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Denys Schulz
Avaliação toxicológica do extrato bruto antibacteriano de
Bacillus amyloliquefaciens R 10
Florianópolis
2008
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1
Denys Schulz
Avaliação toxicológica do extrato bruto antibacteriano de
Bacillus amyloliquefaciens R 10
Tese apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciência dos Alimentos do Centro de
Ciências Agrárias da Universidade Federal de Santa
Catarina, como requisito final para a obtenção do
título de Doutor em Ciência dos Alimentos.
Orientadora: Profa. Dra. Cleide Rosana Vieira Batista
Florianópolis
2008
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2
Avaliação toxicológica do extrato bruto antibacteriano de
Bacillus amyloliquefaciens R 10
por
Denys Schulz
Tese aprovada como requisito final para a obtenção do título de Doutor no
Programa de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos, pela comissão formada
por:
Presidente: _____________________________________________
Profa. Dra. Cleide Rosana Vieira Batista (UFSC)
Membro: _____________________________________________
Profa. Dra. Elaine Cristina Pereira de Martinis (USP/RP)
Membro: _____________________________________________
Profa. Dra. Mercedes Gabriela Ratto Reiter (FURB)
Membro: _____________________________________________
Prof. Dr. Adair Roberto Soares dos Santos (UFSC)
Membro: _____________________________________________
Profa. Dra. Cláudia Maria Oliveira Simões (UFSC)
Coordenadora: ______________________________________________
Profa. Dra. Marilde Terezinha Bordignon Luiz
Florianópolis, 19 de fevereiro de 2008.
3
Aos meus pais, Ingo Schulz e
Lourita Koprovski Schulz e para a
estimada professora Dra. Cleide
Rosana Vieira Batista, pelas
preciosas orientações prestadas
durante o longo caminho acadêmico
percorrido até esse maravilhoso
momento, bem como pelas palavras
confortáveis que serviram de apoio
nas horas mais difíceis para que eu
pudesse realizar meus objetivos e
sonhos.
4
AGRADECIMENTOS
A Deus pela oportunidade de vida;
Aos meus pais Ingo Schulz (*28/05/1951 Timbó/SC) e Lourita Koprovski
Schulz (*19/08/1951 Indaial/SC) pelo incentivo, suporte financeiro, amor e carinho
para que eu jamais desistisse de meus sonhos;
À minha irmã Alyne Schulz (*29/05/1979 Rio dos Cedros/SC), pelo
incentivo, cooperação, carinho e amizade;
Aos meus avós Ingobert Schulz (*26/12/1927 Timbó/SC e +07/05/1988
Timbó/SC, in memoriam), Anita Gerda Schulz, nascida Gebauer (*29/06/1930
Gaspar, distrito de Blumenau/SC, registrada em Timbó/SC e +14/07/1993
Blumenau/SC, in memoriam), Leopoldo Koprovski (*11/12/1909 Indaial/SC e
+02/11/1984 Indaial/SC, in memoriam) e Anna Koprovski, nascida Coninck
(*13/07/1908 Morro Pelado, distrito de Indaial/SC, atualmente limite entre
Apiúna/SC e Ibirama/SC e +26/12/1995 Indaial/SC, in memoriam) pelo exemplo
de luta e carinho;
Aos meus bisavós Leopoldo Schulz (*14/07/1901 Timbó/SC, registrado em
Indaial/SC e +23/08/1972 Braço do Trombudo/SC, in memoriam), Marie Schulz,
nascida Koffke (*18/02/1902 Indaial/SC e +08/07/1979 Indaial/SC, in memoriam),
Ernst Paul Gebauer (*07/02/1897 Kleinkugel, registrado em *10/02/1897 Dieskau,
Landkreis Saalkreis, Bundesland Sachsen Anhalt, Deutschland e +24/11/1960
Timbó/SC, in memoriam), Minna Elisabeth Gebauer, nascida Hörnig (*18/01/1898
e registrada em *22/01/1898 em Bretnig, Regierungsbezirk Dresden, Landkreis
Kamenz, Bundesland Sachsen, Deutschland e +13/07/1947 Timbó/SC, in
memoriam), Ludwig Koprowski (*13/03/1869 Preuβen, atualmente Polônia e
+03/12/1959 Lontras/SC, in memoriam), Josephina Koprowski, nascida Geisler
(*14/05/1872 Indaial/SC e +22/05/1960 Lontras/SC, in memoriam), João Coninck
(*20/09/1866 Ilhota/SC e +??/??/194? Aurora, distrito de Rio do Sul/SC, in
memoriam) e Carolina Coninck, nascida Maes (*27/08/1872 Ilhota/SC e
+11/10/1944 Aurora, distrito de Rio do Sul/SC, in memoriam) pelo exemplo de luta
e carinho;
Não posso deixar de agradecer e relembrar algumas datas e fatos
históricos que levaram meus ascendentes (dignos heróis) a escolher Santa
Catarina, no sul do Brasil, para viver, são eles:
5
(1) A família do patriarca August Friedrich Ferdinand Schulz (*21/06/1836
Preuβen e +25/11/1897 Indaial/SC, in memoriam), conhecido como Augusto
Schulz, de Voigtshagen, Kreis Naugard, Pommern, Preuβen (atualmente
Wojtaszyce, Gmina Dobra, Powiat łobeski, Województwo Zachodnio-Pomorskie,
Polônia), sua esposa Friederike Henriette Wilhelmine Krüger (*1839 Preuβen, in
memoriam), conhecida como Henriette Schulz e o seu filho Herrmann Friedrich
Wilhelm Schulz, conhecido como Hermann Schulz (*06/01/1862 Voigtshagen,
Kreis Naugard, Pommern, Preuβen; +02/09/1921 Timbó/SC, registrado em
Indaial/SC, in memoriam). Essa família emigrou pelo Porto de Hamburg em
10/05/1868 com o navio Victoria sob o comando do capitão Laura (in memoriam).
Chegaram à Colônia Blumenau em 12/07/1868, onde se estabeleceram no lote
n
o
18 do XXI Distrito do Rio Benedito, margem esquerda (região atualmente
pertencente ao município de Timbó/SC), conforme registros de Dr. Hermann
Bruno Otto Blumenau (in memoriam). Tanto a certidão de casamento de August
Friedrich Ferdinand Schulz com Friederike Henriette Wilhelmine Krüger
(registrado no Jahrgang: 1861, Seite: 177, Nummer: 2) quanto a certidão de
batismo de Herrmann Friedrich Wilhelm Schulz (registrado no Jahrgang: 1862,
Seite: 54, Nummer: 2) estão arquivadas no Landeskirchliches Archiv da
Pommersche Evangelische Kirche em Greifswald na Alemanha. Hermann Schulz
casou-se com Bertha Heller (*15/07/1866 Sternitz, residia em Hohenwardin, Kreis
Belgard, Pommern, Preuβen, atualmente Wardyń Górny, Gmina Połczyn-Zdrój,
Powiat świdwiński, Województwo Zachodnio-Pomorskie, Polônia, +22/04/1943
Blumenau/SC, in memoriam), em 20/07/1882 na Paróquia Evangélica do
Badenfurt de Blumenau/SC, cujo registro foi realizado no Ofício do Registro Civil,
Títulos e Documentos do Cartório Braga Varela
®
de Blumenau/SC em
23/04/1883, n. 333, fls. 98 e liv. n. B-1. Agradeço a todos os integrantes dessa
família pela coragem e força que os fizeram emigrar para adquirir aqui no sul do
Brasil seu sonhado pedaço de terra onde cultivaram seu próprio alimento,
sustentaram sua família e acima de tudo, encontraram paz, uma vida digna para
contribuir para o desenvolvimento da Colônia Blumenau e para a fundação do
município de Timbó/SC;
(2) A família do patriarca Ludwig Koprowski (nascido por volta de 1836,
Preu
βen, atualmente Polônia, +20/06/1913 Indaial/SC, in memoriam), que
emigrou para a Colônia Sandweg (Caminho das Areias) de Indaial/SC, onde se
6
estabeleceram no lote n
o
38, em 1874. Ludwig Koprowski era casado com Anna
Koprowska, nascida Tarnowska (*21/02/1838 Preuβen, atualmente Polônia,
+03/08/1920 Indaial/SC, in memoriam), sepultada no cemitério Caminho das
Areias em Indaial/SC. Ludwig Koprowski casou-se com Anna Tarnowska (in
memoriam), provavelmente em 1861, na Parafii Pieniążkowo, localizada na região
de Kwidzyn na Província de Pomorskie na Polônia. Vários integrantes da família
afirmam que seu filho também chamado Ludwig Koprowski (in memoriam), meu
bisavô, nasceu no navio durante a viagem para o Brasil. A investigação do local
de procedência desse patriarca torna-se muito difícil, quer seja pela falta, extravio
ou destruição da documentação no Brasil ou na Polônia, país esse que durante as
sangrentas guerras foi invadido e dividido entre os prussianos, russos e pelo
Império Austro-Húngaro. Agradeço a esses antepassados pela bravura, força e
coragem de emigrar para o sul do Brasil em busca de paz e por melhores
condições de vida, bem como por participarem da fundação da cidade de
Indaial/SC, minha querida terra natal, onde nasci em 19/08/1977;
(3) Ao patriarca Ernst Paul Gebauer (in memoriam) e sua esposa Minna
Elisabeth Gebauer, nascida Hörnig (in memoriam), que em 14/09/1922
embarcaram no porto de Hamburg com destino ao Rio de Janeiro onde chegaram
em 03/10/1922 (permanecendo temporariamente na Hospedaria de Immigrantes –
Ilha das Flôres), e depois transferidos para Santa Catarina, estabelecendo-se
definitivamente em Timbó/SC, pela coragem, força e vontade de buscar novas
oportunidades de trabalho e melhores condições de vida no sul do Brasil, sua
nova pátria, quando aqui chegaram ainda traumatizados pela 1
a
Guerra Mundial.
(4) A família do patriarca Leo De Coninck (natural da Bélgica, de onde
emigrou com 48 anos, in memoriam) residente em St. Bavon na Bélgica (Gent)
que embarcou no porto de Ostende a bordo do navio belga Adèle, capitão
Cornelisse (in memoriam) em 30/05/1846 com destino a Santa Catarina – Brasil
(MAES, 2005). Segundo Dr. John Everaert (apud MAES, 2005), do Inst. Koloniale
& Maritieme Geschiedenis da Universiteit Gent da Bélgica, os imigrantes desse
navio faziam parte de um projeto que propunha introduzir o cultivo do linho no
Brasil. A família dos patriarcas Eugene Maes (natural de Aarsele na Bélgica, de
onde emigrou com 43 anos, in memoriam) residente em Aarsele na Bélgica (vila
do município de Tielt da província de Flandres Ocidental) e Pierre Brackeveld
(natural de Koekelare, município da província de Flandres Ocidental na Bélgica,
7
de onde emigrou com 42 anos, in memoriam) residente em S. Pieters Kapelle na
Bélgica (vila do município de Middelkerke do distrito de Ostende na província de
Flandres Ocidental) que emigraram pelo porto de Ostende a bordo do bridge
belga Jan van Eyck, sob o comando do capitão J. Minne (in memoriam) em 23 de
agosto de 1844 com destino à Santa Catarina (MAES, 2005). Segundo Maes
(2005) esses bravos flamengos, citados nas listas de passageiros da Colônia
Belga do Itajaí – Brasil, obtida no Ministério de Assuntos Exteriores da Bélgica,
vieram para fornecer mão-de-obra ao sonho de Charles Van Lede (in memoriam),
cujo grande objetivo era a mineração do subsolo de Santa Catarina e não a
colonização. Agradeço pela coragem, força e os admiro pela vontade de buscar
novas oportunidades de trabalho e melhores condições de vida no Brasil, sua
nova pátria, frente ao sofrimento e injustiças que lhes foram impostas pelos
recrutadores que prometiam terras, riquezas e facilidades nunca recebidas.
A Associação Catarinense dos Professores (ACP), proprietária do edifício
Christiane localizado na Rua Ferreira Lima, 96, Centro, Florianópolis, que durante
nove anos disponibilizou um aconchegante apartamento para me hospedar,
pensão essa onde tive a oportunidade de compartilhar o quarto com
aproximadamente 30 estudantes que tinham propósitos parecidos com os meus,
mesmos sonhos e dificuldades. As recordações que deixaram são a amizade, o
companheirismo e os vários ensinamentos que utilizo diariamente em minha vida;
À professora Cleide Rosana Vieira Batista do Núcleo de Microbiologia de
Alimentos (NUMICAL) do Departamento de Ciência e Tecnologia de Alimentos
(CAL) do Centro de Ciências Agrárias (CCA) da Universidade Federal de Santa
Catarina (UFSC), que durante esses aproximadamente nove últimos anos me
orientou em vários projetos, pela amizade, paciência, dedicação, apoio, incentivo
e exemplo de persistência, força, humildade e humanidade;
À professora Cláudia Maria Oliveira Simões do Laboratório de Virologia
Aplicada do Departamento de Ciências Farmacêuticas (CIF) do Centro de
Ciências da Saúde (CCS) da UFSC, por ter oferecido a oportunidade da
realização do Ensaio do Cometa, cedendo toda a estrutura laboratorial e material
necessários, orientação, sugestões, paciência e amizade;
Ao Thiago Caon, mestrando do Programa de Pós-Graduação em
Biotecnologia do Centro de Ciências Biológicas (CCB) da UFSC, e à estagiária
8
Carolina Schmanech Mussi, do Laboratório de Virologia Aplicada, pelo auxílio
técnico na realização do Ensaio do Cometa;
Ao professor Adair Roberto Soares dos Santos do Laboratório de Fisiologia
do Departamento de Ciências Fisiológicas (CFS) do CCB da UFSC, por ter
oferecido a oportunidade da realização dos ensaios de toxicidade em
camundongos, cedendo toda a estrutura laboratorial e material necessários,
orientação, sugestões, paciência e amizade;
Aos assistentes do Laboratório de Fisiologia do CFS do CCB da UFSC:
Ana Paula Luiz, Francisney Pinto do Nascimento, Giselle Guginski, Liana Cezar
Maffi, Rodrigo Marcon, Lívia Ribas, Murilo Massaro, Sônia Maria Figueredo
López, Camila Mafalda Ribas, Diana Vieira de Senne e Costa, pelo auxílio técnico
na realização dos ensaios de toxicidade em camundongos, paciência e amizade;
À professora Elaine Cristina Pereira de Martinis do Departamento de
Análises Clínicas, Toxicológicas e Bromatológicas (DACTB) da Faculdade de
Ciências Farmacêuticas de Ribeirão Preto (FCFRP) da Universidade de São
Paulo (USP), pelas sugestões, paciência e amizade;
À professora Mercedes Gabriela Ratto Reiter do Departamento de Ciências
Naturais da Fundação Universidade Regional de Blumenau (FURB), pelas
sugestões, paciência e amizade;
À professora Marilde T. Bordignon Luiz do Laboratório de Bioquímica de
Alimentos do CAL do CCA da UFSC, pela disponibilização do espectrofotômetro
para a dosagem de proteínas e auxílio técnico, paciência e amizade;
Ao professor Ernani Sebastião Sant´Anna e ao bolsista Mauricio Villela da
Costa Braga do Laboratório de Biotecnologia Alimentar do CAL do CCA da UFSC,
pela disponibilização do liofilizador e auxílio técnico, paciência e amizade;
Aos amigos dos Laboratórios de Microbiologia de Alimentos I e II do
NUMICAL do CAL do CCA da UFSC: Rubem Abreu Machado, Murilo Anderson
Pereira, Paulo Rogério Franchin, Sara Fabiana Bittencourt de Aguiar, Márcia
Menezes Nunes, Roberta Juliano Ramos, Letícia Adélia Miotto, Luiz Fernando
Bleyer de Faria, Fernanda Froner Ambrosini, Leonardo Nuernberg, Sabrina de
Bona Sartor, Ana Cristina Tanello, Renata D´Aquino Faria, Mirelle Micheletto
Carradore, Danielle Bragagnolo Martins, Alexandra Adriana Pissoli, Aline de
Andrade Rodrigues, Andreza Magnabosco Mortari, Caroline Simas, Fernanda
Froner Ambrosini, Gisele Corrêa Plácido, Iris, Jucieli, Nelci Rangel de Amaral,
9
Nilton Lourivaldo de Oliveira, Pedro Ivo Pinheiro Fuchs, Renata de Oliveira, Gelso
Francisco Panho, Eliane Bressa Dalcin e Graciette V. Mottana, pela amizade,
incentivo e auxílio técnico;
Aos secretários Sérgio de Souza e Maria Inês Nava Azevedo do Programa
de Pós-Graduação em Ciência dos Alimentos (PGCAL) e do CAL do CCA da
UFSC, respectivamente, pela amizade, favores prestados e incentivo;
Ao povo brasileiro que, através da Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (CAPES), financiou este trabalho;
A todos os professores, colegas de curso, funcionários e amigos que, de
alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho, muito obrigado.
10
“Não procurem o sucesso.
Quanto mais o procurarem e o
transformarem num alvo, mais vocês
vão errar. Porque o sucesso, como a
felicidade, não pode ser perseguido; ele
deve acontecer” (FRANKL, 1991, p. 11).
11
RESUMO
Alguns microrganismos possuem a capacidade de produzir substâncias
que podem influenciar no desenvolvimento de outros microrganismos. Desde os
anos 50 é relatada a capacidade de várias espécies de bactérias do gênero
Bacillus de produzir substâncias com atividade antimicrobiana como peptídeos,
também denominados de bacteriocinas e enzimas como a subtilisina, subtilina, as
proteases e as termolisinas. Muitos desses peptídeos e enzimas têm sido
caracterizados bioquimicamente e geneticamente. Embora sejam conhecidas, a
função estrutural, a biossíntese e modo de ação de alguns peptídeos
antimicrobianos e enzimas, muitos aspectos desses compostos ainda
permanecem desconhecidos. Frente a essa realidade, o presente estudo
investigou a atividade antibacteriana e antifúngica e a toxicidade in vitro e in vivo
do extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens R 10. O extrato bruto antibacteriano
de Bacillus amyloliquefaciens R 10 foi obtido por técnicas de precipitação de
proteínas, centrifugação, diálise e esterilização por filtração. A padronização das
análises toxicológicas e de atividade antibacteriana e antifúngica foi realizada pela
determinação da concentração de proteínas do extrato bruto de Bacillus
amyloliquefaciens R 10. O ensaio de atividade antibacteriana e antifúngica foi
realizado pela técnica de difusão em poços. Dentre os diferentes indicadores
utilizaram-se bactérias Gram-positivas (Listeria monocytogenes NCTC 098630,
Staphylococcus aureus ATCC 25923 e Enterococcus faecalis ATCC 29212),
Gram-negativas (Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium
ATCC 14028, Enterobacter aerogenes ATCC 13048 e Pseudomonas aeruginosa
ATCC 9027), fungos (Aspergillus fumigatus ATCC 9197 e Penicillium commune
J 238) e leveduras (Rhodotorula muscilaginosa J 350, Pichia anomala DSM 70255
e Kluveromyces marxianus ATCC 16045). O extrato bruto foi testado nas
concentrações de 5, 20, 40, 60 e 80µg de proteínas, em ambos os ensaios de
atividade antimicrobiana. Para avaliar a toxicidade do extrato bruto antibacteriano
de Bacillus amyloliquefaciens R 10 foram utilizados ensaios in vitro
(genotoxicidade) e in vivo (toxicidade aguda em ratos e camundongos e
toxicidade de doses repetidas em camundongos). A investigação da
genotoxicidade com células VERO ATCC-CCL 81 foi realizada pelo ensaio
Cometa, utilizando-se 60, 80 e 100µg de proteínas do extrato bruto. Para análise
toxicológica aguda em ratos Wistar (Rattus norvegicus), utilizou-se um grupo de
10 animais (5 machos e 5 fêmeas) tratado com o extrato bruto, por gavagem oral,
com a dose de 2.000µg/kg (dose máxima recomendada). Os animais foram
pesados no início e no final do experimento e observados por 14 dias quanto aos
possíveis sinais de toxicidade (morte, coma, convulsão, prostração, ataxia,
tremores, alteração na pele ou pêlo, alteração nas mucosas, diarréia e salivação).
Para análise toxicológica aguda em camundongos Swiss (Mus musculus), utilizou-
se o extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 por gavagem
oral, numa única administração, nas doses de 5, 50, 500 e 5.000µg/kg a
80 camundongos (40 machos e 40 fêmeas, contendo 10 animais por grupo).
Outros 20 camundongos (10 machos e 10 fêmeas) receberam veículo (salina,
NaCl 0,9%), pela mesma via. Para análise toxicológica de doses repetidas em
camundongos Swiss (Mus musculus) utilizou-se o extrato bruto antibacteriano de
Bacillus amyloliquefaciens R 10 administrado por gavagem oral, por um período
de 90 dias nas doses de 50, 500 e 5.000µg/kg em 120 animais (60 machos e
12
60 fêmeas, contendo 20 animais por grupo). Outros 40 camundongos (20 machos
e 20 fêmeas) receberam veículo (salina, NaCl 0,9%), pela mesma via. Constatou-
se nos ensaios de atividade antimicrobiana que o extrato bruto de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 não apresentou atividade contra os bolores e as leveduras
nas concentrações testadas, e somente apresentou atividade antibacteriana
frente Listeria monocytogenes NCTC 098630. O extrato bruto antibacteriano de
Bacillus amyloliquefaciens R 10 não foi genotóxico para células VERO na
concentração de 60µg/ml, porém apresentou genotoxicidade nas concentrações
de 80 e 100µg/ml. Na análise toxicológica aguda em ratos a dose letal 50 (DL
50
)
foi superior a 2.000µg/kg. Na análise toxicológica aguda em camundongos, o
extrato bruto apresentou boa tolerabilidade e reduzidos efeitos tóxicos agudos
importantes, com DL
50
superior a 5.000µg/kg. Já na análise toxicológica de doses
repetidas, a non toxic adverse effect level (NOAEL) para o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 situa-se entre as doses de 50 e
500µg/kg. Os resultados indicam que o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 apresenta um grande potencial como conservador natural
de alimentos, dada sua marcante atividade antilisterial e sua relativa segurança
toxicológica.
Palavras-chave: Bacillus amyloliquefaciens, antimicrobianos, toxicidade.
13
ABSTRACT
Some microorganisms are able to produce substances that can influence
the growth of other microorganisms. The ability of various bacterial species of the
genus Bacillus to produce substances with antimicrobial activity such as peptides,
also called bacteriocins, and enzymes such as subtilisin, subtilin, proteases and
thermolysins has been reported since the 1950’s. Many of these peptides and
enzymes have been characterized biochemically and genetically. Although the
structural function, biosynthesis and mode of action of some antimicrobial peptides
and enzymes have been identified, many aspects of these compounds are still
unknown. The present study investigated the antibacterial and antifungal activity
and the in vitro and in vivo toxicity of the crude extract of Bacillus
amyloliquefaciens R 10. The antibacterial crude extract of Bacillus
amyloliquefaciens R 10 was obtained by techniques of protein precipitation,
centrifugation, dialysis and sterilization through filtration. The standardization of
the toxicological analysis, and antibacterial and antifungal activity was realized by
determining the concentration of proteins in the crude extract of Bacillus
amyloliquefaciens R 10. The assay of antibacterial and antifungal activity was
done by agar diffusion technique in wells. Among the different indicators were
used the Gram-positive bacteria (Listeria monocytogenes NCTC 098630,
Staphylococcus aureus ATCC 25923 and Enterococcus faecalis ATCC 29212),
Gram-negative (Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium
ATCC 14028, Enterobacter aerogenes ATCC 13048 and Pseudomonas
aeruginosa ATCC 9027), molds (Aspergillus fumigatus ATCC 9197 and
Penicillium commune J 238), and yeasts (Rhodotorula muscilaginosa J 350, Pichia
anomala DSM 70255 and Kluveromyces marxianus ATCC 16045). The crude
extract was tested in concentrations of 5, 20, 40, 60 and 80µg of protein in both
assays of antimicrobial activity. To evaluate the Bacillus amyloliquefaciens R 10
antibacterial crude extract’s toxicity were used in vitro (genotoxicity) and in vivo
(acute toxicity in rats and mice and repeated doses toxicity in mice) assays. The
research of the genotoxicity with VERO ATCC-CCL 81 cells was made by Comet
assay, using 60, 80 e 100µg of protein of the crude extract. To the acute
toxicological analysis in rats Wistar (Rattus norvegicus), were used one group with
10 animals (5 males and 5 females) treated with the crude extract by oral gavage,
with dose of 2,000µg/kg (maximum dose recommended). The animals were
weighed at the beginning and at the end of the experiment, and observed during
14 days as the possible toxicity signs (death, coma, convulsions, prostration,
ataxy, tremors, skin or hair alterations, mucous alteration, diarrhea and salivation).
To the acute toxicological analysis in Swiss mice (Mus musculus), the antibacterial
crude extract of Bacillus amyloliquefaciens R 10 was used by oral gavage, in a
single administration, in doses of 5, 50, 500 and 5,000µg/kg to 80 mice (40 males
and 40 females, with 10 animals per group). Other 20 mices (10 males and
10 females) received the vehicle (saline, NaCl 0.9%), through the same route. To
the repeated doses toxicological analysis in Swiss mice (Mus musculus) the
antibacterial crude extract of Bacillus amyloliquefaciens R 10 was administrated by
oral gavage during 90 days in doses of 50, 500 and 5,000µg/kg in 120 animals (60
males and 60 females, in groups of 20 animals). Other 40 mice (20 males and 20
females) received the vehicle (saline, NaCl 0.9%), through the same route. It was
verified in the antimicrobial activity assays that the crude extract of Bacillus
14
amyloliquefaciens R 10 didn’t present activity against molds and yeasts in the
tested concentrations, and only presented antibacterial activity against Listeria
monocytogenes NCTC 098630. The antibacterial crude extract of Bacillus
amyloliquefaciens R 10 was not genotoxic to VERO cells at concentration of
60µg/ml, but showed genotoxicity at concentration of 80 and 100µg/ml. In the
acute toxicological analysis in rats the letal dose 50 (DL
50
) was higher than
2,000µg/kg. In the acute toxicological analysis in mice, the crude extract presented
good tolerability and litle important acute toxic effects with DL
50
higher than
5,000µg/kg. In the repeated doses toxicological analysis, a non toxic adverse
effect level (NOAEL) for the antibacterial crude extract is between the doses of 50
and 500µg/kg. The results showed that the antibacterial crude extract of Bacillus
amyloliquefaciens R 10 presents a great potential as a natural food preservative,
due to its notable antilisterial activity, and its relative toxicological security.
Keywords: Bacillus amyloliquefaciens, antimicrobials, toxicity.
15
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS.................................................................................17
LISTA DE ILUSTRAÇÕES....................................................................................19
LISTA DE TABELAS.............................................................................................20
LISTA DE APÊNDICES.........................................................................................23
1 INTRODUÇÃO....................................................................................................24
2 OBJETIVOS........................................................................................................26
2.1 Objetivo geral.................................................................................................26
2.2 Objetivos específicos....................................................................................26
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA..............................................................................27
3.1 Microrganismos de interesse em alimentos...............................................27
3.1.1 Bactérias Gram-positivas..............................................................................28
3.1.2 Bactérias Gram-negativas.............................................................................34
3.1.3 Bolores e leveduras......................................................................................38
3.2 Atividade antimicrobiana..............................................................................39
3.2.1 Substâncias com atividade antimicrobiana...................................................39
3.2.1.1 Classificação..............................................................................................41
3.2.1.2 Definição, composição química e características......................................43
3.2.1.3 Mecanismo de ação...................................................................................45
3.2.1.4 Fatores que afetam a atividade da nisina..................................................48
3.2.2 Bacillus produtores de bacteriocinas............................................................48
3.2.3 Métodos para detecção da atividade antimicrobiana....................................52
3.2.4 Enzimas produzidas por Bacillus spp...........................................................54
3.3 Aplicação de substâncias antimicrobianas na conservação e
processamento de alimentos..............................................................................57
3.4 Segurança de bacteriocinas e enzimas produzidas por Bacillus spp......61
4 MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................................66
4.1 Atividade antimicrobiana do extrato bruto de Bacillus
amyloliquefaciens R 10.......................................................................................67
4.1.1 Obtenção do extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens
R 10........................................................................................................................67
4.1.2 Dosagem de proteínas do extrato bruto........................................................69
16
4.1.3 Avaliação da atividade antibacteriana...........................................................69
4.1.4 Avaliação da atividade antifúngica................................................................70
4.2 Toxicidade do extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 in vitro........................................................................71
4.2.1 Genotoxicidade.............................................................................................71
4.3 Toxicidade do extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 in vivo.........................................................................75
4.3.1 Análise toxicológica aguda em ratos.............................................................76
4.3.2 Análise toxicológica aguda em camundongos..............................................77
4.3.3 Análise toxicológica de doses repetidas.......................................................79
4.4 Análise estatística..........................................................................................82
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO..........................................................................84
5.1 Dosagem de proteínas do extrato bruto......................................................84
5.2 Atividade antibacteriana................................................................................84
5.3 Atividade antifúngica.....................................................................................88
5.4 Genotoxicidade..............................................................................................90
5.5 Análise toxicológica aguda em ratos...........................................................92
5.6 Análise toxicológica aguda em camundongos...........................................94
5.7 Análise toxicológica de doses repetidas...................................................108
6 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS................................................129
7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS...............................................130
REFERÊNCIAS...................................................................................................131
APÊNDICES........................................................................................................147
17
LISTA DE ABREVIATURAS
AS – ágar sangue.
ATCC – American Type Culture Collection.
BAL - bactérias láticas.
CDC - National Center for Infectious Diseases.
CEUA - Comitê de Ética no Uso de Animais.
DL
50
– dose letal mediana 50.
DMSO – dimetilsulfóxido.
FAO – Food and Agriculture Organization (comitê conjunto da organização para
alimentação e agricultura).
FDA – Food and Drug Administration (órgão que regulamenta o uso de alimentos
e medicamentos nos Estados Unidos).
FFDCA – Federal Food, Drug and Cosmetic Act (órgão federal que regulamenta o
uso de alimentos, medicamentos e cosméticos nos Estados Unidos).
FPM – força próton-motriz.
xg – giros.
GRAS – Substances Generally Recognized as Safe (substâncias geralmente
reconhecidas como seguras).
IDA – ingestão diária aceitável para o homem.
ISP – Intracelular Serine Protease (serina protease intracelular).
IV – via venosa.
kDa – kilodaltons.
MEM – meio mínimo essencial.
MTT – sal de tetrazólio.
NIS – N-inhibitory substances (substância N-inibitória).
NOAEL - non toxic adverse effect level (dose sem efeito observado).
OMS – Organização Mundial da Saúde.
PAGE – gel de poliacrilamida.
PBS – tampão fosfato de sódio.
PDA – ágar dextrose batata.
ppm – partes por milhão.
SDA – ágar dextrose sabouraud.
SDS – dodecil sulfato de sódio.
18
SFB – soro fetal bovino.
SLO – estreptolisina.
SNK – teste de comparações múltiplas Student-Newman-Keuls.
TSA-YE – ágar triptona de soja suplementado com extrato de levedura.
TSB-YE – caldo triptona de soja suplementado com extrato de levedura.
UFC/g – unidades formadoras de colônia por grama.
UFC/ml – unidades formadoras de colônia por mililitro.
UI – Unidades Internacionais.
v.o. – via oral.
19
LISTA DE ILUSTRAÇÕES
Figura 1 - Estrutura da nisina A.............................................................................44
Figura 2 - Modelos propostos para a formação de poros pela nisina....................47
Figura 3 - Diferenciação das classes dos cometas em ensaios de
genotoxicidade.......................................................................................75
Figura 4 - Atividade antibacteriana do extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens
R 10, em diferentes concentrações (µg de proteínas), frente Listeria
monocytogenes NCTC 098630 previamente inoculada em placa de
TSA-YE e incubada a 35
o
C por 24h. SI – sem inoculação................85
Figura 5 - Efeito do tratamento agudo (14 dias) realizado com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 (5 - 5.000 µg/kg)
ou veículo, administrado pela via oral, numa única administração,
sobre o peso corporal absoluto de camundongos machos (A) e
fêmeas (B). Cada ponto representa a média de 10 animais e
as linhas verticais representam o erro padrão da média.
Difere significativamente do grupo controle (veículo, C): *p<0,05 e
**p<0,01...............................................................................................102
Gráfico 1 - Atividade antibacteriana do extrato bruto de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 e nisina comercial (Nisaplin
®
) em placas
de TSA-YE incubadas a 35
o
C por 24h, utilizando Listeria
monocytogenes NCTC 098630 como microrganismo indicador. .......86
Quadro 1 - Classificação das bacteriocinas...........................................................42
Quadro 2 - Fluxograma do processo de obtenção do extrato bruto antibacteriano
de Bacillus amyloliquefaciens R 10.....................................................68
20
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Avaliação da genotoxicidade do extrato bruto antibacteriano de
Bacillus amyloliquefaciens R 10 utilizando-se células VERO.............90
Tabela 2 - Variação do peso dos ratos tratados com 2.000µg/kg do extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, por via oral,
durante 14 dias....................................................................................93
Tabela 3 - Efeito do tratamento agudo realizado com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 observado 0,25,
0,5, 1, 2, 4, 8 e 24h após sua administração pela via oral, sobre
alguns parâmetros comportamentais indicativos de toxicidade
aguda em camundongos machos.......................................................95
Tabela 4 - Efeito do tratamento agudo realizado com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 observado 0,25,
0,5, 1, 2, 4 , 8 e 24h após sua administração pela via oral, sobre
alguns parâmetros comportamentais indicativos de toxicidade
aguda em camundongos fêmeas........................................................97
Tabela 5 - Efeito do tratamento agudo realizado com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, administrado
pela via oral, sobre a variação da massa corporal de camundongos
analisados do 1º ao 14º dia após o tratamento.................................100
Tabela 6 - Efeito do tratamento agudo realizado com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, administrado
pela via oral, sobre a variação do consumo médio de ração e água
de camundongos no final do tratamento...........................................101
Tabela 7 - Efeito do tratamento agudo realizado com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, administrado
pela via oral, sobre o peso relativo do baço, rins, coração, pulmão,
fígado, linfonodo mesentérico, glândula adrenal, timo, estômago,
encéfalo, testículos e glândula salivar de camundongos machos....103
21
Tabela 8 - Efeito do tratamento agudo realizado com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, administrado
pela via oral, sobre o peso absoluto do baço, rins, coração,
pulmão, fígado, linfonodo mesentérico, glândula adrenal, timo,
estômago, encéfalo, testículos e glândula salivar de camundongos
machos..............................................................................................104
Tabela 9 - Efeito do tratamento agudo realizado com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, administrado
pela via oral, sobre o peso relativo do baço, rins, coração,
pulmão, fígado, linfonodo mesentérico, glândula adrenal, timo,
estômago, ovário e tubas uterinas, encéfalo e glândula salivar de
camundongos fêmeas.......................................................................105
Tabela 10 - Efeito do tratamento agudo realizado com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, administrado
pela via oral, sobre o peso absoluto do baço, rins, coração, pulmão,
fígado, linfonodo mesentérico, glândula adrenal, timo, estômago,
encéfalo, ovário e tubas uterinas, encéfalo e glândula salivar de
camundongos fêmeas.......................................................................106
Tabela 11 - Relação do período e número de camundongos machos ou
fêmeas que morreram ao longo do tratamento realizado com o
extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 ou
veículo (10 ml/kg), administrado pela via oral, durante 90 dias......109
Tabela 12 - Efeito do tratamento por doses repetidas, durante 90 dias
consecutivos realizado com o extrato bruto antibacteriano de
Bacillus amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre
a variação de peso corporal de camundongos ao longo do
tratamento.........................................................................................110
Tabela 13 - Efeito do tratamento prolongado durante 90 dias consecutivos
realizado com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre a
variação do consumo médio de ração e água de camundongos no
final do tratamento.............................................................................113
22
Tabela 14 - Efeito do tratamento prolongado durante 90 dias consecutivos
realizado com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre alguns
parâmetros hematológicos em camundongos..................................115
Tabela 15 - Efeito do tratamento prolongado durante 90 dias consecutivos
realizado com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre o número
diferencial de células sangüíneas em camundongos........................116
Tabela 16 - Efeito do tratamento prolongado durante 90 dias consecutivos
realizado com extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre alguns
parâmetros bioquímicos do sangue em camundongos machos.......118
Tabela 17 – Efeito do tratamento prolongado durante 90 dias consecutivos
realizado com extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre alguns
parâmetros bioquímicos do sangue em camundongos fêmeas........121
Tabela 18 - Efeito do tratamento prolongado durante 90 dias consecutivos
realizado com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre o peso
relativo do baço, rins, coração, pulmão, fígado, linfonodo
mesentérico, glândula adrenal, timo, estômago, encéfalo,
testículo/ovário e glândula salivar de camundongos ........................124
Tabela 19 - Efeito do tratamento prolongado durante 90 dias consecutivos
realizado com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre o peso
absoluto do baço, rins, coração, pulmão, fígado, linfonodo
mesentérico, glândula adrenal, timo, estômago, encéfalo,
testículo/ovário e glândula salivar de camundongos........................126
23
LISTA DE APÊNDICES
APÊNDICE A.......................................................................................................148
APÊNDICE B.......................................................................................................152
APÊNDICE C.......................................................................................................160
APÊNDICE D.......................................................................................................170
APÊNDICE E.......................................................................................................176
24
1 INTRODUÇÃO
Alimentos, industrializados ou não, podem conter uma ampla variedade e
quantidade de microrganismos, que podem interferir em sua vida útil ou causar
doenças. Existem inúmeros recursos para eliminar esses microrganismos ou
controlar seu desenvolvimento nos alimentos, incluindo tratamento térmico,
adição de conservadores químicos e uso de baixa temperatura durante o
armazenamento. No entanto, a cada dia aumenta a procura por alimentos, que
não tenham sido submetidos a nenhum tipo de processamento industrial, e que
não sejam adicionados de produtos químicos. Com isso, aumenta também a
preocupação dos fabricantes de alimentos em produzir alimentos que não
necessitem desses procedimentos para que sejam saudáveis e para que atendam
os parâmetros de qualidade e segurança exigidos pelos consumidores
(MURIANA, 1996; DE MARTINIS; ALVES; FRANCO, 2002).
Assim, deu-se o início do uso de bioconservadores, onde o
desenvolvimento de microrganismos em alimentos é controlado pela adição de
substâncias conhecidas como bacteriocinas, que são peptídeos antimicrobianos
produzidos por uma grande variedade de bactérias, particularmente bactérias
láticas (BAL) e espécies do gênero Bacillus (CLEVELAND et al., 2001; PALMER,
2004).
A natureza química das bacteriocinas e de várias toxinas (hemolisinas) faz
com que essas substâncias sejam degradadas no trato gastrintestinal de homens
e animais, muitas vezes perdendo sua toxicidade (PIARD et al., 1992). Segundo
Marugg (1991), estudos realizados com várias bacteriocinas indicaram que elas
não são tóxicas nem provocam reações imunológicas e, por isso, possuem
grande potencial como conservadores naturais em alimentos. Até o presente, as
únicas bacteriocinas produzidas para conservação de alimentos são a nisina e a
pediocina PA-1, vendidas com os nomes comerciais de Nisaplin
®
e Alta
®
,
respectivamente (MORENO et al.,1999; DEEGAN et al., 2006).
25
Frente a essa realidade, Schulz (2003) investigou a citotoxicidade do
extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens R 10, isolado por Batista (1993).
Em continuidade aos estudos realizados, esse trabalho teve como objetivo
investigar a toxicidade do extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens R 10, bem
como estudar seu espectro de atividade antibacteriana e antifúngica, com o intuito
de utilizá-lo como conservador natural de alimentos.
26
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo geral
Investigar a atividade antibacteriana, atividade antifúngica e a toxicidade in
vitro e in vivo do extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens R 10.
2.2 Objetivos específicos
. Investigar o espectro de atividade antibacteriana e antifúngica do extrato
bruto de Bacillus amyloliquefaciens R 10;
. Investigar o potencial de genotoxicidade do extrato bruto de Bacillus
amyloliquefaciens R 10;
. Verificar o comportamento do extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens
R 10 quando submetido à análise toxicológica oral aguda em ratos Wistar (Rattus
norvegicus);
. Investigar a toxicidade do extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens R 10
administrado agudamente e por dose repetida pela via oral em camundongos
Swiss (Mus musculus).
27
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
3.1 Microrganismos de interesse em alimentos
A manipulação e a exposição de alimentos antes, durante ou após o seu
preparo podem introduzir contaminantes capazes de causar infecções ou
intoxicações alimentares. Quando tal efeito ocorre em alimentos a gravidade e
dimensões do surto são imprevisíveis (JAY; LOESSNER; GOLDEN, 2005).
As toxinfecções alimentares são doenças que apresentam principalmente
sintomas gastrintestinais e possuem um período de incubação relativamente
curto; adquiridas pelo consumo de alimentos contendo microrganismos
patogênicos, substâncias tóxicas, químicas, de origem física ou biológicas
(HAZELWOOD; McLEAN, 1994).
O National Center for Infectious Diseases (CDC) estima que existam
anualmente nos Estados Unidos 76 milhões de casos de doenças transmitidas
por alimentos, com 325.000 hospitalizações e 5.000 óbitos (CDC, 2008).
Os microrganismos presentes nos alimentos podem ser classificados em
deteriorantes, patogênicos e os causadores de alterações benéficas nos
alimentos. Os deteriorantes (bolores e as leveduras) são os causadores de
alterações químicas prejudiciais como: alterações de cor, odor, sabor, textura e
aspecto do alimento. Os microrganismos patogênicos, como Listeria
monocytogenes, Staphylococcus aureus, Escherichia coli e Salmonella sp., são
os que podem representar um risco à saúde, chegando até o alimento por
condições precárias de higiene durante a produção, armazenamento, distribuição
ou manuseio; podendo afetar tanto o homem como animais. Em contrapartida, os
microrganismos benéficos são adicionados aos alimentos intencionalmente para
que determinadas reações químicas sejam realizadas ou apenas estimulados
seletivamente no próprio alimento, como ocorre nos queijos, pães e vinhos, onde
estão presentes naturalmente (FRANCO; LANDGRAF, 2003; JAY; LOESSNER;
GOLDEN, 2005).
28
Alguns microrganismos são também utilizados como indicadores da
qualidade higiênico-sanitária dos alimentos ou de contaminação fecal, como os
coliformes a 35ºC, coliformes a 45ºC e Escherichia coli e os enterococos
(FRANCO; LANDGRAF, 2003).
Existem relatos sobre casos de toxinfecção alimentar por cepas mesófilas
de enterococos e Pseudomonas, quando presentes em números elevados,
embora não sejam patogênicas via alimento (FRANCO; LANDGRAF, 2003).
Nos últimos anos, várias bacteriocinas têm sido testadas contra
microrganismos patogênicos e deteriorantes de alimentos com intuito de fornecer
para a população alimentos cada vez mais seguros (CLEVELAND et al., 2001;
DEEGAN et al., 2006).
3.1.1 Bactérias Gram-positivas
a) Listeria monocytogenes
Listeriose é uma doença infecciosa causada pela bactéria Listeria
monocytogenes. As investigações epidemiológicas dos surtos de listeriose
mostraram a sua freqüente etiologia veiculada por alimentos. Listeria
monocytogenes distribui-se amplamente pela natureza em todo o mundo,
podendo ser recuperada da água, solo, vegetação em decomposição, grãos,
esgotos, insetos, crustáceos, peixes, pássaros, assim como de mamíferos
selvagens e domésticos. O estado de portador intestinal assintomático em seres
humanos é observado em 1 a 5% dos adultos (BENNETT; GOLDMAN, 2001).
Listeria monocytogenes é um patógeno com bastante impacto na saúde
pública. O perigo desse microrganismo como risco associado aos alimentos é, em
grande parte, devido à sua capacidade de se adaptar a condições disgenésicas,
tanto em nível do ambiente exterior que antecede a ingestão dos alimentos como
também no interior do hospedeiro (GUERRA; BERNARDO, 2006).
29
Listeria monocytogenes é um patógeno intracelular facultativo, capaz de se
multiplicar nos monócitos-macrófagos não imunes. A hemolisina listeriolisina O
constitui um importante fator de virulência nesse processo. A fagocitose da
bactéria estimula a sua produção; a listeriolisina O liga-se ao colesterol nas
membranas celulares, resultando em sua ruptura, propriedade que permite ao
microrganismo escapar dos fagolisossomas, permanecendo no citoplasma, onde
se multiplica. Listeria migra para a periferia celular, cria protrusões da membrana
externa, sendo ingerida por células adjacentes. Assim, o microrganismo propaga-
se diretamente de uma célula para outra, evitando o ambiente extracelular. Com
isso, é capaz de causar doenças invasivas sérias, especialmente em hospedeiros
imunodeprimidos, neonatos e fetos. Adultos imunodeprimidos podem desenvolver
meningoencefalite e bacteremia (McLAUCHLIN, 1987; KEROUANTON et al.,
1998; BENNETT; GOLDMAN, 2001).
O período de incubação da listeriose varia de horas a semanas. O
reconhecimento de Listeria monocytogenes como patógeno veiculado por
alimentos levou à descoberta de que a listeriose pode manifestar-se na forma de
febre, diarréia e dor abdominal em cólica durante um a dois dias (BENNETT;
GOLDMAN, 2001).
Um terço dos casos de listeriose é associado à gestação. Com mais
freqüência, no terceiro trimestre a mãe desenvolve uma doença gripal, com febre,
dor de garganta, mialgia, dor abdominal em cólica e diarréia. Depois de três a
sete dias, ocorrem trabalho de parto prematuro ou aborto. A transmissão
transplacentária da doença torna-se clinicamente evidente no recém-nascido
algumas horas após o parto. Essa grave doença septicêmica é conhecida como
granulomatose infantosséptica. Os neonatos também podem contrair essa doença
no canal de parto, ou como infecção hospitalar, no berçário; a doença manifesta-
se como anorexia, febre ou meningismo (BENNETT; GOLDMAN, 2001).
A ampicilina é o antibiótico de escolha para o tratamento da listeriose,
podendo ser administrada mesmo durante a gravidez e a lactância. A dose
padrão para os pacientes com meningite é de 200mg/kg/dia em seis doses
30
fracionadas, administrada por via venosa (IV), durante três semanas (BENNETT;
GOLDMAN, 2001).
Diferentes tipos de alimentos podem apresentar Listeria monocytogenes.
No entanto, os produtos de laticínios e, mais recentemente, os derivados de carne
e aves são os mais envolvidos com casos de listeriose (FARBER et al., 1993).
Queijos macios e semi-macios produzidos e importados pela Suécia foram
analisados quanto à presença de Listeria monocytogenes. Esse patógeno foi
detectado em 6% das 333 amostras estudadas. Os queijos fabricados com leite
cru apresentaram maior incidência de Listeria monocytogenes (42%) que os
queijos fabricados com leite termicamente tratado (2%). O número de Listeria
monocytogenes detectado nos referidos queijos, variou de <1x10
2
a 1x10
5
unidades formadoras de colônia por grama (UFC/g). Sendo assim, os
pesquisadores afirmaram que o uso do leite cru para a fabricação de queijos
representa um risco à saúde pública (LONCAREVIC; DANIELSSON-THAM;
THAM,1995).
No Brasil, 103 amostras de vários tipos de queijos, produzidos na cidade
do Rio de Janeiro foram analisadas para verificar a incidência de Listeria
monocytogenes e outras espécies de Listeria. Entre as amostras analisadas, 11
(10,68%) continham Listeria monocytogenes, 13 (12,62%) Listeria innocua, 6
(5,83%) Listeria grayi e 1 (0,97%) Listeria welshimeri. Nos queijos Minas Frescal,
fabricados artesanalmente, foi encontrado um alto nível de contaminação; sendo
que, das 17 amostras analisadas, 7 (41,17%) continham Listeria monocytogenes.
Em queijos fabricados industrialmente como Ricota e Minas frescal, 3,03% das
amostras estavam contaminadas com esse patógeno. Nos queijos maturados
como o Gorgonzola, Brie e Roquefort, Listeria monocytogenes foi encontrada em
5,67% das amostras. De acordo com os pesquisadores, dois fatores podem ter
contribuído para essa contaminação. Primeiro, a bactéria lática utilizada no
processamento não inibiu completamente Listeria monocytogenes e, segundo, um
rápido aumento do pH durante a maturação dos queijos permitiu o crescimento
desse microrganismo (SILVA; HOFER; TIBANA, 1998).
31
Na cidade de Goiânia, 100 amostras de leite foram analisadas, com intuito
de verificar a presença de Listeria spp. Das amostras analisadas, 50 eram de leite
cru e as outras 50 de leite pasteurizado. Listeria foi isolada de 8% das amostras
de leite cru, mas não foi encontrada em amostras de leite pasteurizado
(OLIVEIRA et al., 1998).
Baseados na gravidade da listeriose e no fato de que a dose oral
necessária para causar infecção em indivíduos saudáveis ou susceptíveis não é
conhecida, foi determinada tolerância zero para Listeria monocytogenes em
alimentos de vários países, incluindo os Estados Unidos, mas os surtos
continuam a ocorrer (SAMELIS; METAXOPOULOS, 1999; DEEGAN et al., 2006).
No Brasil, a Resolução RDC n
o
12/2001 estabelece a ausência de Listeria
monocytogenes em 25g de amostra de queijos de média (36%), alta (46%) e
muito alta (55%) umidade, exceto os temperados, condimentados, adicionados de
ervas ou outros ingredientes (BRASIL, 2001).
Nos últimos anos têm sido publicados vários trabalhos que demonstram a
resistência térmica de Listeria monocytogenes ligada a fatores de adaptação,
como a temperatura de incubação, tratamentos térmicos subletais precedentes à
pasteurização, pH e a concentração de solutos do meio e uma recuperação
anaeróbia das células danificadas pelo calor. Por outro lado, a capacidade desse
microrganismo para se multiplicar a temperaturas de refrigeração constitui uma
característica relevante em termos de segurança sanitária, principalmente no que
se refere aos alimentos refrigerados. Também a adaptação à acidez ou à elevada
osmolaridade é um aspecto da maior importância a ser considerado, pois pode
corresponder a um fator que influencia na sobrevivência desse microrganismo nos
alimentos (especialmente os fermentados e curados) e nas superfícies de
trabalho (biofilmes). Esse comportamento de tolerância e até de adaptação de
Listeria monocytogenes, face à aplicação de agentes e situações de exclusão e
controle microbiológico habitualmente utilizados na produção de alimentos,
constitui uma preocupação nos programas de higienização e de controle da
produção de alimentos (BHATTI; VEERAMACHANENI; SHELEF, 2004;
BOZIARIS; NYCHAS, 2006; GUERRA; BERNARDO, 2006).
32
Martínez e Rodrígues (2005) investigaram a segurança do uso de nisina
em alimentos, frente ao risco de ocorrência de resistência cruzada com alguns
antibióticos de uso clínico. Adicionalmente, relatam que algumas cepas de Listeria
monocytogenes isoladas do leite são resistentes a essa bacteriocina, porém não
conseguiram estabelecer uma correlação entre resistência a nisina e o uso de
antibióticos de amplo espectro, sugerindo um estudo futuro com maior número de
cepas de Listeria monocytogenes isoladas de diferentes alimentos.
Frente a essa realidade, várias pesquisas nos últimos anos têm sido
direcionadas para busca de novos bioconservadores ativos contra Listeria
monocytogenes (ZHENG; SLAVIK, 1999; DE MARTINIS; ALVES; FRANCO,
2002).
b) Staphylococcus aureus
As bactérias do gênero Staphylococcus são pertencentes à família
Micrococcaceae, sendo Staphylococcus aureus a espécie mais frequentemente
associada às doenças estafilocócicas, quer sejam de origem alimentar ou não. Os
estafilococos são bactérias mesófilas apresentando temperatura de crescimento
na faixa de 7 a 47,8
o
C; as enterotoxinas são produzidas em temperatura ótima
entre 40 e 45
o
C (FRANCO; LANDGRAF, 2003; JAY; LOESSNER; GOLDEN,
2005).
O agente causal da intoxicação (sintomas: náuseas, vômitos, cãibras
abdominais, diarréia e sudorese) são as várias toxinas (A, B, C
1
, C
2
, C
3
, D, E)
produzidas por esta bactéria (10
5
a 10
6
unidades formadoras de colônias por
grama de alimento para que esta seja produzida), apresentando um período de
incubação de 30 minutos a 8 horas (JAY; LOESSNER; GOLDEN, 2005).
O homem e os animais são os principais reservatórios de Staphylococcus
aureus. A cavidade nasal é o principal habitat dos estafilococos no homem e, a
partir desse foco atingem tanto a epiderme e feridas como a água, solo, leite,
esgoto e qualquer superfície ou objeto que tenha entrado em contato com o
homem. Nos alimentos contaminados que não são cozidos ou refrigerados
33
adequadamente e que permanecem a temperatura ambiente por muito tempo
pode ocorrer a multiplicação do Staphylococcus aureus e a produção da toxina
(FRANCO; LANDGRAF, 2003).
Para prevenir a intoxicação estafilocócica, é importante manter os
alimentos sob refrigeração, manipulá-los corretamente, bem como submetê-los ao
aquecimento após a sua manipulação (FRANCO; LANDGRAF, 2003).
c) Enterococcus faecalis
Os enterococos, antes um subgrupo do gênero Streptococcus, a partir de
1984 passaram a pertencer ao gênero Enterococcus. As espécies de enterococos
com maior importância em microbiologia de alimentos são Enterococcus faecalis
e Enterococcus faecium (FRANCO; LANDGRAF, 2003).
A utilização dos enterococos como indicadores de contaminação fecal dos
alimentos apresenta algumas restrições, pois também são encontrados em
ambientes diferentes do trato intestinal. Além disso, apresentam uma sobrevida
maior do que outros enteropatógenos no solo, vegetais e em alimentos,
principalmente naqueles submetidos à desidratação, ação de desinfetantes e a
flutuações de temperatura (FRANCO; LANDGRAF, 2003).
Apesar dessas limitações, os enterococos em números elevados em
alimentos indicam práticas sanitárias inadequadas ou exposição do alimento a
condições que permitiram a multiplicação de microrganismos indesejáveis
(FRANCO; LANDGRAF, 2003).
Enterococcus faecalis e Enterococcus faecium produzem uma síndrome
clínica similar à intoxicação por estafilococos com diarréia, cólica abdominal,
náusea, vômito, febre, calafrio e vertigem, sendo a dose infectante maior que 10
7
microrganismos. O reservatório é o ser humano. O período de incubação varia de
2 a 36 horas. A transmissão dos enterococos ocorre por alimentos preparados
sob precárias condições sanitárias ou por manipuladores doentes (FDA, 2006).
34
As principais medidas preventivas de surtos são: (i) o afastamento de
manipuladores doentes, (ii) a manipulação correta dos alimentos e (iii) evitar a
ingestão de leite e derivados não pasteurizados (FDA, 2006).
Recentemente, Enterococcus é o gênero que apresenta a maior
preocupação quanto à resistência aos antibióticos, sendo isolado em casos de
endocardite, bacteremia e de infecção hospitalar. Algumas cepas desse
microrganismo mostram-se resistentes a todos os antibióticos conhecidos
(BENNETT; GOLDMAN, 2001; POETA; ANTUNES; RODRIGUES, 2005).
3.1.2 Bactérias Gram-negativas
a) Escherichia coli
O grupo dos coliformes a 35ºC é composto por microrganismos da família
Enterobacteriaceae, fazendo parte deste grupo predominantemente bactérias
pertencentes aos gêneros Escherichia, Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella.
Destas, apenas Escherichia coli tem como hábitat primário o trato intestinal do
homem e animais, sendo que as demais podem ser encontradas em outros
ambientes como vegetais e solo (JAY; LOESSNER; GOLDEN, 2005).
As bactérias pertencentes ao grupo dos coliformes a 45ºC, correspondem
as do grupo dos coliformes a 35ºC que apresentam a capacidade de continuar
fermentando lactose com produção de gás, quando incubadas à temperatura de
44-45,5
o
C por 24 horas. Nestas condições, cerca de 90% das culturas de
Escherichia coli são positivas, enquanto que, nos demais gêneros, apenas
algumas cepas de Enterobacter e Klebsiella mantém essa característica (SILVA;
JUNQUEIRA; SILVEIRA, 1997).
A pesquisa de coliformes a 45ºC ou de Escherichia coli nos alimentos
fornece, com maior segurança, informações sobre as condições higiênicas do
produto e indica uma eventual presença de patógenos (JAY; LOESSNER;
GOLDEN, 2005).
35
Baseando-se nos fatores de virulência, manifestações clínicas e
epidemiologia, as linhagens de Escherichia coli consideradas patogênicas são
atualmente agrupadas em seis classes: Escherichia coli enteropatogênica
clássica - EPEC, Escherichia coli enteroinvasiva - EIEC, Escherichia coli
enterotoxigênica - ETEC, Escherichia coli enterohemorrágica - EHEC, Escherichia
coli enteroagregativa - EAggEC e Escherichia coli facultativamente patogênica -
FEEC (JAY; LOESSNER; GOLDEN, 2005).
A diarréia provocada por EPEC é geralmente acompanhada de dores
abdominais, vômitos e febre, sendo que a duração da doença varia de seis a três
dias, com período de incubação variando entre 17 e 72 horas. A gastrenterite
provocada por EIEC é bastante semelhante àquela provocada por Shigella,
caracterizada por disenteria, cólicas abdominais, febre e mal-estar geral, com
eliminação de sangue e muco com as fezes. O período de incubação varia entre 8
e 24 horas. As bactérias pertencentes ao grupo da ETEC são importantes
causadoras de diarréia em países subdesenvolvidos, nas regiões endêmicas,
caracterizando-se pela diarréia aquosa, normalmente acompanhada de febre
baixa, dores abdominais e náuseas. A dose de infecção é de 10
6
a 10
8
células. A
colite hemorrágica causada pela EHEC é caracterizada clinicamente por dores
abdominais severas e diarréia aguda, seguida de diarréia sanguinolenta, diferindo
das manifestações clínicas causadas por outros agentes invasores; pela grande
quantidade de sangue nas fezes e ausência de febre, tendo um período de
incubação de quatro dias (FRANCO; LANDGRAF, 2003; JAY; LOESSNER;
GOLDEN, 2005).
A prevenção de muitas infecções entéricas por Escherichia coli está
relacionada ao desenvolvimento econômico básico, a condições sanitárias
adequadas e ao fornecimento de água de boa qualidade e em quantidade
suficiente. As pessoas devem realizar a desinfecção dos alimentos crus (com uso
de cloro), bem como o cozimento adequado da carne e leite e utilizar as boas
práticas de fabricação e de higiene pessoal (BENNETT; GOLDMAN, 2001).
36
b) Salmonella typhimurium
Salmonella é um gênero da família Enterobacteriaceae que pode causar
um estado de portador intestinal assintomático ou doença clínica tanto em seres
humanos quanto em animais (BENNETT; GOLDMAN, 2001; JAY; LOESSNER;
GOLDEN, 2005).
Atualmente, Salmonella é um dos microrganismos mais frequentemente
envolvidos em casos e surtos de doenças de origem alimentar em diversos
países, inclusive no Brasil, estando amplamente distribuídas na natureza, sendo o
trato intestinal do homem e de animais o seu principal reservatório natural
(FRANCO; LANDGRAF, 2003).
As doenças causadas por Salmonella costumam ser subdivididas em três
grupos: a febre tifóide (sintomas: febre alta, diarréia e vômitos), causada por
Salmonella Typhi, as febres entéricas (sintomas: diarréia, vômitos, febre e
geralmente septicemia), causadas por Salmonella paratyphi (A, B e C) e as
enterocolites ou salmoneloses (sintomas: diarréia, febre, dores abdominais e
vômitos) causadas pelas demais salmonelas. O estabelecimento dos sintomas de
salmonelose, bem como sua gravidade, depende do sorotipo da Salmonella
envolvido, da competência dos sistemas de defesa inespecíficos e específicos do
indivíduo e também das características do alimento envolvido (JAY; LOESSNER;
GOLDEN, 2005).
Salmonella Enteritidis e Salmonella typhimurium são as causas mais
comuns de doença em seres humanos, e constituem quase 50% dos
microrganismos isolados no homem. Em geral são necessários grandes inóculos
(10
7
bactérias) para provocar infecção clínica no hospedeiro normal (BENNETT;
GOLDMAN, 2001).
A salmonelose é transmitida por alimentos contaminados e ingeridos crus
ou mal cozidos, sendo a carne de frango e ovos os mais envolvidos nos casos de
surtos. Os sintomas aparecem em média de 12 a 36 horas após o contato com o
microrganismo (FRANCO; LANDGRAF, 2003).
37
A melhor maneira de prevenir a infecção por Salmonella consiste no
tratamento adequado dos suprimentos de água e esgoto e refrigeração de
alimentos derivados de produtos animais, pasteurização do leite e laticínios,
assim como a lavagem das mãos antes do preparo dos alimentos e depois do
manuseio de produtos animais crus. O calor é uma forma eficiente para a
destruição de salmonelas nos alimentos, bem como a utilização da chamada
exclusão competitiva, que consiste no tratamento dos animais recém-nascidos
com culturas microbianas mistas contendo bactérias inócuas, que vão ocupar os
sítios de adesão das salmonelas, excluindo-as da biota intestinal dos animais
(BENNETT; GOLDMAN, 2001; FRANCO; LANDGRAF, 2003).
c) Enterobacter aerogenes
Microrganismos do gênero Enterobacter, pertencentes à miscelânea
entérica, têm sido apontados como causas de doenças gastrintestinais agudas e
crônicas, haja vista que podem se transformar transitoriamente em virulentos por
adquirirem elementos genéticos de mobilidade de outros patógenos (FDA, 2007).
A gastrenterite aguda é caracterizada por dois ou mais sintomas: vômito,
náusea, febre, calafrio, dor abdominal, diarréia ocorrendo 12 a 24 horas após a
ingestão do alimento ou água contaminada. A forma crônica é caracterizada pelos
sintomas disentéricos: gosto ruim na boca, fezes diarréicas com muco, flatulência
e distensão abdominal, podendo continuar por meses e requerendo tratamento
com antibiótico. A dose infecciosa é desconhecida. Suspeita-se que ambas
formas da doença resultam da elaboração de enterotoxinas (FDA, 2007).
Esses microrganismos têm sido isolados principalmente de laticínios,
crustáceos e vegetais frescos crus, onde causam deterioração e reduzem a vida-
de-prateleira desses alimentos (FDA, 2007).
d) Pseudomonas aeruginosa
Pseudomonas aeruginosa é encontrada no solo, água e plantas, podendo
também ser um comensal em animais e seres humanos. Esse microrganismo
38
causa deterioração (modificação no aroma, aumento do pH, amolecimento e
liquefação, limosidade na superfície do alimento, hidrólise e oxidação de
gorduras) nos alimentos ricos em proteínas, como leite, carne e ovos (BENNETT;
GOLDMAN, 2001; FRANCO; LANDGRAF, 2003).
É comumente encontrada em exaustores, sifão de esgotos, máquinas de
gelo e cozinhas hospitalares, onde torna-se um problema particular, pois suporta
a ação de vários desinfetantes e mostra-se resistente a uma ampla variedade de
agentes antimicrobianos. Pseudomonas aeruginosa causa bacteremia hospitalar,
pneumonia hospitalar, infecção hospitalar das vias urinárias, infecção de feridas
cirúrgicas e queimaduras, endocardite, otite e raros casos de meningite
(BENNETT; GOLDMAN, 2001).
A infecção por Pseudomonas ocorre em três estágios distintos: (i) fixação e
colonização bacteriana; (ii) invasão local e (iii) disseminação pela corrente
sangüínea e doença sistêmica. Esses estágios são relacionados ao fato de tal
microrganismo ser tanto invasivo quanto toxigênico (BENNETT; GOLDMAN,
2001).
3.1.3 Bolores e leveduras
Os bolores são em sua maioria aeróbios, formados por filamentos
denominados hifas, que, em conjunto, formam o micélio, que promove a fixação
do bolor ao substrato e a reprodução, através da produção de esporos. O micélio
dos bolores é o responsável pelo aspecto característico das colônias, podendo
estas terem aspecto cotonoso, serem secas, úmidas, compactas, aveludadas,
gelatinosas e com variadas colorações. A presença de certos gêneros em
alimentos, como Aspergillus, Penicillium e Rhizopus, está relacionada com a
deterioração, principalmente nos produtos de origem vegetal (FRANCO;
LANDGRAF, 2003; JAY; LOESSNER; GOLDEN, 2005).
Além de causarem a deterioração, algumas espécies de fungos quando em
condições ideais de crescimento nos alimentos produzem toxinas, denominadas
micotoxinas, que quando ingeridas causam uma doença ou síndrome
39
denominada micotoxicose. Dentre os principais fungos de estocagem produtores
de micotoxinas estão os gêneros Aspergillus e Penicillium. Penicillium comune
produz a micotoxina Ocratoxina A, responsável por nefropatia e necrose nas
células periportais hepáticas tanto no homem quanto em animais. Aspergillus
fumigatus produz as micotoxinas fumitremorginas A e B, que causam dano ao
Sistema Nervoso Central de animais cujos sintomas de envenenamento são
tremores e convulsões. A ocratoxina e as fumitremorginas podem ser encontradas
principalmente no milho, cevada, feijão, amendoim, café, soja, trigo sarraceno,
centeio, arroz, sorgo, castanha do Pará, superfície de presunto, pimenta do reino,
ervilha, vegetação em decomposição e solo (SCUSSEL, 1998).
As leveduras são definidas como fungos cuja forma predominante é
unicelular, requerendo maior umidade que a maioria dos bolores, sendo a sua
temperatura ideal de crescimento entre 25 e 30
o
C, porém não existem relatos da
presença de espécies patogênicas em alimentos. Kluveromyces marxianus é uma
das espécies mais comuns em produtos lácticos, principalmente em queijos
deteriorados, estando também envolvida na fermentação de alguns alimentos. As
leveduras do gênero Pichia normalmente formam filme em substratos líquidos,
estando envolvidas na deterioração de produtos ácidos como picles e azeitonas
em conservas, porém algumas espécies são importantes na produção de comidas
orientais. Rhodotorula muscilaginosa produz pigmento que varia do rosa ao
vermelho, podendo ser isolada de produtos de laticínios, carnes e produtos
fermentados (SPENCER; SPENCER, 1997; FRANCO; LANDGRAF, 2003).
3.2 Atividade antimicrobiana
3.2.1 Substâncias com atividade antimicrobiana
Segundo Jack; Tagg e Ray (1995), a maioria, senão todas as bactérias,
são capazes de produzir várias substâncias durante seu crescimento in vitro e,
presumivelmente, nos seus habitats naturais, que podem ser inibitórias tanto para
elas quanto para outras bactérias. Tais substâncias incluem:
40
• toxinas (muitas substâncias tradicionalmente conhecidas como toxinas
bacterianas; devido sua ação contra células eucarióticas também podem ter
atividade antimicrobiana);
• enzimas bacteriolíticas como lisostafina, fosfolipase A e hemolisinas;
• subprodutos das vias metabólicas primárias como ácidos orgânicos, amônia e
peróxido de hidrogênio e vários outros metabólitos secundários;
• substâncias antibióticas como garamicina, valinomicina e bacitracina;
• bacteriocinas ou moléculas semelhantes às bacteriocinas.
As bacteriocinas são capazes de inibir cepas ou espécies que são,
geralmente, taxonomicamente relacionadas à bactéria produtora. O mecanismo
de ação das bacteriocinas sobre células vegetativas não está totalmente
esclarecido, mas envolve ação sobre a membrana celular, pela formação de
poros (CLEVELAND et al., 2001; PALMER, 2004).
Segundo Jack; Tagg e Ray (1995), as bacteriocinas termolábeis de alto
peso molecular da classe III de Klaenhammer (>30 kilodaltons - kDa) incluem
muitas enzimas extra-celulares bacteriolíticas (hemolisinas e muramidases) que
podem mimetizar as atividades fisiológicas das bacteriocinas. Algumas
hemolisinas pertencentes à família das citolisinas tiol-ativas, que é um grupo
proeminente de toxinas microbianas, na qual a estreptolisina O (SLO) é o
protótipo, também possuem efeito antimicrobiano. Os membros deste grupo
envolvem mais de 20 espécies de bactérias Gram-positivas, incluindo espécies do
gênero Bacillus, Listeria, Clostridium e Streptococcus. Essas toxinas são
sintetizadas como polipeptídeos hidrossolúveis de cadeia simples, com peso
molecular de 47 a 60kDa e provocam a lise de células eucariontes pela formação
de poros na membrana (PORTNOY et al., 1992; SHEPARD et al., 1998;
BILLINGTON; JOST; SONGER, 2000).
Segundo Daeschel (1989), são seis os requerimentos para que um
antimicrobiano de ocorrência natural possa ser usado como conservador
alimentar:
• sua toxicidade deve ser considerada aceitável por autoridades reconhecidas;
41
• não deve apresentar efeito prejudicial sobre as propriedades organolépticas do
alimento;
• seu custo de produção deve ser economicamente viável para a indústria;
• deve ser estável durante seu armazenamento antes do uso e, no caso de sua
ação depender de um residual, deve ser suficientemente estável para a vida de
prateleira do alimento;
• deve ser efetiva em concentrações relativamente baixas;
• não deve ter aplicação médica.
3.2.1.1 Classificação
As bacteriocinas de BAL investigadas até o momento diferem em seus
espectros de atividade, mecanismos de ação, características bioquímicas e
determinantes genéticos. Entretanto, a maioria delas possui baixo peso molecular
(3 a 10kDa), alto ponto isoelétrico e contém regiões hidrofílicas e hidrofóbicas (DE
MARTINIS; ALVES; FRANCO, 2002).
Levando-se em consideração as semelhanças observadas nas suas
características, a classificação de Klaenhammer (1993) acabou sendo adotada
também para substâncias produzidas por outras bactérias Gram-positivas (KLEIN;
ENTIAN, 1994; NAVARATNA; SAHL; TAGG, 1998; FURMANEK et al., 1999).
Klaenhammer (1993) e Cleveland et al. (2001) classificam as bacteriocinas
de BAL em quatro classes, conforme mostrado na Quadro 1.
42
Quadro 1 - Classificação das bacteriocinas.
Fonte: Cleveland et al. (2001).
Dentre as principais bacteriocinas pertencentes à Classe I encontram-se a
nisina, lactacina 481, carnocina UI49 e lactocina S. As bacteriocinas pertencentes
à classe II podem ser subdivididas em três subclasses: (i) IIa - constituída por
peptídeos ativos contra Listeria, com uma seqüência N-terminal comum,
composta por –Tir-Gli-Asn-Gli-Val-Xaa-Cis. Exemplos: pediocina PA-1, sakacinas
A e P, leucocina A, bavaricina MN e curvacina A; (ii) IIb – constituída por
peptídeos formadores de poros na membrana celular, formados de duas
subunidades importantes para a atividade. Exemplos: lactococina G, lactococina
M e lactacina F; (iii) IIc – constituída por peptídeos ativados por tiol, que requerem
resíduos de cisteína reduzida para tornarem-se ativos. Exemplo: lactacina B. As
bacteriocinas não lantibióticas, ou seja, sem lantionina na estrutura química,
produzidas por BAL da classe II, são exclusivamente formadas por aminoácidos
não modificados. A helveticina J, helveticina V-1829, acidofilina e lactacinas A e B
são as principais bacteriocinas pertencentes à classe III. Em contrapartida, a
plantaricina S, leuconocina S, lactocina 27 e pediocina SJ1 são as principais
representantes da classe IV (CLEVELAND et al., 2001; GARNEAU; MARTIN;
VEDERAS, 2002; PAPAGIANNI, 2003; DEEGAN et al., 2006; RICHARD et al.,
2006).
Cotter; Hill e Ross (2005) classificam como bacteriolisinas as mureínas
hidrolases classificadas por Klaenhammer (1993) como pertencentes à Classe III.
43
Essas bacteriolisinas são proteínas líticas que possuem um tipo de estrutura
complexa composta por vários domínios, os quais possuem funções específicas
para translocação, ligação ao receptor e atividade letal. O mecanismo de ação
dessas bacteriocinas ocorre através da hidrólise das membranas celulares de
bactérias sensíveis. Essas moléculas também possuem uma estrutura modular
composta por um domínio N-terminal homólogo às peptidases e um C-terminal
que, provavelmente, compõem o sítio de ligação dessa proteína na parede
bacteriana alvo.
Sendo a nisina a bacteriocina mais amplamente estudada, descreve-se, a
seguir, algumas características dessa substância, bem como seu mecanismo de
ação e alguns fatores que afetam sua atividade em alimentos.
3.2.1.2 Definição, composição química e características
A nisina é um polipeptídeo antibacteriano produzido por certas linhagens
de Lactococcus lactis, cujo nome é derivado do termo “N-inhibitory substances”
(NIS) adicionado ao sufixo INA (DAVIES et al., 1998; CLEVELAND et al., 2001).
De acordo com Harris; Fleming e Klaenhammer (1992), essa bacteriocina foi
descrita pela primeira vez por Rogers (1928), como uma substância inibidora do
crescimento do Lactobacillus bulgaricus. De modo geral, a nisina é ativa apenas
frente a bactérias Gram-positivas e seus esporos, não afetando as Gram-
negativas, bolores e leveduras. Postula-se que a parede das bactérias Gram-
negativas, composta por lipopolissacarídeos e proteínas, atua como uma barreira
de permeabilidade celular, impedindo que a nisina atinja a membrana
citoplasmática. Contudo, a presença de agentes quelantes, pressão hidrostática
ou injúria celular podem desestruturar a parede, deixando a membrana celular
exposta à ação da bacteriocina (KLAENHAMMER, 1988; DELVES-BROUGHTON,
1990a; DE MARTINIS; ALVES; FRANCO, 2002).
Na literatura, o termo nisina é empregado para cinco polipeptídeos,
designados como Nisinas: A, B, C, D e E; onde, entre elas, acredita-se que a
Nisina A, por degradação, dá origem às demais (HARRIS; FLEMING;
KLAENHAMMER, 1992). Desta forma, estudos sobre a estrutura molecular da
44
Nisina-A, revelaram que a mesma é um peptídeo composto de 34 aminoácidos
com 3354 Daltons, incluindo um resíduo de dehidroalanina, dois resíduos
de dehidrobutirina, uma lantionina e quatro metillantioninas, como mostra a
Figura 1 (EAPEN; SANKARAN; VIJAYARAGHAVAN, 1983; DELVES-
BROUGHTON, 1990a; HARRIS; FLEMING; KLAENHAMMER, 1992). A Nisina-B,
apesar de ser tão ativa quanto a anterior, diferencia-se da mesma por apresentar
como produto de degradação 32 aminoácidos. Com respeito às outras nisinas,
apesar das mesmas serem bioquimicamente relacionadas e apresentarem
atividade antimicrobiana similar, sua sequência de aminoácidos ainda permanece
desconhecida (HOLLEY, 1981; HARRIS; FLEMING; KLAENHAMMER, 1992).
Fonte: Delves-Broughton (1990a) e Hoffmann et al. (2002).
Figura 1 - Estrutura da nisina A.
Comercialmente, a nisina produzida pela “Applin e Barrett” recebe a
denominação de Nisaplin
®
, cuja composição é: nisina (1.026 UI/mg), cloreto de
sódio (74,7%), proteína (17,12%), umidade (1,7%), carboidratos (59,3%),
gorduras (traços), chumbo (0,15 partes por milhão - ppm), arsênio (<0,5ppm),
zinco (9,2ppm) e cobre (0,5ppm), definida por Fowler (1979). Esse concentrado é
atualmente comercializado no Brasil pelo Grupo Bela Vista (São Paulo, SP),
sendo considerado por Delves-Broughton (1990a) como bactericida.
ABA = aminoácido butírico
DHA = dehidroalanina
ALA-S-ALA = lantionina
DHB = dehidrobutirina
ABA-S-ALA = β-metillantionina
45
Segundo informações fornecidas pelo Grupo Bela Vista, 100mg de
Nisaplin
®
possuem 2,5mg de nisina (2,5%). O teor mínimo de nisina em 1mg de
Nisaplin
®
é de 1.000 Unidades Internacionais (UI), ou seja, 1UI de nisina
corresponde a 0,025µg de nisina. O fabricante do Nisaplin
®
recomenda o uso de
10 a 20g de Nisaplin
®
(250 a 500mg de nisina) por 100kg de produto final,
dependendo da vida de prateleira desejada, assim como da condição
microbiológica da matéria-prima (WESSELS; JELLE; NES, 1998).
A nisina comercial (Nisaplin
®
) é primeiramente obtida por fermentação do
leite desnatado com Lactococcus lactis. O fermentado resultante é, em seguida,
concentrado e separado, desidratado e triturado até obtenção de partículas de
pequena granulometria (DEEGAN et al., 2006).
3.2.1.3 Mecanismo de ação
O conhecimento do mecanismo de ação da nisina torna-se, cada dia, mais
importante e um pré-requisito indispensável para sua efetiva aplicação na
tecnologia de alimentos (HENNING; METZ; HAMMES, 1986b). Nesse sentido,
inúmeras pesquisas têm sido realizadas tanto com esporos quanto com células
vegetativas (WAITE; SIRAGUSA; HUTKINS, 1998).
O mecanismo de ação das bacteriocinas sobre células vegetativas não
está totalmente esclarecido, mas envolve ação sobre a membrana celular. O
mecanismo de formação de poros é o mais aceito porque uma solubilização
generalizada, como conseqüência da ação detergente, ocasionaria a lise total das
células, levando a um colapso repentino dos parâmetros bioenergéticos. Isso leva
à dissipação do gradiente eletroquímico da membrana citoplasmática, resultando
em uma situação incompatível com a viabilidade celular. Podem ocorrer alguns
efeitos secundários, tais como degradação de macromoléculas vitais como
proteínas, DNA e RNA, ou inibição de sua síntese. Já foi relatada, inclusive,
interferência na formação e degradação de ATP (JACK; TAGG; RAY, 1995;
FRANCO; LANDGRAF, 2003). Hoffmann et al. (2002), Cotter; Hill e Ross (2005) e
Deegan et al. (2006) relatam que além de formar poros na membrana dos
46
microrganismos sensíveis, a nisina interfere na biossíntese da parede celular,
sendo essa ação mediada pelo receptor específico de membrana denominado
lipídio II.
Outra teoria quanto ao mecanismo de ação das bacteriocinas sugere que a
atividade dessas não depende de sua adsorção específica na superfície das
células sensíveis. A adsorção inespecífica deriva de sua natureza hidrofóbica,
enquanto que a imunidade das cepas resistentes a bacteriocina se deve mais à
produção de uma enzima implicada na imunidade do que da alteração nos
receptores (PIARS; DESMAZEAUD, 1992; EIJSINK et al., 1998).
A maioria das bacteriocinas de BAL caracterizadas parece ter um
mecanismo de ação comum, no qual dissipam a força próton-motriz (FPM), com
variação no potencial de membrana (∆ψ) e no pH (∆pH). Tais efeitos, em
microrganismos-alvo, levam à formação de poros na membrana citoplasmática
(BRUNO; MONTVILLE, 1993; MOLL; KONINGS; DRIESSEN, 1999; CLEVELAND
et al., 2001; PAPAGIANNI, 2003).
Montville e Chen (1998), Moll; Konings e Driessen (1999) apresentaram
dois modelos que oferecem mecanismos alternativos para a formação dos poros.
Ambos os modelos propõem que, inicialmente, a nisina liga-se à membrana-alvo
através de algum grau de interação eletrostática. Os dois modelos descritos são
mostrados na Figura 2.
47
A. Representação esquemática da nisina mostrando domínios N e C-terminais
conectados por uma região flexível. A face hidrofílica está representada como
escura e a hidrofóbica, como clara.
B. Modelo de Ojcius e Young (1991), Sahl (1991).
C. Modelo de Driessen et al. (1995).
Fonte: Montville e Chen (1998).
Figura 2 - Modelos propostos para a formação de poros pela nisina.
No primeiro (Modelo B), a nisina liga-se como um monômero, insere-se nas
bicamadas de lipídeos e os monômeros inseridos agregam-se lateralmente para
formar poros (OJCIUS; YOUNG, 1991; SAHL, 1991). No segundo (Modelo C), a
formação dos poros é causada por uma perturbação local na camada lipídica que
ocorre quando as moléculas de nisina se ligam. A nisina é então puxada para a
membrana por um componente da FPM. A orientação das moléculas não muda
relativamente aos grupos lipídicos, portanto, o peptídeo não entra em contato com
a parte hidrofóbica da membrana. Em vez disso, os resíduos hidrofóbicos da
nisina são, superficialmente, inseridos na parte externa da bicamada lipídica.
Ainda não foi esclarecido como as interações eletrostáticas iniciais entre as
moléculas de nisina positivamente modificadas e os fosfolipídios aniônicos da
membrana transformam interações hidrofóbicas na estrutura predita (DRIESSEN
et al., 1995).
48
3.2.1.4 Fatores que afetam a atividade da nisina
Existem alguns fatores importantes que podem afetar a atividade
antimicrobiana da nisina, como por exemplo, condições de armazenamento, ação
enzimática, pH e temperatura. Durante a estocagem, podem ocorrer perdas da
atividade dessa bacteriocina em decorrência da temperatura e tempo de
armazenamento, sendo então necessária a aplicação de diferentes concentrações
de Nisaplin
®
no alimento para alcançar os objetivos desejados (DELVES-
BROUGHTON, 1990a).
No que diz respeito à ação enzimática, a nisinase produzida por algumas
bactérias, consegue inativar diferentes tipos de nisina (A, B, V e E) constituindo,
dessa forma, um sério problema na fabricação de queijos que contém
microrganismos produtores dessa enzima (KIM, 1993).
O pH exerce um efeito tanto sobre a solubilidade como também sobre a
estabilidade da nisina, fazendo com que ambas diminuam com o aumento do pH
(LIU; HANSEN, 1990). Baseado nisso, Henning; Metz e Hammes (1986a)
sugeriram que essa bacteriocina deve ser aplicada somente em alimentos com
pH inferior a 7,0 e onde o crescimento de microrganismos Gram-positivos não é
desejado.
A temperatura também é importante na estabilidade da molécula de nisina,
que se torna mais vulnerável ao efeito do calor, quando ocorre um aumento no
valor de pH. Resultados obtidos por Delves-Broughton (1990a) revelaram que a
porcentagem de retenção de atividade de Nisaplin
®
, em tampão aquecido a 121
o
C
por 15min, mostrou-se dependente do pH, com porcentagens de retenção de
100; 71; 35; 14,5 e 0,5 em pH 3; 4; 5; 6 e 7, respectivamente.
3.2.2 Bacillus produtores de bacteriocinas
Recentemente, vários estudos envolvendo Bacillus estão sendo
direcionados para a produção de bacteriocinas. A subtilina, produzida por Bacillus
subtilis ATCC 6633, é a bacteriocina mais amplamente estudada. Além de
49
Bacillus subtilis outras espécies de Bacillus estão sendo utilizadas para obtenção
de bacteriocinas, como Bacillus thuringiensis, Bacillus stearothermophilus,
Bacillus licheniformis e Bacillus megaterium (OSCÁRIZ; LASA; PISABARRO,
1999).
Atualmente, têm sido estudas as seguintes bacteriocinas produzidas por
Bacillus:
- Ahern; Verschueren e Sinderen (2003) caracterizaram a thuricina 439,
uma bacteriocina produzida por Bacillus thurigienses B439. Os resultados obtidos
nesse estudo confirmam que essa bacteriocina permanece ativa numa ampla
faixa de pH e não perde a atividade antimicrobiana quando submetida a
temperaturas superiores a 80
o
C. Para sua purificação foram utilizadas várias
técnicas cromatográficas, resultando em dois peptídeos com a mesma seqüência
N-terminal, mas com massas moleculares diferentes. Adicionalmente, Cherif et al.
(2003) constataram que Bacillus thuringiensis ssp. entomocidus HD9 produz uma
bacteriocina denominada entomocina 9, ativa contra Listeria monocytogenes,
Pseudomonas aeruginosa e vários fungos. Essa bacteriocina manteve 72% de
sua atividade antimicrobiana quando incubada a 121
o
C por 20min. É estável na
faixa de pH de 3 a 9, perde sua atividade quando tratada com proteinase K,
apresenta um peso molecular aparente de 12,4kDa e não é tóxica para células
VERO. Na pesquisa não se verificou a presença de genes de virulência, incluindo
hemolisina BL, enterotoxina não hemolítica e citotoxina K.
- Martirani et al. (2002) detectaram e caraterizaram a bacillocina 490
produzida por Bacillus licheniformis. Essa bacteriocina é inativada quando tratada
com pronase E e proteinase K. Apresentou um peso molecular de 2kDa e foi ativa
contra Bacillus smithii.
- Pattnaik; Grover e Batish (2005) estudaram o efeito de fatores ambientais
na produção da lichenina, um composto codificado cromossomicamente como
uma bacteriocina, produzido por Bacillus licheniformis 26L-10/3RA, isolado do
rúmen de búfalo. Segundo esse estudo, a lichenina representa o primeiro
composto antibacteriano de amplo espectro expresso em anaerobiose e efetivo
50
somente em condições de anaerobiose, sendo codificada pelo DNA
cromossômico. Resultados obtidos pelos autores podem ser utilizados para a
produção da lichenina em larga escala, com potencial de aplicação na
manipulação da função do rúmen com o propósito de melhorar a produtividade
dos ruminantes. Cladera-Oliveira; Caron e Brandelli (2004) constataram que a
metodologia estatística de superfície de resposta pode ser empregada para
otimizar a produção de bacteriocinas por Bacillus licheniformis P40. O soro de
leite proveniente do queijo foi utilizado como meio para testar por superfície de
resposta as variáveis temperatura, pH e concentração de leite. A análise
estatística dos resultados demonstrou que todas as variáveis estudadas tiveram
um efeito significativo na produção da bacteriocina. Dados da superfície de
resposta demonstraram produção máxima de bacteriocina nos pHs iniciais de 6,5
e 7,5 e temperatura entre 26 e 27ºC quando a concentração do soro de leite do
queijo foi 70g.L
-1
.
- A utilização de bactérias do gênero Bacillus como biocontroladores de
fitopatógenos e patógenos humanos têm sido bastante pesquisada, haja vista que
várias espécies desse gênero são responsáveis pela produção não só de
bacteriocinas, mas também de antibióticos peptídicos antifúngicos e
antibacterianos. Um exemplo desses compostos é a iturina A, produzida por
Bacillus amyloliquefaciens B94 utilizada no controle do fitopatógeno Rhizoctonia
solani, responsável pela redução no rendimento da produção de soja. Outro
exemplo desses compostos são as maltacinas, também pertencentes ao grupo de
antibióticos peptídicos cíclicos de Bacillus subtilis, sendo ativos contra
determinados patógenos humanos como Candida albicans, Thricophyton
mentagrophytes e Aspergillus fumigatus (YU et al., 2002; HAGELIN et al., 2004).
- Kim e Chung (2004) caracterizaram uma potente proteína antifúngica
isolada de uma cepa de Bacillus amyloliquefaciens MET0908, proveniente do
solo. A proteína isolada por cromatografia de filtração em gel apresentou, na
eletroforese em poliacrilamida (SDS PAGE), um peso molecular aparente de
40kDa. A proteína isolada é estável a 80ºC por 20min e apresentou um amplo
espectro de atividade antifúngica contra fungos fitopatogênicos. Análises por
microscopia mostraram que a proteína atua na parede celular do fungo
51
Colletotrichum lagenarium, responsável pela doença antracnose que afeta
melancias. A seqüência aminoacídica N-terminal da proteína purificada também
foi determinada, sendo Ser-Lys-Ile-x-Ile-Asn-Ile-Asn-Ile-x-Gln-Ala-Pro-Ala-Pro-x-
Ala. A pesquisa da seqüência no programa NCBI BLAST demonstrou que a
proteína purificada era inédita. Lisboa et al. (2006) caracterizaram uma linhagem
de Bacillus amyloliquefaciens, isolada da Floresta Atlântica brasileira, que inibe
bactérias patogênicas e deteriorantes em alimentos como Listeria
monocytogenes, Bacillus cereus, Serratia marcescens e Pasteurella haemolytica.
A substância antimicrobiana foi estável num amplo intervalo de temperatura,
porém perdeu a atividade quando submetida a 121ºC por 15 min. A atividade
antimicrobiana máxima foi observada em valores de pH ácidos e neutros. A
substância foi sensível frente à ação proteolítica da tripsina, da papaína, da
proteinase K e da pronase E. Os autores concluíram o estudo afirmando que a
atividade dessa bacteriociona contra Listeria monocytogenes atende a um
aspecto importante da proteção dos alimentos.
- He; Chen e Liu (2006) isolaram uma nova bacteriocina de Bacillus
licheniformis ativa contra diferentes espécies de bactérias Gram-positivas e
fungos. Essa bacteriocina foi sensível ao tratamento com proteinase K e tripsina e
sua atividade permaneceu estável durante tratamento térmico de 100ºC por
30min, porém foi inativada quando submetida a 121ºC por 15 min. O composto
antagonista apresentou um peso molecular aparente de 3kDa em eletroforese
Tricina-SDS-PAGE. O sobrenadante, livre de células bacterianas, manteve sua
atividade inibitória numa faixa de pH de 2 a 9, sendo o pH ótimo para a mesma de
6,5.
- Motta; Cladera-Oliveira e Brandelli (2004) identificaram bactérias com
atividade antimicrobiana entre 86 isolados de ambientes aquáticos da Bacia
Amazônica. Destes, 59 isolados (68,6%) apresentaram atividade antimicrobiana
contra pelo menos uma bactéria indicadora. A atividade inibitória foi
principalmente observada contra bactérias Gram-positivas, como Listeria
monocytogenes e Bacillus cereus. As substâncias antimicrobianas produzidas por
19 linhagens que demonstraram maior atividade inibitória foram parcialmente
caracterizadas, apresentando resistência térmica até 100
o
C e resistência parcial
52
ao tratamento proteolítico. A detecção da atividade antimicrobiana em géis de
poliacrilamida mostrou que os compostos apresentaram peso molecular inferior à
14kDa. Várias linhagens apresentaram atividade antibacteriana, que em alguns
casos estaria relacionada com peptídeos antimicrobianos. Os pesquisadores
afirmam que o potencial destes microrganismos produtores de substâncias
antimicrobianas é grande e merece ser mais explorado.
3.2.3 Métodos para detecção da atividade antimicrobiana
A maioria das antibioses entre bactérias é, primeiramente, resultado de
estudos envolvendo a combinação de diferentes cepas bacterianas em meio ágar
através de métodos de antagonismo diretos ou indiretos (TAGG; DAJANI;
WANNAMAKER, 1976).
Segundo De Martinis; Alves e Franco (2002), após excluir a possibilidade
da inibição ter sido devida à produção de ácidos orgânicos ou peróxido de
hidrogênio, as cepas com atividade antagonista isoladas devem ser, em seguida,
submetidas a ensaios confirmatórios para detecção da atividade inibitória. Entre
os métodos diretos para confirmação, podemos destacar os seguintes:
a) difusão em poços: os sobrenadantes de culturas, supostamente
produtoras de bacteriocinas, são colocados em orifícios cortados em uma placa
de ágar semeado com o microrganismo indicador. Durante a incubação, a
bacteriocina difunde-se pelo ágar, inibindo o crescimento do indicador e formando
um halo ao redor do orifício;
b) “flip-streak”: as bactérias teste são semeadas em estrias na superfície de
um meio sólido, invertendo-se em seguida esse meio. O organismo sensível à
bacteriocina é então semeado no lado inverso do ágar. Durante a incubação,
verifica-se a inibição do crescimento do microrganismo indicador;
c) “spot-on-the-lawn”: as culturas teste são semeadas como um ponto na
superfície de um meio de cultura sólido adequado contendo ágar. Após a
incubação dessa placa, adiciona-se uma camada de um indicador, observando-se
a inibição de seu crescimento após uma nova incubação. A sensibilidade do
inibidor a enzimas proteolíticas pode ser determinada empregando-se uma
modificação da técnica “spot-on-the-lawn”. Nessa técnica, antes de se adicionar a
53
sobrecamada com o microrganismo indicador, adicionam-se ao meio proteases,
além de água deionizada como controle negativo.
No antagonismo indireto, o microrganismo teste cresce no ágar por um
período de tempo. As bactérias são então destruídas por exposição a clorofórmio
ou aquecimento, e uma sobrecamada do microrganismo indicador em ágar
fundido é plaqueada na superfície. Procedimentos de antagonismo indireto são
mais sensíveis do que o antagonismo simultâneo e permite uma variação
independente do tempo e condições de incubação do teste e cultura indicadora.
Uma vantagem adicional desse procedimento é a exclusão da atividade de
bacteriófago, porém uma desvantagem é que os vapores de clorofórmio podem
inativar alguns agentes inibitórios. É importante testar a atividade inibitória das
cepas por ambos os métodos e também utilizar vários meios e condições de
crescimento. A condição ótima de crescimento do microrganismo teste não
necessariamente coincide com a máxima produção de bacteriocina. Entretanto, a
composição do meio pode afetar indiretamente a sensibilidade do microrganismo
indicador (TAGG; DAJANI; WANNAMAKER, 1976).
Para a extração de substâncias semelhantes à bacteriocinas, a maioria dos
métodos utiliza precipitação com sulfato de amônio (0 a 20%) a partir do meio de
cultura após o crescimento da cepa produtora, mas já livre de células (NACLERIO
et al., 1993; FARIAS; HOLGADO; SESMA, 1994).
Após precipitação, as bacteriocinas são submetidas a técnicas de
cromatografia para purificação e determinação da composição e sequência de
aminoácidos. Algumas bacteriocinas, quando purificadas, tornam-se instáveis,
perdendo sua atividade biológica, já outras necessitam de duas ou mais
substâncias para permanecerem ativas (JIMÉNEZ-DÍAZ et al., 1995;
KALMOKOFF; TEATHER, 1997; ZAMFIR et al., 1999).
54
3.2.4 Enzimas produzidas por Bacillus spp.
De acordo com Abate et al. (1999), o gênero Bacillus é a maior fonte
industrial de enzimas e Bacillus amyloliquefaciens é uma das espécies mais
amplamente utilizadas para a produção de α-amilase e proteases.
Bactérias utilizadas para produção comercial de α-amilase foram
originalmente isoladas e denominadas Bacillus amyloliquefaciens (PRIEST,
1993). Apesar de ser eventualmente confundido com Bacillus subtilis, são baixos
os níveis de homologia entre as seqüências de DNA dessas duas espécies e
também as amilases que produzem possuem diferentes propriedades (WELKER;
CAMPBELL, 1967a; WELKER; CAMPBELL, 1967b). Bacillus amyloliquefaciens e
Bacillus subtilis possuem, em média, de 17 a 36% de homologia; Bacillus
amyloliquefaciens e Bacillus licheniformis, 9 a 17%. Assim, Bacillus
amyloliquefaciens foi estabelecida filogeneticamente como espécie. Estudos
subseqüentes revelaram que várias características fenotípicas como fermentação
de lactose, utilização de gliconato e secreção de DNAse e carboximetilcelulase
são capazes de prontamente distingui-lo de Bacillus subtilis (PRIEST, 1993).
A α-amilase produzida por Bacillus amyloliquefaciens possui peso
molecular aparente de 50kDa, é estável em pH de 5,5 a 9,0 e em temperaturas de
até 80-90°C. Sua biossíntese é controlada tanto pela indução por substratos
quanto pela repressão catabólica. É produzida no final da fase de crescimento
exponencial e no começo da fase estacionária. Apresenta-se como enzima
extracelular e somente pequenas quantidades dela permanecem ligadas à célula
(MORCEL; BIEDERMANN, 1994).
Abate et al. (1999) relataram características interessantes do Bacillus
amyloliquefaciens com relação à sua curva de crescimento e produção de
enzimas. Segundo eles, a presença de extrato de levedura aumentou
significativamente o crescimento desse microrganismo no meio de cultura
utilizado. Em co-cultura com Zimomonas mobilis, observaram uma diminuição nos
valores detectados de etanol, o qual estaria, provavelmente, sendo utilizado pelo
55
Bacillus amyloliquefaciens, uma vez que essa bactéria pode crescer em meio
contendo etanol como única fonte de carbono. Quanto à produção de α-amilase,
foi possível detectá-la no início da fase de crescimento exponencial e a adição de
extrato de levedura aumentou muito a quantidade produzida e a atividade
específica dessa enzima (unidades de enzima/grama de biomassa). Contudo, a
produção de proteases também foi aumentada, levando à inativação da α-amilase
depois de 24h; no final da fase exponencial. Mamo e Gessesse (1999)
destacaram ainda a influência que a disponibilidade de oxigênio, pH e a fonte de
nitrogênio podem exercer sobre a produção desta enzima.
De maneira geral, as bactérias possuem vários sistemas que as permitem
controlar a secreção de enzimas. Simonen e Palva (1993) publicaram uma
revisão bibliográfica sobre secreção de proteínas por espécies de Bacillus, onde
discorrem sobre estruturas e mecanismos envolvidos na liberação (por exemplo,
peptídeos sinalizadores e Complexo-S) e que influenciam na produção e no
próprio processo secretório dessas substâncias (como proteólise, estrutura de
parede celular e mecanismo de retroalimentação).
Schulz (2000) e Bonelli (2001) desenvolveram uma técnica de obtenção do
extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, em tampão
fosfato, utilizando técnicas de precipitação, diálise e esterilização por filtração em
membrana. No teste de sensibilidade a enzimas, esse extrato antibacteriano
perdeu parcialmente sua atividade quando tratado com protease de Streptomyces
griseus, protease de Aspergillus saitoi e alfa-amilase, indicando sua natureza
protéica.
Adicionalmente, Schulz (2003) constatou que: (i) é possível obter o extrato
bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, tanto em água destilada
quanto em tampão fosfato; (ii) nos ensaios de atividade antimicrobiana utilizando
Listeria monocytogenes a 10
5
UFC/ml como microrganismo indicador, o extrato
bruto apresentou um halo de inibição máximo (raio) de 8,3mm (profundidade) e
7,5mm (superfície) numa concentração de 80µg e 10µg de proteínas,
respectivamente; (iii) em ágar sangue (AS), utilizando Listeria monocytogenes a
56
10
5
UFC/ml como microrganismo indicador, observou-se que o extrato bruto
apresentou um halo de inibição máximo (raio) de 4,5mm (profundidade) e 6,6mm
(superfície) numa concentração de 80µg e 10µg de proteínas, respectivamente;
(iv) na determinação da composição global de aminoácidos do extrato bruto em
eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE) - 7,5 a 20%/dodecil sulfato de sódio
(SDS) - 10% foram constatadas seis bandas com pesos moleculares aparentes
de: 14,8; 20; 29; 30; 34 e 56,2kDa e esse é composto principalmente de
aminoácidos hidrofóbicos (não polares), incluindo a prolina (446,77ppm), leucina
(11,03ppm), valina (6,27ppm), isoleucina (4,59ppm), alanina (2,91ppm) e glicina
(1,87ppm). A quantidade de aminoácidos totais presentes no extrato bruto foi de
526,59ppm; (v) em ensaios de citotoxicidade, o extrato bruto apresentou uma
concentração hemolítica 50% em tubos na concentração de 11,43µg de proteínas
numa suspensão de eritrócitos de carneiro e uma concentração citotóxica 50% na
concentração de 32,14µg de proteínas em células VERO; o halo de hemólise
máximo (raio) em AS foi de 5,6mm (profundidade) e 5,7mm (superfície) numa
concentração de 80µg e 10µg de proteínas, respectivamente.
Schulz (2003) concluiu o estudo afirmando que o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 é composto, principalmente, de
proteases e outras enzimas bacteriolíticas, sugerindo estudos adicionais para se
obter um resultado mais conclusivo da toxicidade do extrato bruto antibacteriano
de Bacillus amyloliquefaciens R 10, como ensaios in vivo de toxicidade aguda,
sub-crônica e crônica.
Cepas geneticamente modificadas de Bacillus subtilis produziram
subtilisina com peso molecular de 28,5kDa. Essa subtilisina (Carlsberg) foi,
primeiramente, isolada nos anos 50 de uma cepa classificada como Bacillus
subtilis e, posteriormente, reclassificada como Bacillus licheniformis. A segunda
maior protease extracelular de Bacillus subtilis é a protease neutra (30kDa) ou
metaloprotease (40kDa). Além de proteases extracelulares presentes na cultura
de Bacillus subtilis, vários pesquisadores têm verificado a presença de outras
serina proteases. Dentre essas, a Bacilopeptidase F (50kDa) que possui forte
atividade proteolítica. Protease neutra, subtilisina e Bacillopeptidase F foram as
57
únicas proteases extracelulares originalmente detectadas em culturas de Bacillus
subtilis. Uma das menores proteases isoladas de cepas de Bacillus subtilis
modificados foi a metaloprotease Mpr com peso molecular de 28kDa. Duas
proteases intracelulares têm sido isoladas da esporulação ou fase estacionária de
células de Bacillus subtilis, sendo a primeira protease caracterizada a intracelular
serina protease (ISP) com peso molecular de 31kDa. Estudos recentes têm
indicado que essa enzima está sujeita à proteólise durante a purificação e que
possui, in vivo, um peso molecular de 34kDa (PERO; SLOMA, 1993; OH; KIM;
PARK, 2002).
A atividade hemolítica apresentada por algumas espécies de bacilos pode
estar relacionada à sua atividade antimicrobiana, pois ambas são resultantes da
ação de substâncias que tem como alvo primário à membrana citoplasmática,
tanto em células procariontes quanto eucariontes. Isso foi observado no estudo de
Boucabeille et al. (1997), que isolou a linenscina, uma substância com atividade
antimicrobiana e hemolítica de Brevibacterium linens OC2.
A maioria dos peptídeos de Bacillus contém altas concentrações de prolina
e glicina, o que confere dobras β no final do centro hidrofóbico na posição –5 a –7
do C-terminal (+1 refere ao aminoácido N-terminal da proteína madura), sendo
suas cadeias peptídicas estabilizadas por pontes de hidrogênio. O grupo amino
secundário (imino) da prolina é mantido em uma conformação rígida que reduz a
flexibilidade estrutural nesse ponto da cadeia polipeptídica (PERO; SLOMA, 1993;
LEHNINGER; NELSON; COX, 2000).
3.3 Aplicação de substâncias antimicrobianas na conservação e
processamento de alimentos
Com a emergência de microrganismos psicrotróficos em alimentos, o
desenvolvimento de novas tecnologias e a procura dos consumidores por
alimentos naturais, as bacteriocinas e/ou seus microrganismos produtores têm
sido reconhecidos como uma fonte potencial de bioconservadores para alimentos
(MARTH, 1998; MORENO; LERAYER; LEITÃO, 1999).
58
Algumas espécies de Bacillus são utilizadas como probióticos em nutrição
humana, bem como para prevenir distúrbios gastrintestinais. Os probióticos
também são usados como suplementos de rações em aqüicultura. No sudeste
asiático os produtos contendo probióticos são administrados como agentes
terapêuticos, já em outros países são também usados como agentes profiláticos
de diarréia infantil. Esses probióticos são comercializados na forma de
endosporos em dose única contendo 10
9
esporos/g ou 10
9
esporos/ml. Dentre as
espécies de Bacillus utilizadas como probióticos encontra-se Bacillus subtilis. O
efeito probiótico no hospedeiro ocorre por três mecanismos básicos: (i)
imunomodulação do tecido linfóide associado ao intestino; (ii) exclusão
competitiva dos patógenos gastrintestinais e por (iii) secreção de compostos
antimicrobianos que inibem o crescimento de patógenos (DUC et al., 2004).
Apesar do grande número de trabalhos de pesquisa sobre a aplicação de
bacteriocinas em bioconservação, o uso efetivo desses compostos em alimentos
ainda é bastante limitado, particularmente às produzidas por Bacillus spp. A idéia
da utilização de nisina em alimentos foi sugerida pela primeira vez por Hirsch et
al. (1951), depois de realizar um experimento com linhagens de Lactococcus
lactis subsp. lactis na fabricação do queijo suíço, obtendo como resultado a
inibição do estufamento tardio causado por Clostridium butyricum e Clostridium
tyrobutyricum (DELVES-BROUGHTON, 1990b; ROBERTS; ZOTTOLA; MICKAY,
1992). Diversos países permitem o uso de nisina em produtos como leite, queijo,
produtos lácteos, tomates, sopas enlatadas, maionese e alimentos infantis. No
Brasil, a nisina é aprovada para uso em todos os tipos de queijo no limite máximo
de 12,5mg/kg e nosso país é pioneiro na utilização dessa bacteriocina em
produtos cárneos, sendo permitida a sua aplicação na superfície externa de
salsichas de diferentes tipos. O produto pode ser aplicado como solução
comercial de nisina a 0,02% em solução de ácido fosfórico grau alimentício (DE
MARTINIS; ALVES; FRANCO, 2002).
Benkerroum e Sandine (1988) investigaram a utilização de nisina no
controle de Listeria monocytogenes ATCC 7644 em queijo “Cottage”, realizando
dois experimentos. O primeiro deles, envolveu duas séries de três amostras cada,
contendo uma mistura estéril de 250g de queijo e 50ml de creme pasteurizado
59
(leite com 12% de gordura) cada uma. A primeira amostra de cada série foi
destinada à adição de nisina e Listeria monocytogenes, perfazendo uma
concentração final de 2,55x10
3
UI/g e 3,5x10
5
células/g de queijo, respectivamente.
A outra amostra designada de controle positivo teve somente adição da bactéria
estudada, enquanto que a terceira delas serviu como controle negativo. Dessas
amostras, uma das séries foi incubada a 4
o
C e a outra a 37
o
C. O segundo
experimento realizado foi diferente do anterior pela não esterilização da mistura e
pela temperatura de incubação, que só ocorreu a 4
o
C. Os dados obtidos
revelaram que em ambos os casos, com ou sem esterilização, a presença de
Listeria monocytogenes não foi detectada depois de 24h nas condições
estudadas, permitindo aos autores concluírem que a adição da nisina não
somente inibiu o crescimento, mas também eliminou esse microrganismo.
Além da nisina, outras bacteriocinas produzidas por BAL já foram testadas
em alimentos, principalmente produtos cárneos e laticínios, com relativo sucesso,
podendo ser adicionadas na forma purificada ou semi-purificada como um
ingrediente, por incorporação de um ingrediente previamente fermentado por uma
cepa bacteriogênica ou pela adição de uma cultura inicializadora em alimentos
fermentados com produção da bacteriocina in situ (McMULLEN; STILLES, 1996;
BUYONG; KOK; LUCHANSKY, 1998; WESSELS; JELLE; NES, 1998; DEEGAN
et al., 2006).
No entanto, a autorização para que uma dada bacteriocina seja
regulamentada para uso em alimentos, depende dos alimentos nos quais ela será
usada e seu propósito nos mesmos. O uso de bacteriocinas purificadas,
microrganismos produtores de bacteriocinas, ou expressão genética de
bacteriocinas em microrganismos produtores de alimentos, nos Estados Unidos,
está sob jurisdição da Food and Drug Administration (FDA) e são regulamentados
como ingredientes alimentares sob o Federal Food, Drug and Cosmetic Act
(FFDCA). No FFDCA, as substâncias são reconhecidas como seguras
(substances generally recognaized as safe - GRAS) por especialistas qualificados.
A decisão é baseada em pesquisas científicas ou no fato de tais agentes já
estarem presentes, historicamente, sem problemas em alimentos (FIELDS, 1996).
60
As bacteriocinas, em geral, são uma das opções em um mosaico de
possíveis mecanismos para controlar bactérias patogênicas e deteriorantes em
alimentos. Porém, é importante lembrar que elas jamais poderão substituir as
boas práticas de fabricação fundamentais para a produção de alimentos seguros
(GIRAFFA, 1995).
Nos últimos 20 anos, a redução no custo e a maior disponibilidade no
mercado de enzimas tem estimulado o interesse da indústria na aplicação de
catalisadores biológicos no processamento de alimentos (TUCKER; WOODS,
1995).
Proteases de Bacillus amyloliquefaciens são muito utilizadas na produção
de queijos, com intuito de melhorar o sabor. Essas enzimas também são usadas
para remover proteínas aderidas à espinha de peixes, que são difíceis de serem
removidas mecanicamente, sendo posteriormente usadas na fabricação de
enlatados e sopas. Na indústria de panificação, as proteases são usadas na
hidrólise parcial do glúten de farinhas para massas de pães, bolos e biscoitos
(CHAPLIN; BUCKE, 1990).
A subtilisina de Bacilus subtilis vem sendo utilizada para proteólise de
proteínas de soja na produção de molho de soja. Além de melhorar a capacidade
emulsificante na produção de salsichas e mortadelas, as proteínas hidrolisadas de
soja melhoram o sabor de carnes curadas (CHAPLIN; BUCKE, 1990).
Além das proteases e subtilisina, produzidas por Bacillus spp., Hewitt e
Solomons (1996) apresentam a α-amilase de Bacillus amyloliquefaciens como
uma enzima de grande importância comercial para hidrólise, tanto de dextrinas de
alto peso molecular quanto de polímeros de glicose de baixo peso molecular,
utilizada pela indústria alimentícia.
Esses são apenas alguns exemplos do potencial de aplicação das
bacteriocinas e enzimas produzidas por Bacillus spp. na conservação e
processamento de alimentos. Muitas dessas substâncias precisam ainda ser
descobertas e melhor caracterizadas para utilização pela indústria alimentícia.
61
3.4 Segurança de bacteriocinas e enzimas produzidas por Bacillus spp.
As bacteriocinas são ainda pouco utilizadas industrialmente como
conservadores de alimentos, em função dos elevados custos dos ensaios
toxicológicos necessários para liberar um novo antimicrobiano (GOULD, 1996).
Os principais estudos toxicológicos envolvendo bacteriocinas relatados até
o momento se referem aos testes realizados para a aprovação do uso da nisina
como bioconservador em alimentos (FDA, 1988).
Frazer; Sharratt e Hickman (1962) investigaram a toxicidade aguda e
crônica dessa bacteriocina e pelo estudo de sensibilização intestinal em cobaias.
No ensaio de toxicidade aguda os grupos de 10 cobaias foram tratados por 12
semanas com queijo contendo nisina. A dose máxima administrada foi de
2,4x10
6
UI/kg de peso corpóreo. Nesse estudo não foi observada diferença
significativa em relação ao grupo controle, quanto ao peso, estado clínico e
histologia. No ensaio de toxicidade crônica, realizado durante dois anos, foram
utilizados grupos de cobaias constituídos de 30 fêmeas e 15 machos. A dose
máxima administrada foi de 3,3x10
6
UI/kg de peso corpóreo/dia. O grupo tratado
com a maior dose apresentou um aumento significativo do peso dos rins em
relação ao grupo controle. Já no ensaio de sensibilização intestinal em cobaias
não se constatou sensibilização no íleo após administração de 5x10
4
UI/kg de
peso corpóreo/dia, durante três meses.
De acordo com Henning; Metz e Hammes (1986a), a nisina foi aceita como
aditivo alimentar em 1969 pelo Comitê Conjunto da Organização para
Alimentação e Agricultura (FAO) e Organização Mundial da Saúde (OMS). O
mesmo estabeleceu uma ingestão diária aceitável (IDA) para a nisina de 33.000
UI/kg de peso corpóreo, baseando-se nos estudos de Frazer; Sharratt e Hickman
(1962). Em nisina pura essa IDA corresponde a 821µg/kg de peso corpóreo, ou
seja, para uma pessoa de 70kg corresponde a uma ingesta de 58mg de nisina
pura por dia.
62
Em 1988, o FDA considerou essa bacteriocina como uma substância
GRAS, ou seja, segura para a saúde do consumidor (HARRIS; FLEMING;
KLAENHAMMER, 1991).
Em 1990 o Comitê Científico em Alimentos da União Européia estabeleceu
uma IDA de 0,13mg/kg de peso corpóreo para o produto contendo nisina na
concentração de 40x10
6
UI/kg. Isso corresponde a 5.200UI/kg de peso corpóreo
(ou 130µg de nisina pura/kg de peso corpóreo), sendo aproximadamente 6,5
vezes menor que a IDA estabelecida pelo comitê FAO/OMS (WESSELS; JELLE;
NES, 1998).
Considerando que a nisina é consumida por via oral, Claypool et al. (1966),
realizaram estudos sobre os efeitos dessa na microbiota oral. A partir desses
estudos foi constatado que um minuto após o consumo de leite achocolatado
contendo nisina foi possível detectar apenas 40% de sua atividade quando
comparada ao controle de saliva. Em contraste, o mesmo estudo mostrou que
quando o leite achocolatado tinha penicilina, a saliva apresentava atividade
antimicrobiana por um tempo maior. Outro estudo mostrou o efeito das enzimas
gástricas sobre a nisina; o peptídeo antimicrobiano é inativado pela tripsina e a
partir disso concluiu-se que a ingestão da nisina não interfere sobre a microbiota
gastrintestinal (HARA et al., 1962).
A bacteriocina com maior uso comercial é a nisina, mas a segurança de
outras bacteriocinas com potenciais aplicações em alimentos também tem sido
avaliada. A pediocina PA-1 foi injetada tanto em ratos como em camundongos e o
teste imunológico mostrou que a pediocina não é imunogênica para ambos
animais. Esse peptídeo é também suscetível a proteólise por tripsina e
quimiotripsina (BHUNIA et al.,1990).
Muitos microrganismos do gênero Bacillus são utilizados na fermentação
de alimentos. Por outro lado, algumas espécies também podem causar
deterioração e toxinfecções alimentares. Bacillus cereus é um patógeno clássico,
causador de síndrome diarréica ou emética, porém, outras espécies de Bacillus,
incluindo Bacillus subtilis, Bacillus pumilus e Bacillus licheniformis têm sido
63
relacionadas a enterites seguidas de ingestão de alimentos contaminados com
essas bactérias (JAY, 1996; LINDSAY et al., 2000; EHLING-SCHULZ; FRICKER;
SCHERER, 2004).
Contudo, a principal contribuição do gênero Bacillus para a indústria dá-se
através da produção de uma grande variedade de enzimas como, por exemplo,
xilanase, α-amilase e proteases (GHORBEL; SELLAMI-KAMOUN; NASRI, 2003;
ASGHARI et al., 2004; HECK et al., 2005).
Segundo Fermanian e Wong (2000), a hemolisina BL produzida por
Bacillus cereus é composta de três proteínas distintas B, L1 e L2; as quais não
são tóxicas individualmente, mas quando combinadas são hemolíticas,
enterotoxigênicas, dermonecróticas e citotóxicas para vários tipos de células e
tecidos.
A citotoxicidade da toxina CytK, produzida por Bacillus cereus, foi avaliada
utilizando uma linhagem de células epiteliais intestinais denominada CACO-2.
Nesse estudo foi constatado que a quantidade de proteína necessária para inibir
em 50% a síntese de proteínas foi de 16ng, sendo aproximadamente 10.000
vezes mais potente que a β-toxina produzida por Clostridium perfringens, que é
considerada citotóxica e não citolítica. A atividade da CytK está diretamente
relacionada com a formação de poros na membrana das células CACO-2. Os
valores obtidos no estudo foram cinco vezes menores do que os encontrados
utilizando a linhagem de células epiteliais renais VERO (HARDY; LUND;
GRANUM, 2001).
Pariza e Foster (1983) discutiram os critérios de segurança para enzimas
industriais usadas no processamento de alimentos, derivadas de cepas
melhoradas via metodologias tradicionais (não-recombinantes). Os seguintes
pontos foram analisados: a segurança da cepa com atenção especial para o seu
potencial toxigênico e patogênico; alergias e irritações primárias; carcinogênese e
mutagênese; teratogênese e efeitos reprodutivos; antibióticos; produtos de reação
enzimática; interações entre enzimas e outros componentes alimentares e efeitos
diretos das enzimas alimentares sobre o consumidor. Segundo esses mesmos
64
autores, a avaliação de segurança de enzimas alimentares começa pelo teste oral
de toxicidade aguda em ratos com dose única, onde essa deve ser equivalente,
no mínimo, a 100 vezes a exposição humana média estimada ou no mínimo
2.000mg/kg de peso corporal, conforme diretrizes estabelecidas para testes em
animais (OECD, 1987). O segundo teste de toxicidade proposto é um estudo da
dose oral repetida (14-91 dias) de preferência em ratos, onde o material teste
pode ser administrado na ração ou via sonda esofágica. A dose mínima para esse
teste deve ser ao menos 100 vezes a exposição média humana estimada. Além
disso, os autores recomendam que o material teste seja avaliado quanto à
presença de micotoxinas, como as aflatoxinas, zearalenona, toxina T-2,
ocratoxina A e esterigmatocistina.
O ensaio de toxicidade aguda determina o potencial de letalidade através
da determinação da dose letal mediana (DL
50
), tendo em vista que, com raras
exceções, as únicas toxinas produzidas por bactérias são proteínas ou peptídeos,
como, por exemplo, certas enterotoxinas ou neurotoxinas (PARIZA; FOSTER,
1983). De acordo com o protocolo internacional, um ensaio limite pode ser
realizado com apenas 10 animais quando utiliza-se dose única de no mínimo
2.000mg/kg. No caso de não observação de mortalidade, esse ensaio pode ser
considerado como definitivo. Em havendo mortalidade, esse deve ser realizado
com três doses. O protocolo internacional não preconiza a necessidade de um
grupo controle negativo paralelo ao grupo experimental em caso da utilização do
veículo para o qual há controle histórico do laboratório (OECD, 1987).
Apesar de Pariza e Foster (1983) questionarem se é cientificamente
justificado e necessário testar novas preparações de enzimas alimentares quanto
à atividade mutagênica, os testes continuam sendo conduzidos, muitas vezes
devido a exigências regulamentares em determinados países. Vale, portanto,
mencionar que, os testes de toxicidade in vitro quanto a agentes mutagênicos e
clastogênicos exigidos para novas preparações enzimáticas se mostraram
semelhantes aos determinados por química analítica e testes em animais.
Segundo esses autores, existem três razões para isso: (i) proteínas, incluindo
enterotoxinas e neurotoxinas alimentares produzidas por algumas bactérias não
são genotóxicas; (ii) todas as micotoxinas conhecidas, algumas das quais
65
genotóxicas, também induzem outros efeitos tóxicos em animais de laboratório,
facilmente detectáveis em testes alimentares de curto prazo; e (iii) existem
procedimentos analíticos confiáveis para virtualmente todas as toxinas e
micotoxinas protéicas alimentares.
Phelps e McKillip (2002) investigaram a presença dos genes hblC, hblD,
hblA, nheA e nheB e dos operons HBL e NHE, responsáveis pela produção de
enterotoxinas, em 39 espécies de Bacillus incluindo Bacillus amyloliquefaciens,
Bacillus cereus, Bacillus circulans, Bacillus lentimorbis, Bacillus pasteurii e
Bacillus thuringienses, utilizando a reação em cadeia da polimerase (PCR),
ensaios imunológicos e a detecção em placa de lecitinase e hemólise. Os
resultados obtidos confirmam a presença dos genes em espécies de Bacillus fora
do grupo do Bacillus cereus e a habilidade em produzir toxinas em sistemas
alimentares em aerobiose a 32
o
C.
Recentemente, têm sido realizados vários estudos do potencial citotóxico
de cepas industriais de Bacillus sp. utilizando ensaios in vitro. Pedersen et al.
(2002) investigaram o potencial citotóxico de Bacillus licheniformis, Bacillus
amyloliquefaciens e Bacillus subtilis em células de óvário de hamsters utilizando o
ensaio do sal de tetrazólio (MTT) e ensaios imunológicos, onde concluíram que as
espécies de Bacillus pertencentes ao grupo subtilis são seguras para uso
industrial.
66
4 MATERIAIS E MÉTODOS
O extrato bruto antibacteriano foi obtido de uma cultura de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, isolada por Batista (1993).
Nos ensaios para avaliação da atividade antimicrobiana do extrato bruto
foram utilizadas culturas de Listeria monocytogenes NCTC 098630,
Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212,
Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Enterobacter
aerogenes ATCC 13048, Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027, Aspergillus
fumigatus ATCC 9197, Penicillium commune J238, Rhodotorula muscilaginosa
J350, Pichia anomala DSM 70255 e Kluveromyces marxianus ATCC 16045,
adquiridas da Fundação André Tosello de Campinas, SP.
Para o ensaio de genotoxicidade foram utilizadas células VERO ATCC-
CCL 81, que são culturas contínuas de fibroblastos de Cercopithecus aethiops,
adquiridas da American Type Culture Collection (ATCC).
No ensaio de toxicidade aguda em ratos, foram utilizados 10 ratos Wistar
(Rattus norvegicus), brancos, adultos e sadios, com sete semanas de idade de
ambos os sexos, pesando entre 202 e 380g, adquiridos junto ao Setor de Criação
do Biotério Central da Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia (FMVZ) da
USP de São Paulo, SP.
Para análise toxicológica aguda do extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 também foram utilizados 100 camundongos Swiss (Mus
musculus) machos e fêmeas, pesando entre 25 e 35g, adquiridos do Biotério
Central da Universidade do Sul de Santa Catarina (UNISUL) de Tubarão, SC.
Na análise toxicológica de doses repetidas foram utilizados 160
camundongos Swiss (Mus musculus) machos e fêmeas, pesando entre 25 e 35g,
adquiridos do Biotério Central da UNISUL de Tubarão, SC.
67
4.1 Atividade antimicrobiana do extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens
R 10
4.1.1 Obtenção do extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10
O processo de obtenção do extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 e a triagem de sua atividade antimicrobiana foram
realizados no Laboratório de Microbiologia de Alimentos do CAL do CCA da
UFSC, de acordo com a metodologia utilizada por Schulz (2003), com algumas
modificações.
Todos os ensaios desse trabalho foram realizados com dois pools de
extrato bruto, sendo um obtido pela mistura de extratos brutos extraídos em
tampão (Quadro 2) e o outro obtido pela mistura de extratos brutos extraídos em
água, constituídos de 1l e 3l de extrato bruto, respectivamente. O pool extraído
em água foi obtido utilizando somente água destilada no processo de
ressuspensão do precipitado e em todas as etapas de diálise. Esse foi utilizado
em todos os ensaios, exceto para avaliação da atividade antimicrobiana do
extrato bruto utilizando diferentes indicadores. Os pools foram concentrados por
liofilização (Liofilizador Terroni Favel LT1000/8) conforme a necessidade, sendo
previamente testados quanto à atividade antimicrobiana antes de serem utilizados
nos ensaios (DAWSON et al., 1969; KAISER; MONTVILLE, 1996). Os pools de
extratos brutos foram liofilizados no Laboratório de Biotecnologia Alimentar do
CAL do CCA da UFSC.
O processo de diálise foi monitorado, qualitativamente, com o reagente de
Nessler, objetivando o controle da remoção de todo o sulfato de amônio utilizado
no processo de precipitação (FARMACOPÉIA BRASILEIRA, 1996).
68
Quadro 2 – Fluxograma do processo de obtenção do extrato bruto antibacteriano
de Bacillus amyloliquefaciens R 10.
Ativar a cultura estoque de Bacillus amyloliquefaciens R 10 em caldo triptona de soja
suplementado com extrato de levedura (TSB-YE)
35
o
C por 24h
Inocular um erlenmeyer contendo 450ml de TSB-YE com 4,5ml da cultura de Bacillus
amyloliquefaciens R 10
35
o
C por 24h
Centrifugar o caldo de crescimento a 700xg por 30min
Eliminar o precipitado
Adicionar, ao sobrenadante, cristais de sulfato de amônio até 20% de saturação (42,2g)
Deixar em repouso a 4
o
C por 1h para precipitação de proteínas
Centrifugar a suspensão a 700xg por 30min
Eliminar o sobrenadante
Ressuspender o precipitado em 75ml de água destilada
Dialisar o material ressuspenso em membrana de diálise de 3,5kDa, contra 5l de água
destilada substituindo esta após 2, 18h e na quarta diálise (após 20h do início desse
processo) utilizar 5l de tampão fosfato de sódio 0,2M pH 7,2 por 4h
24h em refrigeração
Esterilizar o material dialisado através de membrana (0,22µm)
Extrato bruto
Fonte: Schulz (2003), com algumas modificações.
Para triagem da atividade inibitória do extrato bruto antibacteriano de
Bacillus amyloliquefaciens R 10 obtido foram preparadas placas contendo ágar
triptona de soja suplementado com extrato de levedura (TSA-YE) que, após
solidificado, foi inoculado, por semeadura em superfície, com 0,1ml de Listeria
monocytogenes na concentração de 10
5
UFC/ml, previamente ativada em TSB-YE
a 35
o
C por 24h.
69
Volumes de 10µl do extrato bruto foram aplicados na superfície de placas
de TSA-YE. As placas foram deixadas em temperatura ambiente por 30min para
difusão do extrato bruto no ágar e depois incubadas a 35
o
C por 24h. Após
incubação foi realizada a leitura para observação dos halos de inibição. Essa
triagem da atividade antimicrobiana do extrato bruto foi realizada a cada extração
para ser em seguida padronizada pela dosagem de proteínas e, posteriormente,
avaliada nos ensaios de atividade antimicrobiana utilizando diferentes indicadores
(BATISTA, 1993; SCHULZ, 2000; BONELLI, 2001; SCHULZ, 2003).
4.1.2 Dosagem de proteínas do extrato bruto
A dosagem de proteínas do extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 foi realizada no Laboratório de Bioquímica de Alimentos
do CAL do CCA da UFSC.
A padronização da atividade antimicrobiana e dos ensaios de toxicidade do
extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens R 10
foi realizada pela determinação
da concentração de proteínas utilizando o Kit de Ensaio para Dosagem de
Proteínas Totais (Analisa Diagnóstica - Método de Biureto) por comparação com
padrão de albumina de soro bovino (BSA). A leitura foi em espectrofotômetro
(Hitachi U2010) a 545 nm.
4.1.3 Avaliação da atividade antibacteriana
A avaliação da atividade antibacteriana do extrato bruto de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 foi realizada no Laboratório de Microbiologia de Alimentos
do CAL do CCA da UFSC.
Para o estudo foram utilizadas placas de TSA-YE, previamente inoculadas
com 0,1ml de cada microrganismo na concentração de 10
5
UFC/ml, pela técnica
de difusão em poços. Foram testados 5, 20, 40, 60 e 80µl de uma solução
estoque de 1000µg de proteínas/ml em tampão fosfato 0,2M pH 7,2, contendo 5,
20, 40, 60 e 80µg de proteínas, respectivamente. A atividade antibacteriana do
70
extrato bruto foi comparada com a nisina comercial (Nisaplin
®
), por ser essa a
primeira bacteriocina utilizada comercialmente na conservação de alimentos. A
partir de uma solução estoque de Nisaplin
®
contendo 1000µg de nisina/ml em
tampão fosfato 0,2M pH 7,2, foram utilizados 5, 20, 40, 60 e 80µl contendo 5, 20,
40, 60 e 80µg de nisina, respectivamente. Após inoculação nas placas, foram
necessários 30min para difusão do inóculo no ágar. Após esse período as placas
inoculadas foram incubadas a 35
o
C por 24h. Como controle negativo foi utilizado
tampão fosfato 0,2M pH 7. A atividade antimicrobiana foi avaliada pela medida do
raio do halo de inibição utilizando um paquímetro (BATISTA, 1993; SCHULZ,
2003).
4.1.4 Avaliação da atividade antifúngica
A avaliação da atividade antifúngica do extrato bruto de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 foi realizada no Laboratório de Microbiologia de Alimentos
do CAL do CCA da UFSC, de acordo com Yu et al. (2002), Magnusson et al.
(2003) e Kim e Chung (2004), com algumas modificações. Após reativação dos
esporos e células liofilizadas em água destilada realizaram-se diluições decimais
seguintes em água peptonada a 0,1%p/v.
Foram utilizadas placas de ágar dextrose batata (PDA) e ágar dextrose
sabouraud (SDA) para os fungos e leveduras, respectivamente. As placas foram
previamente inoculadas com 0,1ml de cada microrganismo na concentração de
10
5
esporos/ml e 10
5
UFC/ml para fungos e leveduras, respectivamente. O ensaio
foi realizado pela técnica de difusão em poços. Para o estudo foram utilizados 5,
20, 40, 60 e 80µl de uma solução estoque de 1000µg de proteínas/ml em tampão
fosfato 0,2M pH 7,2 contendo 5, 20, 40, 60 e 80µg de proteínas, respectivamente.
A atividade antifúngica do extrato bruto foi comparada com a nisina
comercial (Nisaplin
®
), por ser essa a primeira bacteriocina utilizada
comercialmente na conservação de alimentos. A partir de uma solução estoque
de Nisaplin
®
contendo 1000µg de nisina/ml em tampão fosfato 0,2M pH 7,2, foram
utilizados 5, 20, 40, 60 e 80µl contendo 5, 20, 40, 60 e 80µg de nisina,
71
respectivamente. Após inoculação nas placas foram necessários 30min para
difusão do inóculo no ágar. Após esse período as placas inoculadas foram
incubadas a 24
o
C por 96h e 28
o
C por 48h para fungos e leveduras,
respectivamente. Como controle negativo foi utilizado tampão fosfato 0,2M pH 7.
A atividade antifúngica foi avaliada pela medida do raio do halo de inibição
utilizando um paquímetro (BATISTA, 1993; SCHULZ, 2003).
4.2 Toxicidade do extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens
R 10 in vitro
O estudo de toxicidade do extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 foi realizado de acordo com o guia para realização de
estudos de toxicidade pré-clínica de fitoterápicos descrito na Resolução RE
nº 90/2004 (BRASIL, 2004).
4.2.1 Genotoxicidade
A avaliação da genotoxicidade do extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 foi realizada no Laboratório de Virologia Aplicada do MIP
do CCB e do CIF do CCS da UFSC.
Para o estudo da genotoxicidade foi utilizado o Ensaio do Cometa, segundo
a técnica alcalina originalmente proposta por Singh et al. (1988), com algumas
modificações na preparação das lâminas propostas por Klaude et al. (1996) e de
acordo com as recomendações do International Workshop on Genotoxicity Test
Procedures (TICE et al., 2000).
a) Procedimento
As células VERO ATCC-CCL 81, foram cultivadas em placas de 24
cavidades (2,5 x 10
5
células/ml, 1ml/cavidade), formando uma monocamada
confluente em 24h a 37
o
C/5% de CO
2
. Essas células foram cultivadas em meio
199 suplementado com 10% de soro fetal bovino e 100U/ml de
estreptomicina/penicilina/fungizona. Após o tapete formado, cada uma das
72
amostras foi adicionada à placa (500µl/cavidade), a qual foi incubada durante
90min, a 37
o
C/5% CO
2
, para avaliação da indução de genotoxicidade por
exposição aguda das células ao extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10. As concentrações utilizadas do extrato bruto foram 60, 80
e 100µg/ml de proteínas. Os controles positivos foram lâminas preparadas com
células VERO tratadas com uma solução de peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) 200 e
100µM, durante 90min, a 37
o
C/5% CO
2
. A titulação da solução a 30% de H
2
O
2
por
permanganometria, foi realizada periodicamente, para garantir a concentração
dos controles positivos. Os controles negativos foram lâminas preparadas com
células VERO não tratadas, ou seja, contendo apenas meio de manutenção,
submetidas ao mesmo tratamento que as demais.
b) Preparação da suspensão celular
Após os tratamentos, o tapete celular de cada cavidade das placas foi
lavado três vezes com 300µl de tampão fosfato de sódio (PBS) e então
tripsinizado. Em cada cavidade, foram adicionados 150µl da solução de tripsina
(0,05%): EDTA (0,02%), deixando-se agir por até 5min, para a obtenção da
suspensão celular a ação da tripsina foi interrompida pela adição de meio mínimo
essencial (MEM)/5% soro fetal bovino - SFB (500µl/cavidade). A suspensão
celular foi recolhida com auxílio de uma pipeta Pasteur e centrifugada a 350xg por
3min em tubo Falcon. Após o sobrenadante foi cuidadosamente descartado e as
células foram ressuspendidas com 200µl de meio MEM de forma a obter uma
suspensão de aproximadamente 1x10
8
células/ml. Essa suspensão celular foi,
posteriormente, adicionada à agarose de baixo ponto de fusão (Gibco BRL) para
formar a segunda camada sobre as lâminas. Foram utilizadas duas lâminas por
tratamento.
c) Preparação das lâminas
Conforme as modificações propostas por Klaude et al. (1996), foram
utilizadas lâminas de microscópio foscas apenas numa das extremidades,
desengorduradas, e que já tiveram uma primeira camada de agarose formada
com uma solução de agarose de ponto de fusão normal (Gibco BRL) a 1,5% em
73
PBS livre de íons cálcio e magnésio e deixadas à temperatura de 4ºC para
secagem. Após coloração e análise, as lâminas podem, ainda, ser secadas
novamente e guardadas sem que haja perda importante de material ou alteração
na aparência dos cometas.
Para cada lâmina foram usados 40µl da suspensão celular, previamente
preparada e tratada, e 60µl de solução de agarose de baixo ponto de fusão a
0,5% em PBS livre de íons cálcio e magnésio, mantida a 37
o
C. Uma lamínula de
24x60mm foi colocada sobre cada lâmina, imediatamente, para que a agarose
não secasse, antes de se espalhar por toda lâmina. As lâminas foram deixadas a
4ºC, por 15min, para a solidificação da agarose.
d) Lise celular
Em seguida, foram retiradas as lamínulas e as lâminas foram submersas
em 100ml de solução de lise gelada (4ºC), recém-preparada (NaCl 2,5M, EDTA
100mM, Tris-HCl 10mM, qsp de NaOH 10N para obter pH 10) adicionada de 10%
DMSO e 1% Triton X-100. A solução de lise é uma solução detergente contendo
altas concentrações de sais, que promove a desintegração das membranas
celulares. As lâminas podem permanecer nesta solução, no mínimo, por 1h e, no
máximo, por 30 dias.
e) Tratamento alcalino e eletroforese
Após a lise celular, as lâminas foram lavadas com PBS gelado com auxílio
de uma pipeta Pasteur e submetidas ao tratamento alcalino em solução tampão
de pH 13 (300mM NaOH e 1mM EDTA), previamente refrigerada, por 30min, em
banho de gelo. A eletroforese foi feita numa cuba horizontal disposta num banho
de gelo, com voltagem constante (25Volts) e amperagem de 280-300mA, por
30min. Durante o tratamento alcalino, ocorre o relaxamento e desespirilização dos
sítios de rompimento da molécula de DNA (ROJAS; LOPEZ; VALVERDE, 1999).
74
f) Neutralização
Após eletroforese, as lâminas foram lavadas três vezes com uma solução
de neutralização (Tris-HCl 0,4M, pH 7,5), por 5min cada, sendo em seguida
secadas e posteriormente colocadas numa cuba com etanol absoluto por alguns
segundos. Após secagem, as lâminas foram submetidas à coloração.
g) Coloração
As lâminas foram coradas com 30µl de uma solução aquosa de brometo de
etídeo a 20µg/ml e cobertas com lamínulas. O brometo de etídeo é um agente
intercalante de DNA que emite fluorescência quando exposto à radiação UV
(SAMBROOK; RUSSEL, 2001).
h) Análise dos cometas
Após coradas, as lâminas foram avaliadas, imediatamente, em microscópio
de epifluorescência (Olympus BX 40), com filtro de excitação de 515-560nm e
filtro de barreira de 590nm, com aumento de 400X.
A análise dos cometas foi realizada visualmente, conforme classificação
proposta por Kobayashi et al. (1995), seguindo algumas modificações
introduzidas por Miyamae et al. (1998).
Através da análise microscópica, os cometas foram classificados em cinco
categorias: classe I, sem cauda; classe II, cometas com pequenas caudas
(comprimento da cauda menor que 25% do diâmetro da cabeça); classe III,
cometas com caudas médias (comprimento da cauda entre 25 e 100% do
diâmetro da cabeça); classe IV, cometas com caudas longas (comprimento da
cauda maior do que o diâmetro da cabeça); e classe V, cometas mal definidos ou
com cabeças pequenas (KOBAYASHI et al., 1995).
Cinqüenta células foram analisadas, ao acaso, na região central de cada
lâmina e diferenciadas visualmente em cinco classes, utilizando-se um escore,
75
onde foram atribuídos valores 0, 1, 2, 3 e 4 para as classes I, II, III, IV e V,
respectivamente, conforme Figura 3 (COLLINS et al., 1997; DA SILVA, 2000;
SILVA et al., 2002). Os cometas localizados nas bordas do gel não foram
quantificados a fim de evitar resultados falso-positivos.
Fonte: Savi (2004).
Figura 3 – Diferenciação das classes dos cometas em ensaios de genotoxicidade.
4.3 Toxicidade do extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens
R 10 in vivo
Com intuito de melhor investigar o indicativo de toxicidade do extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 apresentado no ensaio do
Cometa, optou-se pela realização de análises toxicológicas in vivo.
Todos os ensaios in vivo, utilizando ratos e camundongos, foram
previamente submetidos à avaliação do Comitê de Ética no Uso de Animais
(CEUA) da USP e UFSC, protocolos números 2374/2002/USP e 23080.0011700/
2005-03/UFSC, respectivamente.
Esses ensaios foram realizados com intuito de detectar a toxicidade oral
associada às toxinas microbianas ativas por via oral conhecidas até o momento,
bem como investigar a toxicidade do extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, quando administrado em doses menores por longo
período de tempo, como ocorre geralmente com o consumo dos aditivos
alimentares (PARIZA; FOSTER, 1983).
76
4.3.1 Análise toxicológica aguda em ratos
A análise toxicológica aguda do extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 em ratos foi realizada no setor de Toxicologia do
Laboratório de Tecnologia Ambiental Ltda (TECAM) de São Paulo, SP.
O presente estudo foi conduzido de acordo com os procedimentos
descritos na OECD (1987).
a) Animais
Os animais foram aclimatados no biotério por 5 dias em condições de
temperatura de 22±3
o
C, umidade relativa do ar de 30 a 70% e fotoperíodo de 12h
de luz e 12h de escuro, recebendo dieta basal (ração Nuvilab CR1, São Paulo,
SP) e água ad libitum. O alimento e água foram retirados 1h antes do início do
ensaio. Durante esse período, as condições de saúde dos animais foram
atentamente observadas e registradas (morte, coma, convulsão, prostração,
ataxia, tremores, alteração na pele ou pêlo, alteração nas mucosas, diarréia e
salivação). Antes da exposição à amostra, todos os animais foram pesados e
identificados individualmente.
b) Preparação do extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens
R 10
O extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 foi
mantido em geladeira e diluído momentos antes das administrações diárias. A
amostra liofilizada utilizada no ensaio era constituída de 610,89µg/ml de
proteínas.
c) Toxicidade aguda (DL
50
)
Um grupo de 10 ratos (5 machos e 5 fêmeas) foi tratado com o extrato
bruto em água, por via oral (gavagem), com a dose de 2.000µg/kg (dose máxima
recomendada). O protocolo internacional não preconiza a necessidade de um
77
grupo controle negativo paralelo ao grupo experimental em caso de utilização de
veículo para o qual há controle histórico do laboratório.
A amostra foi solubilizada em água deionizada (998µg/ml) e administrada
na dose de 0,2ml/100g de peso do animal. O volume de amostra administrado foi
calculado de acordo com o peso corpóreo. Os animais receberam uma dose
única, utilizando uma seringa descartável e tubo de silicone e foram observados
por 14 dias quanto às condições de saúde (morte, coma, convulsão, prostração,
ataxia, tremores, alteração na pele ou pêlo, alteração nas mucosas, diarréia e
salivação). No final do experimento todos os animais foram pesados.
4.3.2 Análise toxicológica aguda em camundongos
A análise toxicológica aguda em camundongos do extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 foi realizada no Laboratório de
Fisiologia do CFS do CCB da UFSC.
O presente estudo foi conduzido utilizando normas de Boas Práticas de
Laboratório (OECD, 1998b) e de acordo com as metodologias descritas na
Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OECD, 2001a;
OECD, 2001b).
a) Animais
Os animais foram mantidos no Biotério de setorial do CFS do CCB da
UFSC, em caixas plásticas (medindo 40x32x17cm) dentro de estufas ventiladas
Alesco (Monte Mor, SP), com temperatura controlada (22±2°C) e ar filtrado, em
ciclo claro/escuro de 12h, tratados com água e ração ad libitum. A ração Nuvilab
CR-1 utilizada foi fornecida pela Nuvital Nutriente S.A., apresentando a seguinte
composição básica: milho integral moído, farelo de soja, farelo de trigo, carbonato
de cálcio, fosfato bicálcico, cloreto de sódio, premix vitamínico mineral e
aminoácidos. Os animais foram aclimatizados no laboratório por um período de
adaptação de pelo menos uma semana antes da realização dos experimentos,
sendo que os mesmos foram realizados de acordo com orientações para os
78
cuidados com animais de laboratório e considerações éticas para experimentação
animal (COBEA, 1991). Os animais foram inicialmente identificados,
individualmente, para permitir a avaliação comportamental e do peso corporal ao
longo do estudo, bem como do peso dos órgãos ao final do experimento.
b) Preparação do extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens
R 10
O extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 foi
mantido em geladeira e diluído momentos antes das administrações diárias. A
solução estoque de extrato bruto utilizada no ensaio era constituída de 567,75µg
de proteínas/ml.
c) Toxicidade aguda (DL
50
)
O objetivo desse estudo foi investigar a possível toxicidade aguda
(letalidade) do extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10,
administrado por via oral, numa única administração, nas doses de 5, 50, 500 e
5.000 µg/kg a 80 camundongos (40 machos e 40 fêmeas, contendo 10 animais
por grupo), sendo 20 camundongos (10 machos e 10 fêmeas) para cada dose,
mantidos em jejum por cerca de 4h. Outros 20 camundongos (10 machos e 10
fêmeas), pertencentes aos grupos controles, receberam veículo (salina, NaCl
0,9%, 10 ml/kg), pela mesma via, utilizado para diluir o extrato bruto de Bacillus
amyloliquefaciens R 10. Foi avaliado o efeito do extrato bruto antibacteriano de
Bacillus amyloliquefaciens R 10 sobre a letalidade nas primeiras 24h e durante os
14 dias após a administração do extrato, a fim de verificar possíveis alterações
relacionadas ao curso do tratamento. Após a administração do extrato bruto ou do
veículo, os animais foram agrupados e mantidos em caixas plásticas, por um
período de 14 dias nas condições descritas acima, sendo que nas primeiras 4
horas subseqüentes os mesmos foram mantidos em jejum. Os parâmetros
indicadores de toxicidade (Teste Hipocrático): resposta ao toque, aperto da
cauda, reflexo córneal, aumento da freqüência respiratória, taquicardia, contorção,
tônus corporal, tremores, convulsões, sinal de straub, ptose, piloereção, força de
79
agarar e a eventual mortalidade foram observados às 0,25; 0,5; 1; 2; 4; 8 e 24h
após o tratamento dos animais.
No decorrer do experimento, foi investigada a possível influência da
administração aguda do extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens
R 10 sobre o consumo de comida, água e ganho de peso, bem como sobre
alguns órgãos vitais. Para isto, os animais foram mantidos em caixas plásticas,
sendo que no 1º, 4°, 7°, 9°, 11° e 14° dias após a administração do extrato bruto
ou do veículo, o peso corporal, consumo de água e comida foram avaliados. No
14° dia de observação, os animais foram sacrificados, mediante anestesia através
de éter, seguida por deslocamento cervical, e submetidos a uma laparotomia, que
permitiu a observação macroscópica (aspecto geral do órgão, cor e peso) dos
órgãos e/ou glândulas, tais como: coração, pulmão, fígado, rins, baço, estômago,
testículos, ovário e tubas uterinas, glândula salivar, glândula adrenal, timo,
linfonodo mesentérico e encéfalo.
4.3.3 Análise toxicológica de doses repetidas
A análise toxicológica de doses repetidas em camundongos do extrato
bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 foi realizada no
Laboratório de Fisiologia do CFS do CCB da UFSC.
O presente estudo foi conduzido utilizando normas de Boas Práticas de
Laboratório (OECD, 1998b) e de acordo com as metodologias descritas na
Organização para a Cooperação e Desenvolvimento Econômico (OECD, 1998a).
a) Animais
Idem a análise toxicológica aguda em camundongos.
b) Preparação do extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens
R 10
Idem a análise toxicológica aguda em camundongos.
80
c) Toxicidade por doses repetidas
O objetivo deste estudo foi avaliar a toxicidade por doses repetidas do
extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, administrado pela
via oral, através de gavagem, uma vez ao dia (entre 8 e 12h da manhã) por 90
dias consecutivos, nas doses de 50, 500 e 5.000µg/kg em 120 camundongos (60
machos e 60 fêmeas, contendo 20 animais por grupo). Outros 40 camundongos
(20 machos e 20 fêmeas), animais controles, receberam apenas o veículo (salina,
NaCl 0,9%), pela mesma via.
A diluição do extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens
R 10 foi realizada em solução NaCl 0,9% e o volume administrado foi de 10ml/kg,
pela via oral. Os animais receberam água e ração ad libitum e as gaiolas foram
lavadas e trocadas três vezes por semana. Após a administração do extrato ou do
seu veículo, os animais foram mantidos em caixas plásticas (medindo
40x32x17cm), durante todo o período de experimentação, sendo que diariamente
foram observados alguns parâmetros indicadores de toxicidade: resposta ao
toque, aperto da cauda, reflexo córneal, aumento da freqüência respiratória,
taquicardia, contorção, tônus corporal, tremores, convulsões, sinal de straub,
ptose, piloereção, força de agarar e a eventual mortalidade dos animais.
Durante o estudo foi registrado o peso corporal, o consumo de ração e de
água dos animais. Ao final dos 90 dias, os animais foram sacrificados e o sangue
foi coletado para a determinação do hemograma completo e análise bioquímica
do sangue. Alguns órgãos e/ou glândulas foram retirados para a verificação de
alterações macroscópicas.
d) Influência do tratamento prolongado dos animais com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 sobre a massa corporal,
consumo de comida e água
No decorrer do experimento, foi também investigada a influência da
administração de doses repetidas do extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 sobre o consumo de comida, água e o ganho de peso dos
81
animais. Para isto, os animais foram mantidos em caixas plásticas, sendo
semanalmente, após a administração diária do extrato ou do veículo, submetidos
à pesagem (para verificação de ganho ou perda de massa corpórea). O consumo
de comida e água foi medido duas vezes por semana.
e) Análise dos parâmetros hematológicos dos animais após o tratamento
com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10
Ao final do tratamento prolongado (90 dias) com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, o sangue dos animais foi
retirado através da punção do globo ocular (plexo orbital), com o animal
previamente anestesiado em éter, com o auxílio de uma pipeta Pasteur contendo
EDTA (anticoagulante). A seguir, foi realizado o hemograma completo para
verificar a possível influência do extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 sobre a atividade hematopoiética da medula óssea dos
animais através dos seguintes parâmetros hematológicos: hematócrito (através da
utilização da centrífuga de microhematócrito), contagem de hemácias, leucócitos,
plaquetas e determinação de hemoglobina (através do aparelho de hematologia,
ADVIATM 60 – Bayer) e diferenciação das células sangüíneas (através da
confecção de esfregaço sangüíneo (lâminas) e coloração pelo método de May
Grünward-Giemsa).
f) Análise dos parâmetros bioquímicos dos animais após tratamento
prolongado com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10
Vários parâmetros bioquímicos (enzimas e produtos provenientes do
metabolismo orgânico) foram também avaliados com o objetivo de verificar
possíveis efeitos tóxicos sobre órgãos alvos específicos. Para tal, o sangue
coletado de cada animal contendo anticoagulante (EDTA) foi centrifugado
(840xg, por 7min) e o plasma obtido foi congelado para posterior determinação
dos seguintes parâmetros bioquímicos: glicose, ácido úrico, albumina, proteínas
totais e frações, bilirrubinas (total, direta e indireta), colesterol total e frações,
triglicerídeos, creatinina, uréia, sódio, potássio, fosfatase alcalina (FA), alanina
aminotransferase (ALT), aspartato aminotransferase (AST),
γ-glutamil transferase
82
(γGT) através de metodologias específicas contidas nos kits fornecidos pela
LabTest (Minas Gerais, Brasil), também utilizadas por Eno; Konya e Ibu (1998).
g) Análise anátomo-patológica (autópsia) dos animais após o tratamento
prolongado com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10
Após a coleta de sangue para análise dos parâmetros bioquímicos, os
animais foram sacrificados por deslocamento cervical e submetidos à laparotomia,
que permitiu a observação macroscópica (autópsia) de alguns órgãos, tais como:
coração, pulmão, fígado, rins, baço, estômago, testículos, ovário e tubas uterinas,
glândula salivar, glândula adrenal, timo, linfonodo mesentérico e encéfalo.
4.4
Análise estatística
a) Avaliação da atividade antibacteriana e antifúngica do extrato bruto
utilizando diferentes indicadores
Os valores obtidos nos ensaios de avaliação da atividade antibacteriana
foram submetidos à análise de regressão não linear e análise de variância
(WINER, 1971) utilizando o programa SAS
, versão 6.12 (Copyright
1989-1996,
SAS Institute Inc, Cary, NC 27513, USA). O gráfico foi plotado utilizando o
programa Microsoft
Excel 2000, versão 9.0.2812. O teste de separação de
médias utilizado foi o teste F ao nível de significância de 5%. Os dados de todas
as investigações tratados, estatisticamente, foram obtidos de três ensaios
independentes, cada um em triplicata. Os resultados de avaliação da atividade
antifúngica não foram submetidos à análise estatística, haja vista que essa não foi
detectada em nenhuma das concentrações testadas, tanto com o extrato bruto
quanto com a nisina.
b) Genotoxicidade
Os resultados da avaliação da genotoxicidade através do Ensaio Cometa
foram submetidos ao teste de comparações múltiplas Student-Newman-Keuls
(SNK) ao nível de significância de 5%. Os dados foram obtidos de três ensaios
83
independentes, cada um em duplicata. Os valores referentes às repetições foram
obtidos mediante somatório dos resultados experimentais, para as diferentes
classes de cometas.
c) Análise toxicológica aguda em ratos
Os valores obtidos no ensaio foram submetidos ao teste t ao nível de
significância de 5%.
d) Análise toxicológica aguda e de doses repetidas em camundongos
Os resultados estão apresentados como a média ± erro padrão da média
ou como a média seguida do intervalo de confiança a 95%. A DL
50
foi estimada
utilizando o método de regressão linear através do programa “Graph Pad Prism”.
A análise estatística dos resultados foi realizada por meio de análise de variância
(ANOVA), seguida pelo teste SNK, quando apropriado. Valores de p<0,05 foram
considerados como indicativos de significância.
84
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Dosagem de proteínas do extrato bruto
O pool de extratos brutos de Bacillus amyloliquefaciens R 10 obtido em
tampão (1l) apresentou 246,15µg de proteínas/ml e o pool de extratos brutos
obtido em água (3l) apresentou 283,88µg de proteínas/ml.
5.2 Atividade antibacteriana
Para calcular a concentração de proteína do extrato bruto responsável por
50% (X
50
) da máxima atividade antibacteriana, utilizou-se como referência a
melhor equação da reta para o fenômeno observado. Os resultados observados
para o extrato bruto e nisina são os dados constatados no laboratório e os
estimados são os calculados com a equação da reta.
O extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens R 10 somente apresentou
atividade antibacteriana frente Listeria monocytogenes NCTC 098630 (Figura 4).
O extrato bruto quando inoculado em placas de TSA-YE, previamente inoculadas
com Listeria monocytogenes, apresentou um halo de inibição de 1,3 e 8,3mm
numa concentração de 5 e 80µg de proteínas, respectivamente. Em contrapartida,
a nisina não apresentou halo de inibição em nenhuma das concentrações
testadas.
85
Figura 4 – Atividade antibacteriana do extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens
R 10, em diferentes concentrações (µg de proteínas), frente Listeria
monocytogenes NCTC 098630 previamente inoculada em placa de
TSA-YE e incubada a 35
o
C por 24h. SI – sem inoculação.
Os resultados para o extrato bruto inoculado em profundidade de placas de
TSA-YE, foram ajustados pela seguinte equação: Yi=18,77Xi/(108,24+Xi), com
um R
2
=0,94. Portanto, se considerarmos que o halo de inibição na concentração
de 80µg de proteínas corresponde a atividade máxima, com uma concentração de
X
50
=29,22µg do extrato bruto, obtivemos uma atividade antibacteriana de 50%
com um halo de inibição de aproximadamente 4mm. Todos os resultados de
atividade antibacteriana em profundidade para o extrato bruto e nisina em placas
de TSA-YE, previamente inoculadas com Listeria monocytogenes NCTC 098630,
podem ser observados no Gráfico 1.
Analisando os resultados de atividade antibacteriana, podemos constatar
que o extrato bruto, quando inoculado em profundidade em placas de TSA-YE,
apresentou inibição em todas as concentrações testadas; ao contrário da nisina.
Logo, o extrato bruto é mais potente do que a nisina nas concentrações testadas,
e pode ser considerado um potencial candidato a bioconservador de alimentos.
86
Gráfico 1 – Atividade antibacteriana do extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens
R 10 e nisina comercial (Nisaplin
®
) em placas de TSA-YE incubadas a
35
o
C por 24h, utilizando Listeria monocytogenes NCTC 098630 como
microrganismo indicador.
Apesar da nisina não ter sido ativa frente Listeria monocytogenes nesse
estudo, deve-se levar em consideração que essa foi diluída em tampão fosfato, o
que pode ter influenciado na atividade antibacteriana. Isso é um indicativo de que
seja necessária maior concentração de nisina diluída em tampão fosfato para
talvez compensar o efeito sinérgico que essa apresenta quando aplicada com
solução de ácido fosfórico para inibição do crescimento de Listeria
monocytogenes (DE MARTINIS; ALVES; FRANCO, 2002).
As bacteriocinas são comumente vistas como única solução para garantir a
segurança microbiológica dos alimentos, quando deveriam representar uma
excelente alternativa para uso em combinação com outros métodos de barreira
para proteger os consumidores de doenças transmitidas por alimentos. Logo, o
extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens R 10 poderia ser submetido a ensaios
de atividade antimicrobiana em associação com agentes quelantes como o EDTA,
os quais agem quelando os íons Mg
2+
da membrana externa das bactérias Gram-
negativas, tornando esses microrganismos mais sensíveis à ação da bacteriocina.
Além disso, esse extrato pode ser adicionado a alimentos submetidos a outros
métodos de conservação, como aumento da pressão hidrostática, luz pulsada,
combinação com citrato de sódio, lactato e diacetato de sódio e incorporados a
87
embalagens que visam aumentar a vida-de-prateleira dos alimentos. Exemplos de
sucesso utilizando a associação de métodos de conservação são a eliminação
completa de cepas de Staphylococcus aureus e de Escherichia coli O157:H7 em
queijos pelo efeito sinérgico da nisina A, bacteriocina TAB 57 e enterocina ou
bacteriocina AS-48, com elevada pressão hidrostática (DIELBANDHOESING et
al., 1998; DEEGAN et al., 2006).
A atividade antimicrobiana de uma bacteriocina depende da concentração,
composição e potencial da membrana citoplasmática da célula-alvo, nível de
expressão das proteínas de imunidade e da composição química do ambiente
onde se encontra ou do meio de cultura utilizado para sua produção. Pesquisas
recentes demonstram uma forte correlação entre as pontes dissulfeto presentes
nas moléculas das bacteriocinas da classe II e seu espectro de atividade
(RICHARD et al., 2006).
As bacteriocinas produzidas por bactérias Gram-positivas, classificadas
como não lantibióticas (classes II e III), incluem tanto as bacteriocinas de alto
como as de baixo peso molecular. As pertencentes à subclasse IIa apresentam
atividade antibacteriana frente Listeria (anti-listerial) e as da classe IIb são as que
necessitam de dois peptídeos para a atividade antibacteriana (GARNEAU;
MARTIN; VEDERAS, 2002; DRIDER et al., 2006; RICHARD et al., 2006).
A(s) substância(s) antibacteriana(s) presente(s) no extrato bruto de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, provavelmente pertence(m) a subclasse IIa das
bacteriocinas não lantibióticas, haja vista que foi ativa apenas frente Listeria
monocytogenes.
Para a confirmação dessa hipótese, estudos futuros de caracterização e do
mecanismo de ação da(s) substância(s) antibacteriana(s) presente(s) no extrato
bruto serão de vital importância para sua classificação definitiva.
88
5.3 Atividade antifúngica
Nem o extrato bruto nem a nisina apresentaram halos de inibição frente a
fungos em nenhuma das concentrações testadas pela técnica de difusão em
poços.
A deterioração de alimentos por fungos causa significativas perdas
econômicas, além de constituir um perigo à saúde dos consumidores, com a
produção de esporos alergênicos e possibilidade de formação de micotoxinas.
Nesse contexto, vários bioconservadores e biocontroladores têm sido estudados
para inibir o crescimento desses microrganismos nos alimentos (MAGNUSSON et
al., 2003).
Segundo Paster et al. (1999), a nisina é freqüentemente aplicada em
alimentos para prevenir a deterioração induzida por bactérias e não por bolores,
porém na presença de pequenas concentrações de ácido propiônico essa
bacteriocina também pode prevenir a deterioração por bolores, ou seja, a nisina
apresenta efeito sinérgico com o ácido propiônico. Nesse estudo constatou-se
que o crescimento de Aspergillus ochraceus foi completamente inibido no meio
contendo ácido propiônico e nisina nas concentrações de 0,05% de ácido
propiônico com 1.000ppm de nisina e 0,1% de ácido propiônico com 500 ou
1.000ppm de nisina. O crescimento de Fusarium moniliformes e Aspergillus
parasiticus, bem como a germinação dos esporos de Aspergillus parasiticus foram
completamente inibidos com 0,1% de ácido propiônico e 1.000ppm de nisina. Já
os esporos de Fusarium moniliformes não germinaram no meio contendo 0,05%
de ácido propiônico com 500 ou 1.000ppm de nisina. Adicionalmente, observou-
se que a germinação dos esporos de Aspergillus ochraceus foi completamente
inibida no meio contendo 0,1% de ácido propiônico com 500 ou 1.000ppm de
nisina.
Segundo Dielbandhoesing et al. (1998), a parede celular das leveduras,
constituída principalmente de quitina, glucanos e proteínas, forma uma barreira
para várias moléculas proteináceas e não proteináceas, incluindo a nisina. A
variação da sensibilidade à nisina varia de acordo com o estágio do ciclo celular
89
das leveduras, sendo essas mais sensíveis à nisina na fase S. Em contrapartida,
na fase G2, constatou-se maior resistência das células à nisina. Essa resistência
a nisina parece estar relacionada à expressão de determinadas proteínas da
parede celular (mannoproteínas) durante os estágios do ciclo celular das
leveduras.
A atividade fungicida e hemolítica dos peptídeos antimicrobianos catiônicos
é fortemente dependente da força iônica dos tampões utilizados nos ensaios de
citotoxicidade. Helmerhorst et al. (1999) constataram forte atividade fungicida e
hemolítica de peptídeos antimicrobianos catiônicos (histatinas e magainas) em
tampão fosfato de potássio 1mM, suplementados com glicose 287mM. Porém,
esses mesmos peptídeos apresentaram-se inativos contra eritrócitos humanos e
células de Candida albicans em tampão PBS, o que comprova a influência da
força iônica dos tampões utilizados nos ensaios de atividade fungicida e
hemolítica.
Enzimas que degradam a parede celular, tais como β-1,3 glucanases,
proteases e quitinases são envolvidas na atividade antagonista de alguns agentes
de controle biológico contra fungos fitopatogênicos. Nos últimos anos têm-se
observado várias correlações entre antagonismos fúngicos e a produção de
quitinases e/ou β-1,3 glucanases; haja vista que a quitina e os β-1,3 glucanos são
os principais constituintes da parede celular dos fungos (KIM; CHUNG, 2004).
Sant-Lang et al. (2002) investigaram a atividade antifúngica do extrato
bruto do Bacillus subtilis W113 e Bacillus subtilis W118 em tampão fosfato de
sódio frente Fusarium oxysporum. A cultura foi obtida em meio base contendo
quitina pré-tratada de resíduos de animais marinhos, nas concentrações de 0,
0,75, 1,75 e 3%. A atividade antifúngica máxima foi obtida no meio contendo 1,75
e 0,75% de quitina para Bacillus subtilis W113 e Bacillus subtilis W118,
respectivamente. Os pesquisadores demonstraram, assim, que a quitina é um
elemento essencial para indução de atividade antifúngica, sugerindo que o
composto em questão trata-se de uma quitinase.
90
5.4 Genotoxicidade
O extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 não foi
genotóxico para células VERO na concentração de 60µg/ml, haja vista que não se
diferenciou, estatisticamente, do controle negativo. As demais concentrações
testadas, 80 e 100 µg/ml, foram genotóxicas para células VERO (Tabela 1).
Tabela 1 – Avaliação da genotoxicidade do extrato bruto antibacteriano de
Bacillus amyloliquefaciens R 10 utilizando-se células VERO
Concentração
Repetição
1
Repetição
2
Repetição
3
Média
Desvio-
padrão
Tratamento
estatístico
100µg/ml
215 162 144 173,67
36,91
a
80
µg/ml
120 126 89 111,67
19,86
b
60µg/ml
81 46 38 55,00 22,87
c
C (+)
H
2
O
2
100 µM
160 147 174 160,33
13,50
a
C (+)
H
2
O
2
200 µM
197 151 189 179,00
24,58
a
C (-) 34 34 37 35,00 1,73
c
Os valores referentes às repetições foram obtidos mediante somatório dos resultados
experimentais, para as diferentes classes de Cometa, seguindo-se as classificações de Silva et al.,
2002. C(+) Controle positivo; C(-) Controle negativo. Letras diferentes significam que houve
diferença significativa entre os grupos; teste SNK.
Analisando-se a Tabela 1, constata-se que o extrato bruto antibacteriano
de Bacillus amyloliquefaciens R 10 na concentração de 100µg/ml foi altamente
genotóxico para células VERO, pois não se diferenciou, estatisticamente, dos
controles positivos. Já na concentração de 80µg/ml apresentou uma
genotoxicidade intermediária, pois se constatou uma diferença estatística
significativa, tanto em relação ao controle negativo, quanto em relação aos
controles positivos.
Cabe ressaltar, que mesmo em função da ausência de genotoxicidade do
extrato bruto antibacteriano na concentração de 60µg/ml, não devemos descartar
o indicativo de genotoxicidade apresentado nas demais concentrações testadas.
91
Assim, esses resultados foram importantes para justificar a realização dos
estudos toxicológicos in vivo do extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10.
Poucos estudos de genotoxicidade in vitro têm sido realizados com
bacteriocinas para uso em alimentos. Esses ensaios conseguem detectar a
maioria das substâncias ou seus metabólitos genotóxicos, porém os resultados
positivos precisam ser confirmados com ensaios de toxicidade in vivo (BARLOW
et al., 2002).
Tanto os ensaios de genotoxicidade quanto os de toxicidade de dose
repetida são fundamentais para avaliação da segurança dos aditivos alimentares,
sendo importantes na predição de toxicidade e identificação dos alvos de
toxicidade. Em alguns casos, quando constatada toxicidade em tecidos ou
órgãos-alvos, torna-se necessária à realização de ensaios complementares para
investigação definitiva da segurança desses compostos (BARLOW et al., 2002).
Levando-se em consideração a crescente resistência ao uso de nisina e
outras bacteriocinas em alimentos por certos países, principalmente da União
Européia, deve-se considerar a necessidade de estudos sistemáticos de
mutagenicidade, teratogenicidade, de efeitos alérgicos, genotoxicidade, bem
como de ação dessas substâncias na microbiota intestinal, haja vista a
possibilidade de resistência cruzada desses antimicrobianos com os antibióticos
utilizados rotineiramente no combate a infecções (WESSELS; JELLE; NES,
1998).
Recentemente, SASAKI et al. (2002) investigaram a genotoxicidade in vivo
de 39 aditivos alimentares em uso, pertencentes a seis categorias: (1) corantes,
(2) fixadores de cor, (3) conservantes, (4) antioxidantes, (5) fungicidas e (6)
adoçantes. No estudo foram testados grupos de quatro camundongos machos
tratados por via oral com cada aditivo na dose de até 0,5xDL
50
ou dose limite
(2.000mg/kg). Os animais foram sacrificados 3 e 24h após o tratamento e suas
vísceras (estômago, cólon, fígado, rins, bexiga, pulmão, cérebro e medula óssea)
submetidas ao ensaio do Cometa. De todos os aditivos, os corantes foram os
92
mais genotóxicos, induzindo danos no DNA do estômago, cólon e/ou bexiga.
Todos os corantes induziram danos no DNA dos órgãos gastrintestinais nas
doses mais baixas testadas (10 ou 100mg/kg). Dois antioxidantes, três fungicidas
e quatro adoçantes também induziram danos no DNA dos órgãos gastrintestinais.
Os autores acreditam que são necessárias avaliações de genotoxicidade in vivo
em larga escala para os aditivos alimentares, em função do elevado número de
pessoas expostas diariamente aos mesmos.
A genotoxicidade in vivo nem sempre resulta em carcinogenicidade, haja
vista que esse ensaio detecta o dano no DNA após administração de dose única
relativamente alta, enquanto carcinogenicidade é detectada após longo
tratamento com doses relativamente menores. O desenvolvimento de tumores em
órgãos-alvos não depende somente do nível inicial de dano induzido no DNA ou
do seu reparo, mas também de outros fatores, como a produção de metabólitos
reativos, sua distribuição e seus efeitos na proliferação celular (SASAKI et al.,
2002).
5.5 Análise toxicológica aguda em ratos
a) Toxicidade aguda (DL
50
)
Não foi observado mortalidade ou sinais de intoxicação entre os 10 ratos
durante os 14 dias de teste. Todos os animais apresentaram aumento de peso
durante o período do teste. A variação de peso observada entre os machos foi
superior à observada entre as fêmeas. Os pesos iniciais e finais dos dez animais
(5 machos e 5 fêmeas) tratados com 2.000µg/kg de extrato bruto antibacteriano
de Bacillus amyloliquefaciens R 10, a variação de peso obtida após 14 dias de
observação e os resultados referentes aos sinais clínicos de intoxicação dos
animais no período do teste são mostrados na Tabela 2.
93
Tabela 2 – Variação do peso dos ratos tratados com 2.000µg/kg do extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, por via oral,
durante 14 dias
Animais
*
PI (g) PF (g) PF-PI (g) Sintomas
1 332 373 +41 NA
2 311 350 +39 NA
3 380 436 +56 NA
4 310 355 +45 NA
5 340 382 +42 NA
Média 335 379 +44 -
6 230 248 +18 NA
7 209 235 +26 NA
8 202 217 +15 NA
9 206 227 +21 NA
10 218 238 +20 NA
Média 213 233 +20 -
*1 a 5: Machos; 6-10: fêmeas. PI- peso inicial (dia 0); PF- peso final (dia 14). NA- nenhuma
alteração. Sintomas avaliados: morte, coma, convulsões, prostração, ataxia, tremores, alteração
na pele ou pêlo, alteração nas mucosas, diarréia e salivação.
De acordo com o protocolo internacional (OECD, 1987), no caso de não
ocorrência de mortalidade na dose máxima recomendada e se as condições de
teste respeitarem os procedimentos descritos no protocolo, a toxicidade aguda
oral da amostra, nas condições de teste e em termos de dose nominal, pode ser
considerada superior a 2.000µg/kg (DL
50
>2.000µg/kg).
Durante o teste, a temperatura no biotério variou de 21,1 a 23,0ºC e a
umidade foi de 72%.
Harbak e Thygesen (2002) investigaram a segurança da xilanase produzida
por Bacillus subtilis utilizando ensaios de toxicidade oral aguda e subcrônica em
ratos, ensaio de Ames e de aberração cromossômica in vitro. Os pesquisadores
não detectaram toxicidade em nenhum dos ensaios, afirmando que o
microrganismo utilizado para produção da enzima é seguro para uso em
panificação. Adicionalmente, relataram que o uso de preparações enzimáticas
derivadas de Bacillus em alimentos é seguro, quando obedecidas às boas
práticas de fabricação.
94
5.6 Análise toxicológica aguda em camundongos
a) Toxicidade aguda (DL
50
)
Os resultados obtidos indicam que o extrato bruto antibacteriano de
Bacillus amyloliquefaciens R 10 (5–5.000µg/kg) administrado agudamente pela
via oral, tanto para camundongos machos quanto para fêmeas, não causou
letalidade dos animais até a dose de 5.000µg/kg. Assim, a DL
50
foi superior a
5.000µg/kg para camundongos machos ou fêmeas. Além disso, o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 (5–5.000µg/kg) não produziu
letalidade adicional dos animais durante todo o período de observação. Pode
ser observado, também, que o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 (5–5.000µg/kg), administrado agudamente pela via oral,
tanto para camundongos machos quanto para fêmeas, produziu piloereção e
alteração da sensibilidade ao aperto da cauda, principalmente em doses mais
elevadas (500-5.000µg/kg). As alterações foram observadas somente durante as
24h após a administração do extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10. No entanto, o mesmo tratamento dos animais com o
extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 não foi capaz de
produzir outras alterações comportamentais significativas sugestivas de
toxicidade aguda (tais como: contorções abdominais, tremores, convulsões,
aumento da freqüência cardíaca e respiratória, sinal de straub, ptose, entre
outros), quando comparado com os animais controles, tratados com salina
(Tabelas 3 e 4).
95
Tabela 3 - Efeito do tratamento agudo realizado com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 observado 0,25,
0,5, 1, 2, 4, 8 e 24h após sua administração pela via oral, sobre
alguns parâmetros comportamentais indicativos de toxicidade
aguda em camundongos machos
(continua)
Parâmetros avaliados
Dose
(µg/kg, v.o.)
0,25h
0,5h
1h 2h 4h 8h 24h
0 10/0 10/0 10/0
10/0
10/0 10/0
9/1
5 10/0 10/0 10/0
10/0
10/0 10/0
10/0
50 10/0 10/0 10/0
10/0
10/0 10/0
10/0
500 10/0 10/0 10/0
10/0
10/0 10/0
10/0
Resposta ao
toque
5.000 10/0 10/0 10/0
10/0
10/0 10/0
10/0
0 10/0 10/0 10/0
10/0
10/0 10/0
10/0
5 10/0 10/0 9/1 9/1 10/0 10/0
8/2
50 10/0 10/0 10/0
10/0
10/0 10/0
10/0
500 10/0 10/0 9/1 4/6 10/0 5/5 10/0
Aperto da cauda
5.000 8/2 9/1 7/3 7/3 10/0
9/1 10/0
0 10/0 10/0 10/0
10/0
10/0 10/0
10/0
5 10/0 10/0 10/0
10/0
10/0 10/0
10/0
50 10/0 10/0 10/0
10/0
10/0 10/0
10/0
500 10/0 10/0 10/0
10/0
10/0 10/0
10/0
Reflexo córneal
5.000 10/0 10/0 10/0
10/0
10/0 10/0
10/0
0 0/10 0/10 0/10
0/10
0/10 0/10
1/9
5 0/10 0/10 1/9 0/10
0/10 0/10
2/8
50 0/10 0/10 1/9 1/9 1/9 0/10
0/10
500 0/10 0/10 0/10
0/10
0/10 0/10
0/10
Aumento da freqüência
respiratória
5.000 0/10 0/10 0/10
0/10
1/9 0/10
0/10
0 0/10 0/10 0/10
0/10
0/10 0/10
1/9
5 0/10 0/10 1/9 0/10
0/10 0/10
2/8
50 0/10 0/10 1/9 3/7 0/10 0/10
0/10
500 0/10 0/10 0/10
0/10
0/10 0/10
0/10
Aumento da
freqüência
cardíaca
5.000 1/9 0/10 0/10
0/10
0/10 0/10
0/10
0 0/10 0/10 0/10
0/10
0/10 0/10
0/10
5 0/10 0/10 0/10
0/10
0/10 0/10
0/10
50 0/10 0/10 0/10
0/10
0/10 0/10
0/10
500 0/10 0/10 0/10
0/10
0/10 0/10
0/10
Contorção
5.000 0/10 0/10 0/10
0/10
0/10 0/10
0/10
0 10/0 10/0 10/0
10/0
10/0 10/0
10/0
5 10/0 10/0 10/0
10/0
10/0 10/0
10/0
50 10/0 10/0 10/0
10/0
10/0 10/0
10/0
500 10/0 10/0 10/0
10/0
10/0 10/0
10/0
Tônus corporal
5.000 10/0 10/0 10/0
10/0
10/0 10/0
10/0
0 0/10 0/10 0/10
0/10
0/10 0/10
0/10
5 0/10 0/10 0/10
0/10
0/10 0/10
0/10
50 0/10 0/10 1/9 0/10
0/10 0/10
0/10
500 1/9 0/10 0/10
0/10
0/10 0/10
0/10
Tremores
5.000 0/10 0/10 0/10
0/10
0/10 0/10
0/10
Os valores foram expressos pelo número de animais que apresentaram as alterações
comportamentais observadas em relação ao número total de animais. v.o.– via oral.
96
Tabela 3 - Efeito do tratamento agudo realizado com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 observado 0,25,
0,5, 1, 2, 4, 8 e 24h após sua administração pela via oral, sobre
alguns parâmetros comportamentais indicativos de toxicidade
aguda em camundongos machos
(conclusão)
Parâmetros
avaliados
Dose
(µg/kg, v.o.)
0,25h 0,5h 1h 2h 4h 8h 24h
0
0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
5
0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
50
0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
500
0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
Convulsões
5.000
0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
0
0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
5
0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
50
0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
500
0/10 0/10 3/7 0/10 0/10 0/10 0/10
Sinal de straub
5.000 1/9 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
0
0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
5
0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
50
0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
500
0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
Ptose
(lacrimação)
5.000
0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
0
0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 7/3 1/9
5
0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 4/6 2/8
50
0/10 0/10 0/10 6/4 5/5 2/8 3/7
500
5/5 4/6 6/4 0/10 0/10 0/10 0/10
Piloereção
5.000
10/0 5/5 5/5 4/6 4/6 4/6 1/9
0
10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
5
8/2 10/0 10/0 9/1 10/0 10/0 10/0
50
10/0 7/3 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
500
10/0 9/1 9/1 7/3 10/0 10/0 10/0
Força de agarrar
5.000
10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
Os valores foram expressos pelo número de animais que apresentaram as alterações
comportamentais observadas em relação ao número total de animais. v.o.– via oral.
97
Tabela 4 - Efeito do tratamento agudo realizado com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 observado 0,25,
0,5, 1, 2, 4 , 8 e 24h após sua administração pela via oral, sobre
alguns parâmetros comportamentais indicativos de toxicidade
aguda em camundongos fêmeas
(continua)
Parâmetros
avaliados
Dose
(µg/kg, v.o.)
0,25h 0,5h 1h 2h 4h 8h 24h
0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
5 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
50 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
500 10/0 10/0 9/1 10/0 10/0 10/0 10/0
Resposta ao
toque
5.000 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
5 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
50 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
500 10/0 8/2 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
Aperto da
cauda
5.000 10/0 10/0 7/3 10/0 10/0 10/0 10/0
0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
5 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
50 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
500 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
Reflexo
córneal
5.000 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
0 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
5 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
50 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
500 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
Aumento da
freqüência
respiratória
5.000 0/10 0/10 2/8 0/10 0/10 0/10 0/10
0 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
5 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
50 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
500 0/10 0/10 0/10 0/10 2/8 0/10 0/10
Aumento da
freqüência
cardíaca
5.000 0/10 0/10 0/10 0/10 2/8 0/10 0/10
0 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
5 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
50 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
500 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
Contorção
5.000 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
5 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
50 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
500 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
Tônus
corporal
5.000 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
0 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
5 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
50 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
500 1/9 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
Tremores
5.000 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
Os valores foram expressos pelo número de animais que apresentaram as alterações
comportamentais observadas em relação ao número total de animais. v.o.– via oral.
98
Tabela 4 - Efeito do tratamento agudo realizado com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 observado 0,25,
0,5, 1, 2, 4 , 8 e 24h após sua administração pela via oral, sobre
alguns parâmetros comportamentais indicativos de toxicidade
aguda em camundongos fêmeas
(conclusão)
Parâmetros
avaliados
Dose
(µg/kg, v.o.)
0,25h 0,5h 1h 2h 4h 8h 24h
0 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
5 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
50 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
500 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
Convulsões
5.000 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
0 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
5 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
50 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
500 0/10 0/10 7/3 9/1 0/10 0/10 0/10
Sinal de
straub
5.000 0/10 0/10 1/9 0/10 0/10 0/10 0/10
0 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
5 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
50 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
500 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
Ptose
(lacrimação)
5.000 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
0 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
5 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 2/8 0/10
50 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10 0/10
500 0/10 0/10 0/10 1/9 10/0 0/10 0/10
Piloereção
5.000 0/10 0/10 2/8 0/10 8/2 1/9 0/10
0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
5 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
50 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
500 9/1 9/1 10/0 10/0 10/0 10/0 10/0
Força de
agarrar
5.000 10/0 10/0 9/1 8/2 10/0 10/0 10/0
Os valores foram expressos pelo número de animais que apresentaram as alterações
comportamentais observadas em relação ao número total de animais. v.o.– via oral.
99
b) Toxicidade aguda após tratamento por via oral
O tratamento de camundongos com o extrato bruto antibacteriano de
Bacillus amyloliquefaciens R 10 (5 – 5.000 µg/kg), administrado agudamente por
via oral, tanto para camundongos machos quanto para fêmeas, não alterou de
forma significativa o peso corporal relativo dos animais (com exceção das fêmeas
na dose de 50 µg/kg que aumentou), nem tampouco o consumo de água e de
comida (Tabelas 5 e 6).
Os dados apresentados na Figura 5 mostram que o tratamento dos
camundongos machos com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 (5 – 5.000 mg/kg), administrado agudamente pela via oral
não alterou, de forma significativa, o peso corporal absoluto dos animais, ao longo
de todo o período analisado, em relação ao controle. Contudo, o mesmo
tratamento dos camundongos fêmeas, alterou de forma significativa o peso
corporal absoluto dos animais, somente na dose de 500 µg/kg e nos 1º, 4º, 11º e
14º dias de observação em relação ao controle. No entanto, é importante
mencionar, que esta redução é devido à diferença de peso dos animais no início
do tratamento e não em função do tratamento específico (Figura 5).
100
Tabela 5 - Efeito do tratamento agudo realizado com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10,
administrado pela via oral, sobre a variação da massa corporal de camundongos analisados do 1º ao 14º dia após o
tratamento
Grupo
(µg/kg, v.o.)
Sexo
1
a
dia
Peso dos
animais (g)
4
a
dia
Peso dos
animais (g)
7
a
dia
Peso dos
animais (g)
9
a
dia
Peso dos
animais (g)
11
a
dia
Peso dos
animais (g)
14
a
dia
Peso dos
animais (g)
Diferença Final
Peso dos
animais (g)
0 Macho 2,6 + 0,27 -0,2 + 0,42 0,5 + 0,31 -0,7 + 0,33 1,0 + 0,70 0,6 + 0,16 3,8 + 0,58
5 Macho 3,6 + 0.65 -0,6 + 0,70 0,8 + 0,29 -0,2 + 0,49 1,1 + 0,82 -0,2 + 0,41 5,5 + 1,23
50 Macho 3,5 + 0.50 0,8 + 0,33 0,3 + 0,21 0,8 + 0,80 -0,4 + 0,22 0,4 + 0,16 4,6 + 0,52
500 Macho 1,5 + 0.73 1,1 + 0,94 0,1 + 0,10 0,8 + 0,20 0,5 + 0,37 0,4 + 0,30 4,4 + 084
5.000 Macho 3,3 + 0.21 -0,7 + 0,33 1,4 + 0,60 -0,5 + 0,80 0,7 + 0,39 0,4 + 0,22 4,6 + 0,72
0 Fêmea 2,0 + 0,47 0,6 + 0,50 0,3 + 0,36 0,1 + 0,55 0,3 + 0,33 0,5 + 0,30 3,8 + 1,30
5 Fêmea 2,0 + 0,44 0,0 + 1,01 0,5 + 0,30 1,4 + 1,72 -1,9 + 1,49 0,7 + 0,26 2,7 + 1,00
50 Fêmea 3,6 + 1,04 0,7 + 0,26 0,3 + 0,33 0,7 + 0,21 0,2 + 1,04 0,7 + 0,26 6,2 + 0,87***
500 Fêmea -1,5 + 0,93** 0,1 + 0,23 1,7 + 0,26* -4,0 + 0,76** 2,9 + 0,74 0,4 + 0,22 1,6 + 1,00
5.000 Fêmea 1,9 + 0,38 -0,7 + 0,47 -0,3 + 0,26 1,3 + 0,55 1,5 + 0,6 0,5 + 0,30 4,2 + 0,36
Os valores representam a média de 10 animais ± o erro padrão da média. v.o.– via oral.
Os valores foram obtidos através da variação do peso dos animais (em gramas, g) nos respectivos dias (1
o
, 4
o
, 7
o
, 9
o
, 11
o
e 14
o
) ao longo do
tratamento.
A diferença final representa a diferença de massa corpórea obtida da variação média do peso dos animais no 14
a
dia com a variação média do peso
dos animais no 1
a
dia.
Difere significativamente do grupo controle (veículo, 0): * p<0,05; ** p<0,01 e *** p<0,001; teste SNK.
101
Tabela 6 - Efeito do tratamento agudo realizado com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, administrado
pela via oral, sobre a variação do consumo médio de ração e água
de camundongos no final do tratamento
Grupo
(µg/kg, v.o.)
Sexo Ração (g) Água (ml)
0 Macho 6,59 + 0,29 6,39 + 1,05
5 Macho 7,16 + 0,29 7,01 + 0,83
50 Macho 6,18 + 0,23 6,65 + 0,64
500 Macho 6,75 + 1,67 5,21 + 1,05
5.000 Macho 6,10 + 0,22 5,26 + 0,51
0 Fêmea 5,43 + 0,32 6,53 + 0,92
5 Fêmea 5,54 + 0,24 5,87 + 0,39
50 Fêmea 5,05 + 0,38 5,11 + 0,21
500 Fêmea 5,27 + 0,42 7,61 + 1,34
5.000 Fêmea 4,84 + 0,26 4,88 + 0,15
Os valores representam a média da variação da ingesta sólida
(g/animal/dia) e líquida (ml/animal/dia) de 10 animais ± o erro padrão da
média. v.o.– via oral.
102
0 1 4 7 9 11 14
25
30
35
40
45
C
5 mg/kg
50 mg/kg
500 mg/kg
5000 mgkg
Dias após tratamento
A
Peso Corporal (g)
0 1 4 7 9 11 14
20
25
30
35
40
C
5 mg/kg
50 mg/kg
500 mg/kg
5000 mg/kg
Dias após o tratamento
*
**
**
**
B
Peso Corporal (g)
Figura 5 - Efeito do tratamento agudo (14 dias) realizado com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 (5 - 5.000 µg/kg) ou
veículo, administrado pela via oral, numa única administração, sobre o
peso corporal absoluto de camundongos machos (A) e fêmeas (B).
Cada ponto representa a média de 10 animais e as linhas verticais
representam o erro padrão da média. Difere significativamente do
grupo controle (veículo, C): *p<0,05 e **p<0,01; teste SNK.
O extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 não
causou alteração macroscópica importante quanto ao aspecto e a cor de alguns
órgãos e/ou glândulas analisados (coração, pulmão, fígado, rins, baço, estômago,
testículos, ovário e tubas uterinas, glândula salivar, glândula adrenal, timo,
linfonodo mesentérico e encéfalo), quando comparado com o grupo controle e
avaliado no 14° dia após sua administração. Além disso, o tratamento dos
camundongos machos com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 (5 – 5.000 µg/kg), administrado agudamente pela via oral,
não causou alteração de forma significativa tanto do peso relativo quanto do peso
absoluto do coração, testículos, fígado, linfonodo mesentérico, rins, baço,
estômago, glândula salivar, glândula adrenal, timo e encéfalo, quando comparado
com o grupo controle e avaliado no 14° dia após sua administração, com exceção
do pulmão, onde causou um aumento significativo no peso absoluto na dose de
5.000 µg/kg (Tabelas 7, 8, 9 e 10). No entanto, os camundongos fêmeas tratados
103
Tabela 7 - Efeito do tratamento agudo realizado com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10,
administrado pela via oral, sobre o peso relativo do baço, rins, coração, pulmão, fígado, linfonodo mesentérico,
glândula adrenal, timo, estômago, encéfalo, testículos e glândula salivar de camundongos machos
Extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 (µg/kg, v.o.)
Estrutura
0 5 50 500 5.000
Baço 0,35
(0,29 – 0,40)
0,39
(0,31 – 0,48)
0,36
(0,30 – 0,42)
0,34
(0,29 – 0,40)
0,37
(0,32 – 0,41)
Rins 0,68
(0,64 – 0,71)
0,67
(0,61 – 0,72)
0,73
(0,60 – 0,85)
0,66
(0,60 – 0,74)
0,67
(0,63 – 0,71)
Coração 0,46
(0,43 – 0,50)
0,50
(0,44 – 0,56)
0,47
(0,40 – 0,53)
0,44
(0,41 – 0,46)
0,46
(0,40 – 0,52)
Pulmão 0,64
(0,59 – 0,69)
0,68
(0,60 – 0,75)
0,65
(0,54 – 0,76)
0,78
(0,69 – 0,88)
0,94
(0,80 – 0,11)
Fígado 4,6
(4,3 – 4,9)
4,3
(3,5 – 5,2)
4,5
(4,3 – 4,7)
4,3
(3,8 – 4,7)
4,6
(4,4 – 4,8)
Linfonodo
mesentérico
0,06
(0,04 – 0,08)
0,04
(0,02 – 0,06)
0,02
(0,004 – 0,03)
0,05
(0,02 – 0,08)
0,04
(0,03 – 0,05)
Glândula
adrenal
0,013
(0,009 – 0,017)
0,011
(0,007 – 0,016)
0,011
(0,005 – 0,016)
0,010
(0,006 – 0,013)
0,008
(0,005 – 0,003)
Timo 0,11
(0,08 – 0,14)
0,09
(0,05 – 0,13)
0,10
(0,04 – 0,15)
0,11
(0,08 – 0,14)
0,09
(0,04 – 0,14)
Estômago 0,69
(0,64 – 0,74)
0,75
(0,65 – 0,85)
0,70
(0,58 – 0,83)
0,71
(0,61 – 0,81)
0,70
(0,62 – 0,78)
Encéfalo 1,16
(1,10 – 1,22)
1,17
(1,07 – 1,27)
1,14
(1,07 – 1,22)
1,08
(0,92 – 1,23)
1,24
(1,15 – 1,34)
Testículos 0,18
(0,14 – 0,22)
0,11
(0,06 – 0,16)
0,14
(0,09 – 0,18)
0,16
(0,11 – 0,20)
0,16
(0,13 – 0,10)
Glândula
salivar
0,29
(0,20 – 0,38)
0,31
(0,22 – 0,40)
0,39
(0,18 – 0,60)
0,28
(0,23 – 0,33)
0,25
(0,18 – 0,33)
Os valores representam a média de peso dos órgãos de 10 animais juntamente com o intervalo de confiança a 95%.
Os valores foram obtidos através da relação (em percentagem) do peso dos órgãos pela massa corpórea dos animais
(através da seguinte fórmula: peso do órgão/peso do animal x 100). v.o.– via oral. Teste SNK.
104
Tabela 8 - Efeito do tratamento agudo realizado com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10,
administrado pela via oral, sobre o peso absoluto do baço, rins, coração, pulmão, fígado, linfonodo mesentérico,
glândula adrenal, timo, estômago, encéfalo, testículos e glândula salivar de camundongos machos
Extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 (µg/kg, v.o.)
Estrutura
0 5 50 500 5.000
Baço 137,20
(113,70 – 160,80)
157,20
(132,50 – 181,90)
151,40
(124,60 – 178,20)
136,80
(118,60 – 154,90)
136,10
(118,40 – 153,70)
Rins 268,80
(242,20–295,40)
273,20
(250,80–295,50)
272,40
(238,60–306,30)
263,90
(244,60–283,30)
249,20
(231,70–266,60)
Coração 185,20
(163,70 – 206,70)
202,30
(183,30 – 221,30)
192,00
(162,50 – 221,50)
175,10
(161,50 – 188,60)
169,20
(146,20 -192,20)
Pulmão 253,00
(231,80 – 274,20)
284,80
(253,40 – 316,20)
271,20
(221,90 – 320,60)
309,90
(281,60 – 338,20)
350,00**
(298,80 – 403,20)
Fígado 1.840,00
(1656,00 – 2024,00)
1671,00
(1364,00 – 1978,00)
1875,00
(1729,00 – 2020,00)
1696,00
(1537,00 -1854,00)
1714,00
(1567,00 – 1861,00)
Linfonodo
mesentérico
25,20
(17,62 – 32,90)
17,72
(9,94 – 25,50)
12,93
(6,04 – 19,82)
17,50
(5,34 – 29,65)
14,08
(9,51 – 18,65)
Glândula
adrenal
4,97
(3,43 – 6,50)
7,30
(2,57 – 12,02)
4,92
(2,69 – 7,15)
4,06
(2,50 – 5,61)
6,57
(2,41 – 10,73)
Timo 45,14
(34,51 – 55,77)
38,96
(23,60 – 54,32)
34,94
(23,46 – 46,42)
45,53
(31,71 – 59,15)
61,36
(33,32 – 89,41)
Estômago 272,70
(253,40 – 292,10)
305,90
(272,50 – 339,20)
295,20
(238,80 – 351,60)
281,30
(247,30 – 315,30)
260,40
(231,60 – 289,20)
Encéfalo 71,59
(53,68 – 89,50)
52,17
(29,90 – 74,54)
65,87
(55,19 – 76,55)
71,24
(61,47 – 81,02)
64,71
(53,07 – 76,35)
Testículos 461,10
(435,50 – 486,60)
476,20
(462,20 – 490,20)
474,80
(446,80 – 502,90)
447,20
(427,80 – 466,60)
417,60
(320,60 – 514,50)
Glândula
salivar
127,5
(111,30 – 143,70)
132,70
(97,28 -168,20)
126,40
(106,10 – 146,60)
110,70
(93,13 – 128,20)
102,00
(83,21 – 120,80)
Os valores representam a média de peso dos órgãos de 4 - 10 animais juntamente com o intervalo de confiança a 95%. v.o.– via oral.
Os valores foram obtidos através da média dos pesos dos órgãos em mg.
Difere significativamente do grupo controle (veículo, 0): ** p<0,01; teste SNK.
105
Tabela 9 - Efeito do tratamento agudo realizado com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10,
administrado pela via oral, sobre o peso relativo do baço, rins, coração, pulmão, fígado, linfonodo mesentérico,
glândula adrenal, timo, estômago, ovário e tubas uterinas, encéfalo e glândula salivar de camundongos fêmeas
Extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 (µg/kg, v.o.)
Estrutura
0 5 50 500 5.000
Baço 0,63
(0,41 – 0,84)
0,49
(0,43 – 0,55)
0,50
(0,45 – 0,54)
0,46
(0,41 – 0,50)
0,53
(0,47 – 0,59)
Rins 0,60
(0,55 – 0,66)
0,61
(0,45 – 0,78)
0,49
(0,47 – 0,52)
0,54
(0,57 – 0,62)
0,54
(0,50 – 0,57)
Coração 0,46
(0,43 – 0,49)
0,50
(0,43 – 0,57)
0,41
(0,38 – 0,43)
0,48
(0,41 – 0,55)
0,44
(0,39 – 0,49)
Pulmão 1,04
(0,90 – 1,18)
0,77
(0,66 – 0,88)
0,77
(0,65 – 0,89)
0,77
(0,68 – 0,86)
0,73
(0,58 – 0,88)
Fígado 4,80
(4,20 – 5,30)
4,40
(4,20 – 4,70)
4,20
(3,90 – 4,40)
4,20
(3,90 – 4,60)
4,30
(4,10 – 4,40)
Linfonodo
mesentérico
0,05
(0,03 – 0,069)
0,05
(0,03 – 0,063)
0,04
(0,01 – 0,061)
0,04
(0,01 – 0,061)
0,06
(0,02 – 0,091)
Glândula
adrenal
0,031
(0,022 – 0,041)
0,022
(0,014 – 0,029)
0,026
(0,020 – 0,034)
0,025
(0,017 – 0,033)
0,024
(0,017 – 0,031)
Timo 0,200
(0,129 – 0,271)
0,225
(0,186 – 0,265)
0,208
(0,161 – 0,255)
0,312
(0,229 – 0,395)
0,214
(0,186 – 0,243)
Estômago 1,02
(0,91 – 1,12)
0,92
(0,86 – 0,98)
0,94
(0,87 – 1,01)
1,07
(0,98 – 1,17)
0,94
(0,87 – 1,01)
Ovário e
tubas uterinas
1,37
(1,00 – 1,73)
1,13
(0,70 – 1,56)
1,14
(1,32 – 1,54)
1,15
(1,33 – 1,60)
1,38
(1,31 – 1,44)
Encéfalo 0,92
(0,69 – 1,15)
1,31
(1,06 – 1,57)
0,74
(0,59 – 0,89)
0,75
(0,63 – 0,86)
0,68
(0,58 – 0,79)
Glândula
salivar
0,32
(0,24 – 0,40)
0,41
(0,19 – 0,64)
1,95
(0,15 – 0,24)
1,69
(0,09 – 0,24)
1,72
(0,15 – 0,19)
Os valores representam a média de peso dos órgãos de 4 - 10 animais juntamente com o intervalo de confiança a 95%. v.o.– via oral.
Os valores foram obtidos através da relação (em percentagem) do peso dos órgãos pela massa corpórea dos animais (através da seguinte
fórmula: peso do órgão/peso do animal x 100). Teste SNK.
106
Tabela 10 - Efeito do tratamento agudo realizado com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10,
administrado pela via oral, sobre o peso absoluto do baço, rins, coração, pulmão, fígado, linfonodo mesentérico,
glândula adrenal, timo, estômago, encéfalo, ovário e tubas uterinas, encéfalo e glândula salivar de camundongos
fêmeas
Extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 (µg/kg, v.o.)
Estrutura
0 5 50 500 5.000
Baço 192,90
(141,00 – 244,70)
165,30
(140,20 – 190,40)
171,20
(151,80 – 190,70)
130,00*
(116,30 – 143,80)
180,50
(162,50 -198,50)
Rins 184,50
(156,70 -212,30)
201,60
(134,80 – 268,50)
170,10
(155,70 – 184,40)
169,70
(158,50 – 180,90)
182,70
(171,70 – 193,70)
Coração 146,00
(133,60 – 158,30)
156,20
(135,90 – 176,50)
138,20
(126,70 -149,80)
146,70
(103,80 – 189,60)
149,40
(133,40 – 165,40)
Pulmão 325,90
(289,50 -362,40)
258,60*
(229,90 – 287,70)
263,70**
(223,80 – 303,60)
218,50***
(193,80 – 243,20)
247,80**
(200,70 – 295,00)
Fígado 1480,00
(1377,00 – 1583,00)
1481,00
(1304,00 – 1659,00)
1427,00
(1288,00 – 1566,00)
1208,00**
(1102,00 – 1314,00)
1448,00
(1359,00 -1538,00)
Linfonodo
mesentérico
18,26
(10,97 – 25,55)
15,80
(10,46 – 21,14)
14,60
(6,65 – 22,54)
12,80
(5,36 – 20,24)
22,24
(10,02 – 34,47)
Glândula
adrenal
10,39
(7,65 – 13,13)
9,70
(5,64 – 13,75)
9,26
(6,98 -11,53)
7,23
(4,99 – 9,46)
8,68
(6,13 – 11,23)
Timo 73,20
(63,73 – 82,67)
75,55
(60,66 – 90,44)
72,78
(55,78 – 89,78)
89,86
(62,95 – 117,0)
73,20
(63,73 – 82,67)
Estômago 320,30
(282,80 – 357,90)
306,30
(277,40 – 335,30)
322,20
(292,70 – 351,70)
305,00
(281,30 – 328,60)
321,90
(298,40 – 345,40)
Ovário e
tubas uterinas
294,90
(207,30 – 382,50)
433,20**
(356,80 – 509,60)
250,00
(179,80 – 269,50)
224,70
(179,80 – 269,50)
232,10
(197,20 – 267,00)
Encéfalo 463,00
(431,90 – 494,00)
477,10
(456,10 – 449,90)
472,30
(449,90 – 494,60)
433,80
(400,00 – 467,60)
468,90
(441,50 – 496,30)
Glândula
salivar
100,40
(74,95 – 126,20)
130,50
(96,48 – 164,50)
70,10
(53,35 – 86,85)
55,51**
(41,41 – 69,61)
59,65**
(52,65 – 65,51)
Os valores representam a média de peso dos órgãos de 4 - 10 animais juntamente com o intervalo de confiança a 95%. v.o.– via oral.
Os valores foram obtidos através da média dos pesos dos órgãos em mg.
Difere significativamente do grupo controle (veículo, 0): * p<0,05, ** p<0,01 e *** p<0,001; teste SNK.
107
agudamente com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens
R 10 (5 - 5.000 µg/kg), administrado pela via oral, apresentaram redução
significativa do peso absoluto do baço, fígado, glândula salivar e pulmão na dose
de 500 µg/kg, 500 µg/kg, 500 e 5.000 µg/kg e 5, 50, 500 e 5.000 µg/kg,
respectivamente. Em contrapartida, no ovário e tubas uterinas dos camundongos
fêmeas, o tratamento com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 (5 - 5.000 µg/kg), administrado pela via oral, causou
aumento significativo do peso absoluto na dose de 5 µg/kg (Tabela 10).
A ausência de letalidade observada no estudo de toxicidade aguda oral do
extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens R 10 em camundongos, está de
acordo com os realizados com outras bacteriocinas produzidas por bactérias do
gênero Bacillus.
He; Chen e Liu (2006) constataram, no estudo de toxicidade aguda em
camundongos, que a nova bacteriocina isolada de Bacillus licheniformes não
apresentava efeitos colaterais, quando administrada por via oral (gavagem), numa
dose de 0,8mg/20g de peso corpóreo. Não houve mortalidade nos 6 grupos de
animais estudados. Cada grupo foi tratado, diariamente, com 0,26, 0,33, 0,41,
0,51, 0,64 e 0,80ml/20g do sobrenadante estéril da cultura de Bacillus
licheniformes numa concentração de 1mg/ml. Não foram encontradas alterações
histológicas no coração, fígado, baço, pulmões, rins, estômago e intestino. Os
autores concluíram que essa substância antimicrobiana poderia ser utilizada
como bioconservante natural, haja vista que é ativa contra alguns microrganismos
patogênicos e deteriorantes, como Staphylococcus aureus e Micrococcus flavus.
Conclui-se, portanto, que o extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens
R 10, quando administrado agudamente pela via oral até a dose de 5.000µg/kg
em camundongos de ambos os sexos, demonstrou boa tolerabilidade e poucos
efeitos tóxicos importantes. Contudo, as principais alterações observadas foram
somente nos camundongos fêmeas, justificando assim a continuação dos estudos
toxicológicos por doses repetidas.
108
5.7 Análise toxicológica de doses repetidas
a) Toxicidade por doses repetidas
O extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 (nas
doses de 50, 500 e 5.000µg/kg, contendo 20 animais por grupo) administrado
diariamente por 90 dias consecutivos, pela via oral, tanto em camundongos
machos quanto para fêmeas, produziu a morte de 5 a 15% dos animais durante
os 90 dias de tratamento, sendo a DL
50
superior a 5.000µg/kg, enquanto que a
letalidade observada nos animais tratados com veículo (grupos controles) foi de
5%. A Tabela 11 mostra o período (em dias) após o início do tratamento com o
extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 (50 – 5.000µg/kg)
ou com o veículo (10ml/kg) em que ocorreram as mortes, bem como o número de
camundongos machos e fêmeas que morreram em cada período. Além disso, o
tratamento dos animais durante 90 dias com o extrato bruto antibacteriano de
Bacillus amyloliquefaciens R 10 não produziu outras alterações comportamentais
significativas, sugestivas de toxicidade, quando comparado com os animais
controles (tratados com o veículo), que comprometesse a continuidade do
tratamento.
109
Tabela 11 - Relação do período e número de camundongos machos ou fêmeas
que morreram ao longo do tratamento realizado com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 ou veículo
(10 ml/kg), administrado pela via oral, durante 90 dias
Camundongos machos Camundongos fêmeas
Extrato bruto (µg/kg, v.o.) Extrato bruto (µg/kg, v.o.)
Período
após
tratamento
(dias)
0 50 500 5.000 0 50 500 5.000
2º
3º
4º
5º
6º 1 1
7º 1
9º 1
10º
12º 1 1
14º 1
15º
16º 1 1
20º
21º 1
32º
37º
39º 1
45º
46º 1
Total 1 2 3 2 0 1 2 1
v.o.– via oral.
b) Influência do tratamento prolongado dos animais com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 sobre a massa corporal,
consumo de comida e água
O tratamento com doses repetidas do extrato bruto antibacteriano de
Bacillus amyloliquefaciens R 10 (nas doses de 50, 500 e 5.000µg/kg),
administrado por 90 dias consecutivos, pela via oral, tanto em camundongos
machos quanto fêmeas, promoveu redução ou aumento de forma significativa da
massa corporal dos animais ao longo do tratamento, quando comparado com o
grupo controle. Contudo, é importante mencionar que camundongos fêmeas, mas
não os camundongos machos, apresentaram maior sensibilidade a redução do
peso corporal ao final do tratamento, sendo que este efeito foi significativo na
dose de 50µg/kg (Tabela 12). É importante ressaltar que a redução significativa
110
Tabela 12 - Efeito do tratamento por doses repetidas, durante 90 dias consecutivos realizado com o extrato bruto antibacteriano de
Bacillus amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre a variação de peso corporal de camundongos ao
longo do tratamento
(continua)
Grupo
(µg/kg, v.o.)
Sexo
1
a
semana
Peso dos
animais (g)
2
a
semana
Peso dos
animais (g)
3
a
semana
Peso dos
animais (g)
4
a
semana
Peso dos
animais (g)
5
a
semana
Peso dos
animais (g)
6
a
semana
Peso dos
animais (g)
0 Macho
1,67 ± 0,19 0,07 ± 0,28 -0,36 ± 0,34 3,10 ± 0,25 -1,73 ± 0,50 2,07 ± 0,68
50 Macho
1,09 ± 0,38 0,17 ± 0,14 -1,51 ± 0,48 4,36 ± 0,63 -4,1 ± 0,29*** 3,87 ± 0,38**
500 Macho
1,39 ± 0,50 -0,70 ± 0,19* 0,66 ± 0,53 3,88 ± 0,21 -1,72 ± 0,20 4,02 ± 0,25*
5.000 Macho
1,61 ± 0,38 -0,35 ± 0,17 -0,24 ± 0,38 1,93 ± 0,56 -0,38 ± 0,42* 1,88 ± 0,34
0 Fêmea
0,79 ± 0,13 -0,72 ± 0,22 1,51 ± 0,18 -0,28 ± 0,28 1,45 ± 0,30 0,19 ± 0,23
50 Fêmea
0,25 ± 0,25 -2,46 ± 0,22*** 3,24 ± 0,53** -0,29 ± 0,20 -0,90 ± 0,38*** 0,16 ± 0,26
500 Fêmea
0,28 ± 0,12 -1,47 ± 0,23 3,24 ± 0,19** -0,30 ± 0,24 -0,11 ± 0,29** -0,005 ± 0,20
5.000 Fêmea
1,46 ± 0,37 -0,74 ± 0,31 2,73 ± 0,37* -0,04 ± 0,25 0,40 ± 0,25* -0,22 ± 0,24
Os valores representam a média de 17 - 20 animais ± o erro padrão da média. v.o.– via oral.
Os valores foram obtidos através da variação semanal de peso dos animais (em gramas, g) ao longo do tratamento.
A diferença final representa a diferença de massa corpórea obtida da variação média do peso dos animais na 13
a
semana com a variação média do peso dos
animais na 1
a
semana.
Difere significativamente do grupo controle (veículo, 0): *p<0,05; **p<0,01 e ***p<0,001; teste SNK.
111
Tabela 12 - Efeito do tratamento por doses repetidas, durante 90 dias consecutivos realizado com o extrato bruto antibacteriano de
Bacillus amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre a variação de peso corporal de camundongos ao
longo do tratamento
(conclusão)
Grupo
(µg/kg, v.o.)
Sexo
7
a
semana
Peso dos
animais (g)
8
a
semana
Peso dos
animais (g)
9
a
semana
Peso dos
animais (g)
10
a
semana
Peso dos
animais (g)
11
a
semana
Peso dos
animais (g)
12
a
semana
Peso dos
animais (g)
13
a
semana
Peso dos
Animais (g)
Diferença de
Peso final
(g)
0
Macho
0,37 ± 0,19 2,29 ± 0,41 1,02 ± 0,46 0,57 ± 0,54 1,15 ± 0,78 0,09 ± 0,26 0,87 ± 0,64 8,56 ± 0,62
50
Macho
0,10 ± 0,19 3,09 ± 0,76 2,16 ± 0,76 2,15 ± 0,48 0,87 ± 0,56 0,81 ± 0,47 1,22 ± 0,51 11,22 ± 0,80
500
Macho
0,28 ± 0,20 1,29 ± 0,45 0,98 ± 0,38 0,54 ± 0,34 0,86 ± 0,41 1,54 ± 0,69 1,89 ± 0,28 11,16 ± 0,94
5.000
Macho
0,20 ± 0,17 2,80 ± 0,87 0,20 ± 0,41 0,71 ± 0,26 1,68 ± 0,18 1,32 ± 0,35 0,44 ± 0,34 10,05 ± 1,68
0
Fêmea
0,015 ± 0,34
2,35 ± 0,36 -0,61 ± 0,77 2,12 ± 0,56 -0,12 ± 0,25 1,92 ± 0,41 1,00 ± 0,33 9,32 ± 0,60
50
Fêmea
0,32 ± 0,43 3,016 ± 0,27
0,69 ± 0,21 0,42 ± 0,29 0,05 ± 0,17 2,04 ± 0,48 0,35 ± 0,22 5,33 ± 0,70**
500
Fêmea
0,06 ± 0,67 1,27 ± 0,30 0,58 ± 0,40 1,56 ± 0,28 0,21 ± 0,37 0,44 ± 0,74 1,18 ± 0,35 7,53 ± 0,91
5.000
Fêmea
-0,64 ± 067 1,64 ± 0,30 0,62 ± 037 0,93 ± 0,89 -0,40 ± 0,98 -0,38 ± 0,84 0,64 ± 0,15 6,78 ± 1,19
Os valores representam a média de 17 - 20 animais ± o erro padrão da média. v.o.– via oral.
Os valores foram obtidos através da variação semanal de peso dos animais (em gramas, g) ao longo do tratamento.
A diferença final representa a diferença de massa corpórea obtida da variação média do peso dos animais na 13
a
semana com a variação média do peso dos
animais na 1
a
semana.
Difere significativamente do grupo controle (veículo, 0): *p<0,05; **p<0,01 e ***p<0,001; teste SNK.
112
da massa corpórea de camundongos fêmeas tratados com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 não foi acompanhada de
redução significativa da ingesta de comida e líquido (água), tanto em
camundongos machos quanto fêmeas (Tabela 13). Logo, o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 não alterou o consumo de
ração e água e nem tão pouco o ganho de peso em camundongos machos e
fêmeas ao final do experimento.
Em estudos de toxicidade de longo prazo é comum ocorrer obesidade nos
animais. A propensão à obesidade ocorre, geralmente, quando a ração é
administrada ad libitum ou quando não existem condições adequadas para o
exercício físico. Alguns genes que determinam a propensão à obesidade têm sido
descobertos em algumas linhagens de roedores, porém deve-se analisar com
cautela a verdadeira relevância do modelo animal para o estudo da interação da
obesidade com a toxicidade de aditivos alimentares, bem como sua influência na
saúde dos animais e do próprio ser humano. Vários estudos mostram que uma
pequena restrição calórica na dieta de ratos pode reduzir a incidência e
severidade de várias patologias, incluindo a formação de tumor (BARLOW et al.,
2002).
113
Tabela 13 - Efeito do tratamento prolongado durante 90 dias consecutivos
realizado com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre a
variação do consumo médio de ração e água de camundongos no
final do tratamento
Grupo
(µg/kg, v.o.)
Sexo Ração (g) Água (ml)
0 Macho 5,13 ± 0,30 7,56 ± 0,32
50 Macho 5,50 ± 0,18 7,04 ± 0,33
500 Macho 5,83 ± 0,14 6,98 ± 0,30
5.000 Macho 5,72 ± 0,09 7,41 ± 0,33
0 Fêmea 5,21 ± 0,18 6,43 ± 0,23
5 Fêmea 5,05 ± 0,09 6,67 ± 0,26
500 Fêmea 4,96 ± 0,13 6,41± 0,23
5.000 Fêmea 4,86 ± 0,11 6,56 ± 0,24
Os valores representam a média da variação da ingesta sólida (g/animal/dia) e
líquida (ml/animal/dia) de 17 - 20 animais ± o erro padrão da média. v.o.– via
oral. Teste SNK.
114
c) Influência do tratamento prolongado dos animais com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 sobre alguns parâmetros
hematológicos
O tratamento prolongado dos camundongos machos ou fêmeas com o
extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 (50 – 5.000µg/kg),
administrado diariamente por 90 dias consecutivos, por via oral, produziu
alterações pontuais na atividade hematopoiética da medula óssea, determinada
através dos seguintes parâmetros hematológicos: hematócrito, contagem de
hemácias, plaquetas, hemoglobina e contagem de leucócitos. O tratamento de
camundongos machos e fêmeas com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 (50 – 5.000µg/kg), administrado por via oral, não produziu
alteração significativa dos parâmetros hematológicos analisados (hematócrito,
contagem de hemácias, leucócitos, plaquetas e hemoglobina) quando
comparados com o grupo controle (Tabela 14). Por outro lado, a contagem
diferencial das células sangüíneas não foi alterada nos diferentes grupos
experimentais quando comparados com o grupo controle (Tabela 15).
Pablo et al. (1999), investigaram o efeito da nisina na resposta imunológica
em camundongos. A nisina comercial (Nisaplin
®
) foi incorporada à dieta dos
animais por 30, 75 e 100 dias. Quando administrada por curto prazo, a nisina
induziu um aumento na contagem de linfócitos T e diminuiu a contagem dos
linfócitos B. Esse efeito não foi observado quando a bacteriocina foi administrada
por longo prazo, porém observou-se um aumento significativo na fração de
monócitos/macrófagos no sangue periférico após 100 dias de administração.
Após administração de baixas doses de Nisaplin
®
observou-se uma diminuição da
atividade fagocítica das células peritoniais. Além das ações imunomodulatórias
observadas, os pesquisadores descrevem que o uso de nisina na dieta induz ao
aumento de peso, beneficiando a nutrição dos animais.
115
Tabela 14 - Efeito do tratamento prolongado durante 90 dias consecutivos realizado com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre alguns parâmetros hematológicos em camundongos
Grupo
(µg/kg, v.o.)
Sexo
Hemácias
(x 10
6/
mm
3)
Hematócrito
(%)
Hemoglobina
(g/dL)
Leucócitos
(x 10
3
/mm
3
)
Plaquetas
(x 10
3
/mm
3
)
0 Macho
8,2
(7,70-8,69)
41,05
(38,58–43,52)
13,03
(11,93-14,12)
6,28
(4,67 – 7,89)
902,00
(842,71-961,29)
50 Macho
8,08
(7,14-9,01)
40,32
(35,65-44,99)
13,17
(11,65-14,70)
9,65
(7,83 – 11,98)
965,30
(919,16-1011,40)
500 Macho
8,56
(8,07-9,05)
42,75
(40,32-45,18)
13,97
(13,17-14,76)
8,99
(7,44 – 10,54)
939,90
(874,10-1005,60)
5.000 Macho
8,12
(6,84-9,41)
40,45
(34,81-46,09)
12,96
(11,98-14,73)
8,22
(6,06 – 10,39)
918,50
(839,70-997,30)
0 Fêmea
8,01
(7,46-8,55)
39,97
(37,25-42,67)
13,06
(12,17-13,95)
8,77
(6,14 – 11,40)
808,70
(680,34-937,06)
50 Fêmea
8,27
(7,88-8,65)
41,27
(39,36-43,17)
13,49
(12,86-14,11)
9,98
(7,02 – 12,94)
977,00
(804,57-1149,40)
500 Fêmea
8,08
(7,80-8,36)
40,35
(39,96-41,74)
13,19
(12,74-13,64)
7,93
(5,95 – 9,91)
838,70
(676,57-1000,80)
5.000 Fêmea
7,49
(6,83-8,15)
37,48
(34,2-40,76)
12,25
(11,18-13,32)
10,18
(6,65 – 13,71)
1008,60
(815,77-1201,40)
Os valores representam a média de 10 - 12 animais juntamente com o intervalo de confiança de 95%. v.o.– via oral.
Teste SNK.
116
Tabela 15 - Efeito do tratamento prolongado durante 90 dias consecutivos realizado com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre o número diferencial de células sangüíneas em
camundongos
Grupo
(µg/kg, v.o.)
Sexo
Basófilo
(%)
Bastão
(%)
Segmentado
(%)
Linfócito
(%)
Monócito
(%)
0 Macho
0,08
(-0,10-0,27)
0,33
(-0,08-0,740)
7,08
(5,56-8,60)
89,08
(86,59-91,57)
3,33
(2,05-4,61)
50 Macho
0 0 6,0
(4,46-7,54)
92,92
(91,09-94,76)
1,08
(0,50-1,65)
500 Macho
0 0,25
(-0,04-0,54)
6,41
(3,63-9,19)
91,42
(88,42-94,42)
2,08
(1,21-2,96)
5.000 Macho
0 0,14
(-0,21-0,49)
9,0
(3,41-14,60)
88,0
(80,19-95,81)
2,86
(0,38-5,33)
0 Fêmea
0 0 4,6
(2,71-6,67)
94,38
(92,16-96,61)
0,92
(0,46-1,38)
50 Fêmea
0 0 5,6
(4,46-7,65)
90,37
(86,07-94,68)
2,25
(1,18-3,32)
500 Fêmea
0 0,14
(-0,07-0,35)
3,21
(1,38-5,04)
95,07
(92,73-97,41)
1,57
(0,86-2,28)
5.000 Fêmea
0 0,07
(-0,08-0,23)
4,21
(3,15-5,28)
94,35
(92,64-96,08)
1,36
(0,52-2,19)
Os valores representam a média de 10 - 12 animais juntamente com o intervalo de confiança de 95%.
v.o.– via oral. Teste SNK.
117
d) Influência do tratamento prolongado dos animais com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 sobre alguns parâmetros
bioquímicos
O tratamento prolongado de camundongos machos com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 (50 – 5.000µg/kg), administrado
diariamente por 90 dias consecutivos, por via oral, não causou alterações
significativas dos níveis plasmáticos de glicose, globulinas, albumina, proteínas
totais, bilirrubina total e indireta, creatinina, sódio, fosfatase alcalina (FA), γ-
glutamil transferase (γGT), alanina aminotransferase (ALT), aspartato
aminotransferase (AST), ácido úrico, colesterol total, colesterol LDL, colesterol
HDL, colesterol VLDL, triglicerídeos quando comparado com os animais controle.
No entanto, o mesmo tratamento de camundongos machos com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, aumentou de forma
significativa, os níveis de potássio nas doses de 50 e 5.000µg/kg e diminuiu os
níveis de uréia nas doses de 50, 500 e 5.000µg/kg, em relação ao grupo controle,
tratado com veículo (Tabela 16).
O aumento dos níveis séricos de potássio, constatado nos grupos de
camundongos machos tratados com 500 e 5.000µg/kg do extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, pode ser um indicativo de
nefropatias, principalmente com insuficiência renal e insuficiência hepática.
Apesar dessa alteração não estar associada a alterações de outros indicadores
de função renal e hepática analisados, essa hipótese só pode ser descartada por
exames histopatológicos. Já a diminuição dos níveis séricos de uréia, constatado
nos grupos de camundongos machos tratados com 50, 500 e 5.000µg/kg do
extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, não apresenta
significado clínico, dada a presença de níveis séricos de uréia menores que os
constatados no grupo controle (FLEURY, 2006).
118
Tabela 16 - Efeito do tratamento prolongado durante 90 dias consecutivos realizado com extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre alguns parâmetros bioquímicos do sangue em
camundongos machos
(continua)
Extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 (µg/kg, v.o.)
Parâmetro
bioquímico
0 50 500 5.000
Proteínas totais (g/%) 4,46
(4,26-4,66)
4,53
(4,09-4,97)
4,54
(4,27-4,97)
4,28
(3,94-4,62)
Albumina (g/%) 1,21
(1,11-1,32)
1,22
(1,02-1,42)
1,19
(1,07-1,31)
1,11
(0,98-1,24)
Globulinas (g/%)
3,24
(3,10-3,39)
3,31
(3,04-3,58)
3,35
(3,13-3,57)
3,17
(2,88-3,46)
Relação
Albumina/Globulina
0,38
(0,34-0,41)
0,37
(0,32-0,41)
0,36
(0,32-0,40)
0,35
(0,31-0,40)
Glicose (mg/dL) 136,86
(126,00-147,71)
141,20
(90,19-122,21)
133,10
(120,49-145,71)
130,60
(117,44-143,76)
Creatinina (mg/dL) 0,24
(0,17-0,30)
0,19
(0,14-0,24)
0,22
(0,12-0,31)
0,24
(0,14-0,34)
Uréia (mg/dL) 54,00
(46,90-61,10)
46,60*
(42,24-50,96)
43,00*
(38,11-47,89)
43,60*
(40,72-46,48)
Sódio (mEq/L) 146,07
(141,92-150,22)
145,00
(141,48-148,52)
139,30
(136,34-142,26)
144,00
(135,40-152,60)
Potássio (mEq/L) 4,63
(4,40-4,85)
5,17**
(4,91-5,43)
4,85
(4,61-5,09)
5,38***
(5,04-5,72)
Ácido úrico (mg/dL) 0,56
(0,39-0,74)
0,99
(0,69-1,29)
0,59
(0,36-0,82)
0,89
(0,52-1,26)
Bilirrubina total (mg/dL) 0,33
(0,30-0,35)
0,35
(0,30-0,39)
0,30
(0,28-0,33)
0,33
(0,28-0,38)
Os valores representam a média de 10 - 12 animais juntamente com o intervalo de confiança de 95%. v.o.– via oral.
Difere significativamente do grupo controle (veículo, 0): *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. Teste SNK.
119
Tabela 16 - Efeito do tratamento prolongado durante 90 dias consecutivos realizado com extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre alguns parâmetros bioquímicos do sangue em
camundongos machos
(conclusão)
Extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 (µg/kg, v.o.)
Parâmetro bioquímico
0 50 500 5.000
Bilirrubina indireta (mg/dL) 0,23
(0,21-0,25)
0,25
(0,22-0,28)
0,22
(0,20-0,23)
0,23
(0,20-0,26)
Bilirrubina direta (mg/dL) 0,16
(0,03-0,28)
0,10
(0,08-0,12)
0,09
(0,08-0,10)
0,10
(0,08-0,13)
Alanina
aminotransferase (U/L)
71,57
(52,65-90,50)
79,10
(60,65-97,55)
76,00
(61,81-90,19)
70,00
(57,44-82,56)
Aspartato
aminotransferase (U/L)
145,21
(116,29-174,14)
148,40
(109,43-187,37)
124,30
(99,99-148,61)
127,10
(100,56-153,64)
Fosfatase alcalina (U/L) 0,21
(-0,25-0,68)
0
(0,00-0,00)
0
(0,00-0,00)
0
(0,00-0,00)
Gama GT (U/L) 1,16
(0,32-1,99)
2,00
(0,65-3,35)
0,98
(0,30-1,66)
1,38
(0,84-1,92)
Colesterol total (mg/dl) 89,71
(78,01-101,42)
78,80
(60,58-97,02)
79,40
(68,70-90,10)
79,50
(69,16-89,84)
Colesterol HDL(mg/dl) 17,43
(13,15-21,70)
19,4
(17,08-21,72)
24,8
(19,10-30,50)
19,5
(11,06-27,95)
Colesterol LDL(mg/dl) 55,28
(48,26-68,31)
48,30
(31,46-65,14)
43,00
(36,02-49,98)
46,90
(37,74-56,06)
Colesterol VLDL (mg/dl) 17,00
(10,38-23,62)
11,10
(8,98-13,22)
11,60
(9,54-13,66)
13,10
(10,27-15,93)
Triglicerídeos 84,93
(52,28-117,58)
56,40
(46,28-66,52)
57,30
(47,27-67,33)
65,20
(51,08-79,32)
Os valores representam a média de 10 - 12 animais juntamente com o intervalo de confiança de 95%. v.o.– via oral.
Difere significativamente do grupo controle (veículo, 0): *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001. Teste SNK.
120
Os dados apresentados na Tabela 17 demonstram que o tratamento
prolongado dos camundongos fêmeas com o extrato bruto antibacteriano de
Bacillus amyloliquefaciens R 10 (50 – 5.000µg/kg), administrado diariamente por
90 dias consecutivos por via oral, não causou alterações significativas dos níveis
plasmáticos de glicose, albumina, globulinas, creatinina, fosfatase alcalina,
γ-glutamil transferase (γGT), alanina aminotransferase (ALT), bilirrubina total,
direta e indireta, colesterol total, colesterol LDL, colesterol VLDL, colesterol HDL,
triglicerídeos, sódio, potássio, uréia e ácido úrico, quando comparado com os
animais controle. No entanto, o mesmo tratamento de camundongos fêmeas com
o extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 aumentou de
forma significativa os níveis de aspartato aminotransferase (AST) e diminuiu os
níveis de sódio na dose de 500 e 5.000µg/kg, respectivamente, em relação ao
grupo controle, tratado com veículo (Tabela 17).
O aumento dos níveis séricos de aspartato aminotransferase (AST)
constatado nos grupos de camundongos fêmeas tratadas com 500µg/kg do
extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, pode ser um
indicativo de hepatopatias, como necrose hepatocística tóxica ou isquêmicas e
anemias hemolíticas. Já a diminuição dos níveis séricos de sódio, constatado nos
grupos de camundongos fêmeas tratadas com 5.000µg/kg do extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, pode ser um indicativo de
síndrome nefrótica e de nefropatias com perda de sódio. Apesar dessa alteração
não estar associada a alterações de outros indicadores de função hepática e renal
analisados, essa hipótese só pode ser descartada por exames histopatológicos
(FLEURY, 2006).
121
Tabela 17 - Efeito do tratamento prolongado durante 90 dias consecutivos realizado com extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre alguns parâmetros bioquímicos do sangue em
camundongos fêmeas
(continua)
Extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 (µg/kg, v.o.)
Parâmetro
bioquímico
0 50 500 5.000
Proteínas totais (g/%) 4,48
(4,25 - 4,71)
4,87
(4,55 – 5,19)
4,63
(4,35 - 4,91)
4,68
(4,50 - 4,86)
Albumina (g/%) 1,17
(1,06 - 1,28)
1,23
(1,04 – 1,41)
1,23
(1,05 - 1,41)
1,09
(0,99 - 1,19)
Globulinas (g/%)
3,31
(3,10 - 3,52)
3,64
(3,31 – 3,97)
3,40
(3,22 - 3,58)
3,59
(3,37 - 3,81)
Relação
Albumina/Globulina
0,36
(0,31 - 0,40)
0,34
(0,29 – 0,40)
0,36
(0,31 - 0,41)
0,31
(0,27 - 0,35)
Glicose(mg/dL) 113,00
(105,99 - 120,01)
113,90
(94,31 -133,48)
120,46
(109,69 - 131,23)
126,70
(107,21 -146,19)
Creatinina (mg/dL) 0,30
(0,19 - 0,41)
0,40
(0,27 – 0,53)
0,45
(0,34 - 0,56)
0,31
(0,21 - 0,41)
Uréia (mg/dL) 39,00
(35,93 - 42,07)
35,90
(29,82 - 41,97)
36,80
(27,95 -45,66)
41,50
(35,19 – 47,81)
Sódio (mEq/L) 142,60
(138,05 - 147,15)
140,80
(136,00 – 145,60)
137,00
(131,53 –142,47)
129,50***
(124,60 -134,40)
Potássio (mEq/L) 4,70
(4,29 - 5,12)
4,86
(4,60 – 5,12)
7,78
(0,43 - 15,13)
4,79
(4,47 - 5,11)
Ácido úrico (mg/dL) 0,58
(0,10 - 1,06)
0,22
(0,11 – 0,33)
0,31
(0,11 – 0,51)
0,31
(0,11 - 0,51)
Bilirrubina total
(mg/dL)
0,30
(0,27 - 0,33)
0,31
(0,28 – 0,34)
0,31
(0,27 – 0,35)
0,27
(0,25 – 0,29)
Os valores representam a média de 10 - 12 animais juntamente com o intervalo de confiança de 95%. v.o.– via oral.
Difere significativamente do grupo controle (veículo, 0): * p <0,05, *** p <0,001; teste SNK.
122
Tabela 17 - Efeito do tratamento prolongado durante 90 dias consecutivos realizado com extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre alguns parâmetros bioquímicos do sangue em
camundongos fêmeas
(conclusão)
Extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 (µg/kg, v.o.)
Parâmetro
bioquímico
0 50 500 5.000
Bilirrubina indireta
(mg/dL)
0,20
(0,18 - 0,22)
0,21
(0,19 – 0,23)
0,23
(0,20 - 0,26)
0,20
(0,19 - 0,21)
Bilirrubina direta
(mg/dL)
0,10
(0,08 - 0,12)
0,10
(0,07 - 0,12)
0,08
(0,07 - 0,10)
0,07
(0,06 - 0,08)
Alanina
aminotransferase (U/L)
60,90
(48,26 - 73,54)
45,50
(35,32 – 55,68)
71,00
(60,44 – 81,56)
52,10
(36,65 – 67,55)
Aspartato
aminotransferase (U/L)
100,90
(78,43 - 123,36)
77,90
(60,67 – 95,12)
154,40 *
(114,91 -193,89)
127,90
(90,59 -165,21)
Fosfatase alcalina
(U/L)
0,40
(-0,29 - 1,09)
0,20
(-0,10 - 0,50)
0,40
(-0,29 – 1,09)
0,30
(-0,04 - 0,64)
Gama GT (U/L) 2,70
(0,76 – 4,64)
2,50
(1,14 - 3,86)
6,50
(-1,99 - 14,99)
2,10
(0,91 - 3,29)
Colesterol HDL (mg/dl) 11,20
(8,66 - 13,74)
10,60
(7,56 - 13,64)
10,40
(7,87 - 12,93)
14,50
(11,52 - 17,48)
Colesterol LDL (mg/dl) 30,30
(17,04 - 43,56)
27,40
(16,38 - 38,42)
27,80
(13,57 - 42,02)
21,40
(8,22 - 34,58)
Colesterol total (mg/dl) 66,70
(58,20 - 75,20)
65,20
(55,95 - 74,45)
61,20
(48,05 - 74,35)
54,50
(44,84 - 64,16)
Colesterol VLDL
(mg/dl)
25,20
(17,92 - 32,48)
27,20
(20,06 - 34,33)
23,00
(17,35 - 28,65)
18,60
(11,26 - 25,94)
Triglicerídeos (mg/dL) 126,30
(90,19 - 162,41)
136,00
(99,99 - 172,00)
115,30
(86,77 -143,83)
93,40
(56,47 -130,33)
Os valores representam a média de 10 - 12 animais juntamente com o intervalo de confiança de 95%. v.o.– via oral.
Difere significativamente do grupo controle (veículo, 0): * p <0,05, *** p <0,001; teste SNK.
123
e) Influência do tratamento prolongado dos animais com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 sobre determinadas
características de alguns órgãos
O tratamento com doses repetidas do extrato bruto antibacteriano de
Bacillus amyloliquefaciens R 10 (nas doses de 50, 500 e 5.000µg/kg),
administrado por 90 dias consecutivos por via oral, tanto em camundongos
machos quanto fêmeas, não causou alterações macroscópicas importantes
quanto ao aspecto e a cor de alguns órgãos analisados, como o coração, pulmão,
fígado, rins, baço, estômago, testículos, ovário e tubas uterinas, glândula salivar,
glândula adrenal, timo, linfonodo mesentérico e encéfalo, quando comparado ao
grupo controle e avaliado no final do experimento.
Os camundongos machos e fêmeas tratados com o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 (50 - 5.000µg/kg) não
apresentaram alteração significativa do peso relativo do coração, pulmão, baço,
rins, estômago, testículos, ovário e tubas uterinas, glândula salivar, glândula
adrenal, timo, linfonodo mesentérico e encéfalo, quando comparado ao grupo
controle e avaliado no final do experimento. No entanto, os camundongos machos
apresentaram diminuição significativa do peso relativo do fígado nas doses de 50
e 5.000µg/kg, enquanto que a dose de 5.000µg/kg do extrato bruto antibacteriano
de Bacillus amyloliquefaciens R 10 aumentou o peso relativo do fígado de
camundongos fêmeas, quando comparado ao grupo controle (Tabela 18).
Por outro lado, os dados apresentados na Tabela 19 mostram que o
tratamento de camundongos machos e fêmeas com o extrato bruto antibacteriano
de Bacillus amyloliquefaciens R 10 (50 – 5.000µg/kg) não causou alteração
significativa do peso absoluto do coração, baço, rins, pulmão, estômago,
testículos, ovário e tubas uterinas, glândula salivar, glândula adrenal, timo,
linfonodo mesentérico e encéfalo, quando comparado ao grupo controle e
avaliado no final do experimento. No entanto, os camundongos machos e fêmeas
apresentaram diminuição e aumento, respectivamente, significativos do peso
absoluto do fígado na dose de 5.000µg/kg, quando comparado ao grupo controle.
124
Tabela 18 - Efeito do tratamento prolongado durante 90 dias consecutivos realizado com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre o peso relativo do baço, rins, coração, pulmão, fígado,
linfonodo mesentérico, glândula adrenal, timo, estômago, encéfalo, testículo/ovário e glândula salivar de camundongos
(continua)
Grupo
(µg/kg, v.o.)
Sexo Baço (%) Rins (%) Coração (%) Pulmão (%) Fígado (%)
Linfonodo
mesentérico (%)
0 Macho 0,29
(0,27 – 0,30)
0,58
(0,56 – 0,61)
0,41
(0,38 – 0,44)
0,56
(0,50 – 0,63)
4,60
(4,30 – 5,00)
0,13
(0,10 – 0,15)
50 Macho 0,28
(0,26 – 0,31)
0,57
(0,53 – 0,61)
0,38
(0,34 – 0,42)
0,52
(0,48 – 0,56)
3,90*
(3,50 – 4,20)
0,10
(0,8 – 0,12)
500 Macho 0,28
(0,26 – 0,30)
0,57
(0,54 – 0,61)
0,39
(0,35 – 0,43)
0,54
(0,48 – 0,61)
4,30
(3,90 – 4,70)
0,12
(0,09 – 0,14)
5.000 Macho 0,31
(0,27 – 0,36)
0,55
(0,49 – 0,66)
0,40
(0,34 – 0,46)
0,49
(0,45 – 0,54)
3,60**
(3,20 – 4,10)
0,09
(0,07 – 0,11)
0 Fêmea 0,47
(0,36 – 0,57)
0,50
(0,45 – 0,55)
0,40
(0,35 – 0,45)
0,62
(0,54 – 0,71)
4,30
(3,60 – 4,90)
0,13
(0,10 – 0,16)
50 Fêmea 0,38
(0,34 – 0,41)
0,47
(0,44 – 0,50)
0,38
(0,36 – 0,40)
0,66
(0,59 – 0,73)
4,50
(4,10 – 4,80)
0,15
(0,13 – 0,17)
500 Fêmea 0,41
(0,34 – 0,48)
0,47
(0,44 – 0,51)
0,38
(0,35 – 0,41)
0,63
(0,56 – 0,69)
4,70
(4,50 – 4,80)
0,15
(0,12 – 0,19)
5.000 Fêmea 0,45
(0,35 – 0,55)
0,53
(0,48 – 0,57)
0,42
(0,39 – 0,44)
0,65
(0,57 – 0,73)
5,90***
(5,20 – 6,70)
0,18
(0,14 – 0,22)
Os valores representam a média de peso dos órgãos de 17 - 20 animais juntamente com o intervalo de confiança a 95%. v.o.– via oral.
Os valores foram obtidos através da relação (em percentagem) do peso dos órgãos pela massa corpórea dos animais (através da seguinte fórmula: peso do
órgão/peso do animal x 100).
Difere significativamente do grupo controle (veículo, 0): *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001; teste SNK.
125
Tabela 18 - Efeito do tratamento prolongado durante 90 dias consecutivos realizado com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre o peso relativo do baço, rins, coração, pulmão, fígado,
linfonodo mesentérico, glândula adrenal, timo, estômago, encéfalo, testículo/ovário e glândula salivar de camundongos
(conclusão)
Grupo
(µg/kg, v.o.)
Sexo
Glândula
adrenal (%)
Timo (%) Estômago (%) Encéfalo (%)
Testículo/
Ovário (%)
Glândula salivar
(%)
0 Macho 0,0053
(0,003-0,007)
0,13
(0,09 – 0,16)
0,75
(0,69 – 0,81)
1,01
(0,96 – 1,06)
0,20
(0,18 – 0,22)
0,26
(0,22 – 0,31)
50 Macho 0,0050
(0,003 – 0,007)
0,16
(0,12 – 0,20)
4,5
(0,36 – 12,7)
0,92
(0,85 – 0,98)
0,20
(0,18 – 0,22)
0,24
(0,19 – 0,28)
500 Macho 0,0084
(0,005 – 0,011)
0,16
(0,13 – 0,18)
0,71
(0,65 – 0,77)
0,96
(0,88 – 1,03)
0,21
(0,18 – 0,25)
0,26
(0,20 – 0,33)
5.000 Macho 0,0066
(0,005 – 0,009)
0,17
(0,12 – 0,22)
0,63
(0,57 – 0,70)
0,98
(0,88 – 1,07)
0,18
(0,15 – 0,22)
0,19
(0,13 – 0,25)
0 Fêmea 0,015
(0,012 – 0,018)
0,20
(0,16 – 0,23)
0,91
(0,81 – 1,00)
1,22
(1,07 – 0,36)
0,03
(0,02- 0,04)
0,20
(0,16 – 0,24)
50 Fêmea 0,018
(0,013 – 0,022)
0,18
(0,14 – 0,22)
0,86
(0,80 – 0,92)
1,25
(1,19 – 1,31)
0,03
(0,02 - 0,04)
0,19
(0,15 – 0,24)
500 Fêmea 0,015
(0,013 – 0,018)
0,18
(0,14 – 0,22)
0,91
(0,84 – 0,98)
1,23
(1,14 – 1,32)
0,03
(0,02 – 0,04)
0,19
(0,14 – 0,24)
5.000 Fêmea 0,016
(0,012 – 0,019)
0,17
(0,14 – 0,21)
0,98
(0,91 – 1,07)
1,23
(1,15 – 1,32)
0,03
(0,02 – 0,04)
0,19
(0,15- 0,23)
Os valores representam a média de peso dos órgãos de 17 - 20 animais juntamente com o intervalo de confiança a 95%. v.o.– via oral.
Os valores foram obtidos através da relação (em percentagem) do peso dos órgãos pela massa corpórea dos animais (através da seguinte fórmula: peso do
órgão/peso do animal x 100).
Difere significativamente do grupo controle (veículo, 0): *p<0,05, **p<0,01 e ***p<0,001; teste SNK.
126
Tabela 19 - Efeito do tratamento prolongado durante 90 dias consecutivos realizado com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre o peso absoluto do baço, rins, coração, pulmão, fígado,
linfonodo mesentérico, glândula adrenal, timo, estômago, encéfalo, testículo/ovário e glândula salivar de camundongos
(continua)
Grupo
(µg/kg, v.o.)
Sexo Baço Rins Coração Pulmão Fígado
Linfonodo
mesentério
0 Macho 125,60
(116,40 -134,80)
254,30
(234,80 - 273,90)
176,30
(162,10 - 190,40)
244,40
(214,70 - 274,20)
2013,1
(1851,1-2174,70)
54,00
(46,90 - 61,50)
50 Macho 135,20
(123,00 – 147,40)
269,50
(247,10 - 291,90)
185,80
(166,80 - 204,80)
248,90
(223,60 - 274,20)
1839,2
(1676,9-2003,5)
49,10
(40,20 - 57,80)
500 Macho 124,90
(116,40 – 133,50)
257,20
(243,70 - 270,70)
172,20
(160,60 - 183,90)
244,4 0
(216,10 - 272,70)
1913,2
(1761,1-2073,0)
58,00
(50,20 – 65,80)
5.000 Macho 139,10
(122,10 - 156,00)
239,20
(227,40 - 251,10)
175,50
(159,90 - 191,20)
222,10
(200,60 - 243,70)
1661,9**
(1504,2-1818,2)
43,10
(34,90 - 51,20)
0 Fêmea 174,10
(137,60 -210,50)
186,50
(179,70 - 193,30)
148,00
(140,70 - 155,30)
240,90
(208,50 - 273,30)
1678,2
(1550,3-1806,8)
51,00
(39,90 - 62,10)
50 Fêmea 133,70
(121,90 - 145,50)
166,80
(155,80 -177,80)
144,70
(130,30 -159,00)
234,70
(209,40 - 260,10)
1579,4
(1473,1-1685,7)
52,9
(44,30 - 61,60)
500 Fêmea 148,70
(120,30 -177,10)
167,00
(152,10 - 182,00)
133,70
(122,40 -145,00)
228,60
(196,90 - 260,20)
1672,4
(1524-1821)
56,70
(43,10 - 70,30)
5.000 Fêmea 159,70
(124,80 - 194,60)
184,40
(171,50 - 197,40)
144,80
(137,70 - 151,80)
223,60
(196,80 - 250,30)
2057,4***
(1869,7-2246,1)
58,20
(44,50 - 71,80)
Os valores representam a média de peso dos órgãos de 17 - 20 animais juntamente com o intervalo de confiança a 95%. v.o.– via oral.
Os valores foram obtidos através da média dos pesos dos órgãos em mg. Teste SNK.
127
Tabela 19 - Efeito do tratamento prolongado durante 90 dias consecutivos realizado com o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10, administrado pela via oral, sobre o peso absoluto do baço, rins, coração, pulmão, fígado,
linfonodo mesentérico, glândula adrenal, timo, estômago, encéfalo, testículo/ovário e glândula salivar de camundongos
(conclusão)
Grupo
(µg/kg, v.o.)
Sexo Glândula adrenal
Timo Estômago Encéfalo
Testículo/
Ovário
Glândula
salivar
0 Macho 2,22
(1,43-3,01)
54,00
(41,30-66,80)
307,40
(286,50-328,20)
436,60
(423,70-449,50)
88,50
(79,50-96,50)
117,80
(101,20-134,50)
50 Macho 1,95
(1,21-2,70)
64,70
(55,80-73,70)
312,80
(289,20-336,40)
430,60
(403,90-457,70)
95,10
(84,60-105,60)
110,40
(90,00-130,70)
500 Macho 3,43
(2,24-4,16)
64,10
(52,80-75,30)
319,20
(295,50-343,00)
430,80
(403,90-457,70)
96,30
(84,40-108,20)
118,90
(90,90-146,90)
5.000 Macho 2,57
(1,86-3,28)
72,50
(57,90-87,20)
291,60
(272,10-311,20)
426,80
(410,20-443,30)
88,00
(79,40-96,60)
96,30
(71,70-121,00)
0 Fêmea 5,45
(4,54-6,36)
80,20
(63,90-96,50)
347,80
(319,70-375,90)
450,40
(440,70-460,20)
9,40
(6,60-12,20)
73,50
(61,60-85,30)
50 Fêmea 6,29
(4,66-7,92)
67,70
(53,70-81,70)
290,20
(267,50-312,90)
442,70
(429,10-456,30)
10,40
(7,20-13,50)
68,00
(53,40-82,70)
500 Fêmea 5,49
(4,56-6,42)
63,90
(46,90-81,10)
323,30
(297,20-353,80)
430,20
(413,60-446,80)
11,70
(8,10-15,20)
70,90
(53,70-82,20)
5.000 Fêmea 5,63
(4,61-6,64)
60,50
(40,20-71,80)
347,30
(316,30-378,40)
429,80
(412,50-447,20)
11,30
(6,70-15,80)
65,50
(52,00-79,10)
Os valores representam a média de peso dos órgãos de 17 - 20 animais juntamente com o intervalo de confiança a 95%. v.o.– via oral.
Os valores foram obtidos através da média dos pesos dos órgãos em mg. Teste SNK.
128
Em conjunto, as análises bioquímicas, hematológicas e anátomo-
patológicas (macroscópica), realizadas nos animais tratados com veículo
(controle) ou com as diversas doses do extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 (50, 500 e 5.000µg/kg), por via oral, durante 90 dias
consecutivos, detectaram alterações pontuais em alguns desses parâmetros,
demonstrando que o extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens
R 10, quando administrado por um período prolongado em camundongos de
ambos os sexos, apresenta reduzidos sinais de toxicicidade, principalmente para
as maiores doses empregadas, em relação ao peso corporal e letalidade. A non
toxic adverse effect level (NOAEL) para o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 situa-se entre as doses de 50 e 500µg/kg.
Ao dividirmos a NOAEL encontrada para o extrato bruto antibacteriano de
Bacillus amyloliquefaciens R 10 em camundongos pelo fator de segurança de
100, chegamos a uma IDA alocada entre 0,5 e 5µg/kg de peso corpóreo, ou seja,
para uma pessoa de 70kg corresponderia a uma ingesta aproximada entre 35 e
350µg por dia do extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10,
respectivamente.
Essa IDA alocada para o extrato bruto antibacteriano de Bacillus
amyloliquefaciens R 10 é menor que a IDA estabelecida para a nisina pura, tanto
pela FAO/OMS, quanto pelo Comitê Científico em Alimentos da União Européia,
que é de 821 e 130µg/kg de peso corpóreo, respectivamente. Logo, para uma
pessoa de 70kg, corresponde a uma ingesta de aproximadamente 58 e 9mg de
nisina pura por dia pela FAO/OMS e pelo Comitê Científico em Alimentos da
União Européia, respectivamente.
Levando-se em consideração a IDA para a nisina pura estabelecida pelo
Comitê Científico em Alimentos da União Européia, o extrato bruto antibacteriano
de Bacillus amyloliquefaciens R 10 apresenta uma IDA alocada aproximadamente
26 a 260 vezes menor.
129
6 CONCLUSÕES E CONSIDERAÇÕES FINAIS
O extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens R 10 apresenta atividade
antibacteriana frente Listeria monocytogenes NCTC 098630, porém não é ativo
contra Staphylococcus aureus ATCC 25923, Enterococcus faecalis ATCC 29212,
Escherichia coli ATCC 25922, Salmonella typhimurium ATCC 14028, Enterobacter
aerogenes ATCC 13048 e Pseudomonas aeruginosa ATCC 9027.
O extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 não é
genotóxico para células VERO na concentração de 60µg/ml, porém apresenta
genotoxicidade nas concentrações de 80 e 100 µg/ml.
O extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, quando
administrado agudamente por via oral em ratos e camundongos, demonstra boa
tolerabilidade e poucos efeitos tóxicos importantes, apresentando DL
50
superior a
2.000µg/kg e 5.000µg/kg de peso corpóreo, respectivamente.
O extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10, quando
administrado repetidamente durante 90 dias por via oral em camundongos,
demonstra reduzidos sinais de toxicidade, apresentando uma NOAEL entre as
doses de 50 e 500µg/kg.
O extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10
apresenta um grande potencial como conservador natural de alimentos, dada sua
marcante atividade antilisterial e sua relativa segurança toxicológica.
130
7 SUGESTÕES PARA TRABALHOS FUTUROS
Apesar do extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10
ter apresentado apenas atividade antilisterial, as demais enzimas e bacteriocinas
produzidas por Bacillus spp. utilizadas no processamento de alimentos, podem
ser uma nova alternativa para indústria na conservação de alimentos,
necessitando ser submetidas tanto a ensaios de atividade antibacteriana quanto
antifúngica, haja vista seu grande potencial como agentes antibacterianos e
antifúngicos.
O extrato bruto antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10
apresentou reduzidos efeitos tóxicos e boa tolerabilidade nos ensaios de
toxicidade oral aguda e de dose repetida em ratos e camundongos, porém, torna-
se necessário verificar seu comportamento utilizando outra espécie de mamífero
não roedor, conforme preconizado pela legislação (BRASIL, 2004).
Ensaios utilizando diferentes metodologias de cromatografia, eletroforese e
seqüenciamento serão necessárias para verificar se a(s) substância(s)
antimicrobiana(s) presente(s) no extrato bruto já são conhecidas ou não, bem
como estudos adicionais de seu(s) mecanismo(s) de ação(ões).
Serão também necessários estudos preditivos, utilizando vários
microrganismos indicadores e diferentes tipos de alimentos para testar o extrato
bruto ou a(s) substância(s) antimicrobiana(s) presente(s) nesse, com o objetivo de
utilizá-lo(as) na indústria de alimentos.
Além de ser utilizado diretamente nos alimentos, o extrato bruto
antibacteriano de Bacillus amyloliquefaciens R 10 apresenta um grande potencial
para ser utilizado na elaboração de biofilmes comestíveis, porém pesquisas nessa
direção precisam ainda ser desenvolvidas.
131
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147
APÊNDICES
148
APÊNDICE A
SCHULZ, D.; PEREIRA, M. A.; NUNES, M. M.; BATISTA, C. R. V. Atividade
antimicrobiana e hemolítica do extrato bruto produzido por Bacillus
amyloliquefaciens. Alimentos e Nutrição, Araraquara, v. 15, n. 2, p. 115-117,
2004.
149
150
151
152
APÊNDICE B
SCHULZ, D.; SIMÕES, C. M. O.; FRÖHNER, C. R. A.; GABILAN, N. H.; BATISTA,
C. R. V. Citotoxicidade do extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens frente a
hemácias de carneiro e células VERO. Alimentos e Nutrição, Araraquara, v. 16,
n. 2, p. 145-151, 2005.
153
154
155
156
157
158
159
160
APÊNDICE C
SCHULZ, D.; BONELLI, R. R.; BATISTA, C. R. V. Bacteriocinas e enzimas
produzidas por Bacillus spp. para conservação e processamento de alimentos.
Alimentos e Nutrição, Araraquara, v. 16, n. 4, p. 403-411, 2005.
161
162
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164
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166
167
168
169
170
APÊNDICE D
SCHULZ, D.; BATISTA, C. R. V. Atividade antibacteriana do extrato bruto de
Bacillus amyloliquefaciens frente a diferentes indicadores. Alimentos e Nutrição,
Araraquara, v. 17, n. 1, p. 73-77, 2006.
171
172
173
174
175
176
APÊNDICE E
SCHULZ, D.; CAON, T.; MUSSI, C. S.; SIMÕES, C. M. O.; BATISTA, C. R. V.
Genotoxicidade do extrato bruto de Bacillus amyloliquefaciens frente a células
VERO. Alimentos e Nutrição, Araraquara, v. xx, n. xx, p. xx-xx, 2007.
[submetido].
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