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INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGÉTICAS E NUCLEARES
AUTARQUIA ASSOCIADA À UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
SECREÇÃO DE HORMÔNIO DE CRESCIMENTO DE
CAMUNDONGO POR QUERATINÓCITOS HUMANOS PRIMÁRIOS:
PERSPECTIVAS PARA UM MODELO ANIMAL DE TERAPIA
GÊNICA CUTÂNEA
CLÁUDIA REGINA CECCHI
Dissertação apresentada como parte
dos requisitos para obtenção do Grau
de Mestre em Ciências na Área de
Tecnologia Nuclear – Aplicações
Orientadora:
Dra. Cibele Nunes Peroni
São Paulo
2008
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Livros Grátis
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INSTITUTO DE PESQUISAS ENERGÉTICAS E NUCLEARES
AUTARQUIA ASSOCIADA À UNIVERSIDADE DE SÃO PAULO
SECREÇÃO DE HORMÔNIO DE CRESCIMENTO DE
CAMUNDONGO POR QUERATINÓCITOS HUMANOS PRIMÁRIOS:
PERSPECTIVAS PARA UM MODELO ANIMAL DE TERAPIA
GÊNICA CUTÂNEA
CLÁUDIA REGINA CECCHI
Dissertação apresentada como parte
dos requisitos para obtenção do Grau
de Mestre em Ciências na Área de
Tecnologia Nuclear – Aplicações
Orientadora:
Dra. Cibele Nunes Peroni
São Paulo
2008
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Aos meus pais José Augusto Cecchi (in memoriam) e Suely Mitie Fujita Cecchi,
por todo amor e dedicação, por nunca me deixarem desistir,
e me ensinarem o que é a determinação;
A minha avó Lourdes Bertoldo Cecchi, por todo apoio incondicional aos meus
estudos e por acreditar sempre em mim;
E a minha irmã Michelle Cecchi, por todo carinho e compreensão
.
Agradecimentos
Agradeço primeiramente a minha orientadora e mestra Dra. Cibele Nunes Peroni,
a quem devo respeito e tenho muita admiração por tudo que aprendi durante
esses anos, por todas as broncas que serviram de lição, por toda paciência que teve
comigo e pela grande amizade construída.
Ao Dr. Paolo Bartolini, meu co-orientador, pelos ensinamentos, por toda seriedade
que me ajudou no meu amadurecimento como pessoa, pela confiança e por toda
contribuição científica para realização deste trabalho.
A Dra. Teresa Carvalho Pinto Ribela, por seu colo de mãe, seus conselhos e todos
os seus abraços de conforto durante essa longa caminhada.
Ao Dr. Carlos Roberto Jorge Soares, pelo apoio, incentivo e alegria contagiante.
A Dra. Kayo Okazaki, pelos ensinamentos e sabedoria compartilhada.
A Dr. Enrique Boccardo, Dra. Luisa Lina Villa, Suely Nonogaki e demais técnicos
do Instituto Ludwig por toda colaboração para complementação deste trabalho.
À minhas irmãs e irmão do coração, Renata Martinussi, Flavia Valgode, Taís Lima,
Natália Malavasi e Eric Ueda, por toda a amizade consolidada, por toda ajuda, por
estarem presentes em todos os momentos bons e nunca me abandonarem nos
ruins...
Ao João Ezequiel Oliveira, Miriam Suzuki, Nélio Oliveira, Elisa Higuti e Renata
Damiani por toda força e ajuda diretamente neste trabalho e grande amizade...
À Maria Neide Mascarenhas, por me ensinar a manipular os animais, pelo auxílio
e pela amizade construída.
À Fernanda de Mendonça, Márcia Augusta, Cristiane Moreira, Susana Heller
Walter Hirata, Antônio Carlos Junqueira, José Maria de Souza, Adriana Ozaki,
Geyza Spigotti, Beatriz Almeida, Sueli Venâncio , Renan Loureiro, Diane Belchior,
Rosângela Arkaten, Hebert Goulart, Fernanda Arthuso, Dirce Pinto e Arlete
Correia pela amizade e alegria diariamente transmitida.
À Edna, Bernadete, Néia, pela amizade, alegria, apoio... e limpeza dos
laboratórios, materiais, do meu cantinho da sala e por sempre arrumarem minha
bagunça da mesa.
A Elizabeth Somessari, Carlos Gaia e Hélio Paes, do Centro de Tecnologia das
Radiações (CTR-IPEN), pela disponibilidade para as irradiações das células...
À Dra. Nanci do Nascimento, Dra. Lígia Morganti, Lucélia, Janaína, Alberto,
Murilo, Danielle, Felipe, Marcos, Jean, Rosa, Eduardo, Rodrigo, Solange, Camila e
aos demais colegas do Centro de Biotecnologia pelos momentos de descontração
durante as festas e almoços.
Ao Instituto de Pesquisas Energéticas e Nucleares, e a Comissão Nacional de
Energia Nuclear, pela oportunidade de realizar este trabalho e pelo auxílio
financeiro.
A toda minha família Cecchi e Fujita... principalmente minha madrinha Regina
Maria Cecchi Ferreira da Costa e meu avô Agostinho Bastos Lemos (in memoriam),
por me ensinar que o estudo é a alma da vida, e que conhecimento nunca é
demais.
Aos meus amigos: Adriano Zager , Alberto Perchiavalli, Alcino Golegã, Ana
Claudia Mandolesi, André Gibbon, André Silveira, André Takatsu, Antônio Celso
Coradini Júnior, Arianne Silva, Ariel Cardoso, Beatriz Aguiar, Bruna Malagoli,
Brunno Ferraz, Bruno Boscarato, Carlos Antonio Vergara, Carolina Bastos, Cauê
Magnani, Daniela Zuppani, Edilson Dantas, Emerson Kenji, Fanny Tzelepis,
Fernando de Souza, Fernando Mesquita, Fernando Salicete, Gabriela Cabral,
Gianlucca Nicastro, Giuliana Marques, Gustavo Baltazar, Isis Oliveira, Juliana
Simões, Karla Alves, Larissa Meyer, Leandro Henrique Alves, Luciana Almeida,
Marcos Parmesan, Mariah Munhoz, Mariana Kair, Marianny Passos, Marina Reis,
Michel Barros, Moacir Gabriel, Odevani Barros, Paula Catib, Paulo Nasser , Rafael
Frias Ovies, Rafael Salerno, Rafael Sanfurgo, Rejane Vasquez, Rodrigo Pacheco,
Rodrigo Réssio, Ronaldo Anunciação Júnior, Tânia Barcellos, Talita Conde, Victor
Proença e Vinicius Rodrigues, por fazerem esses longos anos passarem mais
rápidos, por todos os brindes a verdadeira amizade e à vida.
"O saber a gente aprende com os mestres e com os livros.
A sabedoria, se aprende é com a vida e com os humildes."
Cora Coralina
SECREÇÃO DE HORMÔNIO DE CRESCIMENTO DE CAMUNDONGO POR
QUERATINÓCITOS HUMANOS PRIMÁRIOS: PERSPECTIVAS PARA UM
MODELO ANIMAL DE TERAPIA GÊNICA CUTÂNEA
Cláudia Regina Cecchi
RESUMO
Queratinócitos são um veículo bastante atrativo para a transferência gênica
ex vivo e liberação sistêmica uma vez que as proteínas secretadas por estas
células podem atingir a circulação via um mecanismo similar ao processo natural.
Um eficiente vetor retroviral (LXSN) contendo o gene do hormônio de
crescimento de camundongo (mGH) foi utilizado para transduzir queratinócitos
humanos primários.
Os queratinócitos transduzidos apresentaram um nível de secreção in vitro
alto e estável atingindo até 11 µg mGH/10
6
células/dia. Os epitélios formados por
estes queratinócitos geneticamente modificados apresentaram, porém, uma
queda na taxa de secreção > 80 % quando foram retirados da placa de cultura
utilizando um procedimento clássico. A substituição desta metodologia clássica
por uma cultura organotípica resolveu completamente este problema.
Camundongos anões imunodeficientes (lit/scid) implantados com estes enxertos
organotípicos foram acompanhados durante 4 meses, e apresentaram um
aumento de peso significativo (P<0,05) nos primeiros 40 dias. Níveis circulatórios
de mGH atingiram um pico de 21 ng/mL 1 h após o implante, mas estes níveis
rapidamente atingiram níveis basais (~2 ng/mL).
Os queratinócitos humanos primários apresentaram portanto altos níveis de
expressão in vitro e os maiores níveis circulatórios, porém por um breve período
de tempo, reportados até o momento para GH neste tipo de células. Em conjunto
com resultados que mostraram uma recuperação considerável da eficiência de
secreção de mGH em cultura por enxertos organotípicos retirados dos animais,
foram discutidos os fatores que ainda impedem a utilização clínica deste modelo
promissor de terapia gênica cutânea.
SECRETION OF MOUSE GROWTH HORMONE BY TRANSDUCED PRIMARY
HUMAN KERATINOCYTES: PROSPECTS FOR AN ANIMAL MODEL OF
CUTANEOUS GENE THERAPY
Cláudia Regina Cecchi
ABSTRACT
Keratinocytes are a very attractive vehicle for ex vivo gene transfer and
systemic delivery, since proteins secreted by these cells may reach the circulation
via a mechanism which mimics the natural process.
An efficient retroviral vector (LXSN) encoding the mouse growth hormone
gene (mGH) was used to transduce primary human keratinocytes. Organotypic raft
cultures were prepared with these genetically modified keratinocytes and were
grafted onto immunodeficient dwarf mice (lit/scid).
Transduced keratinocytes presented a high and stable in vitro secretion
level of up to 11 µg mGH/10
6
cells/day. Conventional epidermal sheets made with
these genetically modified keratinocytes, however, showed a drop in secretion
rates of > 80% simply due to detachment of the epithelium from its substratum.
Substitution of conventional grafting methodologies with organotypic raft cultures
completely overcame this problem. The stable long-term grafting of such cultures
onto immunodeficient dwarf (lit/scid) mice could be followed for more than 4
months, and a significant weight increase (P<0.05) over the control group was
observed in the first 40 days. Circulating mGH levels revealed a peak of 21 ng/mL
just 1h after grafting, but unfortunately these levels rapidly fell to baseline values
(~ 2 ng/mL).
mGH-secreting primary human keratinocytes presented the highest in vitro
expression and peak circulatory levels reported to date for a form of GH with this
type of cells. Together with data showing that excised implants can recover in
culture a remarkable fraction of their original in vitro mGH secretion efficiency, the
factors that might still hamper the success of this promising model of cutaneous
gene therapy are discussed.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO...................................................................................................11
2 OBJETIVOS.......................................................................................................18
3 MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................................19
3.1 MATERIAL 19
3.1.1 Equipamentos e acessórios principais ......................................................19
3.1.2 Material utilizado no cultivo celular............................................................20
3.1.3 Material plástico estéril para cultura celular ..............................................21
3.1.4 Preparações padrão, antissoros e reagentes para radioimunoensaios ....21
3.1.5 Principais reagentes para imunohistoquímica...........................................22
3.1.6 Principais reagentes para biologia molecular............................................23
3.1.7 Plasmídeo utilizado ...................................................................................24
3.1.8 Linhagens celulares utilizadas ..................................................................24
3.1.8.1 Fibroblastos GP+E86 e GP+ENV+AM12..........................................24
3.1.8.2 Fibroblastos NIH-3T3-J2 ...................................................................24
3.1.8.3 Queratinócitos humanos primários.................................................24
3.1.9 Animais utilizados .....................................................................................25
3.1.9.1 Camundongos da linhagem C57BL/6J-GHRHR /+ (lit/lit)
LIT
............25
3.1.9.2 Camundongos da linhagem B6;CB17-Ghrhr /+ Prkdc /BM
(lit/scid)
lit scid
..........................................................................................................25
3.2 MÉTODOS 26
3.2.1 Construção do vetor de expressão retroviral pLmGHSN e transdução dos
queratinócitos
.....................................................................................................26
3.2.2 Cultura celular ...........................................................................................26
3.2.2.1 Cultura de fibroblastos .....................................................................26
3.2.2.2 Cultura de queratinócitos.................................................................27
3.2.3 Radioimunoensaio (RIA) para quantificação de mGH e de hGH ..............27
3.2.4 Northern blotting........................................................................................28
3.2.5 Southern blotting .......................................................................................28
3.2.6 Obtenção do epitélio a partir da placa de cultura ......................................29
3.2.7 Construção da cultura celular organotípica...............................................29
3.2.8 Implante da cultura celular organotípica em camundongos anões
imunodeficientes (lit/scid)
...................................................................................30
3.2.9 Inoculação de mGH via subcutânea .........................................................31
3.2.10 Cultura dos epitélios retirados após implante..........................................31
3.2.11 Imunohistoquímica dos epitélios retirados após implante .......................31
3.2.12 Determinação da porcentagem de células-tronco de queratinócitos
transduzidos
.......................................................................................................32
3.2.13 Determinação da meia-vida circulatória (t ) do mGH e do hGH em
camundongos anões (lit/lit)
1/2
................................................................................33
3.2.14 Análise estatística ...................................................................................33
4 RESULTADOS ..................................................................................................34
4.1 Secreção de mGH in vitro por queratinócitos transduzidos 34
4.1.1 Funcionamento de culturas organotípicas.................................................34
4.1.2 Análise clonal ............................................................................................36
4.1.3 Análise mediante Northern blotting ...........................................................37
4.2 Secreção de mGH in vivo por queratinócitos transduzidos 38
4.2.1 Ensaio de longa duração...........................................................................38
4.2.2 Estudo da dinâmica de secreção in vivo ...................................................39
4.2.3 Comparação entre enxertos organotípicos e administração subcutânea de
mGH
...................................................................................................................40
4.2.4 Retirada dos enxertos após uma semana de implante .............................41
4.2.5 Análise imunohistoquímica dos enxertos ..................................................42
4.2.6 Análise por Southern blot 43
4.3 Determinação da meia-vida circulatória (t ) do mGH e do hGH em
camundongos anões (lit/lit)
1/2
44
5 DISCUSSÃO......................................................................................................46
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS..................................................................51
11
1 INTRODUÇÃO
A terapia gênica pode ser definida como um método para tratar ou
prevenir doenças, baseado na transferência de material genético, substituindo
genes defeituosos ou ausentes por outros novos, ou pela mudança do perfil de
expressão de um gene de interesse (Edelstein e col., 2004; Peroni e col., 2005;
Van Gaal e col., 2006). É uma estratégia terapêutica baseada na inserção de um
gene (transgene) no interior de uma célula destinatária, tradicionalmente
considerada uma modalidade de tratamento para pacientes com vida ameaçada
por defeitos congênitos de funções metabólicas ou pacientes em estágio
avançado de malignidades (Bransky e col., 2007). Atualmente, a utilização da
terapia gênica também tem sido discutida no âmbito da melhora do desempenho
e da aparência, tais como aumento da massa muscular, resistência física,
memória, controle de peso e de altura e crescimento capilar (Kiuru e Crystal,
2008). Com esse espectro tão amplo, novos sistemas são desenvolvidos para
permitir a liberação de proteínas, mediante utilização de genes que codificam
hormônios, citocinas, anticorpos, antígenos ou novas proteínas recombinantes.
O gene de interesse (transgene) é transportado por um vetor e está
contido em um fragmento de DNA ou RNA, que carrega ainda outros elementos
genéticos importantes para sua manutenção e expressão. As formas de
transferência deste vetor contendo o gene são muito variadas. Algumas utilizam o
vírus como veículo transportador, mais especificamente retrovírus, adenovírus e
vírus adeno-associados. Outras formas possíveis de transferência são as técnicas
não-virais, que incluem a injeção direta do plasmídeo (naked DNA), métodos
físicos como eletroporação e biobalística e métodos químicos, como a lipofecção
(Nardi e col., 2002).
A terapia gênica é caracterizada por dois grupos distintos, a terapia
gênica somática (com modificações genéticas em qualquer tipo de célula adulta) e
a terapia gênica germinativa (que modifica somente células da linhagem
germinativa). Esta última é, portanto, uma esperança de tratamento para um
grande número de doenças até hoje consideradas incuráveis por métodos
convencionais, mas que ainda apresenta grandes barreiras de ordem ético-social.
A maioria dos experimentos clínicos atuais está direcionada para o tratamento de
12
doenças adquiridas, doenças cardiovasculares e diversos tipos de câncer (mama,
próstata, ovário, pulmão e leucemias).
Como toda nova proposta de tratamento, a terapia gênica deve ser
testada em protocolos pré-clínicos, com estudos in vitro, seguidos por
experimentação em modelos animais e só após em protocolos clínicos, seguindo
uma série de etapas envolvendo pacientes (Nardi e col., 2002).
De acordo com o National Institute of Health (NIH - Bethesda, MD,
EUA), já foram aprovados 1.411 testes clínicos para terapia gênica em diversos
campos terapêuticos, onde 827 ainda estão abertos a procura de pacientes para
completar esses estudos. Na Fig. 1, observamos a distribuição mundial dos testes
clínicos apresentada no site americano ClinicalTrials.gov
1
, em 156 diferentes
países.
Fig.1: Distribuição mundial dos testes clínicos de acordo com o NIH.
O primeiro teste clínico terapêutico foi realizado em 1990, por Blaese
e col. (1995), para corrigir a deficiência da enzima adenosina deaminase (ADA),
capaz de comprometer o sistema imunológico causando uma imunodeficiência
severa combinada (SCID). Mais tarde, o grupo de Cavazzana-Calvo e col. (2000),
realizou um teste clínico para o tratamento da imunodeficiência severa combinada
associada ao cromossomo X (X-linked-SCID) causada pela mutação do gene
IL2RG, e que acomete apenas indivíduos do sexo masculino. Foi obtido um
impressionante sucesso até que duas, das onze crianças tratadas com esta
terapia genética desenvolveram leucemia pelo fato do vetor retroviral ter se
_
_____________________________________
1
http://www.clinicaltrials.gov/ct2/results/map?term=gene+therapy
13
integrado próximo ao promotor do proto-oncogene LMO2, o qual induziu sua
transcrição e expressão de forma aberrante (Hacein-Bey-Abina e col.; 2003a,
2003b). Este grave incidente, em conjunto com a morte de um jovem atribuída a
uma severa reação inflamatória a um vetor adenoviral (Raper e col., 2003),
acarretou uma redução drástica do número de testes clínicos neste início de
século. Consequentemente, as agências regulatórias internacionais tornaram-se
mais rigorosas na liberação dos protocolos em termos de segurança, os quais
sofreram atrasos consideráveis devido principalmente ao fato dos vetores de
expressão terem que ser reformulados no sentido de diminuir toxicidade,
imunogenicidade e potencial inflamatório (Amalfitano, 2003; St. George, 2003;
Tomanin e Scarpa, 2004; Ferrari e col., 2005; Yi e col. 2005).
Diversos tipos de terapia genética são descritas, entre elas a terapia
gênica cutânea, considerada um método alternativo potencialmente atrativo para
o tratamento de deficiências, hereditárias ou adquiridas, de alguns tipos de
proteínas circulantes, como o tratamento de deficiência de hormônio de
crescimento (GH), para o qual várias estratégias de transferência ex vivo e in vivo
do gene deste hormônio em diferentes modelos animais têm sido utilizadas, com
resultados bastante satisfatórios (Peroni e col., 2005).
Atualmente, o único tratamento para esse tipo de deficiência é a
administração de GH exógeno, mas apresenta uma série de dificuldades, entre
elas o alto custo do tratamento. Um paciente que necessita do tratamento com
hGH recombinante gasta em média mais de 20 mil dólares por ano, portanto a
síntese deste hormônio in vivo pode oferecer um benefício também do ponto de
vista financeiro (Al-Hendy e col., 1996; Rivera e col., 1999; Marmary e col., 1999;
Sondergaard e col., 2003; Peroni e col., 2005).
Além disso, o tratamento da deficiência de GH utilizando transferência
gênica apresenta a possibilidade de eliminar os inconvenientes das repetidas
injeções da terapia convencional com administração do hormônio recombinante.
Deste modo, indubitavelmente não haveria a necessidade dos desgastantes e
dispendiosos processos de purificação de uma proteína recombinante e,
especialmente, os mecanismos de liberação in vivo da proteína de interesse
seriam mais similares ao processo fisiológico natural do organismo humano
(Morgan e Anderson, 1993; Heartlein e col., 1994; Krueger e col., 1999;
Taichman, 1999; Peroni e col., 2005).
14
Um dos tecidos-alvo mais atrativos para terapia gênica somática
incluindo manipulações genéticas é a pele, por suas células serem de fácil
acessibilidade e transdução, fácil monitoramento para reações adversas e pelo
alto número de doenças que podem ser amenizadas utilizando a terapia gênica
cutânea, incluindo desde doenças monogênicas da pele até doenças sistêmicas
(De Luca e Pelegrini, 1997; Taichman, 1999; Jensen e col., 1994; Hengge e
Bardenheuer, 2004; Jensen, 2004a e 2004b; Mavilio e col., 2006; Branski e col.,
2007; Kikuchi e col., 2007; Peroni e col., 2008).
Uma das estratégias mais utilizadas para terapia gênica cutânea
baseia-se na modificação genética de queratinócitos humanos, as células mais
abundantes da epiderme, que desta maneira tornam-se capazes de produzir e
secretar as proteínas de interesse terapêutico com efeito sistêmico (De Luca e
Pellegrini, 1997; Taichman, 1999). Os queratinócitos constituem a principal
população de células da epiderme, e podem ser cultivados sob condições
apropriadas de cultura. Dessa maneira, reconstituem in vitro um epitélio
transplantável, mantendo as mesmas características de diferenciação e o mesmo
padrão de expressão gênica de seus correspondentes in vivo (Green e col.,
1979).
Um dos principais veículos de transferência gênica cutânea para células
de mamífero são os vetores virais, destacando-se os retrovirais por serem de
relativa facilidade para construção, possuir uma capacidade de clonagem
suficiente para vários genes terapêuticos e integrarem-se ao genoma do
hospedeiro (Miller e col., 1993; Robbins e col., 1998).
Todos os sistemas virais utilizados baseiam-se em vírus deficientes em
replicação, portanto são capazes de transferir seu material genético para as
células-alvo, mas não conseguem replicar-se e continuar seu ciclo infeccioso
(Romano e col., 2000; Nardi e col., 2002). Entretanto, esta estratégia de terapia
gênica cutânea ainda apresenta um importante obstáculo, que é a obtenção de
níveis terapêuticos sustentáveis de secreção do transgene in vivo (Taichman,
1999; Ferrari e col., 2006). Esta expressão não duradoura e a ausência de
mecanismos precisos de regulação do gene de interesse na célula-alvo também
dificultam ainda mais o avanço da terapia gênica como ferramenta terapêutica.
O primeiro sucesso da terapia gênica utilizando queratinócitos, foi
descrito por Mavilio e col. (2006), que obteve a correção gênica da epidermólise
15
bulhosa juncional (JEB), mediante transplante de queratinócitos modificados pela
introdução do gene da laminina-5.
Vários autores já utilizaram queratinócitos contendo o gene do GH em
protocolos de terapia gênica ex vivo, como apresentado na Tab. 1 (Morgan e col.,
1987; Teumer e col., 1990; Jensen e col., 1994; Vogt e col., 1994; Bellini e col.,
2003; Peroni e col., 2006 e 2008). O grupo de Morgan e col. (1987) realizou os
primeiros estudos utilizando queratinócitos humanos primários transduzidos por
um vetor retroviral contendo o gene do hGH e obteve uma taxa de secreção in
vitro de 0,072 µg/10
6
células/dia (Teumer e col., 1990). Apesar de não ter sido
detectado hGH na circulação de camundongos atímicos implantados com os
queratinócitos transduzidos, os autores enfatizaram que estas células
reconstruíram uma epiderme normal capaz de sofrer diferenciação. A seguir, o
mesmo grupo (Teumer e col., 1990) utilizou um vetor não viral contendo o gene
do hGH para transfectar queratinócitos de uma linhagem estabelecida (SCC-13),
derivada de um carcinoma escamoso de epiderme (Rheinwald e Belkett, 1981).
Embora um nível de expressão relativamente alto de 5,3 µg hGH/10
6
células/dia
tenha sido obtido in vitro, os níveis de hormônio circulante em camundongos nude
não foram constantes, decaindo de valores iniciais de ~ 0,6 – 1,0 ng/mL a valores
indetectáveis 4 semanas após o implante.
Jensen e col. (1994) utilizaram queratinócitos humanos primários
transfectados via lipofecção com um vetor de expressão contendo o gene do hGH
controlado por um promotor de SV40. Houve detecção do hormônio na circulação
durante apenas 4 dias, embora tenha sido obtido um nível relativamente alto de
2,6 ng/mL em um camundongo implantado, com uma média de 0,6 ng/mL em n=5
camundongos. Em outro estudo (Vogt e col., 1994), queratinócitos porcinos foram
transduzidos com um vetor retroviral contendo o gene do hGH e implantados em
fluidos de ferida de porcos para criar um tipo de cultura celular in vivo. No fluido
foi detectado hGH durante 10 dias com um pico de 0,35 ng/mL no 6º dia, cujo
desaparecimento coincidiu com o restabelecimento de uma barreira epitelial que
provavelmente impediu sua difusão. Os autores sugeriram que este modelo
poderia ser útil para a cura de feridas, nas quais é requerida a produção
temporária de fatores de crescimento ou proteínas terapêuticas.
16
Tabela 1: Principais estudos de terapia gênica para GH utilizando queratinócitos
Referência Vetor
(promotor)
Célula-alvo Animal Expressão
in vitro
(µg/10
6
céls
/dia)
Níveis
circulatórios
de GH
(ng/mL)
Duração
in vivo
(dias)
Morgan e
col. (1987)
DOL-hGH
a
(LTR)
QHP
b
Camundongo
nude
0,072 _ _
Teumer e
col. (1990)
pTKGH
(TK)
c
Queratinócitos
humanos
(SCC-13)
Camundongo
nude
5,3 0,6 - 1,0 28
Jensen e
col. (1994)
vetor
baseado em
EBV (SV40)
QHP
b
Camundongo
nude
0,7 2,6 (n=1)
0,6 (n=5)
4
Vogt e col.
(1994)
αSGC-hGH
a
Queratinócitos
porcinos
Porco ~3 ng/ml 0,35
d
10
Bellini e
col. (2003)
pLhGHSN
a
(LTR)
QHP
b
Camundongo
lit/scid
7 0,2 - 0,3 12
Peroni e
col. (2006 e
2008
pLmGHSN
a
(LTR)
QHP
b
Camundongo
lit/scid
11 20 1
a
Vetor retroviral;
b
queratinócitos humanos primários;
c
promotor de timidina quinase;
d
no fluido da
ferida
Não foi ainda descrita, porém, uma secreção prolongada de hGH in vivo
ou um aumento de peso significativo. Este último efeito fenotípico, mesmo
limitado, foi reportado pelo nosso grupo de pesquisa (Bellini e col., 2003). Mais
recentemente realizamos a construção de um sistema homólogo com o gene do
GH de camundongo (mGH), que havia sido anteriormente utilizado por poucos
pesquisadores. Al-Hendy e col. (1995) demonstraram que o mGH secretado por
mioblastos microencapsulados foram capazes de promover um crescimento
significativo de camundongos anões (Snell dwarf), enquanto que Marmary e col.
(1999), utilizando este mesmo modelo animal, injetaram por via intramuscular um
vetor adenoviral contendo o gene do mGH e obtiveram uma recuperação total do
peso corpóreo frente aos camundongos não afetados por um período de
tratamento da ordem de 30 dias.
Em nosso laboratório é desenvolvido um modelo de transferência
gênica cutânea ex vivo, que utiliza queratinócitos humanos primários transduzidos
com um eficiente vetor retroviral (LXSN), contendo o gene do hGH ou do mGH.
Esta estratégia permitiu a obtenção do mais alto nível de expressão “in vitro” de
17
uma forma de GH já reportado na literatura empregando este tipo de célula (11 µg
mGH/10
6
células/dia) (Rosauro, 2003; Peroni e col., 2006 e 2008), superando até
mesmo valores anteriormente obtidos com o gene do hGH (Bellini e col., 2003),
como também é apresentado na Tabela 1.
Foi verificado, porém que, quando o epitélio formado por estes
queratinócitos transduzidos é retirado da placa de cultura com a utilização da
enzima dispase, para ser implantado em camundongos anões imunodeficientes
(lit/scid), ocorria uma perda de secreção in vitro maior que 80%. Esta enzima é
utilizada para desprender o epitélio da placa de cultura antes do implante nos
camundongos, de acordo com procedimento clássico de Barrandon e cols. (1988).
Esta mesma metodologia havia sido também utilizada para implantar os
queratinócitos secretores de hGH nos camundongos lit/scid, proporcionando
níveis circulatórios de 0,2-0,3 ng hGH/mL durante 12 dias com um pico de
secreção de 1,5 ng/mL depois de 4 h da cirurgia (Bellini e col., 2003).
A técnica de implante foi então alterada mediante a construção de uma
cultura celular organotípica, baseada em uma matriz de colágeno e fibroblastos,
onde são cultivados os queratinócitos modificados. Com a utilização desta
metodologia, houve a manutenção dos níveis de expressão de mGH in vitro.
Por outro lado, a transdução de células-tronco tem sido considerada um
importante pré-requisito para a manutenção da expressão do transgene in vivo
(Taichman, 1999; Dunnwald e col., 2001; Peroni e col., 2006; Ferrari e col., 2006).
Uma das metodologias utilizadas para a determinação da porcentagem de
células-tronco epidermais numa determinada população de queratinócitos
transduzidos é a análise clonal, que avalia o potencial de proliferação in vitro
destas células (Mathor e col., 1996; Kolodka e col., 1998; Peroni e col., 2006) e
verifica se estes clones também mantém a eficiência de expressão durante
sucessivas passagens.
18
2 OBJETIVOS
O objetivo principal do presente trabalho foi a utilização de uma cultura
celular organotípica para otimizar as condições de implante de queratinócitos
humanos primários transduzidos com o gene do mGH em camundongos lit/scid,
na tentativa de evitar a perda de 80% da secreção in vitro e de manter por um
período mais prolongado a secreção do transgene in vivo. Outros fatores que
podem influenciar o tempo de permanência desta secreção, tais como a
porcentagem de células-tronco epidermais transduzidas e a meia-vida circulatória
do transgene, foram também estudados para ajudar na viabilização deste modelo
promissor de terapia gênica cutânea.
19
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 MATERIAL
3.1.1 Equipamentos e acessórios principais
Agitador magnético modelo 258 - FANEM (São Paulo, SP, Brasil);
Agitador rotatório tipo vortex, modelo 162 - MARCONI (São Paulo, SP,
Brasil);
Autoclave vertical, modelo 103 - FABBE-PRIMAR (São Paulo, SP, Brasil);
Balança analítica, modelo H20T - METTLER (Zurich, Suíça);
Balança analítica, modelo P100N - METTLER (Zurich, Suíça);
Balança analítica, modelo M5AS - METTLER (Zurich, Suíça);
Câmera de Neubauer - BOECO (Hamburg, Alemanha);
Centrífuga, modelo LS-3 plus - CELM (São Paulo, SP, Brasil);
Centrífuga refrigerada automática modelo Super Speed RC – 2B -
SORVALL (Newtown, Connecticut, EUA);
Contador gama tipo "poço", com troca automática de amostra, modelo
Cobra auto-gama, eficiência aproximada para
125
I de 80% - PACKARD
INSTRUMENT COMPANY (Illinois, EUA);
Destilador de água, modelo 016 - FABBE-PRIMAR (São Paulo, SP, Brasil);
Estufa de cultura celular, modelo 3159 - FORMA SCIENTIFIC (Marietta,
Ohio, EUA);
Fluxo Laminar classe II A/B 3, modelo 1140 - FORMA SCIENTIFIC
(Marietta, Ohio, EUA);
Freezer –20ºC, modelo 0651 - PROSDÓCIMO (São Paulo, SP, Brasil);
Freezer –40ºC, modelo AB 240 - METALFRIO, (São Paulo, SP, Brasil);
Freezer –80ºC, modelo 8425 - FORMA SCIENTIFIC (Marietta, Ohio, EUA);
Medidor digital de pH, modelo 420A - ORION (Boston, MA, EUA);
Membranas de filtração de 0,22 µm - MILLIPORE (Bedford, MA, EUA);
Microscópio invertido, modelo ID 03 - CARL ZEISS (Oberkochen,
Alemanha);
20
Refrigerador duplex, modelo 320 clear - BRASTEMP (São Paulo, SP,
Brasil);
Sistema de purificação de água Milli-Q plus - MILLIPORE (Bedford, EUA);
Tubos de poliestireno para imunoensaios (7,5 x 1,2 cm) - EMTEL (São
Paulo, SP, Brasil).
3.1.2 Material utilizado no cultivo celular
Ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) - LABSYNTH (São Paulo, SP,
Brasil);
Ácido etanossulfônico hidroxietilpiperazina (HEPES) - SIGMA (St. Louis,
MO, EUA);
Bicarbonato de sódio - LABSYNTH (São Paulo, SP, Brasil);
Colágeno tipo I da cauda de rato – UPSTATE BIOTECHNOLOGY (Lake
Placid , NY, EUA);
Dimetilsulfóxido (DMSO) - MERCK (São Paulo, SP, Brasil);
Dispase - INVITROGEN (Carlsbad, CA, EUA);
Fator de crescimento epitelial humano (hEGF) - INVITROGEN (Carlsbad,
CA, EUA);
Geneticina (G418), Geneticin
®
- INVITROGEN (Carlsbad, CA, EUA);
Glicose Anidra - CASA AMERICANA (São Paulo, SP, Brasil);
Hidrocortisona - CALBIOCHEM - NOVABIOCHEM CORPORATION (La
Jolla, CA, EUA);
Insulina de pâncreas bovino - SIGMA (St. Louis, MO, EUA);
Meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) - INVITROGEN
(Carlsbad, CA, EUA);
Meio Ham - F12 - INVITROGEN (Carlsbad, CA, EUA);
Penicilina-estreptomicina - INVITROGEN (Carlsbad, CA, EUA);
Soro de bovino neonato (SBN) - INVITROGEN (Carlsbad, CA, EUA);
Soro fetal bovino (SFB) – HYCLONE (Logan, UT, EUA);
Toxina colérica - SIGMA (St. Louis, MO, EUA);
Tripsina - INVITROGEN (Carlsbad, CA, EUA).
21
3.1.3 Material plástico estéril para cultura celular
Garrafas de 75 cm
2
- CORNING COSTAR CORP. (NY, EUA);
Insertos plásticos (membrana Anopore
®
de
0,02µm) - NALGE NUNC
INTERNATIONAL (Rochester, NY, EUA);
Pipetas de 1, 2, 5, 10 e 25 mL - CORNING COSTAR CORP. (NY, EUA);
Placas de 6 poços - CORNING COSTAR CORP. (NY, EUA);
Placas de 24 poços - CORNING COSTAR CORP. (NY, EUA);
Placas de 10 cm
2
- CORNING COSTAR CORP. (NY, EUA);
Sistemas de filtração de 150, 200, 500 e 1000 mL, porosidade de 0,22µm -
CORNING COSTAR CORP. (NY, EUA);
Tubos criogênicos de 2 mL - CORNING COSTAR CORP. (NY, EUA);
Tubos para centrífuga de 15 e 50 mL - CORNING COSTAR CORP. (NY,
EUA).
3.1.4 Preparações padrão, antissoros e reagentes para radioimunoensaios
Anticorpo policlonal anti-rGH (lote # AFP5672099), fornecido pelo Dr. A. F.
Parlow – NATIONAL HORMONE AND PITUITARY PROGRAM (NHPP,
Torrance, CA, EUA);
Anticorpo policlonal anti-hGH, NIDDK – anti-hGH-2, fornecido pelo Dr. A. F.
Parlow – NATIONAL HORMONE AND PITUITARY PROGRAM (NHPP,
Torrance, CA, EUA);
Azida sódica - SIGMA (St. Louis, MO, EUA);
Controles de qualidade para imunoensaios baseados em sangue humano,
Lyphochek I Immunoassay Plus Control (níveis 1,2,3) – BIORAD -
INVITROGEN (Carslbad, CA, EUA);
Cloramina T p.a.- MERCK (São Paulo, SP, Brasil);
Fosfato de sódio bibásico p.a - MERCK (São Paulo, SP, Brasil);
Fosfato de sódio monobásico p.a - MERCK (São Paulo, SP, Brasil);
Metabissulfito de sódio - CARLO ERBA (São Paulo, SP, Brasil);
22
Na
125
I comercial, livre de carreadores e oxidantes, com atividade específica
de 11.100 - 22.200 MBq/mL (300 - 600 mCi/mL) - NORDION EUROPE S.A.
(Fleurus, Bélgica);
Preparação de mGH pituitário (lote # AFP 10783B) altamente purificada,
para iodação, fornecida pelo Dr. A. F. Parlow – NATIONAL HORMONE
AND PITUITARY PROGRAM (NHPP, Torrance, CA, EUA);
Preparação de referência de mGH pituitário (lote # AFP 10783B), fornecida
pelo Dr. A. F. Parlow – NATIONAL HORMONE AND PITUITARY
PROGRAM (NHPP, Torrance, CA, EUA);
Preparação de hGH recombinante altamente purificada para iodação –
IPEN-CNEN/SP (São Paulo, SP, Brasil) (Ribela e col., 1993; Oliveira e col.,
1999);
Resinas cromatográficas Sephadex G100 - GE HEALTHCARE
BIOSCIENCES (Piscataway, NJ, EUA);
Segundo anticorpo anti-IgG de coelho preparado em carneiro – IPEN-
CNEN/SP (São Paulo, SP, Brasil);
Soro albumina bovina (BSA), RIA grade (fração V) – SIGMA (St. Louis,
MO, EUA);
Soro de coelho normal - INVITROGEN (Carlsbad, CA, EUA);
Tween - 20 - SIGMA (St. Louis, MO, EUA).
3.1.5 Principais reagentes para imunohistoquímica
Anticorpo anti-citoqueratina humana de alto peso molecular, clone 34βE12
- DAKOCYTOMATION (Carpinteria, CA, EUA);
Anticorpo anti-involucrina humana – BIOMEDICAL TECHNOLOGIES
(Stoughton, MA, EUA);
Anticorpo anti-mGH para imunocitoquímica (lote # AFP 5672099 fornecido
pelo Dr. A. F. Parlow – NATIONAL HORMONE AND PITUITARY
PROGRAM (NHPP, Torrance, CA, EUA);
Sistema de detecção de anticorpos primários baseado em anticorpo
secundário conjugado a um polímero marcado com peroxidase - Envision
Plus Systems – DAKOCYTOMATION (Carpinteria, CA, EUA).
23
Sistema de detecção de anticorpos primários baseado em anticorpo
secundário conjugado a um polímero marcado com peroxidase
SuperPicTure Polymer Detection (cat. 87-9663) - ZYMED LABORATORIES
- INVITROGEN IMMUNODETECTION (South San Francisco, CA, EUA).
3.1.6 Principais reagentes para biologia molecular
Agarose - INVITROGEN (Carlsbad, CA, EUA);
Ampicilina – SIGMA (St. Louis, MO, EUA);
Brometo de etídio – LKB – PRODUKTER AB (Bromma, Suécia);
Enzimas de restrição – FERMENTAS (Burlington, Ontário, Canadá);
Extrato de levedura – DIFCO (São Paulo, SP, Brasil);
Filtros Hybond N - GE HEALTHCARE BIOSCIENCES (Piscataway, NJ,
EUA);
Hiperfilme Kodak - GE HEALTHCARE BIOSCIENCES (Piscataway, NJ,
EUA);
Marcador de peso molecular lambda DNA / ECORI + HindIII –
FERMENTAS (Burlington, Ontário, Canadá);
Micro colunas
Ι
llustra G-25 - GE HEALTHCARE BIOSCIENCES
(Piscataway, NJ, EUA);
Nucleotídeo [α -
32
P] dcTP (300 Ci/mmol) - GE HEALTHCARE
BIOSCIENCES (Piscataway, NJ, EUA);
Sistema de marcação de DNA (DNA labeling kit) – GE HEALTHCARE
BIOSCIENCES (Piscataway, NJ, EUA);
Sistema de marcação radioativa de sondas Ready – To – Go Labelling
Beads - GE HEALTHCARE BIOSCIENCES (Piscataway, NJ, EUA);
Sistema para extração de DNA em larga escala QIAGEN Plasmid Maxi Kit -
QIAGEN (Hilden, Alemanha);
Sistema para purificação de DNA QIAGEN Quiaquick Nucleotide Removal
Kit – QIAGEN (Hilden, Alemanha).
24
3.1.7 Plasmídeo utilizado
pLmGHSN – plasmídeo construído em nosso laboratório (Peroni e col.,
2008), a partir do vetor retroviral pLXSN, no qual foi inserido o cDNA do hormônio
de crescimento de camundongo (mGH). Este gene foi obtido do plasmídeo
pKLmGH, gentilmente cedido pela Dra. Patrícia L. Chang da Universidade Mc
Master (Hamilton, Ontário, Canadá).
3.1.8 Linhagens celulares utilizadas
3.1.8.1 Fibroblastos GP+E86 e GP+ENV+AM12
Foram utilizadas as células da linhagem GP+E86, denominadas
ecotróficas por sua capacidade de infectar células murinas, e também células da
linhagem GP+ENV+AM12, denominadas anfotróficas, pela capacidade de infectar
tanto células murinas, como também células humanas (Markowitz e col., 1988a;
1988b). Estas linhagens celulares derivadas de fibroblastos de camundongo NIH-
3T3 co-transfectados com plasmídeos contendo os genes gag, pol e env, foram
gentilmente cedidas pelo Dr. Bank da Columbia University (NY, EUA).
3.1.8.2 Fibroblastos NIH-3T3-J2
Estas células são fibroblastos de camundongo, que foram utilizadas
como camada de sustentação (feeder layer) para os queratinócitos humanos. A
linhagem destas células foi cedida pelo Dr. Carlos Pincelli (Modena, Itália).
3.1.8.3 Queratinócitos humanos primários
São células presentes na camada epidérmica, que foram obtidas a
partir de fragmentos de pele humana resultante de cirurgia plástica de mama
(mamoplastia) ou a partir de prepúcio de neonatos, de acordo com o protocolo
descrito por Green e col. (1979), modificado em nosso laboratório (Rosauro,
2003).
25
3.1.9 Animais utilizados
Os camundongos das linhagens lit/lit e lit/scid, descritas abaixo, foram
adquiridos da empresa THE JACKSON LABORATORY (Bar Harbor, ME, EUA), e
as colônias derivadas desses animais são mantidas no biotério do IPEN –
CNEN/SP (São Paulo, SP, Brasil), nas seguintes condições de criação:
Temperatura ambiente: 22 ± 2º C;
Iluminação artificial com ciclo circadiano de 12 horas de luz / 12 horas de
escuridão;
Ração e água ad libitum
Os animais da linhagem lit/scid, por apresentarem uma
imunodeficiência severa, foram mantidos em microisoladores, dentro de uma área
de criação controlada, e todo material utilizado para sua manutenção, bem como
a ração e água servidas, foram esterilizados para garantir a saúde desses
animais.
3.1.9.1 Camundongos da linhagem C57BL/6J-GHRHR
LIT
/+ (lit/lit)
Os animais desta linhagem apresentam uma mutação espontânea de
origem recessiva, no gene do receptor do fator liberador de GH (GHRH),
localizado no cromossomo 6, que origina o nanismo (Deitel e col., 2002). As
características principais das alterações fenotípicas podem ser visualizadas a
partir da segunda semana após o nascimento, como a redução da massa
corpórea e das dimensões ósseas.
3.1.9.2 Camundongos da linhagem B6;CB17-Ghrhr
lit
/+ Prkdc
scid
/BM (lit/scid)
Os camundongos dessa linhagem, além de apresentarem a mutação
“lit”, descrita anteriormente, apresentam outra mutação autossômica recessiva
originada no gene Prkdc, situado no cromossomo 16, que lhes confere uma
imunodeficiência severa.
26
3.2 MÉTODOS
3.2.1 Construção do vetor de expressão retroviral pLmGHSN e transdução
dos queratinócitos
Estas etapas já haviam sido realizadas em nosso laboratório (Rosauro,
2003; Peroni e col., 2008). Resumidamente, o vetor retroviral contendo o gene do
mGH foi construído a partir do plasmídeo pKLmGH. O fragmento correspondente
ao cDNA do mGH foi isolado deste plasmídeo e inserido nos sítios de restrição
das enzimas Xho I e BamH I do vetor retroviral pLXSN, originando assim o vetor
de expressão pLmGHSN.
Este vetor foi introduzido nas células GP+E86, mediante transfecção a
partir de co-precipitação do DNA, pelo método do cloreto de cálcio. A seguir, ao
sobrenadante destas células ecotróficas foi adicionado polibreno (brometo de
hexadimetrina) na concentração de 8 µg/mL, para aumentar a permeabilidade da
membrana celular. Este sobrenadante foi colocado em contato com as células
anfotróficas GP + ENV + AM12, previamente semeadas em placas de cultura,
para infecção das mesmas. Os melhores clones destas células selecionados com
base na expressão de mGH (no meio de cultura), determinada por
radioimunoensaio e no título viral foram utilizados para a transdução de
queratinócitos. Os queratinócitos transduzidos foram selecionados com geneticina
(G-418), uma vez que o vetor retroviral contém o gene da neomicina
fosfotransferase (“neo”), atingindo níveis de até 11,24 ± 1,06 µg mGH/ 10
6
células
/dia (n= 6). Estes queratinócitos foram congelados para utilização nos
experimentos subsequentes.
3.2.2 Cultura celular
3.2.2.1 Cultura de fibroblastos
Foram utilizados fibroblastos de camundongos da linhagem NIH - 3T3 -
J2, que atuam como uma camada de sustentação dos queratinócitos (feeder
27
layer) durante o cultivo celular, quando submetidos à irradiação gama em bomba
de cobalto (Co
60
) a uma dose de 60 Gy, antes de atingirem a confluência. Estas
células foram mantidas em meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM),
acrescido de 10% de soro de bovino neonato (SBN), penicilina - estreptomicina
(100 UI/mL - 100 pg/mL) e tamponado a um pH de 7,2 com HEPES (8 mM). A
cultura destas células foi realizada em estufa a 37º C e 5% de CO
2
.
Para a cultura celular organotípica, foram utilizados fibroblastos
humanos, que são cultivados da mesma maneira, com exceção do meio de
cultura acrescido de 10% de soro fetal bovino (SFB).
3.2.2.2 Cultura de queratinócitos
Os queratinócitos humanos foram cultivados no meio apropriado para
crescimento destas células (KGM - Keratinocyte Growth Medium), composto por
70% de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM) e 30% de meio Ham F-
12. A este meio foram adicionados soro fetal bovino (SFB) a 4 %, tampão HEPES
(8 mM), toxina colérica (0,1 nM), penicilina-estreptomicina (100 UI/mL – 100
pg/mL), hidrocortisona (0,4 µg/mL), insulina (5 µg/mL) e fator de crescimento
epidermal (EGF) (10 ng/mL), mantidos em estufa a 37º C e 5% de CO
2
.
3.2.3 Radioimunoensaio (RIA) para quantificação de mGH e de hGH
Para análise quantitativa do hormônio de crescimento humano (hGH) e
de camundongo (mGH), durante todas as etapas do presente trabalho, os níveis
de expressão in vitro e in vivo destes hormônios foram determinados mediante
utilização de radioimunoensaios específicos para estes hormônios, padronizados
em nosso laboratório (Bellini e col., 1998; Bellini e col., 2003; Rosauro, 2003;
Peroni e col. 2008). As amostras foram analisadas em duplicata, calculando-se o
valor médio. Como controle de qualidade, nos ensaios relativos ao mGH foram
utilizados soros com concentração média deste hormônio conhecida, obtidos de
camundongos lit/lit (1,3 ± 0,7 ng mGH/mL; n= 8) e de camundongos normais da
linhagem C57BL6 (6,5 ± 1,8 mg mGH/mL; n= 8). No caso do hGH, foram
utilizadas preparações comerciais de controle de qualidade (Lyphochek I
28
Immunoassay Plus Control) com diferentes concentrações deste hormônio. As
sensibilidades dos ensaios foram de 0,25 ng mGH/mL e de 0,1 ng hGH/mL,
calculadas de acordo com a definição de Rodbard (1978).
3.2.4 Northern blotting
Para a análise por Northern blotting, 10 µg de RNA total extraído dos
queratinócitos transduzidos e não transduzidos foram fracionados em gel de
agarose denaturante a 1% e transferidos por capilaridade para filtros Hybond N.
As técnicas de pré-hibridização, hibridização e lavagens foram realizadas de
acordo com o protocolo descrito por Church e Gilbert (1984). A sonda de mGH foi
preparada a partir de um fragmento de cDNA do mGH, retirado do vetor
pLmGHSN mediante digestão com as enzimas de restrição Eco R I e BamH I.
Uma sonda de cDNA do gene da enzima GAPDH (Glyceraldehyde-3-Phosphate
Dehydrogenase)
humana foi utilizada como controle para garantir a mesma
quantidade de RNA analisado. Estas sondas foram marcadas utilizando o sistema
Ready-To-Go Labelling Beads e [α-
32
P] dCTP (3000 Ci/mmol). Os filtros de nylon
foram expostos a um hiperfilme Kodak com tela intensificadora.
3.2.5 Southern blotting
O DNA genômico total dos queratinócitos transduzidos e controles (não-
transduzidos), recuperado dos enxertos 0, 1 e 7 dias do implante, foi preparado
por ressuspensão dos enxertos em tampão de lise (NaCl 200 mM; Tris-HCl 100
mM pH 8.5, EDTA 5 mM, SDS a 0.2%, proteinase K 100 µg/µL), seguida de
incubação por 16 h (overnight) a 37°C. O DNA foi clivado passando por uma
agulha de 18 G aproximadamente 10 vezes, extraído com fenol-clorofórmio e
precipitado com etanol. O DNA genômico total (10 µg) foi digerido com BamH I e
logo após separado em gel de agarose a 0,8%, denaturado por 45 minutos em
NaCl 1,5 M e NaOH 0,5 M, e transferido para uma membrana de nylon Hybond-N.
A membrana foi pré-hibridizada em solução de hibridização contendo fosfato de
sódio 0,5M pH 7,2, EDTA 1 mM pH 8,0, SDS a 7%, BSA a 1%. A sonda de mGH
foi a mesma utilizada no Northern blotting e foi marcada com o sistema de
29
marcação de DNA Ready-To-Go. A sonda marcada foi purificada com micro-
colunas
Ι
llustra G-25, denaturada, adicionada a uma nova solução de
hibridização, incubada com a membrana por 16 h (overnight) a 65
o
C. A
membrana foi lavada duas vezes com fosfato de sódio 40 mM pH 7,2, EDTA 1mM
pH 8,0, SDS a 5% e BSA a 0,5% durante 5 minutos a 65
o
C e oito vezes com
fosfato de sódio 40 mM pH 7,2, EDTA 1 mM pH 8,0, SDS a 1%. As membranas
foram visualizadas por auto-radiografia.
3.2.6 Obtenção do epitélio a partir da placa de cultura
Queratinócitos transduzidos foram semeados em placas de cultura de
10 cm de diâmetro e cultivados até atingir a confluência. Os epitélios foram
retirados das placas de cultura mediante incubação com dispase (2,5 mg/mL),
diluída em meio KGM (Keratinocyte Growth Medium). O epitélio (78 cm
2
) foi
deixado então livre em KGM ou envolto num pedaço de gaze parafinada (2 x 2
cm), que atua como um suporte de acordo com a técnica clássica de implante de
Barrandon e col. (1988). Outra alternativa foi desprender o epitélio
mecanicamente utilizando uma espátula. Após estes procedimentos, os epitélios
foram incubados por 24 h em KGM sem soro, o qual foi coletado para a
determinação de mGH por RIA.
3.2.7 Construção da cultura celular organotípica
A metodologia de preparo deste tipo de cultura, utilizada por Kolodka e
col. (1998), foi posteriormente modificada pelo mesmo grupo de pesquisa. A
principal alteração consistiu na introdução de uma primeira camada acelular
composta basicamente de colágeno tipo I obtido da cauda de rato. Esta primeira
camada acelular foi colocada sobre um inserto de plástico (Anopore
®
Membrane),
acomodado num poço de uma placa de 6 poços, para diminuir a possibilidade da
segunda camada se desprender e sofrer um encolhimento. A primeira matriz
(camada acelular) foi portanto composta de meio de cultura DMEM (Dulbecco´s
Modified Eagle´s Medium), soro fetal bovino (SFB), NaOH 1 M e colágeno. Esta
matriz foi então pipetada sobre o inserto e incubada a 37
o
C para polimerizar
30
durante aproximadamente 30 min. A segunda matriz (camada celular) foi
preparada com os mesmos reagentes adicionando-se 2 x 10
5
fibroblastos
humanos/inserto e a mistura foi pipetada sobre a primeira camada seguida de
polimerização por ~ 1 h nas mesmas condições. Foram adicionados 2 mL de
KGM sobre as matrizes e 3 mL na placa de cultura. Seguiu-se uma incubação de
7 dias na estufa a 37
o
C e 5 % CO
2
com uma troca de meio após 3 dias, antes da
adição dos queratinócitos transduzidos ou não modificados (7 x 10
5
células/inserto) sobre as matrizes. Após 4 dias desta adição, os queratinócitos
foram mantidos numa interface ar-líquido, retirando-se o meio KGM e
recolocando-se apenas 2 mL na placa de cultura. Este meio foi trocado a cada 2
dias e as culturas organotípicas estavam prontas para serem implantadas nos
camundongos após 10-14 dias.
3.2.8 Implante da cultura celular organotípica em camundongos anões
imunodeficientes (lit/scid)
Antes do procedimento de implante cirúrgico, os animais de 45-90 dias
foram anestesiados com 100 µL de uma mistura contendo 2 mL de cloridrato de
quetamina, 0,5 mL de cloridrato de xilazina e 2,5 mL de solução salina estéril e o
pêlo da região escapular dorsal foi retirado. A seguir, a pele do animal (um círculo
de ~1,2 cm de diâmetro) foi retirada para acomodar a cultura organotípica, que foi
recoberta com um fragmento de gaze parafinada e curativo com band-aid durante
uma ou duas semanas.
Em diferentes intervalos de tempo após o implante, foram coletadas
amostras de sangue via plexo retro-orbital para determinação dos níveis
circulantes de mGH por RIA. O peso dos animais implantados com queratinócitos
transduzidos ou do grupo controle (queratinócitos não modificados), foi
monitorado durante 20 semanas para avaliar possíveis alterações no peso
corpóreo (Bellini e Bartolini, 1993; Bellini e col., 1998).
31
3.2.9 Inoculação de mGH via subcutânea
Uma quantidade similar de mGH à da secretada pela cultura
organotípica, ou seja, 2 µg deste hormônio obtido do NHPP em 50 µL de solução
salina, foi administrada subcutaneamente no dorso de camundongos lit/scid
(mesma região onde é realizado o implante dos queratinócitos). Em diferentes
intervalos de tempo após a inoculação, foram retiradas amostras de sangue para
determinação dos níveis circulantes de mGH.
3.2.10 Cultura dos epitélios retirados após implante
A cultura celular organotípica foi mantida implantada nos camundongos
lit/scid por 7 dias. Os animais foram então sacrificados e os epitélios implantados
foram removidos, lavados com PBS e recolocados em cultura com 2 mL de KGM
na forma íntegra ou após recuperação dos queratinócitos com a utilização da
tripsina, de acordo com trabalhos que já haviam realizado este tipo de
recuperação (Teumer e col., 1990; Kolodka e col., 1998). A quantidade de mGH
secretada por estes epitélios ou células recuperadas foi determinada por RIA em
meios condicionados de 24 h e comparada com a da concentração nos meios
coletados de culturas organotípicas mantidas in vitro durante o experimento.
3.2.11 Imunohistoquímica dos epitélios retirados após implante
Para a imunoshistoquímica, epitélios derivados de culturas
organotípicas foram removidos 1 e 7 dias após o implante. Estes epitélios
recuperados, juntamente com um controle positivo não implantado e um
fragmento de pele de camundongo lit/scid (controle negativo), foram fixados em
formol tamponado a 10% para a próxima etapa de parafinização. Após a
desparafinização e re-hidratação, as lâminas foram submersas em tampão citrato
pH 6,0 e a recuperação do antígeno foi realizada por aquecimento sob pressão. A
atividade da peroxidase endógena foi bloqueada com peridrol a 3% e os cortes
foram incubados por 16 h (overnight) com os anticorpos mencionados acima a 4
o
C. Os cortes histológicos foram submetidos à reação com os seguintes anticorpos
32
primários: anti-involucrina humana produzido em coelho, anti-citoqueratina de alto
peso molecular (anticorpo monoclonal anti-citoqueratina humana produzido em
camundongo, clone 34βE12) e anti-mGH produzido em coelho. As expressões da
involucrina e da citoqueratina foram detectadas com sistemas EnVision plus,
baseados em segundos anticorpos anti-coelho e anti-camundongo conjugados a
um polímero marcado com peroxidase, enquanto a expressão de mGH foi
detectada utilizando o sistema SuperPicTure Polymer Detection baseados no
mesmo princípio. Todos os cortes foram revelados com diaminobenzidina e
contra-corados com eosina - hematoxilina.
3.2.12 Determinação da porcentagem de células-tronco de queratinócitos
transduzidos
Esta determinação foi realizada de acordo com a metodologia descrita
por Kolodka e col. (1998). Os queratinócitos transduzidos foram semeados a
baixas densidades (~ 500 células/placa de cultura de 10 cm de diâmetro) com o
intuito de obter clones isolados. As colônias com diâmetro de ~ 5 mm foram
isoladas com cilindros de clonagem e as células derivadas de cada clone foram
inicialmente semeadas em uma placa de 24 poços (primeira passagem celular),
contendo uma camada de fibroblastos irradiados (feeder layer). Após intervalos
de 7-10 dias, com os queratinócitos em semi-confluência (~80%), as células
derivadas de cada clone foram transferidas sucessivamente para placas de 6 cm
(segunda passagem celular) e de 10 cm de diâmetro (terceira e quarta passagens
celulares), perfazendo um total de 4 passagens. Em cada passagem, o meio de
cultura condicionado de 24 h de cada clone foi coletado para determinação do
nível de expressão de mGH por RIA e os queratinócitos foram submetidos à
contagem em hemocitômetro (câmara de Neubauer) para o cálculo de
produtividade em µg/10
6
células/dia.
33
3.2.13 Determinação da meia-vida circulatória (t
1/2
) do mGH e do hGH em
camundongos anões (lit/lit)
Os camundongos foram injetados via intravenosa, utilizando a veia
caudal, com 1 µg de hormônio por animal, em 100 µL de solução salina. Após as
injeções, os animais foram submetidos à sangria via plexo retro-orbital em
diferentes tempos (n=4 animais /tempo). Os níveis circulantes de hGH e de mGH
no soro foram dosados por RIA e a meia-vida circulatória foi calculada mediante
verificação do tempo necessário para que a concentração de hormônio na
circulação decaísse à metade do valor máximo alcançado.
3.2.14 Análise estatística
As análises para avaliar significância foram realizadas de acordo com o
teste “t” de Student, onde P< 0,05 foi considerado uma diferença estatisticamente
significativa.
34
4 RESULTADOS
4.1 Secreção de mGH in vitro por queratinócitos transduzidos
4.1.1 Funcionamento de culturas organotípicas
A partir dos queratinócitos transduzidos com o gene do mGH, que
apresentaram altos níveis de secreção in vitro de até ~11 µg mGH/10
6
células/dia,
foi realizado um experimento no qual estas células foram submetidas à ação da
enzima dispase para desprender o epitélio formado in vitro, segundo a
metodologia clássica de Barrandon e col. (1988). Como pode ser observado na
Tabela 2, epitélios submetidos à ação da dispase ou desprendidos
mecanicamente com a utilização de uma espátula, apresentaram uma perda de
secreção in vitro > 80%. É interessante observar também que a simples
eliminação da dispase mediante desprendimento mecânico, proporcionou um
aumento da secreção de ~ 20%.
Tabela 2: Perda de secreção de mGH in vitro por queratinócitos transduzidos com
o gene deste hormônio, após aplicação de diferentes métodos para desprender os
epitélios das placas de cultura
Método para desprender
Secreção celular
específica de mGH
(µg/10
6
células/dia)
Perda de secreção
(%)
a) controle (sem desprender) 6,50 0
b) dispase com gaze parafinada 0,06 99,0
c) dispase sem gaze parafinada 0,09 98,5
d) mecânico (espátula) 1,25 80,8
Foi então comparada a taxa de secreção in vitro de epitélios preparados
de acordo com esta técnica clássica, utilizada em nosso laboratório, com aquela
obtida utilizando culturas organotípicas preparadas de acordo com Kolodka e col.
35
(1998). Com a utilização destas culturas, foi observado que não havia perda de
secreção in vitro, enquanto que os epitélios tratados com dispase apresentaram
novamente quase 100% de perda (Fig. 2). Deve-se observar, entretanto, que com
as culturas organotípicas houve um aumento da taxa de secreção de ~ 2 vezes
quando calculada com base no número inicial de queratinócitos utilizados (7 x 10
5
células/enxerto). Porém, não é possível calcular o número exato de queratinócitos
durante a progressão do experimento, devido à complexa mistura de colágeno,
fibroblastos e queratinócitos que formam estas culturas. Apesar de haver portanto
uma super-estimação da taxa de secreção, acreditamos que este fato não invalide
as conclusões do experimento. Outro aspecto a ser considerado é que o
tratamento com tripsina e subcultura não influenciou a taxa de secreção do
hormônio. Esta taxa foi recuperada após 6 dias da transferência das células para
uma segunda placa de cultura preparada com fibroblastos irradiados (feeder
layer), onde os queratinócitos se aderiram novamente e se proliferaram, o que
não ocorreu após o tratamento com dispase.
Fig. 2: Secreção in vitro de mGH por queratinócitos transduzidos, após diferentes
tratamentos.
___
•
___
epitélio desprendido da placa de cultura mediante tratamento com dispase e
transferido para uma segunda placa de cultura também preparada com fibroblastos
(feeder layer) (n=2);
___▲___
células submetidas a tratamento com tripsina e transferidas como no item
anterior, (n=2);
___
___
culturas organotípicas preparadas de acordo com a metodologia de Kolodka e col.
(1998) (n=5).
36
4.1.2 Análise clonal
Um outro estudo realizado com os queratinócitos in vitro foi a
determinação da porcentagem de células-tronco transduzidas com mGH. Para
esta determinação foram isolados 24 clones de queratinócitos transduzidos e as
células derivadas de cada clone foram expandidas durante quatro passagens
sucessivas e submetidas à contagem em cada passagem, enquanto os meios
condicionados de 24 h foram coletados e o conteúdo de mGH determinado por
RIA. Verificou-se que após estas passagens (equivalentes a mais que 30
duplicações ou 10
7
células), a maioria dos clones manteve e alguns apresentaram
até mesmo um aumento do nível de expresão de mGH (Fig. 3). Estes resultados
indicaram portanto que pelo menos 30% dos clones (7 dos 24) parece ser
derivado de células-tronco transduzidas, pois apresentaram a manutenção de
altos níveis de expressão (acima de 10 µg mGH / 10
6
células / dia) após as
passagens celulares.
Esta porcentagem representaria, de acordo com a literatura a fração de
células-tronco transduzidas, sendo que em experimentos anteriores, nos quais os
queratinócitos foram submetidos a três passagens celulares, os resultados foram
similares.
5101520
0
5000
10000
15000
20000
25000
mGH (ng/10
6
células/dia)
Clones (número)
passagem 1
passagem 2
passagem 3
passagem 4
Fig. 3: Níveis de mGH determinados por RIA no meio de cultura de células isoladas
(clones) de uma população de queratinócitos transduzidos. As células foram semeadas
em placa de 24 poços (passagem 1), transferidas para placas de 6 cm de diâmetro
(passagem 2) e posteriormente para placas de 10 cm de diâmetro (passagens 3 e 4). As
placas foram previamente preparadas com uma camada de fibroblastos irradiados
(feeder layer).
37
4.1.3 Análise mediante Northern blotting
Foi também realizada uma análise por Northern blot, a fim de verificar a
presença de mRNA de mGH nas células utilizadas para a construção da cultura
organotípica. Como é mostrado na Fig. 4, os queratinócitos transduzidos
apresentaram claramente a presença do mRNA correspondente ao mGH.
Fig. 4: Northern blotting utilizando um fragmento de cDNA de mGH como sonda. (1)
Queratinócitos humanos primários não-transduzidos. (2) Queratinócitos humanos
primários transduzidos com o gene do mGH. (3) Fibroblastos imortalizados de
camundongo - NIH-3T3J2. GAPDH: sinal correspondente ao cDNA da GAPDH
(Glyceraldehyde - 3 - Phosphate Dehydrogenase) humana, utilizado como controle da
quantidade de mRNA aplicada no gel.
38
4.2 Secreção de mGH in vivo por queratinócitos transduzidos
4.2.1 Ensaio de longa duração
As culturas organotípicas foram preparadas para serem implantadas
nos camundongos anões imunodeficientes (lit/scid). Um ensaio de longa duração
foi realizado utilizando dois grupos de camundongos lit/scid, enxertados com
culturas organotípicas contendo queratinócitos transduzidos ou não transduzidos
(grupo controle). Os animais foram submetidos à pesagem a cada 2-3 dias
durante 4 meses, mas a variação de peso foi significativamente diferente entre os
dois grupos (P<0.05) apenas durante 40 dias após o implante. Neste período foi
obtida uma inclinação de 0,042 g/animal/dia para os animais implantados com os
queratinócitos transduzidos e 0,016 g/animal/dia para o grupo controle. A variação
de peso dos camundongos lit/scid nos dois grupos durante o período total do
experimento pode ser visualizada na Fig. 5. Entretanto, os enxertos estavam
perfeitamente integrados à epiderme e não demonstraram nenhum sinal de
rejeição até o 125
o
dia.
Fig. 5: Variação de peso de camundongos anões imunodeficientes (lit/scid) (n=6
animais/grupo), que receberam implante de queratinócitos transduzidos com o gene do
mGH (
___
•
___
) ou de queratinócitos não modificados (
___
▪
___
). Os implantes foram
preparados de acordo com uma metodologia de cultura organotípica descrita por Kolodka
e col. (1998), posteriormente modificada. As culturas foram implantadas na região dorsal
dos animais após retirada do pêlo, segundo técnica descrita pelos mesmos autores.
39
Neste mesmo experimento, a determinação dos níveis circulantes de
mGH resultou num valor de ~ 4 ng/mL após 4 h do implante, esses níveis logo
decaíram e 4 dias depois haviam se igualado aos valores basais (Fig. 6).
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
1
2
3
4
5
Tempo (dias)
mGH (ng/mL)
Fig. 6: Níveis de mGH circulante em camundongos lit/scid (n=2 animais/ponto), que
receberam implante de queratinócitos transduzidos com o gene do mGH (
___
•
___
) ou de
queratinócitos não modificados (
___
▪
___
). Os implantes foram preparados como descrito na
legenda da Fig.5. São apresentados os valores médios e os desvios padrões da média.
4.2.2 Estudo da dinâmica de secreção in vivo
Uma análise mais detalhada foi então realizada para se tentar
compreender a dinâmica da secreção in vivo do mGH imediatamente após o
enxerto da cultura organotípica, realizando coletas de sangue dos animais
implantados em intervalos menores de tempo, num período de 24 h. Os
resultados apresentados na Fig. 7 evidenciam um pico de secreção relativamente
elevado (~20 ng mGH/mL) na circulação dos camundongos após 1 h da cirurgia,
níveis estes que se mantiveram apenas 24 h, quando se igualaram aos valores
basais do grupo controle.
Deve ser enfatizado também que as culturas organotípicas foram
lavadas 3 vezes com meio de cultura, a fim de diminuir a possibilidade de
transferência passiva de hormônio sintetizado in vitro. Estes enxertos exibiram
40
imediatamente antes da cirurgia, uma secreção in vitro de 1,89 ± 0,57 µg mGH/dia
(n=5).
Fig. 7: Níveis de mGH circulante em camundongos lit/scid (n=2 animais/ponto), que
receberam implante de queratinócitos transduzidos com o gene do mGH (
___
•
___
) ou de
queratinócitos não modificados (
___
▪
___
). O preparo da cultura organotípica e o implante
foram realizados como descrito na legenda da Fig. 5. São apresentados os valores
médios e os desvio padrão da média.
4.2.3 Comparação entre enxertos organotípicos e administração subcutânea
de mGH
Os níveis circulantes de mGH obtidos após o implante destes enxertos
foram então comparados com os níveis obtidos na circulação dos animais após
administração subcutânea de 2 µg do mesmo hormônio (Fig. 8). Deve-se levar em
consideração que na administração subcutânea ocorre um único estímulo seguido
da depuração metabólica do hormônio, enquanto que no implante organotípico
deveria ocorrer uma secreção mais prolongada. É possível observar que os níveis
circulantes obtidos foram similares nos dois procedimentos, mas há uma
diferença de ~50 min para que o mGH secretado pelos implantes atinja os
mesmos níveis daqueles obtidos com a injeção. Pode-se observar também que
com a administração subcutânea a quantidade de mGH circulante é claramente
maior e sua presença mais extensa.
41
Fig. 8: Níveis de mGH no soro de camundongos lit/scid (n=2 animais/ponto), que
receberam implante de queratinócitos humanos transduzidos com o gene do mGH
(
___
•
___
) ou que foram injetados via subcutânea com 2 µg de mGH (
___
▪
___
). São
apresentados os valores médios e o desvio padrão da média.
4.2.4 Retirada dos enxertos após uma semana de implante
Foi também verificado que culturas organotípicas retiradas após 1
semana do implante, apresentaram uma secreção de 191 ± 84 ng
mGH/implante/dia, o que representa ~ 45% do valor de 424 ± 271 ng
mGH/implante/dia obtido para culturas mantidas in vitro durante o mesmo período
de tempo (Tabela 3). Pode-se observar que mesmo as células recuperadas com
tripsina, apesar de uma redução maior da secreção de mGH, não apresentaram
uma completa supressão da secreção deste hormônio.
Tabela 3: Níveis de mGH determinados em meios condicionados (24 h) de
culturas organotípicas, mantidas in vitro ou recuperadas de camundongos lit/scid
implantados
Condições da cultura
organotípica
ng mGH/mL
a
ng mGH/implante
a
in vitro
212 ± 135 424 ± 271
implantada e retirada
95,6 ± 41,7 191 ± 84
in vitro + tripsina
170 ± 31,2 340 ± 62
implantada e retirada +
tripsina
43,5 ± 38,1 89 ± 15,6
a
Secreção de mGH média ± SD; cada valor é derivado de n=3 placas de cultura.
42
4.2.5 Análise imunohistoquímica dos enxertos
A persistência de células humanas in vivo foi confirmada por
imunohistoquímica, utilizando anticorpos anti-involucrina humana e anti-
citoqueratina humana de alto peso molecular, como ilustrado na Fig. 9. É
interessante observar que, após 1 semana as células humanas aparentemente
migraram para a camada de colágeno, a qual parece desprovida de
vascularização.
Fig. 9: Imunohistoquímica utilizando anticorpos anti-involucrina humana (A1-D1) e
anti-citoqueratina humana de alto peso molecular (A2-D2). (A) Fragmento de pele de
camundongo lit/scid. (B) Cultura organotípica mantida in vitro (não implantada). (C)
Implante retirado 1 dia após cirurgia. (D) Implante retirado 7 dias após cirurgia. (A-D, x
100).
43
Foi realizada uma análise confirmatória também por imunohistoquímica,
específica para verificar a presença de hormônio de crescimento de
camundongo no epitélio humano implantado no animal, utilizando anticorpo
anti-mGH. Podemos observar na Fig. 10, a presença de células secretoras
desta proteína, após 1 e 7 dias, do implante.
Na cultura organotípica não implantada (amostra B) e no implante
retirado 1 dia após a cirurgia (amostra C), os queratinócitos secretores de mGH
encontram-se mais estratificados no topo, enquanto 7 dias após o implante
(amostra D), estas células ainda estão presentes, porém mais dispersas dentro
do epitélio.
Fig. 10: Imunohistoquímica utilizando anticorpo anti-mGH. (A) Fragmento de pele de
camundongo lit/scid. (B) Cultura organotípica mantida in vitro (não implantada). (C)
Implante retirado um dia após a cirurgia. (D) Implante retirado uma semana após a
cirurgia. (A-D, x 100).
4.2.6 Análise por Southern blot
Para verificar a presença do cDNA do mGH nos queratinócitos
implantados, foi realizada uma análise por Southern blot, utilizando um
fragmento do cDNA do mGH como sonda. Foram analisadas amostras sem
implantar e 1 e 7 dias após o implante. Na Fig. 10 podemos observar o sinal
44
devido à presença do cDNA da proteína de interesse nos queratinócitos
transduzidos, mesmo após 7 dias do implante. Como esperado, nenhum sinal
pode ser visualizado nos implantes com queratinócitos não transduzidos.
Fig. 10: Análise por Southern blot utilizando um fragmento de cDNA de mGH como
sonda. Queratinócitos não transduzidos obtidos de (1) cultura organotípica antes do
implante, (2) cultura organotípica retirada 1 dia após o implante, (3) cultura organotípica
retirada 7 dias após o implante. Queratinócitos secretores de mGH obtidos de (4) cultura
organotípica antes do implante, (5) cultura organotípica retirada 1 dia após o implante, (6)
cultura organotípica retirada 7 dias após o implante.
4.3 Determinação da meia-vida circulatória (t
1/2
) do mGH e do hGH em
camundongos anões (lit/lit)
A meia-vida circulatória (t
1/2
) do mGH e do hGH foi determinada injetando-
se estes hormônios em camundongos anões (lit/lit), via intravenosa (veia caudal),
e verificando-se a variação dos níveis circulantes de cada hormônio com o tempo.
Um exemplo das curvas obtidas nos ensaios com mGH é apresentado na Fig. 11,
onde foi obtido um t
1/2
= 55,5 ± 19,1 min (n=3) para este hormônio. Porém não
45
houve uma diferença estatisticamente significativa (P=0,24) entre o t
1/2
obtido para
o mGH e aquele calculado para o hGH (t
1/2
= 39,5 ± 2,1 min; n=2) em
experimentos anteriores. Estes resultados indicaram portanto que a utilização do
mGH em camundongo provavelmente não é um fator determinante para a
manutenção dos níveis circulatórios, quando comparado com a utilização do hGH
no nosso modelo de terapia gênica cutânea.
0 20 40 60 80 100 120 140
0
20
40
60
1o. ensaio mGH - t
1/2
= 77 min
2o. ensaio mGH - t
1/2
= 49 min
3o. ensaio mGH - t
1/2
= 40,5 min
Tempo (min)
mGH (ng/mL)
Fig. 11: Níveis de mGH circulante em camundongos lit/lit (n= 4 animais/ponto), injetados
via intravenosa com 1 µg de mGH e submetidos à sangria em diferentes tempos. São
mostrados os valores de meia-vida circulatória (t
1/2
) obtidos em três ensaios. Cada ponto
representa o valor médio e o desvio padrão da média.
46
5 DISCUSSÃO
Neste trabalho foi utilizada uma metodologia de cultura celular organotípica
(Garlick e Taichman, 1994; Kolodka e col., 1998) para implantar em camundongos
lit/scid os queratinócitos transduzidos com o gene do mGH, que apresentaram os
mais altos níveis de expressão in vitro já descritos na literatura, atingindo 11 µg
mGH/10
6
células/dia (Rosauro, 2003; Peroni e col., 2006; Peroni e col., 2008). A
alteração do sistema de implante foi realizada após verificação de que o epitélio,
formado por estes queratinócitos modificados geneticamente, apresentou uma
queda de secreção in vitro de mGH > 80%, quando utilizada a enzima dispase de
acordo com procedimento clássico de implante (Barrandon e col., 1988).
Como reportado na literatura, a secreção in vitro de um epitélio
desprendido da placa de cultura apresentou uma perda de 72 – 83%, quando
comparada com aquela das células aderidas (Teumer e col., 1990). Um resultado
semelhante foi portanto obtido neste trabalho, quando o método clássico de
preparação dos epitélios foi utilizado (Barrandon e col., 1988; Bellini e col., 2003).
Isto sugere que os queratinócitos teriam capacidade de secreção somente
quando se encontram aderidos à uma superfície ou membrana específica.
Evitando o uso de dispase (por exemplo, mediante desprendimento mecânico),
houve uma recuperação da secreção de ~20%. A utilização da cultura celular
organotípica, que é mais similar ao sistema natural (Garlick e Taichman, 1994;
Parenteau e col., 1996), demonstrou ser uma alternativa válida, uma vez que
houve a manutenção dos altos níveis de expressão de mGH in vitro, como
apresentado na Fig. 2. Este fato demonstra que in vitro, as células transduzidas
apresentaram na cultura organotípica um aumento de seu número ou de sua taxa
de secreção. Além disso, nesta etapa do trabalho, foi também realizada uma
análise por Northern blot, que confirmou a clara presença do mRNA
correspondente ao mGH nos queratinócitos transduzidos. Esta análise
complementou uma caracterização preliminar realizada mediante SDS-PAGE
seguida de Western blotting e mediante cromatografia de alta eficiência por
exclusão molecular (HPSEC) associada a uma determinação por
radioimunoensaio (RIA) (Peroni e col., 2008).
47
Considerando a resolução deste problema, juntamente com a potencial
vantagem de um sistema homólogo, utilizando mGH ao invés do hGH, esperava-
se obter um aumento dos níveis circulatórios concomitante com uma secreção
mais prolongada desta proteína a longo prazo. Entretanto, exceto por um pico
inicial de secreção de ~20 ng mGH/mL após 1h do implante, a durabilidade da
secreção in vivo e o aumento de peso corpóreo não foram melhores que os
obtidos em trabalho anterior (Bellini e col., 2003). Os níveis circulatórios
igualaram-se aos basais em 24 h após a cirurgia, enquanto que o ganho de peso
foi significativo apenas nos 40 primeiros dias do ensaio. Durante o período em
que os animais implantados foram acompanhados (125 dias), observou-se porém
que os queratinócitos apresentaram uma perfeita integração e indistinguível re-
epitelização na forma de epitélios organotípicos.
A parte mais intrigante dos resultados foi portanto a obtenção de um alto
nível inicial de hormônio na circulação atingindo 21 ng mGH/mL 1 h após o
implante, seguido de um rápido declínio destes níveis circulatórios. Já havia sido
verificado, contudo, que implantes recuperados 1 semana após o implante nos
camundongos lit/scid e recultivados in vitro, apresentaram aproximadamente
metade do nível de secreção inicial (Peroni e col., 2006). Foi demonstrado
também, por imunohistoquímica, a presença de queratinócitos humanos
(utilizando os marcadores involucrina e citoqueratina de alto peso molecular
humanos) e destas células secretoras de mGH (utilizando o marcador específico
para este hormônio) 7 dias após o implante. Esta persistência foi ainda
confirmada mediante análise por Southern blot, no qual foi visualizado o sinal
devido à presença do cDNA do mGH.
A rápida perda dos níveis circulatórios de transgenes secretados por
queratinócitos humanos primários modificados geneticamente tem sido atribuída
na literatura a várias causas. Dentre elas, podemos citar: morte celular (apoptose)
ou diferenciação celular, transporte ineficiente da proteína para a circulação,
meia-vida circulatória reduzida, ligação a células endoteliais ou mesmo o efeito de
uma barreira formada pela membrana basal existente entre a epiderme e a derme
(Teumer e col., 1990; Gerrard e col., 1993). Tem sido ainda sugerida que uma
rápida inativação do promotor poderia ocorrer em células que expressam
componentes retrovirais (sequências LTR - Long Terminal Repeat – e ativadoras),
que são mais susceptíveis à apoptose ou ao silenciamento do transgene por
48
metilação do promotor (Mulligan, 1993; Fenjves e col., 1994; Choate e Khavari,
1997; Kolodka e col., 1998; Krueguer e col., 1999). A imunogenicidade da
proteína transgênica, dos elementos do vetor ou do tipo celular também tem sido
considerada como uma possível causa da eliminação das células transduzidas
em animais imunocompetentes (Ghazizadeh e col., 2003; Hengge, 2006).
Baseados em dados da literatura, a maioria dos quais referentes ao hGH,
apolipoproteína E (apo E) e fator IX utilizados nos trabalhos citados acima, não é
fácil explicar a rápida queda de secreção in vivo do nosso transgene (mGH).
Como mencionado nos resultados, as culturas organotípicas foram lavadas antes
do implante e, mesmo 30 min após o procedimento cirúrgico, os níveis séricos
ainda eram basais. Como também demonstrado por Gerrard e col. (1993) que
utilizaram o fator IX, os níveis iniciais relativamente altos de secreção in vivo não
seriam devidos a uma transferência passiva de mGH previamente sintetizado em
cultura. A injeção subcutânea de aproximadamente a mesma quantidade de mGH
secretado em 24 h pela cultura organotípica, mostrou que o hormônio atinge a
circulação cerca de 50 min antes da proteína secretada pelo implante. Este fato
também contribui contra a possibilidade de ocorrência de transferência passiva de
mGH em nossas condições de implante.
De qualquer maneira, partindo-se de células altamente secretoras in vitro,
algo deve ocorrer que rapidamente bloqueia a secreção ou o transporte da
proteína de interesse para a circulação. É ainda prematuro especular as causas
desta supressão ou bloqueio imediato. De acordo com os nossos resultados, a
meia-vida circulatória (t
1/2
) do mGH em camundongos lit/lit não seria um fator
determinante para este rápido mecanismo de perda de secreção. Foi encontrado
um valor de t
1/2
de 55,5 min para o mGH e de 39,5 min para o hGH (Peroni e col.,
2006); o t
1/2
do hGH em humanos é da ordem de 11-20 min (Li e col., 2001;
Klerman e col., 2003; Melmed e Kleinberg, 2003; Bidlingmaier e col., 2004). Um
impedimento de transporte devido à pobre vascularização do local de implante da
cultura organotípica, a um rápido processo inflamatório ou à formação de uma
barreira específica também é possível, especialmente considerando a ausência
de níveis circulatórios contrapondo-se à presença de células secretoras de mGH
7 dias após o implante; contudo, esta barreira teria que ser ativada imediatamente
após o transporte inicial de mGH.
49
Nossos resultados, que mostram uma considerável recuperação da
secreção após a retirada e cultivo do tecido implantado, também colaboram
contra a ocorrência de eventos apoptóticos extremamente eficientes. Embora a
presença do promotor LTR e de sequências retrovirais, presentes em nossos
queratinócitos transduzidos, tem sido considerada responsável pela inativação do
transgene, falha do promotor ou mesmo apoptose (Choate e Khavari, 1997;
Krueger e col., 1999), outros autores tendem a excluir esta possibilidade (Teumer
e col., 1990; Gerrard e col., 1993; Fenjves e col., 1994; Stockschlader e col.,
1994; Ghazizadeh e Taichman, 2000). Finalmente, a utilização de mGH em
camundongo imunodeficiente deveria, pelo menos em princípio, excluir alguns
mecanismos imunogênicos, especialmente aqueles relacionados à natureza do
transgene e dos elementos do vetor. Entretanto, ainda é possível haver alguma
resposta imune contra os queratinócitos humanos, especialmente considerando a
linhagem de camundongos scid utilizada neste trabalho, que espontaneamente
poderia desenvolver uma imunorreatividade parcial levando à produção de células
B e T em animais de 12 semanas de idade. Este “vazamento” de resposta imune
pode ser mais significativo para camundongos oriundos da linhagem BALB/cBy,
segundo comunicado do próprio fornecedor (Jax Communication, n
o
2, May 25,
2000).
Considerando os nossos resultados preliminares de determinação da
porcentagem de células-tronco transduzidas com mGH, foi observado mediante
análise clonal que ~30% dos clones isolados e expandidos mantiveram ou mesmo
apresentaram um aumento significativo de expressão de mGH (Peroni e col.,
2006). Esta porcentagem representaria portanto a fração de células-tronco de
queratinócitos transduzidos, sendo similar à obtida por Kolodka e col. (1998) que
mostraram um valor de 21,1 - 27,8% de células-tronco de queratinócitos
transduzidos com o gene da β-galactosidase. É interessante observar que estas
células puderam ser detectadas em camundongos nude por um período de até 40
semanas após o implante.
Em conclusão, no presente trabalho foi otimizada a utilização de uma
cultura celular organotípica, contendo queratinócitos secretores de mGH, para
implante em camundongos lit/scid. O fato da secreção de mGH in vivo não
persistir por mais de um dia, levou-nos a estudar possíveis fatores envolvidos
neste bloqueio ou supressão de secreção. Acreditamos que outros estudos, tais
50
como a utilização comparativa da metodologia de naked DNA associada à
eletroporação in vivo (Prud’homme e col. 2006; Ratanamart e Shaw, 2006;
Prud’homme e col., 2007), o enriquecimento da população de queratinócitos em
células-tronco e modificações na técnica de implante, podem também ajudar na
viabilização clínica desta metodologia mediante identificação dos obstáculos que
ainda impedem o sucesso deste modelo promissor de terapia gênica cutânea.
Salientamos que a maioria dos resultados aqui apresentados foram
inseridos em duas publicações: em Molecular Biotechnology (Peroni e col., 2006)
e no Journal of Gene Medicine (Peroni e col. , 2008).
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