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UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
Pró-reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação
Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal
Márcia Nieves Carneiro da Cunha
Seleção de actinomicetos isolados de liquens da região Amazônica
produtores de inibidores de β-lactamases e sua atividade
antimicrobiana frente a isolados de mastite bovina
Recife, 2010
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ii
UNIVERSIDADE FEDERAL RURAL DE PERNAMBUCO
Pró-reitoria de Pesquisa e Pós-Graduação
Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal
Márcia Nieves Carneiro da Cunha
Seleção de actinomicetos isolados de liquens da região Amazônica
produtores de inibidores de β-lactamases e sua atividade
antimicrobiana frente a isolados de mastite bovina
Dissertação apresentada ao Programa de Pós
Graduação em Biociência Animal da
Universidade Federal de Pernambuco, como
pré-requisito parcial para obtenção do grau de
Mestre em Biociência Animal
Orientadora: Profª Drª Ana Lúcia Figueiredo Porto
Co-Orientadora: Profª Drª Tatiana Souza Porto
Recife, 2010
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iii
iv
MÁRCIA NIEVES CARNEIRO DA CUNHA
Seleção de actinomicetos isolados de liquens da região Amazônica produtores de
inibidores de β-lactamases e sua atividade antimicrobiana frente a isolados de
mastite bovina
Dissertação apresentada à Universidade Federal Rural de Pernambuco, como parte
das exigências do Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal, para
obtenção do título de Mestre.
APROVADO EM: 25 de fevereiro de 2010
______________________________
PRESIDENTE:
Profa. Dra. Ana Lúcia Figueiredo Porto - Departamento de
Morfologia e Fisiologia Animal – UFRPE
______________________________
EXAMINADOR EXTERNO:
Prof. Dr. Attilio Converti – Departamento de
Engenharia Química da Universidade de Genova-Itália
______________________________
EXAMINADOR EXTERNO: Profa. Dra. Janete Magali de Araújo – Departamento
de Antibióticos -UFPE
_________________________________
EXAMINADOR EXTERNO:
Profa. Dra. Maria Taciana Cavalcanti Vieira Soares -
Departamento de Morfologia e Fisiologia Animal – UFRPE
________________________________
SUPLENTE:
Prof. Dr. Celso de Amorim Câmara - Departamento de Química -
UFRPE
v
DEDICO
A minha mãe Maria das Neves, minha
grande incentivadora, por todo amor
e apoio a mim oferecidos nos bons e
maus momentos da minha vida.
Mainha eu te amo, obrigada por tudo!
vi
AGRADECIMENTOS
A Deus, que ilumina meus dias, por ter me dado força nos momentos de
fraqueza, calma nos momentos de desespero, saúde, sabedoria e conforto para a
execução deste trabalho.
Ao Painho e a Mainha pela paciência, atenção e amor dedicados a mim, sem
os quais seria quase impossível chegar onde estou.
A minha família, por todo o apoio e confiança.
Ao meu tio Luiz Claudio e a minha tia Eliete, por toda ajuda oferecida
A minha querida avó Juracy e ao meu tio Roberto pelo auxilio oferecido nas
primeiras etapas da minha caminhada até aqui.
Aos amigos, que se fizeram sempre presentes durante esta caminhada.
A minha querida orientadora Profa. Dra. Ana Lúcia Figueiredo Porto, por
acreditar em meu potencial, pelo carinho, dedicação e incentivo fundamentais para a
conclusão deste trabalho.
A Profa. Dra. Tatiana Souza Porto, pela co-orientação, por seus valiosos
ensinamentos, pela paciência, amizade e principalmente pela calma transmitida nos
momentos de desespero, quando tudo parecia estar errado. Obrigada Tati!
As Profa. Dra. Janete Magali de Araújo
, Maria Francisca Simas e ao Prof. Dr.
Rinaldo Aparecido Mota por cederem os microrganismos utilizados neste estudo.
Ao apoio financeiro do CNPQ, e as bolsas de estudo oferecidas pela CAPES
e da FACEPE
.
Ao Professor Jose Luiz de Lima Filho, diretor do LIKA, por ter permitido que
fossem utilizadas as instalações e equipamentos possibilitando parte da execução
deste projeto.
Aos amigos do grupo de pesquisa Ana Porto, por todas as experiências
trocadas e pelo convívio alegre e descontraído, Valeu!!!
vii
Aos funcionários do LIKA, que tanta ajuda prestaram ao longo da execução
deste trabalho.
À Dra. Daniela de Araújo Marques e a Profa. Dra. Keila Aparecida Moreira
pelas sugestões oportunas que acrescentaram muito ao trabalho.
Aos colegas de Pós-Graduação pelos momentos de estudo e dedicação
durante a obtenção dos créditos
Aos professores da Pós-Graduação, pela ajuda e conhecimentos repassados
ao longo do curso de Mestrado em Biociência Animal.
A todas as pessoas aqui não mencionadas, mas que de alguma forma
contribuíram para a realização deste sonho. Obrigada!!!
viii
RESUMO
A mastite bovina é uma das principais enfermidades que acometem os rebanhos
leiteiros no mundo, sendo considerada um obstáculo à sua exploração lucrativa. As
maiores perdas causadas pela mastite são devidas à diminuição na produção de
leite, depreciação na qualidade nutritiva, custo de tratamento, custo de atendimento
veterinário e laboratorial e perdas no potencial genético. Vários microorganismos
são citados como agentes etiológicos da mastite bovina sendo que as espécies mais
frequentemente isoladas são
Staphylococcus aureus, Streptococcus agalactiae,
Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis e Escherichia coli.
Os antibióticos
β-lactâmicos são importantes agentes antibacterianos, porém sensíveis às enzimas
β-lactamases, capazes de clivar o anel β-lactâmico, tornando-os inativos. Os
inibidores de β-lactamases são uma alternativa para o tratamento de doenças
causadas por bactérias resitentes à penicilina. Neste estudo foi avaliada a
capacidade de produzir inibidores de β-lactamases por 71 actinomicetos isolados de
liquens da Região Amazônica e sua atividade antimicrobiana utilizando
Staphylococcus aureus, resistentes à penicilina, isolados de mastite bovina. A
seleção dos actinomicetos que produziram inibidores de
β-lactamases foi realizada
através da técnica de bloco de gelose contra
Klebsiella pneumoniae ATCC 29665 e
os actinomicetos selecionados foram testados contra
Staphylococcus aureus
resistentes. Os melhores produtores de inibidores de β-lactamases foram
Streptomyces sp. DPUA 1542 e Nocardia sp DPUA 1571, os quais foram
submetidos a cultivo submerso para o estudo da curva de crescimento, pH e
atividade antimicrobiana. Os maiores halos de inibição, utilizando
S. aureus, foram
obtidos após 96 horas de cultivo tanto para
Nocardia sp (13,5 e 12,0 mm) como para
Streptomyces sp. (8,0 e 14,0 mm) com os testes-difusão nos discos e poços,
respectivamente.
Nocardia sp DPUA 1571 foi utilizado na produção de inibidores de
β-lactamases por planejamento fatorial onde a influencia de três variáveis foi
avaliada: concentrações da fonte de carbono (0,5, 1,0 e 1,0%), concentrações de
fonte de nitrogênio (1,0, 2,5 e 4,0%) e pH (6,0, 6,5 e 7,0). A produção ocorreu em
Erlenmeyers de 250mL contendo 100mL do meio de cultivo MS-2 modificado de
acordo o modelo experimental, os frascos foram incubados em agitador orbital (200
rpm) a 28°C por um período de 120 horas e a cada 24 horas, alíquotas de 5mL
foram retiradas e centrifugadas a 5.000 rpm por 20 minutos a 4ºC, para a
ix
determinação da atividade biológica e peso seco. A atividade biológica do líquido
metabólico foi realizada através da técnica de difusão em disco e poço, nas
melhores condições de cultivo (ensaio 3) com concentração da fonte de carbono de
1,0%, concentração do filtrado de soja de 1% e o pH 6,0, foram obtidos halos de
inibição de até 22mm de diâmetro frente aos microrganismos teste utilizados. Os
resultados permitiram concluir, que os actinomicetos isolados de liquens da Região
Amazônica são uma fonte promissora de inibidores de
β-lactamases, com potencial
para aplicação futura na indústria farmacêutica.
Palavras-chave: Inibidores de β-lactamases, Mastite, Actinomicetos,
Staphylococcus aureus, Atividade antimicrobiana.
x
ABSTRACT
Bovine Mastitis is one of the main diseases that affect the dairy herds in the world
and is considered one of the greatest obstacles to their operation profitable. The
greatest losses from mastitis are due to the decrease in milk production, depreciation
in nutritional quality, treatment cost, cost of veterinary care and laboratory losses in
genetic potential. Several microorganisms are cited as agents of bovine mastitis and
the species most frequently isolated are Staphylococcus aureus, Streptococcus
agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis and Escherichia coli.
The β-lactam antibiotics are important antibacterial agents, but sensitive to β-
lactamase enzymes capable of cleaving the β-lactam ring, rendering them inactive.
Inhibitors of β-lactamases are an alternative for diseases treatment caused by
resistant-penicillin bacteria. This study evaluated the ability to produce β-lactamase
inhibitors by 71 actinomycetes isolated from lichens of the Amazonian and its
antimicrobial activity using Staphylococcus aureus, penicillin-resistant isolates of
bovine mastitis. The selection of actinomycetes that produced β-lactamases
inhibitors was performed using the agar block technique against Klebsiella
pneumoniae ATCC 29665 and selected actinomycetes were tested against
Staphylococcus aureus penicillin resistant. The best producers of β-lactamase
inhibitors were Streptomyces sp. DPUA 1542 and Nocardia sp DPUA 1571, which
were subjected to submerged cultivation in the study of the growth curve, pH and
antimicrobial activity. The largest inhibition zones using S. aureus, were obtained
after 96 hours of culture for both
Nocardia sp (13.5 and 12.0 mm) and for
Streptomyces sp. (8.0 and 14.0 mm) with diffusion-tests on the discs and wells,
respectively. Nocardia sp DPUA 1571 was used in the production of inhibitors of β-
lactamases by factorial design where the influence of three variables: concentrations
of carbon source (0.5, 1.0 and 1.0%), concentrations of nitrogen source (1.0, 2.5 and
4.0%) and pH (6.0, 6.5 and 7.0) were evaluated. The production carried out in 250mL
flasks containing 100mL of culture medium MS-2 modified according to the
experimental design, the flasks were incubated in an orbital shaker (200 rpm) at 28 °
C for 120 hours and each 24 hours, aliquots of 5 mL were withdrawn and centrifuged
at 5000 rpm for 20 minutes at 4 ° C for the study of biological activity and dry weight.
The biological activity of the liquid assay was performed using the diffusion-tests on
the discs and wells, the best cultive conditions (test 3) with concentration of carbon
xi
source of 1.0% concentration of the soy bean flour 1% and pH 6,0, were obtained
from the inhibition of up to 22mm diameter test against microorganisms used. The
results showed that the actinomycetes are a promising source of β-lactamase
inhibitors, demonstrated the potential application to pharmaceutical industry.
Key Words: β-lactamase inhibitors, Actinomycetes, antimicrobial activities,
Staphylococcus aureus, bovine mastitis
xii
SUMÁRIO
LISTAS DE FIGURAS ............................................................................................XIV
LISTA DE TABELAS ...............................................................................................XV
1.0 INTRODUÇÃO ....................................................................................................15
1. INTRODUÇÃO ...............................................................................................16
2.0 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...............................................................................18
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ...........................................................................19
2.1 Mastite Bovina..............................................................................................19
2.1.1 Classificação das Mastites ....................................................................19
2.1.2. Mastite Bovina causada por Staphylococcus aureus............................21
2.1.3 Tratamento das Mastites Bovinas..........................................................22
2.2 Produção de Antibióticos..............................................................................22
2.3 Actinomicetos...............................................................................................23
2.4 Resistência Bacteriana.................................................................................24
2.5 Inibidores de β-lactamases ..........................................................................26
3.0 OBJETIVOS........................................................................................................29
3. OBJETIVOS ...................................................................................................30
3.1 Objetivo Geral ..............................................................................................30
3.2 Objetivos Específicos ...................................................................................30
4.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS...................................................................31
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS................................................................32
CAPITULO I ................................................................................................36
RESUMO.................................................................................................37
ABSTRACT .............................................................................................38
INTRODUÇÃO ........................................................................................39
MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................40
RESULTADOS E DISCUSSÃO...............................................................42
CONCLUSÕES .......................................................................................45
AGRADECIMENTOS ..............................................................................45
xiii
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................45
CAPITULO II ...............................................................................................54
RESUMO.................................................................................................55
ABSTRACT .............................................................................................56
INTRODUÇÃO ........................................................................................56
MATERIAIS E MÉTODOS.......................................................................59
RESULTADOS E DISCUSSÃO...............................................................62
CONCLUSÕES .......................................................................................70
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................71
Anexo I........................................................................................................76
xiv
LISTAS DE FIGURAS
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Figura 1. Estrutura química de inibidores de β-lactamases mais utilizados na clínica
médica (Venkatesan et al., 2004)...............................................................................24
CAPITULO I
Figura 1. Curva de crescimento e de pH do Streptomyces sp. DPUA 1542 e do
Nocardia sp. DPUA 1571 cultivados no meio MS-2 em agitador orbital (200rpm) a
28°C por 144 horas....................................................................................................53
CAPITULO II
Figura 1. Gráfico de Pareto da produção de inibidores de β-lactamases por Nocardia
sp . DPUA 1571 tendo como variável resposta a biomassa......................................64
Figura 2- Gráfico de Pareto da produção de inibidores de β-lactamases por Nocardia
sp . DPUA 1571 para a variável resposta atividade antimicrobiana (halos de inibição)
frente a
Klebsiella pneumoniae ATCC 29665 após 120 horas de
cultivo.........................................................................................................................65
Figura 3. Gráfico da atividade antimicrobiana frente à Klebsiella pneumoniae ATCC
29665 em diferentes níveis de pH, concentração de farinha de soja e concentração
de glicerol de acordo com o planejamento fatorial descrito na Tabela
2..................................................................................................................................66
Figura 4- Gráfico de Pareto da produção de inibidores de β-lactamases por Nocardia
sp . DPUA 1571 para a variável resposta atividade antimicrobiana frente ao
Staphylococcus aureus isolado de mastite bovina após 120 horas de
cultivo.........................................................................................................................67
xv
LISTA DE TABELAS
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Tabela 1. Combinações de -lactâmicos/inibidores de -lactamases utilizados
clinicamente (Williams, 1999).....................................................................................28
CAPITULO I
Tabela 1. Atividade antimicrobiana expressa por halos de inibição produzidos pelos
actinomicetos frente a
K.pneumoniae para seleção dos produtores de inibidores de
β-lactamases pela técnica do bloco de gelose...........................................................49
Tabela 2. Atividade antimicrobiana expressa por halos de inibição (mm)
apresentados pelos actinomicetos frente aos
Staphylococcus aureus isolados de
mastite bovina através da técnica do bloco de gelose...............................................50
Tabela 3. Atividade antimicrobiana apresentadas pelo Streptomyces sp. (DPUA
1542) e
Nocardia sp. (DPUA 1571), expressas por halos de inibição (em mm) frente
aos microrganismos testes
Klebsiella pneumoniae e Staphylococcus aureus isolados
de mastite bovina através da técnica de difusão em disco e poço............................51
CAPITULO II
Tabela 1. Níveis dos fatores utilizados no estudo das melhores condições de cultivo
dos inibidores de β-lactamases..................................................................................60
Tabela 2. Resultados do planejamento fatorial 2
3
para a produção de inibidores de
β-lactamases..............................................................................................................62
Tabela 3. Concentração de glicerol e valores de peso seco no cultivo de Nocardia
sp. DPUA 1571 em comparação com halos de inibição apresentados para os
microrganismos teste utilizados (
K. pneumonie DPUA 1571 e S. aureus) utilizando a
técnica de difusão em disco no ensaio 3 (concentração de glicerol 1,0%; filtrado de
soja 1% e pH 6,0).......................................................................................................63
Tabela 4 – Concentração inibitória mínima do líquido metabólico produzido por
Nocardia sp. DPUA 1571 após 120 horas de cultivo.................................................68
15
1.0 INTRODUÇÃO
16
1. INTRODUÇÃO
A mastite é definida como uma inflamação da glândula mamária, a qual
frequentemente tem origem bacteriana, mais de 80 diferentes espécies de
microrganismos foram identificadas como agentes causadores de mastite bovina
(HOLTENIUS, 2004). Estimativas feitas em vários países indicam perdas na ordem
de 10% a 15% da produção de leite e derivados devido à doença, sendo a redução
na produção total representada principalmente pela forma subclínica, pois sua
prevalência é maior que a da forma clínica. Os prejuízos com a mastite no Brasil
representam diminuição na produção de 30% e 70%, atribuídos às formas clínica e
subclínica da doença, respectivamente (SANTOS, 2006).
Staphylococcus aureus destaca-se como o microrganismo de grande
importância na incidência de mastite nos rebanhos leiteiros mundiais (ZECCONI;
HAHN, 2000). A maioria das amostras de estafilococos tem se tornado resistente a
múltiplos antibióticos, incluindo
β-lactâmicos, quinolonas, aminoglicosídeos,
macrolídeos, cloranfenicol, mupirocina e outros (SANTOS, 2006).
O tratamento antibiótico é uma alternativa recomendada para reduzir a
infecção intramamária e, consequentemente, a prevalência da mastite no rebanho
(BRITO; BRITO, 1998). Entretanto, o nível de resistência de muitos microrganismos
a drogas antimicrobianas tem aumentado consideravelmente tornando-se um fator
preocupante no controle de mastites bovinas.
A utilização de antibióticos no combate a doenças provocadas por bactérias
tem encontrado problemas devido ao aumento da resistência de microrganismos aos
antibióticos mais comumente utilizados, os pertencentes ao grupo dos
-lactâmicos
(NETO, 2004). Essa resistência se dá principalmente pela produção das enzimas
-
lactamases, as quais hidrolizam o anel
-lactâmico dos antibióticos desativando
penicilinas e cefalosporinas (BEHARRY, 2004).
O uso indiscriminado dos antibióticos acoplado com a mudança dos
elementos genéticos que codificam todas as classes de enzimas
-lactamases
dificulta as terapias atuais de combate às infecções bacterianas e promove a
resistência bacteriana aos compostos
-lactâmicos. Conseqüentemente, se torna
necessário desenvolver novos antibacterianos (BEHARRY, 2004). A fim de superar
17
esta resistência, diversas combinações antibióticas de inibidores de
β-lactamases /β-
lactâmicos estão sendo utilizadas atualmente na área clínica (VENKATESAN et al.,
2004).
Três inibidores de
β-lactamases estão sendo utilizados em uso clínico
associados com β-lactâmicos: ácido clavulânico; sulbactam e o tazobactam.
(LYNCH; YANG, 2004). O principal inibidor de
-lactamase utilizado clinicamente é o
ácido clavulânico que é produzido industrialmente por culturas submersas do
actinomiceto
Streptomyces clavuligerus. Os actinomicetos são de grande valor para
a biotecnologia, pois, são fontes de vários metabólitos secundários de interesse
industrial, em particular os antibióticos (CHATER, 2006).
Tendo em vista a necessidade de obtenção de novos compostos
antimicrobianos e fármacos de importância biotecnológica, tais como os inibidores
de
-lactamases, que vêm se mostrando eficientes no combate a doenças
provocadas por bactérias resistentes a antibióticos, a exemplo das mastites bovinas.
O objetivo deste trabalho foi selecionar actinomicetos isolados de liquens da região
Amazônica produtores de inibidores de
-lactamases com atividade antimicrobiana
frente a isolados de mastite bovina de rebanhos do Estado de Pernambuco.
18
2.0 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
19
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Mastite Bovina
A mastite é conseqüência da interação de fatores relacionados ao animal,
patógenos e ambiente (BRITO; BRITO, 2000). A mastite é definida como uma
inflamação no parênquima da glândula mamária promovida por diferentes fatores,
tais como, agressões físicas, químicas, térmicas ou microbianas (TOZZETI et al.,
2008). No entanto, cerca de 90% das mastites são causadas por infecções
bacterianas (RIBEIRO et al., 2003). Mais de 80 diferentes espécies de
microrganismos foram identificadas como agentes causadores de mastites, as
espécies mais freqüentemente isoladas são
Staphylococcus aureus, Streptococcus
agalactiae, Streptococcus dysgalactiae, Streptococcus uberis e Escherichia coli
(HOLTENIUS, 2004). Dentre as espécies comumente isoladas nas mastites bovinas
o
Staphylococcus aureus assume um papel de destaque como agente etiológico
causador da doença (CARDOSO et al., 2000).
A mastite é uma doença que causa muitos prejuízos, estima-se que,
mundialmente as perdas anuais causadas pela doença são por aproximadamente 35
bilhões de dólares (BENEDETTE et al., 2008). A principal perda econômica causada
pela mastite bovina resulta da redução na produção de leite e produtos derivados,
levando ainda a perdas devido ao descarte prematuro de vacas, custos com drogas
e com serviços veterinários (RADOSTIS et al., 2002). A mastite provoca ainda
problemas de saúde pública devido a alterações na composição do leite (ZADOKS,
2004).
2.1.1 Classificação das Mastites
Conforme sua forma de manifestação, a mastite pode ser dividida em dois
grupos; a forma clínica e a forma subclínica. A forma clínica apresenta como sinais
evidentes, edema, hipertemia, endurecimento e dor da glândula mamária e/ou
aparecimento de grumos, pus ou alterações das características do leite. No caso das
formas clínicas, o diagnóstico pode ser realizado pelo uso da caneca de fundo preto
ou telada onde visualizam-se as alterações macroscópicas do leite (RIBEIRO et al.,
2003).
20
Enquanto que na mastite subclínica não existem alterações visíveis
relacionadas ao aspecto do leite ou do úbere, esta forma se caracteriza por
alterações não evidentes na composição do leite, entre as principais alterações
destaca-se o aumento no número de células somáticas (CSS), o aumento nos teores
de proteínas séricas, diminuição do percentual de caseína, lactose, gordura e cálcio
total do leite (TOZZETTI et al., 2008). Células somáticas são todas as células
presentes no leite, que incluem as células originárias da corrente sanguínea como
leucócitos e células de descamação do epitélio glandular secretor. Na secreção
láctea de vacas com infecção intramamária, ocorre um aumento no número de
células de defesa passando a predominar neutrófilos, seguidos por macrófagos,
linfócitos e o número de células epiteliais permanece inalterado (PHILPOT;
NICKERSON, 1991).
A mastite subclínica pode ser detectada pela contagem direta ou indireta de
células somáticas no leite. Estas são compostas basicamente por dois tipos de
células principais; células de descamação do epitélio secretor e leucócitos de origem
do sangue, sendo que estas se apresentam com elevadas concentrações nos casos
de mastite (RIBEIRO et al., 2003)
Na forma subclínica os prejuízos econômicos são maiores, levando-se em
consideração a sua freqüência nos rebanhos e o longo período de infecção
inaparente (DIAS, 2007). A contínua ação dos microrganismos sobre a mucosa,
durante uma ou várias lactações provoca a perda progressiva do epitélio secretor,
reduzindo a produção láctea (SOMMERHAUSER et al
., 2003).
As mastites podem ainda serem classificadas em dois grandes grupos,
ambientais e contagiosas, de acordo com o tipo de microrganismo causador da
maioria das infecções no rebanho (DIAS, 2007).
A mastite ambiental geralmente ocorre no período entre as ordenhas,
podendo também ocorrer novas infecções no período das ordenhas, é de fácil
disseminação colocando em risco todas as categorias de animais: vacas em
lactação, vacas secas e novilhas (BEAUDEAU et al., 2002).
A mastite contagiosa caracteriza-se pela alta incidência de casos subclínicos
de longa duração ou crônicos e apresentam alta contagem de células somáticas
21
(CCS). A mastite contagiosa é causada por patógenos cujo habitat preferencial é o
interior da glândula mamária e a superfície dos tetos, sendo a ordenha a maior
forma de transmissão desta forma da doença (ESSELEMONT; KOSSAIBATI, 2002).
Staphylococcus aureus destaca-se como o microrganismo de grande
importância na incidência de mastite infecciosa nos rebanhos leiteiros mundiais, e
em função de sua elevada resistência aos antibióticos, seu tratamento torna-se difícil
(ZECCONI; HAHN, 2000).
2.1.2. Mastite Bovina causada por Staphylococcus aureus
O Staphylococcus aureus é reconhecido como o principal patógeno da
mastite bovina e seus principais sítios de localização nos animais são os quartos
infectatos, portanto a sua transmissão se dá geralmente entre vacas durante a
ordenha (ZAFALON et al., 2008). O
S. aureus tem sido o agente mais
frequentemente isolado tanto de infecções clínicas como subclínicas (BRITO et al.,
1999).
Para o diagnóstico da mastite o teste de produção de coagulase em tubo é
empregado para classificar os
Staphylococcus em dois grupos; os coagulase-
positivos e os coagulase-negativos. O
S. aureus apresenta hemólise incompleta em
ágar sangue e resultado positivo para o teste de coagulase em tubo após quatro
horas de incubação (HARMON et al., 1990). Entretanto ainda é recomendado um
teste adicional para diferenciar as espécies coagulase-positivas que é a produção de
acetoína a partir de glicose ou piruvato, o
S. aureus apresenta resultado positivo
para o teste em questão (BRITO et al., 2002).
A produção da coagulase pelo
S. aureus constitui um importante determinante
fenotípico, uma vez que está associado à virulência destes microrganismos. Estudos
correlacionam a produção de enterotoxinas com a presença de enzimas como a
coagulase (ZAFALON et al., 2008).
Um dos fatores considerados para o controle das mastites é a resistência dos
agentes etiológicos aos antimicrobianos. O
S. aureus de origem humana podem
apresentar resistência à penicilina, eritromicina, gentamicina, oxacilina, cefalotina,
cloranfenicol, sulfametoxasol, ciprofloxacina e clindamicina (TEXEIRA et al., 1995).
22
Desta forma torna-se necessário o conhecimento de novas estratégias que atuem
como alternativas para o controle da mastite bovina.
2.1.3 Tratamento das Mastites Bovinas
O tratamento das mastites é uma das medidas preconizadas para o seu
controle, além de prevenir a morte dos animais, atua no retorno à composição e
produção normal do leite (CULLOR, 1993). O tratamento a ser seguido nas mastites
clínicas e subclínicas deve diferir de acordo com a intensidade da infecção
(ALMEIDA, 2005).
A eficácia clínica de um antimicrobiano é de quantificação muito difícil, porque
há grandes variações na resposta individual e do rebanho, por causa do tipo de
microrganismo envolvido, localização dos sítios infectados, grau de endurecimento
da glândula mamária, duração da infecção e outros fatores indefinidos (REBHUM,
2000).
A antibioticoterapia atua como prevenção da mortalidade nos casos
hiperagudos, o retorno da composição e produção normal de leite, a eliminação das
fontes de microrganismos invasores. Tradicionalmente utiliza-se a via de
administração intramamária, numa tentativa de aumentar a concentração do agente
quimioterápico no local ativo da infecção (REBHUM, 2000).
O método via intramamária de agentes antimicrobianos para o tratamento de
mastite clínica ou subclínica é também a preferida, pela indústria do leite, permitindo
aplicações de pequenas quantidades de agentes antimicrobianos diretamente no
local da infecção (SMITH, 1994). Entretanto, o alto custo e a resistência bacteriana a
esses compostos vêm dificultando o tratamento das mastites por métodos
convencionais, este fato sugere a necessidade de se estudar novos antibióticos com
eficácia no tratamento das mastites bovinas.
2.2 Produção de Antibióticos
Dos produtos tradicionais obtidos por processos fermentativos, um dos mais
importantes são os metabólitos secundários, nos quais se destacam os antibióticos,
compostos químicos que têm a capacidade de destruir, inibir a ação ou crescimento
de outros microrganismos (TEODORO, 2003). Antimicrobianos são compostos com
23
a mesma função, porém podem também ser de origem sintética. O uso destes
termos não segue exatamente esta definição, podendo ser usados como sinônimos
(CHAMBERS, 2003). Os antimicrobianos são agrupados em classes de acordo com
sua estrutura química e mecanismo de ação. A estrutura molecular define os
mecanismos de ação. Podemos dividir os antimicrobianos em dois grandes grupos:
β-lactâmicos e não-β-lactâmicos (ANDREAZZI; ROSSI, 2005).
A descoberta de novos compostos antimicrobianos tem muito sucesso
quando são utilizados produtos naturais de origem microbiana, sobretudo
actinomicetos e fungos, e esses produtos são normalmente metabólitos secundários
(PELÁEZ, 2006).
Uma comprovação de que os produtos naturais são a melhor fonte de
pesquisa de antibióticos é que nos últimos 30 anos, somente as oxazolidinones são
de origem totalmente sintética (OVERBYE; BARRETT, 2005). Os actinomicetos têm
sido o grupo de organismos mais bem sucedido na busca de compostos
antimicrobianos, inclusive modelos matemáticos sugerem que o número de
antibióticos a serem descobertos a partir do gênero
Streptomyces pode ser maior
que 10
5
(PELÁEZ, 2006; WATVE et al., 2001).
2.3 Actinomicetos
As bactérias da ordem Actinomicetales são denominadas genericamente por
actinomicetos, apresentam características específicas, tais como: sensibilidade às
lisozimas e agentes antibacterianas; apresentam crescimento de colônias
cartilaginosas, filamentos finos semelhantes às hifas fúngicas com diâmetro entre
0,5 a 2,0
m, tipicamente ramificados e denominados micélios; e reprodução por
fragmentos das hifas ou por produção de esporos assexuados em áreas
especializadas do micélio (BERGEY’S MANUAL, 2001).
Os actinomicetos possuem uma morfologia que superficialmente
assemelham-se à dos fungos filamentosos; no entanto, os filamentos dos
actinomicetos consistem de células muito menores que a dos fungos filamentosos
(TORTORA et al., 2000). São bactérias Gram positivas encontradas, sobretudo no
solo, estima-se que cada grama de solo contenha 10
6
-10
9
células dessas bactérias.
24
Os actinomicetos podem ainda estar presentes nos mais diversos ambientes, como
águas, plantas e até mesmo em associação com liquens (GONZÁLEZ et al., 2005).
Estas bactérias se caracterizam por apresentar alta diversidade morfológica e
metabólica, a diversidade morfológica dos actinomicetos pode ser exemplificada
primariamente, pelas suas estratégias reprodutivas que levam a formação de uma
variedade de estruturas de esporos, como: artrósporos, característicos de
Streptomyces; endósporos, dos Thermoactinomyces; aleuriósporos, das
Micromonospora e os zoósporos móveis dos membros dos Actinoplanaceae, assim
como
Oerskovia, Geodermatophilus e Kitasatoa (ENSIGN, 1978).
Um exemplo da sua diversidade de metábolitos é a produção de antibióticos
produzidos principalmente, por seu metabolismo secundário no final da fase
exponencial do ciclo de crescimento. Os actinomicetos são notáveis por sua
produção de antibióticos (AL-ZAHRAMI, 2007). Segundo Sato (2001) das
substâncias antimicrobianas conhecidas, os actinomicetos produzem 4.600,
enquanto fungos produzem 1.600, e outras bactérias produzem apenas 950. Várias
substâncias usadas em medicina humana e veterinária, tetraciclinas, estreptomicina,
avermectinas, e ionóforos com efeitos sobre bactérias e, endo e ectoparasitos são
produzidas pelos actinomicetos. Existe uma grande variedade em estrutura e
número de antibióticos que são encontrados nas substâncias produzidas por
actinomicetos, especialmente os do gênero
Streptomyces.
2.4 Resistência Bacteriana
A descoberta das sulfonamidas e da penicilina parecia ter acabado como
problema das infecções bacterianas. Entretanto, já no início do século passado
apareceram linhagens de
Streptococcos pyogenes em hospitais militares que não
respondiam mais ao tratamento com sulfas e nos anos 40 isolados de
Staphylococcus aureus se mostraram resistentes à penicilina em hospitais de
Londres (LEVY; MARSHALL, 2004).
O homem passou a conhecer e a se preocupar com as bactérias resistentes
aos antibióticos. A utilização de antibióticos no combate a doenças provocadas por
bactérias tem encontrado problemas devido ao aumento da resistência de
microrganismos aos antibióticos mais comumente utilizados, os pertencentes ao
25
grupo dos β-lactâmicos (NETO, 2004). Os antibióticos β-lactâmicos inibem o
crescimento das bactérias ao interferir na síntese da parede celular bacteriana
(KATZUNG, 2005).
Os mecanismos de resistência bacteriana dependem de vários fatores que
podem ser inter-relacionados ou não e são divididos em quatro tipos diferentes. A
inativação enzimática é um mecanismo relacionado com a produção de diferentes
tipos de enzimas capazes de neutralizar a droga ou os efeitos antimicrobianos da
mesma,
como as β-lactamases. A alteração da permeabilidade da membrana ocorre
devido a alteração na expressão dos canais de porina, modificando assim a
penetração e conseqüente ação de diferentes antibióticos. O efluxo ativo de
antibióticos é o mecanismo que dispõe de uma bomba de efluxo estas são proteínas
integrantes da membrana plasmática bacteriana (PIDDOCK, 2006), e possuem a
capacidade de expulsar ativamente os antibióticos para fora da célula, contribuindo
para uma concentração inadequada da droga. A alteração do sítio de ligação do
antibiótico impede que ele se ligue efetivamente ao seu sítio alvo, impedindo a sua
atuação. Esta alteração diminui a afinidade da droga pelo sítio e faz com que haja
perda da atividade antimicrobiana (ROSSI; ANDREAZZI, 2005).
A produção de
β-lactamases constitui o mecanismo mais comum de
resistência bacteriana. Foram identificadas mais de 300
β-lactamases diferentes.
Algumas delas como as produzidas por
Staphylococcus aureus apresentam
especificidade de substrato relativamente baixa, hidrolizando apenas as penicilinas e
não as cefalosporinas. Outras
β-lactamases como as produzidas por Pseudomonas
aeruginosa
e por espécies Enterobacter, possuem um amplo espectro e são
conhecidas como beta-lactamases de amplo espectro (Extended-Spectrum Beta-
Lactamase - ESBL), são capazes hidrolizar tanto as penicilinas como as
cefalosporinas (KATZUNG, 2005).
O número de antibióticos em pesquisas científicas diminuiu drasticamente nos
últimos anos, enquanto a resistência às drogas antimicrobianas tem crescido de
forma inexorável. Em 2002 foi descrita nos EUA a primeira cepa de
Staphylococcus
aureus
totalmente resistente a vancomicina. Cepas produtoras de β-lactamases de
espectro ampliado, conhecidas como ESBL, capazes de inativar cefalosporinas de
terceira e quarta geração, passaram também a ser preocupação mundial. No Brasil
26
a prevalência de linhagens ESBL é bastante expressiva em diferentes centros,
podendo exceder 50% quando relacionada ao gênero
Klebsiella (ANDREAZZI;
ROSSI, 2005). Estratégias para inativar essas enzimas têm assumido uma
importância crítica na área médica (BETHEL et al., 2004).
2.5 Inibidores de β-lactamases
As -lactamases são enzimas serino-dependentes produzidas por bactérias
em defesa a todas as classes de antibióticos, como, as penicilinas, cefalosporinas,
carbapênicos e monobactâmicos. São enzimas que hidrolizam a amida cíclica da
molécula
-lactâmica (WILLIAMS, 1999). Baseado nas variações da seqüência de
aminoácidos, as enzimas
β-lactamases foram divididas nas classes A, B, C, e D
(BUSH; JACOBY, 1995; BUSH, 1999). O número de enzimas
β-lactamases
descritos recentemente está aumentando exponencialmente, conforme mais
enzimas plasmídeos-codificadas são identificadas e dados adicionais da seqüência
dos genomas bacterianos e dos isolados clínicos são descobertos (BUSH et al.,
1995).
A identificação de mais de 340 enzimas
-lactamases diferentes apresenta
um desafio significativo no tratamento das infecções bacterianas (LEE, et al., 2003).
Uma proposta para contornar esse problema é a utilização de um inibidor de
-
lactamases juntamente com um antibiótico
-lactâmico (NETO, 2004).
Os inibidores de
-lactamases podem ser classificados como reversíveis e
irreversíveis. Os inibidores reversíveis como a cloxacilina retardam a hidrólise do
-
lactâmico associado a ela, e a enzima ativa é rapidamente regenerada do complexo
enzima-inibidor. Dentre os inibidores de
-lactamases irreversíveis, encontram-se os
mais efetivos desde que sejam hábeis para inativar a enzima por períodos extensos.
Os inibidores utilizados clinicamente pertencem a este grupo, tais como as
penicilinas sulfonas (sulbactâmico, tazobactâmico, e seus derivados) e o acido
clavulânico, produzido por
Streptomyces clavuligerus (MILER et al., 2001).
Os inibidores de
-lactamases mais utilizados clinicamente são de três tipos:
ácido clavulânico, sulbactam e tazobactam, assemelham-se morfologicamente a
moléculas
-lactâmicas (Figura 1). Embora tenham ação antibacteriana muito fraca,
27
são potentes inibidores de muitas das -lactamases bacterianas, de modo que são
capazes de proteger as penicilinas hidrolisáveis contra a inativação por essas
enzimas. Os três inibidores diferem levemente quanto à sua farmacologia,
estabilidade, potência e atividade, porém essas diferenças possuem pouca
importância terapêutica (KATZUNG, 2005).
Figura 1. Estrutura química de inibidores de β-lactamases mais utilizados na clínica
médica (Venkatesan et al., 2004).
Os inibidores de -lactamases são mais ativos contra -lactamases da classe
A, os quais são codificadas por plasmídios e são as mais frequentemente
encontradas, como as produzidas por Staphylococos, H. influenzae, N. gonorrhoeae,
Salmonella, Shigella, E. coli, e K. pneumoniae (KATZUNG, 2005).
Os inibidores de -lactamases são utilizados em uso clínico associados com
-lactâmicos, cinco combinações de -lactâmico/inibidor de -lactamase estão
comercialmente disponíveis para tratamento de algumas infecções (Tabela 1)
A combinação de um -lactâmico com um inibidor de -lactamase se
apresenta como uma opção de tratamento de grande importância, uma vez que
restaura a atividade do antibótico -lactâmico resultando na efetividade desta família
de antibióticos para o tratamento de várias infecções (WILLIANS, 1999).
Ácido Clavulânico
Sulbactam
Tazobactam
28
Tabela 1. Combinações de -lactâmicos/inibidores de -lactamases utilizados
clinicamente (Williams, 1999).
-lactâmicos Inibidor de -lactamase
Administração
Ampicilina Sulbactam Parenteral e oral
Cefoperazone Sulbactam Parenteral
Piperacilina Tazobactam Parenteral
Ticarcilina Ácido clavulânico Parenteral
Amoxicilina Ácido clavulânico Parenteral e oral
29
3.0 OBJETIVOS
30
3. OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
Selecionar actinomicetos isolados de liquens da Região Amazônica,
produtores de inibidores de β-lactamases e avaliar sua atividade antimicrobiana
frente a linhagens de
Staphylococcus aureus isolados de mastite bovina.
3.2 Objetivos Específicos
Selecionar dentre as 71 espécies de actinomicetos isolados de liquens da
Região Amazônica, os melhores produtores de inibidores de
β-lactamases;
Avaliar a atividade antimicrobiana dos inibidores de β-lactamases produzidos
pelos actinomicetos previamente selecionado frente a isolados de mastite
bovina;
Avaliar o efeito das condições de cultivo, em frascos agitados, (pH, agitação,
concentrações das fontes de nitrogênio e carbono) utilizando a linhagem
previamente selecionada, na produção dos inibidores de
β-lactamases
utilizando planejamento estatístico;
31
4.0 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
32
4. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Almeida, R. M. R. G.; Estudo da purificação do ácido clavulânico utilizando processo
continuo de absorção – Universidade Federal de São Carlos, p. 42-25, 2003.
Al-Zahrami, S. H. M. (2007), Studies on antimicrobial activity of
Streptomyces sp.
Isolated from Jazan
JKAU: Sci., 19, 127-138
Andreazzi
, D.; Rossi, F. (2005) Resistência Bacteriana: Interpretando o
Antibiograma. 1. ed. São Paulo, Rio de Janeiro, BH: Atheneu, v. 1. p.118.
Beaudeau, F., Fourichon, C., Seegers, H., Bareille, N. (2002) Risk of clinical mastitis
in dairy herds with a high proportion of low individual Milk somatic-cell counts.
Prev. Vet. Med. v. 53, p. 43-54.
Beharry, Z.; Chen, H.; Gadhachanda, V. R.; Buynak, J.; Palzkill, T. (2004), Evaluation
of penicillin-based inhibitors of the class A and ß-lactamases from
Bacillus
anthracis
. Biochemistry and Biophysics, v. 313, p. 541-545.
Benedette, M. F., Silva, D., Rocha, F. P. C., Santos, D. A. N., Costa, E. A. A.,
Avanza, M. F. B. (2008), Mastite Bovina.
Revista cientifica eletrônica de
medicina veterinária
. Ano VI, n. 11.
Bethel C. R.; Hujer A. M.; Helfand M. S.; Bonomo R. (2004) Exploring the
effectiveness of tazobactam against ceftazidime resistant Escherichia coli:
insights from the comparison between susceptibility testing and b-lactamase
inhibition.
FEMS Microbiology Letters, v. 234, p. 99–103.
Boone, D. R.; Castenholz, R. W., Eds., In: Garrity G. M. (2001), ed.-in-chief. Bergey’s
Manual of Systematic Bacteriology, New York: Springer, 2 ed., v.1, p. 721.
Brito, M.A.V.P., Brito, J.R.F., Ribeiro, M.T. (1999), Padrão de infecção intramamária
em rebanhos leiteiros: exame de todos os quartos mamários das vacas em
lactação.
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia, v.51, n.2,
p.129-135.
Brito, M. A. P. V.; Campos, G. M. M.; Brito, J. R. F. (2002), Esquema simplificado
para identificação de estafilococos Coagulase-positivos isolados de mastite
bovina.
Ciência Rural, v.32, n.1, p.79-82.
Brito, J.R.F; Brito, M. A.V.P. (2000), Mastite bovina, São Paulo: Manole, pp. 114-129.
Bush, K.; Jacoby, G. A.; Medeiros A. A. A. (1995), Functional classification scheme
for β-lactamases and its correlation with molecular structure. Antimicrobial
Agents Chemotheraphy
, v.39, p.1211–1233.
Bush, K. (1999), Beta-lactamases of increasing clinical importance.
Current
Pharmaceutical
, v.5, p.839-845.
33
Cardoso, H. F. T., Carmo, L.S., Silva, N. (2000), Detecção da toxina-1 da síndrome
do choque tóxico em amostras de Staphylococcus aureus isoladas de mastite
bovina.
Arq. Bras. Med. Vet. Zootec., v.52, p.7-10.
Chambers, H. F. Antimicrobianos: considerações Gerais; In: Goodman, G. (2003), As
bases farmacológicas da terapêutica. 10 ed. Rio de Janeiro: Mc-Graw Hill,
p.859 – 875.
Chater, K. F. (2006),
Streptomyces inside-out: a new perspective on the bacteria that
provide us witch antibiotics.
Philosofical Translactions of the Royal Society,
v.361, p. 761 – 798.
Cullor, J. S. (1993), The control, treatment and prevention of the various types of
bovine mastitis.
Vet Med., p. 571-579.
Dias, R. V. C. (2007), Principais Métodos de Diagnóstico e Controle da Mastite
Bovina.
Acta Veterinária Brasílica, v.1, n.1, p.23-27.
Esslemont, D. e Kossaibati, M. (2002) Mastitis: how to get out of the dark ages.
Vet.
J.
v. 164, p. 85-86.
González, I.; Sacido, A. A.; Anderson, A.; Geniloud, O. (2005), Actinomycetes
isolated from lichens: Evaluation of their diversity and detection of biosynthetic
gene sequences.
FEMS Microbiology Ecology, Oxford, England, v. 54, p. 401-
415.
Harmon, R.J., Eberhart, R.J., Jasper, D.E. (1990), Microbiological procedures for the
diagnosis of bovine udder infection. Arlington : National Mastitis Council, p. 34
Holtenius, K., Persson, W. K., Essen-Gustavsson, B., Holtenius, P., Hallen
Sandgren, C. (2004). Metabolic parameters and blood leukocyte profiles in
cows from herds with high or low mastitis incidence.
Vet. J. v. 168, p.65-73.
KATZUNG, G. Bertram. (2005), Farmacologia Básica & Clínica. 9ª edição. Rio de
Janeiro.
Editora Guanabara Koogan.
Lee, N., Yuen, K. Y., Kumara, C. R. (2003), Clinical role of beta-lactam/beta-
lactamase inhibitor combinations.
Drugs, v. 63, p. 1511-1524.
Levy, B.S.; Marshall, B. (2004), Antibacterial resistance worldwide: causes,
challenges and responses.
Nature Medicine supplement, New York, United
States, v. 10, p122-129.
Lynch, H.C.; Yang, Y. (2004) Degradation products of clavulanic acid promote
clavulanic acid production in cultures of
Streptomyces clavuligerus. Enzyme
and Microbial Technology,
v. 34 p. 48–54.
34
Miller, L. A., Ratnam, K., Payne, D. J. (2001),
β-lactamases-inhibitor combinations in
the 21st century: current agents and new developments.
Current Opinion in
Pharmacology
. v.1, p. 451-458.
Neto, A. B. (2004) Estudo do Processo de Produção de Ácido Clavulânico por
Streptomyces clavuligerus em cultivos contínuos com alta concentração celular,
Tese de Doutorado, Universidade de São Carlos, São Carlos-SP, 206 pp.
Overbye, K. M., Barrett, J. F. (2005), Antibiotics: Where did we go wrong,
Drug
Discovery Today
, London, England, v. 10, p. 45-52.
Peláez, F. (2006), The historical delivery of antibiotics from microbial natural
products—Can history repeat?
Biochemical Pharmacology, London, England,
v.7 1, p.981– 990.
Philpot, W. N.; Nickerson, S. C. (1991), Mastitis: Counter Attack. A strategy to
combat mastitis. Illinois: Babson Brothers Co. p.150.
Radostits, O. M., Blood, D.C., Gay, C. C. (2002), Clínica Veterinária. Um tratado de
doenças dos bovinos, ovinos, suínos, caprinos e eqüinos. 9 ed. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan. p.1737.
Rebhun, W. C. (2000), Doenças do Gado Leiteiro, São Paulo: Roca, p. 339-370.
Ribeiro, M. E. R., Petrini, L. A., Aita, M. F., Balbinotti, M. (2003), Relação entre
mastite clinica, subclinica infecciosa e não infecciosa em unidades de produção
leiteiras na Região Sul do Rio Grande do Sul.
Revista brasileira de Agrociência,
v. 9, n. 3, p 287-290.
Santos, C. D. M.; Leal, G. S.; Rossi, D. A.(2006), Frequência e suscetibilidade a
antimicrobianos de
Staphylococcus spp isolados de leite de vacas com
mastites recorrentes de rebanhos da Região de Uberlândia – MG.
Vet. Not., v.
12, n. 2, p. 83-88.
Sato S. Produção de antibióticos
. In: Lima UA, Aquarone E, Borzani, W, Schmidell
W. (2001), Biotecnologia industrial - Processos fermentativos e enzimáticos.
Editora Edgard Blücher Ltda, São Paulo, p.101-124.
Smith, B. (1994), Tratado de Medicina Interna de Grandes Animais. v. 2, São Paulo:
Manole, p 1045-1056.
Sommerhauser, J.; Klopper, B.; Wolter, W.; Zschock, M.; Sobiraj, A.; Failing, K.
(2003), The epidemiology of
Sthaphylococcus aureus infecction from subclinical
mastitis in dairy cows.
Livest Prod. Sci, v. 77, p. 23-34.
Teixeira, L. A. (1995), Geographic spread of epidemic multiresistant
Staphylococcus
spp. clone in Brazil. J. Clin. Microbiol., v. 33, p. 2400-2404.
35
Teodoro, J. C., Baptista-Neto, A., Baldino Jr, A. C. (2003), Influência da velocidade
de alimentação de glicerol na produção de ácido clavulânico por
Streptomyces
clavuligerus
em batelada alimentada. In: XIV SINAFERM, Anais do XIV
SINAFERM, Florianópolis, Santa Catarina.
Tortora, G. J., Funck, B. R., Case, C. L. (2000) Microbiologia, 6ª edição, Porto
Alegre,
Artmed.
Tozzetti, D. S.; Bataier, M. B. N.; Almeida, L. R. (2008), Prevenção, controle e
tratamento das mastites bovinas – Revisão de literatura.
Revista Científica
Eletônica de Medicina Veterinária
– issn: 1679-7353, n. 10.
Venkatesan, A. M.; Agarwal, A.; Abe, T.; Ushirogochi, H.; Yamamura, I.; Kumagai, T.;
Petersen, P. J.; Weiss, W. J.; Lenoy, E.; Yang, Y.; Shlaes, D. M.; Ryan, J. L.;
Mansour, T. S. (2004) Novel imidazole substituted 6-methylidene-penems as
broad-spectrum b-lactamase inhibitors.
Bioorganic and Medicinal Chemistry,
v.12, p.5807–5817.
Watve, M.G.; Tickoo, R.; Maithili M. ; Bhalachandra, J.; Bhole, D. (2001), How many
antibiotics are produced by the genus Streptomyces?
Archives of Microbiology,
v.176, p.386–390.
Willians, J. D. (1999),
β-lactamases and β- lactamases inhibitor. International Journal
of Antimicrobial Agents
. v.12, p S3-S7.
Zadoks, R.N. (2004), Molecular methods on dairy farms: case studies. In: Molecular
Methods in Milk Quality: Proceedings of a Symposium to celebrate the opening
of the new Ithaca facilities of Quality Milk Production Services, Ithaca, NY.
Proceedings Ithaca: Cornell University, p. 31-38.
Zafalon, L. F., Langoni, H., Benvenutto, F., Castelani, L., Broccolo, C. R. (2008),
Aspectos epidemiológicos da mastite bovina causada por
Staphylococcus
aureus. Veterinária e Zootecnia
v. 15, n. 1, p. 56-65.
Zecconi, A.; Hahn, G. (2000),
Staphylococcus aureus in raw milk and human health
risk
. Bull. Int. Dairy Fed., n.345, p.15-18.
36
CAPITULO I
ACTINOMICETOS PRODUTORES DE INIBIDORES DE β-LACTAMASES COM
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA FRENTE A ISOLADOS DE MASTITE BOVINA
ACTINOMYCETES PRODUCERS β-LACTAMASES INHIBITORS WITH
ANTIMICROBIAL ACTIVITY AGAINST ISOLATED FROM BOVINE MASTITIS
Submetido a revista:
Arquivo Brasileiro de Medicina Veterinária e Zootecnia
(Brazilian Journal of Veterinary and Animal Sciences)
Qualis: (0102-0935) B1 - MEDICINA VETERINÁRIA
37
ACTINOMICETOS PRODUTORES DE INIBIDORES DE β-LACTAMASES COM1
ATIVIDADE ANTIMICROBIANA FRENTE A ISOLADOS DE MASTITE BOVINA2
ACTINOMYCETES PRODUCERS β-LACTAMASES INHIBITORS WITH 3
ANTIMICROBIAL ACTIVITY AGAINST ISOLATED FROM BOVINE MASTITIS4
5
Márcia Nieves Carneiro da Cunha
1,2
; Nelly Mara Vinhote da Silva
3
; Maria Francisca Simas 6
Teixeira
3
; Rinaldo Aparecido Mota
1
; José Luiz de Lima-Filho
2
; Tatiana Souza Porto
1,2
; Ana 7
Lúcia Figueiredo Porto
1,2*
8
1
Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal - Laboratório de Tecnologia de 9
Bioativos. Universidade Federal Rural de Pernambuco.10
2
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami – LIKA – Universidade Federal de 11
Pernambuco. 12
3
Departamento de Parasitologia - Laboratório de Micologia - Universidade Federal do 13
Amazonas.14
Autor de Correspondência: Ana Lúcia Figueiredo Porto, Endereço: Rua Dom Manoel de 15
Medeiros SN, Dois Irmãos, Recife – Pernambuco. CEP. 52171-900 Tel: (81)3320-6345 e-16
mail: [email protected].17
18
RESUMO19
O objetivo deste trabalho foi avaliar a capacidade de 71 actinomicetos isolados de liquens da 20
Região Amazônica em produzir inibidores de β-lactamases coma atividade antimicrobiana 21
utilizando Staphylococcus aureus, resistentes à penicilina, isolados de mastite bovina do 22
Estado de Pernambuco. A seleção dos actinomicetos produtores de inibidores de β-lactamases 23
foi realizada através da técnica de bloco de gelose contra Klebsiella pneumoniae ATCC 24
29665 e os actinomicetos selecionados, foram testados frente a 17 linhagens resistentes a 25
penicilina de Staphylococcus aureus. Os melhores produtores de inibidores de β-lactamases 26
foram Streptomyces sp. DPUA 1542 e Nocardia sp DPUA 1571, os quais foram submetidos 27
ao cultivo submerso para determinação da curva de crescimento, pH e atividade 28
antimicrobiana. Os maiores halos de inibição foram obtidos pelos metabólitos produzidos 29
38
após 96 horas de cultivo tanto para Nocardia sp (13,5 e 12,0 mm) como para Streptomyces sp. 30
(8,0 e 14,0 mm) com os testes-difusão nos discos e poços, respectivamente. Os resultados 31
permitiram concluir, que os actinomicetos são uma fonte promissora de inibidores de β-32
lactamases, com potencial para uso no tratamento de mastites bovinas.33
Palavras-chaves: inibidor de β-lactamase, actinomicetos, atividade antimicrobiana,34
Staphylococcus aureus, mastite bovina35
ABSTRACT 36
The aim was to evaluate the ability of 71 actinomycetes isolated from the Amazon lichens to 37
produce β-lactamase inhibitors with antimicrobial activity using Staphylococcus aureus, 38
penicillin-resistant isolates of bovine mastitis in Pernambuco State. The selection of 39
actinomycetes producing β-lactamase inhibitors was performed using Agar-plug method 40
against Klebsiella pneumoniae ATCC 29665 and selected actinomycetes were tested against 41
17 penicillin-resistant Staphylococcus aureus strains. The best producers of β-lactamase 42
inhibitors were Streptomyces sp. DPUA 1542 and Nocardia sp DPUA 1571, were submitted 43
to the submerged cultivation to determine the growth and pH curve, and antimicrobial 44
activity. The highest inhibition halo zone was obtained by metabolites produced after 96 45
hours of cultivation for both Nocardia sp (13.5 and 12.0 mm) and Streptomyces sp. (8.0 and 46
14.0 mm) with discs and wells diffusion tests, respectively. The results showed that the 47
actinomycetes are a promising source of β-lactamase inhibitors, with potential for use in the 48
bovine mastitis treatment.49
Key Words: β-lactamase inhibitor, actinomycetes, antimicrobial activity, Staphylococcus 50
aureus, bovine mastitis51
52
53
54
55
56
39
INTRODUÇÃO57
A mastite é a inflamação da glândula mamária de diferentes etiologias e em 90% dos 58
casos são causadas por bactérias (Tozzeti et al., 2008; Benedette et al., 2008). A mastite 59
bovina é apontada como a principal doença dos rebanhos leiteiros no mundo inteiro, causando 60
prejuízos econômicos tanto ao produtor de leite quanto a indústria de lacticínios (Tozzeti et 61
al., 2008), pela redução da quantidade e pelo comprometimento da qualidade do leite 62
produzido, ou até pela perda total da capacidade secretora da glândula mamária (Ribeiro et al., 63
2003). 64
Staphylococcus aureus é reconhecido como o principal patógeno nos casos de mastite 65
(Salasia, 2004). Ainda que o controle da mastite fundamente-se principalmente nas medidas 66
higiênico-sanitárias, a antibioticoterapia exerce papel importante no caso de infecções por 67
bactérias, tendo em vista a possibilidade de eliminar as infecções intramamárias e reduzir 68
prováveis fontes de infecção (Erskine et al., 1993). Um dos fatores que vêm sendo 69
considerado para o controle das mastites é a resistência dos agentes etiológicos aos 70
antimicrobianos (Zafalon et al., 2008). 71
O uso indiscriminado e prolongado de antibióticos tem levado a seleção de 72
microrganismos patogênicos resistentes a esses compostos (Tresoldi et al., 2000). Um dos 73
mecanismos mais importantes da resistência exibidos por uma variedade de bactérias Gram-74
positivas e Gram-negativas é sua habilidade de produzir β-lactamases. Essas enzimas 75
inativam penicilinas e cefalosporinas por meio da hidrólise do anel β-lactâmico (Brown et al., 76
1976). O grau de resistência da bactéria depende da quantidade de enzima produzida, da 77
habilidade dessa enzima em hidrolisar o antimicrobiano em questão e da velocidade com que 78
o β-lactâmico penetra pela membrana externa da bactéria (Macedo et al., 2005).79
Estratégias para inativar essas enzimas têm assumido uma importância crítica na área 80
médica (Bethel et al., 2004). Uma proposta para contornar esse problema é a utilização de um 81
inibidor de β-lactamase juntamente com um antibiótico β-lactâmico (Neto, 2004). Os 82
inibidores de β-lactamases são compostos similares aos antibióticos que se ligam às β-83
lactamases, de forma geralmente irreversível, protegendo os antibióticos contra sua 84
destruição, garantindo sua atividade frente a microrganismos patogênicos (Macedo et al., 85
2005).86
40
Neste trabalho foram selecionadas espécies de actinomicetos isolados de liquens da 87
Região Amazônica, produtoras de inibidores de β-lactamases, utilizando como microrganismo 88
teste a Klebsiella pneumoniae ATCC 29665 e 17 linhagens de Staphylococcus aureus, 89
isoladas de mastite bovina em rebanhos do Estado de Pernambuco, resistentes à penicilina e 90
amoxilina. 91
MATERIAIS E MÉTODOS92
Microrganismos93
Os microrganismos utilizados foram 71 Actinomicetos isolados de liquens da Região 94
Amazônica, pertencentes à coleção de microrganismos do Departamento de Parasitologia da 95
Universidade do Amazonas (DPUA), cedidos pela Profa. Maria Francisca Simas Teixeira. 96
Os microrganismos testes utilizados foram 17 linhagens de S. aureus isolados de 97
mastite bovina de rebanhos do Estado de Pernambuco, resistentes à penicilina (Medeiros et 98
al., 2009), cedidas pelo Prof. Rinaldo Aparecido Mota do Departamento de Medicina 99
Veterinária da UFRPE e K. pneumoniae ATCC 29665 produtora de β-lactamase.100
Manutenção dos microrganismos101
O meio de cultura utilizado para manutenção das amostras de actinomicetos foi o meio 102
ISP-2 (Pridham et al., 1957), modificado pela retirada de glicose. As culturas de 103
actinomicetos foram semeadas em placas de Petri, incubadas a 30°C por 168 horas e mantidas 104
em temperatura ambiente, as amostras foram repicadas a cada 30 dias. O caldo nutriente foi 105
utilizado como o meio de manutenção para os microrganismos testes K. pneumoniae ATCC 106
29665 e S. aureus. Todos os microrganismos testes foram conservados como cultura estoque 107
em criotubos utilizando glicerol 20% (v/v) e incubados a -20°C.108
Seleção dos actinomicetos produtores de inibidores de β-lactamases por bloco de gelose109
A produção de inibidores de β-lactamases foi avaliada através da técnica de bloco de 110
gelose por difusão em ágar segundo Brown et al. (1976), utilizando K. pneumoniae ATCC 111
29665 como microrganismo teste. Os testes foram realizados em Ágar Müeller-Hinton 112
adicionado de solução de benzil-penicilina G (0,01μg/mL). O meio foi distribuído em placas 113
de Petri (90x15mm de diâmetro) e na superfície do meio foi semeada uma suspensão do 114
microrganismo teste, crescidos em Erlenmeyers (50mL) contendo o meio Tryptic Soy Broth115
(TSB) incubados a 37°C por 24 horas, na concentração de 10
8
UFC/mL o que corresponde a 116
41
uma solução padrão de McFarland a 0,5, ou seja, um valor de absorbância igual a 0,1 a 600 117
nm (National Comité Clinical Laboratory Standards - NCCLS, 2003). Nas placas foram 118
adicionados fragmentos de 6mm de diâmetro, retirados da área central das culturas dos 119
actinomicetos, crescidos em meio ISP-2 sólido a 30°C por 168 horas. O padrão utilizado foi o 120
clavulanato de potássio (Sigma Aldrich - São Paulo, Brasil) na concentração de 10 mg/mL. 121
Após incubação das placas a 37°C por 24 e 48 horas foram realizadas as leituras dos 122
diâmetros dos halos de inibição, expressos em milímetro.123
Determinação atividade antimicrobiana por bloco de gelose dos actinomicetos 124
selecionados frente às amostras de S. aureus isolados de mastite bovina125
A técnica utilizada nesta etapa foi a técnica de bloco de gelose por difusão em ágar 126
segundo Brown et al. (1976) como descrito no item anterior. Os microrganismos testados 127
foram 17 estirpes de S. aureus isolados de mastite bovina e resistentes a penicilina e 128
amoxilina.129
Produção de inibidores de β-lactamases pelos actinomicetos selecionados por cultura 130
submersa131
Fragmentos de 6mm de diâmetro retirados da área central das colônias dos 132
actinomicetos crescidos em placas contendo o meio ISP-2 a 30°C por 168 horas, foram 133
cultivados em Erlenmeyers (125mL) contendo 25mL do meio ISP-2 e mantidos sob agitação 134
(200rpm) a 28°C por 48 horas. Após esse período 10% (v/v) deste pré-inóculo foi transferido 135
para Erlenmeyers de 250mL contendo 100mL do meio de cultivo MS-2 descrito por Porto et 136
al. (1996), a constituição do meio para 100mL foi de: 50 mL de filtrado de soja (4% p/v), NH
4
137
Cl (0,1 % p/v), MgSO
4.
7H
2
O (0,06 % p/v), extrato de levedura (0,1% p/v), glicerol (1 % 138
p/v), K
2
HPO
4
(0,435 % p/v) e 1 mL de solução mineral (100 mg de FeSO
4
. 7H
2
O; 100 mg de 139
MnCl
2
4H
2
O; 100 mg de ZnSO
4
. H
2
O; 100 mg de CaCl
2.
H
2
O e água destilada q.s.p. 100 140
mL).Os cultivos foram realizados em agitador orbital (200 rpm) a 28°C por um período de 141
144 horas, onde a cada 24 horas um Erlenmyers era retirado para acompanhar a cinética de 142
crescimento, curva de pH e determinação da atividade antimicrobiana do liquido metabólico. 143
Determinação da atividade antimicrobiana dos líquidos metabólicos produzidos pelos 144
actinomicetos selecionados através da técnica de difusão em disco e poço.145
A atividade dos inibidores de β-lactamases nos líquidos metabólicos produzidos pelos 146
actinomicetos foi estimada empregando-se o método biológico de difusão em disco descrito 147
42
por Ericsson e Sherris (1971) e difusão em poço. Na técnica de difusão em disco placas 148
contendo Agar Müeller Hinton adicionado com uma solução de benzil-penicilina G 149
(0,01µg/mL) foram semeadas com uma suspensão dos microrganismos teste K. pneumoniae 150
ATCC 29665 e S. aureus isolados de mastite bovina, crescidos em meio TSB a 37°C por 24 151
horas com concentração de 10
8
UFC/mL o que corresponde a uma solução padrão de152
McFarland a 0,5, ou seja, um valor de absorbância igual a 0,1 a 600 nm (National Comité 153
Clinical Laboratory Standards - NCCLS, 2003). Nestas placas foram adicionados discos de 154
papel de filtro de 6mm de diâmetro impregnados com 10μL dos líquidos metabólicos livre de 155
células, as placas foram incubadas a 37°C por 24h.156
Para o teste de difusão em poço, o mesmo meio de cultura foi utilizado e distribuído 157
em placas de Petri, onde foi semeada uma suspensão dos microrganismos testes na mesma 158
concentração utilizada no teste de difusão em disco. No centro das placas de Petri foram 159
realizados orifícios de 6mm de diâmetro onde foram adicionados 30μL do líquido metabólico 160
produzido pelos actinomicetos selecionados. As placas foram incubadas em estufa a 37°C por 161
24 horas. Em seguida, foram realizadas as leituras dos diâmetros dos halos de inibição 162
expressos em mm. Os ensaios foram realizados em duplicata.163
Determinação da curva de biomassa e de pH164
A avaliação da biomassa foi realizada por gravimetria (peso seco) e o pH foi medido 165
por potenciometria no decorrer do cultivo a cada 24 horas.166
167
RESULTADOS E DISCUSSÃO168
Os ensaios em bloco de gelose mostraram que dentre as 71 amostras de actinomicetos 169
testadas, 18% apresentaram atividade antimicrobiana frente ao microrganismo teste K. 170
pneumoniae ATCC 29665 produtora de β-lactamase após 24 horas de cultivo e 22% após 48 171
horas de cultivo. As melhores atividades antimicrobianas obtidas frente à K. pneumoniae172
ATCC 29665 após 24 horas de cultivo foram apresentadas pelos Streptomyces sp. DPUA 173
1542 e DPUA 1543, e pelo Nocardia sp. DPUA 1571 com halos de inibição de 30mm, 28mm 174
e 24mm respectivamente (Tab. 1). Ceylan et al. (2009) isolaram 15 amostras de Streptomyces 175
sp do solo da Turquia e estudaram suas atividades antimicrobianas frente a S. aureus, 176
Escherichia coli, Pseudomonas aeruginosa e Stenotrophomonas maltophilia e obtiveram 177
43
halos de inibição de > 30mm. Estes resultados corroboram com os dados obtidos neste 178
trabalho. 179
Os actinomicetos selecionados, os quais apresentaram maior atividade antimicrobiana 180
frente ao microrganismo teste K. pneumoniae ATCC 29665, foram submetidos novamente a 181
testes de bloco de gelose frente a 17 linhagens de S. aureus, isolados de mastite bovina182
resistentes a penicilina. Os resultados das atividades antimicrobianas das linhagens de 183
actinomicetos frente aos isolados de mastite bovina estão apresentados na Tab. 2.184
Das 16 amostras de actinomicetos pré-selecionadas, apenas Streptomyces sp. DPUA 185
1547 e Streptomyces sp. DPUA 1605 não apresentaram atividade antimicrobiana frente aos 186
isolados de mastite bovina testados. Os actinomicetos Streptomyces sp. DPUA 1542 e 187
Nocardia sp. DPUA 1571 foram os que apresentaram maiores halos de inibição frente aos S.188
aureus 28 e 31mm, respectivamente (Tab. 2). Estes resultados comprovam a produção de 189
inibidores de β-lactamases, pois os S. aureus utilizados neste estudo foram os descritos por 190
Medeiros et al. (2009), o quais estudaram o perfil de sensibilidade microbiana in vitro de 291 191
linhagens de Staphylococcus spp isoladas de mastites bovina, e foram testadas frente aos 192
seguintes antibióticos: amoxicilina, ampicilina, azitromicina, cefquinome, cephalonium, 193
ciprofloxacina, cloxacilina, danofloxacina, enrofloxacina, eritromicina, florfenicol, 194
gentamicina, penicilina + novobiocina, trimetoprim, tobramicina, tetraciclina+ neomicina+ 195
bacitracina. Os autores observaram também um perfil de multirresistência para 65 dos S.196
aureus isolados, onde: 44 estirpes apresentaram resistência de 2 – 4; 17 estirpes apresentaram 197
resistência de 5 – 7 e 4 dos S. aureus foram resistentes a 8 ou mais antibióticos.198
Al-Zahrami (2007) quando estudou a atividade antimicrobiana de Streptomyces sp. 199
(J12) isolados do solo da Arábia Saudita, frente a amostras de S. aureus através da técnica 200
bloco de gelose, utilizando blocos de 5mm de diâmetro, observaram halos de inibição de até 201
29mm de diâmetro, resultados semelhantes aos obtidos neste estudo.202
Thakur et al. (2007) isolaram 110 amostras de actinomicetos do solo da Índia e destas, 203
39 (60%) apresentaram atividade antimicrobiana frente ao S. aureus. Das amostras testadas 204
neste estudo contra estirpes de S. aureus, 14 apresentaram atividade inibitória, o que 205
corresponde a 87,5% do total.206
Streptomyces sp DPUA 1542 e Nocardia sp DPUA 1571 apresentaram um perfil de 207
crescimento característico durante o cultivo em meio líquido (MS-2), como apresentado na 208
44
Fig. 1. Observou-se, durante o crescimento microbiano que os microrganismos apresentaram 209
fase lag de 24 horas e uma fase logarítmica característica, a qual exibiu crescimento máximo 210
no tempo 72 horas para Nocardia sp DPUA 1571 e 96 horas para Streptomyces sp. DPUA 211
1542, o qual apresentou maior valor de biomassa que nas mesmas condições de cultivo. O pH 212
do meio de cultivo aumentou de 7,0 para 8,5 ao final das 144 horas de cultivo (Fig. 1).213
Verificou-se tanto para Streptomyces sp. DPUA 1542 como para Nocardia sp. DPUA 214
1571 que a produção de metabólicos com atividade antimicrobiana teve início no tempo 215
correspondente ao início da fase estacionária do crescimento microbiano, ou seja, como 216
metabólito secundário. Esses resultados estão de acordo com os descritos por Yu et al. (1999) 217
os quais descreveram que a produção de metabólitos secundários pelos actinomicetos em 218
meio líquido é limitada à fase estacionária, que frequentemente coincide com a escassez dos 219
nutrientes do meio de cultura.220
Durante o crescimento também foi avaliada a atividade antimicrobiana do liquído 221
metabólico produzido pelas culturas dos actinomicetos através da técnica de difusão em 222
discos e em poços e os resultados estão apresentados na Tab. 3. Foi possível observar a 223
atividade antimicrobiana apresentada pelo Streptomyces sp. DPUA 1542 e Nocardia sp. 224
DPUA 1571 com diâmetros de halos de inibição de 8,00 e 13,5mm utilizando S. aureus e de 225
9,00 e 12,00mm com K. pneumoniae, respectivamente. Streptomyces sp. DPUA 1542 226
produziu halos de inibição apenas no tempo de 96 horas de crescimento, já Nocardia sp. 227
DPUA 1571 produziu halos de inibição em 72 horas e 96 horas de crescimento, 228
respectivamente. 229
Para a atividade antimicrobiana utilizando a técnica difusão em poço, foi possível 230
detectar halos de inibição na maioria dos tempos para os dois microrganismos. Esta maior 231
detecção ocorreu devido à maior quantidade de líquido metabólico (30µL), bem como pela 232
maior difusão do mesmo utilizando esta metodologia, como pode ser observado na tab. 3. 233
De acordo com a NCCLS (2003) um microrganismo é sensível a combinação β-234
lactâmico/inibidor de β-lactamase quando utilizando de 20 - 10μg deste composto em testes 235
de difusão em disco, halos > 18mm de diâmetro de inibição são produzidos. Através da 236
comparação dos halos de inibição apresentados por Streptomyces sp. DPUA 1542 e por 237
Nocardia sp. DPUA 1571 frente aos microrganismos teste K. pneumoniae ATCC 29665 e S.238
aureus resistente a penicilina, não foram obtidos halos de inibição maiores que 18mm, no 239
45
entanto, as amostras testadas não podem ser classificadas como resistentes, visto que, a 240
concentração de inibidores de β-lactamases contida nos líquidos metabólicos não foi 241
determinada, e como encontram-se em solução, supõe-se que as concentrações são menores 242
que as recomendadas pelas normas da NCCLS. Estudos serão realizados visando identificar e 243
purificar esses compostos.244
Os resultados obtidos neste trabalho corroboram com os dados apresentados por 245
Alberton et al (2006) que estudaram a atividade antimicrobiana do líquido metabólico obtido 246
da fermentação do Streptomyces viridosporus T7A e observaram que este não foi capaz de 247
inibir o crescimento de Salmonelas sp., Pseudomonas sp., e Escherichia coli. O extrato bruto 248
também não promoveu grandes halos de inibição frente as culturas de S. aureus causadoras de 249
intoxicação alimentar e de mastites. Estes autores justificaram os resultados obtidos devido ao 250
metabólito está diluído no extrato bruto, por isso a utilização de um processo de separação e 251
purificação visando concentrar este extrato irá possibilitar melhores resultados.252
253
CONCLUSÕES254
Estes resultados permitiram concluir que os actinomicetos Streptomyces sp. DPUA 255
1542 e Nocardia sp. DPUA 1571 foram capazes de produzir inibidores de β-lactamases 256
destacando-se frente a amostras de S. aureus resistentes à penicilina, isolados de mastite 257
bovina. Avaliações futuras deverão ser realizadas visando otimizar a produção e identificação258
deste metabólito para aplicação no tratamento de mastites bovinas.259
AGRADECIMENTOS260
Os autores agradecem o apoio financeiro do CNPQ, e as bolsas de estudo da CAPES e 261
da FACEPE.262
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS263
ALBERTON, L. R.; VANDENBERGHE, L. P. S.; JOINEAU, M. E.; MARTINS, L. A.; 264
PACHALY, J. R.; ASSMAN, R.; CIFFONI, E. M. G.; SOCCOL, C. R. Avaliação do 265
Potencial de Uso do Extrato Bruto da Fermentação por Streptomyces vidosporium T7A em 266
Medicina Veterinária. Arq. Ciên. Vet. Zool., n.9, p. 41-47, 2006.267
46
AL-ZAHRAMI, S. H. M. Studies on antimicrobial activity of Streptomyces sp. Isolated from 268
Jazan JKAU: Sci., n.19, p.127-138, 2007.269
BENEDETTE, M. F.; SILVA, D.; ROCHA, F. P. C.; SANTOS, D. A. N.; COSTA, E. A. A.; 270
AVANZA, M. F. B. Mastite Bovina. Rev. Cien. Elet. Med. Vet. Ano VI, n.11, 2008.271
BETHEL C. R.; HUJER A. M.; HELFAND M. S.; BONOMO R. Exploring the effectiveness 272
of tazobactam against ceftazidime resistant Escherichia coli: insights from the comparison 273
between susceptibility testing and b-lactamase inhibition. FEMS Microbiol. Lett., v.234, 274
p.99–103, 2004.275
BRITO, J.R.F; BRITO, M. A.V.P. Mastite bovina, São Paulo: Manole, p.114-129. 2000.276
BRITO, J.R.F.; BRITO, M.A.V.P. Programas de controle das mastites causadas por 277
microrganismos contagiosos e do ambiente. Embrapa CNPGL, Juiz de Fora, p. 25, 1998.278
BROWN, A. G.; BUTTERWORTH, D.; COLE, M.; HANSCOMB, G.; HOOD, J. D.; 279
READING, C.; ROLINSON, G. N. Naturally occurring β-Lactam inhibitors with antibacterial 280
activity. J. Antibiotics, v.29, n.6, p.668 – 669, 1976.281
CEYLAN, O.; OKMEN, G.; UGUR, A. Isolation of soil Streptomyces as source antibiotics 282
active against antibiotic-resistant bacteria. EurAsia. J. BioSci., v. 2, p.73-83, 2008.283
ERICSSON, H.M.; SHERRIS, J.C. Antibiotic sensitivity testing-Report of an International 284
Collaborative Study. Acta Pathol. Microbiol. Scand, n.217, p.1-90, 1971.285
ERSKINE, R. J., KIRK, J. H., TYLER, J. W., DeGRAVES, F. J. (1993), Advances in the 286
therapy for mastitis. Vet. Clin. N. Amer.: Food Animal Practice. v. 9, n. 3, p. 499-513.287
MACEDO, M. L. A. P.; CARTAXO, R. S.; ALMEIDA, T. C. C., SOUZA, L. B. S.; 288
SANTANA, W. J. Mecanismos de resistência e detecção das beta-lactamases. UNOPAR 289
Cient., Ciênc. Biol. Saúde, Londrina, v.7, n.1, p.59-63, 2005.290
MEDEIROS, E. S.; MOTA, R. A.; SANTOS, M. V.; FREITAS, M. F. L.; PINHEIRO 291
JÚNIOR, J. W.; TELES, J. A. A. Perfil de sensibilidade microbiana in vitro de linhagens de292
Staphylococcus spp. isoladas de vacas com mastite subclínica. Pesq. Vet. Bras. v.29 n.7 293
p.569-574, 2009.294
47
NCCLS - National Comité Clinical Laboratory Standards, Methods for Dilution Antimicrobial 295
Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically; Approved Standard—Sixth Edition. 296
NCCLS document M7-A6 [ISBN 1-56238-486-4]. NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 297
1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA. 2003298
NETO, A. B. Estudo do Processo de Produção de Ácido Clavulânico por Streptomyces 299
clavuligerus em cultivos contínuos com alta concentração celular, Tese de Doutorado, 300
Universidade de São Carlos, São Carlos-SP, pp. 206, 2004.301
302
PORTO, A. L. F., CAMPOS-TAKAKI, G. M. and LIMA FILHO, J. L. Effects of culture 303
conditions on protease production by Streptomyces clavuligerus growing soy bean flour 304
medium. Appl. Biochem. Biotech., n.60, p.115-122, 1996.305
306
PRIDHAM, T. G.; ADERSON, P.; Foley, C.; LINDENFELSER, L. A.; HESSELTINE, C. 307
W.; BENEDICT, R. G. A. Selection of Media for Maintenance and Taxonomic Study of 308
Streptomyces. Antibiot. M., p.947-953, 1957.309
RIBEIRO, M. E. R., PETRINI, L. A., AITA, M. F., BALBINOTTI, M. Relação entre mastite 310
clinica, subclinica infecciosa e não infecciosa em unidades de produção leiteiras na Região 311
Sul do Rio Grande do Sul. R. bra. Agrociência, v.9, n.3, p.287-290, 2003.312
SAHIN, N.; UGUR, A. Investigation of the antimicrobial activity of some Streptomyces313
isolates. Turk J.Biol., n.27, p.79-82, 2003.314
SALASIA, S. I. O. Comparative studies on pheno- and genotypic properties of 315
Staphylococcus aureus isolated from bovine subclinical mastitis in central Java in Indonésia 316
and Hesse in Germany. J. Vet. Sci., n.5, p.103-109, 2004.317
THAKUR, D., YADAY, B. K. G., Bora, T. C. Isolation and screening of Streptomyces in soil 318
of protected forest areas from the states of Assam and Tripura, India, for antimicrobial 319
metabolites. J. Mycol Méd., n.17, p.242-249, 2007.320
TOZZETI, D. S.; BATAIER, M. B. N.; ALMEIDA, L. R. Prevenção, controle e tratamento 321
das mastites bovinas – Revisão de literatura. Rev. Cien. Elet. Med. Vet – issn: 1679-7353, 322
v.10, 2008.323
48
TRESOLDI, A. T.; BARISON, E. M.; PEREIRA, R. M.; PADOVEZE, M. C.; TRABASSO, 324
P. Risck factors associeted witch the acquisition of multiresistant bacteria in pedriatic nursery. 325
J. Pediatr., n.4, p.275-286, 2000.326
YU, T. W.; SHEN, Y.; DOI-KATAYAMA, Y.; TANG, L.; PARK, C.; MOORE, B. S.; 327
HUTCHINSON, C. R.; FLOSS, H. G. Direct evidence that the rifamycin polyketide synthase 328
assembles polyketides chains processively. Proc Natl Acad Sci USA, v.9, p.9051-9056, 1999329
ZAFALON, L. F., LANGONI, H., BENVENUTTO, F., CASTELANI, L., BROCCOLO, C. 330
R. Aspectos epidemiológicos da mastite bovina causada por Staphylococcus aureus. Vet.331
Zoot., v.15, n.1, p.56-65, 2008.332
333
49
Tabela 1. Atividade antimicrobiana expressa por halos de inibição produzidos pelos 334
actinomicetos frente a K.pneumoniae para seleção dos produtores de inibidores de β-335
lactamases pela técnica do bloco de gelose.336
Amostras Diâmetro do halo de
inibição (mm) após 24
horas
Diâmetro do halo de
inibição (mm) após 48
horas
Streptomyces sp. DPUA 1542
30,0 39,0
Streptomyces sp. DPUA 1543
28,0 37,0
Streptomyces sp. DPUA 1547 10,0 10,0
Streptomyces sp. DPUA 1549 14,0 17,0
Streptomyces sp. DPUA 1550 18,0 18,0
Streptomyces sp. DPUA 1557 14,0 14,0
Streptomyces sp. DPUA 1559 10,0 14,0
Streptomyces sp. DPUA 1566 10,0 10,0
Streptomyces sp. DPUA 1568 16,0 16,0
Nocardia sp. DPUA 1571
24,0 38,0
Streptomyces sp. DPUA 1573 18,0 24,0
Nocardia sp. DPUA 1577 14,0 14,0
Streptomyces sp. DPUA 1586 - 14,0
Streptomyces sp. DPUA 1587 - 12,0
Streptomyces sp. DPUA 1591 14,0 14,0
Streptomyces sp. DPUA 1605 - 10,0
337
50
Tabela 2. Atividade antimicrobiana expressa por halos de inibição (mm) apresentados pelos 338
actinomicetos frente as estirpes de Staphylococcus aureus isolados de mastite bovina através 339
da técnica do bloco de gelose.340
DPUA 1542
DPUA 1543
DPUA 1547
DPUA 1549
DPUA 1550
DPUA 1557
DPUA 1559
DPUA 1566
DPUA 1568
DPUA 1571
DPUA 1573
DPUA 1577
DPUA 1586
DPUA 1587
DPUA 1591
DPUA 1605
S1
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
-
S2
13
11
-
8
8
-
9
8
10
12
-
8
8
-
8
-
S3
28
18,5 - 10 8 - - 13 - 23 13 - - - 11 -
S4
- - - - - - - - - - - - - - - -
S5
26 19 - 9 9 - 8 9 19 21 10 - - - 15 -
S6
20 14 - 12 - 13 7 9 12 24 7 7 - - 12
S7
19 12,5 - - - - - - - 19 - - - - - -
S8
24
18,5
-
10
8
-
-
9
13,5
23
13
7,5
-
-
10
-
S9
28
29
-
18,5
13
-
19
12
18
28
8
10
-
-
15
-
S10
24 21 - 14 - - - 11 -
30
10 - - - 10 -
S11
26,5 21 - 15 18 - - 9 11
31
9 8 - - 10 -
S12
24,5 19 - 13,5 13 - - 13 19 21 8 7 - - 12 -
S13
24,5 19 - 11,5 15 - - 12 14
28
11 8 - - 12 -
S14
25 16 - 11 - - - - 13,5 26 12 12 - - - -
S15
19 13 - 17 12 - - 10 13
30
8 7 - 7,5 13 -
S16
27 19 - 17 12 - - 10 13
30
8 7 - 7,5 13 -
S17
- - - - - - - - - - - - - - - -
341
342
51
Tabela 3. Atividade antimicrobiana apresentadas pelo Streptomyces sp. (DPUA 1542) e 343
Nocardia sp. (DPUA 1571), expressas por halos de inibição (em mm) frente aos 344
microrganismos testes Klebsiella pneumoniae e Staphylococcus aureus isolados de mastite 345
bovina através da técnica de difusão em disco e poço.346
Microrganismos Streptomyces sp DPUA 1542 Nocardia sp DPUA 1571
48h 72h 96h 120h 48h 72h 96h 120h
K. pneumoniae
(Disco)
- - 9,00 - - 12,00 12,00 -
K. pneumoniae
(Poço)
- 12,25 14,25 10,00 - 12,50 17,50 9,00
S. aureus
(Disco)
- - 8,00 - - 9,00 13,50 -
S. aureus
(Poço)
- 11,00 10,50 9,5 - 11,00 9,00 12,00
347
348
52
LEGENDA DA FIGURA 349
350
351
Figura 1. Curva de crescimento e de pH do Streptomyces sp. DPUA 1542 e do Nocardia sp. 352
DPUA 1571 cultivados no meio MS-2 em agitador orbital (200rpm) a 28°C por 144 horas.353
354
355
356
357
358
359
360
361
362
363
364
365
366
367
368
53
54
CAPITULO II
PRODUÇÃO DE INIBIDORES DE β-LACTAMASES POR Nocardia sp. DPUA
1571
PRODUCTION OF β-LACTAMASE INHIBITORS BY Nocardia sp. DPUA 1571
55
PRODUÇÃO DE INIBIDORES DE β-LACTAMASES POR Nocardia sp. DPUA
1571
PRODUCTION OF Β-LACTAMASE INHIBITORS BY Nocardia sp. DPUA 1571
M. N. CARNEIRO-DA-CUNHA
1,2
, N. M. V. SILVA
3
, M. F. S. TEIXEIRA
3
, R. A.
MOTA
1
, J. L. LIMA-FILHO
2
, T. S. PORTO
1,2
, A. L. F. PORTO
1,2
1
Programa de Pós-Graduação em Biociência Animal - Laboratório de Tecnologia de
Bioativos - Universidade Federal Rural de Pernambuco.
2
Laboratório de Imunopatologia Keizo Asami – LIKA – Universidade Federal de
Pernambuco.
3
Departamento de Parasitologia - Laboratório de Micologia - Universidade Federal do
Amazonas.
RESUMO
A disseminação do uso de antibióticos β-lactâmicos indiscriminadamente fez com que
as bactérias desenvolvessem defesas relativas aos agentes antibacterianos
β-lactâmicos,
com o consequente aparecimento de resistência, que ocorre principalmente pela
produção de
β-lactamases. A utilização de um inibidor de β-lactamase juntamente com
um antibiótico
β-lactâmico é uma alternativa viável para o tratamento de infecções
provocadas por bactérias resistentes. Neste estudo foi avaliada a influência de três
variáveis: concentrações da fonte de carbono (0,5, 1,0 e 1,5%), concentrações de fonte
de nitrogênio (1,0, 2,5 e 4,0%) e pH (6,0, 6,5 e 7,0), através de um planejamento fatorial
(2
3
) para a produção de inibidor de β-lactamase por Nocardia sp. DPUA 1571. A
produção ocorreu em Erlenmeyers de 250mL contendo 100mL do meio de cultivo MS-
2 modificado de acordo o modelo experimental, os frascos foram incubados em agitador
orbital (200 rpm) a 28°C por um período de 120 horas e a cada 24 horas, alíquotas de
5mL foram retiradas e centrifugadas a 5.000 rpm por 20 minutos a 4ºC, para o estudo da
atividade biológica e peso seco. A atividade biológica do líquido metabólico foi
realizada através da técnica de difusão em disco e poço, nas melhores condições de
cultivo (ensaio 3) com concentração da fonte de carbono de 1,5%, concentração do
filtrado de soja de 1% e o pH 6,0, foram obtidos halos de inibição de até 22mm de
diâmetro frente aos microrganismos teste utilizados. Os resultados permitiram concluir,
56
que os actinomicetos isolados de liquens da Região Amazônica são uma fonte
promissora de inibidores de β-lactamases, com potencial para aplicação futura na
indústria farmacêutica.
Palavras-chaves: inibidor de β-lactamase, Nocardia sp., planejamento fatorial,
atividade antimicrobiana.
ABSTRACT
The widespread use of antibiotics unfortunately caused the bacteria develop defenses
for antibacterial agents, with the consequent appearance of resistance. This is caused
mainly by β-lactamases production. The use of an inhibitor of β-lactamase with a β-
lactam antibiotic is a viable alternative for the treatment of infections caused by
resistant bacteria. This study using a factorial design (2
3
) the influence of three
variables: concentrations of carbon source (0.5, 1.0 and 1.5%), concentrations of
nitrogen source (1.0, 2.5 and 4.0%) and pH (6.0, 6.5 and 7.0) were evaluated in the
production of inhibitors of β-lactamases by Nocardia sp DPUA 1571. The production
carried out in 250mL flasks containing 100mL of culture medium MS-2 modified
according to the experimental design, the flasks were incubated in an orbital shaker (200
rpm) at 28 ° C for 120 hours and each 24 hours, aliquots of 5 mL were withdrawn and
centrifuged at 5000 rpm for 20 minutes at 4 ° C for the study of biological activity and
dry weight. The biological activity of the liquid assay was performed using the
diffusion-tests on the discs and wells, the best cultive conditions (test 3) with
concentration of carbon source of 1.5% concentration of the soy bean flour 1% and pH
6,0, were obtained from the inhibition of up to 22mm diameter test against
microorganisms used. The results showed that the actinomycetes are a promising source
of β-lactamase inhibitors, demonstrated the potential application to pharmaceutical
industry.
Key Words: β-lactamase inhibitor, Nocardia sp., factorial design, antimicrobial
activities.
INTRODUÇÃO
Os antibióticos β-lactâmicos tais como as penicilinas e cefalosporinas estão entre
os primeiros antibióticos descobertos e continuam sendo utilizados clinicamente no
57
combate à infecções causadas por bactérias, no entanto, o uso generalizado e
indiscriminado dos antibióticos
β-lactâmicos por mais de 50 anos, levou a redução de
sua eficácia, devido ao aparecimento de bactérias resistêntes a esses medicamentos (LI e
TOWNSEND, 2006).
A resistência bacteriana é mediada por três mecanismos: menor acesso do
antibiótico a célula bacteriana; alterações nas proteinas de ligação do antibiótico e a
inativação enzimática que é um mecanismo relacionado com a produção de diferentes
tipos de enzimas capazes de neutralizar a droga ou os efeitos antimicrobianos da
mesma, tai
s como as β-lactamases (SYKES e MATTHEW, 1976; SANDERS e
SANDERS, 1992; PIDDOCK, 2006).
A produção de
β-lactamases constitui o mecanismo mais comum de resistência
bacteriana. Essas enzimas catalisam a hidrólise do anel
β-lactâmico do antibiótico,
originando um produto inativo, isto é, sem ação antibiótica (OLIVEIRA et al., 2009). A
identificação de mais de 340 enzimas
-lactamases diferentes apresenta um desafio
significativo no tratamento das infecções bacterianas (LEE, et al., 2003).
Para contornar o problema da resistência bacteriana foram desenvolvidas
algumas estratégias, a primeira foi a modificação da estrutura química do antibiótico e a
segunda a descoberta de compostos que inibem as enzimas
-lactamases. Os inibidores
de
-lactamases são compostos que possuem baixa atividade antimicrobiana, mas
potencializam a ação dos antibióticos
-lactâmicos (OLIVEIRA, 2004), sendo assim, a
combinação de um
-lactâmico com um inibidor de -lactamase se apresenta como uma
opção de tratamento de grande importância, uma vez que restaura a atividade do
antibiótico
-lactâmico resultando na efetividade desta família de antibióticos para o
tratamento de várias infecções (WILLIANS, 1999).
Os inibidores utilizados clinicamente são as penicilinas sulfonas (sulbactâmico,
tazobactâmico, e seus derivados) e o clavulânico, produzido por
Streptomyces
clavuligerus
(MILLER et al., 2001).
O ácido clavulânico é o mais efetivo inibidor de
β-lactamases, produzidas por
bactérias resistentes a penicilinas e cefalosporinas. Quando utilizado em combinação
com estes antibióticos, o ácido clavulânico liga-se irreversivelmente à serina do grupo
58
hidroxila do centro ativo das β-lactamases, produzindo um intermediário acilado estável
e assim inativando a enzima (FOULSTONE e READING, 1982; BAGGALEY et al,
1997).
O mecanismo de inibição tanto para o sulbactâmico quanto para o tazobactâmico
é parecido com o do ácido clavulânico, entretanto Payne e colaboradores (1994),
estudaram a atividade desses compostos e observaram uma atividade inibidora de
enzimas
-lactamase quase 5 vezes maior que o tazobactâmico e quase 600 vezes maior
que o sulbactâmico.
Os inibidores de
-lactamase, a exemplo de outros antibióticos -lactâmicos, são
produzidos por microrganismos através de processos fermentativos, no entanto, o
processo de obtenção industrial do ácido clavulânico, assim como dos demais inibidores
de
-lactamase, é pouco documentado na literatura, e é uma premissa importante o
conhecimento e melhoramento de sua obtenção e produção (ELANDER, 2003).
Actinobactérias em geral, e em particular o gênero
Streptomyces, continuam
sendo fonte de novos metabólitos secundários com uma grande variedade de atividades
biológicas, tais como, antibacterianas, antifúngicas, antivirais, anticancerígenas,
antiparasitárias, entre outras (YU et al., 1999; THAKUR et al., 2007).
Nocardia
usualmente é o segundo gênero mais abundante de actinobactérias, a importância deste
gênero também tem sido relacionada com a produção de antibióticos (KONEMAN et
al., 2001), cuja ação é evidenciada principalmente em meio de cultura, através da
produção de halos de inibição, onde se forma uma zona livre de crescimento
microbiano, em torno da colônia do actinomiceto que sintetiza o antibiótico.
O planejamento estatístico de experimentos é uma ferramenta amplamente
utilizada para a otimização e controle de processos, é um método muito eficiente para
estudar a influência de um certo número de variáveis em uma determinada resposta de
interesse. Por uma fração fatorial, os fatores significativos e seus efeitos podem ser
estudados usando um numero menor de experimentos, reduzindo assim os custos de
operação (BRUNS et al., 2006).
Visto a necessidade do desenvolvimento de novos compostos antimicrobianos o
objetivo deste trabalho foi a obtenção de inibidores de
-lactamase produzidos por
59
Nocardia sp. DPUA 1571, bem como o estudo dos fatores que influenciam nesta
produção, utilizando planejamento fatorial completo.
MATERIAIS E MÉTODOS
Microrganismos e manutenção
O microrganismo Nocardia sp. DPUA 1571 foi isolado de liquens de Região
Amazônica, é produtor de inibidores de
β-lactamases (CARNEIRO-DA-CUNHA et al,
2009), e pertencente à coleção de microrganismos do Departamento de Parasitologia da
Universidade Federal do Amazonas (DPUA), gentilmente cedido pela Profa. Maria
Francisca Simas Teixeira. As culturas foram repicadas em tubos de ensaio inclinados
contendo o meio ISP-2 (PRIDHAM et al., 1957), modificado pela retirada de glicose, e
incubadas a 30°C por 168 horas, após este procedimento foram mantidas sob
refrigeração e repicadas a cada 30 dias
Os microrganismos testes, resistentes a antibióticos (MEDEIROS et al., 2009),
utilizados foram 10 linhagens de
Staphylococcus aureus isolada de mastite bovina de
rebanhos do estado de Pernambuco e, cedida pelo professor Rinaldo Aparecido Mota do
Departamento de Medicina Veterinária da UFRPE e o microrganismo produtor de
β-
lactamases foi
Klebsiella pneumoniae ATCC 29665. O meio de cultura caldo nutriente
foi utilizado como o meio de manutenção para os microrganismos testes
K. pneumoniae
ATCC 29665 e S. aureus. Todos os microrganismos testes foram conservados na
presença de glicerol para um volume final de 20% (v/v) a -20°C.
Condições de cultivo
Fragmentos de 6mm de diâmetro retirados da área central da colônia de
Nocardia sp. DPUA 1571 crescidos em meio ISP-2 a 30°C por 168 horas, foram
cultivados em Erlenmeyers (125 mL) contendo 25mL do meio ISP-2 e mantidos sob
agitação (200rpm) a 28°C por 48 horas. Após esse período alíquotas deste pré-inóculo
na concentração final de 10
6
células.mL
-1
, correspondendo a 10% do volume total foi
transferido para Erlenmeyers de 250mL contendo 100mL do meio de cultivo MS-2
descrito por Porto et al. (1996), a constituição do meio para 100mL foi de: 50 mL de
filtrado de soja (4% p/v), NH
4
Cl (0,1 % p/v), MgSO
4.
7H
2
O (0,06 % p/v), glicerol (1 %
p/v), K
2
HPO
4
(0,435 % p/v), 5mL do tampão MOPS (100mM) e 1mL de solução
60
mineral (100 mg de FeSO
4
. 7H
2
O; 100 mg de MnCl
2
4H
2
O; 100 mg de ZnSO
4
. H
2
O;
100 mg de CaCl
2.
H
2
O e água destilada q.s.p. 100 mL). Os frascos foram incubados em
agitador orbital (200 rpm) a 28°C por um período de 120 horas e a cada 24 horas,
alíquotas de 5mL foram retiradas e centrifugadas a 5.000 rpm por 20 minutos a 4ºC, o
sobrenadante foi utilizado para o estudo atividade antimicrobiana. A massa celular
obtida após a centrifugação foi lavada com 2mL de água destilada e mantida em estufa a
75ºC por 24 horas para a determinação da biomassa seca por gavimetria.
Planejamento fatorial para Produção de inibidores de β-lactamases
O estudo da produção de inibidores de β-lactamases foram realizados baseados
em um planejamento fatorial completo proposto por Bruns e colaboradores., (2002).
Foram avaliadas variáveis em diferentes níveis, de acordo com a literatura
(AHARONOWITZ e DEMAIN, 1978; VIANA et al., 2009) tais como, concentrações
das fontes de nitrogênio e de carbono e o pH, utilizando um planejamento 2
3
composto
por 8 ensaios e 4 pontos centrais (Tabela 1), Foram selecionadas duas variavéis
resposta: atividade antimicrobiana e biomassa. Após os experimentos foram realizadas
as análises estatísticas dos resultados, com o auxílio do softwarer
Statistica 8.0 (Statsoft
Inc , 2008).
Tabela 1- Níveis dos fatores utilizados no estudo das melhores condições de cultivo
dos inibidores de β-lactamases
Fatores
Níveis
Inferior (-1) Central (0) Superior (+1)
pH 6,0 6,5 7,0
Fonte de carbono (%p/v) 0,5 0,75 1,0
Fonte de nitrogênio (% p/v soja)
1,0 2,5 4,0
Determinação da atividade antimicrobiana através da técnica de difusão em disco
e poço.
A atividade dos inibidores de β-lactamases no líquido metabólico obtido da
fermentação de
Nocardia sp. DPUA 1571 foi estimada empregando-se o método
biológico de difusão em disco descrito por Ericsson e Sherris (1971) e difusão em poço.
61
Na técnica de difusão em disco, placas contendo Ágar Mueller Hinton adicionado de
uma solução de benzil-penicilina G (0,01µg/mL), onde foram semeadas com uma
suspensão dos microrganismos teste
K. pneumoniae ATCC 29665 e S. aureus isolado
de mastite bovina, crescidos em meio Tryptic Soy Broth (TSB) a 37°C por 24 horas
com concentração de 10
8
UFC/mL o que corresponde a uma solução padrão de
McFarland a 0,5, ou seja, um valor de absorbância igual a 0,1 a 625nm. Nestas placas
foram adicionados discos de papel de filtro de 6mm de diâmetro impregnados com
20μL dos líquidos metabólicos livre de células e as placas foram incubadas a 37°C por
24h.
Para o teste de difusão em poço, o mesmo meio de cultura foi utilizado e
distribuído em placas de Petri, onde foi semeada uma suspensão dos microrganismos
testes, na mesma concentração utilizada no teste de difusão em disco. No centro das
placas de Petri foram realizados orifícios de 6mm de diâmetro onde foram adicionados
50μL do líquido metabólico produzido pelos actinomicetos selecionados. As placas
foram incubadas em estufa a 37°C por 24 horas. Em seguida, foram realizadas as
leituras dos diâmetros dos halos de inibição expressos em mm. Os ensaios foram
realizados em duplicata.
Determinação da concentração inibitória mínima
A determinação da concentração inibitória mínima (CIM) do liquido metabólico
produzido por fermentação de
Nocardia sp. DPUA 1571 foi determinada através da
técnica de microdiluição em caldo. As amostras dos microrganismos testes foram
inoculadas em meio (TSB) e incubadas à 37
o
C por 24 horas. Após, este período a
cultura foi diluída até uma concentração de aproximadamente 5 x 10
5
UFC/mL de
caldo, utilizando-se como referência a escala de turbidez 0,5 da escala de McFarland, o
que corresponde a um valor absorbância igual a 0,1 (625nm). Alíquotas de 5
μL desta
cultura foram depositadas em poços de microplacas de fundo redondo em até 15
minutos após a normatização do inóculo, um volume de 45
μL do caldo Muller Hinton
adicionado de benzil-penicillina G (0,02μg/mL) foi adicionado ao poço. Um volume de
50 µL do liquido fermentado por
Nocardia sp. DPUA 1571 foi adicionado no primeiro
poço de cada linha e diluído no fator 1:2 até a concentração mínima de 1:9. As
microplacas foram incubadas à 37 °C por 24 horas. Foi observado o crescimento
bacteriano nas diferentes concentrações do líquido fermentado e considerou-se a
62
concentração inibitória mínima a maior diluição de antimicrobiano que inibiu o
crescimento bacteriano.
Dosagem da concentração de glicerol
A concentração de glicerol no liquido metabólico foi determinada de acordo com
Hae Bok and Demain (1977).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Os resultados obtidos da produção de inibidores de β-lactamases por Nocardia
sp DPUA 1571 de acordo com o planejamento fatorial completo estão apresentados na
Tabela 2. Pode-se observar que os melhores resultados de inibição dos microganismos
teste (
K. pneumoniae ATCC 29665 e S. aureus resistentes a penicilina) foram obtidos
com concentração do filtrado de soja a 1,0% (ensaios 3 e 5). Os maiores diâmetros dos
halos de inibição foram detectados após 120 horas de crescimento de
Nocardia sp
DPUA 1571 em cultura submersa, sendo de 20mm frente
S. aureus e de 22mm frente K.
pneumoniae
ATCC 29665.
Na Tabela 3 estão apresentados os valores da biomassa em peso seco, consumo
do glicerol e os diâmetros dos halos de inibição (mm) obtidos para os microrganismos
teste (
K. pneumoniae ATCC 29665 e S. aureus resistentes a penicillina) através da
técnica de difusão em disco ao longo do período de cultivo no ensaio 3 (concentração de
glicerol 1,0%; filtrado de soja 1,0% e pH 6,0). O líquido metabólico produzido pela
fermentação de
Nocardia sp DPUA 1571 só foi capaz de inibir o crescimento bacteriano
após 96 horas de cultivo, apresentando maiores halos de inibição (16,0mm para
K.
pneumoniae
ATCC 29665 e de 14,0mm para S. aureus) após 120 horas de cultivo.
63
Tabela 2- Resultados do planejamento fatorial 2
3
para a produção de inibidores de β-
lactamases.
Ensaios Filtrado de
soja (%)
Glicerol
(%)
pH Técnica de difusão em poço
Halos de inibição (mm)
Klebsiella pneumoniae
ATCC 29665
Staphylococcus aureus
isoladas de mastite bovina
96 horas 120 horas 96 horas 120 horas
1 1 0,50 6,0 12,50 17,0 13,0 18,0
2 4 0,50 6,0 10,00 12,0 9,0 11,0
3 1 1,00 6,0 17,00 22,0 14,0 20,0
4 4 1,00 6,0 10,00 15,0 9,0 13,0
5 1 0,50 7,0 12,00 19,0 11,0 20,0
6 4 0,50 7,0 12,50 13,5 10,0 14,0
7 1 1,00 7,0 11,00 17,5 9,0 16,0
8 4 1,00 7,0 9,00 15,0 9,0 14,5
9 (C) 2,5 0,75 6,5 13,00 18,0 9,0 19,0
10 (C) 2,5 0,75 6,5 11,00 17,0 10,0 19,0
11 (C) 2,5 0,75 6,5 11,00 18,0 10,0 20,0
12 (C) 2,5 0,75 6,5 12,50 18,0 10,0 16,0
Os melhores resultados de atividade antimicrobiana foram obtidos na fase
estacionária de crescimento microbiano, com consumo da fonte de carbono, após 120
horas de cultivo. Estes resultados diferem dos obtidos por Ortiz et al. (2007), os quais
estudaram a produção de ácido clavulânico por Streptomyces clavuligerus utilizando
soja e derivados como fontes de nitrogênio. Estes autores observaram que a fonte de
carbono utilizada foi consumida totalmente, antes das primeiras 40 horas de cultivo,
enquanto que a melhor produção do
inibidor de β-lactamase foi obtida após 100 horas
de cultivo. No nosso estudo o consumo da fonte de carbono foi tardia, o que indica que
ocorreu o fenômeno de dioxia, a fonte de nitrogênio (farinha de soja) foi primeiramente
consumida, e apenas após 120 horas de cultivo a fonte de carbono (glicerol) foi
consumida, período este onde foram obtidos os melhores resultados para a atividade
antimicrobiana (Tabela 3).
64
Segundo Mayer e Deckwer (1996) durante a produção de ácido clavulânico por
S. clavuligerus em meio utilizando farinha de soja como fonte de nitrogênio é possível
que a presença de partículas da farinha de soja presentes no meio de cultivo leve a
formação de hidrolases e particularmente proteases extracelulares produzidas por S.
clavuligerus, induzindo a contínua degradação da farinha de soja durante a fase
exponencial de crescimento, e assim forneceria uma fonte constante de nutrientes
essenciais para o crescimento do microrganismo. Este fenômeno pode ter ocorrido no
nosso estudo, pois a farinha de soja foi consumida inicialmente.
Os metabólitos secundários, como por exemplo, os antibióticos, são sintetizados
por várias vias metabólicas e também por espécies geneticamente distintas, sendo sua
produção afetada por diferentes condições ambientais. Parâmetros da fermentação tais
como tempo, temperatura, pH e nutrientes, podem ser modificados visando ampliar a
quantidade dos metabólitos secundários produzidos por microrganismos (PFEFFERLE
et al., 2000).
Tabela 3. Concentração de glicerol e valores de peso seco no cultivo de Nocardia sp.
DPUA 1571 em comparação com halos de inibição apresentados para os
microrganismos teste utilizados (
K. pneumonie DPUA 1571 e S. aureus) utilizando a
técnica de difusão em disco com concentração de glicerol 1,0%; filtrado de soja 1% e
pH 6,0 (ensaio 3).
Tempo
(horas)
Peso seco
(gramas)
Concentração de
glicerol (mg/mL)
Diâmetro dos halos
de inibição frente
K. pneumoniae
(mm)
Diâmetro dos halos
de inibição frente
S.
aureus
(mm)
0 10,0 0,63 - -
24 10,4 0,62 - -
48 19,5 0,58 - -
72 22,9 0,59 - -
96 31,1 0,56 11,0 11,0
120 15,7 0,15 16,0 14,0
65
As Figuras 1, 2 e 4 apresentam o gráfico de Pareto, que apresenta os efeitos
estimados das variáveis e das interações entre as variáveis (concentração de filtrado de
soja, concentração de glicerol e pH) sobre as respostas (atividade antimicrobiana e
biomassa) em ordem de magnitude. O comprimento de cada barra é proporcional ao
efeito da variável. A linha vertical pode ser usada para julgar os efeitos estatisticamente
significativos, ou seja, as barras que se estenderem através desta linha correspondem aos
efeitos estatisticamente significativos com nível de confiança de 95% ou p=0,05
A análise estatística dos resultados foi inicialmente realizada para a variável
resposta biomassa (Figura 1), a qual apresentou a concentração de filtrado de soja como
à única variável com efeito positivo e estatisticamente significativa, ou seja, uma maior
concentração da fonte de nitrogênio favoreceu o crescimento bacteriano.
-0,089
0,329
-0,689
-0,869
1,169
1,169
14,188
p=0,05
Efeito Estimado (valor absoluto)
1*2*3
1*3
2*3
(3)pH
1*2
(2)Glicerol
(1)Filtrado de soja
Figura 1- Gráfico de Pareto da produção de inibidores de β-lactamases por Nocardia
sp. DPUA 1571 tendo como variável resposta a biomassa
A farinha de soja utilizada neste estudo pode ser considerada como fonte de
nitrogênio, porém os esqueletos carbônicos dos aminoácidos gerados a partir da
hidrólise por proteases podem ser utilizadas também como fonte de carbono (Mayer e
Deckwer, 1996). Além da farinha de soja poder ser utilizada como fonte de nitrogênio e
66
de esqueletos carbônicos, ela é um substrato de baixo custo, quando comparado com
outras proteínas de soja (Ortiz et al., 2007), sendo comercializada a US$ 0,30/kg em
fevereiro de 2010 segundo Index Mundi (2010).
A análise estatística dos resultados foi realizada para a variável atividade
antimicrobiana frente
K. pneumoniae ATCC 29665 durante as 120 horas de
fermentação. Porém, apenas nos tempos de 96 e 120 horas o líquido metabólico
apresentou halos de inibição, sendo em 120 horas a maior produção de inibidores de
β-
lactamases, com halos de inibição que variaram de 12 a 22 mm com a técnica de difusão
em poço (Tabela 2).
0,707
-0,707
2,828
3,535
-5,656
5,656
-14,142
p=0,05
Efeito Estimado (valor absoluto)
1*2
(3)pH
1*3
1*2*3
2*3
(2)Glicerol
(1)Filtrado de soja
Figura 2- Gráfico de Pareto da produção de inibidores de β-lactamases por Nocardia sp
. DPUA 1571 para a variável resposta atividade antimicrobiana (halos de inibição)
frente a
K. pneumoniae ATCC 29665 após 120 horas de cultivo.
67
A Figura 2 mostra os efeitos das variáveis sobre a atividade antimicrobiana
frente a
K. pneumoniae ATCC 29665 e as concentrações do filtrado de soja (1) e do
glicerol (2) apresentaram efeitos significativos. Também pode-se observar interações
significativas entre duas (1x2) e três (1x2x3) das variáveis estudadas.
O filtrado de soja apresentou efeito negativo sobre a produção de inibidores de
β-lactamases, ou seja, uma maior concentração desta fonte de nitrogênio inibiu a
produção deste metabólito. Resultados similares foram apresentados por Ortiz et al.,
(2007) os quais observaram que os carboidratos presentes na farinha de soja não foram
consumidos pelo
S. clavuligerus, não tendo influenciado a biossíntese de inibidor de β-
lactamase (ácido clavulânico).
A concentração de glicerol como fonte de carbono apresentou efeito positivo
sobre a produção de inibidores de
β-lactamases, significando que uma maior
concentração de glicerol favoreceu a produção do inibidor de
β-lactamase. Similarmente
ao ocorrido neste estudo, Gouveia e colaboradores (2001), os quais estudaram a
otimização da composição do meio de cultivo para a produção de ácido clavulânico por
Streptomyces clavuligerus, estes autores observaram baixos níveis de concentrações de
glicerol no final da fermentação, tendo o consumo do glicerol influenciado
positivamente para a produção do inibidor de
β-lactamase.
As interações entre três variáveis são mais bem compreendidas utilizando a
representação do gráfico cúbico, o efeito da interação entre a concentração da fonte de
nitrogênio, concentração de fonte de carbono e o pH sobre a atividade antimicrobiana
frente a
K. pneumoniae ATCC 29665 após 120 horas de cultivo está representada na
Figura 3. O maior valor de efeito indicou que as condições filtrado de soja a 1,0%,
glicerol a 1,0% e pH 6,0 foram as melhores para a produção de inibidores de
β-
lactamases.
Figura 3.
Gráfico da atividade antimicrobiana frente à
29665 em diferentes níveis de pH, concentração de farinha de soja e concentração de
glicerol de acordo com o planejamento fatorial descrito na
A concentração do filtrado
antimicrobiana frente à K.
pneumoniae
Neto et al (2005) estudaram a influência da fonte de nitrogênio na produção de ácido
clavulânico por
Streptomyces
elevada de fonte de nitrogênio (3% de Samprosoy 90NB) podem inibir ou reprimir a
formação deste inibidor de β-
lactamases.
68
Gráfico da atividade antimicrobiana frente à
Klebsiella
pneumoniae
29665 em diferentes níveis de pH, concentração de farinha de soja e concentração de
glicerol de acordo com o planejamento fatorial descrito na
Tabela 2.
A concentração do filtrado
de soja apresentou efeito negativo sob a atividade
pneumoniae
ATCC 29665, como apresentado na Figura 4.
Neto et al (2005) estudaram a influência da fonte de nitrogênio na produção de ácido
Streptomyces
clavuligerus
esses autores supõem que uma concentração
elevada de fonte de nitrogênio (3% de Samprosoy 90NB) podem inibir ou reprimir a
lactamases.
pneumoniae
ATCC
29665 em diferentes níveis de pH, concentração de farinha de soja e concentração de
de soja apresentou efeito negativo sob a atividade
ATCC 29665, como apresentado na Figura 4.
Neto et al (2005) estudaram a influência da fonte de nitrogênio na produção de ácido
esses autores supõem que uma concentração
elevada de fonte de nitrogênio (3% de Samprosoy 90NB) podem inibir ou reprimir a
69
0,102
0,510
0,918
0,918
1,326
-1,530
-4,388
p=0,05
Efeito Estimado (valor absoluto)
(2)Glicerol
(3)pH
1*2*3
1*2
1*3
2*3
(1)Filtrado de soja
Figura 4- Gráfico de Pareto da produção de inibidores de β-lactamases por Nocardia
sp. DPUA 1571 para a variável resposta atividade antimicrobiana frente ao S. aureus
isolado de mastite bovina após 120 horas de cultivo.
A atividade antimicrobiana do líquido metabólico produzido por
Nocardia sp.
DPUA 1571 frente
S. aureus, apresentou halos de inibição após 96 e 120 horas que
variaram entre 9,0 e 20,0 mm utilizando a técnica de difusão em poço. Após a análise
estatística dos resultados observou-se que apenas a concentração do filtrado de soja
apresentou um efeito significativo negativo para a produção de inibidores de
β-
lactamases, ou seja, uma menor concentração do filtrado de soja favoreceu o aumento
do halo de inibição (Figura 4). Os resultados de susceptibilidade para a
K. pneumoniae
ATCC 29665 e S.aureus isolados de mastite, resistentes à penicilina foram semelhantes,
sendo o efeito da variável concentração da farinha de soja, o mais significativo para a
produção de inib
idores de β-lactamases.
Na literatura são encontrados trabalhos que descrevem a utilização de diferentes
fontes de nitrogênio, os meios de cultura utilizados para o cultivo de
S. clavuligerus na
produção de ácido clavulânico, em geral contêm fontes de nitrogênio complexas que
70
variam entre 0,1 a 10% (v/v), tais como extrato de levedura, proteína vegetal, proteínas
de sementes e fontes de proteínas hidrolisadas, além dessas, as proteínas da soja
demonstraram ser de grande importância para a produção deste inibidor de
β-lactamase
(Butterworth, 1984; Gouveia, 2001). Spizek et al. (1995) ressaltam as vantagens da
utilização de derivados de soja como constituintes do meio de cultura em processos
fermentativos envolvendo actinomicetos. Em seus estudos Mayer e Deckwer (1996)
descreveram a utilização de meio de cultura a base de farinha de soja. A farinha de soja
é uma boa fonte de nitrogênio, o que pode explicar a alta produtividade de ácido
clavulânico obtida neste trabalho.
A Tabela 4 apresenta os resultados do teste da concentração mínima capaz de
inibir o crescimento bacteriano, o líquido metabólico depois de diluído na proporção
de 1:2 em associação com a penicilina foi capaz de inibir o crescimento de todos os
microrganismos testes, na proporção de 1:3 inibiu apenas 4 dos microrganismos
testados, não houve, inibição nas demais diluições, esses resultados confirmam a
presença dos inibidores de
β-lactamase no liquido metabólico. Serão necessários
estudos futuros para purificar e identificar esses compostos.
Tabela 4 – Concentração inibitória mínima do líquido metabólico produzido por
Nocardia sp. DPUA 1571 após 120 horas de cultivo.
Diluições do líquido
metabólito
Microrganismos Teste
Kp S1 S2 S3 S4 S5 S6 S7 S7 S9 S10
1:2 + + + + + + + + + + +
1:3 + + + - - + - - - - -
1:4 - - - - - - - - - - -
Kp: K. pneumoniae; S1, S2, S3, S4, S5, S6, S7, S8, S9, S10: Staphylococcus aureus isolados de mastite
bovina; (+) houve inibição; ( -) não houve inibição
CONCLUSÕES
Neste estudo foi investigada a influência das variáveis para a produção de
inibidores de β-lactamase por Nocardia sp. DPUA 1571 isolado de liquens da Região
Amazônica, de acordo com os resultados obtidos foi possível concluir que maiores
concentrações da fonte de carbono (1,0%), menores concentrações do filtrado de soja
(1%) e o pH 6,0 foram as melhores condições para a produção desse metabólico
71
secundário, que em associação com a penicilina foi capaz de produzir halos de inibição
frente aos microrganismos resistentes à penicilina. Serão necessários estudos posteriores
visando a otimização da produção, bem como identificação e purificação desses
compostos.
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
Aharonowitzt, Y.; Demain, A. L. (1978), Carbon Catabolite Regulation of
Cephalosporin Production in
Streptomyces clavuligerus. Antimicrobial Agents and
Chemotherapy
, v. 14, p. 159-164.
Baggaley, K.H., Brown, AG.; Schofield, C.J. (1997). Chemistry and
biosynthesis of clavulanic acid and others clavams.
Natural Products Reports, v.14,
p.309-333.
Bruns, R. E.; Scarminio, I. S.; Barros-Neto, B. (2006). Statistical design—
Chemometrics. Amsterdam, Netherlands: Elsevier.
Butterworth, D. (1984) Clavulanic acid: properties biosynthesis, and
fermentation. In:
Biotechnology of Industrial Antibiotics, ed. E. J. Vandamme, NY, M.
Dekker, Inc., p.3-31.
Carneiro-da-Cunha, M. N., Viana Marques, D. A., Lima-Filho, J. L., Simas, M.
F. T., Porto, T. S., Porto, A. L. F. (2009), Produção de Inibidores de
β-lactamases por
Actinomicetos Isolados de Liquens da Região Amazônica. In: XVII Simpósio Nacional
de Bioprocessos. Natal - Brasil.
Elander, R. P. (2003) Industrial production of beta-lactam antibiotics.
Appl.
Microbiol. Biotechnol.
v.61, n. 5-6, p.385-392.
Ericsson, H.M.; Sherris, J.C. (1971) Antibiotic sensitivity testing-Report of an
International Collaborative Study.
Acta Pathol. Microbiol. Scand, n.217, p.1-90.
Foulstone, M.; Reading, C. (1982). Assay of amoxicillin and clavulanic acid,
components of augumentin, in biological fluids with performance líquid cromatography.
Antimicrobial Agents and Chemoterapy, v.22, p.753-762.
72
Gouveia, E. R. (2001), Desenvolvimento do Processo de Produção de Ácido
Clavulânico por
Streptomyces clavuligerus NRRL 3585. Tese de Doutorado, APG-
DEQ/UFSCar, São Carlos, Brasil. pp. 133-172.
Hae Bok, S., & Demain, A. L. (1977). Analytical Biochemistry, 81, 18–20.
Koneman, E.W., Allen, S. D., Janda, W. A., Schreckenberger, P. C., Winn, W.
C. (2001). Diagnóstico Microbiológico. Texto e Atlas Colorido 5.ed. Rio de Janeiro:
MEDSI, p.551-588.
INDEX MUNDI (2010). Disponível em:
<
http://www.indexmundi.com/pt/pre%C3%A7os-de-
mercado/?mercadoria=farinha-de-soja> Acessado em: 17 de março de 2010.
Lee, N., Yuen, K. Y., Kumara, C. R. (2003), Clinical role of beta-lactam/beta-
lactamase inhibitor combinations.
Drugs, v. 63, p. 1511-1524.
Li, R.; Townsend, C. A. (2006). Rational strain improvement for enhanced
clavulânico acid production by genetic engineering of the glycolytic pathway in
Streptomyces clavuligerus. Metabolic Engineering n.8 p.240–252.
Mayer A. F, Deckwer W. D. (1996) Simultaneous production and decomposition
of clavulanic acid during Streptomyces clavuligerus cultivations.
Appl Microbiol
Biotechnol
. v.45: p.41–6.
Medeiros, E. S.; Mota, R. A.; Santos, M. V.; Freitas, M. F. L.; Pinheiro Júnior, J.
W.; Teles, J. A. A. (2009). Perfil de sensibilidade microbiana in vitro de linhagens de
Staphylococcus spp. isoladas de vacas com mastite subclínica. Pesq. Vet. Bras. v.29 n.7
p.569-574.
Miller, L. A.; Ratnam, K.; Payne, D. J. (2001) b-Lactamase inhibitor
combination sinthe 21
st
century: current agents and new developments. Curr. Opin.
Pharmacol
. n.1, p.451–458.
NCCLS - National Comité Clinical Laboratory Standards (2003),
Methods for
Dilution Antimicrobial Susceptibility Tests for Bacteria That Grow Aerobically;
73
Approved Standard—Sixth Edition. NCCLS document M7-A6 [ISBN 1-56238-486-4].
NCCLS, 940 West Valley Road, Suite 1400, Wayne, Pennsylvania 19087-1898 USA.
Neto, A. B., Hirata, D. B., Cassiano-Filho, L. C. M., Badino-Júnior, A. C.,
Hokka, C. O. (2006) Influência da Concentração da Fonte de Nitrogênio na Produção de
Ácido Clavulânico por S
treptomyces clavuligerus. In: XV Simpósio Nacional de
Bioprocessos - Brasil.
Oliveira, P. M. S. Seleção de
Streptomyces spp produtores de inibidores de beta
lactamases (2004). Dissertação (Mestrado em Biotecnologia de produtos Bioativos)
Programa de Pós Graduação em Biotecnologia de produtos Bioativos, UFPE,
Pernambuco.
Oliveira, J. H. H. L.; Granato, A. C.; Hirata, D. B.; Hokka, C. O.; Barboza, M.
(2009). Ácido clavulânico e cefamicina c: uma perspectiva da biossíntese, processos de
isolamento e mecanismo de ação
. Quim. Nova, v.32, n.8, p. 2142-2150.
Ortiz, S. C. A.; Hokka, C. O.; Badino-Jr, A. C. (2007), Utilization of soybean
derivatives on clavulanic acid production by
Streptomyces clavuligerus. Enzyme and
Microbial Technology
, v. 40, p.1071-1077.
Payne, D. J.; Cramp, R.; Winstanley, D. J.; Knowles, D. J. C. (1994).
Antimicrob.
Agents Chemother. p.767
Pfefferle, C.; Theobald, U.; Gürtler, H.; Fiedler, H.P. (2000), Improved
secondary metabolite production in the genus
Streptosporangium by optimization of the
fermentation conditions.
Journal of Biotechnology, v. 80, p. 135-142.
Piddock, L. J. V. (2006). Clinically relevant chromosomally encoded multidrug
resistance efflux pumps in bacterial.
Clin Microbiol Rev n.19 p.382-402.
Porto, A. L. F., Campos-Takaki, G. M. and Lima Filho, J. L. (1996) Effects of
culture conditions on protease production by
Streptomyces clavuligerus growing soy
bean flour medium.
Appl. Biochem. Biotech., n.60, p.115-122.
74
Pridham, T. G.; Aderson, P.; Foley, C.; Lindenfelser, L. A.; Hesseltine, C. W.;
Benedict, R.G. (1957), A Selection of Media for Maintenance and Taxonomic Study of
Streptomyces.
Antibiotics Manual, p.947-953.
Sanders, C. C.; Sanders, W.E. (1992). b-lactam resistance in gram-negative
bacteria: global trend sand clinical impact.
Clin Infect Dis n.15 p.824–39.
Spizek, J. and Tichy, P. (1995) Some aspects of overproduction of secondary
metabolites,
Folia Microbiologica, v.40, N.1, p.43-50.
Statsoft, Inc. (2008). STATISTICA (data analysis soft-ware system), version
8.0.
Sykes, R. B.; Matthew, M. (1976). The beta-lactamases of gram-negative
bacteria and their role in resistance to beta-lactam antibiotics.
Antimicrob Agents
Chemother
, n.2 p.115–57.
Thakur, D., Yaday, B. K. G., Bora, T. C. (2007). Isolation and screening of
Streptomyces in soil of protected forest areas from the states of Assam and Tripura,
India, for antimicrobial metabolites.
Journal de Mycologie Médicale, n.17, p.242-249.
Viana D. A.; Carneiro-Cunha, M. N.; Araújo J. M.; Barros-Neto, B.; Lima-Filho,
J. L.; Converti, A.; Pessoa-Júnior, A.; Porto, A. L. F. (2009) Screening of Variables
Influencing the Clavulanic Acid Production by Streptomyces DAUFPE 3060 Strain.
Appl Biochem Biotechnol, DOI10.1007/s12010-009-8671-3.
Willians, J. D. (1999),
β-lactamases and β- lactamases inhibitor. International
Journal of Antimicrobial Agents. v.12, p S3-S7.
Yu, T. W.; Shen, Y.; Doi-Katayama, Y.; Tang, L.; Park, C.; Moore, B. S.;
Hutchinson, C. R.; Floss, H. G. (1999). Direct evidence that the rifamycin polyketide
synthase assembles polyketides chains processively.
Proc Natl Acad Sci USA, v.9,
p.9051-9056.
75
76
Anexo I
77
ISSN 0102-0935 versão
impressa
ISSN 1678-4162 versão online
INSTRUÇÕES AOS AUTORES
Tipos de artigos aceitos para publicação
Política editorial
Preparação dos manuscritos para
publicação
Citações bibliográficas
Submissão dos trabalhos
Tipos de artigos aceitos para publicação
Artigo Científico.
É o relato completo de um trabalho
experimental. Baseia-
se na premissa de que os resultados são
posteriores ao planejamento da pesquisa. Seções do texto:
Introdução, Material e Métodos, Resultados e Discussão e
Conclusões. O número total de páginas não de
ve exceder a
15.
Relato de Caso
. Contempla principalmente as áreas
médicas, em que o resultado é anterior ao interesse de sua
divulgação ou a ocorrência dos resultados não é planejada.
Seções do texto: Introdução, Casuística, Discussão e
Conclusões (quando
pertinentes). O número total de páginas
não deve exceder a 10.
Comunicação
. É o relato sucinto de resultados parciais de
um trabalho experimental, dignos de publicação, embora
insuficientes ou inconsistentes para constituírem um artigo
científico. Levanta
mentos de dados (ocorrência,
diagnósticos, etc.) também se enquadram aqui. Deve ser
compacto, com no máximo seis páginas impressas, sem
distinção das seções do texto especificadas para "Artigo
Científico", embora seguindo aquela ordem. Quando a
comunicação
for redigida em português deve conter um
"Abstract" e quando redigida em inglês deve conter um
"Resumo".
Política editorial
Publicar trabalhos científicos originais (artigos, relatos de
casos e comunicações) que sejam de interesse para o
desenvolvimento da ciência animal. Serão recomendados
para publicação somente os trabalhos aprovados pelos
editores, baseados na recomendação
de dois revisores
científicos da área pertinente e/ou do corpo editorial.
Preparação dos manuscritos para publicação
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Os trabalhos devem ser redigidos em português ou inglês, na
forma impessoal. Para ortografia em inglês recomenda-
se o
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. Para
ortografia em português adota-se o
Vocabulário Ortográfico
da Língua Portuguesa
, da Academia Brasileira de Letras. Os
trabalhos submetidos em inglês deverão conter resumo em
português e vice-versa.
Os trabalhos e ilustraç
ões deverão ser apresentados em
Microsoft Word, folha no formato A4, fonte Times New
Roman tamanho 12, espaço entre linhas 1,5, margens de
3cm, com páginas e linhas numeradas (numeração contínua).
Seções de um trabalho
Título
. Em português e em inglês. D
eve ser o resumo do
resumo e não ultrapassar 100 dígitos.
Autores.
Os nomes dos autores virão abaixo do título, com
identificação da instituição a que pertencem. Deve estar
indicado o autor para correspondência com endereço
completo, telefone, fax e e-mail.
Resumo e Abstract
devem conter no máximo 200 palavras
em um só parágrafo. Não repetir o título. Cada frase é uma
informação. Atenção especial às conclusões.
Palavras-chave e Keywords. No máximo cinco.
Introdução. Explanação concisa, na qual são estabelec
idos
brevemente o problema, sua pertinência, relevância e os
objetivos do trabalho.
Material e Métodos
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material envolvido, a descrição dos métodos usados ou
referenciar corretamente os métodos já publicados. Não usar
subtítulos.
Nos trabalhos que envolvam animais ou organismos
geneticamente modificados deverá constar o número do
protocolo de aprovação do Comitê de Bioética e/ou de
Biossegurança.
Resultados
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resultados encontrados.
Discussão
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trabalho.
Obs
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79
apresentadas em conjunto.
Conclusões.
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Tabela. Conjunto de dados alfanuméricos ordenad
os em
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cabeçalho e no final da tabela. A legenda recebe inicialmente
a palavra Tabela, seguida pelo número de ordem em
algarismo arábico e é referida no texto como Tab., mesmo
quando se referir a várias tabelas.
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esquema etc. As legendas recebem inicialmente a palavra
Figura, seguida do número de ordem em algarismo arábico e
é referida no
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e Moreno (1974)
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ordem cronológica ascendente e alfabética de
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80
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. Todo esforço deve ser empreendido para
se consultar o documento ori
ginal. Em situações
excepcionais pode-
se reproduzir a informação já citada por
outros autores. No texto, citar o sobrenome do autor do
documento não consultado com o ano de publicação, seguido
da expressão citado por e o sobrenome do autor e ano do
documento consultado. Na listagem de referência, deve-
se
incluir apenas a fonte consultada.
Comunicação pessoal
. Não fazem parte da lista de
referências. Na citação coloca-
se o sobrenome do autor, a
data da comunicação, nome da Instituição à qual o autor é
vinculado.
Referências bibliográficas
São adotadas as normas ABNT/NBR-
6023 de 2002,
simplificadas conforme exemplos:
Periódicos
ANUÁRIO ESTATÍSTICO DO BRASIL
. v.48, p.351,
1987-88.
FERGUSON, J.A.; REEVES, W.C.; HARDY, J.L
.
Studies on immunity to alphaviruses in foals.
Am. J. Vet.
Res., v.40, p.5-10, 1979.
HOLENWEGER, J.A.; TAGLE, R.; WASERMAN, A.
et
al. Anestesia general del canino. Not. Med. Vet., n.1, p.13-
20, 1984.
Publicação avulsa
DUNNE, H.W
. (Ed). Enfermedades del cerdo
. México:
UTEHA, 1967. 981p.
LOPES, C.A.M.; MORENO, G
. Aspectos bacteriológicos
de ostras, mariscos e mexilhões. In: CONGRESSO
BRASILEIRO DE MEDICINA VETERINÁRIA, 14., 1974,
São Paulo. Anais... São Paulo: [s.n.] 1974. p.97. (Resumo).
MORRIL, C.C
. Infecciones por clostridios. In: DUNNE,
H.W. (Ed). Enfermedades del cerdo
. México: UTEHA,
1967. p.400-415.
NUTRIENT requirements of swine. 6.ed. Washington:
National Academy of Sciences, 1968. 69p.
SOUZA, C. F. A.
Produtividade, qualidade e rendimentos
81
de carcaça e de carne em bovinos de corte. 1999
. 44f.
Dissertação (Mestrado em Medicina Veterinária) -
Escola de
Veterinária, Universidade Federal de Minas Gerais, Belo
Horizonte.
Documentos eletrônicos
QUALITY food from animals for a global market.
Washington: Association of American Veterinary Medic
al
College, 1995.
Disponível em: <http://www.
org/critca16.htm>. Acessado em: 27 abr. 2000.
JONHNSON, T. Indigenous people are now more
cambative, organized. Miami Herald
, 1994. Disponível em:
<http://www.summit.fiu.edu/MiamiHerld-Summit-Related
Articles/>. Acessado em: 5 dez. 1994.
Submissão dos trabalhos
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-
line, no
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ação. A taxa de publicação de R$55,00, por
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