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Universidade
Estadual de Londrina
EDNEIA APARECIDA DE SOUZA-PACCOLA
BIOLOGIA E HISTOPATOLOGIA DE Colletotrichum
sublineolum EM SORGO
Londrina
2006
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ii
EDNEIA APARECIDA DE SOUZA-PACCOLA
BIOLOGIA E HISTOPATOLOGIA DE Colletotrichum
sublineolum EM SORGO
Londrina
2006
Tese apresentada ao Curso de Pós-
graduação em Agronomia da
Universidade Estadual de Londrina,
como requisito à obtenção do título de
doutor em Agronomia
Orientadora: Dr
a
. Luzia Doretto
Paccola-Meirelles
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iii
COMISSÃO EXAMINADORA
MEMBROS TITULARES
___________________________________________________
Prof. Dra. Luzia Doretto Paccola-Meirelles (UEL/CCB)
_________________________________________________
Prof. Dr. Nelson Sidnei Massola Júnior (ESALQ/USP)
________________________________________
Prof. Dr. Dauri José Tessman (UEM)
_______________________________________________
Dr. Álvaro Manuel Rodrigues Almeida (EMBRAPA Soja)
_______________________________________________
Dra. Claudine Dinali Santos Seixas (EMBRAPA Soja)
MEMBROS SUPLENTES
Dr. Rui Pereira Leite Júnior (IAPAR)
Prof
a
. Dr
a
. Débora Cristina Santiago (UEL)
Londrina, 21 de Fevereiro de 2006.
iv
DEDICATÓRIA
Aos meus pais, Pedro Alexandrino de Souza e
Maria Aparecida de Souza, os grandes
responsáveis pela minha formação.
Ao companheiro, Carlos Antônio Paccola, amigo e
aliado constante, pela paciência, apoio, incentivo e
amor, especialmente nos momentos difíceis.
Dedico-lhes este trabalho, em nome de tudo o que
significam para mim, agradecendo-lhes pelo amor,
confiança e apoio de sempre.
v
AGRADECIMENTOS
À DEUS, que se fez sempre presente, e que me permitiu chegar até aqui para desfrutar de tão
especial e único momento. A todos aqueles que com auxílio, presença e apoio me ajudaram a
concluir esta tese, quer seja com sua valiosa colaboração, quer seja com palavras de apoio, ou
mesmo com sua presença amiga e descontraída.
Agradecimentos especiais:
À prof
a
. Dr
a
. Luzia Doretto Paccola-Meirelles, que conduziu a orientação desta tese com
seriedade e competência exemplares. Agradeço-lhe sobretudo pela participação ativa em todas as
etapas, pela amizade, apoio, confiança e incentivo;
Aos Drs. Nelson Sidnei Massola Júnior e Elliot W. Kitajima, que gentilmente me
receberam em seus laboratórios da ESALQ/USP para a realização dos experimentos, pelas
sugestões e incentivo;
Ao Dr. Carlos Roberto Casela, que gentilmente me recebeu em seu laboratório na
EMBRAPA Milho e Sorgo, para realização de parte dos experimentos, pelas sugestões e interesse
pelo nosso trabalho;
À Prof
a
. Dr. Suzana de Fátima Paccola-Mesquita (UEL), pelas sugestões e pela presença
amiga;
Aos Drs. Franscisco Tanaka e Paulo Tarso, pela paciência e valiosas dicas no manuseio
das amostras e do microscópio eletrônico de transmissão e de varredura;
Ao técnico Ideval (UEL), Clóvis (EMBRAPA Milho e Sorgo) e Renato (ESALQ/USP),
pelas valiosas dicas e prestatividade;
À amiga Cleide A. Bomfeti e Léia C. L. Fávaro, pela amizade, pela “força”, pelos
momentos de descontração e divertido companheirismo e aos amigos do laboratório Maria
Eugênia, Viviane, Gabriela, Maria Paula, Philip, Daiana, Roberto, Kátia, Ana Paula,
Júnior, Manuela, Alexei. A vocês, minha gratidão pela torcida, pelo apoio e pelo carinho de
sempre;
À minha irmã Edna A. Souza-Mendonça, pelo carinho e apoio sempre presentes;
A todos os professores que contribuíram para minha formação profissional;
À Universidade Estadual de Londrina, por fornecer estrutura e condições para a
realização dos experimentos;
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pelo
auxílio financeiro através da concessão da bolsa de estudos.
vi
BIOLOGIA E HISTOPATOLOGIA DE Colletotrichum sublineolum EM SORGO
RESUMO GERAL
A antracnose causada por Colletotrichum sublineolum é a mais importante doença da cultura do
sorgo (Sorghum bicolor). Resultados da literatura relatam que este fungo apresenta dimorfismo
conidial quando cultivado em meio sintético. Em meio sólido são produzidos conídios falcados e
em meio líquido, os conídios ovais. Por serem escassas as informações sobre a biologia dos
conídios ovais, este trabalho objetivou em um primeiro momento, estudar os estádios de
desenvolvimento de conídios falcados e ovais de C. sublineolum sobre superfícies artificiais
através da microscopia de luz e em folhas de sorgo através da microscopia eletrônica de
varredura e de transmissão. E no segundo momento examinar o processo de infecção tanto do
conídio falcado quanto do oval de C. sublineolum sobre cultivares de sorgo, a fim de determinar a
diferença no processo de infecção entre os dois conídios e a reação dos cultivares frente à
colonização dos dois tipos de conídios. Em superfícies artificiais, á semelhança dos conídios
falcados, os conídios ovais se aderem, germinam e formam estruturas de infecção. A partir da
germinação de conídios falcados sobre estas superfícies, são formadas hifas espessas altamente
vacuoladas e em suas regiões apicais e laterais, dão origem aos conídios ovais. Conídios ovais
quando inoculados sobre folhas de sorgo germinam e com 24h formam apressório, caracterizando
o processo de adesão deste conídio. Acérvulos com setas contendo conídios falcados envoltos por
mucilagem foram formados a partir da infecção de conídios ovais sobre a superfície foliar,
caracterizando o processo infectivo deste conídio. Conídios ovais apresentam semelhanças nos
eventos de pré-penetração e penetração com os conídios falcados de C. sublineolum, no entanto
no processo de infecção, os conídios falcados produzem hifas de penetração em proporção
superior aos conídios ovais. Vesículas de infecção são formadas nas células epidérmicas do
hospedeiro, abaixo tanto dos apressórios oriundos da germinação de conídio falcado como oval.
Conídios ovais mostraram-se infectivos e capazes de desenvolver uma série de estruturas de
infecção, como por exemplo, tubo germinativo, apressório, poro de penetração, vesículas de
infecção, hifas primárias e hifas secundárias, completando assim o ciclo da doença. Porém é de
extrema importância investigações mais precisas para esclarecer o verdadeiro papel biológico
destes conídios no processo de estabelecimento e disseminação da doença.
vii
BIOLOGY AND HISTOPATHOLOGY OF Colletotrichum sublineolum IN SORGHUM
OVERALL ABSTRACT
Anthracnose, caused by Colletotrichum sublineolum, is the most important disease of sorghum
(Sorghum bicolor). Results in the literature report that this fungus exhibits conidial dimorphism
when grown in synthetic media. Falcate conidia are produced in solid media whereas oval conidia
are produced in liquid media. Because information on the biology of oval conidia is scarce, this
research aimed to initially study the stages of development of falcate and oval conidia of C.
sublineolum on artificial surfaces through light microscopy and in sorghum leaves through
scanning and transmission electron microscopy. And, further on, to examine the infection process
of falcate, as well as oval conidia of C. sublineolum in sorghum cultivars, to determine the
difference in the infection process between the two conidia and the reaction of the cultivars in the
face of colonization by both types of conidia. On artificial surfaces, similarly to falcate conidia,
oval conidia adhere, germinate and form infection structures. Highly vacuolated, thick hyphae are
formed from the germination of falcate conidia on these surfaces and oval conidia are formed on
the apical and lateral regions of these hyphae. Oval conidia, when inoculated on sorghum leaves,
germinate and with 24 hours form the appressorium, characterizing the process of adhesion of
this conidium. Acervuli with setae containing falcate conidia enveloped in mucilage were formed
by the infection of oval conidia on the foliar surface, characterizing the infective process of this
conidium. Oval conidia exhibit similarities to falcate conidia of C. sublineolum in pre-penetration
and penetration events, however, in the infection process falcate conidia produce penetration
hyphae in superior proportion to oval conidia. Infection vesicles are formed in the epidermal cells
of the host, under the appressoria originated from the germination of either falcate or oval
conidia. Oval conidia were infective and capable of developing a series of infection structures,
such as the germ tube, appressorium, penetration pore, infection vesicle, primary and secondary
hyphae, thus completing the disease cycle. However, more precise investigations are extremely
important to clarify the true biological role that these conidia have in the establishment and
dissemination of the disease.
viii
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO 01
REVISÃO DE LITERATURA 04
2.1 Histórico, Distribuição e Importância da Antracnose 05
2.2 Ambiente e Desenvolvimento da Doença 06
2.3. Sintomas da Doença 07
2.4. Características Biológicas do Patógeno 10
2.4.1. Dimorfismo Conidial 12
2.5. Sobrevivência e Disseminação do Patógeno no Ambiente 13
2.6. Patogênese . 14
2.7. Eventos de Pré-Penetração e Penetração 15
2.8. Infecção e Colonização dos Tecidos 17
2.9. Literatura Citada 20
ARTIGO 1: Aspectos Biológicos, Ultra-Estruturais e Patogênicos do Conídio Oval de
Colletotrichum sublineolum
3.1. Resumo 32
3.2. Abstract 33
3.3. Introdução . 34
3.4. Material e Métodos 35
3.5. Resultados e Discussão 41
3.7. Referências Bibliográficas 56
ARTIGO 2: Morfogênese e Mecanismo de penetração de Conídios Falcados e Ovais de
Colletotrichum sublineolum
4.1 Resumo 59
4.2 Abstract 60
4.3. Introdução . 61
4.4. Material e Métodos 63
4.5. Resultados e Discussão 65
4.7. Referências Bibliográficas 73
ARTIGO 3: Dimorfismo Conidial em Colletorichum sublineolum: Um Estudo Citológico
Comparativo do Processo de Infecção
5.1 Resumo 76
5.2 Abstract 77
5.3. Introdução 78
5.4. Material e Métodos 80
5.5. Resultados e Discussão 84
5.7.Referências Bibliográficas 103
CONCLUSÃO 108
1
1. INTRODUÇÃO
O sorgo é um dos principais cereais cultivados no mundo, particularmente em
áreas de alta temperatura e baixa precipitação, onde atinge altas produções de grãos e de
forragens.
São cultivados quatro tipos de sorgo: o granífero, o forrageiro, o sacarino e o
vassoura. O sorgo granífero pode ser utilizado na alimentação humana, constituindo alimento
importante para a população. É bastante empregado na forma de farinha nos países da África e
Ásia. Este tipo de sorgo apresenta uma composição química semelhante à do milho, e pode
substituí-lo como fonte energética em rações de bovinos, suínos e aves. Na indústria é utilizado
para a produção de amido, farinha, cerveja, cera, óleo comestível. Sua farinha pode ser misturada
com a do trigo para a fabricação de pães e massa.
O sorgo forrageiro é empregado na produção de feno, silagem e pastejo direto,
possuindo elevado potencial produtivo e de adaptação a regiões mais secas.
O sorgo sacarino pode ser utilizado na produção de xarope, que substitui o
açúcar como adoçante em indústrias, podendo ser empregado também na produção de álcool a
partir dos açúcares diretamente fermentáveis existentes no colmo.
O sorgo vassoura apresenta porte alto, com colmos geralmente finos e panículas
com características especiais, que as tornam adaptadas ao fabrico de vassouras e escovas.
Pela ampla faixa de ambiente em que é cultivado, o sorgo apresenta-se
vulnerável a um grande número de doenças. A mais importante entre elas é a antracnose, causada
pelo fungo Colletotrichum sublineolum, encontra-se disseminada nas principais regiões
produtoras do país, constituindo fator limitante ao desenvolvimento dessa cultura, por ocasionar
altas perdas na produção de grãos e forragens.
2
São reconhecidas três fases da doença: a antracnose foliar, a fase da podridão
do colmo e a antracnose da panícula e dos grãos, sendo a fase foliar, a mais destrutiva,
normalmente observada a partir de 30 a 40 dias após a emergência.
O emprego de cultivares resistente é o método mais eficiente de controle da
antracnose. Entretanto, essa medida é dificultada pela variabilidade apresentada por C.
sublineolum, a qual determina rápida adaptação deste patógeno aos cultivares resistentes em uso.
Colletotrichum sublineolum na sua forma assexuada forma conídios
falciformes, conhecidos como conídios falcados, os quais são produzidos em acérvulos de cor
marrom-escuros no tecido do hospedeiro ou em meio-ágar. Os estromas medem de 70-300 µm de
diâmetro e são providos de setas escuras, septadas com 100 µm de comprimento. Os conidióforos
produzidos nos acérvulos são eretos, hialinos, não-septados e curtos, medindo 1,6-3,3 x 4,9-13,3
µm, liberando conídios terminalmente entre as setas. Os conídios com dimensão de 4,9-5,2 x
26,1-30,8 µm são hialinos, não septados, cilíndricos e obclavéos, sendo que a sua germinação
ocorre em qualquer área do conídio.
Um tipo de dimorfismo conídial foi anteriormente descrito neste fungo quando
cultivado em meio de cultura sólido e líquido. Em meio sólido conídios falcados são produzidos,
enquanto que em meio líquido os conídios ovais.
Diante destas considerações e por serem escassas as informações sobre o
verdadeiro papel dos conídios ovais e a importância destes na relação patógeno-hospedeiro, estas
observações nos levaram a estudar os estádios de desenvolvimento e o processo de infecção de
conídio falcado e oval de C. sublineolum através da microscopia de luz, microscopia eletrônica
de transmissão e microscopia eletrônica varredura. A tese é apresentada na forma de artigos
científicos, a saber:
3
Artigo 1: ASPECTOS BIOLÓGICOS, ULTRA-ESTRUTURAIS E PATOGÊNICOS DO
CONÍDIO OVAL DE Colletotrichum sublineolum
Artigo 2: MORFOGÊNESE E MECANISMO DE PENETRAÇÃO DE CONÍDIOS
FALCADOS E OVAIS DE Colletotrichum sublineolum
Artigo 3. DIMORFISMO CONIDIAL EM Colletotrichum sublineolum: UM ESTUDO
CITOLÓGICO COMPARATIVO DO PROCESSO DE INFECÇÃO.
4
2. REVISÃO DE LITERATURA
O sorgo [Sorghum bicolor (L.) Moench] é uma planta nativa da África Central,
da região da Etiópia e Sudão, de onde propagou se por todo o continente africano e asiático,
atingindo, posteriormente, a América e a Austrália (Frederiksen,1986). Trata-se de um importante
cereal cultivado no mundo, principalmente nas áreas de alta temperatura e baixa precipitação,
onde atinge elevada produção de grãos e de forragem (Leslie e Frederiksen, 1995). A produção
mundial de sorgo, no ano de 2001, foi de aproximadamente 58 milhões de toneladas,
correspondendo a uma área colhida de cerca de 42 milhões de hectares (FAO, 2002). A produção
no Brasil, apesar de contribuir com apenas cerca de 1,54 % da produção mundial, tem
apresentado aumentos significativos de produção nos últimos anos, passando de 356.467
toneladas no ano de 1996, para 895.331 toneladas no ano de 2001 (FAO, 2002).
No Brasil, a cultura do sorgo ocorre em regiões ecologicamente distintas e com
diferentes sistemas de produção. Na região Sul, especialmente no Rio Grande do Sul, o déficit
hídrico acentuado na região de Bagé proporcionou o estabelecimento e a expansão da cultura. Na
região Nordeste, o sorgo sempre foi apontado como opção para cultivo, por apresentar maior
tolerância ao déficit hídrico. Nas regiões Centro-Oeste e Sudeste, o sorgo é cultivado em
monocultivo em plantios de verão, principalmente em sucessão com a soja (Pitta, 1991; Waquil,
1992; Duarte, 1994).
Pela ampla faixa de condições ambientais em que é cultivado, o sorgo
apresenta-se particularmente suscetível a um grande número de doenças, cuja extensão e
severidade variam de ano para ano e de uma localidade para outra em função do grau de
compatibilidade entre o hospedeiro e o patógeno e da ação do ambiente sobre essa associação.
5
Atualmente, a antracnose, doença causada pelo fungo Colletotrichum sublineolum Henn. [as
“sublineola”], em Kabát & Bubát é considerada a principal doença do sorgo e encontra-se
disseminada em todas as regiões produtoras, constituindo fator limitante ao desenvolvimento da
cultura, por ocasionar grandes perdas de produção de grãos e de forragens (Guimarães et al.,
1999). Perdas superiores a 50% na produção de grãos, têm sido relatadas, sob condições de
epidemias severas, principalmente quando há alternância de condições secas e úmidas associadas
a temperaturas elevadas (Casela et al., 1997).
2. 1. HISTÓRICO, DISTRIBUIÇÃO E IMPORTÂNCIA DA ANTRACNOSE
A antracnose do sorgo foi descrita pela primeira vez em Togo, Oeste da África,
em 1902 (Pande et al., 1991). Posteriormente, detectada no Texas, Estados Unidos da América
(EUA), no ano de 1912 (Casela et al., 1997). Atualmente a doença encontra-se presente em,
praticamente, todas as regiões produtoras de sorgo no mundo, sendo predominante em regiões de
clima quente e úmido envolvendo os trópicos semi-áridos, úmido e regiões de clima temperado
com temperaturas elevadas no período do verão (Ali e Warren, 1987; Pande et al., 1991; Pande et
al., 1994) incluindo a África, Ásia e as Américas (Frederiksen, 1986).
Perdas na produção de grãos têm sido relatadas em diversos locais onde o sorgo
é cultivado, como por exemplo, nos EUA onde perdas superiores a 50% foram constatadas em
cultivares suscetíveis durante severas epidemias da doença (Harris e Johnson, 1967), Porto Rico,
onde as perdas foram superiores a 70% (Powell et al., 1977), na Índia, com perdas de até 16,4%
(Mishra e Siradhama, 1979), na Nigéria, onde são relatadas perdas em torno de 45% (Neya e
Kabore, 1987), e no Oeste da África, onde há relatos de perdas acima de 50% (Thomas et al.,
6
1995). Segundo Powell et al., (1977), as reduções na produção devido à antracnose, resultaram de
incompleto enchimento de grãos, como demonstrado por reduções no peso e na densidade de
sementes por panícula.
No Brasil, a antracnose do sorgo foi relatada pela primeira vez no estado de São
Paulo, em 1934 (Panizzi e Fernandes, 1997) e atualmente está presente em todas as áreas
produtoras (Casela et al., 2001). Reduções superiores a de 80% na produção de grãos têm sido
constatadas em cultivares suscetíveis, em anos e locais favoráveis ao desenvolvimento e
disseminação da doença (Panizzi e Fernandes, 1997).
2. 2. AMBIENTE E DESENVOLVIMENTO DA DOENÇA
Epidemias de antracnose do sorgo são favorecidas por condições de alta
precipitação e umidade relativa, temperatura moderada e grande quantidade de inóculo
(Frederiksen, 2000). Segundo Pande et al. (1994), o máximo desenvolvimento da doença foi
observado em temperaturas em torno de 25
o
C, enquanto temperaturas abaixo de 15
o
C e acima
de 30
o
C restringiram seu desenvolvimento. Segundo os mesmos autores, um período mínimo de
24 h de molhamento foliar é necessário para iniciar o processo de infecção pelo fungo cuja
severidade aumenta com o aumento do período de molhamento foliar.
7
2.3. SINTOMAS DA DOENÇA
São reconhecidas três fases da doença: a antracnose foliar, a podridão do colmo
e a antracnose da panícula e dos grãos (Thakur e Mathur, 2000). A fase foliar da antracnose
(Figura 1A – 1B) é mais prevalecente a partir do desenvolvimento da panícula, podendo
entretanto ocorrer em qualquer estádio de desenvolvimento da planta. Nesta fase os sintomas
iniciais são caracterizados por pequenas lesões elípticas a circulares, com diâmetro em torno de 5
mm. Com a evolução das lesões, elas passam a apresentar centros necróticos de coloração palha,
com margens avermelhadas, alaranjadas ou castanhas, variando em função da pigmentação da
cultivar. No centro das lesões há formação, em quantidade variável, de acérvulos, a frutificação
típica do patógeno, que constituem a principal forma de identificação da doença em condições de
campo. A coalescência é observada principalmente sob condições de alta umidade, quando
grande parte do limbo foliar apresenta-se tomado por lesões, no centro das quais há formação de
grande quantidade de acérvulos (Warren, 1986).
A infecção na nervura central da folha (Figura 1A) ocorre de maneira
independente da infecção foliar (Thakur e Mathur, 2000). Nesse caso, os sintomas são
caracterizados por lesões elípticas a alongadas, de coloração avermelhada, púrpura ou escura, nas
quais podem ser observados os acérvulos do patógeno. A fase de podridão do colmo ocorre
principalmente a partir da maturação das plantas e, normalmente, é causada por conídios
produzidos na fase foliar da doença. Os sintomas caracterizam-se pela formação de cancros, com
áreas mais claras circundadas por áreas com pigmentação característica da planta hospedeira. As
lesões ocorrem no tecido internodal, principalmente no pedúnculo, podendo apresentar-se de
forma contínua ou na forma de manchas isoladas. Quando o colmo é seccionado
8
longitudinalmente, observa-se uma coloração avermelhada a escura, equivalente à necrose do
tecido vascular (Warren, 1986; Casela e Ferreira, 1998).
A infecção da panícula (Figura 1C) pode ser uma extensão da fase de podridão
do colmo. Os sintomas caracterizam-se pela presença, abaixo da epiderme, de lesões que têm,
inicialmente, um aspecto encharcado, adquirindo, mais tarde, uma coloração cinza a púrpura –
avermelhada. Se o pedúnculo é seccionado longitudinalmente, verifica-se uma coloração
castanho–avermelhada, alternada com áreas de tecido esbranquiçado. Panículas de plantas
infectadas normalmente são menores e amadurecem mais cedo (Warren, 1986). A antracnose da
panícula e dos grãos tem como inóculo, conídios produzidos durante a fase foliar da doença, os
quais são levados à bainha das folhas pela água da chuva, germinam e penetram o pedúnculo ou a
panícula, causando a podridão no interior do colmo (Figura 1D) (Guimarães, 1996; Casela e
Ferreira, 1998). A esporulação ocorre na ráquis central, estendendo-se para as demais
ramificações, glumas e sementes. Desse modo, a antracnose prejudica não só o desenvolvimento
da planta, mas também causa esterilidade parcial e redução da produção (Warren, 1986; Thakur e
Mathur, 2000).
9
A
B
C
D
Figura 1. Sintomas da doença causada por Colletotrichum sublineolum em sorgo. (A) Infecção
da nervura central da folha caracterizada pela presença de lesões elípticas a alongadas, de
coloração avermelhada, púrpura ou negra. (B) Infecção das folhas caracterizada pela produção
de lesões elípticas a circulares de coloração palha, com margens avermelhadas, alaranjadas,
púrpura-escuras ou castanhas. (C) Panícula de sorgo com sintomas de antracnose ao lado de
uma panícula sadia. A infecção da panícula é caracterizada por lesões formadas abaixo da
epiderme, que tem, inicialmente, um aspecto encharcado, adquirindo mais tarde, uma
coloração cinza a púrpura-avermelhada. (D) Podridão de antracnose em colmos de sorgo,
caracterizada pela formação de cancros, os quais apresentam áreas mais claras circundadas
pela pigmentação característica da planta. (Fotos: Casela e Ferreira, 1998)
10
2.4. BIOLOGIA DO PATÓGENO
A antracnose do sorgo é causada pelo fungo Colletotrichum graminicola (Ces)
G. W. Wilson, correspondente à forma teleomórfica Glomerella graminicola Politis. A espécie C.
graminicola pertence à ordem Melanconiales, que inclui fungos assexuados que produzem
conídios em estruturas reprodutivas (conidiomas) denominadas acérvulos. Colletotrichum
graminicola foi descrito pela primeira vez em plantas de milho (Zea mays L.), na Itália, por
Cesati em 1852, com o nome de Dicladium graminicolum Ces. Posteriormente o fungo foi
constatado nos Estados Unidos no ano de 1855, e descrito sob o nome de Psilonia apalospora
Berk & Curt (Sutton, 1980). Wilson (1914) incluiu 11 espécies que apresentavam conídios
falciformes à sinonímia C. graminicola. Outras espécies como C. cereale Manns e C. lineola
Corda, foram incluídas nesse amplo conceito de C. graminicola, com exceção da espécie
Colletotrichum falcatum Went, agente causal da podridão vermelha da cana-de-açúcar
(Saccharum officinarum L.).
Trabalhos envolvendo isolados de C. graminicola provenientes de milho e
sorgo, têm demonstrado uma estreita especificidade de hospedeiro (Jamil e Nicholson, 1987),
indicando que as formas de C. graminicola que atacam o milho e o sorgo são distintas, podendo
ser consideradas como formae speciales ou espécies diferentes. Mais recentemente, estudos
comparando as seqüências de nucleotídeos de rDNA da região ITS-2 de C. graminicola
proveniente de milho e de sorgo (Sherriff et al., 1995), testes de cruzamento, análises de RFLPs
de DNA mitocondrial e RAPD de isolados de Glomerella de milho e de sorgo (Vaillancourt e
Hanau, 1992), indicaram que os isolados de milho representam uma espécie distinta daquela dos
isolados de sorgo, confirmando estudos morfológicos e genéticos anteriores.
11
Costa et al. (2003) relataram a importância de se reconhecer a existência das
duas espécies de Colletotrichum, e que apesar da semelhança morfológica entre elas, possam
existir diferenças fisiológicas quanto ao modo de infecção, esporulação, gama de hospedeiros,
compatibilidade genética, epidemiologia e sensibilidade a fungicidas, requerendo em certos
casos, estratégias e práticas de manejo diferenciadas.
Colletotrichum graminicola à semelhança de C. sublineolum, apresenta micélio
septado, ramificado, hialino e granular. Culturas desenvolvidas em meio de aveia–ágar produzem
grande quantidade de conídios em resposta à luz a uma temperatura em torno de 25
o
C. Os
acérvulos, as estruturas de frutificação do patógeno, apresentam coloração marrom escura,
formato circular ou oval, medem de 70-300 µm e são caracterizados pela presença de setas negras
e pela grande quantidade de conídios produzidos em massa de coloração rosa a creme tanto em
meio de cultura como em tecido do hospedeiro. Os conidióforos são curtos, eretos, hialinos, não
septados e não ramificados, medindo de 1,6-3,3 x 4,9-13,3 µm. As setas são longas e septadas,
com comprimento de 100 µm e são formadas entre os conidióforos (Casela e Ferreira, 1998). Os
conídios são produzidos isoladamente na extremidade dos conidióforos entre as setas e em
massas imersas em um substrato gelatinoso; medem entre 4,9-5,2 x 26,1-30,8 µm, são hialinos,
unicelulares e falciformes. A germinação pode ocorrer em qualquer área do conídio (Warren,
1986; Thakur e Mathur, 2000).
A forma sexual, raramente encontrada na natureza, foi obtida a partir de C.
graminicola infectando milho e é caracterizada por peritécios rostrados e erumpentes, onde são
produzidas ascas cilíndricas a clavadas apresentando poro apical por onde os ascósporos são
liberados. Estes por sua vez, são hialinos, unicelulares e ligeiramente curvos, medindo cerca de 3-
6 x 8-16 µm (Politis, 1975). A forma sexual de C. sublineolum ainda não foi relatada.
12
2. 4. 1. Dimorfismo Conidial
Souza-Paccola et al. (2003a) descreveram um segundo tipo de conídio em
isolados de C. sublineolum, o conídio oval, quando cultivado em meio líquido, a exemplo
daqueles descritos em isolados de C. graminicola em milho por Nishihara (1975). Segundo esse
último autor, os conídios ovais apresentam-se mais virulentos que os conídios falcados quando
inoculados em plântulas de milho. Panaccione et al. (1989) descreveram a produção destes dois
tipos de conídios em C. graminicola tanto em cultura como em plantas infectadas. Segundo estes
autores o conídio falcado é produzido blasticamente a partir de células conidiógenas
morfologicamente distintas, enquanto que o conídio oval é produzido blasticamente a partir de
hifas que faltam as células conidiógenas diferenciadas. O conídio oval de C. sublineolum
apresenta-se com forma oval a elíptica, de tamanho variado, porém menor que o falcado (Souza-
Paccola et al., 2003a) à semelhança do conídio oval de C. graminicola (Panaccione et al., 1989).
Yang et al. (1991), observaram que a luz branca induz a expressão do gene responsável pela
formação dos conídios ovais a partir de hifas de C. graminicola.
Segundo Souza-Paccola et al. (2003a) os conídios ovais representam uma
alternativa importante para estudos de natureza genética e para testes de patogenicidade,
principalmente em linhagens que dificilmente esporulam em meios sintéticos. Estes autores
utilizando conídios ovais, provenientes de linhagens mutantes de C. sublineolum não produtoras
de conídios falcados, descreveram a anastomose de hifas seguida de parameiose (Souza-Paccola
et al., 2003b) como mecanismos geradores de variabilidade genética na espécie, sendo
responsáveis em parte pelo aparecimento de novas raças fisiológicas.
13
Fávaro (2004) descreve elementos genéticos transponíveis como possíveis
mediadores de variabilidade genética em C. sublineolum.
2. 5. SOBREVIVÊNCIA E DISSEMINAÇÃO DO PATÓGENO NO AMBIENTE
Conídios ou micélio do patógeno podem sobreviver por até 18 meses na
ausência do hospedeiro, em restos culturais na superfície do solo, mas não sobrevivem quando
restos culturais são incorporados ao solo (Warren, 1986; Casela e Ferreira, 1998; Thakur e
Mathur, 2000). O fungo pode também sobreviver em espécies selvagens de sorgo, como S.
halepense (L.) Persoon, S. verticilliflorum (Steud.) Stapf., S. arundinaceum (Desv.) Stapf., e
ainda como micélio e conídios em sementes infetadas. Nos acérvulos há produção de uma
mucilagem que protege os conídios da dessecação e da ação de compostos fenólicos produzidos
pela planta, os quais impedem a sua germinação (Ngugi et al., 2000).
Abundante produção de microesclerócios pode ser observada em colmos secos
de cultivares sensíveis, ao final o ciclo da cultura. Estas estruturas desempenham um importante
papel como fonte primária de inóculo (Casela e Frederiksen, 1993). Os microesclerócios são
esporogênicos sendo sua sobrevivência maior em restos culturais mantidos na superfície do solo.
A mais rápida degradação dos restos culturais abaixo da superfície do solo contribui para a
colonização dos microesclerócios por microorganismos presentes na microflora do solo (Casela e
Frederiksen, 1993).
A disseminação através dos conídios ocorre principalmente através de
respingos de chuva, e em menor proporção, através do vento. Em condições de campo, a
14
dispersão dos conídios em respingos de água no sentido vertical, pode atingir distâncias de até 75
cm da fonte de inóculo, enquanto a dispersão lateral pode atingir até 1 m (Nicholson e Moraes,
1980; Ngugi et al., 2000). Pande et al. (1994) estudaram a distância e a direção da dispersão de
conídios de C. graminicola a distâncias crescentes de 0,75 m a partir da fonte de inóculo, durante
o período chuvoso de 1985, no sul da Índia. Segundo os autores, dentro de sete dias foram
observados sintomas da doença na fonte de inóculo, a 3,5 m da fonte na fase de 13-14 folhas, e a
9,75 m na fase de maturação. A disseminação de C. graminicola a longa distância se dá
principalmente através de sementes contaminadas (Cardwell et al., 1989).
2. 6. PATOGÊNESE
O conhecimento do processo de infecção das espécies de Colletotrichum em
seus hospedeiros, assim como os fatores que influenciam tais processos são um pré-requisito para
o desenvolvimento de estratégias efetivas de controle, fornecendo informações para a elaboração
de modelos de previsão, auxiliando na seleção e aplicação de estratégias de controle (Bailey et al.
1992).
Na literatura o processo de infecção e penetração do patógeno é bem estudado
em isolados de Colletotrichum graminicola em milho. Pouco é conhecido em C. sublineolum,
porém devido à semelhança entre esses dois patógenos, o processo é descrito com base nas
descrições feitas em C. graminicola e em outras espécies de Colletotrichum.
15
2. 7. EVENTOS DE PRÉ-PENETRAÇÃO E PENETRAÇÃO
Infecção típica de Colletotrichum envolve uma seqüência comum de eventos.
Inicialmente tem-se a adesão dos conídios ou ascósporos dispersos sobre a planta, sendo este um
processo passivo e inespecífico (Bailey et al., 1992; Lopez, 2001). Logo após a deposição na
superfície foliar, os conídios de C. graminicola, em contato com um filme de água na superfície
da folha, iniciam o processo de germinação. Segundo Wharton e Julian (1996), a maioria dos
esporos germina dentro de um período de nove horas. Tanto conídios quanto ascósporos emitem
tubos germinativos indiferenciados ou podem passar por uma diferenciação complexa na sua
extremidade livre formando um apressório globoso (Parbery, 1981) próximo ao conídio,
normalmente na junção entre células epidérmicas. Apressórios são considerados essenciais à
infecção e apresentam morfologia característica dentro do gênero, podendo ser globosos e de
contorno regular ou com variados graus e freqüência de rugosidades (Sutton, 1992). Materiais
exógenos como grãos de pólen, ácidos orgânicos e sideróforos, podem influenciar a germinação
do conídio e sua diferenciação em apressórios. Na presença de nutrientes, o índice de germinação
conidial é acentuado, porém, baixas concentrações freqüentemente inibem a formação de
apressórios (Mercer et al., 1971, Bailey et al., 1992, Skipp et al., 1995).
No gênero Colletotrichum, a germinação é altamente influenciada por
temperatura e umidade. Espécies de Colletotrichum em Citrus spp., que causam queda de frutos
jovens, têm acentuada germinação de seus conídios sob condições de temperatura acima de 25
o
C
e umidade atmosférica em torno de 80%. Neste patossistema, a incidência da doença aumenta
quando ocorre aumento da precipitação pluviométrica seguida de um prolongado período de
umidade atmosférica alta (Denham e Waller, 1981).
16
A topografia da superfície do hospedeiro é relatada também afetando a
formação de apressórios (Lapp e Skoropad, 1978). Em C. orbiculare, é necessário que o tubo
germinativo alcance junções das células antes da formação de apressórios (Anderson e Walker,
1962). Segundo Lapp e Skoropad (1978), a formação de apressórios em C. graminicola é
dependente da estrutura física da superfície foliar, havendo maior formação de apressórios nas
suas depressões.
A partir da fixação do apressório na superfície da folha, há formação da hifa
infetiva, a qual emerge a partir do poro do apressório iniciando o processo de penetração. Há
várias possibilidades de penetração: diretamente pela cutícula e parede celular do hospedeiro
(Wharton et al., 2001), por aberturas naturais, tais como estômatos ou, por ferimentos. O modo
mais comum de penetração é diretamente pela cutícula da planta, havendo, entretanto, casos em
que ferimentos são essenciais, tais como podridão da coroa e do pedicelo em banana (Musa sp.),
causados por C. musae (Krantz et al., 1978) e podridão em mandioca, causada por C.
gloeosporioides (Van der Bruggen e Maraite, 1987; Van der Bruggen et al., 1990).
Para a maioria das espécies de Colletotrichum, especialmente aquelas que
atacam tecidos jovens, sua habilidade para penetrar a cutícula diretamente é de extrema
importância. Três mecanismos têm sido propostos para explicar a penetração através da cutícula:
a) a força mecânica; b) secreção de enzimas degradadoras da cutícula e parede celular; e c) uma
combinação dos processos anteriores (Bailey et al., 1992). Existem evidências de que o
apressório de C. graminicola exerce força mecânica suficiente para penetrar através da cutícula e
da parede celular da planta (Pascholati et al., 1993). Segundo Soliday et al. (1989) há indicações
da presença de enzimas de hidrólise de quitina durante os eventos de penetração.
Mercer et al. (1971) comprovaram que C. lindemuthianum exerce força
suficiente para penetrar uma cutícula, fato evidenciado quando este patógeno foi capaz de romper
17
membranas de Formvar, insensíveis à hidrólise por enzimas fúngicas. Por outro lado, a
penetração pode requerer enzimas que dissolvam ou enfraqueçam a cutícula do hospedeiro.
Várias espécies de Colletotrichum produzem esterases capazes de degradar cutina. Mutantes de
C. gloeosporioides deficientes na produção de cutinase não foram patogênicos a frutos de mamão
intactos, entretanto, quando feridos ou superficialmente tratados com cutinase, lesões normais
foram produzidas (Dickman e Patil, 1986). Similarmente, lesões não foram produzidas quando
inibidores químicos de cutinase foram misturados com conídios de C. gloeosporioides (Dickman
et al., 1983). Em outro caso, em que foram isolados dois tipos de cutinases de C. lagenarium, a
inibição de cutinase não foi capaz de afetar a patogenicidade (Bonnen e Hammerschmidt, 1989a,
b), além de não haver diferença em virulência quando se inoculavam mutantes que produziam
menores quantidades desta enzima.
A penetração por meio de tubo germinativo não diferenciado, ou seja, sem
formação de apressório, ou através dos estômatos não foi observada. Dentro da parede celular a
hifa infectiva aumenta de volume e desenvolve uma vesícula de infecção globosa (Wharton e
Julian, 1996; Wharton et al., 2001).
2. 8. INFECÇÃO E COLONIZAÇÃO DOS TECIDOS
Após a penetração dos tecidos da folha, C. graminicola inicia o processo de
infecção o qual apresenta dois estádios: uma fase inicial biotrófica e uma fase secundária
necrotrófica. Na fase biotrófica, a qual tem uma duração de, aproximadamente, 24 h, as
membranas das células infetadas invaginam-se em torno de vesículas de infecção, não havendo
qualquer alteração estrutural no citoplasma. Após a colonização dos tecidos vegetais, o patógeno
altera seu comportamento para necrotrofia, alimentando-se de nutrientes que exsudam da célula.
18
Nesta fase, há danificação acentuada de células do hospedeiro, devido a uma série de fatores, tais
como aumento do volume e decréscimo na densidade do citoplasma, aumento da fragilidade e
permeabilidade da membrana plasmática, levando à sua ruptura e desorganização geral do
citoplasma culminando com a morte celular (Bailey et al., 1992; O´Connell, 1987; Skipp et al.,
1995).
Espécies de Colletotrichum utilizam duas estratégias de infecção: colonização
subcuticular intramural e colonização intracelular (Bailey et al., 1992).
Após a penetração, patógenos que possuem colonização subcuticular intramural
antes de se desenvolver sob a cutícula, formam uma rede intramural de hifas que crescem inter e
intracelularmente, matando as células com o seu avanço. Neste tipo de infecção o estágio
biotrófico não é detectável (Bailey et al., 1992; Perfect et al., 1999).
A maioria das espécies de Colletotrichum exibe o segundo tipo de infecção, isto
é, colonização intracelular, embora a extensão do estágio biotrófico seja variável ou ausente em
muitas interações. Após a penetração, hifas crescem entre a membrana plasmática e a parede
celular das células do hospedeiro sem a penetração no protoplasto formando uma vesícula
(O´Connell, 1987; Skipp et al., 1995). Estes fungos que se nutriam inicialmente de células vivas
do hospedeiro, antes de trocar para necrotrofia são considerados hemibiotróficos ou biotróficos
facultativos.
Após a infecção de várias células do hospedeiro, as hifas crescem
intracelularmente, degenerando as células infetadas e dando origem à fase necrotrófica de
infecção, quando hifas secundárias, de diâmetro variável são formadas (Wharton & Julian, 1996;
Wharton et al., 2001).
Esta fase necrotrófica destrutiva está associada com abundante produção de
enzimas capazes de degradar paredes, matando células e liberando nutrientes suficientes para o
19
avanço das hifas para outros tecidos (Bailey et al., 1992; O´Connell, 1987; Skipp et al., 1995).
Nesta fase são observados os sintomas típicos da doença. Durante a colonização dos tecidos do
hospedeiro, a cutícula é rompida mecanicamente, permitindo a exteriorização dos conidióforos,
conídios e setas, caracterizando a esporulação do patógeno. Eventualmente, conidióforos
emergem através da cutícula do hospedeiro e formam acérvulos na superfície da planta (Bailey et
al., 1992).
20
2. 9. LITERATURA CITADA
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3. ASPECTOS BIOLÓGICOS, ULTRA-ESTRUTURAIS E PATOGÊNICOS DO
CONÍDIO OVAL DE Colletotrichum sublineolum
3. 1. RESUMO
Neste estudo foi investigado o comportamento de conídios ovais de
Colletotrichum sublineolum sobre três diferentes materiais artificiais; as características ultra-
estruturais entre conídios falcados e ovais e foram analisados qualitativamente a capacidade de
infecção destes dois tipos de conídios sobre folhas de sorgo. No processo de adesão e germinação
sobre lamínulas revestidas com albumina, membrana de diálise e lâminas recobertas com
poliestireno, conídios ovais foram capazes de germinar sobre estes materiais, indicando que, a
exemplo dos conídios falcados, também possuem mecanismos de adesão. Os resultados
demonstram a capacidade infectiva e patogênica dos conídios ovais sobre plantas de sorgo,
sugerindo que estes poderiam representar uma fonte adicional de inóculo e atuar como um agente
responsável não só pelo aumento da variabilidade na espécie como também contribuir para com
as quebras de resistência na cultura.
Palavras – chave: dimorfismo conidial, microscopia eletrônica de transmissão, patogenicidade
33
BIOLOGICAL, ULTRASTRUCTURAL AND PATHOGENIC ASPECTS OF THE OVAL
CONIDIUM of Colletotrichum sublineolum
3. 2. ABSTRACT
In this study we investigated the behavior of oval conidia of Colletotrichum sublineolum
on three different artificial materials; the ultrastructural characteristics between falcate and oval
conidia and we analyzed qualitatively the infection capacity of these two types of conidia on
sorghum leaves. In the adhesion and germination process on cover slips coated with albumin,
dialysis membrane and microscope slides covered with polystyrene, oval conidia were capable of
germinating on these materials, indicating that, like falcate conidia, they too possess adhesion
mechanisms. The results demonstrate the infective and pathogenic capacity of oval conidia on
sorghum plants, suggesting that these could represent an additional source of inoculum and act as
a responsible agent not only for the increase in variability in the species but also contributing to
overcome resistance in this culture.
Key words: conidial dimorphism, transmission electron microscopy, pathogenicity.
34
3. 3. INTRODUÇÃO
Antracnose, causada pelo patógeno Colletotrichum sublineolum, é uma das
mais importantes doenças da cultura do sorgo, estando presente em todas as áreas de plantio de
sorgo no Brasil (Casela e Ferreira, 1996). A estratégia mais eficiente para o controle desta doença
é a utilização de cultivares resistente. O uso da resistência genética é, entretanto, dificultada pela
ocorrência de alta variabilidade na população do patógeno, o que leva a freqüentes quebras de
resistência dos cultivares (Casela et al., 1998).
O modo de infecção primária do fungo C. sublineolum ocorre por meio dos
conídios falcados, produzidos terminalmente em conidióforos nos acérvulos (Warren, 1986).
Além dos conídios falcados, Souza-Paccola et al. (2003) descreveram a formação de um segundo
tipo de conídio, os conídios ovais. Este conídio apresenta forma ovalada, de tamanho menor que
o falcado. Panaccione et al. (1989) estudando isolados de Colletotrichum graminicola em milho
observaram que os conídios ovais apresentavam ontogenia distinta dos falcados. Souza-Paccola
et al. (2003) através da caracterização cultural descreveram conídios ovais como uma alternativa
para testes de patogenicidade e estudos genéticos, especialmente para isolados que esporulam
pouco em meio de cultura sólido.
São escassas as informações sobre a biologia e patogenicidade destes conídios,
de forma que o presente estudo tem como objetivo (i) investigar a germinação de conídios ovais
de C. sublineolum sobre diferentes materiais artificiais. (ii) observar diferenças celulares e no
processo de infecção entre conídios falcados e ovais através da microscopia eletrônica de
transmissão e (iii) verificar por meio de análises qualitativas a capacidade de infecção de conídios
ovais em comparação com conídios falcados.
35
3. 4. MATERIAL E MÉTODOS
3. 4. 1. Isolados de C. sublineolum, Meios de Cultivo e Esporulação
Colletotrichum sublineolum Henn., Kabát & Bubák, isolados BR 23.02, BR
84.02, BR 85.02, BR 201.01 e BR 204.01, foram cedidos pela EMBRAPA Milho e Sorgo, Sete
Lagoas, MG, Brasil. Para obtenção de conídios falcados, os isolados foram cultivados em meio
farinha de aveia-ágar, sob luz fluorescente contínua (50 µE/m
2
/s) a uma temperatura de 22 ± 3º
C, durante 7 a 10 dias.
Para a produção de conídio oval, seguiu-se a metodologia descrita por Souza-
Paccola et al. (2003), onde três discos de ágar de 10 mm de diâmetro contendo micélio de C.
sublineolum, foram usados para inocular 50 mL de meio caldo batata dextrose. A cultura foi
mantida sob agitação (60 rpm) por quatro dias a 22 ± 3º C sob luz fluorescente contínua (50
µE/m
2
/s). O micélio foi filtrado em gaze e conídios ovais foram recuperados por centrifugação a
6000 g por 5 minutos. O pellet foi ressuspendido em 2 mL de solução de Tween 80 0,01% em
água.
3. 4. 2. Caracterização da Condição Nuclear e Monitoramento do Processo de Germinação
de Conídios Ovais por Meio da Microscopia de Luz
Para esta etapa foram empregadas três técnicas: uma utilizando lamínulas
recobertas com uma fina camada de albumina 50%, o que possibilitou caracterizar os conídios
ovais quanto à condição nuclear; a outra técnica empregando cultivo sobre membrana de diálise,
36
que permitiu o monitoramento da germinação destes conídios e a formação dos apressórios; e
uma terceira técnica, utilizando lâminas recobertas com uma camada de poliestireno, onde foi
monitorado o processo de germinação de conídios ovais comparado com o de conídio falcado.
3. 4. 2. 1. Observação de conídios sobre lâminulas recobertas com uma fina camada de
albumina
Sobre lamínulas contendo uma fina camada de albumina 50%, foi depositada
40 µL de uma suspensão contendo 10
5
conídios ovais mL
-1
em Tween 80 0,01% em água. Após
secagem ao ar, o material foi fixado durante 30 minutos em fixador Carnoy e passado em álcool
95% (5 min) e álcool 70% (30 min). O material foi lavado três vezes em água destilada e
hidrolisado em HCl 1N a 60
o
C durante 10 min. A seguir novamente lavado três vezes em água
destilada e 1 vez em tampão fosfato 0,02M, pH 6,9 e então corado com solução Giemsa seguindo
a metodologia descrita por Tanaka et al. (1979).
3. 4. 2. 2. Germinação de conídios sobre membranas de diálise
Para observação do processo de formação de tubos germinativos e apressórios,
conídios ovais foram inoculados sobre membranas de diálise em meio ágar farinha de aveia. O
material foi incubado à 25
o
C sob luz fluorescente contínua (50 µE/m
2
/s) e as membranas foram
removidas em períodos pré-determinados (4, 8, 12, 24h), fixadas em fixador Carnoy e coradas
com solução Giemsa usando metodologia descrita por Tanaka et al. (1979).
37
3. 4. 2. 3. Germinação de conídios sobre lâminas recobertas com camada de poliestireno
Alíquotas de 40 µL de uma suspensão de conídios falcados (10
5
mL
-1
) e de uma
suspensão de conídios ovais (10
5
mL
-1
) dos isolados BR 23.02, BR 84.02, BR 85.02, BR 201.01 e
BR 204.01 foram misturadas separadamente em 40 µL de caldo batata dextrose. As suspensões
foram colocadas sobre lâminas de microscopia revestidas por uma camada delgada de
poliestireno (Mercure et al., 1994). As lâminas recobertas por poliestireno foram obtidas pela
imersão destas em uma solução contendo o polímero (uma placa de Petri de poliestireno com 90
mm de diâmetro) dissolvido em 50 mL de acetato de amila. Após inoculação as lâminas foram
incubadas em câmara úmida sob luz constante a 25
o
C, sendo a porcentagem de conídios
germinados e não germinados determinada nos tempos de 4; 6; 8, 10; 12, 16 horas após
inoculação, utilizando lactofenol azul de algodão a fim de paralisar a germinação.
Foram feitas duas repetições para cada tratamento e selecionado ao acaso três
campos de cada lâmina para estimar a porcentagem de germinação.
A imagem do processo de germinação foi capturada e posteriormente foram
realizadas as medidas necessárias através do sistema digitalizador MOTIC Images 200 - versão
1.2. profissional. Foram medidos 50 conídios para cada tempo.
3. 4. 3. Análises em Microscopia Eletrônica de Transmissão
Cultura líquida contendo conídios ovais foi centrifugada nos tempos 0 e 4h de
incubação em tubos eppendorf. O sobrenadante foi descartado e então adicionado ágar-água (10
%). O bloco de ágar contendo a massa de conídios foi retirado do eppendorf e seccionado em
segmentos menores. Posteriormente iniciou-se o processo de fixação conforme descrito abaixo.
38
Amostras de 1 cm de tecido foliar infectado com conídios ovais do cultivar de
sorgo BR009, com 3 semanas de desenvolvimento foram pulverizadas com uma suspensão
contendo 10
6
conídios ovais mL
-1
e incubadas em câmara úmida à 25
o
C. Após 36h da inoculação
as amostras foram submetidas ao processo de fixação.
Os blocos de ágar contendo a massa de conídios e os segmentos foliares
inoculados com os conídios ovais, foram fixados em glutaraldeido (2,5% vol/vol), formaldeído
2,5% em tampão cacodilato de sódio 0,05M, pH 7,2, CaCl
2
0,01M. por um período de 24 horas,
incluindo 5 min de infiltração a vácuo, lavagem em tampão cacodilato 0,1M (3X 10min), e pós-
fixados em tetróxido de ósmio 1% em tampão cacodilato 0,05M pH 7,2 por 1 hora. Após
lavagens sucessivas em água destilada (3X 10 min), as amostras foram deixadas em acetato de
uranila 0,5% por 12h e desidratadas em uma série gradual de acetona (30, 50, 70, 90 e 100%)
durante 10 min para o tecido foliar e 20 min para os blocos de ágar.
A seguir o material foi submetido a uma mistura de resina Spurr acetona 100%
(1:1) durante 5h, transferidas para resina Spurr pura por 12 h. Foram acondicionados em forma de
silicone contendo resina pura e polimerizados em estufa a 70º C durante 48 h. Os locais de
infecção e o aglomerado de conídios nos estádios de desenvolvimento foram identificados pela
microscopia de luz. Secções ultrafinas foram coletadas em telinhas de cobre cobertas com
formvar e contrastadas com solução aquosa de acetato de uranila e citrato de chumbo. Os
espécimes foram examinados em microscópio MET ZEISS EM900.
3. 4. 4. Análise Qualitativa da Capacidade de Infecção de Conídios Falcado e Oval
O trabalho foi conduzido no Laboratório de Fitopatologia e Casa de Vegetação
da EMBRAPA Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG-Brasil, tendo sido testados conídios ovais e
39
falcados de dois isolados monospóricos de C. sublineolum (BR 204.01 e BR 85.02) em cinco
cultivares de sorgo utilizado como diferenciadores (BR005, BR008, BR009, CMSXS210 e
SC283), cedidos pela EMBRAPA Milho e Sorgo, Sete Lagoas, MG. As plantas foram
desenvolvidas em vasos de cerâmica medindo 23 cm de diâmetro e 30 cm de altura, tendo sido
semeadas, em cada vaso, dez sementes de uma mesma cultivar desbastando-se para 4
plantas/vaso antes da inoculação.
Os isolados fúngicos foram cultivados em meio aveia ágar durante sete dias à
temperatura de 22
o
± 3
o
C. A produção de conídio falcado foi induzida pelo método mecânico de
raspagem do micélio com auxílio de uma lâmina de metal e as culturas assim injuriadas foram
incubadas a 23 ± 2
o
C sob luz branca fluorescente (50rE/m
2
/sec).
Para a obtenção de conídios ovais inoculou-se 1,5 litros de meio Caldo Batata
com sessenta discos miceliais de 1 cm de diâmetro, obtidos a partir de culturas em meio aveia
ágar de sete dias de idade. As culturas foram mantidas em condições estáticas durante quatro dias
sob luz branca à 25
o
C. Posteriormente, o micélio foi filtrado em gaze esterilizada e o filtrado
contendo os conídios ovais foi centrifugado a 3000 rpm durante 5 minutos. Ao pellet foi
adicionado 10 mL de água destilada, sendo a suspensão ajustada para a concentração de 10
6
conídios ovais mL
-1
.
Para obtenção de conídios falcados, adicionou-se 10 mL de água destilada em
cada placa contendo cultura dos isolados fúngicos em desenvolvimento, sendo em seguida feita
uma raspagem superficial com alça de drigalski para liberação dos conídios. A suspensão de
conídios falcados assim obtida foi passada através de uma peneira de 42 mesh, sendo em seguida
ajustada para a concentração final de 10
6
conídios falcados mL
-1
.
As inoculações foram feitas aos 25 dias após o plantio, pulverizando-se as
folhas com uma suspensão de conídios até o ponto de escorrimento com um pulverizador manual
40
Uni-spray Mod. 2000 na dose de aproximadamente 20 mL/vaso. Imediatamente inoculadas, as
plantas foram acondicionadas em câmara úmida durante 24 horas sendo em seguida transferidas
para mesas em casa de vegetação, onde permaneceram até a época da avaliação. As avaliações
foram realizadas no 10º dia após a inoculação, utilizando-se o índice de notas apresentado na
Tabela 1.
Tabela 1. Registro de um esquema visual para avaliar o desenvolvimento dos sintomas da
antracnose em plantas de sorgo inoculadas artificialmente com conídios de C. sublineolum
(Ferreira e Casela, 1986)
Notas Sintomas
1 Ausência de sintomas
2 Presença de pequeno número de lesões alongadas sem esporulação ou de
reação de hipersensibilidade (infecção leve)
3 Presença de lesões alongadas sem esporulação ou de reação de
hipersensibilidade com até 20% da área foliar afetada. Infecção leve a
moderada
4 Infecção severa. Grande número de lesões esporulantes e com alguma
coalescência . De 21 a 40% da área foliar afetada
5 Infecção muito severa, com lesões abundantes e coalescidas. Mais de 40% da
área foliar afetada. Esporulação abundante.
As notas 1, 2 e 3 foram consideradas como indicativas de reação de resistência e as notas 4 e 5,
como indicativas de suscetibilidade.
O diâmetro das lesões foliares foi estimado no décimo dia após a inoculação.
As folhas foram retiradas e as lesões medidas com régua. Foram medidas 50 lesões para cada
tratamento.
41
3. 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
3. 5. 1. Caracterização da Condição Nuclear e Análise do Processo de Germinação de
Conídios Ovais e Conídios Falcados por Meio da Microscopia de Luz
Foi comparado o processo de adesão e germinação dos conídios de C.
sublineolum em três superfícies artificiais, lamínulas revestidas com albumina, membrana de
diálise e lâminas recobertas com poliestireno. Conídios ovais foram capazes de germinar sobre
estes materiais, indicando que, a exemplo do que ocorre com os conídios falcados, eles também
possuem mecanismos de adesão. Segundo Leite et al. (2001), os mecanismos de adesão de
fitopatógenos aos hospedeiros representam a primeira etapa de conexão física entre o parasita e o
parasitado. O sucesso da adesão traz em si um conjunto de fatores evolutivos que determina a
atração entre as superfícies envolvidas. O entendimento de como a adesão se processa pode abrir
as portas para o controle de algumas doenças de vegetais de importância econômica.
A germinação do conídio é um evento crítico no ciclo de vida da maioria dos
fungos, e é um importante fator para o controle da doença, muito embora vários fatores
ambientais e fisiológicos possam afetar a germinação em várias espécies (d´Enfert, 1997).
Em Colletotrichum graminicola, conídios falcados fixam-se eficientemente na
maioria das superfícies artificiais (Mercure et al., 1994 b), permitindo investigações do processo
de fixação conidial, germinação e formação do apressório in vitro. Mercure et al. (1995)
visualizaram materiais adesivos produzidos por conídios falcados nesta espécie e Sugui et al.
(1998) utilizando lâminas recobertas com poliestireno, caracterizaram uma matriz extracelular
liberada por estes conídios falcados descrevendo a natureza glicoproteíca da mesma. Chaky et al.
42
(2001) investigaram a relação entre características de superfícies artificiais, fixação e germinação
de conídios em C. graminicola, concluindo que superfícies hidrofóbicas e rígidas foram ambas
sinalizadoras na quebra da dormência e do início da germinação do conídio. Apoga et al. (2004),
também utilizando superfícies artificiais observaram que tubos germinativos de C. graminicola
requerem mais do que 4 µm de contato contínuo com um substrato hidrofóbico para induzir a
formação do apressório.
Os resultados demonstraram a eficiência das três superfícies artificiais aqui
empregadas para a condução de estudos referentes à biologia dos conídios ovais e monitoramento
dos eventos que ocorrem durante a pré e pós-germinação destes conídios em C. sublineolum.
A coloração com HCl - Giemsa confirmou a condição multinucleada dos
conídios ovais C. sublineolum, que variou de um a quatro núcleos por célula (Figs. 1A e 1B).
Estes núcleos apresentaram forma elíptica em todos os isolados avaliados, com diâmetro médio
que variou entre 25,35 x 5,83 a 18,54 x 4,76 µm. O isolado BR 84.02 apresentou conídios ovais
significativamente maiores, enquanto que o isolado BR 85.02 o menor diâmetro (Tabela 2).
Em trabalhos anteriores já havíamos relatado a ocorrência de conídios ovais
uni, bi e trinucleados em C. sublineolum, sendo que a freqüência de conídios uninucleados foi
significativamente maior (Souza-Paccola et al., 2003). Panaccione et al. (1989) observaram esta
mesma condição em conídios ovais de C. graminicola isolados de milho, em uma freqüência de
60% uninucleados, 30% binucleados e 10% tri e tetranucleados. O diâmetro destes conídios ovais
variou de 6 – 21 x 3 – 6 µm.
Os resultados mostram que a primeira divisão nuclear nos conídios ovais em C.
sublineolum ocorreu 4 h após a inoculação, no final da germinação, onde um septo central é
produzido na porção basal tubo germinativo. Após migração de um dos núcleos para extremidade
distal da hifa em crescimento (Fig. 1C) e sucessivas divisões mitóticas vão ocorrendo (Fig. 1D e
43
1E) determinando a condição multinucleada dos segmentos hifais deste fungo. A formação de
apressórios melanizados pôde ser evidenciada 24 h após a inoculação (Fig. 1F).
Tebeest et al. (1989), verificaram o número de núcleos em esporos de três
espécies de Colletotrichum enfatizando a importância de se verificar a condição nuclear da
espécie para estudos de natureza genética, como a fusão de protoplastos e a recombinação
mediada por plasmídios. Comparando a taxa de germinação entre conídios ovais e falcados
(Tabela 3) observa-se que estes não diferiram entre si nas primeiras horas de incubação. A partir
de 6 horas, pequenas diferenças na taxa de germinação entre conídios falcados e ovais foram
observadas entre os isolados, mas de forma geral ambos os tipos de conídios apresentam taxa de
germinação semelhante em praticamente todos os isolados avaliados. Com 16h após a
inoculação, todos os isolados apresentam uma freqüência de germinação acima de 50%.
Diferenças na germinação foram observadas entre os isolados. Na fase inicial
da germinação, 4h e 6 h, os isolados BR 204.01 e o BR 84.02 apresentaram uma taxa de
germinação maior, tanto para conídios falcados como para conídios ovais com relação aos outros
isolados. A partir de 8h após a inoculação a freqüência de germinação foi variável entre os
isolados e dependentes do tempo e do tipo de conídio. De forma geral o isolado BR 204.01
mostrou em todos os tempos alta freqüência na germinação tanto de conídios falcados como em
conídios ovais.
3. 5. 2. Análises Ultra-Estruturais dos Conídios Ovais e Falcados de C. sublineolum Através
da Microscopia Eletrônica de Transmissão
Características celulares de conídios ovais foram observadas em relação a
conídios falcados através da microscopia eletrônica de transmissão. Conídios falcados (Fig. 2A) e
44
conídios ovais (Fig. 3A, 4C e 4D) apresentam citoplasma com grande quantidade de corpos
lipídicos. Conídios falcados de C. sublineolum são uninucleados (Fig. 2B – 2C) apresentando
parede celular mais delgada comparada com a parede celular de conídios ovais (Fig. 3A – 3C). A
presença de corpos lipídicos semelhantes aos aqui observados, também foram descritos em
conídios falcados não germinados de C. graminicola (Mims et al., 1995).
No início da emissão dos tubos germinativos, aproximadamente 4 horas após a
inoculação, um acúmulo de corpos lipídicos pode ser visto na base do tubo germinativo em
desenvolvimento (Fig. 5A), demonstrando a mobilização de lipídios, necessária para o processo
de germinação (Schadeck et al., 1998). Uma diferenciação das camadas da parede celular
promove a formação do septo (Fig. 5B).
Após a emissão do tubo germinativo do conídio oval forma-se um apressório
(Fig.5C e 5D) altamente vacuolado com presença abundante de corpos lipídicos e formação de
material adesivo ao seu redor, o que caracteriza o início do processo de penetração sobre a folha
de sorgo.
3. 5. 3. Análise Qualitativa da Capacidade de Infecção de Conídios Falcados e Oval
Uma vez constatado um comportamento semelhante do conídio oval com o
conídio falcado nos processos de adesão, germinação e formação de apressório, objetivou-se
avaliar a virulência destes comparada ao do conídio falcado. No décimo dia após a inoculação, as
plantas de sorgo inoculadas com conídios ovais e com conídios falcados reproduziram sintomas
de antracnose caracterizados pela produção de lesões elípticas à circulares o que comprova a
patogenicidade dos conídios ovais.
45
Nas Tabelas 4 e 5 são mostradas as reações das cultivares de sorgo aos conídios
ovais e falcados de três isolados de C. sublineolum. A cultivar BR009, descrita como suscetível
pelo programa de melhoramento da Embrapa Milho e Sorgo quando inoculada com conídios
falcados também, demonstrou ser suscetível aos conídios ovais (Tabela 4 e 5).
Conídios ovais do isolado BR 85.02 quebraram a resistência da cultivar BR005
considerada resistente e da cultivar CMSXS210 considerada intermediária (Tabela 4).
A Tabela 6 mostra que, com exceção do isolado BR 204.01, conídios ovais
formaram lesões sobre folhas de sorgo que não diferiram em tamanho daquelas produzidas pelos
conídios falcados. Tanto conídios ovais como falcados produzidos pelo isolado BR 204.01
também quebraram a resistência da cultivar BR005.
Os resultados aqui apresentados demonstram a capacidade infectiva e a
patogenicidade dos conídios ovais sobre plantas de sorgo, sugerindo que estes poderiam
representar uma fonte adicional de inóculo e atuar como um agente responsável não só pelo
aumento da variabilidade na espécie como também contribuir para com a quebra de resistência na
cultura.
46
Figura 1. Microscopia de luz de conídios ovais de Colletotrichum sublineolum pela
técnica de HCl-Giemsa de coloração de núcleo. (A e B) conídios ovais com 1, 2 e 3
núcleos (Barra A: 9 um; B: 6 µm); (C) germinação de conídios ovais após 4 horas de
inoculação, presença de tubo germinativo (TG), septo (s) (Barra 4,5 um); (D) conídios
com 8 horas de inoculação (Barra 4 um); (E) conídios com 12 horas de inoculação (Barra
4 um); (F) após 24 horas de inoculação presença de apressório (Ap) nas extremidades
das hifas (Barra 4,5 um).
A
D
E
B
C
TG
s
F
Ap
47
Figura 2. Microscopia eletrônica de transmissão de conídios falcados de C. sublineolum (corte
longitudinal). (A) Conídio falcado com citoplasma eletrodenso com abundante presença de corpos
lipídicos (*L) e parede celular pouco espessa (Barra 1,7 µm). (B – C) Visualização de conídios
falcados uninucleados (N) com corpos lipídicos (L) e vacúolos (V). (Barra B - 0,9 µm; C - 0,6
µm).
*L
*L
*L
B
P
N L
L
C
L
V
N
P
A
48
Figura 3. Microscopia eletrônica de transmissão de conídios ovais de C. sublineolum (corte
longitudinal) (A – C) Conídio oval mostrando corpos lipídicos (*L), mitocôndrias (m) e
parede celular (P) (Barra: A - 1,1 µm; B - 1 µm; C - 200 nm).
B
P
C
P
*L
*L
*L
*L
m
m
m
m
m
m p
A
49
Figura 4. Microscopia eletrônica de transmissão de conídios ovais (corte longitudinal). (A) conídio
oval binucleado (N) (Barra 2 µm); (B-D) conídio oval uninucleado (N) com corpos lipídicos (L)
(Barra: B - 2 µm; C - 1 µm; D - 2 µm).
B
N
L
C
N
L
L
D
N
L
L
L
A
N
N
50
A
S
T
g
B
S
C
A
p
m
a
D
A
p
Figura 5. Microscopia eletrônica de transmissão de conídios ovais germinando (corte longitudinal). (A
– B) Conídio oval com 4 h após a inoculação, com formação do septo (S) e tubo germinativo com
grande quantidade de corpos lipídicos (Barra: A - 2 µm; B - 200 nm). (C – D) Após 36 h de inoculação
sobre folhas de sorgo. (C) Formação do apressório com a visualização de material adesivo (ma) em
contato com a superfície foliar e (D) apressório iniciando o processo de penetração sobre a superfície
da célula vegetal (Barra 2 µm).
51
Tabela 2. Diâmetro médio (µm) de conídios ovais de cinco isolados de Colletotrichum. sublineolum sobre lâminas de poliestireno, em
intervalos de tempo após a inoculação. (Média do diâmetro de 50 conídios para cada tempo).
Diâmetro Médio dos conídios (µm)
Isolados 0 hora 4 horas 8 horas 12 horas
BR 23.01 12,3 c
(1)
10,9 b 9,54 c 9,33 c
BR 84.02 15,6 a 14,2 a 14,20 a 14,14 a
BR 85.02 11,6 d 12,0 ab 11,63 b 11,17 b
BR 201.01 14,4 b 13,6 a 11,73 b 11,91 b
BR 204.01 12,2 c 12,5 ab 12,33 ab 11,74 b
cv (%): 11,47
(1)
Média dos isolados, para conídio oval no mesmo tempo, seguida de mesma letra minúscula, na coluna, não difere entre si pelo teste de Tukey (p< 0,05).
cv (%): coeficiente de variação
52
Tabela 3. Freqüência da germinação de conídios falcados e ovais de cinco isolados de Colletotrichum sublineolum sobre lâminas de
poliestireno, em intervalos de tempo definidos após a inoculação (Média de seis repetições).
Freqüência de germinação de conídios (%)
4h
6h
8h
10h
12h 16h
Falcado Oval Falcado
Oval Falcado
Oval Falcado
Oval Falcado
Oval Falcado Oval
BR 23.02 35 b
(1)
A
(2)
44 b
(1)
A
(2)
53 b B 63 b A 58 b B
89 a A
59 c A
70 b A
83 c A 87 c A 92 b A 93 b A
BR 84.02 78 a A 82 a A 81 a A 72 ab A
89 a A
83 a A
89 b A
91 a A
93 b A 96 b A 96 ab A
98 ab A
BR 85.02 6 c A 4 d A 18 c A 15 d A
25 c A
19 c A
82 b A
64 b B
90 bc A 51 d B
95 ab A
52 c B
BR 201.01
26 b A 21 c A 24 c B 35 c A
55 b A
52 a A
45 c A
42 c A
68 d A 30 e B
60 c A
49 c A
BR 204.01
85 a A 85 a A 81 a A 77 a A
94 a A
89 a A
98 a A
89 a A
100 a A
100 a A
100 a A
100 a A
cv (%) 6,89 4,61 7,86 5,52 3,68 6,68
(1)
Médias seguidas pela mesma letra minúscula, na coluna, não difere entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
(2)
Médias seguidas pela mesma letra maiúscula, na linha para o mesmo tempo, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05).
cv (%): coeficiente de variação
53
Tabela 4. Reações de cinco cultivares de sorgo a conídios falcados e ovais de dois isolados monospóricos de Colletotrichum
sublineolum (Época I)
Cultivares
Isolados
1
BR 85.02
Falcado
BR 85.02
Oval
BR 204.01
Falcado
BR 204.01
Oval
BR005 R S R R
BR008 R R R R
BR009 S S S S
CMSXS210 S S R R
CMSXS169 R R S R
1
R indica reação de resistência e S indica reação de suscetibilidade.
54
Tabela 5. Reações de cinco cultivares de sorgo a conídios falcados e ovais de dois isolados monospóricos de Colletotrichum
sublineolum (Época II)
Cultivares
Isolados
1
BR 85.02
Falcado
BR 85.02
Oval
BR 204.01
Falcado
BR 204.01
Oval
BR005 S R S S
BR008 R R R R
BR009 S S S S
SC283 R R R R
CMSXS210 R R R R
1
R indica reação de resistência e S indica reação de suscetibilidade.
55
Tabela 6. Diâmetro médio (cm) de lesões formadas em folhas de sorgo da cultivar BR009 por conídios falcados e ovais de quatro
isolados de Colletotrichum sublineolum. (Média de 50 lesões para cada isolado e conídio).
Diâmetro das lesões sobre folhas de sorgo (cm)
Conídios Isolados
BR 23.02 BR 84.02 BR 85.02 BR 204.01
Falcado 0,44 a A 0,44 a A 0,39 a A 0,47 a A
Oval 0,40 a A 0,40 a A 0,39 a A 0,31 b B
cv (%): 30,64
(1)
Média dos isolados, para conídios falcados e ovais, seguida de mesma letra minúscula, na coluna, não difere entre si pelo teste de Tukey (p< 0,05).
(2)
Média dos conídios falcados e ovais, seguidas de mesma letra maiúscula, na linha, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p< 0,05).
cv (%): coeficiente de variação
56
3. 7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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59
4. MORFOGÊNESE E MECANISMO DE PENETRAÇÃO DE CONÍDIOS
FALCADOS E OVAIS DE Colletotrichum sublineolum
4. 1. RESUMO
A antracnose, causada pelo fungo Colletotrichum sublineolum é uma importante doença e afeta
economicamente a cultura do sorgo no Brasil. Observações da presença de dimorfismo conídial
neste fungo nos levaram a estudar os estádios de desenvolvimento e o mecanismo de penetração
de conídios falcados e ovais de C. sublineolum através da microscopia de luz e microscopia
eletrônica de varredura. Conídios falcados quando colocados sobre lâminas de poliestireno, após
16 horas de incubação sob luz constante, germinaram e formaram hifas espessas com grande
quantidade de vacúolos, que deram origem a conídios ovais em regiões apicais e laterais das
mesmas. Conídios falcados quando inoculados sobre folhas de sorgo, iniciaram o processo de
germinação após 4 horas e em 24 h o tubo germinativo sofreu uma complexa diferenciação em
sua extremidade livre, formando um apressório globoso dando início ao processso de fixação
sobre a epiderme foliar. Com 32 h formou-se um denso micélio e abaixo desse micélio pode se
observar conídios ovais em processo de germinação. Conídios ovais quando inoculados sobre
folhas de sorgo, iniciaram o processo de germinação com a formação do tubo germinativo
também 4 h após a inoculação e, da mesma forma que o conídio falcado, com 24h, formaram
apressórios que se aderiram à superfície foliar. Transcorridas 48 h de inoculação, formou-se um
emaranhado de hifas e sobre esta superfície originou-se acérvulos com setas contendo conídios
falcados envoltos por mucilagem. Nenhuma penetração do tubo germinativo nem do apressório
através dos estômatos foi observada. Conídios ovais apresentam semelhanças nos eventos de pré-
penetração e penetração com os conídios falcados de C. sublineolum.
Palavras-chave: dimorfismo conidial, microscopia eletrônica de varredura, Colletotrichum
sublineolum
60
MORPHOGENESIS AND PENETRATION MECHANISMS BY FALCATE AND OVAL
CONIDIA OF Colletotrichum sublineolum.
4.2. ABSTRACT
Anthracnose, caused by Colletotrichum sublineolum, is an important disease and seriously affects
sorghum crops in Brazil. Observations for the presence of conidial dimorphism in this fungus led
us to study the stages of development and the penetration mechanism of the falcate and oval
conidia of C. sublineolum through light microscopy and scanning electron microscopy. Falcate
conidia, when placed under polystyrene microscope slides, after 16 hours of incubation under
constant light, germinated and formed thick hyphae with large quantities of vacuoles, and
originated oval conidia in the apical and lateral regions of the hyphae. Falcate conidia, when
inoculated in sorghum leaves, initiated the germination process after 4 hours and with 24 hours
the germ tube suffered a complex differentiation in its free extremity, forming a globose
appressorium, initiating the process of fixation upon the foliar epidermis. With 32 hours, a dense
mycelium was formed and under it could be observed oval conidia in the germination process.
Oval conidia, when inoculated in sorghum leaves, also initiated the germination process with the
formation of the germ tube 4 hours after inoculation and, in the same way as falcate conidia,
formed appressoria that adhered to the foliar epidermis with 24 hours. Forty-eight hours after
inoculation, tangled hyphae were formed and acervuli with setae containing falcate conidia
wraped in mucilage, appeared on the surface. No penetration of the germ tube or appressorium
through stomata was observed. Oval conidia exhibit similarities to falcate conidia of C.
sublineolum in the pre-penetration and penetration events.
Key words: conidial dimorphism, scanning electron microscopy, Colletotrichum sublineolum.
61
4. 3. INTRODUÇÃO
Colletotrichum sublineolum P. Henn. Kabát & Bubák. (Sutton, 1980; Sherriff et
al., 1995), agente causal da antracnose em sorgo (Sorghum bicolor (L.) Moench), encontra-se
presente em todas as áreas de plantio desta cultura no Brasil (Casela et al., 2001). Colletotrichum
sublineolum produz frutificações denominadas acérvulos, de coloração escura que podem ser
visualizadas no centro das lesões. Os conidióforos são eretos, hialinos e não septados e deles são
produzidos terminalmente conídios hialinos, não septados e falciformes (Warren, 1986),
denominados de conídios falcados (Sutton, 1980).
O agente causal da antracnose em cereais, incluindo milho e sorgo, foi
considerado durante muito tempo, como formas diferentes da mesma espécie, Colletotrichum
graminicola (Cesati) Wilson (Syn. Colletotrichum sublineolum P. Henn). No entanto, aspectos
da morfologia do apressório (Sutton, 1968), testes de cruzamentos (Vaillancourt e Hanau,
1992) análises de “fingerprints” de DNA e seqüências de DNAr (Sherriff et al.,1995),
demonstraram claramente que isolados de milho e sorgo são espécies distintas. Portanto,
isolados de milho são agora denominados C. graminicola, enquanto que os isolados de sorgo
são designados C. sublineolum. Muito do que se conhece sobre a biologia do agente da
antracnose tem sido estudado em isolados de C. graminicola em milho. Nishihara (1975)
descreveu um segundo tipo de conídio em C. graminicola, além do conídio falcado, o conídio
oval. Segundo Panaccione et al. (1989), esses dois tipos de conídios são observados tanto em
cultura quanto durante o processo de infecção em folhas de milho. O primeiro tipo, o conídio
falcado é produzido blasticamente a partir de células conidiógenas morfologicamente distintas.
O segundo tipo, produzido blasticamente a partir hifas, tem forma oval a elíptica, de tamanho
variado, porém menor que o conídio falcado.
62
Esse dimorfismo conidial também foi relatado posteriormente em isolados de C.
sublineolum em sorgo por Souza-Paccola et al. (2003). Os autores demonstraram a importância
dos conídios ovais como uma ferramenta alternativa para estudos genéticos e em testes de
patogenicidade. O processo de infecção de conídios falcados tem sido analisado tanto em C.
graminicola sobre folhas de milho (Politis, 1976; Politis e Wheeler, 1973; Mims, et al., 1995;
Mims e Vaillancourt, 2002) quanto em C. sublineolum em sorgo (Wharton e Julian, 1996;
Wharton et al., 2001). Entretando, não há informações disponíveis sobre a formação, germinação
e penetração de conídios ovais de C. sublineolum na planta de sorgo. Foram estudados os estádios
de desenvolvimento e o mecanismo de penetração de conídios falcados e ovais de C. sublineolum
sobre folhas de sorgo através da microscopia eletrônica de varredura e microscopia de luz.
63
4. 4. MATERIAL E MÉTODOS
4. 4. 1. Cultivo e Esporulação do Fungo
Colletotrichum sublineolum isolado BR 204.01, foi cedido pela EMBRAPA
Milho e Sorgo – Sete Lagoas, MG Brasil. Conídios falcados, foram produzidos em meio farinha
de aveia-ágar, mantendo a cultura sob luz fluorescente contínua (50 µE/m
2
/s) a uma temperatura
de 22 ± 3º C, durante 7 a 10 dias.
Conídios ovais foram obtidos em cultura líquida, inoculando três discos (10mm
de diâmetro) de micélio em 50 mL de caldo batata. A cultura foi mantida sob agitação (60 rpm)
por quatro dias a 22 ± 3º C sob luz fluorescente contínua (50 µE/m
2
/s), posteriormente filtrada em
gase e os conídios ovais recuperados por centrifugação a 6000 g por 5 min. O pellet foi
ressuspendido em 2 mL de solução de Tween 80, 0,01% em água.
4. 4. 2. Morfogênese dos Conídios Ovais
Para acompanhamento da formação dos conídios ovais, uma alíquota de 40 µL
da suspensão na concentração de 10
6
conídios falcados mL
-1
foi colocada sobre lâminas de
microscopia revestidas por uma camada delgada de poliestireno (Mercure et al., 1994). Este
procedimento consistiu em imergir as lâminas em uma solução contendo o polímero (uma placa
de Petri de poliestireno com 90 mm de diâmetro) dissolvido em 50 mL de acetato de amila. Após
secagem as lâminas foram inoculadas e incubadas em placas de Petri a 22 ± 3
o
C sob luz
fluorescente constante (50 µE/m
2
/s) por 2, 4, 8, 10, 12, 16 e 24 horas. Após cada tempo de
64
incubação, as lâminas foram retiradas das placas de Petri, cobertas com lamínula e observadas em
microscópio óptico.
4. 4. 3. Análises em Microscopia Eletrônica de Varredura
4. 4. 3. 1. Fixação com aldeído
Segmentos foliares de 1cm
2
oriundos da cultivar BR009, com três semanas de
desenvolvimento foram retirados das plantas de sorgo e pulverizados com suspensão de conídios
ovais e falcados cada uma contendo aproximadamente 10
6
mL
-1
conídios. Os segmentos foliares
foram incubados em câmara úmida à 25
o
C, removidos em intervalos de tempo pré-determinados
(0, 4, 8, 12, 24, 32 e 48h) e fixados em 2,5% (v/v) glutaraldeído, 2,5% formaldeído em tampão
cacodilato de sódio 0,05M (pH 7,2) e CaCl
2
0,001M por 24h à 4
o
C.
4. 4. 3. 2. Pós-fixação com tetróxido de ósmio (OsO
4
)
As amostras pré-fixadas foram lavadas em aldeído com 3 passagens de cerca de
10 min em tampão cacodilato 0,05M pH 7,2 e fixadas em volume igual de tetróxido de ósmio 2%
em tampão cacodilato 0,1M durante 1h. As amostras fixadas em tetróxido de ósmio foram
lavadas 3 passagens de 10 min em água destilada, seguido da desidratação em solução em série
de concentrações crescentes de acetona (30, 50, 70, 90 e 3X em 100%) durante 10 min, secas ao
ponto crítico, metalizadas com ouro e observadas em microscópio ZEISS DSM 940A.
65
4. 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4. 5. 1. Morfogênese dos Conídios Ovais
Sobre lâminas recobertas com poliestireno, hifas provenientes de conídios
falcados, cresceram e se diferenciaram resultando em conídios ovais maduros, que se formaram
nas regiões laterais e apicais das mesmas, com 16 horas após exposição na luz (Figs. 1-5). As
hifas que deram origem aos conídios ovais mostraram-se mais espessas e altamente vacuoladas.
Panaccione et al. (1989) descreveram em isolados de C. graminicola, a
produção de dois tipos de conídios tanto em meio de cultura como durante o processo de infecção
em folhas de milho. O primeiro, o conídio falcado, produzido em acérvulos e o segundo tipo, o
conídio oval, de forma oval a elíptica formado a partir de hifas diferenciadas. Segundo Yang et
al. (1991), na ausência de luz as células conidiogênicas não se diferenciam enquanto que a luz
altera a expressão do gene que induz a conidiação em hifas vegetativas.
Souza-Paccola et al. (2003) também relataram dimorfismo conidial em isolados
de C. sublineolum, onde conídios ovais tornaram-se uma alternativa para testes de patogenicidade
e estudos genéticos, especialmente para isolados que dificilmente esporularam em meio sólido.
4. 5. 2. Análise do Processo de Germinação e Infecção dos Conídios Ovais e Falcados em
Folhas de Sorgo por Meio da Microscopia Eletrônica de Varredura
No presente estudo, através da microscopia eletrônica de varredura, foi possível
relatar pela primeira vez os eventos ocorridos durante o processo de germinação de conídios
66
ovais de C. sublineolum e a pré-penetração dos tubos germinativos oriundos destes. Á
semelhança do que ocorreu com os conídios falcados, logo após a deposição na superfície foliar
quando em contato com um filme de água, os conídios ovais iniciaram o processo de germinação.
Conídios falcados (Fig. 6), depositados sobre a superfície das folhas de sorgo,
deram início ao processo de germinação após 4 horas de inoculação com a formação do tubo
germinativo seguida de septação (Fig. 7). Com 24 horas o tubo germinativo sofreu uma complexa
diferenciação na sua extremidade livre, formando um apressório globoso dando início ao
processo de fixação na epiderme da folha (Fig. 8).
A germinação de conídios dentro do gênero Colletotrichum é bastante variável,
iniciando-se entre 4 a 48 horas (Bailey et al., 1992; Roberts e Snow, 1984) e é dependente de
fatores externos tais como temperatura e presença de materiais exógenos (Bailey et al., 1992).
Segundo Wharton e Julian (1996), a maioria dos conídios falcados de C. sublineolum germinam
após 9h de inoculação, e com 18h, quase 100% dos esporos germinados produzem apressórios de
coloração marrom escuro.
A adesão do esporo na superfície do hospedeiro é reconhecida, por vários
autores, como sendo um evento essencial para o sucesso da infecção (Mendgen e Deising, 1993;
Mercure et al., 1994) influenciando inclusive no desenvolvimento da doença, pois a rápida
adesão dos conídios aumenta a chance de sucesso no estabelecimento do patógeno na cultura
(Mercure et al., 1994).
Transcorridas 32 horas, conídios falcados germinaram e formaram um micélio
denso sobre a folha e abaixo do micélio, pôde ser observada a formação de um tipo de conídio
ovalado (Fig. 9), semelhante ao conídio oval, os quais germinam e formam o septo (Fig. 10).
Foi possível então caracterizar eventos morfológicos associados ao
desenvolvimento de conídios falcados, através da observação de hifas que se desenvolveram
67
sobre a superfície da folha. Após 24 horas de inoculação (Figs. 11-16), conídios ovais foram
produzidos blasticamente em região lateral e apical de hifas conidiogênicas. Uma pequena
protuberância no conídio oval mostra onde ocorreu a formação da parede celular na separação do
conídio com a hifa (Fig. 16).
Quando conídios ovais foram inoculados sobre folhas de sorgo (Fig. 17), após 4
horas de inoculação (Fig. 18-20), os conídios iniciaram o processo de germinação com a
formação do tubo germinativo na extremidade ou nas laterais do conídio. Nas Figs. 18-20, com 4
horas de inoculação, visualiza-se a formação de septo no centro do conídio oval.
Seguida a inoculação, estes conídios ovais germinaram, emitiram um tubo
germinativo na superfície da folha e com 24 horas, formou-se a estrutura de infecção, o
apressório (Fig. 21). Não foi observada a penetração do tubo germinativo nem do apressório
através dos estômatos. As Figs. 22-24, permitem observar a formação de um apressório globoso
decorrente do inchaço da hifa que se aderiu à superfície foliar. O poro de penetração pode ser
visualizado nos apressórios que se desprenderam da folha (Figs 23 e 24).
Seguidas 48 horas de inoculação dos conídios ovais, um emaranhado de hifas
foi formado sobre a superfície foliar o qual continha acérvulos com setas, onde foram produzidos
conídios falcados envoltos por mucilagem (Fig. 25-27).
Conídios ovais de C. sublineolum apresentaram comportamento semelhante ao
dos conídios falcados durante os processos de pré-penetração e penetração sobre folhas de sorgo.
Os conídios ovais, como descrito anteriormente são produzidos em meio de cultura líquido
(Souza-Paccola, et al., 2003), mas os resultados aqui apresentados demonstram que os mesmos
podem ser formados abaixo de hifas desenvolvidas sobre a superfície foliar de plantas de sorgo.
68
Prancha 1. Fig. 1 - 5. Microscopia de luz mostrando as hifas conidiogênicas formando conídios ovais em suas
regiões laterais (Figs. 1-2 e 3) e apicais (4-5). Na Fig. 5 é possível evidenciar a condição multinucleada dos
conídios ovais (seta). (escala 10 µm; aumento 400 x).
Prancha 2. Microscopia Eletrônica de Varredura de conídios de Colletrotrichum sublineolum (Figura 6-10). Fig.
6; Conídios falcados de C. sublineolum não germinados (escala 5 µm; aumento 2000x). Fig. 7; Germinação de
conídio falcado (Cf) com 4 horas de inoculação, mostrando a formação do tubo germinativo (Tg) e septo (S) no
conídio falcado (Cf) (escala 5 µm; aumento 3000 x). Fig. 8; Formação de apressório globoso (Ap) pelo conídio
falcado (Cf) após 24h de inoculação (escala 5 µm; aumento 2000 x). Fig. 9 – 10; Micélio denso formado sobre a
folha de sorgo após 32 horas de inoculação oriundo da germinação de conídios falcados, onde pode ser
observada a formação de conídios ovais (Co). Alguns destes conídios encontram-se em processo de germinação
(Fig. 9: escala 20 µm; aumento 550 x). (Fig. 10: escala 10 µm; aumento 1750 x).
Prancha 3. Estádios de desenvolvimento de conídios ovais (Co) de C. sublineolum (Figs. 11-16). Após um
período de 24 horas de inoculação, o micélio formado a partir de conídios falcados deram origem aos conídios
ovais os quais são formados nas regiões laterais e apicais de hifas conidiogênicas (H) (Fig. 11-15) (aumento
5000 x). Fig 16; Conídio oval (Co) onde é possível evidenciar o ponto de separação do conídio com a hifa (seta)
(escala 5 µm; aumento 3000 x).
Prancha 4. Germinação e penetração de conídios ovais de C. sublineolum sobre folhas de sorgo (Figs 17-24).
Fig. 17; Conídios ovais (Co) não germinados. (escala 5 µm; aumento 3000 x). Fig. 18 – 20; Conídios ovais (Co)
germinados após 4 horas de inoculação evidenciando a presença de tubo germinativo (Tg) nas laterais e
extremidades do conídio e septação (S) dos conídios (Fig. 18: escala 5 µm; aumento 3000 x; Fig. 19: escala 5
µm; aumento 3300 x; Fig. 20: escala 5 µm; aumento 3500 x); Fig. 21-22; Formação do apressório (Ap) sobre a
superfície da folha (escala 11 mm; aumento 850 x) após 24 horas de germinação. Fig. 23-24; Visualização do
poro de penetração no apressório (Ap) (seta) (Fig. 23: escala 11 mm; aumento 850 x; Fig. 24: escala 12 mm;
aumento 1000 x).
1
Co
2
Co
3 4
5
1
Co
1
Co
2
Co
2
Co
33 44
55
69
10
Co
Co
Co
Co
6
7
Tg
Cf
S
8
Tg
Cf
Ap
9
70
15
Co
H
14
Co
13
Co
12
Co
H
16
Co
Co
11
15
Co
H
15
Co
H
14
Co
14
Co
13
Co
13
Co
12
Co
H
12
Co
H
16
Co
16
Co
Co
11
Co
11
71
17
Co
18
Co
Tg
19
Co
20
Co
Tg
21
Ap Co
22
Ap
2423
Ap
17
Co
17
Co
18
Co
Tg
18
Co
Tg
19
Co
19
Co
20
Co
Tg
20
Co
Tg
21
Ap Co
21
Ap Co
22
Ap
22
Ap
242423
Ap
23
Ap
72
25
A
c
St
26
C
f
27
C
f
Prancha 5. Figs. 25 – 27; Micélio
proveniente da germinação de conídios
ovais originando acérvulos (Ac)
contendo setas (St) com conídios
falcados envoltos por mucilagem (seta)
(Fig. 25: escala 12 mm; aumento 500 x;
Fig. 26: escala 12 mm; aumento 1000 x;
Fig. 20: escala 12 mm; aumento 2000 x).
73
4. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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76
5. DIMORFISMO CONIDIAL EM Colletotrichum sublineolum: UM ESTUDO
CITOLÓGICO COMPARATIVO DO PROCESSO DE INFECÇÃO
5. 1. RESUMO
Estudos citológicos foram conduzidos sobre o processo de infecção de conídios falcado e oval de
dois isolados BR 204.01 e BR 8502 de Colletotrichum sublineolum sobre folhas de sorgo de
cultivares suscetíveis, moderadamente suscetíveis e resistentes. Conídios falcado e oval de cada
isolado foram inoculados, separadamente sobre as folhas destacadas. O processo de infecção foi
investigado através da microscopia de luz de 2 a 168 h após inoculação (AI). A germinação de
conídios tanto dos ovais como dos falcados teve início a partir de 2h AI em todos os cultivares
avaliados e aumentou com o tempo. Com 4 horas AI, tanto conídios ovais como falcados
oriundos do isolado BR 204.01 deram início ao processo de formação do apressório. Já conídios
ovais oriundos do isolado BR 8502, iniciaram este processo 6 h AI. Neste isolado, à semelhança
do isolado BR 204.01, conídios falcados produziram estas estruturas 4 horas AI. A frequência de
formação de apressórios entre os cultivares variou entre os diferentes tempos de incubação para
os dois isolados fúngicos, porém após 24 horas essas diferenças não mais foram detectadas de
forma que, tanto conídios ovais como falcados formaram apressórios em igual freqüência,
independente do nível de resistência do cultivar. O tempo necessário para a formação do poro de
penetração variou entre os dois tipos de conídios, entre os isolados fúngicos e entre os cultivares.
Poros de penetração foram visualizados 8 h AI de conídios falcados nos segmentos foliares de
cultivares suscetíveis. Nos demais cultivares e no outro isolado fúngico esta estrutura foi formada
10 h AI, tanto no conídio oval como no falcado. As hifas de infecção foram produzidas no
interior de células epidérmicas do tecido vegetal inicialmente 24h AI, por ambos os isolados
fúngicos independente da resistência ou suscetibilidade das cultivares porém conídios falcados
produzem hifas de penetração em proporção superior a dos conídios ovais. Vesículas de infecção
são formadas nas células epidérmicas do hospedeiro, abaixo dos apressórios oriundos tanto da
germinação de conídios falcado quanto de oval. Conídios ovais mostraram-se infectivos e
capazes de completar o ciclo da doença, da mesma maneira que os conídios falcados, porém
ainda permanece desconhecido o verdadeiro papel biológico destes conídios no processo de
estabelecimento e disseminação da doença.
Palavras-chave: Conídios ovais, conídios falcados, Sorghum bicolor, interação patógeno-
hospedeiro.
77
CONIDIAL DIMORPHISM IN Colletotrichum sublineolum: A COMPARATIVE
CYTOLOGICAL STUDY OF THE INFECTION PROCESS.
5. 2. ABSTRACT
Cytological studies were conducted on the infection process of falcate and oval conidia of two
isolates, BR 204.01 and BR 8502, of Colletotrichum sublineolum on sorghum leaves of
susceptible, moderately susceptible and resistant cultivars. Falcate and oval conidia of each
isolate were inoculated, separately, on detached leaves. The process of infection was investigated
through light microscopy from 2 to 168 hours after inoculation (AI). The germination of oval, as
well as falcate conidia began 2 hours AI in all the evaluated cultivars and increased with time.
Four hours after inoculation, oval and falcate conidia from the isolate BR 204.01 began the
appressorium formation process. However, oval conidia from the isolate BR 8502 initiated this
process 6 hours AI. In this isolate, similarly to the isolate BR 204.01, falcate conidia produced
these structures after 4 hours of incubation. The frequency of appressoria formation between the
cultivars varied among the different incubation times for both fungal isolates, but after 24 hours,
these differences were no longer detected, so that oval and falcate conidia formed appressoria
with equal frequencies, independent of the level of resistance of the cultivar. The time needed for
the formation of the penetration pore varied between both types of conidia, between the fungal
isolates and between cultivars. Penetration pores were visualized 8 hours AI of falcate conidia in
foliar segments of susceptible cultivars. In the other cultivars and in the other fungal isolate, this
structure was formed 10 hours AI of the oval and falcate conidia. The infection hyphae were
produced in the interior of epidermal cells of the plant tissue, initially 24 hours AI, by both fungal
isolates independent of resistance or susceptibility of the cultivars, but falcate conidia produced
penetration hyphae in a superior proportion to oval conidia. Infection vesicles are formed in the
epidermal cells of the host, under the appressoria formed from the germination of either falcate or
oval conidia. Oval conidia were infective and capable of completing the disease cycle, in the
same manner as falcate conidia, but the true biological role of these conidia in the process of
establishing and disseminating the disease is still unknown.
Key words: Oval conidia, falcate conidia, Sorghum bicolor, pathogen-host interaction.
78
5. 3. INTRODUÇÃO
A antracnose é uma das mais importantes doenças do sorgo (Sorghum bicolor)
no Brasil, representando um sério problema à cultura em regiões quentes e úmidas, embora
perdas severas possam também ocorrer em áreas sujeitas a breve períodos de chuva seguida de
seca prolongada (Frederiksen et al., 1995). O agente causal da antracnose sobre cereais incluindo
milho e sorgo, foi muito estudado como Colletotrichum graminicola (Holliday, 1980). Entretanto
análises de seqüências de DNA ribossômico, DNA fingerprinting, testes de cruzamentos e
morfologia do apressório tem demonstrado claramente que isolados do milho e sorgo pertencem a
espécies diferentes (Sherriff et al, 1995; Sutton, 1968; Vaillancourt e Hanau, 1992). Isolados do
milho são agora considerados C. graminicola, enquanto que os de sorgo são considerados C.
sublineolum (Sutton, 1980). Em estudos prévios de caracterização cultural Souza-Paccola et al.
(2003), demonstraram que isolados de C. sublineolum apresentavam dimorfismo conidial
produzindo, além dos conídios falcados formados em acérvulos, um segundo tipo de conídio, o
conídio oval. Este apresenta forma oval, de tamanho menor que o falcado e é produzido em
cultura líquida.
Durante a colonização em plantas hospedeiras, fungos patogênicos exibem dois
modelos principais de nutrição: biotrófico, onde nutrientes são obtidos de células vivas do
hospedeiro, e necrotrófico, onde os nutrientes são obtidos de células do hospedeiro mortas pelo
fungo (Thrower, 1966). Espécies de Colletotrichum usam diversas estratégias para invadir o
tecido hospedeiro, variando de hemibiotrófico intracelular a necrotrófico subcuticular, por meio
de estruturas especializadas, incluindo tubo germinativo, apressório, hifas intracelulares e hifas
secundárias necrotróficas, fornecendo assim excelentes modelos para estudos celulares e
moleculares no processo de interação planta - patógeno (Bailey et al., 1992; Perfect et al., 1999).
79
Wharton e Julian (1996) verificaram a importância da fase inicial biotrófica na
colonização do sorgo por C. sublineolum e Wharton et al. (2001), acompanharam este mesmo
processo de infecção através de microscopia eletrônica de transmissão em cultivares suscetível e
resistente.
Por serem escassas as informações sobre o verdadeiro papel dos conídios ovais
na planta, o propósito deste trabalho foi examinar as etapas do processo de infecção de conídio
falcado e oval de C. sublineolum sobre cultivares suscetível a resistente de sorgo para determinar
(i) se o processo de infecção difere entre os dois conídios e (ii) a reação dos cultivares frente à
colonização dos conídios.
80
5. 4. MATERIAL E MÉTODOS
5. 4. 1. Cultivo das Plantas de Sorgo
As sementes de cultivares de sorgo utilizadas como diferenciadoras (Tabela1)
foram cedidas pelo EMBRAPA Milho e Sorgo – Sete Lagoas, MG /Brasil.
As sementes dos cultivares germinaram em vasos de cerâmica de 23 cm de
diâmetro por 30 cm de altura. Foi adicionado 14 g do adubo NPK (Nitrogênio 10%; Potássio
10%; Fósforo 10%) por vaso no quinto dia após a semeadura. As plantas desenvolveram-se em
casa de vegetação durante 25 dias. Após este período as folhas foram destacadas das plantas e
levadas ao laboratório para os procedimentos de inoculação.
Tabela 1. Cultivares de sorgo com suas respectivas reações de resistência.
Cultivares Reação de resistência
BR005 Resistente
BR 008 Resistente
BR 009 Suscetível
CMSXS210 Moderadamente suscetível
SC283 Resistente
Uma vez destacadas, as folhas foram lavadas com água destilada e sabão neutro
e cortadas com estilete esterilizado. Foram recortados 512 segmentos foliares medindo
aproximadamente 1,5 x 1,5 cm. Duas camadas de papel de filtro autoclavados (8 cm de diâmetro)
foram depositadas em placas de Petri esterilizadas.
81
Água destilada esterilizada (1,6 mL) foi adicionada em cada placa para
umedecer o papel de filtro. Os segmentos foliares foram então colocados sobre o papel de filtro
umedecido, com a superfície adaxial voltada para cima.
5. 4. 2. Obtenção e Inoculação dos Conídios
Colletotrichum sublineolum, isolado BR 204.01 e BR 85.02, foram cedidos pela
Embrapa Milho e Sorgo – Sete Lagoas, MG/ Brasil. Para obtenção de conídio falcado, os
isolados foram cultivados em meio farinha de aveia-ágar, sob luz fluorescente contínua (50 µE
.
m
-
2.
s
-1
) à temperatura de 22 ± 3º C, durante 6 dias. A produção de conídio falcado foi induzida pelo
método mecânico de raspagem do micélio com auxílio de uma lâmina de metal. As culturas
assim injuriadas foram novamente incubadas nas mesmas condições de cultivo. Após 13 dias de
inoculação, foi adicionado às placas contendo o fungo em desenvolvimento 9 mL de solução
salina 0,85% acrescida de 2,5 mL de solução Tween 80 0,01% em água, sendo em seguida feita
uma raspagem superficial com alça de Drigalski para liberação dos conídios falcados.
Para produção de conídio oval, três discos de 10 mm de diâmetro, contendo
micélio dos isolados de C. sublineolum, foram usados para inocular 50 mL de meio BD (Batata
Dextrose). A cultura foi mantida sob agitação (60 rpm) por 4 dias a 22 ± 3º C sob luz fluorescente
contínua (50 µE/m
2
/s) e, posteriormente filtrada em gase. O filtrado foi centrifugado a 6000g por
5 min para recuperação dos conídios ovais. O pellet contendo os conídios ovais foi ressuspendido
em 2 mL de solução de 0,01% Tween 80 em água. O número de conídios falcados e ovais foi
estimado em Câmara de Neubauer (Boeco, Germany) e a concentração final ajustada para 3 x 10
6
conídios mL
-1
. Separadamente, as suspensões dos inóculos foram colocadas em pequenos
82
borrifadores e 0,02 mL foi borrifado uniformemente nos segmentos foliares depositados em cada
placa de Petri. As placas foram incubadas à 23
o
C sob luz fluorescente contínua (50 µE
.
m
-2.
s
-1
).
Em cada tratamento foram feitas quatro repetições.
5. 4. 3. Coloração
As observações foram realizadas em intervalos de 2 h até 10 h após inoculação
(AI), em seguida em intervalos de 24 h até 168 h AI e duas semanas após as 168 h. Os segmentos
foliares foram clarificados em 1,5 mL de álcool acético (1 parte de ácido acético glacial e 3 partes
de etanol 95%) por 48 h (Busch e Walker 1958; Khan e Hsiang 2003). Após 24 h, substituiu-se a
solução de álcool acético por uma nova solução e assim mantida por mais 24 h. As folhas
clarificadas foram removidas e colocadas por 5 minutos em uma solução de 0,05% de Trypan
blue (w/v) em lactofenol (20% fenol, 20% ácido lático, 40% glicerina e 20% de água destilada).
Após a coloração as folhas foram depositadas sobre lâminas com a superfície adaxial voltada
para cima e então adicionada à lamínula. As lâminas foram analisadas em microscópio óptico e
fotografadas em Fotomicroscópio AXIOPHOT Zeins.
5. 4. 4. Estruturas de Infecção
O processo de germinação de conídios foi avaliado nas preparações de 2 a 48 h
AI. Em cada segmento foliar, 25 conídios foram observados quanto a emissão do tubo
germinativo nos tempos determinados. Um conídio foi considerado germinado quando seu tubo
germinativo apresentou pelo menos 50% da largura do conídio.
83
A formação do apressório e do poro de penetração foram observados sobre as
preparações de 4 à 48h AI. Em cada segmento foliar verificou-se a presença de apressório nos
primeiros 25 conídios visualizados, germinados ou não. Apressórios originados a partir de
fragmentos de micélio foram desconsiderados. A formação do poro de penetração foi observada
através da formação de um ponto claro e redondo no interior do apressório, visto pela
microscopia de luz.
A ocorrência da hifa de infecção foi avaliada nas preparações de 10, 24, 48, 72,
96 e 120 h AI. Em cada segmento foliar a presença da hifa de infecção foi avaliada em 25
conídios. A penetração foi considerada bem sucedida quando o apressório produziu hifa no
interior das células epidérmicas foliares.
As preparações de 48, 72, 96, 120, 144 e 168 h AI foram usadas para avaliar a
presença de acérvulos e produção de conídios. Duas semanas após a inoculação avaliou-se
também o número de acérvulos sobre o segmento foliar.
84
5. 5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
5. 5. 1. Germinação de Conídios
O processo de germinação tanto dos conídios ovais como dos falcados teve
início a partir de 2 h após a inoculação (AI) em todos as cultivares avaliadas e a freqüência deste
processo aumentou com o tempo de incubação. Transcorridas 48 horas da inoculação, a
porcentagem de germinação de ambos os conídios não diferiu para o isolado BR 204.01, no
entanto para o isolado BR 8502 esta taxa foi ligeiramente maior para os conídios falcados
(Tabela1).
Conídios ovais oriundos do isolado BR 8502 apresentam nas primeiras horas de
incubação uma taxa de germinação significativamente superior aos conídios falcados, porém a
partir de 6 horas de incubação a taxa de germinação destes últimos superou à dos conídios ovais.
Em 48 h AI, nos dois isolados testados, conídios ovais germinaram em freqüência acima de 95%,
enquanto que nos conídios falcados esta freqüência foi de 99% (Tabela 1).
Apesar das cultivares apresentarem diferenças nas reações de resistência e
suscetibilidade a taxa de germinação dos conídios, após 48 horas de incubação, não mostrou
diferenças significativas entre eles, para ambos os isolados.
Conídios falcados podem formar um ou dois tubos germinativos, um na
extremidade do conídio e outro na lateral deste (Fig. 1A e 1B). Somente após 96 horas de
inoculação, pode ser observada a formação do septo central (Fig. 1A). Já os conídios ovais
formam apenas um tubo germinativo na extremidade do conídio (Fig. 2B e 2C).
Segundo Nicholson e Epstein (1991), a adesão é considerada pré-requisito essencial durante a
patogênese de fungos. As etapas de atração e contato entre patógeno e hospedeiro fazem parte da
85
fase de reconhecimento da interação (Leite et al., 1997). Durante a pré-penetração, ocorre a
adesão através da liberação de materiais adesivos produzidos pelo patógeno. A penetração e a
infecção somente serão atingidas se houver adesão adequada (Leite et al., 2001) para assim
estabelecer as relações parasitárias estáveis entre fungo e planta (Amorim, 1995). Evidências em
várias espécies de Colletotrichum indicam que a rápida adesão inicial de conídios não
germinados envolve interações hidrofóbicas. Em C. musae e C. graminicola, enzimas localizadas
nas superfícies protéicas das células do hospedeiro podem impedir a adesão de conídios não
germinados, sugerindo que a superfície protéica de células pode mediar este processo (Mercure et
al., 1994; Sela-Buurlage et al., 1991).
Mercure et al. (1994), observaram que conídios de C. graminicola, fixam-se às
folhas de milho após alguns minutos de contato e a germinação destes conídios tem início 6h
após a inoculação. Alterações nos conídios e presença de material adesivo sobre a superfície de
contato tanto de conídios não germinados como nos tubos germinativos podem ser visualizadas.
A microscopia eletrônica de varredura e a microscopia de luz revelaram que os materiais
envolvidos na adesão são de natureza glicoproteíca.
5. 5. 2. Formação e Morfologia do Apressório
O tempo necessário para a formação do apressório variou entre os dois tipos de
conídios dependendo do isolado. Após 4 horas de incubação, tanto conídios ovais como falcados
oriundos do isolado BR 204.01 deram início ao processo de formação do apressório. Já conídios
ovais oriundos do isolado BR 8502, iniciaram este processo 6 h AI. Neste isolado, à semelhança
86
do isolado BR 204.01, conídios falcados produziram estas estruturas após 4 horas de incubação
(Tabela 2).
A freqüência de formação de apressórios entre as cultivares variou nos
diferentes tempos de incubação para os dois isolados fúngicos, porém após 24 horas essas
diferenças não mais foram detectadas de forma que, tanto conídios ovais como falcados
formaram apressórios com igual freqüência, independente do nível de resistência da cultivar
(Tabela 2).
Apressórios provenientes de conídios falcados foram produzidos diretamente
nos conídios (Fig. 1A – 1G) enquanto que nos conídios ovais estes se formaram a partir de tubos
germinativos (Fig. 2D, 2E e 2F).
Apressórios oriundos de conídios falcados apresentaram forma arredondada
com a superfície lisa (Fig. 3A e 3B) enquanto que apressórios de conídios ovais apresentaram-se
ligeiramente irregulares (Fig. 3C – 3G). Em conídios ovais os apressórios intumescem e são
separados do tubo germinativo por meio de um septo (Fig. 3F). Apressórios jovens de ambos os
conídios são hialinos, e as paredes tornam-se mais espessas e escuras com o acúmulo de melanina
durante o processo de maturação.
O apressório desenvolve-se sobre a superfície foliar quando o tubo germinativo
cessa seu crescimento e sua extremidade sofre uma dilatação, tornando-se delimitado por um
septo. A maturação do apressório envolve a formação do poro de penetração na base da célula,
deposição de uma nova camada de parede e a secreção de material da matrix extracelular e
finalmente a fixação do apressório na superfície do hospedeiro (Pain et al., 1996).
Subseqüentemente, a melanina é depositada na camada da parede celular perto da membrana
plasmática (Kubo e Furusawa, 1986).
87
Browning et al. (1999), e Khan e Hsiang (2003), descreveram apressórios de
conídios falcados de C. graminicola em Agrostis palustris e Poa annua. Estes variaram
morfologicamente de redondos a ovalados e lobulados. Como observado por Browing et al.
(1999), o apressório de isolados de gramíneas apresentaram grande similaridade com apressórios
de isolados de sorgo. Estes foram descritos por Sutton (1968) como piriformes, elípticos,
ovalados a claviforme. Apressórios provenientes de isolados de milho, foram descritos por este
mesmo autor com forma mais variada, circulo ovalado, pequeno, piriforme a elíptico,
completamente irregular e podendo apresentar de um a cinco lóbulos distintos.
A morfologia do apressório maduro de uma determinada espécie é
razoavelmente constante, permitindo classifica-lo como globoso (= ovalado) ou subgloboso (=
obovado) e de contorno regular ou com variados graus e freqüência de rugosidades (Lenné, 1978
apud Lopez, 2001).
5. 5. 3. Poro de penetração, hifas de infecção e acérvulos
Na microscopia de luz, o poro de penetração aparece como um ponto claro
pequeno e circular no centro do apressório (Fig. 1D; 2F; 3A – 3G), e é no poro que se forma o
peg de penetração, uma estrutura pequena e embutida na parede celular que dificilmente pode ser
visualizada pela microscopia de luz.
O poro de penetração foi observado após 8 h de inoculado apenas em
segmentos foliares do cultivar suscetível BR009 e moderadamente suscetível CMSXS210,
inoculados com conídios falcado do isolado BR 204.01 (Tabela 3). Nos demais cultivares e no
88
outro isolado fúngico esta estrutura foi formada após 10 horas da inoculação, tanto com conídio
oval quanto no falcado.
Os resultados não permitiram correlacionar suscetibilidade do cultivar com
freqüência de formação do poro de penetração.
Passadas 48 h AI, 79,5% dos conídios do isolado BR 204.01 inoculados na
cultivar resistente BR005 formaram os poros de penetração, enquanto que nos demais cultivares
esta freqüência variou de 33,5 a 45,5%. Neste mesmo tempo de incubação, 58% dos conídios do
isolado BR 8502 inoculado sobre folhas do cultivar suscetível, BR009, formaram poros de
penetração, enquanto que nos demais cultivares essa freqüência variou de 31 a 43% (Tabela 3).
Apressórios originados de conídios ovais de ambos os isolados fúngicos,
iniciaram o processo de formação de poros de penetração 10h AI em uma freqüência
relativamente baixa, em torno de 2,6%. No entanto esta freqüência aumentou significativamente a
partir de 24h AI chegando a 47,6% com 48h AI, não diferindo dos conídios falcados para o
isolado BR 204.01, e 45,0% para o isolado BR 8502, freqüência maior que em conídios falcados.
Outra forma de penetração de hifas no tecido foliar do hospedeiro seria através
das aberturas naturais, como estômatos, sem a necessidade de formação de poros de penetração.
Esse tipo de penetração não foi aqui observado.
As primeiras hifas de infecção ocorrendo no interior de células epidérmicas do
tecido vegetal foram observadas com 24h AI, tanto no isolado BR 204.01 como no BR 8502 em
todas as cultivares (Tabela 4). Com 48h AI, em torno de 45,5% dos conídios oriundos do isolado
BR 204.01 formaram hifas de infecção na cultivar resistente BR005, enquanto que a freqüência
destas estruturas nas demais cultivares foi significativamente menor, variando de 19 a 32%.
89
Transcorridas 120 h AI, esta freqüência subiu para 84% e 93% nas cultivares
resistentes BR005 e SC 283, respectivamente, e 77% no cultivar moderadamente resistente,
CMSXS210. O BR 8502 teve comportamento diferente para esta característica. Com 48h AI
42,5% dos conídios inoculados na cultivar suscetível BR009 apresentaram hifas de penetração,
enquanto que nas demais cultivares esta freqüência variou de 8,5% a 17%. A freqüência de
formação das hifas de penetração após 120h AI foi semelhante em todas as cultivares
independente da reação de resistência e de suscetibilidade de cada um (Tabela 4).
No isolado BR 204.01, hifas de infecção foram formadas em maior
porcentagem pelos conídios falcados do que pelos conídios ovais em todos os intervalos de
tempo avaliados. O isolado BR 8502 apresentou comportamento diferente, uma maior
porcentagem destas hifas formadas pelos conídios falcados foi verificada somente a partir de 72h
AI permanecendo em freqüência superior mesmo após 120h AI.
Os resultados permitiram concluir que conídios falcados produzem hifas de
penetração em proporção superior aos conídios ovais (Tabela 4).
Fungos patogênicos após formação do apressório, penetram em plantas através
do poro apressorial, uma zona fina e circular na base do apressório a qual não é melanizada. As
hifas de infecção emergem pelo poro e penetra pela parede celular do hospedeiro. Então a
vesícula de infecção é formada, a qual caracteriza o crescimento biotrófico por um período curto.
A vesícula de infecção não atravessa a membrana plasmática do hospedeiro, mas a membrana
plasmática invagina-se ao redor dela. Esta forma de crescimento proporciona um aumento da área
de superfície do fungo, permitindo maior acesso aos nutrientes do hospedeiro (Bergstrom e
Nicholson, 2000).
90
Vesículas de infecção, resultantes da germinação dos conídios falcados, foram
formadas abaixo das células epidérmicas do tecido hospedeiro (Fig. 4A e 4B). Apressórios,
vesículas e hifas de infecção formadas a partir do processo de germinação dos conídios ovais
podem ser visualizadas nas Figuras 4D e 4E. A Figura 4E permite observar a formação de
conídios ovais na extremidade das hifas de infecção no interior das células epidérmicas do sorgo.
Panaccione et al. (1989) sugerem que a função dos conídios ovais produzidos
durante o processo de necrose em milho por C. graminicola seja o de disseminação dentro da
planta.
Embora esta função não tenha sido aqui completamente determinada, a
ocorrência da formação destes conídios no interior das células epidérmicas (Fig. 4E) sugere que o
possível papel destes conídios como agente disseminador da doença na planta.
Wharton et al. (2001), através de observações ultraestruturais do processo de
infecção de conídios falcados de C. sublineolum verificaram que os eventos iniciais de
penetração foram os mesmos tanto em cultivares de sorgo suscetíveis como nos resistentes.
Tubos germinativos originados da germinação de conídios falcados formaram apressórios
melanizados e globosos que penetraram diretamente nas células epiteliais do hospedeiro. A
penetração foi seguida da formação de vesículas globulares biotróficas nas células epiteliais e as
hifas primárias oriundas das vesículas colonizaram outras células do hospedeiro com micélios
intracelulares.
Os primeiros sintomas da doença foram visualizados a partir de 72h AI nos
segmentos foliares inoculados com conídios falcados de ambos os isolados (Tabela 5), com
formação de lesões necrosadas seguida de formação de acérvulos no centro das mesmas.
91
Enquanto que nos segmentos foliares inoculados com conídios ovais, os sintomas surgiram
somente a partir de 144h AI (Tabela 5).
A cultivar BR009 inoculada com o isolado BR 204.01 (Tabela 5) apresentou
um número maior de acérvulos com 96h; 120h; 144h; 168h e duas semanas em relação às outras
cultivares. Este mesmo cultivar inoculado com o isolado BR 8502, apresentou um número maior
de acérvulos a partir de 120h, 144h e 168h AI, em relação aos tecidos foliares inoculados com
conídios ovais (Tabela 5).
A Figura 5 mostra os acérvulos formados no tecido foliar no cultivar SC283
inoculado com conídios ovais do isolado BR 204.01. O processo inicia-se com a formação do
estroma resultante de um acúmulo de hifas que se agregam na superfície celular (Fig 5A e 5B).
Pequenos acérvulos contendo um número ainda pequeno de setas podem ser vistos a partir dos
estromas (Fig 5C-5D). O número de setas aumenta com o tempo de incubação (Fig 5E). No
intervalo de 144h AI é possível verificar a presença de conídios falcados em abundância sobre os
acérvulos e o tecido lesionado.
Estes resultados demonstram que conídios ovais também são infectivos
promovendo o desenvolvimento de lesões com acérvulos que dão origem ao conídio falcado,
fechando o ciclo de infecção.
Apesar das diferenças morfológicas e ontogênicas dos conídios falcados e ovais
ambos são capazes de reproduzir sintomas da doença.
Os conídios ovais emitem no início da germinação apenas um tubo
germinativo, enquanto que os conídios falcados podem emitir até dois. A emissão de múltiplos
tubos germinativos em C. sublineolum não foi visualizada como descrito por Khan e Hsiang
(2003) em C. graminicola. Uma vez emitido o tubo germinativo inicia-se o processo de formação
92
do apressório. No conídio falcado este é formado a partir do próprio conídio, enquanto que no
oval este é formado a partir do tubo germinativo. Uma vez formado os apressórios, em ambos os
conídios, vesículas de infecção podem ser vistas de onde partem as hifas de infecção seguida da
formação do estroma e exteriorização dos acérvulos contendo setas, onde os conídios falcados
são ali produzidos. Conídios ovais foram produzidos internamente nas células epidérmicas, nas
extremidades das hifas de infecção.
O processo geral de infecção pelos conídios ovais de C. sublineolum foi similar
ao dos conídios falcados e semelhante a aqueles descritos por outros autores em C. graminicola.
Conídios ovais mostraram-se infectivos e capazes de completar o ciclo da doença, porém o papel
biológico destes conídios no processo de estabelecimento e disseminação da doença requer
melhores investigações.
93
Figura 1. Fotomicrografias de tecido foliar de sorgo tratado com álcool acético e corados com
Trypan blue (0,005%), demonstrando o processo de germinação de conídios falcados do isolado
204.01 de Colletotrichum sublineolum após inoculação (A – G). (A) Conídio falcado (Cf) com
96h de inoculação, apresentando dois tubos germinativos, um na extremidade do conídio e outro
na lateral (escala 20 µm); (B) Com 96 h de inoculação, conídio falcado (Cf) com septo (S) e
apressório formado (escala 20 µm); (C) Conídios falcados (Cf) após 10 h de inoculação, um não
germinado e o outro com apressório (Ap) melanizado (escala 10 µm); (D) Conídio falcado (Cf)
com 10 h de inoculação com formação de apressório diretamente do conídio e apresentando poro
de penetração (escala 10 µm); (E-G) Conídios falcados (Cf) com 10 h de inoculação, com
apressórios (Ap) melanizados formados (escala : (E) 20 µm; (F) 15 µm; (G) 10 µm).
A
T
T
C
B
C
S
C
C
C
A
D
C
A
P
G
A
C
F
A
A
C
E
A
A
C
94
Figura 2. Germinação de conídios ovais de Colletotrichum sublineolum sobre tecido foliar
sorgo após clarificação com álcool acético e coloração com Trypan blue (0,005%), (A)
Conídios ovais (Co) com 2 h de inoculação (escala 25 µm); (B-C) Conídio oval (Co) com 4
h de inoculação com tubo germinativo (Tg) em formação (escala: (B) 9 µm; (C) 10 µm); (D-
E) Conídio oval (Co) com 10 h de inoculação com formação do apressório (Ap) próximo ao
conídio (escala 20 µm) e a partir do tubo germinativo (Tg) (escala 10 µm); (F) Apressório
(Ap) com poro de penetração (P) formado a partir de um conídio (escala 10 µm).
A
B
C
D
E
F
C
C
Co
C
C
C
T
T
T
A
A
A
P
95
Figura 3. Fotomicrografias de tecido foliar de sorgo tratado com álcool acético e corados com
Trypan blue (0,005%), demonstrando a morfologia de apressórios formados a partir de conídios
falcados e ovais e a formação do poro de penetração do isolado 204.01 de Colletotrichum
sublineolum após inoculação (A – G). (A) Apressórios (Ap) redondos com superfície lisa,
formados a partir de conídios falcados após 48 h de inoculação (escala 20 µm); (B) poro de
penetração (P) em apressório (Ap) melanizado formados de conídios falcados (escala 9 µm); (C-E)
Apressórios (Ap) ligeiramente irregulares e no centro a presença do poro de penetração(P),
formados da germinação de conídios ovais com 10 h de inoculação (escala 10 µm); (F-G) Após
168 h, apressórios (Ap) irregulares e apressórios lobulados com poro de penetração podem ser
visualizados (escala 10 µm).
B
Ap
P
G
Ap
Ap
E
Ap
P
D
Ap
P
F
Ap
Ap
S
P
A
Ap
P
C
Ap
P
96
Figura 4. Fotomicrografias de células do tecido foliar de sorgo tratados com álcool
acético e corados com Trypan blue (0,005%), demonstrando as hifas e vesículas de
infecção (A-E). (A-B) Apressórios (Ap) são vizualizados na região mais escura e em
seguida a vesícula (V) de infecção que se forma logo abaixo na célula após 48 h de
inoculação. Estes apressórios foram formados a partir da germinação de conídios falcados
do isolado 204.01 de C. sublineolum (escala: (A) 11 µm; (B) 60 µm); (C-D) Apressórios
(Ap), vesículas (V) e hifas de infecção (Hi) formada após 48h de inoculação de conídios
ovais do isolado 204.01 de C. sublineolum (escala: (C) 9 µm; (D) 11 µm); (E) Hifa de
infecção (Hi) crescendo em diferentes direções após 120 h de inoculação de conídios
ovais do isolado 204.01 de C. sublineolum (escala 20 µm).
A
Ap
V
B
Ap
V
C
Ap
V
Hi
E
Hi
Hi
D
Ap
V
Hi
V
97
Figura 5. Fotomicrografias de células do tecido foliar de sorgo tratados com álcool acético e corados
com Trypan blue (0,005%), demonstrando formação de acérvulos a partir de conídios ovais que
germinaram e colonizaram os tecido foliar (A-F). (A-B) Com 96h de inoculação, houve agregação de
hifas e a formação do estroma (E) (escala 50 µm); (C-E) Acérvulos (A) com setas (St) e conídios
falcados (Cf) em abundância após 144h de inoculação (escala 50 µm); (F) Acérvulo (A) produzindo
conídio falcado (Cf), hifas infectivas (Hi) nas células do tecido foliar e tecido necrosado (Tn) (escala
40 µm).
A
E
C
A
S
t
D
S
t
E
S
t
C
f
F
A
T
n
H
i
B
E
98
Tabela 1. Freqüência de germinação de conídios falcado e oval de isolados de Colletotrichum sublineolum sobre folhas destacadas de cinco cultivares de
sorgo com 25 dias de idade, em intervalos de tempo definidos após a inoculação. (Média de 4 repetições com 25 conídios cada)
Germinação de conídios sobre superfície das folhas (%)
Isolado 204.01 Isolado 8502
2h 4h 6h 8h 10h 24h 48h 2h 4h 6h 8h 10h 24h 48h
Cultivar BR005 18 70 93 a
(1)
86 92 98 100 30 42 64 67 79 b 89 95
BR008 25 75 83 b 88 90 92 96 21 48 68 78 93 a 97 99
BR009 21 76 82 b 89 93 98 99 19 49 62 72 82 ab 94 98
210B 27 62 80 b 87 95 96 99 26 44 59 75 90 ab 97 97
SC283 18 62 73 b 82 92 94 98 14 36 60 73 93 ab 96 99
ns
(3)
ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns ns
Conídio Falcado 22 78 A
(2)
82 85 95 98 A 99 14 B 37 B 69 A 76 95 A 99 A 100 A
Oval 22 60 B 83 88 90 93 B 98 30 A 50 A 56 B 70 80 B 90 B 95 B
ns ns ns ns ns ns
cv% 25,33 14,37 10,99 17,63 13,56 10,25 5,99 38,18 15,70 14,91 13,38 12,05 8,76 7,13
(1)
Médias dos cultivares, para um mesmo isolado e no mesmo tempo, seguidas de mesma letra minúscula, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05)
(2)
Médias dos conídios falcado e oval, para um mesmo isolado e no mesmo tempo, seguidas de mesma letra maiúscula, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey
(p<0,05). Os dados foram transformados em arc sen √ p/100.
(3)
ns: não significativo
99
Tabela 2. Freqüência de formação de apressório a partir de conídio falcado e oval de dois isolados de Colletotrichum sublineolum sobre folhas
destacadas de cinco cultivares de sorgo com 25 dias de idade, em intervalos de tempo definidos. (Média de 4 repetições com 25 conídios cada)
Formação de apressório sobre superfície das folhas (%)
Isolado 204.01 Isolado 8502
4h 6h 8h 10h 24h 48h 4h 6h 8h 10h 24h 48h
Cultivar BR005 50 ab
(1)
52 54 55 b 95 95 9 ab 29 a 55 ab 82 ab 89 96
BR008 58 a 57 73 77 a 87 99 16 a 39 a 67 a 86 a 91 96
BR009 57 a 63 74 76 ab 91 100 12 ab 33 a 48 b 82 a 89 98
210B 37 ab 60 66 79 a 92 97 13 ab 14 b 52 ab 71 b 91 97
SC283 34 b 58 63 82 a 89 94 8 b 19 ab 55 ab 75 ab 90 97
ns
(3)
ns ns ns ns ns
Conídio Falcado 63 A 74 A 80 A 89 A 95 A 98 24 A 42 A 62 A 93 A 99 A 99
Oval 31 B 42 B 52 B 59 B 86 B 97 0 B 12 B 50 B 65 B 81 B 95
ns ns ns
cv% 25,89 16,21 18,85 14,73 8,86 8,69 22,13 30,15 16,23 12,14 7,96 8,50
(1)
Médias dos cultivares, para um mesmo isolado e no mesmo tempo, seguidas de mesma letra minúscula, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05)
(2)
Médias dos conídios falcado e oval, para um mesmo isolado e no mesmo tempo, seguidas de mesma letra maiúscula, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey
(p<0,05). Os dados foram transformados em arc sen √ p/100.
(3)
ns: não significativo
100
Tabela 3. Freqüência de conídio falcado e oval de Colletotrichum sublineolum que formaram o poro de penetração sobre folhas destacadas de
cinco cultivares de sorgo com 25 dias de idade, em intervalos de tempo definidos. (Média de 4 repetições com 25 conídios cada)
Formação do poro de penetração sobre a superfície da folha (%)
Isolado 204.01 Isolado 8502
4h 6h 8h 10h 24h 48h 4h 6h 8h 10h 24h 48h
Cultivar BR005 0 0 0 9 36 79 a 0 0 0 8 12 b 33 b
BR008 0 0 0 5 19 38 b 0 0 0 5 18 ab 31 b
BR009 0 0 3 a
(1)
3 22 45 b 0 0 0 11 24 ab 58 a
210B 0 0 4 a 11 19 41 b 0 0 0 9 15 b 36 b
SC283 0 0 0 6 10 33 b 0 0 0 13 29 a 43 ab
ns
(3)
ns ns
Conídio Falcado 0 0 3 A
(2)
12 A 18 B 47 0 0 0 16 A 22 35 B
Oval 0 0 0 B 3 B 25 A 48 0 0 0 3 B 18 45 A
ns ns
cv% 58,64 57,29 30,27 14,61 55,39 25,66 19,93
(1)
Médias dos cultivares, para um mesmo isolado e no mesmo tempo, seguidas de mesma letra minúscula, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05)
(2)
Médias dos conídios falcado e oval, para um mesmo isolado e no mesmo tempo, seguidas de mesma letra maiúscula, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey
(p<0,05). Os dados foram transformados em arc sen √ p/100.
(3)
ns: não significativo
101
Tabela 4. Freqüência de conídio falcado e oval de Colletotrichum sublineolum que formaram hifas de infecção no interior de células epidérmicas
de cinco cultivares de sorgo com 25 dias de idade, em intervalos de tempo definido. (Média de 4 repetições com 25 conídios cada)
Hifa de infecção observadas em células da epiderme
Isolado 204.01 Isolado 8502
10h 24h 48h 72h 96h 120h 10h 24h 48h 72h 96h 120h
Cultivar BR005 0 21 a
(1)
45 a 59 64 84 ab 0 0 b 17 b 31 b 63 82
BR008 0 9 ab 19 b 49 60 67 b 0 2 ab 8 b 37 b 60 73
BR009 0 9 ab 32 ab 52 71 75 b 0 2 ab 42 a 63 a 73 83
210B 0 7 ab 24 b 42 70 77 ab 0 2 ab 10 b 41 b 64 78
SC283 0 4 b 20 b 58 75 93 a 0 5 a 13 b 41 b 72 89
ns
(3)
ns ns ns ns
Conídio Falcado 0 12 A
(2)
34 A 64 A 73 A 88 A 0 1 17 B 51 A 73 A 89 A
Oval 0 8 B 21 B 40 B 63 B 70 B 0 3 19 A 34 B 59 B 73 B
ns
cv% 55,37 23,37 19,13 17,76 13,46 132,5 32,63 21,12 16,31 13,43
(1)
Médias dos cultivares, para um mesmo isolado e no mesmo tempo, seguidas de mesma letra minúscula, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05)
(2)
Médias dos conídios falcado e oval, para um mesmo isolado e no mesmo tempo, seguidas de mesma letra maiúscula, na coluna, não diferem entre si pelo teste de Tukey
(p<0,05). Os dados foram transformados em arc sen √ p/100.
(3)
ns: não significativo
102
Tabela 5. Número de acérvulo por segmento foliar após inoculação de conídios falcado e oval de Colletotrichum sublineolum sobre folhas
destacadas de 25 dias idade de cinco cultivares de sorgo, em intervalos de tempo definidos após a inoculação. (Média de 4 repetições com 25
conídios cada)
Número de acérvulo
Isolado 204.01 Isolado 8502
48h
72h 96h 120h 144h 168h 2 s* 48h
72h 96h 120h 144h 168h 2 s*
Cultivar
BR005 0 7 c
(1)
9 b 54 b 74 b 122 c 258 c
0 9 a 10 b 56 ab
81 bc 142 b 292 b
BR008 0 0 d 26 ab
46 b 123 b
199 bc
301 c
0 0 b 27 ab
46 b 110 bc
188 a 267 b
BR009 0 12 b 27 a 93 a 209 a
294 a 498 a
0 12 a 25 ab
90 a 184 a 238 a 443 a
210B 0 18 a 30 a 47 b 65 b 132 c 324 b
0 10 a 27 ab
51 ab
68 c 132 b 298 b
SC283 0 9 bc 28 a 74 ab
154 a
194 b 374 b
0 8 a 29 a 77 ab
93 b 183 b 485 a
Conídio
Falcado
0 18 A
(2)
48 A
125 A
206 A
307 A
510 A
0 16 A
47 A
128 A
188 A
284 A
497 A
Oval 0 0 B 0 B 0 B 44 B 69 B 192 B
0 0 B 0 B 0 B 27 B 68 B 217 B
cv% 13,74 27,31
17,88
17,30
14,86 9,45 18,97
28,34
14,91
11,20 14,05 9,27
(1)
Médias dos cultivares, para um mesmo isolado e no mesmo tempo, seguidas de mesma letra minúscula, na linha, não diferem entre si pelo teste de Tukey (p<0,05)
(2)
Médias dos conídios falcado e oval, para um mesmo isolado e no mesmo tempo, seguidas de mesma letra maiúscula, na linha, não diferem entre si pelo teste de Tukey
(p<0,05). Os dados foram transformados em arc sen √ p/100.
(2 s*) duas semanas
103
5. 6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
AMORIM, L. Ciclos primários e secundários. In: BERGAMIN, F, A.; KIMATI, H.; AMORIM,
L. (Eds.). Manual de Fitopatologia – princípios e conceitos. São Paulo, Ceres, 1995. p. 234-
245.
BAILEY, J.A.; O'CONNELL, R.J.; PRING, R.J.; NASH, C. Infection strategies of
Colletotrichum species. In: Bailey, J.A. & Jeger, M.J. (Eds.) Colletotrichum: Biology, Pathology
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Phytopathological Society, St. Paul, Minnesota, 2000. p. 374-393.
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Morphological, pathogenic and genetic comparisons of Colletotrichum graminicola isolates from
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6. CONCLUSÃO
Com estes trabalhos foi possível concluir que:
Os processos de pré-penetração, penetração e infecção de conídios ovais de C.
sublineolum foram similares aos dos conídios falcados. Conídios ovais mostraram-se infectivos e
capazes de completar o ciclo da doença, além disso, são produzidos internamente nas células
epidérmicas, nas extremidades das hifas de infecção.
Se conídios ovais possuem um papel efetivo na doença, provavelmente este possa ser o de
propagação dentro da planta para promover a proliferação do fungo, ao contrário da dispersão,
uma função associada aos conídios falcados os quais são produzidos externamente na superfície
da lesão. Esta sugestão tem papel especulativo e deve ser confirmada através de experimentos
adicionais. Acreditamos na importância dos conídios ovais no desenvolvimento da doença e estes
devem ser incluídos como uma característica desta espécie.
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