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Elizane Ferreira Hamanaka
RESVERATROL COMO MEIO DE CONSERVAÇÃO
PARA DENTES AVULSIONADOS: ANÁLISE
HISTOMORFOLÓGICA E IMUNOISTOQUÍMICA
ARAÇATUBA – SP
- 2010 -
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Elizane Ferreira Hamanaka
RESVERATROL COMO MEIO DE CONSERVAÇÃO
PARA DENTES AVULSIONADOS: ANÁLISE
HISTOMORFOLÓGICA E IMUNOISTOQUÍMICA
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia do Câmpus de Araçatuba –
Unesp, para a obtenção do Grau de “Mestre
em Odontologia” – Área de Clínica Integrada.
Orientador: Prof. Adj. Wilson Roberto Poi
Coorientadora: Prof. Roberta Okamoto
ARAÇATUBA – SP
- 2010 -
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Dedicatória
Dedicatória
A Deus,
por sempre iluminar meu caminho e me conceder força para
continuar lutando em busca das conquistas da minha vida.
Aos meus pais Luiz e Neuza,
por todo amor, carinho, incentivo, confiança e dedicação.
Vocês sempre me apoiaram em minhas decisões
, e se
esforçaram muito para que eu conseguisse alcançar
meus
objetivos. Muito obrigada por tudo! Amo vocês!
Aos meus irmãos Fabrízio e Liziane,
por toda amizade, carinho, amor,
paciência e convivência
maravilhosa. Tenho muito orgulho de vocês!
E tenho muito a
lhes agradecer pelo incentivo e apoio em momentos difíceis.
Ao meu namorado Alessander,
pelo amor,
compreensão, incentivo, carinho e amizade. Você
se tornou uma pessoa muito importante em minha vida.
Te
amo!
Agradecimentos
Especiais
Agradecimentos Especiais
Ao Meu Orientador Wilson Roberto Poi,
Palavras nunca serão suficientes para expressar a
intensidade dos meus sentimentos de
gratidão, admiração e
carinho. Agradeço a Deus por ter lhe
colocado em meu
caminho. Muito obrigada pela amizade, pelos
conselhos, pelo
incentivo, proteção, por acreditar em mim e não m
e deixar
desistir. Obrigada por todo carinho, cuidado, apoio,
paciência, compreensão e
pela convivência extremamente
ag
radável. Obrigada pelos ensinamentos científicos, pela
ajuda profissional... Enfim, obrigada por tudo!
À Minha Coorientadora Roberta Okamoto,
P
elo carinho, amizade, colaboração, inestimável ajuda e
pelas
análises críticas de extrema importância na
qualificação desta dissertação.
À minha amiga
Lucieni Campoli Alves Furlan, pela
convivência maravilhosa. Compartilhamos alegrias,
angústias, experiências, aprendizado... Muito ob
rigada pela
verdadeira amizade, companheirismo, força, incentivo,
apoio
e carinho. Você é minha irmã de coração!
Às minhas amigas Carolina Lunardell
i Trevisan e Daniela
Maria de Mendonça Janjacomo.
Obrigada pela convivência,
companheirismo e amizade.
Às minhas amigas Juliana Aparecida Delben, Kizzy
dos
Santos Fernandes, Patrícia Antunes e Roberta Lopes
Zingaro. A distância não abalou nossa amizade
sincera de
todos esses anos. Obrigada pelos momentos
inesquecíveis,
pelo apoio e carinho. Vocês são pessoas muito especiais!
À todos os meus familiares e amigos que me incentivaram e
apoiaram nesta importante etapa da m
inha vida. Muito
obrigada!
Agradecimentos
Agradecimentos
Ao Programa de Pós-
Graduação em Odontologia, Área de
C
línica Integrada, aos professores: Celso Koogi Sonoda,
Sônia Regina Panzarini Barioni,
Denise Pedrini, José
Carlos Monteiro de Castro e Daniela Brandini pela
amizade, carinho, convivência e por todo o aprendizado.
Vocês são grandes exemplos, pessoas que admiro muito!
Ao professor Dr. Tetuo Okamoto pelo
ensinamento,
orientação, atenção, disponibilidade
e contribuição para esse
trabalho.
Aos colegas do Curso de pós-graduação pela convivência e
companheirismo.
Aos f
uncionários da Biblioteca da Faculdade de Odontologia
do Câmpus de Araçatuba – Unesp:
Ana Cláudia, Isabel,
Izamar, Ivone, Cláudia e Luzia, pela ajuda e atenção.
Aos funcionários do Departamento de Cirurgia e Clínica
Integrada da Faculdade de Odontologia de Araçatuba –
UNESP, Maria Dirce Colli Boa
tto, Gilmar Martins de
Oliveira e Paulo Roberto Gratão, pela inestimável ajuda
durante a realização deste trabalho.
À funcionária Antonia Ferreira Artiolli,
uma pessoa
maravilhosa que sempre me apoiou desde a época da
graduação. Obrigada pelo carinho!
À aluna da graduação Paula Ervolino da Silva
, por toda
ajuda e paciência durante a realização deste trabalho.
Aos funcionários da Seção de Pós-
Graduação da
Faculdade de Odontologia do Câmpus de Araçatuba –
Unesp: Valéria de Queiroz M. Zagatto e Diogo
Luís
Reatto, pela assistência e atenção.
À
Capes (Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de
Ensino Superior), pelo auxílio financeiro que viabilizou a
realização desse trabalho de pesquisa.
Epígrafe
Epígrafe
“ Bom mesmo é ir a luta com determinação,
Abraçar a vida com paixão,
Perder com classe e vencer com ousadia,
pois o triunfo pertence a quem se atreve...
A vida é muito para ser insignificante. ”
Charles Chaplin
Sumário
Resumo
19
Abstract
2
2
1. Introdução
2
5
2. Proposição
3
0
3. Material e Método
3
2
4. Resultado
3
8
5. Discussão
4
5
6. Conclusão
5
1
7. Referências
5
3
Anexo
A
–
Comissão de Ética
6
2
Anexo
B
–
Ilustração da Fase Experimental
6
3
Lista de Figuras
FIGURA
1
-
Teste de solubilidade
.
3
4
FIGURA 2
-
Grupo I
–
imediato.
4
0
FIGURA 3 - Grupo II – resveratrol 1 hora.
4
1
FIGURA 4
-
Grupo
III
–
resveratrol 2 horas.
4
1
FIGURA 5 - Grupo IV – resveratrol 6 horas.
4
2
FIGURA 6
-
G
rupo V
–
resveratrol 12 horas.
4
2
FIGURA 7 - Grupo VI – resveratrol 24 horas.
4
3
FIGURA 8
-
Grupo VII
–
seco 6 horas.
4
3
Resumo
19
Resumo
Resumo
HAMANAKA EF. Resveratrol como meio de conservação para dentes
avulsionados: análise histomorfológica e imunoistoquímica, [dissertação].
Araçatuba: Universidade Estadual Paulista; 2010.
A manutenção da vitalidade do ligamento periodontal cementário é de
extrema importância para o sucesso do reimplante dentário. Minimizar o
período de exposição do dente avulsionado ao meio seco ou mantê-lo em
meio úmido, se constitui em importante conduta para o tratamento.
Recentemente, o resveratrol tem sido bastante estudado, em razão das suas
propriedades antioxidantes e da sua capacidade de prolongar a vida de
diversos organismos desde as leveduras até os mamíferos. Portanto, o
objetivo deste trabalho é avaliar a manutenção da vitalidade do ligamento
periodontal cementário armazenado em resveratrol. Para isso foram
empregados incisivos superiores e inferiores de sete macacos, totalizando
56 dentes. No grupo I os dentes foram extraídos e imediatamente imersos
em solução fixadora. Nos grupos II a VI os dentes foram imersos em 50mL
de solução de resveratrol em propilenoglicol (5 µM/L) durante 1, 2, 6, 12 e
24 horas, respectivamente. No grupo VII os dentes foram mantidos em
meio seco por 6 horas. Parte dos cortes obtidos foi corada em H.E. para
20
estudo histomorfológico e outra parte para análise imunoistoquímica
utilizando anticorpos primários contra osteopontina e caspase. Os
resultados demonstraram que nos grupos imediato e resveratrol 12 horas
houve presença de moderado número de fibroblastos, alguns macrófagos e
linfócitos. Nos grupos resveratrol 1, 2, 6 e 24 horas houve presença de
pequeno número de fibroblastos e discreta vascularização. O grupo seco
apresentou ausência de vasos sanguíneos e fibroblastos em degeneração.
Houve imunomarcação moderada de osteopontina nos grupos imediato,
resveratrol 12 e 24 horas. Nos demais grupos a imunomarcação variou de
ausente a leve. Quanto à caspase, foi observada imunomarcação moderada
nos grupos resveratrol 1, 2, 6 e 24 horas. No restante dos grupos a
imunomarcação variou de ausente a leve. Foi possível concluir que o
resveratrol parece ser um bom meio de conservação da vitalidade das
células do ligamento periodontal até o tempo de 12 horas.
Palavras-Chave: Reimplante dentário; avulsão dentária; resveratrol.
Abstract
22
Abstract
HAMANAKA EF. Resveratrol as storage media for avulsed teeth:
histomorphological and immunohistochemical analysis, [dissertation].
Araçatuba: Universidade Estadual Paulista, 2010.
The maintenance of vitality of the cement periodontal ligament is
important for success of tooth reimplantation. It has been suggested to
minimize the period of exposure of the avulsed tooth to dry environment
or keep it in wet storage. Recently, resveratrol has been extensively
studied due to its antioxidant properties and ability to prolong the lives of
several organisms since yeast to mammals. The aim of this study is to
evaluate the maintenance of vitality of the cement periodontal ligament
stored in resveratrol. The analysis was conducted using maxillary and
mandibular incisors of seven monkeys, total of 56 teeth. In group I, the
teeth were extracted and immediately immersed in fixative solution. In
groups II to VI, the teeth were immersed in 50ml of solution of resveratrol
in propylene glycol (5 µM/L) for 1, 2, 6, 12 and 24 hours; respectively. In
group VII, the teeth were maintained in dry environment for 6 hours.
Some cuts were stained with HE for histomorphological analysis while
23
some cuts were submitted to immunohistochemical analysis using primary
antibody against osteopontin and caspase. The results demonstrated that
in the groups immediate and resveratrol 12 hours showed presence of a
moderate number of fibroblasts, some macrophages and lymphocytes. In
the groups resveratrol 1, 2, 6 and 24 hours showed presence of small
numbers of fibroblasts and mild vascularization. The dry group showed
absence of blood vessels and fibroblasts in degeneration. There was
moderate immunomarcation of osteopontin in the groups immediate, and
resveratrol 12 and 24 hours. In the other groups, immunomarcation
ranged from absent to light. Considering the caspase, it was observed
moderate immunomarcation in the groups resveratrol 1, 2, 6 and 24 hours.
In the remaining groups, immunomarcation ranged from absent to light. It
was concluded that the resveratrol may be adequate for maintenance of
vitality of cells of periodontal ligament until 12 hours.
Keywords: tooth reimplantation; tooth avulsion; resveratrol.
Introdução
25
1 Introdução
avulsão dentária se constitui em um trauma complexo
caracterizado pelo rompimento do feixe vásculo-nervoso e ligamento
periodontal, expondo o dente ao meio externo. Apesar de pouco freqüente
entre as agressões traumáticas, pode levar a perda do elemento dentário. A
prática de esportes, trabalhos de alto risco e o uso cada vez maior de
veículos automotores têm contribuído para isso (1).
O procedimento ideal para tratamento da avulsão é o
reimplante dentário, mesmo quando as condições não sejam as mais
favoráveis, pois restabelece a função e a estética, mesmo que
temporariamente (1). Para se obter um prognóstico favorável, a
manutenção da vitalidade do ligamento periodontal é de extrema
importância e o reimplante imediato é a melhor opção de tratamento (2).
Porém, tal conduta raramente ocorre, seja por conta da extensão do trauma
que coloca em risco a vida do paciente, ou devido à complexidade do dano à
área receptora e ainda a falta de conhecimento sobre a possibilidade do
reimplante dentário (3-7).
A
26
Em tais condições, quanto menor o tempo em que o dente
avulsionado permanecer em meio seco, melhor o prognóstico, sendo que os
melhores resultados foram obtidos para reimplantes feitos em até 5 minutos
(5,8). Para contornar esse inconveniente os meios de conservação para
manutenção da vitalidade celular têm sido estudados, pois essa capacidade
pode ser até mais importante que o tempo extra-alveolar (3,9,10).
O meio de conservação deve estar disponível no momento da
avulsão e ser capaz de manter a vitalidade, a capacidade de fixação e a
clonogenicidade da célula (11,12). Deve possuir pH e osmolaridade
fisiologicamente compatíveis e não provocar danos às células (13,14).
Dentre os vários tipos estudados encontramos o Viaspan®, a solução salina
balanceada de Hank (15,16), o Eurocollins (17), a própolis (18), a água de
torneira (12), a saliva (14,19), o soro fisiológico (20) e o leite (9-
11,13,15,16,21).
Alguns meios de conservação como o Viaspan® e a solução
salina balanceada de Hank possuem melhores propriedades do que o leite e
podem manter a vitalidade das células por longos períodos de tempo
(15,16).
Recentemente, um composto tem chamado a atenção dos
pesquisadores por apresentar a capacidade de prolongar o tempo de vida
das células (22-26). Inicialmente isolado das raízes do heléboro-branco
(Veratrum grandiflorum), em 1940, o resveratrol (trans-3,5,4’-
27
triidroxistilbeno), um composto polifenólico natural, é também encontrado
em outras plantas incluindo amora, amendoim, castanhas, legumes e,
especialmente, na casca das uvas vermelhas. É encontrado em alta
concentração em alguns tipos de vinhos elaborados a partir de uvas tintas,
podendo alcançar até 14 mg/L. Sendo uma fitoalexina, ou o antibiótico da
planta, é produzido em resposta ao estresse, tais como uma infecção por
fungos, radiação ultravioleta e alterações de temperatura (27).
Pesquisas têm demonstrado que apresenta potente ação
antioxidante, antiinflamatória, antimicrobiana, antiplaquetária, além de
efeitos antiproliferativos (26,28,29). Está associado a um grande número de
benefícios à saúde, notadamente aqueles que envolvem o envelhecimento,
incluindo as doenças neurodegenerativas, câncer e arteriosclerose (30-33).
Achados recentes indicam também benefícios para o sistema
cardiovascular (33) tais como a redução do estresse oxidativo do miocárdio
(34), a redução da apoptose (35) e o aumento da formação capilar (36).
Esse composto comprovadamente estende a vida de diversos
organismos como nematóides (37), leveduras (22,38,39), mosca da fruta
(37,40), peixes (41) e camundongos (42).
Uma metodologia utilizada para avaliar a manutenção da
vitalidade das células é a imunoistoquímica. A cultura de células do
ligamento periodontal de camundongos mostrou a sua capacidade de
secretar osteopontina, uma glicoproteína fosforilada secretada na matriz
28
óssea extracelular. Está associada à regulação do processo de mineralização
do tecido ósseo, sendo evidenciada em células ósseas (osteoblastos e
osteócitos) e em células osteoprogenitoras em proliferação e diferenciação
(43). Alguns autores relatam que a osteopontina tem papel importante no
processo de regeneração óssea induzido pelas células do ligamento
periodontal (44).
As caspases constituem uma família de proteases baseadas em
cisteína e desempenham um papel fundamental durante a morte celular por
apoptose. São dividas em dois grupos, iniciadoras e efetoras, sendo as
últimas responsáveis pela execução do processo em si. Por meio da ação das
caspases são gerados, pela reação em cascata, fragmentos característicos da
apoptose (45).
Como não foram encontrados trabalhos na literatura que
avaliam a vitalidade celular utilizando o resveratrol como meio de
conservação e, em razão das suas propriedades já relatadas, é oportuna a
realização deste estudo.
Proposição
30
2 Proposição
2. Proposição
propósito deste trabalho é analisar a vitalidade das
células do ligamento periodontal de dentes de macaco
mantidos em resveratrol por vários períodos de tempo, utilizando avaliação
histomorfológica e imunoistoquímica.
O
Material e Método
32
3 Material e Método
3. Material e Método
reviamente à sua realização, a metodologia empregada
no trabalho foi aprovada pelo Comitê de Ética em
Experimentação Animal da Faculdade de Odontologia de Araçatuba –
UNESP (Anexo A). Para a realização deste trabalho foram utilizados os
incisivos superiores e inferiores de sete macacos (Cebus apella) com boa
saúde, adultos, cedidos e alojados no Núcleo de Procriação de Macaco-
Prego do Departamento de Ciências Básicas da Faculdade de Odontologia
do Câmpus de Araçatuba – UNESP. Esses animais também foram
utilizados em outros estudos experimentais.
Para o procedimento cirúrgico, os animais foram inicialmente
pesados e sedados por meio de inalação de éter sulfúrico (Miyako do Brasil
Indústria e Comércio LTDA, Guarulhos, SP, Brasil), recebendo a seguir
0,1mL de Diazepan (Sigma Pharma, São Bernardo do Campo, SP, Brasil)
intramuscular para promover um relaxamento e, logo após, anestesiados
com injeção intraperitonial de Thionembutal (Abbott Laboratórios do
Brasil Ltda) na dosagem de 30 mg/kg por peso corporal. Alcançado o
P
33
estado de anestesia cirúrgica foi realizada a sindesmotomia, luxação e
extração dos incisivos superiores e inferiores, previamente à eutanásia.
Após a extração, os dentes foram divididos em sete grupos
(com oito dentes cada):
Grupo I: os dentes foram imersos imediatamente em solução
fixadora (formalina a 10%).
Grupo II: os dentes foram imersos em solução de resveratrol
por 1 hora.
Grupo III: os dentes foram imersos em solução de resveratrol
por 2 horas.
Grupo IV: os dentes foram imersos em solução de resveratrol
por 6 horas.
Grupo V: os dentes foram imersos em solução de resveratrol
por 12 horas.
Grupo VI: os dentes foram imersos em solução de resveratrol
por 24 horas.
Grupo VII: os dentes foram mantidos em meio seco, presos
pela coroa dental em uma lâmina de cera utilidade, por um período de 6
horas.
Nos grupos II a VI os dentes foram imersos em 50mL de
solução de resveratrol em propilenoglicol (baseado em teste de solubilidade
previamente realizado - Figura 1) 5 µM/L (Apothicário Farmácia de
34
Manipulação, Araçatuba, São Paulo, Brasil), contidos em copos plásticos
descartáveis. Todos os procedimentos foram realizados em temperatura
ambiente.
FIGURA 1 – Teste de solubilidade previamente realizado para os seguintes solventes:
Tubo 1: Álcool de Cereais (produto completamente solúvel neste solvente); Tubo 2:
Propilenoglicol (produto completamente solúvel neste solvente); Tubo 3: Glicerina
(produto parcialmente solúvel neste solvente, formando uma suspensão, pouca presença
de corpo de fundo); Tubo 4: Sorbitol (produto parcialmente solúvel neste solvente,
formando uma suspensão, pouca presença de corpo de fundo); Tubo 5: Saliva Artificial
(produto parcialmente solúvel neste solvente, formando uma suspensão, mas sendo
menos solúvel do que no Sorbitol e Glicerina, além de formar um corpo de fundo mais
volumoso); Tubo 6: Leite (produto pouco solúvel neste solvente, sem formação de uma
suspensão perceptível, formando um corpo de fundo equivalente a quase toda a amostra
testada).
As peças obtidas foram fixadas em solução de formalina a
10% por 24 horas e descalcificadas em solução de EDTA 4,13% (Ácido
35
Etileno Diamino Tetracético - pH 7,0, Merck, Darmstadt, Alemanha). O
ponto exato da descalcificação foi obtido quando, ao introduzir uma agulha
(Terumo Medical do Brasil Ltda, São Paulo, SP, Brasil) na coroa de cada
dente, a mesma não apresentou resistência. Em seguida, as peças foram
embebidas em parafina e submetidas a cortes transversais de 6µm de
espessura.
Parte dos cortes obtidos foi corada em hematoxilina e eosina,
para análise histomorfológica. A outra parte foi preparada para o
processamento imunoistoquímico previamente à adição dos anticorpos
primários. Estes foram: anticorpos policlonais de cabra contra a
osteopontina – OPN (Santa Cruz Biotechnology, Califórnia, USA) e
anticorpos policlonais de cabra contra a caspase 3 (Santa Cruz
Biotechnology, Califórnia, USA). O anticorpo secundário utilizado foi o
biotinilado anti-cabras, produzido em burros (Pierce Biotechnology,
Illinois, USA).
O sinal da reação imunoistoquímica foi amplificado com o
sistema avidina-biotina (Kit DAKO, Glostrup, Dinamarca) e a reação foi
revelada utilizando a diaminobenzidina (DAB, DAKO Co., Califórnia, USA)
como cromógeno, resultando em uma imagem acastanhada. A
contracoloração foi obtida com a hematoxilina de Harris (Merck,
Darmstadt, Alemanha).
36
Para todos os grupos foram realizados controles
imunoistoquímicos, pela adição apenas do anticorpo secundário após o
processamento convencional. O objetivo foi avaliar a efetividade e a
especificidade das reações de OPN e caspase 3. Assim, como uma
contraprova, se houver marcação no controle, reações inespecíficas estão
ocorrendo, inviabilizando a metodologia.
As análises foram realizadas qualitativamente em microscópio
de luz. As características do ligamento periodontal foram observadas nos
diversos tempos de conservação em resveratrol. Para a análise
histomorfológica foram considerados os fibroblastos, as células
inflamatórias e os vasos sanguíneos.
Em seguida, para a captura das imagens, foi utilizado o
microscópio óptico Leica Aristoplan Microsystems (Leitz, Benshein,
Alemanha) acoplado a uma câmera de captação da imagem (Leica DFC
300FX, Leica microsystems, Heerbrug, Switzerland) conectada a um
microcomputador Pentium III com um software analisador de imagens
digitalizadas (Leica Câmera Software Box, Leica Imaging Manager – IM 50
Demo software).
A análise imunoistoquímica foi realizada com a atribuição de
escores, variando de 0 para as lâminas que não apresentaram marcação
alguma, 1 para as que apresentaram marcação leve, 2 para moderada e 3
para as lâminas que apresentaram marcações intensas.
Resultados
38
4 Resultados
4. Resultado
ela análise histomorfológica, o grupo I (imediato)
apresentou alguns espécimes com ligamento periodontal
bem vascularizado com moderado número de fibroblastos e alguns
macrófagos. Em outros espécimes, pode ser notada a presença de feixes de
fibras colágenas com moderado número de fibroblastos, ao lado de raros
linfócitos e macrófagos (Figura 2).
No grupo II (resveratrol – 1 hora) foi evidenciada, em alguns
espécimes, a presença de remanescentes do ligamento periodontal pouco
vascularizado, ao lado de pequeno número de fibroblastos e alguns
macrófagos e linfócitos (Figura 3). Nos demais espécimes, os
remanescentes do ligamento periodontal exibiram pequeno número de
fibroblastos e vasos sanguíneos.
O grupo III (resveratrol – 2 horas) apresentou alguns
espécimes com áreas ocupadas por remanescente do ligamento periodontal,
exibindo pequeno número de fibroblastos ao lado de raros macrófagos e
linfócitos (Figura 4). Em outros espécimes, foram observadas extensas
P
39
áreas ocupadas por raros fibroblastos. Nas áreas mais próximas à superfície
do dente, houve presença de moderado número de fibroblastos.
No grupo IV (resveratrol – 6 horas) uma delgada faixa de
tecido conjuntivo é observada em um dos espécimes, com raros
fibroblastos e macrófagos e ausência de vasos sanguíneos. Outros
espécimes apresentaram remanescente do ligamento periodontal com
moderado número de fibroblastos e discreta vascularização (Figura 5).
No grupo V (resveratrol – 12 horas) a maioria dos espécimes
apresentou remanescente do ligamento periodontal com elevado número
de fibroblastos ao lado de alguns macrófagos e linfócitos (Figura 6). Em
um dos espécimes evidenciou-se o remanescente do ligamento periodontal
com pequeno número de fibroblastos e ausência de vasos sanguíneos.
No grupo VI (resveratrol – 24 horas) a maioria dos espécimes
apresentou o remanescente do ligamento periodontal com pequeno número
de fibroblastos, alguns macrófagos e linfócitos (Figura 7). Em todos os
casos houve ausência quase total de vasos sanguíneos.
O grupo VII (Seco) mostrou o remanescente do ligamento
periodontal com ausência de vasos sanguíneos ao lado de alguns
fibroblastos em degeneração (Figura 8).
A análise imunoistoquímica mostrou imunomarcação
moderada de Osteopontina nos grupos Imediato, Resveratrol 12 e 24 horas
(Tabela 1). Nos demais grupos a imunomarcação variou de ausente a leve.
Quanto à Caspase, foi observada imunomarcação moderada nos grupos
Resveratrol 1, 2 e 24 horas. O grupo Resveratrol 6 horas apresentou
imunomarcação
variando de
Resveratrol 12 horas e Seco a imunomarcação variou d
Tabela 1 –
Imunomarcação
os grupos.
Imediato
O
PN
moderada
Caspase
-
Quanto à Caspase, foi observada imunomarcação moderada nos grupos
Resveratrol 1, 2 e 24 horas. O grupo Resveratrol 6 horas apresentou
variando de
moderada e intensa. Já nos grupos Imediato,
Resveratrol 12 horas e Seco a imunomarcação variou d
e ausente a leve.
Imunomarcação
(escores)
de osteopontina e caspase
Resv 1 h
Resv 2 h
Resv 6 h
Resv 12 h
leve
leve
leve
moderada
moderada
moderada
intensa
-
FIGURA 2- Grupo I (i
mediato)
fibras colágenas, moderado número de
fibroblastos e alguns macrófagos e linfócitos.
HE. 160x. B.
Imunomarcação moderada de
Osteopontina. H
ematoxilina de Harris
C.
Ausência de imunomarcação de Caspase.
Hematoxilina de Harris.
400
A
C
40
Quanto à Caspase, foi observada imunomarcação moderada nos grupos
Resveratrol 1, 2 e 24 horas. O grupo Resveratrol 6 horas apresentou
moderada e intensa. Já nos grupos Imediato,
e ausente a leve.
de osteopontina e caspase
em todos
Resv 12 h
Resv 24 h
Seco 6 h
moderada
leve
moderada
leve
mediato)
– A. Feixes de
fibras colágenas, moderado número de
fibroblastos e alguns macrófagos e linfócitos.
Imunomarcação moderada de
ematoxilina de Harris
. 400x.
Ausência de imunomarcação de Caspase.
400
x.
B
FIGURA 3- Grupo II
(resveratrol 1 hora)
Remanescente do ligamento periodontal
vascularizado e
pequeno número de
fibroblastos, alguns
macrófagos e linfócitos.
HE. 250x. B.
Imunomarcação leve de
Osteopontina. Hematoxilina de Harris. 400x.
C. Imunomarcação moderada de Caspase.
Hematoxilina de Harris. 400x.
FIGURA 4- Grupo III
(resveratrol 2 horas)
– A. Espécime
mostrando o remanescente
do ligamento periodontal com pequeno
número de fibroblastos e raros macr
linfócitos. HE. 250x. B.
Imunomarcação leve
de Osteopontina.
Hematoxilina de Harris.
400x. C.
Imunomarcação moderada de
Caspase. . Hematoxilina de Har
A
A
C
C
41
(resveratrol 1 hora)
– A.
Remanescente do ligamento periodontal
pouco
pequeno número de
macrófagos e linfócitos.
Imunomarcação leve de
Osteopontina. Hematoxilina de Harris. 400x.
C. Imunomarcação moderada de Caspase.
Hematoxilina de Harris. 400x.
(resveratrol 2 horas)
mostrando o remanescente
do ligamento periodontal com pequeno
número de fibroblastos e raros macr
ófagos e
Imunomarcação leve
Hematoxilina de Harris.
Imunomarcação moderada de
Caspase. . Hematoxilina de Har
ris. 400x.
B
B
FIGURA 5- Grupo IV
(resveratrol 6 horas)
A. Espécime mostrando
ligamento period
ontal com moderado
de fibroblastos e
discreta vascularização.
250x. B.
Imunomarcação leve de Osteopontina.
Hematoxilina de Harris. 400
Imunomarcação intensa de Caspase.
Hematoxilina de Harris. 400
FIGURA 6- Grupo V
(resveratrol 12 horas)
A. Remanescente do li
gamento periodontal
com elevado
número de fibrob
macrófagos e linfócitos
. HE. 250x.
Imunomarcação moderada de Osteopontina.
Hematoxilina de Harris. 40
imunomarcação de Caspase.
Harris. 400x.
A
C
A
C
42
(resveratrol 6 horas)
–
remanescente do
ontal com moderado
número
discreta vascularização.
HE.
Imunomarcação leve de Osteopontina.
Hematoxilina de Harris. 400
x. C.
Imunomarcação intensa de Caspase.
Hematoxilina de Harris. 400
x.
(resveratrol 12 horas)
–
gamento periodontal
número de fibrob
lastos e alguns
. HE. 250x.
B.
Imunomarcação moderada de Osteopontina.
Hematoxilina de Harris. 40
0x. C. Ausência de
imunomarcação de Caspase.
Hematoxilina de
B
B
FIGURA 7- Grupo VI
(resveratrol 24 horas
A.
Remanescente do ligamento periodontal
com
pequeno número de fibroblastos,
macrófagos e linfócitos. HE. 250x.
Imunomarcação moderada de Osteopontina.
Hematoxilina de Harris. 40
Imunomarcação moderada de Caspase.
Hematoxilina de Harris. 40
0x
FIGURA 8- Grupo VII
(Seco 6 horas)
Ligamento periodontal com ausência de
vasos sanguíneos
e pre
fibroblastos em degeneração. HE. 160x.
Imunomarcação leve
de Osteopontina.
Hematoxilina de Harris. 40
Imunomarcação leve
Hematoxilina de Harris. 40
A
C
A
C
43
(resveratrol 24 horas
) –
Remanescente do ligamento periodontal
pequeno número de fibroblastos,
alguns
macrófagos e linfócitos. HE. 250x.
B.
Imunomarcação moderada de Osteopontina.
Hematoxilina de Harris. 40
0x. C.
Imunomarcação moderada de Caspase.
0x
.
(Seco 6 horas)
– A.
Ligamento periodontal com ausência de
e pre
sença de alguns
fibroblastos em degeneração. HE. 160x.
B.
de Osteopontina.
Hematoxilina de Harris. 40
0x.
C.
de Caspase.
Hematoxilina de Harris. 40
0x.
B
B
Discussão
45
5 Discussão
5. Discussão
reimplante dentário exige atenção especial com relação
às suas principais complicações, as reabsorções
radiculares (17,46-48). Durante a avulsão, o rompimento das fibras do
ligamento periodontal não pode ser evitado. No entanto, as complicações
adicionais durante o tempo em que o dente encontra-se fora do alvéolo
podem ser evitadas ou minimizadas (47) pelo reimplante imediato (49,50)
ou pela manutenção em meios de conservação adequados, tais como
solução salina balanceada de Hank, Viaspan®, Eurocollins, leite, soro
fisiológico e saliva (17,46,47).
O resveratrol tem a capacidade de prolongar o tempo de vida
das células. A redução do suprimento alimentar (restrição calórica) aumenta
a expectativa de vida de um grande número de espécies desde as leveduras
até os mamíferos (51). Quando as leveduras sofrem restrição calórica,
dispositivos de estresse são ativados e as células são forçadas a encontrar
energia em substratos alternativos. Isso produz alteração no consumo de
oxigênio, que por sua vez afeta os padrões de oxidação e redução do DNA
O
46
que estimula a atividade da SIR2 (silent information regulator 2), que codifica
uma enzima, a histona desacetilase dependente de NAD+.
O Resveratrol ativa diretamente a SIR2 e gera benefícios
similares àqueles encontrados diante da restrição alimentar (52). Tais
caminhos podem existir também em organismos superiores, pois em
mamíferos há sete genes de sirtuínas, sendo que a SIRT1 é a mais parecida
com SIR2. A concentração ideal para a ativação da proteína recombinante
SIR2 varia de 2 a 5µM (22,53). Em virtude disso, foi utilizada solução de
resveratrol em propilenoglicol 5µM, sendo que tal solvente foi escolhido
devido às suas propriedades já conhecidas em Odontologia.
Apesar de não estar bem conhecido o mecanismo pelo qual as
sirtuínas participam do envelhecimento nos mamíferos, recente
investigação indica que parece agir como regulador da programação de
morte e maturação celular (apoptose e diferenciação, respectivamente, 54).
No presente estudo, o quadro histológico encontrado nos
grupos imediato e resveratrol 12 horas demonstra a presença de moderado
número de fibroblastos, alguns macrófagos e linfócitos. Em contrapartida,
nos grupos resveratrol 1, 2, 6 e 24 horas observou-se pequeno número de
fibroblastos e discreta vascularização.
O grupo seco 6 horas se caracterizou pela ausência de vasos
sanguíneos e fibroblastos em degeneração. Já no grupo resveratrol 6 horas
observou-se moderado número de fibroblastos e discreta vascularização.
47
Comparando o grupo Imediato com o resveratrol 12 horas é possível
verificar que ambos apresentaram moderado número de fibroblastos. Esses
resultados sugerem certo grau de eficiência do resveratrol quanto à
manutenção da vitalidade do ligamento periodontal até o período de 12
horas.
Essa situação pode ser verificada também na análise
imunoistoquímica. O grupo Imediato se caracterizou pela imunomarcação
intensa de osteopontina e de leve a ausente de caspase. Essa resposta é
esperada, visto que a osteopontina está envolvida nos processos de
proliferação celular (vitalidade) e a caspase está relacionada a apoptose
(ausência de vitalidade).
Diante disso, se o material não tivesse capacidade de manter a
vitalidade das células, a imunomarcação de osteopontina deveria diminuir
gradativamente nos grupos resveratrol, 1, 2, 6, 12 e 24 horas, assim como
no grupo seco. Já a imunomarcação de caspase deveria aumentar a partir
do grupo imediato.
No entanto, essa condição não foi observada. O grupo
resveratrol 12 horas se mostrou semelhante ao imediato. Talvez o material
tenha um período de latência, um intervalo de tempo entre o estímulo e a
reação associada a ele.
Resultado semelhante já foi relatado quando do uso da
própolis, ou seja, a manutenção por 6 horas foi melhor do que 60 minutos.
48
Segundo os autores esse fato pode ser explicado em razão da maior
incorporação dos princípios ativos responsáveis pela ação antimicrobiana,
antiinflamatória e cicatrizante no período de 6 horas (55).
Essas perguntas não poderiam ser respondidas com a
metodologia aqui empregada, pois este estudo traz algumas limitações. É
possível determinar, pelo aspecto morfológico, que os fibroblastos do
ligamento periodontal apresentam vitalidade, mas não é possível afirmar
que as células sejam capazes de se proliferar. Entretanto, trata-se do
primeiro ensaio diante do ineditismo do assunto.
A despeito da diferença de metodologia, é possível fazer
alguma inferência, comparando os resultados aqui obtidos com aqueles de
trabalhos que estudaram as propriedades favoráveis de outros meios de
conservação.
O leite tem sido recomendado pela maioria dos pesquisadores
(4,9,10,21,56,57). A sua eficácia está relacionada à osmolaridade, à presença
de substâncias nutritivas, fatores de crescimento, e ao baixo conteúdo
bacteriano (9). A manutenção do dente avulsionado em leite não deve ser
superior a 6 horas (9,57), considerando que após esse período sua eficácia
diminui substancialmente (10).
O Viaspan® e a solução salina balanceada de Hank possuem
capacidade de proporcionar a preservação da vitalidade das células por
longos períodos de tempo (15).
49
Por sua vez, os resultados obtidos com o resveratrol podem
ser explicados pelas suas propriedades antiinflamatória, antimicrobiana,
antioxidante, antiplaquetária, além de efeitos antiproliferativos (26,28,29).
Deve ser enfatizada a importância da realização de outros
trabalhos utilizando métodos mais aprimorados de detecção de vitalidade
celular, abrindo perspectiva para novas pesquisas.
Conclusão
51
6 Conclusão
pós a análise dos resultados, foi possível concluir
que o resveratrol parece ser um bom meio de
conservação da vitalidade das células do ligamento periodontal até o tempo
de 12 horas.
A
Referências
53
1. As referências no texto estão de acordo com as normas da revista Dental Traumatology, para a
qual o trabalho será enviado.
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Anexos
62
ANEXO A - Autorização do Comitê de Ética em Pesquisa - FOA –UNESP
63
ANEXO B – Ilustração da Fase Experimental
FIGURA 9
-
Adaptação de cânula para
abertura bucal.
FIGURA 13
-
Incisivos superiores.
FIGURA 1
0
-
Sindesmotomia.
FIGURA
1
4
-
Luxação.
FIGURA 11
-
Extração dentária.
FIGURA 15
-
Dente extraído.
FIGURA 12
-
Frasco com solução de
Resveratrol.
FIGURA 16
-
Dente extraído mantido em
solução de Resveratrol.
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