ads:
UNIVERSIDADE FEDERAL DO ESPÍRITO SANTO
CENTRO DE CIÊNCIAS AGRÁRIAS
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PRODUÇÃO VEGETAL
EDUARDO DOMINGOS GRECCO
SELEÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Bacillus
thuringiensis Berliner COM ATIVIDADE TÓXICA PARA Trichoplusia
ni (Hüebner, 1802)
ALEGRE, ES
2009
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
EDUARDO DOMINGOS GRECCO
SELEÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Bacillus
thuringiensis Berliner COM ATIVIDADE TÓXICA PARA Trichoplusia
ni (Hüebner, 1802)
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Espírito Santo, como parte das
exigências do Programa de Pós-
Graduação em Produção Vegetal, para
obtenção do título de Mestre em
Produção Vegetal.
Orientador: Prof. Dr. Ricardo Antonio
Polanczyk
Co-orientador: Prof. Dr. Dirceu Pratissoli
Co-orientador: Prof. Dr. Cláudio Roberto
Franco
ALEGRE, ES
MARÇO – 2009
ads:
EDUARDO DOMINGOS GRECCO
SELEÇÃO E CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DE Bacillus
thuringiensis Berliner COM ATIVIDADE TÓXICA PARA Trichoplusia
ni (Huebner, 1802)
Dissertação apresentada à Universidade
Federal do Espírito Santo, como parte das
exigências do Programa de Pós-Graduação
em Produção Vegetal, para obtenção do
título de Mestre em Produção Vegetal.
Aprovada: 27 de março de 2009.
COMISSÃO EXAMINADORA
__
__________________________________
Prof. Dr. Ricardo Antonio Polanczyk
Universidade Federal do Espírito Santo
Orientador
____________________________________
Prof. Dr. Dirceu Pratissoli
Universidade Federal do Espírito Santo
____________________________________
Prof. Dr. Ulysses Rodrigues Vianna
Universidade Federal do Espírito Santo
____________________________________
Prof. Dr. Anderson Mathias Holtz
(membro externo)
ii
Dedico aos meus pais, Domingos Procollo Grecco e
Bernardete Krohling Grecco, que me deram a vida.
Aos meus irmãos, Sander Grecco e Adriana Penha
Grecco.
iii
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus, por estar sempre me ajudando a vencer os obstáculos da vida e a
minha família que sempre me apoiou.
Ao Prof. Dr. Ricardo Antonio Polanczyk, pela orientação, amizade, compreensão e
oportunidade de realizar o Curso de Pós-Graduação em Produção Vegetal.
Ao Prof. Dr. Dirceu Pratissoli, pelas informações, confiança e amizade.
Ao Prof. Dr. Ulysses Rodrigues Vianna, pelas informações.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela
concessão da bolsa.
Ao Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq) e Banco
do Nordeste do Brasil (BNB), pelo suporte financeiro.
Aos Professores do Programa de Pós-Graduação em Produção Vegetal do
CCA/UFES, pelos ensinamentos.
Ao professor Manoel Victor Franco Lemos do Laboratório de Genética de Bactérias
da Universidade Estadual Paulista (Jaboticabal-SP), pelo auxílio no PCR.
Aos amigos do Laboratório de Entomologia: Luiz, Juliéder, Gilberto, Wagner, Flávio
Neves, Flávio (Bronco), Arildo, Débora, Carolina, Victor Lima, Hugo Zago, Hugo
Gonçalves, André, Alexandre, Leandro, José Romário, Ligia, Fernando, João Rafael.
Aos amigos de república: Allan, Flávio, Henrique, Marcel, Rômulo, Ângelo, Gabriel,
Vinícius, Luciano e Jânio, pela convivência e amizade.
Aos funcionários do Laboratório de Entomologia, Carlota e Leonardo e o motorista
Janin, por sempre me levar em campo para coleta da praga.
iv
“Sonhei que estava andando na praia, e no céu
passavam cenas da minha vida. Para cada cena, eram
deixados dois pares de pegadas na areia, entretanto
nos momentos mais difíceis havia apenas um, e
perguntei ao Senhor: - Tu me disseste que andarias
sempre comigo, e não compreendo porque nas horas
em que eu mais necessitei me deixaste sozinho. O
Senhor me respondeu: Jamais te deixaria, quando viu
na areia apenas um par de pegadas, eram as minhas,
de quando eu te carreguei...”
Margareth F. Powers
v
BIOGRAFIA
Eduardo Domingos Grecco, filho de Domingos Procollo Grecco e Bernardete
Krohling Grecco, nasceu em 08 de novembro de 1982, no município de Domingos
Martins, Estado do Espírito Santo, Brasil.
Residente na comunidade de São Paulo de Aracê, Distrito de Aracê, localizado na
região serrana do Estado do Espírito Santo, onde permaneceu até 2002.
Em 2002, ingressou no curso de Agronomia da Universidade Federal do Espírito
Santo, graduando-se no ano de 2006.
Em março de 2007, ingressou no curso de Mestrado em Produção Vegetal da
Universidade Federal do Espírito Santo, defendendo a dissertação no mês de março
de 2009.
vi
RESUMO
GRECCO, Eduardo Domingos, M.Sc. Universidade Federal do Espírito Santo, março
de 2009. Seleção e caracterização molecular de Bacillus thuringiensis Berliner
com atividade tóxica para Trichoplusia ni (Hüebner, 1802). Orientador: Prof. Dr.
Ricardo Antonio Polanczyk.
Co-orientador: Prof. Dr. Dirceu Pratissoli. Co-orientador:
Prof. Dr. Cláudio Roberto Franco.
Trichoplusia ni é uma praga polífaga importante em plantios de brássicas, soja e
algodão no Brasil. Visando reduzir a utilização de inseticidas no controle de pragas,
têm-se buscado alternativas de controle, dentre as quais se destaca a utilização de
Bacillus thuringiensis (Bt). O presente estudo objetivou selecionar e caracterizar
molecularmente isolados de Bt com potencial para atuar como agentes de controle
biológico de T. ni. Para a execução dos bioensaios, os isolados de Bt foram
cultivados em meio de cultura (BHI) a 30
o
C, sob agitação orbital a 180 rpm por 72 h,
sendo em seguida centrifugados 3 vezes por 20 min a 5.000 rpm, e quantificados
posteriormente. Para os bioensaios de patogenicidade, uma alíquota com 3 x 10
8
esporos/mL de suspensão de Bt de cada isolado foi aplicada na superfície do disco
de dieta artificial, previamente distribuída em placas de acrílico com 50 lagartas,
distribuídas em 5 repetições. Nos bioensaios para a obtenção da CL
50
, apenas os
isolados com 100% de mortalidade foram pré-selecionados, sendo testadas as
seguintes concentrações: 10
2
, 5 x 10
2
, 10
3
, 2 x 10
3
, 4 x 10
3
, 6 x 10
3
e 8 x 10
3
esporos/mL, sendo os tratamentos compostos por 120 lagartas, distribuídas em 3
repetições. Os bioensaios foram mantidos em câmaras climatizadas (25 ± 1,0
o
C, 65
± 10% de U.R e 14 h de fotofase) e avaliados após cinco dias. Foi utilizada
caracterização molecular para detectar os genes cry1, cry2 e Vip para os isolados
que obtiveram mortalidade acima de 95%. Os isolados HD1 (Btk), Bt-1043N-V, Bt-
1034F, Bt-1009K, Bt-1000 e Bt-969A causaram 100% de mortalidade genes cry
estar causando a mortalidade de T. ni, nos testes de patogenicidade e CL
50
de 1,17
x 10
3
, 1,45 x 10
3
, 1,46 x 10
3
, 1,01 x 10
3
, 0,94 x 10
3
e 1,22 x 10
3
, respectivamente.
Não foram encontrados genes cry1, cry2 e Vip nos isolados testados, podendo
outros visto que os isolados testados são específicos para a ordem Lepidoptera.
Esses isolados mostraram potencial para o controle de T. ni, sendo virulentos a esse
inseto, com potencial para serem utilizados em programa de manejo dessa praga,
vii
porém estudos em condições de campo e semicampo, bem como de formulação,
são necessários para integrar o Bt em um programa de manejo integrado de T. ni.
Palavras-chave: MIP. Controle biológico. Entomopatógeno. Toxinas.
viii
ABSTRACT
GRECCO, Eduardo Domingos, M.Sc. Universidade Federal do Espírito Santo, march
of 2009. Selection and molecular characterization of Bacillus thuringiensis
Berliner with toxic activity for the control of Trichoplusia ni (Hüebner, 1802).
Adviser: Prof. Dr. Ricardo Antonio Polanczyk.
Co-Adviser: Prof. Dr. Dirceu Pratissoli.
Co-adviser: Prof. Dr. Cláudio Roberto Franco.
Trichoplusia ni is a important polyphagous pest in plantations of cruciferous,
soybeans and cotton in Brazil. Aiming to reduce the use of insecticides to control
pests, alternatives of control have been searched, among which stands out the use
of Bacillus thuringiensis (Bt). The objective of this study was to select and
characterize molecularly efficient isolates of Bt for the control of T. ni. For the
execution of the bioassays the isolates of Bt were cultivated in middle culture (BHI)
on 30
o
C, under orbital shaking at 180 rpm for 72 h, and then centrifuged 3 times for
20 min at 5.000 rpm, being after quantified. For the bioassays of pathogenicity, a rate
of 3 x 10
8
spores/mL suspension of Bt of each isolate was applied on the surface of
the disk of artificial diet, previously distributed on acrylic plates with 50 larvae,
distributed in 5 repetitions. In bioassays to obtain the LC
50
, only isolates with 100%
mortality were pre-selected, being tested the following concentrations 10
2
, 5 x 10
2
,
10
3
, 2 x 10
3
, 4 x 10
3
, 6 x 10
3
and 8 x 10
3
spores/mL, and the treatments consisting of
120 larvae, distributed in 3 repetitions. The bioassays were kept in acclimatized
chamber (25 ± 1.0 ºC, R.H of of 65 ± 10% and fotofase of 14 h) and evaluated after
five days. A molecular characterization was performed to detect the genes cry1, cry2
and Vip for the isolates which obtained mortality over 95%. Isolates HD1 (Btk), Bt-
1043N-V, Bt-1034F, Bt-1009K, Bt-1000 and Bt-969A caused 100% mortality in the
test of pathogenicity and LC
50
of 1.17 x 10
3
, 1.45 x 10
3
, 1, 46 x 10
3
, 1.01 x 10
3
, 0.94 x
10
3
and 1.22 x 10
3
, respectively. Genes cry1, cry2 and Vip were not found in the
isolates tested, with other genes cry being able to cause the mortality of T. ni, since
the isolates tested are specific for the Lepidoptera order. These isolates showed
potential for the control of T. ni, being aggressive to this insect, with potential to be
used in a management program of this pest, however studies in field and semi-field
conditions, as well as formulation are necessary to integrate Bt in a program of
integrated handling of T. ni.
ix
Key words: IPM. Biological control. Entomopathogen. Toxins.
x
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES
ºC graus Celsius
CL
50
concentração letal para matar 50% dos insetos
PCR reação em cadeia da DNA polimerase
EUA Estados Unidos da América
km kilômetro
NPV vírus da poliedrose nuclear
AcMNPV vírus de poliedrose nuclear multinucleocapsideo
mm milímetro
g gramas
µg micrograma
mg miligrama
kDa quilodalton
h horas
min minutos
U.R umidade relativa
rpm rotação por minuto
mL mililitro
kgf kilograma-força
s segundos
µL microlitro
dNTP desoxinucleosídeo trifosfato
MgCl
2
cloreto de magnésio
U unidade de atividade enzimática
V volts
mM milimolar
µM micromolar
kb kilobase
pb pares de base
EDTA ácido etilenodiaminotetracético
DNA ácido desoxirribonucléico
xi
CONTEÚDO
RESUMO........................................................................................................................ VI
ABSTRACT .................................................................................................................. VIII
LISTA DE SÍMBOLOS E ABREVIAÇÕES ..................................................................... X
1 INTRODUÇÃO ............................................................................................................ 12
2 REVISÃO DE LITERATURA ...................................................................................... 14
2.1 Trichoplusia ni (Hüebner, 1802) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE) ............................ 14
2.1.1 Características gerais ......................................................................................... 14
2.1.2 Biologia de Trichoplusia ni (Hüebner, 1802) ..................................................... 14
2.1.3 Danos ................................................................................................................... 15
2.1.4 Controle químico ................................................................................................. 15
2.2 CONTROLE BIOLÓGICO ........................................................................................ 16
2.2.1 Controle microbiano ........................................................................................... 17
2.2.2 Bacillus thuringiensis ......................................................................................... 19
2.3 REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO EM CADEIA (PCR) .............................................. 23
3 MATERIAL E MÉTODOS ........................................................................................... 24
3.1 ISOLADOS DE Bacillus thuringiensis ....................................................................... 24
3.2 COLETA E CRIAÇÃO DE Trichoplusia ni ................................................................ 25
3.3 TESTES DE PATOGENICIDADE ............................................................................ 26
3.4 ESTIMATIVA DA CONCENTRAÇÃO LETAL MÉDIA (CL
50
) .................................... 27
3.5 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS DE Bacillus thuringiensis ..... 27
3.5.1 Reação de amplificação ...................................................................................... 29
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES ................................................................................ 31
5 CONCLUSÕES ........................................................................................................... 37
6 REFERÊNCIAS ........................................................................................................... 38
12
1 INTRODUÇÃO
Trichoplusia ni (Hüebner, 1802) (Lepidoptera: Noctuidae) é uma espécie polífaga
com cerca de 160 espécies de plantas hospedeiras. Dentre essas, podemos
destacar as crucíferas, além de soja e algodão, pela importância econômica. As
lagartas se alimentam das plantas, reduzindo a área foliar, prejudicando a
fotossíntese (SHOREY et al., 1962; SHELTON et al., 1982; JOST; PITRE, 2002).
Tradicionalmente, o controle dessa praga é realizado com aplicações de inseticidas
de amplo espectro, incluindo os carbamatos, organofosforados e piretróides. No
entanto, a popularização do uso de agroquímicos como forma única de controle de
pragas culminou no seu uso indiscriminado causando muitos problemas, como a
resistência de insetos e ácaros, os ataques intensos de pragas tidas como
secundárias, a ressurgência de pragas, os desequilíbrios biológicos e efeitos
prejudiciais ao homem, os insetos úteis e outros organismos, além de resíduos nos
alimentos, água e solo (GALLO et al., 2002; PARRA et al., 2002).
Entre os organismos promissores que podem ser utilizados no controle biológico de
pragas agrícolas, destacam-se os entomopatógenos que representaram cerca de
41% do volume dos produtos biológicos comercializados no mercado mundial com
um faturamento previsto para 330 milhões de dólares em 2008 (GUILON, 2008),
Atualmente são conhecidos muitos microrganismos entomopatogênicos,
especialmente fungos, vírus e bactérias, que podem ser empregados no controle
biológico (VALADARES-INGLIS et al., 1998). Além disso, a utilização de inseticidas
biológicos no controle de pragas apresenta diversas vantagens para o
agroecossistema, em comparação com o uso dos inseticidas químicos, como a
preservação dos inimigos naturais, menos agressão ao meio ambiente e produto
final com mais qualidade (MOSCARDI, 1999).
Dentre os microrganismos empregados no controle biológico, a bactéria Bacillus
thuringiensis (Bt) (Bacillaceae) destaca-se por apresentar atividade tóxica a diversas
espécies de pragas agrícolas e urbanas, sendo formadora de esporos capaz de
produzir inclusões cristalinas durante a esporulação (GLARE; O’CALLAGHAM,
2000; POLANCZYK; ALVES, 2003). O número de isolados de Bt que exibem alta
atividade inseticida vem crescendo, porém os produtos comerciais de bioinseticidas
atualmente usados no controle de pragas de lepidópteros são constituídos por
13
poucos isolados, podendo aumentar rapidamente a frequência de indivíduos
resistentes dentro de uma população a esses bioinseticidas (SWIECICKA et al.,
2008), pois já se detectou resistência em populações de estufas e campo de T. ni a
produtos de Bt kurstaki (Btk) (JANMAAT; MYERS, 2003).
A variabilidade genética existente entre diferentes isolados de Bt é caracterizada
principalmente por meio da utilização de técnicas que têm como base a Reação em
Cadeia da DNA Polimerase (PCR), muitas vezes evidenciando a presença de genes
desconhecidos e detectando diferenças entre as estirpes de Bt (CERÓN et al. 1995;
BRAVO et al., 1998; MARQUES et al., 2002; VILAS-BÔAS, 2002; LIMA et al., 2002).
Um aspecto importante no desenvolvimento de um novo bioinseticidas é a
descoberta de estirpes com maior atividade e melhor adaptadas às condições
ambientais onde esses produtos serão utilizados (DIAS, 1992).
Este trabalho teve como objetivo selecionar e caracterizar molecularmente os
isolados de Bt com potencial de ação tóxica para T. ni.
14
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 Trichoplusia ni (Hüebner, 1802) (LEPIDOPTERA: NOCTUIDAE)
2.1.1 Características gerais
As crucíferas cultivadas, assim como as silvestres e atualmente em plantios de
algodão no cerrado brasileiro, vêm sofrendo danos com a T. ni que é um inseto da
ordem Lepidoptera, da família Noctuidae. T. ni é uma praga encontrada em toda a
América e em outros continentes ocorrendo em abundância em um ano, podendo
passar dois a três anos sem ocorrer e ainda possui grande dispersão em vôos de
aproximadamente 200 km (CAPINERA, 1999).
2.1.2 Biologia de Trichoplusia ni (Hüebner, 1802)
O ciclo de ovo a adulto da T. ni varia de 18 a 25 dias, quando os insetos são criados
de 32 e 21 ºC, respectivamente (TOBA et al.,1973).
A fêmea coloca os ovos isoladamente na borda superior e inferior da superfície
foliar, embora agrupamentos de seis a sete ovos não sejam incomuns. Esses têm
coloração branca amarelada, com 0,6 mm de diâmetro e 0,4 mm de altura
(AGROFIT, 2009).
As lagartas eclodem entre dois a cinco dias após a oviposição não apresentando 4
pares de pernas na parte mediana do corpo, locomovendo-se como se estivessem
medindo palmo. Podem ter de 30 a 40 mm de comprimento com um número normal
de 5 instares. Essas lagartas não possuem dentes na mandíbula interna da face,
característica que as diferenciam das lagartas de Pseudoplusia includens (Walker,
1857) (Lepidoptera: Noctuidae). A coloração é verde-clara, apresentando três linhas
brancas em sentido longitudinal e três pares de falsas pernas (AGROFIT, 2009).
As pupas são verdes, com manchas marrons, e ficam presas às folhas através de
fios de seda. O estágio de pupa dura aproximadamente duas semanas (MCEWEN;
HERVEY, 1960; SHOREY et al., 1962; AGROFIT, 2009).
15
Os adultos são mariposas de coloração marrom-mosqueado e sem brilho cúpreo. O
estigma e a mácula possuem o mesmo tamanho, além de serem brancos
contornados por um brilho prateado. Apresentam ainda asa marrom-clara e um tufo
de escamas no abdome. Durante a fase adulta, que varia em média de 10 a 12 dias,
uma fêmea pode ovipositar de 300 a 600 ovos. Os adultos não possuem dimorfismo
sexual, no entanto a diferenciação dos sexos é feita no estádio de pupa pela
diferença da genitália do macho e fêmea (SHOREY, 1963; AGROFIT, 2009).
2.1.3 Danos
As lagartas de T. ni se alimentam de folhas, sendo que nos três primeiros instares se
limitam a uma alimentação na face inferior raspando o limbo foliar. No quarto e
quinto instares fazem grandes orifícios, e normalmente não se alimentam da
margem foliar. Nesse estádio, as lagartas podem consumir diariamente três vezes o
peso de seu corpo. Em repolho, no entanto, elas não só se alimentam das folhas
externas, mas também podem perfurar a cabeça, acumulando no local, material
fecal que forma uma massa pegajosa, tornando o produto impróprio para o consumo
(KIRBY; SLOSSER, 1984).
Infestações de T. ni são favorecidas pelas condições de estiagens prolongadas, que
provoca baixa umidade relativa do ar, e com isso baixa ou nenhuma presença de
fungos e vírus entomopatogênicos (GONDIM et al., 2001) Essa praga é ocasional
em plantios de algodão no Estado do Mississipi, EUA, que só atinge danos
consideráveis no final do plantio (JOST; PITRE, 2002). A alta densidade e vigoroso
crescimento das plantas são atraentes para a praga ovipositar fazendo com que as
densidades larvais sejam maiores sob essas condições (GREENE, 1984).
2.1.4 Controle químico
No Brasil, apenas os produtos químicos: deltametrina (piretróide), metamidofós
(organofosforado), permetrina (piretróide), cloridrato de cartape (bis(tiocarbamato)),
16
carbaril (metilcarbamato de naftila) e indoxacarb (oxadiazina) são registrados para o
controle de T. ni (AGROFIT, 2009).
Um dos produtos mais utilizados pelos produtores de crucíferas e algodão para o
controle de T. ni no Brasil é o indoxacarb, inseticida do grupo químico das
oxidiazinas, cuja ação é a inibição da alimentação após o tratamento (WING et al.,
1998).
2.2 CONTROLE BIOLÓGICO
O controle biológico é uma alternativa cada vez mais promissora para a agricultura,
uma vez que diversos estudos têm relatado a importância dos microrganismos
entomopatogênicos no controle de pragas na agricultura. Essa utilização não é nova
e vem sendo empregada, principalmente, após os anos 70, devido aos problemas
advindos da utilização dos agrotóxicos (AZEVEDO, 1998).
A importância dos microrganismos no controle de pragas é significativa sob diversos
enfoques como: a) proteção do potencial produtivo das culturas; b) diminuição
drástica do uso de produtos químicos tóxicos; c) preservação do meio ambiente; d)
diminuição dos custos na produção agrícola; e e) surgimento de novas indústrias.
Com todas essas vantagens, nota-se a importância que eles representam para a
agricultura moderna (ALMEIDA, 1984.)
As principais vantagens do controle biológico para os agricultores advêm do menor
impacto ambiental e maior segurança ao homem, tanto para quem aplica os
produtos quanto para o consumidor dos alimentos. Outra vantagem dos agentes de
controle biológico é sua maior seletividade, quando comparados com os agrotóxicos
(HABIB; ANDRADE, 1998).
Nos últimos anos, os inseticidas biológicos têm despertado um crescente interesse
como método alternativo para o controle de pragas, pois o público consumidor está
cada vez mais preocupado com a saúde e segurança, diante dos efeitos maléficos
dos agrotóxicos. A incorporação dessa forma alternativa como parte de um manejo
fitossanitário reduz os riscos ambientais e públicos do uso de inseticidas sintéticos
(ARCAS, 1996).
17
Embora os agrotóxicos sejam usados com sucesso na agricultura, seus efeitos
podem trazer consequências sobre os organismos não-alvos, problemas de
contaminação das águas superficiais e subterrâneas, resíduos em alimentos e
surgimento de populações de pragas resistentes. Tudo isso tem incentivado o
desenvolvimento de métodos alternativos de controle (MELO; AZEVEDO, 1998).
O parasitóide Voria ruralis (Fallén, 1810) (Diptera: Tachinidae), que ataca lagartas
médias ou grandes, e o parasitóide de ovos Trichogramma spp. também foram
relatados em T. ni. O predador Labidura riparia (Pallas, 1773) (Dermaptera:
Labiduridae) tem sido observado alimentando-se de lagartas e pupas em plantios de
crucíferas na Flórida, EUA. Liberações em massa de Trichogramma spp. têm sido
estudadas em várias culturas e mostrado eficácia em crucíferas, mas não tem sido
utilizado pelos produtores (CAPINERA, 1999).
O controle biológico de pragas no Brasil tem um grande caminho a ser trilhado, com
a biodiversidade tropical apresentando um grande número de espécies ainda
desconhecidas, adaptadas às nossas condições ambientais, com potencial para uso
tecnológico no controle de pragas. Constitui praticamente a única alternativa viável
de controle de pragas que atende à demanda mundial, cada vez maior, de produtos
e alimentos livres de resíduos tóxicos deixados pelas aplicações convencionais de
inseticidas químicos (ALVES et al., 2008).
2.2.1 Controle microbiano
As primeiras referências sobre a ocorrência de entomopatógenos sobre pragas e
insetos úteis no Brasil datam da década de 1920 (ALVES et al., 2008). Os primeiros
trabalhos no Brasil visando ao emprego de produtos à base de Bt foram realizados
por Figueiredo et al. (1960) e Pigatti et al. (1960).
Hoje são conhecidos muitos microrganismos que podem ser empregados no
controle biológico de insetos praga. Dentre eles, o Bt destaca-se por apresentar
atividade tóxica contra diversas ordens de insetos, como Lepidoptera, Diptera e
Coleoptera, onde se incluem importantes pragas brasileiras (VALADARES-INGLIS et
al., 1998).
18
Outros agentes de mortalidade natural ocorrem em T. ni no Brasil. Silva e Santos
(1980), em plantios de algodão no Brasil, verificaram a presença dos fungos
Nomurea riley, Entomophthora sp., o parasitóide Copidosoma truncatellum (Dalman,
1820) (Hymenoptera: Encyrtidae) e o vírus da poliedrose nuclear (NPV). Grecco et
al. (2008) encontraram isolados de Beauveria bassiana eficientes para o controle de
lagartas de T. ni. Também podemos destacar o uso de Bt, que no Brasil ainda é
pequeno, com apenas seis bioinseticidas registrados para o controle de 26 pragas
em florestas, hortaliças e grandes culturas (POLANCZYK et al., 2008). Além disso,
diversos projetos de pesquisas estão sendo realizados com o objetivo de selecionar
isolados de Bt para o controle de pragas e verificar seu efeito sobre inimigos naturais
(PRATISSOLI et al., 2007).
Na América do Norte, produtos à base de Bt são muito utilizados para o controle de
pragas florestais, principalmente: Lymantria dispar (Linnaeus, 1758) (Lepidoptera:
Lymantriidae), Choristoneura fumiferana (Clemens, 1865) (Lepidoptera: Tortricidae)
e Choristoneura occidentalis (Freeman, 1967) (Lepidoptera: Tortricidae). Nos EUA,
de 1980 até 1995, cerca de 2 milhões de hectares de florestas foram tratados com
Btk para o controle de L. dispar, em alguns casos resultando na erradicação da
praga. Porém, esse inseto ainda é o principal alvo de aplicações de Bt em florestas.
A partir da década de 90, a aplicação contra C. fumiferana nos EUA e Canadá
praticamente cessou, devido ao sucesso obtido na década anterior. Na Austrália
produtos formulados com Bt são utilizados para controle de pragas em algodão,
frutíferas, ornamentais, fumo, entre outras culturas (GLARE; O’CALLAGHAM, 2000;
Van FRANKENHUYZEN, 2000).
A partir da metade da década de 80, foram obtidas as primeiras plantas transgênicas
com a incorporação dos genes codificadores das proteínas tóxicas de Bt na cultura
do fumo e tomate (DIAS, 1992). Vários trabalhos vêm demonstrando a importância
das plantas transgênicas, expressando genes de Bt como instrumento no manejo
integrado de pragas (PILCHER et al., 1997).
No mundo todo, muitos esforços estão sendo realizados na busca de novas estirpes
que sejam efetivas contra outras pragas específicas (LEMOS et al., 1997). As
populações naturais dessa bactéria são muito diversas quanto à sua patogenicidade
(HABIB; ANDRADE, 1998). Sua eficiência se baseia em uma rápida ação apesar da
curta sobrevivência dos esporos e toxinas na folhagem (TREVOR, 1996).
19
Nos EUA, o vírus da poliedrose nuclear (NPV) ocorre naturalmente e reduz as
populações de T. ni em plantios de repolho. As lagartas que consomem as inclusões
do vírus morrem geralmente dentro de cinco a sete dias e ficam com um aspecto
cremoso de cor branca e inchada. O vírus é espalhado com a desintegração das
lagartas infectadas, um processo que é auxiliado pelas chuvas. A mortalidade de T.
ni pelo NPV tende a ser maior durante anos de uma precipitação maior. Porém, o
NPV tem poucos hospedeiros, o que dificulta sua comercialização (CAPINERA,
1999).
Também podemos destacar o vírus de poliedrose nuclear multinucleocapsideo
(AcMNPV) e granulovirus de T. ni (TnGV) que replicam eficientemente em lagartas
de T. ni. Após a fase de colonização e replicação no intestino médio epitelial, o
AcMNPV replica em todos os tecidos principais. A replicação do TnGV é restrita ao
tecido gorduroso do inseto (FEDERICI, 1993; BIDESHI; FEDERICI, 2000).
Um aspecto muito importante que deve ser considerado em controle biológico para o
desenvolvimento de novos bioinseticidas é a descoberta de agentes de controle
biológico com maior atividade e melhor adaptadas às condições ambientais onde
esses produtos serão utilizados (DIAS, 1992).
2.2.2 Bacillus thuringiensis
Dentre as bactérias entomopatogênicas, destaca-se o Bt que é uma espécie
cosmopolita, sendo encontrada em diversos substratos como solo, água, superfície
de plantas, insetos mortos e grãos armazenados (De MAAGD et al., 2001). As
células dessa bactéria têm forma de bastonete (alongada) de 1 µm por 3 a 5 µm
(HABID; ANDRADE, 1998), possuindo esporos elípticos e cilíndricos localizados na
região central e seu esporângio é pouco estendido (ALMEIDA; FILHO, 2006). É uma
bactéria Gram positiva e aeróbia, podendo facultativamente crescer em anaerobiose,
no intervalo de 10 a 45 ºC (MONNERAT; BRAVO, 2000).
A primeira menção a doenças em insetos causada por esse tipo de bactéria data de
1902, quando Ishiwata no Japão descreveu uma bactéria esporulante responsável
pela mortalidade do bicho-da-seda, Bombyx mori (Linnaeus, 1758) (Lepidoptera:
Bombycidae), e a chamou de Bacillus sotto. Em 1911, Berliner, na Alemanha,
20
reescreveu a mesma bactéria isolada a partir de lagartas da traça da farinha
Anagasta kuehniella (Zeller, 1879) (Lepidoptera: Pyralidae) e, em 1915, a chamou
de Bt, em homenagem à província de Thuringia (Alemanha) de onde as lagartas
foram coletadas (DIAS, 1992).
Embora geralmente o termo seja empregado para uma única espécie, levando em
consideração aspectos taxonômicos essa bactéria pertence a um complexo de
várias espécies (B. anthracis, B. cereus, B. mycoides, Bt e B. weihenstephanensis)
(POLANCZYK; ALVES, 2003).
As possibilidades de utilização da Bt foram logo reconhecidas em controle biológico,
e, em 1938, uma formulação à base dessa bactéria, a Sporeína, foi produzida na
França. A partir dos anos 1950, diversos países como a Rússia, Checoslováquia,
França, Alemanha e EUA começaram a produzir inseticidas biológicos à base dessa
bactéria (WEISER, 1986).
Na década de 1960, foi isolada uma estirpe de Btk, chamada HD-1 que apresentou
uma toxicidade de 2 a 200 vezes superior às estirpes normalmente utilizadas nos
produtos comerciais. A partir de então, a procura por outras estirpes, possuidoras de
novas toxinas foi estimulada e, em 1977, foi isolada uma estirpe eficaz contra
dípteros (GOLDBERG; MARGALIT, 1977). Alguns anos mais tarde, em 1983, outra
estirpe foi identificada como patogênica contra coleópteros (KRIEG et al., 1983).
No mundo inteiro, diversas estirpes de Bt foram isoladas e atualmente diversos
laboratórios continuam procurando por outras novas. Existem várias coleções
espalhadas pelo mundo e estima-se que existam mais de 60.000 estirpes
conhecidas. Entre essas, existem algumas que são eficazes contra diversas ordens
de insetos (lepidópteros, dípteros e coleópteros) e contra outros grupos de
invertebrados (nematóides, ácaros e protozoários) (CRICKMORE et al., 1995).
A Bt desenvolve-se, em condições aeróbicas, em meios artificiais bastante simples.
No início da esporulação, a Bt sintetiza uma grande quantidade de proteínas com
atividade inseticida. As proteínas acumuladas formam um corpo de inclusão
cristalina, razão pela quais elas são denominadas Cry (YAMAMOTO; DEAN, 2000).
Essas toxinas são codificadas por genes cry e sua toxicidade está ligada à região N-
terminal das cadeias polipeptídicas, enquanto que a porção C-terminal determina a
forma da estrutura do cristal (LI et al., 1991).
21
A toxicidade de Bt a insetos é devida à presença das inclusões cristalinas
paraespodais que apresentam formas variáveis e que se constituem de proteínas
com massa variável entre 27 a 140 kDa (AUGUSTYNIAK et al., 1997). O espectro de
ação de diferentes isolados de Bt depende da combinação das δ-endotoxinas
individuais presentes no cristal. Enquanto o esporo, que representa a forma de
resistência da bactéria, pode sobreviver durante vários anos, a durabilidade dos
cristais é altamente variável, dependendo das condições ambientais (HOFTE;
WHITELEY, 1989).
Após a ingestão dos esporos+cristais pelos insetos, os cristais sofrem ação do pH
intestinal e de protoxinas que em presença de enzimas digestivas (proteinases) são
convertidas em 4 ou mais polipeptídios tóxicos (δ-endotoxinas), que solubilizam o
cristal e ativam as toxinas. Estas, por sua vez, se ligam a receptores localizados no
tecido epitelial do intestino da lagarta, ocasionando a quebra do equilíbrio osmótico
da célula, propiciando o extravasamento do conteúdo intestinal para a hemolinfa do
inseto. Em consequência, a lagarta para de se alimentar, entra em paralisia geral e
morre por inanição ou septicemia (GLARE; O’CALLAGHAM, 2000). Não há atividade
direta de Bt nas fases de pupa e adulto dos insetos (MONNERAT; BRAVO, 2000).
Uma nova classe de toxinas, as Vip (Vegetative Insecticidal Protein) ou proteínas
vegetativas, com elevada toxicidade para lepidópteros, incluindo Agrotis ipsilon
(Hufnagel, 1767) (Lepidoptera: Noctuidae), Heliothis virescens (Fabr., 1781)
(Lepidoptera: Noctuidae), Helicoverpa zea (Bod., 1850) (Lepidoptera: Noctuidae),
Spodoptera exigua (Huebner, 1803) (Lepidoptera: Noctuidae) e Spodoptera
frugiperda (J. E. Smith, 1797) (Lepidoptera: Noctuidae) e estão presentes em
abundância no sobrenadante (células vegetativas, água e impurezas) (GLARE;
O’CALLAGHAM, 2000). As referidas toxinas causam paralisia do intestino e lise das
células do epitélio do intestino médio, de modo semelhante às proteínas Cry (YU et
al., 1997). De acordo com Rice (1999), análises do DNA feitas por PCR mostram
que o gene que codifica a toxina Vip3A é encontrado em cerca de 30% dos isolados
de Bt.
Uma das grandes vantagens da utilização de Bt é sua inocuidade ao homem,
animais domésticos e plantas, além de seu efeito não poluente ao ambiente. A
atividade inseticida dessa bactéria é devida à produção de inclusões protéicas
22
cristalinas durante a fase de esporulação que contém proteínas denominadas δ-
endotoxinas ou toxinas Cry (ARONSON et al., 1986).
Essa bactéria entomopatogênica pode ser considerada como o agente biológico de
maior potencial para o controle de insetos-praga florestais, agrícolas e vetores de
doenças, devido à especificidade das δ-endotoxinas aos insetos e invertebrado-
alvos, fazendo desse agente um componente chave em estratégias de manejo
integrado de pragas e controle de vetores de doenças (SCHNEPF et al., 1998).
As toxinas ativas contra lepidópteros estão associadas, principalmente, aos genes
cry1 e cry2, caracterizando determinadas subespécies e cepas de Bt. Dentre estas,
podem ser citadas Btk, Bt aizawai, Bt thuringiensis e Bt entomocidus (HÖFTE;
WHITELEY, 1989).
O produto à base de Bt com maior alcance no mercado mundial é o Dipel (Btk HD-
1). Esse produto, pouco tóxico para ácaros, coleópteros, dípteros e hemípteros é
altamente eficiente para 170 lepidópteros-praga (GLARE; O’CALLAGHAM, 2000).
Diversos fatores limitam a utilização dos referidos bioinseticidas: o seu custo, que na
maioria das vezes é superior ao dos inseticidas químicos; a baixa persistência em
campo da maioria das formulações devido à falta de proteção contra a radiação
ultravioleta; o baixo espectro de ação, a ineficácia contra pragas de solo e
endofíticas; e a ausência de translocação nas plantas, porém os autores enfatizam
que estão sendo desenvolvidas pesquisas para minimizar essas desvantagens
(NAVON, 2000).
Até os anos 80, a nomenclatura era confusa sendo baseada em propriedades
bioquímicas e na aglutinação de antígenos flagelares que são produzidos a partir de
células vegetativas (De BARJAC et al., 1980).
Outras técnicas foram propostas para a classificação do Bt através das proteínas
Cry, baseadas na sequência de aminoácidos codificada pelos genes, não levando
em consideração o perfil de toxicidade (CRICKMORE et al., 1995). Entretanto, a
semelhança na sequência de aminoácidos geralmente indica uma similaridade no
espectro dos insetos-alvo de uma proteína Cry. Uma única estirpe normalmente
sintetiza de uma a cinco proteínas Cry ou Cyt. A combinação dessas toxinas é que
define o espectro de atividade de uma estirpe (De MAAGD et al., 2001).
23
2.3 REAÇÃO DE POLIMERIZAÇÃO EM CADEIA (PCR)
O conhecimento detalhado do organismo estudado se faz necessário para o
sucesso no uso de Bt na agricultura ou no controle de pragas urbanas. No caso
desse entomopatógeno, a grande variabilidade genética identificada entre os
diferentes isolados leva à necessidade de utilização de técnicas avançadas, como a
PCR (Reação em Cadeia da DNA Polimerase) que evidenciarão a presença dos
genes responsáveis pela produção das proteínas específicas, direcionando os
trabalhos de bioensaios e possibilitando o seu uso de forma segura e específica, ou
seja, em pragas que tais cristais irão ou poderão atuar com comprovada eficiência
(CERÓN et al., 1995; BRAVO et al., 1998; VILAS-BÔAS, 2002; LIMA et al., 2002).
Descrita na década de 80 por Mullis e Faloona (1987), a técnica PCR permite obter
in vitro várias cópias de um determinado segmento de DNA (ácido
desoxirribonucléico), baseando-se na atividade da enzima DNA Polimerase que é
capaz de produzir uma cadeia de DNA complementando outra já existente,
obedecendo às seguintes etapas: a) extração do DNA que contém a região a ser
amplificada, b) escolha do segmento a ser amplificado e obtenção de “primers”
(iniciadores) específicos para o reconhecimento desse segmento, c) amplificação
que dará origem a várias cópias, fazendo-se uso de um termociclador; e, por fim, d)
leitura do produto amplificado após eletroforese e coloração.
A reação de PCR consiste em uma reação de polimerização de DNA em cadeia, na
qual se dá o enriquecimento de um fragmento específico de DNA por meio de sua
duplicação em modo exponencial, ou seja, o número de fragmentos amplificados
duplica-se a cada ciclo de reação pelo anelamento e extensão enzimática de um par
de oligonucleotídeos (pequenas moléculas de DNA fita simples) utilizados como
iniciadores (“primers”) que delimitam a sequência de DNA de fita dupla alvo da
amplificação. Assim, apenas fragmentos de DNA que tenham a mesma sequência
inicial de nucleotídeos são amplificados (SILVA-PEREIRA, 2003).
Com essa técnica, fragmentos específicos de DNA são amplificados e
posteriormente verificados quanto à presença ou não do(s) gene(s) em estudo
(GLARE; O’CALLAGHAM, 2000). Essa identificação por PCR prediz parcialmente a
atividade tóxica de determinado isolado a praga específica. É um método seguro e
24
rápido e pode substituir bioensaios preliminares para uma coleção de isolados
(PORCAR; JUÁREZ-PÉREZ, 2003).
A técnica de PCR é uma ferramenta que vem sendo utilizada para a caracterização
de Bt, pois permite amplificar uma sequência conhecida do DNA bacteriano e
determinar as relações filogenéticas entre estirpes de uma mesma espécie e de um
mesmo sorotipo (SILVA-WERNECK; MONNERAT, 2001).
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 ISOLADOS DE Bacillus thuringiensis
Os 60 isolados de Bt utilizados nos experimentos foram cedidos pelo Laboratório de
Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada (LGBBA), junto ao Departamento de
Biologia Aplicada a Agropecuária da Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinárias,
Campus de Jaboticabal-SP. Os isolados dessa coleção foram estocados na forma
de fitas de papel filtro impregnados com uma suspensão de esporos, e mantidos a 4
ºC no Núcleo de Desenvolvimento de Manejo Fitossanitário de Pragas e Doenças
(NUDEMAFI) do Centro de Ciências Agrárias da Universidade Federal do Espírito
Santo (CCA-UFES), em Alegre-ES (Quadro 1).
Os isolados de Bt utilizados neste trabalho foram coletados em solos de diferentes
locais do Brasil (Quadro 1). Para se ter um padrão, utilizou-se o isolado HD1 (Btk).
.
25
Quadro 1 - Isolados e local de origem de B. thuringiensis utilizados no experimento
(LGBBA) UNESP/Jaboticabal-SP.
3.2 COLETA E CRIAÇÃO DE Trichoplusia ni
A criação de T. ni foi iniciada a partir de coletas de lagartas feitas manualmente no
distrito de Aracê no município de Domingos Martins, Espírito Santo, em cultivos de
repolho e couve-flor, sendo acondicionadas em caixa de isolamento térmico. No
Laboratório de Entomologia do NUDEMAFI, as lagartas foram alimentadas com
folhas de couve até atingirem o estágio de pupa. Em seguida foram transferidas para
um recipiente (150 x 150 mm) com papel filtro umedecido e acondicionado em
Isolados de
Bt
Local de isolamento Isolados de
Bt
Local de isolamento
1001 Uberaba-MG 766 B Campo grande-MS
1009 K Uberaba-MG 985 Sacramento-MG
1034 F Sacramento-MG 805 B2 Viçosa-MG
1044 CN-V Coqueiral-MG 858 EC Patos de minas-MG
1000 Uberaba-MG 775 C Gurolândia-MG
1038 K Coqueiral-MG 857 CD Lagoa Formosa-MG
1077 C Boa Esperança-MG 814 B Ervália-MG
969 A Uberaba-MG 928 Ervália-MG
1043 N-V Coqueiral-MG 886 F Indefinido
1024 A Teixeiras-MG 862 CF2 Patos de minas-MG
1030 A Coqueiral-MG 858 H Patos de minas-MG
977 FA Uberaba-MG 937 H2 Uberaba-MG
1009 SLR Uberaba-MG S 646 Indefinido
CST 23.10 Indefinido 816 A Ervália-MG
1000 Q
1052 B
1005
1002 B
1044 CV-N
1010 J
1048 NM
1012
775 G
S 165
S 1328
948 G
1010 I
S 244
867 BC
810 B
Uberaba-MG
Coqueiral-MG
Uberaba-MG
Sacramento-MG
Coqueiral-MG
Uberaba-MG
Coqueiral-MG
Uberaba-MG
Gurolândia-SP
Indefinido
Indefinido
Ervália-MG
Uberaba-MG
Indefinido
Lagoa Formosa-MG
Ervália-MG
852 F
852 C
941 D
979 C
927 R
862 DE
1077 A
933 E
888 AD
878 B
1133
SEIVA1/1000Y
872 B
862 C
868 G
927 A 9.15
Viçosa-MG
Patos de minas-MG
Sacramento-MG
Viçosa-MG
Viçosa-MG
Patos de Minas-MG
Boa esperança-MG
Viçosa-MG
Ervália-MG
Patos de Minas-MG
Indefinido
Sete Lagoas-MG
Indefinido
Patos de Minas-MG
Residente Olegário-MG
Viçosa-MG
26
gaiolas de madeira (700 x 600 x 500 mm) revestidas por teflon. Após a emergência,
os adultos foram colocados em gaiolas com folhas de couve para oviposição e
alimentados com solução de mel a 10% em chumaço de algodão. Os ovos foram
coletados a cada 24 h, sendo que 10% destes foram utilizados para a manutenção
da criação e o restante para a realização dos experimentos. A dieta artificial utilizada
para manutenção da praga foi desenvolvida por Burton (1969). Lagartas recém
eclodidas de T. ni (± 3 dias) foram inoculadas em tubos de vidro contendo dieta,
sendo inoculadas duas lagartas por tubo. A criação permaneceu em sala climatizada
a 25 ± 2,0
o
C, 60 ± 15% de U.R e 14 h de fotofase. A cada seis meses foram
efetuadas reintroduções de novos espécimes na população da praga, com o objetivo
de diminuir a degeneração da criação.
3.3 TESTES DE PATOGENICIDADE
Os isolados foram multiplicados em meio de cultura BHI (“Brain Heart Infusion” ou
Infusão de Cérebro e Coração - Biobrás) a 30 ºC, sob agitação orbital a 180 rpm por
72 h para um crescimento padrão dos mesmos. Após a lise bacteriana, a mistura
contendo esporos, cristais e células vegetativas foram submetidas a 3
centrifugações consecutivas de 5.000 rpm por 20 min. Em seguida, uma alíquota de
1 mL da suspensão foi diluída 1.000 vezes em água destilada, e a concentração de
esporos determinada por meio de leitura em câmara de Newbauwer conforme
método descrito em Alves e Moraes (1998).
Lagartas de primeiro instar de T. ni foram utilizadas para a execução dos bioensaios
de patogenicidade, sendo conduzidos em câmara de fluxo laminar, previamente
esterilizada com luz ultravioleta por 20 min. A suspensão de Bt contendo 3 x 10
8
esporos/mL foi aplicada na superfície do disco de dieta artificial desenvolvida por
Burton (1969). Após a absorção e evaporação do excesso de água, 50 lagartas de
primeiro instar de T. ni, distribuídas em 5 repetições, foram acondicionadas
individualmente em gerbox plástico (65 x 25 mm). Para o controle foi aplicado água
destilada e esterilizada em autoclave vertical por 20 min a 1 kgf.
Os bioensaios permaneceram em câmara climatizada a 25 ± 1,0
o
C, 65 ± 10% de
U.R e 14 h de fotofase, sendo avaliados após 5 dias. O critério de mortalidade usado
27
para as lagartas foi o de estar imóvel e escurecida ou não conseguir se locomover
uma distância igual a do seu corpo. Os dados observados foram corrigidos pela
fórmula de Abbott (1925) e submetidos à análise de variância e, posteriormente, ao
teste de Scott-Knott, ao nível de 5%, ou seja:
Mortalidade corrigida = % de mortalidade no tratamento % de mortalidade na testemunha x 100
100 - % de mortalidade na testemunha
3.4 ESTIMATIVA DA CONCENTRAÇÃO LETAL MÉDIA (CL
50
)
Os bioensaios de CL
50
foram submetidos com apenas os isolados de Bt que
causaram 100% de mortalidade nos testes de patogenicidade, onde foram utilizados
os mesmos substratos alimentares e condições de ambiente mencionadas nos
bioensaios de patogenicidade.
A amplitude das concentrações testadas foi pré-estabelecida em ensaio preliminar
em valores que atendessem às exigências da análise de Probit (5 a 95% de
mortalidade). Para cada isolado foram testadas sete concentrações espaçadas
logaritmicamente e controle (água destilada e autoclavada), com 120 lagartas,
distribuídas em 3 repetições para cada concentração, totalizando 960 insetos por
isolado. Os bioensaios de estimativa da CL
50
foram avaliados após 5 dias da
aplicação. Os dados de mortalidade foram corrigidos e submetidos à análise de
Probit com a utilização do programa POLO-PC (Análise de Probit), (LEORA
SOFTWARE, 1987).
3.5 CARACTERIZAÇÃO MOLECULAR DOS ISOLADOS DE Bacillus thuringiensis
Para a realização das análises de Reação da Polimerase em Cadeia (PCR), o
material genético de cada um dos isolados foi obtido com a utilização de uma
técnica através de resina de troca iônica InstaGene Matrix, produzida pela Bio-
Rad®, seguindo as instruções do fabricante como descritas abaixo.
28
Os isolados de Bt foram obtidos pela inoculação de uma alíquota da solução
estoque de esporos, em placas de Petri, contendo meio BHI (“Brain Heart Infusion”
ou Infusão de Cérebro e Coração - Biobrás), incubadas em B.O.D. (Biological
Oxygen Demand), a 30 ± 0,5 ºC por 18 h e suspensas novamente em tubos para
microcentrífuga de 1,5 mL contendo 1,0 mL de água destilada esterilizada e
centrifugadas a 15.000 rpm por 2 min a 20 ºC.
Após centrifugação, o sobrenadante foi descartado, sendo adicionados 200 µL da
Matriz InstaGene Matrix (Bio-Rad®) e, em seguida o material foi incubado em banho
aquecido a 56 ºC por 20 min, agitado rigorosamente em aparelho do tipo ‘Vortex’
por 10 segundos e incubado em água fervente (100 ºC) por 8 min. A amostra foi
novamente agitada em aparelho do tipo ‘Vortex’ por 10 segundos e centrifugada a
20 ºC por 3 min. Por fim, 200 µL do sobrenadante foram colhidos e transferidos para
outro tubo de microcentrífuga esterilizado e o DNA armazenado a - 20 ºC até ser
utilizado.
Além das extrações dos DNA genômicos dos isolados utilizados, foi também
extraído DNA das linhagens padrão: Bt subsp. Kurstaki - HD1 (Lepidoptera -
específico) e Bt subsp. tenebrionis (Coleoptera - específico), que foram utilizadas
como controles positivos e negativos nas reações de amplificação por PCR. Os
iniciadores para os genes cry1, cry2 e Vip foram elaborados e otimizados no
laboratório de Genética de Bactérias e Biotecnologia Aplicada.
A identificação das subclasses do gene cry1 foi realizada para 5 subclasses (Tabela
1) em um volume de 20 µL, para cada isolado, contendo: 2 µL de DNA molde, 0,5 µL
de dNTPs; 0,8 µL de MgCl
2
; 0,4 µL de cada iniciador; 1,0 U da enzima Taq DNA
Polimerase (Invitrogen®); solução tampão para reação de PCR 1X concentrada
(Invitrogen); e água destilada Milli-Q previamente esterilizada, em seguida, 20 µL da
mistura foram depositados em microtubos para PCR e adicionados 2 µL da amostra
de DNA de cada isolado.
A identificação do gene cry2Aa (Tabela 1) foi realizada em um volume de 17 µL,
para cada isolado, contendo: 3,5 µL de dNTPs; 0,8 µL de MgCl
2
; 0,5 µL de cada
iniciador; 1,0 U da enzima Taq DNA Polimerase (Invitrogen®); 3,5 µL de solução
tampão; e 10,9 µL de água destilada Milli-Q previamente esterilizada, sendo, em
29
seguida, coletados 17 µL da mistura e depositados em microtubos para PCR e
adicionados 3 µL da amostra de DNA de cada isolado nos microtubos.
Para a identificação dos genes Vip2 e Vip5 (Tabela 1), a amplificação foi conduzida
em um volume de 17 µL para cada isolado, contendo: 0,5 µL de uma solução de
dNTPs; 0,8 µL de MgCl
2
; 0,5 µL de cada iniciador; 0,5 U da enzima Taq DNA
Polimerase (Invitrogen®); 2 µL de solução tampão; e 12,3 µL de água destilada Milli-
Q previamente esterilizada. Em seguida, 17 µL da mistura foram depositados em
microtubos para PCR e 3 µL da amostra de DNA de cada isolado foram distribuídos
nos microtubos.
Tabela 1 - Iniciadores utilizados nas reações de amplificação (PCR) dos isolados de
Bacillus thuringiensis testados para Trichoplusia ni
Iniciadores Sequências Genes
reconhecidos
Gral-Cry 1-1 5’CTGGATTTACAGGTGGGGATAT3’ cry1A, cry1B,
Gral-Cry 1-2 5’TGAGTCGCTTCGCATATTTGACT3’ cry1C, cry1D,
cry1E, cry1F,
cry1G, cry1H,
cry1I, cry1J,
cry1K
Cry2Aa 5’TTTCATCTGGTCTCATAGGG3’ cry2Aa
5’TGTAACTATTTCCATTCCCTC3’
Vip5 5’ATGACCAAGAATAATACTAAATTAAGC3’ Vip5
Vip2 5’TCTGGGCACAATAATTTATCC3’ Vip2
Em todos os lotes de reação, realizou-se um controle negativo no qual a quantidade
de DNA foi substituída por água Milli-Q, previamente esterilizada. Para as reações
de PCR realizou-se uma mistura ‘Mix’, onde se multiplicou a quantidade, em
microlitros, de cada reagente, com exceção do DNA, pelo número de amostras. Os
reagentes foram misturados até completa homogeneização.
3.5.1 Reação de amplificação
As reações de amplificação foram realizadas em aparelho termociclador (PTC - 100
“Programmable Thermal Controller” - MJ Research, inc.), equipado com circuito “Hot
30
Bonnet”, onde foi utilizado o seguinte programa para cry1: um passo inicial de
desnaturação de 95 ºC/5 min e 31 ciclos consistindo de um ciclo de desnaturação a
95 ºC/1 min, pareamento dos oligonucleotídeos iniciadores a 50 ºC/1 min e extensão
a 72 ºC/1 min e, ao final dos ciclos, um passo extra de extensão a 72 ºC/5 min. Ao
fim do programa, foi adicionado um passo para a manutenção da amostra a 5 ºC até
a retirada dos tubos do termociclador.
Para o cry2, utilizou-se o programa: um passo inicial de desnaturação de 95 ºC/10
min e 30 ciclos consistindo de um ciclo de desnaturação a 95 ºC/1 min, pareamento
dos oligonucleotídeos iniciadores a 50 ºC/1 min e extensão a 72 ºC/1 min e, ao final
dos ciclos, um passo extra de extensão a 72 ºC/10 min. Ao fim do programa, foi
adicionado um passo para a manutenção da amostra a 5 ºC até a retirada dos tubos
do termociclador.
Para a Vip, utilizou-se o programa: um passo inicial de desnaturação de 94 ºC/2 min
e 30 ciclos consistindo de um ciclo de desnaturação a 94 ºC/30 seg, pareamento dos
oligonucleotídeos iniciadores a 53 ºC/45 s e extensão a 72 ºC/1 min e, ao final dos
ciclos, um passo extra de extensão a 72 ºC/5 min. Ao fim do programa, foi
adicionado um passo para a manutenção da amostra a 4 ºC até a retirada dos tubos
do termociclador.
Após as amplificações, 5 µL das amostras foram transferidos para outro tubo
plástico e foi adicionado às amostras 3 µL de tampão de amostra (“loading buffer” -
0,5% de azul de bromofenol em glicerol 50%). O volume total de 8 µL de cada
amostra foi aplicado em gel de agarose a 1,5%, contendo brometo de etídeo (0,5
µg/mL) e submetido à eletroforese horizontal em cuba tipo “sunrise” (96 canaletas),
por 2 h, a 70 V, conduzida em tampão TEB 1X (Tris 89 mM, EDTA 2,5 mM e Ácido
Bórico 89 mM com pH 8,3), também adicionado de brometo de etídeo (0,5 µg/mL).
Em todas as eletroforeses realizadas, foi adotado o emprego de uma amostra de
DNA com fragmentos de tamanhos conhecidos, múltiplos de 1kb de DNA ladder®”,
produzida pela Invitrogen, a qual serviu como referência de migração eletroforética
para verificação dos tamanhos dos fragmentos obtidos nas reações de amplificação.
Utilizou-se, também, o controle negativo da reação no qual foi colocada água estéril
em substituição ao DNA genômico.
31
Os géis de agarose foram visualizados sob luz ultravioleta e fotodocumentados em
equipamento fotodocumentador (GEL DOC 2000 - Bio-Rad®), através do software
Quantity-one.
4 RESULTADOS E DISCUSSÕES
Os resultados encontrados evidenciam que há efeito de Bt sobre T. ni (F = 10,126; P
≥ 0,05; g.L = 244) (Tabela 2). Entre os isolados testados, 27 (45%) apresentam
mortalidade corrigida acima de 80% e dentre estes 5 (8,33%) apresentam uma
mortalidade de 100%, a mesma obtida pelo Btk nos testes de patogenicidade. Dos
outros, em 14 isolados (23,33%) constata-se uma mortalidade entre 59 e 79%, em 9
isolados (15%) entre 38 e 54% e 10 isolados (16,66%) entre 22,5 e 34% (Tabela 2).
Estes resultados mostram que 27 isolados são promissores para o controle de T.ni e
podem ser usados em futuros trabalhos para o controle dessa praga.
Para a estimativa da CL
50,
os dados se ajustaram ao modelo proposto, mostrando
um χ
2
não significativo e com baixa heterogeneidade. Os intervalos de confiança (P ≥
0,05) mostram que não há diferenças significativas entre os isolados (Tabela 3). O
HD1 (Btk) e o Bt-1043N-V, o Bt-1034F, o Bt-1009K, o Bt-1000 e o Bt-969A obtiveram
uma Cl
50
de 1,17 x 10
3
, 1,45 x 10
3
, 1,46 x 10
3
, 1,01 x 10
3
, 0,94 x 10
3
e 1,22 x 10
3
esporos/mL, respectivamente. Apesar de não haver diferença estatística, o isolado
Bt-1034F apresenta uma CL
50
19,66% menor que a CL
50
do padrão, evidenciando
que pode ser mais eficiente no controle dessa praga e mais econômico para o uso
de um futuro formulado, pois necessitará de menos esporos/mL para matar 50% dos
insetos. Porém novos estudos devem ser feitos para que esses isolados possam ser
usados em um futuro bioinseticida.
Para verificar a presença de toxinas cry1, cry2 e Vip nos isolados de Bt, foram
testados os isolados: Bt-1043N-V, Bt-1034F, Bt-1009K, Bt-1000, Bt-969A, Bt-
1044CN-V, Bt-1044CN-V, Bt-1038K e Bt-1001, que causaram mortalidade acima de
95%. Nenhum fragmento de DNA homólogos aos genes cry1, cry2 e Vip (genes
específicos da ordem Lepidoptera) foram encontrados nos isolados testados. No
entanto, todos os isolados de Bt podem ter novas toxinas Cry para o controle de
pragas da ordem Lepidoptera.
32
Tabela 2 - Mortalidade corrigida (%) (± EP) de Trichoplusia ni (Lepidoptera:
Noctuidae) inoculadas em dieta artificial contendo suspensão de diferentes isolados
de Bacillus thuringiensis, a 25 ± 1,0 ºC, U.R 65 ± 10% e fotofase de 14h
(continua)
Isolados Mortalidade (%)
Bt - HD1 (Btk)
100,00 ± 0,00 A
Bt - 1034F
100,00 ± 0,00 A
Bt - 1009K
100,00 ± 0,00 A
Bt - 1000
100,00 ± 0,00 A
Bt - 969A
100,00 ± 0,00 A
Bt - 1043N-V
100,00 ± 0,00 A
Bt - 1044CN-V
97,87 ± 2,12 A
Bt - 1038K 97,87 ± 12,25 A
Bt - 1001
97,87 ± 2,12 A
Bt - 1077C 95,74 ± 12,17 A
Bt - 1024A
93,61 ± 11,93 A
Bt - 1030A
93,61 ± 11,87 A
Bt - 977FA
91,61 ± 12,04 A
Bt - 1009SLR
91,48 ± 11,62 A
Bt - CST23.10
91,48 ± 12,54 A
Bt - 1000Q
91,48 ± 11,82 A
Bt - 1052B
89,36 ± 12,36 A
Bt - 1005
89,36 ± 11,97 A
Bt - 1002B 89,36 ± 11
,87 A
Bt - 1044CV-N
87,23 ± 14,07 A
Bt - 1010J
87,23 ± 11,71 A
Bt - 1048NM 85,11 ± 14,81 A
Bt - 1012 82,97 ± 10,41 A
Bt - 775G
82,97 ± 12,44 A
Bt - S165
80,85 ± 12,13 A
Bt - S1328 80,85 ± 11,32 A
Bt - 948G
80,85 ± 8,51 A
Bt - 1010I
80,85 ± 12,02 A
Bt - S244
78,72 ± 12,10 B
Bt - 867BC
72,34 ± 10,00 B
Bt - 810B
72,34 ± 12,20 B
Bt - 766B
72,34 ± 12,31 B
Bt - 985 70,21 ± 12,30 B
Bt - 805B2
70,21 ± 11,91 B
Bt - 858EC
68,08 ± 11,46 B
Bt - 775C
68,08 ± 12,20 B
Bt - 857CD
65,95 ± 11,60 B
Bt - 814B
65,95 ± 11,75 B
Bt - 928
61,70 ± 8,23 B
Bt - 746 61,70 ± 9,05 B
Bt - 886F 61,70 ± 10,54 B
Bt - 858H
59,57 ± 11,27 B
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferenciam entre si pelo teste de
Scott-Knott a 5%.
33
Tabela 2 - Mortalidade corrigida (%) (± EP) de Trichoplusia ni (Lepidoptera:
Noctuidae) inoculadas em dieta artificial contendo suspensão de diferentes isolados
de Bacillus thuringiensis, a 25 ± 1,0 ºC, U.R 65 ± 10% e fotofase 14h
(conclusão)
Isolados Mortalidade (%)
Bt - 937H2 53,19 ± 10,59 C
Bt - S646
51,06 ± 12,15 C
Bt - 816A 48,93 ± 12,13 C
Bt - 852F
42,55 ± 12,02 C
Bt - 852C
42,55 ± 12,25 C
Bt - 941D
40,42 ± 6,20 C
Bt - 979C
40,42 ± 10,39 C
Bt - 927R
38,29 ± 10,39 C
Bt - 862DE
38,29 ± 9,15 C
Bt - 1077A 33,19 ± 11,
45 D
Bt - 933E
26,80 ± 10,34 D
Bt - 888AD
26,80 ± 8,22 D
Bt - 878B
25,53 ± 8,20 D
Bt - 1133
25,53 ± 8,20 D
Bt - SEIVA 1/1002Y 24,68 ± 11,58 D
Bt - 872B
23,40 ± 6,05 D
Bt - 862C
23,40 ± 5,93 D
Bt - 868G
22,55 ± 10,67 D
Bt - 927A9.15 22,55 ± 7,03 D
CV (%) 26,17
Médias seguidas pela mesma letra na coluna não diferenciam entre si pelo teste de
Scott-Knott a 5%.
Tabela 3 - Resultados de dose/resposta de isolados de Bacillus thuringiensis a
lagartas de Trichoplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae)
CL
50
(IC
0,05
)
Isolado n α (10
2
; 10
3
) χ
2
g.l
Bt-HD1(Btk) 960 1,197 1,17 x 10
3
(6,04; 1,77) 5,59
ns
5
Bt-1043N-V 960 1,239 1,22 x 10
3
(8,25; 1,64) 3,57
ns
5
Bt-1034F 960 1,041 0,94 x 10
3
(5,10; 1,44) 5,23
ns
5
Bt-1009K 960 1,037 1,01 x 10
3
(5,13; 1,58) 6,85
ns
5
Bt-1000 960 1,175 1,46 x 10
3
(7,46; 2,21) 5,21
ns
5
Bt-969A 960 1,218 1,45 x 10
3
(5,62; 2,35) 7,82
ns
5
ns: não significativo; n =
número de insetos/isolado; g.l = graus de liberdade; α =
coeficiente angular; e IC = intervalo de confiança.
34
Estudos que vêm sendo realizados com Bt no controle de T. ni. MacIntosh et al.
(1990), estudando o efeito de Btk (HD-1: Cry1Ab e HD-73: Cry1Ac) para o controle
de T. ni, encontraram uma CL
50
de 0,19 e 0,09 µg/mL, respectivamente. Porém,
Swiecicka et al. (2008), estudando um isolado de Bt thuringiensis (Cry1Ab) em T. ni,
encontraram uma CL
50
de 16,9 µg/mL e 29,7 µg/mL em lagartas de segundo e
quarto instar, respectivamente. Segundo Ignoffo et al. (1981), o Bt israelensis que é
específico para Diptera apresentou uma CL
50
de 0,12 µg/mL enquanto o Btk
apresentou uma CL
50
de 0,016 µg/mL. Swiecicka et al. (2008) encontraram
mortalidade de 23,5% em lagartas de segundo instar de T. ni em suspensão de 1 x
10
4
esporos e cristais/mL de Bt após 24 h de inoculação. Para lagartas de terceiro
instar, foi observada uma mortalidade de 8% em 24 h e 40% em 48 h, em uma
suspensão de 2 x 10
4
esporos e cristais/mL. Os resultados encontrados neste
trabalho mostram uma CL
50
entre 0,94 e 1,46 x 10
3
esporos/mL em lagartas de T. ni,
valores 10 a 13 vezes menos que os encontrados por Swiecicka et al. (2008),
evidenciando a necessidade de se fazer a CL
50
para determinar a agressividade do
Bt em T. ni.
A variação na eficiência dos isolados testados, neste estudo, pode ser explicada por
uma série de fatores, relacionados ou não, ligados ao modo de ação desse
patógeno, como: dissolução do cristal, ativação da protoxina e ligação da toxina
ativada a receptores no epitélio intestinal, sendo que, este último mostra uma maior
complexidade funcional e é, geralmente, determinante no desenvolvimento da
doença no inseto-alvo (PEYRONNET et al., 1997).
Estes resultados evidenciam a grande variabilidade de resultados encontrados em
pesquisas envolvendo seleção e ação tóxica de Bt em diversas pragas, pois vários
trabalhos realizados confirmam com os dados positivos obtidos no presente
estudo.
Estudos demonstram que o Bt controla diversas pragas agrícolas e urbanas,
evidenciando o potencial desse entomopatógeno. Polanczyk (2004), estudando a
atividade de diversos isolados de Bt para o controle de S. frugiperda, uma das
pragas mais importantes da agricultura brasileira, principalmente em algodão, alfafa,
amendoim, arroz, aveia, batata, batata-doce, cana-de-açúcar, hortaliças, milho, soja
e trigo, chegou à mortalidade máxima de 45%. Pratissoli et al. (2007) estudaram o
efeito de 31 isolados de Bt em populações de S. frugiperda e encontraram 10
35
isolados para a população do Espírito Santo e 12 para a população de Minas
Gerais que causaram 100% de mortalidade. Silva-Werneck et al. (2000)
estudaram o efeito de 205 isolados de Bt sobre S. frugiperda e apenas um
causou mortalidade de 100%. Loguercio et al. (2001) testaram 3.408 isolados
nativos e somente 3,3% causaram mortalidade acima de 75%, sendo que 52% do
material testado mostrou-se pouco ativo (0 a 10%). Fatoretto (2002) avaliou a
eficiência de 115 isolados de Bt, de várias regiões do Brasil, contra S. frugiperda
obtendo 100% de mortalidade para 25 destes (21,7%) e acima de 75% de
mortalidade para 31 isolados (26,9%). Por outro lado, 7,8% dos isolados testados
foram inócuos ao inseto.
Os receptores geralmente são específicos para determinadas toxinas Cry, sendo
que para algumas espécies já foram identificados os que estão presentes nas
microvilosidades apicais do intestino médio. Várias N-aminopeptidases foram
identificadas como os principais receptores para Cry1 em B. mori, H. virescens, L.
dispar, Manduca sexta (Linnaeus, 1763) (Lepidoptera: Sphingidae), Plutella
xylostella (Linnaeus, 1748) (Lepidoptera: Plutellidae) T. ni. (GÓMEZ et al., 2001).
Um fator importante no manejo da praga e na diminuição de danos causados por ela
é quando devemos atuar no seu controle. Lagartas neonatas são mais suscetíveis
aos bioinseticidas do que outras que já estão em um estádio superior. Por isso é
importante que a aplicação do bioinseticida seja após a eclosão da lagarta,
aumentando assim o controle e a diminuição de possível aumento de insetos
resistentes na população ao bioinseticida.
Outro fator que deve ser considerado é o efeito subletal que esses isolados causam
nos sobreviventes após as aplicações de bioinseticidas, pois alguns isolados de Bt
são capazes de afetar a fisiologia dos adultos, refletindo na quantidade e qualidade
da oviposição, tornando-se incapazes de causar dano econômico às plantas. Abdul-
Sattar e Watson (1982) verificaram que o Bt afetou os adultos de H. virescens
prejudicando o acasalamento e a oviposição, sendo que a fecundidade dos ovos em
adultos sobreviventes foi praticamente nula. Se esse efeito não for considerado,
podem-se efetuar pulverizações desnecessárias de inseticidas, o que resulta em
elevação do custo/produção, maior contaminação ambiental e prejuízos aos inimigos
naturais presentes na área.
36
Outro aspecto que deve ser considerado é a utilização de proteínas purificadas de Bt
para que o resultado expresse a atividade de determinadas toxinas Cry, evitando a
influência de outras toxinas, como as Vip’s e exotoxinas. Testes com proteínas
purificadas também são utilizados para estudar a eficiência de uma determinada
toxina em relação ao inseto-alvo, porém esse não foi o objetivo deste trabalho que
foi conduzido utilizando-se a suspensão, provavelmente, contendo mais de uma
toxina. Outro fator importante foi a utilização de uma cepa “padrão” (Btk HD-1) para
comparação de eficiência dos isolados de Bt (BOHOROVA et al., 1997).
O Btk é muito usado no mundo para o controle de pragas, porém possui baixa
persistência após a aplicação devido à degradação pela luz solar e chuva (BEHLE et
al., 1997). As práticas atuais de controle microbiano ignoram frequentemente a
possibilidade de evolução da resistência, contudo, o uso sustentado dos
bioinseticidas depende de uma consideração desse fenômeno (JANMAAT, 2007).
Apesar das vendas de produtos à base de Bt totalizarem menos de 1% de todos os
inseticidas vendidos em todo o mundo, tem havido uma mudança no sentido da
utilização dos inseticidas, pois o Bt tem baixo risco ambiental em comparação com
os inseticidas. Embora exista uma forte tendência de reduzir ou mesmo acabar com
a utilização dos inseticidas em alguns países desenvolvidos, esse continuará a ser
indispensável para controlar insetos-pragas, pois a utilização intensiva de ambos
proporciona resistência, portanto, se faz necessário o uso de técnicas de manejo
fitossanitário (GLARE; O` CALLAGHAN, 2000).
Como não foi possível a identificação das toxinas específicas para Lepidoptera nos
isolados estudados, provavelmente novas toxinas podem estar causando a
mortalidade de T. ni, visto que as toxinas cry1, cry2 e Vip não foram identificadas.
Outras caracterizações moleculares com genes diferentes deverão ser feitas para
descobrir quais toxinas Cry podem estar causando a mortalidade de T. ni.
Os resultados demonstram que isolados de Bt são virulentos para T. ni, porém ainda
devem ser realizados vários estudos em laboratório, para se chegar a níveis em que
se possa testar esse produto em campo. Posteriormente, devem-se identificar
geneticamente quais são as proteínas, purificá-las para apresentarem apenas as
toxinas de interesse e, por fim, testar produtos formulados mais puros e estáveis às
condições ambientais, principalmente no que diz respeito à persistência da bactéria.
37
5 CONCLUSÕES
Todos os isolados testados apresentam ação tóxica para T. ni.
Os isolados Bt-1043N-V, Bt-1034F, Bt-1009K, Bt-1000 e Bt-969A mostram potencial
para o controle de T. ni, pois obtiveram 100% de mortalidade.
As toxinas cry1, cry2 e Vip não foram encontradas nos isolados estudados, porém
estudos com outras toxinas Cry devem ser realizados para se detectar qual toxina
causa a mortalidade das lagartas de T. ni.
38
6 REFERÊNCIAS
ABBOTT, W. S. A method of computing the effectiveness of a insecticide. Journal of
Economic Entomology, College Park, v. 18, p. 265-266, 1925.
ABDUL-SATTAR, A. A.; WATSON, T. F. Effects of Bacillus thuringiensis var. kurstaki
on tabacco budworm (Lepidoptera: Noctuidae) adult and egg stage. Journal of
Economic Entomology, College Park, v. 75, n. 4, p. 596-598, 1982.
AGROFIT. Sistema de Agrotóxicos e fitossanitários. Disponível em:
<http://extranet.agricultura.gov.br/agrofit_cons/principal_agrofit_cons>, acesso em
27 de jan. 2009.
ALMEIDA, J. E.; FILHO, A. B. Microrganismos no controle de pragas. In: PINTO, A.
S.; NAVA, D. E.; ROSSI, M. M.; MALERBO-SOUZA, D. T. (Eds.). Controle
Biológico de pragas na prática. Piracicaba, 2006. 287 p.
ALVES, S. B.; MORAES, S. A. Quantificação de inóculo de patógenos de insetos. In:
ALVES, S. B. (Ed.). Controle microbiano de insetos. Piracicaba: FEALQ, 1998. p.
765-777.
ALVES, S. B.; LOPES, R. B.; PEREIRA, R. M.; TAMAI, M. A. O controle microbiano
na América Latina. In: ALVES, S. B.; LOPES, R. B. (Orgs.). Controle Microbiano de
Pragas na América Latina: avanços e desafios. 1. ed. Piracicaba: FEALQ, 2008. p.
21-48.
ARCAS J. A. Produccion de bactérias entomopatógenas. In: LECUONA, R. E. (Ed.).
Microorganismos patógenos empleados em el control microbiano de insectos
plaga. Argentina, 1996. 337 p.
ARONSON, A. I.; BECKMAN, W.; DUNN, P. Bacillus thuringiensis and related insect
pathogens. Microbiology Reviews, Washington, v. 50, p. 1-24, 1986.
AUGUSTYNIAK, J.; DABERT, M.; WYPIJEWSKI, K. Transgenes in plants: protection
against viruses and insects. Acta Physiologia Plantarum, Berlin, v. 19, n. 4, p. 561-
569, 1997.
AZEVEDO, J. L. de. Controle Microbiano de insetos-pragas e seu melhoramento
Genético. In: MELO I. S. de.; AZEVEDO J. L. de. Controle Biológico. Jaguariúna:
Embrapa-CNPMA, 1998. 264 p.
BEHLE, R. W.; MCGUIRE, M. R.; SHASHA, B. S. Effects of sunlight and simulated
rain on residual activity of Bacillus thuringiensis formulations. Journal of economic
entomology, College Park, v. 90, p. 1560-1566, 1997.
BIDESHI, D. K.; FEDERIC, B. A. The Trichoplusia ni granulovirus helicase is unable
to support replication of Autographa californica multicapsid nucleopolyhedrovirus in
cells and larvae of T. ni. Journal of General Virology, London, v. 81, p. 1593-1599,
2000.
39
BOHOROVA, N.; CABRERA, M.; ABARCA, C.; QUINTERO, R.; MACIEL, A. M.;
BRITO, R. M.; HOISINGTON, D.; BRAVO. A. Susceptibility of four tropical
lepidopteran maize pests to Bacillus thuringiensis Cry1-type insecticidal proteins.
Journal of Economic Entomology, College Park, v. 90, n. 2, p. 412-415, 1997.
BRAVO, A.; SARABIA, S.; LOPEZ, L.; ONTIVEROS, H.; ABARCA, C.; ORTIZ, A.;
LINA, L.; VILLALOBOS, F. J.; PEÑA, G.; NUÑEZ-VALDEZ, M.; SOBERÓN, M.;
QUINTERO, R. Characterization of cry genes in a mexican Bacillus thuringiensis
strain collection. Applied and Environmental Microbiology, Washington v. 64, p.
4965-4972, 1998.
BURTON, R. L. Mass reaning the com earworn in the laboratory. U.S. Department
Agriculture Presentation Pap Ars, USA, p. 33-134, 1969.
CAPINERA, J. L. Cabbage Looper. Featured Creatures EENY-116. Entomology and
Nematology Department, University of Florida. Gaineshville, p. 1-7, 1999.
CERÓN, J.; ORTIZ, A.; QUINTERO, R.; GUERECA, L.; BRAVO, A. Specific PCR
primers directed to identify cryI and cryIII genes within a Bacillus thuringiensis strains
collection. Applied and Environmental Microbiology, Washington, v. 61, p. 3826-
3831, 1995.
CRICKMORE, N.; ZEIGLER, D. R.; FEITELSON, J.; SCHNEPF, E.; LAMBERT, B.;
LERECLUS, D.; GAWRON-BURKE, C.; DEAN, D. H. Revision of the nomenclature
for Bacillus thuringiensis cry genes. In: PROGRAM AND ABSTRACTS OF THE
28TH ANNUAL MEETING OF THE SOCIETY FOR INVERTEBRATE PATHOLOGY.
Society for Invertebrate Pathology, 1995. 14 p.
DE BARJAC, H.; VERON, M.; DUMANOIR, V. C. Caracterization biochimique et
sorologique dês souches de Bacillus sphaericus pathogenes ou non pour lês
moustiques. Annales de Microbiologie, Paris, p. 191-201, 1980.
DE MAAGD, R. A.; BRAVO, A.; CRIKMORE, N. How Bacillus thuringiensis has
envolved specific toxins to colonize the insect world. Trend in Genetics, Cambrigde,
v. 17, p. 193-199, 2001.
DESTÉFANO, R. H. R. Detecção e identificação de Metarhizium anisopliae em
larvas de Diatraea saccharalis por primers específicos. 2003. 72 f. Tese de
doutorado – Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queirós, Universidade de São
Paulo, Piracicaba.
DIAS, J. M. C. S. Produção e utilização de bioinseticidas bacterianos. Pesquisa
Agropecuária Brasileira, Brasília, v. 27, p. 59-76, 1992.
FATORETTO, J. C. Associação de bioensaio e caracterização molecular para
seleção de isolados de Bacillus thuringiensis efetivos contra Spodoptera
frugiperda. 2002. 105 f. Monografia (Graduação) – Faculdade de Ciências Agrárias
e Veterinárias, Universidade Estadual Paulista “Julio de Mesquita Filho”,
Jaboticabal.
40
FEDERICI, B. A. Viral pathobiology in relation to insect control. In: BECKAGE, N.;
THOMPSON, S. N.; FEDERICI, B. A. (Eds.). Parasites and pathogens of insects.
San Diego: Academic Press, v. 2. 1993. p. 81-101.
FIGUEIREDO, M, B.; COUTINHO, J. M.; ORLANDO. A. Novas perspectivas para o
controle biológico de algumas pragas com Bacillus thuringiensis. Arquivos do
Instituto Biológico, São Paulo, v. 27, p. 77-88, 1960.
GALLO, D.; NAKANO, O.; NETO, S. S.; CARVALHO, R. P. L.; BAPTISTA, G. C. de;
FILHO, E .B.; PARRA, J. R. P.; ZUCCHI, R. A.; ALVES, S. B.; VENDRAMIM, J. D.;
MARCHINI, L. C.; LOPES, J. R. S.; OMOTO, C. 2002. Entomologia Agrícola.
Piracicaba: FEALQ, 2002. 920 p.
GLARE, T. R.; O` CALLAGHAN, M. Bacillus thuringiensis: Biology, Ecology and
Safety, John Wiley, 2000. 350 p.
GOLDBERG, L. J.; MARGALIT, J. A bacterial spore demonstrating rapid larvicidal
activity against Anopheles sergenti, Uranotaenia unguiculata, Culex univitattus,
Aedes aegypti, and Culex pipiens. Mosquito news, v. 37, p. 355-358, 1977.
GÓMEZ, I.; OLTEANS, D. I.; GILL, S. S.; BRAVO, A.; SOBERÓN, M. Mapping the
epitope in cadherin-like receptors involved in Bacillus thuringiensis Cry1a toxin
interaction using phage display. The Journal of Biological Chemestry, Baltimore, v.
276, n. 31, p. 28906-28912, 2001.
GONDIM, D. M. C.; BELOT, J. L.; SILVIE, P.; PETIT, N. Manual de Identificação
das pragas, doenças, deficiências minerais e injúrias do algodoeiro no Brasil.
3. ed. Cascavel: COODETEC/CIRAD – CA, v. 33, 2001. 120 p.
GRECCO, E. D.; POLANCZYK, R. A.; PRATISSOLI, D.; VIANNA, L. F. S.; VIANNA,
U. R.; CELESTINO, F. N.; BARBOSA, W. F. Patogenicidade de isolados de
Beauveria bassiana para o controle da lagarta-mede-palmo das crucíferas
Trichoplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae). In: CONGRESSO BRASILEIRO DE
OLERICULTURA, 48., 2008. Maringá. Anais... Maringá: Associação Brasileira de
Olericultura, 2008. CD – ROM, p. S1905-S1909.
GREENE, G. L. Seasonal populations of eggs and larvae in North America. In:
LINDGREN, P. D.; GREENE, G. L. (Eds.). Suppression and management of cabbage
Looper populations. USDA Technical Bulletin, v. 1684, 1984. 150 p.
GUILLON, M. Current world situation on acceptance and marketing of
biological control agents (bcas). Disponível em:
<http://www.ibma.ch/pdf/20041028%20Presentation%20BCAs%20Thailand%20%20
&%20Indonesia%20Cuba.pdf>, acesso em 21 out. 2008.
HABIB, M. E. M.; ANDRADE, C. F. S. Bactérias entomopatogênicas. In: ALVES, S.
B. (ed.). Controle Microbiano de Insetos. Piracicaba: FEALQ, 1998. p. 383-446.
HOFTE, H.; WHITELEY, H. R. Insecticidal crystal proteins of Bacillus thuringiensis.
Microbiological Reviews, Washington, v. 53, p. 242-255, 1989.
41
IGNOFFO, C. M.; COUCH, T. L.; GARCIA, C.; KROHA, M. J. Relative activity of
Bacillus thuringiensis var. kurstaki and B. thurirngiensis var. israelensis against
larvae of Aedes aegypti, Culex quinquefasciatus, Trichoplusia ni, Heliothis zea and
Heliothis virescens. Journal of Economic Entomology, College Park, v. 74, p. 218-
222, 1981.
JANMAAT, A. F.; MYERS, J. Rapid evolution and the cost of resistance to Bacillus
thuringiensis in greenhouse populations of cabbage loopers, Trichoplusia ni.
Proceedings of the Royal Society of London, London, v. 270, 2263-2270, 2003.
JANMAAT, A. F. Development of Resistance to the Biopesticide Bacillus
thuringiensis kurstaki. In: VINCENT, C.; GOETTEL, M. S.; LAZAROVITS, G. (Eds.).
Biological control: a global perspective, case studies from around the world. CAB
International, 2007. p. 179-184.
JOST, D. J.; PITRE, H. N. Soybean looper and cabbage looper (Lepidoptera:
Noctuidae) populations in cotton and soybean cropping systems in Mississippi.
Journal of Entomological Science, Griffen, v. 37, 227-235, 2002.
LEMOS, M. V. F.; CARNEIRO, N. P.; CARNEIRO A. A. Novas Tecnologias Controle
Biológico por Bacillus thuringiensis. Revista Biotecnologia Ciência &
Desenvolvimento, Rio de Janeiro, n. 2, p. 12-17, 1997.
LEORA SOFTWARE. POLO-PC: Na user`s guide to Probit or Logit analysis. LeOra
Software, Berkely, 1987.
LI, J.; CARREL, J.; ELLAR, D. J. Cristal structure of insecticide delta-endotoxina from
Bacillus thuringiensis at 2,5 A resolution. Nature, London, v. 353, n. 7, p. 815-821,
1991.
LIMA, A. S. G.; GUIDELLI, A. M.; ABREU, I. L.; LEMOS, M. V. F. Identification of
new isolates of Bacillus thuringiensis using rep-PCR products and δ-endotoxin
electron microscopy. Genetics and Molecular Biology, v. 25, p. 225-229, 2002.
LOGUERCIO, L. L.; SANTOS, C. G.; BARRETO, M. R.; GUIMARAES, C. T.; PAIVA,
E. Association of PCR and feeding bioassays as a large-scale method to screen
tropical Bacillus thuringiensis isolates for a cry constitution with higher insecticidal
effect against Spodoptera frugiperda (Lepidoptera: Noctuidae) larvae. Letters in
Applied Microbiology, v. 32, p. 362-367, 2001.
KIRBY, R. D.; SLOSSER, J. E. Composite economic threshold for three
lepidopterous pests of cabbage. Journal of Economic Entomology, College Park,
v. 77, p. 725-733, 1984.
KRIEG, A.; HUGER, A. M.; LANGENBRUCH, G. A.; SCHNETTER, W. Bacillus
thuringiensis var. tenebrionis: ein neuer, gegenüber larven von coleopteren
wirksamer pathotyp. Zeitschrift fur angewandte Entomologie, v. 96, p. 500-508,
1983.
MACINTOSH, S. C.; KISHORE, G. M.; PERLAK, F. J.; MARRONE, P. G.; STONE, T.
B.; SIMS, S. R.; FUNCHS, R. L. Potentiation of Bacillus thuringiensis insecticidal
42
activity by serine protease inhibitors. Journal of Agricultural and Food Chemistry,
v. 38, p. 1145-1152, 1990.
MARQUES, E. K.; IKUTA, N.; LUNGE, V. R.; FONSECA, A. S. K. Diagnóstico
molecular e biotecnologia. In: SERAFINI, L.; BARROS, N. M.; AZEVEDO, J. L.
(Coords.). Biotecnologia: avanços na Agricultura e na Agroindústria. EDUCS, 2002.
p. 110-130.
MCEWEN, F. L.; HERVEY, R. I. C. Mass-rearing the cabbage looper, Trichoplusia ni,
with notes on its biology in the laboratory. Annals of the Entomological Society of
America, v. 53, p. 229-234, 1960.
MELO I. S.; AZEVEDO J. L. de. Controle Biológico. Embrapa-CNPMA, 1998. 264
p.
MONNERAT, R. G.; BRAVO, A. Proteínas bioinseticidas produzidas pela bactéria
Bacillus thuringiensis: modo de ação e resistência. In: MELO, I. S.; AZEVEDO, J. L.
(Eds.). Controle biológico. Embrapa-CNPMA, v. 3, p. 163-200, 2000.
MOSCARDI, F.; SOSA-GÓMEZ, D. R.; CORRÊIA-FERREIRA, B. S. Soybean IPM in
Brazil, with emphasis on biological control tactics. In: WORLD SOYBEAN
RESEARCH CONFERENCE, Chicago, v. 6, 1999. p. 331-339.
MULLIS, K.; FALOONA, F. Specific synthesis of DNA in vitro via a polymerase
catalysed chain reaction. Methods in Enzymology, v. 55, n. 2, p. 335-350, 1987.
NARDO, E. A. E.; CAPALBO, D. M. F. Utilização de agentes microbianos de controle
de pragas. Mercado, Riscos e Regulamentações. In: MELO, I. S. de.; AZEVEDO, J.
L. de. (Eds.). Controle Biológico. Embrapa-CNPMA, 1998. 264 p.
NAVON, A. Bacillus thuringiensis application in agriculture. In: CHARLES, J. F.;
DELÉCLUSE, A.; NIELSEN-LE ROUX, C. (Eds.). Entomopathogenic bacteria: from
laboratory to field application. Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 2000. p.
355-367.
PARRA, J. R. P.; BOTELHO, P. S. M.; CORRÊA-FERREIRA, B. S.; BENTO, J. M. S.
Controle biológico: terminologia. In: ______. (Eds.). Controle biológico no Brasil:
parasitóides e predadores. São Paulo: Manole, 2002. p. 1-16.
PEYRONNET, O.; VACHON, V.; BROUSSEAU, R. Effect of Bacillus thuringiensis
toxins on the membrane potential of lepidopteran insect midgut cells. Applied and
Environmental Microbiology, Massachusetts, v. 63, n. 5, p. 1679-1684, 1997.
PIGATTI, A.; FIQUEIREDO, M. B.; ORLANDO, A. Experiências de laboratório sobre
a atividade de novos inseticidas contra o mandarová da mandioca. Biológico, v. 26,
p. 47-51, 1960.
PILCHER, C. D.; RICE, M. E.; OBRYCKI, J. J. Field and laboratory evaluations of
transgenic Bacillus thuringiensis corn on secundary lepidopteran pests (Lepidoptera:
43
Noctuidae). Journal of Economic Entomology, College Park, v. 90, n. 2, p. 669-
678, 1997.
POLANCZYK, R. A.; ALVES, S. Bacillus thuringiensis: uma breve revisão.
Agrociência, v. 7, n. 2, p. 1-10, 2003.
POLANCZYK, R. A.; SILVA, R. F. P. da.; FIUZA, L. M. Isolamento de Bacillus
thuringiensis BERLINER a partir de amostras de solos e sua patogenicidade para
Spodoptera frugiperda (J. E. Smith) (Lepidoptera: Noctuidae). Agrociência, v. 10, n.
2, p. 209-214, 2004.
POLANCZYK, R. A.; VALICENTE, F. H.; BARRETO, M. R. Utilização de Bacillus
thuringiensis no controle de pragas agrícolas na América Latina. In: ALVES, S. B.;
LOPES, R. B. (Orgs.). Controle Microbiano de Pragas na América Latina:
avanços e desafios. 1. ed. Piracicaba: FEALQ, 2008. v. 1, p. 111-136.
PORCAR, M.; JUARÉZ-PÉREZ, V. PCR-based identification of Bacillus thuringiensis
pesticidal crystal genes. Microbiology Reviews, v. 26, n. 5, p. 419-432, 2003.
PRATISSOLI, D.; POLANCZYK, R. A.; GRECCO, E. D.; FERREIRA, R. A.; HOLTZ,
A. Efeito entomotóxico de novos isolados de Bacillus thuringiensis em duas
populações de Spodoptera frugiperda oriundas de minas gerais e do espírito santo.
Revista Brasileira de Milho e Sorgo, Sete Lagoas, v. 6, n. 2, p. 140-148, 2007.
RICE, W. C. Specific primers for the detection of Vip3A insecticidal gene within a
Bacillus thuringiensis collection. Letters and Applied Microbiology, v. 28, n. 5, p.
378-382, 1999.
SCHNEPF, E.; CRICKMORE, N.; Van RIE, J.; LERECLUS, D.; BAUM, J.;
FEITELSON, J.; ZEIGLER, D. R.; DEAN, D. H. Bacillus thuringiensis and its
pesticidal crystal proteins. Microbiology and Molecular Biology Reviews, v. 62, n.
3, p. 775-806, 1998.
SHELTON, A. M.; ANDALORO, J. T.; BARNARD, J. Effects of cabbage looper,
imported cabbage worm, and diamondback moth on fresh market and processing
cabbage. Journal of Economic Entomology, College Park, v. 75, p. 742-745, 1982.
SHOREY, H. H.; ANDRES, L. A.; HALE, R. L. The biology of Trichoplusia ni
(Lepidoptera: Noctuidae). I. Life history and behavior. Annals of the Entomological
Society of America, v. 55, p. 591-597, 1962.
SHOREY, H. H. The biology of Trichoplusia ni (Lepidoptera: Noctuidae). II. Factors
affecting adult fecundity and longevity. Annals of the Entomological Society of
America, v. 56, p. 476-480, 1963.
SILVA-PEREIRA, I. Amplificação de DNA por PCR. In: AZEVEDO, M. O.; FELIPE,
M. S. S.; BRIGIDO, M. M.; MARANHÃO, A. Q.; SOUZA, M. T. (Orgs.). Manual sobre
Técnicas Básicas em Biologia Molecular. Brasília: Editora da UnB, 2003, v. 01, p.
99-110.
44
SILVA-WERNECK, J. O.; ABREU NETO, J. R. M. V.; TOSTES, A. N.; FARIA, L. O.;
DIAS, J. M. C. S. Novo isolado de Bacillus thuringiensis efetivo contra a lagarta-do-
cartucho. Pesquisa Agropecuária Brasileira, v. 35, n. 1, p. 221-227, 2000.
SWIECICKA, I.; BIDESHI, D. K.; FEDERICI, B. A. Novel Isolate of Bacillus
thuringiensis subsp. thuringiensis that produces a quasicuboidal crystal of Cry1Ab21
toxic to larvae of Trichoplusia ni. Applied and Environmental Microbiology,
Washington, p. 923-930, 2008.
TOBA, H. H.; KISHABA, A. N.; PANGALDAN, R.; VAIL, P. V. Temperature and the
development of the cabbage looper. Annals of the Entomological Society of
America, Washington, v. 66, p. 965-974, 1973.
TREVOR, A J. Utilización de bactérias para el control de insectos plaga de la
agricultura. In: LECUONA, R. E. (Ed.). Microorganismos patógenos empleados
em el control microbiano de insectos plaga. Argentina, 1996. 337 p.
VALADARES-INGLIS, M. C.; MELO I. S. Métodos de extração de DNA e sua
aplicação em estudos genéticos e ecológicos. In: MELO, I. S.; AZEVEDO, J. L.
(Eds.). Controle Biológico. Embrapa-CNPMA, v. 1, 1998. p. 187-203.
VILLAS-BÔAS, G. F. L. T. Diversidade e estrutura genética de populações de
Bacillus thuringiensis e de Bacillus cereus. 2002, Tese de Doutorado –
Faculdade de Ciências Agrárias e Veterinária, Universidade Estadual Paulista,
Jaboticabal.
Van FRANKENHUYZEN, K. Application of Bacillus thuringiensis in forestry. In:
CHARLES, J. F.; DELÉCLUSE, A.; NIELSEN-LE ROUX, C. (Eds.).
Entomophatogenic bacteria: from laboratory to field application Netherlands:
Kluwer Academic Publishers. 2000. p. 371-381.
WEISER J. Impact of Bacillus thuringiensis on applied entomology in Eastern Europe
and in Soviet Union. In: KRIEG A.; HUGER A. M. (Eds.). Mitteilungen aus der
Biologischen Bundesanstalt für Land und Forstwirtschaft Berlin-Dahlem Heft.
Paul Parey. 1986. 233 p.
WING, K. D.; SCHNEE, M.; SACHER, M.; CONNAIR, M. A novel oxidiazine
insecticide is bioactivated in lepidopteran larvae. Archives of insect biochemistry
and physiology, New York, v. 37, p. 91- 103, 1998.
YAMAMOTO, T.; DEAN, D. H. Insecticidal proteins produced by bacteria pathogenic
to agriculturas pests. In: CHARLES, J. F.; DELÉCLUSE, A.; NIELSEN-LE, R. C.
(Eds.). Entomopathogenic bacteria: from laboratory to field application.
Netherlands: Kluwer Academic Publishers, 2000. p. 81-100.
YU, C. G.; MULLINS, M. A.; WARREN, G. W.; KOZIEL, M. G.; ESTRUCH, J. J. The
Bacillus thuringiensis vegetative insecticidal protein Vip3A lyses midgut epithelial
cells of susceptible insects. Applied and Environmental Microbiology,
Washington, v. 63, p. 532-536, 1997.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
