( PDF ) Avaliação quantitativa e morfométrica dos neurônios mioentéricos miosina-V imunoreativos e da tunica mucosa do íleo de ratos diabéticos suplementados com glutamina

Download PDF

ads:

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ

DEPARTAMENTO DE FARMÁCIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

AVALIAÇÃO QUANTITATIVA E MORFOMÉTRICA DOS NEURÔNIOS

MIOENTÉRICOS MIOSINA-V IMUNOREATIVOS E DA TÚNICA MUCOSA DO ÍLEO

DE RATOS DIABÉTICOS SUPLEMENTADOS COM GLUTAMINA

ELEANDRO APARECIDO TRONCHINI

MARINGÁ

2006

ads:

Livros Grátis

http://www.livrosgratis.com.br

Milhares de livros grátis para download.

UNIVERSIDADE ESTADUAL DE MARINGÁ

DEPARTAMENTO DE FARMACIA E FARMACOLOGIA

PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS FARMACÊUTICAS

AVALIAÇÃO QUANTITATIVA E MORFOMÉTRICA DOS NEURÔNIOS

MIOENTÉRICOS MIOSINA-V IMUNOREATIVOS E DA TÚNICA MUCOSA DO ÍLEO

DE RATOS DIABÉTICOS SUPLEMENTADOS COM GLUTAMINA

ELEANDRO APARECIDO TRONCHINI

Dissertação apresentada ao Programa de Pós-

graduação em Ciências Farmacêuticas (área de

concentração: Produtos Naturais

Biologicamente Ativos), da Universidade

Estadual de Maringá-UEM, para obtenção do

grau de Mestre em Ciências Farmacêuticas.

Orientadora:

Prof.ª

Dr.ª

Jacqueline Nelisis Zanoni

MARINGÁ

2006

ads:

A Deus que com sua infinita grandeza fez com que

esse sonho pudesse se tornar realidade , permitindo

entendimento e colocando as pessoas certas em

minha vida para superar as dificuldades ao longo

dessa jornada.

Foi na família que aprendi a amar e ser amado.

Foi a família que fez nascer em mim a auto estima,

sem a qual não poderia ter chegado tão longe.

É na família que recebo carinho nas horas mais

difíceis.

É na família que vivo meus momentos de maior

alegria

É na família que busco inspiração para lutar sempre

É na família que aprendi a amar e ser amado

É a você família (papai, mamãe, irmão e namorada)

que dedico esse momento de conquista e de grande

emoção

Há em certas pessoas uma energia muito forte,

tornando aqueles que a possuem seres especiais

como você JACQUELINE NELISIS ZANONI que

durante esse tempo soube conduzir os trabalhos

com firmeza e sensibilidade. Nesse período à

conheci, passei a admira-la e me tornei fã

incondicional de alguém que tomei a liberdade de

chamar de AMIGA porque essa é a única palavra

que pode definir alguém com tamanha dedicação ao

próximo.

Muito obrigado.

AGRADECIMENTOS

Obrigado a todas as pessoas que participaram de forma direta ou indireta para a

realização deste trabalho. Agradeço....

Ao programa de Pós-Graduação em Ciências Farmacêuticas da Universidade

Estadual de Maringá, pela oportunidade de realização do curso de mestrado e

pelos serviços prestados, em especial à Helena, secretária do Departamento de

Farmácia e Farmacologia.

Ao Dr. Roberto Barbosa Bazotte pelo constante incentivo e apoio prestado para

mim desde que o conheci. Sua humildade e sabedoria me surpreendem a cada dia.

Aos docentes e funcionários do Departamento de Ciências Morfofisiológicas da

Universidade Estadual de Maringá pelo apoio e colaboração.

Aos técnicos de laboratório Cleonira, Elizete, Eurides, Maria dos Anjos e Valdir

pelo apoio técnico e pela amizade que mantivemos durante toda esta jornada.

Ao José Antonio pela ajuda na utilização dos equipamentos de análises de

imagens.

À minha namorada (Aline) pelo amor, compreensão, companheirismo e incentivo

principalmente nas decisões difíceis.

À minha família (papai, mamãe e meu irmão) por serem fontes permanentes de

incentivos, amor e carinho.

À meus tios (Andinéia e José) que não pouparam esforços em me incentivar

desde a graduação até os dias de hoje.

À meus amigos irmãos Cristiano Tashima, Fernando Canas e João Paulo Schoffen

por serem pessoas que estiveram a maior parte do tempo ao meu lado dando

incentivo, novas idéias e ajudando nas decisões difíceis dessa jornada, sempre

com humildade, sinceridade e sabedoria. Vocês são demais.

Aos amigos (as), Aline, Angélica, Angélica Cristina, Daniela, Diego, Éder,

Fernanda, Ivan, Janine, Luciana, Marcela, Márcia, Priscila, Priscila Freitas,

Renata e Thais que sempre me proporcionaram momentos de alegria,

companheirismo e amizade tanto no local de trabalho quanto em outros locais.

À todos que embora não estejam citados aqui mas tiveram sua contribuição em

meu trabalho.

Meu Muito Obrigado.

RESUMO

O diabetes mellitus é uma patologia caracterizada por hiperglicemia e distúrbios no

metabolismo de carboidratos, gorduras e proteínas, que estão associados a uma deficiência

absoluta ou relativa na secreção de insulina pelas células beta do pâncreas. Embora seja

uma doença de origem endócrina, suas principais manifestações são de origem metabólica,

podendo haver complicações vasculares e neuropáticas. Esses distúrbios em longo prazo

são responsáveis por complicações crônico-degenerativas tais como: microangiopatias

(retinopatia e nefropatia), macroangiopatias e a neuropatia diabética. As neuropatias

diabéticas manifestam-se em função de lesões de fibras nervosas periféricas por alterações

na microcirculação dos nervos (vasa nervorum), e no metabolismo dos neurônios,

resultando em sérias repercussões às áreas inervadas. Em nível gastrintestinal leva à

modificações motoras, sensoriais e na função reflexa desse sistema, podendo ocasionar

gastroparesia, diarréia, constipação, megacolon, lentidão do trânsito gastrointestinal, estase

e dilatação gástrica com diminuição ou aumento de contrações peristálticas. Vários

mecanismos são descritos para tentar explicar esta patologia, inclusive o estresse oxidativo.

Este mecanismo, quando associado ao diabetes mellitus, é aumentado e pode ter um

importante papel na patogenia das complicações do diabetes. O aumento do estresse

oxidativo pode ser resultado da alta produção de precursores de espécie reativa de oxigênio

(ROS) e/ou baixa eficiência de sistemas enzimáticos que os combatem. O tecido nervoso

pode ser afetado pelos radicais livres através peroxidação lipídica das membranas do

axônio e das células de Schwann, levando a uma diminuição da função das células

nervosas. A glicosilação autoxidativa, via do poliol, alterações nos níveis de mediadores

inflamatórios e redução dos antioxidantes são também mecanismos potenciais para o

aumento do estresse oxidativo. A ativação da via do poliol devido à hiperglicemia é um

outro fator determinante no desenvolvimento da neuropatia diabética. Esta via resulta no

acúmulo de sorbitol e frutose nos nervos, a qual é acompanhada por decréscimo de

mioinositol e inibição da bomba Na

ATPase, resultando em edema, aumento de

mielina, disjunção axo-glial e degeneração do nervo. Por outro lado, a enzima aldose

redutase para converter glicose em sorbitol utiliza o NADPH. Com a depleção de NADPH,

as enzimas que dele necessitam podem ser inibidas. Dentre várias, incluímos a glutationa

redutase que necessita de NADPH para regenerar a glutationa oxidada em reduzida. Deste

modo, a diminuição nos níveis de glutationa reduzida aumenta a susceptibilidade das

células endoteliais ao dano causado pelo peróxido de hidrogênio. Estudos têm demonstrado

que o diabetes mellitus pode reduzir o número de neurônios mioentéricos. Drogas que

reduzem o estresse oxidativo podem ter um papel relevante no tratamento das complicações

neurológicas do diabetes mellitus. A glutamina é um aminoácido não essencial, sintetizado

a partir das necessidades corporais, sendo a forma mais abundante encontrada no corpo.

Um fator de particular interesse na suplementação com glutamina no diabetes mellitus é

que esse aminoácido é de grande importância em estados catabólicos e também precursora

da glutationa. O objetivo deste estudo foi avaliar o efeito da suplementação com l-

glutamina sobre os neurônios mioentéricos imunomarcados pela miosina-V e da túnica

mucosa do íleo de ratos diabéticos. Foram utilizados cinco grupos de animais (Rattus

norvegicus): normoglicêmico (UN), normoglicêmico tratado com l-glutamina (NG),

diabéticos (UD), diabéticos tratados com l-glutamina após o 4

dia da indução do diabetes

(DG4) e diabéticos tratados com l-glutamina após o 45

dia da indução do diabetes (DG45).

Para a indução do DM foi administrada a droga estreptozootocina (35 mg/Kg), sendo

mantida esta condição durante 120 dias. Aos 210 dias de idade, os animais foram

anestesiados, mortos e amostras do íleo foram coletadas. Para análise da população

mioentérica, amostras do íleo foram submetidas à elaboração de preparados totais para a

técnica imunohistoquímica miosina-V. Para o estudo da proliferação celular da mucosa

utilizamos sulfato de vincristina (1mg·/kg) (bloqueador do fuso mitótico). Cortes semi-

seriados corados com hematoxilina e eosina (HE) foram utilizados para a determinação do

índice metafásico, altura das vilosidades e a profundidade das criptas. Os cortes corados

pelo método PAS foram utilizados para fazermos a estimativa do número de células

caliciformes. O DM foi confirmado por elevados índices glicêmicos observado nos grupos

UD, DG4 e DG45. Em decorrência do DM ocorreu uma redução no número de neurônios

mioentéricos miosina-V imunoreativos do grupo UD e a suplementação com l-glutamina

não evitou esta redução nos grupos DG4 e DG45 (p > 0,05). O índice metafásico e o

número de células caliciformes não apresentaram diferenças significativas quando os

grupos foram comparados (p > 0,05). Os animais do grupo DG4 e DG45 apresentaram vilos

com alturas superiores a 45,5 % (p < 0,05) e 32,4 % (p > 0,05), respectivamente, quando

comparados aos animais do grupo UD. As criptas analisadas apresentaram profundidade

similar em todos os grupos estudados.

Palavras-Chaves: L- glutamina. Diabetes mellitus. Mucosa intestinal. Neurônios

mioentéricos. Miosina-V.

ABSTRACT

Diabetes mellitus is a pathology characterized by hyperglycemia and alterations in the

metabolism of carbohydrates, fats and proteins, which are associated to an absolute or relative

deficit in the insulin secretion by the pancreas beta cells. Although being an endocrine

disease, its main manifestations are of metabolic origin with vascular and neuropathic

complications. In the long run, these changes are responsible for such chronic-degenerative

complications such as: micro-angiopathies (retinopathy and nephropathy), macro-

angiopathies and the diabetic neuropathy. These diabetic neuropathies occur in the form of

lesions of the peripheric nerve fibers through changes in the nerves microcirculation (vasa

nervorum), and in the metabolism of neurons, resulting in serious consequences to the

innerved areas. In the gastrointestinal area, it leads to changes in the motor, sensorial and

reflexive function of this system. Disturbances such as gastroparesis, diarrhea, constipation,

megacolon, slowness of the gastrointestinal traffic, estase and gastric dilation with decrease or

increase of peristaltic contractions may appear. Several mechanisms are described in order to

explain this pathology, including the oxidative stress. This mechanism, when associated to the

diabetes mellitus, is increased and may play an important role in the pathogeny in the diabetes

complications. The increase of the oxidative stress might be due to the high production of

reactive oxygen species (ROS) precursors and/or to the low efficiency of enzymatic systems

that fight them off. The nervous tissue may be affected by free radicals through the lipidic

peroxidation of the axon membranes and the Schwann cells, leading to a decrease on the

function of nerve cells. The autoxidative glycosylation, polyol pathway, changes in the

inflammatory mediators levels and the reduction of antioxidants are also potential

mechanisms for the increased oxidative stress. The activation of the polyol pathway due to the

hyperglycemia is another decisive factor to the development of the diabetic neuropathy. This

pathway results into sorbitol and fructose accumulation in the nerves; this is followed by a

myo-inositol decrease and inhibition of the Na

ATPase pump, resulting in edema, myelin

increase, axo-glial disjunction and nerve degeneration. On the other hand, the aldose

reductase enzyme used to convert glucose into sorbitol needs NADPH. With the depletion of

NADPH, the enzymes that needs it might be inhibited. Among several enzymes, we studied

the glutathione reductase that needs NADPH to regenerate the oxide glutathione into reduced

glutathione. Therefore, the decrease in the glutathione levels, increases the susceptibility of

the endothelial cells to the damage caused by hydrogen peroxide. Studies have shown that the

diabetes mellitus may reduce the number of myenteric neurons. Drugs that reduce the

oxidative stress may play an important role in the treatment of he DM neurological

complications. Glutamine is a non-essential amino acid, synthesized from the body needs. A

very important factor in the glutamine supplementation in the diabetes mellitus is that this

amino acid is of great importance in catabolic states and it is also a precursor of the

glutathione. The objective of this study was to assess the effect of the supplementation with l-

glutamine on the myenteric neurons stained by the Myosin-V and on the ileum mucosa of

diabetic rats. Five groups of animals were used (Rattus norvegicus): normoglycemic (UN),

normoglycemic treated with l-glutamina (NG), diabetic (UD), diabetics treated with l-

glutamine after the 4

day of diabetes induction (DG4) and diabetic treated with l-glutamine

after the 45

day of diabetes induction (DG45). Streptozotocin (35 mg/Kg) was given to the

animals to induce DM. This condition was maintained for 120 days. At the 210 day of age,

the animals were anesthetized, killed and samples of the ileum were collected. To assess the

myenteric population, samples of the ileum were submitted to the total whole mounts with the

myosin-V technique. To study the cell proliferation of the mucosa, we used vincristine sulfate

(1mg/kg) (a mitotic spindle blocker). We used hematoxiline and eosine semi-serial stained

cuts (HE) to assess the metaphasic index, the height of villi and the depth of crypts. We used

the PAS stained cuts to estimate the number of calyciform cells. DM was confirmed by the

high levels of glycemia observed in groups UD, DG4 and DG45. Due to DM, there was a

decrease in the number of myosin-V stained myenteric neurons of group UD. The l-glutamine

supplementation did not prevent this reduction in groups DG4 and DG45 (p > 0.05). The

metaphasic index and the number of calyciform cells showed no significant differences when

the groups were compared (p > 0.05). Animals from group DG4 and DG45 presented villi

45.5% (p < 0.05) and 32.4% (p > 0.05) higher, respectively, when compared to animals from

group UD. The analyzed crypts had similar depth in all of the studied groups.

Keywords: L – glutamine. Diabetes mellitus. Intestinal mucosa. Myenteric neurons. Myosin-

APRESENTAÇÃO

A dissertação é composta por:

a) Revisão da literatura seguindo as normas da ABNT............................................14

b) Artigos científicos apresentados em português e em inglês, com suas respectivas

normas.

1) 1.1. Eleandro Aparecido Tronchini

, Cristiano Massao Tashima

, Enilza Maria

Espreafico

, Roberto Barbosa Bazotte

, Jacqueline Nelisis Zanoni

Avaliação quantitativa e morfométrica da população de neurônios

mioentéricos imunoreativos à miosina-V do íleo de ratos diabéticos

suplementados com L-glutamina. Redigido na forma exigida pela revista

Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical (ISSN 1566-

0702.........................................................................................................30

1.2. Eleandro Aparecido Tronchini

, Cristiano Massao Tashima

, Enilza Maria

Espreafico

, Roberto Barbosa Bazotte

, Jacqueline Nelisis

Zanoni

.Quantitative and morphometrical evaluation of the myosin-

stained myenteric neuron population of the ileum of diabetic rats

supplemented with L-glutamine. Redigido na forma exigida pela revista

Autonomic Neuroscience: Basic and Clinical (ISSN 1566-

0702).......................................................................................................54

2) 2.1. Eleandro Aparecido Tronchini

, Cristiano Massao Tashima

, Roberto

Barbosa Bazotte

, Jacqueline Nelisis Zanoni

. Análise da proliferação

celular, morfometria dos vilos e criptas e células caliciformes da túnica

mucosa de íleo de ratos diabéticos suplementados com L-glutamina.

Redigido na forma exigida pela revista Journal of Pharmacy and

Pharmacology (ISSN 0022-

3573).......................................................................................................77

2.2. Eleandro Aparecido Tronchini

, Cristiano Massao Tashima

, Roberto

Barbosa Bazotte

, Jacqueline Nelisis Zanoni

. Analysis of cell

proliferation, villi and crypts morphormetry and goblet cell of the ileum

mucosa of L-glutamine supplemented diabetic rats. Redigido na forma

exigida pela revista Journal of Pharmacy and Pharmacology (ISSN

0022-

3573)........................................................................................................97

REVISÃO DA LITERATURA

O diabetes mellitus (DM) é uma desordem metabólica caracterizada por

hiperglicemia, resultante de déficit na secreção e/ou na ação da insulina, estando associada

com alteração, disfunção e falência de vários órgãos, especialmente rins, nervos, coração e

vasos sanguíneos (AMERICAN DIABETES ASSOCIATION, 1997).

Esta patologia consiste em duas grandes categorias. A primeira é conseqüência de

uma deficiência absoluta na secreção de insulina (diabetes tipo 1); a outra, mais comum, é

uma combinação da resistência à ação da insulina e/ou inadequada resposta secretora de

insulina (diabetes tipo 2) (WOLFF, 1993; DYCK; GIANNINI, 1996; AMERICAN

DIABETES ASSOCIATION, 1997).

Ambos os tipos de diabetes a longo prazo podem acarretar complicações graves

tais como: retinopatia, nefropatia e neuropatia. A maior parte das evidências experimentais e

clínicas disponíveis sugerem que as complicações são uma conseqüência dos distúrbios

metabólicos, principalmente da hiperglicemia (COTRAN et al., 1996; DYCK; GIANNINI,

1996; BERNSTEIN et al., 2002).

Dentre as complicações crônicas causadas pelo diabetes mellitus, as

manifestações neurológicas são, provavelmente, as mais comuns, podendo afetar o sistema

nervoso autonômico e periférico, prejudicando a qualidade de vida dos pacientes (McLAREN,

1976; VINIK, 1999).

A neuropatia diabética é um grupo heterogêneo de desordens e apresenta uma

gama extensiva de anormalidades (VINIK; MEHRABYAN, 2004). Esta complicação é

caracterizada por uma notável atrofia e diminuição das fibras mielinizadas e não mielinizadas,

acompanhada por degeneração Walleriana, segmental e desmielinização para-nodal, além do

enfraquecimento da regeneração da fibra nervosa (AFZAAL et al., 2002).

Contudo, as neuropatias ocorrem no sistema nervoso periférico e atingem o

sistema nervoso entérico. Alguns pacientes diabéticos apresentaram uma série de desordens

no trato gastrointestinal, tais como: vômito, anorexia, naúsea, distensão abdominal, diarréia e

constipação (KATZ; SPIRO, 1966; KARAKIDA et al., 1989; ZAUPA; ZANONI, 2000).

Segundo Hosking et al. (1978) as neuropatias gastrointestinais são as

complicações crônicas mais comuns do diabetes mellitus. Vários autores demonstraram a

redução no número de neurônios e alteração de seu tamanho em diversos segmentos

intestinais de ratos diabéticos (ROMANO et al., 1996; ZANONI et al., 1997; HERNANDES

et al., 2000). Karakida et al. (1989) também realizaram estudos com o trato gastrintestinal de

ratos diabéticos e mostraram várias mudanças nos nervos entéricos, tais como: degeneração

do axônio e redução no número de neurônios no plexo mioentérico.

Durante muito tempo o sistema nervoso entérico (SNE) foi descrito como a

porção pós-ganglionar da divisão parassimpática do sistema nervoso autônomo. Atualmente,

entretanto, sabe-se que o SNE, terceiro componente do sistema nervoso autônomo (os outros

são o simpático e parassimpático), é uma rede neuronal complexa presa à parede do tubo

digestivo. Está presente desde a faringe até o esfíncter anal, sendo composto por um grande

conjunto de neurônios intrínsecos (neurônios entéricos) e os processos de neurônios

extrínsecos – tanto aferentes (neurônios sensoriais espinhais e cranianos) quanto eferentes

(simpáticos e parassimpáticos). O SNE é formado por dois plexos principais que incluem

gânglios contendo os corpos celulares dos neurônios entéricos. Esses plexos ganglionados são

os plexos mioentérico e submucoso. Os gânglios são conectados por pequenos feixes de fibras

nervosas (fibras internodais). Feixes menores, compostos por fibras nervosas, emergem desses

dois plexos ganglionados e formam plexos não-ganglionados no músculo longitudinal, no

músculo circular, ao redor dos vasos sanguíneos, na muscular da mucosa, em torno das bases

das glândulas das mucosas, e dentro das vilosidades (FURNESS; COSTA et al., 1987a).

O plexo mioentérico é uma rede de feixes de nervos e pequenos gânglios,

localizados entre a camada muscular longitudinal e circular externa do intestino. O gânglio

mioentérico varia em tamanho, forma e orientação, de espécie para espécie e de uma parte do

intestino para outra (FURNESS; COSTA, 1980, 1987b; STERNINI, 1988).

Vários autores vêm analisando o comportamento destes neurônios em animais

diabéticos induzidos por estreptozootocina. Eles observaram decréscimo da atividade

neuronal, desenvolvimento de cromatólise seguida de mudanças degenerativas

(MONCKTON; PEHOWICH, 1980) e redução na densidade neuronal, a curto ou a longo

prazo, no estômago (FREGONESI et al., 2001), duodeno (BUTTOW et al., 1997), íleo

(HERNANDES et al., 2000; ZANONI et al., 2003), ceco (ZANONI et al., 1997) e colo

proximal (ROMANO et al., 1996).

Para tentar explicar a relação entre a extensão e a severidade da hiperglicemia e o

desenvolvimento da neuropatia diabética vários mecanismos são descritos. Um deles é a via

do poliol, que é ativada devido hiperglicemia. Esta via resulta do acúmulo de sorbitol e

frutose nos nervos, acompanhado por decréscimo de mioinositol e conseqüente inibição da

bomba Na

ATPase, resultando na retenção de Na

, causando edema, aumento de mielina,

disjunção axo-glial e degeneração do nervo (CLEMENTS; REX, 1979; FINEGOLD et al.,

1983; VINIK, 1999; AFZAAL et al., 2002). Por outro lado, quando a atividade da enzima

aldose redutase esta aumentada, observa-se um aumento dos níveis intracelulares de sorbitol

(VINIK, 1999; GIUGLIANO et al., 1996; AFZAAL et al., 2002). Este mecanismo diminui a

taxa de NADPH (nicotinamida adenina dinocleotideo fosfato, reduzida) para NADP

(nicotinamida adenina dinocleotideo fosfato, oxidado) (GIUGLIANO et al., 1996).

Conseqüentemente, esta depleção de NADPH pela enzima aldose redutase pode inibir

enzimas que necessitem de NADPH. Dentre elas, incluimos a glutationa redutase que

necessita de NADPH para regenerar a glutationa oxidada em glutationa reduzida. Deste

modo, a diminuição nos níveis de glutationa reduzida aumenta a susceptibilidade das células

endoteliais ao dano causado pelo estresse oxidativo (GIUGLIANO et al., 1996).

Tanto a glicose quanto a frutose podem sofrer glicolisação oxidativa. Contudo, a

frutose é um substrato dez vezes melhor que a glicose para glicolisação autoxidativa

(CAMERON; COTTER, 1997), uma fonte potencial para formação de radicais livres no

diabetes (KUYVENHOVEN; MEINDERS, 1999). Este mecanismo é seguido por um

processo no qual a glicose se liga quimicamente ao grupo amino de proteínas, sem a ajuda de

enzimas. A glicose forma produtos de glicolisação quimicamente reversíveis com a proteína

(bases de Schiff), que se reorganiza para formar produtos de glicolisação inicial do tipo

Amadori mais estáveis e quimicamente reversíveis. Os produtos de glicolisação inicial (no

colágeno e em outras proteínas de vida longa) presentes nos tecidos intersticiais e paredes dos

vasos não sofrem dissociação e realizam uma lenta série de rearranjos químicos para formar

produtos terminais de glicolisação avançada irreversível (AGE – advanced glycosylation end).

Estes produtos se acumulam no transcorrer de toda vida na parede dos vasos (KIKUCHI et al.,

2003; BAYNES, 1991). A formação dos AGEs pode induzir ligação covalente cruzada,

resultando no endurecimento da parede do vaso (KUYVENHOVEN; MEINDERS, 1999).

Outro mecanismo importante é o estresse oxidativo. Quando associado ao

diabetes mellitus, ele é aumentado e pode ter uma importante função na patogenia de

complicações no diabetes como neuropatia e microangiopatia (VAN DAM et al., 1997;

KUYVENHEVEN; MEINDERS, 1999;. HOUNSON et al., 2001; VINCENT et al., 2004). O

estresse oxidativo aumentado pode ser resultado da alta produção de precursores de espécies

reativas de oxigênio e/ou baixa eficiência de sistemas enzimáticos que os combatem

(BAYNES, 1991; PARTHIBAN et al., 1995; VINCENT et al., 2004).

Radicais livres são quaisquer átomos de molécula que contenham um ou mais

elétrons desemparelhados em seu orbital externo. Esta situação é energicamente instável. A

estabilidade é alcançada pela remoção de um elétron, ou de um par de elétrons de uma

molécula circunvizinha. Na transferência do elétron seguinte, o radical livre original se torna

estável. Porém, a molécula vira doadora, portanto, tem um elétron desemparelhado, que

aumenta sua reatividade química. Deste modo, a presença de um único radical pode iniciar

uma cadeia de reações de transferências de elétrons. Exemplos de espécies reativas de

oxigênio: ânion superóxido (2O

), hidroxila (OH

), óxido nítrico (NO), radical peróxido

(ROO

), e o não-radical peróxido de hidrogênio (H

) (KUYVENHOVEN; MEINDERS,

1999). Estes radicais livres sofrem ação de sistemas enzimáticos como, por exemplo, a

superóxido dismutase e hidroperoxidases (catálase e glutationa peroxidase) encontrados na

mitocôndria e citosol.

A enzima superóxido dismutase catalisa a conversão de superóxido para peróxido

hidrogênio e molécula de oxigênio:

+ 2H

→→ H

+ O

A glutationa peroxidase metaboliza o peróxido de hidrogênio gerado pela

superoxido dismutase, oxidando o tripeptídeo glutationa em uma forma oxidada:

GSH + H

→→ GSSG + 2H

A catálase também transforma peróxido de hidrogênio em água e oxigênio

(PARTHIBAN et al., 1995; KUYVENHOVEN; MEINDERS, 1999; McCORD, 2000).

→ 2H

O + O

A disfunção do tecido nervoso diabético pode ser provocada por efeitos diretos

dos radicais livres. Eles se originam através da peroxidação lipídica das membranas do axônio

e das células de Schwann, levando a uma diminuição da função das células nervosas

(CAMERON et al., 1993) e/ou efeitos indiretos, que são gerados via vascular. Neste caso, a

concentração elevada das lipoproteínas (LDL) no diabetes inibe o relaxamento do tecido

vascular; quando estas são oxidadas tornam-se citotóxicas para vários tipos de células,

incluindo as células endoteliais (MOREL; CHISOLM, 1989; BAYNES, 1991).

Outros mecanismos potenciais para o aumento do estresse oxidativo são a

glicosilação autoxidativa (MARITIM et al., 2003), via do poliol, micro e macroangiopatia

relacionada à hipóxia e alterações nos níveis de mediadores inflamatórios (BAYNES, 1991).

A deficiência do ácido γ-linolênico e N-acetil-L-carnitina também tem sido

implicado como fator do desenvolvimento da neuropatia. O ácido linolênico é metabolizado

em um importante ácido, constituinte de fosfolipídio da membrana neuronal e como um

substrato para formação de prostaglandina E, o qual pode ter importante prevenção do nervo e

fluxo sanguíneo. A conversão do ácido linolênico para dihomo-γ-linolênico e o subseqüente

metabólito é prejudicado em pacientes diabéticos, possibilitando contribuir para a patogenia

da neuropatia diabética (VINIK, 1999).

No diabetes mellitus as enzimas antioxidantes estão com seus níveis reduzidos e

há um aumento na peroxidação lipídica (VIJAYALINGAM et al., 1996; CAMERON;

COTTER, 1999; KUYVENHOVEN; MEINDERS, 1999). Dentre as enzimas antioxidantes

que são afetadas em conseqüência do diabetes mellitus podemos citar a glutationa. A

suplementação com glutamina pode ser promissora, visto que é precursora da glutationa e

poderá atuar desta maneira na neuroproteção.

A glutamina é o aminoácido livre mais abundante no corpo. Sua fonte primária é

o músculo esquelético, sendo posteriormente liberado na corrente sangüínea e transportado

para vários tecidos (CURI et al., 2005). Este aminoácido é armazenado principalmente no

músculo esquelético (75%) e fígado (25%) (VAHDAT et al., 2001). Seu peso molecular é

147,1 e pode ser sintetizado virtualmente por todos os tecidos do organismo. Na sua

composição química encontramos: C (41,09%), H (6,9%), O (32,84%) e N (19,17%) (CURI,

2000). A glutamina tem um papel essencial, participando na manutenção da função de vários

órgãos e células tais como: rins, intestino, fígado, coração, neurônios, linfócitos, macrófagos,

células beta pancreática e adipócitos (CURI et al., 2005). Dentre suas muitas funções, este

aminoácido serve como transportador primário de nitrogênio entre os tecidos. É também a

principal fonte de energia para a rápida proliferação de células como, por exemplo, do epitélio

intestinal, linfócitos ativados e fibroblastos (VAHDAT et al., 2001). Não é considerado um

aminoácido essencial, pois pode ser sintetizado pelo organismo. Contudo, em algumas

condições, como trauma, septicemia e câncer e, eventualmente, esforço físico extremo, a

concentração intracelular e plasmática deste aminoácido sofre redução de até 50%. Assim,

quando a demanda é maior que a produção, estabelece-se um quadro de deficiência de

glutamina. Por esta razão, este aminoácido tem recebido a denominação de “condicionalmente

essencial” (CURI, 2000).

O processo catabólico da glutamina adicional gera precursores para a síntese de

moléculas chave, tal como a glutationa (CURI et al., 2005). Deste modo, o aminoácido é

metabolizado através da enzima mitocôndrial fosfato-glutaminase, resultando em glutamato e

amônia. Estes são transportados para o citosol onde o glutamato é usado na síntese de

glutationa através do ciclo γ- glutamil. Na realidade, a glutamina sustenta o pool de glutamato

intracelular e glutationa evitando sua depleção (AMORES-SÁNCHEZ; MEDINA, 1999;

KIDD, 1997).

Ao contrário do que acontece em muitas células, o neurônio não contém a enzima

γ-glutamil-cisteina-sintetase (importante na síntese de glutationa) e, portanto, necessita que as

células gliais secretem dipeptídeos (VINCENT et al., 2004). No sistema nervoso central, a

síntese de glutationa necessita das células gliais (astrócitos) que, a partir do glutamato,

combinam com a γ-glutamil-cisteína-sintetase e formam um γ-peptídeo, unindo uma molécula

cisteína e um resíduo de glutamato, formando o γ-glutamil-cisteína. A seguir, a glicina é

acrescentada pela glutationa síntetase (VINCENT et al., 2004), formando a glutationa

(DRINGEN et al., 1999). Conseqüentemente, a glutationa liberada do astrócito é substrato da

ectoenzima astroglial γ-glutamil transpeptidase (γ-GT). Os dipeptídeos cisteína glicina,

produto da reação da ectoenzima astroglial γ-glutamil transpeptidase, servem como

precursores da glutationa neuronal. Em adição, a glutamina é liberada pelo astrócito e usada

pelo neurônio como precursor do glutamato necessário para síntese de glutationa (fig. 1)

(DRINGEN et al., 1999). No sistema nervoso periférico as células da glia incluem células

satélites e células de Schwann, as quais apresentam função similar a dos astrócitos no sistema

nervoso central atendendo a demanda dos neurônios (MILLER et al., 2002).

Figura 1. Esquema propõe interação metabólica entre neurônios

e astrócitos referente à síntese de glutationa. A glutationa

liberada pelo astrócito é substrato da ectoenzima y-GT. Os

dipepitídeos CysGly, um produto da reação y-GT, servem como

precursores neuronais da glutationa.

Fonte: Dringen et al. (1999).

Vários autores mostraram que a glutamina aumenta ou mantém os níveis da

glutationa nas células. Roth et al. (2002) demonstraram que ratos tratados com glutamina

apresentaram um aumento nos níveis de glutationa nas células. Flaring et al.(2003) também

demonstraram que a suplementação com glutamina reduz a depleção da glutationa no

músculo esquelético em humanos que sofreram trauma cirúrgico. Timothy et al. (1994)

demonstraram que a suplementação com a glutamina em ratos mantém os níveis de glutationa

durante a isquemia/reperfusão intestinal.

Estudos mostram que os níveis de glutationa bem como a atividade da

superoxido dismutase apresentam-se reduzidos em ratos diabéticos induzidos com

estreptozootocina (LOVEN et al., 1986). A glutationa é um tripeptídeo γ-glutamil-cisteína-

glicina, considerado um dos mais importantes antioxidantes, e essencial para função de

replicação da célula normal, antitoxina e cofator para enzima. Deste modo, como a cisteína

contém um resíduo sulfídril que é facilmente oxidado, a glutationa se comporta como um

eficiente redutor de espécie reativa de oxigênio. Em uma típica reação de redução, a espécie

reativa de oxigênio está reduzida (e desativada) pela geração de uma ligação dissulfúrica entre

duas moléculas de GSH, resultando assim em um par de glutationa oxidada. Uma vez que a

espécie reativa de oxigênio foi desativada, duas moléculas de glutationa podem ser

recuperadas pela reação de enzima catalisada através da glutationa redutase (AMORES-

SÁNCHEZ; MEDINA, 1999). Esta enzima usa como fonte de elétrons a coenzima NADPH

para que ocorra a reação como mostra a figura 2 (KIDD, 1997).

Vários estudos com o uso de glutationa já foram realizados. Segundo Bravenboer

et al. (1992), o uso potencial de GSH em ratos diabéticos induzidos por estreptozootocina é

particularmente efetivo na prevenção da neuropatia diabética, mas seu valor é limitado

quando a complicação já está presente. Ueno et al. (2002) demonstraram que o tratamento

dietético com glutationa em ratos diabéticos induzidos por estreptozootocina preveniu a

disfunção neuronal e renal. Isto sugere uma potencial utilidade do tratamento dietético da

glutationa para reduzir complicações diabéticas.

Portanto, a suplementação com glutamina na neuropatia diabética pode

possivelmente apresentar um efeito neuroprotetor, uma vez que ela é precursora da glutationa.

A glutationa é um antioxidante endógeno que, na presença do estresse oxidativo associado

com o diabetes mellitus, tem seus níveis reduzidos, sofrendo assim um aumento na

concentração de radicais livres, levando à complicações diabéticas tais como a neuropatia.

Figura 2. Demonstra a via de oxidação - redução que envolve glutationa.

Fonte: Kidd (1997).

Referência

AFZAAL, S.; SINGH, M.; SALEEM, I. Aetipathogenesis and management of diabetic

neuropathy. JAPI: Journal of the Association of Physicians of India, Bombay, v. 50, p.

707-711, 2002.

AMERICAN DIABETES ASSOCIATION. Report of the expert committee on the diagnosis

and classification of diabetes mellitus. Diabetes Care, Alexandria, v. 20, n. 7, p. 1183-1197,

1997.

AMORES-SANCHES, M. I.; MEDINA, M. A. Glutamine, as a precursor of glutathione, and

oxidative stress. Molecular Genetics and Metabolism, San Diego, v. 67, p. 100-105, 1999.

BAYNES, J. W. Role of oxidative stress in development of complications in diabetes.

Diabetes, New York, v. 40, p. 405-412, 1991.

BERNSTEIN, R. R.; BUSIK, V. J.; HENRY, N. D. Are diabetic neuropathy, retinopathy and

nephropathy caused by hyperglycemic exclusion of dehydroascorbate uptake by glucose

transporters? Journal of Theoretical Biology, London, v. 216, p. 345-359, 2002.

BRAVENBOER, B.; KAPPELLE, A. C.; HAMERS, F. P. T.; VAN BUREN, T.;

ERKELENS, W. D.; GISPEN, W. H. Potential use of glutathione for the prevention and

treatment of diabetic neuropathy in the streptozotocin-induced diabetic rat. Diabetologia,

Heidelberg, v. 35, p. 813-817, 1992.

BÜTTOW, N. C.; MIRANDA-NETO, M. H.; BAZOTTE, R. B. Morphological and

quantitative study of the myenteric plexus of the duodenum of streptozotocin-induced diabetic

rats. Experimental Gastroenterology, São Paulo, v. 34, p. 34-42, 1997.

CAMERON, N.E.; COTTER, M.A. Effects of antioxidants on nerve and vascular dysfunction

in experimental diabetes. Diabetes Research and Clinical Practice, New York, v. 45, no.

2/3, p. 137-46, 1999.

CAMERON, N. E.; COTTER, M. A. Metabolic and vascular factors in the pathogenesis of

diabetic neuropathy. Diabetes, Aberdeen, v. 46, 2S, p. 31s-37s, 1997.

CAMERON, N. E.; COTTER, M. A.; MAXFIELD, E. K. Anti-oxidant treatment prevents the

development of peripherical nerve disfunction in streptozotocin-diabetic rats. Diabetologia,

Heidelberg, v. 36, no. 4, p. 299-304, 1993.

CLEMENTS, JR.; REX, S. Diabetic neuropathy-new concepts of its etiology. Diabetes, New

York, v. 28, p. 604-11, 1979.

COTRAN, R. S.; KUMAR, V.; ROBBINS, S. L. Robbins patologia estrutural e funcional.

5. ed. Rio de Janeiro: Guanabara Koogan, 1996.

CURI, R. Glutamina: metabolismo e aplicações clinicas e no esporte. Rio de janeiro: Sprint,

2000.

CURI, R., LAGRANHA, C. J., DOI, S. Q., SELLITTI, D. F., PROCORPIO, J., PITHON-

CURI, T. C., CORLESS, M., NEWSHOLME, P. Molecular mechanisms of glutamine action.

Journal of Cellular Physiology. v. 204, 392-401, 2005.

DYCK, J. P.; GIANNINI, C. Pathologic alterations in the diabetic neuropathies of humans: a

review. Journal of Neuropathology and Experimental Neurology, Lawrence, v. 55, no. 12,

p. 1181-1193, 1996.

DRENGK, A. C., KAJIWARA, S. B., GARCIA S. B., CARMO, V. S., LARSON, R. E.,

ZUCOLOTO, S., ESPREAFICO, E. M. Immunolocalization of myosin-V in the enteric

nervous system of the rat. Journal of the Autonomic Nervous System, Ribeirão-Preto SP, v.

78, p. 109-112, 2000.

DRINGEN, R.; PFEIFFER, B.; HAMPRECHT, B. Synthesis of antioxidant glutathione in

neurons: supply by astrocytes of cysgly as precursor for neuronal glutathione. Journal of

Neuroscience, n. 1, v. 19, p.562-569, 1999.

FINEGOLD, D.; LATTIMER, A. S.; NOLLE, S.; BERNSTEIN, M.; GREENE, A. D. Polyol

pathway activity and myo-inositol metabolism: a suggested relationship in the pathogenesis of

diabetic neuropathy. Diabetes, New York, v. 32, p. 988-992, 1983.

FLARING, U. B.; ROOYACKERS O. E.; WERNERMAN, J.; HAMMARQVIST, F.

Glutamine attenuates post-traumatic glutathione depletion in human muscle. Clinical Science,

v. 104, p. 275-282, 2003.

FREGONESI, C. E. P. T.; MIRANDA-NETO, M. H.; MOLINARY, S. L. ZANONI, J. N.

Quantitative study of the myenteric plexus of the stomach of rats with streptozotocin-induced

diabetes. Arquivo de Neuropsiquiatria, São Paulo, v. 59, p. 50-53, 2001.

FURNESS, J.B.; COSTA, M. Types of nerves in the enteric nervous system. Autonomic

Neuroscience, Oxford, v. 5, p. 1-20, 1980.

FURNESS, J. B.; COSTA, M. Physiology of the gastrointestinal tract. 2

. ed. New York:

Leonard R. Johnson: Raven Press, 1987a.

FURNESS, J. B.; COSTA, M. The Enteric Nervous System. New York: Churchill

Livingstone, New York, 1987b.

GIUGLIANO, D. et al. Oxidative stress and diabetic vascular complications. Diabetes Care,

Alexandria, v.19, n. 3, p.257-267,1996.

HERNANDES, L.; BAZOTTE, R. B.; GAMA P.; MIRANDA-NETO, M. H. Streptozotocin-

induced diabetes duration is important to determine changes in the number and basophily of

myenteric neurons. Arquivo de Neuropsiquiatria, São Paulo, v. 58, n. 4, p. 1035-1039,

2000.

HOSKING, D. J.; BENNET, T.; HAMPTON, J. R. Diabetic autonomic neuropath. Diabetes,

New York, v. 27, p. 1043-1055, 1978.

HOUNSOM, L.; CORDER, R.; PATEL, J.; TOMLINSON, D. R. Oxidative stress participates

in the breakdown of neuronal phenotype in experimental diabetic neuropathy. Diabetologia,

Heildelberg, v. 44, p. 424-428, 2001.

KARAKIDA, T.; ITO, S.; HOMMA, S. In vitro motor activity of intestinal segments of

streptozotocin diabetics rats. Journal of the Autonomic Nervous System, Amsterdan, v. 26,

p. 43-50, 1989.

KATZ, L. A.; SPIRO, H. M. Gastrointestinal manifestations of diabetes. The New England

Journal of Medicine, Massachusettes, v. 275, n. 24, p.1350-361, 1966.

KIKUCHI, S. et al. Glycation - a sweet tempter for neuronal death. Brain Research Reviews,

Sapporo, Japan, v. 41, p. 306-323, 2003.

KIDD, M. P. Glutathione: Systemic protector against oxidative and free radical damage.

Alternative Medicine Review, n. 3, v. 2, p. 155-176, 1997.

KUYVENHOVEN, J. P., MEINDERS, A. E. Oxidative stress and diabetes mellitus

pathogenesis of long-term complications. European Journal of Internal Medicine, New

York, v.10, p. 9-19, 1999.

LOVEN D.; SCHEDL, H.; WILSON, H. et al. Effect of insulin and oral glutathione levels

and superoxide dismutase activities in organs of rats with streptozotocin-induced diabetes.

Diabetes, v. 35, p. 503 – 507, 1986.

MARITIM, A. C.; SANDERS, R. A.; WATKINS, J. B. Diabetes, oxidative stress, and

antioxidants: A review. Journal Biochemical and Molecular Toxicology, New York, v. 17,

no. 1, p. 24-38, 2003.

McCORD, M. J. The evolution of free radicals and oxidative stress. American Journal of

Medicine, Philadelphia, v. 108, p. 652-659, 2000.

McLAREN, H. E. Diabetic Neuropathy. Comprehensive Therapy, v. 4, n. 6, p. 54-58, 1976.

McLEAN J.W.; NAKANE P.K. Periodate-lysine-paraformaldehyde fixative. A new fixation

for immunoelectron microscopy. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry., n.

12, V. 22 p. 1077-83, 1974.

MILLER, E. K.; RICHARDS, A. B.; KRIEBEL, M. R. Glutamine, glutamine synthetase,

glutamate dehydrogenase and pyruvate carboxylase imunoreactivities in rat dorsal root

ganglion and peripheral nerve. Brain Research, v. 945, p.202-211, 2002.

MONCKTON, G.; PEHOWICH, E. Autonomic neuropathy in the streptozotocin diabetic rat.

The Canadian Journal of Neurological Sciences, v. 7, p. 135-142, 1980.

MOREL, D. W.; CHISOLM G. Antioxidant treatment of diabetic rats inhibits lipoprotein

oxidation and cytotoxicity. Journal of Lipid Research, Bethesda, v. 30, p. 1827-1834, 1989.

PARTHIBAN, A.; VIJAYALINGAM, S.; SHANMUGASUNDARAM, K. R.; MOHAN, R.

Oxidative stress and the development of diabetic complications-antioxidants and lipid

peroxidation in erythrocytes and cell membrane. Cell Biology International, London, v. 19,

p. 987-993, 1995.

ROMANO, B. E.; MIRANDA-NETO, M.; CARDOSO, R. C. S. Preliminary investigation

about the effects of streptozotocin-induced chronic diabetes on the nerve cell number and size

of myenteric ganglia in rat colon. Revista Chilena de Anatomia, Cautin, v.14, p. 139-145,

1996.

ROTH, E.; OEHLER,R.; MANHART, N.; EXNER, R.; WESSENER, B.; STRASSER, E.;

SPITTLER, A. Regulative potential of glutamine-relation to glutathione metabolism.

Nutrition, v. 18, p. 217-221, 2002.

STERNINI, C. Structural and chemical organization of the myenteric plexus. Annual Review

of Physiology, Palo Alto, v. 50, p. 81-93, 1988.

TIMOTHY, R. S.; HARWARD, M. D.; DOUGLAS COE, M. D. et al. Glutamine preserves

gut glutathione levels during intestinal ischemia/reperfusion. Journal of Surgical Research,

v. 56, p. 351-355, 1994.

UENO, Y.; MIHO, K.; RYUSUKE, N.; TOSHIKAZU, K.; HIROYUKI, S.; TOSHIHIKO, O.

Dietary glutathione protects rats from diabetic nephropathy and neuropathy. Journal of

Nutrition, v. 132, p. 897-900, 2002.

VAHDAT, L. et al.

Reduction of paclitaxel-induced peripheral neuropathy with glutamine.

Clinical Cancer Research, Philadelphia, v. 7, p. 1192-1197, 2001.

VAN DAM, S. P. et al. Nerve function and oxidative stress in diabetic and vitamin E deficient

rats. Free Radical Biology and Medicine, New York, v. 24, n. 1, p. 18-26, 1997

VIJAYALINGAM, S.; PARTHIBAN, A.; SHANMUGASUNDARAM, R. K.; MOHAN, V.

Abnormal antioxidant status in impaired glucose tolerance and non-insulin-dependent

diabetes mellitus. Diabetic Medicine, Oxford, v. 13, p. 715-719, 1996.

VINCENT, A. M.; RUSSELL, J. W.; LOW, P.; FELDMAN, E. L. Oxidative stress in the

pathogenesis of diabetic neuropathy. Endocrine Reviews, Ann Arbor, v. 25, no. 4, p. 612-

628, 2004.

VINIK, A. I.; ANAHIT MEHRABYAN. Diabetic neuropathies. The Medical Clinics of

North America, v. 88, p. 947–999, 2004.

VINIK, I. A. Diabetic Neuropathy: Pathogenesis and therapy. American Journal of

Medicine, Philadelphia, v. 107, no. 2B, p. 17-26, 1999.

WOLFF, S. P. Diabetes mellitus and free radicals: free radicals, transition metals and

oxidative stress in the etiology of diabetes mellitus and complications. British Medical

Bulletin, Oxford, v. 49, n. 3, p. 642-652, 1993.

ZANONI, J.N.; MIRANDA-NETO, M.H.; BAZOTTE, R.B.; SOUZA, R.R. Morphological

and quantitative analysis of the neurons of the myenteric plexus of the cecum of

streptozotocin diabetic rats. Arquivo de Neuropsiquiatria, São Paulo, v. 55, p. 696-702,

1997.

ZANONI, J. N.; BUTTOW N. C.; BAZOTTE, R. B.; MIRANDA-NETO, M. H. Evaluation

of the population of NADPH-diaphorase-stained and myosin-V myenteric neurons in the

ileum of chronically streptozotocin-diabetic rats treated with ascorbic acid. Autonomic

Neuroscience, Amsterdan, v. 104, p. 32-38, 2003.

ZAUPA, C.; ZANONI, J. N. Diabetes mellitus aspectos gerais e neuropatia diabética.

Arquivo de Ciências e Saúde da Unipar. v. 4, p. 19-25, 2000.

Avaliação quantitativa e morfométrica da população de neurônios mioentéricos

imunoreativos à miosina-V do íleo de ratos diabéticos suplementados com L-glutamina

Eleandro Aparecido Tronchini

, Cristiano Massao. Tashima

, Enilza Maria Espreafico

Roberto Barbosa Bazotte

, Jaqueline Nelisis Zanoni

Departamento de Ciências Morfofisiológicas (DCM/UEM), Universidade Estadual de

Maringá, 87020900 Maringá, PR, Brasil;

Departamento de Biologia Celular e Molecular –

USP – São Paulo;

Departamento de Farmácia e Farmacologia, Universidade Estadual de

Maringá, Maringá, PR, Brasil;

* Correspondência para o autor: Av. Colombo, 5790 – 87020-900 – Maringá, PR, Brasil.

Tel. +55-044-32614705 Fax. +55- 044-32614340. E-mail: [email protected]

Número de tabelas: 2

Número de figuras: 4

Resumo

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da suplementação com L-glutamina

sobre os neurônios mioentéricos do íleo de ratos Wistar portadores de diabetes mellitus

induzido por estreptozootocina. Os animais foram divididos em cinco grupos (n= 5):

normoglicêmico não tratado (UN), normoglicêmico tratado com L-glutamina (NG), diabéticos

não tratados (UD), diabéticos tratados com L-glutamina, a partir do 4° (DG4) ou 45° dia da

indução do diabetes (DG45). O aminoácido foi adicionado à ração na quantidade de 1%. A

técnica imunohistoquímica miosina-V foi utilizada para evidenciação dos neurônios

mioentéricos. Foram avaliadas as áreas de corpos celulares de 500 neurônios em cada grupo

estudado. A análise quantitativa foi realizada em uma área de 9.16 mm

de cada íleo

analisado.

Observamos a organização do plexo mioentérico através da técnica

miosina–V,

onde visualizamos os plexos primário, secundário e terciário, além da presença de neurônios

isolados no trajeto das fibras nervosas. Não houve diferença na densidade neuronal e na área

do corpo celular dos neurônios mioentéricos miosina–V imunoreativos dos grupos DG4 e

DG45 em relação ao grupo D. A suplementação com L-glutamina (1%) não causou efeito

neuroprotetor sobre os neurônios miosina-V imunoreativos.

Palavras-chave: L-glutamina, diabetes mellitus, glutationa, íleo, miosina-V, plexo

mioentérico, ratos, estreptozootocina.

1. Introdução

O diabetes mellitus é uma síndrome clínica heterogênea que se caracteriza por

anormalidades endócrino-metabólicas que alteram a homeostase. As anormalidades

metabólicas envolvem importantes transtornos do metabolismo de carboidratos, lipídios e

proteínas. Dentre as complicações crônicas causadas pelo diabetes mellitus as manifestações

neurológicas são provavelmente as mais comuns. A neuropatia diabética é um grupo

heterogêneo de desordens e apresenta uma gama extensa de anormalidades (Vinik e

Mehrabyan, 2004), que podem afetar o sistema nervoso autonômico e periférico prejudicando

a qualidade de vida (Vinik, 1999; Afzaal et al., 2002).

Diversos estudos vêm demonstrando alterações no plexo mioentérico de vários

segmentos intestinais de ratos diabéticos, envolvendo não apenas a redução do número, mas

também do tamanho dos neurônios (Romano et al., 1996; Zanoni et al., 1997; Hernandes et

al., 2000; Furlan et al., 2002; Zanoni et al., 2003). Um importante fator relacionado a

neuropatia diabética é o estresse oxidativo (Vinson et al., 1989; Baynes, 1991), que ocorre

quando há um aumento de espécies reativas de oxigênio (EROS) (Parthiban et al., 1995;

Kuyvenhoven e Meinders, 1999) e/ou uma redução da eficiência dos antioxidantes endógenos

(Baynes, 1991; Kuyvenhoven e Meinders, 1999).

Outro fator que provoca degeneração neuronal é a elevação intracelular do

sorbitol, devido ao aumento da atividade da enzima aldose redutase da via do poliol em

conseqüência da hiperglicemia (Vinik, 1999; Giugliano et al., 1996; Afzaal et al., 2002).

Como a conversão de glicose em sorbitol consome NADPH, há redução da razão

NADPH:NADP

(Giugliano et al., 1996). Essa redução pode comprometer as reações que

requerem NADPH, com destaque para a conversão de glutationa oxidada em glutationa

reduzida pela glutationa redutase. De acordo com esta observação, verifica-se níveis

reduzidos de glutationa no diabetes mellitus (Vincent et al., 2004) o que aumenta a

susceptibilidade das células endoteliais ao estresse oxidativo (Giugliano et al., 1996). Assim,

medidas que elevem a disponibilidade de antioxidantes podem ser relevantes no tratamento

das complicações crônicas do diabetes mellitus. Dentro deste contexto, a suplementação com

L-glutamina pode possivelmente apresentar algum efeito neuroprotetor, uma vez que é

precursora da glutationa (Amores-Sánchez e Medina, 1999).

A L-glutamina é um aminoácido não essencial, armazenado principalmente no

músculo esquelético (75%) e no fígado (25%). Dentre suas muitas funções, a L-glutamina

serve como transportador primário de nitrogênio entre os tecidos e é a principal fonte de

energia para a proliferação de células, tais como: do epitélio intestinal, linfócitos e

fibroblastos (Vahdat et al., 2001). A L-glutamina é metabolizada através da fosfato-L-

glutaminase, resultando em glutamato e amônia. O glutamato é transportado para o citosol e

pode ser usado na síntese de glutationa (Amores-Sánches e Medina, 1999), mantendo assim a

concentração de glutationa nas células.

O objetivo deste trabalho foi avaliar o efeito da suplementação com L-glutamina

sobre os neurônios mioentéricos imunomarcados pela miosina-V no íleo de ratos diabéticos

induzidos pela estreptozootocina.

2. Materiais e métodos

2.1. Procedimento com os animais.

Todos os experimentos descritos neste trabalho foram revisados e aprovados pelo

Comitê de Ética na Experimentação Animal da Universidade Estadual de Maringá. Foram

utilizados vinte e cinco ratos Wistar (Rattus norvegicus) machos, com 90 dias de idade. O

diabetes foi induzido através da administração endovenosa de 35 mg kg

-1

do peso corporal de

estreptozootocina (Sigma, St. Louis, MO, USA), dissolvida em solução tampão de 10 mmol l

(pH 4.5), após um jejum de 14 horas. A injeção com estreptozootocina resultou na síndrome

diabética com poliúria, polifagia e polidpsia. A glicemia (Bergmeyer e Bernt, 1974) de cada

animal foi avaliada no quarto dia após a indução do diabetes, obtendo-se o valor médio de

486.9 ± 14.25 mg/dl. Os ratos foram divididos em cinco grupos: normoglicêmico não tratado

(UN), normoglicêmico tratado com L-glutamina (NG), diabéticos não tratados (UD),

diabéticos tratados com L-glutamina, a partir do 4° (DG4) ou 45° dia da indução do diabetes

(DG45). A quantidade de alimento ingerido, de água consumida e urina eliminada foi avaliada

durante cinco dias da última semana de cada mês com utilização de gaiolas metabólicas.

Os animais foram mantidos em caixas individuais, recebendo água e alimento

(Nuvital

lab) ad libitum, com fotoperíodo (6:00 am – 6:00 pm) e temperatura ambiente

(24ºC±2ºC) controladas. Parte dos animais recebeu ração suplementada (1%) com L-

glutamina (Ajinomoto, Tokyo, Japan), preparada semanalmente.

Aos 210 dias os animais foram anestesiados com tiopental (40 mg kg

-1

do peso

corporal) e o sangue coletado por punção cardíaca para dosagem da glicose (Bergmeyer e

Bernt, 1974).

2.2. Imunolocalização da miosina-V (Drengk et al., 2000)

Os ratos foram perfundidos com 250 ml de solução fixadora contendo periodato de

sódio (10 mM), lisina (75 Mm), paraformaldeído (1%) tampão fosfato (37 mM), pH 7,4 e

posteriormente com solução salina 1.1 %. Imediatamente após a perfusão, os íleos foram

removidos, lavados com solução salina, abertos e imersos na mesma solução fixadora por 1

hora. Depois, os segmentos foram desidratados em etanol (50, 70, 80, 90 e 100%)

permanecendo em cada solução por 10 minutos, diafanizados em xilol (10 minutos),

reidratados com etanol 100, 95, 90, 80, 70% e estocados em etanol 70%. Em seguida, os

segmentos foram dissecados sob estereomicroscópio com trans-iluminação, através da

remoção da túnica mucosa e tela submucosa, obtendo preparados totais da túnica muscular.

Os preparados totais foram lavados duas vezes em tampão fosfato salinado (PBS) 0,1 M, pH

7,4 e bloqueados por 1 hora com PBS, albumina soro bovina (BSA) 2 % (Sigma, St. Louis,

MO, USA), soro de cabra 2 % e Triton-X-100 0,5 % (Sigma, St. Louis, MO, USA), à

temperatura ambiente (TA). Em seguida, os segmentos foram incubados em TA (24 hs) em

solução contendo anticorpo primário anti-miosina-V 1:750 (obtido de coelho) diluído em

PBS, BSA 2%, Triton-X-100 (0,1%) e soro de cabra (2%), em tubos eppendorf. Após a

incubação, os preparados totais foram lavados duas vezes em PBS + Triton-X-100 0,1% e

duas vezes em solução de PBS + Tween 0,05%. Em seguida, foram incubados em anticorpo

secundário (anti coelho) conjugado com peroxidase 1: 1000 (Pierce, Rockford, USA) à TA

sob agitação por 24 hs. A seguir, foram lavados quatro vezes, durante 15 minutos, em PBS +

Tween 0,05%. Os preparados foram revelados com diaminobenzidina (DAB) (Sigma, St.

Louis, MO, USA) e montados com glicerol gel. O controle negativo foi realizado com a

omissão do anticorpo primário.

2.2.2. Anticorpo miosina V

Anticorpo anticauda policlonal, gerado contra a proteína recombinante miosina-V

da galinha foi caracterizado previamente (Espreafico et al., 1992). Um fragmento cDNA (que

corresponde aos aminoácidos 899-1830) de um clone miosina-V cauda do cérebro de galinha

foi subclonado dentro do vetor pGEX para gerar uma Glutationa transferase (GST)/ miosina

cauda medial (que corresponde aos aminoácidos 1117-1435) proteína em fusão em bactéria

XL1Blue. Esta GST/miosina-V cauda medial foi purificada sobre resina glutationa. Esta

proteína em fusão foi usada como um antígeno para produção de anticorpo em coelhos. O

soro imune foi purificado sobre uma coluna de proteína com afinidade PLM/miosina-V cauda

para enriquecer IgG anticorpos direcionados contra a miosina-V cauda medial. Anticorpos

secundários conjugados com peroxidase soro anticoelhos IgG foram usados (Pierce,

Rockford, USA).

2.3. Analise quantitativa

A análise quantitativa foi realizada na região intermediária da circunferência

intestinal (60º

a 120º; 240º a 300º), considerando-se como 0º a inserção do mesentério

(Miranda-Neto et al., 2001; Zanoni et al., 2005). Os neurônios foram contados com auxílio de

microscópio BX40 Olympus sob objetiva de 40X. Foram contados 40 campos microscópicos

aleatórios em cada preparado total. A área de campo microscópico foi de 0.229 mm

2.4. Análise morfométrica

As imagens foram capturadas por câmera de alta resolução e transferidas para

computador. O perfil celular (µm

) de 100 corpos celulares em cada animal, num total de 500

neurônios para cada grupo estudado foi mensurado através de programa computadorizado de

análises de imagens Image-Pro-Plus 4 (Media Cybernetics, USA). Os neurônios foram

classificados em classes de 100 µm

e foram obtidas as porcentagens de cada grupo para cada

intervalo.

2.5. Análise estatística

Os dados foram analisados pelo método de quadrado mínimo, por meio de análise

de variância (ANOVA), seguida de teste Tukey, que foi empregado como pós-teste para

comparação de médias. Uma vez que as áreas dos corpos celulares dos neurônios não

apresentavam uma distribuição normal, utilizamos a análise de variância e teste “t de

Student” para comparação das médias. As análises foram realizadas com software Prisma 3.0.

Os resultados estão expressos como média ± erro padrão (M ± EP).

3. Resultados

Verificamos no presente estudo que os ratos diabéticos (grupos UD, DG4 e DG45)

não ganharam peso na mesma proporção quando comparados aos animais dos grupos

normoglicêmicos (N e NG) (p < 0,05) (tabela 1). A suplementação com L-glutamina não

alterou o peso corporal final dos ratos dos grupos DG4 e DG45 quando comparados com os

animais do grupo UD (p > 0,05) (tabela 1). A condição diabética foi mantida durante o

período de estudo, pois a glicemia apresentava-se elevada em todos os grupos diabéticos

investigados. A síndrome diabética foi também confirmada pela presença de polifagia,

poliúria e polidpsia (tabela 1). A suplementação com L-glutamina não reverteu estes

parâmetros.

Com a técnica imunohistoquímica miosina-V, pudemos observar os três

componentes do plexo mioentérico (Fig. 1). O plexo primário foi bem evidenciado, sendo

constatada a presença de gânglios e fibras nervosas interganglionares. No trajeto das fibras

nervosas do plexo primário observamos a presença de neurônios isolados. Os plexos

secundários e terciários apresentavam-se bastantes evidentes. As fibras nervosas do plexo

secundário corriam paralelamente às células musculares da camada circular da túnica

muscular. O plexo terciário era formado por finas fibras nervosas, situadas entre os espaços

deixados pelo plexo primário (Fig. 1). A Fig. 2 mostra os neurônios mioentéricos miosina-V

imunoreativos observados nos cinco grupos (UN, NG, UD, DG4, DG45). Observamos uma

diferente intensidade na marcação dos neurônios nos gânglios mioentéricos (Fig. 2).

Verificamos uma redução de 22,90% na densidade neuronal no íleo dos animais do

grupo UD quando comparados aos normoglicêmicos não tratados (UN) e normoglicêmicos

tratados com L-glutamina (NG) (p > 0,05). A densidade neuronal dos animais dos grupos

DG4 e DG45 foi similar à observada nos diabéticos não tratados (UD) (p > 0,05) (Fig. 3).

A área do perfil celular dos neurônios imunoreativos miosina-V dos animais do

grupo UD foi 4,6% maior em relação aos animais do grupo UN (p > 0,05) (tabela 2). A

suplementação com L-glutamina (grupo DG4 e DG45) não alterou estes resultados, sendo

observados valores semelhantes aos do grupo UD (p > 0,05). A maioria dos neurônios

apresentava perfis celulares que variavam de 101 a 400 µm

. A proporção de neurônios nesta

faixa para os grupos UN, NG, UD, DG4 e DG45 foi de 82,2%, 89,6%, 84,4%, 92,2% e 88,4%

respectivamente, como mostra a Fig. 4.

4. Discussão

Nosso modelo de diabetes experimental mostrou-se eficiente, pois observamos

aumento do consumo diário de água, ração, glicemia, além de menor peso corporal nos

animais dos grupos UD, DG4 e DG45 quando comparado aos animais normoglicêmicos

(grupos N e NG).

A técnica imunohistoquímica miosina-V foi utilizada para realizar a

imunomarcação dos neurônios mioentéricos em preparados totais da túnica muscular (Drengk

et al., 2000). Vários autores têm aplicado esta técnica de imunomarcação para evidenciação

dos neurônios mioentéricos em diferentes regiões do trato gastrintestinal (Buttow et al., 2003,

2004; Zanoni et al., 2003, 2005; Schoffen et al., 2005). A miosina-V é uma versátil proteína

motora e está envolvida no rápido transporte de vesículas dos dendritos para o axônio

(Langford, 2002). Esta técnica é utilizada como marcador da população neural total em

virtude de a miosina-V ser uma proteína motora e estar presente nos corpos celulares e fibras

nervosas. Através desta técnica, podemos observar a organização do plexo mioentérico no

íleo. Verificamos a presença dos três componentes (primário, secundário e terciário) que

formam este plexo. Este arranjo assemelha-se àquele descrito inicialmente por Auerbach em

1864 e por vários outros autores posteriormente, incluindo Furness e Costa (1980). A

diferente intensidade de marcação nos neurônios mioentéricos dentro dos gânglios foi

evidenciada em todos os grupos estudados. Segundo Drengk et al. (2000), esta

heterogeneidade na intensidade de coloração pode indicar diferentes níveis de atividade

neuronal.

Verificamos redução do número de neurônios mioentéricos imunomarcados pela

miosina-V no grupo UD na proporção de 22,90% quando comparados com os

normoglicêmicos (N). Este resultado foi similar ao evidenciado por Zanoni et al. (2003) que

verificaram redução de 24.4 % na densidade dos neurônios miosina-V imunoreativos do íleo

de ratos diabéticos. Existem vários fatores que atuam na redução do número de neurônios

mioentéricos. Dentre eles destacamos: a) - Aumento da atividade da aldose redutase que está

associada com um aumento nos níveis de sorbitol e frutose (Ferraz et al., 1997). O acúmulo de

sorbitol e frutose nos nervos leva a um decréscimo do mioinositol e conseqüente inibição da

bomba Na

ATPase, resultando na retenção de Na

, causando edema, disjunção axo-glial e

degeneração do nervo (Hosking et al., 1978; Clements e Rex, 1979; Finegold et al., 1983;

Vinik, 1999; Afzaal et al., 2002). b) - Aumento do estresse oxidativo (Baynes, 1991, Vincent

et al., 2004) que provoca um incremento na produção dos radicais livres. Os radicais livres

provocam uma disfunção do tecido nervoso diabético diretamente através da peroxidação

lipídica das membranas do axônio e das células de Schwann, levando a uma diminuição da

função das células nervosas (Cameron et al., 1993) e/ou efeitos indiretos, que são gerados via

vascular. Neste caso, a concentração elevada das lipoproteínas (LDL) no diabetes mellitus

inibe o relaxamento do tecido vascular, pois quando estas são oxidadas tornam-se citotóxicas

para vários tipos de células, incluindo as células endoteliais (Morel e Chilsom, 1989; Baynes,

1991). c) – Diminuição dos níveis de antioxidantes endógenos. Os níveis de glutationa se

encontram reduzidos durante a hiperglicemia levando a um aumento nas espécies reativas de

oxigênio (Parthiban et al., 1995; Greene et al., 1999; Vincent et al., 2004). A glutationa é um

importante antioxidante na maioria das células de mamíferos (Vincent et al., 2004). Esta

substância serve como um co-fator essencial para a enzima glutationa peroxidase, que remove

hidroperoxidase, e a formação de glutationa oxidada (GSSG). A glutationa reduzida (GSH) é

regenerada pela enzima glutationa redutase usando NADPH (Parthiban et al., 1995; Vincent

et al., 2004). Portanto, a hiperatividade da via poliol reduz os níveis de glutationa, levando a

um aumento nas espécies reativas de oxigênio (Nakamura et al., 2002). Esta redução está

relacionada ao aumento da atividade aldose redutase que consome NADPH, a qual também é

requerida para a formação da glutationa reduzida (Tesfamariam, 1994; Giugliano et al., 1996).

Com relação aos grupos diabéticos tratados com L-glutamina (DG4 e DG45),

verificamos que a suplementação com L-glutamina não evitou a redução do número de

neurônios mioentéricos, quando comparado ao grupo UD. Resultados semelhantes foram

observados por Zanoni et al. (2003) no íleo de ratos diabéticos tratados com acido ascórbico.

A suplementação com L-glutamina nos animais do grupo DG4 foi realizada para prevenir o

desenvolvimento da neuropatia diabética. Nos animais do grupo DG45, a suplementação teve

por objetivo atuar como um tratamento. Contudo, a suplementação com L-glutamina tanto na

prevenção como na reversão desta patologia não foi positiva. Shotton et al. (2004) também

analisaram a prevenção e a reversão do diabetes em nervos entéricos do íleo de ratos

diabéticos com tratamento combinado de ácido α-lipólico e ácido γ-linolênico. Neste

experimento, Shotton et al. (2004) examinaram imunohistoquimicamente nervos que

expressam para o polipeptídeo vasoativo intestinal (VIP), peptídeos relatado-gene calcitonina

(CGRP) e noradrenalina (NA). Verificou-se que as administrações de ácido α-lipólico e ácido

γ-linolênico preveniram e reverteram parcialmente as mudanças induzidas pelo diabetes em

nervos VIP e CGRP, embora individualmente nenhum tratamento foi efetivo.

A L-glutamina é um substrato energético muito importante para as células, sendo

também precursora para nucleotídeos, glutamato e, em particular, para síntese de GSH. Este

aminoácido durante o estresse catabólico apresenta sua concentração reduzida (Matés et al.,

2002). Sabe-se que a GSH é um importante antioxidante para as células, mas durante o

diabetes seus níveis apresentam-se reduzidos devido ao aumento de ROS. Portanto, a L-

glutamina, sendo precursora da GSH (Amores-Sánchez e Medina, 1999), é metabolizada pelo

ciclo γ-glutamyl produzindo a GSH. Esta é produzida por glutamato, glicina e cisteína (Matés

et al., 2002), os quais elevam a concentração da GSH e aumentam a produção de NADPH.

Isso irá subseqüentemente aumentar a taxa de GSH/GSSH (Curi et al., 2005), ajudando a

reduzir o quadro de ROS. Estudos executados por Roth et al. (2002) demonstraram que ratos

alimentados com L-glutamina exibiram um aumento no conteúdo celular de GSH. Uma

hipótese para nossos resultados não terem sido significativos com a suplementação da L-

glutamina deve-se ao fato de vários mecanismos estarem produzindo ROS. Dentre estes estão:

a via do poliol, a glicosilação autoxidativa, a redução dos antioxidantes e a redução da

eficiência do sistema enzimático (Vincent et al., 2004). Portanto, um tratamento combinado

de substâncias já estudadas individualmente (como o ácido ascórbico (Zanoni et al., 2003) ou

acetil-l-carnitina (Miranda–Neto et al., 2005)) com a L-glutamina poderia ser efetivo, pois

desta maneira os ROS seriam neutralizados por mecanismos diferentes.

Com relação a área do perfil neuronal, verificamos que não houve diferenças

significativas quando os cinco grupos foram comparados. Ao considerarmos especificamente

a condição do grupo UD com o grupo UN, verificamos que os neurônios miosina-V

imunoreativos dos animais do grupo UD foram 4,6% maior em relação aos animais do grupo

UN. Zanoni et al. (2003) também não observaram diferenças ao compararem o perfil celular

dos neurônios mioentéricos miosina-V do íleo de ratos diabéticos com os ratos diabéticos

tratados com ácido ascórbico. Por outro lado, neurônios VIP-érgicos e nitrérgicos observados

por Zanoni et al. (2002) e (2003) no íleo respectivamente, apresentaram aumento da área nos

ratos diabéticos e a suplementação com ácido ascórbico preveniu este aumento. Podemos

inferir que o diabetes mellitus afeta de um modo diferente as subpopulações de neurônios

mioentéricos, pois não verificamos alterações na área neuronal quando analisamos a

população total de neurônios.

Ao analisarmos a distribuição da população neuronal em classes arbitrárias em

intervalos de 100 µm

, verificamos que apesar da variabilidade observada no tamanho da área

do perfil neuronal (47,301 a 855,102 µm

), a maioria dos neurônios em ambos os grupos

apresentou uma área do perfil celular na faixa de 101 a 400 µm

. Isto indica a uniformidade na

distribuição neuronal entre os grupos.

Em síntese, o presente resultado mostrou que a suplementação com L-glutamina

(1%) não teve efeito sobre os neurônios mioentéricos miosina-V imuoreativos, evidenciado

pelo fato de não se encontrar diferenças significativas entre o número total e área dos perfis

celulares nos neurônios dos grupos diabéticos suplementados ou não com L-glutamina.

Agradecimentos

Os autores agradecem o apoio da MSc. Priscila de Freitas, Maria Euride do Carmo Cancino,

Maria dos Anjos Fortunato, Valdir Trombeli e José Antonio de Souza pelo excelente apoio

técnico.

Referências

Afzaal, S., Singh, M., Saleem, I., 2002. Aetipathogenesis and management of diabetic

neuropathy. J. Assoc. Physicians India 50, 707-711.

Amores-Sánches, M.I., Medina, M.A., 1999. Glutamine, as a precursor of glutathione, and

oxidative stress. Mol. Genet. Metab. 67, 100-105.

Baynes, J.W., 1991. Role of oxidative stress in development of complications in diabetes.

Diabetes 40, 405-412.

Bergmeyer, H.U., Bernt, E., 1974. Determination of glucose with glucose oxidase and

peroxidase. Methods of enzymatic analysis. New York: Verlag Chemiem-Academic

Press.

Buttow, N.C., Zucoloto, S., Espreafico, E.M., Gama, P., Álvares, E.P., 2003. Substance P

enhances neuronal area and epithelial cell proliferation after colon denervation in rats.

Dig. Dis. Sci. 48, 2069-2076.

Buttow, N.C., Santin, M., Macedo, L.C., Neres Teixeira, A.C., Novakowski, G.C., Bolonheis

Armelin, T. R., Assmann, K., 2004. Study of the myenteric and submucous plexuses after

BAC treatment in the intestine of rats. Biocell 28, 135-142.

Cameron, N.E., Cotter, M.A., Maxfield, E.K., 1993. Anti-oxidant treatment prevents the

development of peripherical nerve disfunction in streptozotocin-diabetic rats. Diabetologia

36, 299-304.

Clements, J.R., Rex, S., 1979. Diabetic neuropathy-new concepts of its etiology. Diabetes 28,

604-611.

Curi, R., Lagranha, C.J., Doi, S.Q., Sellitti, D.F., Procopio, J., Pithon-Curi, T.C., Corless, M.,

Newsholme, P., 2005. Molecular mechanisms of glutamine action. J. Cell Physiol. 204,

392-401.

Drengk, A.C., Kajiwara, J.K., Garcia, S.B., Carmo, V.S., Larson, R.E., Zucoloto, S.,

Espreafico, E.M., 2000. Imunolocalisation of myosin-V in the enteric nervous system of

the rat. J. Auton. Nerv. Syst. 78, 109-112.

Espreafico, E.M., Cheney, R.E., Matteoli, M., Nascimento, A.A., De Camilli, P.V., Larson,

R.E., Mooseker, M.S., 1992. Primary structure and cellular localization of chicken brain

myosin-V (p190), an unconventional myosin with calmodulin light chains. J. Cell Biol.

119, 1541-1557.

Ferraz, M., Ishii-Iwamoto, E., Batista, M.R., Brunaldi, R.B., Bazotte, R.B., 1997. Sorbitol

accumulation in rats kept on diabetic condition for short and prolonged periods. Acta

Pharmacol. Sin. 18, 309-311.

Finegold, D., Lattimer, A.S., Nolle, S., Bernstein, M., Greene, A.D., 1983. Polyol pathaway

activity and myo-inositol metabolism: a suggested relationship in the pathogenesis of

diabetic neuropathy. Diabetes 32, 988-992.

Furlan, M.M.D.P., Molinar, S.L., Miranda-Neto, M.H., 2002. Morphorquantitative affects of

acute diabetes on the myenteric neurons of the proximal colon of adult rats. Arq.

Neuropsiquiatr. 60, 576-581.

Furness, J.B., Costa, M., 1980. Types of nerves in the enteric nervous system. Neuroscience

5, 1-20.

Giugliano, D., Ceriello, A., Paolisso, G., 1996. Oxidative stress and diabetic vascular

complication. Diabetes Care. 19, 257-267.

Greene, D.A., Stevens, M.J., Obrosova, I., Feldman, E.L., 1999. Glucose-induced oxidative

stress and programmed cell death in diabetic neuropathy. Eur. J. Pharmacol. 375, 217-223.

Hernandes, L., Bazotte, R.B., Gama P., Miranda-Neto, M.H., 2000. Streptozotocin-induced

diabetes duration is important to determine changes in the number and basophily of

myenteric neurons. Arq. Neuropsiquiatr. 58, 1035-1039.

Hosking, D.J., Bennet, T., Hampton, J.R., 1978. Diabetic autonomic neuropath. Diabetes 27,

1043-1055.

Kuyvenhoven, J.P., Meinders, A.E., 1999. Oxidative stress and diabetes mellitus pathogenesis

of long-term complications. Eur. J. Intern. Med. 10, 9-19.

Langford, M.G., 2002. Myosin-Va Versatile Motor for Short-Range Vesicle Transport.

Traffic 3, 859–865.

Matés, J.M., Pérez-Gómez, C., Castro, I.N., Asenjo, M, Márquez, J., 2002 Glutamine and its

relationship with intracellular redox status, oxidative stress and cell proliferation/death.

Int. J. Biochem. Cell Biol. 34, 439-458.

Miranda Neto, M.H.; Defani, M. A., Fregonesi, C.E.P.T., Natali, M.R.M.; Pereira, A., 2005.

Morphometric and Quantitative Evaluation of the NADH-diaphorase Positive Myenteric

Neurons of the Jejunum of streptozotocin-Diabetic Rats Supplemented with Acetyl-L-

Carnitine. Anat. Histol. Embryol. 34, 154-158.

Miranda-Neto, M.H., Molinari, S.L., Natali, M.R.M., Sant’ana, D.M.G., 2001. Regional

differences in the number and type of myenteric neurons of the ileum of rats. Arq.

Neuropsiquiatr. 59, 54– 59.

Morel, D.W., Chisolm, G., 1989. Antioxidant treatment of diabetic rats inhibits lipoprotein

oxidation and cytotoxicity. J. Lipid. Res. 30, 1827-1834.

Nakamura, J., Homada, Y., Chaya, S., Nakashima, E., Naruse, K., Kato, K., Yasuda, Y.,

Kamiya, H., Sakakibara, F., Koh, N., Hotta, N., 2002. Transition metals and polyol

pathway in the development of diabetic neuropathy in rats. Diabetes Metab. Res. Rev. 18,

395-402.

Parthiban, A., Vijayalingam, S., Shanmugasundaram, K.R., Mohan, R., 1995. Oxidative stress

and the development of diabetic complications-antioxidants and lipid peroxidation in

erythrocytes and cell membrane. Cell Biol. Int. 19, 987-993.

Romano, B.E., Miranda-Neto, M., Cardoso, R.C.S., 1996. Preliminary investigation about the

effects of streptozotocin-induced chronic diabetes on the nerve cell number and size of

myenteric ganglia in rat colon. Rev. Chil. Anat. 14, 139-145.

Roth, E., Koehler, R., Manhart, N., Exner, R., Wessener, B., Strasser, E., Spittler, A., 2002.

Regulative potential of glutamine-relation to glutathione metabolism. Nutrition 18, 217-

221.

Schoffen, J.P.F, Soares, A., Freitas, P., Buttow, N.C., Natali, M.R.M., 2005. Effects of a

hypoproteic diet on myosin-V immunostaneid myenteric neurons and the proximal colon

wall of aging rats. Auton. Neurosci. 122, 77-83.

Shotton, H.R., Broadbent, S., Lincoln, J., 2004. Prevention and partial reversal of diabetes-

induced changes in enteric nerves of the rat ileum by combined treatment with a-lipoic

acid and evening primrose oil. Auton. Neurosci. 111, 57-65.

Tesfamariam, B., 1994. Free radicals in diabetes endothelial cell dysfunction. Free Radic.

Biol. Med. 16, 383-391.

Vahdat, L., Papadopoulos, K., Lange, D., Leuin, S., Kaufman, E., Donovan, D., Frederick, D.,

Bagiella, E., Tiersten, A., Nichols, G., Garret, T., Savage, D., Antman, K., Hesdorffer,

C.S., Balmaceda, C., 2001. Reduction of paclitaxel-induced peripheral neuropathy with

glutamine. Clin. Cancer Res. 7, 1192-1197.

Vincent, A.M., Russell, J.W., Low, P., Feldman, E.L., 2004. Oxidative stress in the

pathogenesis of diabetic neuropathy. Endocr. Rev. 25, 612-628.

Vinik, A.I., Mehrabyan, A., 2004. Diabetic neuropathies. Med. Clin. N. Am. 88, 947–999.

Vinik, I.A., 1999. Diabetic Neuropathy: Pathogenesis and therapy. Am. J. Med.107, 17-26.

Vinson, J.A., Staretz, M.A., Bose, P., Kassm, H.M., 1989. In vitro and in vivo redution of

erythrocyte sorbitol by ascorbic acid. Diabetes 38, 1036-1041.

Zanoni, J.N., De Freitas, P., Pereira, R.V.F., Dos Santos Pereira, M.A., Miranda-Neto, M.H.,

2005. Effects of supplementation with ascorbic acid for a period of 120 days on the

myosin-v and NADPH-d positive myenteric neurons of the ileum of rats. Anat. Histol.

Embryol. 34, 149-153.

Zanoni, J.N., Buttow N.C., Bazotte, R.B., Miranda-Neto, M.H., 2003. Evaluation of the

population of NADPH-diaphorase-stained and myosin-V myenteric neurons in the ileum

of chronically streptozotocin-diabetic rats treated with ascorbic acid. Auton. Neurosci.

104, 32-38.

Zanoni, J.N., Hernandez, L., Bazotte, R.B., Miranda-Neto, M.H., 2002. Terminal ileum

submucous plexus: a study of the VIP-agric neurons of diabetic rats treated with ascorbic

acid. Arq. Neuropsiquiatr. 60, 32-37.

Zanoni, J.N., Miranda-Neto, M.H., Bazotte, R.B., Souza, R.R., 1997. Morphological and

quantitative analysis of the neurons of the myenteric plexus of the cecum of streptozotocin

diabetic rats. Arq. Neuropsiquiatr. 55, 696-702.

Tabela 1- Glicemia (GI), peso corporal inicial e final (PCI e PCF), consumo diário água

(CDA), consumo diário de ração (CDR) e eliminação diária de urina (EDU) nos animais dos

grupos: normoglicêmico não tratado (UN), normoglicêmico tratado com glutamina (NG),

diabéticos não tratados (UD), diabéticos tratados com glutamina (DG4), diabéticos tratados

com glutamina (DG45).Todos os resultados foram expressos como media ± EP da média.

Parámetros UN NG UD DG4

DG45

GI mg.dl

-1

158.1 ± 9.3

143.2 ± 7.1

649.6 ± 36.5

524.7 ± 44.8

500.5 ± 28.4

PCI.g

-1

330.6 ± 8.5

300.3 ± 9.3

314.8 ± 9.2

328.0± 8.2

312.4 ± 9.0

PCF.g

-1

480.3 ± 10.7

406.4 ± 13.4

309. 3± 17.7

292.1 ±10.9

286.7 ± 18.5

CDA. ml

-1

54.35 ± 2.6

49.2 ± 1.35

185.7 ± 11.7

213.3 ± 7.0

160.6 ± 5.0

CDR.g

-1

32.1 ± 0.75

28.77 ± 1.1

50.8 ± 2.1

54.82 ± 1.2

48.3 ± 2.5

EDU.ml

-1

12.82 ± 1.7

10.7 ± 1.6

101.7 ± 5.5

127 ± 7.0

88.7 ± 3.8

Médias seguidas por letras diferentes na mesma linha são diferentes pelo teste de Tukey (p <

0,05).

Fig. 1. Micrografias mostrando os componentes do plexo mioentérico do íleo de ratos

evidenciados através da técnica imunohistoquímica miosina-V. Figuras A e B: 1- plexo

primário; 2- plexo secundário; 3- plexo terciário; 4- neurônios isolados. Barra de

calibração: (A) 50µm e (B) 30 µm.

Fig. 2. Micrografias do plexo mioentérico do íleo de ratos mostrando gânglios mioentéricos

imunomarcados pela miosina- V nos grupos de animais: normoglicêmico não tratado (A),

normoglicêmico tratado com L-glutamina (B), diabéticos não tratados (C), diabéticos tratados

com L-glutamina (DG4) (D), diabéticos tratados com L-glutamina (DG45) (E). Barra de

calibração: 20µm

Fig. 3 - Número de neurônios mioentéricos imunomarcados pela

miosina-V em uma área de 9,16 mm

observados no íleo de

ratos. Grupos: normoglicêmico não tratado (UN),

normoglicêmico tratado com L-glutamina (NG), diabéticos não

tratados (UD), diabéticos tratados com L-glutamina (DG4),

diabéticos tratados com L-glutamina (DG45). Todos resultados

foram expressos como média ± erro padrão. n= 5 ratos por grupo.

p > 0,05 quando todos grupos foram comparados

200

400

600

800

1000

1200

1400

1600

UN NG UD DG4 DG45

Neurônios em 9,16mm

Tabela 2 – Médias e erros padrões da área dos corpos

celulares dos neurônios miosina-V imunoreativos nos

grupos: normoglicêmico não tratado (UN),

normoglicêmico tratado com L-glutamina (NG),

diabéticos não tratados (UD), diabéticos tratados com L-

glutamina (DG4), diabéticos tratados com L-glutamina

(DG45). n= 5 ratos por grupo

Grupo Miosina-V

UN 273.5 ± 17.17

NG 255.4 ± 5.268

UD 286.6 ± 11.59

DG4 285.5 ± 21.16

DG45 274 ± 12.91

As médias não apresentaram diferenças significativas pelo

t- test (p > 0,05)

Fig. 4 - Distribuição por tamanho dos neurônios mioentéricos imunomarcados pela

miosina-V. Os neurônios foram classificados a cada 100 µm

nos animais dos

grupos: normoglicêmico não tratado (UN), normoglicêmico tratado com L-

glutamina (NG), diabéticos não tratados (UD), diabéticos tratados com L-

glutamina (DG4), diabéticos tratados com L-glutamina (DG45).n= 5 ratos por

grupo.

100 200 300 400 500 600 700 800 900

Intervalos 100 µm2

DG4

DG45

Quantitative and morphometrical evaluation of the myosin-stained myenteric neuron

population of the ileum of diabetic rats supplemented with L-glutamine

Eleandro Aparecido Tronchini

, Cristiano Massao Tashima

, Enilza Maria Espreafico

Roberto Barbosa Bazotte

, Jacqueline Nelisis Zanoni

Department of Morpho-physiological Sciences (DCM/UEM), State University of Maringá,

87020900 Maringá, PR, Brazil;

Department of Cellular and Molecular Biology - USP - São

Paulo;

Department of Pharmacy and Pharmacology , State University of Maringá, Maringá,

PR, Brazil;

* Corresponding Author: Av. Colombo, 5790 - 87020-900 - Maringá, PR, Brazil.

Tel. +55-044-32614705 Fax. +55 - 044-32614340. E-mail: [email protected]

Number of tables: 2

Number of figures: 4

Abstract

The objective of this work was to evaluate the effect of the L-glutamine

supplementation on the myenteric neurons of the ileum of Wistar rats with diabetes mellitus

induced by streptozotocin. The animals were divided in five groups (n = 5): non treated

normoglycaemic (UN), normoglycaemic treated with L-glutamine (NG), non treated diabetics

(UD), diabetics treated with L-glutamine, from the 4

(DG4) or 45

day of the diabetes

induction (DG45). The amino acid was added to the diet at 1 %. The immunohistochemical

technique myosin-V was used to stain the myenteric neurons. We assessed the cellular body

areas of 500 neurons in each studied group. The quantitative analysis was carried out in an

area of 9.16 mm

of each analyzed ileum. We observed the organization of the myenteric

plexus employing the myosin-V technique; we visualized the primary, secondary and tertiary

plexus, besides the presence of isolated neurons in the nervous fibers path. There was no

difference in the neuronal density and in the cellular body area of the myosin-stained

myenteric neurons of groups DG4 and DG45 when compared to group D. The L-glutamine

supplementation (1%) did not have a neuroprotector effect on the myosin-V stained myenteric

neurons.

Keywords: L-glutamine, diabetes mellitus, glutathione, ileum, myosin-V, myenteric plexus,

rats, streptozotocin.

1. Introduction

Diabetes mellitus is a heterogeneous clinical syndrome characterized by

endocrine-metabolic abnormalities that alter the homeostasis. The metabolic abnormalities

involve important disruptions on the metabolism of carbohydrates, lipids and proteins. The

neurological manifestations are probably the most common among the chronic complications

caused by the diabetes mellitus. The diabetic neuropathy is a heterogeneous group of

disorders, with an extensive range of abnormalities (Vinik and Mehrabyan, 2004), that can

affect the autonomous and peripheral nervous system harming the quality of life of

individuals (Vinik, 1999; Afzaal et al., 2002).

Many studies have demonstrated alterations in the myenteric plexus of several

intestinal segments of diabetic rats, not just regarding the reduction on the number, but also on

the size of neurons (Roman et al., 1996; Zanoni et al., 1997; Hernandes et al., 2000; Furlan et

al., 2002; Zanoni et al., 2003). An important factor related to the diabetic neuropathy is the

oxidative stress (Vinson et al., 1989; Baynes, 1991), which happens when there is an increase

of reactive oxygen species (ROS) (Parthiban et al., 1995; Kuyvenhoven and Meinders, 1999)

and/or a reduction on the efficiency of the endogenous antioxidants (Baynes, 1991;

Kuyvenhoven and Meinders, 1999).

Another factor that provokes neuronal degeneration is the intracellular increase of

sorbitol, due to the increase of the aldose reductase enzyme activity on polyol pathway as a

consequence of hyperglycemia (Vinik, 1999; Giugliano et al., 1996; Afzaal et al., 2002). As

the glucose conversion into sorbitol consumes NADPH, there is a reduction on the ratio

NADPH:NADP

(Giugliano et al., 1996). That reduction can impair the reactions that need

NADPH, specially the oxidized glutathione conversion to reduced glutathione by the

glutathione reductase. Consequently, reduced levels of glutathione is observed in the diabetes

mellitus (Vincent et al., 2004) increasing the susceptibility of endothelial cells to the oxidative

stress (Giugliano et al., 1996). Hence, measures that increase the availability of antioxidants

may be relevant in the treatment of the diabetes mellitus chronic complications. Within this

context, the L-glutamine supplementation is likely to present some neuroprotetor effect, since

it is precursory of the glutathione (Amores-Sánchez and Medina, 1999).

L-glutamine is a non essential amino acid, stored mainly in the skeletal muscle

(75%) and in the liver (25%). Among its multiple functions, the L-glutamine serves as

primary carrier of nitrogen among the tissues and it is the main source of energy for the cells

proliferation, in the intestinal epithelium, lymphocytes and fibroblasts (Vahdat et al., 2001).

L-glutamine is metabolized through the phosphate-L-glutaminase, resulting in glutamate and

ammonia. The glutamate is transported to the citosol and it can be used in the synthesis of

glutathione (Amores-Sánches and Medina, 1999), thus, maintaining the glutathione

concentration in the cells.

The objective of this work was to evaluate the effect of the L-glutamine

supplementation on the myosin-V-stained myenteric neurons in the ileum of streptozotocin-

induced diabetic rats.

2. Materials and methods

2.1. Procedure with the animals

All of the experiments described in this work were supervised and approved by the

Committee of Ethics on Animal Experimentation of the State University of Maringá. Twenty-

five male Wistar rats (Rattus norvegicus), with 90 days of age were used. The diabetes was

induced through the endovenous administration of 35 mg kg

-1

of body weight of

streptozotocin (Sigma, St. Louis, MO, USA), dissolved in a buffer solution of 10 mmol l

-1

(pH 4.5), prior to a 14-hour-fast. The injection with streptozotocin resulted in the diabetic

syndrome with polyuria, polyphagia and polydipsia. The glycaemia (Bergmeyer and Bernt,

1974) of each animal was assessed on the fourth day after the diabetes onset, with a mean

value of 486.9 ± 14.25 mg dl

-1

. The rats were divided in five groups: non-treated

normoglycaemic (UN), normoglycaemic treated with L-glutamine (NG), non-treated diabetics

(UD), diabetics treated with L-glutamine, from the 4

(DG4) or 45

day of the diabetes onset

(DG45). The amount of food intake, water consumption and eliminated urine were assessed

for five days of the last week of every month, with use of metabolic cages.

The animals were kept in individual cages, receiving water and food (Nuvital®

lab) ad libitum, with a photoperiod (6:00 am - 6:00 pm) and at controlled room temperature

(24ºC±2ºC). Some animals were fed chow supplemented with L-glutamine (1%) (Ajinomoto,

Tokyo, Japan), prepared weekly.

On the 210th day, the animals were anesthetized with sodium thiopental (40 mg

-1

of body weight) and their blood collected by heart puncture to measure the glucose

(Bergmeyer and Bernt, 1974).

2.2. Immunolocalization of myosin-V (Drengk et al., 2000)

The rats were perfused with 250 ml of fixing solution containing sodium periodate

(10 mM), lysine (75 mM), paraformaldehyde (1%) in phosphate buffer (PB) (37 mM), pH 7.4

and then with a 1.1% saline solution. After perfusion, each ileum was removed, rinsed with

saline solution, opened and immersed for 1 hour in the same fixing solution. Subsequently,

the segments were dehydrated in ethanol (50, 70, 80, 90, and 100%), remaining in each

solution for 10 min, cleared in xylol (10 min), rehydrated with ethanol 100, 95, 90, 80, 70%,

and stored in ethanol 70%. Afterwards, the segments were dissected under stereomicroscope

with trans-illumination, through the removal of the mucous and submucous layer, obtaining

whole mount muscular layer preparations. These preparations were rinsed twice in phosphate-

buffered saline (PBS) 0.1 M, pH 7.4 and blocked with PBS, bovine serum albumin (BSA)

(2%), goat serum (2%), Triton-X-100 (0.5%) at room temperature (RT). Then, the segments

were incubated in a solution containing the anti-myosin-V primary antibody 1:750 (extracted

from rabbits) diluted in PBS, BSA (2%), Triton-X-100 (0.1%) and goat serum (2%) at RT (24

hours), in eppendorf tubes. After incubation, the tissues were rinsed twice in PBS Triton-X-

100 (0.1%) and twice in the solution of PBS + Tween 0.05%. They were incubated in

secondary antibodies (anti rabbit) conjugated with peroxidase 1:1000 (Pierce, Rockford,

USA) at RT, by shaking for 24 h. They were then rinsed 4 times, during 15 minutes, in PBS +

Tween 0.05%. The tissues were developed with diaminobenzidine (DAB) and mounted in

glycerol gel. The negative control was performed with the lack of primary antibody.

2.2.2. Antibody myosin-V

The polyclonal antibody anticauda, generated against the chicken recombining

protein myosin-V, has already been characterized previously (Espreafico et al., 1992). A

cDNA fragment (that corresponds to the 899-1830 amino acids) of a myosin-V clone of the

chicken brain caudal was sub cloned inside the pGEX vector to generate a Glutathione

transferase (GST)/myosin medial cauda protein (that corresponds to the 1117-1435 amino

acids) fused in XL1Blue bacteria. This GST/myosin-V medial cauda was purified on

glutathione resin. This fusing protein was used as an antigen for the production of antibodies

in rabbits. The immune serum was purified on a protein column with affinity to PLM/myosin-

V cauda to enrich the IgG antibodies directed against the myosin-V medial cauda. Secondary

antibodies conjugated with IgC anti rabbit peroxidase serum were used (Pierce, Rockford,

USES).

2.3. Quantitative analysis

The quantitative analysis was performed at the intermediate region (60° - 120°;

240° - 300°), considering as 0° the mesenteric insertion (Miranda-Neto et al., 2001; Zanoni et

al., 2005). Enteric neurons were counted on BX 40 Olympus microscope under a 40 X lens.

Forty microscopic fields were counted for each preparation. Half-seen neurons were counted

in alternated fields. The area of each microscopic field was 0.229 mm

2.4. Morphometric analysis

The images were taken with a high-resolution camera and sent to a

microcomputer. The cell profile (µm

) of 100 cell bodies for each animal was measured

through the image-analyses software Image-Pro-Plus 4, in a total of 500 neurons for each

studied group. Neurons were classified at 100 µm

classes and the percentage of each group

was calculated for each interval.

2.5. Statistical analysis

The data were analyzed by the minimum squares method, through the Variance

Analysis (ANOVA), followed by Tukey test, which was used as a post-test to compare the

means. Since the areas of the cell bodies did not present a similar distribution, we employed

the Variance Analysis and Student “t” test to compare the means. The analyses were carried

out with the software Prisma 3.0. The results are shown as means ± standard error (M ± SE).

3. Results

We verified in this study that the diabetic rats (groups UD, DG4 and DG45) did

not gain weight in the same proportion as the animals from the normoglycaemic groups (UN

and NG) (p < 0.05) (table 1). The L-glutamine supplementation did not alter the final body

weight of rats from groups DG4 and DG45 when compared to the animals from group UD (p

> 0.05) (table 1). The diabetic condition was kept throughout the studied period, since

glycaemia levels were maintained in all of the investigated diabetic groups. The diabetic

syndrome was also confirmed by the polyphagia, polyuria and polydipsia (table 1). The L-

glutamine supplementation did not alter these parameters.

The myosin-V technique allowed us to observe the three components of the

myenteric plexus (Fig. 1). The primary plexus was well evidenced, with the presence of

ganglions and interganglion nerve fibers. Isolated neurons were observed in the path of the

nerve fibers of the primary plexus. The secondary and tertiary plexuses were quite evident.

The nerve fibers of the secondary plexus ran parallel to the muscular cells of the circular layer

of the muscular tunica. The tertiary plexus was formed by fine nerve fibers, situated between

the spaces left by the primary plexus (Fig. 1). Figure 2 shows the myenteric neurons stained

by myosin-V found in the five groups (UN, NG, UD, DG4 and DG45). We observed a

different intensity in the neurons staining in the myenteric ganglions (Fig. 2).

There was a 22.90% reduction in the neuronal density in the ileum of animals of

group UD when compared to the non-treated normoglycaemic (UN) and the normoglycaemic

treated with L-glutamine (NG) (p > 0.05). The neuronal density of animals of groups DG4

and DG45 was similar to that observed in the non-treated diabetics (UD) (p > 0.05) (Fig. 3).

The cell profile area of the myosin-V stained-neurons of animals of group UD was

4.6 % larger when compared to the animals of group UN (p > 0.05) (table 2). The L-

glutamine supplementation (group DG4 and DG45) did not change these results, with means

similar to group UD (p > 0.05). Most neurons had cell profiles that varied from 101 to 400

µm

. The proportion of neurons in this range for groups UN, NG, UD, DG4 and DG45 was of

82.2%, 89.6%, 84.4%, 92.2% and 88.4% respectively, as shown in Fig. 4.

4. Discussion

Our experimental model of diabetes was efficient, since there was an increase on

the daily water consumption, food intake and glycaemia; the animals of groups UD, DG4 and

DG45 had a smaller body weight when compared to the normoglycaemic animals (groups U

N and NG).

The myosin-V immunohistochemical technique was used to stain the myenteric

neurons in the muscular layer wholemounts (Drengk et al., 2000). Several authors have used

this technique to stain myenteric neurons in different areas of the gastrintestinal tract (Buttow

et al., 2003, 2004; Zanoni et al., 2003, 2005; Schoffen et al., 2005). The myosin-V is a

versatile motor protein and it is involved in the fast transport of vesicles from the dendrites to

the axon (Langford, 2002). This technique is used as marker of the overall neural population

because the myosin-V is present in cell bodies and nerve fibers. With this technique, we are

able to observe the organization of the myenteric plexus in the ileum. We verified the

presence of the three components that compose this plexus (primary, secondary and tertiary).

This arrangement resembles the one described initially by Auerbach in 1864 and by several

other authors later, including Furness and Costa (1980). The different demarcation intensity in

the myenteric neurons inside the ganglions was seen in all studied groups. According to

Drengk et al. (2000), this heterogeneity in the coloration intensity may indicate different

levels of neuronal activity.

We observed a 22.90% decrease on number of myenteric neurons stained by the

myosin-V in group UD when compared to the normoglycaemic (UN). This result was similar

to the one found by Zanoni et al. (2003) who verified a 24.4% reduction in the density of

myosin-V stained neurons in the ileum of diabetic rats. There are several factors that

contribute to the reduction on the number of myenteric neurons. Some of them are: a) the

increase of the aldose reductase activity, which is associated to an increase in the sorbitol and

fructose levels (Ferraz et al., 1997). The accumulation of sorbitol and fructose in the nerves

leads to a decrease of myo-inositol and a consequent inhibition of the Na+/K+ ATPase

activity, resulting in the retention of Na+, causing edema, axoglial disjunction and nerve

degeneration (Hosking et al., 1978; Clements and Rex, 1979; Finegold et al., 1983; Vinik,

1999; Afzaal et al., 2002). b) - an increase of the oxidative stress (Baynes, 1991, Vincent et

al., 2004) that causes an increment in the production of free radicals. Free radicals cause a

direct dysfunction of the diabetic nervous tissue through the lipidic peroxidation of the axon

membranes and the Schwann cells, causing a decrease on the function of nerve cells

(Cameron et al., 1993) and/or indirect effects, that are vascular generated. In this case, the

high concentration of lipoproteins (LDL) in the diabetes mellitus inhibits the vascular tissue

relaxation, because when they are oxidized they become cytotoxic to several types of cells,

including endothelial cells (Morel and Chilsom, 1989; Baynes, 1991). c) - decrease on the

levels of endogenous antioxidants. The glutathione levels are reduced during the

hyperglycaemia leading to an increase in the reactivate oxygen species (Parthiban et al., 1995;

Greene et al., 1999; Vincent et al., 2004). Glutathione is an important antioxidant in most

cells of mammals (Vincent et al., 2004). This substance serves as an essential cofactor for the

glutathione peroxidase enzyme, which removes hydroperoxidase, and the formation of

oxidized glutathione (GSSG). The reduced glutathione (GSH) is regenerated by the enzyme

glutathione reductase using NADPH (Parthiban et al., 1995; Vincent et al., 2004). Therefore,

the hyperactivity of the polyol pathway reduces the glutathione levels, causing an increase in

the ROS (Nakamura et al., 2002). This reduction is related to the increase of the aldose

reductase activity that consumes NADPH, which is also necessary for the formation of the

reduced glutathione (Tesfamariam, 1994; Giugliano et al., 1996).

We observed that the L-glutamine supplementation (DG4 and DG45) did not avoid

the decrease on the number of myenteric neurons when compared to the group UD. Similar

results were found by Zanoni et al. (2003) in the ileum of diabetic rats treated with ascorbic

acid. The L-glutamine supplementation in the animals of group DG4 was accomplished to

prevent the development of the diabetic neuropathy. The objective of the supplementation of

animals from the DG45 group was to work as a treatment. However, the L-glutamine

supplementation was not efficient either in preventing or in reversing this pathology. Shotton

et al. (2004) also analyzed the prevention and reversion of diabetes in the ileum enteric nerves

of diabetic rats with a combined treatment of

α-lipolic and γ-linolenic acids. In the

experiment, Shotton et al. (2004) examined immunohistochemically the nerves that express

the vasoactive intestinal polypeptide (VIP), calcitonin gene-related peptide (CGRP) and

noradrenaline (NA). They verified that the administration of α-lipolic and γ-linolenic acids

prevented and reverted partially the changes induced by the diabetes in the VIP and CGRP

nerves, although individually neither treatment was effective.

The L-glutamine is a very important energy substrate for cells, being also a

precursor for nucleotides, glutamate and, especially, the GSH synthesis. This amino acid has

its concentration reduced during the catabolic stress (Matés et al., 2002). It is known that GSH

is an important cell antioxidant, but during the diabetes its levels become reduced due to the

increase of ROS. Therefore, L-glutamine, as a precursor of GSH (Amores-Sánchez and

Medina, 1999), is metabolized by the γ-glutamyl cicle producing GSH. GSH is produced by

glutamate, glycine and cysteine (Matés et al., 2002), which elevate the concentration of GSH

and increase the production of NADPH. That will increase the level of GSH/GSSH (Curi et

al., 2005), helping to reduce ROS. Studies carried out by Roth et al. (2002) showed that rats

fed with L-glutamine had an increase in their cellular content of GSH. Our results with the L-

glutamine supplementation were not significant. This might be due to the fact that several

mechanisms were producing ROS. Among them are: the polyol pathway, the autoxidative

glucosilation, the reduction of antioxidants and the reduction of the efficiency of the

enzymatic system (Vincent et al., 2004). Therefore, a combined treatment of substances

already studied individually (as the ascorbic acid (Zanoni et al., 2003) or acetil-l-carnitine

(Miranda-Neto et al., 2005)) with L-glutamine it could be effective, because of this it sorts out

ROS would be neutralized by different mechanisms.

There were no significant differences regarding the neuronal profile area when the

five groups were compared. When comparing group UD with group UN, we observed that the

immunoreactive neurons to myosin-V of animals belonging to UD were 4.6% larger than the

animals from group UN. Zanoni et al. (2003) did not notice differences when they compared

the cellular profile of myosin-V myenteric neurons of the ileum of diabetic rats to the diabetic

rats treated with ascorbic acid. On the other hand, VIP-ergic and nitrergic neurons observed

by Zanoni et al. (2002) and (2003) in the ileum had an increase in their area in the diabetic

rats. The ascorbic acid supplementation prevented this increase. We can infer that the diabetes

mellitus affects in a different way the subpopulations of myenteric neurons, since we noticed

no changes in the neuronal area when analyzing the neurons overall population.

When we analyze the distribution of the neuronal population in random classes at

intervals of 100 µm

, we observed that despite the size variability observed in the area of the

neuronal profile (47.301 to 855.102 µm

), most neurons in both groups had a profile cell area

ranging from 101 to 400 µm

. This shows the uniformity in the neuronal distribution between

the groups.

Summing up, the present work showed that the L-glutamine supplementation (1%)

was not effective on the myenteric neurons stained by myosin-V, as we did not find

significant differences between the overall number and the cell profile area in the neurons of

the diabetic groups supplemented or not with L-glutamine.

Acknowlegments

The authors would like to thank the support of MSc. Priscila of Freitas as well as

of Maria Euride do Carmo Cancino, Maria dos Anjos Fortunato, Valdir Trombeli and José

Antonio de Souza for their excellent technical support.

References

Afzaal, S., Singh, M., Saleem, I., 2002. Aetipathogenesis and management of diabetic

neuropathy. J. Assoc. Physicians India 50, 707-711.

Amores-Sánches, M.I., Medina, M.A., 1999. Glutamine, as a precursor of glutathione, and

oxidative stress. Mol. Genet. Metab. 67, 100-105.

Baynes, J.W., 1991. Role of oxidative stress in development of complications in diabetes.

Diabetes 40, 405-412.

Bergmeyer, H.U., Bernet, E., 1974. Determination of glucose with glucose oxidase and

peroxidase. Methods of enzymatic analysis. New York: Verlag Chemiem-Academic

Press.

Buttow, N.C., Zucoloto, S., Espreafico, E.M., Gama, P., Álvares, E.P., 2003. Substance P

enhances neuronal area and epithelial cell proliferation after colon denervation in rats.

Dig. Dis. Sci. 48, 2069-2076.

Buttow, N.C., Santin, M., Macedo, L.C., Neres Teixeira, A.C., Novakowski, G.C., Bolonheis

Armelin, T. R., Assmann, K., 2004. Study of the myenteric and submucous plexuses after

BAC treatment in the intestine of rats. Biocell 28, 135-142.

Cameron, N.E., Cotter, M.A., Maxfield, E.K., 1993. Anti-oxidant treatment prevents the

development of peripherical nerve disfunction in streptozotocin-diabetic rats. Diabetologia

36, 299-304.

Clements, J.R., Rex, S., 1979. Diabetic neuropathy-new concepts of its etiology. Diabetes 28,

604-611.

Curi, R., Lagranha, C.J., Doi, S.Q., Sellitti, D.F., Procopio, J., Pithon-Curi, T.C., Corless, M.,

Newsholme, P., 2005. Molecular mechanisms of glutamine action. J. Cell Physiol. 204,

392-401.

Drengk, A.C., Kajiwara, J.K., Garcia, S.B., Carmo, V.S., Larson, R.E., Zucoloto, S.,

Espreafico, E.M., 2000. Imunolocalisation of myosin-V in the enteric nervous system of

the rat. J. Auton. Nerv. Syst. 78, 109-112.

Espreafico, E.M., Cheney, R.E., Matteoli, M., Nascimento, A.A., De Camilli, P.V., Larson,

R.E., Mooseker, M.S., 1992. Primary structure and cellular localization of chicken brain

myosin-V (p190), an unconventional myosin with calmodulin light chains. J. Cell Biol.

119, 1541-1557.

Ferraz, M., Ishii-Iwamoto, E., Batista, M.R., Brunaldi, R.B., Bazotte, R.B., 1997. Sorbitol

accumulation in rats kept on diabetic condition for short and prolonged periods. Acta

Pharmacol. Sin. 18, 309-311.

Finegold, D., Lattimer, A.S., Nolle, S., Bernstein, M., Greene, A.D., 1983. Polyol pathaway

activity and myo-inositol metabolism: a suggested relationship in the pathogenesis of

diabetic neuropathy. Diabetes 32, 988-992.

Furlan, M.M.D.P., Molinar, S.L., Miranda-Neto, M.H., 2002. Morphorquantitative affects of

acute diabetes on the myenteric neurons of the proximal colon of adult rats. Arq.

Neuropsiquiatr. 60, 576-581.

Furness, J.B., Costa, M., 1980. Types of nerves in the enteric nervous system. Neuroscience

5, 1-20.

Giugliano, D., Ceriello, A., Paolisso, G., 1996. Oxidative stress and diabetic vascular

complication. Diabetes Care. 19, 257-267.

Greene, D.A., Stevens, M.J., Obrosova, I., Feldman, E.L., 1999. Glucose-induced oxidative

stress and programmed cell death in diabetic neuropathy. Eur. J. Pharmacol. 375, 217-223.

Hernandes, L., Bazotte, R.B., Gama P., Miranda-Neto, M.H., 2000. Streptozotocin-induced

diabetes duration is important to determine changes in the number and basophily of

myenteric neurons. Arq. Neuropsiquiatr. 58, 1035-1039.

Hosking, D.J., Bennet, T., Hampton, J.R., 1978. Diabetic autonomic neuropath. Diabetes 27,

1043-1055.

Kuyvenhoven, J.P., Meinders, A.E., 1999. Oxidative stress and diabetes mellitus pathogenesis

of long-term complications. Eur. J. Intern. Med. 10, 9-19.

Langford, M.G., 2002. Myosin-Va Versatile Motor for Short-Range Vesicle Transport.

Traffic 3, 859–865.

Matés, J.M., Pérez-Gómez, C., Castro, I.N., Asenjo, M, Márquez, J., 2002 Glutamine and its

relationship with intracellular redox status, oxidative stress and cell proliferation/death.

Int. J. Biochem. Cell Biol. 34, 439-458.

Miranda Neto, M.H.; Defani, M.A., Fregonesi, C.E.P.T., Natali, M.R.M.; Pereira, A., 2005.