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ELIZABETH DE SOUZA LIMA
Capacidade de Tradescantia pallida (Rose) DR
Hunt cv Purpurea Boom para
biomonitoramento do potencial clastogênico de
ozônio
Dissertação apresentada ao Instituto de
Botânica da Secretaria do Meio
Ambiente, como parte dos requisitos
exigidos para obtenção do título de
MESTRE em BIODIVERSIDADE
VEGETAL E MEIO AMBIENTE, na
Área de Concentração de Plantas
Vasculares em Análises Ambientais.
SÃO PAULO
2007
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ELIZABETH DE SOUZA LIMA
Capacidade de Tradescantia pallida (Rose) DR
Hunt cv Purpurea Boom para
biomonitoramento do potencial clastogênico de
ozônio
Dissertação apresentada ao Instituto de
Botânica da Secretaria do Meio
Ambiente, como parte dos requisitos
exigidos para obtenção do título de
MESTRE em BIODIVERSIDADE
VEGETAL E MEIO AMBIENTE, na
Área de Concentração de Plantas
Vasculares em Análises Ambientais.
ORIENTADORA: DRA. MARISA DOMINGOS
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Ficha Catalográfica elaborada pela Seção de Biblioteca do Instituto de Botânica
Lima, Elizabeth de Souza
L732c Capacidade de Tradescantia pallida (Rose) DR Hunt cv Purpurea Boom para
avaliação do potencial clastogênico de ozônio / Elizabeth de Souza Lima -- São
Paulo, 2007.
121 p. il.
Dissertação (Mestrado) -- Instituto de Botânica da Secretaria de Estado do Meio
Ambiente, 2007
Bibliografia.
1. Commelinaceae. 2. Poluição atmosférica. 3. Micronúcleos. I. Título
CDU 582.565.2
Aos meus pais, Pedro e Bia, por tudo.
“Só o conhecimento traz o poder.”
(Sigmund Freud)
Agradecimentos
À Dra. Marisa Domingos, minha orientadora, pela serenidade, dedicação e conhecimento com
que me conduziu ao longo desse trabalho. Sou privilegiada por ter sido orientada por uma
cientista tão competente e humana.
A Amariles Celsa de Souza, competente e dedicada auxilar técnica da Seção de Ecologia, pelo
auxílio em todas as atividades práticas desse trabalho. E, principalmente, por sua amizade.
Às auxilares técnicas Marli, Dóris e Valdenice, igualmente competentes e dedicadas, pelo
imensurável apoio, e por tornar mais coloridos (e saborosos) nossos dias na Seção de
Ecologia.
À Dra. Silvia Ribeiro de Souza, pelo apoio no uso dos equipamentos de fumigação e
procedimentos analíticos.
Aos amigos estagiários e pós graduandos da Seção de Ecologia e todos aqueles que, de
alguma forma, contribuíram com esse trabalho.
Às minhas professoras da graduação, Dra. Mara Magenta e Msc. Suzana Martins, por me
apresentarem a esse fascinante mundo da Biologia Vegetal.
Ao Instituto de Astronomia e Geofísica da Universidade de São Paulo (IAG/ USP) pela
concessão dos dados de monitoramento climático.
À Secretaria de Estado da Educação, por conceder a bolsa-auxílio que permitiu que eu
pudesse dedicar preciosas horas à execução desse trabalho.
Índice
Resumo 01
Abstract 03
Capítulo 1 Introdução
1.1.Introdução geral e justificativas 05
1.2.Objetivos 18
1.3. Literatura citada 18
Capítulo 2 Monitoramento da freqüência espontânea de micronúcleos em T. pallida
'Purpurea' em ambiente isento de contaminação atmosférica
2.1.Resumo 29
2.2.Introdução 31
2.3.Material e Métodos 33
2.4.Resultados 37
2.5.Discussão 42
2.6.Literatura citada 44
Capítulo 3 Grau de sensibilidade de Tradescantia pallida 'Purpurea' ao ozônio por
meio de respostas clastogênicas
3.1.Resumo 49
3.2.Introdução 51
3.3.Material e Métodos 55
3.4.Resultados 62
3.5.Discussão 75
3.6.Literatura citada 82
Capítulo 4 Discussão geral 93
4.1 Literatura citada 98
Capítulo 5 Bibliografia 101
1
Resumo
Ozônio, um dos principais poluentes em áreas urbanas, é altamente oxidativo,
promovendo injúrias diversas em plantas. Para monitorar a presença desse e de outros
contaminantes atmosféricos e avaliar riscos para os seres vivos, são utilizadas espécies
vegetais bioindicadoras, as quais podem apresentar cloroses, necroses, pigmentações foliares
típicas, desarranjos fisiológicos e aberrações cromossômicas como quebras cromossômicas,
originando fragmentos denominados micronúcleos (MCN). Entre as espécies que apresentam
tais anormalidades cromossômicas, pode-se citar Tradescantia pallida (Rose) DR Hunt cv.
'Purpurea' Boom, uma Commelinaceae originária da América Central e amplamente utilizada
em paisagismo em vários países, inclusive no Brasil. Entretanto, a formação de MCN é
condicionada por diversos fatores, entre os quais a poluição atmosférica e as variáveis
climáticas, cuja influência ainda não está bem estabelecida para T. pallida 'Purpurea'. No
presente estudo, assim, pretendeu-se: (1) investigar a freqüência basal de micronúcleos em
células-mães de grão de pólen de indivíduos cultivados exclusivamente em casa de vegetação,
isenta de poluentes clastogênicos; (2) determinar a sensibilidade dessa cultivar ao ozônio e
identificar fatores (temperatura e antioxidantes) que exercem influência sobre as respostas
clastogênicas ao poluente; (3) determinar o tempo de recuperação adequado para diagnosticar
clastogênese. A freqüência espontânea de MCN, monitorada ao longo de 17 meses em
inflorescências provenientes de plantas mantidas na casa de vegetação, foi geralmente baixa
(entre 0,4 a 1,8%) e foi influenciada, entre os fatores climáticos monitorados, apenas pela
temperatura três dias antes da amostragem (amplitude térmica e valores máximos diários). Em
paralelo, ramos florais coletados das mesmas plantas, foram expostos, em câmara de
fumigação fechada, a 60ppb de ozônio, por três horas, nas quatro estações climáticas do ano
2
ou a 80 ppb de ozônio somente na primavera e ao ar filtrado. Os ramos florais permaneceram,
após exposição, na câmara de fumigação fechada com aporte de ar filtrado para períodos de
recuperação, de 24 a 120 horas. Ao término de cada tempo de recuperação estudado, os ramos
florais foram fixados e dissecados. Das brácteas extraiu-se ácido ascórbico total e a contagem
de MCN em células-mães de grão de pólen foi feita nos botões florais. Houve aumento
significativo da formação de MCN em inflorescências fumigadas com ozônio, em relação
àquelas fumigadas com ar filtrado somente, demonstrando a alta sensibilidade de T. pallida
'Purpurea' ao poluente. Esse aumento foi mais conspícuo no inverno e no verão. A
concentração de ácido ascórbico variou ao longo do tempo de recuperação, tendo sido
condicionada pela amplitude térmica e por temperaturas máximas em cada dia. Porém, não foi
alterada significativamente pelo ozônio. A intensidade de formação de MCN foi influenciada
por variações da concentração desse antioxidante 24 horas antes e igualmente pela amplitude
térmica e por temperaturas máximas em cada dia. Sob temperaturas máximas mais amenas
observaram-se as maiores taxas de MCN. O tempo de recuperação mais indicado para
diagnosticar clastogênese imposta por ozônio foi de 72 horas após exposição ao poluente.
Contudo, não foi possível estabelecer uma curva dose X resposta entre freqüência de MCN e
diferentes concentrações de ozônio, de modo que a capacidade de T. pallida ‘Purpurea’ para
avaliação do potencial clastogênico de ozônio ainda não pôde ser estabelecida.
Palavras-chave: ecotoxicologia, micronúcleo, ozônio, bioensaio Trad-MCN.
3
Abstract
Ozone, one of the most important air pollutants in urban areas, is highly
oxidative. It promotes different kinds of injury in plants. Bioindicator plant species are often
used for monitoring the presence of ozone and of other contaminants in the air, as well as the
biological risks associated, by means of leaf chlorosis, necrosis and other typical
pigmentations, physiological disturbances and chromosomal fragments or micronuclei
(clastogenesis). Among the plants that show clastogenic injuries, we can quote Tradescantia
pallida (Rose) DR Hunt cv Purpurea Boom, a Commelinaceae from Central America and
frequently cultivated in gardens in several parts of the world, including Brazil. However,
micronuclei formation in inflorescences of T. pallida 'Purpurea' exposed to air pollution is
conditioned by several environmental factors, such as pollutants and climatic variables, whose
influence is still not established. to investigate: (1) the basal frequency of micronuclei in
pollen mother cells from plants cultivated inside a greenhouse, free from clastogenic air
pollutants, (2) the sensitivity of this cultivar to ozone, identifying factors (temperature and
antioxidants) that may influence on the clastogenic responses to the pollutant; (3) the
appropriate recovery time to observe clastogenesis in this plant. Spontaneous micronuclei
frequency, monitored during 17 months in plants maintained inside the greenhouse, was
generally low (0,4-1,8%) and was influenced, among climatic factors analyzed, by air
temperature three days before analysis (thermal amplitude and maximal daily values). In
parallel, flowering branches were collected from the same plants and exposed, into closed
fumigation chambers, to 60 ppb of ozone, for three hours in one day of the four climatic
seasons of the year or to 80 ppb of ozone only in spring and to filtered air. The flowering
4
branches remained, after exposure, in the closed fumigation chamber with filtered air for
recovery times from 24 to 120 hours. Then, the flowering branches were dissected at the end
of each recovery time. Total ascorbic acid was determined in the bracts and micronuclei were
scored in pollen mother cells of flower buds. The frequency of micronuclei increased
significantly in inflorescences exposed to ozone, regarding to the frequency estimated in those
exposed only to filtered air, revealing the high sensitivity of T. pallida 'Pupurea' to ozone.
This increase was more conspicuous in winter and summer. The ascorbic acid concentration
varied along the recovery times and was conditioned by thermal amplitude and maximal air
temperatures in each day. However, this concentration was not affected by ozone. The
intensity of micronuclei formation was influenced by both the variations in the concentrations
of this antioxidant 24 hours before scoring of micronuclei and thermal amplitudes and
maximal temperatures in each day. The highest rates of micronuclei in T. pallida 'Purpurea'
were observed under mild daily maximum temperatures. The r most appropriate recovery
time to detect clastogenesis induced by ozone was 72 hours after exposure. However, it was
not possible to establish a dose-response curve between micronuclei frequency and different
ozone concentrations, so that the capacity of T. pallida 'Purpurea' for evaluating the
clastogenic potential of ozone still remains undetermined.
Key words: ecotoxicology, micronuclei, ozone, Trad-MCN bioassay.
5
Capítulo 1
Introdução geral
1.1 Introdução geral e justificativas
1.1.1.) Poluição atmosférica
A espécie humana, ao longo de seu histórico de ocupação da Terra, têm se
caracterizado pela notável capacidade de alterar o ambiente para garantir melhores condições
de sobrevivência. Da manipulação do fogo à queima de combustíveis diversos para alimentar
suas máquinas, passando pelos impactos tecnológico, econômico e social da Revolução
Industrial, tais alterações trazem sérias implicações para os ecossistemas e, paradoxalmente,
para a saúde do próprio ser humano.
Entre essas implicações, destaca-se a crescente emissão de gases e partículas
poluentes, oriundos de atividades antrópicas, que degradam a qualidade do ar nas regiões
6
mais densamente povoadas do planeta. Junte-se a isso, as emissões provenientes de fontes e
processos naturais, como fumaça de erupções vulcânicas, queimadas, decomposição, etc.
De acordo com a Resolução nº 3 de 28/06/1990, do Conselho Nacional do
Meio Ambiente (CONAMA 1990), considera-se poluente do ar como:
“(...) qualquer forma de matéria ou energia com intensidade e em quantidade,
concentração, tempo ou características em desacordo com os níveis
estabelecidos e que tornem ou possam tornar o ar impróprio, nocivo ou
ofensivo à saúde, inconveniente ao bem-estar público, danoso aos materiais, à
fauna e a flora (...) e as atividades normais da comunidade”
Nas áreas com grande concentração de habitantes, são verificados dois tipos de
fonte de emissão de poluentes atmosféricos: móvel, que engloba a frota de veículos
automotores, e estacionária, que abrange as atividades industriais (CETESB 2007).
Os poluentes do ar são classificados como primários e secundários. Os
primeiros são emitidos diretamente de suas fontes, enquanto que os secundários derivam de
reações entre aqueles (Finlayson-Pitts et al.. 1997).
Entre os poluentes primários, destacam-se as partículas inaláveis ou material
particulado (MP), partículas totais em suspensão (PTS), monóxido de carbono (CO),
hidrocarbonetos (HC), óxidos de nitrogênio (NO
x
), dióxido de enxofre (SO
2
) e monóxido de
carbono (CO) (CETESB 2007).
Os poluentes secundários são originados de reações entre os poluentes
primários. Algumas dessas reações ocorrem na presença de luz solar e seus produtos
compõem um grupo de poluentes secundários denominados smog fotoquímico. Os principais
constituintes do smog fotoquímico são nitrato de peroxiacetila (PAN) e ozônio (O
3
) (Clapp &
7
Jenkin 2001).
Com o intuito de divulgar entre a comunidade a qualidade do ar na Região
Metropolitana de São Paulo (RMSP), a Companhia Tecnologia de Saneamento Ambiental do
Estado de São Paulo (CETESB) periodicamente atribui índices de qualidade do ar para vários
poluentes gasosos e material particulado, provenientes de atividades antrópicas. Esses índices
são calculados de acordo com uma função matemática, que relaciona concentração do
poluente com o valor do índice e mostram, por exemplo, que o ozônio pode oferecer riscos
insignificantes em concentração de até 80 µg/ m
3
ou sérios riscos à saúde humana em
concentração acima de 800 µg/ m
3.
(CETESB 2007).
As conseqüências para a população variam de acordo com o tempo de
exposição e a toxicidade do poluente e são crescente preocupação dos órgãos gestores de
saúde pública. Correlações entre poluição do ar, doenças diversas e morbidade têm sido
amplamente investigadas (Logan 1953, Schwartz & Dockery 1992, Saldiva et al.. 1994,
Saldiva et al.. 1995, Spengler et al.. 1996, Goldsmith et al.. 1996, entre muitos outros).
1.1.2)
Ozônio como poluente
Pode-se dizer que o ozônio é um gás com função ambígua em relação aos seres
vivos, de acordo com a camada atmosférica em que é encontrado. Na estratosfera, camada
delimitada entre 10 e 50km da superfície terrestre, o ozônio absorve radiação ultravioleta
entre 240 e 320 nm, protegendo a biosfera dos efeitos nocivos dessa radiação (Krupa &
Manning 1988).
8
Na troposfera, camada atmosférica mais próxima da superfície, onde vivem os
seres vivos, o ozônio é formado quando dióxido de nitrogênio é dissociado em óxido nítrico e
oxigênio atômico, na presença de luz solar. O oxigênio atômico reage com oxigênio
molecular e forma ozônio. Essa reação de fotodissociação é reversível, em condições de
equilíbrio químico da troposfera (Krupa & Manning 1988).
Entretanto, em ambientes com ar poluído, a emissão de hidrocarbonetos, como
os compostos orgânicos voláteis (COV), rompe esse equilíbrio. Os COV reagem com óxido
nítrico, tornando a reação de fotodissociação do dióxido de nitrogênio não reversível e
promovendo o acúmulo de ozônio (Clapp 2001).
Uma vez formado, o ozônio troposférico pode ser transportado pelo vento para
longas distâncias afetando tanto áreas densamente urbanizadas quanto rurais (Rodrigues et
al.., 1996). Sua concentração em um ambiente também não é estanque, uma vez que a razão
entre seus precursores, NO
x
e COV, que regulam a formação e decomposição de ozônio na
atmosfera, pode variar de acordo com a densidade horária do tráfego veicular, principal
responsável pela emissão de tais precursores (Seinfeld 1989).
Ozônio é considerado o mais tóxico entre os poluentes oxidativos (Alloway &
Ayres 1993, Gardner & Gardner 1994). Seus efeitos deletérios consistem na alta reatividade
com membranas e biomoléculas como lipídios, proteínas, enzimas, ácidos nucléicos (Heath
1975, Mehlman & Borek 1987). Uma vez difundido nos espaços intercelulares dos seres
vivos, o poluente rege com a superfície aquosa e forma as espécies ativas de oxigênio (EAO),
que são moléculas ou íons com um átomo livre na sua camada eletrônica mais externa, o que
confere instabilidade eletrônica e alta reatividade indiscriminada com biomoléculas (Emerit
1984).
9
1.1.3) Efeitos do ozônio sobre as plantas
O aumento da concentração de ozônio, inclusive em remotas regiões agrícolas,
tem possibilitado muitos estudos sobre os efeitos desse poluente sobre as comunidades
vegetais. O poluente penetra nas folhas através dos estômatos e se difunde na câmara
subestomática (Krupa & Manning 1988, Ashmore 2005). Por ser altamente reativo com a
superfície aquosa dos tecidos do mesofilo, promove a formação de EAO e a concentração de
ozônio nas câmaras subestomáticas logo chega a patamares muito baixos, próximos de zero
(Laisk et al.. 1989).
Desde a década de 1950, muitos estudos têm sido conduzidos para
compreender os efeitos do ozônio sobre plantas. No início daquela década, começaram a ser
observadas lesões cloróticas em folhas de plantas de Nicotiana tabacum Bel-W3 cultivadas
em vastas regiões dos EUA. Essas injúrias, a princípio, atribuídas apenas a condições
climáticas, foram, anos depois, acertadamente correlacionadas com episódios de alta
concentração de ozônio troposférico (Treshow & Anderson 1989).
A partir de então, pesquisadores, em diversas partes do mundo e com as mais
variadas espécies, de cultivares de interesse agronômico a espécies arbóreas nativas, passaram
a investigar os efeitos desse poluente sobre as plantas. A tabela 1.1 lista tais injúrias de acordo
com o nível de organização do vegetal e também de acordo com alguns dos inúmeros estudos
desenvolvidos com vistas a compreender a interação poluente – planta.
10
Tabela 1.1. Injúrias decorrentes de exposição a ozônio, ordenadas de acordo com o nível de
organização.
NÍVEL DE ORGANIZAÇÃO
INJÚRIAS
REFERÊNCIA
Molecular
Peroxidação lipídica, formação
de compostos tóxicos como
malondialdeído, oxidação de
proteínas e aminoácidos,
oxidação de enzimas de reparo,
provocando danos no DNA
Janakiraman & Harney 1976
Castillo et al. 1984
Chernikova et al. 2000
Calatayud et al. 2003,
Moraes et al. 2004
Iglesias et al. 2006
Celular
Alterações na permeabilidade e
ruptura de membranas
Perchorowicz & Ting 1974
Tecido/ órgão
Cloroses, necroses e
senescência precoce
Heggestad 1991
Orendovici et al. 2003
Sant'Anna 2007
Organismo
Perda de biomassa, alterações
na arquitetura dos ramos,
alterações nas relações com
patógenos e pragas
Percy et al. 2002
População
Alterações nos ciclos de vida
Misik et al. 2007
Comunidade/ecossistema
Perda de diver
sidade, alterações
fitossociológicas, alterações na
ciclagem de nutrientes
Novak et al. 2003
11
1.1.4) Sistema de defesas antioxidativas
Antioxidantes são extremamente importantes para a sobrevivência de seres
aeróbicos, pois desintoxicam as EAO formadas nos processos metabólicos, em condições
naturais. Entretanto, em condições de estresse oxidativo, as EAO podem superar a capacidade
de desintoxicação do sistema de defesas antioxidativas, reagindo com ácidos graxos
insaturados dos lipídios das membranas,desnaturando proteínas e reagindo com bases do
DNA, causando mutações (Darral 1989). Os aldeídos derivados da peroxidação lipídica
podem inativar proteínas e enzimas (Smirnoff 1995).
Assim, tais seres vivos, entre os quais as plantas, desenvolveram um sistema de
substâncias enzimáticas e não enzimáticas, que têm por objetivo manter o equilíbrio
oxidante/antioxidante e impedir a formação de injúrias diversas, durante os processos
metabólicos naturais. Essas substâncias estão distribuídas entre as organelas celulares,
especialmente cloroplastos e mitocôndrias, diretamente envolvidos no transporte de elétrons e
na fotorrespiração, eventos que produzem EAO (Scandalios 1993).
Entre os componentes desse sistema, pode-se destacar ácido ascórbico
(vitamina C), glutationa, alfa-tocoferol (vitamina E), carotenóides, flavonóides, antocianinas
(não enzimáticos), superóxido dismutase, ascorbato peroxidase, catalases, glutationa redutase,
entre outras substâncias enzimáticas (Mittler 2002).
Ácido ascórbico ocorre em todos os tecidos, em maior quantidade em células
fotossintéticas e meristemas e também em alguns frutos (Smirnoff 1995). São atribuídos a
esse antioxidante influência na divisão celular e expansão das células, fotoproteção no
processo de fotossíntese e também proteção contra estresse oxidativo imposto por ozônio
12
(Smirnoff 1996).
Vários estudos correlacionam tolerância a ozônio e concentração de ácido
ascórbico, mostrando que os genótipos que sintetizam menor concentração desse antioxidante
são mais sensíveis ao poluente (Conklin & Barth 2004).
Espécies vegetais sensíveis, as quais são ineficientes em compensar o estresse
oxidativo ocasionado por ozônio e outros poluentes do ar têm sido, ao longo dos anos,
importantes ferramentas para monitorar a presença dos mesmos na atmosfera, bem como
avaliar riscos potenciais aos organismos vivos.
1.1.5) Biomonitoramento de qualidade do ar com plantas
Alterações físico-químicas do ambiente freqüentemente causam alterações
morfológicas e fisiológicas nos seres vivos. O grau de alteração depende da intensidade e do
potencial deletério dessas alterações ambientais. Com isso, todos os organismos podem ser
considerados bioindicadores, pois a resposta a estímulos ambientais é uma das condições para
classificá-lo como vivente (Klumpp 2001).
Nesse contexto, plantas são ferramentas bastante eficientes para apontar
alterações ao longo do tempo devido ao seu sedentarismo e condição estática em um
ambiente. Também mostram respostas a agentes clastogênicos do mesmo modo que outros
organismos eucariotos, certas espécies são altamente sensíveis a agentes clastogênicos, no
caso das plantas herbáceas, apresentam ciclo de vida curto e, por fim, constituem material de
baixo custo e fácil manejo. Com isso, as plantas superiores constituem uma eficiente
13
ferramenta para estudos in situ de poluição do ar (Constantin & Owens 1982). O primeiro
registro do reconhecimento dos efeitos de poluição sobre plantas data de 1661, com a
publicação de 'Fumifugium' por J. Evelyn (apud De Temmerman et al.. 2004). Em meados do
século XIX, Nylander correlacionou freqüência de liquens a poluição do ar (apud De
Temmerman 2004). Mas, apenas em meados do século XX, registros de alta concentração de
poluentes, os quais causaram alta mortalidade entre os habitantes (Logan 1953) e perdas
agrícolas (Heggestad 1991) intensificaram estudos de biomonitoramento da poluição do ar
com plantas, especialmente com variedades de Nicotiana tabacum (De Temmerman et al..
2004).
De Temmerman et al.. (2004) classificam as espécies vegetais utilizadas em
biomonitoramento de acordo com o tipo de reação ao poluente:
•
Bioindicadoras: são sensíveis e apresentam sintomas visíveis como necroses e
cloroses foliares, bem como alteração na morfologia e aborto de flores e frutos;
•
Biosensoras ou biomarcadoras: os sintomas apresentados não são visíveis,
necessitando de microscópio ou técnicas de análises fisiológicas. Os danos
restringem-se a alterações nos níveis molecular, celular, além de distúrbios
fisiológicos;
•
Bioacumuladoras: espécies menos sensíveis à poluição do ar, acumulam
partículas e gases-traço em seus tecidos;
•
Indicadoras ecológicas: são observadas mudanças em comunidades vegetais,
14
como o desaparecimento de espécies não tolerantes à poluição ou colonização de
espécies oportunistas e/ou mais tolerantes.
Nos últimos anos, muitas espécies vegetais têm sido utilizadas com eficiência
no monitoramento de poluentes, sobretudo ozônio. Entre essas espécies, destacam-se, pela
difusão e procedimentos analíticos simples, aquelas que apresentam mutagênese, enquadradas
na categoria de biosensoras, como Allium cepa, Vicia faba e clones de híbridos de
Tradescantia sp. (Grant 1994).
1.1.6) Bioensaios de mutagênese e clastogênese
Agentes genotóxicos (como as EAO) podem causar lesões primárias em DNA,
como oxidação e dimerização de bases nitrogenadas, as quais podem ou não ser atenuadas
com enzimas de reparo do DNA. Injúrias mais dramáticas ocorrem tanto no nível de gene
quanto de cromossomos e levam, respectivamente, à expressão de genes mutantes e alterações
estruturais (fragmentações e aberrações) cromossômicas (Uhl et al.. 2003).
Os bioensaios utilizados para detectar genotoxidade, listados por Grant (1999),
baseiam-se, freqüentemente, em dois grupos de injúrias: aberrações cromossômicas e
mutações genéticas.
A fragmentação de braços de cromossomos (clastogênese) ocorre durante a
divisão celular, tanto em mitose quanto em meiose e em conseqüência de mutações genéticas.
Tem sido, igualmente, utilizada como resposta bioindicadora da presença de agentes
15
genotóxicos no ambiente. Tais fragmentos, denominados micronúcleos (MCN), organizam-se
fora do núcleo principal e podem ser visualizados em fases específicas da divisão celular (Uhl
et al.. 2003).
Entre os bioensaios de clastogênese mais utilizados, estão o Allium Test, que
consiste em quantificar MCN em células do ápice de raiz de espécies como Allium cepa, Vicia
faba, Zea mays, entre outras (Fiskesjo 1997).
Outra categoria de bioensaio de clastogênese, denominado TRAD-MCN
envolve clones híbridos de Tradescantia sp. (BNL e KU). Tal bioensaio consiste em
quantificar MCN em células-mães de grão de pólen em ramos florais expostos a um agente de
clastogênese. Se tais células estiverem nas fases iniciais do ciclo meiótico (prófase I),
consideradas as mais sensíveis à ação de agentes de clastogênese, serão formados MCN, os
quais poderão ser visualizados na fase de tétrades (Ma 1982). A figura 1.1 mostra o ciclo
meiótico em células-mães de grão de pólen em Tradescantia sp. .
Figura 1.1: Ciclo meiótico em Tradescantia sp. (Ma 1983). As setas indicam presença de
micronúcleos.
16
Os clones da série BNL foram desenvolvidos na década de 1950, no
Brookhaven National Laboratory, EUA. Tais clones demonstraram, desde o início,
sensibilidade a agentes genotóxicos, especialmente radiação (Rodrigues et al.1997).
Apenas a partir da década de 1970, os clones BNL, especialmente o 4430,
híbrido diplóide resultante do cruzamento de T. hirsutufolia e T. subacaulis, passaram a ser
utilizados em biomonitoramento de poluição ambiental (Vant' Hof & Schairer 1982). Nessa
mesma época, foram desenvolvidos os clones da série KU, na Universidade de Kioto, Japão,
para o mesmo fim (Ichikawa 1992). Desde então, inúmeros estudos têm aplicado tais clones
na detecção, principalmente, de poluentes em água (Gill & Sandhu 1992), ar (Ferreira et al..
2007) e solo (Cotelle et al.. 1999), entre muitos outros.
Na região metropolitana de São Paulo, vários estudos têm sido conduzidos com
tais clones para detectar a presença de poluentes atmosféricos (Batalha et al.. 1999,
Sant’Anna 2003, entre outros)
Porém, alguns desses autores apontam dificuldades de adaptação dos clones às
condições climáticas da região, o que compromete sua eficiência como bioindicador de
contaminação do ambiente (Sant’Anna 2003, Ferreira 2004).
Além disso, a formação de MCN pode ser condicionada por diversos fatores,
entre climáticos (radiação, temperatura, umidade relativa), poluentes diversos ou substâncias
tóxicas (formaldeído, pesticidas, etc) (Rodrigues et al.. 1997). Em relação à poluição
atmosférica, essa não especificidade dificulta investigações in situ sobre o potencial
clastogênico de poluentes específicos como o ozônio, como ocorreu no estudo de Savóia
(2007). Em vista disso, estudos devem ser conduzidos para atestar a clastogênese de ozônio,
em condições experimentais controladas.
Aliás, embora reconhecidamente fitotóxico para várias espécies vegetais, não é
17
consencioso que ozônio possa impor clastogênese para clones de Tradescantia (Rodrigues et
al.. 1996)
Assim com o intuito de propor uma espécie que possa ser empregada para
biomonitoramento de ozônio, adaptada às condições climáticas da Região e eficiente para o
bioensaio TRAD-MCN, o presente estudo propõe investigar o potencial bioindicador de
Tradescantia pallida ‘Purpurea’ para ozônio.
Tradescantia pallida ‘Purpurea’ é uma cultivar nativa da América
Central, muito utilizada em várias partes do mundo para ornamentação de canteiros, inclusive
no Brasil e tem sido utilizada para monitorar poluição ambiental por meio do bioensaio
TRAD-MCN (Batalha et al.. 1999, Guimarães et al.. 2000, Suyiama et al.., 2002, Sant’Anna
2003, Savóia 2007)
No presente estudo, levantaram-se as seguintes hipóteses:
• T. pallida ‘Purpurea’, devido ao seu alto conteúdo de água nas células
do mesofilo, de acordo com Paiva et al. (2003), é sensível ao ozônio.
• A intensidade da injúria clastogênica depende da capacidade
antioxidativa, de modo que esta aparecerá após a quebra do equilíbrio
oxidante/ antioxidante. Partindo desse desequilíbrio, um certo período é
requerido para a formação de micronúcleos.
18
1.2. Objetivos
• Estabelecer freqüência basal de micronúcleos em indivíduos
cultivados em ambiente isento de contaminação do ar (casa de
vegetação) e fatores condicionantes;
• Determinar o grau de sensibilidade de T. pallida ‘Purpurea’ a
ozônio e fatores condicionantes além do período necessário para
a visualização dos danos;
• Estabelecer a capacidade bioindicadora de T.pallida ‘Purpurea’
para avaliar riscos clastogênicos impostos por ozônio.
1.3. Literatura citada
Alloway, B. J. & Ayres, D. C. 1993. Chemical Principles of Environmental Pollution.
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29
Capítulo 2
Monitoramento da frequência espontânea de
micronúcleos em T. pallida 'Purpurea' em ambiente
isento de contaminação atmosférica
2.1. Resumo
Entre as espécies vegetais utilizadas em biomonitoramento da poluição
atmosférica, Tradescantia pallida (Rose) D.R. Hunt cv Purpurea Boom, uma Commelinaceae
de hábito herbáceo, originária da América Central, tem sido utilizada com eficiência, devido à
sua rusticidade, facilidade de cultivo e boa adaptação às condições climáticas do Brasil. O
bioensaio TRAD-MCN, o qual é empregado para tal espécie, consiste em quantificar
fragmentação de cromossomos, induzida por agentes mutagênicos, como contaminantes do ar,
durante a prófase I da meiose. Esses fragmentos, chamados de micronúcleos (MCN),
organizam-se na periferia do núcleo e são visualizados em tétrades de células – mães de grãos
30
de pólen. Entretanto, não são conhecidos registros de acompanhamento da freqüência
espontânea de MCN em ambientes indoor, livres de poluentes atmosféricos, para T. pallida
'Purpurea'. Nesse estudo, propõe-se demonstrar a variação na freqüência basal de MCN, no
período de agosto de 2005 a dezembro de 2006 e correlacionar tais valores às médias de
temperatura e de umidade relativa máximas, mínimas, e à variação diária de radiação solar
global registrada no período. Indivíduos de T pallida 'Purpurea' foram cultivados em vasos
plásticos, exclusivamente em casa de vegetação climatizada, com irrigação por capilaridade e
adubação quinzenal. Foram coletadas inflorescências dessas plantas e empregado o bioensaio
TRAD-MCN, com análise de dez lâminas por mês. A temperatura dentro da casa de
vegetação foi auferida por termohigrógrafo. Dados sobre umidade relativa do ar e radiação
solar global foram cedidos pelo Instituto Astronômico e Geofísico da Universidade de São
Paulo e corrigidos para as condições da casa de vegetação. A média mensal das máximas
registradas foi de 24 ºC (janeiro de 2006) a 33,6 ºC (outubro de 2005), mínimas de 16,9 ºC
(setembro de 2006) a 26,1 ºC (novembro de 2006) e variação de 4,8 ºC (novembro de 2006) a
13 ºC (setembro de 2006). A média de radiação solar global variou entre 6,34 (setembro de
2005) a 10,78 (dezembro de 2005) MJ/ m
2
. A umidade relativa do ar variou entre 65,1%
(agosto de 2005) a 75,7 (setembro de 2005). A porcentagem de MCN variou de 0,4%
(novembro de 2005) a 1,8% (junho de 2006). No entanto, análises estatísticas não indicaram
diferenças entre os meses. Não houve relação significativa entre as freqüências basais e
umidade relativa do ar e radiação solar global. Entretanto, episódios mais amenos de
temperatura máxima diária (entre 22 e 28
o
C) e menores oscilações térmicas (amplitude entre
4 e 8
o
C) foram determinantes para picos de MCN ao longo do experimento.
Palavras-chave: bioensaio Trad-MCN, clastogênese, Commelinaceae,
31
2.2. Introdução
Alterações fenotípicas e genotípicas dos órgãos reprodutivos de vegetais são
dramaticamente influenciadas pelas condições do ambiente. Essa plasticidade pode ser
explicada pelo fato de que carpelos e estames são originados pela diferenciação de tecidos
meristemáticos vegetativos, constantemente afetados pelas alterações ambientais, sobretudo
climáticas (Chiarello & Gulmon 1991).
Disfunções hormonais e expressão de genes induzem alterações na ontogênese
de estames e carpelos e gametogênese (Raghavan 1997). Em várias espécies, anormalidades
na meiose são responsáveis pela formação de pólen estéril e baixa produção de sementes
(Golubovskaya 1979).
Como exemplo, Corrêa et al.. (2005) conduziram experimento de análise de
microsporogênese e viabilidade polínica em espécies de Araceae e constataram que a
temperatura e sazonalidade climática podem afetar a produção de pólen viável. Em outro
estudo, Souza et al.. (2006) encontraram segregação incompleta de cromossomos na meiose e
formação de micronúcleos em uma espécie de Rubiaceae e também creditaram essas
alterações a fatores ambientais e expressão gênica.
Entre as alterações ambientais mais dramáticas, a poluição de diversos tipos
pode afetar, de modo significativo, a reprodução das plantas. Em um estudo, emissões de
contaminantes do ar, oriundos de pólo industrial, foram positivamente correlacionadas com
esterilidade de pólen em diversas espécies arbóreas nativas em uma região da Europa (Misik
et al.. 2007).
Em face dessa influência, para algumas espécies vegetais empregadas em
ensaios de genotoxicidade, a correta compreensão dos dados depende do prévio conhecimento
32
da ocorrência dessas anomalias em condições de ausência dos poluentes ou de agentes
genotóxicos a que se pretende monitorar. Assim, vários estudos foram realizados nos últimos
anos, com o objetivo de estabelecer níveis basais de mutações espontâneas, especialmente em
clones de Tradescantia sp.
A maior parte desses estudos aborda a freqüência de mutações espontâneas em
células somáticas de pêlo estaminal em clones KU e BNL, utilizando o bioensaio TRAD –
STH (Ichikawa 1992, Ma et al.. 1994). Nesses experimentos, a variação na temperatura
ambiente pode ser correlacionada com a taxa de mutações. A despeito da ampla difusão do
bioensaio de clastogênese com células – mães de grão de pólen, poucos estudos se
propuseram a acompanhar a frequência espontânea de micronúcleos em clones de
Tradescantia sp. Pode-se destacar, nesse grupo, o experimento conduzido por Klumpp et al..
(2004), que simularam diversos gradientes de temperatura e umidade relativa do ar em
laboratório e expuseram inflorescências do clone BNL 4430 para conferir sua eficácia em
diferentes condições térmicas. Não há registros de experimento semelhante envolvendo
Tradescantia pallida 'Purpurea'.
Em face disso, o presente estudo propõe delimitar a taxa espontânea de
micronúleos em tétrades de T. pallida 'Purpurea' e estabelecer um valor basal com plantas
cultivadas em ambiente comprovadamente isento de contaminantes atmosféricos, mas
submetido à sazonalidade climática observada na cidade de São Paulo. e correlacionar os
valores basais às oscilações da temperatura, umidade relativa do ar e radiação solar global,
registrados ao longo do experimento.
33
2.3. Material e métodos
2.3.1) Cultivo
Indivíduos de T. pallida 'Purpurea' foram propagados vegetativamente por
estacas e plantados em vasos plásticos contendo uma mistura de substrato de casca de Pinus e
turfa e vermiculita, na proporção de 3:1. Pedaços de barbante de náilon foram introduzidos no
fundo de cada vaso, deixando que uma extremidade ficasse entre o substrato e a outra imersa
em caixotes plásticos abastecidos com água, o que garantiu constante irrigação por
capilaridade.
As plantas foram adubadas quinzenalmente com solução hidrossolúvel de N-P-
K (10-30-20) e permaneceram durante todo o experimento na casa de vegetação da Seção de
Ecologia do Instituto de Botânica (figura 2.1.A e 2.1.B). Esse ambiente recebeu ar filtrado,
isento de partículas e de gases, durante todo o experimento. Aparelhos de ar condicionado,
cujo funcionamento era controlado por termostato, permitiram simular as condições térmicas
similares às do ambiente externo. Durante o cultivo, as plantas permaneceram sob fotoperíodo
de, aproximadamente, 12 h.
34
Figura 2.1. Condições de cultivo de T. pallida 'Purpurea' para o experimento. A: Casa de
vegetação da Seção de Ecologia/ IBT. B: T. pallida 'Purpurea' plantada em vasos plásticos
sobre caixotes com água para irrigação. Fotos: E. S. Lima.
2.3.2) Bioensaio TRAD-MCN
Inflorescências de T. pallida 'Purpurea' foram coletadas na segunda ou terceira
semana de cada mês, entre agosto de 2005 e dezembro de 2006. Tais inflorescências não
passaram por período de recuperação e foram diretamente fixadas após coleta. O material
coletado foi fixado solução de Carnoy # 1 (Singh 2003), onde permaneceu por 24 horas e
depois, foi transferido para solução de etanol a 70% até a preparação para o bioensaio TRAD-
MCN (figura 2.2).
O protocolo adotado para o bioensaio foi o estabelecido por Ma (1981). Para
cada amostragem mensal, foram coletadas dez inflorescências jovens das plantas mantidas na
casa de vegetação. Entre os botões de cada uma dessas inflorescências, um deve apresentar
B
A
35
células-mães no estágio da prófase I da meiose, mais especificamente, a fase de tétrades, onde
é possível visualizar micronúcleos (MCN), como na figura 2.3. Esses botões foram dissecados
com estiletes e as anteras foram maceradas sobre lâmina de vidro, juntamente com o corante
aceto carmim (Roth 1964).
As lâminas foram analisadas em microscópio (modelo CBB, Olympus), em
aumento de 400 X
A freqüência de MCN foi expressa em porcentagem, para lâmina analisada, a
partir do seguinte cálculo (Silva 2005):
% de MCN = a/b*100
, sendo: a = total de MCN encontrados
b = total de tétrades analisadas
Figura 2.2. Procedimentos protocolados para o bioensaio TRAD-MCN (Ma 1981).
36
Figura 2.3: Tétrade de T. pallida 'Purpurea' com um micronúcleo, apontado pela seta. Foto:
E. S. Lima.
Durante todo o período, a temperatura foi auferida por termohigrógrafo (TZ- -18
td, Zootechnikh, Poland). Entretanto, falhas ocasionais no equipamento não permitiram reunir
dados contínuos ao longo de todo o período. Para preencher tais lacunas, foram adotados,
então, dados fornecidos pelo Instituto de Astronomia e Geofísica (IAG) da Universidade de
São Paulo. Foi empregado um índice de correção, obtido a partir dos dados registrados pelo
termohigrágrafo, para tornar os valores cedidos pelo IAG adequados para as condições da
casa de vegetação. Da mesma maneira, os valores diários de umidade relativa do ar e de
radiação global, também cedidos pelo IAG, foram adaptados às condições da casa de
vegetação, tendo por base as diferenças entre os valores gerados por Bulbovas (2005) para o
mesmo local e para seus locais de amostragem situados na cidade de São Paulo.
37
2.3.4) Análises estatísticas
Foi empregada análise de variância (não paramétrica; teste de Kruskal-Wallis)
com 1 fator para verificar se houve variação na freqüência basal de MCN ao longo dos meses.
Foram realizadas análises de regressão entre a freqüência de micronúcleos e os
registros de temperatura e de umidade relativa do ar (com valores máximos, mínimos e
médios diários, assim como com a amplitude entre valores máximos e mínimos em cada dia)
e os de radiação solar global média.
2.4. Resultados
A figura 2.4 ilustra os valores diários das variáveis climáticas, registrados na
casa de vegetação da Seção de Ecologia do IBT. Na figura 2.4.A, nota-se que não houve forte
sazonalidade nas temperaturas médias, máximas e mínimas diárias ao longo dos meses de
amostragem. A temperatura média permaneceu em uma faixa entre 20 e 30ºC. A média
mensal das máximas registradas variou de 24ºC (janeiro de 2006) a 33,6ºC (outubro de 2005),
das mínimas de 16,9ºC (setembro de 2006) a 26,1ºC (novembro de 2006) e da amplitude
térmica de 4,8ºC (novembro de 2006) a 13ºC (setembro de 2006). A figura 2.4.B mostra os
valores de máximas e mínimas diárias para umidade relativa do ar. Nota-se considerável
variação entre as médias diárias dos valores mínimos registrados (20% a 80%) e menor
variação nos valores máximos diários ao longo do ano (60 a 90%). Em média, a umidade
38
relativa do ar, em base diária, ficou entre 65,1% (agosto de 2005) e 75,7 (setembro de 2005).
Com o índice de correção empregado para adequar os valores cedidos pelo IAG à casa de
vegetação, constatou-se redução da umidade relativa do ar em 11% nesse recinto, em relação
à observada no ambiente externo. Na figura 2.4.C, a média de radiação solar global variou
entre 6,34 (setembro de 2005) a 10,78 (dezembro de 2005) MJ/ m
2 .
Com a correção dos
valores fornecidos pelo IAG, foi constatada uma redução de 45% de radiação incidente na
casa de vegetação em relação ao ambiente externo.
39
0
10
20
30
40
jul-
05
ago-
05
set-
05
out-
05
nov-
05
dez-
05
jan-
06
fev-
06
mar-
06
abr-
06
mai-
06
jun-
06
jul-
06
ago-
06
set-
06
out-
06
nov-
06
dez-
06
Temperatura (
o
C)
Máx. diária Min. diária Ampl. diária Média diária
0
20
40
60
80
100
jul-
05
ago-
05
set-
05
out-
05
nov-
05
dez-
05
jan-
06
fev-
06
mar-
06
abr-
06
mai-
06
jun-
06
jul-
06
ago-
06
set-
06
out-
06
nov-
06
dez-
06
Umidade relativa (%)
Máx. diária
Min. diária
0
5
10
15
20
jul-
05
ago-
05
set-
05
out-
05
nov-
05
dez-
05
jan-
06
fev-
06
mar-
06
abr-
06
mai-
06
jun-
06
jul-
06
ago-
06
set-
06
out-
06
nov-
06
dez-
06
Rad. global (MJ/m
2
)
A
B
C
Figura 2.4: Variáveis climáticas registradas na casa de vegetação Seção de Ecologia/IBT
durante o experimento de monitoramento (agosto de 2005 a dezembro de 2006). A:
Temperatura máxima, média, mínima e amplitude térmica diária; B: Umidade relativa do ar
máxima e mínima diárias; C: média diária de radiação solar global.
40
A figura 2.5 mostra a frequência de MCN obtida de células-mães de grão de
pólen em inflorescências coletadas entre os indivíduos de T. pallida 'Purpurea' cultivados
exclusivamente em casa de vegetação. Análises de variância indicaram que a frequência de
MCN não indica diferenças significativas entre os meses investigados. Entretanto, nota-se
tendência de aumento dessa freqüência nos meses em que foram registradas as temperaturas
mais amenas e radiação solar mais baixa. Os referidos meses foram junho e agosto (mediana
= 1,3% para ambos os meses).
Figura 2.5: Freqüência de micronúcleos (MCN) observada em inflorescências de plantas de
T. pallida 'Purpurea' mantidas em casa de vegetação, ambiente isento de contaminação
atmosférica, entre agosto de 2005 e dezembro de 2006.
A linha que divide cada retângulo indica a mediana dos dados; os retângulos delimitam os 25% de dados acima e
abaixo da mediana (percentis de 25 e 75); as barras de erro mostram os valores situados entre os percentis de 10
e 25 ou entre os de 75 e 90 e os símbolos (o) os valores extremos (abaixo do percentil de 5 ou acima do de 95).
a
g
o
/
0
5
s
e
t
/
0
5
o
u
t
/
0
5
n
o
v
/
0
5
d
e
z
/
0
5
j
a
n
/
0
6
f
e
v
/
0
6
m
a
r
/
0
6
a
b
r
/
0
6
m
a
i
/
0
6
j
u
n
/
0
6
j
u
l
/
0
6
a
g
o
/
0
6
s
e
t
/
0
6
o
u
t
/
0
6
n
o
v
/
0
6
d
e
z
/
0
6
MCN/100 tétrades
0
1
2
3
4
5
6
7
41
Foram construídas matrizes de regressão entre a taxa de micronúcleos obtida
em cada dia de amostragem e os valores das variáveis climáticas mencionadas anteriormente,
no próprio dia de análise e nos 05 dias que antecederam a amostragem, assim como com
valores médios mensais (dados não mostrados). Verificou-se relação significativa e mais
evidente (com base no maior valor de r
2
) entre freqüência de MCN e amplitude térmica e
valores máximos de temperatura registrados três dias (72 horas) antes da amostragem, como
mostra a figura 2.6. Assim, a menor freqüência de MCN observada ao longo de um mês pode
ser explicada pela maior oscilação térmica (figura 2.5.A), com r
2
= 0,49 e também por picos
de temperatura registrados 72 horas antes (figura 2.5.B), com r
2
= 0,47. Por outro lado, as
oscilações na freqüência de MCN não foram associadas à sazonalidade nos valores de
umidade relativa e de radiação global (dados não mostrados).
Figura 2.6: Relação entre freqüência de micronúcleos (MCN) e temperatura do ar três dias
antes da amostragem. A: MCN versus amplitude térmica; B: MCN versus máximas de
temperatura.
Amplitude T (
o
C)
4 6 8 10 12 14
MCN/100 tétrades (Mediana - %)
0
1
2
y = 1,72 + 0,11x
R
2
= 0,49; p = 0,02
A
T máx (
o
C)
22 24 26 28 30 32 34
MCN/100 térades (Mediana - %)
0
1
2
y = 3,00 + 0,08x
R
2
= 0,47; p = 0,02
B
42
2.5. Discussão
As freqüências espontâneas de MCN observadas no presente estudo variaram
entre 0,4 e 1,8% de MCN. Estudos de monitoramento da freqüência basal de MCN em
ambiente comprovadamente isento de poluentes genotóxicos são escassos, mesmo para os
clones KU e BNL de Tradescantia, amplamente difundidos em biomonitoramento. Ruiz et
al.. (1992) investigaram poluentes genotóxicos em várias regiões do Mexico e mantiveram,
em laboratório com condições experimentais controladas, inflorescências do clone BNL 4430
para monitoramento mensal, por mais de dois anos. Os autores afirmam que a média de
freqüência de MCN nessas inflorescências foi de 0,8 %. Klumpp et al.. (2006) determinaram
que, nas condições climáticas européias, a freqüência de MCN de clones BNL 4430
cultivados em casa de vegetação variou entre 0,6 e 2,9%. Assim, a freqüência basal de MCN
em T. pallida 'Purpurea' se alinha àquelas observadas para o clone BNL, propostas nos
estudos citados.
Porém, em relação a T. pallida 'Purpurea', o presente estudo é o primeiro
registro conhecido de freqüência de MCN em plantas cultivadas em ambiente
reconhecidamente isento de poluentes genotóxicos. Estudos realizados com essa cultivar
utilizam plantas já estabelecidas em localidades consideradas livres ou com menor
concentração de contaminantes atmosféricos. Alves et al.. (2003) encontraram uma faixa de
freqüência entre 1,9 e 5,3% em inflorescências expostas em sítio-controle. Já Guimarães et
al.. (2000) constataram uma média de 2,3% de MCN em inflorescências cultivadas em uma
localidade distante daquelas investigadas no estudo. Todos esses valores, aliás, estivaram
acima dos registrados nesta pesquisa. Essas diferenças são possíveis visto a formação de
43
MCN ser um evento não específico, isto é, a clastogênese pode ser condicionada por vários
agentes, como poluentes do solo, ar e água, radiação ionizante, radiação UV, pesticidas, etc,
como demonstra Ma et al.. (1982), que testou a genotoxidade de vários agentes em clones de
Tradescantia. Assim, pode-se dizer que mesmo em condições supostamente livres de
contaminantes atmosféricos, um considerável conjunto de fatores condicionantes podem ter
imposto clastogênese à T. pallida 'Purpurea' tomadas como controle nos referidos estudos.
Nas condições experimentais do presente estudo, análises estatísticas não
revelaram ligação significativa com umidade relativa do ar, o que está de acordo com o
observado por Klumpp et al.. (2004), ao investigarem o efeito de diferentes faixas de
temperatura e umidade relativa do ar para a freqüência de MCN em plantas do clone BNL
4430 expostas a condições experimentais controladas. Esses autores não encontraram relação
significativa entre freqüência de MCN e esse fator climático.
Não foi encontrada relação significativa entre MCN e radiação solar para T.
pallida 'Purpurea'. Não há registros de monitoramento de clastogênese imposta por radiação
solar nessa cultivar. No entanto, para o clone BNL 03, por exemplo, há o estudo desenvolvido
por Wang & Wang (1999), que expuseram inflorescências a radiação solar acrescida de
radiação UVB, artificialmente produzida. Os autores afirmam que inflorescências mantidas
como controle, que foram submetidas a um pico de radiação solar, sem adição de UVB,
apresentaram uma taxa anormalmente alta de MCN (7,1%). Os autores concluíram que o
aumento de MCN foi estimulado pela intensidade da radiação solar.
A temperatura foi apontada como o fator climático mais influente na
freqüência basal de MCN observada em T. pallida 'Purpurea'. Análises estatísticas indicaram
que declínio de temperatura ou grandes oscilações térmicas levaram à formação de MCN 72
horas depois. Tal constatação está de acordo com estudos desenvolvidos com clones BNL e
44
KU. Kumpp et al.. (2004) constataram que aumento de clastogenicidade no clone BNL 4430
está condicionado a temperaturas mais baixas no período de recuperação, quando
inflorescências são mantidas em ambiente livre de agentes genotóxicos para a continuidade do
ciclo meiótico. Ichikawa et al.. (1996) também reportam o aumento de mutações em células
somáticas de pêlo estaminal nos clones KU a temperaturas mais baixas.
No presente estudo, concluiu-se que a freqüência de MCN em T. pallida
'Purpurea' em ambiente isento de contaminantes atmosféricos oscilou pouco ao longo do
estudo, em média entre 0,4 e 1,8%. Não houve comprovação estatística da relação entre essas
freqüências basais e variáveis climáticas, como umidade relativa do ar e radiação solar global.
Entretanto, episódios mais amenos de temperatura máxima diária (entre 22 e 28
o
C) e
menores oscilações térmicas (amplitude entre 4 e 8
o
C) foram determinantes para picos de
MCN ao longo do experimento. Conforme será mostrado no próximo capítulo, as respostas
clastogênicas observadas em inflorescências de T. pallida expostas ao ozônio foram mais
intensas nessas condições.
2.6. Literatura citada
Alves, E. S., Pedroso, A. N. V., Domingos, M., Guimarães, E. T. & Saldiva, P. H. N.
2003. Biomonitoramento indoor do potencial mutagênico do ar em laboratórios e
herbário do Instituto de Botânica por meio do bioensaio Trad-MCN. Hoehnea 30(2):
89-94
45
Bulbovas, P. 2005. Defesas antioxidativas em plantas jovens de Caesalpinia echinata Lam.
(pau-brasil) como indicadoras de resistência da espécie à poluição atmosférica na
cidade de São Paulo, SP. Tese de Doutoramento. Instituto de Biociências.
Universidade de São Paulo, São Paulo. 108 p.
Chiarello, N.R. & Gulmon, S.L. 1991. Stress effects on plant reproduction. In: Response of
plants to multiple stresses, H. Mooney, AA. William, E. Winner & E. J. Pell (eds).
Academic Press Inc. pp. 161 – 187
Corrêa, M.G.S., Viégas, J., Silva, J. B., Ávila, P. F. V., Busato, G. R., Lemes, J. S. 2005.
Meiose e viabilidade polínica na família Araceae. Acta Botanica Brasilica 19(2): 295-
303
Golubovskaya, I. N. 1979. Genetic control of meiosis. International Review of Cytology.
58:247-290
Guimarães, E. T., Domingos, M., Alves, E. S., Caldini Jr., N., Lobo, D. J. A., Lichtenfels,
A. J. F. C. & Saldiva, P. H. N. 2000. Detection of the genotoxicity of air pollutants in
and around the city of São Paulo (Brazil) with the Tradescantia – micronucleus (Trad-
MCN) assay. Environmental and Experimental Botany 44: 1-8
Ichikawa, S. 1992. Tradescantia stamen-hair system as an excellent botanical tester of
mutagenicity: its responses to ionizing radiations and chemical mutagens, and some
synergistici effects found. Mutation Research 270: 3-22
46
Ichikawa, S., Nakano, A., Kenmochi, M., Yamamoto, I., Murai, M., Takahashi, E.,
Yamaguchi, A., Watanabe, K., Tomiyama, M., Sugiyama, K., Yogo, A., Yazaki,
T., Okumura, M., Shima, N., Satoh, M., Yoshimoto, M., Xiao, L. Z. 1996. Yearly
variation of spontaneous somatic mutation frequency in the stamen hairs of
Tradescantia clone KU 9 grown outdoors, wich showed a significant increase after the
Chernobyl accident. Mutation Research 349: 249-259
Klumpp, A, Ansel, W., Fomin, A., Schnirring, S. & Pickl, C. 2004. Influence of climatic
conditions on the mutations in pollen mother cells of Tradescantia clone 4430 and
implications for the Trad-MCN bioassay protocol. Hereditas 141: 142-148
Klumpp, A., Ansel, W., Klumpp, G., Calatayud, V., Garrec, J. P., He, S., Peñuelas, J.,
Ribas, A., Ro-Poulsen, H., Rasmussen, S., Sanz, M. J. & Vergne, P. 2006.
Tradescantia micronucleus test indicates genotoxic potential of traffic emissions in
Europe cities. Enviromental Pollution 139: 515-522
Ma, T. H. 1981. Tradescantia micronucleus bioassay and pollen tube chromatid aberration
test for in situ monitoring and mutagen screening. Environmental Health Perspective
37: 85-90
Ma, T. H., Cabrera, G. L., Cebulska-Wasilewska, A., Chen, R., Loarca, F., Vandenberg,
A. L. & Salamone, M. F. 1994. Tradescantia stamen hair mutation bioassay.
Mutation Research 310: 211-220
47
Misik, M.. Micieta, K., Solenska, M., Misikova, K., Pisarcikova, H. & Knasmuller, S.
2007. In situ biomonitoring of the genotoxic effects of mixed industrial emissions
using the TRAdescantia micronucleus and pollen abortion tests with wild life plants:
demonstration of the efficacy of emission controls in a eastern European city.
Environmental Pollution 145: 459-466
Raghavan, V. 1997. Molecular embriology of flowering plants. Cambridge University Press.
690 p
Roth, I. 1964. Microtécnica vegetal. Editora Facultad de Ciencias Universidad Central de
Venezuela, Caracas. 87 p.
Ruiz, E. F., Rabago, V. M. E., Lecona, S. U., Perez, A. B. & Ma, T. H. 1992. Tradescantia-
micronucleus (Trad-MCN) bioassay on clastogenicity of wastewater and in situ
monitoring. Mutation Research 270: 45-51
Silva, M. D. 2005. Delimitação do potencial de plantas de Tradescantia pallida cv. Pupurea
cultivadas na cidade de São Paulo par indicadores de riscos clastogênicos impostos
pela poluiçã aérea. Tese de Doutoramento. Instituto de Biociências, Universidade de
São Paulo, São Paulo. 69 p.
Singh, R. 2003. Plant cytogenetics. C R C Press, USA. 463 p.
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Souza, M. M., Martins, E. R., Pereira, T. N . S. & Oliveira, L. O. 2006. Reproductive
studies on Ipeac ( Cephaelis ipecacuanha (BROT.) A. Rich; Rubiaceae): Meiotic
behaviour and pollen viability. Brazillian Journal of Biology 66(1A): 151-159
Wang, S. & Wang, X. 1999. The Tradescantia – micronucleus test on the genotoxicity of
UV-B radiation. Mutation Research 426: 151-153
49
Capítulo 3
Grau de sensibilidade de Tradescantia pallida
'Purpurea' ao ozônio por meio de respostas
clastogênicas
3.1. Resumo
O presente estudo investiga a correlação entre formação de micronúcleos
(MCN) e fatores condicionantes, como concentração de ácido ascórbico (AA), um
reconhecido antioxidante, e temperatura do ar durante a realização dos bioensaios, em
inflorescências de T. pallida 'Purpurea' expostas a ozônio. Propõe-se também investigar se o
tempo de recuperação para visualização de micronúcleos (MCN) é diferente do estabelecido
no protocolo TRAD-MCN. Inflorescências retiradas de indivíduos cultivados exclusivamente
em casa de vegetação foram distribuídas em duas câmaras fechadas de fumigação, uma com
aporte de ar filtrado e outra com ar filtrado enriquecido com 60 ou 80 ppb de ozônio,
50
fumigados durante três horas de um único dia. Subgrupos dessas inflorescências começaram a
ser retirados a cada 24 horas após fumigação, até completar 120 horas. Em cada subgrupo,
foram analisadas a formação de micronúcleos em células-mães de grãos de pólen (bioensaio
TRAD-MCN) e, por meio de análises de regressão, a influência da concentração de AA total
em brácteas dessas inflorescências e da temperatura diária durante o bioensaio sobre as
respostas clastogênicas. Análises estatísticas mostram que há, predominantemente,
significativo aumento da freqüência de MCN a 72 horas após fumigação com ozônio. A
concentração de AA variou nos dois tratamentos em função do tempo de recuperação e da
amplitude térmica desse período, não apresentando correlação positiva com ozônio.
Entretanto, há nítida relação entre declínio da concentração de AA e conseqüente aumento da
freqüência de MCN 24 horas depois. A intensidade de formação de micronúcleos também
dependeu da amplitude térmica ou das temperaturas máximas. Nas condições de realização do
presente estudo, a fim de obter respostas clastogênicas mais evidentes, pode-se recomendar
que os bioensaios, da exposição ao ozônio ao período de recuperação, sejam realizados sob a
menor amplitude diária possível entre temperaturas máxima e mínima (< 8
o
C) e sob
temperaturas máximas entre 20 e 26
o
C. Contudo, ainda não é possível determinar a eficiência
de T. pallida para indicar riscos clastogênicos impostos por ozônio, sob condições naturais,
uma vez que não foi possível estabelecer modelo de curva dose x resposta entre concentrações
de ozônio e freqüência de micronúcleos.
Palavras-chave: ácido ascórbico, ecotoxicologia, micronúcleo
51
3.2. Introdução
Ozônio é um dos mais oxidativos constituintes do smog fotoquímico (Heath
1975). Esse poluente reage com a superfície aquosa de membranas e espaços intercelulares e
forma espécies ativas de oxigênio (EAO), que reagem indiscriminadamente com lipídios,
proteínas e ácidos nucléicos nos seres vivos, levando à degradação e rompimento de
membranas, peroxidação lipídica e mutagênese (Perchorowicz & Ting 1974, Victorin 1992,
Rodrigues et al.. 1996, Bray et al.. 2000, Baier et al.. 2005, Foyer & Noctor 2005).
Há décadas atrás, vários estudos já relacionavam o potencial fitotóxico desse
poluente e formação de injúrias em plantas (Treshow & Anderson 1989). Desde então,
variados efeitos sobre as plantas têm sido apontados na literatura, como os relacionados na
tabela 1.2 (capítulo 1).
Além disso, uma miríade de estudos aponta a variação da sensibilidade a
ozônio entre as espécies vegetais (Castillo & Greppin 1988, Kangasjarvi et al.. 1994, Luwe &
Heber 1995, Torsethaugen et al.. 1997, Lyons et al.. 1999, Burkey & Eason 2002,
Langebartels et al.. 2002, Song et al.. 2005, Moraes et al.. 2006, entre muitos outros). Esses
estudos convergem para o fato de que plantas apresentam um complexo sistema de defesas
antioxidativas, formado por várias substâncias enzimáticas e não-enzimáticas, entre as quais
ácido ascórbico, que são mobilizadas para atenuar os efeitos das EAO e manter o equilíbrio
oxidante /antioxidante.
Ácido ascórbico é, reconhecidamente, um antioxidante não-enzimático protetor
contra os efeitos deletérios das EAO (Smirnoff 1995, Horemans et al.. 2000). Em plantas
expostas a concentrações de ozônio, genótipos sensíveis são justamente aqueles que
52
sintetizam ácido ascórbico em menor quantidade, indicando que concentrações mais altas
desse antioxidante conferem maior tolerância ao poluente (Menser 1964, Turcsányi et al..
2000, Chen & Gallie 2005).
As injúrias deverão ocorrer somente após superada a capacidade de
detoxificação e reparo. (Calatayud & Barreno 2001, Burkey & Eason 2002, Long & Naidu
2003). A eficiência do sistema antioxidativo contra EAO é, portanto, um indicativo da
sensibilidade de plantas às condições de estresse impostas por ozônio.
Plantas com genótipos sensíveis a ozônio, por geralmente serem ineficientes
em minimizar o estresse oxidativo, são recomendadas para estudos de biomonitoramento,
desde que rapidamente indiquem a presença desse poluente no ambiente pela formação de
injúrias características e detectáveis por métodos de fácil aplicação. Assim, muitas dessas
espécies vegetais têm sido utilizadas como bioindicadoras de ozônio, baseadas, sobretudo, na
formação de típicas necroses foliares (Heggestad 1991, Krupa et al. 1993, Orendovici et al.
2003).
Tais respostas visíveis, no entanto, são menos apropriadas para indicar riscos
genotóxicos impostos por ozônio do que bioensaios baseados em efeitos sobre o DNA. Essa
aplicação adicional seria possível, considerando que danos citogenéticos em plantas sensíveis
ao ozônio, como clastogênese (formação de fragmentos cromossômicos ou micronúcleos
{MCN}) e expressão de genes mutantes já foram observados, como demonstraram Fetner
(1958) e Rajeshwari & Harney (1976), expondo indivíduos de Vicia faba a fumigações com
ozônio e correlacionando esse tratamento a clastogênese. Porém, isso ainda não é
consencioso, pois Girchner et al. (1992), com procedimentos semelhantes, não detectou
mutações somáticas em Tradescantia (clone BNL 4430). Já Rodrigues et al. (1996), também
utilizando BNL 4430, observaram aumento da freqüência, porém apenas após três dias de
53
tratamento com 100 ppb de ozônio por 6 horas/dia.
Tais resultados contrastantes indicam, portanto, que o grau de sensibilidade da espécie
vegetal ao poluente não é o único aspecto a ser considerado na procura de plantas
bioindicadoras sensíveis ao ozônio.
A intensidade de necroses foliares ou mesmo de respostas clastogênicas mostradas por
essas espécies, na realidade, pode ser condicionada tanto por fatores do meio em que vivem as
plantas, como por suas características fisiológicas e metabólicas. Além disso, vários estudos
apontam características anatômicas como espessura da epiderme e mesofilo, densidade
estomática, espaços intercelulares, proporção entre parênquima paliçádico/ lacunoso e
alterações estruturais nos elementos condutores como condicionantes adicionais de
sensibilidade a poluentes atmosféricos (Alves 1995, Evans et al. 1996, Ferdinand et al. 2000,
Pedroso 2006). Fatores climáticos, especialmente temperatura e umidade relativa do ar, estão
entre os condicionantes do meio físico capazes de interferir na sensibilidade de plantas a
estresse. Isidori et al. apontam a sazonalidade das estações climáticas como fator adicional
para a formação de MCN, além da exposição à poluição atmosférica em clones BNL 4430 de
Tradescantia. Ainda, Klumpp et al. (2004) observaram nítida influência da temperatura na
formação de MCN para o mesmo clone BNL 4430. Desse modo, a utilização de plantas
sensíveis ao ozônio para biomonitoramento pode ser inviabilizada por tais interferências.
Alguns estudos demonstraram que os clones de Tradescantia parecem não se adaptar
às condições climáticas da região metropolitana de São Paulo (Sant'anna 2003, Ferreira 2004),
cuja densidade populacional e grande frota de veículos sublinha a importância de estudos de
biomonitoramento da poluição atmosférica na região. Com isso, estudos recentes têm
procurado utilizar uma espécie do mesmo gênero, mas comprovadamente melhor adaptada às
condições climáticas da região: Tradescantia pallida 'Purpurea'. Essa espécie, nativa da
54
América Central e amplamente utilizada em paisagismo, já demonstrou ser sensível à
radiação ionizante, agente reconhecidamente clastogênico, tanto quanto o clone BNL 4430
(Suyama et al. 2002). Outros estudos correlacionam constituintes da poluição atmosférica
com aumento da freqüência de micronúcleos em T. pallida 'Purpurea', retificando sua
sensibilidade à poluição do ar (Batalha et al. 1999, Guimarães et al. 2000, Savóia 2007, Silva
2007). Contudo, não foi investigada, ainda, a sensibilidade dessa cultivar a ozônio, que,
conforme hipótese levantada no capítulo anterior, pode ser alta, e tão pouco os fatores que a
condicionam. Além disso, Falistocco et al. (2000), investigando a duração do ciclo meiótico
em micrósporos do clone BNL 4430, demonstraram que, em plantas tratadas com agente
clastogênico, o aumento de micronúcleos mais intenso é observado a partir de 72 horas após a
exposição. Estudos dessa natureza com T. pallida 'Purpurea' não são conhecidos.
Portanto, com base nessas considerações, o presente estudo propõe investigar o
grau de sensibilidade de T. pallida 'Purpurea' ao ozônio, sob condições experimentais e se o
potencial clastogênico de ozônio para a cultivar é modulado pelas variações nas
concentrações de ácido ascórbico foliar e/ou nas condições de temperatura durante as etapas
de execução do bioensaio Trad-MCN. Além disso, propõe-se delimitar o período de
recuperação ideal para visualizar as injúrias citogenéticas provocadas pela exposição ao
poluente.
55
3.3. Material e Métodos
3.3.1) Cultivo
Os ramos florais utilizados nos bioensaios foram provenientes de plantas
cultivadas exclusivamente em casa de vegetação climatizada e sob ar filtrado, com manejo
descrito no ítem Cultivo do capítulo dois.
3.3.2) Sistema de fumigação de ozônio
O presente estudo foi desenvolvido sob condições experimentais, em sistema
de fumigação com ozônio (figura 3.1). Este é composto por duas câmaras fechadas (figura
3.2.A), de um metro cúbico cada, construídas com estrutura de aço inoxidável e revestidas
com filme Teflon®, conectadas a compressor, filtro de ar, válvula de controle de fluxo de ar
(Alborg®), desumidificador, cilíndros de mistura de poluentes (misturadores 1 e 2), gerador
de ozônio (Ozontechnik®) e equipamento de monitoramento contínuo da concentração de
ozônio (Ecotech ® 9810B), em destaque na figura 3.2.B.
No laboratório que abriga as câmaras, foram instaladas lâmpadas de vapor
metálico de 400 W e lâmpadas fluorescentes de 30 W (figura 3.2.C). Os ramos florais de T.
pallida permaneceram sob essa iluminação artificial (aproximadamente 270 µmol m
-2
s
-1
),
56
por, aproximadamente, dez horas diárias, durante a fumigação e durante os períodos de
recuperação.
Figura 3.1. Sistema de fumigação de poluentes do laboratório de fumigação da Seção de
Ecologia/ IBT. Ilustração: Yukio Hayashi da Silva
57
Figura 3.2. Componentes do sistema de fumigação de ozônio. A: Câmara de fumigação; B:
Monitor de concentração de ozônio, filtro e um dos misturadores; C: Lâmpadas do laboratório
de fumigação. Fotos: S.M.R. Sant'Anna.
3.3.3) Fumigação
Como mencionado anteriormente, foram utilizadas duas câmaras fechadas de
fumigação. Uma delas recebeu um aporte de ar filtrado isento de partículas e de gases
(tratamento denominado AF) e a outra câmara, ar filtrado enriquecido com ozônio (AF + O
3
),
em concentração média de 60 ou 80 ppb, em um único dia por três horas. Foram realizados
quatro experimentos de fumigação com 60 ppb, um em cada estação do ano. As fumigações
com 80 ppb de ozônio, em número de duas, foram conduzidas apenas na primavera, período
em que se supunha observar maior intensidade de respostas clastogênicas. Em todos os casos,
as concentrações desejadas de ozônio foram obtidas por meio da mistura proporcional de ar
A
B
C
Monitor
58
filtrado e de ozônio gerado pelo ozonizador (figura 3.1) e checadas continuamente por meio
do monitor de ozônio.
Cinco grupos distintos com 10 a 15 ramos florais de T. pallida 'Purpurea' foram
distribuídos em béqueres contendo água ultra-pura (3.3.A) e acondicionadas entre as duas
câmaras (figura 3.3.B). Durante três horas, enquanto a câmara AF recebia ar filtrado, a câmara
AF + O
3
recebia o ar enriquecido de ozônio, na concentração estipulada. Ao fim desse prazo,
o fluxo de ozônio foi interrompido nesta última, a qual passou a receber apenas ar filtrado por
mais três horas. Ao fim desse processo, os cinco grupos de inflorescências provenientes do
tratamento AF + O3 foram transferidos para a câmara AF, onde permaneceram até o final do
período de recuperação (de 24 a 120 h). Quando possível, um sexto grupo adicional de ramos
florais foi introduzido em cada câmara, os quais representaram a situação antes do início da
recuperação (indicada com 0h nas figuras de resultados).
Os registros diários de temperatura máxima e mínima na câmara de ar filtrado,
na qual as inflorescências permaneceram durante todo o período de recuperação foram
obtidos por termohigrógrafo (TZ-18td, Zootechnikh, Poland), que ficou instalado, durante
todo o experimento, dentro da referida câmara. Foi calculado, ainda, por subtração o valor
máximo e mínimo, a amplitude diária de temperatura.
59
Figura 3.3. Exposição de inflorescências de T. pallida 'Purpurea' a fumigação. A: Grupo de
inflorescências em béquer; B: Disposição dos cinco grupos de béqueres com inflorescências
no interior de uma câmara.
3.3.4) Períodos de recuperação e obtenção de amostras para os ensaios
Imediatamente após a transferência dos ramos florais da câmara AF + O
3
para
a AF, foram retirado, sempre que possível, o sexto grupo de inflorescências submetido a cada
um dos tratamentos, representando a situação inicial do período de recuperação (0h). A partir
de então, a cada 24 h, um grupo de ramos de cada tratamento, nos quatro experimentos com
60 ppb, foi sendo retirado e levado para análises de concentração de ácido ascórbico nas
brácteas e da freqüência de micronúcleos nas inflorescências até o prazo máximo de 120 h,
em que o último lote foi retirado. Cada lote retirado foi denominado de acordo com o período
em que permaneceu em recuperação na câmara AF (indicados como 24h, 48h, 72h, 96h e
120h nas figuras de resultados). Nos experimentos com 80 ppb, somente a freqüência de
MCN nas inflorescências foi obtida.
A
B
60
3.3.5) Bioensaio TRAD-MCN
Os procedimentos utilizados nesse experimento seguem o protocolo
estabelecido por Ma (1981), descritos no ítem Material e Métodos do capítulo dois.
3.3.6) Análise da concentração de ácido ascórbico
Ácido ascórbico total foi determinado em brácteas frescas (0,5 g),
homogenizados com 12 mL de EDTA-Na
2
(0,07%) e ácido oxálico (0,5%). A mistura foi
centrifugada em 18.000 rpm por 30 minutos a 2ºC. A uma alíquota do supernadante foram
adicionados 2,5 mL de diclorofenol-indofenol PA (DCPiP) (0,02%) e a absorbância do
extrato foi mensurada espectofotometricamente em 520 nm (primeira leitura). Depois da
adição de 0,05 mL de ácido ascórbico (1%), uma segunda absorbância foi medida. Ambas as
medidas de absorbância foram utilizadas para estimar a concentração de ácido ascórbico, a
qual foi expressa em mg g
-1
de massa seca (Keller & Schwager 1977).
61
3.3.7) Análises estatísticas
As diferenças entre as concentrações de ácido ascórbico e entre as freqüências
de MCN observadas nos dois tratamentos, câmara de ar filtrado (AF) e câmara de ar filtrado
enriquecida com 60 ppb de ozônio (AF+O
3
) e ao longo do tempo de recuperação, foram
determinadas por análise de variância com dois fatores: primeiro fator – Fumigação com AF
ou AF + O
3
e segundo fator – tempos de recuperação. Quando a análise de variância indicou
diferença significativa, foi usado teste de comparação múltipla (método de Student-Newman-
Keuls) para localizar as diferenças significativas. Em todos os casos, analisou-se se os dados
apresentavam distribuição normal e igualdade de variâncias.
Análises não paramétricas (teste de Kruskal-Wallis, seguidas do mesmo teste
de comparações múltiplas ou teste de Mann-Whitney, que compara dois tratamentos),
identificaram diferenças significativas em cada um dos tratamentos (AF e AF + O
3
) entre os
experimentos realizados. Os resultados, nessas situações, foram apresentados por gráficos do
tipo box-plot. Em tal representação, a mediana dos dados foi indicada pela linha que divide
cada retângulo; estes, por sua vez, delimitaram os 25% de dados acima e abaixo da mediana,
ou seja, os percentis de 25 e 75. Considerando ainda a distribuição dos dados separados pela
mediana, as barras de erro mostraram os valores situados entre os percentis de 10 e 25 ou
entre os de 75 e 90 e os símbolos (o) os valores extremos (abaixo do percentil de 5 ou acima
do de 95).
Análises de regressão linear foram empregadas para estabelecer a relação entre
temperatura e as variáveis biológicas (freqüência de MCN e concentração de ácido
ascórbico), assim como entre concentrações de ácido ascórbico e freqüência de MCN.
62
3.4.Resultados
3.4.1) Temperatura média registrada durante os experimentos
Os valores máximos, mínimos, bem como a amplitude de temperatura a cada
tempo de recuperação são ilustrados na figura 3.4. Sempre que possível, foi considerada
também a temperatura registrada imediatamente após o término da fumigação. Ressalta-se
que esses valores referem-se apenas à câmara de ar filtrado, sítio de recuperação das
inflorescências. Por ser formado por peças de liga metálica, não foi instalado um
termohigrógrafo na câmara de ar com ozônio, pois havia a possibilidade das peças sofrerem
oxidação. Porém, diante da semelhança entre as câmaras e do fato de ambas terem estado no
mesmo recinto, pôde-se admitir que os ramos florais inseridos em ambas as câmaras foram
submetidos às mesmas variações de temperatura durante a fumigação e a recuperação.
Nota-se maior estabilidade térmica no experimento de fumigação realizado no
inverno, quando as inflorescências foram submetidas a 60 ppb de ozônio. Essa estabilidade é
corroborada pela menor amplitude entre todos os tratamentos, bem como valores de
temperatura máxima e mínima bem próximos. Nos demais experimentos, a amplitude entre
temperaturas máxima e mínima em cada dia de recuperação foi maior (entre 10 e 20
o
C).
Verifica-se, ainda, a semelhança nas condições térmicas entre os três experimentos realizados
na primavera.
63
Figura 3.4. Temperaturas máximas, mínimas e amplitude térmica registrada em cada tempo
de recuperação nos experimentos de 60 e 80 ppb.
Ver: verão; Out: outono; Inv: inverno; Pri: primavera; Pri1: primeira fumigação com 80 ppb realizada na
primavera; Pri2: segunda fumigação com 80 ppb realizada na primavera.
3.4.2) Freqüência de micronúcleos e concentrações de acido ascórbico após fumigação
com 60 ppb de ozônio
A freqüência de micronúcleos em T. pallida 'Purpurea' submetida à fumigação
com ar filtrado (AF) e fumigação com ar filtrado enriquecido com 60 ppb de ozônio (AF +
O
3
), cujos experimentos foram realizados em diferentes estações climáticas, é apresentada na
figura 3.5. A freqüência de MCN entre os períodos de recuperação foi bastante variada entre
os tempos de recuperação. No verão, no tratamento AF + O
3
, houve aumento significativo na
0
10
20
30
40
60 ppb/Ver
60 ppb/Out
6
0 pp
b/Inv
60 pp
b/
P
r
i
80 ppb/P
ri1
80 pp
b/
P
ri2
60 ppb/V
er
60 ppb/O
ut
6
0 ppb/
Inv
60 ppb/Pri
80 ppb/Pri1
80 ppb/Pr
i
2
60 ppb/Ver
60 ppb/Out
6
0 pp
b/Inv
60 ppb/P
r
i
80 ppb/Pr
i
1
80 ppb/P
ri2
Temperatura (
o
C)
0h 24h 48h 72h 96h 120h
Máximas
Amplitude
Mímimas
64
formação de micronúcleos, em comparação aos valores observados sob ar filtrado, em todos
os tempos de recuperação. No inverno, isso ocorreu após 24h, 48h e 120h de recuperação.
Nota-se, também, o aumento da freqüência de micronúcleos observada a 72 horas após
fumigação nos experimentos da primavera, do verão e do outono, em ambas as câmaras. No
inverno, enquanto as freqüências foram equivalentes ao longo da recuperação nas
inflorescências submetidas ao ar filtrado, valores máximos foram obtidos após 24h e 120h de
recuperação, seguidos pelos obtidos após 48 e 72h, comparados à freqüência inicial (0h),
naquelas fumigadas com 60 ppb de ozônio
As análises estatísticas indicaram também diferenças significativas entre as
campanhas efetuadas nas quatro estações climáticas, para ambos os tratamentos de
fumigação, como mostra a figura 3.6. Nas fumigações com ar filtrado somente e com ar
filtrado enriquecido com ozônio, observa-se freqüência significativamente maior na
campanha realizada no inverno, em relação às outras estações climáticas (figuras 3.6A e B).
Comparando-se os dois tratamentos de fumigação, verificou-se que a fumigação com
60 ppb de ozônio promoveu aumento significativo da freqüência de micronúcleos (figura
3.6C).
65
Figura 3.5: Freqüência média de MCN e respectivos erros-padrão (barras) observada
em cada tempo de recuperação nos tratamentos de fumigação efetuados nas quatro estações
climáticas.
AF: fumigação com ar filtrado; AF + O3: fumigação com ar filtrado enriquecido com 60 ppb de ozônio. Em cada
tratamento de fumigação, freqüências médias indicadas com letras distintas diferem entre si significativamente.
Asteriscos indicam freqüências médias significativamente maiores do que as observadas no tempo de
recuperação correspondente no tratamento AF.
Primavera
b
b
a
ab
b
a
a
0
5
10
15
AF AF+O3
MCN/100 tétrades
0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
Verão
*
b
b
*
ab
ab
*
a
a
*
ab
ab
*
ab
ab
0
5
10
15
AF AF+O3
MCN/10
tétrades
0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
Outono
b
b
ab ab
a
a
ab
ab
ab
ab
0
5
10
15
AF AF+O3
MCN/100 tétrades
0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
Inverno
a
c
a
*
a
a
*
b
a
b
a bc
a
*
a
0
5
10
15
AF AF+O3
MCN/100 tétrades
0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
66
Figura 3.6:Comparações entre as campanhas de um mesmo tratamento de fumigação (AF ou
AF + O3) e entre os tratamentos de fumigação. A: Comparação entre as campanhas de ar
filtrado; B: Comparação entre as campanhas de ar filtrado com 60 ppb de ozônio. C:
Comparação entre os dois tratamentos de fumigação.
Em cada gráfico, freqüências médias indicadas com letras distintas diferem entre si significativamente.
AF AF + O3
MCN/100 tétrades
0
2
4
6
8
10
12
14
a
b
a
Ar filtrado (AF)
Verão Outono Inverno Primavera
MCN/100 tétrades
0
2
4
6
8
10
12
14
a
b
ab
b
AF + O
3
Verão Outono Inverno Primavera
MCN/100 tétrades
0
2
4
6
8
10
12
14
a
b
b
ab
ab
A
B
C
67
A figura 3.7 mostra a concentração de ácido ascórbico em brácteas de ramos
florais de T. pallida 'Purpurea' expostas à fumigação com AF e AF + O
3
(60 ppb), em
campanhas realizadas em diferentes estações climáticas, mas nenhuma tendência clara a
respeito da ocorrência de picos de concentração em determinados tempos de recuperação.
Geralmente, as maiores concentrações foram observadas entre 24h e 72h de recuperação.
Raramente o tratamento com 60 ppb de ozônio causou uma mudança significativa nos níveis
de ácido ascórbico, em comparação com resultados obtidos no tratamento AF. Isto foi
observado apenas 24h e 96h após a fumigação, respectivamente nas campanhas de verão e
inverno.
Figura 3.7: Concentrações médias de ácido ascórbico (AA) e respectivos erros-padrão
(barras) determinadas em cada tempo de recuperação nos tratamentos de fumigação efetuados
nas quatro estações climáticas.
AF: fumigação com ar filtrado; AF + O3: fumigação com ar filtrado enriquecido com 60 ppb de ozônio. Em cada
tratamento de fumigação, freqüências médias indicadas com letras distintas diferem entre si significativamente.
Asteriscos indicam freqüências médias significativamente maiores do que as observadas no tempo de
recuperação correspondente no tratamento contrastante.
Primavera
b
b
a
a
a
a
b
b
b
b
0
2
4
6
8
AF AF+O3
AA (mg.g
-1
ms)
0h 24h 48h 72h 96h 120 h
Outono
a
b
a
a
a
ab
b
c
0
2
4
6
8
AF AF+O3
AA (mg.g
-1
ms)
0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
Inverno
b
c
b
c
a
b
ab
a
*
a
b
c
0
2
4
6
8
AF AF+O3
AA (mg.g
-1
ms)
0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
Verão
b
*
a
bc
c
a
ab
bc
bc
c
d
0
2
4
6
8
AF AF+O3
AA (mg.g
-1
ms)
0 h 24 h 48 h 72 h 96 h 120 h
68
Além disso, não foram observadas diferenças significativas entre as
campanhas, ilustradas na figura 3.8.A, para fumigação com ar filtrado e 3.8.B para ar filtrado
com 60 ppb de ozônio, assim como entre os tratamentos de fumigação (figura 3.8C).
Figura 3.8: Comparações entre as campanhas de um mesmo tratamento de fumigação (AF ou
AF + O3) e entre os tratamentos de fumigação. A: Comparação entre as campanhas de ar
filtrado; B: Comparação entre as campanhas de ar filtrado com 60 ppb de ozônio. C:
Comparação entre os dois tratamentos de fumigação.
Em cada gráfico, freqüências médias indicadas com letras iguais não diferem entre si significativamente.
Ar Filtrado (AF)
Verão Outono Inverno Primavera
AA (mg.g
-1
ms)
0
2
4
6
8
10
a
a
a
a
Ar filtrado (AF)
AF + O
3
Verão Outono Inverno Primavera
AA (mg.g
-1
ms)
0
2
4
6
8
10
a
a
a
a
AF + O3
AF AF + O3
AA (mg.g
-1
ms)
0
2
4
6
8
10
a
a
A
C
B
69
Contudo, análises de regressão linear demonstram que a concentração de AA é
influenciada significativamente e positivamente pela amplitude térmica diária e máximas de
temperatura registrada durante os períodos de recuperação (figura 3.9). Quanto menor
amplitude térmica (figura 3.9A) ou as temperaturas máximas (figura 3.9B) menor será a
concentração de ácido ascórbico.
Figura 3.9: Relação entre ácido ascórbico e variáveis de temperatura registradas durante
tempos de recuperação. A: ácido ascórbico e amplitude térmica; B: ácido ascórbico e
máximas de temperatura.
Dados obtidos em todos os tempos de recuperação e em ambos os tratamentos de fumigação agrupados.
Análises de regressão linear também indicaram que a formação de
micronúcleos é explicada significativamente pela concentração de ácido ascórbico (figura
3.10A), assim como pela amplitude de temperatura e temperaturas máximas durante os dias
de recuperação. As menores concentrações de ácido ascórbico determinam maiores
Amplitude T (
o
C)
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
Raiz
2
AA (mg.g
-1
ms)
1,0
1,5
2,0
2,5
y = 1,52 + 0,03x
R
2
= 0,24; p = 0,002
T máx (
o
C)
20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
Raiz
2
AA (mg.g
-1
ms)
1,0
1,5
2,0
2,5
y = 0,96 + 0,03x
R
2
= 0,22; p = 0,008
A B
70
freqüências de MCN 24 horas depois (r
2
= 0,35), como mostra a figura 3.10A. A freqüência
de micronúcleos também foi inversamente proporcional à
amplitude térmica (r
2
= 0,29),
registrada durante os tempos de recuperação (figura 3.10B) e às máximas de temperatura (r
2
=
0,19) (figura 3.10C).
Figura 3.10: Relação entre freqüência de micronúcleos (MCN) e concentração de ácido
ascórbico (AA) 24 horas antes e variáveis temperatura durante os tempos de recuperação. A:
MCN versus concentração de AA 24 horas antes; B: MCN versus amplitude térmica; C:
MCN versus máximas de temperatura.
Dados obtidos em todos os tempos de recuperação e em ambos os tratamentos de fumigação agrupados.
AA (mg.g
-1
ms)
1 2 3 4 5 6 7
MCN/100 tétrades
3
5
7
9
1
10
y = 0,93 - 0,12x
R
2
= 0,35; p = 0,002
T máx (
o
C)
20 22 24 26 28 30 32 34 36 38 40
MCN/100 tétrades
0,5
5,0
1,0
10,0
y = 1,0 - 0,02x
R
2
= 0,19; p = 0,008
Amplitude T (
o
C)
2 4 6 8 10 12 14 16 18 20
MCN/100 tétrades
0
0
3
5
9
1
10
y = 0,59 - 0,04x
R
2
= 0,29; p < 0,001
C
71
3.4.3) Freqüência de micronúcleos após fumigação com 80 ppb de ozônio
A figura 3.11 ilustra as freqüências de MCN nos dois experimentos, realizados
na primavera, com fumigação de 80 ppb de ozônio. No experimento 1, a freqüência de MCN
variou significativamente, nos diferentes tempos de recuperação nos dois tratamentos de
fumigação, sendo observados valores máximos após 72 horas. Porém, o tratamento com
ozônio não promoveu aumento significativo em qualquer um dos tempos de recuperação.
Entretanto, no experimento 2, nota-se que, apesar de não ter havido variação
entre os tempos de recuperação, nos dois tratamentos de fumigação, a freqüência de MCN
observada no tratamento de fumigação com ozônio foi significativamente maior do que a
observada no tratamento com ar filtrado, a partir de 48 horas de recuperação
Não houve diferença significativa na freqüência de micronúcleos observada
entre os dois experimentos, dentro de cada tratamento de fumigação. Além disso, fumigação
com 80 ppb de ozônio causou um aumento no número de micronúcleos/100 tétrades, em
comparação com o observado nas inflorescências mantidas sob ar filtrado, apenas no
experimento 2 (figura 3.12).
72
Figura 3.11. Freqüência de micronúcleos e concentração de ácido ascórbico em diferentes
tempos de recuperação observados nos dois experimentos de primavera, com fumigação de 80
ppb.
MCN: micronúcleos; AF: ar filtrado; AF + O3: ar filtrado enriquecido com 80 ppb de ozônio.
Primavera (Experimento 2)
a
a
*
a
a
*
a
a
*
a
a
0
2
4
6
8
AF AF+O3
MCN/100 tétrades
0h 24h 48h 72h 96h
# #
Primavera (Experimento 1)
b
b
ab
ab
ab
ab
a
a
ab
ab
0
2
4
6
8
AF AF+O3
MCN/100 tétrades
0h 24h 48h 72h 96h
73
Figura 3.12. Comparações entre as freqüências de MCN, dentro de um mesmo tratamento de
fumigação (AF ou AF + O3), considerando todos os experimentos realizados.
MCN: micronúcleos; AF: ar filtrado; AF + O3: ar filtrado enriquecido com 60 ppb ou 80 ppb de ozônio. V:
verão; O: outono; I: inverno; P: primavera. (1) primeiro experimento realizado na primavera – 80 ppb; (2)
segundo experimento realizado na primavera – 80 ppb. * Significativamente menor do que nos experimentos não
marcados, em cada tratamento de fumigação.
Ar filtrado (AF)
6
0
p
p
b
(
V
)
6
0
p
p
b
(
O
)
6
0
p
p
b
(
I
)
6
0
p
p
b
(
P
)
8
0
p
p
b
(
P
-
1
)
8
0
p
p
b
(
P
-
2
)
MCN/100 tétrades
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
*
Ar filtrado (AF)
AF + O3
6
0
p
p
b
(
V
)
6
0
p
p
b
(
O
)
6
0
p
p
b
(
I
)
6
0
p
p
b
(
P
)
8
0
p
p
b
(
P
-
1
)
8
0
p
p
b
(
P
-
2
)
MCN/100 tétrades
-2
0
2
4
6
8
10
12
14
*
*
*
*
AF +O3
74
Figura 3.13. Comparações entre as campanhas de um mesmo tratamento de fumigação (AF
ou AF + O3) e entre os tratamentos de fumigação (80 ppb).
MCN: micronúcleos; AF: ar filtrado; AF + O3: ar filtrado enriquecido com 80 ppb de ozônio. (1) primeiro
experimento; (2) segundo experimento. Letras minúsculas e maiúsculas comparam respectivamente as
freqüências de micronúcleos nos tratamentos AF e AF+O3. * Freqüência significativamente maior no tratamento
AF+O3 do que no AF (no experimento 2).
Finalmente, verificou-se que a freqüência de micronúcleos nas inflorescências
submetidas ao ar filtrado, em todos os experimentos foi semelhante (figura 3.13). A única
exceção ocorreu no tratamento controle do segundo experimento de fumigação (80 ppb),
realizado na primavera, quando se estimou freqüência significativamente menor de MCN no
tratamento controle de qualquer outro experimento. Sob fumigação com ozônio, a formação
de micronúcleos nos experimentos realizados na primavera, quer sob 60 ppb ou sob 80 ppb, e
A
F
-
1
A
F
(
2
)
A
F
+
O
3
(
1
)
A
F
+
O
3
(
2
)
MCN/100 tétrades
0
2
4
6
8
10
Primavera
a
a
A
*
A
75
no experimento do outono (sob 60 ppb) foi significativamente menor do que nos realizados no
verão e primavera (sob 60 ppb).
3.5. Discussão
Nas condições experimentais dese estudo, ozônio demonstrou ser genotóxico
para T. pallida 'Purpurea' nas fumigações com 60 ppb ou 80 ppb, mesmo sendo a planta
exposta em um único dia, por três horas, a concentrações freqüentemente observadas no
ambiente urbano da cidade de São Paulo (CETESB 2007). Tal constatação corrobora estudos
anteriores, que apontam injúrias citogenéticas em diferentes organismos, mesmo após
exposições agudas. O potencial genotóxico do ozônio, aliás, está bem documentado na
literatura científica. Fetner (1962) expôs culturas de linfócitos humanos a 0,8 ppm (80 ppb) de
ozônio e, em curtas exposições de cinco a dez minutos, verificou clastogênese. Merz et al.
(1975) também atestaram aumento da freqüência de MCN em linfócitos de voluntários
expostos a 0,5 ppm (50 ppb) por seis e dez horas.
Ressalta-se a alta sensibilidade de T. pallida 'Purpurea' a ozônio, quando se
comparam os resultados obtidos no presente estudo com os poucos estudos realizados com
plantas. Fetner (1958) submeteu plântulas de Vicia faba à fumigação com ozônio em aparato
de fumigação fechada e observou até 42% de “anáfases anormais” em células meristemáticas
de ápice radicular expostas durante 60 minutos a um fluxo de 2 litros/min de ozônio. Girchner
et al. (1992) não encontraram aumento na freqüência de mutações somáticas em células de
pêlos estaminais (bioensio TRAD-STH) em clones BNL 4430 submetidos a ozônio. Ma et al.
76
(1982) também não encontraram aumento significativo de MCN em tétrades de
inflorescências do mesmo clone submetidas a 5000 ppb (Ma et al. 1982 apud Rodrigues et al.
1996).
Em valores mais realistas, Rodrigues et al. (1996) expuseram inflorescências
do clone 4430 a 50 e 100 ppb por seis horas diárias por um período de um a três dias. Esse
estudo mostrou que apenas amostras expostas durante três dias consecutivos a 100 ppb
mostraram um aumento significativo de MCN, indicando uma relação temporal com a
detecção de genotoxidade. Essa relação temporal foi verificada no presente estudo, já que um
aumento significativo de micronúcleos foi verificado a partir de um período de recuperação
de 48 e, principalmente, 72 horas após fumigação. Ressalta-se que esse acréscimo de
genotoxidade foi verificado, também, em fumigação com ar filtrado no presente estudo,
indicando que o microclima da câmara de ar filtrado, considerada como sítio-controle,
também impôs estresse às amostras vegetais, embora em menor escala, se comparado à
fumigação com ozônio. Com isso, pode-se considerar que a clastogênese verificada em
células-mães de grão de pólen nas inflorescências tratadas com o poluente parte de uma
freqüência basal de MCN mais alta que a verificada em inflorescências não manipuladas (ver
capítulo 2).
A despeito da massificação do uso de clones de Tradescantia para
biomonitoramento, há poucos estudos que investigam a relação entre tempos de recuperação e
detecção de clastogenicidade, o que é crucial para a eficiência do bioensaio TRAD-MCN.
Steinitz (1944) observou que inflorescências de T. paludosa submetidas a um meio anóxico
por até 24 horas, apresentaram um maior aumento de MCN, de 8%, a 72 horas após
tratamento. O autor relacionou esse fato a maior sensibilidade ao tratamento em células em
prófase I da meiose. Falistocco et al. (2000) investigaram a duração do ciclo meiótico em
77
clones BNL 4430 e determinaram que a duração completa desse ciclo está em torno de 80
horas. Os autores afirmam que a duração da profase I naqueles clones chega a 60 horas, e,
então, mais 20 horas para a formação de tétrades, e, enfim, a visualização de micronúcleos.
Expondo inflorescências do clone a conhecidos agentes de genotoxidade durante seis horas,
os autores investigaram períodos de recuperação de 24 a 72 horas e constataram aumento
significativo de MCN a 72 horas, enquanto que, em 24 horas, clastogenicidade não foi
detectada. Assim sendo, segundo Falistocco et al. (2000), o tempo de recuperação de 24
horas, há bastante tempo estabelecido (Ma 1982), é insuficiente para detectar clastogenicidade
devido à duração da profase I, até para o clone BNL 4430 de Tradescantia. Por fim, os
autores recomendam um período de recuperação de 72 horas, como mais eficiente para
diagnosticar a genotoxidade de um agente utilizando o bioensaio TRAD-MCN. No presente
estudo, a freqüência de MCN observada nos tempos de recuperação investigados vai de
encontro às constatações de Falistocco et al. (2000) e permite inferir que 72 horas após
exposição foi o período mais indicado para atestar a genotoxidade de ozônio para T. pallida
'Purpurea'.
A resposta de T. pallida 'Purpurea' em função do tempo de recuperação e do
tratamento com ozônio, observada claramente em termos de frequência de MCN, não foi
verificada para os valores de concentração de ácido ascórbico (AA) obtidos. Não foram
apontadas relações significativas entre o antioxidante e o poluente em nenhuma das
campanhas realizadas e nem foi identificado um período de recuperação em que uma
mudança no perfil deste antioxidante fosse evidente. Entretanto, análises de regressão
propuseram modelo em que a freqüência de MCN está relacionada com a variação da
concentração de ácido ascórbico verificada 24 horas antes. Assim, concentrações mais altas
do antioxidante resultaram, depois de um período de 24 horas, em menos MCN. O inverso foi
78
verificado quando a concentração de ácido ascórbico diminuiu nesse intervalo.
Esses dados são consistentes com vários estudos que atestam o potencial de
AA para diminuição do estressse oxidativo e, conseqüentemente, para atenuar ou impedir a
formação de injúrias. Turcsányi et al. (2000), por exemplo, expuseram plântulas de Vicia faba
a 75 nmol mol
-1
por até 28 dias a sete horas por dia, não encontrando injúrias foliares após
esse período, mesmo atestando o decréscimo da concentração de AA em folhas das amostras
tratadas com o poluente. Os autores sugerem que outros mecanismos de defesa devem agir
sinergisticamente com AA para detoxificar o ozônio e impedir a formação de injúrias. Menser
(1964) também creditou o decréscimo de injúrias foliares em Nicotana tabacum 'Bel W3' ao
aumento da concentração de AA em suas folhas.
A capacidade preventiva de AA contra injúrias citogenéticas está estabelecida
através de vários estudos envolvendo, principalmente, culturas de células humanas e
experimentos in vivo com cobaias. Giri et al. (1998), por exemplo, investigaram micronúcleos
em células da medula óssea e em espermatozóides de cobaias tratadas com cisplatina, um
reconhecido agente genotóxico. Os autores verificaram que cobaias que receberam doses de
ácido ascórbico junto com o agente genotóxico apresentaram menos clastogênese do que
aquelas que não receberam doses do antioxidante. Estudos da mesma natureza com plantas
são pouco conhecidos. Entretanto, pode-se inferir que, assim como injúrias foliares,
micronúcleos só serão formados quando exaurida a capacidade de detoxificação do ozônio
por AA, entre outros antioxidantes, o que deve ocorrer após um dado período de tempo. O
intervalo de tempo requerido para a ocorrência de clastogênese, no caso de ramos florais de
Tradescantia pallida 'Purpurea' analisados no presente estudo, foi de 24 horas, conforme
modelo proposto por análises estatísticas.
Há que se considerar que a variação observada na concentração de AA em
79
inflorescências de T. pallida 'Purpurea' foi relacionada às máximas de temperatura e à maior
oscilação térmica diária (amplitude), independente do tratamento de fumigação a que foram
submetidas. Assim, concentrações mais altas do antioxidante foram encontradas em
temperaturas mais altas e sob maior variação térmica (amplitude) registradas durante o
experimento, o que se refletiu sobre a intensidade de respostas clastogênicas das
inflorescências.
Tais relações entre a dinâmica do sistema antioxidativo ao longo das estações
climáticas do ano são freqüentemente apontadas na literatura para outras plantas. Bulbovas
(2005) expuseram indivíduos de Caesalpinia echinata a vários pontos com diferentes perfis
de poluição do ar da cidade de São Paulo. Os autores observaram que as variações nos
antioxidantes não pareceram estar relacionadas ao crescente tempo de exposição a poluentes,
mas a mudanças sazonais de fatores do ambiente. Burkey et al. (2006), ao estudarem a
concentração de AA em espécies herbáceas nativas de um parque florestal dos EUA,
encontraram variações de acordo com as estações climáticas e concluíram que essas variações
influenciaram a capacidade de defesa daquelas espécies contra a ação oxidativa do ozônio,
presente em concentrações moderadas na região. Turcsányi et al. (2000) constataram que
plântulas de Vicia faba submetidas à fumigação de 75 nmol mol
-1
de ozônio durante 28 dias
não apresentaram injúrias foliares, embora os níveis de ácido ascórbico tenham diminuído ao
longo do experimento. Os autores argumentam que outros antioxidantes podem ter atuado de
maneira sinérgica para atenuar os efeitos deletérios do poluente. Ainda, Yamaguchi et al.
(2005) afirmaram que biflavonóides, uma outra categoria de antioxidantes vegetais, extraídos
de acículas de Araucaria angustifolia protegem um plasmídeo contra clivagem do DNA,
imposta por EAO. Tais autores sugerem que os biflavonóides também são importantes
antioxidantes contra os efeitos das EAO sobre biomoléculas, notadamente ácidos nucléicos.
80
Assim, pode-se supor que outros antioxidantes, além de AA, presentes em T. pallida
'Purpurea', podem variar ao longo das estações climáticas e promover proteção contra EAO
juntamente com ácido ascórbico. Se confirmada, tal variação pode comprometer a análise de
dados sobre genotoxidade de um poluente em uma determinada estação climática. Entretanto,
é preciso, a princípio, investigar mais amplamente os antioxidantes presentes nas células de T.
pallida 'Purpurea' e a influência da sazonalidade sobre essa espécie.
Além da influência do sistema antioxidativo na intensidade de respostas
clastogênicas de T. pallida 'Purpurea', a sazonalidade climática ao longo das estações do ano,
notadamente na temperatura do ar durante os experimentos, pareceu ser outro fator importante
para as diferenças observadas na intensidade de formação de MCN após fumigação com
ozônio . Nas campanhas experimentais realizadas na primavera, tanto na campanha de 60 ppb,
quanto nas duas campanhas de 80 ppb realizadas na primavera, freqüências foram as mais
baixas entre todas as campanhas realizadas. Surpreendentemente, fumigações com 80 ppb,
que, teoricamente, deveriam resultar em maior clastogênese do que a fumigação com 60 ppb,
apresentaram valores pouco acima do basal verificado em inflorescências não submetidas a
qualquer tratamento (ver capítulo 2). Ainda que a campanha 2 de 80 ppb tenha mostrado
diferenças entre fumigação com ar filtrado e ar filtrado com ozônio, a freqüência de MCN
ficou aquém das observadas em fumigação com 60 ppb do poluente nas campanhas de verão
e, principalmente, inverno. Esses dados convergem para os observados por Alves et al.
(2003), que utilizaram inflorescências de T. pallida 'Purpurea' para monitorar o potencial
clastogênico do ar em laboratórios do Instituto de Botânica de São Paulo. As autoras afirmam
que houve variação de 1,9 a 5,3% no controle negativo ao longo de nove meses de
experimento e que tal variação pode ser atribuída a fatores climáticos ao longo do período.
Isidori et al. (2003) e Ichikawa et al. (1996) também observam aumento da freqüência de
81
mutações em estações de temperatura mais amena. No estudo desenvolvido por Isidori et al.
(2003), exposições de inflorescências do clone BNL 4430 no inverno mostraram maior
freqüência freqüência de MCN do controle negativo nessa estação. Ichikawa e colaboradores
verificaram aumento de mutações em células somáticas do mesmo clone nos dias em que a
temperatura registrada foi mais baixa. Klumpp et al. (2004) creditaram o aumento de MCN à
ocorrência de temperaturas mais baixas (> 16ºC) durante o tempo de recuperação no
bioensaio TRAD-MCN.
Nas condições de realização do presente estudo, a fim de obter respostas
clatogênicas mais evidentes, pode-se recomendar que os bioensaios, da exposição ao ozônio
ao período de recuperação, sejam realizados sob a menor amplitude diária possível entre
temperaturas máxima e mínima (< 8
o
C) e sob temperaturas máximas entre 20 e 26
o
C. Nessas
condições, as concentrações de ácido ascórbico tenderão a ser menores, assim como os danos
clastogênicos tenderão a ser maiores. Atenção deve ser dada, para as condições climáticas
durante o cultivo das plantas, conforme discutido no capítulo anterior.
Portanto, o presente estudo demonstrou a alta sensibilidade de T. pallida
'Purpurea' ao ozônio, por meio de respostas clastogênicas. Tais respostas foram
predominantemente mais evidentes após 72 horas de exposição ao poluente. Contudo, a
intensidade de formação de micronúcleos nas inflorescências foi condicionada pelos níveis de
ácido ascórbico nas brácteas dos ramos florais, determinados principalmente por sazonalidade
em fatores climáticos como a temperatura do ar, e por variações nas próprias condições
ambientais, especialmente na temperatura, no local de realização dos bioensaios.
Finalmente, com base nos resultados apresentados, ainda não é possível
determinar a eficiência de T. pallida 'Purpurea' para indicar riscos clastogênicos impostos por
ozônio, sob condições naturais, uma vez que não foi possível estabelecer modelo de curva
82
dose x resposta entre concentrações de ozônio e freqüência de micronúcleos.
3.6. Literatura citada
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93
Capítulo 4
Discussão geral
A freqüência basal de micronúcleos (MCN) em indivíduos de T. pallida
’Purpurea', cultivados em ambiente sabidamente isento de poluentes clastogênicos, foi
influenciada pela sazonalidade climática ao longo de 17 meses de monitoramento.
A não influência de umidade relativa do ar na formação de MCN, no presente
estudo, está de acordo com Klumpp et al..(2004), que constatou tal fato analisando
inflorescências do clone BNL 4430 expostas a diferentes faixas dessa variável climática.
Embora a radiação solar não tenha também promovido alterações na frequência
de MCN neste estudo, Wang &Wang (1999) verificaram aumento de clastogênese em picos
de irradiância artificialmente produzidos.
A temperatura do ar observada na casa de vegetação foi mensurada durante
todo o monitoramento e, com base em análises estatísticas realizadas, foi o fator climático
mais influente na formação de MCN. Modelos propostos estatisticamente mostram que o
declínio ou grandes oscilações da temperatura levaram à formação de MCN 72 horas depois
94
desses eventos climáticos. Mesmo nos experimentos de fumigação, a temperatura do ar
(valores máximos diários e de amplitude térmica) também foi um fator determinante da
intensidade de respostas clastogênicas nas inflorescências expostas a 60 ppb de ozônio, por 3
horas. Esses resultados alinham-se aos obtidos por Klumpp et al.. (2004), que expuseram
inflorescências do clone BNL 4430 em diferentes gradientes de temperatura, e, aplicando o
bioensaio TRAD-MCN, verificaram interferências nos níveis basais de MCN.
Estudos que relacionam a influência da temperatura à formação de grãos de
pólen em Tradescantia e conseqüente influência sobre o bioensaio TRAD-MCN são escassos.
Xiao & Mascarenhas (1985) analisaram a formação de heat shock proteins (hsps), sintetizadas
em condições de estresse térmico para oferecer termoproteção a células e tecidos. Em
experimentos conduzidos em tubos polínicos e grãos de pólen de Tradescantia paludosa, os
autores verificaram que nos tubos polínicos submetidos a exposições agudas a 37 ou 41ºC ou
incremento gradual de 29 a 41ºC, não foram sintetizadas as hsps. Grãos de pólen não
germinados retirados de anteras submetidas ao mesmo tratamento térmico também não
continham hsps, embora essas proteínas fossem encontradas em tecidos vegetativos em
condições normais de temperatura do ar. Os autores concluem que o desenvolvimento de
termotolerância em T. paludosa pode ocorrer sem a síntese de hsps.
No presente estudo, tanto nas condições experimentais do monitoramento
quanto nas condições experimentais das exposições a ozônio, foi verificada maior
clastogênese em T. pallida 'Purpurea', submetida à temperatura mais amena. Amostras
submetidas a até, aproximadamente, 40ºC, observada no monitoramento, não apresentaram
clastogênese significativa. Embora Xiao e colaboradores não tenham analisado quebras
cromossômicas em grãos de pólen, pode-se supor que, assim como em T. paludosa, T. pallida
'Purpurea' parece também desenvolver mecanismos que minimizam os efeitos de estresse
95
térmico por temperaturas elevadas oferecendo maior proteção aos seus tecidos reprodutivos e,
conseqüentemente, ocorrendo menor clastogênese em temperaturas altas, mesmo após a
fumigação com ozônio. Entretanto, faz-se necessário investigar a síntese de hsps sob
condições de estresse térmico na cultivar T. pallida 'Purpurea' para corroborar tal hipótese.
Mecanismos fisiológicos que conferem termotolerância não são os únicos
atributos do gênero Tradescantia para minimizar efeitos deletérios de estresse abiótico. Em
um amplo estudo, Martínez & Martínez (1993) apontam a presença de diversos grupos de
flavonóides em 42 espécies de Tradescantia distribuídas ao longo do continente americano.
Essas substâncias, derivadas do metabolismo secundário de plantas, têm importantes
atribuições como sinalização de hormônios, participação ativa na germinação do tubo
polínico, proteção de tecidos contra radiação UV-B e também como compostos alelopáticos e
fitoalexinas (Taylor & Grotewold 2005). Além disso, a capacidade de flavonóides de
detoxificar EAO's também é amplamente reconhecida (Husain et al..1987, Larson 1988).
Entre os flavonóides identificados em Tradescantia, destacam-se as
antocianinas, pigmentos, cuja função mais destacada é promover coloração a tecidos
vegetativos e reprodutivos, o que confere maior atração de polinizadores e dispersão de
sementes (Kong et al.. 2003). Chalker-Scott (1999) também afirma que alta irradiância e
temperaturas extremas favorecem o incremento de antocianinas em tecidos vegetativos.
Outros estudos apontam a importância de antocianinas, especialmente a cianidina, como
antioxidante, reduzindo a formação de malondialdeído a partir de peroxidação lipídica e
também prevenindo a oxidação do ácido ascórbico por EAO's. Ainda, cianidina forma com
DNA um complexo que protege ambas as moléculas contra injúria oxidativa (Sarma &
Sharma 1999, Kong et al.. 2003).
A presença de antocianinas em T. pallida 'Purpurea' é atestada por estudos
96
desenvolvidos por Baublis & Berber-Jiménez (1995) e Paiva et al.. (2003). Os primeiros
conduziram estudos de aprimoramento de técnicas de extração desses pigmentos para uso
comercial. Os autores afirmam que extratos de antocianinas extraídas da cultivar 'Purpurea'
mostram excelente estabilidade química para usos industriais.
Paiva et al. submeteram indivíduos de T. pallida 'Purpurea' a diferentes
gradientes de luminosidade artificialmente produzidos e constataram que a porcentagem de
antocianina por massa seca diminui com a redução da luminosidade. Plantas cultivadas sob
alta irradiância apresentaram até mesmo o dobro de porcentagem do pigmento se comparada
àquelas cultivadas sob sombreamento. Com base na forte correlação linear positiva entre
valores de intensidade luminosa e teores de antocianinas, os autores concluem que o
incremento desses pigmentos deve proteger o aparato fotossintético contra fotoinibição em T.
pallida 'Purpurea'.
Embora teores de antocianinas não tenham sido mensurados no presente
estudo, as evidências da presença desses pigmentos na cultivar analisada, bem como a
contribuição na detoxificação de EAO's permitem inferir que tais substâncias podem ter sido
importantes para a baixa frequência de MCN ao longo do experimento de monitoramento e
também em experimentos de exposição a ozônio em algumas estações climáticas. É possível,
supor, assim, que as respostas clastogênicas menos intensas em inflorescências de T. pallida
‘Purpurea’ expostas em dias quentes ou com amplitudes térmicas maiores, podem estar
associadas ao maior conteúdo desses pigmentos com função antioixadante e não somente com
o conteúdo de ácido ascórbico, identificado no presente estudo no estudo de fumigação com
ozônio. Contudo, estudos de quantificação da concentração de antocianinas e a sinergia entre
esses e outros antioxidantes, especialmente, ácido ascórbico, devem ser conduzidos para
delinear a ação do sistema antioxidativo de T. pallida 'Purpurea' e seu reflexo sobre a
97
aplicabilidade da cultivar em ensaios de toxidade ambiental.
Por fim, os resultados obtidos no presente estudo demonstraram que, nas
condições experimentais das exposições, o período requerido para diagnosticar a formação de
MCN excedeu o intervalo recomendado em protocolo amplamente difundido (Ma 1983). Os
resultados obtidos com T. pallida 'Purpurea' apontam o prazo de 72 horas após exposição
preponderante para observação de clastogênese máxima, tanto em tratamento com ozônio
quanto após picos de temperatura observados no monitoramento. O período de recuperação de
72 horas alinha-se aos resultados obtidos por Falistocco et al.. (2000) que investigaram a
duração do ciclo meótico em clones BNL 4430 para determinar a fase de maior sensibilidade
para a aplicação do bioensaio. Os autores concluíram que o período necessário para a meiose
em micrósporos do clone BNL 4430 foi de 80 horas e que períodos de recuperação superiores
a 24 horas foram determinantes para o aumento da freqüência de MCN. Sobretudo, em
amostras vegetais tratadas com reconhecido agente clastogênico mostraram significativo
aumento de MCN 72 horas após exposição, em comparação ao período de 24 horas, tal como
observado no presente estudo.
Com base nas constatações desse estudo, propõe-se recomendar que:
• A temperatura máxima do ar ambiente e oscilações ao longo do dia nessa variável
climática devem ser consideradas como fatores que potencializam ou não a
formação de micronúcleos. Assim, recomenda-se que a temperatura do ambiente
seja mantida entre 20 e 26ºC e que a amplitude térmica diária não ultrapasse uma
variação de 8ºC.
• Deve ser considerada a possibilidade de um tempo de recuperação mais longo que
98
24 horas para diagnosticar clastogênese. Entretanto, estudos sobre o ciclo
meiótico em T. pallida 'Purpurea' devem ser conduzidos para confirmar tal
hipótese.
• Indivíduos de T. pallida 'Purpurea' selecionados para determinar a frequência basal
(controle) em um experimento devem ser, sempre que possível, cultivados em
um ambiente isento de fatores de confusão, como presença de poluentes gasosos
e partículas, que ocorrem mesmo em sítios considerados livres de poluição.
Nessas condições, conforme dados apresentados e, considerando as condições
experimentais desse estudo, a freqüência basal de clastogênese espontânea não
chega a 2% por 100 tétrades analisadas.
• Mecanismos de reação a estresse imposto por ozônio parecem ser influenciados
por sazonalidade de estações climáticas. Estudos similares conduzidos em
diferentes estações climáticas devem ser conduzidos para corroborar essa
constatação.
4.1. Literatura citada
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