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Bandeamento cromossômico em Lippia alba
SAULO MARÇAL DE SOUSA
2006
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Ficha Catalográfica Preparada pela Divisão de Processos Técnicos da
Biblioteca Central da UFLA
Sousa, Saulo Marçal de
Bandeamento cromossômico em Lippia alba / Saulo Marçal de Sousa. --
Lavras : UFLA, 2006.
65 p. : il.
Orientador: Giovana Augusta Torees.
Dissertação (Mestrado) – UFLA.
Bibliografia.
1. Erva cidreira. 2. Bandeamento cromossômico. 3. Verbenaceae. I.
Universidade Federal de Lavras. II. Título.
CDD-633.88388
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SAULO MARÇAL DE SOUSA
Bandeamento cromossômico em Lippia alba
Orientadora
Profa. Dra. Giovana Augusta Torres
LAVRAS
MINAS GERAIS – BRASIL
2006
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
Lavras como parte das exigências do Curso de
Mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas,
área de concentração em Citogenética Vegetal, para a
obtenção do título de “Mestre”
SAULO MARÇAL DE SOUSA
Bandeamento cromossômico em Lippia alba
APROVADA em 17 de Fevereiro de 2006
Prof. Dr. Lyderson Facio Viccini UFJF
Profa. Dra. Lisete Chamma Davide UFLA
Profa. Dra. Giovana Augusta Torres
(Orientadora)
LAVRAS
MINAS GERAIS- BRASIL
Dissertação apresentada à Universidade Federal de
Lavras como parte das exigências do Curso de
Mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas,
área de concentração em Citogenética Vegetal, para a
obtenção do título de “Mestre”
Aos meus queridos pais, Hermínio (in memoriam) e Lúcia, pelo exemplo de vida
e por serem os melhores pais que eu poderia ter; aos meus irmãos: Kátia,
Fernanda, Humberto e Flávio, por todo apoio, carinho, atenção e união,
DEDICO
AGRADECIMENTOS
A Deus, pelo mais belo dos presentes, a vida.
Aos meus pais, Hermínio (in memoriam) e Lúcia, por todo incentivo, presença
em todos os momentos, pelo carinho, pelos ensinamentos, por tudo.
Aos meus irmãos, Kátia, Fernanda, Humberto e Flávio, por todo apoio, incentivo
e amizade.
Ao professor Lyderson Facio Viccini, por me apresentar ao fabuloso mundo dos
cromossomos, pela colaboração, confiança, incentivo, apoio, por todas as
oportunidades e pela valiosa amizade.
À professora Giovana Augusta Torres, pela confiança e pela oportunidade de
continuar meus estudos com a citogenética.
À professora Lisete Chamma Davide, por toda a atenção e gentileza.
À amiga Pâmela Souza Silva, pela empolgação, alegria e por toda ajuda neste
trabalho.
Aos amigos Patrícia, Sarah e José Marcello, pelo companheirismo, pelas boas
risadas e pelas contribuições ao longo desta jornada.
À amiga, baiana, Adriana Dias Cardoso, pelo companheirismo e pelo acesso de
Lippia alba trazido de sua cidade.
A todos os colegas do Laboratório de Citogenética da UFLA e da UFJF.
A todos os funcionários da UFLA e do Departamento de Biologia.
À Universidade Federal de Lavras, pela oportunidade de continuar meus
estudos.
Ao CNPq, pela bolsa de estudos.
SUMÁRIO
RESUMO..............................................................................................
i
ABSTRACT...........................................................................................
ii
1 INTRODUÇÃO..................................................................................
1
2 REFERENCIAL TEÓRICO...............................................................
3
2.1 A família Verbenaceae e o gênero Lippia........................................
3
2.2 O gênero Lippia e seus aspectos químicos.......................................
4
2.3 A importância da identificação e do conhecimento de espécies que
apresentam quimiotipos.........................................................................
5
2.4 Lippia alba e seus quimiotipos........................................................
5
2.5 Citogenética dos quimiotipos de Lippia alba..................................
8
2.6 Bandeamento C e coloração com fluorocromos..............................
9
2.7 Constrições secundárias e bandeamento com nitrato de prata........
12
3 MATERIAL E MÉTODOS................................................................
14
3.1 Obtenção dos acessos de Lippia alba..............................................
14
3.2 Extração e análise química dos óleos essenciais.............................
14
3.3 Análise citogenética........................................................................
15
3.3.1 Pré-tratamento com bloqueador mitótico......................................
15
3.3.2 Preparo das lâminas.......................................................................
15
3.3.3 Morfometria cromossômica...........................................................
16
3.4 Metodologias de bandeamento cromossômico.................................
16
3.4.1 Coloração com DAPI....................................................................
16
3.4.2 Coloração com cromomicina (CMA
3
)...........................................
17
3.4.3 Técnica de bandeamento C............................................................
18
3.4.4 Técnica de bandeamento com nitrato de prata..............................
18
3.5 Análise de imagens...........................................................................
19
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO........................................................
20
4.1 Morfometria cromossômica.............................................................
20
4.2 Coloração sólida com giemsa, constrições secundárias, padrão de
bandas com CMA 3 e atividade das regiões organizadoras de
nucléolo .................................................................................................
4.3 Coloração com DAPI, bandeamento C e polimorfismos
cromossômicos entre os acessos de Lippia alba....................................
27
39
4.4 Mapeamento físico da heterocromatina em Lippia alba..................
50
4.5 Análise química, quimiotipos e número cromossômico em Lippia
alba.........................................................................................................
53
5 Conclusões..........................................................................................
56
6 Referências bibliográficas...................................................................
57
i
RESUMO
SOUSA, Saulo Marçal de. Bandeamento cromossômico em Lippia alba. 2006.
65p. Dissertação (Mestrado em Genética e Melhoramento de Plantas).
Universidade Federal de Lavras. Lavras, MG.
1
A espécie Lippia alba, Verbenaceae, caracteriza-se por apresentar
quimiotipos com diferentes princípios ativos. Estudos citogenéticos têm sido
realizados entre estes e têm demonstrado que os mesmos apresentam diferenças
com relação ao número cromossômico. Apesar de tais estudos, pouco se sabe
sobre a organização da heterocromatina nesta espécie. O presente trabalho teve
por objetivo caracterizar 5 acessos de Lippia alba com 2n= 30 cromossomos por
técnicas de bandeamento cromossômico. Para isso foram obtidas metáfases de
meristemas radiculares de cada acesso com subseqüente aplicação das técnicas
de bandeamento com fluorocromos DAPI e CMA
3
, bandeamento C e
bandeamento com o nitrato de prata. Todos os acessos apresentaram a seguinte
fórmula cariotípica: 10m e 5sm. Destes, 3 pares apresentaram constrições
secundárias (pares 2, 5 e 11 ), os quais são CMA
3
+
. Em contrapartida, apenas 2
pares (5 e 11) apresentaram atividade nucleolar quando submetidos à coloração
com o nitrato de prata. Tal fato, mais a observação de um número máximo de
quatro nucléolos na intérfase, indica que, na espécie estudada, existem dois pares
de RONs ativas. O bandeamento C e a coloração com DAPI demonstraram um
padrão coincidente de bandas, sendo as bandas observadas com o fluoro cromo
DAPI maiores que as bandas C em alguns acessos. Apesar dos acessos terem
apresentado uma grande semelhança cariotípica, foram encontrados números
diferentes de bandas em cada um deles, assim como diferentes percentuais de
heterocromatina. Muitas destas diferenças devem-se à degradação dos
cromossomos em resposta aos tratamentos utilizados com o bandeamento C.
Alguns polimorfismos observados, no entanto, parecem não ser devido à técnica.
Além dos resultados obtidos com os estudos citogenéticos, por meio da análise
química foi possível observar que dois dos acessos são diferentes com relação
aos seus compostos majoritários. A partir de tais observações concluiu-se que o
número cromossômico não está relacionado com quimiotipos específicos e que
esta variação química, provavelmente, ocorre por meio de algum mecanismo de
controle genético.
1
Comitê Orientador: Profa Giovana Augusta Torres (Orientador), Lyderson Facio
Viccini (Co-orientador)
ii
ABSTRACT
SOUSA, Saulo Marçal de. Chromosome banding in Lippia alba. 2006, 65p.
Dissertation (Master’s degree in Genetics and Plant Breeding).Federal
University of Lavras, Lavras, Minas Gerais, Brazil.
2
The specie Lippia alba (Verbenaceae) shows variation on chemical
compounds of essencial oil, being recognized different chemotypes.
Cytogenetics studies carried on these chemotypes have been showing that they
present different number of chromosomes. However, little information about
heterochromatin organization is available about this specie. The aim of this
study, was to characterize 5 accesses of Lippia alba with 2n= 30 chromosomes,
regarding to their heterochromatic pattern, using banding techniques.
Metaphases were obtained from root tips and submitted to DAPI, CMA
3,
AgNOR and C banding procedures. All accesses showed 10 median and 5 sub-
median chromosomes, 1 to 10 and 11 to 15 pairs, respectively. Pairs 2, 5 and 11
showed satellites and their constrictions were CMA
3
+
. On the other hand, only 2
pairs were positive for AgNOR (pairs 5 and 11). The maximum of 4 nucleolus
was observed in interphase nuclei, while only two bivalents were associated with
the nucleolus in diakinesis.These observation reveal only two pairs of active
NORs in Lippia alba. Bands revealed by C and DAPI techniques were located at
the same sites in telomeres and centromers of all chromosomes, but did not
coincide in length, since DAPI bands were larger than DAPI ones. This can be
result of chromosome degradation resulted from the procedure to obtain C band
pattern. Other kinds of polymorphism were observed, revealing variability in
karyotype among access. The chemical analysis of oil extracted from the
accesses showed differences on principal compounds among accesses.
Therefore, the association between chromosome number and chemotype were
not verified as proposed in previous works. This suggest that variation on
essencial oil may be related to genetic control rather than to differences on
karyotype.
2
Guiding committee: Profa Giovana Augusta Torres (Major Professor), Lyderson Facio
Viccini
1
1 INTRODUÇÃO
Pertencente à família Verbenaceae, Lippia alba está presente em todas as
regiões do Brasil, sendo amplamente utilizada como medicinal.
Seu rico potencial farmacológico está relacionado à ampla variação
química de seu óleo essencial. Tal variação permite, até mesmo, a separação
desta espécie em quimiotipos, os quais podem ser delimitados de acordo com o
componente químico majoritário presente em seus óleos essenciais.
Atualmente, dentre os diversos quimiotipos descritos para esta espécie,
três são bem estudados no Brasil, apresentando seus óleos essenciais ricos em
citral, carvona ou linalol.
Além da variação química, estes quimiotipos também apresentam
algumas variações morfológicas. Tais variações foram observadas de acordo
com a distribuição geográfica dos mesmos, o que levou vários autores a
acreditarem que esta variabilidade está relacionada à plasticidade fenotípica da
espécie.
No entanto, alguns trabalhos têm demonstrado que, quando expostos ao
mesmo ambiente, tais quimiotipos mantêm suas diferenças químicas e
morfológicas, demonstrando que esta variabilidade é, em grande parte,
controlada geneticamente.
Estudos citogenéticos têm mostrado que os quimiotipos citral, carvona e
linalol apresentam diferentes números cromossômicos: 2n=30, 2n=60 e 2n=12-
60 (mixoplóide), respectivamente.
Apesar destas observações, trabalhos comparando diferentes acessos de
cada quimiotipo ainda não foram realizados. Os únicos realizados até o
momento apresentam controvérsias em relação à classificação dos
cromossomos, assim como a posição de alguns marcadores cromossômicos
(constrição secundária, por exemplo) em diferentes populações com 2n=30
2
cromossomos. Tais observações evidenciam que diferentes acessos desta espécie
podem apresentar polimorfismos cromossômicos.
O objetivo do presente trabalho foi comparar cinco acessos de L. alba
com 2n=30 cromossomos, por meio de técnicas de bandeamento cromossômico,
tendo como finalidade detectar possíveis polimorfismos cromossômicos entre os
mesmos, estabelecer técnicas de bandeamento C, Ag NOR e verificar o padrão
de bandas obtidos com os fluorocromos DAPI e CMA.
3
2 REFERENCIAL TEÓRICO
2.1 A família Verbenaceae e o gênero Lippia
A família Verbenaceae, subfamília Verbenoideae, apresenta
aproximadamente 36 gêneros e 1.035 espécies. Os gêneros mais representativos
são: Verbena (200 spp.), Lippia (150), Citharexylum (70), Stachytarpheta (70),
Glandularia (60) e Duranta (30) (Judd et al., 2002).
Além do grande número de espécies representantes, possui também uma
ampla distribuição pelas regiões tropicais e temperadas das Américas, África e
Índia; os principais centros de diversidade são a América do Sul, o México e a
Cordilheira dos Andes (Sanders, 2001, Judd et al.,2002).
O gênero Lippia, o segundo maior da família, reúne espécies herbáceas,
arbustivas e pequenas árvores que estão distribuídas por toda América do Sul,
América Central e territórios intertropicais do continente africano (Troncoso,
1974, Terblanché e Kornelius, 1996, Salimena, 2000). Além de se destacar pela
grande diversidade botânica e ampla distribuição, este gênero vem recebendo
importante atenção por apresentar espécies que podem ser utilizadas para os
mais diversos fins. Dentre estes, um grande número de espécies se destaca por
apresentar propriedades medicinais comprovadas, possuindo efeitos contra a
malária (Gasquet et al., 1993), efeito antiviral (Abad et al., 1995), atividade
citostática (López et al. 1979, Slowing Barillas, 1992, Klueger et al. 1997),
assim como ação sedativa, diurética, anti-reumática, antiinflamatória,
miorrelaxante e outras (Morton 1981, Costa 1998, Vale et al., 1999; Rao et al.,
2000; Viana et al., 2000; Pascual et al., 2001).
Algumas espécies também têm sido usadas na indústria alimentícia na
produção de aromatizantes, temperos e na produção de cosméticos e perfumes
(Stashenko et al., 2003).
Apesar de muitas espécies apresentarem tais utilidades, várias outras
4
ainda não foram estudadas e, de acordo com alguns autores (Abad et al., 1995,
Pascual et al., 2001, Stashenko et al., 2003), são materiais promissores para o
isolamento de novas substâncias químicas com diferentes potenciais,
principalmente farmacológicos.
2.2 O gênero Lippia e seus aspectos químicos
Dentre os grupos de substâncias naturais mais estudados e utilizados
para os diversos fins citados anteriormente, estão os óleos essenciais (Pascual et
al., 2001). Fisicamente, estas substâncias são líquidas, voláteis e geralmente com
um aroma agradável e intenso, podendo ser incolores ou ligeiramente
amareladas (Raven et al., 2001, Lima et al., 2003). Na maioria dos vegetais, os
óleos essenciais são ricos em terpenóides, e sua composição na maioria das
plantas, inclui uma mistura de várias substâncias (Larcher 2000).
Com relação à composição química destes óleos em espécies de Lippia,
estudos com várias técnicas têm mostrado que os componentes mais comuns, na
maioria das espécies, são: limoneno, β criofileno, p-cimeno, cânfora, linalol, α-
pineno, ácido ferúlico e timol (Lemos et al., 1992; de Vincenzi et al.,1995;
Catalán e Lampasona 1995; Terblanché e Kornelius 1996; Fricke et al., 1999,
Pascual et al., 2001).
Outros estudos revelaram também que algumas espécies de Lippia
podem apresentar grande variabilidade na composição química de seus óleos
essenciais, como é o caso de L. ukambensis, L. junelliana, L. chevalieri, L.
multiflora e L.alba (Vale et al., 1999; Juliani-Jr et al., 2002, Theis e Lerdau
2003). Tais variações têm levado à separação destes táxons em “raças químicas”
ou quimiotipos, havendo sempre um componente químico majoritário que os
caracteriza (Pascual et al., 2001, Tavares, 2003).
5
2.3 Importância da identificação e do conhecimento de espécies
medicinais que apresentam quimiotipos
A taxa de variação do princípio ativo em uma espécie medicinal deve ser
muito pequena para que o medicamento produzido a partir da mesma seja seguro
e eficaz (Lima et al., 2003). Portanto, a identificação e a correta classificação de
quimiotipos, os quais apresentam princípios ativos diferentes em plantas
medicinais, são de grande importância para a manutenção da qualidade,
planejamento de cultivo e para a obtenção de fitofármacos que não prejudiquem
a saúde de quem venha a utilizá-los (Pascual et al., 2001, Lima et al., 2003).
Essa diversidade do óleo essencial em algumas espécies pode resultar da
ação de diversos fatores, tais como a variabilidade genética, fatores ecológicos e
ambientais (luz, temperatura, umidade e altitude), herbivoria e outros (D’
Andrea et al., 1995).
Conhecendo a causa de tais variações, o homem pode se beneficiar de
diversas formas, pois, tanto a seleção de genes como a de regimes ambientais
ótimos podem ser utilizadas para aumentar a produção de metabólitos
secundários, assim como a produtividade e a pureza das substâncias desejadas
(Lima et al., 2003).
Dentre as espécies de Lippia, aquela com quimiotipos mais bem
delimitados e conhecidos é Lippia alba (Ricciard et al. 2000) que é também
conhecida no Brasil como erva-cidreira, falsa-melissa, chá-de-tabuleiro, erva-
cidreira-do-campo, salva-do-Brasil, salva-limão e erva-cidreira-brava (Rao et al.
2000).
2.4 Lippia alba e seus quimiotipos
Lippia alba é uma planta arbustiva com ampla distribuição nas Américas
Central e do Sul, sendo encontrada em praticamente todas as regiões do Brasil.
Esta espécie apresenta inúmeras propriedades medicinais e seus constituintes
6
químicos podem conferir ação sedativa, antiespasmódica, estomáquica,
diurética, anti-reumática, antiinflamatória, analgésica e anti-séptica, entre outras
(Bezerra, 1981, Gomes, 1990, Viana, 2000).
Como citado anteriormente, a espécie apresenta uma inconstância nos
seus constituintes químicos. A composição química dos óleos essenciais de seus
quimiotipos sofre uma variação quantitativa e qualitativa, conferindo-lhes
diferentes propriedades farmacológicas (Matos et al. 1996, Frigheto et al. 1998,
Zoghbi et al. 1998).
Segundo Ricciard et al. (2001), na Argentina, são conhecidos cinco
quimiotipos de Lippia alba que são encontrados em diversas regiões com
diferentes características climáticas, diferentes tipos de solo e com variado grau
de umidade. Estes cinco quimiotipos são: La citral/linalol, La d-
limoneno/lippiona, La d-piperitona, La citral e La piperitona/limoneno + 1,8
cineol.
No Brasil, por outro lado, atualmente, distinguem-se três quimiotipos
com base nas variações qualitativas e quantitativas dos teores de citral, carvona,
e linalol. Alguns autores, como Tavares et al. (2005), Santos-Mendes (2001) e
outros, denominam estes quimiotipos de forma arbitrária. Aqui, serão
denominados La1, La2 e La3, respectivamente para os componente majoritários
citral, carnova e linalol.
Vários estudos têm mostrado as diferentes propriedades de cada um
destes quimiotipos. Dentre estes, Vale et al. (1999) detectaram efeito ansiolítico
e hipotérmico para o óleo essencial do quimiotipo La1. Viana et al. (2000)
também observaram efeito analgésico e antidematogênico.
Segundo Tavares (2003), o quimiotipo La2 possui ações nematicida,
bacteriostática, bactericida e fungicida, e a carvona, encontrada em La2, tem
efeito alelopático sobre o brotamento de batatas, diminuindo a taxa de brotos
quando o óleo essencial é aplicado aos tubérculos.
7
Para o quimiotipo La3, são descritas inúmeras funções, tais como efeitos
sedativos, propriedade hipnótica, hipotérmica, anticonvulsivante,
antiinflamatória, analgésica, antifúngica, inseticida e atividade contra linhagens
de células de leucemia e linfomas humanos (Andrada et al., 1998, Elizabetsky et
al., 1999, Re et al., 2000, Chiang et al., 2003, Tavares, 2003, Tavares et al.,
2005). Além de ser utilizado farmacologicamente, outra característica do linalol
é que ele também é essencial para a fabricação de vários perfumes e cosméticos
(Frighetto et al., 1998).
Além desta variação química, tais quimiotipos também apresentam
variações no que diz respeito à sua morfologia. Estudos mostraram que os três
quimiotipos diferenciam-se, principalmente, em relação ao tamanho, à textura
das folhas e à coloração das flores (Tavares, 2003). Outras observações
revelaram também que alguns caracteres anatômicos e histoquímicos estão
sujeitos a grandes variações resultantes de adaptações às condições ambientais
dos locais de origem (Correa, 1992).
Santos-Mendes (2001) observou que a plasticidade fenotípica em L. alba
poderia estar relacionada à sua ampla distribuição pelos mais diversos
ambientes. Para muitos autores, os resultados obtidos no estudo dos principais
componentes do óleo essencial de L. alba nem sempre são os mesmos devido ao
efeito de fatores ambientais e metodológicos utilizados (Matos et al.,1996,
Correa, 1992). No entanto, Sanders (2001) relata que perfis de óleos essenciais
em Verbenaceae são diversificados e altamente específicos para as espécies da
família.
Como as variações morfológicas e da composição química do óleo
essencial têm sido observadas dependendo da origem geográfica do material
analisado, muitas hipóteses apontam para o fato de que elas sejam causadas
principalmente pelo ambiente ao qual a planta está submetida (Santos-Mendes
2001). Porém, Tavares et al. (2005) verificaram que os três quimiotipos La1,
8
La2 e La3, obtidos em diferentes procedências, mantiveram suas diferenças
químicas e morfológicas, mesmo quando submetidos às mesmas condições
ambientais em experimentos bem delineados em casa de vegetação. Tal fato
indica que as variações são de cunho genético e não apenas ambiental. Estes
resultados foram reforçados pelos resultados observados por Pierre (2004), que
demonstrou, por meio de marcadores moleculares e análises citogenéticas, que
tais quimiotipos apresentam diferenças genéticas.
2.5 Citogenética dos quimiotipos de Lippia alba
O primeiro relato sobre a citogenética da espécie Lippia alba se refere
apenas ao número cromossômico, quando Bose e Choudhy (1960) observaram
2n=30 cromossomos.
Brandão (2003), ao realizar estudos cariológicos nesta espécie, verificou
que esta apresenta onze pares de cromossomos metacêntricos (pares
cromossômicos 1, 2, 3, 4 5, 6, 7, 10, 12, 14 e 15) e quatro pares
submetacêntricos (pares cromossômicos 8, 9, 11 e 13). Dentre estes, foi
observado que as constrições secundárias localizam-se nos braços curtos dos
pares cromossômicos 2 e 5.
Pierre (2004), ao estudar a cariologia dos quimiotipos La1, La2 e La3,
observou que os mesmos apresentam-se diferentes em relação ao número e
morfologia dos cromossomos. Foi observado que o quimiotipo La1 citral
apresenta 2n=30 cromossomos, o que corresponde ao primeiro número relatado
para L. alba (Bose e Choudhry, 1960). No entanto, seis pares mostraram-se
metacêntricos (pares cromossômicos do 1 ao 6) e 9 pares submetacêntricos
(pares cromossômicos do 7 ao 15), tendo os pares 5 e 11 apresentado constrições
secundárias nos braços curtos diferentemente do que foi observado por Brandão
(2003).
Para o quimiotipo La2 carvona, verificou-se número cromossômico de
9
2n=60, levando Pierre (2004) a inferir que este quimiotipo poderia ser um
autopoliplóide do quimiotipo La1. Como não houve semelhança entre o
cariótipo deste quimiotipo com aquele de La1, sugeriu-se que, durante o
processo de poliploidização, vários rearranjos estruturais teriam ocorrido nos
cromossomos de La2, diferindo-os dos cromossomos de La1. Por outro lado, tais
rearranjos ainda não foram identificados.
Com relação ao quimiotipo La3 linalol, Pierre (2004) observou variação
numérica dentro dos próprios indivíduos estudados, 2n=12 a 60, tratando-se,
portanto, de um quimiotipo mixoplóide.
Como se pode observar, os quimiotipos de Lippia alba são
extremamente variáveis entre si no que diz respeito às suas características
cromossômicas. No entanto, trabalhos que comparem acessos de um mesmo
quimiotipo, a fim de confirmar se estas características cromossômicas numéricas
e morfológicas sejam constantes para cada quimiotipo, ainda não foram
realizados.
Além das diferenças numéricas observadas entre os três quimiotipos por
Pierre (2004), pode-se observar que existe também um polimorfismo
cromossômico estrutural, entre acessos diferentes de um mesmo quimiotipo,
visto que foram observadas diferentes classificações cromossômicas nos
trabalhos realizados por Brandão (2003) e Pierre (2004).
Sob ponto de vista técnico, uma boa ferramenta que elucidaria alguns
dos fatos observados seriam as técnicas de bandeamentos cromossômicos, as
quais ainda não foram aplicadas com sucesso em Lippia alba.
2.6 Bandeamento C e coloração com fluorocromos
As técnicas de bandeamento cromossômico com giemsa (bandeamento
C) ou com os fluorocromos permitem uma análise mais detalhada do cariótipo,
uma vez que coram diferencialmente regiões específicas dos cromossomos,
10
sendo, por isso, reconhecidas como técnicas de diferenciação longitudinal (Vosa,
1985).
Entre as técnicas que permitem a análise da heterocromatina, as mais
empregadas em vegetais são o bandeamento C e a coloração com os
fluorocromos CMA e DAPI (Sumner, 1990).
A utilização de fluorocromos nas análises cromossômicas a partir do
final da década de 1960 permitiu identificar diferentes tipos de heterocromatina
com base na propriedade de corarem mais ou menos intensamente os segmentos
cromossômicos ricos em determinados pares de bases (Schweizer, 1976; Vosa,
1985, Sumner, 1990).
Os fluorocromos mais empregados na citogenética vegetal são a
quinacrina e a cromomicina A
3
(específicos para regiões ricas em GC), assim
como o Hoechst 33258 e o DAPI (específicos para regiões ricas em AT) (Guerra
e Souza, 2002).
Alguns táxons com cariótipo estável, quando observados com técnicas
de coloração convencionais, podem revelar uma intensa variação estrutural
quando analisados com bandeamento C ou com fluorocromos. É o caso, por
exemplo, do gênero Cycas, que apresenta número e morfologia cromossômica
bastante estável, possuindo, no entanto, uma quantidade variável de
heterocromatina em diferentes espécies (Kokubugata e Kondo, 1996).
Técnicas de bandeamento podem auxiliar na identificação de parentais
de híbridos. A partir do padrão de banda C observado em alguns tetraplóides de
Medicago, por exemplo, foi possível estabelecer que os mesmos são híbridos
formados pelo cruzamento de duas subespécies de Medicago sativa. Bauchan e
Hossain (1997) verificaram que alguns tetraplóides neste gênero apresentam um
genoma com bandas C centroméricas e outro com bandas C centroméricas e
teloméricas, que são os padrões observados nas subespécies diplóides Medicago
sativa caerulea e Medicago sativa falcata, respectivamente.
11
Em alguns programas de melhoramento de Citrus, a utilização de
fluorocromos, principalmente CMA, tem sido amplamente empregada para a
identificação de híbridos somáticos ainda in vitro (Miranda et al., 1997), assim
como a identificação de Citrus de origem nucelar ou zigótica (Pedrosa et al.,
2000).
Em estudos de citotaxonomia, as técnicas de bandeamento também
possibilitam a confirmação da presença de cromossomos B em algumas
espécies, uma vez que a maioria dos cromossomos B já descritos é
extremamente heterocromática em sua extensão (Hossain e Bauchan, 1999,
Jones e Houben, 2003).
Estas técnicas também têm auxiliado na identificação e no entendimento
dos tipos de alterações em plantas que apresentam polimorfismos
cromossômicos. Svetlana et al. (2000), ao estudarem o padrão de bandas N, em
oito acessos de Aegilops geniculata, observou que os mesmos apresentam
polimorfismos cromossômicos em seu padrão de bandas N. Alguns acessos
apresentavam bandas terminais não encontradas em outros, os quais
apresentavam, por sua vez, bandas intersticiais não encontradas naqueles. A
partir destes dados e outros de morfometria cromossômica, o autor conseguiu
identificar translocações e inversões nos cromossomos destes acessos.
Vários autores especulam que polimorfismos cromossômicos podem
estar relacionados com o fenótipo de alguns vegetais (Vosa, 1974, Weimarck,
1975, Lelley et al., 1978, Sumner, 1990). Heneen e Brismar (1987), por
exemplo, observaram que linhagens de trigo que apresentavam blocos
heterocromáticos terminais apresentavam grãos maiores do que linhagens cujos
cromossomos não apresentavam heterocromatina terminal. Rayburn et al.
(1985), observaram, a partir do padrão de bandas C, que linhagens de milho
obtidas de regiões geográficas distintas apresentavam quantidades diferentes de
heterocromatina. As linhagens, quando submetidas aos mesmos tratamentos de
12
cultivo, que apresentavam pouca heterocromatina, alcançavam a maturidade
mais rápido que aquelas com muita heterocromatina. Para os autores, as
linhagens com menos heterocromatina apresentavam um ciclo celular mais
rápido, levando as plantas a um desenvolvimento adiantado.
Brandão (2003), ao utilizar fluorocromos e a técnica de banda C,
observou que Lippia alba é uma espécie muito rica em heterocromatina
constitutiva. No entanto, em nenhum momento, o mapeamento da
heterocromatina nos cromossomos desta espécie foi mencionado. A realização
deste mapeamento em Lippia alba seria mais um passo para o entendimento
cariológico da mesma, uma vez que a espécie apresenta variantes
cromossômicas.
2.7 Constrições secundárias e bandeamento com nitrato de prata
A coloração com nitrato de prata, em condições adequadamente
controladas, é um método altamente seletivo para a coloração de nucléolos
interfásicos e regiões organizadoras de nucléolos (constrições secundárias ou
outras regiões com sítios responsáveis pela transcrição de RNA ribossomal,
também denominados RON) em cromossomos (Sumner, 1990), apesar da
técnica de FISH ser mais utilizada devido à sua maior especificidade.
A grande limitação desta técnica é o fato do nitrato de prata marcar
apenas as regiões organizadoras de nucléolo que foram ativamente transcritas
durante as intérfases precedentes às metáfases analisadas (Sumner, 1990), não
possibilitando, muitas vezes, a demonstração do número real de RONs.
A técnica também se destina ao estudo do comportamento nucleolar
durante o ciclo celular (Sumner, 2003). Na maioria das espécies, esta organela se
desintegra no final da prófase. No entanto, vários autores utilizando o nitrato de
prata para a marcação de nucléolos, têm demonstrado que, em algumas espécies,
13
estes não se desintegram e podem permanecer até mesmo durante a anáfase e a
telófase (Murugesan et al., 2001).
O estabelecimento da coloração de RON em Lippia alba com nitrato de
prata ainda não foi obtido. Esta técnica poderia ser um ferramenta útil para a
análise de acessos destes quimiotipos, tanto para a localização das RONs nas
metáfases, como na sua atividade. Além disso, tal técnica poderia ajudar na
identificação de possíveis polimorfismos relacionados à posição destes
marcadores em Lippia alba.
14
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Obtenção dos acessos de Lippia alba
Cinco acessos de Lippia alba, contendo 2n=30 cromossomos foram
obtidos de diferentes locais. Na Tabela 1 estão indicadas as procedências de
cada um deles.
TABELA 1. Procedências dos acessos de Lippia alba
ACESSO CIDADE DE ORIGEM ESTADO
LaCat Cataguases Minas Gerais
LaGua Guarani Minas Gerais
LaJF Juiz de Fora Minas gerais
LaRJ Rio de Janeiro Rio de Janeiro
LaVC Vitórias da Conquista Bahia
Os acessos LaCat, LaGua, LaJF e LaRJ foram multiplicados na Estação
Experimental de Cultivo e Manutenção de Plantas da Universidade Federal de
Juiz de Fora, MG e, após a obtenção de mudas, cinco réplicas de cada um destes
quatro acessos foram encaminhadas para a Universidade Federal de Lavras, MG,
(UFLA) onde foram mantidas em casa de vegetação. O acesso LaVC foi
multiplicado a partir de estacas recebidas na própria UFLA.
3.2 Extração e análise química dos óleos essenciais
Os óleos essenciais foram extraídos por hidrodestilação, empregando-se
extrator descrito na Farmacopéia Brasileira, IV edição, durante 2horas, para cada
um dos acessos a partir da trituração de 80g de folha dos mesmos.
A análise por cromatografia com fase gasosa (CG) foi efetuada sob as
seguintes condições: coluna capilar Supleco DB 5 de 30m com o hélio como gás
de arraste; temperatura do injetor de 200°C, temperatura do detector 250°C,
15
aquecimento da coluna programado para 50° a 200°C com velocidade de
aquecimento de 4°C/min. A análise por CG foi realizada acoplado ao
espectrômetro de massa Shimadzu QP5050A com temperatura da interface de
220°C e o tamanho dos fragmentos a serem detectados de 40 a 300 m/z. Para
cada acesso foi analisada uma amostra composta do óleo de vários indivíduos.
3.3 Análise citogenética
3.3.1 Pré-tratamento com bloqueador mitótico
Para a obtenção de cromossomos metafásicos e núcleos interfásicos,
foram coletadas estacas dos cinco acessos. Estas foram mantidas em sistemas de
hidroponia à temperatura ambiente até a formação de raízes. Em seguida, as
raízes foram submetidas à pré-tratamentos com 8-hidroxiquinoleína (3mM) por
8horas a 4°C. Após o tratamento, as raízes foram secas e fixadas em metanol-
ácido acético 3:1 por, no mínimo, 24horas.
3.3.2 Preparo das lâminas
As raízes foram submetidas à maceração enzimática em uma solução
contendo celulase 4% e pectinase 40% durante 4horas e meia, a 37°C. As
lâminas foram preparadas por meio da técnica de secagem ao ar com maceração
enzimática (Carvalho, 1995). Em seguida, foram analisadas em microscopia de
luz (microscópio Olympus BX 60), sob contraste de fase. As metáfases
completas e os núcleos interfásicos mais espalhados na lâmina foram marcados
em lâmina guia.
Em seguida, as lâminas foram colocadas em estufa a 28°C e foram
envelhecidas por, no mínimo, sete dias antes de serem submetidas às técnicas de
bandeamentos.
Para a observação de metáfases em coloração sólida com giemsa, após a
confecção das lâminas, as mesmas foram imersas diretamente em solução de
16
giemsa a 5% em tampão fosfato pH 6,8, à temperatura ambiente, por 5 minutos.
Após lavagem em água destilada, as lâminas foram secas ao ar e analisadas ao
microscópio.
3.3.3 Morfometria cromossômica
Para cada acesso, foram avaliadas 10 metáfases para cada técnica
aplicada. A partir destas metáfases, foram obtidas as medidas de comprimento
total dos cromossomos (CT= comprimento do braço curto+comprimento do
braço longo) e o comprimento dos braços cromossômicos. Além disso, foi
medido o percentual de heterocromatina em cada acesso.
Para a confecção dos ideogramas foram utilizados os seguintes
parâmetros: tamanho relativo (TR= comprimento total do cromossomo
individual x 100/comprimento total do genoma), índice centromérico (IC=
comprimento do braço curto x 100/comprimento do braço longo+comprimento
do braço curto) e relação de braços (RB= comprimento do braço longo/
comprimento do braço curto) e comprimento total do lote haplóide (CTLH). Os
cromossomos foram classificados segundo Levan et al.(1964).
3.4 Metodologias de bandeamento cromossômico
3.4.1 Coloração com DAPI
Para a obtenção do padrão de bandas com o fluorocromo DAPI,
utilizaram-se os protocolos descritos por Schweizer (1976), Sumner (1990) e
Fukui e Nakayama (1996), com algumas modificações.
Após os sete dias de envelhecimento, as lâminas foram coradas com
solução de 4,6-diamidino-2-phenilindole (Sigma
TM
), à temperatura ambiente, em
câmara úmida, no escuro, por 20 minutos. A solução foi preparada momentos
antes do uso, na concentração de 1µg/ml em solução tampão Mcllvaine pH 7,0.
Após a coloração, a preparação foi lavada com o mesmo tampão e seca ao ar.
17
Duas gotas do tampão foram depositadas sobre as lâminas, as quais foram
cobertas, posteriormente, com lamínula. O excesso de tampão foi removido,
pressionando-se cuidadosamente a lâmina e a lamínula entre papel-filtro. Em
seguida, a lamínula foi vedada com esmalte incolor. O material foi
imediatamente observado em microscópio equipado com acessório de
fluorescência, utilizando-se comprimento de onda entre 360 e 390 nm.
3.4.2 Coloração com cromomicina (CMA
3
)
O seguinte protocolo foi realizado a partir de pequenas modificações dos
protocolos desenvolvidos por Sumner (1990) e Fukui e Nakayama (1996):
preparações envelhecidas por 7 dias, previamente incubadas em tampão
Mcllvaine pH 7,0 contendo 0,5mM de MgCl
2
, por 20 minutos, foram coradas
com cromomicina A
3
-CMA (Sigma
TM
), em câmara úmida, no escuro e à
temperatura ambiente.
A solução de CMA foi preparada em concentração de 0,1 mg/ml, em
tampão Mcllvaine contendo 0,5mM de MgCl
2
, e armazenada em geladeira por,
no mínimo, 24horas antes do uso. Após 30 minutos de coloração, as lâminas
foram lavadas cuidadosamente com solução-tampão e secas ao ar. A mesma
solução-tampão contendo MgCl
2
foi utilizada para a montagem da lâmina que
foi coberta com lamínula e vedada com esmalte incolor. Para estabilizar a
fluorescência, as lâminas ficaram armazenadas em geladeira (4°C) por, no
mínimo, 24horas e, em seguida, foram examinadas em microscópio de
fluorescência, usando comprimento de ondas de 430 a 480 nm.
Algumas lâminas anteriormente utilizadas para o bandeamento com
DAPI foram descoradas em três baterias de álcool absoluto, durante trinta
minutos e, em seguida, foram submetidas ao protocolo descrito para o
bandeamento com CMA. Assim, foi possível a coloração seqüencial de algumas
metáfases.
18
3.4.3 Técnica de bandeamento C
O protocolo utilizado para técnica de bandeamento C foi o estabelecido
por Schwarzacher et al. (1980), com algumas modificações.
Após o período de envelhecimento, as lâminas foram incubadas em
ácido acético 45%, a 65°C. Em seguida, foram lavadas em água destilada por 30
minutos, em 5 baterias de lavagem. Posteriormente, realizou-se incubação das
mesmas em solução de hidróxido de bário 5% por 25 minutos, à temperatura
ambiente. Em seguida, as lâminas foram lavadas novamente por 30 minutos em
água destilada, em 5 baterias de lavagem. As lâminas lavadas foram incubadas
em 2xSSC a 65°C por uma hora e trinta minutos e lavadas em água destilada por
15 minutos, em 3 baterias de lavagem. Finalmente, as lâminas foram secas e
coradas em giemsa 10% por, no mínimo, 10 minutos.
3.4.4 Técnica de bandeamento com nitrato de prata
O método utilizado para a marcação de RONs (regiões organizadoras de
nucléolo) e nucléolos com nitrato de prata foi o proposto por Howell e Black
(1980), com algumas modificações.
Para esta técnica foi preparado um meio coloidal com gelatina incolor,
em que 2g de gelatina foram dissolvidas em 100 ml de água deionizada. Após a
total dissolução da gelatina, foram acrescentados ao meio, 2ml de ácido fórmico.
Em seguida, foi preparada uma solução de nitrato de prata a 40% em água
deionizada.
Para coloração das RONs e nucléolos, duas gotas da solução coloidal
foram colocadas sob a lâmina e, em seguida, mais quatro gotas de nitrato de
prata a 40%. As lâminas foram cobertas com lamínula e colocadas em câmara
úmida a 45°C, por cerca de 30 minutos. A coloração dos nucléolos foi
monitorada a cada 10 minutos, sob microscópio e com a marcação dos mesmos,
19
as lâminas foram lavadas por 30 min em água corrente e 10 minutos em água
destilada.
Algumas lâminas utilizadas para o bandeamento com CMA foram
descoradas em três baterias de álcool absoluto e submetidas à técnica de
bandeamento com nitrato de prata, possibilitando, assim, a coloração seqüencial
de algumas metáfases.
Além de ter sido aplicada às células mitóticas, esta técnica foi aplicada
também em células meióticas. Para a obtenção dos meiócitos, foi utilizada a
técnica de secagem ao ar com maceração enzimática adaptada para plantas de
flores de tamanho reduzido (Praça et al.,2000).
3. 5 Análise de imagens
Todas as metáfases e núcleos interfásicos analisados foram capturados
por uma câmara digital acoplada ao microscópio Olympus Bx 60 e analisadas
pelo programa Image Pro-Plus versão 4.5 (Media Cybernetics).
20
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Morfometria cromossômica
Os cinco acessos estudados no presente trabalho apresentaram 2n=30
cromossomos. Dentre estes, aquele que apresentou o maior cromossomo,
cromossomo 1, foi LaCat, cujo comprimento total foi de 6,59 µm. Em
contrapartida, o acesso com o menor cromossomo, cromossomo 15, foi LaGua,
cujo comprimento total foi de 2,52 µm.
Todos os acessos estudados apresentaram uma morfologia cromossômica
muito semelhante, com a seguinte fórmula cariotípica: 10M (metacêntrico) e
5SM (submetacêntrico). Dos quinze pares de cromossomos, do 1 ao 10, todos
foram metacêntricos, sendo que, dos pares 11 ao 15, todos foram
submetacêntricos.
Com relação ao comprimento total do lote haplóide, foi observado que o
acesso que apresentou o maior tamanho foi LaCat com 67,99 µm, enquanto o
menor tamanho foi observado para o acesso LaRJ, cujo tamanho foi de 52,54
µm. Tal variação se deve, principalmente, à variação no grau de condensação
dos cromossomos nos acessos estudados, visto que o tamanho relativo dos
cromossomos, quando comparados entre os acessos, foi muito próximo. Todos
os dados relacionados à morfometria dos cromossomos podem ser observados
nas Tabelas 2, 3, 4, 5 e 6.
Resultados semelhantes foram observados por Linde-Laursen & Ole
Seberg (2001), entre acessos de Elymus scabrifolius. Estes autores observaram
diferentes valores para o tamanho total do complemento haplóide e dos
cromossomos entre os acessos. No entanto, os tamanhos relativos dos
cromossomos foram muito próximos, indicando com isso, que as diferenças
eram somente devido à condensação dos cromossomos.
As classificações propostas, em relação à posição do centrômero em
Lippia alba, por Brandão (2003) e Pierre (2004) são discordantes, levantando
21
com isso a hipótese de rearranjos estruturais entre as respectivas populações
estudadas. Diferente destes autores, comparando-se diferentes populações desta
espécie, observa-se que a mesma apresenta um cariótipo muito semelhante, não
havendo diferenças na classificação dos cromossomos entre os acessos
estudados.
22
ACESSO LaCat
PAR BC BL CT TR% RB IC CC
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
2,83
2,51
2,4
2,1
1,81
1,74
1,73
1,53
1,54
1,34
1,33
1,27
1,25
1,18
0,89
3,53
3,43
3,37
3,53
2,93
2,82
2,94
2,54
2,51
2,21
2,62
2,25
2,92
2,68
2,03
6,59
5,94
5,77
5,63
4,74
4,56
4,67
4,07
4,05
3,55
3,95
3,52
4,17
3,86
2,92
9,69
8,73
8,48
8,28
6,97
6,70
6,86
5,98
5,95
5,22
5,80
5,17
6,13
5,67
4,29
1,24
1,36
1,40
1,68
1,61
1,62
1,69
1,66
1,62
1,64
1,96
1,77
2,33
2,27
2,28
42,94
42,25
41,59
37,30
38,18
38,15
37,04
37,59
38,02
37,74
33,67
36,07
29,97
30,56
30,47
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
SM
SM
SM
SM
SM
CTHL 67,99
TABELA 2. Dados morfométricos dos cromossomos do acesso LaCat
Lavras, 2006.
BC= comprimento do braço curto (µm); BL= comprimento do braço
longo (µm); CT= comprimento total do cromossomo (µm); TR= tamanho
relativo; RB= relação de braços; IC= índice centromérico; CC=
classificação centromérica; MT= metacêntrico; SM= submetacêntrico;
CTLH = comprimento total do lote haplóide (µm);
23
ACESSO LaGua
PAR BC BL CT TR% RB IC CC
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
2,16
2,02
2
1,98
1,73
1,7
1,66
1,44
1,4
1,38
1,23
1,11
1,09
0,98
0,63
2,52
2,78
2,27
2,5
2,31
2,1
1,83
2,47
2,35
2,25
2,11
2
1,88
1,75
1,73
4,68
4,8
4,27
4,48
4,04
3,8
3,46
3,84
3,75
3,63
3,34
3,11
2,97
2,73
2,36
8,47
8,6
7,72
8,10
7,31
6,87
6,26
6,94
6,78
6,56
6,04
5,62
5,37
4,94
4,27
1,16
1,37
1,13
1,26
1,33
1,23
1,08
1,66
1,67
1,63
1,71
1,80
1,72
1,78
2,74
46,15
42,08
46,83
44,19
42,82
44,73
47,97
37,5
37,3
38,01
36,82
35,69
36,70
35,89
26,69
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
SM
SM
SM
SM
SM
CTHL 55,26
BC= comprimento do braço curto (µm); BL= comprimento do braço longo
(µm);CT= comprimento total do cromossomo (µm); TR= tamanho relativo;
RB= relação de braços; IC= índice centromérico; CC= classificação
centromérica; MT= metacêntrico; SM= submetacêntrico; CTLH =
comprimento total do lote haplóide (µm);
TABELA 3. Dados morfométricos dos cromossomos do acesso LaGua
Lavras, 2006.
24
ACESSO LaJF
PAR BC BL CT TR% RB IC CC
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
3,02
2,23
2,03
1,92
1,76
1,54
1,52
1,46
1,41
1,36
1,27
1,15
1,1
1
0,98
3,1
3,05
2,98
3,01
2,97
1,98
1,76
2,14
2,38
2,29
2,38
2,1
2,9
2,93
2,54
6,12
5,28
5,01
4,93
4,73
3,52
3,28
3,6
3,79
3,65
3,65
3,25
4
3,93
3,52
9,82
8,48
8,04
7,91
7,59
5,65
5,26
5,78
6,08
5,86
5,86
5,22
6,42
6,31
5,65
1,02
1,36
1,46
1,56
1,68
1,28
1,15
1,46
1,68
1,68
1,87
1,82
2,63
2,93
2,59
49,34
42,23
40,51
38,94
37,20
43,75
46,34
40,55
37,20
37,26
34,79
35,38
27,5
25,44
27,84
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
SM
SM
SM
SM
SM
CTHL 62,26
TABELA 4. Dados morfométricos dos cromossomos do acesso LaJF
Lavras, 2006.
BC= comprimento do braço curto (µm); BL= comprimento do braço
longo (µm); CT= comprimento total do cromossomo (µm); TR= tamanho
relativo; RB= relação de braços; IC= índice centromérico; CC=
classificação centromérica; MT
=
metacêntrico; SM
=
submetacêntrico;
25
ACESSO LaRJ
PAR BC BL CT TR% RB IC CC
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
2,02
1,98
1,78
1,69
1,61
1,5
1,48
1,45
1,38
1,34
1,1
1,18
1,13
1,1
0,95
2,64
2,73
2,6
2,63
2,37
1,63
1,59
1,52
1,68
1,76
1,98
2,03
1,93
1,9
1,86
4,66
4,71
4,38
4,32
3,98
3,13
3,07
2,97
3,06
3,1
3,08
3,21
3,06
3
2,81
8,86
8,96
8,33
8,22
7,57
5,95
5,84
5,65
5,82
5,90
5,86
6,10
5,82
5,70
5,34
1,30
1,37
1,46
1,55
1,47
1,08
1,07
1,04
1,21
1,31
1,8
1,72
1,70
1,72
1,95
43,34
42,03
40,63
39,12
40,45
47,92
48,20
48,82
45,09
43,22
35,71
36,76
36,92
36,66
33,80
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
SM
SM
SM
SM
SM
CTHL 52,54
BC= comprimento do braço curto (µm); BL= comprimento do braço
longo (µm); CT= comprimento total do cromossomo (µm); TR= tamanho
relativo; RB= relação de braços; IC= índice centromérico; CC=
classificação centromérica; MT
=
metacêntrico; SM
=
submetacêntrico;
TABELA 5. Dados morfométricos dos cromossomos do acesso LaRJ
Lavras, 2006.
26
ACESSO LaVC
PAR BC BL CT TR% RB IC CC
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
2,21
2,18
1,98
1,65
1,58
1,5
1,46
1,43
1,38
1,33
1,12
1,1
1,01
1
0,89
2,51
2,41
2,38
2,34
2,21
2,48
1,59
1,95
1,98
1,66
1,94
2,1
1,87
1,94
1,74
4,72
4,59
4,36
3,99
3,79
3,98
3,05
3,38
3,36
2,99
3,06
3,2
2,88
2,94
2,63
8,91
8,67
8,23
7,53
7,16
7,52
5,76
6,38
6,34
5,65
5,78
6,04
5,44
5,55
4,96
1,13
1,10
1,20
1,41
1,39
1,65
1,08
1,36
1,43
1,24
1,73
1,90
1,85
1,94
1,95
46,82
47,94
45,41
41,35
41,68
37,68
47,86
42,30
41,07
44,48
36,60
34,37
34,35
34,01
33,84
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
MT
SM
SM
SM
SM
SM
CTHL 52,92
T
ABELA 6. Dados morfométricos dos cromossomos do acesso LaVC
Lavras, 2006.
BC= comprimento do braço curto (µm); BL= comprimento do braço
longo (µm); CT= comprimento total do cromossomo (µm); TR= tamanho
relativo; RB= relação de braços; IC= índice centromérico; CC=
classificação centromérica
;MT
=
metacêntrico; SM
=
submetacêntrico;
27
4.2 Coloração sólida com giemsa, constrições secundárias, padrão de
bandas com CMA
3
e atividade das regiões organizadoras de nucléolo
Diferente do que foi relatado por Brandão (2003) e Pierre (2004), que
observaram apenas quatro cromossomos com constrições secundárias, a partir da
coloração sólida com giemsa, nos cinco acessos estudados no presente trabalho,
foi possível observar que Lippia alba apresenta seis cromossomos com estas
estruturas (Figura 1). Tal diferença pode ser devido à variação no grau de
condensação dos cromossomos, uma vez que, no presente trabalho, foi possível
observar que, com o aumento da condensação cromossômica, algumas
constrições secundárias podem ser imperceptíveis (Figura 2).
Em algumas espécies de plantas, o número de constrições secundárias
varia de célula para célula. No entanto, o número máximo de constrições
secundárias é, geralmente, constante para cada espécie (Sato et al, 1980,
Yonenaga-Yassuda et al, 1983). Guerra et al (1997), ao estudarem 51 acessos de
citrus, observaram que dentre estes, 19 apresentavam variação no número das
constrições secundárias devido ao grau de condensação. Estes acessos pareciam,
numa primeira análise, possuir menos constrições secundárias que os outros. Por
outro lado, ao analisar pro-metáfases o autor observou que o número de
constrições era semelhante ao dos outros acessos.
Brandão (2003) observou estas estruturas em Lippia alba nos
cromossomos 2 e 5, enquanto Pierre (2004) observou nos cromossomos 5 e 11.
Como aqui elas foram observadas nos cromossomos 2, 5 e 11, para os cinco
acessos, tais resultados reforçam a idéia de variação na condensação e não na
posição das mesmas, mostrando, com isso, que estas estruturas são bastante
estáveis nas diferentes populações de Lippia alba.
Com relação às constrições secundárias, todas as seis mostraram-se
positivas para o fluorocromo CMA
3,
em todos os acessos (Figura 3).
28
A marcação de constrições secundárias com este fluorocromo tem sido
observada em várias outras espécies por inúmeros autores (Schweizer, 1976;
Guerra et al., 2000; Yen-Yu et al, 2001). A explicação para isso é que, na
maioria das espécies, as regiões organizadoras de nucléolo (sítios contendo
genes que codificam RNA ribossomal dos tipos 18S, 5,8S e 28S) estão presentes
nas constrições secundárias. Tais sítios de transcrição, por sua vez, apresentam
regiões ricas em bases do tipo GC (Sumner 1990), cujo fluorocromo CMA
3
tem
alta afinidade.
Estes resultados, portanto, sugerem que L. alba apresenta as regiões
organizadoras de nucléolo (RONs) localizadas em suas constrições secundárias
e, além disso, que estas são encontradas em número de seis nesta espécie.
Atualmente, para a identificação de RONs, a técnica mais utilizada tem
sido a de Hibridização in situ fluorescente (FISH), a partir de sondas contendo as
seqüências de DNAr 18S, 5,8S e 28S. Esta técnica tem sido amplamente
utilizada devido à sua precisão e especificidade ao evidenciar todos os cístrons
ribossomais, ativos e inativos das RONs (Schwarzacher & Ambros, 1979;
Besendorfer et al., 2002).
29
Metáfases dos acessos LaCat (a) e LaGua (b), LaJF (c),
LaRJ (d) e LaVC (e), respectivamente, apresentando
três pares de constrições secundárias (setas). Barra = 10
µm. Lavras, 2006 (“...continua...”).
FIGURA 1.
b
a
30
FIGURA 1, cont.
c
d
31
FIGURA 1, cont.
e
Metáfase do acesso LaCat apresentando apenas
dois pares de constrições secundárias (setas).
Barra = 10 µm. Lavras, 2006
FIGURA 2.
32
a
b
c
Metáfases dos acessos LaCat (a), LaGua (b) e LaJF (c),
LaRJ (d) e LaVC (e) respectivamente, coradas com
CMA
3
. Barra = 10 µm. Lavras, 2006 (“...continua...”)
FIGURA 3.
33
Figura 3. cont.
d
e
34
Brandão (2003), ao aplicar a técnica de FISH em Lippia alba observou
seis marcas, mas não descreveu a posição destas RONs nos cromossomos.
Apesar destes sítios, geralmente, estarem localizados em constrições secundárias
(Guerra, 1988), muitos estudos têm mostrado que existem sítios de DNAr
(RONs) que estão presentes em outras regiões dos cromossomos.Este é o caso do
que foi descrito por Panzera et al. (1996), que detectaram uma quinta família de
RONs no telômero do braço longo do cromossomo 8 de Allium cepa, no qual não
existe constrição secundária. Sumner (1990) mencionou que as RONs são regiões
que apresentam genes para a transcrição de RNAr 18 S, 5,8S e 28 S,
independente do local onde se encontram nos cromossomos. Além disso, este
autor relatou que muitas constrições secundárias não contêm estes sítios,
apresentando apenas heterocromatina inativa que se descondensa, formando esta
estrutura.
Com a finalidade de identificar a posição das RONs nos cromossomos
dos cinco acessos, foi empregada a técnica de bandeamento com nitrato de prata.
Esta técnica possibilitou a observação de apenas quatro RONs nos cromossomos
de Lippia alba. Em todos os acessos, foi possível a observação destes sítios nos
pares de cromossomos cinco e onze (Figura 4). Todas as marcas apresentaram
praticamente o mesmo tamanho e coincidiram em dois pares de constrições
secundárias. No entanto, não foi observada nenhuma marcação no par
cromossômico 2. Esta técnica, ao contrário da FISH, permite a observação
apenas de RONs que foram ativas na intérfase precedente (Sumner 1990). Com
isso, pode-se inferir que apenas dois pares de RONs em Lippia alba são ativas.
Além disso, foi observado um número máximo de quatro nucléolos em todos os
acessos, o que corrobora com a possibilidade de um par das RONs ser inativo
(Figura 5).
b
d
e
35
A presença de nucléolos na meiose, geralmente, é observada até a fase de
paquíteno (Sumner 2003). No entanto, alguns estudos mostram a presença de
nucléolo no final da prófase I e até mesmo durante a metáfase da segunda divisão
meiótica (Almeda 1992; Almeda 1997).
36
a
b
c
d
e
Metáfases dos acessos LaCat (a), LaGua (b), LaJF (c),
LaRJ (d) e LaVC (e), respectivamente, mostrando dois
pares de cromossomos com RONs ativas, após coloração
com nitrato de prata. Barra = 10 µm. Lavras, 2006.
FIGURA 4.
37
Foi observado que, nesta espécie, durante a meiose, o nucléolo pode
permanecer até o final da prófase I. Com a aplicação do bandeamento com nitrato
de prata na meiose dos acessos LaCat e LaGua, foi possível observar com clareza
a presença de dois pares de cromossomos associados ao nucléolo (Figura 6),
aumentando, assim, as evidências de inativação de um par de RON.
Apesar da técnica de bandeamento AgNOR ter evidenciado a presença de
dois pares de cromossomos com RONs ativas, é importante ressaltar que o nitrato
de prata possui afinidade por proteínas nucleolares e RNAr que se mantêm presos
às RONs de algumas metáfases. Não há, portanto, afinidade pela cromatina ou
DNA destas regiões. Segundo Sumner (1990), o componente granular do
nucléolo é desfeito após a prófase e se dispersa pelos cromossomos durante a
mitose. Caso em uma RON ativa não fiquem resquícios deste material, ela pode
não ser corada, levando a uma interpretação de inativação da mesma.
Vários eventos, principalmente epigenéticos, podem levar a uma real
inativação destas regiões, tornando-as silenciosas, fato comum entre híbridos
interespecíficos e intergenéricos (Pikaard 2000).
Como, entre os acessos de Lippia alba, uma das constrições não
apresentou sinais de atividade, novos estudos, principalmente utilizando a técnica
de FISH, devem ser realizados com o intuito de se observar se esta constrição
secundária contém RON ou se o terceiro par destes sítios se encontra em outras
regiões dos cromossomos, uma vez que o fluorocromo CMA
3
foi positivo para as
seis constrições secundárias.
Além disso, outras técnicas específicas para marcar RONs poderiam ser
utilizadas, como é o caso do bandeamento N, auxiliando, assim, no
entendimento da atividade destas regiões.
38
a
b
c
d
Núcleos interfásicos de Lippia alba corados com nitrato de
prata, apresentando quatro nucléolos (a), três nucléolos (b),
dois nucléolos (c) e um único nucléolo (d). Barra = 10 µm.
Lavras, 2006.
FIGURA 5.
FIGURA 6. Diacinese do acesso LaCat corada com nitrato de prata
apresentando dois bivalentes associados a um nucléolo (seta). Barra =
10 µm. Lavras, 2006.
39
4.3 Coloração com DAPI, bandeamento C e polimorfismos cromossômicos
entre os acessos de Lippia alba.
Com relação ao padrão heterocromático em Lippia alba, Brandão (2003)
observou que esta espécie apresenta grandes blocos de heterocromatina
constitutiva. No entanto, não foi relatado, em seu trabalho, o mapeamento desta
cromatina. Foram realizadas inferências em relação ao tamanho e a constituição
das regiões heterocromáticas, sendo sugerido que as mesmas poderiam ser ricas
em bases do tipo AT (devido à presença de grandes extensões coradas com DAPI
e poucas com CMA
3
).
No presente trabalho, o emprego de colorações seqüenciais
DAPI/CMA/Banda C permitiu a obtenção de mapas físicos, bem como a
caracterização qualitativa das bandas heterocromáticas para esses acessos. Foi
possível observar, com a técnica de banda C, que todos os acessos apresentam
bandas centroméricas em todos os cromossomos e bandas teloméricas em apenas
alguns. Além disso, todas as bandas centroméricas apresentaram-se ricas em
bases adenina e timina, uma vez que se mostraram DAPI positivas (DAPI
+
) em
todos os cromossomos. No entanto, algumas bandas obtidas com DAPI foram
maiores do que aquelas obtidas com o bandeamento C, sendo também variável
em tamanho quando comparadas entre os acessos (Figura 7). Tal fato também
pode ser observado em núcleos interfásicos, nos quais, além da coincidência
entre padrão de bandas C e DAPI, pôde-se observar a maior quantidade de
marcas positivas para o DAPI (Figura 8).
Segundo Rocchi (1982), a diferença de tamanho de bandas obtidas por
diferentes métodos de coloração em indivíduos e entre indivíduos de uma mesma
espécie, pode ser explicada, principalmente, pelas diferentes concentrações de
DNA satélite localizados na heterocromatina constitutiva. Atualmente, sabe-se
que este tipo de DNA é altamente polimórfico, variando muito entre indivíduos
de diferentes populações ou de uma mesma população.
40
Associado ao que foi dito anteriormente, vários trabalhos, como o de
Popov et al. (2001), mostram que, de acordo com o tamanho dos cromossomos,
porções de heterocromatina podem não ser visualizadas devido ao grau de
condensação. Além disso, a presença de proteínas em determinadas regiões dos
cromossomos pode prejudicar a visualização da real extensão dos blocos
heterocromáticos, de acordo com a técnica utilizada.
Segundo Guerra (2000), o estudo do padrão de distribuição da
heterocromatina constitutiva (HC) em vegetais deve sempre considerar que esta
porção do genoma apresenta variação qualitativa e quantitativa entre as espécies.
Além disso, este mesmo autor cita que, entre indivíduos de uma mesma espécie,
polimorfismos para o número e tamanho das bandas heterocromáticas podem ser
muito freqüentes.
De acordo com Sumner (2003), este tipo de cromatina pode sofrer
grandes mudanças em pouquíssimo tempo e diferentes metodologias podem
revelar diferentes frações da mesma.
Em termos quantitativos, no presente trabalho, o acesso que apresentou
o maior percentual de heterocromatina em relação ao genoma total foi o acesso
LaCat, com 54% do seu genoma sendo formado de heterocromatina constitutiva,
enquanto o que apresentou o menor percentual foi o acesso LaGua, com 43%.
Além destas observações, nota-se que o número de bandas não é o mesmo para
todos os acessos (Tabela 7).
41
b
a
Coloração seqüencial DAPI/Banda C, mostrando o padrão
heterocromático em metáfase do acesso LaCat (a e b), LaGua (c e
d), LaJF (e e f), LaRJ (g e h) e LaVC (i e j) respectivamente. Barra
= 10µm. Lavras, 2006. (“...continua...”)
FIGURA 7.
42
FIGURA 7. cont.
d
c
43
FIGURA 7. cont.
f
e
44
FIGURA 7. cont.
h
g
45
FIGURA 7. cont.
j
i
46
.
Coloração seqüencial com DAPI (a), CMA(b), Banda
C (c) em núcleos interfásicos de Lippia alba. Barra =
10
µ
m. Lavras, 2006.
FIGURA 8.
a
b
c
47
ACESSO PH N° de bandas C N° Bandas DAPI N° Bandas CMA
3
LaCat 54% 48 48 6
LaGua 43% 42 40 6
LaJF 48% 48 46 6
LaRJ 51% 48 44 6
LaVC 45% 44 40 6
Esta diferença no percentual heterocromático está relacionada com a
ausência de algumas marcas para o bandeamento C em alguns cromossomos
entre os acessos (telômeros dos cromossomos 12, 13 e 14, principalmente). No
entanto, como estas marcas ausentes no bandeamento C foram DAPI
+
em todos
os acessos, tal fato leva-nos a inferir que tais resultados podem ser explicados
pela degradação dos cromossomos após o emprego da técnica de bandeamento C
(Pignone and Attolico, 1980, Sato and Yoshioka, 1984). Isso pode ser observado
quando comparam-se os cariogramas obtidos a partir de metáfases submetidas
primeiramente, à coloração com DAPI e, posteriormente, ao bandeamento C
(Figura 9). Nota-se que as bandas degradadas pelo bandeamento C estão
presentes nas metáfases coradas com DAPI, provavelmente porque a coloração
com DAPI provoca menos dano à estrutura cromossômica.
Por outro lado, nos cinco acessos, nem todas as marcas DAPI
+
coincidiram
com marcas C positivas (C
+
). Quatro deles (LaCat, LaGua, LaRJ e LaVC)
apresentaram uma marca DAPI
no telômero do braço longo do cromossomo 1,
enquanto o outro acesso (LaJF), em todas as metáfases analisadas, não
apresentou marcas nesta região. Isso pode ter ocorrido, possivelmente, devido à
perda de tais regiões a partir de eventos deletérios.
Ao contrário do fato exposto anteriormente, o acesso LaCat apresentou
TABELA 7.
Percentual heterocromático (PH) e número de bandas C, DAPI e
CMA
3
observadas em cinco acessos de Lippia alba.
48
uma banda DAPI
+
e C
+
(coincidentes) no telômero do braço longo do
cromossomo 8 em todas as metáfases analisadas. Como essa marca não foi
observada para os outros acessos, algumas hipóteses poderiam ser formuladas.
Dentre estas, uma possível translocação não recíproca entre dois cromossomos,
sendo o cromossomo 8 o receptor de uma pequena porção contendo esta banda
heterocromática. Outra hipótese poderia ser a transposição de um segmento
heterocromático do genoma do acesso LaCat para o telômero deste cromossomo.
Apesar de tais observações e hipóteses levantadas, vale ressaltar que para
se obter um resultado mais consistente em relação aos polimorfismos entre
populações de Lippia alba, novos estudos com uma boa amostragem devem ser
realizados, explorando o máximo de regiões de onde os acessos tenham origem.
49
21
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
g
h
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
e
f
a
b
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
c
d
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
i
j
Cariogramas dos acessos LaCat (a e b) e LaGua (c e d),
LaJF (e e f), LaRJ (g e h) e LaVC (i e j), respectivamente.
Com coloração seqüencial DAPI/Bandeamento C. N° 1- 15
= pares cromossômicos. Lavras, 2006.
FIGURA 9.
50
4.4 Mapeamento físico da heterocromatina em Lippia alba
A partir dos dados obtidos com as técnicas utilizadas nos cinco acessos de
Lippia alba, foi possível obter-se o padrão de distribuição da heterocromatina
nesta espécie.
Os idiogramas da Figura 10 representam o mapeamento de toda
heterocromatina (em termos quantitativos e qualitativos) observada no presente
trabalho.
Foi possível concluir que este padrão é pouco variável entre as populações
desta espécie e que a maior parte das variações com relação à presença ou
ausência de bandas está relacionada com a metodologia utilizada e não com a
presença de polimorfismos.
23
51
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
a
b
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
d
c
Idiogramas dos acessos LaCat (a e b) e LaGua (c e d), LaJF (e e
f), LaRJ (g e h) e LaVC (i e j), respectivamente Lavras, 2006.
Legenda: representação da coloração com DAPI (azul);
representação da coloração com CMA
3
(amarelo);
representação do bandeamento C (cinza); representação da
coloração com prata (Esfera azul indica os cromossomos com
RONs ativas). (“...Continuação...”)
FIGURA 10.
52
FIGURA 10. cont.
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
f
e
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
h
g
j
i
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15
53
4.5 Análise química, quimiotipos e número cromossômico em Lippia alba
Vários trabalhos têm mostrado que a ocorrência de quimiotipos é muito
comum entre plantas aromáticas e medicinais ( Zoghbi et al., 1998; Vale et al.,
1999; Ricciardi et al., 2000; Juliani Jr et al., 2002; Theis & Lerdau, 2003).
No entanto, a maior parte destes trabalhos está relacionada apenas com a
caracterização da composição química dos diferentes quimiotipos, havendo
poucos estudos que mostram a origem, genética ou ambiental, de tais variações
químicas.
Estudos recentes têm indicado que as variações químicas em Lippia alba
são devido a variações genotípicas entre os três quimiotipos de Lippia alba
(Tavares et al., 2005) e que tais quimiotipos apresentam números
cromossômicos diferentes (Pierre 2004). A partir das análises citogenéticas e
químicas realizadas em nosso trabalho, algumas considerações adicionais ao que
vêm sendo realizado neste sentido devem ser feitas.
Os resultados das análises dos componentes majoritários dos óleos
essenciais dos cinco acessos de L. alba estudados em nosso trabalho estão
descritos na Tabela 8. Nota-se que os acessos LaCat, LaJF e LaRJ apresentam o
citral (geranial + neral) como composto majoritário e que os acessos LaGua e
LaVC possuem o citral e o linalol.
54
TABELA 8. Componentes do óleo essencial obtido a partir de folhas de
cinco acessos de Lippia alba.
*TR= Tempo de retenção, %= porcentagem relativa.
Tais resultados, como observado por Tavares et al (2005), confirmam
que a diferença na composição do óleo essencial dos cinco acessos estudados
não se deve a fatores ambientais, uma vez que os diferentes acessos foram
cultivados sob as mesmas condições em nosso estudo. Se a variação fosse
apenas ambiental, tais acessos teriam de apresentar uma constituição química
semelhante e não divergente, como foi observado.
Por outro lado, resultados mostraram também que o número
cromossômico não está diretamente relacionado com quimiotipos específicos,
visto que todos os acessos apresentaram 2n=30. Segundo Pierre (2004),
quimitipos de Lippia alba contendo 2n=30 são ricos em citral, enquanto que
aqueles ricos em linalol são indivíduos mixoplóides. É possível que a autora não
tenha observado diferenças porque, naquele trabalho, somente um acesso de
cada quimiotipo foi utilizado. A partir de tais observações, pode-se inferir que
plantas desta espécie que contenham 2n=30 cromossomos apresentam diferenças
genotípicas entre si, que estão relacionadas com o controle da produção dos
componentes químicos. A fim de se investigar o controle genético de tais
variações, estudos populacionais com amostragem significativa devem ser
realizados.
ACESSOS
LaCat
LaGua
LaJF
LaRJ
LaVC
Componentes
TR*
%*
TR
%
TR
%
TR
%
TR
%
Linalol
-
-
13.25
46.82
-
-
-
-
13.25
38.33
Neral
18.36
32.87
18.37
19.47
18.37
38.38
18.36
38.86
18.37
21.48
Geranial
19.42
41.97
19.42
24.96
19.43
55.06
19.41
54.62
19.42
26.52
55
Tais descobertas ajudariam muito no direcionamento de formas
adequadas de aumento da produção dos diferentes compostos que possam ser
obtidos a partir dessa espécie.
56
5 CONCLUSÕES
O citótipo com 2n=30 cromossomos de Lippia alba é rico em
heterocromatina constitutiva, apresentando blocos centroméricos e teloméricos.
Grande parte da heterocromatina constitutiva é rica em bases adenina e
timina. A espécie apresenta variação no número de bandas e na quantidade de
heterocromatina, entre os diferentes acessos.
Quimicamente, este citótipo apresenta variações qualitativas e
quantitativas, cujo ambiente parece não ter grande influência.
O número cromossômico não está diretamente relacionado com a
variação química.
57
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