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André Otavio Peres Protzek
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção
de insulina e distribuição de células β no
pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
Brasília
2009
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Universidade de Brasília
Faculdade de Medicina
Programa de Pós-Graduação em Ciências Médicas
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e
distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego
frugívoro Artibeus lituratus
André Otavio Peres Protzek
Dissertação a ser apresentada ao Programa
de Pós-Graduação em Ciências Médicas da
Universidade de Brasília, como requisito
para obtenção de Título de Mestre em
Ciências Médicas.
Orientação: Profa. Dra. Eliana de Cássia Pinheiro
Brasília
2009
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“A confusão é o começo de uma nova realidade”.
(Richard Bandler)
Agradecimentos
Agradeço sobretudo a vida, pela intriga, beleza e possibilidades que se apresentaram.
Também à Profª Drª Eliana de Cássia Pinheiro, por inicialmente me aceitar como
membro de sua equipe e posteriormente como seu aluno, por me mostrar à beleza e o prazer
na fisiologia comparada, na elaboração de um artigo cientifico e por me abrir os horizontes
da vida acadêmica.
Aos meus pais Sergio Reinaldo Protzek e Mariza Alice Beletti Peres Protzek, por me
incentivar e apoiar incondicionalmente em todos os momentos, as conversas e amizade
neste processo impar.
A meu irmão Julio Vinícius, por estar sempre ao meu lado e ser um exemplo de professor e
amigo.
A companheira Fernanda Duarte, pelo incentivo e amizade neste processo, as noites de
estudo e os ensinamentos de nutrição.
Ao amigo Alex Rafacho, pela colaboração nos experimentos, discussão dos resultados e
pelo incentivo no caminho da ciência.
Às amigas Carolinne Isabella Dias Gomes e Joicy Queiroz pelo ensino do manejo de
animais, coleta no campo, realização de experimentos e companheirismo.
Ao Prof. Dr. Carlos Alberto Gonçalves pelas diversas contribuições no conhecimento de
estatística, metodologia e ensino.
Ao Prof. Dr. José Roberto Bosqueiro, que participou como colaborador desta pesquisa e
cedeu o laboratório de Fisiologia do Pâncreas Endócrino da UNESP-Bauru para a
realização de experimentos, sem o qual este trabalho não poderia se feito.
Agradecimentos
Ao Prof. Dr. Antônio Carlos Boschero, que gentilmente cedeu o laboratório de Pâncreas
Endócrino e Metabolismo do Depto. de Fisiologia e Biofísica da UNICAMP para a
realização de experimentos e agradeço pela colaboração em discutir os resultados.
A todos os professores do Dpt. de Ciências Médicas, em especial ao Prof. Dr. Leopoldo
Luiz dos Santos Neto, pelas valiosas sugestões, e especialmente pela confiança e amizade;
e também aos funcionários da pós-graduação Alessandro e Daniele pela presteza e
colaboração.
Ao Sr. André Salles e à Roche Diagnóstica Brasil Ltda., por fornecer as fitas para o
glicosímetro, material indispensável para a realização deste trabalho.
Aos colegas do Laboratório Integrado, Profs. Drs. Alzira Rosa e Silva e Vanner Boere;
também aos amigos Valter, Ingrid, Danielle, Gustavo, Anderson e a todos que
contribuíram para a fase experimental deste estudo.
A todos os colegas do laboratório de Pâncreas Endócrino e Metabolismo da UNICAMP e
do laboratório de Fisiologia do Pâncreas Endócrino da UNESP-Bauru, que de alguma
forma colaboraram para a realização dos experimentos, em especial à Julia, Danilo, Ana
Paula e Ricardo por terem me acolhido com tanta presteza e pela colaboração nos
experimentos.
À Universidade de Brasília (UnB), à Universidade Julio de Mesquita filho (UNESP-Bauru),
à Universidade Estadual de Campinas (Unicamp) e a Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (CAPES), que possibilitaram e execução deste trabalho.
E a todos que embora não mencionados, contribuíram de alguma forma para a realização
deste trabalho.
Muito obrigado!
i
Protzek, André Otavio Peres Protzek.
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β
no pâncreas endócrino do morcego frugívoro Artibeus lituratus.
viii +62p.
1 – Artibeus lituratus
2 – Insulina
3 – Glicose
4 – Célula β
ii
Índice
ÍNDICE
Índice de figuras.............................................................................................................iv
Índice de tabelas .............................................................................................................v
Lista de abreviaturas.......................................................................................................vi
Resumo..........................................................................................................................vii
Abstract..........................................................................................................................viii
Introdução.......................................................................................................................01
Pâncreas endócrino.............................................................................................01
Mecanismo de secreção de insulina...................................................................02
Receptor de insulina...........................................................................................03
Substrato receptor de insulina............................................................................04
PI3-quinase e proteína quinase B (PKB/Akt)....................................................05
Influência de macronutrientes ou substratos da dieta na secreção hormonal e
ativação de vias metabólicas..............................................................................07
Justificativa....................................................................................................................10
Objetivos Gerais.............................................................................................................11
Específicos.........................................................................................................11
Materiais e métodos.......................................................................................................12
Área de estudo....................................................................................................12
Animais..............................................................................................................12
Teste de Tolerância à Glicose intraperitoneal (ipGTT).....................................14
Teste de Tolerância à Insulina intraperitoneal (ipITT) .....................................15
Insulina plasmática ...........................................................................................15
Secreção in vitro de insulina .............................................................................16
Imunocitoquímica para células β.......................................................................17
Quantificação e fosforilação da Akt por “Western Blot” .................................17
Análise Estatística.............................................................................................18
iii
Resultados .....................................................................................................................19
Discussão e conclusões..................................................................................................25
Referências bibiliográficas.............................................................................................28
Anexos............................................................................................................................37
iv
Índice
Índice de figuras
Figura A: Esquema simplificado do mecanismo de secreção de insulina.....................03
Figura B: Representação simplificada da via de sinalização da insulina nas células....04
Figura C: Ativação da PI3K..........................................................................................06
Figura D: Artibeus lituratus .........................................................................................12
Figura E: Determinação da glicemia a partir de sangue obtido da veia da asa, procedimento
utilizado nos ipGTT e ipITT ........................................................................................14
Figura 1: Teste de tolerância a Glicose (ipGTT) .........................................................19
Figura 2: Teste de Tolerância a Insulina (ipITT)..........................................................20
Figura 3: Concentrações plasmáticas de insulina .........................................................21
Figura 4: Secreção in vitro de insulina .........................................................................21
Figura 5: Fotomicrografia de ilhotas de A. lituratus ....................................................23
Figura 6: Imunobloting para fosforilação da proteína Akt ...........................................24
v
Índice
Índice de tabelas
Tabela 1: Resumo das ações da Akt em tecidos insulino-sensíveis..............................07
Tabela 2: Glicemia e insulinemia .................................................................................21
vi
Lista de abreviações
Lista de abreviações
ADP......................................................................................................... adenosina di-fosfato
ANOVA....................................................................................................análise de Variância
ATP ........................................................................................................ adenosina tri-fosfato
Ca
2+
..........................................................................................................................Íon Cálcio
EPM .......................................................................................................erro Padrão da Média
g/Kg .............................................................................................................grama/ kilograma
GLUT 2...........................................................................................transportador de glicose 2
GLUT4............................................................................................transportador de glicose 4
ipGTT ...................................................................teste de tolerância à glicose intraperitoneal
ipITT ...................................................................teste de tolerância à insulina intraperitoneal
IR ..............................................................................................................receptor de insulina
IRS ........................................................................................substratos receptores de insulina
m.c. ...................................................................................................................massa corporal
mg/dL.......................................................................................................miligramas/ decilitro
mMol ...........................................................................................................................milimol
PDK-1 .....................................................................quinase 1 depende te de fosfatidilinositol
PH ........................................................................................................pleckstream homology
PI3K ..............................................................................................fosfatidilinositol 3-quinase
PIP2 .............................................................................................fosfatidilinositol 3,4-fosfato
PIP3 ..........................................................................................fosfatidilinositol 3,4,5-fosfato
PKB/Akt ..............................................................................PI3-quinase e proteína quinase B
Rab ..................................................................................................GTPase activating protein
SGLT1................................................................................cotransportador de sódio e glicose
SH2..................................................................................................................homologia Src2
U/kg…………………………………………………………......….unidades por quilograma
vii
Resumo
Resumo
O morcego frugívoro Artibeus lituratus absorve grandes quantidades de glicose em curtos
períodos de tempo, além de mantém a normoglicemia, mesmo após prolongado período de
jejum. Com base nesses dados, nosso objetivo foi investigar diversos aspectos relacionados
à homeostase da glicose: concentrações plasmáticas de glicose e insulina; teste
intraperitoneal de tolerância à glicose e à insulina (ipGTT e ipITT), secreção de insulina em
fragmentos de pâncreas estimulados por glicose (2,8, 5,6 ou 8,3 mM), distribuição das
células β nas ilhotas pancreáticas, e conteúdo e atividade da pAkt/Akt no músculo peitoral e
fígado do morcego frugívoro Artibeus lituratus. A glicose plasmática de morcegos
alimentados foi superior a de morcegos jejuados, enquanto que os níveis de insulina foram
semelhantes em ambas às condições. Os valores da área sob curva obtida a partir do ipGTT
foram significativamente mais elevados quando os morcegos receberam 2 ou 3g/ kg m.c. de
glicose em comparação com o controle (salina). Estes morcegos também apresentaram um
decréscimo significativo dos valores de glicose no sangue após a administração de insulina
durante o ipITT. A secreção de insulina a partir de fragmentos de pâncreas estimulados por
concentrações fisiológicas de glicose (5,6 ou 8,3 mM) foi semelhante, mas superior à
secreção induzida por 2,8 mM de glicose. A. Lituratus apresentou grande quantidade de
células β distribuídas não apenas na região central da ilhota pancreática. A fosforilação de
Akt induzida por insulina foi superior no músculo peitoral em relação ao fígado. A alta
sensibilidade à glicose e à insulina, a intensa secreção de insulina em resposta à glicose e a
grande população de células β podem representar adaptações que garantem o controle
apropriado da homeostase glicêmica nesta espécie, constantemente submetida a um grande
influxo de glicose, proveniente de sua dieta rica em carboidratos.
Palavras-chave: Artibeus lituratus; morcego frugívoro; insulina; glicose; células-β
viii
Abstract
Abstract
The fruit bat Artibeus lituratus absorbs large amounts of glucose in short periods of time
and maintains normoglycemia even after a prolonged starvation period. Based on these
data, we aimed to investigate various aspects related with glucose homeostasis analyzing:
blood glucose and insulin levels, intraperitoneal glucose and insulin tolerance tests (ipGTT
and ipITT), glucose-stimulated insulin secretion (2.8, 5.6 or 8.3 mM glucose) in pancreas
fragments, cellular distribution of β cells, and the amount of pAkt/Akt in the pectoral
muscle and liver. Blood glucose levels were higher in fed bats than fasted bats, whereas
insulin levels were similar in both conditions. The values of the area-under-curve obtained
from ipGTT were significantly higher when bats received 2 or 3 g/ kg b.w. compared with
control (saline). These bats also exhibited a significant decrease of blood glucose values
after insulin administration during the ipITT. Insulin secretion from fragments of pancreas
under physiological concentrations of glucose (5.6 or 8.3 mM) was similar but higher than
in 2.8 mM glucose. These bats showed a marked islet distribution along the pancreas, and
the pancreatic β cells are not exclusively located at the central part of the islet. The insulin-
induced Akt phosphorylation was more pronounced in the pectoral muscle, compared to
liver. The high sensitivity to glucose and insulin, the proper insulin response to glucose,
and the large β-cell population could represent benefits for the management of high influx
of glucose from a carbohydrate-rich meal, which permits appropriate glucose utilization.
Keywords: Artibeus lituratus; Fruit bat; Insulin action; Insulin and glucose sensitivity;
Islets and β-cell distribution
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
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1
Introdução
A manutenção da normoglicemia em mamíferos é fundamental para o
metabolismo de tecidos que utilizam a glicose como fonte primordial para seus
requerimentos energéticos, tais como o sistema nervoso e medula renal (Nordlie et al.,
1999; Yeo and Sawdon, 2007), independentemente do estado (absortivo, pós-absortivo ou
jejum). A manutenção da glicemia necessita da interação precisa entre o sistema nervoso,
pâncreas, tecido hepático, muscular e adiposo. Esses tecidos são essenciais para o
fornecimento e a captação de glicose (Tirone and Brunicardi, 2001), através da ativação de
vias metabólicas específicas, como as responsáveis pela estocagem de macronutrientes
oriundos da dieta ou mobilização das reservas corporais.
O tipo de dieta pode modular as diferentes vias metabólicas (Felig, 1979), de tal
forma que, no geral, o padrão metabólico do estado alimentado é distinto quando se ingere
dieta rica em carboidrato ou rica em proteína (Beardsall et al., 2006).
O estado nutricional também influencia a ativação das vias metabólicas (Yeo and
Sawdon, 2007), sendo que, no estado alimentado a glicogenogênese é a principal via
metabólica envolvida na homeostase glicêmica e, durante o jejum, a neoglicogênese e
glicogenólise predominam (Beardsall et al., 2006).
Outro importante modulador da homeostase glicêmica é a ação hormonal, que
controla tanto a captação como a produção de glicose (Beardsall et al., 2006; Klover and
Mooney, 2004). O Pâncreas Endócrino, representado pelas Ilhotas de Langerhans tem
papel fundamental no fluxo de substratos, tanto no estado alimentado, quando a insulina é
secretada, como no jejum, quando o glucagon é o hormônio mais atuante.
Pâncreas Endócrino
As Ilhotas de Langerhans representam de 1 a 2% da massa total do pâncreas em
humanos e são essenciais para o metabolismo energético. Cada Ilhota é composta
predominantemente por células β, que sintetizam e secretam insulina, e células α que
sintetizam e secretam glucagon (Cabrera et al., 2006).
A insulina, um hormônio polipeptídico anabólico tem ação especial no tecido
muscular, hepático e adiposo. É secretada, principalmente, em resposta à elevação da
concentração plasmática de nutrientes, primordialmente a glicose. Desta forma, em um
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organismo sadio a normoglicemia é orquestrada pelo ajuste entre a secreção e as ações da
insulina, sendo a glicose plasmática o principal substrato regulador do processo secretório
(Deeney et al., 2000; Rutter, 2001). Os efeitos metabólicos imediatos da insulina incluem:
aumento da captação de glicose em tecido muscular e adiposo; aumento da oxidação de
glicose; elevação da síntese de proteínas, de ácidos graxos e de glicogênio; inibição da
lipólise, da proteólise, da neoglicogênese (via supressão da produção hepática de glicose) e
da glicogenólise. A insulina, portanto, estimula a utilização e armazenamento do excedente
de substratos energéticos. Outras ações da insulina, a médio e longo prazo, envolvem a
expressão gênica, a proliferação e diferenciação celular, o aumento da produção de óxido
nítrico no endotélio, a prevenção de apoptose ou morte celular e promoção da sobrevida da
célula (Beadrsall et al., 2006; Beardsall et al., 2006; Bernal-Mizrachi et al., 2001; Cabrera
et al., 2006; Yeo and Sawdon, 2007; Zecchin et al., 2004).
Mecanismo de Secreção de Insulina
A secreção de insulina é estimulada pela degradação de diversos substratos
energéticos que podem ser metabolizados pela célula β, sendo a glicose seu principal
secretagogo. O processo secretório é iniciado com o influxo de glicose para a célula β
através de transportadores de membrana do tipo GLUT2. No interior da célula β, a glicose é
fosforilada e convertida em glicose-6-fosfato (G-6-P) por meio das enzimas hexoquinase I e
hexoquinase IV (glicoquinase). A glicoquinase atua na regulação do fluxo pela via
glicolítica e, desta forma, na secreção de insulina, desempenhado papel de sensor de glicose
na célula β (Boschero, 1996). A G-6-P é completamente oxidada, gerando, finalmente,
ATP, promovendo elevação da razão ATP/ADP, o que leva ao fechamento dos canais de
potássio sensíveis a ATP (K
ATP
). Este evento promove a despolarização da membrana
plasmática da célula β e a abertura dos canais de Ca
2+
voltagem-dependentes, com
conseqüente influxo deste íon e ativação da maquinaria secretora, com a migração dos
grânulos contendo insulina para a membrana plasmática e posterior extrusão de seu
conteúdo (Figura A). Embora a glicose seja o principal secretagogo da insulina, este
processo pode ser modulado por outros substratos energéticos como aminoácidos e ácidos
graxos livres, além de hormônios e neurotransmissores. A célula β secreta insulina em
quantidade e tempo adequados, regulando finamente os níveis de substratos energéticos
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presentes no sangue, frente a diferentes condições fisiológicas, como jejum, alimentado,
gravidez, exercício e crescimento (Boschero, 1996).
Figura A. Esquema simplificado do mecanismo de secreção de insulina: a entrada e metabolização
da glicose na célula β induzem o fechamento dos canais de K
+
, a despolarização e abertura de
canais de Ca
2+
voltagem-dependentes na membrana da célula e conseqüente secreção de insulina.
Receptor de insulina
A insulina desempenha seu papel fisiológico após o acoplamento com receptores de
membrana presentes em quase todos os tecidos. O receptor de insulina é uma proteína
heterotetramérica composta por duas subunidades α, localizadas na porção extracelular, e
duas subunidades β transmembrânicas ligadas por pontes dissulfeto e com atividade
tirosina-quinase (Kahn, 1985). O receptor de insulina atua como uma enzima alostérica na
qual as subunidades α apresentam o sítios de ligação para a insulina e possuem atividade
inibitória sobre as subunidades β. O acoplamento da insulina com as subunidades α
promove alteração conformacional e autofosforilação do receptor nas subunidades β em
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diversos resíduos de tirosina (1158, 1162 e 1163) elevando sua atividade quinase (Patti and
Kahn, 1998; White et al., 1984) (Figura B).
Figura B. Via de sinalização da insulina nas células. A insulina liga-se ao seu receptor específico,
ativando a atividade tirosina quinase intrínseca do mesmo, o que resulta na fosforilação de
substratos intracelulares como IRS (substrato receptor de insulina). Os IRS, por sua vez, interagem
com várias moléculas sinalizadoras contendo domínios SH2 (homologia Src 2) como a PI3K
(fosfatidilinositol 3-quinase).
A PI3K é mediadora das principais ações metabólicas da
insulina via efetores “downstream” como a proteína Akt (proteína quinase B). A
fosforilação
de PIP2 (fosfatidilinositol 3,4-fosfato) produzindo PIP3 (fosfatidilinositol 3,4,5-fosfato) induz a
fosforilação da Akt, assim também como a ativação da PDK-1 (quinase 1 depende te de
fosfatidilinositol). A Akt inibe, via fosforilação, a proteína AS160 possibilitando que proteínas Rab
(“GTPase activating protein”) atuem no tráfego de vesículas do transportador de glicose dependente
de insulina GLUT4.
Substratos receptores de insulina
A autofosforilação das subunidades β do receptor de insulina promove uma cascata
de fosforilação no resíduo tirosina de diversos substratos protéicos. Até o momento, já
foram identificados dez substratos do receptor de insulina, sendo quatro destes pertencentes
à família dos substratos do receptor de insulina, as proteínas IRS. Quando fosforilados os
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IRS ativam sítios de reconhecimento para moléculas contendo domínios SH2, como a
fosfatidilinositol 3-quinase (PI3-K) (Zecchin et al., 2004). A PI3K é mediadora das
principais ações metabólicas da insulina via efetores “downstream” como a proteína Akt
(proteína quinase B).
PI3-quinase e proteína quinase B (PKB/Akt)
A PI3-quinase apresenta forte influência na modulação da mitogênese, na
diferenciação celular e no transporte de glicose estimulado por insulina (Zecchin et al.,
2004) e é, em princípio, a única molécula intracelular considerada essencial para a captação
de glicose (Czech and Corvera, 1999). A PI3-quinase é uma proteína dimérica, composta
por uma subunidade regulatória (p85) e uma subunidade catalítica (p110) (Zecchin et al.,
2004). A interação dos sítios fosforilados do IRS com o domínio SH2 da subunidade p85
da PI3-quinase, ativa o domínio catalítico da subunidade p110 (Figura C). Ocorre então, a
catalisação e fosforilação dos fosfoinositídios na posição 3 do anel do inositol, produzindo
fosfatidilinositol 3-fosfato, fosfatidilinositol 3,4-fosfato e fosfatidilinositol 3,4,5-fosfato
(Zecchin et al., 2004). Este último interage com domínios PH (“pleckstream homology”) de
diversas moléculas sinalizadoras, modulando sua atividade e localização subcelular
(Lietzke et al., 2000). Uma das enzimas reguladas por fosfatidilinositol 3,4,5-fosfato é a
PDK-1 (“phosphoinositide-dependent kinase 1”), uma serina/treonina quinase que fosforila
e ativa outra serina/treonina quinase, a Akt ou PKB (Zecchin et al., 2004). Esta ativação
ocorre devido a interação do domínio PH da Akt com o fosfatidilinositol 3,4,5-fosfato,
promovendo a migração da Akt para a membrana celular, assim como sua atividade
catalítica.
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Figura C. A interação dos sítios fosforilados do IRS com o domínio SH2 da subunidade p85 da PI3-
quinase, ativa o domínio catalítico da subunidade p110. Ocorre então, a catalisação e fosforilação
dos fosfatidilinositol 3,4-fosfato em fosfatidilinositol 3,4,5-fosfato.
Em mamíferos, a Akt foi observada em três isoformas: Akt1 (PKBa), Akt2
(PKBb) e Akt3 (PKBg), que se distribuem diferentemente nos tecidos (Vanhaesebroeck and
Alessi, 2000). A isoforma Akt1 encontra-se amplamente distribuída nos diversos tecidos,
Akt2 apresenta expressão nos tecidos muscular, hepático e adiposo e a Akt3 é
predominantemente expressada nos testículos e no cérebro (Zdychova and Komers, 2005).
Quando ativada, a Akt catalisa reações de fosforilação de substratos de diversas vias
metabólicas (Whiteman et al., 2002), como estimulação da captação de glicose (via
GLUT4). Recentemente, uma proteína fosforilada pela Akt, a AS160 foi associada à
translocação de GLUT4 em tecido muscular e adiposo. Essa proteína apresenta um domínio
GAP (“GTPase activating protein”) específico para proteínas reguladoras do tráfego de
vesículas, as proteínas Rab (“GTPase activating protein”) (Watson and Pessin, 2007).
Assim, quando ativada pela Akt, a AS160 pode alterar sua localização celular e sofrer
modificações conformacionais que inibem o domínio GAP, permitindo, assim, a conversão
de Rabs em suas formas ativas (GTP-loaded), induzindo o tráfego e exocitose de vesículas
de GLUT4 para a membrana plasmática. Desta forma o domínio GAP da AS160 é, em
parte, responsável pela retenção intracelular das vesículas de GLUT4 (Figura 2), regulando
negativamente uma ou mais isoformas de Rab na ausência da insulina (Watson and Pessin,
2007). Por outro lado, quando inibida, a Akt promove diminuição parcial do transporte de
GLUT4 estimulado por insulina em células musculares e adiposas (Hill et al., 1999).
PIP2
PIP3
p85 p110
P
P
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A Tabela 1 apresenta uma síntese das ações da Akt em tecidos sensíveis à insulina
(Cho et al., 2001; Downward, 1998; Whiteman et al., 2002; Zecchin et al., 2004)
.
Tabela 1. Resumo das ações da Akt em tecidos insulino-sensíveis (adaptado de Whiteman
et al., 2002).
Pâncreas Fígado Músculo Adipócito
↑ Massa de células B ↓ Gliconeogênese ↑ Captação de glicose
↑ Captação de glicose
↑ Secreção de insulina
↑ Glicogenogênese ↑ Glicogênese ↑ Síntese protéica
↓ Apoptose celular ↓ Glicogenólise ↑ Síntese protéica ↑ Lipogênese
↑ Lipogenese ↓ Lipólise
Influência de macronutrientes ou substratos da dieta na secreção hormonal e
ativação de vias metabólicas
Os macronutrientes presentes na alimentação podem induzir a secreção de
hormônios que modulam a atividade das vias metabólicas.
O consumo de uma dieta rica em carboidratos promove a elevação inicial da
glicemia, o que estimula a secreção de insulina, que promove a captação de glicose, sua
utilização como fonte energética e a síntese de glicogênio, proteínas e lipídios (Yeo and
Sawdon, 2007).
Por outro lado, o consumo de uma dieta rica em proteínas promove a elevação da
concentração plasmática de aminoácidos que, inicialmente, estimulam a secreção de
glucagon, cujas ações serão potencializadas pela menor concentração de insulina e de
glicose plasmáticas. O glucagon promove, principalmente, a ativação da neoglicogênese
hepática, aumentando a produção de glicose a partir dos aminoácidos provenientes da dieta.
A ativação desta via resulta, posteriormente, em elevação na glicemia, o que, por sua vez,
promove modesta secreção de insulina, se comparada a animais com dietas ricas em
carboidrato (Kettelhut et al., 1980).
Quando submetidos ao jejum, tanto animais com dietas ricas em carboidrato quanto
dietas ricas em proteína, apresentam ativação da glicogenólise e da neoglicogênese, em
resposta à secreção de glucagon e outros hiperglicemiantes, resultando na manutenção da
glicemia (Beadrsall et al., 2006; Kettelhut et al., 1980). Ressalte-se que a maior parte dos
animais com dietas ricas em proteína são mais resistentes à privação alimentar, devido à
maior atividade neoglicogenética, já presente no período absortivo, e que se mantém alta
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durante o jejum (Kettelhut et al., 1980).De qualquer forma, independentemente do tipo de
dieta ingerida, a neoglicogênese a partir dos aminoácidos, agora provenientes das proteínas
corporais, é uma via fundamental para a manutenção da glicemia durante o jejum (Gazola
et al., 2007).
Diferentemente do esperado para a maior parte dos animais que se alimentam com
dietas ricas em proteína, o morcego hematófago Desmodus rotundus apresenta pouca
resistência ao jejum (Freitas et al., 2003), morrendo após 2 ou 3 dias consecutivos de
privação alimentar (Altrigham, 1996). Esta susceptibilidade à privação alimentar parece,
em parte, estar associada às pequenas reservas corporais de glicogênio e lipídios observadas
neste morcego (Freitas et al., 2003).
Por outro lado, o morcego frugívoro Artibeus lituratus, que possui uma dieta
muito rica em carboidratos, apresenta maior resistência ao jejum que o morcego
hematófago Desmodus rotundus (Pinheiro et al., 2006). Esse fato deve-se, possivelmente,
às grandes reservas de glicogênio hepático e à ativação da neoglicogênese hepática,
associadas à mobilização dos elevados estoques de gordura da carcaça (Pinheiro, 1995).
Assim, quando A. lituratus é submetido ao jejum de até 6 dias ocorre uma queda de cerca
de 40-50% na glicemia, porém, esta se mantém dentro do limites compatíveis com a vida
para mamíferos (aproximadamente 50 mg/dL)
(Pinheiro et al., 2006).
O morcego frugívoro A. lituratus, pertencente à família Phyllostomidae,
submfamília Stenodermatinae, apresenta um amplo espectro de distribuição, sendo
encontrado do México até o Norte da Argentina, Bolívia, Pequenas Antilhas, Ilhas Três
Marias e em todas as regiões do Brasil (Simmons et al., 2005). É uma das espécies mais
conhecidas no Brasil devido à sua abundância, com presença destacada em ambientes
urbanos (Reis et al., 2007). Embora a alimentação seja predominantemente frugívora, essa
espécie também se alimenta de insetos, folhas, flores, pólen e néctar. Um estudo conduzido
na região Sul do Brasil demonstrou que a dieta frugívora de A. lituratus representa 80-88%
do total de itens alimentares, demonstrando a importância dos frutos para esta espécie
(Passos e Graciolli, 2004). A preferência por frutos, associada ao comportamento de retirá-
los da planta mãe e levá-los a um abrigo para consumi-los torna este morcego um excelente
dispersor de semente de diversas espécies de plantas na região Neotropical, efetuando papel
importante na recuperação de florestas (Reis et al., 2007).
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
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Outra característica interessante de morcegos frugívoros é a elevada ingestão de
frutas a cada noite, consumindo o equivalente à sua própria massa corporal (Morrison,
1978; Van Der Westhuizen, 1976). Esse padrão alimentar poderia resultar em dois
problemas para esse animal: um aumento da carga, na forma de bolo alimentar, que
precisaria ser transportada e comprometeria o desempenho do animal durante o vôo; e uma
sobrecarga de glicose no plasma, que pode afetar negativamente tecidos independentes de
insulina.
Para evitar o sobrepeso durante o vôo, mostrou-se que morcegos frugívoros são
capazes de digerir e absorver refeições ricas em carboidratos de forma rápida e eficiente
(Craik and Markovich, 2000; Keegan, 1977), capacidade associada a adaptações especiais
na estrutura de seu trato-gastrintestinal (Keegan, 1977; Van Der Westhuizen, 1976). É
sabido que a maioria dos vertebrados possui transportadores intestinais de glicose do tipo
SGLT1, na membrana apical, e do tipo GLUT2, na membrana basolateral do enterócito
(Karasov and Diamond, 1988; Karasov and Hume, 1997). Recentemente, foi observado que
o morcego frugívoro Rousettus aegyptiacus era capaz de absorver a 3-O-metil-D-glicose,
um análogo da D-glicose, de forma extremamente rápida e que 55% da captação total de
glicose ocorria por via paracelular (Tracy et al., 2007). Recentemente, foi encontrado A.
lituratus um mecanismo semelhante de absorção de glicose, que contribui com cerca de
70% do transporte total de glicose. Esses achados sugerem que a absorção paracelular possa
ser um padrão geral entre morcegos frugívoros (Caviedes-Vidal et al., 2008; Caviedes-
Vidal et al., 2007).
No que se refere a morcegos frugívoros terem que lidar com uma sobrecarga de
glicose no plasma, proveniente da rápida absorção intestinal da mesma,sem apresentarem
grandes flutuações na glicemia, estudo feito por Michelmore et al., (1998) mostrou que o
morcego frugívoro Rousettus aegyptiacus apresenta uma porcentagem de Ilhotas/Volume
total do pâncreas de 9,1%, o que é muito superior ao observado para outras espécies de
mamíferos (1-2%). Assim, em termos gerais, esses animais parecem possuir, também, uma
maior quantidade de células β e α. Desta forma, as altas porcentagens de Ilhotas de
Langerhans e de células β e um possível aumento na capacidade de secreção de insulina,
façam parte das adaptações morfo-fisiológicas fundamentais para o controle da homeostase
glicêmica em morcegos frugívoros.
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
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Justificativa
Desde 1995 o Laboratório de Metabolismo Energético de Vertebrados, do
Departamento de Ciências Fisiológicas, da Universidade de Brasília tem se dedicado a
deslindar o padrão metabólico de diversas espécies de morcegos e seu comportamento
frente à restrição alimentar. Estes mamíferos têm se mostrado um modelo experimental
bastante interessante para o estudo do metabolismo energético por diversas razões, entre
elas a proximidade evolutiva em relação aos primatas, incluindo o homem, além da grande
diversidade de hábitos alimentares apresentada por esses animais, fazendo deles uma
ferramenta muito valiosa no estudo das adaptações metabólicas aos vários tipos de dieta e
suas respostas à privação alimentar.
Uma das espécies estudadas nesse Laboratório foi o morcego frugívoro Artibeus
lituratus, que possui uma dieta muito rica em carboidratos e precisa lidar, a cada refeição,
com uma sobrecarga de glicose, que deve ser rapidamente absorvida e estocada, para que
não haja grandes flutuações na glicemia.
Sabendo-se que, em dietas ricas em carboidratos, a insulina é o principal
hormônio secretado no estado alimentado, decidimos investigar se A. lituratus também
apresenta um pâncreas endócrino adaptado à grande sobrecarga de glicose e uma maior
sensibilidade tecidual à insulina. Os resultados obtidos por Pinheiro et al. (2006) de que A.
lituratus possui grandes estoques de glicogênio e lipídios, apontam fortemente para uma
grande atuação da insulina nesses animais.
Nossa hipótese é a de que Artibeus lituratus seja capaz de lidar com uma
sobrecarga de glicose por apresentar elevada quantidade de células β, elevada secreção de
insulina e grande sensibilidade a este hormônio em tecidos periféricos.
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
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Objetivos
Gerais
Avaliar em morcegos frugívoros da espécie Artibeus lituratus a resposta à uma
sobrecarga de glicose e insulina; a secreção e sensibilidade periférica à insulina; a
morfologia das ilhotas pancreáticas e a distribuição da célula β; e a secreção in vitro de
insulina.
Específicos
- Avaliar em animais jejuados o comportamento da glicemia aos 30, 60, 90 e 120
minutos após a injeção de uma sobrecarga de glicose durante um Teste de Tolerância à
Glicose (ipGTT);
- Avaliar em animais alimentados o comportamento da glicemia aos 15, 30 45 e
60 minutos após a injeção de insulina durante um Teste de Tolerância à Insulina (ipITT);
- Avaliar a secreção de insulina in vitro por fragmentos de pâncreas estimulados
por glicose;
- Determinar a distribuição das células β nas Ilhotas de Langerhans;
- Determinar a sensibilidade periférica à insulina através de medida da quantidade
total e do índice de fosforilação da enzima Akt/pAkt em tecido muscular e hepático.
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
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Material e Métodos
Área de estudo
A área de estudo compreendeu a área urbana do Distrito Federal, região centro-
oeste do Brasil. As coletas foram realizadas no Plano Piloto do Distrito Federal, Brasília
(15º46’47” S, 47º55’47” W)
, visto que diversos abrigos da espécie Artibeus lituratus são
encontrados em áreas urbanas (Reis et al., 2007), mais especificamente estruturas de
concreto, habitando mais freqüentemente telhados, vãos e juntas de dilatação de edifícios.
Todas as coletas foram realizadas com autorização do IBAMA (Licença n
o
14867-2) e pelo
Comitê de Ética no Uso Animal (CEUA) do Instituto de Ciências Biológicas da
Universidade de Brasília (processo nº 8151/2008).
Animais
Morcegos frugívoros adultos machos (n=40) e fêmeas (n=31) (não prenhes e não
lactantes), da espécie Artibeus lituratus (Figura D), com 50-90 g de massa corporal foram
capturados com redes de neblina (7x3m) armadas próximas a árvores frutíferas, entre
19h00min e 04h00min. Todas as coletas foram realizadas entre Janeiro de 2008 e Fevereiro
de 2009.
Figura D. Um espécime de Artibeus lituratus macho (foto de André Protzek).
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
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Após as coletas, os animais foram mantidos em biotério (Departamento de Ciências
Fisiológicas, IB, UnB), em gaiolas individuais (25x30x45cm) adaptadas à sua posição de
repouso, no escuro e à temperatura ambiente.
Para adaptação dos morcegos ao cativeiro, foram oferecidas aos animais frutas
(banana, mamão e maça) entre 1900h e 0700h e água ad libitum em bebedouros durante
cinco noites antes da realização de experimentos. A alimentação em cativeiro foi baseada
na dieta natural de A. lituratus e seguiu a metodologia utilizada por Pinheiro (1995).
Nos experimentos com 24h de jejum, os morcegos foram mantidos apenas com
água ad libitum. Os experimentos tinham início sempre às 08h00min. Quando necessária, a
eutanásia foi realizado por deslocamento cervical seguido de guilhotinagem.
Para as dosagens plasmáticas, o sangue do tronco foi coletado em tubos
heparinizados, posteriormente centrifugados (2500rpm /4 min - Combate, Celm) e o
plasma obtido foi congelado a -20 º C para determinações posteriores. Para as
determinações teciduais, amostras foram rapidamente retiradas após decapitação e
mantidas em gelo para processamento imediatamente posterior.
Para as determinações realizadas no Laboratório do Pâncreas Endócrino, do
Departamento de Biologia, Universidade Estadual Julio de Mesquita Filho (UNESP –
Bauru) e no Laboratório de Pâncreas Endócrino e
Metabolismo, Departamento de
Fisiologia e Biofísica, Universidade de Campinas (Unicamp), os animais foram
transportados via terrestre e novamente adaptados ao cativeiro por antes dos experimentos.
A manipulação dos animais, bem como dos tecidos e do sangue dos mesmos foi
feita de acordo com todas as normas de higiene e segurança, incluindo as vacinações
antitetânica e anti-rábica prévias dos pesquisadores envolvidos. Após a vacinação anti-
rábica, foi realizada a titulação para determinação da quantidade de anticorpos para o vírus
da raiva e somente membros da equipe imunizados (após confirmação do teste sorológico)
puderam participar dos experimentos.
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Artibeus lituratus
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Procedimentos experimentais
Teste de Tolerância à Glicose intraperitoneal (ipGTT)
As determinações das glicemias, tanto para o ipGTT, quanto para o ipITT foram
realizadas com a utilização de glicosímetro portátil Accu Chek Active (Roche®) (r=0,997),
a partir de amostras de sangue obtidas da veia da asa (Figura E).
Para a realização do ipGTT, morcegos jejuados por 12h tiveram a glicemia
determinada no tempo zero (T0) e, em seguida, receberam injeção intraperitoneal (0,5
mL) de glicose nas concentrações de 2g/kg ou 3g/Kg de massa corporal (GLU2 e GLU3,
respectivamente) ou salina (0,9%) (SAL). Após 30, 60, 90 e 120 minutos (T30, T60, T90 e
T120, respectivamente) da injeção de glicose foram coletadas amostras de sangue dos
animais (n=17) para determinação da curva de decaimento da glicose circulante. O grupo
SAL (n=14) recebeu injeção intraperitoneal (0,5 mL) exclusivamente de solução veículo
(salina 0,9%) e foi submetido aos mesmos procedimentos que o grupo que recebeu glicose.
Fig E. Obtenção de sangue após punção da veia da asa, procedimento utilizado nos Testes de
Tolerância à Glicose (ipGTT) e à Insulina (ipITT). (Foto de André Protzek).
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
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Teste de Tolerância à Insulina intraperitoneal (ipITT)
Após a realização do ipGTT, os animais foram realimentados por três noites
consecutivas e, na manhã posterior à terceira noite de alimentação foram submetidos ao
ipITT.
Para a realização do ipITT, morcegos alimentados tiveram a glicemia determinada
no tempo zero (T0) e, em seguida, receberam injeção intraperitoneal (0,5 mL) de insulina
(INS) regular Humulin® (0,56 U/kg massa corporal) ou salina (0,9%) (SAL). Após 15, 30,
45 e 60 minutos (T15, T30, T45 e T60, respectivamente) da injeção de insulina foram
coletadas amostras de sangue dos animais (n=17) para determinação da curva de
decaimento da glicose circulante, similar ao descrito para o ipGTT. O grupo SAL (n=17)
recebeu injeção intraperitoneal (0,5 mL) de salina (0,9%)
e foi submetido aos mesmos
procedimentos que o grupo que recebeu glicose.
Insulina plasmática
Para a determinação da insulina plasmática, animais alimentados (ALM) (n=5) e
jejuados por 24h (J24) (n=9) foram sacrificados por deslocamento cervical, sucedido por
decapitação. Em seguida, o sangue foi coletado, a partir de punção cardíaca e do tronco, em
tubos de ensaio, posteriormente centrifugados (2500rpm/4 min) para a separação do plasma
(centrífuga Combate, Celm). A insulina plasmática foi determinada por radioimunoensaio,
onde alíquotas do plasma foram diluídas 10, 20 e 40x. Do volume final obtido de cada
diluição foi retirado 1mL, aos quais foram adicionados 200 µL de insulina marcada (
125
Iodo
a 10 COM/µL) e 100 µL de anticorpo anti-insulina (8 µL/100mL) em solução de tampão
radioativo (Novo Nordisk Biolabs). As amostras foram incubadas por 48 horas a 4ºC. Após
esse período, receberam uma solução de carvão Norit A, sendo centrifugadas (2600rpm/20
min) na mesma temperatura. Após aspiração do sobrenadante, foi feita a leitura da
radioatividade (
125
Iodo) em contador gama (Contador Gamma 5500, Beckman Instruments
INC). Os resultados foram expressos ng/ mL.
As determinações de insulina plasmática foram feitas no Laboratório de Pâncreas
Endócrino e Metabolismo do Departamento de Fisiologia e Biofísica, IB, da Universidade
de Campinas - Unicamp, coordenado pelo Prof. Dr. Antonio Carlos Boschero.
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
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Secreção in vitro de insulina
A secreção in vitro de insulina foi avaliada em fragmentos de pâncreas obtidos de
morcegos alimentados (n=9). Os animais foram sacrificados por deslocamento cervical e, a
seguir, tiveram o pâncreas rapidamente removido e colocado em becker contendo tampão
Hanks gelado, pH 7.4, previamente gaseado com uma mistura de CO
2
/O
2
(5/95%). O
pâncreas foi, então, picotado em fragmentos de, aproximadamente, 10 mg cada, que foram
distribuídos igualmente em 36 poços e pré-incubados com 0,8 mL de glicose 5,6 mM a
37°C por 30 min. Posteriormente, o sobrenadante foi aspirado e os poços contendo os
fragmentos de pâncreas foram, então, subdivididos em três grupos experimentais, com seis
poços cada um. Cada grupo experimental foi incubado a 37°C por 60 min, com meio
contendo tampão Hanks e concentrações variáveis de glicose, a saber:
Grupo 1: 1 mL de glicose 2,8 mM;
Grupo 2: 1 mL de glicose 5,6 mM;
Grupo 3: 1 mL de glicose 8,3 mM;
Durante as incubações, os fragmentos foram colocados em meio contendo 2% de
trasylol, para evitar a degradação enzimática das proteínas. Após a incubação, procedeu-se
ao radioimunoensaio, onde alíquotas do meio de incubação foram diluídas 10, 20 e 40x. Do
volume final obtido de cada diluição foi retirado 1mL, ao qual foram adicionados 200 µL
de insulina marcada (
125
Iodo a 10 COM/µL) e 100 µL de anticorpo anti-insulina (8
µL/100mL, em solução de tampão radioativo (Novo Nordisk Biolabs). As amostras foram,
novamente, incubadas por 48 horas a 4ºC. Após esse período, receberam uma solução de
carvão Norit A, e foram centrifugadas (2600rpm/20 min) na mesma temperatura. O
sobrenadante foi aspirado e a leitura da radioatividade (
125
Iodo) foi realizada em contador
gama (Contador Gamma 5500, Beckman Instruments INC). Os resultados foram expressos
pela proporção de insulina secretada/insulina total contida nos fragmentos de pâncreas.
Os experimentos de secreção de insulina in vitro foram realizados nos laboratórios
de Pâncreas Endócrino do Departamento de Biologia, Universidade Estadual Julio de
Mesquita Filho - UNESP-Bauru sob orientação dos Professores José Roberto Bosqueiro e
Alex Rafacho, e de Pâncreas Endócrino e Metabolismo do Departamento de Fisiologia e
Biofísica da Universidade Estadual de Campinas-Unicamp, sob coordenação do Prof. Dr.
Antonio Carlos Boschero.
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
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Imunocitoquímica para células β
Para o estudo de aspectos morfológicos e a massa das células β, os pâncreas de três
morcegos alimentados foram coletados e fixados por imersão em Bouin por 4 h,
desidratados e embebidos em parafina. Em intervalos de 250 µm, três secções em série
(5µm) foram obtidas em micrótomo rotativo e aderidas em lâminas silanizadas individuais.
A primeira secção de cada série foi corada com Tricrômicro de Gömori (Bancroft and
Stevens, 1990) para realização de análise morfológica e estereológica. A segunda e terceira
secção foi corada pelo método de imunoperoxidase para insulina para observação da
distribuição das células β.
Quantificação e fosforilação da Akt por “Western Blot”
Para a quantificação e verificação da fosforilação da proteína Akt, morcegos
alimentados receberam injeção intraperitoneal (0,5 mL) de salina (0,9%) ou insulina (0,56
U/kg massa corporal). Os animais foram, então, sacrificados por deslocamento cervical
após cinco minutos da injeção de salina (SAL) (n=3) ou após cinco (n=3) ou 15 minutos
(n=3) da injeção de insulina (INS5 e INS15, respectivamente). A expressão das proteínas
foi avaliada pela técnica de “Western blot” em fragmentos de fígado e músculo de
aproximadamente 200 mg, homogeneizados (Politron PTA 20S, Brinkmann Instrumental
model PT 10/35) por 30s em solução Hanks. Os extratos obtidos foram centrifugados a
15.000 rpm/45 min a 4 °C em centrífuga refrigerada (5804R Eppendorf) para remoção do
material insolúvel. Alíquotas do sobrenadante foram utilizadas para a medida da
concentração protéica, utilizando a metodologia de Bradford. As amostras foram, então,
tratadas com tampão Laemmli contendo DDT 10 mM e aquecidas em água fervente por 5
min. O volume das amostras foi ajustado (Multiskan EX-Labsystems) para que alíquotas
com 150 µg de proteína fossem aplicadas em gel de SDS-PAGE (10% Tris acrilamida) em
aparelho minigel (Miniprotean- BioRad), em paralelo com marcadores com pesos
moleculares conhecidos. Após a corrida, as proteínas foram transferidas para membrana de
nitrocelulose, que foi incubada por 2h em solução bloqueadora (solução de albumina
bovina a 5%) para diminuir a ligação inespecífica das proteínas. A seguir, as membranas
foram incubadas com anticorpo policlonal anti-Akt (Serina 473) (Santa Cruz
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
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Biotechnology) na diluição 1:1000, por 4 horas. Posteriormente, as membranas foram
incubadas com o anticorpo secundário conjugado com HRP (Sigma), na diluição 1:500, por
2h. Após lavagem com solução basal (NaCl 150mM, Trisma Base 10mM, Tween 20 a
0,02%), as membranas foram incubadas em solução reveladora Super Signal (Pierce) e
colocadas junto a filmes radiográficos (Kodak) para auto-radiografia. A intensidade e
quantificação das bandas foi avaliada por densitometria pelo programa Scion Image (Scion
Corporation).
Os experimentos de quantificação e fosforilação protéica foram realizados no
laboratório de Pâncreas Endócrino, do Departamento de Biologia, da
Universidade Estadual
Julio de Mesquita Filho - UNESP-Bauru, sob orientação dos Professores José Roberto
Bosqueiro e Alex Rafacho.
Análise Estatística
Inicialmente, todos os dados foram testados quanto aos perfis das distribuições das
médias e das variâncias. Para verificar se as médias seguiam uma distribuição normal foi
utilizado o teste de Kolmogorov-Smirnov; para checar a homogeneidade das variâncias
(homocedasticidade) foi utilizado os teste de Brown-Forsythe. Caso as médias não
seguissem uma distribuição normal e houvesse uma violação importante da
homocedasticidade (p<0,01), testes não-paramétricos foram eleitos para a continuação da
análise dos dados. Para GTT, ITT e secreção in vitro de insulina foi utilizado o teste
paramétrico de ANOVA de medidas repetidas, seguido, segundo o caso, do teste post-hoc
de Bonferroni. Na análise da insulina plasmática e da proteína (Akt e pAkt) foi utilizado o
teste t de Student não paramétrico. Para todos os testes foi utilizado um α (índice de
significância) de 5%.
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
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Resultados
Teste de Tolerância à Glicose intraperitoneal (ipGTT)
Não foram observadas diferenças significativas comparando-se o T0 dos diferentes
tratamentos (GLU3, GLU2 e SAL)
(figura 1A). De forma semelhante, não foram
observadas diferenças significativas entre T0, T30, T60, T90 e T120 nos grupos SAL e
GLU2 (Figura 1A). Também não foi observada diferença comparando-se cada um dos
tempos dos grupos SAL e GLU2 (Figura 1A). Entretanto, para o grupo GLU3 houve
aumento significativo da glicemia em T30, que se manteve até T60 e voltou para valores
próximos a T0 em T90 (figura 1A). Os valores da Área Abaixo da Curva (AAC) durante o
ipGTT indicam diferença significativa comparando a AAC do grupo SAL com os grupos
GLU2 e GLU3 (figura 1B).
Figura 1. (A) Glicose circulante de A. Lituratus jejuados por 12h submetidos ao Teste de Tolerância
à Glicose intraperitoneal (ipGTT). A glicemia foi determinada nos tempos zero (T0) antes da
injeção de glicose 2 (GLU2) ou 3 (GLU3) mg/Kg de massa corporal ou salina (0.9%) e após 30, 60,
90 e 120 min (T30, T60, T90 e T120, respectivamente) da injeção (0,5 mL). (B) Área Abaixo da
Curva durante ipGTT. Os valores dos grupos SAL (n=14), GLU2 (n=17) e GLU3 (n=17)
representam a Média ± EPM. * indica p<0,05 comparado a T0; # indica p<0,05 comparado ao
grupo SAL; & indica p<0,05 comparado ao grupo GLU2.
Teste de Tolerância à Insulina intraperitoneal (ipITT)
0 30 60 90 120
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
&
&
#
&
GLU3
GLU2
SAL
#
#
*
*
Glicemia (mg/dL)
(min)
SA
L
GL
U
2
GL
U
3
--
0
2000
4000
6000
8000
10000
#
#
AAC (mg/dL min
-1
)
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
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Não foram observadas diferenças significativas comparando-se T0 para os grupos
INS e SAL (Figura 2). De forma semelhante, não foram observadas diferenças
significativas entre T0, T15, T30, T45 e T60 no grupo SAL (figura 2). Entretanto, o grupo
INS apresentou redução rápida e acentuada da glicemia no em T15 comparado a T0, sendo
que tal redução se manteve em T30, T45 e T60, que foram diferentes, também, comparados
aos mesmos tempos no grupo SAL (Figura 2).
Figura 2. Glicose circulante de A. Lituratus alimentados submetidos ao Teste de Tolerância à
Insulina intraperitoneal (ipITT). A glicemia foi determinada nos tempos zero (T0) antes da injeção
de insulina (0,56 U/kg massa corporal) ou salina (0.9%) e após 15, 30, 45 e 60 min (T15, T30, T45
e T60, respectivamente) da injeção (0,5 mL). Os valores dos grupos SAL (n=17) e INS (n=17)
representam a Média ± EPM. * indica p<0,05 comparado a T0. # indica p<0,05 comparado ao
grupo SAL.
Insulinemia e glicemia
Embora a glicemia de animais jejuados (J24) tenha sido significativamente menor
quando comparada a animais alimentados (ALM) (Tabela 2), não foi observada diferença
significativa na insulinemia entre os grupos ALM e J24 (figura 3).
0 15 30 45 60
30
40
50
60
70
80
90
100
110
#
#
#
#
*
*
*
*
SAL
INS
Glicemia (mg/dL)
(min)
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
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Tabela 2. Concentrações plasmáticas de insulina e glicose em A. lituratus alimentados (n=9) e
jejuados (n=5) por 24 h (ALM e J24, respectivamente). Os valores representam a Média ± EPM. *
indica p<0,05 comparando-se ao grupo alimentado (ALM).
Fig 3. Concentrações plasmáticas de insulina em A. lituratus alimentados (n=9) e jejuados (n=5) por
24 h (ALM e J24, respectivamente). As colunas e as barras verticais representam, respectivamente,
a Média ± EPM.
Secreção in vitro de insulina por fragmentos de pâncreas estimulados glicose
Fragmento de pâncreas incubados em meio contendo concentração basal de glicose
(2.8 mMol) secretaram, aproximadamente, 16% do conteúdo total de insulina presente nos
fragmentos (Figura 4). Quando incubados em meio contendo 5,6 mMol de glicose os
fragmentos secretaram 29% do conteúdo total (1,8 vezes), valor significativamente superior
ao observado com 2,8 mMol (Figura 4). A estimulação com 8,3 mMol de glicose provocou
aumento da secreção de insulina de 100%, valor significativamente superior quando
comparado aos resultados obtidos com 2,8 mMol de glicose (Figura 4).
ALM J24
Glicemia (mg/dL)
124 ± 9
72 ± 15 *
Insulinemia (ng/mL)
1,64 ± 0,5 1,26 ± 0,07
ALM J24
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Insulina plasmática (ng/mL)
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
________________________________________________________________________________________________ Protzek A. O. P.
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Figura 4. Secreção in vitro de insulina por fragmentos de pâncreas de A. lituratus estimulados com
2,8 (n=3), 5,6 (n=3) e 8,3 mMol (n=3) de glicose. As colunas e as barras verticais representam a
Média±EPM. * Indica p<0,05 comparando-se com a concentração 2,8 mM.
Distribuição das células β pancreáticas em pâncreas de A. lituratus
Com a finalidade de identificar e descrever a distribuição de células β pancreáticas
foi realizada a imunocoloração para insulina em secções do pâncreas de A. lituratus. A
Figura 8A mostra uma visão panorâmica da secção histológica do pâncreas. Podemos
observar que o tecido endócrino é bem distribuído através da secção, havendo uma
pronunciada densidade de Ilhotas de Langerhans (número de ilhotas) por todo o pâncreas
(Figura 8A e B). Na amplificação de 40 × podemos observar a forma genérica das ilhotas
pancreáticas (Figura 8C). Geralmente, as maiores ilhotas apresentaram diferentes formas
(redonda, oval e outras irregulares) e parece que as células β não se localizam
exclusivamente no centro da ilhota (Figura 8C, setas longas). Pelo contrário, é comum
observar uma distribuição preferencial na periferia das ilhotas (Figuras 5D-5G).
Finalmente, grupo de células β, possivelmente representando Ilhotas, foram observadas ao
longo de todo o pâncreas (Figura 8C – setas curtas).
2.8 5.6 8.3
0
5
10
15
20
25
30
35
*
*
secreção de insulina
(% do conteúdo do fragmento)
Glicose (mMol)
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Artibeus lituratus
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Figura 5. Fotomicrografia do pâncreas de A. lituratus com imunocitoquímica para células β,
produtoras de insulina. (A) vista panorâmica, (B) distribuição dos aglomerados de células β
(ilhotas), (C) sugestão de formatos e tamanhos diversificados das ilhotase (D, E, F e G) e
localização das células β nas ilhotas.
A sinalização intracelular de insulina no fígado e músculo peitoral
Não houve alterações significativas no conteúdo total da proteína Akt no fígado ou
ou músculo peitoral dos grupos SAL, INS5 ou INS15 (Figura 6). Entretanto, a fosforilação
da proteína Akt em tecido muscular foi significativamente superior nos grupos INS5 e
INS15 comparados ao grupo SAL (Figura 6A). Em relação ao fígado, o grupo INS5 não
apresentou elevação da fosforilação da Akt comparado ao grupo SAL, enquanto que o
grupo INS15 apresentou aumento da fosforilação comparado ao grupo SAL (Figura 6B).
Insulina
A
B
C
D
E
G
F
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
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Fig 6. Immunoblotting para quantificação da proteína Akt e Akt fosforilada (pAkt) em tecido
hepático e músculo peitoral após 5 minutos da injeção de salina (SAL) e insulina (INS5) ou 15
minutos da injeção de insulina (INS15). n=3 por grupo. * Indica p<0,05 na comparação com o
grupo SAL.
SAL INS5 INS15
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
*
*
Expressão da proteína pAkt
1/2/3
(aumento comparado à SAL)
SAL INS5 INS15
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
*
Expressão da proteína pAkt
1/2/3
(aumento comparado à SAL)
Músculo peitoral Fígado
B
A
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Artibeus lituratus
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Discussão e Conclusões
O morcego frugívoro Artibeus lituratus no estado alimentado possui glicemia
similar ao encontrado para todos os mamíferos na mesma condição alimentar. Além disso,
é capaz de manter a normoglicemia, mesmo após seis dias de jejum, possivelmente devido
ao elevado conteúdo de glicogênio hepático e à ativação da neoglicogênese hepática
(Pinheiro et al., 2006).
Morcegos frugívoros são conhecidos pela capacidade de absorver uma grande
quantidade de carboidratos provenientes da dieta de forma rápida e eficiente. Essa
capacidade está ligada a adaptações especiais em seu aparelho digestivo, entre elas destaca-
se uma elevada absorção paracelular de glicose no trato gastro-intestinal, observada tanto
em Rousettus aegyptiacus como em Artibeus lituratus.
Outro aspecto interessante de morcegos frugívoros é a sua capacidade de lidar
com um grande influxo de carboidratos provenientes da dieta, sem apresentar grandes
alterações na sua glicemia. Essa capacidade está, possivelmente, associada ao elevado
número de Ilhotas de Langerhans observadas em Rousettus aegyptiacus (Caviedes-Vidal et
al., 2008; Caviedes-Vidal et al., 2007; Tracy et al., 2007).
Essa relativa facilidade em lidar com uma sobrecarga de glicose no plasma
também pode ser verificada em nosso trabalho com o morcego frugívoro Artibeus lituratus.
Em nosso estudo pudemos observar que, durante o ipGTT, somente a administração de 3
g/kg de glicose foi capaz de provocar um aumento significativo das concentrações de
glicose plasmática. Estes resultados sugerem que A. lituratus apresenta uma captação
eficiente de glicose, notadamente pelos tecidos insulino-sensíveis, o que poderia ser
resultado de um rápido aumento na secreção de insulina e eficiência nas suas ações. O
rápido restabelecimento dos níveis de glicose sanguínea observado durante o ipGTT reforça
a hipótese de uma elevada tolerância à glicose de A. lituratus, reforçando uma elevada
capacidade de manter o controle glicêmico, mesmo após uma refeição rica em carboidratos.
Esses resultados, ainda, corroboram os elevados estoques de glicogênio hepático
encontrados nesta espécie (Pinheiro et al., 2006).
Nossa hipótese de que este morcego teria grande sensibilidade à insulina foi
reforçada pelos resultados obtidos durante o ipITT, onde a administração de uma
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Artibeus lituratus
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quantidade reduzida de insulina (0,56 U/kg), comparado com a dosagem utilizada em
camundongos (1 U/Kg) (Fujiwara et al., 2007) e ratos (2 U/Kg) (Rafacho et al., 2007),
provocou acentuada diminuição dos níveis de glicose no sangue. Esta grande sensibilidade
à insulina foi raramente observada, destacando-se um estudo feito com camundongos com
ausência de receptor de vasopressina V1b, que apresentavam hipersensibilidade à insulina
(Fujiwara et al., 2007).
Nossos resultados de insulinemia mostraram que apenas camundongos
(Fujiwara et al., 2007) e seres humanos obesos idosos (Yassine et al., 2009) apresentaram
concentrações circulantes de insulina durante o jejum,menores do que nosso modelo
animal. Mais marcante, no entanto, é o fato de que não observamos diferença significativa
nos níveis séricos de insulina entre animais jejuados e alimentados, sugerindo que a
quantidade de insulina presente no jejum poderia já ser suficiente para lidar com uma
quantidade de glicose presente em uma refeição regular. Outra possibilidade é a de que uma
refeição regular não promoveria um aumento de glicose circulante suficiente para estimular
a secreção de insulina e, conseqüentemente, elevar os níveis plasmáticos deste hormônio.
Os resultados do ipGTT mostrando que apenas quantidades elevadas de glicose são capazes
de provocar um aumento significativo na glicemia, reforça essa possibilidade. Não
podemos, no entanto, descartar a possibilidade de que um aumento na secreção de insulina
já tivesse ocorrido no período imediatamente posterior à ingestão da refeição rapidamente
absorvida. Desta forma, a impossibilidade de se detectar um aumento na insulinemia em
nossos experimentos pode ser devido ao intervalo de tempo entre a ingestão e coleta de
sangue, local de coleta ou, ainda, maior inativação de insulina durante sua primeira
passagem pelo fígado.
Quando analisamos a capacidade da glicose em estimular a secreção de insulina
em fragmentos de pâncreas de A. lituratus, observamos que, em concentrações basais de
glicose (2,8 mM), a quantidade de insulina secretada para o meio de incubação foi de cerca
de 16% do conteúdo total presente no fragmentos. Estes valores foram significativamente
superiores aos encontrados em humanos (Karam et al., 1974), ratos (Rafacho et al., 2009), e
camundongos (Ullrich et al., 2005), os quais, nas mesmas condições experimentais
secretam em torno de 1-2% do conteúdo total de insulina. Esses resultados reforçam nossa
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Artibeus lituratus
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hipótese de que o pâncreas de A. lituratus possuiria grande capacidade para produção e
secreção de insulina em resposta à glicose.
Ressaltando-se, inicialmente, que não há na literatura descrição prévia da
distribuição de células β pancreáticas em A. lituratus, nossos experimentos de
immunoblotting sugerem que o pâncreas desse morcego possui elevado número de Ilhotas
de Langerhans com formatos irregulares, um padrão muito semelhante ao observado no
morcego frugívoro R. aegyptiacus (Michelmore et al., 1998). Por outro lado, o padrão de
distribuição das células β nas ilhotas do A. lituratus parece diferir do encontrado em outros
mamíferos. Em nosso modelo animal, as células β parecem não estar localizadas
preferencialmente na região central da ilhota, um padrão diferente do observado em R.
aegyptiacus (Michelmore et al., 1998), roedores (Bani Sacchi & Bani, 1985; Cabrera et al.,
2006), humanos, primatas e porcos (Cabrera et al., 2006), onde as células β estão
localizados especialmente no centro da ilhota. A variação topográfica das células
pancreáticas entre as espécies pode refletir adaptações evolutivas de diferentes hábitos
alimentares ou outros condicionamentos ambientais (Cabrera et al., 2006).
Nossos experimentos de immunoblotting indicam que em A. lituratus a
sinalização da insulina no músculo esquelético parece ser mais eficaz do que no tecido
hepático, a julgar pela maior fosforilação da Akt após a administração de insulina. A
serina/treonina quinase Akt é uma proteína chave da via da insulina, com implicações
importantes na homeostase da glicose, crescimento celular, diferenciação e sobrevivência
celular (Cho et al., 2001; Downward, 1998; Schenck et al., 2008). A Akt quando fosforilada
induz à translocação de GLUT4 para a membrana plasmática (Watson and Pessin, 2007),
aumentando o influxo de glicose no tecido muscular e adiposo (Kido et al., 2001; Saltiel
and Kahn, 2001). Nossos resultados sugerem que o tecido muscular de A. lituratus não
somente responde à insulina, como sua via de sinalização é semelhante ao observado em
muitos vertebrados, como humanos (Holness et al., 2000), ratos (Rafacho et al., 2007),
camundongos (Hult et al., 2009) e peixes (Moon, 2001). Em relação à Akt hepática,
também observamos um aumento na sua fosforilação após a administração de insulina, o
que está de acordo com a capacidade da insulina em aumentar a fosforilação da Akt
hepática em outras espécies (Ropelle et al., 2009) e também com a capacidade do fígado
deste morcego em armazenar grandes estoques de glicogênio (Pinheiro et al., 2006).
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
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28
Em conclusão, do ponto de vista evolutivo, a alta sensibilidade à glicose e à
insulina e a grande população de células β observadas em morcegos frugívoros representam
adaptações que garantem o controle apropriado da homeostase glicêmica em Artibeus
lituratus, espécie constantemente submetida ao alto influxo de glicose proveniente de sua
dieta rica em carboidratos.
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________________________________________________________________________________________________ Protzek A. O. P.
29
Referências
ALTRIGHAM, J. D. Bats: biology and behavior. New York: Oxford University Press,
1996.
BANI SACCHI, T.; BANI, D. New views on the identification of the various cell types in
the pancreatic islets of the rat. An ultrastructural and morphometrical study. Acta Anat
(Basel), v. 122, n. 1, p. 1-17, 1985.
BEADRSALL, K.; YUEN, K.; WILLIANS, R.; DUNGER, D. Applied physiology of
glucose control. Curr. Paediatr., v. 56, p. 127-156, 2006.
BEARDSALL, K.; YUEN, K.; WILLIANS, R.; DUNGER, D. Applied physiology of
glucose control. Curr. Paediatr., v. 56, p. 127-156, 2006.
BERNAL-MIZRACHI, E.; WEN, W.; STAHLHUT, S.; WELLING, C. M.; PERMUTT,
M. A. Islet beta cell expression of constitutively active Akt1/PKB alpha induces striking
hypertrophy, hyperplasia, and hyperinsulinemia. J Clin Invest, v. 108, n. 11, p. 1631-8,
Dec 2001.
BOSCHERO, A. C. Acoplamento excitação-secreção nas células beta pancreáticas
(revisão). Arquivos Brasileiros de Endocrinologia e Metabologia, v. 40, p. 149-155,
1996.
CABRERA, O.; BERMAN, D. M.; KENYON, N. S.; RICORDI, C.; BERGGREN, P. O.;
CAICEDO, A. The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has implications for
islet cell function. Proc Natl Acad Sci U S A, v. 103, n. 7, p. 2334-9, Feb 14 2006.
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
________________________________________________________________________________________________ Protzek A. O. P.
30
CAVIEDES-VIDAL, E.; KARASOV, W. H.; CHEDIACK, J. G.; FASULO, V.; CRUZ-
NETO, A. P.; OTANI, L. Paracellular absorption: a bat breaks the mammal paradigm.
PLoS One, v. 3, n. 1, p. e1425, 2008.
CAVIEDES-VIDAL, E.; MCWHORTER, T. J.; LAVIN, S. R.; CHEDIACK, J. G.;
TRACY, C. R.; KARASOV, W. H. The digestive adaptation of flying vertebrates: high
intestinal paracellular absorption compensates for smaller guts. Proc Natl Acad Sci U S A,
v. 104, n. 48, p. 19132-7, Nov 27 2007.
CHO, H.; THORVALDSEN, J. L.; CHU, Q.; FENG, F.; BIRNBAUM, M. J.
Akt1/PKBalpha is required for normal growth but dispensable for maintenance of glucose
homeostasis in mice. J Biol Chem, v. 276, n. 42, p. 38349-52, Oct 19 2001.
CRAIK, J. D.; MARKOVICH, D. Rapid GLUT-1 mediated glucose transport in
erythrocytes from the grey-headed fruit bat (Pteropus poliocephalus). Comp Biochem
Physiol A Mol Integr Physiol, v. 126, n. 1, p. 45-55, May 2000.
CZECH, M. P.; CORVERA, S. Signaling mechanisms that regulate glucose transport. J
Biol Chem, v. 274, n. 4, p. 1865-8, Jan 22 1999.
DEENEY, J. T.; PRENTKI, M.; CORKEY, B. E. Metabolic control of beta-cell function.
Semin Cell Dev Biol, v. 11, n. 4, p. 267-75, Aug 2000.
DOWNWARD, J. Mechanisms and consequences of activation of protein kinase B/Akt.
Curr Opin Cell Biol, v. 10, n. 2, p. 262-7, Apr 1998.
FELIG, P. Starvation. New York: Grune and Stratton: 1979.
FREITAS, M. B.; WELKER, A. F.; MILLAN, S. F.; PINHEIRO, E. C. Metabolic
responses induced by fasting in the common vampire bat Desmodus rotundus. J Comp
Physiol B, v. 173, n. 8, p. 703-7, Nov 2003.
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
________________________________________________________________________________________________ Protzek A. O. P.
31
FUJIWARA, Y.; HIROYAMA, M.; SANBE, A.; AOYAGI, T.; BIRUMACHI, J.;
YAMAUCHI, J.; TSUJIMOTO, G.; TANOUE, A. Insulin hypersensitivity in mice lacking
the V1b vasopressin receptor. J Physiol, v. 584, n. Pt 1, p. 235-44, Oct 1 2007.
GAZOLA, V. A.; GARCIA, R. F.; HARTMANN, E. M.; BARRENA, H. C.;
ALBUQUERQUE, G. G.; SOUZA, H. M.; BAZOTTE, R. B. Glycemia recovery with oral
amino acid administration during experimental short-term insulin-induced hypoglycemia. J
Diabetes Complications, v. 21, n. 5, p. 320-5, Sep-Oct 2007.
GRACIOLLI G.; PASSOS F. Observação da dieta de Artibeus lituratus em duas áreas do
sul do Brasil. Revista Brasileira de Zoologia. 21 v. 3, 2004.
HILL, M. M.; CLARK, S. F.; TUCKER, D. F.; BIRNBAUM, M. J.; JAMES, D. E.;
MACAULAY, S. L. A role for protein kinase Bbeta/Akt2 in insulin-stimulated GLUT4
translocation in adipocytes. Mol Cell Biol, v. 19, n. 11, p. 7771-81, Nov 1999.
HOLNESS, M. J.; LANGDOWN, M. L.; SUGDEN, M. C. Early-life programming of
susceptibility to dysregulation of glucose metabolism and the development of Type 2
diabetes mellitus. Biochem J, v. 349 Pt 3, p. 657-65, Aug 1 2000.
HULT, M.; ORTSATER, H.; SCHUSTER, G.; GRAEDLER, F.; BECKERS, J.;
ADAMSKI, J.; PLONER, A.; JORNVALL, H.; BERGSTEN, P.; OPPERMANN, U. Short-
term glucocorticoid treatment increases insulin secretion in islets derived from lean mice
through multiple pathways and mechanisms. Mol Cell Endocrinol, v. 301, n. 1-2, p. 109-
16, Mar 25 2009.
KAHN, C. R. The molecular mechanism of insulin action. Annu Rev Med, v. 36, p. 429-
51, 1985.
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
________________________________________________________________________________________________ Protzek A. O. P.
32
KARAM, J. H.; GRODSKY, G. M.; CHING, K. N.; SCHMID, F.; BURRILL, K.;
FORSHAM, P. H. "Staircase" glucose stimulation of insulin secretion in obesity. Measure
of beta-cell sensitivity and capacity. Diabetes, v. 23, n. 9, p. 763-70, Sep 1974.
KARASOV, W. H.; DIAMOND, J. M. Interplay between physiology and ecology in
digestion. Bioscience, v. 36, p. 602-611, 1988.
KARASOV, W. H.; HUME, I. D. Vertebrate gastrointestinal system. Handbook of
Comparative Physiology W. Dantzler, 1997. 409-480
KEEGAN, D. J. Aspects of the assimilation of sugar by Rousettus aegyptiacus. Comp.
Biochem. Physiol., v. 58a, p. 349-352, 1977.
KETTELHUT, I. C.; FOSS, M. C.; MIGLIORINI, R. H. Glucose homeostasis in a
carnivorous animal (cat) and in rats fed a high-protein diet. Am J Physiol, v. 239, n. 5, p.
R437-44, Nov 1980.
KIDO, Y.; NAKAE, J.; ACCILI, D. Clinical review 125: The insulin receptor and its
cellular targets. J Clin Endocrinol Metab, v. 86, n. 3, p. 972-9, Mar 2001.
KLOVER, P. J.; MOONEY, R. A. Hepatocytes: critical for glucose homeostasis. Int J
Biochem Cell Biol, v. 36, n. 5, p. 753-8, May 2004.
LIETZKE, S. E.; BOSE, S.; CRONIN, T.; KLARLUND, J.; CHAWLA, A.; CZECH, M.
P.; LAMBRIGHT, D. G. Structural basis of 3-phosphoinositide recognition by pleckstrin
homology domains. Mol Cell, v. 6, n. 2, p. 385-94, Aug 2000.
MICHELMORE, A. J.; KEEGAN, D. J.; KRAMER, B. Immunocytochemical
identification of endocrine cells in the pancreas of the fruit bat, Rousettus aegyptiacus. Gen
Comp Endocrinol, v. 110, n. 3, p. 319-25, Jun 1998.
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
________________________________________________________________________________________________ Protzek A. O. P.
33
MOON, T. W. Glucose intolerance in teleost fish: fact or fiction? Comp Biochem Physiol
B Biochem Mol Biol, v. 129, n. 2-3, p. 243-9, Jun 2001.
MORRISON, W. Foraging Ecology and Energetics of the Frugivorous Bat Artibeus.
Ecological Society of America, v. 59, n. 4, p. 716-723, 1978.
NORDLIE, R. C.; FOSTER, J. D.; LANGE, A. J. Regulation of glucose production by the
liver. Annu Rev Nutr, v. 19, p. 379-406, 1999.
PATTI, M. E.; KAHN, C. R. The insulin receptor--a critical link in glucose homeostasis
and insulin action. J Basic Clin Physiol Pharmacol, v. 9, n. 2-4, p. 89-109, 1998.
PINHEIRO, E. C. Metabolismo Inermediário de morcegos frugívoros 1995. (Tese de
Doutorado). Tese de Doutorado apresentada à Universidade de São Paulo, Ribeirão Preto-
SP.
PINHEIRO, E. C.; TADDEI, V. A.; MIGLIORINI, R. H.; KETTELHUT, I. C. Effect of
fasting on carbohydrate metabolism in frugivorous bats (Artibeus lituratus and Artibeus
jamaicensis). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol, v. 143, n. 3, p. 279-84, Mar
2006.
RAFACHO, A.; CESTARI, T. M.; TABOGA, S. R.; BOSCHERO, A. C.; BOSQUEIRO, J.
R. High doses of dexamethasone induce increased beta-cell proliferation in pancreatic rat
islets. Am J Physiol Endocrinol Metab, v. 296, n. 4, p. E681-9, Apr 2009.
RAFACHO, A.; ROMA, L. P.; TABOGA, S. R.; BOSCHERO, A. C.; BOSQUEIRO, J. R.
Dexamethasone-induced insulin resistance is associated with increased connexin 36 mRNA
and protein expression in pancreatic rat islets. Can J Physiol Pharmacol, v. 85, n. 5, p.
536-45, May 2007.
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
________________________________________________________________________________________________ Protzek A. O. P.
34
REIS N.R.; PERACCHI A. L.; PEDRO W. A.; LIMA I. P. Morcegos do Brasil. Londrina.
2007.
ROPELLE, E. R.; PAULI, J. R.; CINTRA, D. E.; FREDERICO, M. J.; DE PINHO, R. A.;
VELLOSO, L. A.; DE SOUZA, C. T. Acute exercise modulates the Foxo1/PGC-1alpha
pathway in the liver of diet-induced obesity rats. J Physiol, v. 587, n. Pt 9, p. 2069-76, May
1 2009.
RUTTER, G. A. Nutrient-secretion coupling in the pancreatic islet beta-cell: recent
advances. Mol Aspects Med, v. 22, n. 6, p. 247-84, Dec 2001.
SALTIEL, A. R.; KAHN, C. R. Insulin signalling and the regulation of glucose and lipid
metabolism. Nature, v. 414, n. 6865, p. 799-806, Dec 13 2001.
SCHENCK, A.; GOTO-SILVA, L.; COLLINET, C.; RHINN, M.; GINER, A.;
HABERMANN, B.; BRAND, M.; ZERIAL, M. The endosomal protein Appl1 mediates
Akt substrate specificity and cell survival in vertebrate development. Cell, v. 133, n. 3, p.
486-97, May 2 2008.
SIMMONS N. B .Order chiroptera. In Wilson De Reeder. Mammal species of the world:
a taxonomic and geographic reference. 3 ed. v1. Baltimore. Johns hopkins university
press, 2005.
SPARGO, E.; PRATT, O. E.; DANIEL, P. M. Metabolic functions of skeletal muscles of
man, mammals, birds and fishes: a review. J R Soc Med, v. 72, n. 12, p. 921-5, Dec 1979.
TIRONE, T. A.; BRUNICARDI, F. C. Overview of glucose regulation. World J Surg, v.
25, n. 4, p. 461-7, Apr 2001.
TRACY, C. R.; MCWHORTER, T. J.; KORINE, C.; WOJCIECHOWSKI, M. S.;
PINSHOW, B.; KARASOV, W. H. Absorption of sugars in the Egyptian fruit bat
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
________________________________________________________________________________________________ Protzek A. O. P.
35
(Rousettus aegyptiacus): a paradox explained. J Exp Biol, v. 210, n. Pt 10, p. 1726-34,
May 2007.
ULLRICH, S.; BERCHTOLD, S.; RANTA, F.; SEEBOHM, G.; HENKE, G.; LUPESCU,
A.; MACK, A. F.; CHAO, C. M.; SU, J.; NITSCHKE, R.; ALEXANDER, D.;
FRIEDRICH, B.; WULFF, P.; KUHL, D.; LANG, F. Serum- and glucocorticoid-inducible
kinase 1 (SGK1) mediates glucocorticoid-induced inhibition of insulin secretion. Diabetes,
v. 54, n. 4, p. 1090-9, Apr 2005.
VAN DER WESTHUIZEN, J. The feeding pattern of the fruit bat Rousettus aegyptiacus. S.
Afr. J. Med. Sci., v. 41, p. 271-278, 1976.
VANHAESEBROECK, B.; ALESSI, D. R. The PI3K-PDK1 connection: more than just a
road to PKB. Biochem J, v. 346 Pt 3, p. 561-76, Mar 15 2000.
WATSON, R. T.; PESSIN, J. E. GLUT4 translocation: the last 200 nanometers. Cell
Signal, v. 19, n. 11, p. 2209-17, Nov 2007.
WHITE, M. F.; HARING, H. U.; KASUGA, M.; KAHN, C. R. Kinetic properties and sites
of autophosphorylation of the partially purified insulin receptor from hepatoma cells. J Biol
Chem, v. 259, n. 1, p. 255-64, Jan 10 1984.
WHITEMAN, E. L.; CHO, H.; BIRNBAUM, M. J. Role of Akt/protein kinase B in
metabolism. Trends Endocrinol Metab, v. 13, n. 10, p. 444-51, Dec 2002.
YASSINE, H. N.; MARCHETTI, C. M.; KRISHNAN, R. K.; VROBEL, T. R.;
GONZALEZ, F.; KIRWAN, J. P. Effects of exercise and caloric restriction on insulin
resistance and cardiometabolic risk factors in older obese adults--a randomized clinical
trial. J Gerontol A Biol Sci Med Sci, v. 64, n. 1, p. 90-5, Jan 2009.
Sensibilidade à insulina e à glicose, secreção de insulina e distribuição de células β no pâncreas endócrino do morcego frugívoro
Artibeus lituratus
________________________________________________________________________________________________ Protzek A. O. P.
36
YEO, R.; SAWDON, M. Hormonal regulation of metabolism: regulation of plasma
glucose. Anesth. Intens. Care. Med, v. 8, n. 7, p. 295-298, 2007.
ZDYCHOVA, J.; KOMERS, R. Emerging role of Akt kinase/protein kinase B signaling in
pathophysiology of diabetes and its complications. Physiol Res, v. 54, n. 1, p. 1-16, 2005.
ZECCHIN, H. G.; CARVALHEIRA, J. B. C.; SAAD, M. J. A. Mecanismos moleculares de
resisntência à insulina na síndrome metabólica. Rev. Soc. Cardiol. Estado de São Paulo,
v. 14, p. 574-589, 2004.
andre protzek <andreprotzek@gmail.com>
JEXBIO/2010/042507 Acknowledgemnt of Manuscript
Submission
1 mensagem
jeb@biologists.com <jeb@biologists.com> 15 de janeiro de 2010 19:26
Para: André Protzek <andreprotzek@gmail.com>
MS ID#: JEXBIO/2010/042507
MS TITLE: Insulin and glucose sensitivity, insulin secretion and &[beta]-cell distribution in endocrine pancreas of
fruit bat <I>Artibeus lituratus</I>
AUTHORS: André Protzek, Alex Rafacho, Bruno Viscelli, José Bosqueiro, Ana Cappelli, Flávia Paula, Antônio
Boschero, and Eliana Pinheiro
Dear Dr. Protzek
This is an automatic message acknowledging your online submission
to The Journal of Experimental Biology.
Thank you for your submission. We will be in touch again shortly.
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Editorial Staff
------------------------------
The Journal of Experimental Biology
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Bidder Building
140 Cowley Road
Cambridge, CB4 0DL
Phone:44 (0)1223 425525
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UK. Registered in England and Wales. Company Limited by Guarantee No. 514735. Registered Charity No.
277992
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1 de 1 23/2/2010 10:43
37
Insulin and glucose sensitivity, insulin secretion and -cell distribution in endocrine
pancreas of fruit bat Artibeus lituratus
Running title: Endocrine pancreas in A. lituratus
Protzek AOP
1
, Rafacho, A
2,3
, Viscelli BA
2
, Bosqueiro JR
2
, Cappelli AP
3
, de Paula FMM
3
,
Boschero AC
3
, Pinheiro EC
1
1
Department of Physiological Sciences, Institute of Biological Science, University of
Brasília, Brasília, DF, Brazil
2
Department of Physical Education, School of Sciences, UNESP – Univ. Estadual Paulista,
Bauru, SP, Brazil
3
Department of Anatomy, Cell Biology and Physiology and Biophysics, Institute of
Biology, UNICAMP - State University of Campinas, Campinas, SP, Brazil
38
Abstract
The fruit bat Artibeus lituratus absorbs large amounts of glucose in short periods of time
and maintains normoglycemia even after a prolonged starvation period. Based on these
data, we aimed to investigate various aspects related with glucose homeostasis analyzing:
blood glucose and insulin levels, intraperitoneal glucose and insulin tolerance tests (ipGTT
and ipITT), glucose-stimulated insulin secretion (2.8, 5.6 or 8.3 mM glucose) in pancreas
fragments, cellular distribution of
cells, and the amount of pAkt/Akt in the pectoral
muscle and liver. Blood glucose levels were higher in fed bats than fasted bats, whereas
insulin levels were similar in both conditions. The values of the area-under-curve obtained
from ipGTT were significantly higher when bats received 2 or 3 g/ kg b.w compared with
control (saline). These bats also exhibited a significant decrease of blood glucose values
after insulin administration during the ipITT. Insulin secretion from fragments of pancreas
under physiological concentrations of glucose (5.6 or 8.3 mM) was similar but higher than
in 2.8 mM glucose. These bats showed a marked islet distribution along the pancreas, and
the pancreatic
cells are not exclusively located at the central part of the islet. The insulin-
induced Akt phosphorylation was more pronounced in the pectoral muscle, compared to
liver. The high sensitivity to glucose and insulin, the proper insulin response to glucose,
and the large
-cell population could represent benefits for the management of high influx
of glucose from a carbohydrate-rich meal, which permits appropriate glucose utilization.
Keywords: Artibeus lituratus; Fruit bat; Insulin action; Insulin and glucose sensitivity;
Islets and
-cell distribution
39
Introduction
Fruit-eating bats are known to digest carbohydrate-rich meals rapidly (Keegan,
1977) and efficiently (Craik and Markovich, 2000). These properties are probably
associated with adaptations of structures in their gastrointestinal tract (Keegan, 1977; Van
Der Westhuizen, 1976).
Similar to most vertebrates, the fruit-eating bat Artibeus lituratus possesses
intestinal sugar transporters such as the Na
+
-coupled glucose transporter (SGLT1) in the
apical membrane and GLUT2 in the basolateral membrane (Karasov and Hume, 1997).
Rousettus aegyptiacus, another fruit-eating bat, also shows high paracellular absorption of
an analog of D-glucose, the 3-O-Methyl-D-glucose in its intestine that contributes at least
55% of total glucose uptake (Tracy et al., 2007). A similar mechanism was found in A.
lituratus that accounts for approximately 70% of total glucose transport, suggesting that
high paracellular absorption of carbohydrates may be a general pattern among frugivorous
bats (Caviedes-Vidal et al., 2008; Caviedes-Vidal et al., 2007). This mechanism must have
an important role considering that these bats have shorter intestinal tracts than similarly
sized non-flying mammals (Keegan and Modinger, 1979).
Besides the high intestinal absorptive capacity, some authors pointed to a
specialization of the endocrine pancreas of R. aegyptiacus as an additive mechanism to deal
with high glucose uptake (Keegan and Van Der Westhuizen, 1976). Although the
percentage of insulin (
), glucagon ( ) and somatostatin ( ) cells was similar to others
species, it is interesting that in R. aegyptiacus the endocrine pancreas represents 9.1% of
the total pancreas volume, far more than some other mammals (Michelmore et al., 1998).
Thus, it is conceivable to presume that the high absorptive capacity of carbohydrates,
associated to a high percentage of endocrine pancreas, are among the main morpho-
physiological adaptations to control glucose disposal in fruit-eating bats.
The aim of the present study was to investigate morpho-physiological aspects
related to the control of glucose homeostasis in the A. lituratus. We observed that these bats
have high glucose and insulin sensitivity, exhibit an adequate insulin secretion to post-
prandial glucose concentrations, a high number of islets, and higher insulin-induced Akt
phosphorylation in pectoral muscle than in liver. These physiological aspects account for an
appropriate glucose utilization in a carbohydrate-rich meal fed bat.
40
Materials e Methods
Materials
Human recombinant insulin (Biohulin® N) was acquired from Biobrás (Montes Claros,
MG, Brazil). The reagents used in the insulin secretion protocol and RIA were from
Mallinckrodt Baker, Inc. (Paris, Kentucky, France) and from Sigma (St. Louis, MO, USA).
The
125
I-labeled insulin (human recombinant) for radioimmunoassay (RIA) was purchased
from PerkinElmer (Waltham, MA, USA). SDS-PAGE and immunoblotting were performed
using Bio-Rad systems (Hercules, CA, USA) and all chemicals used were from Bio-Rad
(Hercules, CA, USA) and from Sigma (St. Louis, MO, USA). Anti insulin (rabbit
polyclonal), anti serine-threonine kinase (AKT) (rabbit polyclonal), and anti
phosphorylated AKT (Ser473) (pAKT) (rabbit polyclonal) were from Santa Cruz
Biotechnology (Santa Cruz, CA, USA).
Animals and study area
Adult A. lituratus (40 male e 31 female), weighing 50-90 g, were captured in urban areas of
Brasilia, DF, Brazil (15º46’47” S, 47º55’47” W). Bats were housed in cages in groups of
two, and maintained in the dark at room temperature. All bats were fed by fruits (papaya,
apple and banana) during five nights following the capture. Water was available ad libitum
and fruits were offered at 19:00 h and removed at 07:00 h the next morning. In the
experiments with 12 or 24h-fasted bats, the animals were only given water. Measurements
started at 08:00 h. When it was necessary, euthanasia was done by cervical dislocation
followed by guillotining. The free flowing blood was collected in saline-washed tubes,
centrifugated (10 min at 1500 rpm – 5810R Eppendorf) and serum was frozen at -20ºC for
posterior determination of insulinemia. In addition, tissue samples were rapidly removed
and kept on ice for posterior analyses.
Intraperitoneal glucose (ipGTT) and insulin tolerance test (ipITT)
The ipGTT 12h-fasted bats (F12) had blood samples collected from wing vein at the
following times: zero (T0) before i.p. glucose administration (2g/ Kg or 3g/ Kg b.w., 0.5
mL) and after 30, 60, 90 and 120 min (T30, T60, T90 and T120) of glucose load. The ipITT
41
fed bats had blood samples collected at the following times: zero (T0) before i.p. regular
human recombinant insulin administration (0.56 units/ Kg b.w., 0.5 mL) and after 15, 30,
45 and 60 min (T15, T30, T45 and T60) of insulin load. The control group received i.p.
saline administration (0.9%, 0.5 mL) and was submitted to the same procedures as ipGTT
and ipITT. In all groups blood glucose were determined with Accu Chek Active, Roche
(error < 1%).
Serum insulin levels
Serum insulin levels were determined in fed and 24h-fasted bats by RIA, using a Guinea-
Pig anti-rat insulin antibody and rat insulin as standard (Scott et al., 1981).
Cumulative static insulin secretion and pancreas insulin content
Cumulative static insulin secretion was done according to a previous publication (Rafacho
et al., 2008a) with modifications. Briefly, small pancreas fragments (∼2-3 mm∅) were first
incubated for 1 hour at 37ºC in 1 mL Krebs-bicarbonate buffer solution of the following
composition (in mM): 115 NaCl, 5 KCl, 2.56 CaCl, 1 MgCl
2
, 24 NaHCO
3
, 15 N-2-
hidroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid and 5.6 glucose, supplemented with 0.5%
of bovine serum albumin and equilibrated with a mixture of 95%O
2
: 5% carbon dioxide,
pH 7.4. The medium was then replaced with 1 mL fresh buffer containing the solutions,
2.8, 5.6 or 8.3 mM glucose, and further incubated for 1 hour. At the end of the incubation,
the samples were stored at
-
20ºC for subsequent measurement of insulin content by RIA.
During pre and incubation periods the medium also contained a mixture of anti-proteases
(Trazylol, 2%) to avoid insulin degradation by the exocrine enzymes. The insulin content in
the pancreas fragment of each well was also measured. For this purpose, the fragments
were transferred to an eppendorf, washed in Krebs-bicarbonate buffer solution with 2.8 mM
glucose, and the medium replaced with extraction solution (12 mM HCl in 70% ethanol).
Then, the fragments were sonicated for 15 seconds, maintained overnight at 4ºC,
centrifuged for 10 minutes at 3000 × g, and the supernatant was frozen at
-
20ºC for
posterior analysis of insulin content by RIA.
Protein extraction and immunoblotting for pAkt and Akt
42
Protein extraction and immunoblotting were carried out as previously reported (Rafacho et
al., 2009; Rafacho et al., 2008b) with modifications. Briefly, fed bats were killed after 5 or
15 min of insulin (0.56 units/ Kg b.w., 0.5 mL ) or saline (0.9% , 0.5 mL) administration.
Fragments of pectoral muscle or liver were obtained from the same anatomical area of each
bat and first homogenized in ice-cold cell lysis buffer (Cell Signaling) using a Polytron PT
1200C homogenizer (Brinkmann Instruments, NY, USA) (2 pulses of 15 s at the maximal
speed) and subsequently sonicated in a cell homogenizer (Fisher Scientific, Suwanee, GA,
USA) for 2 pulses of 15 s in the intermediate speed. Protein concentration from total cell
lysate was measured by the Bradford method, according to the manufacturer (Bio-Rad,
Hercules, CA, USA). For each experiment, 150
g of protein obtained from muscle and
hepatic tissue was used. Immunoblotting experiments were performed at least three times
using different samples (each sample consisting of tissue obtained from one bat). After 2 h
of blocking at room temperature (RT), membranes containing tissues lysates were washed
in Tris buffer salt Tween (TBST) and incubated overnight with the appropriate primary
antibodies. After washing in TBST, membranes were incubated with the appropriate
secondary antibody. Antibody binding was detected by enhanced SuperSignal® West Pico
Chemiluminescent Substrate (PIERCE, Rockford, IL, USA), as described by the
manufacturer.
Immunostaining for
cells
Three pancreases obtained from male adult bats A. Lituratus, were fixed in Bouin’s fixative
for 3 hours, dehydrated, and embedded in paraffin wax. The tissue was sectioned at 5
m
along the longitudinal axis of each pancreas. Cellular distribution of insulin was analysed
using a standard indirect immunoperoxidase method according to previous description
(Rafacho et al., 2008b).
Statistical analysis
Results are expressed as the means ± SEM of the indicated nunber (n) of
experiments. Analysis of variance (ANOVA two-way) was carried out for ipGTT and
ipITT with the use of Bonferroni post-hoc procedure for multiple comparisons.
Immunoblotting and static insulin secretion was analyzed by ANOVA one-way with the
43
use of Bonferroni post-hoc procedure for multiple comparisons. Serum insulin levels were
analized by unpaired Student’s t Test. The significant level adopted was P < 0.05.
Results
Serum insulin and peripheral sensitivity to glucose and insulin
Blood glucose values were 72 ± 15 mg/dL at the 24-h-fasted state and 124 ± 9 mg/dL at fed
state. Serum insulin levels in 24h-fasted and fed bats were similar. The values were 1.26 ±
0.07 and 1.64 ± 0.5 ng/mL for fasted and fed bats, respectively. To analyze the glucose
tolerance, two doses of glucose [2g (GLU2) or 3g/ kg b.w. (GLU3)] were administered
intraperitoneally, using saline solution as control (SAL). The glycemic values at T0 were
similar among SAL, GLU2 and GLU3 groups. Although a modest increment of blood
glucose was noticed at T30 in GLU2 vs. SAL, no statistical difference was found at this or
the other times (T60 and T90) between these groups (Fig. 1A). However, GLU3 bats
showed increased blood glucose levels in T30 (118.1 mg /dL ± 11.8) and T60 (104.3 mg
/dL ± 12.9) returning to basal levels at T90 (77.6 mg /dL ± 7.9), when compared to SAL
bats at the same intervals (P < 0.05; Fig. 1A). The are-under-the-glucose-curve (AUC)
revealed higher AUC values in GLU2 and GLU3 compared to SAL bats (Fig. 1B). We next
accessed the peripheral insulin sensitivity through an ipITT. At T0, blood glucose was
similar in both saline- (SAL) and insulin-receiving bats (INS). However, a marked
reduction in blood glucose levels were observed at T15, (42.0 mg /dL ± 3.3), T30 (42.3 mg
/dL ± 4.3), T45 ( 38.0 mg /dL ± 2.9), and T60 (46.1 mg /dL ± 4.1) compared to T0 (72.5
mg /dL ± 4.0) and also to SAL at the same intervals (P < 0.05; Fig. 1C). The data obtained
in the ipGTT and ipITT demonstrated a good sensitivity to glucose and insulin by these
bats.
Insulin secretion in pancreas fragments
To test whether this good response to glucose at periphery is associated with an appropriate
insulin release, we investigated the insulin secretion in pancreas fragments, submitted to
different glucose concentrations. At low glucose (2.8 mM), the insulin secretion
represented 16% of the total insulin content in the fragments. When fragments were
44
exposed to 5.6 mM glucose, an increment of 1.8 times in insulin secretion, compared to 2.8
mM glucose, was observed (P < 0.05, Fig. 2A and insert). At 8.3 mM glucose the insulin
secretion was also significantly higher than 2.8 mM glucose, but this increment in insulin
secretion was similar to that observed at 5.6 mM (Fig. 2A and insert).
Distribution of
cells in the pancreas of Artibeus lituratus
To the best of our knowledge, there is no previous description of the
cells distribution in
A. lituratus pancreas. Thus, we performed an immunostaining for insulin in pancreas
sections to observe the distribution of pancreatic
cells in this specie. Figure 3A shows a
panoramic view of a histological section of pancreas from A. lituratus immunostained for
insulin. The exocrine tissue is well distributed along the pancreas and, noteworthy is the
marked islet density (islet number) that were observed in the whole pancreas (Figs. 3A,B).
Figure 3C shows the general shape of pancreatic islets. In general, the big islets exhibited
different shapes (round, oval and other irregular shapes) and the pancreatic
cells did not
preferentially localize at the center of the islets (Fig. 3C, arrows). Rather, it is common to
observe the presence of
cells at the periphery of the islets (Figs. 3D-G). Finally, small
islets or group of
cells were commonly observed along the pancreas section (Fig. 3C –
arrowheads).
Total and phosphorylated levels of Akt in pectoral muscle and liver
The serine-threonine kinase Akt plays an important role in insulin-responsive cells and is
one of the central kinases of the insulin pathway. Good glucose tolerance with modest
glucose-stimulated insulin secretion (GSIS) was observed. We next analyzed the
responsiveness of this kinase to insulin stimulation in vivo, in both pectoral muscle as well
as hepatic tissue. The phosphorylated Akt levels increased significantly after 5 (1.62-fold)
and 15 (1.81-fold) min of ip. insulin (0.56 units/ Kg) administration in pectoral muscle,
compared to the T0 (Fig. 4A). As expected, no changes were observed in total Akt content
among the 3 periods. For the liver, there was an increase of insulin-induced Akt
phosphorylation only significant after 15 min of insulin stimulation (Fig. 4B). No
significant change in the total Akt content among the 3 periods was observed in the liver
(Fig. 4B).
45
Discussion
It was previously demonstrated that the fruit-eating bat Artibeus lituratus is able
to maintain normoglycemia even after 6 days of starvation, possibly because of its high
hepatic glycogen stores and increased gluconeogenesis (Pinheiro et al., 2006).
Frugivourous bats also absorb high amounts of carbohydrates from their diet in a fast and
efficient manner, which points to the adaptations of their absorptive apparatus and also of
the endocrine pancreas. These statements are supported by the presence of a high
paracellular glucose absorption in the intestinal tract of Rousettus aegyptiacus and A.
lituratus as well as a high number of pancreatic islets in R. aegyptiacus (Caviedes-Vidal et
al., 2008; Caviedes-Vidal et al., 2007; Tracy et al., 2007).
Results from ipGTT demonstrated that only the administration of 3g/ Kg of
glucose elicited a significant increase in blood glucose levels in fasted bats, after 30 min.
These results suggest an efficient uptake of glucose by insulin-responsive tissues and could
reflect a well coupled circulating insulin level and its action. The rapid restoration of blood
glucose levels strengthens the high glucose tolerance in A. lituratus, emphasizing its ability
to maintain the glycemic control even after a carbohydrate-rich meal, which is in line with
the higher hepatic glycogen stores found in this specie (Pinheiro et al., 2006).
The hypothesis that this bat has a high insulin sensitivity was supported by the
results obtained during the ipITT, where the administration of a reduced amount of insulin
(0.56 units/ Kg), compared with that used in mice and rats (Fujiwara et al., 2007), provoked
a sharp decrease in blood glucose levels. This response was unique and observed in only a
few cases, such as in the insulin hypersensitive mice lacking the V1b vasopressin receptor
(Fujiwara et al., 2007).
Despite the difficulties to make adequate comparisons of our results on
insulinemia with other species, mice (Fujiwara et al., 2007) and older obese humans
(Yassine et al., 2009) exhibit lower fasting serum insulin levels than our animal model.
More important is the fact that we did not observe a significant difference in serum insulin
levels between fasted and fed states. This unexpected observation could mean that the
considerable amount of circulating insulin during fasting state is quite enough to deal with
the glucose absorbed after a regular meal, or that a regular meal did not induce an increase
in blood glucose enough to stimulate a sufficient amount of insulin secretion able to
46
increase the circulating insulin levels. We cannot rule out the possibility that an increase in
insulin secretion occurs immediately after meal ingestion. However, the inability to detect
this increase may be due to the delay between ingestion and blood collection, place of
collection and, a higher inactivation of insulin during its first passage through the liver. In
addition, the ipGTT results with 3g/ Kg (Fig. 1B) indicate that only high amounts of
glucose are necessary to provoke a significant increase in glycemia after 30 min.
In the next series of experiments, we analyzed the ability of glucose to stimulate
insulin secretion in fragments of pancreas of the A. lituratus. We observed that at basal
glucose concentrations (2.8 mM), the amount of insulin released to the incubation medium
was close to 16% of the total insulin content in the pancreas fragments. These values are
significantly higher than those found in humans (Karam et al., 1974), rats (Rafacho et al.,
2009), and mice islets (Ullrich et al., 2005), in the same experimental conditions, around 1-
2% of the total insulin islet content.
There is no previous description of the
-cells distribution in A. lituratus pancreas.
We found a great number of irregular shaped islets, similar to another fruit-eating bat R.
aegyptiacus (Michelmore et al., 1998). The pattern of islet cell distribution in the A.
lituratus differs from that found in other mammals. In our animal model, the
cells seem to
be located, preferentially, at the periphery of the islets, a pattern not observed in the other
fruit-bat, the R. aegyptiacus (Michelmore et al., 1998), rodents (Bani Sacchi and Bani,
1985; Cabrera et al., 2006), humans and primates, and pig (Cabrera et al., 2006), where the
cells are located throughout the islets, especially at the core. The variety of islet cells
topography among interspecies might reflect evolutionary adaptations to different dietary
habits or other environmental constraints (Cabrera et al., 2006).
Immonobloting experiments indicate that the insulin signaling in the skeletal
muscle is more effective than in hepatic tissue (Fig. 4A, B), as judged by the higher Akt
phosphorylation after insulin administration. The serine/threonine kinase Akt is a key
protein of the insulin pathway with important implications in glucose homeostasis, cell
growth, differentiation, and survival (Cho et al., 2001; Downward, 1998; Schenck et al.,
2008). Phosphorylated Akt participates in GLUT4 translocation to plasma membrane
(Watson and Pessin, 2007), increasing the glucose influx in muscle and adipose tissues
(Kido et al., 2001; Saltiel and Kahn, 2001). These findings suggest that A. lituratus pectoral
47
muscles not only respond to insulin, but its signaling pathway is similar to that observed in
many vertebrates, such as humans (Holness et al., 2000), rats (Rafacho et al., 2007), mice
(Hult et al., 2009) and fish (Moon, 2001). Concerning the Akt response in the liver, we also
observed an increase in its phosphorylation after insulin administration. This observation is
in agreement with the increased capacity of insulin in phosphorylate Akt in livers of other
animal species (Ropelle et al., 2009) and also with the ability of the bat liver in glycogen
storage (Pinheiro et al., 2006).
In conclusion, and from an evolutionary point of view, the high sensitivity to
glucose and insulin and the large
-cell population observed in fruit-eating bats represents
adequate adaptations that guarantee the proper control of glucose homeostasis in this
specie, constantly submitted to high influx of glucose due to its carbohydrate-rich diet.
References
Bani Sacchi, T. and Bani, D. (1985). New views on the identification of the
various cell types in the pancreatic islets of the rat. An ultrastructural and morphometrical
study. Acta Anat (Basel) 122, 1-17.
Cabrera, O., Berman, D. M., Kenyon, N. S., Ricordi, C., Berggren, P. O. and
Caicedo, A. (2006). The unique cytoarchitecture of human pancreatic islets has
implications for islet cell function. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 2334-9.
Caviedes-Vidal, E., Karasov, W. H., Chediack, J. G., Fasulo, V., Cruz-Neto, A.
P. and Otani, L. (2008). Paracellular absorption: a bat breaks the mammal paradigm. PLoS
One 3, e1425.
Caviedes-Vidal, E., McWhorter, T. J., Lavin, S. R., Chediack, J. G., Tracy, C.
R. and Karasov, W. H. (2007). The digestive adaptation of flying vertebrates: high
intestinal paracellular absorption compensates for smaller guts. Proc Natl Acad Sci U S A
104, 19132-7.
Cho, H., Thorvaldsen, J. L., Chu, Q., Feng, F. and Birnbaum, M. J. (2001).
Akt1/PKBalpha is required for normal growth but dispensable for maintenance of glucose
homeostasis in mice. J Biol Chem 276, 38349-52.
48
Craik, J. D. and Markovich, D. (2000). Rapid GLUT-1 mediated glucose transport
in erythrocytes from the grey-headed fruit bat (Pteropus poliocephalus). Comp Biochem
Physiol A Mol Integr Physiol 126, 45-55.
Downward, J. (1998). Mechanisms and consequences of activation of protein
kinase B/Akt. Curr Opin Cell Biol 10, 262-7.
Fujiwara, Y., Hiroyama, M., Sanbe, A., Aoyagi, T., Birumachi, J., Yamauchi,
J., Tsujimoto, G. and Tanoue, A. (2007). Insulin hypersensitivity in mice lacking the V1b
vasopressin receptor. J Physiol 584, 235-44.
Holness, M. J., Langdown, M. L. and Sugden, M. C. (2000). Early-life
programming of susceptibility to dysregulation of glucose metabolism and the development
of Type 2 diabetes mellitus. Biochem J 349 Pt 3, 657-65.
Hult, M., Ortsater, H., Schuster, G., Graedler, F., Beckers, J., Adamski, J.,
Ploner, A., Jornvall, H., Bergsten, P. and Oppermann, U. (2009). Short-term
glucocorticoid treatment increases insulin secretion in islets derived from lean mice through
multiple pathways and mechanisms. Mol Cell Endocrinol 301, 109-16.
Karam, J. H., Grodsky, G. M., Ching, K. N., Schmid, F., Burrill, K. and
Forsham, P. H. (1974). "Staircase" glucose stimulation of insulin secretion in obesity.
Measure of beta-cell sensitivity and capacity. Diabetes 23, 763-70.
Karasov, W. H. and Hume, I. D. (1997). Vertebrate gastrointestinal system. In
Handbook of Comparative Physiology (ed. W. Dantzler), pp. 409-480. bethesa, MD:
American Physiology Societey.
Keegan, D. J. (1977). Aspects of the assimilation of sugar by Rousettus
aegyptiacus. Comp. Biochem. Physiol. 58a, 349-352.
Keegan, D. J. and Modinger, R. (1979). Microvilli of the intestinal mucosal cells
of Rousettus aegyptiacus. S. Afr. J. Zool 14, 223-220.
Keegan, D. J. and Van Der Westhuizen, J. (1976). Pancreas of Rousettus
aegyptiacus. S. Afr. J. Med. Sci. 41, 62.
Kido, Y., Nakae, J. and Accili, D. (2001). Clinical review 125: The insulin
receptor and its cellular targets. J Clin Endocrinol Metab 86, 972-9.
49
Michelmore, A. J., Keegan, D. J. and Kramer, B. (1998). Immunocytochemical
identification of endocrine cells in the pancreas of the fruit bat, Rousettus aegyptiacus. Gen
Comp Endocrinol 110, 319-25.
Moon, T. W. (2001). Glucose intolerance in teleost fish: fact or fiction? Comp
Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 129, 243-9.
Pinheiro, E. C., Taddei, V. A., Migliorini, R. H. and Kettelhut, I. C. (2006).
Effect of fasting on carbohydrate metabolism in frugivorous bats (Artibeus lituratus and
Artibeus jamaicensis). Comp Biochem Physiol B Biochem Mol Biol 143, 279-84.
Rafacho, A., Cestari, T. M., Taboga, S. R., Boschero, A. C. and Bosqueiro, J. R.
(2009). High doses of dexamethasone induce increased beta-cell proliferation in pancreatic
rat islets. Am J Physiol Endocrinol Metab 296, E681-9.
Rafacho, A., Giozzet, V. A., Boschero, A. C. and Bosqueiro, J. R. (2008a).
Functional alterations in endocrine pancreas of rats with different degrees of
dexamethasone-induced insulin resistance. Pancreas 36, 284-93.
Rafacho, A., Ribeiro, D. L., Boschero, A. C., Taboga, S. R. and Bosqueiro, J. R.
(2008b). Increased pancreatic islet mass is accompanied by activation of the insulin
receptor substrate-2/serine-threonine kinase pathway and augmented cyclin D2 protein
levels in insulin-resistant rats. Int J Exp Pathol 89, 264-75.
Rafacho, A., Roma, L. P., Taboga, S. R., Boschero, A. C. and Bosqueiro, J. R.
(2007). Dexamethasone-induced insulin resistance is associated with increased connexin 36
mRNA and protein expression in pancreatic rat islets. Can J Physiol Pharmacol 85, 536-
45.
Ropelle, E. R., Pauli, J. R., Cintra, D. E., Frederico, M. J., de Pinho, R. A.,
Velloso, L. A. and De Souza, C. T. (2009). Acute exercise modulates the Foxo1/PGC-
1alpha pathway in the liver of diet-induced obesity rats. J Physiol 587, 2069-76.
Saltiel, A. R. and Kahn, C. R. (2001). Insulin signalling and the regulation of
glucose and lipid metabolism. Nature 414, 799-806.
Schenck, A., Goto-Silva, L., Collinet, C., Rhinn, M., Giner, A., Habermann, B.,
Brand, M. and Zerial, M. (2008). The endosomal protein Appl1 mediates Akt substrate
specificity and cell survival in vertebrate development. Cell 133, 486-97.
50
Scott, A. M., Atwater, I. and Rojas, E. (1981). A method for the simultaneous
measurement of insulin release and B cell membrane potential in single mouse islets of
Langerhans. Diabetologia 21, 470-5.
Tracy, C. R., McWhorter, T. J., Korine, C., Wojciechowski, M. S., Pinshow, B.
and Karasov, W. H. (2007). Absorption of sugars in the Egyptian fruit bat (Rousettus
aegyptiacus): a paradox explained. J Exp Biol 210, 1726-34.
Ullrich, S., Berchtold, S., Ranta, F., Seebohm, G., Henke, G., Lupescu, A.,
Mack, A. F., Chao, C. M., Su, J., Nitschke, R. et al. (2005). Serum- and glucocorticoid-
inducible kinase 1 (SGK1) mediates glucocorticoid-induced inhibition of insulin secretion.
Diabetes 54, 1090-9.
Van Der Westhuizen, J. (1976). The feeding pattern of the fruit bat Rousettus
aegyptiacus. S. Afr. J. Med. Sci. 41, 271-278.
Watson, R. T. and Pessin, J. E. (2007). GLUT4 translocation: the last 200
nanometers. Cell Signal 19, 2209-17.
Yassine, H. N., Marchetti, C. M., Krishnan, R. K., Vrobel, T. R., Gonzalez, F.
and Kirwan, J. P. (2009). Effects of exercise and caloric restriction on insulin resistance
and cardiometabolic risk factors in older obese adults--a randomized clinical trial. J
Gerontol A Biol Sci Med Sci 64, 90-5.
Figure Legends
Figure 1 Peripheral sensitivity to glucose and insulin. Glycemic values under
intraperitoneal glucose tolerance test (ipGTT) in 12h-fasted (F12) A. lituratus after 2
(GLU2) or 3g/ Kg b.w. (GLU3), or saline (SAL) administration (A). Area-under-the-curve
(AUC) for ipGTT (B). Blood glucose values during intraperitoneal insulin tolerance test
(ipITT) in fed bats after insulin (0.56 units / Kg, b.w.) (INS) or SAL administration (C).
Values represent the mean ± SEM. n = 14 for SAL and GLU2 in A and B, 15 for GLU3 in
A and B and 17 for SAL and INS in C.
#
significantly different vs. SAL,
&
vs. GLU2 and
*vs. T0. P < 0.05.
51
Figure 2 Insulin secretion in pancreas fragments from A. lituratus. Insulin response to low
glucose (2.8mM), 5.6mM glucose and stimulatory 8.3 mM glucose in pancreas fragments.
Increment values from 2.8 to 5.6 or 8.3 mM glucose (insert). Values represent the mean ±
SEM. n = 6 fragments from two independent experiments. *Significantly different vs.
2.8mM. P < 0.05.
Fig. 3 Cellular distribution of
cells in pancreas from A. lituratus. Panoramic view of a
histological section immunostained for insulin (A,B). Morphological aspect of pancreatic
islets (C). Note that there are different shapes (round, oval and other irregular shapes) and
that the pancreatic
cells localize, preferentially, at the periphery of the islet (C, arrows).
Small islets or group of
cells were commonly observed along pancreas section (C –
arrowheads). Observe the peripheral localization of the
cells in islets (D-G).
Magnification ×40 in A, ×100 in B, ×400 in C and ×1000 in D-G.
Figure 4 Protein content of total Akt and phosphorylated Akt in muscle and hepatic tissues.
Total and phosphorylated levels of Akt in pectoral muscle (A) or hepatic tissue (B) from
fed A. lituratus after 5 (INS5) or 15 min (INS15) insulin administration (0.56 unites /Kg).
Values represent the mean ± SEM of 4 independent bats. *significantly different vs. saline
(SAL). P < 0.05. (AOU) = optical arbitrary units.
List of symbols and abbreviations:
Akt; protein kinase B, ANOVA; analysis of variance, AOU; arbitrary optical arbitrary
units, AUC; are under the glucose curve, GSIS; glucose-stimulated insulin secretion,
ipGTT; intraperitoneal glucose tolerance test, ipITT; intraperitoneal insulin tolerance tests,
SDS-PAGE; sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis, SGLT1; Na+-
coupled glucose transporter, TBST; Tris buffer salt Tween
52
SAL
GLU2
GLU3
--
0
2000
4000
6000
8000
10000
#
#
AUC (mg/dL min
-1
)
A
B
C
0 30 60 90 120
40
50
60
70
80
90
100
110
120
130
&
&
#
&
GLU3
GLU2
SAL
#
#
*
*
Blood glucose
(mg/dL)
(min)
0 15 30 45 60
30
40
50
60
70
80
90
100
110
#
#
#
#
*
*
*
*
SAL
INS
Blood glucose
(mg/dL)
(min)
53
2.8 5.6 8.3
0
5
10
15
20
25
30
35
*
*
Insulin release
(% total fragment content)
Glucose (mM)
A
5.6 8.3
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
Increment
(over to 2.8mM glucose)
54
Insulin
A
B
C
D
E
G
F
55
A B
SAL INS5 INS15
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
*
*
pAkt
1/2/3
protein content
(fold change over SAL)
SAL INS5 INS15
0,0
0,4
0,8
1,2
1,6
2,0
*
pAkt
1/2/3
protein content
(fold change over SAL)
Pectoral muscle Liver
56
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Instituto Brasileiro do Meio Ambiente e dos Recursos Naturais Renováveis - IBAMA
Instituto Chico Mendes de Conservação da Biodiversidade - ICMBio
Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade - SISBIO
Autorização para atividades com finalidade científica
Número: 14867-3 Data da Emissão: 04/03/2009 14:54 Data de Validade: 04/03/2010
SISBIO
Dados do titular
Registro no Ibama: 2488143 Nome: André Otavio Peres Protzek CPF: 009.969.171-01
Título do Projeto: RESPOSTA AO TESTE DE TOLERÂNCIA À GLICOSE (GTT) E AO TESTE DE TOLERÂNCIA À INSULINA (ITT), SECREÇÃO E
AÇÕES METABÓLICAS DA INSULINA E DO CORTISOL EM MORCEGOS FRUGÍVOROS DA ESPÉCIE Artibeus lituratus
Nome da Instituição : FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA CNPJ: 00.038.174/0001-43
Observações, ressalvas e condicionantes
1
As atividades de campo exercidas por pessoa natural ou jurídica estrangeira, em todo o território nacional, que impliquem o deslocamento de recursos humanos e
materiais, tendo por objeto coletar dados, materiais, espécimes biológicos e minerais, peças integrantes da cultura nativa e cultura popular, presente e passa da,
obtidos por meio de recursos e técnicas que se destinem ao estudo, à difusão ou à pesquisa, estão sujeitas a autorização do Ministério de Ciência e Tecnologia.
2
Esta autorização não exime o titular e a sua equipe da necessidade de obter as anuências previstas em outros instrumentos legais, bem como do consentimento do
responsável pela área, pública ou privada, onde será realizada a atividade.
3
Esta autorização não poderá ser utilizada para fins comerciais, industriais, esportivos ou para realização de atividades inerentes ao processo de licenciamento
ambiental de empreendimentos. O material biológico coletado deverá ser utilizado para atividades científicas ou didáticas no âmbito do ensino superior.
4
A autorização para envio ao exterior de material biológico não consignado deverá ser requerida por meio do endereço eletrônico www.ibama.gov.br (Serviços on-line -
Licença para importação ou exportação de flora e fauna - CITES e não CITES). Em caso de material consignado, consulte www.ibama.gov.br/sisbio - menu
Exportação.
5
O titular de licença ou autorização e os membros da sua equipe deverão optar por métodos de coleta e instrumentos de captura direcionados, sempre que possível,
ao grupo taxonômico de interesse, evitando a morte ou dano significativo a outros grupos; e empregar esforço de coleta ou captura que não comprometa a viabilidade
de populações do grupo taxonômico de interesse em condição in situ.
6
Este documento não dispensa o cumprimento da legislação que dispõe sobre acesso a componente do patrimônio genético existente no território nacional, na
plataforma continental e na zona econômica exclusiva, ou ao conhecimento tradicional associado ao patrimônio genético, para fins de pesquisa científica,
bioprospecção e desenvolvimento tecnológico.
7
Em caso de pesquisa em Unidade de Conservação Federal, o pesquisador titular deverá contactar a administração dessa unidade a fim de CONFIRMAR AS DATAS
das expedições, as condições para realização das coletas e de uso da infra-estrutura da unidade.
8
As atividades contempladas nesta autorização NÃO abrangem espécies brasileiras constante de listas oficiais (de abrangência nacional, estadual ou municipal) de
espécies ameaçadas de extinção, sobreexplotadas ou ameaçadas de sobreexplotação.
Outras ressalvas
1
Só está permitida a coleta de no máximo 10 (dez)indivíduos por localidade (local de captura com distância mínima de 5km), a cada seis meses.
Não está permitida a coleta de fêmeas grávidas ou lactantes, assim como de animias marcados (anilhados).
Na manutenção em cativeiro, cada gaiola só poderá abrigar um espécime de cada vez e por um período máximo de 10 (dez) dias.
Locais onde as atividades de campo serão executadas
# Município UF Descrição do local Tipo
1 BRASILIA DF Área urbana do Distrito Federal Fora de UC
2 BRASILIA DF SHCGN 714 bl S Fora de UC
Atividades X Táxons
# Atividade Táxons
1 Coleta/transporte de espécimes da fauna silvestre in situ Artibeus lituratus (*Qtde: 48)
2
Manutenção temporária (até 24 meses) de vertebrados silvestres
em cativeiro
Artibeus lituratus
* Qtde. de indivíduos por espécie/localidade/unidade de conservação, a serem coletados durante um ano.
Material e métodos
1 Método de captura/coleta (Outros mamíferos) Rede de neblina
Destino do material biológico coletado
SISBIO
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Autorização para atividades com finalidade científica
Número: 14867-3 Data da Emissão: 04/03/2009 14:54 Data de Validade: 04/03/2010
SISBIO
Dados do titular
Registro no Ibama: 2488143 Nome: André Otavio Peres Protzek CPF: 009.969.171-01
Título do Projeto: RESPOSTA AO TESTE DE TOLERÂNCIA À GLICOSE (GTT) E AO TESTE DE TOLERÂNCIA À INSULINA (ITT), SECREÇÃO E
AÇÕES METABÓLICAS DA INSULINA E DO CORTISOL EM MORCEGOS FRUGÍVOROS DA ESPÉCIE Artibeus lituratus
Nome da Instituição : FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA CNPJ: 00.038.174/0001-43
# Nome local destino Tipo Destino
1 FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
Todos os indivíduos a serem sacrificados terão todos os tecidos corporais
aproveitados integralmente
SISBIO
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Autorização para atividades com finalidade científica
Número: 14867-3 Data da Emissão: 04/03/2009 14:54 Data de Validade: 04/03/2010
SISBIO
Dados do titular
Registro no Ibama: 2488143 Nome: André Otavio Peres Protzek CPF: 009.969.171-01
Título do Projeto: RESPOSTA AO TESTE DE TOLERÂNCIA À GLICOSE (GTT) E AO TESTE DE TOLERÂNCIA À INSULINA (ITT), SECREÇÃO E
AÇÕES METABÓLICAS DA INSULINA E DO CORTISOL EM MORCEGOS FRUGÍVOROS DA ESPÉCIE Artibeus lituratus
Nome da Instituição : FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA CNPJ: 00.038.174/0001-43
Anexo para registrar Coletas Imprevistas de Material Biológico
De acordo com a Instrução Normativa Ibama nº154/2007, a coleta imprevista de material biológico ou de substrato não
contemplado na autorização ou na licença permanente deverá ser anotada na mesma, em campo específico, por
ocasião da coleta, devendo esta coleta imprevista ser comunicada por meio do relatório de atividades. O transporte do
material biológico ou do substrato deverá ser acompanhado da autorização ou da licença permanente com a devida
anotação. O material biológico coletado de forma imprevista, deverá ser destinado à instituição científica e, depositado,
preferencialmente, em coleção biológica científica registrada no Cadastro Nacional de Coleções Biológicas (CCBIO).
Nivel Táxon* Qtde. Amostra Qtde. Data
* Identificar o espécime no nível taxonômico mais específico possível.
SISBIO
Este documento (Autorização para atividades com finalidade científica) foi expedido com base na Instrução Normativa Ibama nº154/2007. Através do
código de autenticação abaixo, qualquer cidadão poderá verificar a autenticidade ou regularidade deste documento, por meio da página do
Ibama/Sisbio na internet (www.ibama.gov.br/sisbio).
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Sistema de Autorização e Informação em Biodiversidade - SISBIO
Autorização para atividades com finalidade científica
Número: 14867-1 Data da Emissão: 13/02/2008 15:18 Data de Validade: 12/02/2009
SISBIO
Dados do titular
Registro no Ibama: 2488143 Nome: André Otavio Peres Protzek CPF: 009.969.171-01
Título do Projeto: RESPOSTA AO TESTE DE TOLERÂNCIA À GLICOSE (GTT) E AO TESTE DE TOLERÂNCIA À INSULINA (ITT), SECREÇÃO E
AÇÕES METABÓLICAS DA INSULINA E DO CORTISOL EM MORCEGOS FRUGÍVOROS DA ESPÉCIE Artibeus lituratus
Nome da Instituição : FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA CNPJ: 00.038.174/0001-43
Observações, ressalvas e condicionantes
1
A participação do(a) pesquisador(a) estrangeiro(a) nas atividades previstas nesta autorização depende de autorização expedida pelo Ministério de Ciência e
Tecnologia (CNPq/MCT);
2
Esta autorização não exime o titular e a sua equipe da necessidade de obter as anuências previstas em outros instrumentos legais, bem como do consentimento do
responsável pela área, pública ou privada, onde será realizada a atividade.
3
Esta autorização não poderá ser utilizada para fins comerciais, industriais, esportivos ou para realização de atividades inerentes ao processo de licenciamento
ambiental de empreendimentos. O material biológico coletado deverá ser utilizado exclusivamente para atividades didáticas ou científicas sem potencial de uso
econômico.
4
A autorização para envio ao exterior de material biológico não consignado deverá ser requerida por meio do endereço eletrônico www.ibama.gov.br/cites. Em caso de
material consignado, consulte www.ibama.gov.br/sisbio - menu Exportação.
5
O titular de licença ou autorização e os membros da sua equipe deverão optar por métodos de coleta e instrumentos de captura direcionados, sempre que possível,
ao grupo taxonômico de interesse, evitando a morte ou dano significativo a outros grupos; e empregar esforço de coleta ou captura que não comprometa a viabilidade
de populações do grupo taxonômico de interesse em condição in situ.
6
Este documento não dispensa a obtenção de autorização de acesso ao componente do patrimônio genético ou ao conhecimento tradicional associado nos termos da
legislação vigente.
7
Em caso de pesquisa em Unidade de Conservação Federal, o pesquisador titular deverá contactar a administração dessa unidade a fim de CONFIRMAR AS DATAS
das expedições, as condições para realização das coletas e de uso da infra-estrutura da unidade.
8
As atividades contempladas nesta autorização NÃO abrangem espécies brasileiras constante de listas oficiais (de abrangência nacional, estadual ou municipal) de
espécies ameaçadas de extinção, sobreexplotadas ou ameaçadas de sobreexplotação.
Locais onde as atividades de campo serão executadas
# Município UF Descrição do local Tipo
1 BRASILIA DF Área urbana do Distrito Federal Fora de UC
Atividades X Táxons
# Atividade Táxons
1 Coleta/transporte de espécimes da fauna silvestre in situ Artibeus lituratus (*Qtde: 10)
2
Manutenção temporária (até 24 meses) de vertebrados silvestres
em cativeiro
Artibeus lituratus
* Qtde. de indivíduos por espécie/localidade/unidade de conservação, a serem coletados durante um ano.
Material e métodos
1 Método de captura/coleta (Outros mamíferos) Rede de neblina
Destino do material biológico coletado
# Nome local destino Tipo Destino
1 FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
Todos os indivíduos a serem sacrificados terão todos os tecidos corporais
aproveitados integralmente
SISBIO
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Autorização para atividades com finalidade científica
Número: 14867-1 Data da Emissão: 13/02/2008 15:18 Data de Validade: 12/02/2009
SISBIO
Dados do titular
Registro no Ibama: 2488143 Nome: André Otavio Peres Protzek CPF: 009.969.171-01
Título do Projeto: RESPOSTA AO TESTE DE TOLERÂNCIA À GLICOSE (GTT) E AO TESTE DE TOLERÂNCIA À INSULINA (ITT), SECREÇÃO E
AÇÕES METABÓLICAS DA INSULINA E DO CORTISOL EM MORCEGOS FRUGÍVOROS DA ESPÉCIE Artibeus lituratus
Nome da Instituição : FUNDAÇÃO UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA CNPJ: 00.038.174/0001-43
Anexo para registrar Coletas Imprevistas de Material Biológico
De acordo com a Instrução Normativa Ibama nº154/2007. , a coleta imprevista de material biológico ou de substrato não
contemplado na autorização ou na licença permanente deverá ser anotada na mesma, em campo específico, por
ocasião da coleta, devendo esta ser comunicada ao Ibama por meio do relatório de atividades. O transporte do material
biológico ou do substrato deverá ser acompanhado da autorização ou da licença permanente com a devida anotação.
O material biológico coletado de forma imprevista, deverá ser destinado à instituição científica, preferencialmente
depositado em coleção biológica científica registrada no Cadastro Nacional de Coleções Biológicas (CCBIO).
Nivel Táxon* Qtde. Amostra Qtde. Data
* Identificar o espécime no nível taxonômico mais específico possível.
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