( PDF ) Biodegradação de naftaleno em solos contaminados por derivados de petróleo em Caratinga, MG

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CENTRO UNIVERSITÁRIO DE CARATINGA

MESTRADO EM MEIO AMBIENTE E SUSTENTABILIDADE

BIODEGRADAÇÃO DE NAFTALENO EM SOLOS

CONTAMINADOS POR DERIVADOS DE PETRÓLEO EM

CARATINGA – MG

BRUNO MARQUES GONÇALVES ALVES

CARATINGA

Minas Gerais - Brasil

Agosto de 2007

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CENTRO UNIVERSITÁRIO DE CARATINGA

MESTRADO EM MEIO AMBIENTE E SUSTENTABILIDADE

BIODEGRADAÇÃO DE NAFTALENO EM SOLOS

CONTAMINADOS POR DERIVADOS DE PETRÓLEO EM

CARATINGA – MG

BRUNO MARQUES GONÇALVES ALVES

Dissertação apresentada ao Centro

Universitário de Caratinga, como parte das

exigências do Programa de Pós-Graduação em

Meio Ambiente e Sustentabilidade, para

obtenção do título de Magister Scientiae.

CARATINGA

Minas Gerais - Brasil

Agosto de 2007

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Sistema de Bibliotecas - UNEC

Ficha Catalográfica

547.842

A474b

2007

ALVES, Bruno Marques Gonçalves.

Biodegradação de naftaleno em solos contaminados por

derivados de petróleo em Caratinga, MG. Bruno Marques

Gonçalves Alves. Centro Universitário de Caratinga – UNEC:

Mestrado em Meio Ambiente e Sustentabilidade, 2007.

49p; 29,7 cm.

Dissertação (Mestrado – UNEC – Área: Meio Ambiente e

Sustentabilidade).

Orientador: Profª. PhD. Miriam Abreu Albuquerque.

Co-orientador: Prof. PhD. Carlos Ernesto Gonçalves Reynaud

Schaefer

1. Biodegradação.

2. Microorganismos.

3. Contaminação do solo - Diesel

I. Título II. Profª. Ph.D. Miriam Abreu Albuquerque.

BRUNO MARQUES GONÇALVES ALVES

BIODEGRADAÇÃO DE NAFTALENO EM SOLOS

CONTAMINADOS POR DERIVADOS DE PETRÓLEO EM

CARATINGA – MG

Dissertação apresentada ao Centro

Universitário de Caratinga, como parte

das exigências do Programa de Pós-

Graduação em Meio Ambiente e

Sustentabilidade, para obtenção do

título de Magister Scientiae.

APROVADA: 17 de agosto de 2007

Profª Dra. Miriam Abreu Albuquerque

(Orientadora)

Prof. Dr. Meubles Borges Júnior

Prof. Dr. Luiz Cláudio Ribeiro

Rodrigues

Prof. Dr. Carlos Ernesto Gonçalves

Reynaud Schaefer

iii

À minha esposa Angélica

Aos meus pais

Às minhas irmãs

AGRADECIMENTOS

Agradeço primeiramente a Deus por existir.

Ao Centro Universitário de Caratinga pela oportunidade de realizar o

curso de Pós-Graduação.

À FAPEMIG pela bolsa de mestrado.

À Professora Miriam Abreu Albuquerque, pela orientação nesse trabalho e

pela dedicação.

Aos professores do Centro Universitário de Caratinga, por seus

ensinamentos.

À UFV, através do Laboratório de Radioisótopos, coordenado pelo

professor Juraci Oliveira, pela disponibilidade de uso de equipamentos e

instrumentos.

Ao Tio Eugênio, pela confiança no trabalho e pela ajuda dada em muitas

ocasiões.

Aos Biólogos Bruno e Grace, pela colaboração e assistência dadas nas

análises laboratoriais.

Aos colegas do Programa de Mestrado em Meio Ambiente e

Sustentabilidade.

A todos aqueles que de alguma forma contribuíram para realização deste

trabalho.

Muito, muito obrigado!

CONTEÚDO

Página

RESUMO............................................................................................................... vii

ABSTRACT............................................................................................................ ix

1 INTRODUÇÃO..............................................................................................01

2 REVISÃO DE LITERATURA.........................................................................04

2.1 – O crescimento populacional e o Petróleo..........................................04

2.2 – Remediação ......................................................................................06

2.2.1 – Biorremediação....................................................................07

2.3 – O Diesel.............................................................................................08

2.3.1 - Naftaleno ..............................................................................10

2.4 – Postos de Combustíveis....................................................................11

2.5 – A Respirometria e o uso de Radioisótopos........................................12

3 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................14

3.1 – Instalação experimental.....................................................................14

3.2 – Coleta das amostras..........................................................................14

3.3 – Acondicionamento e transporte das amostras...................................15

3.4 – Análise química dos solos.................................................................16

3.5 – Ensaios de degradação do [

C] Naftaleno nos solos .......................16

3.5.1 – Reagentes químicos ............................................................16

3.5.2 – Aparato respirométrico.........................................................16

3.5.3 – Coleta e análise das amostras contendo

...................17

3.6 – Ensaios de degradação de [

C] Naftaleno pelas culturas de

enriquecimento das amostras de solos selecionados. ...............................18

3.6.1 – Escolha dos inóculos microbianos.......................................18

3.6.2 – Meio de cultura para ensaios de degradação do Naftaleno.18

3.6.3 – Cultura de enriquecimento...................................................18

3.6.4 – Degradação do [

C] Naftaleno a

em meio de

cultura pelas culturas de enriquecimento.........................................19

3.7 – Testes de degradação do [

C] Naftaleno em solos contaminados

utilizando culturas microbianas nativas e não nativas................................ 19

3.8 – Análises estatísticas..........................................................................19

4 RESULTADOS E DISCUSSÃO....................................................................20

4.1 – Análise química dos solos.................................................................20

4.2 – Ensaios de degradação do [

C] Naftaleno nos solos .......................21

4.3 – Culturas de enriquecimento...............................................................23

4.3.1 – Microrganismos obtidos a partir da cultura de

enriquecimento do solo....................................................................23

4.3.2 – Ensaios de degradação do [

C] Naftaleno pelas culturas

de enriquecimento das amostras de solo selecionado ....................24

4.4 – Inóculos microbianos nativos e não nativos ......................................26

5 CONCLUSÕES.............................................................................................31

6 RECOMENDAÇÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS....................................32

7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................34

ANEXOS...............................................................................................................40

vii

RESUMO

ALVES, BRUNO MARQUES GONÇALVES. Ms.C., Centro Universitário de

Caratinga, agosto de 2007. Biodegradação de naftaleno em solos

contaminados por derivados de petróleo em Caratinga, MG. Orientadora:

Professora Ph.D. Miriam Abreu Albuquerque. Co-orientador: Professor

Ph.D.Carlos Ernesto Schaefer.

Na cidade de Caratinga existem postos de abastecimento de

combustíveis cuja vida útil dos tanques de armazenamento de combustíveis é

estimada em aproximadamente 25 anos. Ao longo do tempo os tanques,

podem apresentar desgastes, podendo ocorrer vazamentos e possíveis

contaminações do ambiente. Os maiores problemas da contaminação do solo e

das águas subterrâneas por combustível são atribuídos aos hidrocarbonetos

aromáticos, estes são os constituintes mais solúveis e móveis da fração do

diesel, tais como Benzeno, Tolueno, Naftaleno (HPAs). Estes compostos

podem atingir as águas subterrâneas e contaminá-las. Os compostos HPAs

são muito tóxicos ao sistema nervoso central do homem, apresentando

toxicidade crônica, mesmo em pequenas concentrações. O objetivo desta

pesquisa foi determinar a existência de microrganismos no solo de um Terminal

de Combustíveis em Caratinga e avaliar a capacidade dos microrganismos em

biodegradar o diesel. Foi aplicada uma metodologia para a identificação da

biodegradação do naftaleno. Os ensaios foram realizados em bancada,

viii

utilizando-se microrganismos típicos do local e exógenos para comparação. Os

resultados obtidos mostraram que ocorreu maior redução da quantidade do

naftaleno adicionado, quando foram utilizados microrganismos nativos.

Palavras Chave: Biodegradação, microrganismos, contaminação do solo,

diesel.

ABSTRACT

ALVES, BRUNO MARQUES GONÇALVES. Ms.C., Centro Universitário de

Caratinga, august, 2007. Biodegradation of naphthalene in contamined soil

by diesel hydrocarbons in Caratinga city, Minas Gerais state. Adviser:

Miriam Abreu Albuquerque. Co-adviser: Carlos Ernesto Schaeffer.

In the Caratinga city many fuel supplying facilities exist and the estimated

lifetime of the fuel storage tanks are of approximately 25 years. In the long run,

these fuel tanks show signs of wearing leading to leaks and possible

environmental contaminations. The greatest problem of soil and groundwater

contamination by fuel is due to the aromatic hydrocarbons, which are the most

soluble and mobile compound of the diesel, such as Benzene, Toluene,

Naphthalene (PAHs). These compounds can reach the groundwater, and

contaminate them. The compounds of PAHs are very toxic to the central

nervous system of the human body, showing signs of chronic toxicity, even in

small concentrations. The purpose of this research was to determine the

existence of microorganisms in the soil of the Fuel Terminals in Caratinga city

and to evaluate the capacity of the micro-organisms in biodegrade diesel. A

methodology was applied study of the biodegradation of the naphthalene in

contaminated soils. Using a known mass of soil collected in the area of study,

and adding the typical microorganisms of the area as well as exogens,

previously selected and enriched. The obtained results showed greater

degradation of naphthalene by typical microorganisms isolated from local

contaminated soils.

Key words: Biodegradation, microorganisms, soil contamination, diesel.

1. INTRODUÇÃO

A ocorrência de vazamentos em sistemas de armazenamentos

subterrâneos de combustível tem sido objetivo de crescente preocupação em

função dos riscos associados a esses acidentes, tanto para a segurança e

saúde da população, como para o meio ambiente como um todo. Além disso,

outro motivo de preocupação refere-se à forma como estes acidentes se

manifestam, pois, na grande maioria dos casos, tanto as contaminações 0-10

provocadas por constantes e sucessivos derrames junto às bombas e locais de

enchimento dos reservatórios, como os vazamentos em tanques de

armazenamentos e tubulações subterrâneas, somente são percebidos após o

afloramento do produto em galerias de esgoto, redes de drenagem de águas

pluviais, no subsolo de edifícios, em túneis, escavações e poços de

abastecimento de água, razão pela qual as ações emergenciais requeridas

durante o atendimento a estas situações requerem o envolvimento de diversos

órgãos públicos, além das empresas privadas envolvidas (Ramos, 2006).

É muito comum que os tanques de armazenamentos, por ação corrosiva

ou por ultrapassagem de sua vida útil, provocarem derramamentos de

combustíveis que contaminam o subsolo e o lençol aqüífero, prejudicando a

qualidade da água e do solo para a atividade produtiva e também, para o

consumo humano.

A contaminação do solo e das águas subterrâneas por derramamento de

petróleo e derivados é um problema que vem ganhando grande importância no

Brasil nos últimos anos em função dos diagnósticos crescentes de áreas

impactadas (Schneider et al., 2003).

Tratando-se de águas subterrâneas, este comportamento tende a ser

mais prolongado, pois esses ambientes não contêm microorganismos aeróbios

em quantidade suficiente para promover a biodegradação desses poluentes.

Assim, os processos de remediação dos poluentes tornam-se muito onerosos

devido ao custo para remoção de solo onde ocorreu o derrame e do tratamento

do resíduo produzido, envolvendo diversos órgãos públicos como também

empresas privadas especializadas além do custo financeiro do

acompanhamento da área afetada por técnicos especializados.

Por outro lado, a biorremediação é uma tecnologia não destrutiva, de

grande efetividade, de baixo custo e, algumas vezes, logisticamente favorável

que visa acelerar o processo natural de biodegradação de contaminantes pela

otimização dos fatores que limitam este fenômeno. O uso de organismos

capazes de degradar compostos como os hidrocarbonetos derivados de

petróleo (HPAs), nos processos de biorremediação, é de extrema importância

por se tratar de uma alternativa de baixo custo, de alta efetividade e de caráter

menos invasivo, sob o ponto de vista ecológico (Tiburtius et al., 2004).

Dentre os combustíveis, a relação de consumo seja nos meios de

transporte, seja no uso industrial, coloca a gasolina no topo da lista (CETESB,

2006). Por conseqüência disso as pesquisas que envolvem a remediação da

gasolina são em maior quantidade, porém, economicamente, o diesel não fica

atrás, sendo alvo inclusive de pesquisas internacionais como as realizadas na

Estação Brasileira Comandante Ferraz na Antártica através do projeto

Criossolos (Schaefer, 2006).

Os compostos aromáticos são os constituintes principais do diesel,

perfazem cerca de 55% de sua constituição (massa/massa). Os

hidrocarbonetos aromáticos são geralmente mais tóxicos que os compostos

alifáticos com o mesmo número de carbonos e possuem maior mobilidade em

água, em função de sua solubilidade ser da ordem de 3 a 5 vezes maior

(Nakhla, 2003). Além de migrarem mais rapidamente através da água atingindo

mananciais de abastecimento, os compostos aromáticos apresentam uma

toxicidade crônica mais significativa do que os hidrocarbonetos alifáticos (Watts

et al., 2000). As doses tóxicas para o naftaleno, por exemplo, são de 4 a 5

mg.L

-1

, enquanto que para o isopentano (alifático mais freqüente em diesel)

são de 300 a 330 mg.L

-1

São objetivos deste trabalho, testar a eficiência na biodegradação,

realizada por culturas nativas e não-nativas, retiradas de solos contaminados

com diesel, através do auxilio da respirometria e do uso de naftaleno marcado

radioativamente, empregado como fonte nutricional das culturas obtidas desses

solos. O presente trabalho subsidiará o desenvolvimento de tecnologias

sustentáveis e apropriadas para a mitigação e despoluição de águas e

sedimentos contaminados por hidrocarbonetos de petróleo. O desenvolvimento

de técnicas de biorremediação com tratamento in situ, contribuirá nos esforços

para a redução dos passivos ambientais acumulados ao longo de muitos anos

de contaminação pelo uso de combustíveis fósseis na região do leste mineiro.

2. REVISÃO DE LITERATURA

2.1. O crescimento Populacional e o Petróleo

O grande crescimento da população mundial nos últimos dois séculos e a

busca constante do desenvolvimento e a intensificação da agricultura

observados nas últimas décadas ocasionaram uma série de modificações na

sociedade atual, algumas de aspectos positivos e outras nem tanto, como

podemos citar os efeitos ambientais da poluição (Chaaban, 2001).

A necessidade da produção em larga escala determinou um aumento na

demanda por combustíveis e na necessidade de desenvolvimento de

substâncias químicas sintéticas, fertilizantes, pesticidas e fármacos que

possibilitassem o desenvolvimento da população em expansão. Essa busca

pelo aumento na produção acarretou um aumento paralelo no descarte de

resíduos potencialmente tóxicos, vindo principalmente das indústrias, no meio

ambiente (Odum, 1997; Bernoth, 2000).

A industrialização iniciada a séculos tornou-se altamente dependente dos

derivados de petróleo. O petróleo é usado como combustível primário em

máquinas de combustão interna, após ser purificado e processado, sendo de

grande importância para o homem (Odum, 1997).

O petróleo é considerado uma fonte de energia não renovável, de origem

fóssil e é matéria prima da indústria petrolífera e petroquímica. O petróleo bruto

possui em sua composição uma cadeia de hidrocarbonetos, cujas frações leves

formam os gases e as frações pesadas o óleo cru. A distribuição destes

percentuais de hidrocarbonetos é que define os diversos tipos de petróleo

existentes no mundo.

Em meados do século XIX, a necessidade de combustível para

iluminação principalmente querosene, e em algumas áreas, gás natural, levou

ao desenvolvimento da indústria do petróleo. Ainda no século XIX, o

crescimento do transporte motorizado fez com que a demanda crescesse muito

rapidamente. Hoje em dia, o petróleo fornece grande parte da energia mundial

utilizada no transporte e nas indústrias e é a principal fonte de energia para

muitas outras finalidades. Dessa forma, o petróleo tornou-se fonte de milhares

de produtos petroquímicos (Odum, 1997).

Na década de 80, estimava-se que o input anual global de petróleo estava

entre 1,7 a 8,8 milhões de toneladas métricas, dos quais a maior parte era

proveniente de fontes antropogênicas (Leahy & Colwell, 1990). Na última

década este input provavelmente cresceu consideravelmente em função do

grande aumento da produção de petróleo e derivados e de seu transporte

praticamente dobrando a estimativa (Ramos, 2006).

São muitos os relatos de incidentes com derramamento de petróleo nas

últimas décadas. O maior deles ocorreu durante a Guerra do Golfo, em 1991,

com o derramamento de seis milhões de barris de petróleo no Golfo Arábico;

grande parte das comunidades animais e vegetais que habitavam a faixa

costeira do sul do Kuwait até a Ilha de Abu Ali, na Arábia Saudita foram

fortemente afetadas (Leahy & Colwell, 1990). A crescente ocupação da terra

realizada pelo homem tem causado incidentes até mesmo em áreas mais

susceptíveis ecologicamente, como em regiões de clima ártico (Leahy &

Colwell, 1990).

Nesse contexto, a poluição de solos e de águas por petróleo e seus

derivados vêm merecendo cada vez mais atenção dos vários segmentos da

sociedade. A presença desses poluentes no ambiente acarreta riscos à saúde

humana e animal, incluindo o homem, daí a necessidade de se eliminar essas

substâncias utilizando processos de limpeza com intervenção humana

denominados de remediação (Bernoth, 2000; Odum, 1997; Tiburtius et al.,

2004; Troquest et al., 2003).

2.2. Remediação

Os processos de remediação utilizam técnicas que visam à degradação

dos poluentes com a geração de produtos não-tóxicos ou inertes ao meio

contaminado. Algumas dessas técnicas realizam a imobilização ou o

isolamento da região contaminada podendo, tais ações, tornar o processo

bastante difícil e demorado, exigindo altos investimentos e sua eficiência

dependerá principalmente das interações entre contaminantes e a matriz

contaminada (Tiburtius et al., 2004).

A remediação pode ser dividida em dois processos de tratamentos, os

tratamentos ex-situ e os in situ. Os processos de tratamento ex-situ, também

chamados de tradicionais, são aqueles que envolvem a remoção física do

material contaminado do local original e o encaminhamento do mesmo para o

tratamento que ocorre em outro local (Volkering et al., 1995; Pala, 2002). Um

exemplo desse tipo de tratamento é a incineração de solos contaminados com

derivados de petróleo, proveniente de postos de gasolina (CETESB, 2006).

Já os processos de tratamento in situ são baseados no estímulo à

biodegradação natural de contaminantes na sub-superfície do solo e da água,

sem a escavação da camada 0-10 do solo. Dentre este tratamentos destacam-

se:

•adição de nutrientes, que aumenta a atividade microbiana nativa,

principalmente, nitrogênio, fósforo, potássio e oxigênio – bioestímulo (Autry e

Ellis, 1992);

•adição de linhagens microbianas exógenas degradadoras – bioaumento

(Bernoth et al., 2000);

•adição de surfactantes, que auxilia a metabolização dos compostos

poluentes, facilitando o transporte destes substratos orgânicos para o interior

das células microbianas ou diminuindo as interações 0-10 contaminante/solo

(Tiburtius et al., 2004);

•ou ainda a adição de enzimas comerciais, que favorecem a oxidação de

moléculas de difícil degradação em moléculas de fácil assimilação pelos

microrganismos (Nano et al., 2003).

Baseando-se nos tratamentos in situ, diversas formas alternativas de

remediação têm sido desenvolvidas com a mesma eficiência das técnicas

tradicionais, porém com vantagens no que diz respeito a custos, tempo de

remediação e diminuição nos riscos de manipulação (Troquest et al., 2003). O

uso de técnicas de biorremediação como alternativas de remediação de solos

tem ganhado importância principalmente nos últimos anos (Tiburtius et al.,

2004; Bernoth et al., 2000).

2.2.1 - Biorremediação

O termo biorremediação engloba uma série de tecnologias distintas para

tratamento não só de solos, mas também de águas contaminadas e outros

resíduos. A biorremediação propõe a utilização de um ou mais consórcios

microbianos, nativos (bioestímulo) ou não (bioaumento), para a degradação de

contaminantes. Esses consórcios seriam preparados a partir de culturas

capazes de degradar os contaminantes, visando utilizá-los em seu

metabolismo, liberando para o meio externo, substâncias inertes como CO

O (Pandey, 2000; Troquest et al., 2003).

As técnicas de biorremediação, que empregam a adição de

microrganismos exógenos (bioaumento), devem ser muito bem avaliadas

devido aos riscos ambientais que a inserção de um microrganismo, não nativo

ao solo, de uma determinada região pode gerar. Assim sendo, as técnicas de

biorremediação que empregam apenas o uso da microbiota nativa

(bioestímulo), podem vir a produzir resultados mais eficazes e de menor

impacto ao meio ambiente (Liebeg e Cutright, 1999). O grau de

descontaminação, entretanto, irá depender da natureza e concentração do

poluente presente, assim como as características do solo (Autry e Ellis, 1992;

Del’arco, 1999; Adeniyl e Afolabi, 2002) A capacidade em degradar o

contaminante e o tempo necessário para que isto ocorra também devem ser

observados (Geerdink et al., 1996).

Segundo Lima et. al. (2001), os fenômenos biológicos abrangem duas

atividades fundamentais interdependentes, que são a síntese dos compostos

orgânicos e a biodegradação destes compostos. A biodegradação é a

decomposição de um material em componentes mais simples por organismos

vivos, em que este processo biológico envolve dois fatores essenciais, que é a

nutrição e a respiração.

Os microrganismos fazem uso da matéria orgânica constituída de um

resíduo, seja ele sólido ou líquido, servindo-se de uma boa parte desta para a

sua autoconstrução e reprodução. O restante é oxidado por meio da

respiração, aproveitando sua energia e compensando ao meio, elementos na

forma de subprodutos do seu metabolismo. Desta maneira, carbono, nitrogênio

e fósforo etc, que faziam parte das moléculas orgânicas dos resíduos, são

devolvidas ao meio (ar, água, solo) na forma de compostos mais simples, como

gás carbônico, fosfatos, nitratos, etc (Lima et al., 2001).

2.3. O Diesel

O diesel é uma mistura complexa de hidrocarbonetos com diferentes

graus de volatilização, como compostos alifáticos (alcanos, cicloalcanos e

alquenos), aromáticos policíclicos (HPAs) e aditivos, com cadeias carbônicas

compreendidas na faixa de 5 a 10 carbonos por moléculas (Silva, 2002).

O maior problema da contaminação por combustíveis está relacionado

com hidrocarbonetos aromáticos policíclicos (HPAs), uma classe de

contaminantes bastante conhecidos, originados da combustão incompleta de

compostos orgânicos, dentre os quais se destacam, benzeno, tolueno e xilenos

(BTX) e o naftaleno (Nakhla, 2003). Estes HPAs podem ser encontrados em

todos os segmentos ambientais, incluindo solo, água e ar e são passíveis de

serem biodegradados (Valdman, 2004).

Os compostos aromáticos são os constituintes principais do diesel,

perfazem entre 48 e 59% de sua constituição (massa/massa). Os

hidrocarbonetos aromáticos são geralmente mais tóxicos que os compostos

alifáticos com o mesmo número de carbonos e possuem maior mobilidade em

água, em função de sua solubilidade ser da ordem de 3 a 5 vezes maior

(Nakhla, 2003). A tabela 1 mostra a solubilidade dos principais HPAs

juntamente com outras propriedades físico-químicas.

A solubilidade de um composto químico em água é a medida da

concentração deste composto que será dissolvida em água pura em uma

determinada temperatura. A solubilidade de uma substância em água aumenta

com a elevação da temperatura. É expressa, normalmente, na forma de

gramas de produto por litro de água, gramas de produto por 100 mL de água,

porcentagem ou em mg.L-1 (parte por milhão). Para compostos puros, a

solubilidade em água é função do tipo de estrutura molecular e das

características eletroquímicas. Para mistura de compostos orgânicos como o

diesel, a solubilidade é função da fração molar de cada constituinte individual

da mistura (Johnson, 1990).

TABELA 1 – Propriedades físico-químicas de alguns hidrocarbonetos

policíclicos aromáticos (HPAs)

Substância

Ponto de

fusão (°K)

Massa

Molar

Solubilidade

(mg/L)

Pressão de

vapor (Pa)

Antraceno 489,2 178,20 0,0450 0,001

Fenantreno 374,0 178,20 1,1000 0,02

Pireno 429,0 202,30 0,1320 0,0006

Fluoranteno 384,0 202,30 0,2600 0,0012

Criseno 528,0 228,30 0,0020 0,00000057

Naftaleno 353,0 128,190 31,0000 10,400

Fluoreno 389,0 166,200 1,9000 0,090

Benzopireno

448,0 252,30 0,0038 0,0000007

Fonte: (Johnson, 1990)

Hidrocarbonetos aromáticos têm também maior mobilidade em sistemas

solo-água, característica que pode ser representada significativamente pelo

menor coeficiente de partição entre octanol-água. Um menor coeficiente de

partição implica em uma lenta absorção no solo e, conseqüentemente, um

transporte preferencial via água. Além de migrarem mais rapidamente através

das águas atingindo mananciais de abastecimento, os compostos aromáticos

apresentam uma toxicidade crônica mais significativa do que os

hidrocarbonetos alifáticos (Watts et al., 2000). As doses tóxicas para benzeno e

naftaleno, por exemplo, são respectivamente de 10 a 90 mg.L

-1

e 4 a 5 mg.L

-1

enquanto que para o isopentano (alifático mais freqüente em diesel) são de 300

a 330 mg.L

-1

2.3.1 - Naftaleno

O naftaleno (C

) é um hidrocarboneto aromático policíclico bastante

simples, formado por dois anéis benzênicos fundidos. As ligações carbono-

carbono do naftaleno não possuem o mesmo comprimento, sendo que as

pontes C1-C2, C3-C4, C5-C6 e C7-C8 possuem cerca de 1,36 Å, enquanto as

demais pontes possuem cerca de 1,42 Å. Possui massa molecular igual a

128,17 g. mol

-1

, densidade de 1,14 g.cm

-3

e solubilidade baixa em água (31,0

mg.L

-1

). O naftaleno sublima facilmente à temperatura ambiente e tende a ser

fortemente absorvido pelo solo, sendo um dos primeiros compostos a atingir o

lençol freático em caso de contaminação do mesmo (Valdman et al., 2004).

Hidrocarbonetos ingeridos por organismos marinhos passam através da

parede intestinal e se tornam parte da reserva lipídica. Quando dissolvidos no

tecido adiposo, os hidrocarbonetos são preservados, porque estão protegidos

do ataque microbiano, podendo ser transferidos da presa para o predador e,

eventualmente, ao homem. O Naftaleno foi considerado, em conjunto com

outros HPAs, como a classe de poluentes de maior contribuição na toxicidade

total de amostras de sedimentos e rejeitos líquidos, passando a ser

enquadrado na lista prioritária de contaminantes orgânicos persistentes (Silva,

2002).

A exposição prolongada a concentrações sub-letais desses poluentes

pode tornar o organismo mais susceptível às doenças. Aparecimento de

tumores, alterações genéticas e leucemias são algumas conseqüências

clínicas da intoxicação por hidrocarbonetos. Estes poluentes influenciam ainda

sistemas endócrinos e enzimáticos (Silva, 2002). Especificamente para o

naftaleno sua ingestão ou inalação pelo homem, pode provocar diversos

efeitos, dentre eles: anemia hemolítica, catarata, aumento do baço, danos aos

rins e ao cérebro (Valdman et al., 2004). Existem comprovações claras de que

o naftaleno passa pelo metabolismo enzimático oxidativo do citocromo P450,

resultando na produção de metabólitos reativos, que levam à depleção da

glutationa, e conseqüente formação de estresse oxidativo (Stohs et al., 2002).

O estresse oxidativo resultante produz efeitos danosos em tecidos,

incluindo opacificação do cristalino e formação de catarata, peroxidação de

lipídios, danos ao DNA e aumento na fluidez de membrana dos tecidos

hepáticos e cerebrais (Stohs et al., 2002).

Em função destes fatores a legislação tem se tornado cada vez mais

restritiva (Bilstad, 1996). A Agência de Proteção Ambiental Norte Americana

(EPA), por exemplo, estabelece os limites máximos para a concentração do

benzeno em 5 µg/g em água potável (Gerlach et al., 1997). No Brasil, a portaria

nº1469/2000 do Ministério da Saúde (acessada em Julho 2006 através de

http//www.funasa.gov.br/pub28.htm) determina que os limites máximos

permitidos para naftaleno, benzeno, tolueno e xilenos são de 2, 5; 170 e 300

µg/L, respectivamente, para que a água seja considerada potável.

O conhecimento da capacidade de degradação destas substâncias, por

exemplo, o naftaleno, realizada por microrganismos é essencial na implantação

de métodos eficazes de biorremediação em áreas que sofreram ou sofrem

contaminação por hidrocarbonetos, uma vez que a capacidade de degradação

de compostos orgânicos por microrganismos vem sendo utilizada a longo

tempo e é cientificamente reconhecida. Sendo o naftaleno uma molécula

orgânica presente em hidrocarbonetos de petróleo, sua decomposição por

meio de microrganismos entre outros, é evidente (Valdman et al., 2004).

2.4. Postos de Combustíveis

Uma importante parcela do processo de contaminação pode ser atribuída

às atividades das refinarias de petróleo e seus derivados (Freire, 2000). Em

virtude desse fato, recentemente, os principais alvos dos tratamentos in situ

passaram a ser os postos de combustíveis. Eles representam umas das

principais fontes de poluição dos solos e das águas subterrâneas,

principalmente, devido aos vazamentos dos tanques de armazenamento

(CETESB, 2006).

Vazamentos em postos de combustíveis provocam graves problemas ao

meio ambiente, principalmente com respeito a contaminação de águas

subterrâneas (Prommer et al., 1999). Para se ter uma idéia do problema, a

Agência de Proteção Ambiental Norte Americana (EPA) estima que existem

mais de 1,5 milhões de tanques subterrâneos de armazenamento de gasolina

nos Estados Unidos. Destes, 400.000 já foram substituídos ou adaptados de

acordo com as legislações federais. Mesmo assim, mais de 250.000 casos de

vazamentos já foram identificados e mais de 97.000 ações remediadoras foram

implantadas. Semanalmente, mais de 1.000 novos vazamentos estão sendo

encontrados em todo o território norte-americano (Corseuil & Marins, 1997;

Gerlach et al., 1997; Mohammed, 1997).

No Brasil, a realidade não é diferente, existem cerca de 27.000 postos de

combustíveis, os quais podem provocar impactos sobre os recursos aquáticos,

principalmente envolvendo águas subterrâneas (Shneider et al., 2003). Ainda

não existem estatísticas sobre a magnitude do problema da contaminação por

esses derivados de petróleo. Entretanto, em função de muitos tanques terem

mais de 25 anos de uso, acredita-se que a possibilidade de ocorrerem

vazamentos é extremamente grande, principalmente pelo surgimento de

rachaduras ou corrosão (Corseuil et al., 1998; Corseuil et al., 1996).

Contextualizando o problema a realidade do Leste Mineiro, mais

especificamente à cidade de Caratinga, observa-se que o problema apenas

diminui em escala, devido, principalmente ao tamanho da região e da cidade

respectivamente, quando comparados com o tamanho do país.

2.5. A respirometria e o uso de radioisótopos

A respiração é um dos mais antigos parâmetros para quantificar a

atividade microbiana. Podendo ser usada para verificar a capacidade de

determinados microrganismos em degradar poluentes como benzeno e

naftaleno. Ela representa a oxidação da matéria orgânica por organismos

aeróbios do solo que, portanto, utilizam O

como aceptor final de elétrons até

. Assim ela pode ser avaliada tanto pelo consumo de O

como pela

produção de CO

. A determinação do O

pode ser feita por cromatografia

gasosa ou por respirometria e a do CO

por titulação ou condutividade elétrica,

cromatografia gasosa, espectroscopia de infravermelho (IRGA) ou por

detecção de

C (Carbono 14), neste último caso quando se deseja monitorar

compostos orgânicos específicos, podendo-se utilizar também a técnica

respirométrica (Moreira e Siqueira, 2002 e Albuquerque, 1995).

As técnicas usando radioisótopos são largamente empregadas

atualmente para detecção da produção metabólica desses microrganismos. De

forma geral, essas técnicas avaliam a taxa de degradação de determinado

poluente por microrganismos pela quantidade de CO

produzido. Para isso

utilizam-se como fonte nutricional da cultura, moléculas marcadas

radioativamente. Durante a decomposição, parte do carbono e nutrientes fica

retido na biomassa que é rica nesses elementos enquanto a outra parte é

liberada para a atmosfera sob a forma de gás carbônico principalmente

(Moreira e Siqueira, 2002). Dessa forma o CO

produzido a partir dessas

moléculas também estará marcado, emitindo energia radioativa, podendo ser

medida com o uso de técnicas adequadas como, por exemplo, a respirometria

aliada a aparelhos capazes de quantificar a radiação emitida por esses

compostos (Moreira e Siqueira, 2002; Albuquerque, 1995).

Os primeiros trabalhos referentes a técnicas respirométricas basearam-se

em estudos experimentais sobre a quantificação do consumo de oxigênio

dissolvido em sistemas de lodos ativados, desenvolvidos na década de 60. O

procedimento para estimar a velocidade de consumo de oxigênio é de extrema

simplicidade e com amplo campo de aplicação (Andreottola et al., 2005).

A respirometria, em geral, consiste em estimar as quantidades de

oxigênio consumido, por células ativas. Como o oxigênio é pouco solúvel em

água, a disponibilidade para os microrganismos depende da sua solubilidade e

da transferência de massa, bem como da velocidade com que o oxigênio

dissolvido é consumido (Gonçalves et al., 2001). A respirometria também pode

medir a quantidade de dióxido de carbono produzida por microrganismos em

amostras líquidas ou sólidas, calculando de forma indireta, a atividade da

cultura microbiana (Spanjers et al., 1998).

Experimentos prévios em laboratórios podem auxiliar no desenvolvimento

dessas tecnologias porque permitem selecionar linhagens microbianas que,

para suprir suas necessidades metabólicas, são capazes de degradar

determinados compostos tóxicos, inclusive os compostos poluentes

encontrados no diesel.

3. MATERIAL E MÉTODOS

3.1. Instalação experimental

O presente trabalho foi desenvolvido em bancada e a instalação dos

experimentos foi realizada no Laboratório de Microbiologia do Centro

Universitário de Caratinga – UNEC e no Laboratório de Radioisótopos da

Universidade Federal de Viçosa – UFV. Todo o trabalho foi realizado com a

utilização de equipamentos adequados de segurança, por tratar-se de

procedimentos utilizando microrganismos e pelo uso de materiais radioativos.

O descarte desses materiais radioativos e dos microrganismos também foi

realizado com a preocupação de evitar contaminação ambiental.

3.2. Coleta das Amostras de Solo

As amostras de solos foram coletadas em um Terminal de Abastecimento

de uma empresa de transporte localizada na cidade de Caratinga em duas

remessas. A primeira feita em 11/2005 e a segunda em 03/2006.

No tanque de armazenamento de diesel deste terminal, ocorreu um

vazamento de diesel há dois anos. Foram construídos então, poços de

monitoramento de água que contornam o local do vazamento. Esses poços

tinham a profundidade de 15 metros e eram situados em pontos que circulavam

o local do incidente, em pontos centrais do inicio do mesmo e em pontos mais

afastados, distantes cerca de 5 metros desse, conforme Figura 1.

As amostras de solo, coletadas em duas etapas, foram realizadas nas

proximidades dos poços centrais e dos poços distantes em duas

profundidades, o chamado solo 0-10, coletado em até 10 cm de profundidade e

o chamado solo 20-30, coletado entre 20 e 30 cm de profundidade, formando

após homogeneizadas, quatro blocos de amostras. A perfuração do solo foi

realizada com cavadeira comum e as amostras foram coletadas com um trado.

FIGURA 1: Visão superior do terminal de abastecimento

Tomou-se o cuidado de retirar os resíduos que ficaram impregnados no

coletor de solo entre uma profundidade e outra e entre a coleta de um poço e

outro, evitando-se possíveis alterações nos resultados das análises.

As amostras foram coletadas com todos os cuidados para se evitar

possíveis contaminações, identificadas segundo a profundidade e local de

retirada, acondicionadas em sacos plásticos estéreis com lacre, próprios para

acondicionar alimentos, do tipo Zip Loc.

3.3. Acondicionamento e transporte das amostras

Uma vez feita a coleta total das amostras, estas foram armazenadas em

caixa de isopor e colocadas sob resfriamento até serem encaminhadas ao

Laboratório de Microbiologia da UNEC para ensaios de degradação, e ao

Departamento de Solos da UFV, para a realização das análises químicas.

3.4. Análise química dos solos

As análises foram feitas no Laboratório de Análises de Solos, do

Departamento de Solos da Universidade Federal de Viçosa. As amostras de

solos foram secas ao ar e passadas em peneiras de 2 mm obtendo a terra fina

seca ao ar para as análises químicas (EMBRAPA, 2006).

3.5. Ensaios de degradação do [

C] Naftaleno nos solos.

3.5.1 – Reagentes químicos

Foram usadas as soluções metanólica de [

C] naftaleno-benzeno

(uniformemente marcada), com atividade específica de 31,3 mCi.mmol

-1

, o

coquetel de contagem em cintilação líquida (Sigma High Performance LSC

Cocktail) e o hidróxido de sódio (NaOH), obtidos da Sigma-Aldrich Chemical

Co., Saint Louis, MO, EUA.

3.5.2 – Aparato respirométrico

O experimento de degradação de [

C] naftaleno foi conduzido num

sistema respirométrico (Albuquerque, 1995). O aparato consiste de: (1) uma

fonte de ar comprimido; (2) um sistema de armadilhamento, que visa tornar o ar

que entra no sistema livre de CO

, composto de uma armadilha seca (500 g de

soda lime); (3) as amostras de solo colocadas em frascos de penicilina,

possuem uma entrada de ar (livre de CO

) e uma saída de ar (por onde o

liberado pode escapar e ser capturado em (4), um segundo sistema de

captura de

, composto por armadilhas (também uma para cada amostra

de solo) contendo 30 mL de solução de NaOH 0,5 M, as quais capturam o

produzido por cada amostra de solo. A Figura 2 apresenta um esquema

simplificado do aparato utilizado.

FIGURA 2: Esquema simplificado do aparato respirométrico.

3.5.3 – Coleta e análise das amostras contendo

Foram realizadas coletas de amostras liquidas para leitura com um

intervalo de 1, 8, 16 e 21 dias a partir dos sistemas de captura de

. A

cada ponto de amostragem, 1mL da solução contida no sistema de captura de

de cada tratamento (cada sistema possuía 30mL ao todo), previamente

homogeneizada através de fluxos contínuos com micropipeta, era recolhida e

acomodada em um vial de contagem do contador de cintilação líquida, que era

hermeticamente fechado. O volume do sistema de captura de

era

completado para 30 mL (com solução de NaOH 0,5 M) e novamente ligado à

sua respectiva amostra de solo no sistema respirométrico.

Foram coletadas 48 alíquotas, 12 de cada amostra de solo, sendo 3 em

cada tempo de 1, 8, 16 e 21 dias.

Para a contagem radioativa, a cada amostra (1mL da solução de NaOH

0,5 M coletada de cada sistema de captura de

) foram adicionados 5 mL

do coquetel de cintilação líquida (Sigma High Performance LSC Cocktail). A

contagem foi realizada em um contador de cintilação líquida (LS 6800,

Beckman, EUA). Os resultados foram corrigidos, considerando o background

do aparelho e a diluição da amostra. Foram ainda comparados com um padrão

contendo o coquetel cintilante e 25 µL de naftaleno, sem amostra antes da

análise estatística.

3.6 Ensaios de degradação do [

C] Naftaleno pelas culturas de

enriquecimento das amostras de solos selecionados.

3.6.1 – Escolha dos inóculos microbianos.

Os inóculos para a cultura de enriquecimento foram obtidos a partir das

amostras de solos que apresentaram maior capacidade de degradar o [

Naftaleno a

conforme metodologia descrita no item 3.5.3.

3.6.2 – Meio de cultura para os ensaios de degradação do Naftaleno.

Os meios básicos para a cultura de enriquecimento de microrganismos

continha, além de 50 mL de diesel, fonte de naftaleno, os seguintes compostos:

1,6 g/L de K

HPO

; 0,2 g/L de MgSO

.7H

O; 0,1 g/L de NaCl; 0,025

CaCl

.2H

O; 0,5 g/L de NH

, com pH ajustado para 6,8 - 7,0.

3.6.3 – Cultura de enriquecimento.

As culturas de enriquecimento dos inóculos selecionados no item 2.6.1

foram obtidas utilizando-se 5g de solo e 5mL de água esterilizada, incubados

com agitação a 28°C com 40mL de meio estéril. Depoi s de 2 semanas de

incubação, diluições foram feitas, transferindo 1mL da cultura inicial para 20mL

de meio fresco estéril por cerca de 1 meses obtendo-se ao final do

procedimento, 3 repetições originadas a partir da cultura inicial. Parte dessas

culturas foi levada a etapa seguinte para testar a capacidade em degradar o

naftaleno. O restante foi reunido formando a chamada cultura mista e levada a

etapas de identificação.

A identificação inicial foi realizada por plaqueamento, segundo a técnica

pour-plate, para a verificação dos microrganismos Após isolamento dos

mesmos foram feitas lâminas de coloração de gram (Tortola, 2000).

3.6.4 – Degradação do [

C] Naftaleno a

em meio de cultura.

O aparato respirométrico conforme descrito no item 3.5.2 foi realizado

substituindo-se o solo por 10 mL meio de cultura adicionado de 200 µL da

cultura de enriquecimento. Foram coletadas 18 alíquotas, 6 de cada repicagem,

sendo 3 para cada tempo de 6, 10, 20, 48, 72 e 96 horas. A leitura das

amostras foi realizada como descrito no item 3.5.3.

3.7. Testes de degradação do [

C] Naftaleno em solos contaminados

utilizando culturas microbianas nativas e não nativas.

Os testes de degradação do [

C] Naftaleno em solos contaminados

utilizando culturas microbianas nativas e não nativas foram realizadas em solos

obtidos da 2ª coleta de amostras, conforme item 2.2.

Os inóculos microbianos nativos utilizados foram os descritos no

procedimento 2.6.3, após mistura das repetições obtidas no mesmo item. Já as

culturas não nativas foram obtidas de amostras de solos coletadas na Antártica

por apresentaram capacidade de degradação do naftaleno (Projeto Criossolos

– dados não publicados) conforme metodologia semelhante à descrita no item

3.6.

Os testes finais de degradação continham como tratamentos, solos 0-10

(sem inóculos, com inoculo nativo e com inóculo não nativo) e solos 20-30

(sem inóculos, com inoculo nativo e com inóculo não nativo).

Foram coletadas 54 alíquotas, 9 para cada tratamento sendo 3 em cada

tempo de 8, 18, 72, 96, 120 e 144 horas. A leitura das amostras foram

realizadas de acordo com a metodologia descrita no item 2.5.3.

3.8. Análises Estatísticas

A partir dos dados obtidos nos tratamentos, para verificar a relevância

estatística, foram realizadas análises de variância e posteriormente testes de

média (Tukey 0,05%) com auxílio do programa SAEG (Sistema para Análises

Estatísticas), versão 9.0, desenvolvido pela Universidade Federal de Viçosa –

MG (SAEG, 2007).

4. RESULTADOS E DISCUSSÃO

4.1. Análise química dos solos.

A análise química e física do solo (Tabela 2) demonstrou que o solo não

oferecia problemas para o desenvolvimento dos microrganismos, uma vez que

apresenta concentrações adequadas de diversos tipos de nutrientes e pH

próximo do neutro (Coulon et al., 2005). A baixa concentração de matéria

orgânica, abaixo de 2 dag/kg, não se mostrou interferente para crescimento de

microrganismos no solo. Alguns autores (Volkering, 1995; Tiburtius, 2004)

citam o enriquecimento do solo como uma das formas de se incrementar as

taxas de degradação, porém, essa técnica não foi utilizada no presente

trabalho, sendo considerada como possível alvo de etapas posteriores.

TABELA 2 – Análise química dos solos contaminados obtidos no terminal de

abastecimento.

Solo pH

P K Ca Mg Al

Zn Fe Mn

Cu MO

mg/dm

cmol

/dm

mg/dm

dag/kg

20-30

6,7

1,2

2,98

0,49

0 4,26

13,9

9,7

0,31

1,16

0-10 5,7

0,8

1,08

0,67

0 1,46

19,5

7,1

0,32

1,0

Observa-se com base no resultado das análises químicas que há pouca

diferença entre os solos 20-30 e 0-10 que, contudo, não são suficientes para

expressar um crescimento diferencial de microrganismos. Observa-se ainda

que valores de P, Ca e Matéria Orgânica são superiores em solos 20-30 do que

em solos 0-10. Tal fato pode ser explicado uma vez que o solo do terminal de

abastecimento de onde foram retiradas as amostras é proveniente de aterro

realizado por terraplanagem. Os solos 20-30 então foram retirados de áreas 0-

10 e soterrados para formar o aterro.

4.2. Ensaios de degradação do [

C] Naftaleno nos solos.

O naftaleno foi degradado a CO

pelos microrganismos nativos presentes

nos quatro tratamentos realizados, com a presença de uma fase de adaptação

bem distinta (Figura 3). Em 21 dias do delineamento, cerca de 85% do

naftaleno adicionado inicialmente, foi degradado pelos microrganismos nos

tratamentos 1 e 2 que continham respectivamente amostras de solos 0-10

próximos ao centro do derramamento e mais distantes do mesmo. A mesma

taxa de degradação não pode ser observada pelos tratamentos 3 e 4 que

continham amostras de solos 20-30 retirados respectivamente de pontos

centrais do desastre e de pontos mais distantes. Nota-se que nos ensaios 3 e 4

a taxa de degradação apresentou uma diminuição da taxa de crescimento por

volta do décimo sexto dia de tratamento, tendência essa também observada

nos tratamentos 1 e 2, porém, um pouco mais suave.

A diferença entre a degradação realizada por solos 0-10 e 20-30,

comprovadas estatisticamente pela análise de variância (Anexo), já era

esperada e pode ser explicada pela maior concentração e variedade de

microrganismos presentes na sub-superfície do solo em detrimento das

camadas mais profundas onde se observa menor concentração de espécies

aeróbias (Albuquerque, 1995). Com relação a locais de coleta não foi

observada diferença estatística pela análise de variância (Anexo).

A cultura de microrganismos presentes no terminal de abastecimento, na

cidade de Caratinga (MG) possui um forte potencial para degradação de

hidrocarbonetos aromáticos, como o naftaleno. Este resultado está de acordo

com resultados de outros estudos, que indicam que a exposição crônica a

HAPs resulta na adaptação das comunidades microbianas à utilização destes

poluentes como fonte de carbono para o crescimento (Spain et al., 1980; Spain

& van Veld, 1983; Heitkamp et al., 1987).

100

0 1 8 16 21

Tempo (dias)

% de [

C] Naftaleno evoluido a

Tratamento 1

Tratamento 2

Tratamento 3

Tratamento 4

FIGURA 3 – Degradação de [

C] naftaleno, em porcentagem (%), por quatro

tratamentos em função do tempo (em dias). Tratamento 1 e 2 representam

respectivamente solos 0-10 próximos e distantes ao local do derramamento.

Tratamento 3 e 4 representam respectivamente solos 20-30 próximos e

distantes ao local do derramamento. Os pontos, no gráfico, representam a

média de três repetições, descontadas as médias do branco e comparadas

com o controle.

Os tratamentos 1 e 2 superam a capacidade em degradar o naftaleno

descritas em outros trabalhos, como o de Heitkamp et al. (1987), que relataram

que a meia vida de degradação do [

C] Naftaleno (tempo necessário para a

degradação de 50% do HAP adicionado) por amostras de sedimentos contendo

bactérias heterotróficas foi de 4,4 semanas. Wyndham & Costerton (1981)

obtiveram uma taxa média de degradação de [

C] Naftaleno igual a 77%, em

oito semanas, para bactérias provenientes de sedimentos de uma região

adjacente a um depósito natural de petróleo.

O resultado encontrado no presente trabalho poderia ser explicado pelas

condições de realização do experimento, como, por exemplo, a temperatura

por volta de 30°C, considerada ótima para degradaçã o do naftaleno por

microrganismos (Leahy & Colwell, 1990), a contaminação muito elevada e

ainda o tempo de contaminação do terminal de combustíveis, utilizado para

coleta de amostras. Os dois últimos fatores, como já citado, possivelmente

levaram à adaptação das comunidades microbianas (Heitkamp et al., 1987).

A elevada taxa de degradação obtida nos leva a considerar como

desprezível tanto a perda de [

C] Naftaleno para o ambiente por volatilização

quanto a perda de

após a degradação. Outros trabalhos (Spain & van

Veld, 1983; Heitkamp et al., 1987) relatam a perda em torno de 0,6 a 1,2% do

naftaleno adicionado. Teste esse realizado em condições abióticas, ou seja,

sem presença de microrganismos, em frascos controle.

4.3. Culturas de Enriquecimento.

4.3.1 – Microrganismos obtidos a partir da cultura de enriquecimento do

solo.

A partir do plaqueamento da cultura de microrganismos, executado como

forma de testar a presença de microrganismos na cultura de enriquecimento,

observou-se uma grande diversidade de colônias de bactérias. Algumas delas

foram aleatoriamente selecionadas para confecção de lâminas através da

coloração de gram, onde se obteve bactérias gram positivas e gram negativas

de diversas morfologias (Figura 4).

FIGURA 4 – Bactérias Gram positivas (a) e Gram negativas (b) obtidas a partir

da cultura de enriquecimento com grande capacidade em degradar o naftaleno.

4.3.2 – Ensaios de degradação do [

C] Naftaleno pelas culturas de

enriquecimento das amostras de solos selecionados.

Com objetivo de testar a viabilidade das repetições obtidas após

repicagem da cultura mista de enriquecimento, antes dos ensaios de

inoculação, as três amostras obtidas foram levadas aos ensaios de degradação

utilizando a técnica respirométrica já descrita anteriormente.

Os resultados obtidos mostraram não existir diferença estatística

significativa entre as três repetições com relação a taxa de degradação do [

Naftaleno a

(Anexo).

O ensaio foi realizado em 96 horas, tempo bastante inferior ao ensaio

anterior por verificar-se que a maior taxa de degradação realizada pelas

culturas no solo foi obtido entre o primeiro e o quarto dias. Os resultados dessa

segunda etapa de degradação são apresentados na Figura 5.

0 6 10 20 48 72 96

Tempo (horas)

% de [

C] Naftaleno evoluido a

Rep 1

Rep 2

Rep 3

FIGURA 5 – Degradação de [

C] Naftaleno, em porcentagem (%), realizada

por três repetições da cultura mista. Os tratamentos Rep 1, Rep 2 e Rep 3,

representam respectivamente a primeira, a segunda e a terceira repicagem da

cultura inicial de enriquecimento obtida dos solos 0-10 coletados no terminal de

abastecimento.

As três repetições obtiveram em média a taxa de degradação do

Naftaleno superiores a 34%, sendo que a primeira repicagem atingiu os 40%

de degradação. Tal resultado vem corroborar com os resultados obtidos na

primeira etapa de degradação. Provavelmente se o ensaio persistisse por mais

dias, a eficiência do processo em segunda etapa superaria os resultados da

primeira etapa.

A eficiência de degradação também supera uma série de outros trabalhos

(Heitkamp et al., 1987; Leahy & Colwell, 1990; Spain et al., 1980; Spain & van

Veld, 1983; Wyndham & Costerton, 1981), comprovando ser os solos

contaminados, utilizados na coleta, um local realmente propício para

crescimento de microrganismos com grande capacidade de degradar poluentes

orgânicos. Assim, são possíveis alvos para desenvolvimento de técnicas de

biorremediação.

4.4. Inóculos microbianos nativos e não nativos.

Os inóculos microbianos nativos utilizados foram retirados da cultura de

enriquecimento na primeira repicagem, obtida dos solos da primeira campanha,

uma vez que as repicagens não demonstraram diferenças estatísticas.

Os inóculos não nativos foram obtidos de culturas de enriquecimento

feitas a partir de amostras de solos coletadas na Antártica que apresentaram

grande capacidade de degradação do naftaleno (Projeto CNPq/Criossolos –

dados não publicados). O trabalho foi realizado por estudantes de iniciação

científica da Universidade Federal de Viçosa. A cultura da qual foram retirados

os inóculos para o teste final de degradação, obtiveram a taxa de degradação

do [

C] Naftaleno por volta de 30% (dados não publicados).

O terceiro teste de degradação foi realizado com dois objetivos, o primeiro

deles foi testar a teoria de uma linha de pesquisadores que diz ser a microbiota

nativa mais adaptada ao solo local e, portanto, com maiores condições de

degradar os poluentes produzindo menor impacto ao meio ambiente. O

segundo objetivo foi testar a existência de uma cultura capaz de degradar

poluentes orgânicos presentes em qualquer tipo de solo, representando uma

possível solução para problemas de contaminação por derivados de petróleo.

Esse experimento também foi realizado em bancada, tomando os devidos

cuidados, principalmente no momento do descarte do material, para evitar

contaminações com material radioativo e não despejar no ambiente,

microrganismos desconhecidos oriundos de outro ambiente (Liebeg e Cutright,

1999).

Os resultados foram semelhantes aos obtidos por Liebeg e Cutright

(1999). A cultura nativa dos solos do terminal de abastecimento mostrou maior

capacidade em degradar o [

C] Naftaleno a

em solo 0-10 do que as

culturas não nativas originárias da Antártica, também em solo 0-10. Quando em

solo 20-30, confirmando os resultados obtidos anteriormente, as degradações

nos tratamentos com inóculo e sem inóculos não foram estatisticamente

diferentes, sendo inferiores ao solo 0-10 (Figura 6).

0,2

0,4

0,6

0,8

1,2

0 8 18 72 96 120 144

Tempo (horas)

% de [

C] Naftaleno evoluido a

SIC

SIA

PIC

PIA

PSI

SSI

FIGURA 6 – Degradação de [

C] Naftaleno, em porcentagem (%), realizada

por seis tratamentos que foram o SIC: 0-10 com inóculo de Caratinga; SIA: 0-

10 com inóculo da Antártica; PIC: 20-30 com inóculo de Caratinga; PIA: 20-30

com inóculo da Antártica; PSI: 20-30 sem inóculo; SSI: 0-10 sem inóculo

aplicados em solos retirados de um terminal de abastecimento da cidade de

Caratinga.

Os resultados foram comprovados estatisticamente pela análise de

variância que apontou diferença entre as médias. O teste de médias de Tukey

(0,05%) foi aplicado para identificar as médias superiores do ensaio (Tabela 3),

mostrando que os melhores tratamentos foram os que apresentavam solo 0-10

sem inóculo e o 0-10 com inóculo de Caratinga; como tratamentos

intermediários os que possuíam solo 20-30 com inóculo de Caratinga e da

Antártica e finalmente como tratamentos inferiores, o solo 0-10 com inóculo da

Antártica e o 20-30 sem inóculo.

Com os resultados obtidos a partir do teste de médias, algumas

estratégias são confirmadas. Primeiramente a vantagem em se utilizar

microrganismos presentes na sub-superfície dos solos em detrimento das

amostras coletadas de solos 20-30. Os solos 0-10 apresentam maior variedade

de microrganismos aeróbios capazes de biodegradar o naftaleno utilizado

como fonte nutricional, liberando o gás carbônico como subproduto do seu

metabolismo. Já os solos 20-30 apresentam menor variedade de

microrganismos levando consequentemente a uma menor taxa de

biodegradação do poluente em teste, o naftaleno.

TABELA 3 – Análise de variância e teste de médias para a eficiência de

degradação do [

C] Naftaleno comparando seis tratamentos aplicados em

solos retirados de um terminal de abastecimento da cidade de Caratinga.

Análise de Variância

Variável dependente: Degradação do naftaleno

Fonte de

Variação

Graus de

liberdade

Soma de

quadrados

Quadrado

médio

F Significância

Ensaios 5 1,377121 0,2754242 5,647* 0,00088

Resíduo 30 1,463199 0,487E-01

Coeficiente de Variação = 95,621

* - indica valor de F significativo a 5% de probabilidade

Teste de médias TUKEY

Variável dependente: Degradação do naftaleno (0.48733 E-01)

Descrição Dados Médias

SSI 6 0,5715 A

SIC 6 0,5563 A

PIC 6 0,2601 AB

PIA 6 0,1894 AB

SIA 6 0,1405 B

PSI 6 0,0745 B

Q(.050, 30)= 4.300 Dms = 0,3877

SIC: 0-10 com inóculo de Caratinga; SIA: 0-10 com inóculo da Antártica; PIC: 20-30

com inóculo de Caratinga; PIA: 20-30 com inóculo da Antártica; PSI: 20-30 sem

inóculo; SSI: 0-10 sem inoculo. Letras diferentes indicam médias diferentes pelo teste

Tukey (5%).

O segundo ponto, refere-se a preferência em se utilizar microrganismos

nativos para biorremediação por serem mais adaptados ao solo de origem. Tais

solos criam um micro ambiente para os seres vivos presentes nele,

possibilitando condições que favorecem o desenvolvimento desses

microrganismos, impossibilitando ou dificultando o crescimento de outras

espécies. Esse resultado nos leva a um ponto importante, os trabalhos que

envolvem biorremediação de solo devem ser localizados devido a

especificidade de crescimento dos microrganismos nos solos. Essa afirmação é

corroborada por autores que comprovam que a biodegradação realizada por

culturas mistas supera a degradação realizada por espécies isoladas

(Heitkamp et al., 1987; Leahy & Colwell, 1990; Spain et al., 1980; Spain & van

Veld, 1983; Wyndham & Costerton, 1981).

Finalmente, talvez a comprovação mais importante, o tratamento com

solos 0-10 sem inóculo não foram estatisticamente diferentes do tratamento

que continha inóculos nativos em solos 0-10, comprovando a idéia central das

pesquisas que buscam a biorremediação, a de produzir culturas capazes de

degradar poluentes.

A princípio a semelhança entre os tratamentos 0-10 sem inóculo e 0-10

com inóculo de Caratinga pode não parecer favorável, porém é preciso

considerar que o solo de onde foram retiradas as amostras foi contaminado há

cerca de 2 anos, portanto, a cultura original do solo já estaria adaptada em

degradar o naftaleno (Heitkamp et al., 1987) assim como os inóculos. A

vantagem do tratamento com inóculo se assemelhar ao sem inóculo estaria na

aplicação desses inóculos em acidentes recentes com derivados de petróleo,

evitando a etapa de adaptação das culturas presentes no local para a

descontaminação.

O ensaio foi realizado por 144 horas e a baixa porcentagem de

degradação do naftaleno, próximas de 1% nas melhores médias, obtida pode

ser explicada pela falta de reposição e troca da solução armadilha de NaOH

0,5M para

. O produto da degradação então foi capturado com maior

dificuldade, desprendendo-se para o ambiente. O tratamento 0-10 sem inóculo

pode funcionar como parâmetro, confirmando a diminuição e fazendo com que

ela seja considerada como normal. O tempo menor do delineamento em

relação ao primeiro teste de degradação também deve ser considerado como

razão para menor taxa de degradação.

A baixa taxa de degradação realizada pelos inóculos não nativos

originados da Antártica, pode ser explicada pela não adaptação da cultura ao

ambiente e ao solo utilizado na inoculação. Mesmo os solos 0-10 quando

inoculados pelas culturas da Antártica obtiveram menores taxas de

degradação, provavelmente pela competição realizada entre culturas diferentes

presentes no solo e no inóculo, porém, a confirmação de tal afirmativa só

poderia ser feita com testes adicionais e com a identificação das espécies

presentes nas culturas. A baixa degradação presente nesse tratamento

confirma a idéia discutida anteriormente da utilização do inóculo nativo como

arma para biorremediação.

5. CONCLUSÃO

Conclui-se com esse trabalho:

• que dentre as técnicas de biorremediação deve-se utilizar preferencialmente

aquelas que fazem uso de culturas nativas como alvo dessas técnicas, por

se adaptarem melhor no solo e por evitar contaminação, não lançando no

ambiente, microrganismos não nativos que podem afetar o ecossistema.

• que os estudos de biorremediação devem ser localizados nas regiões onde

se deseja aplicar a técnica devido ao microambiente formado na região, o

que impede que o resultado obtido em outros trabalhos seja aplicado em

qualquer área.

• que o uso de microrganismos na biorremediação de áreas contaminadas

torna-se mais eficiente quando essas culturas mistas são retiradas da

superfície do solo e não de solos profundos, pois as primeiras apresentam

maior variedade de espécies e consequentemente maior capacidade de

biodegradação.

• que trabalhos que propõe a utilização de microrganismos e material

radioativo devem ter sua execução realizada primeiramente em

laboratórios, em menor escala, e posteriormente aplicados como formas

efetivas de biorremediação caso se obtenha bons resultados. A aplicação

em menor escala se faz necessária não só com objetivo de conter gastos,

mas principalmente como forma de preservação ambiental, evitando liberar

materiais no ambiente sem o conhecimento efetivo de sua utilidade.

6. RECOMENDAÇÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS

O Meio Ambiente naturalmente tende a eliminar os poluentes que nele

são adicionados, porém, essa limpeza pode demorar décadas dependendo do

resíduo. Devido ao aumento do número e do volume de poluentes que têm sido

despejados no ambiente, a capacidade de resiliência do solo, principalmente,

tem diminuído. A interferência do homem no sentido de não só evitar a

contaminação mas de acelerar a descontaminação de poluentes já existentes

deve ser cada vez mais presente e necessária.

As técnicas que utilizam a biorremediação devem ser preferencialmente

utilizadas na descontaminação de áreas degradadas por apresentar

características que preservam o local de aplicação e pelo baixo custo que

apresentam.

Devido a eficácia da degradação realizada pelos inóculos microbianos no

solo, propõem-se a criação de um banco de culturas em todos os grandes

terminais de abastecimento para utilização, no caso de acidentes ambientais,

principalmente quando a proximidade de lençóis freáticos puderem aumentar o

nível de contaminação. Esse banco de culturas, retiradas dos próprios solos

dos terminais, evitaria a fase de adaptação das mesmas com o poluente,

diminuindo assim o tempo de descontaminação ao aplicar esses

microrganismos no solo após o acidente.

Esse Banco de Culturas deve ser criado considerando que acidentes

ambientais acontecem mesmo quando todos os cuidados na manutenção dos

tanques subterrâneos são tomados, sua criação e aplicação então, acelerariam

o processo de descontaminação do solo.

Estudos complementares envolvendo identificação e seleção de

microrganismos com potencial para atuar nos processos de degradação de

HPAs, bem como o uso de surfactantes, materiais ou soluções que aumentem

a disponibilidade dos poluentes para os microrganismos, torna-se positivo para

o desenvolvimento de estratégias que otimizem a biorremediação in situ.

7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS

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ANEXOS

Análise de Variância para a eficiência de degradação do [

C] naftaleno

comparando profundidades de coletas do solo, 0-10 e profundas, realizadas no

terminal de abastecimento.

Análise de Variância

Variável dependente: Degradação do naftaleno

Fonte de

Variação

Graus de

liberdade

Soma de

quadrados

Quadrado

médio

F Significância

Profundidade

4918,374

9.280* 0,0087

Resíduo 14

7420,232

530,0166

Coeficiente de Variação = 95,426

* - indica valor de F significativo a 5% de probabilidade.

Análise de Variância para a eficiência de degradação do [

C] naftaleno

comparando locais de coletas do solo, realizadas no terminal de

abastecimento.

Análise de Variância

Variável dependente: Degradação do naftaleno

Fonte de

Variação

Graus de

liberdade

Soma de

quadrados

Quadrado

médio

F Significância

Local 1 73.35618 73.35618 0,084

********

Resíduo 14 12265.25 876.0893

Coeficiente de Variação = 96,972

– indica valor de F não significativo a 5% de probabilidade

Análise de Variância para a eficiência de degradação do [

C] Naftaleno

comparando repetições de repicagens realizadas da cultura de enriquecimento.

Análise de Variância

Variável dependente: Degradação do naftaleno

Fonte de

Variação

Graus de

liberdade

Soma de

quadrados

Quadrado

médio

F Significância

Repetição 2 161,5235 80,76177 0,467

*********

Resíduo 18 3115,037 173,0576

Coeficiente de Variação = 99,427

– indica valor de F não significativo a 5% de probabilidade

Amostra Contagem Profund tempo Local Media Media soma Final

1 10 0 7 0

2 20 0 7 0

3 10 0 12 0

4 20 0 12 0

5 642,75 10 1 7 816,3833 816,3833333 5,651939

6 419 10 1 7

7 1387,4 10 1 7

8 2,4 20 1 7 28,88333 28,88333333 0,199963

9 47,3 20 1 7

10 36,95 20 1 7

11 1748,55 10 1 12 1648,65 1648,65 11,41384

12 1764,25 10 1 12

13 1433,15 10 1 12

14 77,05 20 1 12 57,23333 69,58333 0,481735

15 18,8 20 1 12

16 75,85 20 1 12

17 4307,35 10 8 7 4140,617 4957 34,31802

18 3846,4 10 8 7

19 4268,1 10 8 7

20 977,4 20 8 7 1025,083 1053,966667 7,296762

21 1042,15 20 8 7

22 1055,7 20 8 7

23 3156,65 10 8 12 3791,733 5440,383333 37,66455

24 3519,45 10 8 12

25 4699,1 10 8 12

26 1828 20 8 12 1636,417 1705,999997 11,81088

27 1873,35 20 8 12

28 1207,9 20 8 12

29 4127 10 16 7 3919,9 8876,9 61,45605

30 3508 10 16 7

31 4124,7 10 16 7

32 850,15 20 16 7 825,55 1879,516667 13,01216

33 768,1 20 16 7

34 858,4 20 16 7

35 2887,5 10 16 12 3622,4 9062,783333 62,74294

36 3426,75 10 16 12

37 4552,95 10 16 12

38 1701,45 20 16 12 1502,533 3208,53333 22,21313

39 1735,2 20 16 12

40 1070,95 20 16 12

41 2996,4 10 21 7 3601,667 12478,56667 86,3909

42 3245,15 10 21 7

43 4563,45 10 21 7

44 877,7 20 21 7 825,5833 2705,1 18,72779

45 779,2 20 21 7

46 819,85 20 21 7

47 2650,95 10 21 12 3187,033 12249,81667 84,80723

48 3833,9 10 21 12

49 3076,25 10 21 12

50 1140,25 20 21 12 1150,55 4359,08333 30,17856

51 1147,9 20 21 12

52 1163,5 20 21 12 Naftaleno

433329,2

Biodegradação realizada pelos microrganismos presentes no solos do terminal de abastecimento

Analise de Variancia

F=9,280

Significancia de 0,0087

Ensaios com profundidade até 10 cm pelo teste de Tukey a 0,05 superam os ensaios com

Tempo Profund Local Contagem Tempo Profund Local Contagem

1 10 1 5,651939 1 20 1 0,199963

8 10 1 34,31802 8 20 1 7,296762

16 10 1 61,45605 16 20 1 13,01216

21 10 1 86,3909 21 20 1 18,72779

Tempo Profund Local Contagem Tempo Profund Local Contagem

1 10 2 11,41384 1 20 2 0,481735

8 10 2 37,66455 8 20 2 11,81088

16 10 2 62,74294 16 20 2 22,21313

21 10 2 84,80723 21 20 2 30,17856

y = 3,589x + 7,879

r = 0,99

Equações de regressão para biodegradação dos microrganismos no solo

y = 3,939x + 1,655

r = 0,99

Existe diferença entre as medias

profundidade de 20 cm

Amostra Local Tempo Contagem Cont.Cum Media Dado Final Gráfico

1 1 6 576,3 576,3

2 1 6 210,45 210,45

3 1 6 264,25 264,25 350,3333 264,18333 2,077967

4 2 6 228 228

5 2 6 216,3 216,3

6 2 6 88,35 88,35 177,55 91,4 0,718918

7 3 6 504,3 504,3

8 3 6 165,45 165,45

9 3 6 289,45 289,45 319,7333 233,58333 1,837279

10 4 6 49,75 49,75

11 4 6 89,3 89,3

12 4 6 119,4 119,4 86,15

13 1 10 494,5 1070,8

14 1 10 380,95 591,4

15 1 10 396,95 661,2 774,4667 704,61667 5,542251

16 2 10 255,6 483,6

17 2 10 339,65 555,95

18 2 10 174,55 262,9 434,15 364,3 2,865447

19 3 10 561,2 1065,5

20 3 10 244,5 409,95

21 3 10 497,45 786,9 754,1167 684,26667 5,382186

22 4 10 34,25 34,25

23 4 10 85,35 85,35

24 4 10 89,95 89,95 69,85

25 1 20 703,4 1774,2

26 1 20 405,9 997,3

27 1 20 920,9 1582,1 1451,2 1424,7 11,20616

28 2 20 229,15 712,75

29 2 20 988,6 1544,55

30 2 20 495,05 757,95 1005,083 978,58333 7,69717

31 3 20 1172,35 2237,85

32 3 20 177,05 587

33 3 20 1168,3 1955,2 1593,35 1566,85 12,32426

34 4 20 16,4 16,4

35 4 20 40 40

36 4 20 23,1 23,1 26,5

37 1 48 1030,8 2805

38 1 48 899,4 1896,7

39 1 48 949,25 2531,35 2411,017 2403,7833 18,90726

40 2 48 299,35 1012,1

41 2 48 852,6 2397,15

42 2 48 318,8 1076,75 1495,333 1488,1 11,70484

43 3 48 1441,7 3679,55

44 3 48 175,85 762,85

45 3 48 1162,25 3117,45 2519,95 2512,7167 19,76409

46 4 48 13,65 13,65

47 4 48 6,35 6,35

48 4 48 1,7 1,7 7,233333

49 1 72 705 3510

50 1 72 1300,05 3196,75

51 1 72 1404,2 3935,55 3547,433 3537,3167 27,82321

52 2 72 335,65 1347,75

Biodegradação realizada pelas repetições obtidas das repicagens da cultura de enriquecimento.

53 2 72 1247,4 3644,55

54 2 72 542,35 1619,1 2203,8 2193,6833 17,25469

55 3 72 1572,1 5251,65

56 3 72 238,4 1001,25

57 3 72 1475,9 4593,35 3615,417 3605,3 28,35794

58 4 72 9,6 9,6

59 4 72 8,15 8,15

60 4 72 12,6 12,6 10,11667

61 1 96 1107,9 4617,9

62 1 96 1827,85 5024,6

63 1 96 1808,15 5743,7 5128,733 5117,4333 40,25182

64 2 96 464,2 1811,95

65 2 96 1651,35 5295,9

66 2 96 814,6 2433,7 3180,517 3169,2167 24,92787

67 3 96 1988,15 7239,8

68 3 96 251,2 1252,45

69 3 96 1902,4 6495,75 4996 4984,7 39,20778

70 4 96 15,3 15,3

71 4 96 9,3 9,3

72 4 96 9,3 9,3 11,3

Naphtaleno

381406,4

Amostra Contagem Repeticao Coleta Amostra Contagem Repeticao Coleta

1 0 1 0 1 0 2 0

2 2,077967 1 6 2 0,718918 2 6

3 5,542251 1 10 3 2,865447 2 10

4 11,20616 1 20 4 7,69717 2 20

5 18,90726 1 48 5 11,70484 2 48

6 27,82321 1 72 6 17,25469 2 72

7 40,25182 1 96 7 24,92787 2 96

y=2,48x-1,503 y=3,94x-0,67

r=0,99 r=0,99

Amostra Contagem Repeticao Coleta Analise de Variancia

1 0 3 0 F=0,467

2 1,837279 3 6 não significativo

3 5,382186 3 10

4 12,32426 3 20

5 19,76409 3 48

6 28,35794 3 72

7 39,20778 3 96

y=2,51x-2,25

r=0,99

Equações de regressão das repicagens

Amostra Local Tempo Contagem Cont.Cum Media Gráfico

1 1 8 617,1 617,1 494,95 0,128335072

2 1 8 444,95 444,95

3 1 8 422,8 422,8

4 2 8 122,7 122,7 126,9333 0,032912412

5 2 8 130,5 130,5

6 2 8 127,6 127,6

7 3 8 135,5 135,5 136,7167 0,035449123

8 3 8 129,2 129,2

9 3 8 145,45 145,45

10 4 8 145,7 145,7 134,2667 0,034813865

11 4 8 135,5 135,5

12 4 8 121,6 121,6

13 5 8 2,5 2,5 3,65 0,000946405

14 5 8 2,5 2,5

15 5 8 5,95 5,95

16 6 8 478,45 478,45 422,2833 0,109493407

17 6 8 349,75 349,75

18 6 8 438,65 438,65

19 1 18 823,1 1440,2 1076,65 0,279163461

20 1 18 486,05 931

21 1 18 435,95 858,75

22 2 18 135,95 258,65 262,8833 0,068162747

23 2 18 135,95 266,45

24 2 18 135,95 263,55

25 3 18 287,75 423,25 399,8 0,103663727

26 3 18 200,6 329,8

27 3 18 300,9 446,35

28 4 18 152,05 297,75 267,8833 0,069459192

29 4 18 130,5 266

30 4 18 118,3 239,9

31 5 18 50 52,5 56,06667 0,014537468

32 5 18 57,25 59,75

33 5 18 50 55,95

34 6 18 822,75 1301,2 1057,983 0,274323401

35 6 18 660,45 1010,2

36 6 18 423,9 862,55

37 1 72 953,75 2393,95 1789,467 0,463988955

38 1 72 626,1 1557,1

39 1 72 558,6 1417,35

40 2 72 132,6 391,25 445,25 0,11544841

41 2 72 207,25 473,7

42 2 72 207,25 470,8

43 3 72 282,95 706,2 782,1167 0,202794219

44 3 72 373,9 703,7

45 3 72 490,1 936,45

46 4 72 296,5 594,25 492,7833 0,127773279

47 4 72 189,1 455,1

48 4 72 189,1 429

49 5 72 124,8 177,3 191,6667 0,049697051

50 5 72 141 200,75

51 5 72 141 196,95

52 6 72 773,45 2074,65 1867,833 0,484308567

53 6 72 882,65 1892,85

Biodegradação pelos inóculos nativos, não nativos e sem inóculos

54 6 72 773,45 1636

55 1 96 996,65 3390,6 2539,017 0,658338997

56 1 96 664,5 2221,6

57 1 96 587,5 2004,85

58 2 96 152,9 544,15 646,2167 0,167556849

59 2 96 225 698,7

60 2 96 225 695,8

61 3 96 302,4 1008,6 1193,667 0,309504591

62 3 96 396,35 1100,05

63 3 96 535,9 1472,35

64 4 96 323,1 917,35 768,35 0,199224674

65 4 96 203,6 658,7

66 4 96 300 729

67 5 96 135 312,3 324,6333 0,08417384

68 5 96 138,35 339,1

69 5 96 125,55 322,5

70 6 96 905,95 2980,6 2603,8 0,6751366

71 6 96 792,45 2685,3

72 6 96 509,5 2145,5

73 1 120 848,5 4239,1 3156,75 0,818510432

74 1 120 534,65 2756,25

75 1 120 470,05 2474,9

76 2 120 138,5 682,65 803,0333 0,20821768

77 2 120 181,95 880,65

78 2 120 150 845,8

79 3 120 369,75 1378,35 1553,583 0,40282701

80 3 120 350 1450,05

81 3 120 360 1832,35

82 4 120 450 1367,35 1231,117 0,319214963

83 4 120 407,65 1066,35

84 4 120 530,65 1259,65

85 5 120 160 472,3 488,3333 0,126619443

86 5 120 178,25 517,35

87 5 120 152,85 475,35

88 6 120 799,6 3780,2 3288,883 0,852771146

89 6 120 760,2 3445,5

90 6 120 495,45 2640,95

91 1 144 919,5 5158,6 3815,25 0,989252213

92 1 144 563,85 3320,1

93 1 144 492,15 2967,05

94 2 144 127,65 810,3 965,9 0,250447209

95 2 144 150 1030,65

96 2 144 210,95 1056,75

97 3 144 291,3 1669,65 1952,217 0,506188234

98 3 144 394,6 1844,65

99 3 144 510 2342,35

100 4 144 317,15 1684,5 1487,517 0,385696653

101 4 144 202,05 1268,4

102 4 144 250 1509,65

103 5 144 170 642,3 660,0333 0,171139358

104 5 144 169,5 686,85

105 5 144 175,6 650,95

106 6 144 839,55 4619,75 3984,533 1,033145513

107 6 144 758,15 4203,65

108 6 144 489,25 3130,2

Naftaleno 385670,1

Analise de Variancia

F=5,6347

Significancia de 0,00088

Existe diferença entre as medias

Ensaio 1 e 6 pelo teste de Tukey a 0,05 superam as demais medias

Contagem Ensaio Tempo Contagem Ensaio Tempo

0 1 0 0 2 0

0,128335 1 8 0,032912 2 8

0,279163 1 18 0,068163 2 18

0,463989 1 72 0,115448 2 72

0,658339 1 96 0,167557 2 96

0,81851 1 120 0,208218 2 120

0,989252 1 144 0,250447 2 144

y=156,14x-9,017

r=0,99

Contagem Ensaio Tempo Contagem Ensaio Tempo

0 3 0 0 4 0

0,035449 3 8 0,034814 4 8

0,103664 3 18 0,069459 4 18

0,202794 3 72 0,127773 4 72

0,309505 3 96 0,199225 4 96

0,402827 3 120 0,319215 4 120

0,506188 3 144 0,385697 4 144

Contagem Ensaio Tempo Contagem Ensaio Tempo

0 5 0 0 6 0

0,000946 5 8 0,109493 6 8

0,014537 5 18 0,274323 6 18

0,049697 5 72 0,484309 6 72

0,084174 5 96 0,675137 6 96

0,126619 5 120 0,852771 6 120

0,171139 5 144 1,033146 6 144

y=148,19x-7,17

r=0,99

Equações de regressão para inóculos nativos, não nativos e sem inóculos

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