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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DO SOLO
BIORREMEDIAÇÃO DE ANTRACENO, FENANTRENO E PIRENO EM UM
ARGISSOLO
Rodrigo Josemar Seminoti Jacques
(Tese de Doutorado)
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIA DO SOLO
BIORREMEDIAÇÃO DE ANTRACENO, FENANTRENO E PIRENO EM UM
ARGISSOLO
RODRIGO JOSEMAR SEMINOTI JACQUES
Engenheiro Agrônomo (UFSM)
Mestre em Microbiologia Agrícola (UFV)
Tese apresentada como um dos requisitos à obtenção do
Grau de Doutor em Ciência do Solo
Porto Alegre (RS) Brasil
Setembro de 2005
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RODRIGO JOSEMAR SEMINOTI JACQUES
Engenheiro Agrônomo (UFSM)
Mestre em Microbiologia Agrícola (UFV)
TESE
Submetida como parte dos requisitos
para a obtenção do Grau de
DOUTOR EM CIÊNCIA DO SOLO
Programa de Pós-Graduação em Ciência do Solo
Faculdade de Agronomia
Universidade Federal do Rio Grande do Sul
Porto Alegre (RS), Brasil
Aprovada em:
Pela Banca Examinadora
Homologado em:
Por
FLÁVIO ANASTÁCIO DE OLIVEIRA CAMARGO
Orientador – PPG Ciência do Solo/UFRGS
CIMÉLIO BAYER
Coordenador do Programa de Pós-
Graduação em Ciência do Solo
FÁTIMA MENEZES BENTO
Co-orientadora – PPG Ciência do Solo/UFRGS
PEDRO ALBERTO SELBACH
PPG Ciência do Solo/UFRGS
ZAIDA INÊS ANTONIOLLI
Departamento de Solos/UFSM
GILMAR A. B. MARODIN
Diretor da Faculdade de Agronomia
FLÁVIO CÉSAR ALMEIDA TAVARES
Departamento de Genética/ESALQ-USP
iii
Ao meu pai Joemar (in memorian)
À minha mãe Neiva e ao meu irmão Bernardo
Á Débora
iv
AGRADECIMENTOS
A Deus, por iluminar meu caminho.
Ao meu pai, por tudo e pela presença sempre constante na minha vida.
À minha mãe e ao meu irmão pela compreensão e apoio em todos os
momentos.
À Débora, pelo nosso produtivo amor.
Ao Professor Flávio, pela orientação, confiança e amizade.
À Professora Fátima, pela alegre convivência, sugestões e auxílios.
Aos Professores Pedro e Enilson, pelos ensinamentos e sugestões.
Aos grandes amigos do Laboratório de Biorremediação de Solos, Kelly,
Alessandro, Daniele, Clarissa, Luís Fernando, Patrícia e ao Seu Valdir, pela
produtiva convivência, pelos favores e pelas cervejadas.
Aos colegas do PPG, em especial aos vizinhos do Laboratório de
Química e Fertilidade/LAS, pela amizade e auxílios.
Aos amigos do Laboratório de Análises (LAS) pela amizade e pelos
favores.
Aos professores do Departamento de Solos, pelos conhecimentos
transmitidos.
À Professora Maria do Carmo Ruaro Peralba e a colega Aline pelas
análises cromatográficas.
À Universidade Federal do Rio Grande do Sul e ao Programa de Pós-
Graduação em Ciência do Solo pela oportunidade de realização do doutorado.
À CAPES e ao CNPq pelo apoio financeiro.
A todos que, de alguma forma, colaboraram para a concretização deste
trabalho.
v
BIORREMEDIAÇÃO DE ANTRACENO, FENANTRENO E PIRENO EM UM
ARGISSOLO
1
Autor: Rodrigo J. S. Jacques
Orientador: Flávio A. de O. Camargo
Co-Orientadora: Fátima M. Bento
RESUMO
O antraceno, o fenantreno e o pireno são hidrocarbonetos aromáticos
policíclicos (HAPs) que podem ser carcinogênicos e que não são degradados
pela maioria dos microrganismos do solo. A biorremediação é uma estratégia
para eliminação dos HAPs, que pode demandar a inoculação de
microrganismos degradadores e a modificação das condições químicas e
físicas do solo. O objetivo do presente estudo foi isolar, identificar e caracterizar
microrganismos degradadores e mineralizadores de antraceno, fenantreno e
pireno em meio mineral e no solo, assim como avaliar a influência do pH e da
disponibilidade de água, N, P, Fe e S na biorremediação de um solo
contaminado com antraceno. Seis amostras de solo de landfarming foram
inoculadas individualmente a um solo contaminado em laboratório com
antraceno. Após 176 dias, o solo com maior produção de C-CO
2
foi utilizado
para o enriquecimento em meio mineral mais antraceno. Os microrganismos
foram isolados e identificados pelo seqüenciamento do gene do RNAr. A
capacidade dos microrganismos em degradar os 3 HAPs no meio mineral e no
solo foi avaliada por cromatografia gasosa. A mineralização de diferentes
concentrações de antraceno, fenantreno e pireno no solo foi avaliada por
respirometria, assim como o efeito de diferentes doses de N, P, S e Fe, de
diferentes pH e umidades do solo na mineralização do antraceno. Isolou-se do
solo de landfarming um consórcio microbiano composto por 6 bactérias,
identificadas como Mycobacterium fortuitum, Bacillus cereus, Microbacterium
sp., Gordonia polyisoprenivorans, Microbacteriaceae bacterium e Naphthalene-
utilizing bacterium, e um fungo, Fusarium oxysporum. O consórcio microbiano
degradou respectivamente 48, 67 e 22% do antraceno, fenantreno e pireno do
meio mineral. No solo o consórcio degradou, em média, mais de 92% e
mineralizou mais de 78% das diferentes concentrações destes 3 HAPs em 70
dias. As maiores mineralizações do antraceno ocorreram nos solos com as
maiores umidades gravimétricas (12,5%) e pH (7,5). A adição de 100 kg ha
-1
ou
mais de nitrogênio no solo e a conseqüente redução da relação C:N para
valores inferiores a 67:1 diminuíram a mineralização do antraceno no solo. O
aumento da disponibilidade do fósforo, do ferro e do enxofre e a presença de
amplas relações C:P (1076:1 a 50:1) e C:N:P (1076:16:1 a 50:1,3:1) no solo
não influenciaram a mineralização do antraceno. Conclui-se que a seleção e a
inoculação ao solo de microrganismos degradadores de HAPs, associado a
modificação das condições ambientais, pode conduzir a um eficiente processo
de biorremediação, onde a grande maioria dos HAPs é mineralizada em curto
período de tempo.
1
Tese de Doutorado em Ciência do Solo. Programa de Pós-Graduação em Ciência do Solo,
Faculdade de Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre, RS. Brasil
(172p.) – Setembro 2005. Trabalho realizado com apoio financeiro da CAPES e CNPq.
v
i
BIOREMEDIATION OF ANTHRACENE, PHENANTHRENE AND PYRENE IN A
PALEUDULT SOIL
1
Author: Rodrigo J. S. Jacques
Advisor: Flávio A. de O. Camargo
Co-Advisor: Fátima M. Bento
ABSTRACT
Anthracene, phenanthrene and pyrene are polycyclic aromatic
hydrocarbons (PAH’s) considered hazardous pollutants due to their toxicity,
mutagenicity and carcinogenicity and resistance to natural biodegradation.
Inoculation of specific microbial- PAH’s degraders and modification of the soil
physic and chemical conditions could enhance PAH’s removal. This study aimed
to isolate and characterize soil microorganisms able to degrade and mineralize
anthracene, phenanthrene and pyrene and evaluate the effect of pH and
availability of water, nitrogen, phosphorus, iron and sulfur. Six soil samples of a
landfarming site were inoculated in soil contaminated with anthracene. After 176
days, the soil sample with the highest C-CO2 production was used for the
enrichment in a mineral medium containing anthracene. Microbial isolates were
identified by rRNA gene sequencing and their abilities to degrade the PAH’s were
evaluated by gas chromatography. Mineralization of the anthracene,
phenanthrene and pyrene at different concentrations was tested by respirometric
methods, as well the effect N, P, S and Fe, pH and soil humidity on anthracene
mineralization. Landfarming soil sample number five was used for enrichment and
from this sample were isolated a microbial consortium containing six bacteria
identified as Mycobacterium fortuitum, Bacillus cereus, Microbacterium sp.,
Gordonia polyisoprenivorans, Microbacteriaceae bacterium and Naphthalene-
utilizing bacterium, and a fungi identified as Fusarium oxysporum. The microbial
consortium degraded 48,67 of anthracene, and 22% of phenanthrene and pyrene
in mineral medium. In the soil, the consortium degraded more than 92% and
mineralized more than 78% of different concentrations of these three PAHS
during 70 days. The greatest antharecene mineralization occurred in soils that
exhibited the greater gravimetric humidity (12,5%) and pH (7,5). The addiction of
100 kg ha
-1
or more of nitrogen in soil an the reduction of the C:N relation (67:1)
conducted to a low anthracene mineralization in soil. The highest relation C:P
(1076:1 to 50:1) and C:N:P (1076:16:1) to (50:1,3:1) did not influenced the
anthacene mineralization. Concluding, selection and the soil inoculation with
PAHs degraders microorganisms and the modification of environmental
conditions can conduct to the efficient bioremediation process (mineralization) in
short period of time.
1 Doctoral thesis in Soil Science. Programa de Pós-Graduação em Ciência do Solo, Faculdade de
Agronomia, Universidade Federal do Rio Grande do Sul. Porto Alegre, RS. Brasil (172p.) –
September 2005. Research supported by CAPES and CNPq.
vii
SUMÁRIO
Página
1. INTRODUÇÃO GERAL........................................................................... 01
2. CAPÍTULO I - BIORREMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS
COM HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS.................. 06
2.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................... 07
2.1.1 Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos no
ambiente.......................................................................................... 07
2.1.1.1 Caracterização dos hidrocarbonetos aromáticos
policíclicos................................................................................ 07
2.1.1.2 Exposição e toxicidade dos HAPs................................ 09
2.1.1.3 Geração, contaminação e legislação dos HAPs........... 10
2.1.2 Biorremediação de HAPs...................................................... 13
2.1.2.1 Estratégias para biorremediação de HAPs no solo...... 13
2.1.2.2 Metabolismo e genética da degradação dos HAPs...... 15
2.1.2.3 Biodisponibilidade e absorção celular dos HAPs......... 22
2.1.2.4 Consórcios microbianos na degradação dos HAPs..... 26
2.1.2.5 Bioaumentação de microrganismos degradadores de
HAPs......................................................................................... 28
2.1.3 Fatores ambientais que influenciam a biorremediação de
HAPs no solo.................................................................................. 31
2.1.3.1 Água............................................................................. 31
2.1.3.2 pH................................................................................. 32
2.1.3.3 Nutrientes..................................................................... 33
2.1.4 Biodisponibilidade dos HAPs no solo................................. 37
2.1.4.1 Sorção dos HAPs na matéria orgânica......................... 38
viii
2.1.4.2 Sorção dos HAPs nos minerais.................................... 40
2.1.4.3 Sorção dos HAPs no solo............................................. 40
2.2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................... 42
3. CAPÍTULO II - ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE
MICRORGANISMOS DO SOLO DEGRADADORES DE
HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS........................... 53
3.1 RESUMO......................................................................................... 54
3.2 INTRODUÇÃO................................................................................. 55
3.3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................ 58
3.3.1 Coleta do solo.......................................................................... 58
3.3.2 Seleção da amostra de solo.................................................... 58
3.3.3 Enriquecimento dos microrganismos degradadores de HAPs 60
3.3.4 Isolamento, purificação e armazenamento dos
microrganismos degradadores de HAPs............................... 61
3.3.5 Concentração do carbono no meio mineral............................. 61
3.3.6 Curvas de crescimento e pH no meio mineral......................... 62
3.3.7 Identificação do consórcio microbiano..................................... 62
3.3.8 Degradação de HAPs em meio mineral.................................. 64
3.3.9 Detecção da produção de biossurfactantes............................ 64
3.3.10 Crescimento dos isolados em outros hidrocarbonetos.......... 65
3.3.11 Análise estatística.................................................................. 65
3.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................... 66
3.4.1 Seleção da amostra de solo................................................... 66
3.4.2 Isolamento e identificação dos microrganismos
degradadores de HAPs.................................................................... 68
3.4.3 Concentração do carbono no meio mineral............................. 70
3.4.4 Curvas de crescimento e pH no meio mineral......................... 71
3.4.5 Degradação de HAPs em meio mineral.................................. 74
3.4.6 Detecção da produção de biossurfactantes............................ 76
3.4.7 Crescimento dos isolados em outros hidrocarbonetos............ 77
3.5 CONCLUSÕES................................................................................ 80
3.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................... 81
ix
4. CAPÍTULO III - BIORREMEDIAÇÃO DE UM SOLO CONTAMINADO
COM HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS.................. 86
4.1 RESUMO......................................................................................... 87
4.2 INTRODUÇÃO................................................................................ 88
4.3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................ 90
4.3.1 Solo......................................................................................... 90
4.3.2 Produção do inóculo............................................................... 90
4.3.3 Análise respirométrica............................................................. 91
4.3.4 Controle.................................................................................. 91
4.3.5 Esterilização do Solo.............................................................. 92
4.3.6 Tipo de Inóculo....................................................................... 92
4.3.7 Concentrações de HAPs......................................................... 93
4.3.8 Análise estatística.................................................................... 94
4.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................... 95
4.4.1 Controle.................................................................................. 95
4.4.2 Esterilização do Solo.............................................................. 97
4.4.3 Tipo de Inóculo ....................................................................... 99
4.4.4 Concentrações de HAPs......................................................... 101
4.5 CONCLUSÕES............................................................................... 110
4.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................... 111
5. CAPÍTULO IV - MINERALIZAÇÃO DO ANTRACENO NO SOLO EM
DIFERENTES CONDIÇÕES QUÍMICAS E FÍSICAS................................. 114
5.1 RESUMO......................................................................................... 115
5.2 INTRODUÇÃO................................................................................. 116
5.3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................ 119
5.3.1 Solo e inóculo.......................................................................... 119
5.3.2 Condições químicas e físicas.................................................. 121
5.3.3 Análise respirométrica............................................................. 122
5.3.4 Análise estatística.................................................................... 123
5.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................... 124
5.5 CONCLUSÕES................................................................................ 138
5.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................... 139
x
6. CAPÍTULO V - COMPARAÇÃO DE DUAS METODOLOGIAS PARA
O ISOLAMENTO DE MICRORGANISMOS DEGRADADORES DE
HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS NO SOLO.......... 142
6.1 RESUMO......................................................................................... 143
6.2 INTRODUÇÃO................................................................................. 144
6.3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................ 147
6.3.1 Coleta do solo.......................................................................... 147
6.3.2 Isolamento de microrganismos degradadores de antraceno... 147
6.3.3 Identificação dos microrganismos degradadores de
antraceno.......................................................................................... 150
6.3.4 Biodegradação e mineralização do antraceno........................ 151
6.3.5 Análise estatística.................................................................... 152
6.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................... 153
6.4.1 Isolamento de microrganismos degradadores de antraceno... 153
6.4.2 Identificação dos microrganismos........................................... 156
6.4.3 Biodegradação do antraceno em meio mineral....................... 158
6.4.4 Mineralização do antraceno no solo........................................ 159
6.5 CONCLUSÕES................................................................................ 163
6.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS............................................... 164
7. CONCLUSÕES GERAIS................................................................... 169
8. APÊNDICE......................................................................................... 170
xi
RELAÇÃO DE TABELAS
Página
Análise química do solo Itapoã. ................................................................... 59
Identificação dos microrganismos degradadores de antraceno pelo
seqüenciamento do gene do RNAr. ............................................................. 68
Degradação do antraceno, fenantreno e pireno pelo consórcio microbiano
por 30 dias em meio mineral com 250 mg L
-1
de um dos HAPs, a 150 rpm,
30°C. ............................................................................................................ 75
Crescimento dos membros do consórcio microbiano em diferentes fontes
de C adicionadas individualmente ao meio mineral após incubação por 7
dias a 150 rpm e 30°C. ................................................................................ 78
Mineralização das diferentes concentrações dos HAPs, no solo inoculado
com o consórcio microbiano ou sem inoculação (SI), ao final dos
experimentos respirométricos. ..................................................................... 105
Concentrações e porcentagens de degradação do antraceno, fenantreno
e pireno no solo após o final dos experimentos respirométricos. ................ 108
Análise química do solo Itapoã. ................................................................... 120
Teor de amônio e nitrato+nitrito, relação C:N e força iônica no solo
contaminado com 500 mg kg
-1
antraceno e adicionado de diferentes
doses de nitrogênio. ..................................................................................... 130
Teor de fósforo, relação C:P e C:N:P no solo contaminado com 500 mg
kg
-1
antraceno e adicionado de diferentes doses de fósforo. .......................
133
xii
Identificação dos microrganismos degradadores de antraceno pelo
seqüenciamento do gene do RNAr. ............................................................. 157
Degradação do antraceno pelos isolados do Consórcio 1 por 48 dias e
pelo Consórcio 2 por 30 dias, em meio mineral Tanner com 250 mg L
-1
de
antraceno, a 150 rpm e 30°C. ......................................................................
159
xiii
RELAÇÃO DAS FIGURAS
Página
Fórmulas estruturais de alguns hidrocarbonetos aromáticos policíclicos..... 08
Mecanismo de ativação metabólica de HAPs e reação com o DNA. .......... 10
Degradação do antraceno por bactérias aeróbias. .................................... 16
Degradação do fenantreno por fungos não-lignolíticos. .............................. 19
Degradação do fenantreno por fungos lignolíticos. ..................................... 20
Produção de C-CO
2
de um solo contaminado com antraceno e inoculado
com diferentes amostras de solo provenientes de uma área de descarte
de resíduos petroquímicos. .......................................................................... 67
pH e contagem das UFC das bactérias e do fungo do consórcio
microbiano, crescendo em meio mineral com 250 mg L
-1
de antraceno a
150 rpm e 30°C. ........................................................................................... 72
Produção de C-CO
2
de um solo após bioestimulação (Bioest),
bioaumentação (Bioaum), contaminação com antraceno (Ant) e acetona
(Acet). .......................................................................................................... 96
Produção de C-CO
2
de um solo contaminado com antraceno após
esterilização e a bioaumentação com um consórcio microbiano. ................ 98
Produção de C-CO
2
de um solo contaminado com antraceno, inoculado
com bactérias e fungo separadamente, ou conjuntamente na forma de um
consórcio microbiano. .................................................................................. 99
xiv
Produção de C-CO
2
de um solo contaminado com diferentes
concentrações de antraceno (mg kg
-1
de solo), inoculado com o consórcio
microbiano ou sem inoculação (SI). ............................................................. 102
Produção de C-CO
2
de um solo contaminado com diferentes
concentrações de fenantreno (mg kg
-1
de solo), inoculado com o
consórcio microbiano ou sem inoculação (SI). ............................................ 103
Produção de C-CO
2
de um solo contaminado com diferentes
concentrações de pireno (mg kg
-1
de solo), inoculado com o consórcio
microbiano ou sem inoculação (SI). ............................................................. 104
Produção de C-CO
2
de um solo com diferentes umidades gravimétricas
(%), contaminado com antraceno e inoculado ou não (SI) com um
consórcio microbiano. .................................................................................. 125
Produção de C-CO
2
de um solo com diferentes pH, contaminado com
antraceno e inoculado ou não (SI) com um consórcio microbiano. ............. 127
Produção de C-CO
2
de um solo com diferentes doses de nitrogênio (kg
ha
-1
), contaminado com antraceno e inoculado com o consórcio
microbiano. .................................................................................................. 129
Produção de C-CO
2
de um solo com diferentes doses de fósforo (kg ha
-1
),
contaminado com antraceno e inoculado ou não (SI) com um consórcio
microbiano. .................................................................................................. 132
Produção de C-CO
2
de um solo com diferentes doses de ferro (kg ha
-1
),
contaminado com antraceno e inoculado ou não (SI) com um consórcio
microbiano. .................................................................................................. 134
Produção de C-CO
2
de um solo com diferentes doses de enxofre (kg
ha
-1
), contaminado com antraceno e inoculado ou não (SI) com um
consórcio microbiano. .................................................................................. 136
Produção de C-CO
2
de um solo contaminado com antraceno e inoculado
com diferentes amostras de solo provenientes de uma área de descarte
de resíduos petroquímicos. .......................................................................... 155
xv
Produção de C-CO
2
de um solo contaminado com 500 mg kg
-1
de
antraceno e inoculado com consórcios microbianos. .................................. 161
1. INTRODUÇÃO GERAL
Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) são compostos químicos
constituídos unicamente de átomos de carbono e hidrogênio, arranjados na forma
de dois ou mais anéis aromáticos. Devido a possibilidade da fusão de um número
variável de anéis e das várias posições em que estes anéis podem se ligar entre si
há atualmente mais de 100 HAPs reconhecidos pela IUPAC (International Union of
Pure and Applied Chemistry). Os HAPs são lipossolúveis na membrana e
prontamente absorvidos no organismo dos humanos via inalação, exposição oral e
dermal, com posterior acúmulo no tecido adiposo. O metabolismo dos HAPs gera
compostos epóxidos com propriedades carcinogênicas e mutagênicas, tendo sido
relatados inúmeros casos de câncer no pulmão, intestino, fígado, pâncreas e na
pele, devido a presença destes compostos.
Os HAPs são gerados naturalmente, e de forma contínua, pela combustão
incompleta de resíduos orgânicos, mas a contaminação do solo por estes
compostos é um típico efeito da atividade antropogênica relacionada aos
processos de extração, transporte, refino, transformação e utilização do petróleo e
seus derivados. Assim, devido a estas atividades, o solo recebe quantidades
consideráveis dos HAPs, entre eles o antraceno, o fenantreno e o pireno. Devido a
complexidade estrutural e a baixíssima solubilidade em água, estes HAPs tornam-
se recalcitrantes no solo e permanecem por longos períodos neste ambiente, o
que aumenta a possibilidade de exposição de humanos e animais a estes
compostos.
Uma estratégia para eliminação dos HAPs dos solos contaminados é
através da biorremediação onde os microrganismos que apresentam capacidade
2
de metabolizar estes compostos irão transformá-los em substâncias inertes, CO
2
e
água. Alguns resultados entretanto, têm demonstrado que a biorremediação pode
tornar-se excessivamente lenta e não reduzir a concentração de poluentes aos
níveis exigidos pela legislação ambiental. Entre os vários fatores responsáveis por
estes insucessos, pode-se destacar a inabilidade dos microrganismos em
degradar os HAPs, a baixa biodisponibilidade e a limitação de nutrientes à
microbiota degradadora.
Para que um microrganismo utilize os HAPs como fonte de C e energia
para o seu crescimento, é necessário que este possua as várias enzimas que
transformam as complexas moléculas dos HAPs em intermediários das rotas
catabólicas. Por isso, a maioria dos microrganismos do solo não possui a
capacidade de degradar estes compostos, justificando a necessidade de se isolar
e selecionar microrganismos degradadores de HAPs, visando sua utilização na
biorremediação de solos contaminados com estes compostos. Desde a década de
50, vários pesquisadores selecionaram bactérias e fungos em culturas puras com
capacidade de degradar HAPs, sendo que somente nos últimos anos tem sido
dada atenção a obtenção de consórcios microbianos degradadores de HAPs, que
comparativamente às culturas puras, tem se mostrado mais efetivos na
degradação destes compostos, devido a capacidade de utilizar um maior número
de HAPs como fonte de C, pela maior taxa de degradação e principalmente pela
maior mineralização destes compostos, o que aumenta a possibilidade de um
processo de biorremediação mais efetivo onde os contaminantes têm maiores
chances de serem completamente eliminados do ambiente.
No entanto, alguns trabalhos têm demonstrado que a inoculação ao solo
dos microrganismos selecionados em laboratório pode resultar em baixas taxas de
degradação, o que pode ser conseqüência da incapacidade destes
microrganismos em colonizar o solo e degradar os HAPs neste ambiente. A
complexidade química, física e biológica do solo pode determinar o declínio da
população inoculada, seja pelas relações antagônicas impostas pelas populações
autóctones, como predação e competição, seja pelos estresses fisiológicos
causados pelos fatores abióticos, como pH, disponibilidade de água e ar,
temperatura e, no caso específico dos HAPs, biodisponibilidade de fontes de C e
3
energia. Assim, a seleção de microrganismos a serem utilizados na
biorremediação de solos deve considerar além da habilidade bioquímica, a
capacidade de colonização e degradação do contaminante no solo.
A baixa solubilidade em água dos HAPs faz com que apresentem forte
tendência de sorção à fase sólida do solo, principalmente à matéria orgânica, o
que reduz a sua biodisponibilidade à microbiota degradadora. Para superar esta
limitação, os microrganismos têm utilizado mecanismos como a produção e a
excreção de biossurfactantes. Estas moléculas apresentam uma porção hidrofílica
e uma porção hidrofóbica fazendo com que se posicionam preferencialmente nas
interfaces entre fases fluidas com diferentes graus de polaridade (como nas
interfaces óleo/água ou ar/água). Uma das propriedades destas moléculas é a
redução da energia interfacial (tensão interfacial) e da tensão superficial devido a
formação de uma camada molecular ordenada na interface. Além disso,
promovem a formação de microemulsões, onde os HAPs são incorporados no
centro hidrofóbico das micelas e desta forma, podem penetrar numa solução
aquosa, aumentando a solubilidade aparente e conseqüentemente, a sua
biodisponibilidade aos microrganismos degradadores.
A biorremediação também pode ser limitada se as condições do solo não
forem favoráveis a sobrevivência e a atividade dos microrganismos degradadores.
A adequada umidade do solo é considerado um fator ambiental importante na
biodegradação, pois uma alta atividade microbiana somente ocorrerá se houver
disponibilidade de água aos microrganismos. Além disto, o teor de água no solo
tem relação direta e inversa com a disponibilidade de oxigênio e
conseqüentemente, com a atividade dos microrganismos aeróbios que são os
principais responsáveis pela degradação dos HAPs.
O pH do solo afeta diretamente a atividade dos microrganismos através dos
efeitos dos íons H
+
na permeabilidade celular e na atividade enzimática, assim
como indiretamente, pela influência na disponibilidade de macro e micronutrientes,
e na solubilidade do alumínio e dos metais pesados, que podem ser tóxicos aos
microrganismos.
Em ambientes naturais, o nutriente que normalmente limita o crescimento
microbiano é o C, sendo que os nutrientes inorgânicos estão presentes em
4
quantidades que normalmente excedem as demandas das comunidades
microbianas. No entanto, a presença de elevadas concentrações de HAPs no solo
com potencial para serem utilizados como substrato para o crescimento dos
microrganismos, pode fazer com que outros nutrientes que não o C se tornem
limitantes. A relação C:N:P de 100:10:1 no solo a ser biorremediado tem sido
normalmente recomendada. No entanto, as pesquisas que avaliaram os efeitos da
adição de N e P ao solo demonstraram resultados muito conflitantes, indicando
que esta relação pode não ser a mais adequada.
Outro nutriente que pode influenciar a degradação dos HAPs no solo é a
disponibilidade do ferro. Isto porque, este elemento desempenha funções
celulares que estão intimamente relacionadas ao metabolismo dos HAPs, como a
participação na estrutura das enzimas do sistema multicomponente das
dioxigenases e participação como cofator enzimático nas enzimas de fissão. A
possível limitação deste elemento aos microrganismos do solo pode ocorrer
porque os óxidos de ferro apresentam baixa solubilidade em ambientes aeróbios,
sendo que a concentração do ferro na solução dos solos oxidados pode ser menor
que 10
-18
M.
O enxofre é outro elemento que está envolvido no metabolismo microbiano
dos HAPs, isto porque é parte integrante do sistema multicomponente das
dioxigenases, na forma de complexos ferro-enxofre. No solo, o enxofre encontra-
se quase que totalmente associado à biomassa viva ou morta e desta forma, pode
não estar prontamente disponível ou não ser quantitativamente suficiente para
suportar uma alta demanda pela população degradadora do solo, quando da
adição de HAPs ao solo.
Assim, em vista de todos estes fatores que podem influenciar a
biorremediação de um solo contaminado com HAPs, esta estratégia deve ser
utilizada somente após uma série de avaliações em laboratório, que visam
caracterizar as populações degradadoras dos contaminantes e conhecer as
demandas desta população no que se refere as condições ambientais do solo a
ser biorremediado. O objetivo do presente estudo foi isolar, identificar e
caracterizar microrganismos degradadores e mineralizadores de antraceno,
fenantreno e pireno em meio mineral e no solo, assim como avaliar a influência do
5
pH e da disponibilidade de água, do nitrogênio, do fósforo, do ferro e do enxofre,
na biorremediação de um solo contaminado com antraceno.
CAPÍTULO I
BIORREMEDIAÇÃO DE SOLOS CONTAMINADOS COM
HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS
7
2.1 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1.1. OS HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS NO
AMBIENTE
2.1.1.1 Caracterização dos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) são compostos
químicos formados natural ou antropogenicamente durante a combustão
incompleta de substâncias orgânicas como o carvão mineral e vegetal, óleo
cru, gás, madeira, lixo, etc (Prince; Drake, 1999). São compostos constituídos
unicamente de átomos de carbono e de hidrogênio, arranjados na forma de
dois ou mais anéis aromáticos. Devido a possibilidade da fusão de um número
variável de anéis e das várias posições em que estes anéis podem se ligar
entre si, há atualmente mais de 100 HAPs reconhecidos pela União
Internacional de Química Pura e Aplicada (IUPAC). Dentre estes, somente 18
são considerados em função das informações químico-físicas, toxicológicas,
ambientais e industriais existentes. São eles: acenaftaleno, acenaftileno,
antraceno, benzo(a)antraceno, benzo(a)pireno, benzo(b)fluoranteno,
benzo(e)pireleno, benzo(k)fluoranteno, benzo(g,h,i)pireleno,
benzo(j)fluoranteno, criseno, dibenzo(a,h)antraceno, fenantreno, fluoranteno,
fluoreno, indeno(um,2,3-c,d)pireno, naftaleno e pireno.
O antraceno é um dos poucos HAP produzidos industrialmente. É
obtido a partir do carvão, numa fração conhecida como “óleo de antraceno” ou
“óleo verde”. O antraceno (C
14
H
10
), também conhecido como antracin ou
paranaftaleno, é formado por três anéis aromáticos, arranjados de forma linear
(Figura 1), apresentando massa molecular de 178,2 g e solubilidade em água
8
de 0,076 mg L
-1
(Verschueren, 2001). O antraceno é usado na produção de
corantes, de fibras sintéticas e como diluente de preservantes de madeira
(Hawley, 1993). Devido a sua menor toxicidade em relação aos demais HAPs,
o antraceno tem sido utilizado como modelo para estudos envolvendo a
dinâmica destes compostos no ambiente (Weigand et al., 2002).
FIGURA 1. Fórmulas estruturais de alguns hidrocarbonetos aromáticos
policíclicos.
O fenantreno também é utilizado industrialmente para a produção de
corantes e de explosivos. Este composto é um isômero do antraceno (C
14
H
10
),
com um dos três anéis aromáticos não arranjado linearmente em relação aos
demais (Figura 1). Este também é conhecido como fenantrin, apresenta massa
molecular de 178,2 g e solubilidade em água de 1,29 mg L
-1
(Verschueren,
2001). A escolha deste HAP para o trabalho foi motivada pela avaliação das
mudanças no comportamento da biodegradação em relação ao seu isômero
antraceno, ao elevado número de trabalhos na literatura e por ser o HAP que
se encontra em maior proporção (2,8%) na lodo oleoso produzido no Pólo
Petroquímico do Sul em Triunfo/RS, exceção feita ao naftaleno que é um
composto muito volátil (Allard et al., 2000; Rangel, 2003).
O pireno é um composto cujo uso nos Estados Unidos não está descrito
na literatura, porém somente no ano de 1994 este país importou
aproximadamente 55 toneladas da Europa (USDHS, 1995). O pireno (C
16
H
10
) é
formado de quatro anéis aromáticos agrupados (Figura 1), apresentando
massa molecular de 202,3 g e solubilidade em água de 0,135 mg L
-1
(Verschueren, 2001). É consenso na literatura, que a biodegradação tem maior
eficiência na eliminação de hidrocarbonetos com um, dois ou três anéis
aromáticos (HAPs de baixa massa molecular), porém tem sido considerada
pouco efetiva com compostos de quatro ou mais anéis aromáticos (HAPs de
Antraceno
Fenantreno Pireno
9
alta massa molecular). Desta forma, a escolha do pireno é motivada pela
avaliação de uma condição limite para a degradação dos HAP pelos
microrganismos do solo.
2.1.1.2 Exposição e toxicidade dos HAPs
A preocupação com a presença de HAPs no ambiente deve-se a
possibilidade destes compostos reagirem diretamente ou após transformações
metabólicas (ativações) com o DNA, tornando-se mutagênicos e
carcinogênicos ao homem e aos animais. Os HAPs e seus derivados estão
associados ao aumento de incidência de câncer no pulmão, intestino, fígado,
pâncreas e na pele do Homem (Chakradeo et al., 1993).
A exposição de humanos e animais aos HAPs ocorre por inalação,
exposição oral ou dérmica. A quantidade absorvida por inalação depende do
grau de contaminação atmosférica, que está diretamente relacionado a
urbanização, tráfego de veículos e industrialização do local. A absorção
dérmica é importante em pessoas que trabalham em atividades relacionadas
ao petróleo e a petroquímica. Os alimentos são considerados outra importante
fonte de exposição, devido a formação de HAPs durante o cozimento e devido
a deposição atmosférica (Netto et al., 2000).
Em vista da característica fortemente apolar, os HAPs são lipossolúveis
e prontamente absorvidos no trato intestinal dos mamíferos, com posterior
acúmulo no tecido adiposo. O metabolismo dos HAPs ocorre em diferentes
tecidos do organismo por várias rotas, em quase todas há formação de
compostos epóxidos, com propriedades carcinogênicas e mutagênicas (IPCS,
1998). As monoxigenases dependentes do citocromo P 450 são responsáveis
pela oxidação enzimática dos HAPs (Figura 2). Estas agem principalmente
sobre a região de elevada densidade eletrônica ou na região angular da
molécula do HAP formando óxidos de arenos (epóxidos primários). Estes
podem espontaneamente formar fenóis ou, por ação das epóxido hidrolases,
produzirem di-hidrodióis, que serão oxidados a quinonas ou podem sofrer nova
epoxidação, levando à formação de epóxidos secundários (di-
hidrodiolepóxidos). Tanto os epóxidos primários quanto os secundários podem
reagir covalentemente com as bases nucleofílicas do DNA, notadamente a
10
guanina, formando os denominados adutos HAP-DNA, que eventualmente,
podem dar início a um processo mutagênico. Reações semelhantes são
observadas com outras macromoléculas tais como a albumina e a hemoglobina
(Netto et al., 2000).
O
OH
OH
OH
OH
O
FIGURA 2. Mecanismo de ativação metabólica de HAPs e reação com o DNA
(Netto et al., 2000).
Um esquema proposto para carcinogênese por exposição considera as
seguintes etapas: exposição ambiental, ativação metabólica, formação de
adutos entre o HAP e o DNA, mutação de genes críticos como, por exemplo, o
P53 (gene repressor de tumor) e sucessão de mutações em outros genes
(White, 1986).
2.1.1.3 Geração, contaminação e legislação dos HAPs
A fonte natural de HAPs é a combustão incompleta de resíduos
orgânicos, como carvão vegetal e mineral, madeira e outros . Como fontes
antropogênicas podemos destacar a produção industrial de HAPs, a geração
de fuligem a partir dos motores de veículos e a cadeia de extração, transporte,
refino e transformação do petróleo e seus derivados. Como exemplo desta
última fonte, podemos citar o lodo oleoso gerado pelo Pólo Petroquímico do Sul
e pela Refinaria Alberto Pasqualini (REFAP – Canoas/RS).
De modo geral, os centros urbanos são os locais com maior potencial de
contaminação de HAPs, onde se destacam as oficinas mecânicas, as lavagens
P-450
DNA
Adutos
HAP-DNA
Epóxido
hidrolase
P-450
Adutos
HAP-DNA
DNA
Epóxidos
Primários
Epóxidos
Secundários
11
e as garagens de automóveis. Entretanto, os maiores responsáveis pela
contaminação do ar, do solo, do subsolo e das águas subterrâneas por
hidrocarbonetos são os postos de serviços e combustíveis. A maioria dos
tanques subterrâneos de armazenamento de combustíveis é susceptível a
corrosão nos primeiros 20 anos após sua instalação. De modo geral, cerca de
50% dos vazamentos ocorrem antes dos 15 anos e grande parte das
tubulações apresentam vazamentos antes dos 10 anos (Lima et al., 1998).
Deste modo a população urbana, em especial, pode estar exposta a
contaminação dos hidrocarbonetos, entre eles os HAPs, não havendo até o
momento nenhuma iniciativa visando informar sobre este risco.
O monitoramento de contaminação ambiental por HAPs realizado na
Inglaterra indicou valores aproximados de concentração no solo de 0,005 µg
kg
-1
em áreas agrícolas, aumentando para 0,03 µg kg
-1
nas proximidades dos
centros urbanos e para 1,8 µg kg
-1
nas áreas industriais (Jones, 1989). Outra
tentativa de quantificar a concentração de HAPs que podem estar presente em
diferentes ambientes foi realizada por Angerer et al. (1997), indicando que a
concentração no ar pode variar de 1,3 a 500 ng m
-3
, no solo de 0,8 ng kg
-1
a
100 mg kg
-1
, na água de 2,5 a 500 ng L
-1
e nos alimentos de 0,1 a 20 ng kg
-1
.
A legislação existente sobre HAPs está principalmente nos Estados
Unidos e na União Européia, havendo entre eles grande diferença nos limites.
As concentrações máximas permitidas dizem respeito principalmente ao
benzo(a)pireno, que é o HAP cujo metabolismo em mamíferos é mais
estudado. Para o ar, a Comissão das Comunidades Européias (2003)
determinou a concentração máxima de 0,001 µg m
-3
de benzo(a)pireno,
enquanto a USEPA (Agência Americana de Proteção Ambiental) limita este
valor em 100 µg m
-3
. Para a água potável, a USEPA estabeleceu o valor
máximo de 0,0028 µg L
-1
de HAP e para meios não específicos, estabeleceu as
doses diárias de referência para o antraceno (0,3 mg kg
-1
dia
-1
), acenafteno
(0,06 mg kg
-1
dia
-1
), fluoranteno (0,04 mg kg
-1
dia
-1
), fluoreno (0,04 mg kg
-1
dia
-
1
) e pireno (0,03 mg kg
-1
dia
-1
) (USDHS, 1995).
Outra legislação reconhecida internacionalmente é a Lista Holandesa de
Valores de Qualidade do Solo e da Água Subterrânea, proposta em 1994 pelo
governo holandês (CETESB, 2005a). Nela são estipulados três valores de
qualidade:
12
Valor de referência (S): indica um nível de qualidade do solo e da água
subterrânea que permite considerá-los “limpos”, considerando-se a sua
utilização para qualquer finalidade.
Valor de intervenção (I): indica um nível de qualidade do solo acima do qual
existem riscos para a saúde humana e para o ambiente. A ultrapassagem
desse valor (média) em um volume de solo de 25 m
3
ou em 100 m
3
de água
subterrânea, indica a necessidade de implementação na área avaliada de
ações voltadas para a sua remediação.
Valor de alerta (T): é um valor médio entre os dois primeiros S e I. Este valor
indica que já ocorreu uma certa alteração que diminuiu, ainda que pouco, as
propriedades funcionais do solo, sendo necessária uma investigação
detalhada na área para quantificação dessa alteração.
Nesta legislação, os limites de contaminação de HAPs no solo são
determinados somando-se a concentração dos seguintes compostos:
naftaleno, fenantreno, antraceno, fluoranteno, benzo(a)antraceno, criseno,
benzo(k)fluoranteno, benzo(a)pireno, benzo(ghi)perilene e indenol(1
,2,3cd)pireno. Desta forma, em solos com teor de material orgânica menor que
100 g kg
-1
, somando as concentrações dos 10 HAPs, o valor de referência é
1,0 mg kg
-1
, o valor de alerta é 20,5 mg kg
-1
e o valor de intervenção é de 40
mg kg
-1
. Para as águas subterrâneas, os limites de contaminação referem-se
individualmente a cada um dos 10 HAPs. Para o antraceno e o fenantreno os
valores são iguais, sendo o de referência de 0,02 µg L
-1
, o de alerta de 2,5 µg
L
-1
e o de intervenção de 5,0 µg L
-1
(CETESB, 2005a).
Ao nosso conhecimento, a única legislação brasileira que trata da
contaminação por HAPs do solo e das águas subterrâneas é a da CETESB
(Companhia de Tecnologia de Saneamento Ambiental do Estado de São
Paulo). Nela, o naftaleno é o único HAP citado, sendo o valor de referência de
0,2 mg kg
-1
e o de intervenção de 15 mg kg
-1
em solos agrícolas, de 60 mg kg
-1
em solos residenciais e de 90 mg kg
-1
em solos industriais. Para águas
subterrâneas o valor de intervenção para o naftaleno é de 100 µg L
-1
(CETESB,
2005b).
Em vista da ampla distribuição dos HAPs no ambiente, da possibilidade
de ocasionarem cânceres no Homem e dos limites impostos pela legislação de
13
alguns países, a sua eliminação do ambiente deve ser buscada, visando a
redução da exposição e da absorção pelo organismo dos mamíferos.
2.1.2 BIORREMEDIAÇÃO DOS HAPs
2.1.2.1 Estratégias para biorremediação de HAPs no solo
O solo, se adequadamente utilizado, é um meio eficaz para o tratamento
de resíduos. Sua complexidade física, química e biológica promove o
transporte, a retenção e a transformação dos resíduos em substâncias mais
simples, húmus, nutrientes, CO
2
e água, possibilitando desta forma, a
reciclagem dos nutrientes e o equilíbrio dos ciclos biogeoquímicos do planeta
(Brady; Weil, 2002).
A contagem microbiana de células viáveis em solos férteis varia entre
10
7
e 10
8
por grama, sendo as bactérias, o grupo mais numeroso de
microrganismos, e os fungos, o grupo com maior biomassa, entre os demais
grupos de actinomicetos, algas e protozoários (Sylvia et al., 1999). Estes
grupos são reservatórios catalíticos potenciais e quando expostos a
determinadas moléculas orgânicas, exibem enriquecimento seletivo de forma a
possibilitar a conversão destes em energia e nutrientes e conseqüentemente, a
sua degradação. Assim, o solo é um ambiente favorável a biodegradação dos
HAPs (Alexander, 1999).
A clivagem dos HAPs é catalisada por complexos enzimáticos
conhecidos como oxigenases, que adicionam átomos de oxigênio ao anel
aromático, desestabilizando as ligações químicas e permitindo a abertura deste
anel. Este será clivado formando intermediários das rotas comuns do
metabolismo microbiano, que possibilitarão aos microrganismos utilizar
compostos aromáticos como fonte de carbono e energia para o seu
crescimento (Caldwell, 2000).
Em vista da capacidade de degradação dos HAPs pelos microrganismos
do solo, a biorremediação é uma alternativa para a remoção destes compostos
do ambiente. Por definição, a biorremediação é a utilização de processo ou
atividade biológica para transformação dos contaminantes em substâncias
14
inertes (Hollinger et al., 1997). Entre as estratégias usadas para a
biorremediação dos HAPs no ambiente, destacam-se a biorremediação
passiva, a bioestimulação, a bioaumentação e o landfarming. Na
biorremediação passiva ou intrínseca o HAP é biodegradado pelos
microrganismos nativos do solo, ao passo que na bioestimulação a microbiota
degradadora recebe aporte de nutrientes orgânicos e/ou inorgânicos para
estimular o seu crescimento. A bioaumentação envolve a inoculação de
culturas puras e ou de consórcios microbianos, contendo microrganismos pré-
selecionados, com alta capacidade de degradação e competição, para
degradar compostos específicos (Skipper, 1999).
O landfarming caracteriza-se como um sistema de tratamento de
resíduos que pode inclusive, utilizar-se das três estratégias de biorremediação
acima citadas. Nele, os resíduos são aplicados e incorporados na camada
superficial do solo, onde se encontra a maioria da população heterotrófica, que
realiza a biodegradação (Boopathy, 2000). A operação do landfarming consiste
de três etapas: i) aplicação e mistura do resíduo no solo, através das
operações com máquinas de preparo; ii) adição de corretivos e nutrientes; iii)
revolvimentos periódicos para possibilitar aeração e a mistura das camadas
superficiais do solo. Desta forma, busca-se no landfarming favorecer ao
máximo a atividade da população microbiana degradadora do contaminante.
Em vista de que no landfarming normalmente são tratados resíduos que
apresentam algum tipo de periculosidade ao Homem e ao ambiente, a área de
tratamento destes resíduos é utilizada exclusivamente para este fim, sendo
realizada a impermeabilização do solo abaixo da camada arável, bem como a
contenção do escoamento superficial, para evitar a dispersão do contaminante
no ambiente. O SICECORS (Sistema Centralizado de Controle de Resíduos
Sólidos do Pólo Petroquímico do Sul) do Pólo Petroquímico do Sul há 16 anos
trata no sistema landfarming o lodo oleoso produzido pelas indústrias do Pólo e
mais recentemente os resíduos da Refinaria Alberto Pasqualini.
Apesar de que todas as frações dos hidrocarbonetos são passíveis de
decomposição microbiana e do relativo baixo custo de operação do
landfarming, a biodegradação de resíduos neste sistema pode ser um processo
lento, e em curto prazo incompleto, com acúmulo dos resíduos mais
recalcitrantes no solo quando há reaplicações sucessivas. Pesquisas
15
realizadas por Mielniczuk (1991) indicaram que a taxa de mineralização do lodo
oleoso no solo em condições otimizadas de laboratório é menor que 8% ao
ano. Segundo Bewley (1996) para que o landfarming seja um processo
eficiente de tratamento de resíduos é necessário o atendimento de três
condições: i) presença no solo de microrganismos com capacidade de
degradar os contaminantes; ii) condições ambientais favoráveis a alta atividade
da população microbiana; iii) disponibilidade do contaminante aos
microrganismos degradadores. Portanto, é provável que esta baixa
porcentagem de mineralização seja conseqüência do não atendimento de
alguma destas condições, o que diante do problema ambiental causado pela
geração e estocagem de um resíduo de alta periculosidade, demanda o
desenvolvimento de pesquisas que visem tornar o landfarming um processo
mais eficiente de eliminação dos resíduos petroquímicos.
2.1.2.2 Metabolismo e genética da degradação de HAPs
A degradação dos HAPs no ambiente pode ocorrer abióticamente
através de processos químicos e físicos. A interação de moléculas e íons ou a
excitação de átomos por efeito da luz e da temperatura conduzem a
desestabilização da estrutura das moléculas e ao rompimento das ligações. No
entanto, estes processos são lentos, incompletos e podem gerar intermediários
mais tóxicos que as moléculas originais. Assim a biodegradação é a principal
via de eliminação dos HAPs no solo (Prince e Drake, 1999).
O metabolismo bacteriano dos HAPs já há algum tempo tem sido
quimicamente estudado, com a determinação de vários intermediários das
rotas de degradação (Evans et al., 1965), porém a identificação dos genes e
das enzimas envolvidas necessita ainda de um maior entendimento (Mishra et
al., 2001). Alguns estudos no entanto, têm nos possibilitado a identificação de
boa parte destas rotas metabólicas, ainda que seja difícil senão impossível,
predizer a maneira exata em que um particular composto aromático será
catabolizado (Caldwell, 2000).
No metabolismo bacteriano as enzimas de degradação dos HAPs
podem ser divididas em dois grupos: as periféricas e as de fissão. As enzimas
periféricas têm a função de reconhecer e converter os HAPs em moléculas
16
degradáveis pelas enzimas de fissão, que farão com que estas moléculas
possam entrar nas rotas comuns de geração de energia e de carbono nas
células microbianas (Mishra et al., 2001). Para demonstrar as principais
transformações pelas quais os HAPs são submetidos após absorção pelas
células bacterianas, utilizaremos como exemplo a rota de degradação do
antraceno (Figura 3).
OH
OH
H
H
Antraceno
Antraceno cis 1,2-dihidrodiol
OH
OH
1,2-Dihidroxiantraceno
CO
OH
COOH
Cis-4(2'hidroxinaft-3-yl)
OH
CHO
2-hidroxi 3-naftaldeído
OH
COOH
Ácido 2-hidroxi-3-naftóico
OH
OH
2,3-hidroxinaftaleno
CO
OH
COOH
Cis 2-hidroxibenzalpiruvato
OH
COOH
Ácido salicílico
OH
OH
COO-
COO-
Catecol
Cis-muconato
COO-
CO
2-hidroximucônico semialdeído
Succinato +
Acetil-Coa
Piruvato +
Acetaldeído
FIGURA 3. Degradação do antraceno por bactérias aeróbias (Evans et al.,
1965; Cerniglia, 1984; Caldwell, 2000).
O passo inicial é o reconhecimento e a incorporação de dois átomos de
oxigênio na molécula. Isto é realizado por uma enzima dioxigenase, originando
um intermediário com duas hidroxilas, denominado antraceno cis 1,2-
dihidrodiol. Este por sua vez, terá dois átomos de hidrogênio retirados da sua
molécula por uma enzima dehalogenase, originando um composto denominado
17
1,2 dihidroxiantraceno, que será substrato de uma oxidase Fe-dependente que
o transformará em um intermediário com dois anéis aromáticos fechados e um
aberto, o cis-4(2’hidroxinaft-3-yl). Por ação de uma aldolase, este composto é
convertido em piruvato e em uma molécula com dois anéis aromáticos
fechados, denominada 2-hidroxi 3-naftaldeído. Ou seja, até este passo da rota
de degradação um dos anéis foi aberto e houve a formação de uma molécula
de piruvato (Evans et al., 1965).
O 2-hidroxi 3-naftaldeído é convertido por uma desidrogenase em ácido
2-hidroxi-3-naftóico, que pela ação de uma aldolase gera o 2,3
dihidroxinaftaleno. Este último composto será substrato de dioxigenases que o
transformarão primeiro em cis 2-hidroxibenzalpiruvato e depois, em piruvato e
salicilato. A salicilato hidrolase converterá este composto monoaromático em
catecol (Cerniglia, 1984). Além do catecol, outros compostos também podem
ser considerados intermediários centrais da rota de degradação de
hidrocarbonetos aromáticos, é o caso do protocatecol, do gentisato, do
homogentisato e do metil-catecol (Caldwell, 2000).
A partir de então, atuam as denominadas enzimas de fissão, que
converterão os intermediários centrais em compostos que possam ser
utilizados nas rotas do metabolismo primário. As enzimas de fissão podem ser
divididas em dois grupos, conforme o local da clivagem no intermediário
central: as enzimas intradiol abrem o anel aromático entre os dois átomos de
carbono hidroxilados, ou seja, por via orto, originando o cis-muconato, que por
passos sucessivos será convertido em succinato e acetil-coenzima A. A catecol
1,2-dioxigenase é a enzima que fará a clivagem do anel aromático se o
intermediário central for o catecol. As enzimas extradiol fazem a abertura do
anel aromático adjacente aos átomos de carbono hidroxilados, ou seja, por via
meta, originando o 2-hidroximucônico semialdeído, que por passos sucessivos
será transformado em piruvato e acetaldeído. Nesta via, a catecol 1,2-
dioxigenase é a enzima que fará a clivagem do anel aromático se o
intermediário central for o catecol (Caldwell, 2000).
Devido a este completo aparato enzimático, os HAPs presentes no meio
de cultura podem ser mineralizados em elevadas proporções pelas bactérias,
exceção feita ao antraceno, que provavelmente devido a sua baixa solubilidade
em água, tem sido mineralizado em proporções sempre menores que 20%
18
(Ahn et al., 1999). Já os trabalhos de Zhang et al. (1997) e de Johnson; Karlson
(2004) obtiveram mineralizações próximas a 100% quando o fenantreno foi
utilizado como única fonte de carbono pela Pseudomonas putida e pela
Sphingobium sp., respectivamente. Mesmo se tratando de um HAP de alto
peso molecular, o pireno foi mineralizado em 60% pela Mycobacterium sp.
(Cerniglia; Heikamp, 1990). Observa-se que, apesar da complexidade
estrutural dos HAPs, as bactérias apresentam capacidade de transformar estes
compostos em intermediários das rotas comuns do seu metabolismo, ou seja,
utilizam os HAPs como fonte de carbono e energia para o seu crescimento, que
em última análise, representa a produção de biomassa. No ambiente edáfico,
esta biomassa será posteriormente transformada em CO
2
e H
2
O ou será
incorporada, na forma de moléculas inertes do ponto de vista toxicológico, ao
húmus, representando um processo completo de eliminação dos HAPs do
ambiente.
Além das bactérias, os fungos também podem metabolizar os HAPs.
São duas as principais rotas descritas na literatura: a primeira está relacionada
aos fungos não-lignolíticos e a segunda aos fungos lignolíticos. Para
exemplificá-las utilizaremos as rotas de degradação do fenantreno. O
metabolismo dos HAPs do Cunninghamella elegans é o mais bem estudado
entre os fungos não-lignolíticos (Figura 4). Assim como em humanos, o
citocromo P450 realiza a monoxigenação inicial do fenantreno em óxidos
arenos (epóxidos), que através das enzimas epóxido hidrolases são
transformados em trans-dihidrodióis, ou um dos anéis pode ser rearranjado
não-enzimaticamente a fenol, que pode ser conjugado, originando compostos
como o-glicosídeos e o-glicoronídeos. Os trans-dihidrodióis são transformados
por desidratação em fenantróis, que podem então ser convertidos em 9-
fenantril-beta-D-glicopiranosídeo, que até então é acreditado ser um dos
produtos final da rota de degradação dos fungos não-lignolíticos (The
University of Minnesota, 2005).
19
Trans
-9-10-dihidrodiol
-fenantreno
O
OH
CH
2
OH
O
O
OH
OH
OH
HOH
2
C
Fenantreno
Fenantreno-9,10-óxido
Fenol
O-glicosídeo
OH
OH
H
H
OH
O
O
OH
OH
OH
CH
2
OH
9-fenantrol
9-fenantril-beta-D-glicopiranosídeo
FIGURA 4. Degradação do fenantreno por fungos não-lignolíticos (The
University of Minnesota, 2005).
A lignina contém uma variedade de estruturas aromáticas, sendo que os
fungos lignolíticos oxidam este polímero extracelularmente pela ação de lignina
peroxidases, peroxidases dependentes de Mn e lacases. Estas são enzimas
não específicas que podem oxidar HAPs (Johnsen et al., 2005). O Pleorotus
ostreatus é um fungo lignolítico que tem o metabolismo dos HAPs mais
estudado (Figura 5). Ele oxida o fenantreno transformando-o em 9,10-
fenantreno-quinona e por clivagem deste anel, em 2,2’-difenato. A partir deste
metabólito, pode ser formado 2,2’bifenildimetanol ou CO
2
, este último por uma
rota bioquímica ainda não elucidada (The University of Minnesota, 2005).
20
COOH
COOH
CH
2
OH
CH
2
OH
Fenantreno
9,10-fenantreno-quinona
2,2'-difenato
CO
2
?
2,2'bifenildimetanol
FIGURA 5. Degradação do fenantreno por fungos lignolíticos (The University of
Minnesota, 2005).
A mineralização de HAPs pelos fungos é um processo pouco entendido
e bastante limitado. Alguns trabalhos têm buscado quantificar o CO
2
produzido
quando os fungos crescem utilizando HAPs como única fonte de carbono e
energia. Bazalel et al (1996) avaliaram a mineralização do fenantreno e do
pireno durante 11 dias pelo fungo Pleorotus ostreatus, sendo esta de somente
3,0 e 0,4%, respectivamente. Neste mesmo trabalho, a mineralização do
antraceno foi ainda menor, 0,6% em 35 dias de incubação. Após 21 dias de
incubação, o fungo Phanerochaete chrysosporium mineralizou 7,7% do
fenantreno num experimento realizado por Bumpus et al. (1985). Melhores
resultados foram obtidos por Hammel et al. (1991) que após 7 dias
quantificaram 12% de mineralização do antraceno por P. chrysosporium. Assim
apesar das várias comprovações da capacidade de degradação dos HAPs
pelos fungos (Cerniglia, 1997), as porcentagens de mineralização descritas na
literatura são relativamente baixas se comparadas às das bactérias.
Considerando-se que a clivagem inicial do anel aromático é o passo
limitante da biodegradação dos HAPs, a produção de intermediários
hidroxilados com alta solubilidade em água pelos fungos é um importante
passo para acelerar a mineralização destes compostos, uma vez que,
possibilita a utilização destes intermediários pelas bactérias heterotróficas, que
os transformarão em carbono e energia para o seu crescimento. Além disso, a
21
formação de intermediários pelos fungos pode ser considerado um processo de
detoxificação dos HAPs, pois estes serão posteriormente mineralizados pelas
bactérias ou têm sua toxicidade reduzida em relação à molécula inicial
(Cerniglia, 1997).
Nas últimas duas décadas, as análises genéticas da degradação dos
HAPs por bactérias aeróbias têm se concentrado nos genes catabólicos do
naftaleno das espécies de Pseudomonas, em especial P. putida G7. Apesar de
serem denominados genes nah, referindo-se ao naftaleno, os isolados que
possuem estes genes apresentam a capacidade de degradar outros HAPs,
como o antraceno e o pireno (Habe; Omori, 2003). No isolado G7, estes genes
estão localizados no plasmídeo NAH7 e estão organizados em três operons:
um que codifica a rota superior (enzimas periféricas), outro a rota inferior
(enzimas de fissão) e o terceiro codifica a proteína regulatória NahR, que é
induzida pelo salicilato e sua expressão permite que os genes nah sejam
transcritos (Schell, 1985).
Em outros isolados, os genes de degradação dos HAPs foram
encontrados tanto no cromossomo como em plasmídeos e mostraram-se muito
semelhantes aos genes do NAH7 do isolado G7, apresentando
aproximadamente 90% de similaridade nas seqüências gênicas da rota
superior. Os genes da rota inferior tiveram suas seqüências completamente
determinadas somente para P. stutzeri AN10, não possibilitando ainda
comparações de similaridade (Habe; Omori, 2003).
Os genes catabólicos do pireno em bactérias aeróbias estão sendo
estudados em Mycobacterium sp. PYR-1, sendo que já foram obtidas as
seqüências dos genes que codificam a dioxigenase inicial e uma
desidrogenase (Khan et al., 2001). Ao nosso conhecimento, não há relatos de
estudos sobre a genética da degradação de HAPs em fungos, o que
provavelmente se deve a que estes microrganismos utilizam mecanismos não
específicos para a degradação dos HAPs, que estão relacionados também com
a degradação da lignina.
22
2.1.2.3 Biodisponibilidade e absorção celular dos HAPs
Pouco é conhecido sobre como os HAPs atravessam a membrana das
bactérias para entrar no citoplasma, que é o local onde se encontram as
enzimas de degradação. Estudos ainda não conclusivos têm indicado para a
possibilidade de dois mecanismos: no mecanismo passivo, a absorção se daria
por diferença de concentração (difusão) entre o meio intra e extracelular. Para
garantir a absorção permanente dos HAPs, as bactérias reordenariam os
fosfolipídios da membrana plasmática, criando uma região no interior desta que
atuaria como um reservatório de compostos hidrofóbicos (Bugg et al., 2000).
O outro mecanismo seria ativo, na qual os HAPs atravessariam a
membrana com gasto de energia da célula, porque a concentração intracelular
seria maior que a extracelular (Miyata et al., 2004). Após a realização de
experimentos que comprovam a existência dos dois mecanismos, estes últimos
autores sugeriram a co-existência dos dois mecanismos. Assim, o transporte
passivo ocorreria quando a célula entra em contato com o meio onde se
encontram os HAPs, ou seja, quando a concentração interna é baixa e a
externa alta, possibilitando o fenômeno da difusão. Após certo período, a
concentração intracelular de HAPs se igualaria a extracelular e o transporte
ativo passaria a atuar.
Na busca de um melhor entendimento da absorção de HAPs pelas
bactérias, os pesquisadores comprovaram a existência de um sistema de
efluxo, onde os intermediários da degradação dos HAPs que são tóxicos às
células seriam excretados para o meio externo para evitar danos celulares.
Estas bombas são enzimas codificadas por genes do cromossomo, o que
indica que este sistema de defesa pode ser utilizado em outras condições de
estresse, como por exemplo, no efluxo de antibióticos (Bugg et al., 2000). Este
sistema de efluxo opera com gasto de energia celular e foi comprovado pela
redução da concentração de HAPs no meio externo concomitantemente com o
aumento da concentração de intermediários polares (já parcialmente
metabolizados). Este sistema de excreção celular pode contribuir para a
ocorrência da complementaridade metabólica observada nos consórcios
microbianos, onde alguns membros realizam os passos iniciais de oxidação
23
dos HAPs, enquanto outros degradam os intermediários resultantes desta
oxidação.
A baixa solubilidade dos HAPs na água reduz a biodisponibilidade de
substrato à microbiota degradadora, constituindo-se em uma limitação a
degradação destes compostos no ambiente. Os microrganismos têm buscado
superar esta limitação utilizando-se de mecanismos como a produção de
substâncias poliméricas extracelulares (EPS), a formação de biofilme e a
produção de biossurfactantes.
Na microbiologia, as EPS são principalmente estudadas na formação e
na adesão de biofilmes microbianos às superfícies. Na degradação de
hidrocarbonetos, as EPS podem aumentar a biodisponibilidade destes
compostos à comunidade microbiana através do armazenamento de HAPs nos
biofilmes (Johnsen et al., 2005). Spath; Wuertz (1998) quantificaram em 80% o
conteúdo de benzeno, tolueno e xileno nas EPS do biofilme e somente em 20%
nas células microbianas. Dohse; Lion (1994) avaliaram 28 polímeros
microbianos e observaram que 24 deles atuaram como sorbentes para o
fenantreno. Outro modo de atuação das EPS foi descrito por Pollock (1993),
que observou que membros do gênero Sphingomonas produziram e
excretaram sphigans, um grupo de EPS formado por unidades repetidas, que
apresentam a capacidade de sorção dos HAPs de modo que permaneceram
biodisponíveis. A presença de três sphigans no meio de cultura resultou em
aumentos médios de 2,2 e 5,1 vezes na solubilidade do fenantreno e do pireno,
respectivamente, sem no entanto, resultar em aumento da mineralização do
fenantreno (a mineralização do pireno não foi avaliada) (Jonhsen; Karlson,
2004).
Outra estratégia para aumentar a disponibilidade de HAPs para os
microrganismos degradadores é através da redução da distância célula-
substrato pela formação de biofilmes. As análises em microscópio laser
confocal revelaram biofilmes de Mycobacterium crescendo sobre cristais de
antraceno e com conseqüente formação de “crateras” pelo consumo do HAP
(Wick et al., 2002). Para isso, o isolado exibiu modificações celulares
específicas, como a redução de tamanho e maior hidrofobicidade na superfície,
o que resultou em maior capacidade de adesão ao antraceno. Jonhsen;
Karlson (2004) avaliaram as estratégias para o aumento da biodisponibilidade
24
de HAPs em 21 bactérias degradadoras e observaram que a formação de
biofilmes foi o mecanismo predominantemente utilizado para superar esta
limitação. Outros autores observaram a formação de biofilmes de
Mycobacterium sobre cristais de antraceno (Wick et al., 2001) e de
Pseudomonas em cristais de fenantreno (Rodrigues et al., 2003).
Os biossurfactantes também podem aumentar a biodisponibilidade dos
HAPs nas soluções aquosas (Cameotra; Bollag, 2003). Estas moléculas
apresentam uma porção hidrofílica e uma porção hidrofóbica fazendo com que
se posicionam preferencialmente nas interfaces entre fases fluidas com
diferentes graus de polaridade (como nas interfaces óleo/água ou ar/água).
Uma das propriedades destas moléculas é a redução da energia interfacial
(tensão interfacial) e da tensão superficial devido a formação de uma camada
molecular ordenada na interface. Além disso, promovem a formação de
microemulsões, onde os HAPs são incorporados no centro hidrofóbico das
micelas e desta forma, podem penetrar numa solução aquosa (Desai; Banat,
1997).
Os surfactantes utilizados na biorremediação podem ser produzidos
industrialmente, a partir de derivados do petróleo, ou serem sintetizados
biológicamente por microrganismos. A utilização de surfactantes biológicos
(biossurfactantes) apresenta vantagens em relação aos industriais, como a
menor toxicidade aos microrganismos degradadores, menor recalcitrância no
ambiente, maior diversidade de estruturas químicas, atuação em uma gama
maior de condições, etc (Christofi; Ivshina, 2002).
Os biossurfactantes são sintetizados nas células microbianas e liberados
para o meio, sua porção hidrofílica pode ser constituída de aminoácidos,
peptídeos e sacarídeos e a porção hidrofóbica é normalmente formada por
ácidos graxos saturados ou insaturados. Um grande número de
microrganismos produz biossurfactantes, o que resulta em uma grande
diversidade de moléculas. Os biossurfactantes que reduzem a tensão
superficial e interfacial no contato água-HAP são os de baixo peso molecular,
como glicolipídeos e lipopeptídeos (Ron; Rosenberg, 2001). Os glicolipídeos
mais bem estudados são ramnolipídeos produzidos por bactérias do gênero
Pseudomonas, trehalolipídeos produzidos pelo gênero Rhodococcus e
soforolipídeos produzidos por leveduras do gênero Turolopsis. Entre os
25
lipopeptídeos destacam-se aqueles produzidos pelo gênero Bacillus, como a
surfactina, um excelente redutor de tensão superficial da água produzido pelo
B. subtilis (Desai; Banat, 1997).
Os biossurfactantes que formam microemulsões são de alto peso
molecular (também denominados de biossurfactantes poliméricos) constituídos
de polissacarídeos, proteínas, lipopolissacarídeos, lipoproteínas ou misturas
complexas destas moléculas. Os mais bem estudados são os produzidos pelo
gênero Acinetobacter, que são uma mistura de heteropolissacarídeo e
proteínas (Ron; Rosenberg, 2001).
Como exemplo das potencialidades da utilização de biossurfactantes na
degradação dos HAPs pode-se citar o trabalho de Zhang et al. (1997) que
utilizando um monoramnolipídeo e um diramnolipídeo verificaram que a
solubilidade do fenantreno no meio mineral aumentou de 0,7 mg L
-1
para 35 mg
L
-1
na presença do monoramnolipídeo e para 13 mg L
-1
na presença do
diramnolipídeo, demonstrando além da capacidade de solubilização, as
diferenças determinadas pelas estruturas químicas dos biossurfactantes. Como
conseqüência deste aumento da solubilidade, os autores também observaram
um aumento significativo da mineralização do fenantreno no meio de cultura.
Pesquisas realizadas recentemente em nosso laboratório possibilitaram
a seleção de um isolado de Pseudomonas citronellolis que reduziu a tensão
superficial de 69,2 mN m
-1
no meio mineral (controle) para 36 mN m
-1
após o
crescimento por 48 dias em antraceno (Jacques et al., 2005). A adição de 0,1
mM of Fe-Fe(NO
3
)
3
ao meio de cultivo reduziu ainda mais a tensão superficial,
atingindo o valor de 26,2 mN m
-1
(Santos, 2004). Segundo Cooper e Zaijic
(1980) para uma bactéria ser considerada boa produtora de biossurfactantes
deve reduzir a tensão superficial para valores inferiores a 40 mN m
-1
. Assim o
isolado de P. citronellolis pode ser considerado um bom produtor de
biossurfactante, reduzindo a tensão superficial para valores próximos aos 27
mN m
-1
obtidos pela surfactina do B.subtilis (Christofi; Ivshina, 2002).
Outros trabalhos no entanto, têm demonstrado que a produção de
biossurfactantes não é uma estratégia utilizada pela maioria dos
microrganismos degradadores de HAPs. Das 21 bactérias avaliadas por
Jonhsen; Karlson (2004), somente duas produziram biossurfactantes que
reduziram a tensão superficial em mais de 18 mN m
-1
. Além disso, Willumsen;
26
Karlson (1997) isolaram 57 degradadores de HAPs e produtores de
biossurfactantes, mas não encontraram correlação entre a redução da tenção
superficial e a mineralização dos HAPs, indicando que este pode não ser um
mecanismo essencial para a degradação destes compostos pelos
microrganismos (Johnsen et al. 2005).
Ao nosso conhecimento, não há ainda relatos da produção de
biossurfactantes por fungos crescendo em HAPs, no entanto Hormoconis
resinae reduziu a tensão superficial de 72 para 50 mN m
-1
após 25 dias
crescendo em meio contendo combustível de avião como única fonte de
carbono e energia (Muriel et al., 1996). Os agentes emulsificantes produzidos
pelos fungos Curvularia lunata e Penicillium citrinum formaram emulsões no
meio de cultura com diversos óleos minerais e vegetais, sendo elas estáveis
por um período superior a 20 dias (Paraszkiewicz et al., 2002; Morais et al.,
2003). Isto demonstra que a produção de biossurfactantes de baixo e alto peso
molecular, visando o aumento da biodisponibilidade de compostos hidrofóbicos
em soluções aquosas, também é uma característica dos fungos.
Em condições de solo, a adição dos surfactantes pode aumentar a
concentração dos HAPs na solução, devido ao aumento da solubilidade
aparente e da dessorção (Zhang et al., 1997; Cameotra; Bollag, 2003),
havendo relatos de melhorias na eficiência da biodegradação de
hidrocarbonetos pela adição de biossurfactantes. Jain et al. (1992) observaram
aumento da biodegradação do tetradecano, pristano e hexadecano num solo,
com a adição de um biossurfactante produzido por uma bactéria do gênero
Pseudomonas. Em 22 dias, as concentrações do antraceno, fenantreno e
pireno foram reduzidas em 90, 85 e 74%, respectivamente, após a adição a
este solo de um soforolipídeo, além disso outros 12 HAPs também tiveram
suas concentrações grandemente reduzidas neste ensaio (Kosaric, 2001).
2.1.2.4 Consórcios microbianos na degradação dos HAPs
Uma condição ideal de biorremediação seria a mineralização completa
dos HAPs que contaminam determinado local. Num ambiente tão complexo
como o solo, esta condição nem sempre ocorre, pois há possibilidade de
acúmulo de intermediários das rotas de metabolismo (Kazunga; Aitken, 2000).
27
Uma alternativa para aumentar a mineralização no solo de moléculas tão
complexas como os HAPs é a utilização de consórcios microbianos que
apresentem complementaridade metabólica e que podem conduzir os HAPs a
total mineralização.
Richard; Vogel (1999) estudando um consórcio bacteriano degradador
de óleo diesel no solo verificaram que dos sete membros deste consórcio,
quatro não utilizavam diretamente o óleo como fonte de carbono e energia, no
entanto a presença destes aumentava a produção de CO
2
pelo consumo de
intermediários produzidos pelos demais membros.
Há certo consenso na literatura que os fungos têm maiores
possibilidades de realizarem a oxidação inicial dos HAPs que as bactérias, isto
porque, suas hifas podem alongarem-se na direção destes compostos assim
como, suas exoenzimas podem difundir-se no solo e atingir o substrato. Já nas
bactérias, as dioxigenases são intracelulares porque requerem o NADH como
cofator e desta forma os HAPs devem ser absorvidos intracelularmente
(Johnsen et al., 2005), o que em se tratando de compostos de alta sorção no
solo, representa uma limitação à biorremediação. Assim, os intermediários
oxidados resultantes do metabolismo fúngico dos HAPs são mais
biodisponíveis à comunidade microbiana do solo que os próprios HAPs,
capacitando os fungos a serem também utilizados na biorremediação de solos
contaminados com estes compostos.
Assim como na maioria dos estudos conduzidos com fungos, Kotterman
et al. (1998) também verificaram que o Bjerkandera sp. BOS55 apresentou alta
capacidade de degradar benzo(a)pireno (73%), porém baixa capacidade de
mineralização deste HAP (8,5%). A adição do meio, com a cultura do fungo
crescida, ao solo resultou em grande aumento da produção de CO
2
, indicando
que os metabólitos produzidos pelo fungo foram rapidamente mineralizados
pela população heterotrófica do solo.
Um extensivo estudo foi conduzido por Boochan et al. (2000) visando
avaliar a degradação e a mineralização de HAPs por uma bactéria
Stenotrophomonas maltophilia, um fungo Penicillium janthinellum e pelo
consórcio resultante da inoculação conjunta destes dois microrganismos. Em
presença de benzo(a)pireno, nenhum dos microrganismos isoladamente
cresceu, porém na forma de consórcio houve crescimento de ambos e
28
degradação de 59% do HAP no meio líquido. No solo, a degradação deste
mesmo HAP pela bactéria foi menor que 20%, pelo fungo menor que 40% e
pelo consórcio maior que 80%, havendo a possibilidade de aumento desta
degradação, uma vez que, após os 100 dias esta ainda não se encontrava
estável. A mineralização do benzo(a)pireno em meio líquido foi nula quando
culturas puras da bactéria ou do fungo estavam presentes. Quando foram
inoculados conjuntamente, a mineralização do HAP foi de 25%. No solo, a
mineralização do benzo(a)pireno realizada pelo fungo foi próxima a zero, pela
bactéria foi de 20% e pelo consórcio de 40%. Assim, o consórcio incrementou
a degradação e a mineralização do HAP, tanto no meio líquido quanto no solo,
demonstrando atividades catabólicas complementares entre o fungo e a
bactéria. As análises de intermediários do metabolismo por cromatografia
líquida de alto desempenho nestes ensaios tenderam a confirmar a hipótese de
que o fungo realiza os passos iniciais da oxidação do benzo(a)pireno e libera
para o meio extracelular intermediários polares, que são convertidos em CO
2
pela bactéria (Boonchan et al., 2000).
2.1.2.5 Bioaumentação de microrganismos degradadores de HAPs
A baixa taxa de degradação de um poluente no solo pode ser resultado
do reduzido ou do inexistente número de microrganismos com habilidade de
degradação do composto (Huesemann et al., 2002). Isto é particularmente
importante quando o solo recebe um xenobiótico e não há populações
microbianas capazes de degradar eficientemente este composto. Nestes
casos, a bioaumentação é uma prática recomendada (Edgehill et al., 1999).
Há que se considerar no entanto, que as comunidades autóctones do
solo têm grande diversidade de espécies e alto grau de estabilidade, estando
amplamente adaptadas a este ambiente assim, a inoculação ao solo de
microrganismos selecionados em laboratório que apresentam alta capacidade
de degradar HAPs pode não ser garantia de sucesso da biorremediação se a
população introduzida não conseguir se estabelecer no solo. Segundo
Alexander (1999), a eficiência da biorremediação é função da extensão em que
a população microbiana degradadora pode manter-se no ecossistema natural.
29
Vários fatores são sugeridos como causa do declínio da população
inoculada no solo, entre eles, o número e o estado fisiológico dos
microrganismos inoculados, os fatores bióticos como competição e predação e
os fatores abióticos do local (van Veen et al., 1997). A competição ocorre
quando as populações usam os mesmos recursos e estes são limitados.
Normalmente, as comunidades autóctones do solo têm maior eficiência na
obtenção do substrato e na tolerância aos estresses ambientais que a
população inoculada (Atlas; Bartha, 1998). A predação é outra interação
antagonística comum no solo. Heynen et al. (1988) observaram que a redução
da população inoculada de Rhizobium leguminosarum biovar trivolli no solo
estava associado ao aumento da população dos protozoários.
Os principais fatores abióticos que determinam estresses fisiológicos na
população microbiana introduzida são pH, disponibilidade de N, P e outros
nutrientes inorgânicos, conteúdo de água, aeração, temperatura e
disponibilidade de substratos orgânicos (van Veen et al., 1997).
No caso específico dos HAPs, a disponibilidade de fonte de C e energia
pode ser o principal determinante do insucesso da inoculação. Huesemann et
al. (2002) quantificaram reduções de 3 e 4 log na população de microrganismos
degradadores, após 78 semanas do experimento, sem no entanto, ter ocorrido
a redução significativa na concentração do pireleno. Segundo estes autores a
baixa disponibilidade dos HAPs no solo pode resultar em insuficientes
quantidades de substrato para a manutenção dos microrganismos, havendo
com isso o seu declínio. A heterogeneidade de distribuição e a tendência de
sorção a fase sólida do solo podem tornar os HAPs inacessíveis principalmente
às bactérias, que são imóveis e necessitam absorver os HAPs para metabolizá-
los intracelularmente. Já os fungos superam parte desta limitação pela
produção de exoenzimas e pela extensão das hifas em direção ao substrato
(Bennet et al., 1996).
Por outro lado, a capacidade da população inoculada em degradar HAPs
representa uma vantagem competitiva em relação a população nativa do solo,
que normalmente não possui as enzimas necessárias para a utilização destes
compostos. Por isso, alguns trabalhos têm demonstrado que a bioaumentação
pode ser eficiente para aumentar a remoção dos HAPs do solo. Assim, Allard et
al. (2000) demonstraram que a inoculação de bactérias degradadoras de HAPs
30
no solo resultou na remoção de aproximadamente 50% do fenantreno do solo,
enquanto o tratamento sem inoculação, a remoção no mesmo período (40 dias)
foi de 35%. Resultados mais significativos foram obtidos por Kästner et al.
(1998), onde a inoculação de bactérias degradadoras de HAPs resultou em
incrementos de seis e de dez vezes na degradação respectivamente, do pireno
e do antraceno no solo, o que possibilitou a remediação em um tempo sete
vezes menor quando comparado ao controle não inoculado.
Em condições de campo, foi realizado o tratamento de 400 m³ de
resíduo oleoso no solo com a inoculação de bactérias degradadoras de
hidrocarbonetos. Em 16 semanas, a redução da concentração do
benzo(a)antraceno, criseno, benzo(b)fluoranteno, benzo(a)pireno,
benzo(g,h,i)pireleno e indeno(1,2,3-c,d)pireno foi reduzido em 95, 96, 86, 93,
54 e 32%, respectivamente (Edgehill et al., 1999).
Fungos degradadores de HAPs como Fusarium sp. e Conithyrium sp.
também têm sido inoculados ao solo, resultando respectivamente, em
degradações de 16 e 12% do fenantreno e de 22 e 25% do pireno presente no
solo após 30 dias da incubação (Potin et al., 2004). O Pleorotus ostreatus foi
inoculado ao solo contaminado com antraceno e pireno, sendo que após 8
semanas degradou respectivamente, 87 e 93% destes HAPs (Novotný et al.,
2004).
Sendo a baixa biodisponibilidade um dos fatores limitantes da
bioremediação dos HAPs, tem sido dada atenção a utilização de
biossurfactantes para aumentar a degradação destes compostos no solo e
desta forma, a bioaumentação pode ser realizada também com microrganismos
produtores de biossurfactantes, como demonstrado por Banat (1995), que
inoculou em um solo contaminado com hidrocarbonetos as bactérias
Pseudomonas ML2 e Acinotobacter haemoliticus, ambas reconhecidamente
produtoras de biossurfactantes, sendo que após dois meses de incubação a
redução média da concentração de hidrocarbonetos em relação ao controle foi
de 55% no solo inoculado com A. haemoliticus e de 41% para o solo inoculado
com a Pseudomonas ML2. Dean et al. (2001) verificou que a co-inoculação de
um isolado produtor de biossurfactante e um degradador de fenantreno
aumentou em aproximadamente quatro vezes a mineralização deste composto
31
no solo, quando comparado ao tratamento onde somente a bactéria
degradadora havia sido inoculada.
2.1.3 FATORES AMBIENTAIS QUE INFLUENCIAM A BIODEGRADAÇÃO DE
HAPs NO SOLO
Os HAPs são poluentes com potencial para serem transformados em
substâncias inertes através da atividade dos microrganismos do solo. No
entanto, a biodegradação pode ser dificultada se as condições ambientais não
forem favoráveis a sobrevivência e a atividade dos microrganismos
degradadores (Turco, 1999). Esta limitação pode ser superada pela
modificação de algumas condições do solo como, a disponibilidade de água, de
oxigênio, de nutrientes inorgânicos e pH.
2.1.3.1 Água
Dentre todos os fatores supra citados, o conteúdo de água no solo é
considerado por Haider (1999) como o mais crítico. Em vista da essencialidade
desta substância aos processos biológicos e pela sua elevada participação na
composição celular, uma alta atividade microbiana no solo somente poderá
ocorrer se houver adequada disponibilidade de água aos microrganismos.
Além disto, o teor de água no solo tem relação inversa com a
disponibilidade de oxigênio, uma vez que a água e o ar ocupam o mesmo
espaço poroso no solo. Assim, indiretamente, o teor de água no solo influencia
quanti-qualitativamente a atividade dos microrganismos por determinar a
composição das populações microbianas e o tipo de metabolismo (aeróbio,
microaeróbio ou anaeróbio) dominante num determinado local (Alexander,
1999).
Os solos com baixo conteúdo de água disponível reduzem o crescimento
e a sobrevivência dos microrganismos e conseqüentemente, a degradação dos
HAPs no solo. Por outro lado os solos saturados são deficientes em oxigênio,
uma vez que os macroporos estão cheios de água. Do ponto de vista prático,
nenhuma transformação metabólica de compostos petroquímicos ocorre em
32
ambiente anaeróbio. Além disso, a depleção do ar do solo estimula a
população microbiana a utilizar aceptores alternativos como o nitrato e o
sulfato, causando transformações muitas vezes indesejáveis nos compostos
inorgânicos do solo (Cheng; Mulla, 1999).
Várias pesquisas foram realizadas buscando o equilíbrio entre os
conteúdos de água e de ar que possibilitem maximizar a taxa de
biodegradação dos poluentes no solo. Segundo Atlas; Bartha (1998) e
Alexander (1999) as ótimas condições para a atividade da população
microbiana no solo ocorrem entre 50 e 70% da capacidade de campo. Porém,
num estudo de Bartha (1986) a biodegradação de hidrocarbonetos no solo foi
inibida em 66% da capacidade de campo, sendo que a maior atividade
degradativa ocorreu em 100% da capacidade de campo. Mais recentemente, a
biodegradação de hidrocarbonetos no solo em diferentes teores de umidade foi
avaliada por Atagana et al. (2003), confirmando 60-70% da capacidade de
campo como o valor que possibilitou maiores contagens da população
microbiana degradadora e onde ocorreu maior degradação dos contaminantes.
Já Haider (1999) verificou que a ótima atividade de biodegradação por
bactérias e fungos ocorreu nos potenciais de água de –0,01 a –0,05 MPa, o
que corresponde a 40 a 45% da capacidade de campo de um solo argiloso.
Abaixo de –8,0 MPa a atividade bacteriana foi zero, porém os fungos
mantiveram-se ativos até –10 MPa. Para o mesmo autor, em condições de alta
disponibilidade de substrato, os solos têm água disponível insuficiente para
suportar máxima atividade microbiana.
Assim, em vista da variabilidade das características físicas dos
diferentes solos, das diversas populações microbianas que podem atuar na
degradação e da variação dos dados observados na literatura justifica-se
determinar a umidade que possibilite maior biodegradação de HAPs nas
condições dos nossos estudos.
2.1.3.2 pH
O pH do solo afeta a atividade dos microrganismos diretamente, através
dos efeitos da concentração dos íons H
+
nas células e indiretamente, através
da influência na disponibilidade de nutrientes e de metais pesados no solo.
33
Cada organismo tem uma faixa de pH onde o crescimento é possível e
um pH ótimo bem definido. Fora desta faixa de pH, a permeabilidade celular é
bastante afetada e conseqüentemente, a atividade enzimática celular. Isto
porque, independente do pH do meio externo, o pH citoplasmático dos
microrganismos é 7,0. A manutenção deste valor, ou outro muito próximo a
este, se faz necessário pois uma mudança no estado de ionização dos grupos
químicos do sítio ativo ou a eliminação de interações iônicas alteram a
conformação ativa e a estabilidade das enzimas e, por conseqüência, reduzem
drasticamente sua atividade (Lehninger, 1995).
Já indiretamente, o pH do solo afeta a disponibilidade de elementos
essenciais a nutrição microbiana, como o fósforo e os micronutrientes. Além
disso, a redução do pH aumenta a disponibilidade do alumínio, do manganês e
dos metais pesados que podem ser tóxicos aos microrganismos. Mielniczuk
(1991) avaliou o efeito do pH 4,6 e 6,8 na mineralização do lodo oleoso no solo
durante 272 dias de incubação, encontrado aumento de 66% na produção de
C-CO
2
quando da correção do pH. Atagana et al. (2003) observaram que as
maiores contagens da população de degradadores e maior degradação dos
hidrocarbonetos no solo ocorreu nos pH 6,5 e 7,0. Normalmente, os fungos
crescem em pH mais ácidos que as bactérias, o que demanda a determinação
do pH de maior atividade do consórcio microbiano, formado por estes dois
grupos de microrganismos.
2.1.3.3 Nutrientes
Em ambientes naturais o nutriente que normalmente limita o crescimento
microbiano é o carbono, sendo que os nutrientes inorgânicos estão presentes
em quantidades que excedem as demandas das comunidades microbianas
(Alexander, 1999). A adição de HAPs ao solo com potencial de serem
utilizados como substrato para o crescimento dos microrganismos pode fazer
com que outros nutrientes que não o carbono se tornem limitantes (Atagana et
al., 2003).
O montante de nutrientes inorgânicos necessários para o metabolismo
de uma certa quantidade de HAP depende da taxa de crescimento, da
composição química celular e do coeficiente de produtividade (y = g biomassa.
34
g substrato
-1
) do microrganismo degradador (Vrede et al., 2002). Interpretando-
se esta afirmação de outra maneira pode-se concluir que a disponibilidade de
nutrientes inorgânicos irá influenciar os parâmetros fisiológicos acima citados.
Por isso, a taxa de degradação, a duração da fase de adaptação e a extensão
da degradação são afetadas pela disponibilidade de nutrientes inorgânicos
(Johnson; Scow, 1997).
O aumento do conteúdo de carbono orgânico resultante da adição de
HAPs no solo reduz em termos proporcionais o conteúdo de N, P e outros
nutrientes, que devem ser disponibilizados adequadamente visando satisfazer
os aspectos assimilatórios do processo de degradação. Adições de adubos,
principalmente nitrogenados e fosfatados, têm sido utilizados para o balanço de
nutrientes nos solos onde o processo de biodegradação de hidrocarbonetos
esteja em curso.
Uma relação C:N:P de 100:10:1 tem sido normalmente utilizada na
biodegradação de resíduos (Cheng; Mulla, 1999; Sadowsky; Turco, 1999;
Moreira; Siqueira, 2001). Esta relação foi deduzida a partir da composição
química média das células bacterianas crescendo em um meio com carbono de
fácil assimilação, que é de 50% de C, 14% de N e 3% de P da massa seca.
Disto, obtém-se uma relação C:N:P de 50:14:3, expressa em miligramas. Com
uma incorporação de 40% de C na biomassa, uma relação teórica seria de
120:14:3 em miligramas, ou 100:10:1 em molar (Leys et al., 2005). No entanto,
desde 1979, Dible; Bartha observaram que a maior atividade de biodegradação
pode ocorrer em relações distintas a esta, pois a relação C:N:P de 800:13:1 foi
a que proporcionou maior degradação de um resíduo oleoso no solo. Zhou;
Crawford (1995) obtiveram as maiores degradações da gasolina no solo com
relações C:N variando de 18:1 a 50:1. Neste mesmo trabalho a relação C:N de
1,8:1 inibiu a degradação. Atagana et al. (2003) observaram durante 6
semanas que a degradação de hidrocarbonetos foi muito baixa na relação C:N
natural do solo de 130:0,08. Nas relações C:N de 25:1, 20:1, 15:1, 10:1 e 5:1, e
C:N:P de 10:1:2 as porcentagens degradações foram próximas, com valor
médio de 55%, sendo que a relação 25:1 foi a que proporcionou maior e a
relação 5:1 a que proporcionou menor degradação, com 68,7 e 33,0%,
respectivamente.
35
Apesar do nitrogênio ser o nutriente que normalmente mais limita a
biodegradação (Liebeg; Cutright, 1999), adições de fósforo também podem
trazer benefícios. Mills; Frankenberger (1994) obtiveram aumentos de
aproximadamente 50% na mineralização do óleo diesel com a adição de 100 a
500 mg kg
-1
de fósforo no solo. A importância do fósforo neste processo
também foi demonstrado por Liebeg; Cutright (1999) que encontraram as
maiores porcentagens de mineralização de vários HAPs no solo onde o fósforo
e não o nitrogênio era o macronutriente predominantemente adicionado. Nas
nossas condições, Mielniczuk (1991) avaliou a mineralização do lodo oleoso
num solo da Unidade de Mapeamento Bom Retiro em doses de nitrogênio de 0
a 200 kg ha
-1
e não observou aumentos significativos da produção de C-CO
2
,
porém a adição de 50 ou de 100 kg ha
-1
de fósforo antecipou a mineralização
deste resíduo pela microbiota degradadora, reduzindo o período de adaptação
na fase inicial do experimento. Os efeitos da adição de N e P ao solo mostram-
se variáveis, o que indica que a relação C:N:P de 100:10:1 pode não ser a mais
indicada, o que provavelmente se deve as especificidades de cada ambiente
no que se refere a teores de nutrientes no solo, tipo de contaminante e
população microbiana envolvida (Leys et al., 2005).
Mielniczuk (1991) avaliou os efeitos do nitrogênio, do fósforo, do pH, da
quantidade de glicose e de lodo oleoso adicionado ao solo na mineralização
deste resíduo petroquímico, obtendo em condições otimizadas menos de 8%
ano
-1
de mineralização e concluiu que outros fatores provavelmente sejam mais
limitantes à biodegradação de hidrocarbonetos que os acima avaliados.
Um dos fatores ambientais que poderia influenciar a degradação dos
HAP no solo é a disponibilidade do ferro. Isto porque, este elemento
desempenha funções celulares essenciais que estão intimamente relacionadas
ao metabolismo dos HAPs, como a participação na estrutura das enzimas do
sistema multicomponente das dioxigenases (periféricas) e participação como
cofator enzimático nas enzimas de fissão (Harayama, 1999). Além disso, o
ferro desempenha outras importantes funções no metabolismo microbiano,
como protetor da célula contra radicais superóxidos, como componente dos
citocromos, como cofator ou participante da estrutura de outras enzimas,
incluindo algumas do ciclo dos ácidos tricarboxílicos (Wei et al., 2003).
36
O ferro ocorre nos minerais primários do solo como silicatos
ferromagnesianos, na forma de ferro reduzido (Fe
+2
). O intemperismo destes
minerais libera o ferro que, é oxidado e precipitado na forma de óxidos,
hidróxidos e oxihidróxidos de Fe
+3
. Como resultado do processo de
intemperismo e de formação do solo, verifica-se a predominância e o aumento
da concentração de óxidos de ferro no solo, tais como hematita, goethita,
leptocrocita e magnetita (Chesworth, 1991).
A possível limitação de ferro aos microrganismos pode ocorrer porque
apesar deste elemento ser um dos metais mais abundantes na Terra, os óxidos
de ferro apresentam baixa solubilidade em ambientes aeróbios, sendo que a
concentração deste elemento na solução do solo pode ser menor que 10
-18
M
(Andrews et al., 2003). Sob estas condições, o ferro do solo pode não atender
a demanda dos microrganismos degradadores de HAPs, sendo que o
suprimento de fontes mais solúveis e em concentrações mais adequadas
poderia aumentar a taxa de degradação no ambiente.
Dinkla et al. (2001) verificaram que o aumento da disponibilidade do ferro
no meio mineral aumentou a degradação do tolueno. Este estímulo
provavelmente se deve a que as enzimas envolvidas na degradação dos
compostos aromáticos apresentam o ferro como importante componente
estrutural e/ou como cofator. Por isso, os mesmos autores verificaram que
houve um aumento da demanda por ferro no momento da expressão dos
genes que codificam estas enzimas. Em outro estudo o suprimento de ferro em
quantidades adequadas aumentou significativamente a atividade das seguintes
enzimas de degradação do tolueno: tolueno monooxigenase (56%), benzoato
1,2 dioxigenase (82%), catecol 2,3 dioxigenase (97%) e 2-hidroximucônico
semialdeído hidrolase (77%) (Dinkla; Janssen, 2003).
Pesquisas realizadas em nosso laboratório demonstraram que a adição
de fontes solúveis de ferro ao meio de cultura (0,1 mM de Fe(NO
3
)
3
) aumentou
o crescimento dos três isolados de Pseudomonas que utilizavam
separadamente vários hidrocarbonetos, além de aumentar em 13% na média, a
degradação do antraceno e de estimular a produção de biossurfactantes em
um destes isolados. O efeito do ferro na degradação do antraceno no solo foi
também avaliado, observando-se que a adição de 50 g kg
-1
de Fe
2
O
3
resultou
em pequenos aumentos da mineralização do HAP (Santos, 2004).
37
O enxofre é outro elemento que está envolvido no metabolismo
microbiano dos HAPs, isto porque é parte integrante do sistema
multicomponente das dioxigenases, na forma de complexos ferro-enxofre. Além
disso, este elemento participa de outras enzimas microbianas (não-heme), faz
parte da coenzima A, estabiliza a estrutura terciária das proteínas, através das
pontes de bissulfito, sendo essencial para síntese protéica por fazer parte dos
aminoácidos cisteína, metionina e homocisteína.
No solo, o enxofre encontra-se quase que totalmente associado à
biomassa viva ou morta e desta forma, pode não estar prontamente disponível
ou não ser quantitativamente suficiente para suportar uma alta demanda pela
população degradadora do solo, quando da adição de HAPs ao solo. Liebeg;
Cutright (1999) avaliaram o efeito da adição de diferentes nutrientes na
mineralização dos HAPs presentes num solo contaminado e observaram que o
maior consumo de O
2
ocorreu quando o enxofre havia sido adicionado em
maiores quantidades em relação aos demais nutrientes, inclusive nitrogênio e
fósforo.
2.1.4 BIODISPONIBILIDADE DOS HAPs NO SOLO
A presença de populações microbianas aptas a utilizar HAPs e de
fatores abióticos adequados a sobrevivência e a atividade desta população
pode não garantir a redução da concentração dos poluentes aos níveis
exigidos pela legislação ambiental (Huesemann et al., 2002). Pesquisa
realizada nas nossas condições demonstrou que a porcentagem dos resíduos
petroquímicos que é efetivamente mineralizada pela população microbiana
após 200 dias de incubação do solo em condições ambientais otimizadas no
laboratório não ultrapassou 6% (Mielniczuk, 1991). A baixa porcentagem de
mineralização pode ser conseqüência da limitação de substrato às populações
microbianas, devido a sorção dos HAPs à fase sólida do solo (Karimi-Lotfabad
et al., 1996).
O termo sorção é definido como o processo em que compostos químicos
tornam-se associados a fase sólida. Este processo afeta dramaticamente o
destino dos compostos adicionados ao solo. Assim, se um composto encontra-
38
se dissolvido na solução do solo apresenta maiores possibilidades de sofrer
processos como fotooxidação, volatilização, biodegradação, transporte,
interação intermolecular, etc, do que se estiver associado à fase sólida, o que
de certa forma, representa uma proteção contra estes processos.
A forte tendência de sorção dos HAPs à fase sólida do solo deve-se a
sua baixa solubilidade em água. Para a permanência de um composto apolar
na fase líquida do solo, é necessário que as moléculas de água rompam as
pontes de H que estão estabelecidas com outras moléculas de água. Como
esta reorganização tem um custo energético muito elevado, o composto apolar
é forçado a deslocar-se na direção dos locais de maior hidrofobicidade,
representados no solo pela matéria orgânica (MO) e pela superfície dos
minerais (Schwarzenbach et al., 1993).
2.1.4.1 Sorção dos HAPs na matéria orgânica
A MO é a principal matriz hidrofóbica do solo. Isto porque ela é
constituída principalmente de átomos de C e de H. Conforme o modelo
proposto por Schnitzer; Khan (1978) citado por Camargo et al. (1999), a
composição média de uma unidade de ácido húmico e fúlvico, em termos de
fórmula química é, respectivamente, C
187
H
186
O
89
N
9
S e C
135
H
182
O
95
N
5
S
2
. Isto
faz com que as pontes de H estejam limitadas a determinados locais de sua
estrutura, além disso, por se encontrar em um meio hidrofílico que é o solo, as
moléculas de MO tendem a exporem suas superfícies carregadas para o
exterior e formar espaços hidrofóbicos em seu interior, nos quais os compostos
apolares podem penetrar e dissolver-se num meio não-aquoso
(Schwarzenbach et al., 1993). Como este processo não está limitado a
interface, pode ser referido como uma absorção. Assim, o sorbato (composto
apolar) está distribuído entre duas soluções - água e MO (sorbente), sendo que
a razão de equilíbrio entre as fases pode ser definida pelo K
d
:
w
s
d
C
C
K =
, (1)
onde C
s
é a concentração total do sorbato associada ao sorbente (mol kg
-1
) e
C
w
é a concentração total do sorbato na solução (mol L
-1
).
39
O C
s
pode ser definido como:
omoms
fxCC
=
, (2)
onde C
om
é a concentração do sorbato associado com a MO (mol kg
-1
de MO)
e f
om
é a fração do solo que é MO (kg de MO kg
-1
de solo).
Além do teor, as características específicas da MO de um determinado
solo também podem ser importantes na sorção de HAPs. Esta particularidade
pode ser avaliada pelo coeficiente de partição K
om
:
w
om
om
C
C
K =
, (3)
substituindo esta última equação no K
d
, temos:
omomd
fxKK
=
(4)
Então, a razão de equilíbrio de um composto apolar entre a fase sólida e
a fase líquida do solo (K
d
) depende tanto das propriedades deste solo no que
diz respeito ao seu conteúdo de MO (f
om
), quanto das características
intrínsecas da MO presente neste solo (K
om
) (Schwarzenbach et al., 1993).
No que diz respeito ao K
om
, Lueking et al. (2000) identificaram dois
modelos que poderiam determinar diferentes capacidades de sorção de HAPs.
A MO oriunda de um húmus do Estado de Michigan (EUA) apresentou
capacidade de sorção do fenantreno 2,5 vezes menor que um xisto oriundo do
Canadá. Segundo estes autores, os solos que sofreram significantes alterações
diagenéticas (conjunto de fenômenos físicos e químicos que atuam sobre os
sedimentos após sua deposição, como por exemplo, compactação,
cimentação, etc.) apresentam MO dominada por moléculas fisicamente
condensadas e quimicamente reduzidas. Estes solos exibem sorção dos HAPs
não linear, lenta e somente parcialmente reversível, o que resulta em elevada
capacidade de sorção quando o conteúdo de C orgânico é normalizado. Por
outro lado, solos que sofreram pouca ou nenhuma alteração diagenética
apresentam MO dominada por moléculas fisicamente mais amorfas e
quimicamente mais oxidadas. Estes solos exibem sorção próximo a linear,
rápida e reversível, além de apresentarem menor capacidade de sorção dos
HAPs quando o conteúdo de C orgânico é normalizado.
Desconsiderando-se os casos em que ocorrem alterações diagenéticas,
tem-se observado que a MO dos solos agrícolas apresenta valores de K
om
muito semelhantes para um mesmo composto químico. Assim, Schwarzenbach
40
et al. (1993) determinaram o K
om
do pireno em 14 solos e verificaram que os
valores foram muito próximos. Resultados semelhantes também foram obtidos
pelos mesmos autores para o diclorobenzeno e para o dibenzotiofeno. Destes
estudos depreende-se que o conteúdo de MO é a característica que mais
influencia na partição do HAP entre a fase sólida e líquida do solo. Vários
autores demonstraram relações lineares positivas entre o conteúdo de C
orgânico do solo e a capacidade de sorção de HAPs (Carmichael et al., 1997;
Totsche et al., 1997; Cornelissen et al., 1998; Nam et al., 1998; Lueking et al.,
2000).
2.1.4.2 Sorção dos HAPs nos minerais
As superfícies do tipo M-OH, presentes nos minerais sem cargas, não
formam pontes de H com a água e são hidrofóbicas, sendo que nelas pode
ocorrer a sorção de compostos apolares (Laird; Sawhney, 2002). Saada et al.
(1995) demonstraram que 75% da superfície da caulinita é hidrofóbica, o que
resultou em sorção de hidrocarbonetos duas vezes maior que a ilita, que
apresenta 60% da sua superfície hidrofóbica. Murphy et al. (1990) procederam
a eliminação da MO associada a caulinita e a hematita do solo e observaram
que a caulinita apresentou capacidade de sorção do antraceno três vezes
maior que a hematita, o que segundo os autores deveu-se a maior
hidrofobicidade da sua superfície.
Este tipo de sorção assume maior importância nos solos com conteúdos
de MO iguais ou menores que 4 g kg
-1
, onde as superfícies hidrofóbicas estão
pouco ou nada cobertas pela MO. Já em solos com conteúdos de MO mais
elevados, a principal matriz hidrofóbica do solo é a MO, que apresenta
capacidade de sorção de hidrocarbonetos muitas vezes maior que aquela
apresentada pelas superfícies minerais (Murphy et al., 1990).
2.1.4.3 Sorção dos HAPs no solo
A composição da fase sólida do solo determina a sua capacidade de
sorção de HAPs. Assim, é de se esperar que solos com diferentes conteúdos
de MO e composições mineralógicas apresentem diferentes capacidades de
sorção e de disponibilização estes compostos aos microrganismos
41
degradadores do solo. Neste contexto, Nam et al. (1998) avaliaram a
mineralização do antraceno em seis solos com diferentes conteúdos de C
orgânico, demonstrando que houve maior sorção deste HAP e
conseqüentemente menor mineralização, nos solos com conteúdo de carbono
orgânico maior que 20 g kg
-1
. A dessorção e a mineralização do fenantreno em
dois solos foram correlacionadas por Carmichael et al. (1997). Os autores
observaram que no solo com maior conteúdo de C orgânico, a dessorção do
fenantreno foi menor, o que resultou em menor taxa de mineralização deste
composto.
Apesar de teoricamente contraditória, em alguns trabalhos o conteúdo
de C orgânico não tem apresentado relação com a sorção ou mineralização
dos HAPs no solo. Karimi-Lotfabad et al (1996) avaliaram a sorção do
antraceno em três solos e observaram que nos menores conteúdos de C
orgânico houveram as maiores sorções deste HAP. Num trabalho com 16
solos, Chung; Alexander (1998) não observaram relação entre a sorção ou a
mineralização do fenantreno e alguma das características destes solos, porém
quando o conteúdo de C orgânico era maior do que 10 g kg
-1
havia maior
sorção e menor mineralização do fenantreno. Estes resultados indicam que a
sorção dos HAPs no solo é uma característica de fundamental importância por
influenciar a biodisponibilidade destes compostos a microbiota degradadora e
conseqüentemente, o sucesso da biorremediação.
42
2.2 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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CAPÍTULO II
ISOLAMENTO E IDENTIFICAÇÃO DE MICRORGANISMOS DO SOLO
DEGRADADORES DE HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS
54
3.1 RESUMO
O antraceno, o fenantreno e o pireno são hidrocarbonetos aromáticos
policíclicos (HAPs) com propriedades mutagênicas e carcinogênicas, que
podem contaminar o solo, uma vez que devido a complexidade estrutural de
suas moléculas e a baixa solubilidade em água, não são degradados pela
maioria dos microrganismos do solo. A biorremediação é uma estratégia para
eliminação dos HAPs do ambiente, onde os microrganismos selecionados irão
transformá-los em substâncias inertes, CO
2
e água. O objetivo deste estudo foi
isolar, identificar e caracterizar microrganismos degradadores de antraceno,
fenantreno e pireno, visando sua utilização na biorremediação de HAPs no
solo. Um grama de cada uma das 6 amostras de solo coletadas em uma área
de landfarming foi adicionado a frascos respirométricos contendo solo
contaminado em laboratório com 250 mg kg
-1
de antraceno. Após 176 dias, o
solo com maior produção de C-CO
2
foi utilizado no enriquecimento dos
microrganismos degradadores de antraceno no meio mineral. Os
microrganismos foram isolados após 3 transferências com intervalos semanais
e identificados pelo seqüenciamento do gene do RNAr. A capacidade de
degradar os 3 HAPs em meio mineral foi avaliado por cromatografia gasosa e a
versatilidade metabólica dos microrganismos foi avaliada através do
crescimento em 18 fontes de C. Do solo do landfarming isolou-se um consórcio
microbiano composto por 6 bactérias, identificadas como Mycobacterium
fortuitum, Bacillus cereus, Microbacterium sp., Gordonia polyisoprenivorans,
Microbacteriaceae bacterium e Naphthalene-utilizing bacterium, e um fungo,
Fusarium oxysporum. O consórcio microbiano degradou respectivamente 48,
67 e 22% do antraceno, fenantreno e pireno do meio mineral após 30 dias de
incubação e cresceu na presença de todas as fontes de C avaliadas. Este
consórcio microbiano apresenta potencial para ser utilizado na biorremediação
de solos contaminados com HAPs.
55
3.2 INTRODUÇÃO
Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) são compostos
químicos constituídos unicamente de átomos de carbono e hidrogênio,
arranjados na forma de dois ou mais anéis aromáticos. Devido a possibilidade
da fusão de um número variável de anéis e das várias posições em que estes
anéis podem se ligar entre si há atualmente mais de 100 HAPs reconhecidos
pela IUPAC (International Union of Pure and Applied Chemistry). Os HAPs são
lipossolúveis na membrana e prontamente absorvidos no intestino dos
mamíferos via inalação, exposição oral e dermal, com posterior acúmulo no
tecido adiposo. O metabolismo dos HAPs no organismo humano gera
compostos epóxidos com propriedades carcinogênicas e mutagênicas, tendo
sido relatados inúmeros casos de câncer no pulmão, intestino, fígado, pâncreas
e na pele, devido a presença destes compostos (Netto et al., 2000).
Os HAPs são gerados natural ou antropogenicamente durante a
combustão incompleta de substâncias orgânicas como o carvão mineral, óleo
cru, gás, madeira, lixo e outros. Os resíduos gerados pelas refinarias e
indústrias petroquímicas também apresentam em sua composição uma grande
variedade de HAPs, entre os quais, o antraceno, o fenantreno e o pireno. A
liberação indiscriminada destes resíduos no ambiente pode provocar
contaminação dos recursos naturais, uma vez que, devido a complexidade
estrutural e a baixíssima solubilidade em água, os HAPs não são degradados
pela maioria dos microrganismos do solo, o que aumenta sua permanência no
ambiente e a possibilidade de exposição de humanos e animais a estes
compostos.
Uma estratégia para eliminação dos HAPs dos ambientes contaminados
é através da biorremediação onde os microrganismos que apresentam
capacidade de metabolizar estes compostos irão transformá-los em
56
substâncias inertes, CO
2
e água. Alguns resultados entretanto, têm
demonstrado que a biorremediação pode tornar-se excessivamente lenta e não
reduzir a concentração de poluentes aos níveis exigidos pela legislação
ambiental (Huesemann et al., 2002; Johnsen et al., 2005). Entre os vários
fatores responsáveis por estes insucessos, pode-se destacar a inabilidade dos
microrganismos em degradar os HAPs, a baixa biodisponibilidade e a limitação
de nutrientes a microbiota degradadora (Boopathy, 2000).
Desde a década de 50, vários trabalhos buscaram selecionar
microrganismos em culturas puras com capacidade de degradar HAPs, sendo
isoladas bactérias pertencentes principalmente aos gêneros Pseudomonas,
Aeromonas, Beijerinckia, Flavobacterium, Nocardia, Corynebacterium,
Sphingomonas, Mycobacterium, Stenotrophomonas, Paracoccus, Burkholderia,
entre outros (Cerniglia, 1984; Zhang et al., 2004), e vários fungos dos gêneros
Cunnighamella, Phanerochaete, Cândida, Penicillium, Pleorotus, Trametes,
Aspergillus, Bjerkandera e Chrysosporium, e outros (Cerniglia, 1997). Somente
nos últimos anos tem sido dada atenção ao isolamento de consórcios
microbianos degradadores de HAPs, que comparativamente às culturas puras,
tem se mostrado mais efetivos na degradação destes compostos, devido a
capacidade de utilizar um maior número de HAPs como fonte de C, pela maior
taxa de degradação e principalmente pela maior mineralização destes
compostos, o que aumenta a possibilidade de um processo de biorremediação
mais efetivo onde os contaminantes têm maiores chances de serem
completamente eliminados do ambiente (Boonchan et al., 2000; Ghazalli et al.,
2004).
A biodisponibilidade de um composto no ambiente é determinada pela
taxa de transferência de massa do substrato às células microbianas em relação
a atividade catabólica intrínseca (Johnsen et al., 2005). Os microrganismos
degradadores podem aumentar a biodisponibilidade de HAPs pela excreção de
biossurfactantes, que são moléculas que apresentam uma porção hidrofóbica e
outra hidrofílica. Estas moléculas reduzem a tensão superficial e interfacial do
meio de crescimento, além de exibirem emulsificação de compostos
hidrofóbicos e formarem emulsões estáveis, aumentando a solubilidade dos
HAPs e conseqüentemente sua disponibilidade no ambiente (Cameotra; Bollag,
2003). O objetivo deste estudo foi isolar, caracterizar e identificar um consórcio
57
microbiano degradador de antraceno, fenantreno e pireno, visando a seleção
de microrganismos para serem utilizados na biorremediação de solos
contaminados com HAPs.
58
3.3 MATERIAL E MÉTODOS
3.3.1 Coleta de solo
As amostras de solo utilizadas para o isolamento de microrganismos
degradadores de HAPs foram coletadas no landfarming do SICECORS
(Sistema Centralizado de Controle de Resíduos Sólidos do Pólo Petroquímico
do Sul), onde desde 1989 é tratado o lodo oleoso produzido pelas indústrias
deste Pólo, localizado em Triunfo/RS, e mais recentemente os resíduos
petroquímicos gerados pela Refinaria Alberto Pasqualini, localizada em
Canoas/RS. Este landfarming é dividido em 12 células, que são áreas de 30 m
x 100 m onde os resíduos são adicionados. Selecionaram-se 3 células que
haviam recebido resíduos mais recentemente e coletou-se as amostras de solo
na profundidade de 0 a 30 cm, em 2 locais escolhidos aleatoriamente no
interior de cada célula, resultando em seis amostras, que foram trazidas para o
Laboratório de Biorremediação de Solos do Departamento de Solos/UFRGS
em caixas de isopor e armazenadas a 4°C.
3.3.2 Seleção da amostra de solo
Em vista da ausência de informações prévias sobre a atividade dos
microrganismos heterotróficos nas células do landfarming e como forma de
aumentar a possibilidade de obtenção de microrganismos degradadores de
HAPs optou-se por selecionar, através de um experimento respirométrico, entre
as 6 amostras de solo a que apresentasse a maior atividade de mineralização
dos HAPs, para ser utilizada nos experimentos posteriores. Um Argissolo
Vermelho-Amarelo distrófico arênico da Unidade de Mapeamento Itapoã foi
coletado em uma área agrícola sem histórico de recebimento de nenhum tipo
59
de resíduo. A análise química deste solo realizada no Laboratório de
Análises/UFRGS é apresentada na Tabela 1. Este solo foi trazido para o
laboratório, seco e peneirado em malha de 2 mm. Para elevar o pH a 6,5
adicionou-se CaCO
3
e MgCO
3
na proporção 3:1, na forma de reagente
comercial, incubando-se o solo úmido por 60 dias. Posteriormente, este solo foi
contaminado em laboratório com 250 mg kg
-1
de antraceno. Para isto,
preparou-se uma solução concentrada de antraceno dissolvido em acetona,
sendo que 3 mL foram adicionados a 50 g de solo no interior de frascos
respirométricos de 1,5 L. Estes frascos foram colocados em estufa por 3 horas
a 50°C para evaporação da acetona. Após adicionou-se mais 49 g de solo,
procedendo-se uma intensa mistura. Devido a baixa fertilidade natural,
adicionou-se o equivalente a 100 kg ha
-1
de N e 50 kg ha
-1
de P, na forma de
solução de NH
4
NO
3
e KH
2
PO
4
.
TABELA 1. Análise química do solo Itapoã.
Atributo Valores Interpretação
1
Argila (g kg
-1
) 90,0 Classe 4
pH (H
2
O) 4,7 Muito baixo
Índice SMP 6,9 -
P (mg dm
-3
) 4,1 Muito baixo
K (mg dm
-3
) 20,0 Baixo
MO (g kg
-1
) 9,0 Baixo
Al trocável (cmol
c
dm
-3
) 0,2 -
Ca trocável (cmol
c
dm
-3
) 0,4 Baixo
Mg trocável (cmol
c
dm
-3
) 0,2 Baixo
S (mg dm
-3
) 3,4 Médio
Fe (g dm
-3
) 0,2 -
Al+H (cmol
c
dm
-3
) 1,6 -
CTC
PH 7,0
(cmol
c
dm
-3
) 2,2 Baixo
Saturação de bases (%) 29,0 Muito baixo
Saturação de Al (%) 8,9 Baixo
1
Conforme Comissão... (2004).
60
Após o solo estar corrigido, contaminado com antraceno e fertilizado, em
cada frasco respirométrico adicionou-se 1,0 g de uma das amostras de solo do
landfarming, visando inocular uma população de microrganismos degradadores
de HAPs. O tratamento controle não recebeu solo do landfarming, sendo
utilizado nos frascos respirométricos 100 g de solo Itapoã. Os frascos foram
equipados com aparato de captura de CO
2
, composto por um copo plástico de
50 mL com 20 mL de NaOH 0,25 M, fechados hermeticamente e incubados em
duplicata, a temperatura ambiente no laboratório. Durante um período de 176
dias, semanalmente os frascos eram abertos, a solução de NaOH recebia um
mL de BaCl
2
1 M e era titulada com HCl 0,5 M, utilizando fenolftaleína como
indicador. A solução do HCl 0,5 M foi padronizada com tris, conforme Tedesco
et al. (1995). Uma amostra com umidade igual ao solo dos frascos
respirométricos foi utilizada para determinação da umidade gravimétrica, sendo
a produção de C-CO
2
expressa em mg por kg de solo seco.
A produção de C-CO
2
foi quantificada através da fórmula de Stotzky
(1965):
C-CO
2
(mg kg
-1
de solo) = (B-T) x eq x M x 10
onde B é o volume (em mL) da solução de HCl gasto para titular a prova em
branco (frasco respirométrico sem solo); T é o volume (em mL) da solução de
HCl gasto para titular os tratamentos; eq é o equivalente-grama do C, que é 6;
M é a molaridade da solução padronizada de HCl e 10 é o fator de conversão
para kilograma de solo.
3.3.3 Enriquecimento dos microrganismos degradadores de HAPs
Do frasco com maior produção de C-CO
2
foi retirado um grama de solo e
adicionado em um frasco de erlenmeyer de 125 mL contendo 50 mL de meio
mineral Tanner e 250 mg L
-1
de antraceno como única fonte de C e energia.
Todos os ensaios utilizaram o meio mineral Tanner com a seguinte
composição, em g L
-1
: CaCl
2
2H
2
O, 0,04; KH
2
PO
4
, 0,1; NaCl, 0,8; NH
4
Cl, 1,0;
MgSO
4
7H
2
O, 0,2 e KCl, 0,1. Os micronutrientes foram adicionados na
concentração, em mg L
-1
: CoCl
2
6H
2
O, 0,1; MnCl
2
4H
2
O, 0,425; ZnCl
2
, 0,05;
CuSO
4
5H
2
O, 0,015; NiCl
2
6H
2
O, 0,01; Na
2
MoO
4
2H
2
O, 0,01; Na
2
SeO
4
, 0,01 e
Fe(NO
3
)
3
, 12,1, conforme modificação de Santos (2004). O meio foi ajustado
61
para pH 7,0, adicionado de antraceno e autoclavado a 121°C por 20 minutos.
Os frascos com o meio mais o solo foram incubados a 150 rpm e 30°C. A cada
7 dias, uma alíquota de 1 mL da cultura crescida era transferida para outro
frasco contendo o mesmo meio estéril e incubado nas mesmas condições.
3.3.4 Isolamento, purificação e armazenamento dos microrganismos
degradadores de HAPs
Após 3 transferências, a cultura crescida foi diluída em solução salina
(NaCl 0,85%) e plaqueada em meio ágar nutritivo (extrato de carne 3 g,
peptona 5 g, ágar 15 g, água destilada 1 L, pH 7,0) contendo 250 mg L
-1
de
antraceno, sendo as placas incubadas por 72 horas a 30°C. As colônias de
bactérias crescidas nas placas que apresentaram diferenças visuais tais como:
aspecto, tamanho, coloração, forma e borda da colônia, foram estriadas no
mesmo meio até purificação dos isolados e armazenadas sob refrigeração a
4°C. A colônia de fungo foi repicada até purificação em meio ágar malte
(extrato de malte 30 g, peptona 5 g, ágar 15 g, água destilada 1 L, pH 5,4)
contendo 250 mg L
-1
de antraceno e armazenada no mesmo meio, sob
refrigeração a 4°C. Deste procedimento isolou-se um consórcio microbiano
composto por 6 bactérias e um fungo.
3.3.5 Concentração do carbono no meio mineral
Em vista de que em vários ensaios posteriores seria utilizado o meio
mineral Tanner, realizou-se a quantificação da concentração de C orgânico
dissolvido presente neste meio, como forma de se evitar que outras fontes de
C, que não os HAPs, pudessem ser adicionadas por algum dos reagentes
inorgânicos. Assim, utilizou-se o Analisador de Carbono Orgânico Total (TOC-V
CSH, Shimadzu, Japão) para determinar a concentração de C orgânico
dissolvido na água destilada (controle negativo), no meio mineral, no meio
mineral mais 250 mg L
-1
de antraceno e no meio mineral mais 590 mg L
-1
de
glicose (controle positivo), que equivale a mesma quantidade de C adicionada
pelo antraceno (236 mg L
-1
de C).
62
Conforme dados da literatura, são muito variáveis as concentrações de
HAPs no meio mineral utilizadas por outros autores. Assim, para determinar a
concentração que seria utilizada nos ensaios realizou-se um teste onde o
consórcio microbiano foi inoculado em frascos de erlenmeyer contendo 100 mL
de meio mineral e as concentrações de antraceno de 0; 31,25; 62,5; 125; 250 e
500 mg L
-1
. Nestes meios, foram adicionados ainda 50 mg L
-1
de TTC (cloreto
de trifeniltetrazólio). Os frascos foram incubados em duplicata a 150 rpm e
30°C e, após 30 dias, a redução do TTC a TPF (trifenil formazan) foi avaliada
visualmente, como indicativo da atividade metabólica dos microrganismos em
cada uma das concentrações (Alef, 1995).
3.3.6 Curvas de crescimento e pH no meio mineral
O crescimento dos isolados bacterianos e do fungo no meio mineral
contendo 250 mg L
-1
de antraceno foi avaliado durante 36 dias. Para isto,
inoculou-se o consórcio microbiano em frascos contendo 100 mL de meio
mineral mais 250 mg L
-1
de antraceno, que foram incubados em duplicata a
150 rpm e 30°C. Neste período eram realizadas contagens do número de
unidades formadoras de colônia (UFC) mediante diluição das culturas
crescidas em solução salina e plaqueamento em meio ágar nutritivo e ágar
malte, sendo as placas incubadas por 72 horas a 30°C para posterior
contagem. Semanalmente também era medido o pH do meio mineral com a
cultura em crescimento.
3.3.7 Identificação do consórcio microbiano
Para a caracterização inicial dos isolados bacterianos a morfologia
celular foi avaliada por coloração de Gram. Para identificação realizou-se o
seqüenciamento do gene do rRNA 16S, conforme descrito por Camargo et al
(2003). As bactérias foram crescidas em meio caldo nutriente, sendo as células
coletadas por centrifugação a 10000 rpm por 5 minutos. O DNA foi extraído de
acordo com o método de Asubel et al. (1997). As células foram suspensas em
numa solução tampão TE, SDS (10%) e proteinase K, e incubadas por uma
hora a 37°C. Uma mistura de NaCl (5 M) e CTAB/NaCl (4,1 g de NaCl e 10 g
63
de brometo de N-cetil-N.N.N.-trimetilamônio) em 100 mL de água destilada pré-
aquecida) foi adicionada, incubando-se por 10 minutos a 65°C. A solução foi
extraída com 780 µL de clorofórmio/álcool isoamílico (24/1), centrifugada por 5
minutos, sendo a fase aquosa novamente extraída com igual volume de
fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25/24/1). Após centrifugação de 5 minutos,
o DNA presente na fase aquosa foi precipitado com 0,6 volume de isopropanol
e o precipitado foi lavado com etanol 70%. O pellet de DNA foi seco usando um
concentrador e ressuspendido em água livre de nuclease. Primers universais
bacterianos correspondendo as posições 27F (5’-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) e 519R (5’-GTATTACCGCGGCTGCTG-3’)
da E.coli foram usadas para amplificação do gene do rRNA 16S por PCR. A
mistura de PCR (Cat. Nº M7502, Promega, Madison, Wisconsin) foi usada de
acordo com instruções do fabricante. O DNA foi amplificado usando PCR com
35 ciclos (desnaturação inicial de 95°C por 3 minutos, demais desnaturações
de 95°C por um minuto, anelamento a 55°C por um minuto, extensão a 72°C
por um minuto e extensão final a 72°C por 5 minutos). Os amplicons foram
analisados em gel de agarose 2% e purificados usando o kit de extração de gel
QIAEX II (QIAGEN, Valência, Califórnia), de acordo com instruções do
fabricante. Brevemente, um pedaço do gel foi suspenso em tampão QXI, foi
adicionado a suspensão QIAEX II, seguido de mistura em vortex. A suspensão
foi incubada a 50°C por 10 minutos, centrifugada por 30 segundos e o pellet foi
lavado duas vezes com tampão QXI e uma vez com tampão PE. Após
secagem ao ar por 15 minutos, o DNA foi eludido com água livre de nuclease.
O seqüenciamento do DNA foi realizado usando um kit terminador BigDye
(Applied Biosystems, Foster City, Califórnia) e um analisador genético Applied
Biosystems ABI 3100. O DNA do fungo foi extraído conforme Schabereiter-
Gurtner et al (2001). A região do gene do RNAr ITS1-5,8S-ITS2 foi amplificada,
utilizando os primers ITS1 (5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3') e ITS4 (5'-
TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'). Os amplicons foram purificados e
submetidos diretamente ao seqüenciador automático MegaBACE 1000
(Amersham Biosciences, Piscataway, New Jersey). A homologia das
seqüências bacterianas e fúngicas foi obtida através do MEGABLAST (Altschul
et al., 1997).
64
3.3.8 Degradação de HAPs em meio mineral
A capacidade do consórcio microbiano em degradar HAPs foi avaliada
através de cromatografia gasosa. Para isto, este consórcio foi inoculado em 50
mL de meio mineral, mais 250 mg L
-1
de antraceno ou de fenantreno ou de
pireno e incubados com três repetições a 30°C por 30 dias. Ao final do período,
cada frasco contendo a cultura crescida foi acidificado a pH 2,0, seguindo-se
de três extrações com 20 mL de diclorometano (EM Science, pureza>99,8%),
em funil de separação. Para retirar o excesso de água após as extrações,
utilizou-se sulfato de sódio anidro (Shuttleworth; Cerniglia, 1996). O material
extraído foi quantificado em um cromatógrafo gasoso (Agilent, Palo Alto,
Califórnia - modelo 6890) com detector seletivo de massa (modelo 5973),
equipado com coluna capilar DB5 (5% fenil metil polisiloxano - 30 m x 0,25 mm
x 0,25 mm). O injetor e a linha de transferência operaram a 290°C. O programa
de temperatura do forno foi: 40°C por um minuto, seguido de aumento de 6°C
por minuto até 220°C, mantendo isotérmica por um minuto e aquecimento de
15°C min
-1
até 300°C. Um alíquota de 0,2 µL foi injetado com uma razão de
split de 1:50. O detector seletivo de massa operou em modo scan.
3.3.9 Detecção da produção de biossurfactantes
A detecção da produção de biossurfactantes pelo fungo em separado ou
pelo consórcio foi realizada pela medida do índice de emulsificação e da tensão
superficial no meio de cultura. Para isto o consórcio foi inoculado em 50 mL de
meio mineral mais 250 mg L
-1
de antraceno e incubado com duas repetições a
30°C por 30 dias. Semanalmente coletava-se amostras do meio de cultura para
as duas avaliações. A tensão superficial foi avaliada na ausência de células
microbianas, removidas através de centrifugação de 10.000 rpm por 10 minutos
a 4°C. A avaliação do índice de emulsificação foi realizado na ausência e na
presença das células microbianas. Para isto, 2 mL do meio de cultura foram
misturados a 2 mL de óleo diesel em um tubo de ensaio com fundo chato (100
mm x 15 mm), sendo a mistura agitada em vortex por dois minutos e os frascos
deixados em repouso por 24 horas, procedendo-se então a avaliação do
volume emulsificado de óleo diesel. O índice de emulsificação é obtido pela
65
medição da coluna emulsificada de óleo diesel dividido pela altura total e
multiplicado por 100. As medidas de tensão superficial foram realizadas após
permanência das amostras por uma hora a 25°C, em um tensiômetro digital
(Gibertini, Milão, Itália), utilizando o método da placa de Wilhelmy e como
referências para a calibração do aparelho água destilada (69 mN m
-1
) e etanol
(24 mN m
-1
).
3.3.10 Crescimento dos isolados em outros hidrocarbonetos
O consórcio microbiano bem como seus membros de forma individual
foram avaliados quanto a capacidade de crescimento em HAPs (pireno,
antraceno, fenantreno e naftaleno), em hidrocarbonetos monoaromáticos
(benzeno, etil-benzeno, tolueno e xileno), em hidrocarbonetos alifáticos (1-
deceno, 1-octeno e hexano), em misturas de hidrocarbonetos (gasolina e óleo
diesel), em intermediários do metabolismo dos HAPs (catecol, ácido gentíssico,
ácido salicílico e ácido dihidroxibenzóico) e no etanol. Todos os substratos
foram adicionados ao meio mineral de modo a fornecerem a mesma
quantidade de C (236 mg L
-1
) que é fornecida por 250 mg L
-1
de antraceno, à
exceção da gasolina e do óleo diesel, que foram adicionados ao meio mineral
na quantidade de 1% (v/v). Os membros do consórcio microbiano foram
individualmente inoculados, sendo os frascos incubados com duas repetições,
sob agitação de 150 rpm, durante um período de 5 dias. Após, uma alíquota de
um mL das culturas crescidas era diluída em solução salina, plaqueada em
meio ágar nutritivo ou meio ágar malte, e incubada a 30°C por 72 horas,
quando então verificada a presença de UFC nas placas.
3.3.11 Análise estatística
O erro padrão foi calculado pela fórmula
))(1(
11
2
yy
m
s
n
i
nn
yis
−
∑∑
==
onde, s = número
da série; i = número do ponto na série s; m = número de séries para o ponto y
no gráfico; n = número de pontos em cada série; y
is
= valor de dados da série s
e ponto i; e n
y
= número total de valores de dados em todas as séries.
66
3.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.4.1 Seleção da amostra de solo
Visando selecionar a amostra de solo do landfarming com maior
atividade de mineralização de hidrocarbonetos, realizou-se um experimento
respirométrico onde as amostras foram utilizadas como inóculo para a
introdução de uma população degradadora em um solo contaminado
artificialmente no laboratório. Independentemente do local de coleta da
amostra, a inoculação de uma população de microrganismos degradadores via
solo de landfarming resultou em aumento da produção de C-CO
2
se
comparado ao controle (Figura 1). Isto indica que durante os 16 anos em que
os resíduos petroquímicos foram tratados neste local houve um enriquecimento
dos microrganismos do solo no sentido de selecionar populações degradadoras
de hidrocarbonetos.
67
Tempo, dias
0 30 60 90 120 150 180
C-CO
2
, mg kg
-1
solo
0
200
400
600
800
1000
1200
Amostra 1
Amostra 2
Amostra 3
Amostra 4
Amostra 5
Amostra 6
Sem inóc.
FIGURA 1. Produção de C-CO
2
de um solo contaminado com antraceno e
inoculado com diferentes amostras de solo provenientes de uma área de
descarte de resíduos petroquímicos.
A maior produção de C-CO
2
foi observada quando o solo foi inoculado
com a amostra 5, sendo esta produção 90% maior que aquela do solo
inoculado com a amostra 4, que apresentou a segunda maior produção, e
281% maior que a produção de C-CO
2
do solo inoculado com a amostra 1, que
apresentou a menor produção entre os solos inoculados. Estas diferenças
provavelmente se devem a heterogeneidade das atividades de mineralização
de HAPs pelas populações presentes nas amostras de solo, o que por sua vez,
refletem o histórico de manejo do landfarming, no que se refere a composição
química, taxa e época de aplicação dos resíduos, adições de nutrientes
inorgânicos, irrigações, revolvimentos do solo e outros. Com base nestes
resultados, selecionou-se a amostra 5 para ser utilizada no isolamento dos
microrganismos degradadores de HAPs.
68
3.4.2 Isolamento e identificação dos microrganismos degradadores de
HAPs
A amostra 5 do solo do landfarming foi inoculada ao meio mineral mais
antraceno e após 3 transferências foram isolados 7 microrganismos, sendo 6
bactérias e um fungo. As bactérias foram analisadas em microscópio ótico,
sendo 4 Gram positivas e 2 Gram negativas, 5 apresentaram a forma de
bastonetes e um de cocos. O fungo formou colônia filamentosa de coloração
branca em meio ágar malte.
A análise da seqüência do gene do RNAr 16S indicou que o primeiro
isolado pertence ao gênero Mycobacterium (Tabela 2). Este gênero tem sido
extensivamente utilizado nos estudos de biodegradação de HAPs (Wick et al.,
2002; Miyata et al., 2004; Leys et al., 2005; Mutnuri et al., 2005). Segundo
Johnsen et al. (2005) a degradação dos HAPs no solo é dominada por alguns
poucos gêneros, entre os quais o Mycobacterium. A espécie identificada como
geneticamente mais próxima deste isolado foi a M. fortuitum, que tem sido
estudada como degradadora de hidrocarbonetos alifáticos dos polímeros da
borracha (Berekaa et al., 2000; Linos et al., 2000).
TABELA 2. Identificação dos microrganismos degradadores de antraceno pelo
seqüenciamento do gene do RNAr.
Comparação da seqüência do RNAr 16S e ITS
Isolado
Isolado ou espécie
mais próxima
Número
de acesso
Similaridade
(%)
1
Mycobacterium fortuitum
AY513242 97
2
Bacillus cereus
AJ586344 96
3
Microbacterium sp.
AB114267 96
4
Gordonia polyisoprenivorans
AY278367 98
5
Microbacteriaceae bacterium
AY673335 99
6
Naphthalene-utilizing bacterium
AF531474 98
7
Fusarium oxysporum
X78260 100
A espécie identificada como geneticamente mais próxima do segundo
isolado foi Bacillus cereus, que também tem sido citada nos estudos de
69
degradação de hidrocarbonetos alifáticos (Cybulski et al., 2003) e de
aromáticos policíclicos (Kazunga; Aitken, 2000). Segundo Chaillan et al. (2004)
tem sido creditado ao gênero Bacillus a capacidade de degradar
hidrocarbonetos, no entanto em condições de cuidadoso controle do
desaparecimento de substrato do meio de cultura, tem se verificado que
tratam-se de degradadores secundários, que utilizam os metabólitos
produzidos pelos degradadores primários de hidrocarbonetos. Esta pode ser
considerada uma evidência da complementaridade metabólica entre os
microrganismos isolados.
O terceiro isolado foi identificado como pertencente ao gênero
Microbacterium. Gauthier et al. (2003), Cavalca et al. (2004) e Zhang et al.
(2004) isolaram bactérias degradadoras de hidrocarbonetos aromáticos
pertencentes a este gênero. O envolvimento das bactérias do Microbacterium
com a degradação de hidrocarbonetos pode ser demonstrada pelas novas
espécies identificadas, denominadas de M. oleivorans e M. hydrocarbon
oxydans (Schippers et al., 2005).
Gordonia polyisoprenivorans foi identificada como a espécie mais
próxima do quarto isolado. Segundo Linos et al. (1999) esta bactéria foi
inicialmente isolada de polímeros de borracha de pneus e por isso identificada
com este nome. Trata-se de um actinomiceto que forma hifas, que ao se
romperem resultam em células com forma de bastonetes ou cocos. Quando da
análise inicial em microscópio ótico observou-se a forma de bastonete. Vários
estudos tem relatado a utilização desta espécie na degradação
hidrocarbonetos alifáticos (Linos et al., 2000), petróleo (Chaillan et al., 2004) e
HAPs (Mutnuri et al., 2005).
O quinto isolado foi identificado apenas ao nível de família,
apresentando similaridade de 99% com o isolado Ellin 7169, obtido de um solo
agrícola por Davis et al. (2005) e que pertence a família Microbacteriaceae.
O último isolado bacteriano apresentou similaridade de 98% com uma
bactéria que foi isolada de um local utilizado na estocagem de carvão mineral e
que cresceu em meio mineral utilizando o naftaleno como única fonte de
carbono e energia (Dore et al., 2003). Segundo estes autores, a análise do
gene do RNAr 16S indicou que a bactéria apresenta similaridade de 98,5%
com a espécie Clavibacter xyli.
70
O fungo foi identificado como pertencente a espécie Fusarium
oxysporum, que tem sido isolada dos solos contaminados por hidrocarbonetos,
sendo suas habilidades de degradação de HAPs demonstradas com o pireno
(Cerniglia, 1997) e benzo(a)pireno (Verdin et al., 2004, 2005).
3.4.3 Concentração do carbono no meio mineral
Em vista da necessidade de se utilizar o meio mineral livre de qualquer
fonte alternativa de C, avaliou-se a concentração de C dissolvido neste meio.
A água destilada apresentou 0,868 mg L
-1
de C orgânico dissolvido. A adição
de macro e micronutrientes inorgânicos a esta água destilada aumentou a
concentração de C dissolvido, sendo que o meio mineral apresentou
concentração de 3,883 mg L
-1
. Apesar do aumento de mais de 4 vezes, há que
se considerar que a concentração de C na água destilada foi muito baixa e que
o valor observado no meio mineral é, em termos absolutos, também muito
baixo, se comparado aos meios de cultura normalmente utilizados, que
apresentar mais de 5000 mg L
-1
de C orgânico dissolvido.
Observou-se grande diferença na concentração de C orgânico dissolvido
entre o meio mineral contendo antraceno (33,410 mg L
-1
) e glicose (240,100
mg L
-1
). Conforme esperado, a totalidade da glicose adicionada ao meio foi
solubilizada, enquanto muito pouco do antraceno tornou-se solúvel e
conseqüentemente disponível à absorção celular. Mesmo assim, a
concentração de C orgânico dissolvido no meio com antraceno foi
superestimada, uma vez que a solubilidade predita na literatura é de somente
0,076 mg L
-1
. Em condições normais de temperatura e pressão, o antraceno, o
fenantreno e o pireno encontram-se na forma de cristais, que ao serem
adicionados a uma solução aquosa como o meio mineral, formam uma camada
superficial de cristais, sem ocorrer sua entrada no meio aquoso. Esta
superestimação provavelmente se deve a presença de microcristais de
antraceno no meio mineral que foram quantificados, sem no entanto, estarem
dissolvidos. De qualquer forma, estes resultados demonstram que o meio
mineral não se encontrava contaminado com outras fontes de C e que a
solubilidade do antraceno no meio aquoso é baixa, sendo este um dos
principais fatores que limitam a absorção celular, além de representar uma
71
dificuldade aos procedimentos microbiológicos e analíticos pela presença de
uma fonte de C não solúvel no meio de cultura.
A atividade metabólica geral dos microrganismos pode ser avaliada pela
intensidade das reações de óxi-redução, que são responsáveis pela
transferência de energia nas rotas catabólicas e anabólicas. O TTC é um
aceptor de elétrons artificial que quando presente no meio de cultura pode ser
reduzido a TPF por várias enzimas de óxi-redução, sendo esta redução
indicada pelo aparecimento de cor rósea no meio de cultura (Alef, 1995). Esta
técnica foi utilizada para a determinação da concentração de antraceno que
iríamos utilizar nos experimentos subseqüentes, em vista que os valores
obtidos na literatura eram muito variáveis.
Entre as concentrações avaliadas, a presença de coloração rósea
tornou-se evidente na presença de 125, 250 e 500 mg L
-1
de antraceno (dados
não apresentados). Na concentração de 62,5 mg L
-1
a coloração rósea foi
pouco evidenciada, sendo que nas concentrações de 0 e 31,25 mg L
-1
não
houve aparecimento de coloração. Estes resultados estão de acordo com
observações teóricas e práticas de Wick et al. (2001) que realizaram um
experimento adicionando diferentes concentrações de antraceno no meio
mineral onde crescia a Mycobacterium sp. LB501T e, ao mesmo tempo, por
meio de modelos matemáticos, descreveram teoricamente o comportamento
observado no experimento. Os autores demonstraram que quanto maior a
concentração de antraceno no meio de cultura, maior será o coeficiente de
transferência de massa da fase sólida para a líquida (dissolução), maior o
fornecimento de antraceno para as células e maior a taxa de crescimento. Para
os ensaios posteriores, optou-se por utilizar a concentração de 250 mg L
-1
de
antraceno, que foi a concentração intermediária entre as que possibilitaram
maior atividade metabólica do consórcio microbiano.
3.4.4 Curvas de crescimento e pH no meio mineral
A curva de crescimento do consórcio microbiano foi obtida realizando-se
diluições e contagens das colônias dos isolados bacterianos e do fungo em
placas de petri. Optou-se por avaliar o crescimento fúngico por UFC ao invés
do aumento de massa celular devido a presença dos cristais de antraceno no
72
meio mineral que poderiam ser quantificados conjuntamente com a biomassa,
resultando em superestimativa do crescimento e introduzindo erro experimental
entre as pesagens. Na Figura 2 são apresentadas a contagem das UFC do
consórcio microbiano em meio ágar nutriente (bactérias) e em meio ágar malte
(fungo), bem como o pH do meio de cultura ao longo de 36 dias.
Tempo, dias
0 5 10 15 20 25 30 35
Log UFC mL
-1
1
2
3
4
5
6
7
8
pH
1
2
3
4
5
6
7
8
Bactérias
Fungo
pH
FIGURA 2. pH e contagem das UFC das bactérias e do fungo do consórcio
microbiano, crescendo em meio mineral com 250 mg L
-1
de antraceno a 150
rpm e 30°C (dados são médias de duas repetições; barras representam o erro
padrão).
A população de bactérias foi maior que a do fungo durante todo o
experimento, sendo que o pH apresentou tendência de redução durante o
período avaliado. A curva de crescimento das bactérias, até o 19º dia, e do
fungo, até o final do experimento, apresentaram comportamento típico de
microrganismos que crescem sob agitação, utilizando como fonte de C e
energia unicamente cristais de HAPs, em quantidade que excede sua
solubilidade no meio mineral (Jonhsen et al., 2005). Do início do experimento
até o 5º dia para as bactérias e, no primeiro dia para o fungo, observou-se a
73
fase exponencial de crescimento, que foi sustentada pela concentração do
antraceno dissolvida no meio mineral que estava no, ou próximo do, seu
máximo. Assim a quantidade de antraceno solúvel no meio foi maior que a
demanda pela biomassa, que ainda era pequena, fazendo com que os
microrganismos crescessem em sua máxima taxa, ou seja, o limitante nesta
fase foi somente o metabolismo celular e não a biodisponibilidade.
Com o aumento da biomassa, a demanda de antraceno excedeu a sua
taxa de dissolução, a concentração de antraceno solúvel no meio caiu e o
crescimento exponencial cessou. Assim do final da fase exponencial até o 19º
dia estabeleceu-se uma fase de crescimento pseudolinear para bactérias e
fungos, onde o crescimento da biomassa foi limitado pela taxa quase constante
de dissolução dos cristais de antraceno. A taxa de crescimento diminuiu, mas a
biomassa continuou aumentando. Com a redução da concentração de
antraceno no meio mineral, a taxa de dissolução reduziu ainda mais, sendo que
o substrato disponível foi suficiente somente para a manutenção da biomassa
viva, não havendo mais crescimento, iniciando-se assim a fase pseudo-
estacionária, que normalmente é bastante longa e onde os microrganismos não
tem substrato suficiente para permitir o aumento da sua população, porém não
há morte, pois ocorre fornecimento contínuo de antraceno para a fase aquosa.
No experimento, a fase pseudo-estacionária parece ter ocorrido somente
para os fungos, pois à partir do 19º dia observou-se um decréscimo do número
de células bacterianas. As medidas do pH desde o início do experimento
revelaram tendência de acidificação do meio, sendo que entre o 8º e 19° dias
houve redução de mais de duas unidades de pH. Este comportamento
provavelmente se deveu ao acúmulo de H
+
ou de outros metabólitos ácidos no
meio de cultura, resultantes da atividade microbiana. Em vista da incapacidade
dos fungos mineralizarem grandes porcentagens dos HAPs, outros
pesquisadores têm demonstrado, com auxílio da cromatografia, a presença
destes intermediários no meio de cultura (Kotterman et al., 1998; Boonchan et
al., 2000). Assim, sendo este um consórcio composto de fungos e bactérias, é
de se esperar que haja realmente a excreção de metabólitos parcialmente
metabolizados por alguns isolados, que poderão ser utilizados como fonte de C
e energia por outros isolados, indicando a presença de uma das principais
características dos consórcios que é a complementaridade metabólica.
74
Interessantemente, o pH manteve-se muito próximo a 7,00 quando o
fungo foi inoculado isoladamente no mesmo meio por um período de 39 dias,
nas mesmas condições (dados não apresentados), indicando que esta
produção de metabólitos ácidos não esteve associada ao fungo ou se esteve,
só ocorreu na presença dos demais membros do consórcio. Esta redução de
pH foi bastante intensa até o 19º dia, quando o pH do meio de cultura atingiu o
valor de 4,25, coincidindo com o início da redução da população de bactérias,
fato que não ocorreu com o fungo, que apresentou crescimento característico
de microrganismos em meio mineral contendo HAPs. Provavelmente, devido a
preferência das bactérias em crescerem em pH mais próximos da neutralidade,
esta intensa redução do pH deve ter ocasionado efeitos danosos à fisiologia
celular e conseqüentemente, levado a morte das bactérias. Há ainda que se
considerar que o meio mineral utilizado não apresenta forte poder de
tamponamento do pH, o que provavelmente se deve a baixa concentração de
fosfato (0,1 g L
-1
). Caso fosse utilizado outros meios minerais com maiores
quantidades de fosfatos as reduções de pH provavelmente seriam menores.
3.4.5 Degradação de HAPs em meio mineral
A comprovação da capacidade do consórcio em degradar HAPs foi
avaliada por cromatografia gasosa após 30 dias de incubação em meio mineral
mais 250 mg L
-1
de antraceno (Tabela 3). O consórcio microbiano foi capaz de
degradar antraceno, fenantreno e pireno do meio mineral. A maior degradação
ocorreu com o fenantreno, provavelmente devido a maior solubilidade deste
HAP em relação aos demais. O antraceno apesar de ter menor solubilidade
que o pireno, apresenta estrutura química com 3 anéis aromáticos, que pode
ter determinado maior degradação que o pireno, que apresenta 4 anéis
aromáticos, sendo este considerado um HAP de alta massa molecular e
portanto, de mais difícil degradação.
75
TABELA 3. Degradação do antraceno, fenantreno e pireno pelo consórcio
microbiano por 30 dias em meio mineral com 250 mg L
-1
de um dos HAPs, a
150 rpm, 30°C (dados são médias de três repetições ± erro padrão).
HAP Degradação (%) Taxa de degradação (mg L
-1
dia
-1
)
Antraceno
47,90 ± 4,65 3,77 ± 0,35
Fenantreno
66,90 ± 3,22 5,29 ± 0,29
Pireno
21,75 ± 3,10 1,75 ± 0,23
Apesar de todos os procedimentos microbiológicos anteriores a
cromatografia utilizarem o antraceno como única fonte de C e energia, o
consórcio apresentou capacidade de degradar o fenantreno e o pireno,
demonstrando que estes procedimentos não resultaram na perda da
capacidade de degradação de outros HAPs. Conforme demonstrado por Habe;
Omori (2003), as seqüências dos genes nah apresentam-se conservadas em
bactérias aeróbias e codificam as enzimas que normalmente conferem aos
isolados a capacidade de degradar outros HAPs. Assim como nos nossos
resultados, outros autores também isolaram bactérias utilizando um
determinado HAP como fonte de C, sendo que posteriormente os isolados
apresentaram a capacidade de degradar outros HAPs (Kastner et al., 1994;
Aislabie et al., 2000; Zhang et al., 2004). As análises genéticas das enzimas de
degradação de HAPs em fungos são praticamente inexistentes na literatura.
Os dados de literatura que tratam da degradação de HAPs por
consórcios microbianos são relativamente novos. Boonchan et al. (2000)
observaram degradações próximas a 100% quando um consórcio composto
pela bactéria Stenotrophomonas maltophilia e pelo fungo Penicillium
janthinellum cresceu por 30 dias em meio mineral com 250 mg L
-1
de pireno.
Trabalhos com culturas puras são mais freqüentemente encontrados na
literatura, como os de Liu et al. (2004) que estudaram a degradação do
fenantreno e do pireno por um isolado de Sphingomonas, sendo estas
respectivamente de 60 e 40% após 5 dias de incubação com 2000 mg L
-1
de
fenantreno ou 100 mg L
-1
de pireno. Porcentagens de degradação próximas a
100% foram observadas por Zhang et al. (2004) quando um isolado de
Paracoccus cresceu em meio mineral com 100 mg L
-1
de fenantreno ou de
pireno.
76
Relatos de pesquisas sobre as porcentagens de degradação do
antraceno são relativamente escassos, provavelmente devido a sua baixíssima
solubilidade (menor entre os HAPs de 3 anéis e que a do pireno) (Verschueren,
2001) e conseqüente reduzida taxa de degradação. Entretanto, pesquisas
realizadas em nosso laboratório quantificaram em 63% a degradação média de
250 mg L
-1
de antraceno em meio mineral, após 48 dias de crescimento, em
separado, de 3 isolados de Pseudomonas (Jacques et al., 2005). Zhang et al.
(2004), sem mencionarem as porcentagens de degradação, relataram que as
taxas de degradação em meio mineral contendo 100 mg L
-1
de antraceno ou
fenantreno ou pireno foram respectivamente de 0,500; 0,333 e 0,083 mg L
-1
dia
-
1
, sendo estes valores inferiores aos apresentados na Tabela 3.
3.4.6 Detecção da produção de biossurfactantes
A detecção da produção de biossurfactantes pelo fungo e pelo consórcio
durante o crescimento em meio mineral e antraceno, foi realizada
semanalmente por 42 dias. Durante este período a tensão superficial do meio
inoculado com o fungo não apresentou decréscimo de seu valor inicial,
mantendo-se próxima de 67 mN m
-1
, em todas as avaliações, não diferindo do
meio estéril (67 mN m
-1
) e da água destilada (68 mN m
-1
). Ao final do
experimento, a tensão superficial do meio inoculado com o consórcio foi, em
média, de 62,7 mN m
-1
. Estes resultados indicam que a produção de
biossurfactantes de baixo peso molecular não foi a estratégia
preferencialmente utilizada para aumentar a biodisponibilidade de HAPs no
meio mineral. Pesquisas realizadas recentemente em nosso laboratório
possibilitaram a seleção de um isolado de Pseudomonas citronellolis que
reduziu a tensão superficial de 69,2 para 36 mN m
-1
após o crescimento de 48
dias no meio mineral com antraceno (Jacques et al., 2005). Segundo Maier
(2003) um eficiente biossurfactante pode reduzir a tensão superficial entre a
água pura e o ar de 73 para 30 mN m
-1
.
O índice de emulsificação também foi avaliado semanalmente durante
os 42 dias, não sendo observada a formação de emulsões no meio inoculado
com o fungo. Na presença do consórcio houve, aos 42 dias, o surgimento de
emulsão no meio mineral, com ou sem as células microbianas, indicando a
77
produção e excreção para o meio extracelular de biossurfactantes de alto peso
molecular. Esta emulsão esteve localizada na interface óleo/meio, mas
preferencialmente posicionada no meio mineral, sugerindo a presença de um
biossurfactante com afinidade pela fase hidrofílica.
A redução observada de 10,5 mN m
-1
por uma das repetições do
consórcio e o surgimento de emulsão aos 42 dias remetem a necessidade de
novos estudos com maior período de avaliação. Conforme demonstrado por
Johnsen; Karlson (2004), os microrganismos podem utilizar-se de outras
estratégias para aumentar a disponibilidade de HAPs no meio aquoso, como a
formação de biofilmes na superfície dos cristais de HAP, que também será
objeto de novos estudos, cujas avaliações serão realizadas através de
microscopia eletrônica de varredura.
3.4.7 Crescimento dos isolados em outros hidrocarbonetos
As contaminações ambientais por hidrocarbonetos normalmente
ocorrem na forma de misturas, sendo que a capacidade dos microrganismos
degradadores utilizarem diferentes compostos é uma das características que
deve ser avaliadas visando a seleção de microrganismos para a
biorremediação de ambientes contaminados com HAPs. O perfil de utilização
de 18 fontes de C pelos membros do consórcio microbiano é apresentado na
Tabela 4. O consórcio apresentou grande versatilidade metabólica, uma vez
que cresceu em todas as fontes avaliadas. Individualmente, os isolados
bacterianos 2, 4, 5 e o fungo apresentaram maior versatilidade metabólica pois
cresceram em 14 ou mais fontes de C. Os isolados bacterianos 1, 3 e 6
cresceram em 11 ou 12 fontes.
78
TABELA 4. Crescimento dos membros do consórcio microbiano em diferentes
fontes de C adicionadas individualmente ao meio mineral após incubação por 7
dias a 150 rpm e 30°C.
Isolados bacterianos
Fonte de C
1 2 3 4 5 6
Fungo Consórcio
Pireno
+ + + + + + + +
Antraceno
+ + + + + + + +
Fenantreno
+ + + + + + + +
Naftaleno
+ + - - - + + +
Catecol
+ - - + - - + +
Ac. Gentíssico
+ + + + + + + +
Ác. Salicílico
- - - - + - - +
Ác. Dihidroxibenzóico
- - - - - + + +
Benzeno
- + + + + - + +
Etil-benzeno
- + + + + - + +
Tolueno
+ + - + + + + +
Xileno
- + + + + - + +
1-Deceno
+ + + + + + + +
1- Octeno
+ + + + + + + +
Hexano
- + + - - - + +
Etanol
+ + + + + + + +
Gasolina
+ + - + + + + +
Óleo diesel
- + + + + + + +
O pireno, o fenantreno e o antraceno foram utilizados por todos os
membros do consórcio, provavelmente em função do enriquecimento ter
selecionado microrganismos degradadores de HAPs. Apesar do naftaleno
apresentar somente 2 anéis aromáticos, não foi degradado por 3 membros do
consórcio. Este comportamento foi também relatado por Zhang et al. (2004),
onde um isolado de Paracoccus degradou o antraceno, o fenantreno e o
pireno, mas não o naftaleno.
Houveram grandes diferenças no perfil de degradação dos
intermediários das rotas de degradação dos HAPs. O ácido gentíssico foi
utilizado como fonte de C por todos os membros do consórcio, indicando que
79
este pode ser o principal intermediário central das rotas de degradação dos
HAPs por estas bactérias. Já o catecol que também é um intermediário central
foi degradado por somente 3 membros do consórcio.
Os hidrocarbonetos monoaromáticos apresentaram perfil de utilização
de fontes de C muito semelhantes, sendo que os isolados 2, 4, 5 e o fungo
cresceram na presença dos 4 compostos. Apesar da estrutura mais simples
que os HAPs, o benzeno, o etil-benzeno e o xileno não foram degradados
pelos isolados 1 e 6. Aislabie et al. (2000) observaram que isolados bacterianos
degradadores de HAPs não cresceram na presença de nenhum hidrocarboneto
monoaromático.
Os membros do consórcio microbiano demonstraram diferentes
capacidades de utilização dos hidrocarbonetos alifáticos. As cadeias mais
longas foram utilizadas por todos os isolados enquanto que, na presença do
hexano houve crescimento de somente 3 membros do consórcio, corroborando
os resultados de Kastner et al. (1994) que também observaram que bactérias
degradadoras de HAPs não cresceram na presença do hexano.
O etanol foi utilizado por todos os membros do consórcio provavelmente
em função da sua alta solubilidade e estrutura química simples. A gasolina e o
óleo diesel foram utilizados como fonte de C por 6 membros do consórcio. Por
se tratarem de misturas complexas de hidrocarbonetos, abrangendo desde
cadeias alifáticas simples até hidrocarbonetos aromáticos, é provável que os
isolados apresentem a capacidade de utilizar algumas destas frações.
Pela análise da Tabela 4 fica evidenciado que a utilização de um
substrato não pode ser previsto somente considerando-se sua estrutura
química, pois muitos compostos de maior complexidade estrutural podem ser
utilizados como fonte de C pelo microrganismo, em detrimento a outros
compostos relativamente mais simples. Assim, o perfil de utilização de
substrato de um determinado microrganismo também pode ser influenciado
pelas suas características genéticas e pelos procedimentos microbiológicos
anteriores, como por exemplo, a fonte de C utilizada no enriquecimento.
80
3.5 CONCLUSÕES
1) A amostra 5 do solo do landfarming apresenta população microbiana
com a maior atividade de mineralização do antraceno no solo, sendo isolado e
identificado um consórcio microbiano, composto por 6 bactérias e um fungo,
capaz de crescer em meio mineral contendo antraceno como única fonte de C
e energia;
2) Os isolados bacterianos e o fungo apresentam comportamento típico
quando crescem em meio mineral contendo antraceno, sendo que o pH deste
meio apresenta forte redução de seu valor, o que coincide com a diminuição do
número de bactérias que nele cresciam;
3) O consórcio microbiano degrada quantidades significativas de
antraceno, fenantreno e pireno presentes no meio mineral;
4) O consórcio microbiano apresenta grande versatilidade metabólica,
crescendo em todos os substratos avaliados, sendo que os isolados
bacterianos Bacillus cereus, Gordonia polyisoprenivorans e Microbacteriaceae
bacterium e o Fusarium oxysporum crescem em um maior número de
substratos que os demais isolados.
81
3.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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CAPÍTULO III
BIORREMEDIAÇÃO DE UM SOLO CONTAMINADO COM
HIDROCARBONETOS AROMÁTICOS POLICÍCLICOS
87
4.1 RESUMO
Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) são compostos
carcinogênicos e mutagênicos que, devido a atividades naturais ou
antropogênicas, podem contaminar o solo e permanecer por longos períodos
neste ambiente, se as populações autóctones do solo não possuírem a
capacidade de degradá-los. Nestes casos, a inoculação do solo com
microrganismos degradadores dos HAPs é uma prática recomendada. O
objetivo do presente estudo foi avaliar a capacidade de um consórcio
microbiano isolado de um solo de landfarming (composto por 6 bactérias e um
fungo) em degradar e mineralizar diferentes concentrações do antraceno, do
fenantreno ou do pireno presentes no solo. Os microrganismos do consórcio
foram inoculados a um solo arenoso contaminado em laboratório com as
concentrações de 0, 250, 500 e 1000 mg kg
-1
de antraceno, ou fenantreno, ou
pireno. A mineralização destes HAPs foi avaliada por respirometria e a
degradação por cromatografia gasosa. A microbiota autóctone do solo em
estudo apresentou nula ou baixa capacidade de mineralização destes HAPs.
Os isolados bacterianos e o fungo, membros do consórcio microbiano, se
inoculados separadamente ao solo, apresentaram baixas porcentagens de
mineralização do antraceno quando comparado a inoculação conjunta na forma
de consórcio. O consórcio microbiano degradou em média, 99, 99 e 96%,
respectivamente das diferentes concentrações de antraceno, fenantreno e
pireno presentes no solo, em 70 dias. Este consórcio mineralizou, neste
mesmo período de tempo, 78% em média, das diferentes concentrações dos 3
HAPs no solo, resultando em grande aumento da mineralização se comparada
a microbiota autóctone do solo. Comprova-se a capacidade do consórcio
microbiano em biorremediar o solo contaminado, de forma a eliminar os HAPs
em curto período de tempo.
88
4.2 INTRODUÇÃO
Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) são compostos
químicos constituídos unicamente de átomos de C e H, arranjados na forma de
dois ou mais anéis aromáticos. Estes compostos são lipossolúveis e
prontamente absorvidos pelo organismo dos mamíferos, cujo metabolismo gera
compostos com propriedades mutagênicas e carcinogênicas ao Homem e aos
animais (Netto et al., 2000). Os HAPs são gerados naturalmente pela
combustão incompleta de resíduos orgânicos, mas a contaminação do solo por
estes compostos é um efeito típico da atividade antropogênica, em especial a
industrial. Um monitoramento realizado na Inglaterra indicou valores
aproximados de concentração no solo de 0,005 µg kg
-1
em áreas agrícolas,
aumentando para 0,03 µg kg
-1
nas proximidades dos centros urbanos e para
1,8 µg kg
-1
nas áreas industriais (Jones, 1989). Entre as causas da
contaminação do solo por estes compostos, podem-se destacar os resíduos
gerados pelas refinarias, postos de combustíveis e indústrias petroquímicas,
que apresentam em sua composição uma complexa mistura de HAPs, entre
eles o antraceno, o fenantreno e o pireno.
Assim, devido as atividades naturais ou antropogênicas, o solo pode
receber quantidades consideráveis de HAPs, que permanecem por longos
períodos neste ambiente, se as populações autóctones do solo não possuírem
a capacidade de degradação destes compostos. Nestes casos, a inoculação do
solo com microrganismos reconhecidamente degradadores dos HAPs, ou seja,
a bioaumentação, é uma prática recomendada (Edgehill et al., 1999). Kästner
et al. (1998) inocularam bactérias degradadoras num solo contaminado com
HAPs e observaram incrementos de seis e de dez vezes na degradação do
pireno e do antraceno, respectivamente, o que possibilitou a remediação em
um tempo sete vezes menor quando comparado ao controle não inoculado.
89
Por outro lado, a falta de atenção com os princípios da degradação de
HAPs no solo tem conduzido a bioaumentação a vários insucessos (Johnsen et
al., 2005). A complexidade química, física e biológica do solo pode determinar
o declínio da população inoculada, seja pelas relações antagonísticas impostas
pelas populações autóctones, como predação e competição, seja pelos
estresses fisiológicos causados pelos fatores abióticos, como pH,
disponibilidade de água e ar, temperatura e, no caso específico dos HAPs,
biodisponibilidade de fontes de C e energia (van Veen et al., 1997). Segundo
Alexander (1999), a eficiência da biorremediação é função da extensão em que
a população microbiana degradadora pode manter-se no ecossistema natural.
Por todos estes motivos, a introdução de uma população de
microrganismos degradadores no ambiente contaminado deve ser precedida
de uma série de avaliações em laboratório, entre as quais destaca-se a
caracterização microbiana e os experimentos em microcosmos (Sabaté et al.,
2004). A caracterização do consórcio microbiano já foi objeto do estudo
anterior, sendo o objetivo do presente estudo avaliar em microcosmos a
capacidade deste consórcio em degradar e mineralizar diferentes
concentrações do antraceno, do fenantreno ou do pireno presentes no solo.
90
4.3 MATERIAL E MÉTODOS
4.3.1 Solo
O solo utilizado em todos os experimentos, pertence a Unidade de
Mapeamento Itapoã (Argissolo Vermelho-Amarelo distrófico arênico) e foi
coletado em uma área agrícola, sem histórico de recebimento de nenhum tipo
de resíduo. Este solo foi trazido para o laboratório, seco e peneirado em malha
de 2 mm. Para elevar o pH a 6,5, adicionou-se CaCO
3
e MgCO
3
na proporção
3:1, na forma de reagente comercial, incubando-se o solo úmido por 60 dias.
Posteriormente, este solo foi contaminado com a concentração desejada de
cada HAP. Para isto, preparou-se uma solução concentrada de HAP dissolvido
em acetona (8,333 mg mL
-1
), que foi adicionada a 50 g de solo no interior de
frascos respirométricos. Estes frascos foram colocados em estufa por 3 horas a
50°C para evaporação da acetona. Após adicionou-se mais 50 g de solo,
procedendo-se uma intensa mistura. Devido a baixa fertilidade natural, o solo
foi adubado com o equivalente a 100 kg ha
-1
de N, 50 kg ha
-1
de P e 56 kg ha
-1
de Fe, na forma de solução de NH
4
NO
3
, KH
2
PO
4
e Fe(NO
3
)
3
. Além disso, 0,5
mL da solução de micronutrientes do meio mineral Tanner foram adicionadas
às 100 g de solo.
4.3.2 Produção do inóculo
Após o solo estar corrigido, contaminado com o HAP e fertilizado, foi
adicionado 2 mL de uma suspensão de células do consórcio microbiano, de
forma a introduzir uma população de 2,0 x 10
8
UFC g
-1
de solo (Kastner et al.,
1998). Para obtenção desta suspensão de células, 100 µL de uma cultura do
consórcio microbiano que havia crescido em meio mineral mais 250 mg L
-1
de
HAP foi inoculada em ágar nutriente contendo 250 mg L
-1
do HAP e incubada a
91
30°C por 72 horas. Após o crescimento das colônias, foi adicionado sobre o
meio 5 mL de água estéril e com o auxílio de uma alça de Drigalsky, as
colônias foram coletadas para tubos e a suspensão foi centrifugada a 10000
rpm, por 8 minutos a 15°C. O sobrenadante foi descartado e o pellet
ressuspendido numa quantidade previamente calculada de água estéril, sendo
então a suspensão adicionada ao solo no interior dos frascos respirométricos.
O HAP (antraceno, fenantreno ou pireno) utilizado na produção do inóculo foi o
mesmo que seria posteriormente degradado no solo pelo consórcio.
4.3.3 Análise respirométrica
Os frascos respirométricos (1,5 L) com o solo já inoculado foram
equipados com aparato de captura de CO
2
, composto por um copo plástico de
50 mL com 20 mL de NaOH 0,25 M, fechados hermeticamente e incubados a
temperatura ambiente no laboratório. Semanalmente os frascos foram abertos,
a solução de NaOH recebeu um mL de BaCl
2
1 M e foi titulada com HCl 0,5 M,
utilizando fenoftaleína como indicador. A solução do HCl 0,5 M foi padronizada
com tris, conforme Tedesco et al. (1995). Uma amostra com umidade igual ao
solo dos frascos respirométricos foi utilizada para determinação da umidade
gravimétrica, sendo a produção de C-CO
2
expressa em kg de solo seco.
A produção de C-CO
2
foi quantificada através da fórmula de Stotzky
(1965):
C-CO
2
(mg kg
-1
de solo) = (B-T) x eq x M x 10
onde, B é o volume (em mL) da solução de HCl gasto para titular a prova em
branco (frasco respirométrico sem solo); T é o volume (em mL) da solução de
HCl gasto para titular os tratamentos; eq é o equivalente-grama do C, que é 6;
M é a molaridade da solução padronizada de HCl e 10 é o fator de conversão
para kilograma de solo.
4.3.4 Controle
O efeito da adição do antraceno, da acetona e do consórcio microbiano
na produção de C-CO
2
do solo foi avaliado por um experimento com 4
tratamentos: 1) solo fertilizado, inoculado com o consórcio e contaminado com
92
1000 mg kg
-1
de antraceno (Bioest+Bioaum+Ant); 2) solo fertilizado, inoculado
com o consórcio e contaminado somente com a mesma quantidade de acetona
do tratamento anterior (sem antraceno) (Bioest+Bioaum+Acet); 3) solo
fertilizado e contaminado com antraceno (Bioest+Ant) e 4) solo fertilizado
(Bioest). Os frascos foram incubados em duplicata durante 60 dias.
4.3.5 Esterilização do Solo
Para avaliar o efeito na produção de C-CO
2
da esterilização do solo
anteriormente a adição do consórcio realizou-se um experimento com 4
tratamentos: 1) solo estéril adicionado de antraceno e nutrientes (Estéril); 2)
solo estéril adicionado de antraceno, nutrientes e do consórcio
(Estéril+consórcio); 3) solo não-estéril adicionado de antraceno e nutrientes
(Não-estéril) e 4) solo não-estéril adicionado de antraceno, nutrientes e do
consórcio (Não-estéril+consórcio). O solo foi autoclavado no interior de
béqueres de 1 L durante 20 minutos a 121°C, sendo a morte dos
microrganismos confirmada por plaqueamento em meio ágar nutritivo e ágar
malte. Este solo estéril foi adicionado aos frascos respirométricos, previamente
esterilizados com álcool 70% em câmara de fluxo, e fertilizado com soluções
estéreis de nutrientes. Posteriormente, foi contaminado com antraceno (250 mg
kg
-1
), inoculado com o consórcio e incubado em duplicata durante 37 dias.
4.3.6 Tipo de Inóculo
A contribuição dos isolados bacterianos, do fungo e de ambos
conjuntamente (consórcio) para a mineralização do antraceno no solo foi
avaliado em um experimento com 4 tratamentos. O solo foi contaminado com
500 mg kg
-1
e adicionado de nutrientes, sendo os tratamentos compostos de
diferentes inóculos: 1) isolados bacterianos; 2) fungo; 3) consórcio microbiano
(isolados bacterianos + fungo) e 4) sem inóculo. Os frascos respirométricos
foram incubados com 4 repetições por 43 dias.
A quantidade de células dos 3 inóculos adicionada ao solo foi de 52
microgramas de massa seca por grama solo, que equivale a 2,0 x 10
8
UFC g
-1
de solo, que foi o inóculo padrão utilizado nos experimentos anteriores. Assim,
93
inoculou-se ao solo a suspensão de bactérias ou do fungo ou do consórcio, de
modo a introduzir a mesma quantidade de massa seca de células. Os
procedimentos para produção e adição ao solo do inóculo foram iguais aos
descritos no item Produção do inóculo.
4.3.7 Concentrações de HAPs
Visando avaliar a capacidade de degradação e de mineralização de
diferentes concentrações de HAPs pelo consórcio microbiano, e compará-la a
da microbiota nativa do solo, realizaram-se 3 experimentos, um para cada
HAP, utilizando-se dos mesmos 5 tratamentos. Em quatro destes tratamentos,
o solo recebeu nutrientes, o consórcio e uma das seguintes concentrações do
HAP: 0, 250, 500 e 1000 mg kg
-1
de solo. No quinto tratamento, o solo recebeu
somente nutrientes e 1000 mg kg
-1
do HAP, ou seja, sem inoculação (SI) do
consórcio. Os frascos foram incubados em duplicata por um período de 60 dias
para o antraceno, 56 dias para o fenantreno e 70 dias para o pireno.
Após o término destes 3 experimentos, quantificou-se a concentração
remanescente dos HAPs no solo, através da extração por solvente orgânico e
análise cromatográfica. Para isto, o solo dos frascos respirométricos foi seco
em capela de exaustão por 3 horas, moído em gral e armazenado a -15°C. Na
extração foram utilizadas 30 g de solo de cada um dos tratamentos, que foram
colocados no sistema extrator Soxhlet por 15 horas, utilizando hexano (Merck,
pureza ≥ 99,8%) como solvente. O material extraído foi concentrado em rota-
vapor e o enxofre que por ventura pudesse estar presente na amostra foi
removido passando por uma coluna de cobre ativado. Posteriormente, o extrato
livre de enxofre foi submetido a cromatografia líquida preparativa, em coluna de
sílica, de modo a obter frações puras de hidrocarbonetos alifáticos e
aromáticos. As frações obtidas foram inicialmente concentradas em rota-vapor
seguido de leve fluxo de N
2
até quase a secura. As frações concentradas foram
armazenadas a 4°C até a análise cromatográfica.
Para isto, utilizou-se um cromatógrafo gasoso (Agilent, Palo Alto,
Califórnia - modelo 6890) com detector seletivo de massa (modelo 5973),
equipado com coluna capilar DB5 (5% fenil metil polisiloxano - 30 m x 0,25 mm
x 0,25 mm). O injetor e a linha de transferência operaram a 290°C. O programa
94
de temperatura do forno foi: 40°C por um minuto, seguido de aumento de 6°C
por minuto até 220°C, mantendo isotérmica por um minuto e aquecimento de
15°C min
-1
até 300°C. Um alíquota de 0,2 µL foi injetado com uma razão de
split de 1:50. O detector seletivo de massa operou em modo scan. Como
padrão interno, utilizou-se fenantreno deuterado, que foi adicionado às
amostras anteriormente a injeção no cromatógrafo.
4.3.8 Análise estatística
O erro padrão foi calculado pela fórmula
))(1(
11
2
yy
m
s
n
i
nn
yis
−
∑∑
==
onde, s = número
da série; i = número do ponto na série s; m = número de séries para o ponto y
no gráfico; n = número de pontos em cada série; y
is
= valor de dados da série s
e ponto i; e n
y
= número total de valores de dados em todas as séries.
95
4.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.4.1 Controle
Este experimento teve como objetivo avaliar a capacidade do consórcio
microbiano em mineralizar o antraceno no solo e de confirmar que o C-CO
2
quantificado provinha da mineralização deste composto no solo. O efeito da
inoculação do consórcio microbiano no solo pode ser verificado ao
compararmos as produções de C-CO
2
dos tratamentos Bioest+Bioaum+Ant e
Bioest+Ant (Figura 1). Quando o solo recebeu somente antraceno e nutrientes
a produção de C-CO
2
foi de 140 mg kg
-1
de solo, sendo que com a inoculação
do consórcio houve aumento de 686% nesta produção, demonstrando que o
consórcio selecionado apresentou elevada capacidade de mineralizar o
antraceno do solo. A maioria dos trabalhos encontrados na literatura trata da
degradação e não da mineralização do antraceno no solo, quantificando o
desaparecimento do substrato através de cromatografia. Kastner et al. (1998)
verificaram que a introdução ao solo de bactérias degradadoras de HAPs
eliminou em 30 dias as 25 mg kg
-1
de antraceno no solo, com uma taxa de
degradação 10 vezes maior e em tempo 7 vezes menor que a microbiota
autóctone do solo.
96
Tempo, dias
0 102030405060
C-CO
2
, mg kg
-1
de solo
0
200
400
600
800
1000
Bioest+Bioaum+Ant
Bioest+Bioaum+Acet
Bioest+Ant
Bioest
FIGURA 1. Produção de C-CO
2
de um solo após bioestimulação (Bioest),
bioaumentação (Bioaum), contaminação com antraceno (Ant) e acetona (Acet)
(dados são médias de duas repetições; barras representam o erro padrão).
Em todos os experimentos, o solo foi contaminado através de uma
solução de antraceno dissolvido em acetona, que posteriormente era deixada
evaporar em estufa. A possibilidade da acetona não ser totalmente evaporada
e contribuir para a produção de C-CO
2
foi eliminada ao compararmos as curvas
dos tratamentos Bioest+Bioaum+Ant e Bioest+Bioaum+Acet, onde o solo
recebeu exatamente a mesma quantidade de acetona, diferindo somente na
presença do antraceno. A produção do C-CO
2
no solo que recebeu somente a
acetona foi de 165 mg kg
-1
, sendo esta 5,8 vezes menor que a apresentada
pelo solo que recebeu também o antraceno. Além disto, a produção de C-CO
2
entre os tratamentos Bioest+Bioaum+Acet e Bioest, onde o solo recebeu
somente nutrientes, foi muito semelhante, indicando que o procedimento de
evaporação da acetona removeu do solo a grande maioria deste solvente e que
a quantidade remanescente no solo foi insuficiente para produzir quantidades
significativas de C-CO
2
.
97
A incapacidade dos microrganismos autóctones do solo em mineralizar o
antraceno pode ser comprovada ao compararmos os tratamentos Bioest+Ant e
Bioest, onde as produções de C-CO
2
foram muito próximas, 140 e 106 mg kg
-1
respectivamente. Ou seja, a presença de 1000 mg kg
-1
de antraceno no solo
resultou em aumento de somente 34 mg kg
-1
de C-CO
2
, o que representa que
os microrganismos autóctones mineralizaram somente 3,42% do antraceno
adicionado ao solo. Este comportamento provavelmente se deve a que o solo
utilizado no experimento foi coletado em área agrícola e não apresentava
histórico de recebimento de resíduos. Assim, é provável que a microbiota
autóctone não estivesse adaptada para a utilização de HAPs, não
apresentando as enzimas necessárias para transformar estes compostos em
intermediários das rotas comuns de geração e energia do metabolismo
microbiano. Em casos como este, a bioaumentação é uma técnica a ser
utilizada visando a biorremediação do solo contaminado.
4.4.2 Esterilização do Solo
O efeito da esterilização do solo na produção de C-CO
2
foi avaliado
durante 37 dias (Figura 2). A baixa mineralização observada no tratamento
Não-estéril indica que a microbiota nativa do solo mineralizou uma quantidade
tão pequena de C-CO
2
que não diferiu do tratamento Estéril, onde não haviam
microrganismos no solo. Com a inoculação do consórcio microbiano verifica-se
um grande aumento da mineralização, sendo esta maior no solo Estéril que no
solo Não-estéril. Este comportamento indica que o consórcio se estabeleceu de
modo mais efetivo no solo estéril, o que resultou em maior consumo de
antraceno e conseqüentemente maior produção de C-CO
2
. A esterilização
interfere na colonização do solo pelas populações alóctones principalmente por
eliminar os fatores bióticos como predação e competição, que são impostas
pelas populações autóctones na tentativa de eliminar a população introduzida e
restabelecer o equilíbrio original do ambiente (Atlas; Bartha, 1998).
98
Tempo, dias
0 10203040
C-CO
2
, mg kg
-1
de solo
0
40
80
120
160
Estéril
Estéril+consórcio
Não-estéril
Não-estéril+consórcio
FIGURA 2. Produção de C-CO
2
de um solo contaminado com antraceno após
esterilização e a bioaumentação com um consórcio microbiano (dados são
médias de duas repetições; barras representam o erro padrão).
A sobrevivência das populações inoculadas no solo é um pré-requisito
para a atividade de degradação do contaminante. Por isso alguns autores
utilizaram a esterilização do solo como forma de promover um satisfatório
estabelecimento da população inoculada e conseqüentemente, observaram
maiores taxas de degradação do contaminante, se comparado ao solo não
esterilizado (Goldstein et al., 1985; Liu et al., 1990; Kastner et al., 1998).
No experimento realizado, a produção de C-CO
2
no solo estéril
inoculado com o consórcio foi maior que no solo não-estéril também inoculado,
indicando que há um efeito inibitório à população inoculada pelas populações
autóctones do solo. No entanto, esta diferença foi de somente 22% e diante
das possíveis alterações dos fatores abióticos do solo devido a autoclavagem
(por exemplo, o aumento da concentração de manganês), os demais
experimentos foram realizados com o solo não-estéril, buscando avaliar a
eficiência do consórcio na presença das populações autóctones, que são
99
também parte integrante do ambiente a ser biorremediado e cujo nicho
ecológico não deve ser ignorado.
4.4.3 Tipo de Inóculo
A contribuição dos isolados bacterianos, do fungo e do consórcio
formado pela inoculação de ambos (bactérias + fungo) para a mineralização do
antraceno no solo foi avaliado em um experimento respirométrico (Figura 3).
Tempo, dias
0 10203040
C-CO
2
, mg kg
-1
de solo
0
100
200
300
400
500
Sem inóculo
Bactérias
Fungo
Consórcio
FIGURA 3. Produção de C-CO
2
de um solo contaminado com antraceno,
inoculado com bactérias e fungo separadamente, ou conjuntamente na forma
de um consórcio microbiano (dados são médias de quatro repetições; barras
representam o erro padrão).
O fungo mineralizou somente 4% do antraceno adicionado ao solo, o
que representa 15 vezes menos que o consórcio. Esta baixa capacidade dos
fungos em mineralizarem HAPs verificada neste experimento está de acordo
com os dados da literatura. Bazalel et al (1996) avaliaram em meio de cultura a
100
mineralização do fenantreno e do pireno durante 11 dias pelo fungo Pleorotus
ostreatus, sendo esta de somente 3,0 e 0,4%, respectivamente. Neste mesmo
trabalho, a mineralização do antraceno foi ainda menor, 0,6% em 35 dias de
incubação. No solo, a mineralização de 50 mg kg
-1
do benzo(a)pireno
realizada
pelo fungo Penicillium janthinellum foi próxima a zero, após 55 dias de
incubação.
A produção de C-CO
2
pelos isolados bacterianos também foi baixa, não
diferindo daquela obtida pelo fungo. As porcentagens de mineralização do
antraceno no solo normalmente tem sido baixas. Grosser et al. (1995)
observaram que a mineralização após 64 dias de incubação deste HAP no solo
foi de 10%. Em igual período de tempo, Santos (2004) quantificou em menos
de 2% a mineralização de 250 mg kg
-1
de antraceno no solo. Estes resultados
indicam que apesar das bactérias apresentarem rotas metabólicas que as
possibilitam transformar o antraceno em CO
2
, as baixas taxas de mineralização
observadas no solo (e também no meio mineral) podem estar relacionadas a
baixa solubilidade deste HAP em água e a conseqüente limitação à absorção
pelas células bacterianas. Weigand et al. (2002) estudando o balanço de C em
solo contaminado com antraceno observou que somente 6% deste HAP foi
metabolizado, sendo que a metade deste valor foi transformado a CO
2
e a
outra metade permaneceu no solo na forma de intermediários do metabolismo.
O autor concluiu que baixa biodisponibilidade é o principal limitante para a
mineralização do antraceno no solo.
Os resultados do experimento não confirmam a hipótese de que a
biodisponibilidade limita a mineralização do antraceno pois, a inoculação ao
solo do consórcio microbiano resultou em produção de C-CO
2
aproximadamente 312% maior que a média da produção observada quando o
fungo ou os isolados bacterianos foram inoculados separadamente,
demonstrando que a baixa mineralização não estava associado a
biodisponibilidade do antraceno, mas sim a limitada capacidade metabólica das
bactérias e do fungo em mineralizarem o antraceno separadamente.
Este grande aumento da mineralização pelo consórcio pode estar
relacionado a presença de complementaridade metabólica entre seus
membros. Entre os poucos estudos relatados na literatura que utilizaram
consórcios microbianos para a degradação de HAPs pode se destacar o de
101
Boonchan et al. (2000) que avaliou a mineralização de 50 mg kg
-1
do
benzo(a)pireno no solo pela bactéria Stenotrophomonas maltophilia, sendo
esta de 20% após 100 dias. A mineralização pelo fungo Penicillium janthinellum
neste mesmo solo por igual período de tempo foi nula. Já a inoculação destes
microrganismos na forma de consórcio resultou em mineralização superior a
40%. As análises dos intermediários do metabolismo por cromatografia nestes
ensaios tenderam a confirmar a hipótese de complementaridade metabólica,
onde o fungo metaboliza os passos iniciais da oxidação do benzo(a)pireno e
libera para o meio extracelular intermediários polares, que são convertidos em
CO
2
pela bactéria (Boonchan et al., 2000). Kotterman et al. (1998) verificaram
que o fungo Bjerkandera sp. BOS55 apresentou baixa capacidade de
mineralização do benzo(a)pireno, porém a adição ao solo do meio mineral na
qual o fungo crescia resultou em grande aumento da produção de CO
2
,
indicando que os metabólitos produzidos pelo fungo foram rapidamente
mineralizados pela população heterotrófica do solo. Assim, os resultados deste
trabalho também indicam para a presença de complementaridade metabólica
entre os membros do consórcio microbiano, cuja inoculação ao solo resultou
em grande aumento da produção de C-CO
2
se comparado a inoculação em
separado do fungo e das bactérias.
4.4.4 Concentrações de HAPs
A capacidade do consórcio microbiano em biorremediar o solo
contaminado com diferentes concentrações de HAPs foi avaliado através de 3
experimentos respirométricos. Observa-se nas Figuras 4, 5 e 6 que quanto
maior a concentração do HAP maior foi a produção de C-CO
2
, à exceção do
tratamento sem inóculo, indicando que o C-CO
2
originou-se da mineralização
do HAP pelo consórcio microbiano.
A fase de adaptação dos microrganismos inoculados para o início da
produção de C-CO
2
foi praticamente inexistente para o antraceno, sendo de 7
dias para o fenantreno e de 14 dias para o pireno, o que indica que apesar do
inóculo ter sido produzido no meio mineral com o mesmo HAP que seria
degradado no solo, o processo de enriquecimento pode ter selecionado os
microrganismos que utilizam mais facilmente o antraceno em relação aos
102
demais HAPs. O pireno apresentou a maior fase de adaptação provavelmente
por apresentar maior complexidade estrutural, sendo reconhecido na literatura
como de mais difícil degradação quando comparado aos HAPs de 3 anéis
aromáticos (Martens et al., 1999; Kanaly et al., 2000; Potin et al., 2004).
Tempo, dias
0 102030405060
C-CO
2
, mg kg
-1
de solo
0
200
400
600
800
1000
0
250
500
1000
1000 SI
FIGURA 4. Produção de C-CO
2
de um solo contaminado com diferentes
concentrações de antraceno (mg kg
-1
de solo), inoculado com o consórcio
microbiano ou sem inoculação (SI) (dados são médias de duas repetições;
barras representam o erro padrão).
103
Tempo, dias
0 102030405060
C-CO
2
, mg kg
-1
de solo
0
200
400
600
800
1000
0
250
500
1000
1000 SI
FIGURA 5. Produção de C-CO
2
de um solo contaminado com diferentes
concentrações de fenantreno (mg kg
-1
de solo), inoculado com o consórcio
microbiano ou sem inoculação (SI) (dados são médias de duas repetições;
barras representam o erro padrão).
104
Tempo, dias
0 10203040506070
C-CO
2
, mg kg
-1
de solo
0
200
400
600
800
1000
0
250
500
1000
1000 SI
FIGURA 6. Produção de C-CO
2
de um solo contaminado com diferentes
concentrações de pireno (mg kg
-1
de solo), inoculado com o consórcio
microbiano ou sem inoculação (SI) (dados são médias de duas repetições;
barras representam o erro padrão).
O consórcio microbiano mineralizou elevadas porcentagens dos 3 HAPs
(Tabela 1) em períodos de tempos relativamente curtos, se comparado a outros
experimentos. Kastner et al. (1998) observaram que a degradação de 25 mg
kg
-1
de antraceno no solo havia sido completada aos 65 dias. A mineralização
de 10 mg kg
-1
de fenantreno no solo foi estabilizada aos 100 dias após o início
do experimento (Nam et al., 1998) e a degradação de 100 mg kg
-1
do pireno no
solo ainda não se encontrava completamente estabilizada após 90 dias de
incubação (Ravelet et al., 2001). Houve também um efeito da concentração de
HAP no solo, sendo que quanto menor esta concentração mais rapidamente a
produção de C-CO
2
foi estabilizada. Pode-se observar que a redução da taxa
de mineralização na concentração de 250 mg kg
-1
ocorreu próximo aos 30 dias
para o antraceno e o pireno, sendo que para o fenantreno, o tempo de
estabilização foi ainda menor, próximo dos 15 dias. Quando o solo encontrava-
105
se com 1000 mg kg
-1
a mineralização foi estabilizada ao final do período de
experimento, à exceção somente do fenantreno que a partir dos 30 dias não
apresentou produções significativas de C-CO
2
, indicando que apesar deste
HAP ter apresentado uma fase de adaptação de 7 dias, superior a do
antraceno, as taxas iniciais de mineralização foram elevadas.
TABELA 1. Mineralização das diferentes concentrações dos HAPs, no solo
inoculado com o consórcio microbiano ou sem inoculação (SI), ao final dos
experimentos respirométricos (dados são médias de três repetições ± erro
padrão).
Concentração Porcentagem de Mineralização
(mg kg
-1
) Antraceno Fenantreno Pireno
0
0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00 0,00 ± 0,00
250
100,00 ± 0,00 58,81 ± 2,57 80,32 ± 6,34
500
70,97 ± 8,99 58,80 ± 1,49 84,09 ± 3,69
1000
90,63 ± 2,79 83,33 ± 1,34 75,69 ± 3,39
1000 SI
3,91 ± 2,00 19,89 ± 1,51 0,00 ± 0,00
Na presença de 250 mg kg
-1
de antraceno a mineralização foi de 100%.
Este elevado valor pode indicar que em vista da estabilização da produção do
C-CO
2
aos 30 dias, pode ter ocorrido até o final do experimento, a morte e a
mineralização da biomassa formada a partir da utilização deste substrato,
resultando nesta elevada porcentagem. Estudos da mineralização do antraceno
no solo são relativamente raros, entretanto trabalhos com o fenantreno têm
também apresentado altas porcentagens de produção de C-CO
2
. Ortiz et al.
(2003) quantificaram em 87% a mineralização de 1000 mg kg
-1
do fenantreno
no solo após 8 dias de incubação.
Para o antraceno, a concentração de 500 mg kg
-1
teve a menor
porcentagem de mineralização, porém apresentou o maior erro padrão,
indicando que esta baixa produção de C-CO
2
pode estar associado a
diferenças no valor quantificado entre as repetições. Na concentração de 1000
mg kg
-1
houve mineralização de 90,63% do antraceno, o que demonstra que o
consórcio microbiano apresentou elevada atividade de mineralização, pois
metabolizou altas quantidades de HAPs em um período de tempo
106
relativamente curto. Se comparada a presença e a ausência do consórcio
microbiano na concentração de 1000 mg kg
-1
, verifica-se que a inoculação de
microrganismos com reconhecida capacidade de degradação do antraceno
aumentou em 2317% a produção de C-CO
2
em 60 dias, o que se mantida as
taxas de mineralização, representa uma redução de 367 dias no tempo de
biorremediação deste solo.
Apesar da mineralização do fenantreno ter sido estabilizada em menor
período de tempo que a dos demais HAPs e da eliminação deste HAP do solo
ao final do experimento, a mineralização média na presença do consórcio foi a
mais baixa, de 67% (Tabela 1), conseqüência da baixa produção de C-CO
2
nas
concentrações de 250 e 500 mg kg
-1
. Assim, a rápida estabilização da
mineralização do fenantreno nestas concentrações deve-se principalmente a
baixa porcentagem do HAP que foi mineralizada em comparação ao antraceno
e ao pireno. Concomitantemente a isto, observa-se que na concentração de
1000 mg kg
-1
a microbiota autóctone do solo mineralizou aproximadamente
20% do fenantreno, sendo esta produção muito superior aquela observada
para os demais HAPs. Além disso, a mineralização do fenantreno pela
microbiota autóctone não foi resultado de um processo adaptativo, pois a partir
do 7º dia já se observa-se uma alta taxa de mineralização, indicando que este
composto foi mais facilmente reconhecido e degradado pelas enzimas dos
microrganismos autóctones do solo. Este comportamento pode ser
conseqüência da maior solubilidade em água e conseqüentemente da maior
biodisponibilidade do fenantreno no solo.
Assim, esta capacidade de metabolização do fenantreno pela microbiota
nativa do solo pode ter estabelecido com o consórcio microbiano maior
competição pela utilização de fontes de C e energia no solo, ou seja, parte
deste HAP pode ter sido utilizado pelo consórcio e parte pelos microrganismos
autóctones do solo, sendo que estes podem apresentar menor capacidade de
transformar o fenantreno em CO
2
que a população inoculada, resultando em
acúmulo de intermediários do metabolismo no solo, reduzindo assim as
porcentagens de mineralização. A menor capacidade de mineralização da
microbiota autóctone em relação ao consórcio microbiano pode ser
comprovado ao compararmos a produção de C-CO
2
no solo contaminado com
1000 mg kg
-1
, onde a presença dos microrganismos inoculados aumentou em
107
419% a mineralização do fenantreno. O decréscimo da concentração de
fenantreno e o acúmulo de metabólitos resultantes da degradação pela
microbiota do solo foi reportado por Andersson et al. (2003), que num estudo
de 12 semanas verificou o acúmulo de 9-fluorenona e benz(a)antraceno-7,12-
diona no solo, ambos identificados como metabólitos fúngicos.
O pireno também foi eliminado do solo na quase totalidade, sendo
mineralizado pelo consórcio microbiano numa alta porcentagem, média de
80%, indicando que apesar de se tratar de um HAP de alto peso molecular, os
microrganismos do consórcio mineralizaram altas quantidades,
independentemente da concentração adicionada ao solo. A dificuldade em
degradar este HAP pode ser verificada pela incapacidade da microbiota
autóctone do solo em mineralizar este composto.
Os resultados da cromatografia gasosa mostram que ao final dos
experimentos respirométricos as quantidades remanescentes dos HAPs no
solo foram muito baixas (Tabela 2). Para o antraceno e o fenantreno observa-
se que independentemente das concentrações, o consórcio microbiano
degradou mais de 99% das quantidades inicialmente adicionadas ao solo. O
pireno apresentou as maiores quantidades remanescentes no solo ao final do
experimento respirométrico, principalmente nas concentrações de 250 e 1000
mg kg
-1
. Entrentanto, ao convertermos estas quantidades para porcentagens,
verificamos que a exemplo do antraceno e do fenantreno, o pireno também foi
eficientemente degradado no solo pelo consórcio microbiano, resultando em
degradações maiores que 92%. Além disso, há que se considerar que o pireno
é de mais difícil degradação se comparado ao antraceno e ao fenantreno, por
apresentar 4 anéis aromáticos na sua fórmula estrutural, demonstrando que o
consórcio microbiano degradou eficientemente altas concentrações dos 3
HAPs no solo, resultando na rápida eliminação dos contaminantes do
ambiente. Outros autores também observaram altas taxas de biodegradação
destes HAPs no solo. Kastner; Mahro (1996) verificaram que as 100 mg kg
-1
do
antraceno e do pireno do solo foram degradadas após 50 dias de incubação. O
pireno, na concentração de 250 mg kg
-1
, também foi eficientemente degradado
após 30 dias da inoculação ao solo da bactéria Stenotrophomonas maltophilia
(Boonchan et al., 2000).
108
TABELA 2. Concentrações e porcentagens de degradação do antraceno,
fenantreno e pireno no solo após o final dos experimentos respirométricos.
Concentração Antraceno Fenantreno
Pireno
(mg kg
-1
) mg kg
-1
% mg kg
-1
%
mg kg
-1
%
0
0
0 0 0 0 0
250
0,85
99,66
1,69 99,32 19,63 92,15
500
3,35 99,33 1,44 99,71 2,91 99,42
1000
6,46 99,36 3,10 99,69 37,26 96,27
Ao nosso conhecimento a única legislação brasileira que trata da
contaminação de HAPs no solo é a da CETESB (Companhia de Tecnologia de
Saneamento Ambiental do Estado de São Paulo), ainda assim, há limites
definidos somente para o naftaleno, que é um composto de 2 anéis aromáticos
que apresenta solubilidade em água (31,7 mg L
-1
) e volatilidade relativamente
altas, o que resulta em uma dinâmica no solo diferente daquela observada para
os demais HAPs de 3 ou mais anéis aromáticos (Allard et al., 2000;
Verschueren, 2001). Assim, considerando-se a Lista Holandesa de Valores de
Qualidade do Solo e da Água Subterrânea (CETESB, 2005), observa-se que o
solo deste experimento apresentou concentrações iniciais muita acima dos
valores de intervenção estipulados por esta legislação, que é de 40 mg kg
-1
,
indicando que o solo apresentava-se altamente contaminado. Mesmo assim, o
consórcio microbiano reduziu em curto período de tempo as concentrações do
antraceno, do fenantreno e do pireno, na concentração de 500 mg kg
-1
, para
valores próximos ao de referência, que é de 1,0 mg kg
-1
, e bem abaixo do valor
de alerta que é de 20,5 mg kg
-1
, indicando que o processo de biorremediação
foi eficiente, principalmente se considerarmos as altas concentrações iniciais
de HAPs presentes no solo.
A eficiência dos microrganismos heterotróficos do solo em utilizarem um
determinado substrato para a produção de material celular é dependente das
populações microbianas predominantemente envolvidas com a degradação, da
quantidade e qualidade deste substrato, no que se refere a sua recalcitrância.
Um valor médio que freqüentemente é utilizado na literatura é de que 35% do C
metabolizado é utilizado nas rotas anabólicas para a produção de biomassa e
que 65% é utilizado para a produção de energia, sendo transformado em CO
2
109
(Sylvia et al., 2000). As porcentagens de mineralização dos 3 HAPs são
apresentadas na Tabela 1. Na presença do consórcio microbiano a
mineralização média do antraceno foi de 87%, do fenantreno de 67% e do
pireno de 80%. Assim, considerando-se o desaparecimento quase que total
dos HAPs no solo e estas elevadas porcentagens de mineralização, poder-se-
ia supor que a diferença entre o C adicionado e o quantificado na forma de CO
2
encontra-se na biomassa microbiana, indicando que a inoculação ao solo do
consórcio microbiano proporcionou um processo de biorremediação efetivo e
rápido.
Nestes 3 experimentos, foi comprovada a capacidade do consórcio
selecionado em biorremediar o solo contaminado, não-estéril, com diferentes
concentrações de antraceno, fenantreno e pireno, e em curto período de
tempo, evidenciando que no caso de uma contaminação acidental de HAPs
neste solo, a bioaumentação seria uma prática a ser considerada para
aumentar as taxas de mineralização, promovendo um processo de
biorremediação seguro, onde haveria a eliminação da grande maioria dos
contaminantes e em curto período de tempo.
110
4.5 CONCLUSÕES
1) A microbiota autóctone do solo Itapuã apresenta nula ou baixa
capacidade de mineralização do antraceno, do fenantreno e do pireno presente
no solo;
2) Os isolados bacterianos e o fungo, membros do consórcio microbiano,
se inoculados separadamente ao solo, apresentam baixas porcentagens de
mineralização do antraceno quando comparado a inoculação conjunta na forma
de consórcio;
3) O consórcio microbiano mineraliza altas porcentagens das diferentes
concentrações de antraceno, fenantreno e pireno presentes no solo, o que
resulta em grande aumento da mineralização se comparada a microbiota
autóctone do solo;
4) O consórcio microbiano degrada a quase totalidade das diferentes
concentrações de antraceno, fenantreno e pireno presentes no solo e em curto
período de tempo;
5) No caso da contaminação do solo Itapuã por antraceno ou fenantreno
ou pireno, a bioaumentação é uma prática recomendada para aumentar as
taxas de mineralização e promover um processo de biorremediação completo e
rápido.
111
4.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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CAPÍTULO IV
MINERALIZAÇÃO DO ANTRACENO NO SOLO EM DIFERENTES
CONDIÇÕES QUÍMICAS E FÍSICAS
115
5.1 RESUMO
Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) podem ser
eliminados do ambiente através da biorremediação, cuja eficiência é limitada se
as condições do solo não forem favoráveis a sobrevivência e a atividade dos
microrganismos degradadores destes contaminantes. O objetivo do presente
estudo foi avaliar a influência do pH, da disponibilidade de água, de nitrogênio,
de fósforo, de ferro e de enxofre, na biorremediação de um solo contaminado
com antraceno. Avaliou-se o efeito de doses (kg ha
-1
)
de nitrogênio (0, 50, 100,
200 e 400), de fósforo (0, 50, 100 e 200), de ferro (0, 15, 30 e 60) e de enxofre
(0, 10, 20, 40), além de diferentes pH (4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5 e 7,0) e umidades
gravimétricas (1,25; 2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 12,5%) na mineralização do antraceno
no solo, que foi quantificada por respirometria. Para isto, inoculou-se um
consórcio microbiano comprovadamente degradador deste HAP em um solo
arenoso contaminado em laboratório com 500 mg kg
-1
de antraceno. As
maiores mineralizações do antraceno ocorreram nos solos com as maiores
umidades gravimétricas e pH avaliados. A adição de 100 kg ha
-1
ou mais de
nitrogênio no solo e a conseqüente redução da relação C:N para valores
inferiores a 67:1 diminuíram a mineralização do antraceno. O aumento da
disponibilidade do fósforo, do ferro e do enxofre e a presença de amplas
relações C:P (1076:1 a 50:1) e C:N:P (1076:16:1 a 50:1,3:1) no solo não
influenciaram a mineralização do antraceno. Na presença de microrganismos
degradadores, a bioestimulação teve efeitos positivos na biorremediação de
solos contaminados com antraceno, mas deve ser recomendada somente após
a avaliação específica da necessidade de adição de cada um dos nutrientes e
corretivos.
116
5.2 INTRODUÇÃO
Os hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) são compostos com
reconhecidas propriedades mutagênicas e carcinogênicas, tendo sido relatados
inúmeros casos de câncer no pulmão, intestino, fígado, pâncreas e na pele,
devido a presença destes compostos (Netto et al., 2000). A contaminação do
solo pelos HAPs pode ocorrer em derrames e vazamentos acidentais do
petróleo e seus derivados, pela adição proposital visando o tratamento de
resíduos gerados por refinarias, postos de combustíveis e indústrias
petroquímicas, em centros urbanos devido a geração de fuligem pelos motores
veiculares e em áreas industriais com atividades relacionadas a petroquímica.
Em vista da complexidade estrutural destes HAPs, da sua baixa
solubilidade em água e forte tendência de sorção à fase sólida do solo, estes
compostos não são degradados pela maioria dos microrganismos, o que
aumenta sua permanência no ambiente e a possibilidade de exposição dos
Homens e animais. Uma alternativa para eliminação dos HAPs do solo é
através da biorremediação, onde os microrganismos degradadores irão
transformá-los em substâncias inertes, CO
2
e água.
A biorremediação pode ser limitada se as condições do solo não forem
favoráveis a sobrevivência e a atividade dos microrganismos degradadores. A
adequada disponibilidade de água no solo é considerado por Haider (1999) o
fator ambiental mais crítico para a biodegradação, pois uma alta atividade
microbiana somente ocorrerá se houver grande disponibilidade de água aos
microrganismos. Além disto, o teor de água no solo tem relação direta e inversa
com a disponibilidade de oxigênio e conseqüentemente, com a atividade dos
microrganismos aeróbicos que são os principais responsáveis pela degradação
dos HAPs.
117
O pH do solo afeta diretamente a atividade dos microrganismos através
dos efeitos dos íons H
+
na permeabilidade celular e na atividade enzimática,
assim como indiretamente pela influência na disponibilidade de macro e
micronutrientes, e na solubilidade do alumínio e dos metais pesados, que
podem ser tóxicos aos microrganismos. Em vista de que os fungos crescem em
pH mais ácidos que as bactérias, a inoculação ao solo de um consórcio
composto por estes dois grupos de microrganismos demanda a determinação
do pH ótimo de atividade de degradação.
Em ambientes naturais, o nutriente que normalmente limita o
crescimento microbiano é o C, sendo que os nutrientes inorgânicos estão
presentes em quantidades que normalmente excedem as demandas das
comunidades microbianas (Alexander, 1999). No entanto, a presença de
elevadas concentrações de HAPs no solo com potencial para serem utilizados
como substrato para o crescimento dos microrganismos pode fazer com que
outros nutrientes que não o C se tornem limitantes. Uma relação C:N:P de
100:10:1 tem sido normalmente recomendada no solo a ser biorremediado
(Cheng; Mulla, 1999; Sadowsky; Turco, 1999). No entanto, várias pesquisas
que avaliaram os efeitos da adição de N e P ao solo demonstraram resultados
muito conflitantes, indicando que esta relação pode não ser a mais adequada
(Dible; Bartha, 1979; Zhou; Crawford, 1995; Atagana et al., 2003; Leys et al.,
2005).
Outro nutriente que pode influenciar a degradação dos HAPs no solo é a
disponibilidade do ferro. Isto porque, este elemento desempenha funções
celulares que estão intimamente relacionadas ao metabolismo dos HAPs, como
a participação na estrutura das enzimas do sistema multicomponente das
dioxigenases e participação como cofator enzimático nas enzimas de fissão
(Harayama, 1999). A possível limitação deste elemento aos microrganismos
pode ocorrer porque os óxidos de ferro apresentam baixa solubilidade em
ambientes aeróbicos, sendo que a concentração do ferro na solução do solo
pode ser menor que 10
-18
M (Andrews et al., 2003). A adição de fontes solúveis
de ferro ao meio de cultura (0,1 mM de Fe(NO
3
)
3
) aumentou o crescimento dos
três isolados de Pseudomonas que utilizavam separadamente vários
hidrocarbonetos, além de aumentar em 13%, na média, a degradação do
antraceno e de estimular a produção de biossurfactantes em um destes
118
isolados. Além disso, a mineralização do antraceno no solo foi aumentada com
a adição de 50 g kg
-1
de Fe
2
O
3
(Santos, 2004).
O enxofre é outro elemento que está envolvido no metabolismo
microbiano dos HAPs, isto porque é parte integrante do sistema
multicomponente das dioxigenases, na forma de complexos ferro-enxofre. No
solo, o enxofre encontra-se quase que totalmente associado à biomassa viva
ou morta e desta forma, pode não estar prontamente disponível ou não ser
quantitativamente suficiente para suportar uma alta demanda pela população
degradadora do solo, quando da adição de HAPs ao solo. Liebeg; Cutright
(1999) observaram maior mineralização dos HAPs no solo quando o enxofre
havia sido adicionado em maiores quantidades em relação aos demais
nutrientes.
O antraceno é um HAP que devido a sua menor toxicidade em relação
aos demais tem sido utilizado como modelo nos estudos da dinâmica destes
compostos no ambiente (Weigand et al., 2002). Assim, o objetivo do presente
estudo foi avaliar a influência do pH e da disponibilidade de água, de
nitrogênio, de fósforo, de ferro e de enxofre na biorremediação de um solo
contaminado com do antraceno.
119
5.3 MATERIAL E MÉTODOS
5.3.1 Solo e inóculo
O solo utilizado em todos os experimentos, pertence a Unidade de
Mapeamento Itapoã (Argissolo Vermelho-Amarelo distrófico arênico) e foi
coletado em uma área agrícola, sem histórico de recebimento de nenhum tipo
de resíduo. A análise química deste solo é apresentada na Tabela 1. No
laboratório, o solo foi seco e peneirado em malha de 2 mm. Para elevar o pH a
6,5, adicionou-se CaCO
3
e MgCO
3
na proporção 3:1, na forma de reagente
comercial, incubando-se o solo úmido por 60 dias. Posteriormente, este solo foi
contaminado em laboratório com 500 mg kg
-1
de antraceno. Para isto,
preparou-se uma solução concentrada deste HAP dissolvido em acetona
(8,333 mg mL
-1
), que foi adicionada a 50 g de solo no interior de frascos
respirométricos. Estes frascos foram colocados em estufa por 3 horas a 50 °C
para evaporação da acetona. Após adicionou-se mais 50 g de solo,
procedendo-se uma intensa mistura. Devido a baixa fertilidade natural, 0,5 mL
da solução de micronutrientes do meio mineral Tanner foram adicionadas às
100 g de solo. As adições de N, P, Fe e S foram realizadas de acordo com
cada experimento.
120
TABELA 1. Análise química do solo Itapoã.
Atributo Valores Interpretação
1
Argila (g kg
-1
) 90,0 Classe 4
pH (H
2
O) 4,7 Muito baixo
Índice SMP 6,9 -
P (mg dm
-3
) 3,3 Muito baixo
K (mg dm
-3
) 20,0 Baixo
MO (g kg
-1
) 9,0 Baixo
Al trocável (cmol
c
dm
-3
) 0,2 -
Ca trocável (cmol
c
dm
-3
) 0,4 Baixo
Mg trocável (cmol
c
dm
-3
) 0,2 Baixo
S (mg dm
-3
) 3,4 Médio
Fe (g dm
-3
) 0,2 -
Al+H (cmol
c
dm
-3
) 1,6 -
CTC
pH 7,0
(cmol
c
dm
-3
) 2,2 Baixo
Saturação de bases (%) 29,0 Muito baixo
Saturação de Al (%) 8,9 Baixo
1
Conforme Comissão... (2004).
Após o solo estar corrigido, contaminado com antraceno e fertilizado, foi
inoculado com um consórcio microbiano que em ensaios anteriores apresentou
a capacidade de degradar e mineralizar este HAP no solo. Este consórcio é
composto por 6 bactérias, identificadas como Mycobacterium fortuitum, Bacillus
cereus, Microbacterium sp., Gordonia polyisoprenivorans, Microbacteriaceae
bacterium e Naphthalene-utilizing bacterium, e um fungo, Fusarium oxysporum.
Adicionou-se 2 mL de uma suspensão de células do consórcio, de forma a
introduzir uma população de 2,0 x 10
8
UFC g
-1
de solo (Kastner et al., 1998).
Para obtenção desta suspensão de células, 100 µL de uma cultura do
consórcio microbiano que havia crescido em meio mineral mais 250 mg kg
-1
de
antraceno foi inoculada em ágar nutriente contendo 250 mg L
-1
deste HAP e
incubada a 30 °C por 72 horas. Após o crescimento das colônias, foi
adicionado sobre o meio 5 mL de água estéril e como o auxílio de uma alça de
Drigalsky, as colônias foram coletadas para tubos e a suspensão foi
centrifugada a 10000 rpm, por 8 minutos a 15 °C. Descartava-se o
121
sobrenadante e ressuspendia-se o pellet numa quantidade previamente
calculada de água estéril, sendo então a suspensão adicionada ao solo no
interior dos frascos respirométricos.
5.3.2 Condições químicas e físicas
O efeito da umidade do solo na mineralização do antraceno foi avaliado
em um experimento com 7 tratamentos, que corresponderam as seguintes
umidades gravimétricas (Ug%): 1,25; 2,5; 5,0; 7,5; 10,0; 12,5 e 10,0 sem
inoculação (SI) do consórcio microbiano. O solo foi fertilizado com o
equivalente a 100 kg ha
-1
de N, 50 kg ha
-1
de P e 56 kg ha
-1
de Fe, na forma de
solução de NH
4
NO
3
, KH
2
PO
4
e Fe(NO
3
)
3
. Os frascos foram incubados com 4
repetições durante 54 dias. Semanalmente, por ocasião da titulação do C-CO
2
,
os frascos foram pesados e água destilada estéril era adicionada de forma a
manter a umidade constante.
A mineralização do antraceno no solo com diferentes pH foi avaliado em
um experimento respirométrico com 8 tratamentos, que corresponderam aos
seguintes pH: 4,5; 5,0; 5,5; 6,0; 6,5; 7,0; 7,5 e 6,5 sem inoculação (SI) do
consórcio microbiano. Para obtenção destes pH, o solo recebeu diferentes
quantidades de CaCO
3
e MgCO
3
na proporção 3:1, na forma de reagente
comercial e foi incubado úmido por 60 dias. O solo foi fertilizado com o
equivalente a 100 kg ha
-1
de N, 50 kg ha
-1
de P e 56 kg ha
-1
de Fe, na forma de
solução de NH
4
NO
3
, KH
2
PO
4
e Fe(NO
3
)
3
. Os frascos foram incubados com 3
repetições durante 56 dias.
O efeito do N na mineralização do antraceno no solo foi avaliado em um
experimento com 5 tratamentos, que equivaleram as doses de 0, 50, 100, 200
e 400 kg ha
-1
. O N foi adicionado ao solo na forma de uma solução de NH
4
NO
3
.
O solo foi ainda fertilizado com 50 kg ha
-1
de P e 56 kg ha
-1
de Fe, na forma de
solução de KH
2
PO
4
e FeSO
4
7H
2
O. Os frascos foram incubados com 4
repetições durante 62 dias. O N mineral do solo (NH
4
+
e NO
3
-
+ NO
2
-
) foi
determinado em cada uma das doses adicionadas pelo método de micro-
Kjeldahl conforme Tedesco et al. (1995). O C orgânico do solo foi quantificado
no Analisador de Carbono Orgânico Total (TOC-V CSH, Shimadzu, Japão). A
força iônica foi calculada a partir da equação descrita em Sparks (1995):
122
FI = 0,0127CE (1)
onde FI é a força iônica (M) e CE é a condutividade elétrica (dS m
-1
),
determinada diretamente no solo pelo método do extrato de saturação na
relação 1:5, conforme Tedesco et al. (1995).
A mineralização do antraceno no solo com diferentes teores de P foi
avaliado em um experimento respirométrico com 5 tratamentos, que
corresponderam as doses, em kg ha
-1
, de 0, 50, 100, 200 e 50 sem inoculação
(SI) do consórcio microbiano. O P foi adicionado ao solo na forma de uma
solução de KH
2
PO
4
. O solo foi ainda fertilizado com 50 kg ha
-1
de N e 56 kg ha
-
1
de Fe, na forma de solução de NH
4
NO
3
, e FeSO
4
7H
2
O. Os frascos foram
incubados com 4 repetições durante 34 dias. O P extraível presente no solo de
cada um dos tratamentos foi determinado pelo método Mehlich-1, conforme
Tedesco et al. (1995).
O efeito do Fe na mineralização do antraceno no solo foi avaliado em um
experimento com 5 tratamentos, que equivaleram as doses, em kg ha
-1
, de 0,
15, 30, 60 e 60 sem inoculação (SI) do consórcio microbiano. O Fe foi
adicionado ao solo na forma de uma solução de FeSO
4
7H
2
O. O solo foi ainda
fertilizado com 50 kg ha
-1
de N e 50 kg ha
-1
de P, na forma de solução de
NH
4
NO
3
e KH
2
PO
4
. Os frascos foram incubados com 4 repetições durante 50
dias. Em cada um dos tratamentos, o Fe amorfo do solo foi determinado
conforme Tedesco et al. (1995).
A mineralização do antraceno no solo com diferentes teores de S foi
avaliado em um experimento respirométrico com 5 tratamentos, que
corresponderam as doses, em kg ha
-1
, de 0, 10, 20, 40 e 20 sem inoculação
(SI) do consórcio microbiano. O S foi adicionado ao solo na forma de uma
solução de K
2
SO
4
. O solo foi ainda fertilizado com 50 kg ha
-1
de N, 50 kg ha
-1
de P e 56 kg ha
-1
de Fe, na forma de solução de NH
4
NO
3
, KH
2
PO
4
e Fe(NO
3
)
3
.
Os frascos foram incubados com 4 repetições durante 48 dias. O S do solo de
cada um dos tratamentos foi determinado conforme Tedesco et al. (1995).
5.3.3 Análise respirométrica
Os frascos respirométricos (1,5 L) com o solo já inoculado foram
equipados com aparato de captura de CO
2
, composto por um frasco de 50 mL
123
com 20 mL de NaOH 0,25 M, fechados hermeticamente e incubados a
temperatura ambiente no Laboratório. Semanalmente os frascos foram abertos,
a solução de NaOH recebia um mL de BaCl
2
1 M e foi titulada com HCl 0,5 M,
utilizando fenoftaleína como indicador. A solução do HCl 0,5 M foi padronizada
com tris, conforme Tedesco et al. (1995). Uma amostra com umidade igual ao
solo dos frascos respirométricos foi utilizada para determinação da umidade
gravimétrica, sendo a produção de C-CO
2
expressa em kg de solo seco.
A produção de C-CO
2
foi quantificada através da fórmula de Stotzky
(1965):
C-CO
2
(mg kg
-1
de solo) = (B-T) x eq x M x 10 (2)
onde B é o volume (em mL) da solução de HCl gasto para titular a prova em
branco (frasco respirométrico sem solo); T é o volume (em mL) da solução de
HCl gasto para titular os tratamentos; eq é o equivalente-grama do C, que é 6;
M é a molaridade da solução padronizada de HCl e 10 é o fator de conversão
para kilograma de solo.
5.3.4 Análise estatística
O erro padrão foi calculado pela fórmula
))(1(
11
2
yy
m
s
n
i
nn
yis
−
∑∑
==
onde, s = número
da série; i = número do ponto na série s; m = número de séries para o ponto y
no gráfico; n = número de pontos em cada série; y
is
= valor de dados da série s
e ponto i; e n
y
= número total de valores de dados em todas as séries.
124
5.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
O efeito da umidade gravimétrica do solo (Ug) na mineralização do
antraceno no solo é apresentado na Figura 1. Observa-se que quanto maior a
umidade maior a produção de C-CO
2
, o que confirma a afirmação de Haider
(1999) segundo a qual em condições de alta disponibilidade de substrato, os
solos têm água disponível insuficiente para suportar alta atividade microbiana.
Neste caso, em vista do experimento ter sido conduzido em laboratório e do
fornecimento de condições adequadas aos microrganismos no que se refere a
nutrientes inorgânicos, temperatura, disponibilidade de fonte de C e outros, a
umidade do solo mostrou-se como um fator limitante para a atividade de
mineralização do antraceno pelo consórcio microbiano, obtendo-se uma
relação linear positiva (R
2
de 0,85 com significância de 1% de probabilidade)
entre Ug e porcentagem de mineralização no solo inoculado.
125
Tempo, dias
0 102030405060
C-CO
2
, mg kg
-1
de solo
0
100
200
300
400
500
1,25
2,5
5,0
7,5
10,0
12,5
10,0 SI
FIGURA 1. Produção de C-CO
2
de um solo com diferentes umidades
gravimétricas (%), contaminado com antraceno e inoculado ou não (SI) com um
consórcio microbiano (dados são médias de quatro repetições; barras
representam o erro padrão).
A menor mineralização do antraceno no solo com as menores Ug pode
estar relacionada ao prolongamento da fase de adaptação no início do
experimento. Para as Ug de 1,25 e 2,5% o início da produção de C-CO
2
ocorreu respectivamente, aos 28 e 14 dias, enquanto que para os demais
tratamentos inoculados, a fase de adaptação teve duração de somente 7 dias.
Observa-se desta maneira que a fase de adaptação do consórcio microbiano
no solo foi tanto maior quanto menor a disponibilidade de água. No entanto, há
que se destacar que mesmo nas menores Ug o consórcio buscou a adaptação
e iniciou a produção de C-CO
2
, mineralizando o antraceno em porcentagens
bem maiores que as da microbiota autóctone do solo em condições de alta
disponibilidade de água, demonstrando desta forma uma característica
importante a ser considerada na seleção dos microrganismos a ser utilizados
126
na bioaumentação, que é a capacidade de superar as limitações impostas pelo
ambiente a ser biorremediado.
Com as umidades utilizadas neste experimento, não foi possível verificar
a redução na produção de C-CO
2
pelo excesso de água no solo, que afetaria a
disponibilidade de oxigênio para os microrganismos aeróbicos degradadores do
antraceno. No tratamento com umidade de 12,5% o solo se encontrava
visualmente saturado de água, o que indicava uma condição de anaerobiose.
No entanto, devido provavelmente ao tipo de solo (arenoso), a quantidade de
solo utilizada nos frascos respirométricos (100 g) e a destruição dos agregados
pelos procedimentos anteriores ao início do experimento, esta alta quantidade
de água não impediu o fluxo de oxigênio, o que possibilitou nas maiores Ug a
ocorrência simultânea de alta disponibilidade de água e de ar, o que resultou
em maior atividade de mineralização do antraceno. Bartha (1986) também
verificou que a biodegradação de hidrocarbonetos no solo foi inibida em 66%
da capacidade de campo, sendo que a maior atividade degradativa ocorreu em
100% da capacidade de campo.
Há ainda que se considerar que a maior produção de C-CO
2
nos
tratamentos com maior umidade pode ser em parte conseqüência da maior
biodisponibilidade do antraceno. Nos solos com maior conteúdo de água,
grande parte das superfícies dos minerais e das moléculas de matéria orgânica
estão formando pontes de H com a água, o que impede a sorção dos HAPs e
conseqüentemente aumenta a biodisponibilidade destes compostos. Karimi-
Lotfabad et al. (1996) demonstraram que quanto maior a umidade do solo
maior foi a recuperação de antraceno do solo por solventes orgânicos, o que
segundo os autores se deveu a menor sorção na fase sólida. Assim, a maior
produção de C-CO
2
nos solos com maiores umidades pode ser devido a
ocorrência conjunta de alta disponibilidade de água, de oxigênio e de antraceno
para o consórcio microbiano.
A mineralização do antraceno pelo consórcio microbiano no solo com
diferentes pH é apresentado na Figura 2. Observa-se que quanto maior o pH,
maior foi a produção de C-CO
2
, indicando ser este um fator ambiental a ser
considerado na biorremediação do solo, apesar dos poucos estudos na
literatura especializada. No pH natural do solo Itapoã (4,5) houve total inibição
da mineralização do antraceno, mesmo sendo o solo fertilizado com N, P, K, S
127
e micronutrientes, e inoculado por um consórcio microbiano que apresenta alta
capacidade de mineralizar este composto. No caso de uma contaminação por
HAPs neste solo, a bioestimulação visando a correção do pH seria um prática
recomendada, que no entanto, deveria ser complementada pela
bioaumentação, pois somente a elevação do pH a 6,5 não resultou em
aumento significativo da mineralização do antraceno, conforme demonstrado
pelo tratamento 6,5 SI. Isto demonstra que a mineralização do antraceno no
solo deveu-se a presença do consórcio microbiano e que a atividade deste
esteve intimamente relacionada ao pH do solo, havendo uma relação linear
positiva (R
2
de 0,86 com significância de 1% de probabilidade) entre pH e
porcentagem de mineralização no solo inoculado.
Tempo, dias
0204060
C-CO
2
, mg kg
-1
de solo
0
100
200
300
400
500
4,5
5,0
5,5
6,0
6,5
7,0
7,5
6,5 SI
FIGURA 2. Produção de C-CO
2
de um solo com diferentes pH, contaminado
com antraceno e inoculado ou não (SI) com um consórcio microbiano (dados
são médias de três repetições; barras representam o erro padrão).
Assim como nos tratamentos com menor umidade do solo, quando o pH
encontrava-se em 5,0 e 5,5 o consórcio microbiano apresentou maior fase de
128
adaptação, iniciando a produção de C-CO
2
aos 28 e aos 14 dias,
respectivamente, demonstrando novamente a capacidade do consórcio
microbiano em adaptar-se a uma condição ambiental adversa e promover a
degradação do contaminante.
Os efeitos do pH no metabolismo celular podem ser diretos, devido a
atividade do H
+
na permeabilidade celular e atividade enzimática, ou
indiretamente pela influência na disponibilidade de macronutrientes,
micronutrientes e nos metais pesados do solo. As maiores produções de C-
CO
2
nos tratamentos com pH 7,0 e 7,5, indicam que a atividade metabólica do
consórcio é sensível ao H
+
da solução do solo e que a redução da
disponibilidade dos micronutrientes Mn, Fe, B, Zn e Cu com o aumento do pH
do solo não influenciou a absorção destes pelas células dos microrganismos, o
que em parte pode ser devido a adição ao solo da solução de micronutrientes.
Além disso, a maior mineralização nos pH 7,0 e 7,5 pode ser conseqüência do
enriquecimento assim como dos demais procedimentos microbiológicos que
utilizaram meios de cultura com pH 7,0, de forma a selecionar um consórcio
microbiano neutrofílico.
Ao final do experimento avaliou-se novamente o pH do solo. Nos
tratamentos 5,5; 6,0; 6,5 e 7,0 houveram reduções de 0,7 ± 0,1 unidades de pH
em relação ao valor observado no início do experimento. Este comportamento
indica que a alta atividade de mineralização do antraceno verificada nestes
tratamentos foi acompanhada da produção e excreção de H
+
ou outros
metabólitos ácidos pela microbiota degradadora, resultando na redução
significativa do pH do solo, se considerado o curto período de 63 dias. Por se
tratar de um solo arenoso e com baixo teor de matéria orgânica, o solo Itapoã
apresenta baixa capacidade de tamponamento do pH, demandando pequenas
quantidades de calcário para a correção da acidez e por outro lado, permitindo
esta redução do valor do pH. Se um processo de biorremediação estivesse em
curso neste solo, o pH deveria ser monitorado com freqüência, e se necessário,
adições de pequenas quantidades de calcário deveriam ser feitas, visando
manter o pH próximo da neutralidade, condição que proporciona maior
atividade de mineralização do antraceno pelo consórcio microbiano.
O efeito do N do solo na mineralização do antraceno é apresentado na
Figura 3. Verifica-se que com o aumento da dose de N houve tendência de
129
redução da mineralização deste HAP. Após 60 dias, as maiores produções de
C-CO
2
foram quantificadas nos tratamentos de 0 e 50 kg ha
-1
. A adição de 100
ou 200 kg ha
-1
reduziu esta produção em 11% e em 26% na dose de 400 kg ha
-
1
, respectivamente. Este comportamento provavelmente se deve as altas
quantidades de N mineral, principalmente NO
3
-
+ NO
2
-
, presentes no solo no
início do experimento, conforme demonstrado pelo tratamento que não recebeu
N (Tabela 2), conseqüência da mineralização da matéria orgânica durante os
procedimentos de preparo do solo e incubação para correção do pH.
Tempo, dias
0 102030405060
C-CO
2
, mg kg
-1
de solo
0
100
200
300
400
500
0
50
100
200
400
FIGURA 3. Produção de C-CO
2
de um solo com diferentes doses de nitrogênio
(kg ha
-1
), contaminado com antraceno e inoculado com o consórcio microbiano
(dados são médias de quatro repetições; barras representam o erro padrão).
A inibição da degradação de HAPs pelo aumento da disponibilidade de
N no solo foi também reportado por outros autores. A inibição da degradação
do fenantreno em 2 solos pela adição de N foi observado por Johnson; Scow
(1999). Segundo estes autores, a adição de nutrientes inorgânicos pode inibir
130
a atividade dos microrganismos do solo, que estão adaptados as condições
oligotróficas deste ambiente. O aumento de 1000 vezes do nitrato do solo de
um biorreator líquido eliminou completamente a degradação do antraceno por
Mycobacterium, que segundo Lyes et al. (2005) deveu-se ao incremento da
força iônica da solução, que atingiu o elevado valor de 0,250. Em vista disto, foi
determinada a força iônica no solo Itapoã (Tabela 2). Observou-se que o
aumento da dose de N resultou em incremento da força iônica do solo, porém
os valores foram muito inferiores ao nível inibitório acima citado e semelhantes
aos determinados por Lyes et al. (2005) em outros solos, indicando que a força
iônica do solo Itapoã não foi responsável pela inibição da mineralização do
antraceno.
TABELA 2. Teor de amônio e nitrato+nitrito, relação C:N e força iônica no solo
contaminado com 500 mg kg
-1
antraceno e adicionado de diferentes doses de
nitrogênio (dados são médias de duas repetições).
Doses
(kg ha
-1
)
NH
4
+
(mg kg
-1
)
NO
3
-
+NO
2
-
(mg kg
-1
)
C:N
(mg)
Força Iônica
(M)
0
0,0 48,2 92:1
1
0,0018
50
7,5 58,5 67:1 0,0021
100
17,4 66,7 52:1 0,0025
200
33,5 83,0 38:1 0,0030
400
57,0 107,5 27:1 0,0043
1
Teor de C orgânico no solo de 4410 mg kg
-1
.
Na Tabela 2, observa-se a tendência de inibição da nitrificação devido
ao aumento da dose de N adicionada ao solo, com incrementos relativamente
maiores do amônio se comparado ao N mineral. Na dose zero, todo o N
mineral do solo encontrava-se na forma de NO
3
-
+NO
2
-
. Na dose de 50 kg ha
-1
,
o NH
4
+
representava menos de 13% do N mineral do solo, enquanto que na
dose de 400 kg ha
-1
esta proporção aumentou para 53%. Carmichael; Pfaender
(1997) observaram que as adições de N reduziram de 50 a 90% a
mineralização do pireno em 4 solos, sendo este comportamento observado
somente quando o NH
4
+
e não o
NO
3
-
era a fonte de N utilizada. Assim, a
possibilidade de inibição da atividade de degradação do antraceno pelo NH
4
+
131
do solo pode ter ocorrido, em vista da elevada quantidade de amônio nas
maiores doses de N avaliadas.
As relações C:N, em mg, resultantes da adição das 5 doses de N no solo
são apresentadas na Tabela 2. Verifica-se que todas foram superiores a
relação normalmente recomendada na literatura para a biodegradação de
resíduos no solo, que é de 10:1 em molar ou 8,6:1 em mg, havendo inclusive a
redução da produção de C-CO
2
a medida que as relações C:N do solo se
aproximavam daquela recomendada pela literatura. Para as condições deste
experimento, uma relação C:N do solo próxima a 67:1 foi o limite a partir do
qual adições de N resultaram em menores mineralizações do antraceno.
Atagana et al. (2003) também observaram que quanto menor a relação C:N do
solo, menor foi a degradação de vários HAPs no solo. Segundo estes autores,
a maior degradação foi obtida na maior relação avaliada, que foi de 25:1, sendo
que na menor relação C:N, 5:1, a degradação foi menor que aquela observada
no solo natural, onde esta relação foi de 1625:1. A inibição da degradação dos
HAPs no solo nas menores relações C:N foi relacionada toxicidade do N a
população dos microrganismos degradadores do solo uma vez que, na relação
C:N de 5:1 observou-se as menores contagens.
Desta forma, observa-se que a mineralização de uma alta porcentagem
de antraceno no solo e em curto período de tempo não demandou a adição de
N visando a redução da relação C:N, o que indica que a adição de fertilizantes
ao solo a ser biorremediado deve ser precedido de estudos visando determinar
as reais necessidades da bioestimulação.
O efeito de diferentes doses de P na mineralização do antraceno no solo
é apresentado na Figura 4. Apesar de que a adição de P resultou em aumentos
progressivos da produção de C-CO
2
, a diferença entre a dose 0 e a 200 kg ha
-1
foi de somente 5%, indicando que a disponibilidade do P não foi limitante à
mineralização do antraceno, uma vez que o consórcio microbiano mineralizou
altas porcentagens deste HAP (em média 77%) no curto período de tempo de
34 dias. Atagana et al. (2003) não observaram aumentos da degradação de
vários HAPs no solo pela adição de P. Carmichael; Pfaender (1997) também
não verificaram incrementos na mineralização do pireno pela adição de P em 3
solos.
132
Tempo, dias
0 5 10 15 20 25 30 35
C-CO
2
, mg kg
-1
de solo
0
100
200
300
400
0
50
100
200
50 SI
FIGURA 4. Produção de C-CO
2
de um solo com diferentes doses de fósforo (kg
ha
-1
), contaminado com antraceno e inoculado ou não (SI) com um consórcio
microbiano (dados são médias de quatro repetições; barras representam o erro
padrão).
As relações C:P dos 5 tratamentos são apresentadas na Tabela 3. O
consórcio microbiano mineralizou o antraceno em porcentagens muito
semelhantes, mesmo estando submetido a relações C:P muito diferentes, o
que indica, ao contrário do N, a ausência de qualquer efeito de limitação ou
toxicidade no solo pelas doses de P avaliadas. No tratamento sem adição de P,
a relação C:P foi 27 vezes superior a normalmente recomendada na literatura,
que é de 40:1 em mg, sem no entanto haver redução da produção do C-CO
2
.
As relações C:N:P da Tabela 3 apresentam grandes amplitudes, sem no
entanto influenciarem a produção de C-CO
2
(Figura 4). Resultados
semelhantes foram obtidos por Lyes et al. (2005) que observaram que os
microrganismos degradadores de HAPs podem crescer em condições de baixa
disponibilidade de nutrientes inorgânicos e em relações C:N:P que variaram de
133
120:3:3 até 120:130:14. Isto demonstra que independentemente das relações
C:N:P do solo, os microrganismos irão metabolizar os contaminantes, bastando
para isto que haja nutrientes inorgânicos em quantidades suficientes para
suprirem suas demandas e insuficientes para causarem efeitos tóxicos.
TABELA 3. Teor de fósforo, relação C:P e C:N:P no solo contaminado com 500
mg kg
-1
antraceno e adicionado de diferentes doses de fósforo (dados são
médias de três repetições).
Doses
(kg ha
-1
)
Teor
(mg dm
-3
)
C:P
(mg)
C:N:P
(mg)
0
4,1 1076:1
1
1076:16:1
50
21,8 220:1 220:3:1
100
42,1 105:1 105:1,5:1
200
88,0 50:1 50:1,3:1
1
Teor de C orgânico no solo de 4410 mg kg
-1
.
A falta de resposta ao incremento da disponibilidade de P neste solo que
apresenta teor natural muito baixo pode ser explicado da seguinte forma: a
contaminação com 500 mg kg
-1
de antraceno adiciona ao solo 472 mg kg
-1
de C
ao solo, sendo que na média dos 4 tratamentos inoculados, 331 mg kg
-1
de C
foram transformados em CO
2
e por diferença, 141 mg kg
-1
de C foram
incorporados na biomassa. Assumindo-se que o P representa 3% da massa
seca da célula microbiana, houve a incorporação na biomassa de somente 4,23
mg kg
-1
de P, sendo que o teor natural de P neste solo é de 4,1 mg dm
-3
.
Assim, a demanda de P pelos microrganismos foi tão baixa que mesmo neste
solo não houve a necessidade da adição de P.
Estes resultados indicam que a bioestimulação com P deve ser
recomendada somente após criteriosa avaliação de forma a evitar a adição
desnecessária de nutrientes que resultam em aumentos de custo e impactos
ambientais ainda maiores no local a ser biorremediado.
A produção de C-CO
2
de um solo contaminado com antraceno onde foi
adicionado de diferentes doses de Fe é apresentada na Figura 5. Observa-se
que a adição do Fe nas doses avaliadas não resultou em aumentos da
mineralização do antraceno pelo consórcio microbiano, indicando que não
134
houve limitação deste elemento uma vez que foram mineralizadas elevadas
porcentagens do antraceno em curto período de tempo. No solo Itapoã, o teor
natural de Fe amorfo foi quantificado em 0,2 g dm
-3
, sendo que a adição de 15
kg ha
-1
não aumentou este valor. Porém com a adição de 30 e 60 kg ha
-1
a
quantidade de ferro amorfo foi elevado para 0,3 g dm
-3
, indicando que houve
aumento da disponibilidade do ferro no solo.
Tempo, dias
0 1020304050
C-CO
2
, mg kg
-1
de solo
0
100
200
300
400
500
0
15
30
60
60 SI
FIGURA 5. Produção de C-CO
2
de um solo com diferentes doses de ferro (kg
ha
-1
), contaminado com antraceno e inoculado ou não (SI) com um consórcio
microbiano (dados são médias de quatro repetições; barras representam o erro
padrão).
O ferro desempenha funções celulares que estão intimamente
relacionadas ao metabolismo dos HAP, como a participação na estrutura das
enzimas do sistema multicomponente das dioxigenases, como cofator
enzimático nas enzimas de fissão e protegendo a célula contra radicais
superóxidos resultantes do metabolismo oxidativo (Harayama, 1999). Dinkla
et al. (2001) observaram que a adição de Fe ao meio de cultura aumentou o
135
crescimento de dois isolados de Pseudomonas e a degradação do tolueno. A
demanda de ferro destes isolados foi aumentada em 4,5 vezes quando
cresciam no tolueno se comparado ao crescimento em citrato. Assim a
mineralização de altas quantidades de antraceno em curto período de tempo
poderia demandar maiores quantidades de Fe solúvel que aquelas
disponibilizadas por um solo com baixo teor de argila, como o Itapoã. No
entanto, a ausência de resposta a adição do ferro pode ser devido a baixa
demanda em termos quantitativos, uma vez que este elemento representa
somente 0,2% da massa seca da célula bacteriana (Neidhardt et al., 1990).
Além disso, em vista da baixa disponibilidade do ferro nos ambientes aeróbios,
os microrganismos desenvolveram mecanismos de grande capacidade de
estocagem deste elemento através das proteínas ferritina, bacterioferritina e
Dps. Cada proteína do tipo ferritina ou bacterioferritina pode acomodar de 2000
a 3000 átomos de ferro no interior das células enquanto as proteínas do tipo
Dps têm capacidade de estocagem de aproximadamente 500 átomos de ferro
(Andrews et al., 2003). Assim, a possível ausência de resposta ao ferro
também pode estar relacionado ao consórcio microbiano ter sido cultivado em
meio mineral com alta disponibilidade de ferro, possibilitando a estocagem
intracelular deste elemento, de forma a não haver deficiências deste elemento,
principalmente no início do experimento.
O efeito de diferentes doses de S na mineralização do antraceno no solo
é apresentado na Figura 6. Observa-se que não houve incremento da produção
de C-CO
2
com o incremento da disponibilidade do S no solo. A maior
mineralização observada no final do experimento pela dose 10 kg ha
-1
provavelmente se deve a variação entre repetições, conforme indicado pelo
erro padrão. Assim, o teor natural de S do solo Itapoã, de 3,4 mg dm
-3
,
considerado médio para a nutrição de plantas, foi suficiente para suprir a
demanda da microbiota degradadora. As adições de 10, 20 e 40 kg ha
-1
incrementaram o teor de S no solo para 10,0; 13,1 e 32,8 mg dm
-3
,
respectivamente.
136
Tempo, dias
0 1020304050
C-CO
2
, mg kg
-1
de solo
0
100
200
300
400
500
0
10
20
40
20 SI
FIGURA 6. Produção de C-CO
2
de um solo com diferentes doses de enxofre
(kg ha
-1
), contaminado com antraceno e inoculado ou não (SI) com um
consórcio microbiano (dados são médias de quatro repetições; barras
representam o erro padrão).
Entre os nutrientes inorgânicos o enxofre é o quarto mais absorvido, com
participação de 1% na composição química celular bacteriana (Neidhardt et al.,
1990). Mesmo assim, não houve resposta a adição do S, o que pode estar
relacionado a mineralização da matéria orgânica. Durante os procedimentos de
preparo do solo, este foi incubado para correção do pH por longos períodos e,
em condições de adequada umidade para a atividade microbiana, o que
resultou na mineralização de aproximadamente 25% da matéria orgânica
(dados não mostrados) e conseqüentemente no aumento do S inorgânico no
solo.
Este aumento da disponibilidade do S, assim como do N e do P pela
mineralização da matéria orgânica e também pela correção do pH do solo pode
justificar a ausência de resposta a adição destes nutrientes ao solo. No entanto
137
há que se considerar que em condições de campo a alteração da estrutura do
solo a ser biorremediado seria comparativamente menor que aquela observada
em laboratório, resultando em menor mineralização da matéria orgânica e em
menor aumento dos teores de nutrientes inorgânicos, que além disso, estariam
sujeito a lixiviação no perfil (principalmente NO
3
-
e SO
4
-
), reduzindo desta forma
a sua disponibilidade aos microrganismos degradadores. Nas condições de
campo, o monitoramento dos teores de nutrientes disponíveis no solo é
ferramenta fundamental para subsidiar decisões acerca da necessidade de se
utilizar a bioestimulação com nutrientes inorgânicos. Por outro lado, o aumento
da disponibilidade do N, S e P de forma isolada não foi suficiente para
promover uma alta atividade de mineralização do antraceno. Conforme
demonstrado na Figura 1, a maior produção de C-CO
2
pelo consórcio
microbiano esteve intimamente dependente da correção do pH do solo,
apresentando uma relação linear positiva entre mineralização do antraceno e
pH, com R
2
de 0,86. Naquele experimento, todos os solos foram submetidos
aos mesmos procedimentos, havendo portanto aumentos semelhantes na
disponibilidade de nutrientes inorgânicos pela mineralização da matéria
orgânica, no entanto o aumento da produção do C-CO
2
foi devido somente a
elevação do pH do solo.
138
5.5 CONCLUSÕES
1) As maiores mineralizações do antraceno ocorrem nos solos com as
maiores umidades gravimétricas e pH avaliados;
3) O aumento do nitrogênio mineral e a conseqüente redução da relação
C:N do solo tendem a diminuir a mineralização do antraceno;
4) O aumento das disponibilidades do fósforo, do ferro e do enxofre no
solo não influenciam a mineralização do antraceno;
5) As relações C:P e C:N:P do solo avaliadas apresentam grandes
amplitudes sem no entanto, influenciarem a mineralização do antraceno no
solo;
6) Na presença de microrganismos degradadores, a bioestimulação
mostra efeitos positivos na biorremediação de solos contaminados com
antraceno, mas deve ser recomendada somente após a avaliação específica
da necessidade de adição de cada um dos nutrientes e corretivos.
139
5.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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CAPÍTULO V
COMPARAÇÃO DE DUAS METODOLOGIAS PARA O ISOLAMENTO DE
MICRORGANISMOS DEGRADADORES DE HIDROCARBONETOS
AROMÁTICOS POLICÍCLICOS NO SOLO
143
6.1 RESUMO
Os HAPs (hidrocarbonetos aromáticos policíclicos) são compostos
químicos com propriedades mutagênicas e carcinogênicas que contaminam o
ar, a água e o solo, sendo a biorremediação uma estratégia que pode ser
utilizada para sua eliminação do ambiente. No entanto, a inoculação do solo
com microrganismos degradadores de HAPs selecionados em laboratório têm
resultado em insucessos. O objetivo deste estudo foi comparar a metodologia
clássica de isolamento de microrganismos degradadores de HAPs com uma
nova metodologia, que visa aumentar a possibilidade de isolamento de
microrganismos com habilidades de mineralizar os HAPs no solo. Na
metodologia 1 (clássica) o solo do landfarming foi adicionado ao meio mineral
contendo o HAP (antraceno). Após 64 dias e 8 transferências, os
microrganismos foram isolados e selecionados através de curvas de
crescimento. Na metodologia 2, as amostras de solo do landfarming foram
inoculadas a um solo contaminado artificialmente em laboratório com antraceno
e a amostra com maior produção de C-CO
2
foi utilizada para o enriquecimento.
Os microrganismos foram isolados após 21 dias e 3 transferências. A
identificação dos microrganismos obtidos pelas duas metodologias foi realizada
pelo seqüenciamento do gene do RNAr. A capacidade de degradar o antraceno
em meio mineral foi avaliada por cromatografia gasosa. Para avaliação da
capacidade de mineralização do antraceno no solo realizou-se um ensaio
respirométrico, onde os microrganismos foram inoculados ao solo como
consórcio 1 (microrganismos isolados pela metodologia 1) e consórcio 2
(microrganismos isolados pela metodologia 2). Através da metodologia 1
isolou-se e selecionou-se 3 bactérias, que degradaram em média 51% do
antraceno do meio mineral. Através da metodologia 2 isolou-se 6 bactérias e
um fungo que degradaram em média 48% do antraceno do meio mineral. O
consórcio 2 mineralizou 84% do antraceno do solo, enquanto que o consórcio 1
mineralizou somente 8% deste HAP, sendo este valor muito próximo do
observado pela microbiota autóctone (solo sem inóculo). A metodologia 2
mostrou-se mais eficiente que a metodologia 1 no isolamento de
microrganismos com capacidade de mineralizar o antraceno no solo.
144
6.2 INTRODUÇÃO
A introdução no ambiente dos hidrocarbonetos aromáticos policíclicos
(HAPs) ocorre naturalmente, e de forma contínua, pela combustão incompleta
de resíduos orgânicos, ou antropogenicamente de várias maneiras, entre as
quais destacam-se os processos de extração, transporte, refino, transformação
e utilização do petróleo e seus derivados (Cameotra; Bollag, 2003). Desta
forma, os HAPs contaminam o ar, a água e o solo, podendo ser absorvidos
pelos mamíferos através da inalação, exposição oral ou dérmica. No organismo
humano, estes compostos são metabolizados, gerando compostos epóxidos
que podem causar mutações e cânceres (Netto et al., 2000).
Uma estratégia para eliminação dos HAPs do ambiente é através da
biorremediação, onde os microrganismos degradadores irão transformar estes
compostos em substâncias inertes, CO
2
e água. Para que um microrganismo
utilize os HAPs como fonte de C e energia para o seu crescimento é necessário
que ele possua as várias enzimas que transformam as complexas moléculas
dos HAPs em intermediários das rotas catabólicas. Por isso, a maioria dos
microrganismos do solo não possui a capacidade de degradar estes compostos
(Alexander, 1999), justificando a necessidade de se isolar e selecionar
microrganismos degradadores de HAPs, visando sua utilização na
biorremediação de solos contaminados com estes compostos.
Desde a década de 50, vários pesquisadores buscaram selecionar
microrganismos em culturas puras com capacidade de degradar HAPs, sendo
isoladas e identificadas inúmeras bactérias e fungos, conforme demonstrado
nas revisões de Cerniglia (1997), Kanaly et al. (2000) e Johnsen et al. (2005).
Somente nos últimos anos tem sido dada atenção ao isolamento de consórcios
microbianos degradadores de HAPs, que comparativamente às culturas puras,
tem se mostrado mais efetivos na degradação destes compostos, devido a
145
capacidade de utilizar um maior número de HAPs, pela maior taxa de
degradação e principalmente pela maior porcentagem mineralização destes
compostos (Boonchan et al., 2000; Ghazalli et al., 2004). No entanto, trabalhos
têm demonstrado que a inoculação ao solo dos microrganismos selecionados
pode resultar em baixas taxas de degradação, tornando a biorremediação um
processo lento e podendo não reduzir a concentração dos contaminantes aos
níveis exigidos pela legislação ambiental (Huesemann et al., 2002). Este
comportamento pode estar relacionado a incapacidade dos microrganismos
selecionados em colonizar o solo e degradar os HAPs neste ambiente.
Segundo Johnsen et al. (2005) estes insucessos são conseqüência da
utilização da habilidade bioquímica no meio mineral como único critério de
seleção dos microrganismos degradadores de HAPs.
A eficiência da biorremediação é função da extensão em que a
população microbiana degradadora pode manter-se no ecossistema natural
(Alexander 1999). Se a baixa solubilidade em água dos HAPs já dificulta a
absorção destes compostos em meio líquido, no solo esta limitação é
magnificada, em vista das menores concentrações dos HAPs, da
heterogeneidade de distribuição destes compostos nos poros do solo e da
sorção nas superfícies dos argilominerais e na matéria orgânica. Além disso,
ao ser inoculado ao solo, os microrganismos selecionados tem que superar
relações antagônicas, como a predação, impostas pelas populações
autóctones, que estão amplamente adaptadas a este ambiente e normalmente
apresentam maior capacidade de competição e tolerância aos estresses
ambientais, causados pelas alterações de temperatura, de pH, de
disponibilidade de água e de oxigênio e outros (van Veen et al., 1997).
Por outro lado, a capacidade da população inoculada em degradar os
HAPs representa uma vantagem competitiva em relação a população nativa do
solo, que normalmente não possui as enzimas necessárias para a utilização
destes compostos. Por isso, trabalhos têm demonstrado que a bioaumentação
pode ser eficiente para aumentar a remoção dos HAPs do solo. Kästner et al.
(1998) inoculou bactérias degradadoras num solo contaminado com HAPs
observando incrementos de seis e de dez vezes na degradação do pireno e do
antraceno, respectivamente. Fungos degradadores de HAPs como Pleorotus
ostreatus também têm sido inoculados ao solo, resultando, respectivamente,
146
em degradações de 87 e 93 % do antraceno e do pireno presente no solo após
8 semanas de incubação (Potin et al., 2004).
Assim, a seleção de microrganismos a serem utilizados na
biorremediação de solos deve considerar além da habilidade bioquímica, a
capacidade de colonização e degradação do contaminante no solo. O objetivo
deste estudo foi comparar a metodologia clássica de isolamento de
microrganismos degradadores de HAPs com uma nova metodologia, que visa
aumentar a possibilidade de isolamento de microrganismos com habilidades de
mineralizar os HAPs no solo.
147
6.3 MATERIAL E MÉTODOS
6.3.1. Coleta do solo
Para o isolamento dos microrganismos degradadores de HAPs utilizou-
se como inóculo as amostras de solo coletadas no landfarming do SICECORS
(Sistema Centralizado de Controle de Resíduos Sólidos do Pólo Petroquímico
do Sul), onde desde 1989 é tratado o lodo oleoso produzido pelas indústrias do
Pólo e mais recentemente os resíduos petroquímicos gerados pela Refinaria
Alberto Pasqualini. Este landfarming é dividido em 12 células, que são áreas de
30 m x 100 m onde os resíduos são adicionados. Selecionaram-se 3 células
que haviam recebido resíduos mais recentemente e coletou-se as amostras de
solo na profundidade de 0 a 30 cm, em 2 locais escolhidos aleatoriamente no
interior de cada célula, resultando em seis amostras, que foram trazidas para o
laboratório em caixas de isopor e armazenadas a 4°C.
6.3.2 Isolamento dos microrganismos degradadores de antraceno
Na metodologia 1, foi utilizada um grama de cada uma das 6 amostras
de solo, que foram individualmente adicionadas a frascos de erlenmeyers de
125 mL contendo 50 mL de meio mineral e 250 mg L
-1
de antraceno como
única fonte de carbono e energia. Todos os ensaios utilizaram o meio mineral
Tanner com a seguinte composição, em g L
-1
: CaCl
2
2H
2
O, 0,04; KH
2
PO
4
, 0,1;
NaCl, 0,8; NH
4
Cl, 1,0; MgSO
4
7H
2
O, 0,2; KCl, 0,1. Os micronutrientes foram
adicionados na concentração, em mg L
-1
: CoCl
2
6H
2
O, 0,1; MnCl
2
4H
2
O, 0,425;
ZnCl
2
, 0,05; CuSO
4
5H
2
O, 0,015; NiCl
2
6H
2
O, 0,01; Na
2
MoO
4
2H
2
O, 0,01;
Na
2
SeO
4
, 0,01. O pH foi ajustado para 7,0 e o meio foi autoclavado por 20
minutos a 121°C. Os frascos foram incubados a 150 rpm e 30°C. A cada 8 dias,
148
uma alíquota de 1 mL da cultura crescida era transferida para outro frasco
contendo o mesmo meio estéril e incubado nas mesmas condições. Após 8
transferências, 1 mL de cada erlenmeyer foi diluído em solução salina e
plaqueado em meio agar nutritivo (extrato de carne 3 g, peptona 5 g, ágar 15 g,
água destilada 1 L, pH 7,0), sendo as placas incubadas por 24 horas a 30°C.
As colônias crescidas nas placas que apresentavam diferenças morfológicas
foram estriadas no mesmo meio até purificação dos isolados. Para selecionar
os mais eficientes foram confeccionadas curvas de crescimento com cada
isolado individualmente e a analisada a cinética de crescimento, pela
estimação da taxa de crescimento, do tempo de geração e do número de
gerações. Para isto, cada isolado foi inoculado individualmente em frascos
contendo 50 mL de meio mineral mais 250 mg L
-1
e incubado em 150 rpm e
30°C por 96 horas. A cada 12 horas, uma alíquota de 1 mL das culturas
crescidas era diluída em solução salina, plaqueada em meio agar nutritivo e
incubada a 30°C por 24 horas, quando então era realizada a contagem das
UFC mL
-1
.
Na metodologia 2, realizou-se inicialmente um ensaio respirométrico
visando selecionar uma entre as 6 amostras de solo do landfarming que
apresentasse a maior atividade de mineralização do antraceno, para
posteriormente ser utilizada no isolamento dos microrganismos degradadores
deste HAP. Um Argissolo Vermelho-Amarelo distrófico arênico da Unidade de
Mapeamento Itapoã foi coletado em uma área agrícola sem histórico de
recebimento de nenhum tipo de resíduo. Este solo foi trazido para o laboratório,
seco e peneirado em malha de 2 mm. Para elevar o pH a 6,5 adicionou-se
CaCO
3
e MgCO
3
na proporção 3:1, na forma de reagente comercial,
incubando-se o solo úmido por 60 dias. Posteriormente, este solo foi
contaminado com 250 mg kg
-1
de antraceno. Para isto, preparou-se uma
solução concentrada de antraceno dissolvido em acetona, sendo que 3 mL
foram adicionados a 50 g de solo no interior de frascos respirométricos de 1,5
L. Estes frascos foram colocados em estufa por 3 horas a 50°C para
evaporação da acetona. Após adicionou-se mais 49 g de solo, procedendo-se
uma intensa mistura. Devido a baixa fertilidade natural, adicionou-se o
equivalente a 100 kg ha
-1
de N e 50 kg ha
-1
de P, na forma de solução de
NH
4
NO
3
e KH
2
PO
4
.
149
Após o solo estar corrigido, contaminado com antraceno e fertilizado, em
cada frasco respirométrico adicionou-se 1 g de uma das amostras de solo do
landfarming, visando inocular uma população de microrganismos degradadores
de HAPs. Os frascos foram equipados com aparato de captura de CO
2
,
composto por um copo plástico de 50 mL com 20 mL de NaOH 0,25 M,
fechados hermeticamente e incubados em duplicata a temperatura ambiente no
laboratório. Durante um período de 176 dias, semanalmente os frascos eram
abertos, a solução de NaOH recebia um mL de BaCl
2
1 M e era titulada com
HCl 0,5 M, utilizando fenolftaleína como indicador. A solução do HCl 0,5 M foi
padronizada com tris, conforme Tedesco et al. (1995). Uma amostra com
umidade igual ao solo dos frascos respirométricos foi utilizada para
determinação da umidade gravimétrica, sendo a produção de C-CO
2
expressa
em kg de solo seco.
A produção de C-CO
2
foi quantificada através da fórmula de Stotzky
(1965):
C-CO
2
(mg kg
-1
de solo) = (B-T) x eq x M x 10
onde, B é o volume (em mL) da solução de HCl gasto para titular a prova em
branco (frasco respirométrico sem solo); T é o volume (em mL) da solução de
HCl gasto para titular os tratamentos; eq é o equivalente-grama do C, que é 6;
M é a molaridade da solução padronizada de HCl e 10 é o fator de conversão
para kilograma de solo.
Do frasco com maior produção de C-CO
2
foi retirado um grama de solo e
adicionado a um erlenmeyer de 125 mL contendo 50 mL de meio mineral
Tanner e 250 mg L
-1
de antraceno como única fonte de C e energia, que foram
incubados a 150 rpm e 30°C. A cada 7 dias, uma alíquota de 1 mL da cultura
crescida foi transferida para outro frasco contendo o mesmo meio estéril e
incubado nas mesmas condições. Após 3 transferências, a cultura crescida foi
diluída em solução salina (NaCl 0,85 %) e plaqueada em meio ágar nutritivo
contendo 250 mg L
-1
de antraceno, sendo as placas incubadas por 72 horas a
30°C. As colônias bacterianas crescidas nas placas foram estriadas no mesmo
meio até purificação dos isolados e armazenadas sob refrigeração a 4 ºC. A
colônia de fungo foi repicada até purificação em meio ágar malte (extrato de
malte 30 g, peptona 5 g, ágar 15 g, água destilada 1 L, pH 5,4) contendo 250
mg L
-1
de antraceno e armazenada no mesmo meio, sob refrigeração a 4 ºC.
150
6.3.3 Identificação dos microrganismos degradadores de antraceno
Para a caracterização inicial das bactérias avaliou-se a morfologia
celular através da coloração de Gram. Para identificação realizou-se o
seqüenciamento do gene do rRNA 16S, conforme descrito por Camargo et al
(2003). As bactérias foram crescidas em meio caldo nutriente, sendo as células
coletadas por centrifugação a 10000 rpm por 5 minutos. O DNA foi extraído de
acordo com o método de Asubel et al. (1997). As células foram suspensas em
numa solução tampão TE, SDS (10 %) e proteinase K, e incubadas por uma
hora a 37°C. Uma mistura de NaCl (5 M) e CTAB/NaCl (4,1 g de NaCl e 10 g
de brometo de N-cetil-N.N.N.-trimetilamônio) em 100 mL de água destilada pré-
aquecida) foi adicionada, incubando-se por 10 minutos a 65°C. A solução foi
extraída com 780 µL de clorofórmio/álcool isoamílico (24/1), centrifugada por 5
minutos, sendo a fase aquosa novamente extraída com igual volume de
fenol/clorofórmio/álcool isoamílico (25/24/1). Após centrifugação de 5 minutos,
o DNA presente na fase aquosa foi precipitado com 0,6 volume de isopropanol
e o precipitado foi lavado com etanol 70 %. O pellet de DNA foi seco usando
um concentrador e ressuspendido em água livre de nuclease. Primers
universais bacterianos correspondendo as posições 27F (5’-
AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’) e 519R (5’-GTATTACCGCGGCTGCTG-3’)
da E.coli foram usadas para amplificação do gene do rRNA 16S por PCR. A
mistura de PCR (Cat. Nº M7502, Promega, Madison, Wisconsin) foi usada de
acordo com instruções do fabricante. O DNA foi amplificado usando PCR com
35 ciclos (desnaturação inicial de 95°C por 3 minutos, demais desnaturações
de 95°C por um minuto, anelamento a 55°C por um minuto, extensão a 72°C
por um minuto e extensão final a 72°C por 5 minutos). Os amplicons foram
analisados em gel de agarose 2 % e purificados usando o kit de extração de
gel QIAEX II (QIAGEN, Valência, Califórnia), de acordo com instruções do
fabricante. Brevemente, um pedaço do gel foi suspenso em tampão QXI, foi
adicionado a suspensão QIAEX II, seguido de mistura em vortex. A suspensão
foi incubada a 50°C por 10 minutos, centrifugada por 30 segundos e o pellet foi
lavado duas vezes com tampão QXI e uma vez com tampão PE. Após
secagem ao ar por 15 minutos, o DNA foi eludido com água livre de nuclease.
151
O seqüenciamento do DNA foi realizado usando um kit terminador BigDye
(Applied Biosystems, Foster City, Califórnia) e um analisador genético Applied
Biosystems ABI 3100. A homologia das seqüências foi obtida através do
MEGABLAST (Altschul et al., 1997). O DNA do fungo foi extraído conforme
Schabereiter-Gurtner et al (2001). A região do gene do RNAr ITS1-5,8S-ITS2
foi amplificada, utilizando os primers ITS1 e ITS4. Os amplicons foram
purificados e submetidos diretamente ao seqüenciador automático MegaBACE
1000 (Amersham Biosciences, Piscataway, New Jersey). A homologia das
seqüências bacterianas e fúngicas foi obtida através do MEGABLAST (Altschul
et al., 1997).
6.3.4 Biodegradação e mineralização do antraceno
A capacidade dos microrganismos selecionados em degradar o
antraceno foi avaliada através de cromatografia gasosa. Para isto, os isolados
obtidos pela metodologia 1 foram inoculados isoladamente, enquanto que os
microrganismos obtidos na Metodologia 2 foram inoculados conjuntamente na
forma de consórcio, em 50 mL de meio mineral com pH 7,0, mais 250 mg L
-1
de
antraceno e incubados com três repetições a 30°C. Ao final do período, cada
frasco contendo a cultura crescida foi acidificado a pH 2,0, seguindo-se de três
extrações com 20 mL de diclorometano (EM Science
®
, pureza>99,8%), em funil
de separação. Para retirar o excesso de água após as extrações, utilizou-se
sulfato de sódio anidro (Shuttleworth; Cerniglia, 1996). O volume do material
extraído foi quantificado e uma alíquota de 0,5 mL foi colocado em vials. A este
volume foi adicionado fenantreno deuterado na concentração equivalente a 250
mg L
-1
. Utilizou-se um cromatógrafo gasoso (Agilent
®
, Modelo 6890, USA)
equipado com coluna 5% fenil metil polisiloxano e detector de massas, no qual
foi injetado 0,2 µL das amostras, com uma razão de split de 1:50, com injetor
automático. A temperatura do forno foi de para 40°C por um minuto, seguido de
6°C min
-1
até 220°C, mantendo isotérmica por um minuto e aquecimento de
15°C min
-1
até 300°C.
A capacidade dos microrganismos selecionados em mineralizar o
antraceno no solo foi avaliado através de respirometria. Após o solo estar com
pH corrigido, contaminado com 500 mg kg
-1
de antraceno e fertilizado,
152
conforme descrito no item 6.3.2, foi adicionado 2 mL de uma suspensão de
células dos microrganismos selecionados, de forma a introduzir uma população
de 2,0 x 10
8
UFC g
-1
de solo (Kastner et al., 1998). Para obtenção desta
suspensão de células, 100 µL das culturas puras de cada um dos
microrganismos obtidos pela metodologia 1, que haviam crescido em meio
mineral mais 250 mg L
-1
de antraceno, foi inoculada em ágar nutriente
contendo 250 mg L
-1
deste HAP e incubada a 30°C por 72 horas. Após o
crescimento das colônias, foi adicionado sobre o meio 5 mL de água estéril e
com o auxílio de uma alça de Drigalsky, as colônias foram coletadas para
frascos de centrífuga, de modo que os 3 isolados apresentassem igual número
de UFC na suspensão de células, originando desta forma o Consórcio 1. Para
obtenção da suspensão de células dos microrganismos obtidos pela
metodologia 2 foi utilizado uma cultura que já havia crescido na forma de
consórcio em meio mineral mais 250 mg L
-1
de antraceno. 100 µL desta cultura
foi inoculada em placas de ágar nutriente contendo 250 mg L
-1
deste HAP, que
foram incubadas a 30°C por 72 horas. Assim, os microrganismos cresceram
conjuntamente sobre o meio sólido e foram coletados para tubos de centrífuga
conforme descrito acima, originando desta forma o consórcio 2. As suspensões
foram centrifugadas a 10000 rpm, por 8 minutos a 15°C e os sobrenadantes
foram descartados. Ressuspendia-se os pellets numa quantidade previamente
calculada de água estéril, sendo então a suspensão adicionada ao solo no
interior dos frascos respirométricos (1,5 L), que foram equipados com aparato
de captura de CO
2
e incubados, com 2 repetições, a temperatura ambiente no
Laboratório. A cada 7 dias, o C-CO
2
foi quantificado conforme descrito
anteriormente.
6.3.5 Análise estatística
O erro padrão foi calculado pela fórmula
))(1(
11
2
yy
m
s
n
i
nn
yis
−
∑∑
==
onde, s = número
da série; i = número do ponto na série s; m = número de séries para o ponto y
no gráfico; n = número de pontos em cada série; y
is
= valor de dados da série s
e ponto i; e n
y
= número total de valores de dados em todas as séries.
153
6.4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
6.4.1 Isolamento de microrganismos degradadores de antraceno
Na metodologia 1, o enriquecimento foi realizado mediante a inoculação
em separado das 6 amostras de solo do landfarming em diferentes frascos.
Após 8 transferências, as 6 culturas crescidas foram diluídas e plaqueadas,
sendo purificadas as colônias que apresentaram diferenças morfológicas,
obtendo-se 26 bactérias originadas de diferentes amostras de solo, que
cresceram em meio mineral utilizando o antraceno como única fonte de C e
energia. Vinte e três bactérias apresentaram forma de bastonete, sendo 18
Gram negativos e 5 Gram positivos. Os outros 3 isolados apresentaram a
forma de cocos, sendo 2 Gram negativos e um Gram positivo. Uma nova
seleção foi realizada entre os isolados obtidos. Para isto, inoculou-se
separadamente os isolados em meio mineral mais antraceno, de forma a obter
curvas de crescimento individuais, que permitiram cálculo de parâmetros
cinéticos. Partindo-se de inóculos aproximadamente de 2,0 Log UFC mL
-1
,
somente três isolados entre os 26, atingiram número de células acima de 12
Log UFC mL
-1
no final do experimento e por conseqüência, apresentarem
maior taxa específica de crescimento, maior número de gerações e menor
tempo de geração, sendo selecionados para os ensaios posteriores e quando
agrupados constituíram o consórcio 1. Os resultados do isolamento dos
microrganismos utilizando-se a metodologia 1 estão também apresentados em
Jacques et al. (2005).
Em vista dos relatos da literatura acerca dos insucessos da
biaumentação com microrganismos degradadores de HAPs obtidos pela
metodologia clássica de enriquecimento (metodologia 1), propôs-se
modificações que visaram aumentar a possibilidade de obtenção de
154
microrganismos com capacidade de degradação de HAPs no solo. Assim, na
metodologia 2, introduziu-se uma etapa anterior ao enriquecimento onde,
através de um ensaio respirométrico, buscou-se avaliar a atividade metabólica
das populações microbianas das diferentes amostras do solo utilizado como
inóculo e ao mesmo tempo, objetivou-se promover um “enriquecimento no
solo”, onde em condições adequadas de disponibilidade de água, de nutrientes
inorgânicos, de pH, de temperatura, etc, as populações degradadoras
pudessem expressar seu potencial genético, crescendo e colonizando o solo,
de forma que fosse utilizado no enriquecimento em meio mineral uma amostra
de solo que apresentasse comprovadamente alta atividade de mineralização
dos HAPs no solo.
Com este objetivo, realizou-se o ensaio respirométrico, cujos resultados
são apresentados na Figura 1. Independentemente do local de coleta da
amostra, a inoculação de uma população de microrganismos degradadores via
solo de landfarming resultou em aumento da produção de C-CO
2
se
comparado ao controle. Isto indica que durante os 16 anos em que os resíduos
petroquímicos foram tratados neste local houve um enriquecimento dos
microrganismos do solo no sentido de selecionar populações degradadoras de
hidrocarbonetos. A amostra 5 apresentou produção de C-CO
2
muito maior que
as demais, indicando possuir uma população microbiana mais adaptada a
degradação de HAPs no solo. Por isso, o solo do frasco respirométricos
inoculado com a amostra 5 foi utilizado para o enriquecimento em meio mineral
mais antraceno, visando a obtenção dos microrganismos degradadores de
HAPs.
155
Tempo, dias
0 30 60 90 120 150 180
C-CO
2
, mg kg
-1
solo
0
200
400
600
800
1000
1200
Amostra 1
Amostra 2
Amostra 3
Amostra 4
Amostra 5
Amostra 6
Sem inóc.
Figura 1. Produção de C-CO
2
de um solo contaminado com antraceno e
inoculado com diferentes amostras de solo provenientes de uma área de
descarte de resíduos petroquímicos.
O enriquecimento em meio mineral teve duração de 3 semanas, período
relativamente curto se comparado aos trabalhos normalmente relatados na
literatura, que duram de 6 a 12 semanas (Richard; Vogel, 1999; Grosser et al.,
2000). Esta redução de tempo teve por objetivo evitar que os microrganismos
que estavam crescendo no meio mineral mais antraceno alterassem suas
características genéticas, fisiológicas e morfológicas, que podem determinar a
perda da capacidade de colonização e degradação do antraceno no solo.
Segundo Conserton; Lappin-Scott (1995) citados por Jonhsen et al. (2005) as
condições de cultivo em laboratório exercem forte pressão de seleção no
genoma dos microrganismos que eventualmente pode produzir falhas nas
estruturas superficiais de adesão e proteção celular que impedem a
sobrevivência no ambiente natural.
Após 3 transferências, os procedimentos de isolamento e purificação
foram realizados utilizando-se o meio ágar nutritivo ou ágar malte com 250 mg
156
L
-1
de antraceno. O uso do HAP junto ao meio sólido (Kiyohara et al., 1982) fez
com que o cultivo dos microrganismos ocorresse sempre na presença do HAP,
exercendo uma pressão de seleção, que reduz a possibilidade de perda dos
plasmídeos que codificam as enzimas de degradação. Do enriquecimento,
obteve-se 7 microrganismos, sendo 6 bactérias e um fungo. As bactérias foram
analisadas em microscópio ótico, sendo 4 Gram positivas e 2 Gram negativas,
5 apresentaram a forma de bastonetes e um de cocos. O fungo formou colônia
filamentosa de coloração branca em meio ágar malte. Estes isolados foram
agrupados, originando o consórcio 2.
6.4.2 Identificação dos microrganismos degradadores de antraceno
Os três isolados do consórcio 1 foram identificados como pertencentes
ao gênero Pseudomonas (Tabela 1). Este gênero é o mais bem estudado entre
os degradadores de HAP, além de inúmeros relatos envolvendo a degradação
de outros poluentes orgânicos (Zhang et al., 2004). Da mesma forma, vários
pesquisadores têm isolado bactérias da espécie P. aeruginosa que degradam
HAP (Yuste et al., 2000; Hwang; Cutright, 2002; Garcia-Junco et al., 2003;
Straube et al., 2003).
Apesar do menor número de relatos, a espécie P. citronellolis também
apresenta capacidade de degradar compostos orgânicos recalcitrantes, como o
poli(cis-1,4 isopreno), que é um polímero natural presente no látex produzido
pela Hevea brasiliensis (Bode et al., 2000). Bhattacharia et al. (2003) isolaram
150 bactérias degradadoras de hidrocarbonetos alifáticos e aromáticos de
diversos solos contaminados da Índia, sendo P. citronellolis a espécie
dominante com 29 isolados.
157
TABELA 1. Identificação dos microrganismos degradadores de antraceno pelo
seqüenciamento do gene do RNAr.
Comparação da seqüência do RNAr 16S ou da região ITS
Consórcio
Isolado ou espécie
mais próxima
Número
de acesso
Similaridade
(%)
Pseudomonas citronellolis
AY499121 96
Pseudomonas aerigonosa
AY162139 100
1
Pseudomonas aeruginosa
AY631241 84
Mycobacterium fortuitum
AY513242 97
Bacillus cereus
AJ586344 96
Microbacterium sp.
AB114267 96
Gordonia polyisoprenivorans
AY278367 98
Microbacteriaceae bacterium
AY673335 99
Naphthalene-utilizing bacterium
AF531474 98
2
Fusarium oxysporum
X78260 100
Os isolados do consórcio 2 foram identificados como pertencentes a
diversos gêneros, nenhum no entanto, pertencente ao gênero Pseudomonas
(Tabela 1). A análise da seqüência do gene do RNAr 16S indicou que o
primeiro isolado pertence ao gênero Mycobacterium (Tabela 3). Este gênero
tem sido extensivamente utilizado nos estudos de biodegradação de HAPs
(Wick et al., 2002; Miyata et al., 2004; Leys et al., 2005; Mutnuri et al., 2005). A
espécie identificada como geneticamente mais próxima deste isolado foi a M.
fortuitum, que tem sido estudada como degradadora de hidrocarbonetos
alifáticos dos polímeros da borracha (Berekaa; Steinbüchel, 2000; Linos et al.,
2000).
A espécie identificada como geneticamente mais próxima do segundo
isolado foi Bacillus cereus, que também tem sido citada nos estudos de
degradação de hidrocarbonetos alifáticos (Cybulski et al., 2003) e de
aromáticos policíclicos (Kazunga; Aitken, 2000). Segundo Chaillan et al. (2004)
tem sido creditado ao gênero Bacillus a capacidade de degradar
hidrocarbonetos, no entanto em condições de cuidadoso controle do
desaparecimento de substrato do meio de cultura, tem se verificado que
tratam-se de degradadores secundários, que utilizam os metabólitos
158
produzidos pelos degradadores primários de hidrocarbonetos. Esta pode ser
considerada uma evidência da complementaridade metabólica entre os
microrganismos isolados.
O terceiro isolado foi identificado como pertencente ao gênero
Microbacterium. Gauthier et al. (2003), Cavalca et al. (2004) e Zhang et al.
(2004) isolaram bactérias degradadoras de hidrocarbonetos aromáticos
pertencentes a este gênero. Gordonia polyisoprenivorans foi identificada como
a espécie mais próxima do quarto isolado. Segundo Linos et al. (1999) este
actinomiceto foi inicialmente isolado de polímeros de borracha de pneus. Vários
estudos têm relatado a utilização desta espécie na degradação
hidrocarbonetos alifáticos (Linos et al., 2000), petróleo (Chaillan et al., 2004) e
HAPs (Mutnuri et al., 2005). O sexto isolado foi identificado apenas ao nível de
família, apresentando similaridade de 99% com o isolado Ellin 7169, obtido de
um solo agrícola por Davis et al. (2005) e que pertence a família
Microbacteriaceae. O último isolado bacteriano apresentou similaridade de 98%
com uma bactéria que foi isolada de um local utilizado na estocagem de carvão
mineral e que cresceu em meio mineral utilizando o naftaleno como única fonte
de carbono e energia (Dore et al., 2003). Segundo estes autores, a análise do
gene do RNAr 16S indicou que a bactéria apresenta similaridade de 98,5%
com a espécie Clavibacter xyli.
O fungo foi identificado como pertencente a espécie Fusarium
oxysporum, que tem sido isolada dos solos contaminados por hidrocarbonetos,
sendo suas habilidades de degradação de HAPs demonstradas com o pireno
(Cerniglia, 1997) e benzo(a)pireno (Verdin et al., 2004, 2005).
6.4.3 Biodegradação do antraceno em meio mineral
Apesar da elevada porcentagem de degradação de um dos isolados de
Pseudomonas, a degradação média destes 3 isolados foi de 50,9%, muito
semelhante a aquela observada pelo consórcio 2 (Tabela 2). No entanto, em
vista do maior tempo de incubação dos isolados de Pseudomonas, a taxa de
degradação foi, em média, 28% menor que a do consórcio 2, confirmando as
observações de que normalmente os consórcios microbianos apresentam
maior taxa de degradação que as culturas puras. Boonchan et al. (2000)
159
observou que a degradação de 50 mg kg
-1
de benzo(a)pireno no período de 55
dias foi de 10% pela bactéria Stenotrophomonas maltophilia e de 16% pelo
fungo Penicillium janthinellum. A inoculação destes dois microrganismos na
forma de consórcio aumentou a degradação deste HAP para 27%, que
segundo os autores deveu-se a presença da complementaridade metabólica
entre os membros do consórcio. Zhang et al. (2004), sem mencionar as
porcentagens de degradação, relataram que a taxa de degradação de 100 mg
L
-1
de antraceno em meio mineral por um isolado de Paracoccus foi de 0,5 mg
L
-1
dia
-1
, valor bem menor que os apresentados na Tabela 2.
TABELA 2. Degradação do antraceno pelos isolados de Pseudomonas
(Consórcio 1) por 48 dias e pelo Consórcio 2 por 30 dias, em meio mineral
Tanner com 250 mg L
-1
de antraceno, a 150 rpm e 30°C (dados são médias de
três repetições; ± erro padrão).
Isolados /
Consórcio
Degradação
(%)
Taxa de degradação
(mg L
-1
dia
-1
)
Pseudomonas citronellolis
56,5 ± 1,3 3,20 ± 0,13
Pseudomonas aeruginosa
71,1 ± 2,6 3,90 ± 0,09
Pseudomonas aeruginosa
24,4 ± 1,4 1,72 ± 0,06
Consórcio 2 47,9 ± 4,7 3,77 ± 0,35
De qualquer modo, os resultados apresentados na Tabela 2 confirmam
que a metodologia 1 foi eficiente para o isolamento de microrganismos
degradadores de HAPs em meio mineral e por isso é amplamente utilizada nas
pesquisas com estes compostos. A metodologia 2, apesar do menor tempo de
enriquecimento em meio mineral, também possibilitou a obtenção de
microrganismos com capacidade de degradação de HAPs, sendo esta
semelhante a degradação observada pelos microrganismos obtidos pela
metodologia 1.
6.4.4 Mineralização do antraceno no solo
A capacidade dos microrganismos selecionados em mineralizar o
antraceno no solo foi avaliada através de um experimento respirométrico
160
(Figura 2). Os isolados de Pseudomonas obtidos pela metodologia 1 foram
inoculados no solo conjuntamente, e em igual número de UFC, formando o
consórcio 1. O consórcio 2 foi formado pelos microrganismos obtidos pela
metodologia 2. Observa-se que a microbiota autóctone do solo apresentou
reduzida produção de C-CO
2
, mesmo o solo estando contaminado com uma
concentração alta de antraceno, o que pressupõe que a biodisponibilidade do
substrato não foi uma limitação a degradação do contaminante. No solo
inoculado com o consórcio 2 houve mineralização de aproximadamente 84%
do antraceno, enquanto que no solo inoculado com o consórcio 1 esta
mineralização foi de somente 8%, sendo muito próxima daquela verificada pela
microbiota autóctone do solo. Isto demonstra que os isolados obtidos pela
metodologia 1, apesar de degradarem o antraceno no meio mineral em
porcentagens semelhantes ao consórcio 2, foram praticamente incapazes de
mineralizar este HAP no solo. Por outro lado, os microrganismos obtidos pela
metodologia 2 foram capazes de degradar o antraceno no meio mineral e
mineralizar este HAP no solo, demonstrando que esta metodologia pode ter
amenizado as alterações genéticas, fisiológicas e morfológicas dos
microrganismos do inóculo, que reduziram a capacidade do consórcio 1 em
degradar os contaminantes no solo.
161
Tempo, dias
0 1020304050
C-CO
2
, mg kg
-1
de solo
0
100
200
300
400
500
Sem inóculo
Consórcio 1
Consórcio 2
FIGURA 2. Produção de C-CO
2
de um solo contaminado com 500 mg kg
-1
de
antraceno e inoculado com consórcios microbianos (dados são médias de duas
repetições; barras representam o erro padrão).
A diferença na habilidade de mineralização do antraceno pelos
microrganismos das metodologias 1 e 2 pode ser devido a vários fatores. Na
metodologia 1, não tem-se informações acerca da atividade dos
microrganismos degradadores nos locais de coleta do solo. Já na metodologia
2, o ensaio respirométrico nos fornece um indicativo da atividade da população
degradadora e ao mesmo tempo, possibilita o período de “enriquecimento no
solo”, onde as populações degradadoras têm condições químicas e físicas
mais adequadas para o seu crescimento e degradação dos HAPs.
Se fosse necessário, o período de tempo destinado ao experimento
respirométrico poderia ter sido menor, uma vez que a maior atividade de
mineralização da amostra 5 pode ser verificada aos 30 dias após o início do
experimento (Figura 1). Além disso, a redução do número de transferências
durante o enriquecimento em meio mineral pode compensar, pelo menos em
parte, o período de tempo destinado ao ensaio respirométrico.
162
A opção pela redução do período de enriquecimento não comprometeu o
enriquecimento das populações degradadoras, pois possibilitou o isolamento
de microrganismos comprovadamente degradadores de antraceno e pode ter
reduzido as alterações genéticas, fisiológicas e morfológicas impostas pelo
cultivo in vitro, mantendo os microrganismos adaptados a degradação no solo.
Em vista da complexidade estrutural dos HAPs, creditar as culturas
puras a tarefa de, isoladamente, mineralizar estes compostos no solo pode
resultar em insucessos. Assim também, a formação de consórcios pela simples
mistura de microrganismos isolados de diferentes locais pode não resultar no
somatório de capacidades degradativas, em vista da possibilidade ocorrência
de relações antagonísticas entre os microrganismos e da sobreposição de
nichos na degradação dos HAPs. É provável que o isolamento de consórcios
microbianos obtidos em um mesmo local pode mais facilmente resultar em
complementaridade metabólica, o que aumenta a possibilidade de eliminação
completa dos HAPs do ambiente e a ocorrência de um efetivo processo de
biorremediação.
Por fim há que perceber que tem-se utilizado unicamente a
biodegradação em meio mineral como forma de selecionar microrganismos
para a degradação ou mineralização dos HAPs no solo. A utilização da
metodologia 2 é uma tentativa de aproximar o método de isolamento do
objetivo almejado.
163
6.5 CONCLUSÕES
1) Os microrganismos obtidos pela metodologia clássica degradam
eficientemente os HAPs no meio mineral, porém mineralizam baixíssimas
porcentagens do antraceno do solo;
2) A metodologia proposta no trabalho possibilita a obtenção de
microrganismos com capacidades de degradação de HAPs em meio mineral
semelhantes aos obtidos pela metodologia clássica;
3) Os microrganismos obtidos pela metodologia proposta mineralizam a
grande maioria do antraceno presente no solo e em curto período de tempo,
demonstrando que esta metodologia foi mais eficiente no isolamento de
microrganismos com habilidade de mineralizar HAPs no solo.
164
6.6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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7. CONCLUSÕES GERAIS
A partir de amostras de solo de landfarming foi isolado e identificado um
consórcio microbiano, composto por seis bactérias e um fungo, que degrada
eficientemente o antraceno, o fenantreno e o pireno no meio mineral e
apresenta grande versatilidade metabólica ao utilizar vários hidrocarbonetos ou
intermediários do metabolismo destes compostos como única fonte de carbono
e energia para o seu crescimento. Este consórcio microbiano foi obtido através
de uma nova metodologia de enriquecimento, que foi utilizada visando reduzir
as alterações celulares impostas pelo cultivo em meio líquido e manter as
características genéticas, fisiológicas e morfológicas dos microrganismos
adaptadas a degradação de hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HAPs) no
solo. O consórcio microbiano degrada e mineraliza altas porcentagens das
diferentes concentrações de antraceno, fenantreno e pireno presentes no solo,
o que resulta em grande aumento da mineralização se comparado a microbiota
autóctone do solo. Se inoculado separadamente ao solo, as bactérias e o fungo
apresentam baixas porcentagens de mineralização do antraceno quando
comparado a inoculação conjunta na forma de consórcio. A mineralização por
este consórcio microbiano do antraceno no solo demanda condições de alta
umidade e pH próximo da neutralidade. O aumento do nitrogênio mineral e a
conseqüente redução da relação C:N do solo tendem a diminuir a
mineralização do antraceno. O aumento da disponibilidade de fósforo, ferro e
enxofre, e a presença de amplas relações C:P e C:N:P no solo não influenciam
a mineralização do antraceno. Comprova-se que a seleção e a inoculação ao
solo de microrganismos degradadores de HAPs, associado a modificação de
condições ambientais deste solo pode conduzir a um eficiente processo de
biorremediação, onde a maioria dos HAPs é mineralizado em curto período de
tempo.
8. APÊNDICE
Sequências do gene do RNAr utilizadas para a identificação dos isolados:
Isolado 1
TCATGGCTCAGGACGAACGCGGGCTGCTTAACACATCAAGTCGAACGGAA
AGGCCCTTCGGGGTACTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGTG
ATCTGCCCTGCACTTTGGGATAAGCCTGGGAAANTGGGTCTAATACCGAAT
ATGACCACATGCTTCATGGTGTGTGGTGGAAAGCTTTTGCGGTGTGGGAT
GGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCG
ACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGA
TACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATG
GGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGACGGGATGATCGGCCTTCG
GGTTGTAAACCTCTTTCAATAGGAACGAAGCGCAAGTGATCGTAC
Isolado 2
GATGAACGCGGGCGTGCCTAATACATGCAAGTCGAGCGAAGGATTAAGAG
CTTGCTCTTATGAAGTGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTC
CCATAAGATGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGATAACATTTT
GAACCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGG
ACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGNAACGGCTCACCAAGGCACGA
TGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGCCACACTGGGACTGAGACACGN
CCCAGACTCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAA
GTCTGACGGAGCAACCGCCGCGTGAGTGANAAGGCTTTCGGGTCGTAAAA
CTCTGTTGTTAGGGAAGAACCAAGTGACTAGTTGAATAAGCTGGCACCTGA
GCGG
171
Isolado 3
TTTTAGAGTTTGGTCATGCTCAGGATGAACGCTGGCGGCTGTTAACACATC
AAGTCGAACGATAATCCAGCTTGCTGGGGGGATTAGTGGCGAACGGGTGA
TAACACGTGAGCAACCTGCCCTGGACTNTGGGATAAGCGCTGGAAACGGT
GTCTAATACNGGATATGAGCTTTCACCGCATGGTGGGGGTTGGAAAGATTT
TTCGGTTCAGGATGGGCTCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGAGGTAATGG
CTTACCAAGGCGTCGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACA
CTGGGANTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAA
TATTGCACAATGGGCGGAAGCCTGATGCAGCAACGCCGCGTGAGGGATG
ACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGCAGGGAAGAAGCGTGAGTGAC
GTAC
Isolado 4
GTCATGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCTGTTAACACATCAAGTCGAACG
GAAAGGCCCTGCTTGCAGGGTGCTCGAGTGGCGAACGGGTGAGTAACAC
GTGGGTGATCTGCCCCTGACTTTGGGATAAGCCTGGGAAACTGGGTCTAA
TACCGGATATGACCAAGGATTGCATGGTTNTTGGTGGAAAGCTTTTGCGGT
TGGGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTAC
CAAGGCGACGACGGGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGG
ACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTG
CACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGATCGG
CCTTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCCAGGGACGAAGCGCAGTGACCGT
ACCTGCGAAAAG
Isolado 5
ATGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACG
ATGAACCTGGAGCTTGCTCTAGGGAATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACA
CGTGAGTAACCTGCCCTTGACTCTGGGATAACCTCCGGAAACGGAAGCTA
ATACCGGATATGACGCACGGAGGCATCTCCTGTGCGTGGAAAGAACTTCG
GTCAAGGATGGACTCGCGGCCTATCAGGTAGTTGGTGAGGTAACGGCCCA
CCAAGCCTACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGG
GACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATT
GCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCAATCGCCGCGTGAGGGATGACG
GCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGTAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGTA
CCCTGCG
172
Isolado 6
TGGCTCAGGACGAACGCTGGCGGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGA
TGAACCTGGAGCTTGCTCTAGGGAATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACAC
GTGAGTAACCTGCCCTTGACTCTGGGATAACCTCCGGAAACGGAAGCTAA
TACCGGATATGACGCACGGAGGCATCTCCTGTGCGTGGAAAGAATTTCGG
TCAAGGATGGACTCGCGGCCTATCAGGTAGTTGGTGAGGTAACGGCCCAC
CAAGCCTACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGG
ACTGATACACGGCCCAGACTCTTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGC
ACAATGGGCGCAAGCCTGATGCAGCAATCCCGCGTGAGGGACGACGGCC
TTCGGGTTGTAAACCTCTTTTAGTAGGGAAGAAGCAAAGTGTCGTACTGCG
AAA
Isolado 7
TCCCAACCGTGTGATTACCATTGTAGCTCGGCGGATCAGCCCGCTCCCG
GTAAAACGGGACGGCCCGCCAGAGGACCCCTAAACTCTGTTTCTATATG
TAACTTCTGAGTAAAACCATAAATAAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTC
TTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCAAAATGCGATAAGTAATGTGA
ATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGC
CAGTATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCAAGC
ACAGCTTGGTGTTGGGACTCGCGTTAATTCGCGTTCCTCAAATTGATTGG
CGGTCACGTCGAGCTTCCATAGCGTAGTAGTAAAACCCTCGTTACTGGT
AATCGTCGCGGCCACGCCGTTAAACCCCAACTTCTGAATGTTGACCTCG
GATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGAG
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