementos Mud P e Mud Q (36 kb) são híbridos do fago P22 de Salmonella e do
colifago Mu (Youderian e col, 1988). Cada elemento, que inclui o marcador de resistência a Cm,
está composto por 2/3 do genoma do fago P22 contido entre terminações Mu. Nestas cepas, estes
elementos constituem a ponte entre duplicações do genoma (fig 49) e são exclusivamente
mantidos pela pressão de seleção do antibiótico (Camacho & Casadesús, 2001). Como
conseqüência, a estabilidade do elemento no genoma é diretamente proporcional à não
segregação das duplicações.
STM 3477 / STM 0322
(cysG / proA)
STM 3905 / STM 0534
(ilvA / purE)
1 2
STM 3905 / STM 0534
(ilvA / purE)
STM 3477 / STM 0322
(cysG / proA)
Mud-P22
STM 3477 / STM 0322
(cysG / proA)
STM 3905 / STM 0534
(ilvA / purE)
1 2
STM 3905 / STM 0534
(ilvA / purE)
STM 3477 / STM 0322
(cysG / proA)
Mud-P22
Figura 49. Duplicações cromossômicas. Diagrama explicativo das duplicações contidas nas cepas utilizadas
p
ara
a determinação da recombinação intracromossômica em S. typhimurium. cysG: sintase de sirohemo (siroheme
syntase, STM 3477) e ilvA: deaminase de treonina (threonine deaminase, STM 3905). Esta duplicação compreende
428 genes e aproximadamente 4,87 x 10
5
bases. proA: redutase de gama-glutamilfosfato (gamma-
glutamylphosphate reductase, STM 0322) e purE: subunidade catalítica da carboxilase fosforibosilaminoimidazol
(phosphoribosylaminoimidazole carboxylase, STM 0534). Esta duplicação compreende 212 genes e
aproximadamente 2,29 x 10
5
bases.
117
O resultado desta determinação é mostrado na figura 50.
% de Segregação
0
10
20
30
Selvagem
Δ
ydaLyfcN
Δ
ydaLyfcN
Selvagem
cysG*Mud P*ilvA
proA*Mud Q*purE
Figura 50. Determinação da segregação nas cepas mutantes em stydaL e styfcN. Cada valor corresponde a
média da segregação de 3.000 colônias e as barras de erro correspondem ao desvio padrão.
Os resultados obtidos nestes experimentos demonstraram que não existe diferença na
segregação das cepas selvagens e mutantes. Portanto, a ausência dos produtos dos genes smr não
afeta a recombinação intracromossômica (ou seja, no bloqueio/facilitação de
emparelhamento/troca de fita ou na resolução –atividade nlucleásica- das estruturas).
4.3.3.2.2. Recombinação Intercromossômica.
A recombinação intercromossômica foi testada mediante experimentos de transdução,
com fago P22. Utilizou-se um fragmento de DNA cromossômico onde um dos genes transferidos
118
(flhC
7
–regulador da biosintese flagelar) está parcialmente interrompido com um casette de
resistência a cloranfenicol. Os resultados se observam na tabela 29.
Cepa Cm
R
/10
8
bactérias
Selvagem 408 ± 54
ΔydaLyfcN
436 ± 109
Tabela 29. Determinação da freqüência de incorporação de DNA exógeno em S. typhimurium. Foram
utilizados a cepa LT2 selvagem e o duplo mutante isogênico. Os valores correspondem a 10 experimentos
independentes.
Segundo os resultados obtidos, entre as cepas selvagem e mutante não houve diferença na
incorporação do marcador e, portanto, da troca de material entre genes. Isto indica que a
recombinação intercromossômica (ou seja, no bloqueio/facilitação de emparelhamento/troca de
fita, ou na resolução –atividade nlucleásica- das estruturas) não se encontra afetada na ausência
das proteínas Smr.
4.3.3.2.3. Recombinação de Fago.
O fenômeno de infecção do fago P22 (natural para S. typhimurium) implica a replicação
do mesmo. Neste processo, existem dois passos de recombinação que são geneticamente
independentes das bactérias hospedeiras, porém, precisam da maquinaria bacteriana. As situações
onde, para o fago, são necessárias as proteínas bacterianas estão explicadas na figura 51.
7
STM 1924
119
Regiões repetitivas no fago
a b c
a b c
a’b’c’
a’b’c’
Regiões repetitivas no fagoRegiões repetitivas no fago
Vários bancos de dados genéticos anotam aos smr como sendo de origem fágica. Esta
informação gerou a hipótese de que as proteínas Smr poderiam atuar no processo de infecção por
fagos. Para verificá-la se analisou o título do fago P22 na cepa selvagem e duplo mutante para os
smr (tabela 30).
Como se observa na tabela 30, não houve diferença no título do fago entre uma e outra
cepa, o que indica que as proteínas StYdaL e StYfcN não estão envolvidas nos processos de
replicação/recombinação do fago P22.
Cepa Centros Infecciosos/10
8
bactérias
Selvagem 30 ± 6
ΔydaLyfcN
39 ± 6
Figura 51. Esquema explicativo das distintas etapas da iniciação da infecção pelo fago P22.
Tabela 30. Título do fago P22. Foram utilizados a cepa LT2 selvagem e o duplo mutante isogênico. Os
valores correspondem à média de 10 experimentos independentes.
Circularização pela recombinação Resolução pela recombinação
(quando o fago entra na bactéria,
precisa circularizar seu DNA para se replicar)
(na circularização podem se formar multímeros,
situação que também é resolvida pela recombinação)
Replicação por
círculo rodante
a b c
a b c
a’b’c’
a’b’c’
a b c
a b c
a’b’c’
a’b’c’
a b c
a b c
a’b’c’
a’b’c’
Replicação por
círculo rodante
Replicação por
círculo rodante
Circularização pela recombinação Resolução pela recombinação
(quando o fago entra na bactéria,
precisa circularizar seu DNA para se replicar)
(na circularização podem se formar multímeros,
situação que também é resolvida pela recombinação)
120
4.3.3.2.4. Reparação de DNA.
Sem descartar ainda a possível atividade nucleásica das proteínas Smr foi avaliada a
possibilidade das mesmas estarem envolvidas em algum processo de reparação do DNA. Para
isso foram testadas várias vias de reparo através da determinação da freqüência de mutagênese
espontânea e a sensibilidade e mutagênese a agentes genotóxicos físicos e químicos. Os
resultados são apresentados a seguir, na figura 52.
Cepa Rif
R
/10
-9
bactérias
Selvagem 4,09 ± 2,52
ΔydaLyfcN
6,17 ± 2,15
A
Figura 52. Avaliação do fenótipo espontâneo e induzido em S. typhimurium na ausência de stydaL/styfcN.
A) Freqüência de mutação espontânea Rif
S
→Rif
R
. Os valores correspondem a 10 experimentos independentes.
B) Sobrevivência a UVC e mutagênese induzida. A seta vermelha indica a DL10, ponto no qual se mediu a
mutagênese.
UVC (J/m
2
)
0 20 40 60 80 100
% de Sobreviventes
1e-7
-6
1e-5
1e-4
1e-3
-2
-1
+0
1e
1e
1e
1e
1
Rif
R
/10
8
bactérias
0
3e-7
5e-7
Selvagem
ΔydaLyfcN
ΔydaLyfcN/selvagem: 0,7
1e-7
Selvagem
ΔydaLyfcN
UVC (J/m
2
)
0 20 40 60 80 100
% de Sobreviventes
1e-7
-6
1e-5
1e-4
1e-3
-2
-1
+0
1e
1e
1e
1e
1
Rif
R
/10
8
bactérias
0
3e-7
5e-7
Selvagem
ΔydaLyfcN
ΔydaLyfcN/selvagem: 0,7
1e-7
UVC (J/m
2
)
0 20 40 60 80 100
% de Sobreviventes
1e-7
-6
1e-5
1e-4
1e-3
-2
-1
+0
1e
1e
1e
1e
1
Rif
R
/10
8
bactérias
0
3e-7
5e-7
Selvagem
ΔydaLyfcN
ΔydaLyfcN/selvagem: 0,7
UVC (J/m
2
)
0 20 40 60 80 100
% de Sobreviventes
1e-7
-6
1e-5
1e-4
1e-3
-2
-1
+0
1e
1e
1e
1e
1
Rif
R
/10
8
bactérias
0
3e-7
5e-7
Selvagem
ΔydaLyfcN
ΔydaLyfcN/selvagem: 0,7
UVC (J/m
2
)
0 20 40 60 80 100
% de Sobreviventes
1e-7
-6
1e-5
1e-4
1e-3
-2
-1
+0
1e
1e
1e
1e
1
Rif
R
/10
8
bactérias
0
3e-7
5e-7
Selvagem
ΔydaLyfcN
ΔydaLyfcN/selvagem: 0,7
1e-7
Selvagem
ΔydaLyfcN
B
121
Dose kJ/m
2
0246810
% de Sobreviventes
1e-7
1e-6
1e-5
1e-4
1e-3
1e-2
1e-1
1e+0
Selvagem
ΔydaLyfcN
1
Rif
R
/10
8
bactérias
0
1e-7
2e-7
3e-7
4e-7
Selvagem
ΔydaLyfcN
ΔydaLyfcN/selvagem: 0,09
UVB (kJ/m
2
)
Dose kJ/m
2
0246810
% de Sobreviventes
1e-7
1e-6
1e-5
1e-4
1e-3
1e-2
1e-1
1e+0
Selvagem
ΔydaLyfcN
1
Rif
R
/10
8
bactérias
0
1e-7
2e-7
3e-7
4e-7
Selvagem
ΔydaLyfcN
ΔydaLyfcN/selvagem: 0,09
UVB (kJ/m
2
)
C
ΔydalyfcN
Selvagem
Dietilsulfato (DES)
Selvagem: 1,86 ± 0,07 cm
ΔydaLyfcN: 1,79 ± 0,10 cm
ΔydalyfcN
Selvagem
Dietilsulfato (DES)
Selvagem: 1,86 ± 0,07 cm
ΔydaLyfcN: 1,79 ± 0,10 cm
D
Figura 52. Avaliação do fenótipo espontâneo e induzido em S. typhimurium na ausência de stydaL/styfcN.
C) Sobrevivência a UVB e mutagênese induzida. A seta vermelha indica a DL10, ponto no qual se mediu a
mutagênese. D) Sobrevivência à ação de agente alquilante (DES -10 μl-).
122
ΔydalyfcN
Selvagem
H
2
O
2
30% w/v
Selvagem: 3,67 ± 0,12 cm
ΔydaLyfcN: 3,66 ± 0,20 cm
ΔydalyfcN
Selvagem
H
2
O
2
30% w/v
Selvagem: 3,67 ± 0,12 cm
ΔydaLyfcN: 3,66 ± 0,20 cm
E
ΔydalyfcN
Selvagem
Acido Nalidixico 9 μg
Selvagem: 2,25 ± 0,14 cm
ΔydaLyfcN: 2,32 ± 0,22 cm
ΔydalyfcN
Selvagem
Acido Nalidixico 9 μg
Selvagem: 2,25 ± 0,14 cm
ΔydaLyfcN: 2,32 ± 0,22 cm
F
Figura 52. Avaliação do fenótipo espontâneo e induzido em S. typhimurium na ausência de stydaL/styfcN.
E) Sobrevivência a agente oxidante (H
2
O
2
-10 μl-). F) Sobrevivência a quinolona.
Através da freqüência de mutagênese espontânea para resistência a rifampicina se avaliou
o envolvimento no reparo de erros de emparelhamento ocorridos durante a replicação e que
escaparam da atividade corretiva da DNA polimerase. Com a exposição ao UVC (sensibilidade e
mutagênese induzida) se avaliou o envolvimento das proteínas Smr nos sistemas de reparo NER e
SOS (reparo pela recombinação homóloga); e com a exposição a UVB (sensibilidade e
mutagenêse induzida) se avaliou o possível papel das proteínas nos sistemas BER e NER. Já para
os agentes químicos se avaliou somente sensibilidade aos mesmos. Os fenômenos induzidos
123
foram alquilação, oxidação (ativação do sistema BER) e ação do acido nalidixico [quinolona de
primeira geração, que além de inibir a DNA girase (Takei e col., 2001), gera danos cuja correção
implica a ativação dos sistemas NER e SOS (Gocke, 1991; Clerch e col., 1992)]. A partir dos
resultados apresentados na figura 52 se observa que o duplo mutante ΔydaLyfcN não apresentou
nenhuma diferença em relação à cepa selvagem na sua freqüência de mutação espontânea. Em
relação à ação de agentes nocivos para o metabolismo do DNA, nenhum deles gerou maior ou
menor sensibilidade e/ou frequência de mutagênese induzida no duplo mutante comparado com a
cepa selvagem. Dentro do alcance destes resultados pode se dizer que as proteínas StYdaL e
StYfcN não possuem nenhuma função no reparo do DNA.
4.3.3.3. Avaliação da função do SMR em S. cerevisiae.
S. cerevisiae, como modelo experimental para o estudo do SMR, apresenta duas grandes
vantagens. A primeira é que o SMR não está vinculado às proteínas MSH (independente). A
segunda é que dentre a seis proteínas do tipo MutS1 que possui, a MSH4 e MSH5 [apesar de
serem anotadas como as mais distantes evolutivamente (Culligan e col., 2000)] são “estrutural e
funcionalmente” similares a MutS2 e as suas funções também se resumem à recombinação. Estas
duas características facilitam o estudo das funções de cada proteína [SMR e MSH4-MSH5
(MutS2-like?)], as quais neste caso, podem ser completamente separadas.
Para a análise da função fisiológica da SMR em levedura foram construídas cepas
mutantes no gene YPL199c e duplos mutantes SMR/MSH4 e SMR/MSH5 (vide Material e
Métodos, seção 3.21). Nenhum destes mutantes apresentou diferença de crescimento ao ser
comparado com a cepa selvagem (dados não mostrados). Diferentes combinações destas cepas
foram utilizadas na caracterização fisiológica, segundo o indicado em cada experimento.
124
4.3.3.3.1. Reparação do DNA.
Para determinar o possível envolvimento da SMR no reparo de DNA foram testadas
várias vias de reparo através da determinação da freqüência de mutagênese espontânea e a
sobrevivência a diferentes agentes genotóxicos (fig 53). Apesar de que o grupo epistático
MSH4/MSH5 não está ligado aos mecanismos de reparo, se decidiu incluir estes genes em alguns
testes para tentar evidenciar qualquer possível via alternativa vinculada ao reparo de DNA.
1
Can
A
0
1
2
3
Figura 53. Avaliação do fenótipo de mutagênese espontânea e induzida dos mutantes em levedura. A)
Freqüência de mutagênese espontânea para resistência a canavanina. Os valores correspondem a dez
experimentos independentes, e as barras de erro representam o desvio padrão.
R
/10 células
7
selvagem
smr
smr
MSH4
smr
MSH5
MSH4
MSH5
smr
MSH4
MSH4
MSH5
smr / selvagem: 0,78
/ selvagem: 0,70
/ selvagem: 0,81
/ selvagem: 0,81
smr
MSH5
125
1
Thr
+
/ 10
8
A resistência a canavania é adquirida por qualquer tipo de mutação [troca de base,
deleções, inserções (deslocamento da fase de leitura)] que ocorre naturalmente no gene CAN1
(arginina permease), o que permite o crescimento na presença do análogo tóxico da arginina, a
canavanina (Whelan e col., 1979). A determinação da freqüência de mutagênese espontânea para
resistência a canavanina (fig 53A) permitiu assinalar que não existe diferença na quantidade (e
aparentemente no tipo) de mutações ocorridas na ausência do gene YPL199c. Também
possibilitou descartar o conjecturado envolvimento do grupo epistático MSH4/MSH5 numa via de
reparo alternativa através da SMR.
A natureza da cepa RKY 3109 permitiu, igualmente, avaliar de forma específica o
deslocamento da fase de leitura em -1. Isto acontece através da reversão A7 para A6 no gene da
aspartocinase (hom3-10) possibilitando assim, a aquisição da auxotrofia para treonina. Este
processo está intimamente relacionado ao sistema de reparo de erros de emparelhamento, razão
pela qual, uma diferencia na reversão é o reflexo da atividade modificada desta via. O resultado
desta avaliação (figura 53B), indicou que o produto do gene YPL199c não está envolvido no
sistema de reparo de erros de emparelhamento.
Como se mencionou anteriormente, a luz ultravioleta C causa lesões do tipo dímeros de
pirimidinas, fotoprodutos 6-4 e outras, que são reparadas pelo sistema de excisão de nucleotídeos.
Com a exposição dos simples e duplos mutantes ao UVC foi possível avaliar os seus
envolvimentos no sistema de reparo NER. A partir do observado na figura 53C, o possível
envolvimento da SMR (conjuntamente com MSH4 e MSH5) no reparo NER pôde ser descartado.
O provável envolvimento da SMR na via de reparo BER foi testado através da exposição
ao agente metilante metilmetanosulfonato (MMS). Como mostrado na figura 53D, não existe
atividade aparente do produto do gene YPL199c neste tipo de reparo.
127
A radiação gama gera quebras simples no DNA. Estas quebras, no momento da
replicação, se transformam em duplas e o seu reparo depende da recombinação homóloga.
Através da exposição à radiação gama foi examinado o possível envolvimento da SMR (sozinha
ou associada a MSH4 e MSH5) no reparo pela recombinação. Os resultados apresentados na
figura 54E indicam que não existe função da SMR (sozinha ou associada) neste tipo de reparo.
4.3.3.3.2. Recombinação Meiótica.
As proteínas MSH4 e MSH5 são necessárias para manter o nível normal de crossing-over
meiótico (Ross-Macdonald & Roeder, 1994; Hollingsworth e col., 1995). Na ausência destas
proteínas os eventos de crossing-over são moderadamente reduzidos. Assim, no caso de
cromossomos que não segregam por que não efetuaram uma conveniente recombinação meiótica
na meiose I (não-disjunção), a inativação dos genes MSH4 e MSH5 agrava este fenômeno e
produz reduzida viabilidade de esporos. Os mutantes MSH4 possuem também interferência de
crossing-over significativamente reduzida, o que resulta em demorada e incompleta formação do
complexo sinaptonêmico (Novak e col., 2001).
A função da SMR na meiose foi estudada através dos efeitos da sua ausência na
viabilidade e distribuição de esporos (fig. 54). Estes parâmetros foram também determinados nos
duplos mutantes YPL199c/MSH4 para avaliar as possíveis funções relacionadas (epistasia,
sinergismo, aditividade, anulação do fenótipo, etc.)
128
12345
% de Tétrades
0
20
40
60
80
100
Selvagem/Selvagem
smr / smr
MSH4
/ MSH4
smr MSH4/ smr MSH4
4
+
: 0
-
3
+
: 1
-
2
+
: 2
-
1
+
: 3
-
0
+
: 4
-
Cruzamento Total de Esporos Esporos Mortos Percentagem de Viabilidade
selvagem/selvagem 420 30 92,9 %
SMR/SMR
576 57 90,1 %
MSH4/MSH4
328 183 55,8 %
SMR MSH4
SMR MSH4
288 163 56,6 %
Figura 54. Padrão de esporos viáveis nas tétrades dos diplóides isogênicos em RKY3109. Na parte superior da
figura pode ser visualizado o padrão de viabilidade onde + é vivo e – é morto. Na parte inferior é mostrada a
percentagem de viabilidade assim como o número de esporos analisados
O resultado apresentado na figura 54 mostra que o simples mutante YPL199c apresentou
um nível de recombinação meiótica similar à cepa selvagem tanto na viabilidade quanto na
distribuição dos esporos. Também se observa que não existiu diferença nos produtos dos
cruzamentos do mutante MSH4 e do duplo mutante YPL199c/MSH4, o que indica que as suas
funções não estão relacionadas. A partir destes resultados se descarta uma função direta ou
indireta do SMR na recombinação meiótica de S. cerevisiae.
129
5. Discussão e Perspectivas.
Helicobacter pylori é um patógeno humano com ampla distribuição mundial. A sua
relevância está relacionada às doenças graves (úlceras, câncer, etc.) geradas como resposta à
forte inflamação causada no hospedeiro através da longa persistência da bactéria (Ernst &
Gold, 2000). Numerosos estudos têm comprovado que H. pylori é um patógeno com grande
diversidade gênica (Tomb e col., 1997; Alm e col., 1999; Marshall e col., 1998; Suerbaum e
col., 1998; Achtman e col., 1999; Falush e col., 2003). A quantidade de variantes alélicas que
apresenta H. pylori dificulta a erradicação e também o tratamento da infecção crônica (Gottke
e col., 2000). A alta freqüência de transformação natural e a elevada taxa de mutação são
consideradas como as principais responsáveis dessa alta diversidade gênica. A análise
detalhada desses mecanismos ressalta um grande desconhecimento sobre o sistema de
reparação de erros de emparelhamentos (MMR). H. pylori possui um único homólogo para
este sistema, o gene mutS2 (Tomb e col., 1997; Alm e col., 1999), sendo que a função desta
subfamília de proteínas ainda é desconhecida.
Este trabalho descreve, pela primeira vez, a função de uma proteína MutS2. Através
de uma detalhada caracterização bioquímica e genética da MutS2 de H. pylori (Molloy, 2005)
evidenciou-se a sua relação com a diversidade gênica do patógeno. Além disto, o aprofundado
estudo do domínio C-terminal de MutS2, o SMR, permitiu elucidar algumas incógnitas e
coloca em discussão a sua presença ubíqua em todos os organismos.
5.1. HpMutS não está envolvida na reparação dos erros de emparelhamento
(MMR).
Um estudo prévio de três isolados de H. pylori mostrou que a inserção de um casette
Kan no nucleotídeo 1.953 (de 2.289 totais) do gene hpmutS não incrementa a freqüência de
mutação espontânea para resistência a rifampicina (Bjorkholm e col., 2001). Contudo, é
130
sabido que as cepas deficientes nos genes envolvidos no MMR, e em especial em mutS (~
78%), são particularmente abundantes nos isolados clínicos de bactérias patogênicas (LeClerk
e col., 1996). Como conseqüência, existem dois fatos desconhecidos que não podem ser
excluídos: a inativação de hpmutS já na cepa parental; e a certeza da anulação da função de
HpMutS no estudo realizado por Bjorkholm e col. em 2001 (devido ao tipo e localização da
interrupção e à natureza hiper-mutadora da bactéria).
Para verificar o envolvimento de HpMutS na reparação dos erros de emparelhamento
foram construídos mutantes por deleção completa do gene em diferentes cepas de H. pylori. A
tabela 21 mostra que a deficiência em hpmutS não confere fenótipo hipermutador às cepas.
Inclusive, não se detecta o incremento da inativação do gene rdxA, o que descarta a função
específica de MutS2 na correção dos deslocamentos do referencial de leitura por inserções
e/ou deleções.
A ausência da função MutS tradicional na HpMutS foi corroborada por
complementação, tanto positiva como negativa, em E. coli (tabela 22). Pelos dados da tabela
23 se constata a incapacidade de HpMutS para interferir com as outras funções do MMR (ex:
endonuclease). Estes resultados rejeitam a hipótese de que HpMutS possa atuar, igualmente,
na função de incisão do erro.
A falta de fenótipo hipermutador nas cepas hpmutS coincide com o descrito para as
MutS2 de Bacillus subtillis (Rossolillo & Albertini, 2001) e Pyrococcus furiosus (Vijayvargia
& Biswas, 2002). Os resultados obtidos neste trabalho indicam que HpMutS não está
envolvida no reconhecimento e/ou processamento dos erros de emparelhamento. Isto não é
surpreendente devido à falta, nas MutS2, do domínio N-terminal presente nas MutS1 e
responsável pelo reconhecimento dos erros.
131
5.2. HpMutS modula negativamente a integração de DNA exógeno.
Além da função de reparação pós-replicativa, as proteínas do sistema MMR
desempenham um importante papel na recombinação gênica, através da interação com os
erros de emparelhamento e “loops” formados no processamento dos intermediários da
recombinação (Friedberg e col., 2006). De acordo com o grau de homeologia das fitas, o
produto dessas interações pode resultar desde uma simples correção do erro até no aborto
completo do evento de recombinação (Stambuk & Radman, 1998). Como se mencionou na
introdução, em H. pylori eventos de transformação natural, que implicam incorporação e
integração (pela recombinação) de fragmentos de DNA exógeno, são altamente freqüentes.
Nas figuras 12 e 13 é mostrado claramente que a resposta à deficiência do produto do
gene hpmutS é um aumento na integração de DNA exógeno (confirmado por expressão em
trans de HpMutS, figura 14). Além disso, as diferenças nas eficiências de integração do
marcador em um e outro gene tornam evidente que a acuidade do incremento da
recombinação depende da região do cromossomo onde acontece o evento.
Ao contrário das MutS1, a função de HpMutS parece não estar relacionada ao grau de
homeologia entre as fitas de DNA. Para constatar este fato se utilizaram substratos
propagados em MC1061 que anularam ou, pelo menos igualaram, os efeitos dos sistemas de
modificação/restrição da bactéria receptora. Estes DNAs foram desenhados a partir dos
mosaicos hipervariáveis s e m presentes no gene vacA, com homologias de seqüência desde
100 % até 74 % e até uma inserção de 57 pb. O resultado desse experimento (fig 15)
confirmou que HpMutS inibe a integração do DNA no cromossomo e essa inibição não
depende do grau de divergência entre as seqüências.
Na avaliação da dependência do tamanho do DNA a ser incorporado (fig 16) se
comprovou que este fato não afeta a ocorrência do fenômeno (hpmutS / selvagem: 25).
Entretanto, se evidenciou a subestimação do incremento da recombinação nos experimentos
132
realizados com o marcador Gm. O casette Gm possui aproximadamente 850 pb (Material e
Métodos). Como se mencionou na introdução, o tamanho médio calculado dos fragmentos de
DNA incorporados em H. pylori é de 417 pb (Falush e col., 2003) Conseqüentemente, para
cada UFC obtida (resistente a Gm) se supõe a incorporação de, pelo menos, a integridade do
casette, que é o dobro do tamanho médio dos fragmentos incorporados. Isto explica a
diferença visualizada nos eixos que mostram as UFC/μg de DNA entre as figuras 12, 13 e 15
com a figura 16.
Apesar de não existirem diferenças entre a incorporação do DNA 100 % homólogo e
do DNA 85 % homólogo, talvez exista uma pequena omissão nesta caracterização, que é o
fato de não se ter seqüenciado os clones obtidos nos ensaios de integração de DNA. Esta
informação possibilitaria conhecer a localização precisa dos eventos de recombinação e
assim, determinar exatamente a heterologia entre as fitas recombinantes. De todos os modos,
a mínima homologia para a incorporação dos substratos derivados da cepa F8 foi de 85 %, e
mesmo assim não houve diferenças significativas na eficiência de integração no cromossomo
da X47-2AL (fig 15). Note-se que para a integração in vitro de um casette ao cromossomo de
H. pylori são necessárias, pelo menos, 300 pb homólogas a montante e a jusante do mesmo
(Dra Agnès Labigne, comunicação pessoal) e os fragmentos s e m utilizados neste trabalho
continham 400 pb.
5.3. HpMutS : proteína pura e multimérica. (purificação da proteína
recombinante.)
A purificação de HpMutS foi uma das etapas mais complicada e inesperadamente
informativa deste trabalho. A caracterização de uma atividade completamente desconhecida
foi a justificativa do grande esforço realizado para a obtenção, sem tratamentos drásticos (ex:
desnaturação) da HpMutS nativa.
133
A presença de uma proteína de fusão é imperativa na superprodução. Na avaliação das
estratégias de purificação tornou-se claro que uma proteína de fusão melhora a expressão e
aumenta a solubilidade, isto último, talvez pela diminuição do pI. Mesmo assim, com as
concentrações extremas de NaCl (500 mM) utilizadas nas lises, a solubilidade lograda para as
distintas proteínas de fusão variou entre 50 % e 60 %. A grande afinidade de HpMutS pelo
DNA pode ser a principal responsável por este comportamento. A utilização de maiores
concentrações de sal provavelmente teria aumentado a solubilidade da proteína, porém,
também teria incrementado enormemente o risco de solubilizar a fração de proteínas mal
enoveladas. Apesar dos cuidados tomados, é desconhecida a proporção de proteínas mal
enoveladas que foram solubilizadas com 500 mM de NaCl.
Os ensaios de corte das proteínas de fusão GST·HpMutS e MBP·HpMutS apontaram
para uma característica inesperada de HpMutS: a sua estrutura quaternária. Em cada tentativa,
o corte foi difícil de obter (muitas horas de tratamento, altas temperaturas, excesso de
protease, e outros) e a efetivação do mesmo sempre esteve marcada pela precipitação da
proteína de interesse (figura 18D). Estes eventos foram confirmados pela filtração molecular
realizada imediatamente após do corte com Fator Xa (figura 22). A partir destes
experimentos, se percebeu que talvez a cronologia dos fatos seja a precipitação da HpMutS e
posterior separação da fusão mediante o livre aceso ao sítio de corte por parte do Fator Xa.
Estes acontecimentos assinalavam, além de um enovelado da fusão que ocultaria o sítio da
protease, a provável formação de oligômeros por parte de HpMutS (figura 22).
Com a proteína HpMutS·His purificada se procurou a resposta às questões surgidas
nas purificações. A partir dos ensaios de separação zonal em gradiente de sacarose se
observou que:
a) embora as associações de 3 a 5 proteínas sejam favorecidas, a maior parte é um
multímero indefinido (figuras 23, 24 e 25). Note-se que a quantidade de HpMutS utilizada em
134
cada ensaio variou segundo as limitações impostas pelas condições testadas (adição de
cofatores e de proteínas controles em relação ao limite de carga no gradiente) e que para a
sedimentação a 200 mM de NaCl -figura 23- não pode se descartar a presença de associações
maiores que pentâmeros já que não se realizou a verificação por SDS-PAGE de todas as
frações.
b) a presença de possíveis cofatores como ATP, ADP e Mg
2+
não influencia, pelo
menos de forma significativa, a organização multimérica (figura 24) e
c) as forças moleculares mais importantes da associação entre as moléculas de
HpMutS são apolares (figura 25).
Estudos, por microscopia eletrônica em presença de DNA, serão os próximos passos
para a determinação da possível formação, por parte de HpMutS, de uma estrutura discreta
(ex: dímero, ou pentâmero, ou outra) ou multimérica globular ou filamentosa. Finalmente, a
cristalização de HpMutS·His é um projeto em andamento realizado em conjunto com o
Laboratório da Dra. Titia Sixma (Grupo de Biologia Estrutural da Divisão de Carcinogenêse
Molecular, Instituto do Câncer da Holanda, Holanda). Até o momento, foram numerosas as
dificuldades ocasionadas pelas propriedades intrínsecas da proteína, que impediram a
obtenção do cristal, contudo, a futura obtenção do mesmo outorgará informações inestimáveis
sobre a estrutura e forma de atuação da HpMutS.
5.4. HpMutS possui atividade ATPásica.
A presença de um suposto domínio de ligação a ATP sugeriu que HpMutS poderia
apresentar atividade ATPásica. Neste trabalho se evidenciou que, efetivamente, HpMutS
possui esta capacidade, que é absolutamente dependente da presença de magnésio (figuras
20A e B). A proteína mutante HpMutS G338R corroborou que esta propriedade é intrínseca
de HpMutS e não um produto de contaminação da purificação (figura 20D).
135
Segundo os valores calculados para os parâmetros que descrevem a reação enzimática
(Lineweaver-Burk e Hanes-Woolf), o poder catalítico calculado para HpMutS condiz com o
único dado disponível para MutS 2 na literatura (-PfuMutS-, Vijayvargia & Biswas, 2002). O
Kcat para HpMutS varia entre 24,8 e 30,52 μM de ATP hidrolisado/μM de HpMutS/min, e
para PfuMutS são valores equivalentes a 20,85 e 17,45 μM de ATP hidrolisado/μM de
PfuMutS/min na presença de Co
2+
e Mn
2+
respectivamente.
Embora existam diferenças entre as proteínas MutS2 e MutS1, a priori os valores dos
parâmetros cinéticos para a hidrólise de ATP não podem ser considerados como um ponto de
divergência, dada a grande variabilidade dos mesmos dentro da subfamília MutS1 (tabela 31)
e apesar disso, o tratamento semelhante (“qualitative agreement”) dos mesmos por parte de
alguns autores (Bjornson e col., 2000).
Organismo
Km
(
μ
M de
ATP)
Vmáx
(
μ
M de ATP
hidrolisado/min)
Kcat
(
μ
M de ATP
hidrolisado /
μ
M de MutS/min)
Referencia
S. typhimurium
6,7 0,34 0,26
Haber & Walker, 1991.
E. coli sem DNA
36,0 0,30 1,00
com MM
33,0 1,20 4,20
Bjornson e col., 2000.
E. coli His-tag
17,1 2,56 7,56
Worth e col., 1998
T. aquaticus
ND ND
25,8
Biswas & Hsieh, 1996.
S. cerevisiae
(Msh2p-Msh6p)
6,0
ND
ND
Alani e col., 1997
Humanos
(hMSH2 sem DNA
hMSH6 G/C
His-tag) G/T
45,8
53,2
71,2
ND
ND
ND
0,97
4,00
15,04
Gradia e col., 2000
sem DNA
0,4 0,025 0,5
Iaccarino e col., 1998.
Tabela 31. Valores de Km, Vmáx e Kcat de diferentes MutS1. Tabela originada a partir de revisão
bibliográfica, esta tese.
Igualmente ao descrito para alguns membros da família MutS (Blackwell e col.,1998;
Bjornson e col., 2000, Fukui e col., 2004), a atividade de hidrólise de HpMutS é estimulada
pela presença de DNA (figura 20C). Porém, não existe estimulação diferenciada pela presença
136
de um G/T na dupla fita (figura 21). Isto não é inesperado já que as MutS2 não possuem o
domínio de reconhecimento de erros de emparelhamento e coincide com o descrito por Fukui
e col para a MutS2 de T. thermophilus (Fukui e col., 2004)
Entretanto, existe a estimulação diferenciada da hidrólise que é gerada pelas estruturas
encontradas no momento da recombinação: forquilhas e junções de Holliday (figura 21).
Segundo os parâmetros calculados por ambos métodos, enquanto a presença de DNA fita
dupla resulta numa estimulação de 40 % a 60 % da atividade a presença de estruturas como
forquilhas e junções de Holliday resultam num incremento de 140 % a 180 % na capacidade
de hidrólise (tabela 25). Este comportamento diferencial indica que HpMutS é estimulada, na
sua atividade ATPásica, pelas transições das estruturas quiméricas de DNA constituídas por
fitas duplas e simples.
É interessante também o fato de que a constante de especificidade (Kcat/Km) se
mantêm estável na presença de forquilhas e FWJ, embora aumente a capacidade catalítica de
HpMutS. Como se evidencia na tabela 25, isto é o resultado do aumento do parâmetro Km.
Comportamentos deste tipo (incremento do Km pela presença de DNA) já foram descritos
para a hMSH2-hMSH6 (Gradia e col., 2000) e pareceriam ser característicos desta classe de
proteínas. Neste caso, o que é traduzido como uma diminuição na afinidade da HpMutS pelo
ATP (aumento de Km), significa menor estabilidade do complexo enzima-substrato, portanto,
maior velocidade. Isto parece indicar a ocorrência de uma troca alostérica, ou um bloqueio
parcial, ou algum outro evento ocasionado pela ação do cofator (DNA) que dificulta a
associação HpMutS-ATP, porém, que facilita a formação do produto (altos valores de Kcat e
Vmáx.). De todas as formas, estas especulações são prematuras e excedem o objetivo (e
capacidade) deste trabalho. Contudo, a partir deste ponto se abrem novas possibilidades para
explorar, em forma detalhada, as propriedades e o papel biológico da atividade ATPásica de
HpMutS.
137
5.5. HpMutS bloqueia a troca de fitas de DNA in vitro ligando preferencialmente
estruturas de DNA que mimetizam intermediários de recombinação.
As evidências obtidas a partir dos experimentos in vivo apontaram para uma atividade
“anti-recombinogênica” de HpMutS. Efetivamente, neste trabalho se mostram pela primeira
vez, os resultados bioquímicos que confirmam o bloqueio de transferência de fitas por parte
de HpMutS (figura 30B). Atualmente é conhecido que as proteínas MutS (MutS1
especificamente) inibem a troca de fitas, porém, somente a partir da existência de 3 % de
divergência na seqüência (Worth e col., 1994); sendo que esta permissibilidade é
drasticamente reduzida na presença de modificações como adutos de cis platina e O
6
-meG
[0,4 % a 0,8 % e 0,1 a 0,2 % respectivamente (Calmann & Marinus 2004; Calmann e col.,
2005a)]. Este trabalho foi o primeiro em estabelecer que um membro da subfamília MutS2
também inibe a troca de fitas de DNA, porém, este evento é independente do grau de
homologia entre as seqüências recombinantes (figuras 15 e 30B).
Os ensaios de troca de fitas não só responsabilizam diretamente a HpMutS pela
atividade anti-recombinogênica (enfatizada pelo inexistente senso de homologia / homeologia
/ heterologia da mesma), como também descartam a possibilidade que os efeitos encontrados
nos ensaios in vivo sejam resultado das implicações ou falhas de outros mecanismos (ex:
incorporação de DNA, M/R e outros) próprios da bactéria.
Os experimentos de ligação ao DNA esclareceram o alvo da HpMutS: alta
especificidade por forquilhas e estruturas de Holliday (figuras 28 e 29). Este fato é inédito
para uma proteína MutS bacteriana visto que, todas as evidências indicam que a MutS1 (junto
com MutL), inibe a migração da fita sem permitir a formação dos intermediários de
recombinação (Worth e col., 1994). Contudo, o mais surpreendente não é a diferença (em
termos de substrato) de HpMutS com as MutS1 bacterianas, senão a semelhança com os seus
homólogos eucarióticos, os complexos MSH4/5 e MSH2/6.
138
Ensaios de ligação a diferentes estruturas de DNA e competição com diferentes
substratos demonstraram que o complexo hMSH4/5 possui alta afinidade e especificidade por
forquilhas e estruturas de Holliday (Snowden e col., 2004). Os valores de Kd para FWJ e DF
apresentados pelo heterodímero hMSH4/5 são de 30 nM e 13,8 nM ± 3 nM respectivamente.
Estes dados são consistentes com os obtidos para HpMutS (57,5 nM para FWJ e 15,9 nM para
DF). Ensaios de digestão com DNAse I demonstraram, detalhadamente, que o complexo
hMSH4/5 se une ao centro da estrutura de Holliday (Snowden e col., 2004). Por outro lado,
foi evidenciado que o complexo MSH2/6 de S. cerevisiae é capaz de ligar, mais
eficientemente, estruturas de Holliday que duplas fitas contendo o emparelhamento G/T
(Alani e col., 1997). Embora o valor do Kd seja menor (0,5 nM para FWJ) as análises por
espectrometria de massa revelaram que 82 % do complexo MSH2/6 se localiza sobre a junção
da estrutura de Holliday (Marsischky e col., 1999). Os homólogos humanos (hMSH2/6)
também ligam preferencialmente estruturas de DNA ramificadas (forquilhas e FWJ) com
valores comparáveis ao complexo hMSH4/5 (Snowden e col., 2004). Apesar da semelhança
de substrato, deve-se observar que o tipo de ligação e o “objetivo” da mesma são diferentes
para um e outro complexo. O deslocamento de hMSH4/5 (FWJ* por FWJ) é limpo e o
objetivo da sua ligação à estrutura de Holliday é estabilizar e preservar os crossing-over
durante a prófase da meiose I (Snowden e col., 2004). Entretanto, no deslocamento de
hMSH2/6 (FWJ* por FWJ) existem múltiplas estruturas intermediárias e a finalidade da
ligação de MSH2/6 (de levedura) à FWJ é o incremento da atividade de corte da T4 endo VIII
e da T7 endo I, e assim, a interrupção dos crossing-over (Marsischky e col., 1999).
Os resultados bioquímicos do presente trabalho não conseguiram, pela impossibilidade
da análise dos deslocamentos de FWJ* por FWJ em geles de retardo, definir qual é o tipo de
ligação de HpMutS. É suspeitado que esta dificuldade esteja intimamente relacionada ao grau
139
de multimerização da proteína. Contudo, futuros estudos de “footprinting” e microscopia
eletrônica podem permitir o esclarecimento desta propriedade de HpMutS.
Por outro lado, a tendência indicada pelas evidencias obtidas neste trabalho (fenótipo
dos mutantes H. pylori mutS, inibição da transferência de fitas, e outros) é a de classificar a
HpMutS no grupo definido pelo complexo MSH2/6 (interrupção dos crossing-over). A partir
disto, a presença de HpMutS pode ser considerada como uma “desvantagem” para H. pylori
dada a restrição da troca gênica entre indivíduos. Porém, recentes estudos in vivo
demonstraram que a presença de HpMutS é fundamental para a colonização durante uma co-
infecção (Pablo Radicella, comunicação pessoal). Estes ensaios determinaram que, apesar da
cepa H. pylori mutS colonizar com êxito os estômagos de camundongos, quando deve
compartilhar este evento com a cepa selvagem, o mutante é rapidamente selecionado em
forma negativa (mesmo quando presente numa proporção de 9 mutantes:1 selvagem). Este
fato torna-se mais polemico ainda quando se considera que a função de HpMutS está restrita à
integração de DNA exógeno (aparentemente, HpMutS não intervêm em reparo
recombinacional nem em recombinação intracromossômica) (Kang e col., 2005). Isto deflagra
a controvérsia sobre a vantagem da presença de uma proteína MutS2 num organismo
especializado em elevada “promiscuidade” gênica.
5.6. HpMutSΔSmr: proteína pura e ativa.
Uma parte dos objetivos deste trabalho foi o estudo da importância do domínio Smr na
HpMutS e uma das estratégias adotada foi a caracterização da proteína mutante
HpMutSΔSmr.
Os passos de purificação, previamente estabelecidos para a proteína selvagem, foram
reproduzidos para a HpMutSΔSmr·His. Apesar da falta de 75 aminoácidos do C-terminal, a
140
proteína mutante apresentou as características de purificação e os perfis de eluição similares a
Uma das razões que possibilita justificar esta insuficiência é a afinidade de
HpMutSΔSmr pelas estruturas de DNA. Nos experimentos realizados em baixa concentração
de sal (10 mM KCl) a proteína mutante demonstrou menor afinidade que a selvagem (figura
33). Nas concentrações de 50 nM e 100 nM de proteína a diferença de afinidade, a favor da
HpMutS, foi de aproximadamente 25 %, que diminuiu para 10 % e se manteve estável nas
concentrações maiores (150 nM e 300 nM -figura 33B-). Note-se que nos ensaios de troca de
fitas (cuja concentração em sais também é baixa, vide Material e Métodos) foram utilizadas
concentrações de proteína a partir de 210 nM. Associando a diferença de afinidade com as
concentrações de proteína testadas é razoável explicar a diminuição num 10 % na atividade
anti-recombinagênica pela diminuição de 10 % da afinidade à estrutura de Holliday.
Entretanto, esta pequena diferença parece não refletir o real comportamento da
HpMutSΔSmr. Quando foram utilizadas maiores concentrações de sal (150 mM KCl, valor
mais próximo às concentrações fisiológicas) nos ensaios de ligação ao DNA a afinidade da
HpMutSΔSmr diminuiu drasticamente, não só pela estrutura de Holliday, mas também pelo
DNA em geral (figuras 35, 36 e 37).
Na avaliação das propriedades da HpSmr, não se encontraram evidências de que esta
proteína, por si mesma, atue na transferência de fitas catalisada por RecA (figura 46). Porém,
em baixas concentrações de sal e só nessas condições, a HpSmr purificada apresentou uma
ligeira e inesperada afinidade pelo DNA simples fita (figura 47C e 48).
Das evidências apresentadas por este trabalho é possível resgatar que a presença do
domínio Smr na HpMutS é parte responsável da afinidade da proteína ao DNA. Como foi
descrito para a MutS1 de E. coli os últimos 53 aminoácidos são os encarregados da formação
de tetrâmeros, associação considerada como forma ativa da proteína e principal responsável
pela prevenção da recombinação (Calmann e col., 2005b). O que constitui o fragmento C-
terminal da MutS1 é uma parte mais central da HpMutS e está presente na HpMutSΔSmr,
142
porém, se é equivalente em função, talvez no caso das MutS2 seja imperativa a presença de
um fragmento protéico posterior (neste caso o Smr) para uma correta funcionalidade. Futuros
estudos, dentre eles o grau de multimerização da HpMutSΔSmr e a análise do cristal da
HpMutS, são necessários para sustentar esta hipótese. Por outro lado, o fenótipo de
recombinação de H. pylori mutSΔsmr é a resposta da atividade do domínio Smr, tema que
será discutido a seguir.
5.8. O fenótipo de H. pylori mutS
Δ
smr ainda é uma incógnita.
Os mutantes parciais de mutS (mutSΔsmr) em H. pylori foram construídos com
especial cuidado para que a deleção efetuada não interferisse em absolutamente nenhuma
função além da visada (vide Material e Métodos). Com base nos resultados dos ensaios in
vitro, era esperado, para os mutantes parciais, um fenótipo de recombinação intermediário
entre a bactéria selvagem e o mutante em mutS. Porém, a resposta obtida foi similar a dos
mutantes totais, a integração de DNA exógeno foi até maior por parte de alguns clones (figura
38). O caráter contraditório e pouco estável do fenótipo medido ocasionou uma extensa
avaliação que revelou a origem artefactual do mesmo: problema na expressão da
HpMutSΔSmr (figura 39). A falta de regularidade e os níveis significativamente menores de
expressão foram detectados em todos os clones H. pylori mutSΔsmr, (os que por sua vez,
tinham sido verificados por seqüenciamento e classificados como corretos com cassette em
fase e sem modificações nas regiões a montante e jusante). Ainda é desconhecido o motivo
deste distúrbio, no entanto, não parece ser exclusivo para HpMutS. O estudo do mutante
parcial mutSΔ800 de E. coli (cujo produto é a proteína mencionada no ponto anterior da
discussão como a deficiente nos últimos 53 aminoácidos) evidenciou que a ausência do C-
terminal, apesar de não possuir nenhum dos sítios ativos, anula todas as atividades da proteína
(Calmann e col., 2005c). Interessantemente, o fenótipo mutS apresentado pela mutSΔ800 é
143
atribuído, em parte, ao decréscimo dos níveis celulares da MutSΔ800 quando comparados
com os da cepa selvagem (problemas na expressão e/ou estabilidade da proteína mutante).
Para contornar esta situação, estão em andamento as construções que permitirão a
expressão em trans da HpMutSΔSmr em cepas hpmutS e assim verificar o fenótipo numa
situação mais controlada. Apesar do C-terminal da HpMutS não ser seqüencialmente similar
ao da MutS1, já foram encontradas duas situações semelhantes pelas ausências dos mesmos (o
fenótipo e o defeito na expressão da proteína mutante in vivo). É por isso que convém
salientar que, à diferença da atividade in vitro da MutSΔ800 de E. coli, a complementação em
trans (tanto com plasmídeos multicópias quanto com plasmídeos de cópia simples) das cepas
E. coli mutS não restaura as atividades dependentes da formação de tetrâmeros (ou seja, a
prevenção da recombinação) (Calmann e col., 2005c).
Se realmente as extrapolações entre MutS1 e MutS2 são válidas, a expressão da
HpMutSΔSmr em cepas hpmutS não garante a fiel determinação do fenótipo conferido pela
ausência do domínio smr; o que enfatiza, por outro lado, a importância do aprofundamento
dos estudos bioquímicos e a obtenção do cristal da HpMutS.
5.9. Smr: atividade diferenciada em cada organismo ou cicatriz evolutiva ?
Os genes smr são ubíquos, altamente conservados, encontram-se num contexto gênico
intrigante e são praticamente desconhecidos. Para as duas proteínas Smr descritas até o
momento, sendo uma delas o C-terminal da MutS2 de T. thermophilus (TtMutS2, TtSmr), foi
demonstrada uma forte atividade nucleásica (Watanabe e col., 2003; Fukui e col., 2007).
Apesar de nunca ter sido detectada uma atividade nucleásica na HpMutS ou na HpSmr, a
grande homologia entre os domínios e as possíveis diferenças nas condições experimentais
utilizadas geraram a necessidade da verificação dessa atividade.
144
Os resultados bioquímicos obtidos neste trabalho evidenciaram a ausência da atividade
nucleásica por parte do produto do domínio smr do hpmutS (figura 45). Além disto, as
proteínas codificadas pelos genes smr de E. coli (utilizados como parâmetros de comparação,
já que ecydaL e ecyfcN são genes independentes), também não demonstraram capacidade
nucleásica (figura 45). Comparando o contexto gênico de cada proteína se observa que T.
thermophilus possui as duas subfamílias de proteínas MutS representadas, o sistema MMR
funcional e aparentemente é MutL a encarregada de potencializar a atividade nucleásica do
domínio Smr da TtMutS2 (Fukui e col., 2004). Por outro lado, E. coli possui a MutS1 e o
MMR funcional, porém, carece de MutS2. Por último, H. pylori carece de MutS1 e
aparentemente também do sistema MMR, porém, a única presença é a da MutS2. Talvez,
nesta quimera de presenças e ausências esteja explicada, pelo menos em parte, a razão das
diferenças de função de uma mesma proteína.
As proteínas Smr recombinantes (de H. pylori e de E. coli) não apresentaram
interferência na transferência de fita mediada por RecA (figura 46). Quanto à ligação ao
DNA, foi demonstrado que a TtSmr se liga a DNA DF (20 pb) e conforme o aumento da sua
concentração é capaz de ligar DNA FS (Fukui e col., 2007). Neste trabalho se comprovou
que, somente a HpSmr liga DNA sendo este FS. Porém, esta afinidade foi detectada somente
em baixas concentrações de sal (atividade artefactual?). As proteínas EcYdaL e EcYfcN,
apesar dos seus respectivos pI (~ 9), não apresentaram afinidade por nenhum substrato de
DNA e em nenhuma condição testada (figura 48).
Como os ensaios bioquímicos não evidenciaram nenhuma atividade das Smr que ajude
a entender as funções dos smr, se optou pela caracterização genética dos mesmos. Esta
escolha foi, mais incerta que a anterior, devido à completa ausência de trabalhos sobre os
fenótipos a testar (as publicações de TtMutS e TtSmr são puramente bioquímicas). Contudo,
devido à estreita relação entre o smr e as MutS2 (sendo que HpMutS inibe a recombinação), à
145
significativa toxicidade demonstrada durante as clonagens e purificações das proteínas Smr de
E. coli e levedura (vide Resultados, seções 4.3.2.2 e 4.3.2.3) e a “atividade nucleásica”
descrita para dois ortólogos (Watanabe e col., 2003; Fukui e col., 2007), se testaram o
possível envolvimento destas proteínas nas vias de recombinação e reparo do DNA (este
último por ser o processo com maior chance de evidenciar uma atividade nucleásica).
Em H. pylori o monitoramento dos fenótipos está sujeito à complementação de
hpmutS por HpMutSΔSmr.
No contexto gênico procariótico onde os smr são genes independentes: as avaliações
da recombinação intracromossômica (fig 50) e intercromossômica (tabela 29) com os duplos
mutantes demonstraram que os produtos dos genes smr não interferem nestes processos
(confirmando os resultados obtidos in vitro). Os dados obtidos da recombinação do fago
mostraram que, apesar das proteínas estarem anotadas como de orígem fágica, pelo menos até
agora, não foi encontrada a relação com estes processos (tabela 30). Este trabalho também
demonstrou que EcYdaL e EcYfcN não possuem atividade no processamento do DNA fora da
recombinação, (figura 52).
S. cerevisiae foi o modelo experimental utilizado para avaliar a atividade do SMR
(ΔSMRΔMSH4 / ΔSMRΔMSH5) de levedura. A interpretação destes resultados não é direta já
que existem numerosas vias de “backup” para cada sistema, porém, para nenhum dos eventos
testados se encontraram indícios de que a proteína SMR estaria envolvida (figuras 53 e 54).
Este trabalho demonstrou claramente o que as proteínas Smr não fazem. Em H. pylori
o domínio smr está envolvido na expressão e/ou estabilidade e/ou multimerização de
HpMutS, porém, certamente não é uma nuclease. Em E. coli as proteínas Smr não são
nucleases. Em S. typhimurium as proteínas Smr não estão envolvidas nos processos de
recombinação (bacteriana e/ou fágica), nem no reparo do DNA. Em S. cerevisiae a proteína
SMR não participa diretamente das vias tradicionais de reparo do DNA e também não está
envolvida na recombinação gênica dentro da via de interferência.
5.10. Modelo proposto para a função de HpMutS.
A partir dos dados obtidos neste trabalho foi possível propor um modelo, embora
prematuro, da função de HpMutS.
Neste modelo devem se distinguir dois aspectos: um real, que está fundamentado pelas
evidências experimentais aqui apresentadas, e outro especulativo composto por hipóteses
formadas mediante inferências das evidências experimentais deste trabalho.
Domínio I (união ao DNA)
Domínio II (ATPase)
Domínio III (multimerização e
reconhecimento de F e FWJ)
Domínio IV (smr)
Considerando a HpMutS como:
Domínio I (união ao DNA)
Domínio II (ATPase)
Domínio III (multimerização e
reconhecimento de F e FWJ)
Domínio IV (smr)
Considerando a HpMutS como:
O cromossomo de H. pylori é alvo contínuo de agentes exógenos e endógenos que o
danificam, como espécies reativas de oxigênio (ROS) originadas pelo hospedeiro e pelo
próprio metabolismo, o pH do ambiente, e outros (fig. 55 –fontes de variabilidade-). A esses
danos devem ser somados os erros de emparelhamento deixados atrás pela DNA polimerase
147
III (fig. 55). Os distintos sistemas de reparação do DNA presentes em H. pylori são os
encarregados de contra-atacar esses danos e erros. Entretanto, a aparente ausência de
importantes componentes destes sistemas, até mesmo de sistemas completos como o de
MMR, dão como resultado uma freqüência de mutação espontânea de 1x10
-4
(fig. 55-2-). Por
outro lado, a transformação natural é também uma fonte importante da variabilidade gênica de
H. pylori. Como descrito na introdução, o DNA exógeno é incorporado na bactéria pelo
sistema ComB e depois de passar pelos sistemas M/R, é processado pelas proteínas
envolvidas na iniciação da recombinação gerando, assim, o extremo 3’ invasor. Após
associação da proteína RecA, o DNA está preparado para a sua integração no cromossomo
(fig. 55). Entretanto, a proteína HpMutS estaria modulando negativamente esse evento, de
modo a limitar essa fonte de diversidade gênica em H. pylori (fig 55-1-).
148
149
Cromossomo
de H. pylori
pH acido
ROS
Sistemas de
Reparação
do DNA
Outros
agentes
DNA
Pol III
DNA
Pol III
Sistema
ComB
Sistema
ComB
Sistema
ComB
Fontes de variabilidade gênica em
Fontes de variabilidade gênica em
H. pylori
H. pylori
Sistemas
M/R
DNA
exógeno
1A
Membranas externa e interna
HpMutS
HpMutS
HpMutS
RecA
Reconhecimento
indireto ?
Reconhecimento
Direto ?
1B
Modelo proposto para a função de
Modelo proposto para a função de
HpMutS
HpMutS
Deslocamento
de RecA?
helicase (UvrD)
exonuclease (XseA)
outras proteínas?
Aborto do evento de recombinação
Figura 55. Fontes de variabilidade gênica em H. pylori e modelo proposto para a função de
HpMutS. As principais fontes de variabilidade de H. pylori são a alta taxa de mutação, devido
principalmente a deficiências em importantes componentes dos sistemas de reparação do DNA (2),
combinada com uma elevada freqüência de transformação natural. O modelo proposto para a função
de HpMutS compreende vários passos. Passo 1A. HpMutS (provavelmente associada em
tetrâmeros
a
) monitoraria constantemente a integridade do DNA
b
, de modo a não afetar
processos como replicação e transcrição (talvez possa existir um equilíbrio de união / não
união).(a) formas favorecidas (pentâmeros a trímeros) nos gradientes de sacarose.(
b
) grande
afinidade da HpMutS pelo DNA (demonstrado na maioria dos experimentos deste trabalho) e
expressão constitutiva da proteína, com uma presença calculada em 2.000 moléculas por bactéria
(Dra. Stephanie Marsin, Laboratoire de l’Instabilite Genetique, CEA, França. Comunicação
pessoal). Passo 1B. No momento da invasão do DNA exógeno, no DNA receptor se forma um
D-loop. Essa estrutura apresenta transições de DNA simples fita/dupla fita. Estas forquilhas
seriam reconhecidas direta ou indiretamente pela HpMutS. A estrutura de DNA estimularia
a atividade de hidrólise de ATP por HpMutS, o que, por sua vez, poderia gerar uma
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163
7. Anexo I.
########################################
# Program: needle
# Align_format: srspair
# Report_file: /ebi/extserv/old-work/needle-20070309-18005749640390.output
########################################
#=======================================
# Aligned_sequences: 2.
# 1: EG10625 Length: 1122
# 2: HP0621 Identity: 154/1122 (13.7%)
# Matrix: EBLOSUM62 Similarity: 252/1122 (22.5%)
# Gap_penalty: 10.0 Gaps: 629/1122 (56.1%)
# Extend
_
penalty: 0.5 Score: 216.0
#=======================================
EG10625 1 MSAIENFDAHTPMMQQYLRLKAQHPEILLFYRMGDFYELFYDDAKRASQL 50
HP0621 1 0
EG10625 51 LDISLTKRGASAGEPIPMAGIPYHAVENYLAKLVNQGESVAICEQIGDPA 100
HP0621 1 0
EG10625 101 TSKGPVERKVVRIVTPGTISDEALLQERQDNLLAAIWQDSKGFGYATLDI 150
HP0621 1 0
EG10625 151 SSGRFRLSEPADRETMAAELQRTNPAELLYAEDFAEMSLIEGRRGLRRRP 200
HP0621 1 0
EG10625 201 LWEFEIDTARQQLNLQFGTRDLVGFGVENAPRGLCAAGCLLQYAKDTQRT 250
HP0621 1 0
EG10625 251 TLPHIRSITMEREQDSIIMDAATRRNLEITQNLAGGAENT----LASVLD 296
|..|.:|:|..| |.....|| |...||
HP0621 1 MSDAPKRSLNPT--LMMNNNNTPPKPLEESLD 30
EG10625 297 CTVTPMGSRMLKRWLHM------PVRDTRVLLER--QQTIGALQDFTAGL 338
||.::.: ..||| :.||. :||...|.:..|..
HP0621 31 ----------LKEFIALFKTFFAKERDT-IALENDLKQTFTYLNEVDAIG 69
EG10625 339 QPVLRQVGDLERILARLA-LRT----------ARPRDLARMRHAFQQLPE 377
.|..:.|.:.:.|:.:|. |.| .|...:..:::||:....
HP0621 70 LPTPKSVKESDLIIIKLTKLGTLHLDEIFEIVKRLHYIVVLQNAFKTFTH 119
EG10625 378 LR--AQLETVDSAPVQALREKMGEFAELRDLLERAIIDTPPVLVRDGGVI 425
|: .:|..:...|. ..||: |:.| |.|.|
HP0621 120 LKFHERLNAIVLPPF------------FNDLI--ALFD-------DEGKI 148
EG10625 426 ASGYNEELDEWRALADGATDYLERLE----------VRERERTG--LDT- 462
..|.| |..|...:.|.||: .|.:|... :||
HP0621 149 KQGAN-------ATLDALNESLNRLKKESVKIIHHYARSKELAPYLVDTQ 191
EG10625 463 -----------LKVGFN-AVHGYYIQISRGQSHLAPINYMRRQTLKNAER 500
||.||: |:.|..::.| .|...
HP0621 192 SHLKHGYECLLLKSGFSGAIKGVVLERS-----------------ANGYF 224
EG10625 501 YIIPELKEYEDKVLTSKGKAL-------------ALEKQLYEELFDLLLP 537
|::||..:...:.:...|..: :|:|.| ||
HP0621 225 YLLPESAQKIAQKIAQIGNEIDCCIVEMCQTLSHSLQKHL---LF----- 266
EG10625 538 HLEALQQSASALAELDVLVNLAERAYTLNYTCPTFIDKPGIRITEGRHPV 587
|:.|.:....|..|...:|.| :||.|.:..|:|..|..| :....||
HP0621 267 -LKFLFKEFDFLDSLQARLNFA-KAYNLEFVMPSFTQKKMI-LENFSHP- 312
EG10625 588 VEQVLNEPFIANPLNLSPQRRMLIITGPNMGGKSTYMRQTALIALMAYIG 637
:|.|| .||||..::.||.:||.|.||| |.:.::.|.| |::.
HP0621 313 ---ILKEP---KPLNLKFEKSMLAVTGVNAGGK-TMLLKSLLSA--AFLS 353
EG10625 638 SYVPAQKVE-----IGPIDRIFTRVGAADDLASGRSTFMVEMTETANILH 682
.::...|:. |.....|...:....:.|:..|||...|.:.:.:|
HP0621 354 KHLIPMKINAHHSIIPYFKEIHAIINDPQNSANNISTFAGRMKQFSALL- 402
EG10625 683 NATEYSLVLMDEIGRGTSTYDGLSLAWACAENLANKIKALTLFATHYFEL 732
:.|..|:.:|||..||...:..||.....|.|..:...: :..||:..|
HP0621 403 -SKENMLLGVDEIELGTDADEASSLYKTLLEKLLKQNNQI-IITTHHKRL 450
164
EG10625 733 TQL---PEKMEGVANVHLDALEHGDTIAFMHSVQDGAASKSYGLAVAALA 779
:.| .:::|.:|.:: |..:...|..|: .|...|||....|...
HP0621 451 SVLMAENKEVELLAALY-DEEKERPTYTFL----KGVIGKSYAFETALRY 495
EG10625 780 GVPKEVIKRAR----QKLRELESISPNAAATQVDGTQMSLLSVPEETSPA 825
|||..:|::|: :...:|..:..|::|.:.:..|.: |....|
HP0621 496 GVPHFLIEKAKTFYGEDKEKLNVLIENSSALERELKQKN-----EHLENA 540
EG10625 826 VEALENLDPDSLTPRQALEWIYRLKSLV 853
::..|.|....|...:..:.|:..|.|.
HP0621 541 LKEQEYLKNAWLLEMEKQKEIFHNKKLELEKSYQQALNILKSEVASKDTS 590
EG10625 854 853
HP0621 591 SMHKEIHKASEILSKHKTNQEIPQIITNFQANEKARYKNESVLIVQILDK 640
EG10625 854 853
HP0621 641 GYYWIETELGMRLKAHGSLLKKIQKPPKNKFKPPKTTIPKPKEASLRLDL 690
EG10625 854 853
HP0621 691 RGQRSEEALDLLDAFLNDALLGGFEEVLICHGKGSGILEKFVKEFLKNHP 740
EG10625 854 853
HP0621 741 KVVSFSDAPINLGGSGVKIVKL 762
#---------------------------------------
#---------------------------------------
Figura 56. Comparação das seqüências protéicas de MutS de E. coli (EG10625 de http://ecogene.org/) e
HpMutS (HP0621 de
http://cmr.tigr.org/) pelo EMBOSS Pairwise Alignment Algorithms. Resultado obtido
pelo método NEEDLE que contempla o alinhamento completo das proteínas. Em verde: domínio de
reconhecimento de bases desemparelhadas da MutS 1, em vermelho: domínio Smr da MutS 2. Em lilás descacam-
se tanto o tamanho das seqüências alinhadas como as percentagens de identidade, similaridade e lacunas (gaps).
Em amarelo destaca-se o motivo de ligação a ATP presente em ambas proteínas.
165
########################################
# Program: water
# Align_format: srspair
# Report_file: /ebi/extserv/old-work/water-20070309-17361057687278.output
########################################
#=======================================
# Aligned_sequences: 2
# 1: EG10625 Length: 597
# 2: HP0621 Identity: 132/597 (22.1%)
# Matrix: EBLOSUM62 Similarity: 228/597 (38.2%)
# Gap_penalty: 10.0 Gaps: 163/597 (27.3%)
# Extend_penalty: 0.5 Score: 219.5
#=======================================
EG10625 347 DLERILARLALRTARPRDLARMRHAFQQLPELRAQLETVDSAPVQALRE- 395
||:..:|......|:.||...:.:..:|......:::.:.....::::|
HP0621 30 DLKEFIALFKTFFAKERDTIALENDLKQTFTYLNEVDAIGLPTPKSVKES 79
EG10625 396 --------KMG--EFAELRDLLER------------------------AI 411
|:| ...|:.::::| ||
HP0621 80 DLIIIKLTKLGTLHLDEIFEIVKRLHYIVVLQNAFKTFTHLKFHERLNAI 129
EG10625 412 IDTPP------VLVRDGGVIASGYNEELDEWRALADGATDYLERLE---- 451
: .|| .|..|.|.|..|.| |..|...:.|.||:
HP0621 130 V-LPPFFNDLIALFDDEGKIKQGAN-------ATLDALNESLNRLKKESV 171
EG10625 452 ------VRERERTG--LDT------------LKVGFN-AVHGYYIQISRG 480
.|.:|... :|| ||.||: |:.|..::.|
HP0621 172 KIIHHYARSKELAPYLVDTQSHLKHGYECLLLKSGFSGAIKGVVLERS-- 219
EG10625 481 QSHLAPINYMRRQTLKNAERYIIPELKEYEDKVLTSKGKAL--------- 521
.|...|::||..:...:.:...|..:
HP0621 220 ---------------ANGYFYLLPESAQKIAQKIAQIGNEIDCCIVEMCQ 254
EG10625 522 ----ALEKQLYEELFDLLLPHLEALQQSASALAELDVLVNLAERAYTLNY 567
:|:|.| || |:.|.:....|..|...:|.| :||.|.:
HP0621 255 TLSHSLQKHL---LF------LKFLFKEFDFLDSLQARLNFA-KAYNLEF 294
EG10625 568 TCPTFIDKPGIRITEGRHPVVEQVLNEPFIANPLNLSPQRRMLIITGPNM 617
..|:|..|..| :....|| :|.|| .||||..::.||.:||.|.
HP0621 295 VMPSFTQKKMI-LENFSHP----ILKEP---KPLNLKFEKSMLAVTGVNA 336
EG10625 618 GGKSTYMRQTALIALMAYIGSYVPAQKVE-----IGPIDRIFTRVGAADD 662
||| |.:.::.|.| |::..::...|:. |.....|...:....:
HP0621 337 GGK-TMLLKSLLSA--AFLSKHLIPMKINAHHSIIPYFKEIHAIINDPQN 383
EG10625 663 LASGRSTFMVEMTETANILHNATEYSLVLMDEIGRGTSTYDGLSLAWACA 712
.|:..|||...|.:.:.:| :.|..|:.:|||..||...:..||.....
HP0621 384 SANNISTFAGRMKQFSALL--SKENMLLGVDEIELGTDADEASSLYKTLL 431
EG10625 713 ENLANKIKALTLFATHYFELTQL---PEKMEGVANVHLDALEHGDTIAFM 759
|.|..:...: :..||:..|:.| .:::|.:|.:: |..:...|..|:
HP0621 432 EKLLKQNNQI-IITTHHKRLSVLMAENKEVELLAALY-DEEKERPTYTFL 479
EG10625 760 HSVQDGAASKSYGLAVAALAGVPKEVIKRAR----QKLRELESISPNAAA 805
.|...|||....|...|||..:|::|: :...:|..:..|::|
HP0621 480 ----KGVIGKSYAFETALRYGVPHFLIEKAKTFYGEDKEKLNVLIENSSA 525
EG10625 806 TQVDGTQMSLLSVPEETSPAVEALENLDPDSLTPRQALE--WIYRLK 850
.: .|.....|.||| :|..::.|: |:..::
HP0621 526 LE------------RELKQKNEHLEN----ALKEQEYLKNAWLLEME 556
#---------------------------------------
#---------------------------------------
Figura 57. Comparação das seqüências protéicas de MutS de E. coli (EG10625) e HpMutS (HP0621)
pelo EMBOSS Pairwise Alignment Algorithms. Comparação realizada pelo método WATER que
apresenta a melhor zona de similaridade entre as duas proteínas. Em lilás descacam-se tanto as seqüências
alinhadas como as percentagens de identidade, similaridade e gaps. Em amarelo destaca-se o motivo
ATPase presente em ambas proteínas. Note-se que neste alinhamento não está presente o N-terminal das
MutS 1 (domínio de reconhecimento ao mismatch), nem o C-terminal das MutS 2 (domínio Smr).
166
Figura 58. Cromatogramas da purificação de HpMutS·His. A- Passagem pela coluna de Heparina. A
figur a, representa da como abso rção a 260 nm ver sus frações, mostra o perfil protéico da eluição (a 280 e
260 nm) como também o gradiente teórico (concentração de sal) e o gradiente real (condutimetria)
aplicados na purificação. B- Passagem pela coluna MonoS (resourseS). A figura, representada como
absorção a 280 nm versus frações, mostra o perfil protéico da eluição (a 280 e 260 nm) como também o
gradiente teórico (concentração de sal) e o gradiente real (condutimetria) aplicados na purificação. O
momento da injeção está marcado em lilás. Na lavagem da coluna se observa o perfil protéico eluido com
2 M da NaCl (proteínas não eluidas no gradiente). A passagem pela coluna Chelating-Ni
+
(primeiro passo
de purificação) foi feita em sistema convencional, portanto, não existe cromatograma dessa etapa.
A
_ UV 280 nm
B
_ UV 260 nm
_ Facções
_ Conce ntra ção de sal
_ Condu time tria
HpMutS
Lavagem da coluna
Gradiente lineal
_ UV 280 nm
_ Conce ntra ção de sal
_ Condu time tria
HpMutS
_ UV 260 nm
_ Facções
Lavagem da coluna
Gradiente lineal
_ UV 280 nm
_ UV 260 nm
_ Facções
_ Concentração de sal
_ Condutimetria
_ Injeç ão
HpMutS
Gradiente lineal
Lavagem da coluna
_ UV 280 nm
_ Concentração de sal
_ Condutimetria
_ Injeç ão
HpMutS
_ UV 260 nm
_ Facções
Gradiente lineal
Lavagem da coluna
167
y = 10,928x + 0,0805
R
2
= 0,9952
y = 11,242x + 0,0874
R
2
= 0,9802
y = 7,6164x + 0,064
R
2
= 0,9977
y = 7,2779x + 0,0364
R
2
= 0,9939
y = 6,743x + 0,034
R
2
= 0,9979
y = 6,1271x + 0,0605
R
2
= 0,9924
-0,1
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
- 0,01 0 0,01 0,02 0,03 0,04
1/
μ
M d e AT P
1/pmoles min
A
-1
sem DNA
FS
FD
MM
F
FWJ
B
y = 0,0397x + 5,4538
R
2
= 0,9837
y = 0,0434x + 6,0236
R
2
= 0,9946
y = 0,0695x + 4,3282
R
2
= 0,9959
y = 0,0685x + 6,8517
R
2
= 0,9964
y = 0,0861x + 10,348
R
2
= 0,9967
y = 0,1081x + 7,525
R
2
= 0,9942
-20
0
20
40
60
80
100
120
140
-200 0 200 400 600 800 1000
μ
M de ATP
μ
M de ATP/Velocidade
se m DN A
FS
FD
MM
F
FW J
Figura 59. Linearização de dados para o cálculo dos parâmetros da atividade ATPásica de HpMutS·His.
A- Dupla recíproca de Lineweaver-Burk. B- Transformação de Hanes Woolf.
168
A
_ UV 280 nm
Figura 60. Cromatogramas da purificação de HpMutS
Δ
Smr·His. A- Passagem pela coluna de Heparina,
e B- Passagem pela coluna MonoS (resourseS). As figuras, representadas como absorção a 280 nm versus
frações, mostram os perfiles protéicos das eluições (a 280 e 260 nm) como também os gradientes teóricos
(concentração de sal) e os gradientes reais (condutimetria) aplicados na purificação. As injeções estão
marcadas em lilás. Na lavagem da coluna se observa o perfil protéico eluido com 2 M da NaCl (proteínas não
eluíidas no gradiente). A passagem pela coluna Chelating-Ni
+
(primeiro passo de purificação) foi feita em
sistema conven cional , p ort anto, não existe cromatograma dessa etapa.
B
_ UV 260 nm
_ Facções
_ Concentração de sal
_ Condutimetria
_ Injeção
HpMutSΔSmr
_ UV 280 nm
_ Concentração de sal
_ Condutimetria
_ Injeção
HpMutSΔSmr
Gradiente lineal Lavagem d a coluna
_ UV 260 nm
_ Facções
Gradiente lineal Lavagem d a coluna
_ UV 280 nm
_ UV 260 nm
_ Facções
_ Concentração de sal
_ Condutim etria
_ Injeção
HpMutSΔSmr
Gradiente lineal
_ UV 280 nm
_ Concentração de sal
_ Condutim etria
_ Injeção
HpMutSΔSmr
_ UV 260 nm
_ Facções
Gradiente lineal
169
A
_ UV 280 nm
B
C
Figura 61. Cromatogramas da purificação de EcYdaL. A- Passagem pela coluna Chelating-Ni
+
. B-
Passagem pela coluna de Heparina. C-Segunda passagem pela coluna de Heparina (depois do corte da
fusão). As figuras, representadas como absorção a 280 nm versus frações, mostram os perfiles protéicos das
eluições (a 280 e 260 nm) como também os gradientes (imidazol e NaCl) e a condutimetria da purificação.
As injeções na coluna estão marcadas em lilás.
_ UV 260 nm
_ Fracções
_ Gradiente de imidazol
_ Condut i m et ria
_ Injeção
Gradiente lineal
His·EcYdaL
_ UV 280 nm
_ Gradiente de imidazol
_ Condut i m et ria
_ Injeção
_ UV 260 nm
_ Fracções
Gradiente lineal
His·EcYdaL
_ UV 280 nm
_ UV 260 nm
_ Fracções
_ Gradiente de NaCl
_ Condutimetria
_ Injeção
His·EcYdaL
_ UV 280 nm
_ Gradiente de NaCl
_ Condutimetria
_ Injeção
His·EcYdaL
Gradiente lineal Lavag em da coluna
_ UV 260 nm
_ Fracções
Gradiente lineal Lavag em da coluna
Gradiente lineal Lavagem da coluna
EcYdaL
_ UV 280 nm
_ UV 260 nm
_ Fracções
_ Gradiente de NaCl
_ Condut i m et ria
_ Injeção
Gradiente lineal Lavagem da coluna
EcYdaL
_ UV 280 nm
_ Gradiente de NaCl
_ Condut i m et ria
_ Injeção
_ UV 260 nm
_ Fracções
170
A
_ UV 280 nm
_ UV 260 nm
_ Fracções
_ Gradiente de imidazol
_ Condutimetria
_ Injeção
Gradiente lineal Lavagem da coluna
His·EcYfcN
_ UV 280 nm
_ Gradiente de imidazol
_ Condutimetria
_ Injeção
Gradiente lineal Lavagem da coluna
His·EcYfcN
_ UV 260 nm
_ Fracções
B
_ UV 280 nm
C
Figura 62. Cromatogramas da purificação de EcYfcN. A- Passagem pela coluna Chelating-Ni
+
. B-
Passagem pela coluna de Heparina. C-Segunda passagem pela coluna de Heparina (depois do corte da
fusão). As figuras, representadas como absorção a 280 nm versus frações, mostram os perfiles protéicos das
eluições (a 280 e 260 nm) como também os gradientes (imidazol e NaCl) e a condutimetria da purificação.
As injeções na coluna estão marcadas em lilás.
_ UV 260 nm
_ Fracções
_ Gradiente de NaCl
_ Condut i m et ria
_ Injeção
Gradiente lineal Lavagem da coluna
His·EcYfcN
_ UV 280 nm
_ Gradiente de NaCl
_ Condut i m et ria
_ Injeção
Gradiente lineal Lavagem da coluna
His·EcYfcN
_ UV 260 nm
_ Fracções
_ UV 280 nm
_ UV 260 nm
_ Fracções
_ Concent ração de sal
_ Condut im etria
_ Injeção
Gradiente lineal Lavagem da coluna
EcYfcN
_ UV 280 nm
_ Concent ração de sal
_ Condut im etria
_ Injeção
Gradiente lineal Lavagem da coluna
EcYfcN
_ UV 260 nm
_ Fracções
171
8. Anexo II
8.1. Artigos originados desta tese
8.1.1. The MutS2 C Terminus (Smr domain) from Helicobacter pylori Is Essential for
Suppression of Recombination In Vivo. Manuscrito em preparação.
8.1.2. Suppression of Homologous and Homeologuos Recombination by the Bacterial
MutS2 Protein. Molecular Cell, 2005.
8.2. Participação em outros trabalhos durante o transcurso desta tese.
8.2.1. Evidence for the Active Role of a Novel Nuclease from Helicobacter pylori in
the Horizontal Transfer of Genetic Information. Journal of Bacteriology, 2004.
8.2.2. Pathogen DNA as Target for Host-Generated Oxidative Stress: Role for Repair
of Bacterial DNA Damage in Helicobacter pylori Colonization. PNAS, 2003.
172
The MutS2 C-Terminus (Smr domain) from Helicobacter pylori Is Essential for
Suppression of Recombination In Vivo.
A. Viviana Pinto
12
, Thierry Kortulewski
2
, J. Pablo Radicella
2
and Alvaro Leitão
1
.
1- Lab. de Radiobiologia Molecular, IBCCF, UFRJ, Brazil.
2- Lab. de Recherche sur l’Instabilité Génétique, CEA, France.
In Helicobacter pylori, recombination events are involved in the appeareance of new allelic
variants that correlates with the severity of pathologies and/or resistance to useful antibiotics.
Recently, it was reported that the MutS2 protein (HpMutS) inhibits homologous and
homeologous recombination. We show that cells with the hpmutSΔsmr mutation (which
removes the C-terminal 225 amino acids of HpMutS) has a MutS null phenotype for
antirecombination. In vitro, however, the HpMutSΔSmr protein suppress the RecA strand
exchange, nevertheless, the affinity for DNA structures is strongly reduced. In constrast to
Smr from T. thermophilus, HpSmr does not possess nucleasic activity. The results indicate
that the C-terminal end of HpMutS is necessary for antirecombination. Like the MutS1
proteins, the absence of the C-terminal from HpMutSΔSmr may indicate that this domain is
involved in the active form of HpMutS.
Manuscrito em preparação para ser submetido em J. Bacteriol.
173
Molecular Cell, Vol. 17, 113–120, January 7, 2005, Copyright ©2005 by Elsevier Inc. DOI 10.1016/j.molcel.2004.11.035
Suppression of Homologous and Homeologous
Recombination by the Bacterial MutS2 Protein
the human population, resulting in chronic gastritis,
leading in some patients to peptic ulcers and, in a small
fraction of cases, to cancer. The adaptation of H. pylori
A. Viviana Pinto,
1,2,3,4
Aure
´
lie Mathieu,
1,3,4
Ste
´
phanie Marsin,
1
Xavier Veaute,
1
Luis Ielpi,
2
Agne
`
s Labigne,
3
and J. Pablo Radicella
1,
*
to the changing gastric environment within a host, or to
1
De
´
partement de Radiobiologie et Radiopathologie
new hosts, suggests an enhanced ability of this patho-
UMR217 CNRS/CEA
gen to change. Indeed, H. pylori is one of the most
Commissariat a
`
l’Energie Atomique
genetically diverse bacterial species. Because of its ge-
BP 6
nome plasticity and its clinical importance, it constitutes
F-92265 Fontenay aux Roses
a model for microbial phenotype evolution.
France
Numerous studies have shown the importance of dif-
2
Fundacio
´
n Instituto Leloir
ferent pathways in achieving genome plasticity. At the
Molecular Cell
114
tance (Table 1). The mutation rates of the different iso-
lates, generally higher than those of Enterobacteriaceae,
were not significantly modified by the disruption of the
HpmutS2 gene. Because mutations giving rise to rifam-
picin resistance are on an essential gene and are mostly
base substitutions, these results confirmed that MutS
does not participate in the repair of simple mismatches
Figure 1. The H. pylori MutS Protein
(Bjorkholm et al., 2001). To include a larger spectrum of
Sequence alignment of the E. coli MutS (a MutS1 protein) and
mutation mechanisms, we also tested the mutation rate
H. pylori MutS (a MutS2 protein). The light gray boxes correspond
at the RdxA locus, a nonessential gene. Inactivation of
to the region homologous between the two proteins, including the
rdxA, coding a nitroreductase, renders H. pylori resistant
ATP binding domain in black. The MutS1 mismatch binding domain
and the MutS2 SMR domains are in dark gray.
to metronidazole (Jeong et al., 2001). Therefore, any
kind of sequence change leading to inactivation of the
gene would be detected, including frameshifts, which
are normally prevented by MMR. Among the strains
genome sequencing efforts showed that the MutS2 pro-
available, 26695 was sensitive to metronidazole. As
teins include proteins from eubacterial, archaea, and
shown in Table 1, although mutation rates to metronida-
plant sources, the latter most likely derived from a cyan-
zole resistance are extremely high, 26695 mutS2 did not
obacterial source and the result of a horizontal transfer
show a higher mutation rate than the parental strain,
from their plastids (Malik and Henikoff, 2000). A MutS2-
thus confirming that HpMutS2 is not involved in MMR.
encoding gene seems to always be present in those
organisms that lack a mutL gene (Moreira and Philippe,
HpMutS Suppresses Homologous
1999). The lack of clear phenotype changes in the ab-
and Homeologous Recombination
sence of a functional MutS2 in the cases analyzed makes
In Saccharomyces cerevisiae, MSH4 and MSH5 have
it difficult to speculate on the in vivo role of the protein
been implicated in the control of meiotic crossing-over
in bacteria. However, there remains the intriguing possi-
(Hollingsworth et al., 1995; Ross-Macdonald and Roeder,
bility that MutS2 prokaryotic proteins are evolutionary
1994). Because HpMutS2 belongs to the same large
precursors of the MSH4 and MSH5 proteins involved
family of proteins, we hypothesized that it could influ-
in meiotic recombination in eukaryotes. We therefore
ence homologous recombination (HR) in H. pylori.In
investigated the function of the H. pylori member of the
this pathogen, exogenous DNA sequences are readily
MutS2 group, HpMutS2, both in vivo and in vitro and
integrated into the bacterial chromosome by HR. There-
find that HpMutS2 plays a significant role in controlling
fore, we compared the recombination proficiencies of
homologous recombination.
the X47-2AL mutS2 and wild-type strains by monitoring
the incorporation of a selectable marker into a nones-
sential locus. The exogenous DNA used was total chro-Results
mosomal DNA from a N6 strain in which ORF HP0645
is disrupted by a cassette conferring gentamicin resis-HpMutS Is Not Involved in Mismatch Repair
ORF HP0621 codes for a 762 amino acid protein with tance. The frequency of recombination of N6 DNA into
X47-2AL mutS2 chromosomes was 5-fold higher thanlimited homology to the MutS protein from E. coli. The
homology region, spanning residues 288–506, shares into the parental strain (Figure 2A). When the experiment
was repeated using DNA from an N6 derivative strain27% identity (41% similarity) to the E. coli protein and
includes a conserved potential ATP binding motif with a marker inserted into another nonessential locus,
HP1186, a 21-fold increase in recombinant colonies was(TGXNXXGK) between amino acids 333 and 340. Align-
ment of the sequences shows that the E. coli and observed in the mutS2 strain (Figure 2B). Very similar
results were obtained when receptor strains 26695 andH. pylori proteins do not share homology outside the
region described above (Figure 1). Moreover, they seem 26695 mutS2 were compared (data not shown). To rule
out an effect of MutS2 on restriction systems, we alsoto have very different domains in their terminal regions.
HpMutS2 has a 100 amino acid C-terminal domain not compared the HR proficiency of the parental and mutS2
strains when the exogenous DNA was obtained frompresent in the MutS1 proteins but found as a family of
conserved bacterial and eukaryotic small proteins, two isogenic bacteria. As a consequence of the lack of re-
striction, incorporation frequencies of X47-2AL DNAmembers of which are found in E. coli. Because this
domain is present at the C terminus of many MutS2 carrying a gentamicin cassette within the HP0645 or
HP1186
locus into X47 chromosomes were two ordersproteins, it has been named smr (for small mutS-related)
(Moreira and Philippe, 1999). It is noteworthy that of magnitude higher than for transformation with N6
DNA (Figures 2C and 2D). However, the impact of dis-HpMutS2 lacks the N-terminal domain from the E. coli
and other MutS1 proteins shown to be responsible for abling the mutS2 gene was also evident. Indeed, the
lack of a functional MutS2 resulted in 3- and 13-foldthe recognition and binding of mismatched bases in
DNA (Sixma, 2001), suggesting that it may not partici- increases of recombination for the HP0645 and HP1186
loci, respectively. The results described above are con-pate in MMR.
To genetically test this hypothesis, we constructed sistent with MutS2 acting to inhibit HR.
To test whether the inhibition of recombination byseveral H. pylori strains where ORF HP0621 was deleted
and compared them to their parental isolates with re- HpMutS2 was dependent on the presence of sequence
divergence between the recombination substrates, wespect to spontaneous mutation rates to rifampicin resis-
MutS2 Suppresses Homologous Recombination
115
Table 1. Spontaneous Mutation Rates of H. pylori Parental and mutS Strains
26695
Strain X47-2AL J99
ADM1
Marker rif rif rif mtz rif
Parental 3.6 (0.9) 9.2 (2.1) 9.7 (2.5) 1293 (264) 1.4 (0.4)
mutS 1.4 (0.4) 9.1 (2.2) 2.6 (0.4) 526 (100) 2.0 (0.4)
Mutation rates are expressed as mutations to rifampicin (rif) or metronidazole (mtz) resistance per locus and per generation (ϫ10
8
). Numbers
correspond to the mutation rates derived from an experimentally determined median number of mutants from at least ten independent cultures.
The standard deviation for each data set is shown in parentheses.
created three DNA constructs designed to integrate into from 0% (for the X47-2AL construct) to 26% (Figure 3A).
The differences not only included base substitutions butanother nonessential locus, vacA, of X47-2AL or X47-
2AL mutS2. The gentamicin resistance cassette was also insertions or deletions of up to 5 bases and in one
case an insertion of 57 bp. Surprisingly, in spite of theirflanked upstream by the first 404 or 430 nucleotides
of vacA, a region containing the s1 or the s2 variable high degree of divergence, no significant differences
were observed in the efficiency of integration into wild-sequences, respectively, and downstream by 448 nucle-
otides associated with the m variable sequences of vacA type X47-2AL of the DNA derived from X47-2AL and the
other strains. However, inactivation of the mutS2 genefrom X47-2AL, 26695, or F8 H. pylori isolates (Figure
3A). Because all constructs were amplified in E. coli, in the recipient strain resulted in 5- to 8-fold increases
in recombination frequencies (Figure 3B).this approach avoids any possible bias due to restriction
by the transformed bacteria. Sequencing of these con- All the recombination experiments described above
require the integration into the chromosome of a largestructs showed that they differ markedly from each
other, with the divergence of their flanking regions with piece of heterologous DNA corresponding to the cas-
sette coding for the antibiotic resistance used as arespect to the X47-2AL recipient chromosome ranging
marker. HpMutS could act as a barrier toward the incor-
poration of such nonhomologous regions into the bacte-
rial chromosome. To determine whether MutS also in-
hibits the recombination into the chromosome of a
sequence differing only in one or two nucleotides, we
isolated DNA from a rifampicin-resistant X47-2AL deriv-
ative strain and used it to transform rifampicin-sensitive
X47-2AL or its mutS2 mutant. As it was the case for the
incorporation by HR of a cassette, the inactivation of
HpMutS2 resulted in a large increase of rifampicin-resis-
tant clones (25-fold), confirming the general hyperre-
combination phenotype of mutS2 strains (Figure 3C).
When a nonintegrating plasmid conferring chloram-
phenicol resistance was tested as donor DNA, no differ-
ence in the yield of antibiotic-resistant colonies was
observed between X47-2AL and X47-2AL mutS2 (data
not shown), showing that the mutant strain is not defec-
tive in its transformation proficiency. Taken together,
these results show that mutS2 disruption in H. pylori
results in an increased frequency of HR, both between
perfectly matched DNA molecules and between mole-
cules with divergent sequences.
HpMutS Has ATPase Activity and Binds
to Recombination Intermediate DNA Structures
To explore the biochemical properties of HpMutS2, we
Figure 2. The Absence of HpMutS2 Facilitates Recombination of
cloned the mutS2 gene from X47-2AL strain in frame
Exogenous DNA into the Bacterial Chromosome
with a histidine tag at its C terminus and expressed it
Integration events were calculated as gentamicin-resistant colonies
in E. coli. After purification, we obtained a near homoge-
per microgram of chromosomal DNA. Values correspond to the
nous protein of apparent molecular weight closely
average of ten independent transformations, and errors bars repre-
matching the predicted MW of 86.7 kDa (Figure 4A). The
sent the corresponding standard deviation.
(A and B) Chromosomal DNA from N6 strains carrying a gentamicin
presence of a putative ATP binding domain suggested
resistance cassette in either HP0645 (A) or HP1186 (B) was intro-
that this protein could have an ATPase activity. Indeed,
duced into wild-type (wt) or mutS X47-2AL strains.
MutS2 has an ATP hydrolyzing activity (Figures 4C and
(C and D) Chromosomal DNA from X47-2AL strains carrying a genta-
4D). Since other MutS proteins family members have
micin-resistance cassette in either HP0645 (C) or HP1186 (D) was
their ATPase activities stimulated by specific DNA sub-
introduced into wild-type (wt) or mutS X47-2AL strains. *p Ͻ 0.001;
strates (Parker and Marinus, 1992; Snowden et al., 2004;
**p Ͻ 0.01 between wt and mutS2 using the Mann-Whitney nonpara-
metric test.
Su and Modrich, 1986), we analyzed the capacity of
Molecular Cell
116
the possibility of a contaminant ATPase in our protein
preparation, a parallel purification was carried out for a
MutS2 in which the conserved glycine 338 of the nucleo-
tide binding domain was mutated to arginine (Figure
4A). No ATPase activity was detectable for the mutated
protein in the absence or in the presence of FWJ DNA
(Figure 4D).
The ATPase experiments suggested the possibility
that HpMutS could specifically bind to DNA structures
mimicking recombination intermediates, rather than mis-
matches or homoduplex DNA. The capacity of HpMutS2
to bind DNA was tested by filter retention experiments
where the protein was incubated in the presence of
end-labeled double-stranded or FWJ DNA. The titration
curves presented in Figure 4E show that HpMutS2 binds
more efficiently a FWJ-structured DNA than homodu-
plex DNA. To compare the relative affinities of HpMutS
for different DNA structures, filter retention experiments
where the labeled FWJ is competed by the various DNAs
shown in Figure 4B were performed. As expected, addi-
tion of unlabeled FWJ competes away the binding of
HpMutS2. A Scatchard analysis (Scatchard, 1949) of the
data yielded an apparent K
D
of 58 nM. Homoduplex
DNA, duplex DNA harboring a G/T mismatch, or single-
stranded DNA inhibit weakly the binding of HpMutS to
the FWJ probe, while the fork structure shows an inhibi-
tion comparable to that of the FWJ (Figure 4F). While
these experiments were carried out at 130 mM NaCl,
similar results were obtained at 50 mM NaCl (data not
shown). These results suggest a selective affinity of
HpMutS for single- to double-strand transitions, likely
to be found during recombination or other DNA repair
events.
HpMutS Blocks In Vitro DNA Strand Transfer
To determine whether HpMutS2 inhibits HR in vitro, we
studied its effect on RecA-promoted strand exchange
reactions between linear double-stranded DNA (dsl) and
circular single-stranded DNA (ssc) (Figure 5A). In the
absence of HpMutS2, after 90 min of incubation almost
all the dsl has disappeared, and substantial levels of the
final strand exchange product, a nicked circular duplex
(nc), are present. When HpMutS2 was added, disappear-
Figure 3. The Degree of Heterology Does Not Affect the Hyperre-
ance of nc was observed (Figures 5B and 5C), indicating
combination Phenotype of H. pylori mutS2 Strains
an inhibitory effect of the protein on the strand exchange
(A) Schematic representation of the DNA constructions used for
reaction. Moreover, identical results were obtained
transformation of H. pylori strains. Numbers in the boxes represent
when the strand exchange experiment was performed
the percentage of identity between the source strains and X47-2AL.
between DNAs displaying 8% heterology (data not
The box with the asterisk corresponds to a 57 bp insertion.
shown). This is in agreement with our in vivo results
(B) Integration efficiency of the constructs shown in (A) into either
showing that inactivation of HpmutS2 has indistinguish-
wild-type (wt) or mutS X47-2AL strains.
(C) Chromosomal DNA from a rifampicin-resistant X47-2AL strain
able effects on the integration of homologous and het-
was introduced into wild-type (wt) or mutS X47-2AL strains. *p Ͻ
erologous sequences (Figure 3).
0.001; **p Ͻ 0.01 between wt and mutS2 using the Mann-Whitney
nonparametric test.
Discussion
Here we provide evidence of a significant phenotypevarious DNA substrates mimicking either MMR or HR
substrates (Figure 4B) to stimulate an HpMutS2 ATPase associated with a protein member of the prokaryote
MutS2 family by showing that the HpMutS2 is inhibitoryactivity. The HpMutS2 ATP hydrolyzing activity is stimu-
lated by the presence of four-way junction (FWJ) or to HR. In addition, we demonstrate that HpMutS2, unlike
the MutS-I proteins, does not participate in MMR. Afork DNA structures (Figure 4C). The incubation in the
presence of a single-stranded, homoduplex or hetero- previous study on three isolates of H. pylori showed
that the spontaneous frequency of rifampicin-resistantduplex double-stranded DNA resulted in a weak activa-
tion when compared to the FWJ or the fork. To rule out mutants was not enhanced by the disruption of the
MutS2 Suppresses Homologous Recombination
117
Figure 4. ATPase and DNA Binding Activities of HpMutS
(A) The HpMutS2 and HpMutS2 G338R overexpressed in E. coli were purified to near homogeneity as judged by analysis on 10% SDS-
polyacrylamide gel electrophoresis and staining with Coomassie blue.
(B) Schematic representation of the DNA substrates used for binding or stimulation experiments: DS, double-stranded homoduplex DNA; MM,
as DS but with a G/T mismatch; SS, single-stranded DNA; F, fork structure; FWJ, four-way junction.
(C) Stimulation of the HpMutS ATPase activity by DNA. Purified HpMutS (25 nM) was incubated with [␥-
32
P]ATP and the indicated concentration
of unlabeled ATP without DNA (᭹), with 100 nM of FWJ (᭿),F(᭜), DS (᭡), MM (ᮀ), or SS (X) for 35 min.
(D) ATPase activity of wild-type or G338R MutS2 proteins. Incubations were carried out as in (C) with 200 ␮M ATP in the absence (ϪDNA) or
presence (ϩDNA) of 100 nM FWJ DNA.
(E) Filter binding analysis of HpMutS2 binding to FWJ (᭿) and DS (᭡) DNAs. Increasing concentrations of HpMutS2 were incubated with 10
fmol of the corresponding end-labeled oligo. Protein-DNA complexes retained on filter were quantified with a PhosphorImager. Error bars
indicate the standard deviation of at least three independent experiments.
(F) Competition analysis of HpMutS2 bound to a FWJ structure. HpMutS2 (400 nM) and 10 fmol end-labeled FWJ were incubated with increasing
amounts of unlabeled competitor DNA: FWJ (᭿), F (᭜), DS (᭡), MM (ᮀ), or SS (X) in a 20 ␮l reaction. Quantification of the products was as
in (E).
HpmutS gene (Bjorkholm et al., 2001). However, MMR- of MutS2 in the avoidance of frameshifts. In B. subtilis,
where both mutS1 and mutS2 are present, disruptiondefective, and in particular mutS, strains are often found
among clinical isolates of bacterial pathogens (LeClerc of the latter did not affect the spontaneous mutation
frequency (Rossolillo and Albertini, 2001). The lack of aet al., 1996), and because for the H. pylori strains there
were no other phenotypes to test, it could not be ruled hypermutator phenotype in H. pylori mutS2 strains is not
surprising since HpMutS2, as the other MutS2 proteins,out that the parental strains’ mutS gene was already
nonfunctional. In the case of two of the strains used in lacks the N-terminal domain responsible for mismatch
recognition in the MutS-I proteins (Malik and Henikoff,this work, X47-AL and 26695, the mutS2 product dis-
plays enzymatic and DNA binding activities, and the 2000; Sixma, 2001). Indeed the DNA binding experi-
ments shown in this work demonstrate that HpMutS2inactivation of the gene leads to a recombination pheno-
type but not to a hypermutator one, thus confirming that does not discriminate between mismatch-containing
DNA and homoduplex DNA. Similarly, MutS2 from Pyro-the MutS2 proteins are not involved in MMR. Moreover,
HpmutS2 disruption does not increase the frequency of coccus furiosus (Vijayvargia and Biswas, 2002) or
Thermus thermophilus (Fukui et al., 2004) has affinityinactivation of rdxA (Table 1), ruling out a specifc role
Molecular Cell
118
the role of the MutS2 ATPase activity could be and
whether other factors are necessary to complete HpMutS2
action in vivo.
The experiments measuring the recombination of ex-
ogenous DNA into the MutS2-proficient H. pylori chro-
mosome yielded the surprising result that the efficiency
of incorporation of the foreign DNA was in all cases
independent of the level of heterology of the incorpo-
rated DNA with respect to the chromosomal sequences.
Indeed, the yield of recombinant bacteria was essen-
tially the same whether the DNA used was isogenic
or up to 26% divergent with respect to the recipient
chromosomal DNA. This suggests that in H. pylori, once
the strand exchange reaction is initiated, probably by
pairing of relative short homologous sequences, the
presence of nonhomologous sequences is not a barrier
for the completion of the recombination event.
The conserved and widespread presence of mutSII
genes leads to the obvious question of their role in evolu-
tion. The presence of MutS2 proteins in some naturally
competent species such as H. pylori or B. subtilis could
regulate the incorporation of foreign DNA. Likewise, in
H. pylori it could be one of the unknown factors pro-
posed to regulate genome plasticity (Aras et al., 2003).
Interestingly, although in yeast MSH4 and MSH5 facili-
tate interhomolog crossover during meiosis, msh5 mu-
tants display an increased frequency of gene conversion
(Hollingsworth et al., 1995), an event similar to the allele
exchange measured here for H. pylori. It is also possible
that MSH4 and MSH5 are only very distant relatives of
prokaryotic MutS2 proteins and have simply conserved
the ATPase domain and a structure-dependent DNA
binding capacity (Snowden et al., 2004) to evolve to very
different functions.
In conclusion, our findings on the genetic and bio-
chemical characteristics of HpMutS2 support the idea
Figure 5. HpMutS Inhibits Strand Exchange Catalyzed by RecA
that the bacterial MutS2 proteins, so far of unknown
(A) Scheme of DNA strand exchange reaction.
function, modulate HR. In the case of bacterial species
(B) Increasing amounts of HpMutS were added at the initiation time
that, as H. pylori, show a high level of genetic diversity,
of the strand exchange reaction (lanes 1–8 correspond to 0, 834, 601,
MutS2 could control the plasticity of their genomes by
401, 267, 178, and 119 nM HpMutS, respectively). Abbreviations: dsl,
double-stranded linear DNA; jm, joint molecules; nc, nicked circular
regulating both the integration of exogenous DNA and
double-stranded DNA; ssl, single-stranded linear DNA; ssc, single-
the reshuffling of sequences in their chromosomes. The
stranded circular DNA.
levels of MutS2 activity could have important conse-
(C) Quantification of the reactions shown in (B).
quences in the appearance of phenotypic variants and
new antibiotic resistances.
for double-stranded DNA but no detectable mismatch-
Experimental Procedures
specific binding activity.
Consistent with the lack of mismatch discrimination,
H. pylori Strains
the degree of inhibition of incorporation of exogenous
Parental H. pylori strains used were X47-2AL (Londono-Arcila et al.,
DNA by a functional HpMutS2 is independent of the
2002), 26695 (Tomb et al., 1997), F8 (Ng et al., 1999), ADM1, J99,
and N6 (Ferrero et al., 1992). To generate the corresponding mutS
level of heterology. This observation strongly suggests
derivatives, pILL570-HP0621-Km was constructed by replacing
that HpMutS2 acts differently than the MutS-I proteins
1689 bp (between positions 300 and 1986) of ORF HP0621 from
whose inhibitory action on recombination depends on
strain 26695 with a nonpolar kanamycin (Km) resistance cassette
the presence of heterologies between the DNAs (Rayssi-
(Skouloubris et al., 1998). For disruption of HP0645 and HP1186,
guier et al., 1989). Moreover, our in vitro experiments
similar plasmids were constructed but with a gentamicin (Gm) resis-
show that HpMutS suppresses RecA-catalyzed strand
tance cassette. Plasmids were introduced into H. pylori strains by
natural transformation, colonies were selected on either 20 ␮g/ml
exchange reactions independently of the presence of
Km or 5 ␮g/ml Gm, and allelic replacement was verified by PCR.
heterology between the sequences. In the case of E. coli
Both independent mutants in HP0621 or pools of mutants were used
MutS, the protein does not inhibit recombination be-
according to the experiments.
tween completely homologous sequences (Worth et al.,
1994). Taken together, these results imply that HpMutS
H. pylori Rates of Spontaneous Mutation
acts by a different mechanism than the MutS1 proteins
Independent cultures were grown for 24 hr on plates with Blood
Agar Base Number 2 (Oxoid) supplemented with 10% horse blood
to inhibit recombination. It remains to be analyzed what
MutS2 Suppresses Homologous Recombination
119
(BAB). Appropriate dilutions were plated either on BAB to determine activity bound to the nitrocellulose, using a Storm Phosphorimager
(Amersham). For competition assays, unlabeled competitor DNAthe number of viable cells or on BAB with either 20 ␮g/ml rifampicin
or 8 ␮g/ml metronidazole to score for mutants. The mutation rates was added at the start of the reaction.
and their standard deviations were calculated by the method of the
median (Lea and Coulson, 1949).
ATP Hydrolysis Assay
Assays were performed in 20 ␮l buffer C, with the indicated amounts
of ATP, and 13.3 nCi [␥-
32
P]ATP. Reactions were started by the
Recombination Substrates
addition of 25 nM HpMutS, incubated at 37ЊC, and stopped with
Genomic DNA from H. pylori strains was prepared using the Qiamp
2 ␮l 0.5 M EDTA (pH 8). ATP hydrolysis was measured as described
(Qiagen) protocol. For the plasmid constructs, the hypervariable s
(Iggo and Lane, 1989). When DNA was used as cofactor, DNA struc-
and m regions of the VacA gene (HP0887) from three H. pylori strains
tures were added at 100 nM to the reaction.
were PCR amplified. The primers 3Ј for the s region and 5Ј for the
m region also contained sequences homologous to the 5Ј and 3Ј
ends of a Gm resistance cassette, respectively. The amplification
DNA Strand Exchange Reaction
products s and m were utilized as primers for the Gm cassette
M13CEF3 ssDNA (4.5 ␮M nucleotides) was incubated in 30 mM Tris
amplification obtaining the construction VacAs-Gm-VacAm. These
HCl (pH 7.6), 9 mM MgCl
2
, 1.8 mM DTT, 1.1 mM ATP, 7.2 mM
products were cloned into plasmid pILL570 and introduced into
phosphocreatine, and 9 U/ml phosphocreatine kinase for 3 min at
E. coli MC 1061 strain (Invitrogen).
37ЊC before the addition of 1.5 ␮M RecA protein and 0.26 ␮M SSB.
The reaction was kept at 37ЊC for 10 min. Variable amounts of
MutS protein were then added followed by the introduction of PacI-
Recombination Assay
linearized M13CEF3 dsDNA (4.5 ␮M nucleotides). After 90 min incu-
Chromosomal DNA from H pylori or plasmids containing the different
bation, the reaction mixture was deproteinized and analyzed by
constructions of VacAs-Gm-VacAm were introduced into X47-2AL
electrophoresis in 0.8% agarose gel in TAE buffer. The gels were
or X47-2AL mutS by natural transformation. For each experiment,
stained with SybrGold (Molecular Probes) and quantified by Im-
ten independent transformations were carried out using 1 ␮gof
ageQuant software.
DNA per in 10 ␮l85.7(agabc(Ther)-457.(apdepxiormive(l85.7(a4.5)]TJ/F7 1 Tff341046 0 TD()Tj/F3 1 T1190341 0 TD9(1)TJ3.8797 0 0 4.18525f0.28 4864.8106 Tm6(2)Tj6.9636 0 0 6.975255.904 48-349927 Tmcellbes))-357.1nNA)-442.BABB.
Molecular Cell
120
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JOURNAL OF BACTERIOLOGY, May 2004, p. 2586–2593 Vol. 186, No. 9
0021-9193/04/$08.00ϩ0 DOI: 10.1128/JB.186.9.2586–2593.2004
Copyright © 2004, American Society for Microbiology. All Rights Reserved.
Evidence for the Active Role of a Novel Nuclease from
Helicobacter pylori in the Horizontal Transfer
of Genetic Information
Eyleen J. O’Rourke,
1,2,3
A. Viviana Pinto,
1,3
E. Alejandro Petroni,
1
†
Marcelo E. Tolmasky,
4
and Luis Ielpi
1
*
Fundacio´n Instituto Leloir, University of Buenos Aires and CONICET, C1405BWE-Buenos Aires, Argentina
1
;
Unite´ de Pathoge´nie Bacte´rienne des Muqueuses, Institut Pasteur, 75724 Paris,
2
and De´partement de
Radiobiologie et Radiopathologie, CEA, UMR217 CEA/CNRS, F-92265 Fontenay-aux-Roses,
3
France;
and Department of Biological Science, California State University, Fullerton, California
4
Received 10 November 2003/Accepted 16 January 2004
Helicobacter pylori is a gram-negative bacterium that colonizes the human stomach, causes gastritis, and is
associated with ulcers and gastric cancer. H. pylori is naturally competent for transformation. Natural genetic
transformation is believed to be essential for the genetic plasticity observed in this species. While the relevance
of horizontal gene transfer in H. pylori adaptiveness and antibiotic resistance is well documented, the DNA
transformation machinery components are barely known. No enzymatic activity associated with the transfor-
mation process has been determined experimentally and described. We isolated, microsequenced, and cloned
a major DNA nuclease from H. pylori. This protein, encoded by the open reading frame hp0323, was expressed
in Escherichia coli. The purified protein, NucT, has a cation-independent thermostable nuclease activity that
preferentially cleaves single-stranded DNA. NucT is associated with the membrane. NucT-deficient H. pylori
strains are one or more orders of magnitude less efficient than the parental strain for transformation with
either chromosomal or self-replicating plasmid DNA. To the best of our knowledge, NucT is the first nuclease
identified in a gram-negative natural transformation system, and its existence suggests that there is a
mechanism of DNA processing and uptake similar to the mechanisms in well-studied gram-positive systems.
Helicobacter pylori is a gram-negative bacterium that infects
the gastric mucosa of more than one-half of the world’s human
population (10). It is the major cause of peptic ulcers and the
main risk factor for the development of gastric cancer (10).
Previous molecular genetic work and comparative analysis of
the complete genomic sequences of two isolates of H. pylori
revealed the highest degree of genetic diversity reported for
any bacterial species (22, 36). The panmictic structure of H.
pylori populations has been determined by mathematical and
experimental approaches (11, 35). A panmictic structure is not
common in haploids, and it is expected that sequential selec-
tive sweeps and/or bottlenecks remove genetic variants result-
ing from mutational events from populations (35, 39). How-
ever, extremely frequent horizontal genetic exchange could
maintain most of the generated allelic variants in a population,
in addition to creating new ones (11, 35).
H. pylori is naturally competent for transformation, and nat-
ural genetic transformation is believed to be essential for the
genetic plasticity observed in this and other haploid species
(11, 22). Genetic variability is expected to be relevant in H.
pylori adaptiveness given the diverse conditions to which this
persistent pathogen is exposed (37). It has been widely re-
ported that more than one strain can simultaneously colonize
a human host, and it has also been proven that genetic recom-
bination occurs during natural mixed infections in humans,
yielding better-adapted pathogen variants (4, 11, 16, 34). These
experiments proved that horizontal genetic transfer occurs in
vivo. Not only can the ability to transfer genes improve the
adaptiveness to a human host, but it can also facilitate the
spread of resistance to clinically useful antibiotics (18, 38).
For H. pylori, the molecular mechanisms of DNA uptake and
integration are barely known. Genes of the com operon, which
are homologues of Agrobacterium tumefaciens vir genes, have
been implicated in DNA transfer in H. pylori (33). The com
operon consists of four genes, designated comB7, comB8,
comB9, and comB10 (14). Knockout of the individual genes in
this operon leads to transformation efficiencies that are re-
duced by 10- to 100-fold (14). Other genes, such as comB4,
comH, and dprA and the open reading frames hp0015, hp1089,
hp1424, and hp1473, were identified as transformation genes
because their absence impairs or eliminates the transformation
process. However, their specific roles are still unknown (6, 15,
31, 32).
EndA and NucA are proteins that are required for Strepto-
coccus pneumoniae and Bacillus subtilis DNA transport, re-
spectively. Both EndA and NucA are membrane-localized pro-
teins. EndA is a nuclease that acts on both DNA and RNA,
and it is d 4(d)--408.4(nvoloved)-408.4(nd)-408.4(the)-408.4dtegrdmation of the
transporred sr(and)-26716((,d)-2671693). The that NucA is required
DNA transformation of subtilis
system (9). In this paper we report biochemical and genetic
characterization of the hp0323 protein product, which we des-
ignated NucT (for “nuclease involved in transformation”). Our
results show that NucT is a vigorous membrane nuclease ac-
tively involved in H. pylori DNA transformation.
MATERIALS AND METHODS
H. pylori strains, plasmids, and media. H. pylori strains and plasmids used in
this study are listed in Table 1. Escherichia coli strains were grown in Luria-
Bertani (LB) broth or agar. H. pylori strains were grown on brucella blood agar
plates at 37°C in an atmosphere containing 5% CO
2
with 95% humidity.
Nuclease assays. Unless indicated otherwise, the buffer used in all assays
contained 20 mM Tris-HCl, 200 mM NaCl, 10 mM
plified 486-bp fragment was ligated between the EcoRI and HindIII sites of the
pMAL-p2 vector, resulting in plasmid pMAL-hp0323.
(ii) Construction of His-tagged NucT. For construction of His-tagged NucT,
the forward primer was 5Ј-CGCGGATCCAAAAACAGCTTATTTGTCTTAG
G-3Ј, and the reverse primer was the primer used for construction of pMAL-
hp0323. The hp0323 gene was cloned by using BamHI and HindIII sites into the
vector pQE30, which introduced a His tag at the N terminus of the recombinant
protein, resulting in plasmid pQE-hp0323.
Amino acid sequence analyses. Amino acid comparisons were performed by
using BLAST at the National Center for Biotechnology Information website
(21). The putative signal sequence and the most probable site of cleavage were
determined by using SignalP V1.1 (24). Theoretical pI/M
w
ratios were deter
-
mined by using the Compute pI/M
w
tool at ExPASy (41).
Overexpression and purification of recombinant NucT. For recombinant over-
expression and purification of the soluble and active NucT, E. coli/pMAL-hp0323
clones were constructed by transforming E. coli TB1 (New England Biolabs) with
the pMAL-hp0323 plasmid. E. coli TB1 cells were also transformed with the
pMAL-p2 vector as a control. Purification of MBP was carried out parallel to
purification of MBP-NucT in order to obtain a control fraction that could be
used to test the absence of E. coli contaminating nuclease activities in the
purified fraction. A 10-ml overnight culture was inoculated into LB broth con-
taining 1% glucose and 200 ␮g of ampicillin per ml. The cultures were incubated
at 37°C with aeration until the optical density at 600 nm was 1.5, and cells were
centrifuged and resuspended in LB broth containing 1 mM isopropyl-␤-
D-thio-
galactopyranoside (IPTG). After3hofinduction, cells were harvested by cen-
trifugation at 4,000 ϫ g and 4°C for 10 min. Cell pellets were resuspended in 25
ml of 20 mM Tris-HCl–1 mM EDTA–1mM␤-mercaptoethanol–1 mM PMSF
(pH 8.0) and treated by following the manufacturer’s recommendations for
periplasmic extraction. The MBP-NucT fusion present in the soluble fraction was
absorbed onto amylose resin (New England Biolabs) by batch mixing at room
temperature for 1 h and then eluted with 10 mM maltose. NucT was cleaved from
the fusion protein by digestion with factor Xa for4hatroom temperature. NucT
was isolated from MBP and factor Xa by fast protein liquid chromatography by
using a Pharmacia MonoS (5/5) ion-exchange column. NucT was concentrated to
a concentration of 5 mg/ml, glycerol was added to a final concentration of 50%,
and the protein solution was stored at Ϫ20°C.
To generate antiserum, plasmid pQE-hp0323 was transformed into E. coli
JM109 (New England Biolabs) and grown in LB broth at 37°C until an A
600
of
0.8 was reached. Cultures were induced with 1 mM IPTG and grown for a further
3 h before bacteria were harvested by centrifugation, washed, and resuspended
in lysis buffer (50 mM Tris-HCl, 1 mM EDTA, 100 mM NaCl, 1 mM PMSF; pH
8.0). Lysozyme (1 mg/ml) was added to the cells, and the cells were incubated at
37°C for 15 min. The cells were sonicated and centrifuged at 4°C for 30 min. The
pellet containing the inclusion bodies was washed by successive resuspension and
centrifugation with lysis buffer containing 0.5% Triton X-100 and then with lysis
buffer containing 2 mg of deoxycholate per ml and finally with lysis buffer
containing 1 M urea. Washed inclusion bodies were resuspended in lysis buffer
containing 4 M urea.
Antisera, cell fractionation, and immunoblots. Antiserum was generated by
using purified and solubilized inclusion bodies of His-NucT as the antigen. Five
8-week-old mice were challenged with 50 ␮g of protein. Three boosters consist-
ing of 10 ␮g of protein were used. The specific antiserum was obtained by
clarifying the sera with raw extracts of induced E. coli JM109 containing pQE30.
Cells from one plate grown for 24 h were harvested, washed, and resuspended
in 30 mM Tris-HCl–20% sucrose–0.5 mM DTT–1 mM EDTA (pH 8.0). The cells
were incubated for 10 min with shaking and then centrifuged at 8,000 ϫ g and
4°C for 10 min. The supernatant was removed, and the pellet was resuspended in
10 ml of ice-cold 5 mM MgSO
4
. The suspension was incubated at 4°C for 10 min
with shaking and then centrifuged as described above. The supernatant corre-
sponded to the periplasmic fraction. Cells were treated with 0.1 mg of lysozyme
per ml at 37°C for 30 min, disrupted with a French press, and ultracentrifuged at
100,000 ϫ g and 4°C for 1 h. The supernatant and pellet corresponded to the
cytoplasm and membrane fractions, respectively. Subcellular fractions were re-
suspended in identical volumes. Aliquots (10 ␮l) of each fraction (approximately
20 ␮g of protein for the cytoplasmic fraction) were loaded in the polyacrylamide
gel. The samples were analyzed by Western blotting by using anti-NucT mouse
antisera diluted 1:500. Anti-mouse immunoglobulin G alkaline phosphatase-
conjugated antibodies (1:30,000) were used to detect anti-NucT by the colori-
metric method; 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-1-phosphate and nitroblue tetrazo-
lium were the substrates. 2-Keto-3-deoxyoctanoic acid quantification and
anti-OmpF Western blotting were used as fraction controls as described previ-
ously (12).
Construction and phenotype analysis of mutants of H. pylori. H. pylori hp0323
mutants were created by allelic exchange and natural transformation with suicide
constructs as reported previously (7). Disruption of the correct gene was con-
firmed by PCR and sequencing. The competence of the mutants for natural
transformation was determined as described previously (40). Briefly, fresh 24-h
cultures of H. pylori were harvested and transferred as thick patches onto fresh
plates. After 5 h, 1 ␮g of chromosomal DNA from an H. pylori resistant strain or
1 ␮g of plasmid pILL444 or pHel3 isolated from E. coli strain MC1061 (5) was
added to each patch. At 16 h posttransformation, the bacteria were harvested
and suspended in brucella broth. All or 100 ␮l of this suspension was spread on
selective plates containing metronidazole (15 ␮g/ml), streptomycin (50 ␮g/ml),
or kanamycin (20 ␮g/ml), and the number of resistant colonies was determined
by counting the colonies after 5 days of incubation. Viable cells were quantified
by the serial dilution method. The frequency of spontaneous mutation to ri-
fampin resistance was measured as previously described (26). The transforma-
tion frequency was defined as the number of resistant colonies divided by the
total number of viable bacteria per microgram of DNA minus the spontaneous
mutation frequency.
The abilities of the NucT-deficient and parental cells to colonize the Swiss
model mouse strain were assessed by performing coinfection experiments as
previously described (26).
RESULTS
hp0323 codes for a nuclease of H. pylori. A strong nuclease
activity can be detected in crude extracts of H. pylori (19). A
specific assay for this nuclease activity was developed. Trichlo-
roacetic acid-soluble products were analyzed after exposure of
heat-denatured E. coli chromosomal [
14
C]DNA to H. pylori
cell extracts or to the purified protein. Incubations that were 10
times longer were required to detect products in the soluble
fraction when chromosomal DNA was not previously heated.
Because of the thermostability and cation independence of
nuclease activity (see below), the reaction was carried out at
70°C and in the presence of EDTA. The nuclease activity was
monitored through different purification steps by this radioac-
tive soluble method. The optimized protocol for purification of
the nuclease activity included heat precipitation, heparin affin-
ity, gel filtration, and anion exchange. The specific activity
increased from 297 to 40,116 U/mg, and the overall yield was
16%. After purification, four discrete bands were detected on
silver-stained SDS-PAGE gels. In order to distinguish the
polypeptide responsible for the nuclease activity, an in situ gel
assay was performed (see Materials and Methods). The activity
was visualized as dark growing bands on a fluorescent back-
ground due to the ethidium bromide-stained DNA. After 24 h
of incubation of the gel in activity buffer, the degradation zone
reached the maximum size (Fig. 1A). Once the activity band
was clearly observed and its position was marked by cutting its
edges, the gel was stained with Coomassie blue, which revealed
a protein band that overlapped the dark activity band (Fig.
1B). The molecular weight markers provided a negative con-
trol, showing that DNA-free regions (dark bands) were not
artifacts caused by exclusion of DNA from areas in the gel
occupied by any protein. This conclusion was also supported by
the fact that the dark bands grew over time. By using this
method we were able to assign the nuclease activity to a single
band at an apparent molecular mass of 17 kDa (Fig. 1). The
active band was electrotransferred to PVDF membranes and
microsequenced by the Edman method. The amino-terminal
sequence obtained was KNSLFVLPY. This sequence corre-
sponds to the amino-terminal end of a putative membrane
nuclease, without the predicted signal peptide, encoded by the
hp0323 open reading frame from H. pylori (36).
2588 O’ROUKE ET AL. J. BACTERIOL.
Analysis of the hp0323 nucleotide and amino acid se-
quences. Based on the genome sequence of H. pylori 26695, it
is predicted that the HP0323 gene is transcribed monocistroni-
cally since the upstream and downstream genes are in opposite
orientations. Analysis of the sequence upstream of the pre-
dicted ATG revealed a perfect TATAAT Ϫ10 promoter ele-
ment; however, no typical Ϫ35 E. coli consensus sequence was
found, which is consistent with previous analyses of transcrip-
tion in H. pylori (8, 23). A ribosomal binding site was identified
upstream of the hp0323 open reading frame, which has the
coding capacity for a protein consisting of 180 amino acids. A
23-residue sequence consistent with a signal peptide was found
at the N terminus. The predicted molecular mass of the mature
protein (amino acids 24 to 180) is 17.75 kDa. The experimen-
tally determined N terminus of HP0323 is consistent with re-
moval of the predicted 23-amino-acid signal peptide. The pro-
tein is highly conserved in H. pylori J99 (accession no.
NP_223026), exhibiting 96% identity and 99% similarity.
BLASTp analysis of the NucT amino acid sequence showed
that it has significant similarity to a large number of nucleases
and putative nucleases from different organisms. The highest
levels of similarity were with the proteins from Helicobacter
hepaticus strain ATCC 51449 (accession no. NP_860236; 55%
identity and 72% similarity) and Wolinella succinogenes strain
DSMZ 1740 (accession no. NP_906451; 48% identity and 69%
similarity). The closest relative of NucT in the BLASTp list
whose biological role has been determined is a nuclease from
Proteus vulgaris. This enzyme has been characterized as a hy-
droxymethylcytosine-specific restriction enzyme (PvuRts1I)
(17). NucT and PvuRts1I exhibit only 29% identity in a region
consisting of 119 residues. Other characterized homologs are
also involved in providing or preventing restriction barriers to
DNA invasion.
NucT can be overexpressed and purified as an exported
MBP fusion from E. coli. To obtain purified NucT, hp0323 was
PCR amplified from the H. pylori 26695 reference strain, pu-
rified, and cloned into the pMAL-p2 vector to be expressed as
an MBP-NucT fusion. Upon IPTG induction, E. coli TB1 cells
transformed with the pMAL-hp0323 plasmid produced the ex-
pected ϳ58-kDa MBP-NucT fusion protein (Fig. 2). The
MBP-NucT fusion was released from cells by osmotic shock,
and the fusion was isolated from the periplasmic fluid by amy-
lose-resin affinity purification. Between 1 and 2 mg of MBP-
NucT was obtained from 3-liter cultures. Since E. coli chromo-
somal DNA is efficiently degraded by NucT, the low yield
could have been a consequence of a potential NucT toxic
effect. In fact, the only construction that gave detectable quan-
tities of active NucT was the fusion to periplasmic MBP,
whereas other constructions, such as glutathione S-trans-
ferase–MBP, His tag-MBP, S tag-MBP, and cytoplasmic MBP
fusions, yielded an inactive protein and/or undetectable levels.
Purification of NucT from MBP after factor Xa treatment was
performed by anion-exchange chromatography. NucT eluted
from the MonoS column at 250 mM NaCl as a pure single band
(Fig. 2). The purified enzyme was stored at a concentration of
5 mg/ml in 50 mM Tris-HCl–10 mM ␤-mercaptoethanol–100
mM NaCl–10 mM EDTA–50% glycerol (pH 8.0) at Ϫ20°C.
Under these conditions, the enzyme was stable for several
months with a minimal loss of activity.
The same purification protocol was carried out by using E.
coli TB1 cells transformed with pMALp2 without any inserted
gene. The purified MBP did not have the ability to degrade
DNA or RNA. The results served as control for the specificity
of the products observed in the following experiments. Fur-
thermore, no nonspecific nuclease activity able to degrade sin-
gle- or double-stranded DNA was present in the wild-type E.
coli raw extracts under the conditions assayed.
NucT is a thermostable cation-independent nuclease. The
purified 17-kDa nuclease was characterized by the radioactive
soluble method, in which E. coli heated chromosomal
[
14
C]DNA was used as the substrate. The optimal pH for NucT
activity was 8.0, and the optimal temperature was 80°C. The
activity was 20 times higher at 70°C than at 37°C. After incu-
bation at 70°C for 30 min, this enzyme was fully active. NucT
was not inhibited by 10 mM EDTA, and its activity was not
stimulated by the presence of the divalent cations Ca, Mg, and
Mn. NucT was more active in the presence of reducing agents,
such as DTT or ␤-mercaptoethanol, and it was inactivated by
FIG. 1. Assignment of the DNase activity to a protein band on an
in situ activity gel. (A) DNase activity with preheated chromosomal
DNA in 16% T–6% C Tricine-PAGE, as revealed by ethidium bro-
mide staining after incubation at 37°C for 24 h in activity buffer. Lane
1, better-purified DNase fraction; lane 2, nuclease S1 (positive con-
trol). (B) Molecular mass markers (lane MW) and the same samples
that were used for panel A. The gel was stained with Coomassie blue.
The numbers on the left indicate the sizes of the molecular mass
markers (in kilodaltons).
FIG. 2. NucT purification from E. coli: SDS-PAGE of preparations
after the different steps used for purification of NucT from an MBP-
NucT fusion overexpressed in E. coli TB1. Lane 1, total induced cells;
lane 2, periplasmic fraction; lane 3, amylase-purified fusion; lane 4,
fusion after Xa treatment; lane 5, NucT after MonoS purification.
Lane MW contained molecular mass markers, whose sizes (in kilodal-
tons) are indicated on the right.
VOL. 186, 2004 H. PYLORI NUCLEASE INVOLVED IN NATURAL COMPETENCE 2589
50 mM oxidized glutathione but not by 1 mM ZnCl
2
, PbCl
2
,or
HgCl
2
(data not shown). The M
r
of the enzyme, as determined
by gel filtration, was approximately 32,000, suggesting that
NucT acts as a dimer.
NucT acts preferentially on single-stranded DNA with weak
sequence selectivity. The substrate preference and the prod-
ucts of NucT were analyzed by using the recombinant protein.
When pUC18 DNA, including supercoiled covalently closed
circular, open circular, and linear forms, was treated with 0.1
mM purified NucT, all the DNA was degraded (Fig. 3). Since
supercoiled DNA has no free ends, this result showed that
NucT possesses an endonucleolytic activity. Complete degra-
dation could result from repeated rounds of endonucleolysis or
by subsequent exonucleolytic degradation from the free ends
produced by the initial cleavage. The specificity of cleavage of
NucT was analyzed further by using
32
P-labeled oligonucleo
-
tides as substrates.
Figure 4 shows the products obtained when a 34-mer that
was labeled with
32
P at the 5Ј end was incubated with the
purified enzyme at a concentration of 1 ␮M for various lengths
of time at 37°C. This experiment was carried out with either
single- or double-stranded 34-mer. The different intermediates
produced did not permit us to unambiguously determine if
NucT possesses an exonucleolytic activity in addition to its
endonucleolytic activity or if it fully degrades DNA by succes-
sive rounds of endonucleolysis. The heterogeneity in the inten-
sities of some of the bands produced by NucT, in conjunction
with the fact that two oligonucleotides of the same length did
not give the same pattern of products, suggests that there is
some type of weak selectivity that is not strictly sequence de-
pendent as it occurs for DNase I (1).
When the same oligonucleotide in its single- and double-
stranded forms was used as the substrate, it was observed that
NucT degraded the single-stranded form more efficiently than
it degraded the double-stranded form (Fig. 4, compare blocks
1 and 4). It is worth noting that under these conditions the
products were different, suggesting that the structure of the
substrate has an effect on NucT activity.
Hydrolysis of single-stranded DNA could be prevented by
addition of a 1,000:1 excess of eukaryotic rRNA (Fig. 4, block
2), but a 100:1 excess of RNA did not inhibit degradation of
the oligonucleotide. Figure 5 shows specifically the degrada-
tion of RNA by 0.1 mM NucT. No RNase activity was detected
in the purified MBP fraction under the conditions assayed.
Taken together, the results show that NucT efficiently de-
FIG. 3. Endonuclease activity of NucT: degradation of pUC18 at
37°C when it was exposed to 0.1 mM NucT in activity buffer for several
different times. No degradation was observed after1hofincubation
with 50 ␮g of MBP purified in parallel with MBP-NucT from E. coli
TB1/pMAL-p2 (data not shown).
FIG. 4. Exonuclease activity of NucT: degradative activity of 1 ␮M NucT with 100 fmol of a 34-base oligonucleotide that was labeled a the 5Ј
end with
32
P. Block 1, hydrolysis of a single-stranded 34-mer for several different times; block 2, 5-min reaction with 100 fmol of the single-stranded
34-mer shown in block 1 preincubated with 1 ␮gofS. cerevisiae rRNA; block 3, activity with a second single-stranded 34-mer with a different
sequence; block 4, hydrolysis of the double-stranded form of the 34-mer shown in block 1 for several different times. The sequences of the two
oligonucleotides used as substrates and molecular weight markers are shown. Lanes MW contained molecular mass markers, whose sizes (in
kilodaltons) are indicated on the right.
2590 O’ROUKE ET AL. J. B
ACTERIOL.
grades nucleic acids endonucleolytically and probably exonu-
cleolytically, that single-stranded DNA is a better substrate
than double-stranded DNA, and that DNA is hydrolyzed more
efficiently than RNA is hydrolyzed.
NucT is associated with the H. pylori membrane. The anti-
NucT serum was used to examine the subcellular localization
of NucT. Periplasmic, cytoplasmic, and membrane fractions
were prepared sequentially by osmotic shock, treatment with a
French press, and ultracentrifugation. The fractions were re-
suspended in equal volumes, and identical aliquots were
loaded on SDS-polyacrylamide gels. The fraction contents
were verified by using 2-keto-3-deoxyoctanoic acid quantifica-
tion and anti-OmpF antisera as controls (data not shown).
Figure 6 shows that NucT was located mainly in the membrane
fraction. Washing of the membranes with 1 M NaCl released
the enzyme into the soluble fraction, suggesting that the pro-
tein is associated with but not anchored to the membranes of
H. pylori.
NucT-deficient H. pylori mutants are deficient in transfor-
mation capability. In order to elucidate the role of NucT in the
DNA metabolism of H. pylori, nucT insertional mutants with
different backgrounds were constructed. Extracts from the mu-
tant cells were not able to hydrolyze DNA in the presence of
EDTA at 70°C. Some activity (200-fold lower) remained at
37°C. The results show that hp0323 codes for the main nucle-
ase activity of H. pylori.
There were no differences in in vitro growth between the
parental and nucT derivative cells (data not shown). Further-
more, coinfection experiments showed that NucT-deficient
cells colonized the mouse stomach at the same rate as the
wild-type strain (approximately 5 ϫ 10
5
CFU/g of tissue15 and
30 days after infection). Taken together, the results provide
evidence that NucT is not required for cell duplication and
does not act as a virulence factor, at least in the mouse model
(Swiss mice) and under the conditions assayed.
The frequency of spontaneous mutation was analyzed as
previously described (26). The absence of NucT did not change
the mutation rate of the deficient H. pylori derivatives.
By contrast, the competence of the hp0323 mutants for
transformation with chromosomal DNA was between 10- and
100-fold lower in the NucT-deficient derivatives than in the
parental strain. While transformation with chromosomal DNA
depends on allelic exchange through recombination, transfor-
mation with self-replicating plasmids does not involve integra-
tion of the DNA into the chromosome. To further elucidate
the role that NucT plays in H. pylori transformation, experi-
ments were carried out in which a self-replicating plasmid was
used as the donor DNA. The parental strain X47-2AL (20) and
derivative mutants of this strain were tested for their natural
transformation competence with pHel3. In this case, a 10-fold
reduction in the transformation capacity was observed in the
mutant strain (Table 2). A plasmid of the expected size was
purified from the transformants, which indicates that pHel3
was indeed maintained as a plasmid. This result indicates that
NucT is not involved in DNA integration but is involved in
DNA binding and/or uptake by the cell.
DISCUSSION
The strong DNase activity found in H. pylori has been used
as a species marker for years (19). In this work we identified
the gene coding for the major nuclease from H. pylori, which
we designated NucT. The product of this gene was character-
ized by functional and biochemical approaches. NucT has en-
donuclease and possibly 3Ј-to-5Ј exonuclease activities that
exhibit weak structural selectivity. Single-stranded DNA is a
better substrate for NucT than other nucleic acids are, al-
though the enzyme recognizes and hydrolyzes double-stranded
DNA, as well as RNA. NucT seems to be structurally very
stable. It is thermostable, it recovers from SDS treatment, and
it resists multiple freeze-thaw cycles. NucT stability could be a
by-product of its function, localization, and/or interaction with
some partners. We are performing site-directed mutagenesis in
order to investigate the nature of NucT stability further.
The results of a computer analysis of the amino acid se-
quence of NucT were consistent with a protein that is exported
from the cytosol and undergoes cleavage of the signal peptide.
Furthermore, the sequence showed high levels of similarity
and identity with a large number of nucleases and putative
endonucleases. However, the level of homology can lead to
misinterpretation of the H. pylori metabolism, as we have pre-
viously demonstrated (25). Here we experimentally demon-
strated that the product of the hp0323 open reading frame
actually encodes a nuclease activity, NucT. Furthermore, the
biological role of NucT was established.
Since disruption of hp0323 resulted in a significant defi-
ciency for transformation, the gene was designated nucT (nu-
clease involved in transformation). By contrast, the absence of
NucT, which resulted in a complete loss of the promiscuous
thermoresistant and cation-independent nuclease activity
present in wild-type H. pylori, did not affect the viability, col-
onization efficiency, or mutation frequency of the mutant cells.
The absence of NucT resulted in at least a 1-log reduction in
FIG. 6. NucT subcellular localization: immunoblot analysis of
whole-cell lysates and subcellular fractions of the H. pylori wild type
and its nucT derivative (see Materials and Methods). Lane 1, wild-type
whole-cell lysate; lane 2, mutant whole-cell lysate; lane 3, periplasm;
lane 4, membranes; lane5, cytoplasm; lane 6, NaCl wash of the mem-
brane fraction; lane 7, membrane fraction after salt wash.
FIG. 5. RNase activity of NucT: degradation rRNA from S. cerevi-
siae when it was exposed to 0.1 mM NucT at 37°C for several different
times. No degradation was observed after5hofincubation with 50 ␮g
of MBP purified in parallel with MBP-NucT from E. coli TB1/
pMAL-p2 (data not shown).
V
OL. 186, 2004 H. PYLORI NUCLEASE INVOLVED IN NATURAL COMPETENCE 2591
the transformation efficiency with a chromosomal marker. The
fact that NucT-deficient cells also exhibited a reduction in the
transformation efficiency when a self-replicating plasmid was
used as the donor DNA strongly suggests that NucT is not
involved in chromosomal integration but is involved in a pre-
vious step in the transformation process, ranging from DNA
binding to the cell surface to DNA translocation through the
membrane. We observed transformation frequencies lower
than the values reported previously with all kind of donor
DNAs. The strains assayed might be less competent than other
strains, or our culture conditions may have disfavored compe-
tence.
It seems unlikely that DNA binding to the cell surface re-
quires a protein with a potent nuclease activity. In spite of the
fact that we cannot rule out this hypothesis, in a simpler model
NucT is actively involved in DNA transfer through the H. pylori
membrane. Two other proteins located in the membrane,
EndA and NucA, have been found to be involved in bacterial
transformation (9, 27). Like NucT, EndA is a promiscuous
membrane nuclease that is capable of degrading DNA and
RNA endonucleolytically and exonucleolytically (9). By con-
trast, NucA seems to possess only endo-DNase activity. How-
ever, since the experiments described by Provvedi et al. (27)
were in vivo experiments, the specific nature of the NucA
substrates and products remains uncertain.
The deduced amino acid sequence of NucT includes a signal
peptide in the N-terminal region (36), which is not present in
the mature protein; this supports the hypothesis that the pep-
tide is cleaved during translocation from the cytoplasm to the
membrane. We were unable to clone an active form of the
nuclease that harbored the signal peptide sequence, suggesting
that the presence of the signal peptide could inhibit NucT
activity, perhaps by affecting protein folding. The mature form
of NucT could not be actively expressed in the cytoplasm, and
the purified protein was activated by reducing agents and in-
hibited by oxidized glutathione.
Taken together, the biochemical activity, the subcellular lo-
calization of the enzyme, and the phenotype of the NucT-
deficient cells support the hypothesis that NucT is actively
involved in the intermediate steps of the transformation pro-
cess.
Given the association of NucT with the membrane and its
role in transformation, it is tempting to suggest that NucT is a
component of the Com transformation complex. The two-hy-
brid protein-protein interaction map of H. pylori did not reveal
any particular interaction between NucT and other H. pylori
proteins (28). However, other Com-Com interactions, such as
those that involve ComB9, have been detected, although they
were not found by the two-hybrid analysis (14, 28, 33). Eluci-
dation of this question requires further experiments. Smeets
and Kusters originally proposed that H. pylori possesses a nu-
clease function as part of the transformation machinery (33).
Furthermore, these authors suggested that comH, a gene re-
quired for transformation whose product shows no homology
to other known enzymes involved in DNA metabolism and
whose localization and interaction with other Com proteins
were not experimentally proved, could encode a nuclease re-
sponsible for DNA translocation through the membrane (31,
33). Although we cannot rule out this hypothesis, we can state
that NucT is a good candidate for fulfilling such a DNA trans-
fer function in H. pylori. Although many questions arose in the
present study, the results described here portray the first re-
ported nuclease involved in natural competence in gram-neg-
ative bacteria and represent a significant step forward in our
understanding of the mechanism of natural competence in H.
pylori.
ACKNOWLEDGMENTS
We thank Ana Di Martino (Mitre Clinic, Buenos Aires, Argentina)
for providing H. pylori clinical isolates and Rainer Haas (Max von
Pettenkofer-Institut fu¨r Hygiene und Medizinische Mikrobiologie,
LMU Mu¨nchen, Munich, Germany) for providing pHel 3. We ac-
knowledge Agne`s Labigne (Institut Pasteur) and members of her lab,
particularly Catherine Chevalier and Chantal Ecobichon, for providing
materials, help, and advice. We especially thank J. Pablo Radicella
(De´partement de Radiobiologie et Radiopathologie, CEA) for his
invaluable collaboration. We thank to Gonzalo Prat Gay (Fundacio´n
Instituto Leloir) and members of his lab for helpful discussions and
Marta Bravo and Jimena Ortega (Fundacio´n Instituto Leloir) for their
assistance with fast protein liquid chromatography and the sequencing
experiment, respectively. We are grateful to Veronica Ielmini (Fun-
dacio´n Instituto Leloir) for providing anti-OmpF sera, S. cerevisiae
RNA, suggestions, and help.
This work was supported by grants from Laboratorios Bago´ SA and
the Argentine Federal Government (grant ANPCyT PICT 01-09016)
(to L.I.) and from CSUF (to M.E.T.). E.O. was the recipient of a
doctoral fellowship from the University of Buenos Aires (FOMEC).
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TABLE 2. Transformation rates of H. pylori wild-type and NucT-deficient strains
H. pylori strain
Transformation rates
a
Chromosomal DNA
(gentamicin resistant)
b
pILL444
(gentamicin resistant)
Chromosomal DNA
(streptomycin resistant)
b
Chromosomal DNA
(kanamycin resistant)
b
pHEL3
(kanamycin resistant)
N6 5.6 ϫ 10
Ϫ6
1.23 ϫ 10
Ϫ6
ND
c
N6 nucT 1.3 ϫ 10
Ϫ9
Ͻ1 ϫ 10
Ϫ9
ND
X47-2AL ND ND 1.19 ϫ 10
Ϫ7
5.75 ϫ 10
Ϫ7
5.26 ϫ 10
Ϫ9
X47-2ALNucT-Km ND ND 6.70 ϫ 10
Ϫ9
X47-2ALNucT-Gm ND 2.29 ϫ 10
Ϫ8
4.67 ϫ 10
Ϫ10
a
The transformation rates are expressed as the number of transformants per microgram of DNA per viable cell.
b
Chromosomal DNA from streptomycin-, gentamicin-, and kanamycin-resistant strains were used in the transformation experiments.
c
ND, not done.
2592 O’ROUKE ET AL. J. BACTERIOL.
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Helicobacter pylori—a conundrum of 2144
3295
Pathogen DNA as target for host-generated oxidative
stress: Role for repair of bacterial DNA damage in
Helicobacter pylori
colonization
Eyleen J. O’Rourke*
†‡
, Catherine Chevalier
‡
, A. Viviana Pinto
†
, Jean Michel Thiberge
‡
, Luis Ielpi
†
, Agne
`
s Labigne
‡
,
and J. Pablo Radicella*
§
*De´ partement de Radiobiologie et Radiopathologie, Commissariat a` l’Energie Atomique (CEA), Unite´ Mixte de Recherche 217͞Centre National de la
Recherche Scientifique, BP6, F-92265 Fontenay-aux-Roses, France;
†
Instituto Leloir, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales–Universidad de
Buenos Aires and Consejo Nacional de Investigaciones Cientı´ficas y Te´ cnicas de Argentina, C1405 BWE Buenos Aires, Argentina;
and
‡
Unite´ de Pathoge´ nie Bacte´ rienne des Muqueuses, Institut Pasteur, F-75724 Paris, France
Communicated by Maurice S. Fox, Massachusetts Institute of Technology, Cambridge, MA, December 16, 2002 (received for review September 10, 2002)
Helicobacter pylori elicits an oxidative stress during host colonization.
This oxidative stress is known to cause lesions in the host DNA. Here
we addressed the question as to whether the pathogen DNA is
subject to lethal or mutational damage by the host-generated oxi-
dative response. H. pylori Hpnth mutants unable to repair oxidized
pyrimidines from the bacterial DNA were generated. H. pylori strains
lacking a functional endonuclease III (HpNth) showed elevated spon-
taneous and induced mutation rates and were more sensitive than
the parental strain to killing by exposure to oxidative agents or
activated macrophages. Although under laboratory conditions the
Hpnth mutant strain grows as well as the wild-type strain, in a mouse
infection the stomach bacterial load gradually decreases while the
population in the wild-type strain remains stable, showing that
endonuclease III deficiency reduces the colonization capacity of the
pathogen. In coinfection experiments with a wild-type strain, Hpnth
cells are eradicated 15 days postinfection (p.i.) even when inoculated
in a 1:9 wild-type:mutant strain ratio, revealing mutagenic lesions
that are counterselected under competition conditions. These results
show that the host effectively induces lethal and premutagenic
oxidative DNA adducts on the H. pylori genome. The possible conse-
quences of these DNA lesions on the adaptability of H. pylori strains
to new hosts are discussed.
T
he well recognized pathogen Helicobacter pylori chronically
infects up to 50% of the world’s human population. It is a
Gram-negative, microaerophilic bacterium associated with gas-
tritis, peptic ulcer, and gastric cancer (1, 2). H. pylori induces an
oxidative stress that enhances DNA damage in the host’s gastric
mucosa (2–5). Although postulated, oxidative host-generated
lethal or premutagenic DNA damage on H. pylori DNA has not
been demonstrated (6–8). Superoxide dismutase-deficient mu-
tants have an impaired ability to colonize the mouse stomach,
confirming that this pathogen is exposed to the toxic effect of
oxygen-derived products during infection (6). The fact that
superoxide dismutase is associated with the bacterial surface is
consistent with its action as a primary barrier for exogenous
reactive molecules. These results, however, do not allow the
identification of the targets on which host generated reactive
oxygen species (ROS) act to interfere with the colonization
process. The hypothesis that DNA bacterial damage constitutes
a host defense mechanism has not, to our knowledge, been
experimentally tested with any host–pathogen couple. Legionella
pneumophila and Salmonella typhimurium strains deficient in
DNA recombination enzymes present an impaired mice colo-
nization capacity (9, 10, 11). Given the pleiotropic effects of the
mutations tested, it is not possible to rule out an intrinsic
impaired growth capability of the deficient strains or to deter-
mine the type of DNA lesions that cause the pathogen lethality
during infection.
The most abundant kind of DNA lesions resulting from oxidative
stress are base derivatives (12). Guanines are especially susceptible
to damage by ROS yielding mainly 8-oxoguanine, a strongly pre-
mutagenic lesion (13). In contrast, pyrimidine residues are chem-
ically more resistant, but some of their oxidation products, such as
5,6-dihydroxydihydrothymine [known as thymine glycol], can entail
lethal consequences for the cell (13). This lesion can block both
DNA and RNA polymerases (14, 15). Other common pyrimidine
derivatives are 5,6-dihydrothymine and urea (13). In Escherichia
coli, endonuclease III (EndoIII) is the enzyme responsible of
excising these lethal or mutagenic pyrimidine lesions (16, 17). In
addition to its DNA glycosylase activity, all of the EndoIII enzymes
described possess an abasic (AP) lyase activity that cleaves the DNA
backbone 3Ј of the AP site. EndoIII from E. coli is coded by the nth
gene. nth single mutants exhibit a weak mutator phenotype but are
not hypersensitive to DNA-damaging agents able to produce the
substrates for this enzyme (17). However, nth nei double mutants
show a strong mutator phenotype and are hypersensitive to H
2
O
2
and x-rays (18, 19). The product of nei is EndoVIII, a DNA
glycosylase that shares a common range of substrates with Nth (19).
From the analysis of the complete genomic sequence of H. pylori,
two ORFs were assigned as coding for Nth homologs, hp0585 and
hp0602 (20, 21). Both gene products have the same level of
similarity to other EndoIII proteins. We have previously demon-
strated (22) that hp0602 actually codes for a 3-methyladenine-DNA
glycosylase, MagIII. Here we show that the product from ORF
hp0585 codes for the H. pylori Nth. Its specific and essential role in
the maintenance of the genetic information and the clearance of the
products of genotoxic agents was established by the analysis of H.
pylori strains in which endoIII was disrupted. The impaired ability
of these strains to remove oxidized pyrimidines from their DNA led
to a reduced colonization capacity in a mouse infection model.
These results show that the environment in the host during the
colonization process is generating oxidative DNA lesions that can
affect the survival and genetic information of H. pylori.
Materials and Methods
Materials and Reference Compounds. All chemicals were, unless
otherwise stated, from Sigma. [
32
P]ATP (3,000 Ci͞mmol; 1 Ci ϭ
37 GBq) and Nensorb-20 cartridges were from New England
Nuclear. T4 polynucleotide kinase, T4 DNA ligase, and restric-
tion enzymes were from New England Biolabs.
Bacterial Strains, Media, and Plasmids. E. coli strain KL16 (thi,
relA1,Hfr,zed::Tn10) and its derivative, SW2-38 (KL16
nth::Kan, ⌬nei::Cm) (19), were grown in LB broth or agar
supplemented with 200
␮
g/ml ampicillin and͞or 100
␮
g/ml
rifampicin. The H. pylori strains used were X47-2AL (23), its
derivative, X47-2AL endoIII (this work), ADM1, and 13͞5 (24).
Abbreviations: AP, abasic; cfu, colony-forming units; dHT, dihydrothymine; Endo, endo-
nuclease; HBAP, horse serum Brucella agar plates; p.i., postinfection.
§
To whom correspondence should be addressed. E-mail: [email protected].
www.pnas.org͞cgi͞doi͞10.1073͞pnas.0337641100 PNAS
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2789–2794
MICROBIOLOGY
H. pylori strains were grown on blood or horse serum Brucella
agar plates (HBAP) at 37°Cina5%CO
2
͞95% humidity
atmosphere. Disruption mutant H. pylori strains were cultured
with 20
␮
g͞ml kanamycin. Mutagenesis assays were made on
HBAP supplemented with 20
␮
g͞ml rifampicin. Plasmid pGEX-
4T-1 was obtained from Amersham Pharmacia Biotech.
Plasmid Constructions. The Hpnth genes with their own start
codons were amplified by PCR from two independent H. pylori
isolates (ADM1 and 13͞5), using oligonucleotide primers de-
duced from the 26695 genome sequence (hp0585). The amplified
DNA products were cloned in pGEX-4T-1 previously digested
with the restriction enzymes BamHI and SalI, resulting in
plasmids pGEX-HP585A and pGEX-HP585T, respectively. In
this system, the HP0585 polypeptide is produced as a fusion
protein with GST at its N terminus.
Complementation Assays of
E. coli
SW2-38. SW2-38 was electro-
transformed with pGEX-4T-1, pGEX-HP585A, or pGEX-
HP585T, and wild-type KL16 with pGEX-4T-1. For mutagenesis
assays, overnight cultures were diluted to start ten 2-ml cultures
from each genotype with inoculae of 1,000–5,000 cells per ml.
The cultures were grown at 37°C to mid-log phase and isopropyl
␤
-D-thiogalactoside (IPTG) was added to 50
␮
M. After over-
night incubation, 200
␮
l of the cultures were plated onto LB
rifampicin plates and serial dilutions were plated onto LB plates.
For survival assays, five overnight cultures in HBAP, of SW2-
38pGEX, SW2-38 pGEX-HP585A, SW2-38 pGEX-HP585T,
and KL16pGEX were pelleted, washed in PBS, resuspended,
and divided in five aliquots. Each aliquot was treated for 10 min
with 0, 10 50, 250, or 500 mM H
2
O
2
. The suspensions were
serially diluted and plated onto LB-agar.
Overproduction and Purification of EndoIII. E. coli SW2-38 carrying
the pGEX or pGEX-HP585 plasmids were used to inoculate 500
ml of LB medium supplemented with ampicillin and were
incubated at 37°C with shaking until the A
600
reached 1.5. IPTG
was added to 50
␮
M, and growth was continued overnight at
18°C with gentle shaking. Cells were harvested by centrifugation,
and HpNth was purified by GST affinity chromatography. The
eluted protein was dialyzed against 20 mM Tris⅐HCl (pH 8)͞
5mM
␤
-mercaptoethanol͞10% glycerol.
DNA Substrates. The 34-mer oligodeoxyribonucleotides used in
this study have the following sequence: 5Ј-GGCTTCATCGTT-
GTC[X]CAGACCTGGTGGATACCG-3Ј with X being dihy-
drothymine (dHT) or AP residues. The dHT oligonucleotide was
a kind gift from J. Cadet (Commissariat a`l’Energie Atomique,
Grenoble, France). Uracil-containing oligonucleotide and its
complementary strand with each of the four bases opposite the
lesion in the duplex were purchased from Oligo Express (Paris).
The AP site was obtained by treatment of the uracil-containing
oligonucleotide with uracil DNA glycosylase.
Enzymatic Activity Assays. For the cleavage of lesion-containing
DNA duplexes, the oligonucleotide carrying the modified base was
32
P-labeled at the 5Ј end and annealed to its complementary strand.
In a standard reaction (10-
␮
l final volume), 50 fmol of labeled
duplex were incubated in the reaction buffer (25 mM Tris⅐HCl, pH
7.6͞2mMNa
2
EDTA͞50 mM NaCl) with the indicated protein
fractionat37°C. Reactions were stopped by addition of 0.2 M
NaOH, unless otherwise stated. After addition of 6
␮
l of formamide
dye the products were separated by 7 M urea͞20% PAGE. Gels
were analyzed by autoradiography.
Construction of an
H. pylori
Mutant Deficient in EndoIII. The hp0585
ORF with its flanking sequences was amplified by PCR from the
genomic DNA from strain 26695 by using the following primers:
F-585 5Ј-CAUCAUCAUGAAAGCGTGTGAAAATGG-
GTT-3Ј and R-585 5Ј-CUACUACUACCACTACGCTTTA-
AAGCTAGC-3Ј. The cloned ORF was disrupted in E. coli by
insertion into the recombinant plasmid of a transposable ele-
ment (MiniTn3-Km) as described (24). Twenty-six independent
disruptions of the pILL570-hp0585 plasmid were pooled and
introduced by natural transformation into H. pylori strain X47.
Insertions in hp0585 were checked by PCR using the F-585
primer together with the Km-1 or Km-2 from the kanamycin
cassette (24). Each PCR fragment was directly sequenced.
Independent mutants with TnKm insertions in hp0585 were
further used as individual mutants or pooled.
Frequency of Spontaneous Mutations to Rifampicin Resistance. Ten
independent cultures each of wild-type and Hpnth H. pylori were
initiated with 2 ϫ 10
4
cells per culture and grown for 48 h in
HBAP agar. After resuspension in peptone broth, serial dilu-
tions on the suspensions were performed. One hundred-
microliter aliquots were plated HBAP with or without rifampi-
cin. Colonies on both selective and nonselective plates were
counted after incubation for 4 days. The frequency of resistant
mutants was calculated using the median method.
H. pylori
Sensitivity to Chemical Oxidative Stress. Five independent,
24-h cultures of wild-type and Hpnth-deficient H. pylori were
harvested, washed, and resuspended in PBS to give a final
concentration of 2.5 ϫ 10
9
cells per ml [estimation, OD
600
Х 0.1
as 2.5 ϫ 10
8
colony-forming units (cfu)]. Ten microliters of cell
suspension was serially diluted and plated to obtain the viable
cfu. Subsequently, menadione and fresh hydrogen peroxide were
added to yield the indicated final concentrations. The cells were
washed 15 min later, diluted, and plated on HBAP. Plates
were incubated for 5 days and colonies were counted.
Macrophages Experiments. The mouse macrophage J774A.1 cells
(TIB-67, American Type Culture Collection) were grown in RPMI
medium supplemented with 10% heat-inactivated FCS, 2 mM
L-glutamine, and 0.1% NaHCO
3
at 37°C in a humidified 5% CO
2
atmosphere for 2–3 days. Cells were harvested by trypsin-EDTA
treatment. Macrophages (2.5–5 ϫ 10
6
) in 1 ml of medium were
placed in each of the 24 wells of a flat-bottom plate. After overnight
growth, macrophages were activated with 1
␮
g͞ml phorbol 12-
myristate 13-acetate (PMA) and 0.1
␮
g͞ml lipopolysaccharide.
After 36–48 h, wild-type and Hpnth-deficient H. pylori cultures
were harvested and PBS washed, and the number of bacteria was
estimated as above. Wild-type and endoIII-deficient cells were
resuspended in supplemented RPMI medium at 2.5–5 ϫ 10
8
cfu͞ml. Cocultures were initiated by addition of 1 ml of bacterial
suspension. The actual bacterial load was determined by plating.
After2and4h,theH. pylori-containing medium was harvested,
wells were washed twice with PBS, and the washes were added to
the harvest. H. pylori cells were centrifuged, washed, diluted if
necessary, and plated in duplicate basic, kanamycin, and͞or rifam-
picin plates.
Experimental Infections. Six- to 8-week-old Swiss specific patho-
gen-free mice (R. Janvier, Centre d’Elevage, Le Genest St. Isle,
France) were fed a commercial pellet diet and water ad libitum.
Mice were inoculated intragastrically once with 100
␮
l of sus-
pensions of 10
8
cfu͞ml H. pylori consisting of strain X47-2AL
(n ϭ 15), strain X47Hpnth
pool
(n ϭ 15), a mix of strains X47-2AL
and X47Hpnth
pool
in a 1:9 ratio (n ϭ 30), or a mix of strains
X47-2AL and X47Hpnth
pool
in a 9:1 ratio (n ϭ 30). Control
groups of mice (n ϭ 6) were given peptone trypsin broth alone.
Mice were killed 15, 30, and 60 days after inoculation [nonin-
fected (n ϭ 2) and H. pylori-infected (n ϭ 5 and 10 for mono- and
coinfection, respectively) at each time point], and stomachs were
removed for assessment of colonization by H. pylori. The pres-
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www.pnas.org͞cgi͞doi͞10.1073͞pnas.0337641100 O’Rourke et al.
ence of H. pylori bacteria was determined by a biopsy urease test
(25) performed on half of each stomach and by quantitative
culturing of the remaining gastric tissues. Viable counts of H.
pylori were estimated by serial dilutions of the homogenized
tissues in peptone broth and plating in parallel on 2.0% agar
standard selective plates (26) and selective plates supplemented
with kanamycin.
Results
Expression of
H. pylori hp0585
Complements the
E. coli nth nei
DNA
Repair Phenotypes. Two ORFs, hp0602 and hp0585, were anno-
tated as putative EndoIII coding genes in the complete genomic
sequence of H. pylori (21, 22). We have recently shown (22) that
hp0602 actually codes for a 3-methyladenine glycosylase activity,
Mag III. hp0585 from two independent isolates, 13͞5 and ADM1,
was amplified and cloned in the E. coli expression vector pGEX.
Sequencing of the hp0585 ORF and comparison of the putative
proteins from 13͞5 and ADM1 and that from the sequenced
26695 strain show that, for any pair, there are at least five amino
acid differences among the 218 residues. Moreover, there is a
two-codon deletion in hp0585 from strain 13͞5. Therefore, the
analysis of both clones was carried out in parallel. The cloned
genes derived from H. pylori 13͞5 and from ADM1 were named
hp585T and hp585A, respectively.
E. coli SW2-38 is hypersensitive to oxidizing agents because of
null mutations in both nth and nei genes (19). Independent
transformants of SW2-38 for each plasmid (pGEX, pGHP585A,
or pGHP585T) and the isogenic wild-type strain KL16 trans-
formed with pGEX were grown on horse serum-containing
plates. After harvesting, wild-type and mutant E. coli strains
were challenged with increasing concentrations of hydrogen
peroxide before spreading on LB plates to calculate the survival
fraction. Given the level of resistance to H
2
O
2
observed, it is
clear that, even after washing, horse serum provides an extra
protection against reactive oxygen species (ROS). Fig. 1 shows
that both alleles of hp0585 are able to restore the wild-type
resistance to H
2
O
2
in the nei, nth double mutant. Moreover,
production of either of the hp0585-encoded proteins partially
complements the mutator phenotype characteristic of the
SW2-38 strain (Table 1). These results suggest that ORF hp0585
encodes a protein with an EndoIII-like activity.
hp0585
Codes for a Protein with EndoIII Activity. Although the
overall identity between the predicted protein product of hp0585
and E. coli Nth is low, it is possible to identify in the putative
HpNth the pattern of cysteines giving rise to the iron–sulfur
cluster and the helix–hairpin–helix motif, characteristic of the
EndoIII family of proteins (27, 28). To examine whether H. pylori
hp0585 codes for a protein with EndoIII activity, hp585A or
hp585T fused to GST were expressed in E. coli SW2-38. A DNA
glycosylase activity on dHT-containing oligonucleotides was
detected in the lysates of cells expressing GST fused to either of
the hp0585 variants, but was absent in extracts from the same
strain transformed with the vector pGEX (data not shown).
Both GST-HP585 fusion proteins overproduced in SW2-38
were purified to yield a single 53-kDa Coomassie blue band in
SDS͞PAGE (data not shown). The fusion proteins can effi-
ciently cleave the dHT-containing oligonucleotide substrate at
the lesion site even without a NaOH treatment of the reaction
products (Fig. 2), showing that, in addition to a dHT DNA
glycosylase activity, the hp0585 products have an associated AP
lyase activity. By comparison to an EndoIV (Nfo) hydrolyzed
tetrahydrofuran-containing oligonucleotide, it was confirmed
that the hp0585 product is that of an AP lyase. These results,
together with the genetic complementation assays, showed that
hp0585 indeed codes for the H. pylori Nth.
EndoIII-Deficient
H. pylori
Strains Fail to Repair DNA Lesions. Dis-
ruption mutants were generated by insertion of a kanamycin
transposon into hp0585 from H. pylori X47, a model strain used
in mouse infection experiments. The disruption of this gene was
confirmed by PCR amplification and sequencing of the genomic
DNA. Two mutants from independent transformation events,
with insertions at positions 315 and 385, were selected and used
Fig. 1. Sensitivity to H
2
O
2
of a nei, nth E. coli mutant strain expressing
hp0585. Survival curves for E. coli SW2-38 (nei, nth) harboring pGEX-4T1 (
F
),
pGEXHP585A (ࡗ), or pGEXHP585T (
Œ
) and the parental wild-type strain
transformed with pGEX-4T1 (
■
). Bacteria were precultured in H. pylori me-
dium and incubated for 10 min with the indicated amounts of hydrogen
peroxide. Values are the mean of n ϭ 5 for each genotype and H
2
O
2
concen-
tration and are representative of two independent experiments.
Table 1. Mutation frequencies of wild-type and SW2-38
(nei, nth) E. coli expressing hp0585
Strain
Spontaneous mutation frequency
of rif
R
per 10
8
cfu
Experiment 1 Experiment 2
Wild-type pGEX 2.0 1.6
SW2-38 pGEXHP585A 6.7 5.8
SW2-38 pGEXHP585T 6.9 6.3
SW2-38 pGEX 16.3 19.9
Each culture was initiated by inoculating with 2,000–10,000 cells. rif
R
,
rifampicin-resistant colonies.
Fig. 2. H. pylori HpNth cleavage activity on a dihydrothymine 34-mer. A
dHT-containing 34-mer (lanes 1–5 and 7) was incubated with 10 ng of HpNth
from 13͞5 (lanes 1 and 2) or ADM1 (lanes 3 and 4), Nth from E. coli (lane 5), or
reaction buffer alone (lane 7) and subjected to NaOH treatment (lanes 2 and
4) and͞or stopped and loaded in 7 M urea͞20% PAGE. Lane 6 shows the
tetrahydrofuran 34-mer cleavage by Nfo. S, substrates; AP-l and AP-e, the
positions of the AP lyase and AP endonuclease products, respectively.
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MICROBIOLOGY
for the subsequent experiments, either individually or pooled to
avoid possible secondary mutations effects. Mutation frequen-
cies were determined by quantifying the appearance of rifam-
picin-resistant colonies (rif
R
). As shown in Table 2, cells lacking
HpNth show a 4-fold-higher spontaneous mutation frequency
compared with the wild-type strain. Thus, in the absence of
HpNth, a significant number of premutagenic pyrimidine lesions
are left unrepaired.
Some of the free-radical-modified DNA bases are not mutagenic
but can block RNA and DNA polymerases (14, 15). Consequently,
HpNth could provide H. pylori with a defense against the lethal
effect of exogenous oxidizing agents. Fig. 3A shows that
X47Hpnth
pool
is more sensitive than the parental strain to the
exposure to a mixture of menadione and H
2
O
2
. To analyze whether
this hypersensitivity of H. pylori Hpnth mutants to a chemically
generated oxidizing stress reflected a hypersensitivity in a more
physiological context, coculture experiments were performed in the
presence of activated mouse J774.A macrophages. Macrophages
were preactivated by exposure to lipopolysaccharide and phorbol
12-myristate 13-acetate (PMA) and subsequently mixed with either
wild-type X47 or mutant X47Hpnth
pool
. Bacteria were harvested
andplated2and4hlater.Fig.3B shows the viability of the wild-type
and mutant derivatives, relative to that of the cells that survived
under the same culture conditions but without macrophages. When
the mutation frequency was measured before and after exposure to
macrophages, both genotypes showed a marked increase in rifam-
picin-resistant colonies after exposure to activated macrophages
(Table 3). However, the frequencies obtained show that the mac-
rophage-induced mutation frequencies are 5-fold higher in
X47endoIII than in the wild-type X47. Taken together, these results
show that the HpNth-deficient strain is less effective in removing
lethal and premutagenic DNA lesions generated by the exposure to
macrophages.
Stomach Colonization Is Impaired in
H. pylori
Lacking EndoIII. To
determine whether a deficiency in HpNth activity is important
for H. pylori host colonization and, at the same time, whether
DNA damage on the pathogen genome is specifically generated
during infection, the relative abilities of wild-type and HpNth-
deficient strains to colonize the stomach were evaluated in a
mouse infection model. For the Hpnth-deficient group, a pool of
six independent mutant clones [insertions at positions 315 (x2),
385 (x2), 428, and 440] was used. Mice were inoculated with 1 ϫ
10
7
cfu of the mouse-adapted X47 H. pylori strain or its Hpnth
derivative. Fifteen, 30, and 60 days p.i., 10 infected mice from
each group were killed and the H. pylori content of their gastric
tissue was determined by plating (Fig. 4). Fifteen days p.i.,
wild-type-infected animals had 10-fold more cfu than mutant-
infected mice. Whereas the bacterial load in the wild-type
population remained high, the mutant bacterial load decreased
gradually, yielding 10
2
and 10
3
less cfu per gram of tissue than the
wild-type 30 and 60 days p.i., respectively. The impaired colo-
nization capability of HpNth-deficient cells was confirmed in
coinfection experiments. Groups of 30 mice were infected with
either 1 ϫ 10
6
wild-type and 1 ϫ 10
7
mutant mix, or the inverse
ratio mixture. Fifteen, 30, and 60 days p.i., 10 infected mice from
each group were killed and their stomach bacterial loads were
quantified by plating on plates containing (for counting Hpnth
Ϫ
H. pylori) or not containing kanamycin (for counting total H.
pylori). After 30 days only one mouse, inoculated with the
predominantly mutant mix, harbored Hpnth bacteria (K
m
R
) and
these mutant cells represented less than 1% of the population
Table 2. Mutation frequencies of wild-type and Hpnth-deficient
X47 H. pylori
Genotype
Spontaneous mutation frequency, rif
R
per 10
8
cfu
Experiment 1 Experiment 2
Parental strain 6 6
Hpnth
315
23 26
Hpnth
385
17 22
Cultures were done on HBAP inoculated with 2 ϫ 10
4
cfu and grown 48 h.
Fig. 3. Sensitivity of H. pylori wild type or Hpnth to oxidative stress gener-
ators. (A) Survival curves for H. pylori X47Hpnth (
Œ
) and the parental wild-type
strain (
F
) incubated for 15 min with increasing amounts of menadione and 2
mM H
2
O
2
. Data show the surviving fraction relative to the initial cfu and are
representative of two independent experiments. (B)Influence of HpNth de-
ficiency on the resistance to the bacteriocidal activity of J774.1A macrophages.
Bacteria were cocultured with preactivated macrophages for the times indi-
cated (see Materials and Methods and Results). The survival fraction of the
wild-type (
F
) and endoIII-derivative H. pylori (
Œ
) compared with the surviving
bacteria in RPMI without macrophages is shown. Data are representative of
two independent experiments.
Table 3. Spontaneous and induced mutation frequencies of
wild-type and Hpnth-deficient X47 H. pylori
Genotype Experiment
Mutation frequency, rif
R
per 10
8
cfu
Induced
mutations
(ϫ10
8
)
Before
macrophages
After
macrophages
Wild-type 1 4 24 20
2 2 21 19
Hpnth
pool
1 21 116 95
2 16 121 105
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harvested. At 60 days p.i. none of the stomachs of the mice
infected had detectable HpNth-deficient cells (Fig. 5). To rule
out the possibility that cells lacking EndoIII had an intrinsic
impaired growth capability, the survival in vitro (on HBAP)
of X47 vs. X47Hpnth was measured during 2 weeks (Ϸ50
generations). No reduction in population was observed in Hpnth
mutant cells when compared with the wild-type strain in the
same conditions (Table 4). These results show that (i) the
host-generated response to infection induces an oxidative stress
that damages the pathogen DNA and (ii) that H. pylori HpNth
provides a bacterial defense against the host response.
Discussion
In H. pylori, two ORFs, hp0585 and hp0602, display similar levels
of homology to EndoIII family members (20, 21). In a previous
study (22) we demonstrated that hp0602, although labeled as
endoIII, codes for a 3-methyladenine DNA glycosylase. Here we
show that the protein encoded by hp0585 is indeed a DNA
glycosylase that recognizes oxidized pyrimidines as substrates
and has an AP lyase activity. We therefore named this protein
HpNth. It is interesting to note that, even when HpNth from
ADM1 and 13͞5 H. pylori strains depict multiple amino acid
substitutions, no differences were noted between their enzymatic
activities.
H. pylori cells deficient in HpNth do not show a growth
phenotype under normal laboratory conditions. As is the case for
E. coli nth mutants (17), H. pylori cells deficient in HpNth show
a weak mutator phenotype. However, the H. pylori Hpnth-
deficient cells differ from the E. coli nth mutants in that they are
more sensitive to the killing effect of oxidative agents. In E. coli,
the impairment of a second DNA glycosylase, EndoVIII en-
coded by the nei gene, is required to obtain a hypersensitivity to
H
2
O
2
(18, 19). The genomic sequence of H. pylori does not show
an ortholog of nei, coding for an EndoVIII-like protein, sug-
gesting that in this pathogen HpNth is the only DNA glycosylase
capable of removing toxic oxidized pyrimidines (20, 21). Inter-
estingly, the same kind of difference between E. coli and H. pylori
gene content exists for another base excision repair pathway. The
removal of methylated adenines from DNA can be performed by
either of two 3-methyladenine glycosylases in E. coli (Tag and
AlkA), whereas in H. pylori only one DNA glycosylase, Mag III,
has been found to protect against killing by DNA-methylating
agents (22). This limited redundancy in H. pylori gene content
when compared with E. coli can be extended to other gene
families as cell division proteins (hp1159), thioredoxin reductase
(hp1164), and carboxynorspermidine decarboxylase (hp0020), as
discussed by Chalker et al. (29).
Because the H. pylori Hpnth mutants are only affected in their
viability when exposed to a specific environmental stress [no
growth defect was observed under normal culture conditions,
even when exposed to pH 3 and 4, with or without urea (ref. 7;
data not shown)], they provide a tool for evaluating whether the
host reaction induces a stress capable of damaging the bacterial
DNA during infection. Experiments with E. coli and S. typhi-
murium had shown that mutagenesis is enhanced when bacterial
cells are exposed to phagocytes (30, 31). Also, recombination
mutants of L. pneumophila and S. typhimurium are impaired in
their ability to colonize mice (9–11). However, mutations in Rep,
Fig. 4. Colonization ability of Hpnth vs. wild-type H. pylori. On day 0, mice
were inoculated with 1 ϫ 10
7
of either wild-type (
F
)orHpnth-deficient
H. pylori (
E
). Mice were killed after 15, 30, or 60 days and the cfu content of
the stomach tissue was determined on normal or kanamycin-containing
HBAP. Points correspond to individual animals. Horizontal bars represent the
median of the population per gram of stomach tissue. Lines indicate the trends
of wild-type (—) and HpNth-deficient (- - -) bacterial loads.
Fig. 5. Colonization competition between Hpnth-deficient and wild-type
H. pylori. On day 0, germ-free mice (n ϭ 10 for each time and genotype) were
inoculated with a ratio 9:1 wild-type (
■
):Hpnth-deficient H. pylori (
u
)(Upper)
or the reverse proportion (Lower). Mice were killed after 15, 30, or 60 days and
cfu in the stomach were counted on normal and kanamycin-containing HBAP
to determine the wild-type and mutant bacterial load, respectively.
Table 4. In vitro survival of wild-type and Hpnth X47 H. pylori
Passage
Genotype
X47 X47endoIII
1 1.9 ϫ 10
8
4.2 ϫ 10
8
2 4.4 ϫ 10
10
3.5 ϫ 10
10
3 3.3 ϫ 10
10
2.8 ϫ 10
10
4 3.8 ϫ 10
10
3.2 ϫ 10
10
5 4.1 ϫ 10
10
2.5 ϫ 10
10
6 1.9 ϫ 10
10
2.3 ϫ 10
10
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MICROBIOLOGY
RecBC, or RecA could have pleiotropic effects on basic DNA
metabolism. Furthermore, both of these species are intracellular
pathogens, and the phagolysosome is considered the most chal-
lenging environment that invading bacteria encounter within the
host and could therefore be considered a special case (32). In
contrast, H. pylori resides in the mucus layer overlying the gastric
epithelium of the stomach (2). For host-generated oxidative
stress to reach the pathogen DNA, it needs to overcome several
barriers. Some of these are the stomach mucus layer itself,
membrane lipids, and bacterial antioxidant enzymes such as
superoxide dismutase, catalase, and thioredoxin reductase (33,
34). Because the coculture with activated macrophages gener-
ates oxidative adducts in the bacterial DNA, we conclude that
the bacterial antioxidant defenses are not sufficient to avoid
oxidative DNA damage generated by a hostile environment.
Furthermore, during monoinfections in Hpnth mutant strains,
the bacterial load gradually decreases, whereas in wild-type the
population remains stable. Therefore, the gradual decrease of
the bacterial load in mice infected with Hpnth bacteria indicates
that the host is playing an active role in the accumulation of
oxidative lethal lesions, most likely by blocking pyrimidine
lesions such as thymine glycol, on the pathogen DNA.
The macrophages experiments show that, besides genotoxic
damage, mutations can be induced in H. pylori by oxidative DNA
damage. The fact that Hpnth strains, when forced to compete
with wild type, in coinfection experiments are eradicated much
faster than in monoinfections, even when inoculated in a 1:9
wild-type:mutant strain ratio, suggests that secondary, nonlethal
genetic changes induced by the host reaction are counter-
selected. The mutations are most likely the consequence of
premutagenic pyrimidine modifications generated in pathogen
DNA by the oxidative environment associated with the infection.
It has been proposed that the high genetic variability found in
H. pylori could reflect a homeostatic mechanism by which this
pathogen would adapt to stress situations (35–37). For other
pathogens, a high mutation rate increases the fitness of the
pathogen when facing a new host (38). Although our results show
that mutagenic lesions reduce the colonization ability of the
mutant strain, it is important to note that infections described
were performed with a strain that had been previously selected
for its good colonization capacity, and therefore, it is expected
that most mutagenic lesions would be deleterious. It would then
be interesting to analyze whether the mutations induced in a
nonadapted strain by the oxidative environment created during
infection could help H. pylori to overcome the genotoxic effect
of the stress and allow its adaptation to a new host.
In conclusion, the identification of a mutant that, by the lack
of a DNA repair activity, is more susceptible to killing by
oxidative agents in vitro provided a tool for assessing the impact
of the oxidative stress reaching the DNA of H. pylori during
stomach infection. The reduced survival of Hpnth H. pylori in the
host shows that once adapted and in a stable environment,
deleterious DNA lesions induced during the infection lead to the
disappearance of the bacterial population. This underscores the
importance of the capacity to repair DNA for microbial persis-
tence during infection.
We thank Jimena Ortega (Instituto Leloir) for sequencing, Marta Bravo
(Instituto Leloir) for her help with FPLC experiments, Jean Cadet
Commissariat a`l’Energie Atomique (CEA) for modified oligonucleo-
tides, and Susan Wallace (University of Vermont, Burlington) for
bacterial strains. We are grateful to Cristian Danna for his critical
reading of the manuscript and especially to Serge Boiteux for his
continuous support and advice. This work was supported in France by the
Program pour le Recherche Fondamentale en Microbiologie et Maladies
Infectieuses et Parasitologie, the CEA, and the Centre National de la
Recherche Scientifique, and in Argentina by grants from Laboratorios
Bago´ SA and the Argentine Federal Government (Agencia Nacional de
Promocion Cientifica y Tecnologica PICT 01-09016 and Carrillo
On˜ativia 2001). The collaboration between the Argentine and French
laboratories was made possible by the ECOS-Sud program. E.J.O. was
the recipient of a doctoral fellowship from the University of Buenos
Aires (FOMEC) and of the Carrillo-On˜ativa program. L.I. is a Research
Career Investigator of the Consejo Nacional de Investigaciones Cientı´-
ficas y Te´cnicas de Argentina.
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