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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
FACULDADE DE AGRONOMIA
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM FITOTECNIA
SELEÇÃO ARTIFICIAL PARA RESISTÊNCIA À MURCHA BACTERIANA
(Ralstonia solanacearum) EM FUMO (Nicotiana tabacum L.)
Cláudio Vidal de Medeiros
Biólogo
Dissertação apresentada como um dos
requisitos à obtenção do grau de
Mestre em Fitotecnia
Área de concentração Plantas de Lavoura
Porto Alegre (RS), Brasil
Abril de 2005.
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ii
FOLHA DE HOMOLOGAÇÃO
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iii
Às minhas filhas, Cláudia e Luiza
À minha esposa, Marisete
Ofereço
Ao Engenheiro Agrônomo
Horst Deeke
Dedico
iv
AGRADECIMENTOS
Ao professor Luiz Carlos Federizzi, pela orientação, exemplo profissional e
amizade.
À professora Sandra C. K. MiIach, pelos ensinamentos, pela oportunidade
de ingresso no programa de pós-graduação em Fitotecnia.
À Direção da Universal Leaf Tabacos Ltda., por ter permitido a execução
desse curso, oportunizando apoio logístico para este desafio.
Ao Engenheiro Agrônomo Gerente do Departamento de Pesquisa da
Universal Leaf Tabacos Ltda. Horst Deeke, pelo incentivo e oportunizando
crescimento de minha formação e qualificação profissional.
A todos os colegas do Departamento de Pesquisa pelo incentivo e apoio
nas horas mais difíceis.
Aos professores do Departamento de Fitossanidade, em especial a
Professora Aida Terezinha Santos Matsumura pelo incentivo e amizade.
Aos amigos e colegas Celson Alexandre Weiler e Marcus André Kurtz
Almança pela amizade e acolhimento em seu laboratório.
À colega Adriane Leite do Amaral pela amizade, incentivo e ajuda na
realização do projeto de mestrado.
À estudante de biologia Mírian Nunes Morales, pela valiosa colaboração na
elaboração e correção dessa dissertação.
Ao colega do Departamento de Pesquisa da Universal Leaf Tabacos Ltda.
Sérgio Luis Lenz pela amizade e compreensão nos momentos difíceis.
v
Ao Dr. Márcio Ender, Engenheiro Agrônomo, pela disponibilidade,
colaboração durante a elaboração dessa dissertação e ensinamentos.
Aos colegas Itamar Cristiano Nava e Luis Marcelo Tisan obrigado por
compartilhar os conhecimentos nas horas de nosso grupo de estudo.
À minha família pela compreensão de minha ausência, e ao incentivo e
apoio, fundamentais para a realização desse trabalho.
E a todos que, direta ou indiretamente, contribuíram para a realização
desse trabalho.
vi
SELEÇÃO ARTIFICIAL PARA RESISTÊNCIA À MURCHA BACTERIANA
(Ralstonia solanacearum) EM FUMO (Nicotiana tabacum L.)
1
Autor: Cláudio Vidal de Medeiros
Orientador: Luiz Carlos Federizzi
RESUMO
O desenvolvimento de materiais tipo Burley resistente a Murcha Bacteriana
é de suma importância para a fumicultura brasileira. Em fumo tipo Burley não
existem variedades comerciais com boa adaptação resistentes à R.
solanacearum. O objetivo desse trabalho foi determinar o efeito da seleção
artificial para resistência à murcha bacteriana na população Burley x Virgínia em
diferentes gerações segregantes. Este estudo foi realizado em um infectário de R.
solanacearum, localizado em Santa Cruz do Sul, RS. Foi realizado cruzamento
entre um cultivar tipo Burley moderadamente resistente (BY 26) e um material tipo
Virgínia resistente à murcha (Oxford 207). Foram comparados quatro gerações
F1, F3, F5, F7, pai moderadamente resistente (BY 26), pai resistente (OX 207) e
uma testemunha suscetível (01528). O delineamento experimental utilizado foi de
blocos ao acaso, com quatro repetições e 10 plantas em cada parcela, para
uniformizar e aumentar o nível de severidade da moléstia, as plantas foram
inoculadas através da deposição de 20 mL de uma suspensão (10
8
UFC/mL) de
R. solanacearum. Para a murcha bacteriana não houve diferença significativa
entre as médias das quatro gerações e nem destas com o genitor resistente, já
que provavelmente a seleção efetuada em todas as gerações foi suficiente para
manter os níveis de resistência observados na geração F1. Observou-se em F7
que várias linhas já estavam fixas com níveis de resistência à murcha semelhante
ao genitor resistente. Portanto, os resultados finais mostraram que a seleção
artificial foi eficiente para selecionar a resistência à murcha bacteriana, e que é
possível transferir resistência a R. solanacearum de fumo Virgínia para fumo tipo
Burley – mantendo as características desejadas de cor e tipo do fumo Burley com
a resistência similar a do pai resistente.
____________
1
Dissertação de Mestrado em Fitotecnia,Faculdade de Agronomia, Universidade
Federal do Rio Grande do Sul, RS, Brasil. (59p.) Abril, 2005.
vii
ARTIFICIAL SELECTION FOR RESISTANCE TO BACTERIAL WILT (Ralstonia
solanacearum) IN TOBACCO (Nicotiana tabacum L.)
1
Author: Cláudio Vidal de Medeiros
Adviser: Luiz Carlos Federizzi
ABSTRACT
The release of new Burley cultivars resistant to Bacterial Wilt is very
important for the Brazilian tobacco production. In Burley tobacco resistance to R.
solanacearum in adapted cultivars is rare. The goal of this study was to verify the
effect of selection for resistance to Bacterial Wilt in segregating generations from a
cross involving a burley and a flue cured tobacco. The population used was
derived from a cross between BY 26, a moderate resistant burley cultivar, and
Oxford 207, a flue cured tobacco cultivar resistant to R. solanacearum. The
generations F1, F3, F5, F7, the parents, BY 26 and Oxford 207 and a susceptible
check, 01528, were tested in the field, in a nursery naturally infested with R.
solanacearum, located in Santa Cruz do Sul, RS. The nursery was artificially
inoculated with the bacterium in order to increase and have a uniform disease
pressure. It was used a Randomized Complete Block Design (RCBD), with four
replications and 10 plants per plot. The four generations, F1, F3, F5 and F7 were
not different regarding the disease severity and were not different compared to the
resistant parent as well. Probably, the selection made in all generations was
enough to maintain the high levels of resistance observed in F1 generation. Many
lines in F7 were uniform in terms of high resistance to bacterial wilt, similar to
Oxford 207. Therefore, the results support the strategy of transferring resistance to
R. solanacearum from flue cured into burley tobacco, maintaining the desired plant
type regarding leaf color and plant architecture of burley tobacco.
____________
1
Master of Science dissertation in Agronomy, Faculdade de Agronomia,
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, RS, Brazil. (59p.) April, 2005.
viii
SUMÁRIO
Página
INTRODUÇÃO.....................................................................................................................1
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA........................................................................................3
1.1 Caracterização e origem do fumo (Nicotiana tabacum L.)............................3
1.2 Caracterização do patógeno (Ralstonia solanacearum)................................6
1.2.1 Controle .....................................................................................................10
1.2.2 Diversidade genética da Ralstonia solanacearum..............................11
1.3 Melhoramento genético do fumo.....................................................................12
1.4 Resistência à Ralstonia solanacearum...........................................................14
2. MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................17
2.1 Método de obtenção das gerações.................................................................17
2.2 Experimento de avaliação das diferentes gerações.....................................25
2.3 Análises estatísticas..........................................................................................29
2.4 Estimativas dos parâmetros genéticos...........................................................31
2.4.1 Médias, variâncias e herdabilidade.......................................................30
2.4.2 Efeitos gênicos .........................................................................................33
2.4.3 Correlações fenotípicas...........................................................................34
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO..................................................................................35
4. CONCLUSÕES.............................................................................................................53
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..........................................................................54
ix
RELAÇÃO DE TABELAS
Página
1. Escala diagramática utilizada para avaliação do sistema radicular de
fumo, infectado por Murcha Bacteriana. Faculdade de Agronomia,
UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005..........................................................................19
2. Plantas selecionadas nos diferentes anos e gerações. Faculdade de
Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.....................................................22
3. Geração, índice de seleção, plantas selecionadas e plantas totais.
Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005...........................25
4. Modelo da Análise de Variância, para a severidade da Murcha
Bacteriana (MB), cor e tipo. Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto
Alegre, RS. 2005.....................................................................................................30
5. Modelo da Análise de Variância, para a severidade da Murcha
Bacteriana (MB), cor e tipo, entre e dentro das gerações. Faculdade
de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005...............................................30
6. Causas de variação, graus de liberdade, quadrado médio e quadrado
médio esperado, entre e dentro de famílias para severidade da
Murcha Bacteriana (MB). Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto
Alegre, RS. 2005.....................................................................................................31
7. Análise de variância para a severidade da moléstia (MB), ao tipo de
fumo, à cor da folha para as causas de variação, médias, coeficiente
de variação (CV%), de quatro gerações de fumo (F1, F3, F5 e F7) e
três testemunhas (pai moderadamente resistente, pai resistente e
testemunha suscetível). Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto
Alegre, RS. 2005.....................................................................................................36
8. Média da severidade da moléstia (MB), do tipo de fumo, e da cor da
folha de quatro gerações de fumo (F1, F3, F5 e F7) e três
testemunhas (pai moderadamente resistente, pai resistente e
testemunha suscetível). Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto
Alegre, RS. 2005.....................................................................................................37
x
9. Análise de variância para a severidade da moléstia (MB), do tipo de
fumo, da cor da folha para as causas de variação, média e coeficiente
de variação (CV%) de quatro gerações de fumo (F1, F3, F5 e F7).
Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005...........................41
10. Severidade da moléstia (MB), desvio padrão (dp) do tipo de fumo, da
cor da folha das linhas dentro da geração F3 de fumo. Faculdade de
Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.....................................................44
11. Severidade da moléstia (MB), desvio padrão (dp) do tipo de fumo, da
cor da folha das linhas dentro da geração F5 de fumo. Faculdade de
Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.....................................................46
12. Severidade da moléstia (MB), desvio padrão (dp) do tipo de fumo, da
cor da folha das linhas dentro da geração F7 de fumo. Faculdade de
Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.....................................................47
13. Efeitos gênicos e valores de probabilidade do teste de quiquadrado
para o ajuste do modelo para três parâmetros, para severidade de
moléstia, em seis gerações de fumo F1, F3, F5, F7. Faculdade de
Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.....................................................48
14. Estimativas das variâncias entre famílias (V
2
F
), dentro das famílias
(V
2
W
), aditiva (V
A
) e de ambiente (V
E
) e herdabilidade no sentido
restrito para o caráter severidade da moléstia (MB), do tipo de fumo,
da cor da folha das linhas dentro das gerações F3, F5, F7 de fumo.
Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005...........................50
15. Coeficientes de correlação geral entre as características severidade
da moléstia (MB), do tipo de fumo, da cor da folha. Faculdade de
Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.....................................................51
16. Coeficientes de correlação entre as características severidade da
moléstia (MB), do tipo de fumo, da cor da folha nas gerações F3, F5 e
F7. Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005....................51
xi
RELAÇÃO DE FIGURAS
Página
1. Escala diagramática da severidade da moléstia utilizado e a proporção
de raízes com lesões típicas de R. solanacearum. Faculdade de
Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.....................................................20
2. Índice de severidade de Murcha Bacteriana em fumo das gerações F1,
F3, F5, F7, do genitor moderadamente resistente KY 26, do genitor
resistente OX 207 e testemunha suscetível 01528. Faculdade de
Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.....................................................40
3. Freqüência das médias de severidade da moléstia (R. solanacearum)
das linhas dentro da geração F3. Faculdade de Agronomia, UFRGS,
Porto Alegre, RS. 2005 ..........................................................................................42
4. Freqüência das médias de severidade da moléstia (R. solanacearum)
das linhas dentro da geração F5. Faculdade de Agronomia, UFRGS,
Porto Alegre, RS. 2005v. .......................................................................................43
5. Freqüência das médias de severidade da moléstia (R. solanacearum)
das linhas dentro da geração F7. Faculdade de Agronomia, UFRGS,
Porto Alegre, RS. 2005..........................................................................................43
6. Médias e desvio padrão de severidade da moléstia (R. solanacearum)
– para as linhas dentro da geração F7. Faculdade de Agronomia,
UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005..........................................................................52
INTRODUÇÃO
O fumo representa uma das principais atividades agrícolas no sul do país,
sendo responsável por uma importante fatia do desempenho econômico dos três
estados que compõem a região sul do Brasil. A fumicultura é uma atividade
centenária concentrada em pequenas propriedades rurais, em média de 17
hectares, dos quais aproximadamente dois hectares são destinados para o plantio
de fumo. Na safra 2004, a cultura do fumo envolveu cerca de 190 mil famílias,
407.169 hectares de área cultivada com volume de fumo de 852.488 toneladas. O
setor gera divisas com exportação de fumo ao redor de 1,5 bilhão de dólares
anualmente, o que representa 2,5% do total das exportações brasileiras e,
considerando-se apenas volumes, o país passou a ocupar, recentemente, a
liderança mundial em exportação de fumo.
Com a expansão do cultivo de fumo, aumentou o aparecimento de
moléstias, destacando-se a Ralstonia solanacearum, que é o agente causal da
murcha bacteriana em várias famílias de plantas como solanáceas, e musáceas
no Brasil e no mundo. Esta bactéria é um fitopatógeno importante em áreas
tropicais e subtropicais, causando grandes perdas na qualidade e produção.
No Brasil não se têm estudos que relatam a quantificação das perdas
causadas pela murcha bacteriana em fumo. Entretanto, nos Estados Unidos,
2
estima-se que a perda na produção chegue de 1 a 7% da safra, com prejuízos de
10 a 15 milhões de dólares anuais.
Algumas moléstias, mesmo potencialmente destrutivas, podem não
merecer prioridade no melhoramento de plantas, se ela puder ser controlada
satisfatoriamente através de outras medidas como, por exemplo, controle
químico, levando em consideração, naturalmente, o custo financeiro e o impacto
ecológico deste controle. No caso da murcha bacteriana causada por Ralstonia
solanacearum, onde não há controle químico, o único caminho possível é o
melhoramento genético para obtenção de genótipos resistentes.
A seleção e lançamento de genótipos resistentes terão um grande impacto
econômico na fumicultura brasileira, beneficiando em primeira instância os
fumicultores e conseqüentemente as indústrias fumageiras do Brasil.
Como não há um controle eficiente para murcha bacteriana e não existem
variedades do fumo tipo Burley com boa adaptação e resistência a este patógeno,
o desenvolvimento de variedades resistentes representa uma alternativa
econômica viável, justificando investimentos para obtenção de resultados a curto
e médio prazo.
Portanto, este trabalho teve como objetivo determinar o efeito da seleção artificial
para resistência à R. solanacearum na população Burley x Virgínia em diferentes
gerações segregantes.
3
1. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
1.1 Caracterização e origem do fumo (Nicotiana tabacum L.)
O fumo é uma planta anual, autógama, cultivada com fim comercial, com
ciclo de vida variando entre 120 a 240 dias. O gênero Nicotiana tem cerca de 60
espécies conhecidas, originárias da América do Sul, América do Norte, Austrália e
Ilhas do Pacífico Sul. O gênero Nicotiana pertence à família Solanaceae e está
dividido em três subgêneros Rustica, Tabacum e Petunioides (Goodspeed, 1954;
Narayan, 1987; Gerstel,1979). O fumo, devido ao alcalóide nicotina era
empregado pelos índios em rituais religiosos e também com fins medicinais.
Atualmente, N. rustica tem sido utilizada também como fonte de nicotina para
produção de inseticida e como fonte de ácido cítrico. Outras espécies como N.
alata, N. sandarae e N. glauca são ornamentais. N. tabacum é entre as espécies
a mais importante na agricultura atual e no mercado internacional (Collins &
Hawks, 1993).
Desde o século XIX Nicotiana spp. se constituem em importante material
para estudo genético devido à facilidade de manipulação das flores e o grande
número de sementes produzido (Gerstel, 1979). A maioria dos fumos cultivados
pertence à N. tabacum L., um alotetraplóide que apresenta 2n = 4x = 48
cromossomos, distribuídos nos genomas S e T. A espécie N. tabacum se originou
da hibridização de duas espécies diplóides, N. sylvestris (2n=24) com genoma S
4
(maternal), e N. tomemtosiformis (2n=24), que apresenta o genoma T (parental)
(Gerstel, 1979; Bland et al., 1985; Okamuro & Goldberg, 1985; Sperisen et al.,
1991; Collins & Hawks, 1993). A hibridização natural entre estas espécies de
Nicotiana ocorreu provavelmente no Nordeste da Argentina ou Sudeste da
Bolívia, porque é a região onde as duas espécies convivem na natureza (Collins &
Hawks, 1993).
No Brasil são plantados os tipos de fumo Virgínia (81%), Burley (17%),
Comum (0,8%) e outros (1,2%), onde se encontram os fumos para capa de
charuto, oriental e fumo em corda. Na fabricação do cigarro são usados 40% de
fumo Virgínia, 35% de fumo Burley, 15% de fumo Oriental e 10% de talo picado. A
mistura destes tipos de fumo na composição do cigarro produz perfeito equilíbrio
no sabor e aroma, atendendo a exigências do mercado consumidor (Kist et al.,
2004).
O fumo Burley, originário de uma mutação, foi descoberto, em 1864, Ohio,
EUA, em canteiros de muda pelos produtores de fumo. A mutação se caracteriza
por ser um gene recessivo que em homozigoze proporciona uma coloração
diferenciada para as plantas de fumo. As características principais do Burley são:
folhas arredondadas, coloração verde clara no início do ciclo à amarelada no final
do ciclo vegetativo, ângulo de inserção da folha fechada (< 45º), coloração
castanha escura do fumo curado, aroma típico (forte), maior número de folhas, na
composição química apresenta apenas nicotina, como alcalóide, e sistema de
cura feita em galpões com temperatura ambiente (Garner, 1951; Akehurtst, 1970;
Palmer & Pearce, 1999). O fumo tipo Burley foi mantido pelos agricultores
americanos até 1930 quando iniciaram os primeiros trabalhos de melhoramento
genético. Por ter sido descoberto e mantido em solos argilosos, férteis e em áreas
5
de elevada altitude, o fumo Burley é mais adaptado a estas condições
(Garner,1951; Akehurtst, 1970).
A murcha bacteriana, também conhecida nos EUA como Granville wilt, por
ter sido identificada pela primeira vez no Condado de Granville, Carolina do Norte
em 1880 (Lucas, 1975; Shoemaker & Shew, 1999), ocorre somente nas áreas
onde são plantados fumos do tipo Virgínia, no entanto, o tipo de fumo Burley não
apresenta genes de resistência à R. solanacearum, fato este que pode ser
justificado pela ausência do patógeno nas áreas de origem, onde não houve
pressão de seleção para este caráter (Garner, 1951; Sisson & Wernsman, 1992).
Em 1893, na Carolina do Norte, EUA, dentre os fumos curados à
temperatura ambiente, foi descoberto o tipo Virgínia, através de um acidente de
cura. Os fumicultores utilizavam carvão para proporcionar um ambiente favorável
à cura desse tipo fumo, uma elevação demasiada de temperatura, provocou
alteração de cor do fumo curado, passando do castanho escuro para coloração
laranja e aroma adocicado. A partir de então, produtores dessa região
selecionaram e preservaram o fumo tipo Virgínia com fenótipo de coloração verde
intenso, folhas estreitas, lanceoladas, ângulo de inserção da folha aberta (90º) e
sistema de cura utilizando aquecimento de ar, em estufas (Palmer & Pearce
1999). Na caracterização do local de origem do fumo tipo Virgínia, pode ser
considerado a adaptação a solos arenosos, de média fertilidade e baixa altitude,
quase ao nível do mar. Em todos os países que produzem fumo tipo Virgínia os
solos são preferencialmente arenosos, leves, de mediana fertilidade, condições
ambientais essenciais para a produção de fumo com características desejáveis
para o mercado consumidor (Garner, 1951; Akehurtst, 1970; Palmer & Pearce,
1999).
6
Com exceção de N. rustica, que é cultivado na Rússia, China, e em outros
países, todos outros fumos comerciais (Virgínia, Burley e Oriental, etc.) são
variações dentro das espécies N. tabacum L., sendo possível o cruzamento entre
fumos Burley e Virgínia com a obtenção de híbridos férteis (Collins & Hawks,
1993).
1.2 Caracterização do patógeno (Ralstonia solanacearum)
A murcha bacteriana, causada por Ralstonia solanacearum (Smith)
(Yabuuchi et al. 1995), sin. Pseudomonas solanacearum é considerada a principal
moléstia vascular de etiologia bacteriana encontrada no mundo. O agente causal
da murcha bacteriana foi descrito pela primeira vez por Smith, em 1886, como
Bacillus solanacearum e, desde então, vem recebendo diferentes denominações.
A nomenclatura dada em 1914 pelo próprio Smith, de Pseudomonas
solanacearum, prevaleceu por quase 80 anos (Bringel, 2002). Em 1992, a
bactéria foi reclassificada por Yabuuchi et al. (1992), dentro do grupo II de
homologia de rRNA como Burkholderia solanacearum (Smith). Entretanto, menos
de três anos depois, foi novamente reclassificada, com base nos dados de análise
filogenética da seqüência de nucleotídeos do 16SrRNA, hibridação de rRNA-DNA,
análise de lipídios celulares e de ácidos graxos e nas características fenotípicas
(Yabuuchi et al., 1995). Permaneceu no grupo III, porém em um novo gênero,
Ralstonia, para abrigar o grupo de homologia de DNA distinto do grupo da
espécie Burkholderia cepacia. Neste novo contexto, o gênero Pseudomonas
passou a ser apenas das espécies fluorescentes (grupo I) e as fitopatogênicas
não fluorescentes ficaram distribuídas entre os gêneros Acidovorax no grupo III e
Burkholderia e Ralstonia no grupo II. O gênero Ralstonia ficou abrangendo as
espécies R. pickettii e R. solanacearum. Esta nova proposta de classificação foi
7
publicada e validada na International Journal of Systematic Bacteriology (IJSB)
(Yabuuchi et al., 1992; Yabuuchi et al. 1995).
Esta bactéria tem habilidade de infectar muitos hospedeiros e está
associada a mais de 200 espécies de plantas em pelo menos 50 famílias
diferentes. Muitas das plantas relatadas como suscetíveis pertencem as
dicotiledôneas e poucas são monocotiledôneas. A família Solanaceae tem um
grande número de espécies suscetíveis (Hayward, 1995; Kelman, 1998). As
espécies de importância econômica mais afetadas são principalmente batata,
tomate, pimentão, berinjela e fumo (Takatsu & Lopes, 1997). Entre os gêneros
com espécies hospedeiras de R. solanacearum, o gênero Nicotiana possui a
maioria das espécies conhecidas como hospedeiras. Devido a este fato, as
diferentes espécies do gênero Nicotiana têm sido intensamente testadas, no
esforço de localizar fontes de resistência ao patógeno (Lucas, 1975).
Em fumo, a murcha bacteriana foi relatada pela primeira vez nos Estados
Unidos em 1880, somente em 1896, Erwin F. Smith registrou a moléstia em
batata, tomate e berinjela (Hayward, 1994).
No Brasil este patógeno foi relatado primeiramente no ano de 1922 por Von
Parseval em fumo e batata, porém a moléstia foi confirmada somente mais tarde
(Takatsu & Lopes, 1997).
French (1994) afirma que R. solanacearum pode ser considerado um
verdadeiro patógeno de solo, por sua habilidade em sobreviver melhor em solos
úmidos, diminuindo em alguns solos pela baixa capacidade de retenção de água.
Também tem redução de crescimento e sobrevivência em solos com elevada
atividade de antagonismo microbiano, e quando exposto à luz solar e devido à
ausência de plantas invasoras hospedeiras. Além da habilidade de multiplicação
rápida, a bactéria é capaz de sobreviver por longos períodos nos solos.
8
Ralstonia solanacearum prefere condições de altas temperaturas e
umidade, é capaz de sobreviver no solo à temperatura de 17,8 ºC durante meses.
Entretanto, os maiores índices de moléstia ocorrem a temperaturas do solo entre
26,7 a 37,8 ºC. Com temperaturas inferiores a 21 ºC as solanáceas são
infectadas, porém não apresentam o sintoma de murchamento (Lucas, 1975;
Tokeshi & Carvalho, 1980; Buddennhagem & Kelman, 1964; Englebrech &
Prinsloo, 1985; Akiew & Trevorrow, 1994; Hayward, 1994).
Na ausência de hospedeiros, algumas raças tendem a desaparecer
rapidamente; assim a raça que ataca a banana pode desaparecer em 18 meses;
raças patogênicas ao fumo desapareceram em Java com três meses de
inundação. Em solos secos as células bacterianas são destruídas rapidamente e
isto explica a sua ausência em solos desérticos, sujeitos a períodos de secas
periódicas (Tokeshi & Carvalho, 1980).
A moléstia é caracterizada por murchamento, atrofiamento e
amarelecimento das folhas e pode ocorrer em qualquer estádio do
desenvolvimento da planta. Em plantas jovens, suculentas e suscetíveis, os
sintomas iniciais são o murchamento de uma ou duas folhas durante as horas
mais quentes do dia, freqüentemente seguido por recuperação no final do dia e ao
amanhecer. Muitas vezes um lado da planta ou até mesmo a metade de uma
simples folha fica murcha. Este murchamento unilateral é um sintoma típico de
murcha bacteriana. Se a moléstia desenvolver rapidamente, as folhas não trocam
de cor. Entretanto, se o murchamento ocorrer gradualmente, as folhas afetadas
ficam com coloração verde claro e progressivamente tornam-se amarelas;
freqüentemente áreas necróticas aparecem entre as nervuras e as margens das
folhas. Com alta temperatura e tempo seco, as folhas murchas são seguidamente
escaldadas (Lucas, 1975; Mariano et al., 1997; Shoemaker & Shew, 1999).
9
A diagnose da murcha bacteriana é bastante simples, factível a campo.
Aos primeiros sintomas de murchamento nas folhas, o sistema radicular deve ser
examinado: normalmente poucas raízes e freqüentemente apenas uma será
encontrada em um estado adiantado de apodrecimento. Se o solo for úmido, as
raízes de fumo afetadas se tornarão tenras e pouco desenvolvidas. A
descoloração das raízes aparece como listras negras nas zonas próximas da
casca e em pequenos pontos onde a patógeno penetrou na raiz principal (Lucas,
1975).
Outro método de fazer a diagnose é através de um corte longitudinal no
caule da planta infectada onde este apresenta descoloração de marrom-clara
para amarela-amarronzada no tecido vascular. Com o progresso da moléstia,
grandes porções da medula e do córtex ficam com coloração marrom para preta.
Finalmente, a casca interna apodrece na base do talo, a planta fica com o talo oco
e o tecido vascular se torna marrom escura para preta (Lucas, 1975; Shoemaker
& Shew, 1999).
Em geral, a penetração da R. solanacearum se dá pelas raízes desde que
haja umidade para permitir a sua multiplicação. A seqüência dos eventos é a que
segue: a) penetração inicial de um número pequeno de células bacterianas em
alguns vasos lenhosos; b) multiplicação em áreas localizadas nos traqueídeos e
sua distribuição longitudinal sem que os parênquimas do xilema ou do floema
sofram alteração; c) obstrução dos vasos lenhosos em grande extensão,
dificultando o fluxo de água; d) degradação das paredes e de células dos
parênquimas adjacentes surgindo cavidades com a invasão do floema, medula e
tecido cortical, principalmente em órgãos suculentos (Tokeshi & Carvalho, 1980).
Estudos em tomate e fumo indicam que o mecanismo de murchamento e o
modo e o efeito do patógeno no hospedeiro pode ser separado em dois processos
10
primários: (1) a indução do murchamento e (2) quebra do tecido. Depois de uma
estirpe virulenta de bactéria entrar no sistema vascular de uma planta suscetível,
ela se multiplica rapidamente produzindo uma exsudação, a qual consiste de
misturas de complexos polissacarídeos e um peptídeo simples. A alta
polimerização da exsudação de tamanho molecular grande aumenta a
viscosidade do fluxo vascular, resultando na ligação dos vasos. A massa
bacteriana por si só oferece algumas obstruções para o movimento da água,
porém o pus bacteriano se torna o mais importante agente. O colapso e
destruição da parede celular permitem o movimento lateral da bactéria de célula
para célula, desorganizando a condução de água nos tecidos, impedindo o
movimento da água e aumentando a severidade do murchamento (Kelman &
Sequeira, 1965).
1.2.1 Controle
O controle da murcha bacteriana é difícil, devido à complexidade de
sobrevivência no solo e ao grande número de plantas hospedeiras da bactéria,
principalmente quando as condições ambientais são favoráveis à moléstia
(Takatsu & Lopes, 1997; Lopes & Reifschneider, 1999). As medidas a serem
adotadas no controle da moléstia dependem da cultura, das estirpes do patógeno
presentes, do conhecimento do seu sítio de sobrevivência e dos modos de
transmissão. Dentre estas medidas, incluem-se o uso de cultivares resistentes, a
rotação de culturas, a seleção de material de plantio livre do patógeno e o uso de
microorganismos antagonistas (Hayward, 1994).
O controle químico da murcha bacteriana tem apresentado pouco sucesso
(Lopes, 1994; Takatsu & Lopes, 1997) e a utilização de produtos químicos e
11
antibióticos no controle da moléstia é considerada impraticável (Eden-Green,
1994).
O uso de material isento do patógeno como medida de controle preventivo
é seguramente uma forma de controle (Takatsu & Lopes, 1997). Assim a
utilização de água não contaminada na irrigação previne a disseminação do
patógeno (Lopes & Reifschneider, 1999), da mesma forma a eliminação de
plantas invasoras suscetíveis assegura a baixa incidência da moléstia (Miranda,
1998).
O cultivo intercalado com outras culturas tem sido usado como uma medida
para redução da população do patógeno. Embora a bactéria sobreviva no solo por
vários anos, sua população pode ser reduzida através de rotação de culturas.
Reduções da população do patógeno no solo foram obtidas após cultivo de arroz,
milho e cana-de-açúcar por período igual ou superior a dois anos (Tussime et al.,
1997).
1.2.2 Diversidade genética da Ralstonia solanacearum
O conhecimento da estrutura genética da população é importante para
estudos epidemiológicos e o controle efetivo de moléstias, principalmente no que
diz respeito ao desenvolvimento de genótipos resistentes (Van der Wolf et al.,
1998). Uma grande diversidade genética tem sido encontrada em bactérias de
solo e a diferenciação genética destas populações pode chegar a nível
microgeográfico, dependendo do solo e das propriedades da rizosfera dos
hospedeiros, como demonstrado para populações de Burkholderia cepacia
(MacArthur et al., 1988; Di Cello et al., 1997). No entanto, pouco se conhece
sobre os fatores que determinam a estrutura da população de R. solanacearum
(Jaunet & Wang, 1998).
12
R. solanacearum tem sido classificada em raças, com base na reação de
hospedeiros, e em biovares, de acordo com a capacidade de oxidar determinados
dissacarídeos e álcoois. Apesar de bastante utilizada, a classificação em raças e
biovares não possuem uma divisão claramente definida e ainda não faz parte dos
critérios do Código Internacional de Nomenclatura de bactérias (Silveira, 2002).
Estirpes de R. solanacearum foram classificadas em quatro biovares de
acordo com a capacidade de oxidar os açúcares celobiose, lactose, e maltose e
os álcoois dulcitol, manitol e sorbitol (Hayward, 1994). As estirpes das biovares I e
II estão amplamente distribuídas, sendo que a biovar I predomina em regiões de
clima quente e caracteriza-se por atacar um maior número de espécies
hospedeiras. A biovar II corresponde à raça 3 e predomina em regiões de clima
temperado, sendo composta por estirpe que infecta basicamente a cultura da
batata. A biovar III está mais adaptada às regiões quentes dos trópicos (Hayward,
1991).
As biovares I, II e III estão presentes em diferentes culturas e regiões do
Brasil. Um estudo conduzido em plantas da família solanácea mostra que a biovar
I ocorre em todas as regiões brasileiras, a biovar II predomina no Sul, Sudoeste e
Centro Oeste, a biovar III é mais comum no Norte e Nordeste (Mariano et al.,
1997).
1.3 Melhoramento genético do fumo
Atualmente, o principal objetivo dos programas de melhoramento de fumo é
desenvolver cultivares que satisfaçam tanto os agricultores quanto as empresas
manufaturadoras de fumo. Em geral, os fumicultores estão interessados nos
atributos que aumentem características tais como: resistência a moléstias, altos
rendimentos de folha, melhorias na qualidade, facilidade de colheita e cura. Por
13
outro lado, as indústrias de fumo desejam alta produção de lâmina e diminuição
de talo, composição química e física equilibrada necessárias para a produção de
misturas com aroma e sabor apropriado (Leeg & Smeeton, 1999).
O fumo é uma clássica espécie autógama, onde a polinização cruzada é
inferior a 3%. As variedades de fumo desenvolvidas pelos programas de
melhoramento são predominantemente linhas puras. Em menor escala, o
desenvolvimento de híbridos tem sido utilizado especialmente quando o objetivo é
resistência à moléstia. Como exemplo específico de cultivares híbridos podem ser
citadas as cultivares de fumo resistentes à TMV (Tabacco Mosaic Virus) (Leeg &
Smeeton, 1999).
No melhoramento de fumo muitos são os métodos utilizados. A seleção
massal foi responsável pelo desenvolvimento dos principais tipos de fumo usados
pelas indústrias fumageiras (Matzinger & Wernsman, 1979).
Quando o objetivo é combinar características desejáveis encontradas em
duas ou mais cultivares, o método genealógico é o procedimento mais adequado.
Entretanto, quando alguma característica ou resistência à moléstia se encontra
em outra espécie do gênero Nicotiana ou tipo de fumo o método retrocruzamento
é o mais indicado (Leeg & Smeeton, 1999).
Com o refinamento da técnica de cultura de tecidos, haplóides e duplo
haplóides têm sido utilizados no melhoramento de fumo. Os recentes avanços na
engenharia genética também oferecem grande potencial para o aumento de
variabilidade genética através da introdução de genes de qualquer organismo vivo
(Wernsman, 1999).
14
1.4 Resistência à Ralstonia solanacearum
O meio mais efetivo de controle da murcha bacteriana em diversas culturas
tem sido a utilização de resistência genética, através dos programas de
melhoramento a este patógeno (Lopes & Quezado-Soares, 1994). Entretanto, o
desenvolvimento de variedades resistentes tem sido dificultado porque o exato
padrão genético de resistência para as várias estirpes do patógeno não foi ainda
definido para nenhuma cultura (Takatsu & Lopes, 1997; Grimault et al., 1994).
O conhecimento existente com relação à murcha bacteriana em fumo,
permite descrevê-la como uma resistência quantitativa, onde a severidade da
moléstia apresenta variação contínua desde muito baixa (alta resistência) até
extremamente alta (alta suscetibilidade) (Sisson & Wernsman, 1992). Neste tipo
de herança vários genes de pequeno valor individual no genótipo e que sofrem
grande influência do ambiente compõem a resistência. Além disso, a resistência
quantitativa se caracteriza por não apresentar especificidade ao patógeno, o que
geralmente proporciona uma resistência de amplo espectro mais durável do que a
resistência monogênica, específica para a raça do patógeno (Johal et al., 1995).
A resistência à murcha bacteriana é predominantemente de ação gênica
aditiva, assim como a maioria dos genes de resistência às moléstias em fumo
(Jack & Robertson, 1997).
A literatura indica que variedades resistentes à R. solanacearum em um
país são suscetíveis em outro. Isto pode ser explicado pela ocorrência de estirpes
distintas entre ambientes e também pela interação estirpe versus gene de
resistência. Como exemplo de gene maior para a resistência é citadas a
variedade KOKUBU que determina alta resistência no Zimbábue e Malásia, baixa
resistência no Brasil e EUA, e susceptibilidade na África do Sul. O que reforça a
ocorrência de interação entre gene maior de resistência com diferentes estirpes
15
de bactéria. De outra forma, a variedade NC 95, com resistência poligênica, que
apresenta resistência em todos os locais estudados, reforça a tese de resistência
não específica à raça (Jack, 2002).
De acordo com Lucas (1975) a resistência à murcha bacteriana em fumo
apresenta a possibilidade de ter mecanismo de reação de hipersensibilidade
(RH), que consiste na morte rápida de um número limitado de células em torno do
sítio inicial da infecção. Esse mecanismo pode funcionar individualmente ou
sinergisticamente, incluindo acúmulo de fitoalexinas, fenóis e proteínas PR –
proteínas relacionadas com a patogênese (quitinases e glucanases, por exemplo)
(Johal et al., 1995).
Em batata, de acordo com Rowe & Sequeira (1970), a resistência é
controlada por três genes dominantes e independentes. Posteriormente, Rowe et
al. (1972) concluíram que era evidente o fato de que relativamente poucos genes
estavam envolvidos na resistência, em um sistema pelo menos parcialmente inter-
relacionado, ainda que aparentemente específico para certas estirpes do
patógeno. Segundo Tung et al. (1990a, 1990b) e Tung (1992), a resistência em
batata é poligênica e são necessários genes de adaptação ao ambiente para a
expressão efetiva da resistência à murcha bacteriana. Programas de
melhoramento estão sendo implementados com genes de resistência de diversas
espécies diplóides de Solanum, incluindo S. phureja, S. sparsipilum, S.
chacoense, S. microdontum e S. raphanifolium. É provável que a base genética
para resistência seja diferente em cada espécie, possibilitando que a resistência
nas novas linhagens possa ser controlada poligenicamente. Entretanto, não há
informações sobre os padrões de herança da resistência das espécies individuais.
As bases genéticas da resistência à murcha bacteriana em fumo, ainda
não estão bem elucidadas, no entanto, alguns estudos permitem afirmar que a
16
resistência pode ser de herança simples ou complexa (Wernsman, 2004, com.
pes.).
17
2. MATERIAL E MÉTODOS
O presente trabalho foi realizado em casa de vegetação no Centro
Agronômico da Universal Leaf Tabacos Ltda, localizada em Rincão Del Rey, Rio
Pardo, RS, em lavoura (infectário) na localidade de Linha Andrade Neves, Santa
Cruz do Sul, RS, e no laboratório de Clínica Vegetal - Departamento de
Fitossanidade da Faculdade de Agronomia da Universidade Federal do Rio
Grande do Sul (UFRGS), Porto Alegre, RS.
2.1 Método de obtenção das gerações
As gerações utilizadas neste estudo são provenientes do cruzamento KY
26 x Oxford 207.
Como fonte de resistência poligênica à R. solanacearum foi utilizada a
variedade americana Oxford 207, fumo tipo Virgínia, lançado comercialmente na
década de 1990. Esta variedade tem como fonte de resistência à murcha
bacteriana a variedade K 399, lançada na década de 1980, que por sua vez
descende da variedade NC 95, da década de 1960. Todas estas variedades
descendem de uma variedade originária da América Central, introduzida nos EUA
em 1934, a T.I. 448-A (T.I. – Tobacco Introduction), a qual é considerada a fonte
primária para resistência à R. solanacearum em fumo (Sisson, 1999).
18
Como pai suscetível utilizou-se uma variedade tipo burley KY 26 oriunda
dos Estados Unidos, introduzida na década de 1950 pela Companhia de Fumos
Souza Cruz, que desde então vem sendo empregada pelas empresas fumageiras
instaladas no Brasil (Deeke, 2002, com. pes.).
Ao longo dos anos observou-se que a variedade KY 26 apresentava um
comportamento moderadamente resistente à murcha bacteriana. Técnicos de
empresas fumageiras e agricultores começaram a selecionar plantas que
sobreviveram em ambientes que estavam contaminados com a bactéria R.
solanacearum, portanto, este cultivar passou por um processo de seleção massal
por várias gerações, de onde foram selecionadas linhagens que apresentaram
melhor desempenho para a característica de resistência à murcha bacteriana.
A geração F1 foi conduzida em casa de vegetação. Das plantas F1 foram
colhidas seis cápsulas das quais retiraram-se as sementes para a geração F2.
As gerações F2, F3, F4, F5 e F7 foram conduzidas em enfermaria de
murcha bacteriana, na localidade de Andrade Neves, Santa Cruz do Sul. Para
uniformizar e aumentar o nível de severidade da moléstia, 35 a 40 dias após o
transplantio foram colocados 20 mL de uma suspensão (10
8
UFC/mL) de R.
solanacearum junto ao colo da planta (Moore et al., 1963, Akiew & Trevorrow,
1994). Como critério de seleção foram avaliados os seguintes aspectos: plantas
resistentes à murcha bacteriana e fenótipo do fumo tipo Burley. Foram
selecionadas algumas plantas com fenótipo intermediário (folha tipo Burley, ou
seja com forma mais arredondada e coloração verde clara). Quando as plantas
selecionadas estavam em estádio de florescimento, foi colocada uma capa
protetora do fabricante NOVOTEX AGRO® para proteção da inflorescência, com
o objetivo de evitar a contaminação com pólen proveniente de outras plantas. Ao
final do ciclo de desenvolvimento das plantas, cerca de 120 dias após o
19
transplantio, foi feita a seleção de resistência através da visualização do sistema
radicular, utilizando-se a escala diagramática de zero a cinco, onde zero
corresponde a raízes sem sintomas e cinco a raízes completamente atacadas
pela bactéria. Esta escala diagramática foi desenvolvida pelo Departamento de
Pesquisa da Universal Leaf Tabacos Ltda., e vem sendo utilizada por muitos anos
na avaliação de sistema radicular de fumo infectado pela bactéria R.
solanacearum (Tabela 1 e Figura 1). Foram selecionadas as plantas que
obtiveram índice severidade do sistema radicular inferior a 1.
TABELA – 1 Escala diagramática utilizada para avaliação do sistema radicular de
fumo, infectado por R. solanacearum. Porto Alegre, RS, UFRGS,
2005.
Severidade
da Moléstia
Raiz com
sintomas
(%)
0,0 0
0,5 10
1,0 20
1,5 30
2,0 40
2,5 50
3,0 60
3,5 70
4,0 80
4,5 90
5,0 100
Na geração F2 transplantaram-se 1.200 plantas provenientes da geração
F1, no infectário de murcha bacteriana, de onde foram selecionadas 43 plantas
(Tabela 2).
20
* Zero corresponde a raízes sadias e 5 a raízes completamente danificadas pela bactéria
FIGURA 1 – Escala diagramática da severidade da moléstia utilizada e a
proporção de raízes de fumo com lesões típicas de Ralstonia
solanacearum. Porto Alegre, RS, UFRGS, 2005.
3,0
Índice 0,0 Índice 0,2
Índice 1,0
Índice 1,5
Índice 3,0
Índice 4,5
Índice 5,0
21
O critério de seleção foi o mesmo em todas as gerações selecionadas. Da
geração F2 até a F4, cada planta selecionada deu origem a uma linha na geração
seguinte. Cada linha consistia de 15 plantas, espaçadas 0,45 m. entre si. O
espaçamento entre linhas foi de 1,20 m. O delineamento experimental foi o de
blocos casualizados com três repetições.
Na geração F5 cada planta selecionada em F4 deu origem a uma linha
com 10 plantas. O espaçamento dentro e entre linhas foi de 0,45 m. e 1,20 m.,
respectivamente. O delineamento experimental foi o de blocos ao acaso com
quatro repetições.
Com o objetivo de avançar uma geração de F5 para F6, as 28 plantas
selecionadas na F5 foram plantadas na casa de vegetação em vasos (Tabela 2).
Utilizaram-se sementes oriundas de uma cápsula de onde foi escolhida, ao acaso,
apenas uma planta para esse avanço de geração.
As 28 plantas F7 foram conduzidas a campo na enfermaria de
murchadeira. Cada planta F6 deu origem a uma linha F7 com 10 plantas e quatro
repetições (Tabela 2). Trinta e sete plantas F7 foram selecionadas, colhidas
individualmente e as sementes mantidas separadas (Tabela 3).
A seleção foi realizada com base no desempenho de plantas individuais
dentro de cada linha. Não foram consideradas as médias de cada linha individual
ou as médias de cada genótipo, considerando todas as repetições.
Um esquema do processo de seleção aplicado nas diferentes gerações é
apresentado (Tabela 2), bem como a intensidade de seleção aplicados em cada
geração (Tabela 3).
22
TABELA 2. Plantas selecionadas nos diferentes anos e gerações. Faculdade de
Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.
1998 1999 2000 2001 2003
F1 F2 F3 F4 F5 SSD F6 F7
9760 # 1A
9760 # 1B 0788-C1
9760 # 1C
0788-C2
9760 # 1F
Cápsula #1
9760 # 1H
GH02-275-1 03241-1
0788-I1 01792-A 02174 GH02-275-2 03241-2
9760 # 1I 0788-I2 GH02-275-3 03250-1
0788-I3 GH02-275-4 03250-2
01805 02169
01793-A 02162-1 GH02-257-1 03231
GH02-257-2 03245
0789-B1
9761 # 2B 01793-B1 02162-2
0789-B2 01793-B2 02163-1
01793-B3 02162-2
9761 # 2C
02170-1 GH02-269 03238
0789-D1 01806-1
Cápsula #2 9761 # 2D 01806-2 02170-2 GH02-270-1 03239-1
0789-D2 01806-3 GH02-270-2 03239-2
01806-4 02178-1
02178-2 GH02-280 03240
9761 # 2F
0789-G1 01786-1 02158
9761 # 2G 01786-2 02171
0789-G2
9761 # 2H
2002
Indicam a planta de origem na geração anterior das progênies selecionadas
23
Continuação TABELA 2. Plantas selecionadas nos diferentes anos e gerações.
Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS.
2005.
1998 1999 2000 2001 2003
F1 F2 F3 F4 F5 SSD F6 F7
9762 # 3C
9762 # 3D
9762 # 3F
9762 # 3G
9762 # 3H
9762 # 3I
9762 # 3L
GH02-264-1 03235-1
02167-1 GH02-264-2 03235-2
Cápsula # 3
GH02-264-3 03247
0790-M1 01802-1 GH02-265-1 03236-1
9762 # 3M 0790-M2 01802-2 GH02-265-2 03236-2
0790-M3 01802-3 02167-2 GH02-265-3 03236-3
GH02-265-4 03248-1
GH02-265-5 03248-2
02176
GH02-261-1 03232-1
01795 02164 GH02-261-2 03232-2
9763 # 4B
9763 # 4C
9763 # 4D 0791-D
9763 # 4E
9763 # 4F
Cápsula # 4
9763 # 4G
9763 # 4H
9763 # 4J
9763 # 4L 0791-L1
0791-L2 01797 02165 GH02-262-1 03233
0791-L3 GH02-262-2 03246
9764 # 5A
9764 # 5F
Cápsula # 5 9764 # 5G 0792-G
9764 # 5H
9764 # 5I
9764 # 5J
2002
Indicam a planta de origem na geração anterior das progênies selecionadas
24
Continuação TABELA 2. Plantas selecionadas nos diferentes anos e gerações.
Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS.
2005.
1998 1999 2000 2001 2003
F1 F2 F3 F4 F5 SSD F6 F7
9765 # 6A
GH02-254-1 03228-1
02159 GH02-254-2 03228-2
GH02-254-3 03228-3
GH02-254-4 03242
01789-A1
01789-A2 02172-1 GH02-272-1 03229-1
01789-A3 GH02-272-2 03229-2
0793-B1 02172-2 GH02-273-1 03243-1
0793-B2 GH02-273-2 03243-2
9765 # 6B 0793-B3
0793-B4 01789-C 02160 GH02-255-1 03244-1
0793-B5 GH02-255-2 03244-2
01799-1 02173
Cápsula #6
01799-2 02166 GH02-263 03234
01799-3 02175
01804-1 02168-1 GH02-266 03249
01804-2 02168-2
01804-3 02177 GH02-278 03237
9765 # 6C 0793-C
9765 # 6D
9765 # 6E
9765 # 6G
9765 # 6I
9765 # 6J 0793-J 01790 02161 GH02-256-1 03230-1
GH02-256-2 03230-2
2002
Indicam a planta de origem na geração anterior das progênies selecionadas
25
TABELA 3. Geração, intensidade de seleção, plantas selecionadas e
plantas totais. Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.
2.2 Experimento de avaliação das diferentes gerações
A área escolhida como enfermaria de murcha bacteriana (localidade de
Andrade Neves, Santa Cruz do Sul, RS) foi selecionada devido ao longo histórico
de ocorrência da moléstia. Realizaram-se coletas de amostras de solo e plantas e
foram enviadas para o Laboratório de Clínica Vegetal – Departamento de
Fitossanidade, Faculdade de Agronomia, UFRGS. De acordo com laudos de
análises, a bactéria foi identificada como Ralstonia solanacearum, classificada
como biovar I.
Para o isolamento da R. solanacearum, os caules de fumo com sintoma da
moléstia foram desinfestados através da imersão consecutiva em álcool 70% e
hipoclorito de sódio 1%, por 30 s, e lavadas em água destilada esterilizada (ADE).
Segmentos de 1 a 2 cm foram então colocados em tubos de centrífuga (1,5 mL)
contendo 500 µL de ADE para coleta do fluxo bacteriano. A suspensão de células
foi diluída em série (10X) por transferência para novos tubos com ADE. Vinte
microlitros das diferentes diluições foram colocados e espalhados na superfície do
meio de cultura SPA (sacarose 20 g/L
-1
; peptona 5 g/L
-1
; K
2
HPO
4
0,5 g/L
-1
;
MgSO
4
. 7H
2
O 0,25 g/L
-1
; Agar 15 g/L
-1
) pH 7,2, mais 0,05 de cloreto de trifenil
Geração
Plantas totais Plantas selecionadas
Intensidade de
seleção
F2 1200 43 0,036
F3 1935 26 0,013
F4 1170 28 0,024
F5 1120 28 0,025
F6 - - -
F7 1120 37 0,033
26
tetrazólio (CTT) (2,3,5- Tripphenyl tetrazolium chloride, Sigma) em placa de Petri.
Colônias fluídas com vermelho e bordas brancas foram transferidas para novas
placas e, após 48 horas a 28
o
C, submetidas aos testes de gram, oxidase e DAS-
ELISA, com anti-soro policlonal reativo à R. solanacearum, fornecido pela
EMBRAPA-CPACT (Castro et al., 1993). Para determinação do biovar foram
utilizados testes bioquímicos, onde as culturas bacterianas foram crescidas em
meio SPA à 28
o
C, por 24 h, e transferidas com um palito de dente previamente
esterilizado, para a superfície de 150 µL de meio Ayers pH 7,2 (NH
4
H
2
PO
4
1 g/L
-1
;
KCl 0,2 g/L
-1
; MgSO
4
. 7H
2
O 0,2 g/L
-1
; Agar 6 g/L
-1
), acrescido de 1 mL/L
-1
de azul
de bromotimol 1,6% e sorbitol, na concentração final de 1%, contido em cada um
dos 96 orifícios de uma placa de microtitulação. O meio sem fontes de carbono
serviu de controle negativo. Cada isolado foi cultivado em três placas diferentes
com cada uma das fontes de carbono. Após sete dias à 28
o
C, a capacidade do
isolado oxidar a fonte de carbono foi considerada positiva quando a cor do meio
mudou de verde para amarela (Schaad, 1988).
Como teste de confirmação da biovar foi feito um teste de reação em
cadeia da polimerase (PCR) das células de R. solanacearum, cultivadas em SPA
por 24 h à 28
o
C, foram transferidas com alça para 100 µL de ADE, contidos em
tubos de centrífuga (1,5 mL). A suspensão foi mantida em banho-maria à 95-98
o
C por 5 min e constitui-se na amostra. A PCR foi feita em 25 µL de tampão (10
mM Tris-HCl [pH 8,3] a 25
o
C, 50 mM KCl, 2 mM MgCl
2
, 0,001 % de gelatina
[peso/vol], 0,05% de Nonidet P-40 [vol/vol], 0,05% de Tween 20 [vol/vol], 0,2 mM
de cada dNTP, 1,25 U de polimerase Ampli Taq (Gibco-BRL). 1µM de
oligonucleotídeos indicadores T3A (5’-GGG GGT TCG AAT TCC CCG CCG GCC
CCA-3’) (Cybersyn), identificador da biovar 1 (Welsh & McClelland, 1991; Seal et
al., 1992). As amplificações foram conduzidas em termociclador MJ Research
27
(Minicycler TM) nas seguintes condições: 96
o
C, 2 min; (94
o
C, 30 s; 50
o
C, 15 s,
72
o
C, 1 min) 35 vezes; 72
o
C, 10 min. Os produtos da PCR foram separados em
gel de agarose 2% (Gibdo-BRL), submetidos a eletroforese à 4V/cm por 2 horas,
corados com brometo de etídio, visualizados sob luz de ultravioleta e fotografados
com sistema computadorizado de análise de gel (Kodak Digital Science 1 D).
Esta estirpe foi isolada e está sendo mantida neste laboratório, em ADE à 5
o
C e em glicerol-água (15:85) à –80
o
C, de onde foi reproduzida e utilizada para
uniformizar e aumentar a pressão do inóculo na enfermaria.
A semeadura das gerações F1, F3, F5, F7 e dos genitores BY 26, OX 207
e da testemunha suscetível (01528) foi realizada em casa de vegetação, em
bandejas plásticas de 25 células com substrato Mecplant ® (à base de casca de
pinus, inoculado com Trichoderma sp. e com adubação recomendada para cultura
do fumo). A densidade de semeadura foi de duas sementes por célula. Após a
germinação realizou-se o desbaste, mantendo-se uma planta por célula. Os
tratamentos fitossanitários e a poda da parte aérea das mudas foram feitos
conforme orientação geral dos produtores de mudas da Universal Leaf Tabacos
Ltda.
O preparo do solo seguiu as orientações do manual de técnicas para
cultura do fumo, fornecido pela Universal Leaf Tabacos Ltda.
Como adubação de base na lavoura foram aplicados 600 Kg de N-P-K por
hectare da fórmula 10-18-20. Após a adubação preparou-se um camalhão com as
dimensões de 0,45 m. de largura por 0,20 m. de altura. Na adubação de cobertura
foram utilizados 480 Kg de salitre de potássio por hectare da fórmula 15-0-14.
O delineamento experimental utilizado neste experimento foi de blocos ao
acaso, com quatro repetições e 10 plantas em cada parcela, sendo que a cada
28
oito linhas foram transplantadas além dos genitores, uma testemunha suscetível,
para melhor visualização da pressão de inóculo no infectário.
O espaçamento utilizado no transplante foi de 1,20 m. entre linhas e 0,45
m. entre plantas, perfazendo uma densidade de 18.518 plantas por hectare. As
técnicas culturais foram às recomendadas para cultura.
Foram avaliadas as gerações F1, F3, F5 e F7 do cruzamento KY 26 x OX
207, além das linhagens genitoras KY 26, OX 207, e um controle suscetível
(01528). Estes genótipos foram dispostos em linhas com 10 plantas por linha. A
geração F1 foi semeada em seis linhas, a F3 em 43 linhas, a F5 em 28 linhas e a
F7 em 37 linhas, totalizando 6.100 plantas.
O transplantio ocorreu no dia 11/09/2003, quando as mudas apresentavam
desenvolvimento de 15 cm de altura e 0,5 cm de diâmetro do caule.
Para manter a umidade do solo a fim de permitir um ambiente favorável ao
desenvolvimento da murcha bacteriana, utilizou-se sistema de irrigação por
aspersão sempre que necessário, assim o ensaio foi irrigado quatro vezes
durante o ciclo da cultura.
A inoculação da bactéria realizou-se quando a temperatura média do
ambiente elevou-se, mantendo-se próxima dos 26
o
C por alguns dias, com menos
possibilidades de ocorrência de temperaturas médias desfavoráveis ao
crescimento da bactéria (em torno de 22-23
o
C). Foi aplicado 20 mL de suspensão
de células (10
8
UFC/mL) de R. solanacearum que foi depositado junto ao colo da
planta. Como fonte de inóculo utilizou-se a estirpe da bactéria Ralstonia
solanacearum que foi isolada do infectário e classificada como biovar I, a qual foi
reproduzida no laboratório de Clínica Vegetal do Departamento de Fitossanidade
da Faculdade de Agronomia, UFRGS.
29
As avaliações da sanidade do sistema radicular, tipo e cor de fumo foram
feitos em três etapas, sendo que a primeira repetição foi avaliada no dia 12/01/04,
a segunda e terceira no dia 13/01/04 e a quarta no dia 15/01/04. Estas avaliações
foram realizadas no final do ciclo da cultura, ou seja, ao redor de 120 dias após o
transplantio.
Avaliou-se a condição sanitária da raiz por visualização direta de podridões
ou lesões típicas da R. solanacearum. A quantificação do dano no sistema
radicular foi realizada através da escala diagramática de zero a 5, apresentada na
Tabela 1 e Figura 1. Foram avaliadas 50% das plantas da parcela, ou seja, cinco
plantas, escolhidas ao acaso, perfazendo um total de 3.050 plantas.
Para avaliação de cor da folha utilizou-se a seguinte escala: 1 para verde, 2
verde clara, 3 cor burley (amarela) e 4 para linhas que apresentavam segregação.
Para a característica tipo de fumo utilizou-se a escala para fenótipo tipo Virgínia 1,
para fenótipo intermediário 2, para fenótipo tipo Burley 3 e para linhas que
estavam segregando 4.
2.3 Análises Estatísticas
Foi realizada a análise de variância para as características de severidade
da moléstia (MB), para cor e tipo conforme seguinte modelo:
Y
ijk
= µ + β
k
+ π
i
+ e
ijk
,
Onde:
Y
ijk
= a severidade da moléstia; µ = média geral do experimento; β
k
= efeito
aleatório da repetição; π
i
= efeito da geração; e e
ijk
= erro ~ N(0,σ
2
).
As médias foram comparadas pelo teste Tukey a 5%.
30
TABELA 4. Modelo da Análise de Variância, para a severidade da murcha
bacteriana (MB), cor e tipo em fumo. Faculdade de Agronomia,
UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.
CAUSAS DA VARIAÇÃO GL
QM F
BLOCOS 3
QMR QMR/QME
TRATAMENTOS 6
QMT QMT/QME
Testemunhas 2
QMTes
QMTes/QME
Gerações 3
QMG QMG/QME
Resíduo 1
QMTxT
QMTxT/QME
Erro Experimental 18
QME
Total 27
Como havia um grande número de linhas (famílias) dentro de cada geração
uma nova análise de variância foi utilizada (Tabela 5).
TABELA 5. Modelo da Análise de Variância, para a severidade da murcha
bacteriana (MB), cor e tipo, entre e dentro das gerações em fumo.
Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.
CAUSAS DA VARIAÇÃO GL QM F
Blocos 3 QMR QMR/QME
Entre geração 3 QMG QMG/QME
Linha dentro de F3 42 QMDF3
QMDF3/QME
Linha dentro de F5 27 QMDF5
QMDF5/QME
Linha dentro de F7 36 QMDF7
QMDF7/QME
Erro Experimental 2163
QME
As análises foram realizadas com o auxílio do programa Genes (Cruz,
2001), aplicativo Microsoft Excel, e do programa estatístico SAS.
Os dados da variável “severidade da murcha bacteriana” (MB) por
apresentarem números que variavam entre zero e cinco, coeficiente de variação
muito alto, e conseqüentemente não apresentando uma distribuição normal, foram
transformados utilizando-se a raiz quadrada de (x + 0,5), segundo Steel & Torrie
(1980).
31
2.4 Estimativas dos parâmetros genéticos
Os parâmetros genéticos foram estimados para a severidade da murcha
bacteriana no sistema radicular (MB), tipo e cor de fumo, de acordo com as
seguintes metodologias.
2.4.1 Médias, variâncias e herdabilidade
A partir dos valores individuais de cada planta foram estimadas as médias
e as variâncias para cada uma das gerações.
As estimativas das variâncias entre famílias (V
2
F
) e dentro de famílias
(V
2
W
), foram obtidas das equações propostas por Kearsey & Pooni (1996),
conforme o modelo abaixo (Tabela 6).
TABELA 6. Causas de variação, graus de liberdade, quadrado médio e quadrado
médio esperado, entre e dentro de famílias para a severidade da
murcha bacteriana (MB), cor e tipo, em fumo. Faculdade de
Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.
FONTE GL QM QME
Repetições r-1 - -
Entre famílias (f-1) QM
F
V
2
W
+ rn V
2
F
Dentro famílias f (rn-1)
QM
E
V
2
W
Onde:
r = repetições.
f = número de famílias dentro de cada geração.
n = número de plantas avaliadas por repetição e por família.
V
2
W
= Variância dentro de famílias.
V
2
F
= Variância entre famílias.
32
Estas foram estimadas pelas seguintes fórmulas:
V
2
F
= (QMF – QME)
rn
V
2
W
= QM
E
Para a geração F3:
A variância dentro (V
W
)contém tanto a V
E
como as variâncias de
aditividade (1/2 V
A
) e dominância (1/4 V
D
).
V
W
= V
E
+
1/2 V
A
+1/4 V
D
Já a variância entre famílias (V
F
) estima 1/2 V
A
+1/4 V
D
de modo que :
V
F
= 1/2 V
A
+1/4 V
D
No entanto, neste trabalho a variância entre famílias foi considerada como
½ V
A
( V
F
= 1/2 V
A
) desprezando-se o valor da dominância.
A variância devido ao ambiente (V
E
) foi determinada através da seguinte
formula:
V
E
= V
W
+1/2 V
A
A herdabilidade no sentido restrito foi calculada com a seguinte fórmula:
h
2
r
= __VA___
V
A
+ V
E
33
Para as gerações F5 e F7 o modelo utilizado foi o mesmo utilizado da
Tabela 6. Onde :
V
F
= (QMF – QME) = V
A
rn
V
W
=
QM
E
= V
E
2.4.2 Efeitos gênicos
Os efeitos gênicos, em cada tratamento, foram estimados para o caráter
índice de severidade da moléstia pelo método dos mínimos quadrados
generalizados ponderados, conforme proposto por Cavalli (1952), onde:
_
P
1
= m + a
_
P
2
= m – a
_
F
1
= m + d
_
F
3
= m + 0,25d
_
F
5
= m + 0,0625d
_
F
7
= m + 0,0156d
34
Considerando-se:
_ _ _ _ _ _
P
1
, P
2
, F
1
, F
3
, F
5
, F
7
– média de cada uma das seis gerações.
e
m = média geral
a = efeito de aditividade
d = efeito de dominância
Foi realizado um teste de X
2
(qui-quadrado) para avaliar o ajuste dos dados
observados ao modelo de três parâmetros (média, aditividade e dominância).
2.4.3 Correlações fenotípicas
As correlações fenotípicas entre os caracteres avaliados no trabalho foram
estimadas conforme Stell & Torrie (1980).
35
3. RESULTADOS E DISCUSSÃO
Não houve diferença significativa entre blocos para nenhum dos
caracteres, indicando presença uniforme do inóculo na área do experimento
(Tabela 7).
As diferenças nas médias entre tratamentos foram altamente significativas
para todos os caracteres. No entanto, quando os tratamentos foram decompostos
em gerações e testemunhas, somente as médias das testemunhas tiveram
diferenças significativas para a incidência da moléstia, enquanto as gerações não
mostraram diferenças. Já, para os demais caracteres (tipo e cor), tanto as
gerações quanto as testemunhas apresentaram diferenças significativas (Tabela
7).
A testemunha suscetível foi, como o esperado, a mais atacada pela murcha
bacteriana (Tabela 8), revelando a presença da doença em toda a área
experimental. Os dois genitores também foram diferentes, mostrando que os
níveis observados no pai moderadamente resistente ainda estão distantes do
genótipo resistente. A média da severidade da doença da geração F1 foi mais
próxima da média observada no genitor mais resistente, indicando a existência de
dominância parcial para a resistência à murcha bacteriana. Entretanto, não houve
diferenças entre as médias das diferentes gerações, e nem destas para o pai de
maior resistência à Ralstonia solanacearum. Provavelmente, a pressão de
36
seleção aplicada (Tabela 3) em todas as gerações foi suficiente para manter os
níveis observados na geração F1.
TABELA 7. Análise de variância para a severidade da murcha bacteriana (MB),
ao tipo de fumo, à cor da folha para as causas de variação, médias,
coeficiente de variação (CV%), de quatro gerações de fumo (F1, F3,
F5 e F7) e três testemunhas (pai moderadamente resistente, pai
resistente e testemunha suscetível). Faculdade de Agronomia,
UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.
Causas de variação GL Quadrado médio
MB Tipo Cor
Bloco 3 0,0255
ns
0,0031
ns
0,0148
ns
Tratamento 6 1,0194* 2,7960* 2,6447*
Geração 3 0,0063
ns
0,4846* 0,4041*
Testemunha 2 1,9742* 5,3333* 5,3333*
Resíduo 1 2,1490* 4,6557* 3,9892*
Erro 18 0,0067 0,0030 0,0117
CV (%) - 6,92 2,56 5,15
* : Efeito significativo em nível de 5% de probabilidade pelo teste F;
ns
: Efeito não significativo pelo teste F.
Nas características tipo de folha e cor os resultados demonstram
diferenças significativas entre tratamentos, gerações e testemunha (Tabela 8). O
genitor moderadamente resistente tipo Burley (tipo desejado) difere de todos os
demais tratamentos, já o genitor resistente e a testemunha suscetível não diferem
significativamente entre eles, porém diferem dos demais tratamentos, por serem
ambos do tipo Virgínia. Na geração F1 obtém-se exatamente o tipo e cor de fumo
intermediário (folha tipo Burley mais arredondada e de coloração verde clara), o
que era esperado devido ao contraste existente entre os tipos de fumo envolvidos
nesse cruzamento (Burley x Virgínia).
37
TABELA 8. Média da severidade da moléstia (MB), do tipo de fumo, e da cor da
folha de quatro gerações de fumo (F1, F3, F5 e F7) e três
testemunhas (pai moderadamente resistente KY 26, pai resistente OX
207 e testemunha suscetível 01528). Faculdade de Agronomia,
UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.
Tratamentos
MB
(1)
Tipo
(1)
Cor
(1)
F1 0,33 c 2,00 d 2,00 c
F3 0,52 c 2,58 c 2,48 b
F5 0,52 c 2,82 b 2,77 a
F7 0,38 c 2,55 c 2,47 b
KY 26 1,76 b 3,00 a 3,00 a
OX 207 0,17 c 1,00 e 1,00 d
01528 4,44 a 1,00 e 1,00 d
(1)
Médias de tratamentos seguidas por mesma letra não diferem entre si a 5% de
probabilidade pelo teste de Tukey.
O fumo tipo Burley é determinado por um gene recessivo e se caracteriza
pela cor amarela da folha e folhas arredondadas, que em homozigoze propicia
uma coloração e tipo diferenciado para as plantas de fumo que o possuem. Em
contraste, o tipo Virgínia é determinado pelo alelo dominante do mesmo loco e se
caracteriza por ter folhas de cor verde e tipo lanceolada conforme já descrito por
Garner, 1951; Akehurtst, 1970; e Palmer & Pearce, 1999.
Na geração F3 observa-se que a média 2,58 obtida para tipo e 2,48 para
cor de fumo (Tabela 8) se deve ao critério de seleção definido para esta
população, onde primeiramente foi selecionado o tipo de fumo Burley ou
intermediário. A característica tipo Burley tem menor freqüência que o
intermediário devido a herança do tipo Virgínia ser dominante (Sisson &
Wernsman, 1992). Se tivesse sido selecionado somente o tipo Burley já na
geração F3, tanto o tipo quanto a cor de folha teriam média muito próxima a 3.
Na geração F5 houve um aumento na média para tipo aproximando-se
mais para o Burley 2,82 e 2,77 para Cor (Tabela 8), o que pode-se inferir que
nesta geração houve um ganho maior desta característica associada à resistência
38
a murcha bacteriana pela diminuição dos tipos intermediários nas gerações mais
avançadas.
Na geração F7 ocorreu uma redução significativa no tipo e na cor em
relação à geração F5, o que não era esperado (Tabela 8). É provável que na
geração F5 algumas linhas foram selecionadas com fenótipo Burley, e com bom
índice de resistência, entretanto podem ter apresentado vigor abaixo da média
estabelecida e foram eliminadas, diminuindo desta forma os valores observados
para estes caracteres na geração F7.
A seleção de indivíduos com característica intermediária pode ser
justificada pelo interesse em obter-se um novo tipo de fumo com característica de
folhas do tipo Burley associado com coloração mais verde, que poderia produzir,
após o processo de cura, um fumo de cor castanha mais escura. No entanto,
verificou-se que após ensaios de qualidade, o tipo de fumo intermediário não
apresentava aroma característico do fumo Burley, sendo então rejeitado por não
atender esta importante condição da indústria fumageira. Entretanto, este tipo de
fumo pode ser utilizado como fonte de resistência tanto para o fumo tipo Virgínia
quanto para Burley.
Como já discutido por Sisson & Wernsmann (1992), a resistência à murcha
bacteriana pode ser descrita como quantitativa, onde o ataque da moléstia
apresenta variação desde alta resistência até extrema suscetibilidade,
dependendo das condições de ambiente. Esta afirmação vem ao encontro dos
resultados da Figura 2, onde observa-se o comportamento instável do cultivar BY
26, e este é o mesmo comportamento observado pelos agricultores a campo, já
que quando o cultivar KY 26 é submetido a uma maior pressão do ataque da
moléstia demonstra suscetibilidade. No Brasil, o cultivar KY 26 vem sendo
utilizado como alternativa de resistência em áreas com infestação moderada de
39
R. solanacearum. Entretanto, a razão da escolha desse cultivar para este trabalho
se deve ao fato de possuir características agronômicas desejáveis, como
produtividade, qualidade e equilíbrio químico, sendo os dois últimos critérios muito
importantes para a indústria.
Como havia diferentes linhas (famílias) dentro de cada geração, foi
determinado se havia diferenças significativas entre elas (Tabela 9).
Para a característica resistência a murcha bacteriana, foram detectadas
diferenças significativas entre as linhas dentro de todas as gerações (Tabela 9).
Em todas as gerações somente as plantas mais resistentes à murcha foram
selecionadas, sendo que nas gerações F3 e F5 as plantas ainda apresentam
heterozigoze, o que pode resultar em linhas com níveis variáveis de resistência na
geração seguinte.
Em F3 o fumo tipo intermediário com resistência à murcha bacteriana foi
fixado, não havendo segregação posterior e provalvemente indicando que poucos
genes estão determinando este caráter.
Da geração F7 era esperado que as linhas não apresentassem diferenças
significativas quanto à resistência à R. solanacearum. Como a fonte de resistência
é poligênica em OX 207 (Sisson,1999) é provável que as linhas tenham fixados
diferentes alelos para a resistência combinando os alelos presentes nos dois
genitores. Quanto a tipo e cor, observa-se que a diferença dentro das gerações
estudadas (F3, F5) são significativas devido ao critério de seleção adotado de
selecionar linhas com características intermediárias, portanto heterozigotos, que
ainda tinham variações genéticas, visto que estes materiais apresentavam boa
resistência, entretanto sem o tipo e cor ideal (Tabela 9).
A não ocorrência de segregação dentro das linhagens F7 para tipo de fumo
indica que existe pelo menos dois locos controlando este caráter, ao contrário do
40
que diz a literatura (Garner, 1951; Akehurtst, 1970, e Palmer & Pearce, 1999). Em
outras palavras se o caráter fosse controlado por apenas um loco, plantas
intermediárias teriam que ser heterozigotas e suas progênies deveriam segregar
para tipo Burley, Virginia e intermediário.
0,0000
0,3250
0,6500
0,9750
1,3000
1,6250
1,9500
2,2750
2,6000
2,9250
3,2500
3,5750
3,9000
4,2250
4,5500
4,8750
F1 F3 F5 F7 KY 26 OX 207 01528
Gerações
Índice de severidade da moléstia
Bloco 1 Bloco 2 Bloco 3 Bloco 4
FIGURA 2 – Índice de severidade da Murcha Bacteriana em fumo das gerações
F1, F3, F5, F7, do genitor moderadamente resistente KY 26, do
genitor resistente OX 207 e testemunha suscetível 01528.
Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.
Não existe variedade comercial com boa adaptação e resistência
poligênica à R. solanacearum em fumo do tipo Burley (Garner,1951; Sisson &
Wernsman, 1992). Nos EUA não ocorre essa moléstia em área de produção de
Burley, e em outros países, a murcha bacteriana não causa grandes prejuízos
(Jack, 2002).
Portanto, o objetivo principal desse trabalho de melhoramento foi atingir ao
final dos ciclos de seleção um material homozigoto do tipo de fumo Burley, de cor
41
amarela e resistente à R. solanacearum, ou seja, a severidade da moléstia abaixo
de 1, combinando com tipo de fumo 3 e cor 3.
TABELA 9. Análise de variância para a severidade da moléstia (MB), ao tipo de
fumo, à cor da folha, média e coeficiente de variação (CV%) de
quatro gerações de fumo (F1, F3, F5 e F7). Faculdade de
Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.
Quadrado médio
Causas de variação
GL
MB Tipo Cor
Bloco 3 1,6162* 2,1747* 11,4437*
Entre geração 3 0,6188* 118,5934* 27,6843*
Linha dentro de F3 42 0,4308* 15,8292* 5,9889*
Linha dentro de F5 27 0,3730* 16,8056* 4,0257*
Linha dentro de F7 36 0,1764* 18,6430* 7,5544*
Erro 2163 0,0452 0,2495 0,1817
CV(%) - 22,38 23,8 16,94
* : Efeito significativo em nível de 5% de probabilidade pelo teste F;
Conforme os resultados apresentados na Tabela 10 na geração F3 várias
linhas apresentam incidência de moléstia abaixo de 1 (Figura 3), porém, a grande
maioria das linhas estava segregando ou apresentavam fenótipo intermediário
para os caracteres tipo e cor. Das 43 linhas testadas 40 apresentaram índice da
moléstia inferior a 1, porém, somente 6 apresentaram também o tipo e cor
desejado (Figura 3 e Tabela 10). A seleção de tão poucas linhas na geração F3
poderia inviabilizar a seleção para outros caracteres de importância nas gerações
mais avançadas.
Na geração F5 a maioria das linhas teve severidade da moléstia abaixo de
1,0 (Figura 4), sendo que das 28 linhas avaliadas nesta geração 18 apresentaram
42
fenótipo Burley (Tabela 11), entretanto, 14 combinaram baixo índice de moléstia
com tipo e cor desejados.
Na geração F7 a maioria das linhas apresentou índice de dano da moléstia
abaixo de 1,0 (Figura 5) e das 37 linhas avaliadas 20 apresentaram fenótipo
Burley (Tabela 12), sendo que 19 linhas apresentaram baixos valores da moléstia
associadas a baixo desvio padrão, cor e tipo desejados (Figura 6), demonstrando
estar uniformes com as características desejadas.
O resultado final desse trabalho gerou 14 linhas selecionadas do tipo e cor
Burley e duas linhas com fenótipo intermediário, com índice de dano ao sistema
radicular abaixo de 0,60, que servirão como fonte de materiais resistentes ao
programa de melhoramento da Universal Leaf Tabacos Ltda. para o
desenvolvimento de linhas puras e de linhas macho estéreis para produção de
híbridos comerciais.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0,11 - 0,20 0,21 - 0,30 0,31 - 0,40 0,41 - 0,50 0,51 - 0,60 0,61 - 0,70 0,71 - 0,80 0,81 - 0,90 0,91 - 1,00 1,01 - 1,10 1,11 - 1,20 > 1,20
(Intervalo)
Freqüência
FIGURA 3 – Freqüência das médias de severidade da moléstia (Ralstonia
solanacearum) das linhas dentro da geração F3 em fumo. Faculdade
de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.
43
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0,21 - 0,30 0,31 - 0,40 0,41 - 0,50 0,51 - 0,60 0,61 - 0,70 0,71 - 0,80 0,81 - 0,90 0,91 - 1,00 1,01 - 1,10 > 1,11
(Intervalo)
Freqüência
FIGURA 4 – Freqüência das médias de severidade da moléstia (Ralstonia
solanacearum) das linhas dentro da geração F5 em fumo.
Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 - 0,10 0,11 - 0,20 0,21 - 0,30 0,31 - 0,40 0,41 - 0,50 0,51 - 0,60 0,61 - 0,70 0,71 - 0,80 0,81 - 0,90 0,91 - 1,00 1,01 - 1,10
(Intervalo)
Freqüência
FIGURA 5 – Freqüência das médias de severidade da moléstia (Ralstonia
solanacearum) das linhas dentro da geração F7 em fumo.
Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.
44
TABELA 10. Severidade da moléstia (MB), desvio padrão (dp) do tipo de fumo, da
cor da folha das linhas dentro da geração F3, do genitor
moderadamente resistente (KY 26) e do genitor resistente (OX 207).
Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.
Número da linha MB dp MB
(1)
Tipo
(1)
Cor
(1)
7
0,48
?
± 0,82
cdefg 3,50a 3,00ab
8
0,64
?
± 0,90
cdefg 3,25ab 3,00ab
9
0,54
?
± 0,35
cdefg 3,00abc 3,25a
10
0,34
± 0,31
defg 3,25ab 3,00ab
11
0,16
?
± 0,13
fg 3,00abc 3,00ab
12
0,89
?
± 0,92
bcdefg 2,80bc 3,00ab
13
0,21
?
± 0,26
efg 2,00d 1,75de
14
0,45
?
± 0,48
cdefg 3,00abc 3,00ab
15
0,94
± 1,03
bcdef 3,00abc 3,00ab
16
0,51
?
± 0,83
cdefg 3,25ab 3,00ab
17
0,18
?
± 0,29
fg 3,00abc 3,00ab
18
1,83
± 1,53
a 3,00abc 3,00ab
19
0,26
?
± 0,22
defg 3,00abc 3,00ab
20
0,45
?
± 0,37
cdefg 3,00abc 3,00ab
21
1,45
± 1,44
ab 2,80bc 3,25a
22
0,60
?
± 0,59
cdefg 2,00d 1,75de
23
0,57
?
± 0,46
cdefg 2,00d 2,00cde
24
0,73
± 0,57
bcdefg 2,50cd 1,75de
25
0,67
?
± 0,50
bcdefg 2,50cd 3,00ab
26
0,17
?
± 0,17
fg 2,00d 3,00ab
27
1,19
± 1,06
abc 2,50cd 2,00cde
28
0,14
± 0,14
g 2,00d 2,65abc
29
0,49
± 0,71
cdefg 2,50cd 2,00cde
30
0,14
?
± 0,16
g 3,00abc 2,50bc
31
0,52
± 0,29
cdefg 2,00d 1,75de
32
0,20
?
± 0,17
efg 2,50cd 2,50bc
33
0,44
± 0,46
cdefg 3,50a 3,00ab
34
0,59
?
± 0,58
cdefg 2,00d 1,75de
35
0,21
?
± 0,22
efg 2,00d 2,00cde
36
0,35
?
± 0,27
defg 2,00d 2,25cd
37
0,20
?
± 0,18
efg 2,80bc 2,50bc
38
0,19
?
± 0,19
fg 2,50cd 2,00cde
39
0,19
?
± 0,16
fg 2,00d 1,75de
40
0,27
± 0,21
defg 2,00d 1,75de
41
0,61
?
± 0,49
cdefg 2,00d 2,50bc
42
0,47
?
± 0,36
cdefg 2,50cd 2,00cde
45
Continuação TABELA 10. Severidade da moléstia (MB), desvio padrão (dp) do
tipo de fumo, da cor da folha (Cor) das linhas dentro da
geração F3, do genitor moderadamente resistente (KY
26) e do genitor resistente (OX 207). Faculdade de
Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.
Tratamento (linha) MB dp MB
(1)
Tipo
(1)
Cor
(1)
43 0,51
?± 0,59
cdefg 2,50cd 2,50bc
44 0,24
± 0,19
defg 2,00d 1,50e
45 0,51
± 0,60
cdefg 2,00d 2,50bc
46 0,99
± 1,10
bcde 2,50cd 1,75de
47 0,42
± 0,30
cdefg 2,00d 2,25cd
48 1,02
± 1,29
bcd 3,25ab 2,50bc
49 0,24
?± 0,36
defg 3,50a 3,25a
OX 207 0,17 1,00 1,00
KY 26 1,76 3,00 3,00
(1
)
Médias de tratamentos seguidas por mesma letra não diferem entre si a 5% de probabilidade
pelo teste de Tukey
46
TABELA 11. Severidade da moléstia (MB), desvio padrão (dp) do tipo de fumo, da
cor da folha das linhas dentro da geração F5, do genitor
moderadamente resistente (KY 26) e do genitor resistente (OX 207).
Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.
Tratamento (linha)
MB dp MB
(1)
Tipo
(1)
Cor
(1)
50 1,15
?
± 0,77
ab 3,00b 3,00a
51 0,61
?
± 0,42
bcde 3,00b 3,00a
52 0,27
?
± 0,41
e 3,00b 3,00a
53 0,45
?
± 0,46
cde 2,00c 1,85c
54 0,23
?
± 0,22
e 3,25ab 3,00a
55 0,35
± 0,25
de 2,00c 2,00c
56 0,56
?
± 0,32
bcde 3,00b 3,00a
57 1,63
?
± 1,17
a 3,00b 3,00a
58 0,35
?
± 0,56
de 2,00c 2,00c
59 0,30
?
± 0,33
e 3,00b 3,00a
60 0,31
?
± 0,40
de 3,00b 3,00a
61 0,44
?
± 0,22
cde 3,00b 2,50b
62 0,25
?
± 0,27
e 2,00c 1,75c
63 1,04
± 1,12
abc 3,00b 3,00a
64 0,31
?
± 0,28
de 3,00b 3,00a
65 0,30
?
± 0,25
e 3,25ab 3,00a
66 0,63
?
± 0,80
bcde 3,50a 3,00a
67 0,52
?
± 0,45
cde 3,00b 3,00a
68 0,80
?
± 0,66
bcde 3,00b 3,00a
69 0,55
± 0,66
bcde 3,00b 3,00a
70 0,61
?
± 0,58
bcde 3,00b 3,00a
71 0,35
± 0,43
de 3,00b 3,00a
72 0,23
± 0,20
e 2,00c 2,00c
73 0,23
?
± 0,21
e 3,00b 3,00a
74 0,41
?
± 0,21
de 2,00c 2,00c
75 0,34
± 0,32
de 3,00b 3,00a
76 0,93
?
± 0,68
bcd 3,00b 3,00a
77 0,36
?
± 0,22
de 3,00b 3,00a
OX 207 0,17 1,00 1,00
KY 26 1,76 3,00 3,00
(1)
Médias de tratamentos seguidas por mesma letra não diferem entre si a 5% de probabilidade
pelo teste de Tukey
47
TABELA 12. Severidade da moléstia (MB), desvio padrão (dp) do tipo de fumo, da cor da
folha das linhas dentro da geração F7, do genitor moderadamente
resistente (KY 26) e do genitor resistente (OX 207). Faculdade de
Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.
Tratamento (linha)
MB dp MB
(1)
Tipo
(1)
Cor
(1)
78 0,43
?
± 0,28
bcde 3,00a 3,00a
79 0,51
?
± 0,57
abcde 3,00a 3,00a
80 0,40
± 0,26
bcde 3,00a 3,00a
81 0,43
?
± 0,46
bcde 3,00a 3,00a
82 0,85
± 1,00
ab 3,00a 3,00a
83 0,26
??
± 0,27
cde 2,00c 1,50d
84 0,25
?
± 0,23
cde 2,00c 1,75cd
85 0,38
?
± 0,43
bcde 3,00a 3,00a
86 0,30
± 0,27
bcde 2,00c 1,75cd
87 0,26
± 0,26
cde 2,00c 2,00bc
88 0,40
?
± 0,24
bcde 3,00a 3,00a
89 0,22
?
± 0,23
cde 3,00a 3,00a
90 0,34
?
± 0,42
bcde 2,00c 2,25b
91 0,09
?
± 0,11
e 2,00c 1,75cd
92 0,31
?
± 0,38
bcde 1,50d 1,75cd
93 0,24
± 0,28
cde 2,00c 1,75cd
94 0,21
± 0,20
cde 2,00c 1,75cd
95 0,73
± 1,08
abc 3,00a 3,00a
96 0,21
± 0,16
cde 2,50b 2,75a
97 0,58
± 0,52
abcde 3,00a 3,00a
98 0,68
?
± 0,81
abcd 3,00a 3,00a
99 0,73
± 0,77
abc 3,00a 3,00a
100 0,11
?
± 0,17
de 2,00c 2,00bc
101 0,34
± 0,29
bcde 2,00c 2,00bc
102 0,29
?
± 0,24
bcde 3,00a 3,00a
103 0,62
± 0,72
abcde 3,00a 3,00a
104 0,42
?
± 0,31
bcde 3,00a 3,00a
105 0,30
?
± 0,25
bcde 3,00a 3,00a
106 0,13
?
± 0,17
de 3,00a 3,00a
107 0,31
?
± 0,30
bcde 3,00a 3,00a
108 0,19
?
± 0,13
cde 3,00a 3,00a
109 0,29
± 0,38
bcde 2,00c 1,75cd
110 0,57
?
± 0,40
abcde 2,00c 1,50d
111 0,27
?
± 0,28
cde 2,00c 1,50d
112 1,07
± 1,15
a 3,00a 3,00a
113 0,29
?
± 0,25
bcde 2,00c 1,75cd
114 0,24
?
±0,19
cde 2,00c 2,00bc
OX 207 0,17 1,00 1,00
KY 26 1,76 3,00 3,00
(1)
Médias de tratamentos seguidas por mesma letra não diferem entre si a 5% de
probabilidade pelo teste de Tukey
48
Todas as análises genéticas neste trabalho ficaram influenciadas pela forte
pressão de seleção exercida sobre todas as gerações conforme tabela 3.
Quando os efeitos gênicos foram testados pelo modelo aditivo dominante
este foi aceito (Tabela 13). Entretanto os efeitos aditivos e dominância foram não
significativos. Provavelmente isto tenha ocorrido pela eficiência da seleção
aplicada em todas as gerações segregantes. Existem evidências neste trabalho
que tanto a dominância como aditividade tem papel relevante na expressão da
resistência R. solanacearum (Tabela 8).
TABELA 13. Efeitos gênicos e valores de probabilidade do teste de quiquadrado
para o ajuste do modelo para três parâmetros, para severidade da
moléstia, em seis gerações de fumo Pai 1(BY 26), Pai 2 (OX 207)
F1, F3, F5 e F7. Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre,
RS. 2005.
Média dp
Pai 1 1,76
±
1,23
Pai 2 0,17
±
0,27
F1 0,33
±
0,26
F3 0,51
±
0,72
F5 0,52
±
0,61
F7 0,38
±
0,58
m 0,62
±
0,14
a 0,46
±
0,17
d 0,29
±
0,18
X
2
(3)
0,48497 P = 0,92218
49
Na tabela 14 estão as estimativas das variâncias fenotípicas, aditivas e do
ambiente, bem como a estimativa da herdabilidade para cada caráter avaliado e
para cada geração.
A herdabilidade no sentido restrito (Tabela 14) está um pouco
superestimada por possuir uma parte da variância de dominância, conforme
descrito em “material e métodos”. Entretanto, com o avanço das gerações, as
herdabilidades foram diminuindo diferente do esperado para plantas
autofecundação, onde a variância aditiva vai aumentando com o passar das
gerações. Provavelmente, com a seleção e eliminação de parte da população as
variâncias ficaram diminuídas.
Entre os caracteres avaliados severidade da murcha bacteriana (MB), tipo
e cor, a herdabilidade para o caráter severidade da murcha bacteriana foi muito
menor que os outros caracteres estudados, provavelmente devido o tipo de
herança envolvida, e às maiores dificuldade de avaliação de R. solanacearum
quando comparada com as outras características avaliadas. Na resistência à
murcha bacteriana a herança envolvida é poligênica (Sisson, 1999), no entanto,
os outros caracteres estudados são provavelmente monogênicos ou oligogênicos,
onde é mais fácil obter o fenótipo desejado.
Os valores da herdabilidade da severidade da murcha bacteriana foram
relativamente baixos em todas as gerações, entretanto, foi possível selecionar a
campo indivíduos com baixo nível de ataque da moléstia (Tabela 14).
50
TABELA 14. Estimativas das variâncias entre famílias (V
2
F
), dentro das famílias
(V
2
W
), aditiva (V
A
) e de ambiente (V
E
) e herdabilidade no sentido
restrito para o caráter severidade da moléstia (MB), do tipo de fumo,
da cor da folha das linhas dentro das gerações F3, F5, F7.
Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.
Caráter
V
2
F
V
2
W
V
A
V
E
h
2
r
F3
MB 0,0187 0,0558 0,0187 0,0465 0,29
Tipo 0,7710 0,4100 0,7710 0,0245 0,95
Cor 0,2847 0,2949 0,2847 0,1516 0,65
F5
MB 0,0164 0,0458 0,0164 0,0458 0,26
Tipo 0,8294 16,5879 0,8294 0,2177 0,79
Cor 0,1978 3,9556 0,1978 0,0710 0,74
F7
MB 0,0700 0,0370 0,0070 0,0370 0,19
Tipo 0,9268 0,1065 0,9268 0,1065 0,87
Cor 0,3735 0,0845 0,3735 0,0845 0,82
A correlação observada na média de todas as gerações entre severidade
de murcha bacteriana (MB) e Tipo (tipo de fumo) (r= -0,0004), e MB e Cor (r=
0,0373), foram não significativas (Tabela 15), podendo-se inferir que não há
associação entre resistência, tipo de fumo e Cor. Esse resultado indica que é
possível selecionar genótipos com o mesmo nível de resistência do genótipo
resistente e com o tipo e cor do genótipo suscetível. Observa-se, entretanto, que
correlação positiva entre cor e tipo (r= 0,6605) indica que pode ser selecionado,
de forma indireta com alguma eficiência, o tipo de fumo através da cor.
51
TABELA 15. Coeficientes de correlação geral entre as características severidade
da moléstia (MB), do tipo de fumo, da cor da folha. Faculdade de
Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS. 2005.
Característica Tipo Cor
MB -0,0004
ns
0,0373
ns
Tipo
0,6605 *
Cor
* : Significativo a 5% de probabilidade, pelo teste t.
ns
: Não significativo.
No entanto, a correlação entre os caracteres vai aumentando com o passar
das gerações. Esta correlação demonstra o grande efeito da seleção, onde na
geração F7 já apresenta valores significativos entre os três caracteres. Estes
dados demonstram que é possível selecionar genótipos com elevado nível de
resistência à R. solanacearum associada a cor e tipo de fumo desejado (Burley)
(Tabela 16) como os obtidos neste trabalho (Tabela 12).
TABELA 16. Coeficientes de correlação entre as características severidade da
moléstia (MB), do tipo de fumo, da cor da folha nas gerações F3,
F5 e F7. Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS.
2005.
Característica Tipo Cor
F3
MB -0,0191
ns
0,0781
ns
Tipo 0,4631*
F5
MB 0,1871* 0,1030
ns
Tipo 0,7318*
F7
MB 0,2642* 0,2434*
Tipo 0,8102*
* : Significativo a 5% de probabilidade, pelo teste t.
ns
: Não significativo.
52
De acordo com estudos de Takatsu & Lopes, (1997); Grimault et al.,
(1994), o desenvolvimento de variedades resistentes à murcha bacteriana para as
mais diversas espécies tem sido dificultado devido à falta de conhecimento sobre
o controle genético da resistência à murcha bacteriana, no entanto, os resultados
desse estudo indicam que foi possível transferir resistência poligênica à murcha
bacteriana de um fumo tipo Virgínia para um fumo tipo Burley, mantendo as
características desejadas.
FIGURA 6 – Médias e desvio padrão de severidade da moléstia (Ralstonia
solanacearum) – para as linhas dentro da geração F7 em fumo.
Faculdade de Agronomia, UFRGS, Porto Alegre, RS, 2005.
F7
0
0,2
0,4
0,6
0,8
1
1,2
1,4
0,000 0,200 0,400 0,600 0,800 1,000 1,200 1,400
médias
desvio padrão
53
4. CONCLUSÕES
1- A seleção artificial realizada a campo é eficiente para obter linhas puras
com resistência à murcha bacteriana.
2- A herdabilidade estimada para a severidade da moléstia (murcha
bacteriana) é baixa, enquanto que é alta para o fenótipo do tipo de planta e cor da
folha.
3- É possível incorporar os genes de resistência a R. solanacearum de
fumo tipo Virgínia para fumo tipo Burley – mantendo as características de tipo e
cor desejadas.
4- É possível obter linhas praticamente homozigotas (F7) e com resistência
à murcha bacteriana similar ao genitor resistente e cor do tipo Burley.
54
5. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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