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MANUELA MARIA CAVALCANTE GRANJA
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO
ESTRESSE GRADATIVO E CHOQUE OSMÓTICO PELO NaCl EM
CANA-DE-AÇÚCAR
RECIFE
FEVEREIRO – 2010
Dissertação apresentada ao Programa de
Pós-Graduação em Agronomia:
Melhoramento Genético de Plantas da
Universidade Federal Rural de
Pernambuco, como parte dos requisitos
para obtenção do título de Mestre.
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RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
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RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO
ESTRESSE GRADATIVO E CHOQUE OSMÓTICO PELO NaCl EM
CANA-DE-AÇÚCAR
MANUELA MARIA CAVALCANTE GRANJA
COMITÊ DE ORIENTAÇÃO:
Profª. Drª. Terezinha Camara
Profª. Drª. Lilia Willadino
RECIFE
FEVEREIRO – 2010
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RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
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RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO
ESTRESSE GRADATIVO E CHOQUE OSMÓTICO PELO NaCl EM
CANA-DE-AÇÚCAR
Dissertação defendida e aprovada pela Banca Examinadora em: ____ de Fevereiro de 2010
ORIENTADORA:
________________________________________________
Dsc. Terezinha Rangel Camara
Professora do Departamento de Química/UFRPE
BANCA EXAMINADORA
________________________________________________
Dsc. Claudia Ulisses de Carvalho Silva
Professora da Unidade Acadêmica de Garanhuns /UFRPE
_______________________________________________
Dsc. Péricles de Albuquerque Melo Filho
Professor do Departamento de Agronomia/UFRPE
_______________________________________________
Dsc. Reginaldo de Carvalho
Professor do Departamento de Biologia/UFRPE
RECIFE – PE
FEVEREIRO – 2010
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
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AGRADECIMENTOS
Agradeço primeiramente Àquele que me guia e que me protege em toda a minha
caminhada. Àquele que me dá força e coragem para conquistar os meus objetivos e sonhos,
Deus.
À Universidade Federal Rural de Pernambuco (UFRPE) por poder participar do programa
de Pós-Graduação em Melhoramento Genético de Plantas para a obtenção do grau de
Mestre.
À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela concessão
da bolsa de estudos.
Ao Centro de Tecnologias Estratégicas para o Nordeste (CETENE) pela concessão do
material vegetal utilizado no estudo
À minha família, Junior, Delma, Nathalia, Vô Granja e Tia Ana. São neles que eu encontro
o conforto de um colo protetor, a sapiência das palavras ditas e os gestos de afetos mais
doces.
A Dsc. Terezinha Camara, pela orientação, por ter “aberto portas”, confiança, amizade,
apoio e valiosos ensinamentos, que me proporcionaram crescer como profissional e pessoa.
Sou muito grata!
A Dsc. Lilia Willadino, pela co-orientação, ensinamentos, amizade e auxílio na elaboração
do trabalho.
A Well, pelos momentos descontraídos, amizade e pela preciosa ajuda na execução das
análises, meu braço direito!
Aos Dsc. André Dias Azevedo Neto, Gilberto Junior e Manoel Bandeira pela ajuda na
compreensão das análises e simpatia.
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
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Ao Dsc. Péricles Melo Filho e Dsc. Roseane dos Santos, por todos os ensinamentos,
conselhos e amizade.
Aos membros da banca examinadora: Dsc. Claudia Ulisses, Dsc. Ana Porto, Dsc. Péricles
Melo Filho e Dsc. Reginaldo de Carvalho, pela amizade, atenção e conhecimentos
transmitidos ao longo desses anos.
Aos professores do Programa de melhoramento Genético de Plantas, em especial ao Dsc.
Clodoaldo Filho, Dsc. Gerson Bastos, Dsc. Edson da Silva, Dsc. Vivian Loges, pela
transmissão de conhecimentos e atenção.
À secretária da fitotecnia Bernadete, pela efetividade, atenção e amizade.
À amiga Lucilia, uma pessoa especial que admiro muito! Por tantos conselhos, incentivos,
força, momentos felizes e amizade sincera.
Aos amigos da minha segunda casa, Laboratório de cultura de tecidos vegetais (LCTV), por
tantos momentos compartilhados, pela amizade, ajuda, cumplicidade e partilha de
aprendizagem. Sucesso a todos: Luciana, Jaislanny, Marina, Silvany, Ronaldo, João,
Emmanuel, Vitor, Gilvany, Gemima, Patrícia Cunha e Vanessa.
Aos meus queridos amigos, Gisele, Taline, Renato, Tatiana e Lucas. Obrigada pelo apoio,
amizade e pelos momentos únicos vividos.
Aos meus queridos amigos da melhor turma de mestrado: Jacqueline, Isabel, Eva,
Jaislanny, Marina, Paula, João, Júlio, Rômulo e Romero, que depois de tantos momentos,
viagens, madrugadas de estudo, conseguimos conquistar o nosso sonho, nos tornar
Melhoristas!
Muito Obrigada!
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
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A mente que se abre a uma nova idéia
jamais volta ao seu tamanho original.
Albert Einstein
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SUMÁRIO
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VIII
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67
67
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ÍNDICE DE FIGURAS
Pág.
Figura 1. Atividade da CAT e POX em duas variedades de cana-de-açúcar (RB931011 e
RB872552) cultivadas in vitro sob dois níveis de NaCl (T1 = 56 mM e T2 = 112 mM de NaCl).
Letras distintas sobre as colunas indicam diferença estatística ao nível de 5% de probabilidade
pelo teste de Tukey.
47
Figura 2. Atividade da CAT, POX E APX em duas variedades de cana-de-açúcar (RB931011 e
RB872552) cultivadas in vitro em resposta à condição de aplicação (Gradativa ou Choque) do
estresse salino. Letras idênticas, maiúsculas entre variedades e minúsculas entre condição de
aplicação do estresse, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
51
Figura 3. Atividade da APX e PPO em duas variedades de cana-de-açúcar (RB931011 e
RB872552) cultivadas in vitro sob duas concentrações de NaCl (T1 = 56 mM e T2 = 112 mM).
Letras idênticas, maiúsculas entre variedades e minúsculas entre os níveis de NaCl, não diferem
entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
52
Figura 4. Atividade da PPO de duas variedades de cana-de-açúcar (RB931011 e RB872552)
cultivadas in vitro em resposta à concentração de NaCl (T1 = 56 mM e T2 = 112 mM) e à
condição de aplicação (Gradativa ou Choque) do estresse salino. Letras idênticas, maiúsculas
entre as condições de indução do estresse salino e minúsculas entre os níveis de NaCl, não
diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
54
Figura 5. Teor de proteínas solúveis e prolina em duas variedades de cana-de-açúcar (RB931011
e RB872552) cultivadas in vitro sob dois níveis de NaCl (T1 = 56 mM e T2 = 112 mM de
NaCl). Letras distintas sobre as colunas indicam diferença estatística ao nível de 5% de
probabilidade pelo teste de Tukey.
56
Figura 6. Teor de proteínas solúveis em duas variedades de cana-de-açúcar (RB931011 e
RB872552) cultivadas in vitro sob duas concentrações de NaCl (T1 = 56 mM e T2 =112 mM) e
condições do estresse salino. Letras idênticas, maiúsculas entre variedades ou condição do
56
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
9
estresse e minúsculas entre os níveis de NaCl, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade.
Figura 7. Concentração dos íons Na
+
e K
+
e relação Na
+
/K
+
em duas variedades de cana-de-
açúcar (RB931011 e RB872552) cultivadas in vitro sob diferentes níveis de NaCl. Letras
distintas sobre as colunas indicam diferença signifivativa pelo teste de Tukey a 5%.
59
Figura 8. Teor de Na
+
e relação Na
+
/K
+
em duas variedades de cana-de-açúcar (RB931011 e
RB872552) cultivadas in vitro sob diferentes formas de indução do estresse salino. Letras
distintas sobre as colunas indicam diferença estatística ao nível de 5% de probabilidade pelo teste
de Tukey.
60
Figura 9. Teor de K
+
em duas variedades de cana-de-açúcar (RB931011 e RB872552) cultivadas
in vitro sob estresse salino. Letras distintas sobre as colunas indicam diferença estatística ao nível
de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
61
Figura 10. Teores de Na
+
, K
+
e Na
+
/K
+
de duas variedades de cana-de-açúcar (RB931011 e
RB872552) cultivadas in vitro em resposta à concentração (T1 = 56 mM e T2 = 112 mM de
NaCl) e à condição de aplicação (Gradativa ou Choque) do estresse salino. Letras idênticas,
maiúsculas entre as condições de indução do estresse salino e minúsculas entre os níveis de
NaCl, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
63
Figura 11. Relação Na
+
/K
+
em duas variedades de cana-de-açúcar (RB930100 e RB872552)
cultivadas in vitro sob dois tratamentos salinos (T1 = 56 mM e T2 = 112 mM). Letras idênticas,
maiúsculas entre variedades e minúsculas entre níveis de NaCl, não diferem entre si pelo teste de
Tukey a 5% de probabilidade.
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RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
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ÍNDICE DE TABELAS
Pág.
Tabela 1. Descrição do acréscimo de NaCl no estabelecimento dos tratamentos ao longo do
período experimental
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RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
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RESUMO
A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) é uma gramínea considerada moderadamente
sensível à salinidade. Embora tradicionalmente cultivada nas zonas de Mata úmida e Litoral
da região Nordeste, o cultivo da cana-de-açúcar vem se expandindo também para regiões
semi-áridas. A má qualidade da água de irrigação, altas taxas de evaporação e baixa
precipitação pluviométrica, aliada a outros fatores contribuem para o processo de
salinização dos solos do semi–árido. Para o desenvolvimento e seleção de genótipos
tolerantes, é necessário conhecer os mecanismos fisiológicos com os quais as plantas
enfrentam o estresse salino. Técnicas de cultivo in vitro para estudos da fisiologia e
bioquímica de plantas, em condições de estresse, são importantes ferramentas por
permitirem o controle e homogeneidade das condições de cultivo. No presente trabalho,
dois genótipos de cana-de-açúcar (RB931011 e RB872552) desenvolvidos pelo Programa
de Melhoramento Genético da Cana-de-Açúcar da RIDESA, para a região Nordeste, foram
submetidos ao estresse salino in vitro mediante o acréscimo de NaCl ao meio de cultura sob
uma ação gradativa e súbita para avaliar o comportamento fisiológico e bioquímico dessas
plantas. As variedades de cana-de-açúcar foram submetidas a duas concentrações de NaCl
(56mM, 112mM e o controle) de forma gradativa e repentina. Aos 35 dias de experimento,
atividades enzimáticas da Catalase (CAT), Peroxidase (POX), Ascorbato peroxidase
(APX), Polifenoloxidase (PPO), teores de sódio (Na
+
),
potássio (K
+
), concentração de
proteínas solúveis e prolina livre foram determinadas. Foi possível observar diferenças nas
respostas das variedades em função da condição de indução do estresse salino, gradativo ou
por choque, mais do que em função das concentrações de NaCl no meio de cultura. A
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
12
resposta ao estresse é, portanto, condicionada não só pela concentração dos sais, mas pela
forma que a planta é exposta ao meio salino.
Palavras-chave: Cana-de-açúcar, sistema antioxidativo, estresse gradativo, choque
osmótico, cloreto de sódio
ABSTRACT
Sugarcane (Saccharum officinarum) is a grass considered moderately sensitive to salinity.
Although traditionally cultivated in the soil of the Atlantic Coast and the Northeast, the
cultivation of sugarcane is expanding to semi-arid regions. The poor quality of irrigation
water, high rates of evaporation and low rainfall, combined with other factors contribute to
the process of soil salinization in semi-arid. For the development and selection of tolerant
genotypes, it is necessary to understand the physiological mechanisms with which plants
face the salt stress. Techniques for in vitro plant tissue for studies of physiology and
biochemistry of plants under stress are important tools to allow control and uniformity of
culture conditions. In this study, two genotypes of sugarcane (RB931011 and RB872552)
developed within the Program of Genetic Improvement of Sugarcane of rides, for the
Northeast region (RIDESA) were evaluated for sudden and gradual action of salt stress-
induced by adding NaCl to the culture medium during in vitro development of plants. The
varieties of sugarcane were subjected to three concentrations of NaCl (0 mM, 50 mM and
100 mM) in a gradual and sudden. At 35 days of experiment, enzyme activities (CAT,
POX, APX, PPO), levels of sodium (Na
+
), potassium (K
+
), soluble protein content and free
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
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proline were recorded. It was possible to observe differences in responses of varieties
depending on the condition of induced salt stress, shock or gradual, rather than depending
on the concentration of NaCl in the culture medium. The stress response is therefore not
only conditioned by salt concentration, but by way of exposure to salt.
Key-words: Sugarcane, antioxidative system, gradual stress, osmotic shock, sodium
chloride
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
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INTRODUÇÃO GERAL
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
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A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) é uma poaceae perene, considerada
moderadamente sensível à salinidade, e a diminuição do rendimento pode chegar a 50% em
solos de condutividade elétrica de 10,4 dS m
-1
(SANTANA et al., 2006). Estudos em
relação à tolerância da cana-de-açúcar à salinidade estão se tornando cada vez mais
freqüentes na última década, tendo em vista o interesse nessa cultura para a produção de
bioenergia e outros subprodutos, além da tradicional extração de sacarose. Áreas irrigadas
são mais propensas à salinização dos solos, tendo em vista que as práticas de irrigação são
mais freqüentes em regiões áridas e semi-áridas. Países tropicais e subtropicais têm
incrementado as pesquisas com relação à tolerância dessa cultura a situações de estresse
salino (GANDONOU et al., 2004). Os mecanismos de tolerância à salinidade ainda não
estão bem elucidados, devido a este fenômeno ser extremamente complexo, podendo
envolver alterações no desenvolvimento e na morfologia, bem afetar processos fisiológicos
e bioquímicos. A tolerância à salinidade geralmente tem sido estudada com base nos
mecanismos de regulação das homeostases iônica e osmótica, os quais são considerados
ubíquos para o ajustamento osmótico celular. Contudo, além dos aspectos iônicos e
osmóticos, o estresse salino também pode induzir estresse oxidativo pelo aumento da
produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) (AZEVEDO NETO, 2005) gerando um
desequilíbrio entre a produção e o seqüestro dessas ROS, entre as quais destacam-se o íon
superóxido (O
2
-
), o radical hidroxila (OH ) e o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
). Para
combater o excesso de ROS, as plantas possuem um complexo sistema de defesa, a fim de
minimizar os danos causados pelo acúmulo dessas espécies reativas. Esse sistema de defesa
envolve metabólitos como ascorbato, além de enzimas antioxidantes, como a catalase,
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
16
peroxidases e polifenoloxidase. Existe uma grande necessidade de identificar culturas e
cultivares tolerantes à salinidade, pois as práticas de recuperação de solos com problemas
acentuados de sais, em sua maioria, são onerosas e demoradas (MACÊDO et al, 2005). O
desenvolvimento e a seleção de genótipos envolvem estudos sobre os mecanismos de
tolerância da cultura. Os programas de melhoramento visando à tolerância à salinidade não
terão êxito sem que se conheçam os mecanismos fisiológicos com os quais as plantas
enfrentam o estresse salino. As técnicas de cultivo in vitro de tecidos vegetais para estudos
de fisiologia e bioquímica de plantas em condições de estresse são importante ferramenta
por permitirem o controle e homogeneidade das condições de cultivo (LERNER, 1985;
LUTTS et al., 2004), além da possibilidade de abrigar um grande número de material
vegetal em espaço físico reduzido, sem dependência de condições climáticas. Diante do
exposto, objetivou-se contribuir para um melhor entendimento das respostas metabólicas da
cana-de-açúcar sob o aumento gradual e súbito da salinidade.
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
17
Capítulo I
REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
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1. CANA-DE-AÇÚCAR
Desde sua introdução no Brasil, a cultura canavieira possui papel importante na
economia nacional. Por várias décadas, a cana-de-açúcar foi a principal fonte de renda do
país, principalmente para o Nordeste, onde se estabeleceu de forma definitiva. Hoje é
produzida em mais de 70 países, sendo o Brasil seu maior produtor, seguido pela Índia e
pela China (CONAB, 2007).
A produção brasileira de cana-de-açúcar foi de 569.062.629 toneladas na safra
2008/2009 refletindo um aumento em comparação a 2007 (UNICA, 2009). A expansão da
área colhida em mais de 1,0 milhão de hectares (16,5%), é reflexo dos novos projetos que
estão sendo implantados no país, com o objetivo de abastecer o mercado nacional e
internacional com etanol (IBGE 2008).
O Estado de Pernambuco é o segundo em safra - 19.822.187 (t), produção de açúcar
-1.683.448 (t) e etanol - 511.576 (m
3
) do Norte/Nordeste (SINDAÇÚCAR, 2009). Embora
tradicionalmente cultivada nas zonas úmidas de Mata e Litoral da região Nordeste, o
cultivo da cana de açúcar vem se expandindo para regiões semi-áridas. Vários estados
nordestinos estão desenvolvendo programas com a cultura no semi-árido com resultados
animadores, como no caso de Juazeiro, na Bahia (SEAGRI, 2007). Em oito municípios do
sertão pernambucano foram estabelecidos, em 2003, cultivos com uma variedade de cana-
de-açúcar (cana do sertão) desenvolvida pela Universidade Federal Rural de Pernambuco
em conjunto com outras universidades. Apesar de consumir pouca água, a cana do sertão
ainda precisa de irrigação (FERNANDES, 2003).
O uso da irrigação na cultura da cana-de-açúcar tem contribuído, significativamente,
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
19
para o aumento da produtividade agrícola, além de permitir melhorias em áreas cujo
potencial para exploração da agricultura é limitado, em razão de seus regimes pluviais. Por
outro lado, a irrigação tem causado alguns problemas ao meio ambiente. Dentre eles,
destaca-se o uso inadequado da água salina e/ou sódica resultando na perda da capacidade
produtiva do solo (RHOADES et al., 1992).
2. ESTRESSE AMBIENTAL
As plantas estão envolvidas em condições que não são ideais para o seu
desenvolvimento normal e podem estar no seu limite de sobrevivência. Estresses abióticos
são conseqüências da exposição a condições climáticas extremas, como seca, salinidade,
frio, altas temperaturas, solos alagados, poluição, etc. Em resposta, as plantas podem
adaptar-se para evitar e superar o estresse por diversos mecanismos fisiológicos,
bioquímicos e genéticos. Os mecanismos de resistência ao estresse são classificados em
dois tipos: evitar e/ou tolerar o estresse. Para evitar o estresse é necessário o
estabelecimento das condições internas das células das plantas que não estão sob estresse
apesar das condições externas, por exemplo: controle das altas temperaturas foliares para
transpiração e prevenção contra a seca pela conservação da água (SHEPHERD E
GRIFFITHS, 2006).
A tolerância envolve a resistência contra o estresse, onde as plantas podem ter suas
funções realizadas sobre condições extremas, tanto estresse externo quanto interno. Como
por exemplo: resistência a dessecação durante a seca, revitalizando a hidratação das células
(SHEPHERD E GRIFFITHS, 2006).
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
20
O desenvolvimento de mecanismos fisiológicos especializados tais como: absorção
seletiva de minerais, carregamento preferencial, remoção de sal através do xilema e
excreção de sais, é mais uma característica de tolerância, enquanto que para evitar tais
estresses muitas vezes, a planta faz uso de determinados processos biológicos atuando
como dispositivos mecânicos e morfológicos que agem sob a forma de escudo contra os
efeitos das condições extremas (SHEPHERD E GRIFFITHS, 2006).
3. SALINIDADE DOS SOLOS
A salinidade diz respeito à existência de níveis de sais no solo que interferem
negativamente no rendimento das culturas, podendo causar prejuízo econômico (BATISTA
ET AL., 2001). A salinidade do solo e da água é um atributo bastante variável no espaço e
no tempo. Os fatores mais diretamente responsáveis por esta salinidade são: a natureza
química dos solos, as interações com outros fatores, aumentando na perda de
permeabilidade, elevação do nível do lençol freático e as variáveis climáticas, como
pluviosidade, além das perdas hídricas por evaporação e evapotranspiração (GURGEL et
al., 2003). Essas taxas de evaporação e as condições de precipitação pluviométrica,
associadas às características do material de origem e às condições de relevo, condicionam a
formação de solos com teores elevados de sais solúveis e sódio trocável (EILERS et al.,
1995).
Solos afetados por sais são mais comuns em regiões áridas e semi-áridas, onde a
precipitação anual é insuficiente para proporcionar a evapotranspiração necessária às
plantas. Como resultado, os sais não lixiviam no solo. Ao contrário, eles acumulam em
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
21
quantidades nocivas para o crescimento vegetal. Contudo, os problemas com a salinidade
não estão restritos somente a áreas semi-áridas, podendo aparecer em regiões sub-úmidas e
úmidas sob determinadas condições (BOHN et al., 1979). Cerca de 5% do solo em que a
cana-de-açúcar é cultivada (20 milhões de hectares) é salino, o que afeta a produtividade e a
qualidade da colheita (PATADE et al., 2009), por isso existe uma necessidade constante do
estudo para conhecimento de genótipos tolerantes, permitindo um melhor desempenho da
cultura, frente ao sal.
4. EFEITO DA SALINIDADE SOBRE O DESENVOLVIMENTO, CRESCIMENTO
E NUTRIÇÃO DAS PLANTAS
As plantas podem ser classificadas como halófitas, aquelas que se desenvolvem
naturalmente em ambientes com elevadas concentrações salinas (tipicamente Na
+
e Cl
-
) e
glicófitas, as que não são capazes de se desenvolver em ambientes com elevadas
concentrações salinas. Plantas glicófitas, em um ambiente com grande quantidade de sais
solúveis, têm uma limitação no seu crescimento e desenvolvimento (LEVITT, 1980),
devido a alterações morfológicas, estruturais e metabólicas (ANDRADE NETO et al.,
2003). A cana-de-açúcar é uma planta glicófita, e tem sua qualidade afetada quando
exposta a salinidade (MUNIR e AFTAB, 2009).
O estresse salino causa efeitos nas plantas em diferentes proporções, dependendo de sua
tolerância ao sal, e tais efeitos podem ser classificados como primários, que incluem efeitos
osmóticos, desbalanço nas relações hídricas, resultando em uma redução e até inibição do
crescimento do vegetal e secundários, que estão associados aos efeitos tóxicos específicos
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
22
dos íons; como os danos na permeabilidade das membranas celulares e de organelas
citoplasmáticas; o desequilíbrio metabólico nos processos fotossintético e respiratório;
anabolismo e catabolismo de aminoácidos, proteínas e ácidos nucléicos; reações
enzimáticas e conversões de fitormônios (LEVITT, 1980; WILLADINO & CAMARA,
2005) e deficiência de nutrientes induzida pela competição dos íons Na
+
e Cl
-
com os
demais íons durante o processo de absorção (LEVITT, 1980).
A inibição do crescimento das plantas na presença de sais ocorre por duas razões.
Primeiramente devido ao efeito osmótico ou déficit hídrico provocado pelo excesso de sais,
o qual reduz a habilidade de absorção de água, e também, devido ao efeito específico dos
íons causado pelo excesso de íons, que entram no fluxo de transpiração e eventualmente
causam injúria as folhas, reduzindo assim o crescimento (MUNNS, 2005). O efeito
osmótico é causado por sais que estão no exterior da planta, diminuindo o potencial
osmótico do solo, ocasionando em um déficit hídrico no vegetal. O efeito específico dos
íons é causado pelo acúmulo de sais no interior da planta, impossibilitando a
compartimentalização total dos sais nos vacúolos (MUNNS, 1993; WILLADINO e
CAMARA, 2005).
O acúmulo de íons Na
+
na célula pode gerar distúrbios metabólicos que são em parte
causados pela competição com íons K
+
, pois compete com sítios ativos enzimáticos no
citoplasma (BLUMWALD et al., 2000) e nos ribossomos (TESTER e DAVENPORT,
2003). A estimativa da toxidez do íon Na
+
pode ser realizada através do cálculo da relação
Na
+
/K
+
, já que esse cátion inibe a atividade das enzimas dependentes do K
+
(JESCHKE,
1984). Se as plantas conseguirem manter essa relação relativamente baixa no citoplasma, e
transportar os íons Cl
-
e Na
+
para longe das folhas (sítio do metabolismo primário),
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
23
ocorrerá o crescimento da planta sob essa condição de estresse (TESTER e DAVENPORT,
2003).
De acordo com Lovato (1991), a salinidade afeta muitos processos fisiológicos nas
plantas. Entretanto na maioria das espécies, a não ser no caso de extrema salinização, o
sintoma mais aparente é uma diminuição no crescimento. À medida que a concentração de
sal no ambiente aumenta acima de um determinado nível, a taxa de crescimento do vegetal
diminue progressivamente. As espécies lenhosas e algumas plantas herbáceas, entretanto,
apresentam sintomas de injúria foliar caracterizada por queimaduras das folhas, necrose e
perda de folhas devido à toxidez de íons específicos (BEZERRA et al., 2001; TYERMAN e
SKREETT, 1999; CUSHMAN et al., 1990).
De acordo com Shannon e Grieve (1999), o excesso de salinidade no ambiente pode
provocar em algumas plantas, desbalanços nutricionais que causam a diminuição no
crescimento e injúrias. O efeito da salinidade na planta depende de vários fatores, tais como
umidade, temperatura, fertilidade do solo e o estádio de desenvolvimento da planta. De
modo geral, Miranda (2000) afirmou que os maiores danos causados pelo estresse salino
ocorrem durante a germinação, nos estágios iniciais de crescimento e na fase de frutificação
de diversas espécies.
Entretanto, o efeito mais comum da salinidade é sobre o crescimento devido à redução
da área foliar, com conseqüente redução da fotossíntese. A redução do crescimento,
acompanhada pelo desenvolvimento de sintomas de toxidez de sódio e o cloro conforme a
tolerância da espécie, pode ser devida à redução do potencial osmótico gerado pelo NaCl
no meio externo ou acúmulo de sais nos tecidos das plantas (SHANNON e GRIEVE,
1999). Em cana-de-açúcar o NaCl afeta, negativamente, tanto o crescimento como o teor de
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
24
potássio (K
+
), reduzindo a qualidade de campo, tanto em genótipos tolerantes quanto nos
sensíveis, sendo observado maior redução nos sensíveis (ASHRAF et al., 2010)
O efeito da salinidade nas plantas aparece primeiramente no desvio de energia do
processo de crescimento para manter o potencial osmótico. Um dos primeiros processos
dos quais a energia é desviada é a elongação celular, portanto as células dos tecidos foliares
se dividem, mas não se alongam. Adicionalmente, o efeito osmótico vai depender da
sensibilidade da planta a determinado íon específico na água de irrigação ou na solução
(BOHN et al., 1979).
De acordo com Tyerman e Skerrett (1999), em ambientes salinos, o cloreto de sódio
(NaCl) tem se mostrado como sendo o sal predominante, causando a maioria das injúrias
nas plantas. Por exemplo, na presença de elevada concentração externa de sódio, a absorção
de potássio e cálcio pode ser inibida, causando deficiência desses nutrientes e aumento no
teor de sódio nas células das plantas (FERNANDES, 2000).
Complexas interações entre os cátions podem ser a razão destes efeitos. A parte aérea é
geralmente mais sensível aos distúrbios catiônicos que as raízes, e as diferenças são grandes
entre as espécies de plantas na habilidade para prevenir ou tolerar elevadas concentrações
de Na
+
nas folhas (FERNANDES, 2000).
Mecanismo de injúrias causado por sais em plantas envolve o desbalanço nutricional.
Um exemplo é a toxicidade por bicarbonato em muitos ambientes salinos. Isto resulta
primeiramente, na redução da disponibilidade de ferro em alto pH, comuns em solos com
alta concentração de bicarbonato. A necessidade nutricional da planta pode variar com o
tipo de sal presente. Por exemplo, altos níveis de sódio levam a deficiência de cálcio e
magnésio; sais ricos em magnésio podem acarretar deficiência de cálcio. Altos níveis de pH
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
25
podem acentuar a deficiência de micronutrientes (BOHN et al., 1979).
O desequilíbrio nutricional causado pelo efeito da salinidade resultará na interferência
na disponibilidade de nutrientes, competição nos processos de absorção, transporte,
disponibilidade de nutrientes, competição nos processos de absorção ou distribuição na
planta, ou pode ser causado por inativação fisiológica de um determinado nutriente,
resultando em um aumento da necessidade interna por elementos essenciais
(FERNANDES, 2000).
Os íons orgânicos mais importantes para o ajuste osmóticos são o potássio (K
+
), sódio
(Na
+
) e o cloreto (Cl
-
), mas ambe alguns soltos orgânicos são importantes, entre eles os que
mais se associam com a tolerância a salinidade são o açúcar solúvel e a prolina (ABDEL,
2007). Elevadas concentrações de sódio e/ou cloro na solução do solo podem reduzir a
atividade iônica e provocar extremas relações destes elementos com os macronutrientes.
Como resultado, a planta torna-se susceptível a um dano osmótico, como também a
desordens nutricionais que podem levar a uma perda de rendimento e de qualidade
(FERNANDES, 2000).
7. ESTRESSE OXIDATIVO COMO RESPOSTA À SALINIDADE
Uma das alterações bioquímicas que ocorrem quando as plantas estão sujeitas ao
estresse salino é a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS – Reactive Oxygen
Species) (MELONI et al., 2003) ocasionando um estresse oxidativo. Tal fenômeno é
acarretado por um desequilíbrio entre a produção e o seqüestro ROS, tais como o íon
superóxido (O2
.-
), radical hidroxila (OH
.
) e o peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
).
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
26
Porém, durante o metabolismo vegetal normal, as ROS são geradas como produto da
cadeia transportadora de elétrons (MOLLER, 2001), sendo as mitocôndrias e cloroplastos
importantes geradores intracelulares de ROS (MELONI et al., 2003). Em cloroplastos, as
ROS podem ser geradas pela transferência direta da energia de excitação da clorofila a para
produzir um oxigênio singleto, ou pela redução univalente do oxigênio do fotossistema I,
na reação de Mehler (ASADA, 1999).
Níveis intermediários de ROS dão início a uma cascata de morte celular programada,
permitindo que células comprometidas sejam eliminadas (DATT et al., 2003). A indução e
execução da morte celular desencadeiam processos controlados e podem ser modulados por
moléculas sinalizadoras, como o ácido jasmônico, ácido salicílico e etileno (LAM et al.,
1999).
O excesso de ROS pode causar danos oxidativos a lipídios, proteínas e ácidos
nucléicos, devido ao fato de serem altamente reativas e poderem alterar o metabolismo
celular normal (AGARWAL e PANDEY, 2004; AZEVEDO NETO et al., 2005).
As ROS têm sido tradicionalmente, consideradas produtos tóxicos do metabolismo
aeróbico (RENTEL e KNIGHT, 2004). Entretanto, nos últimos anos, tornou-se aparente
que células vegetais produzem níveis endógenos basais de ROS (WOHLGEMUT et al.,
2002). Assim, as ROS estariam atuando como moléculas sinalizadoras, onde um aumento
no acúmulo de H
2
O
2
e alterações no estado redox indicariam para uma possível mudança
do ambiente (FOYER e NOCTOR, 2003).
Para combater o excesso de ROS, as plantas possuem um complexo sistema de defesa, a
fim de minimizar os danos causados pelo acúmulo dessas espécies reativas. Esse sistema de
defesa envolve metabólitos (ascorbato, glutationa, tocoferol, etc) e enzimas antioxidantes
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
27
como a catalase (CAT), peroxidases não específicas (POX), superóxido dismutase (SOD),
glutationa redutase (GSR), dentre outras (BRAY, 2000; FILIPI, 2004; AZEVEDO NETO,
2005). O termo antioxidante pode ser considerado para descrever inúmeros compostos
capazes de dissipar essas espécies reativas, sem que a planta passe por uma destruição
severa (DRÖGE, 2002).
Uma das respostas mais comuns a todos os organismos, submetidos ao estresse, é a
produção e/ou acumulação de solutos compatíveis, entre esses solutos destaca-se a prolina.
O acúmulo desse aminoácido representa um mecanismo compensatório para melhor
sobrevivência das plantas, atuando como um regulador osmótico, um protetor contra a
desnaturação enzimática, reserva de carbono e nitrogênio, estabilizador da síntese de
proteína e como um seqüestrador de ROS.
A peroxidação de lipídeos insaturados presentes em membranas biológicas é o sintoma
mais proeminente da ocorrência de estresses oxidativos em plantas. O malonaldeído
(MDA), como produto da decomposição de ácidos graxos polinsaturados de biomembranas,
apresenta um grande acúmulo em condições de estresse salino (GOSSET et al., 1994). A
estabilidade da membrana celular tem sido amplamente usada para diferenciar cultivares
tolerantes e sensíveis e, em alguns casos, uma alta estabilidade da membrana pode ser
correlacionada à tolerância a estresses abióticos.
8. MECANISMOS DE TOLERÂNCIA DAS PLANTAS AO ESTRESSE SALINO
Plantas tolerantes tem adotado certas estratégias na regulação de íons através das
raízes (Wahid et al., 1999), caules (Wolf et al.,1992 ou folhas (Kumar et al., 1994).
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
28
Mudanças nos processos fisiológicos, através do acúmulo de íons, mostram uma adaptação
causada por uma modificação morfológica da planta (Meinzer et al., 1994).
Devido ao fato de que o NaCl seja o sal mais solúvel e mais distribuído, não é de
surpreender que todas as plantas têm mecanismos que estão envolvidos na regulação da
acumulação e seleção de outros nutrientes comumente presentes em baixas concentrações
como o K
+
e NO
3
-
(MUNNS, 2002).
As plantas variam em sua tolerância a salinidade. E para entender os mecanismos
fisiológicos responsáveis pela tolerância à salinidade é necessário saber se esse crescimento
é limitado por efeitos osmóticos dos sais no solo ou se é da toxidade dos íons no interior da
planta. As plantas tolerantes à salinidade devem ser capazes de ajustar o potencial osmótico
o que envolve tanto à absorção e o acúmulo de íons quanto à síntese de solutos orgânicos. É
possível que o mecanismo mais importante para regular o potencial osmótico seja a
absorção seletiva de íons. Plantas tolerantes possuem capacidade de adquirir nutrientes
essenciais na solução salina em que a concentração de íons não essenciais (tóxicos) é muito
maior que a de íons essenciais. Por exemplo, a concentração de Na
+
em solução de solos
salinos é maior que a de K
+
. Entretanto, a relação Na
+
/K
+
em plantas que crescem neste tipo
de solo é aproximadamente um. Esta alta especificidade para a absorção de K
+
está presente
em várias espécies de plantas (LIMA, 1997).
Em relação à cultura da cana-de-açúcar, considerada moderadamente sensível a
salinidade (FRANCOISE e MAAS, 1999), existe diferenças entre os genótipos e os graus
de tolerância (WAHID et al., 1997). Sob condições de salinas, o crescimento é afetado,
diminuindo com o aumento do sal (FLOWERS, 2004). Uma forma para enfrentar o estresse
é incrementar a tolerância ao sal na cultura, sendo possível através da biossíntese de
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
29
metabólitos secundários, (FRANCA et al., 2001), bem com ativando o sistema de defesa
enzimático a fim de proteção contra o estresse salino. A capacidade de tolerância em cana-
da-açúcar também está associada com a capacidade de exclusão de íons tóxicos das folhas,
em especial as de crescimento ativo e também a compartmentalização na bainha foliar
(GARCIA E MEDINA, 2009).
OBJETIVOS
OBJETIVO GERAL
Avaliar a resposta do sistema antioxidativo enzimático ao aumento gradativo ou repentino
da concentração de cloreto de sódio (NaCl) em meio de cultura nos genótipos R872552 e
RB931011 de cana-de-açúcar.
OBJETIVOS ESPECÍFICOS
Avaliar a correlação entre o teor de Na
+
no tecido vegetal e a atividade de enzimas
do sistema antioxidativo (peroxidases, catalase, polifenoloxidase) em dois genótipos de
cana-de-açúcar (RB872552 e RB931011) submetidos a estresse salino gradativo ou por
choque osmótico.
Avaliar a influência do estresse salino sobre o acúmulo de prolina e a absorção
potássica em dois genótipos (RB872552 e RB931011) de cana-de-açúcar.
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
30
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
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RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
37
Capítulo II
Resposta antioxidativa quanto ao estresse gradativo e súbito
provocado pelo NaCl durante o cultivo in vitro nas variedades
RB872552 e RB931011 de cana-de-açúcar
1
1 – Trabalho desenvolvido no programa de mestrado em agronomia: Melhoramento Genético de plantas da
(PPGMGP/UFRPE) a ser enviado para a revista Scientia Agricola
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
38
ANTIOXIDATIVE RESPONSE ON THE GRADUAL AND SUDDEN IN
VITRO STRESS CAUSED BY NACL IN VARIETIES RB872552-RB931011
OF SUGARCANE
Manuela Maria Cavalcante Granja
*
; Maria Jaislanny Lacerda e Medeiros;
Terezinha R. Camara
UFRPE – R. Dom Manoel de Medeiros, s/n, Dois Irmãos – 52171-900 – Recife, PE –
Brasil. * Autor correspondente <[email protected]>
ABSTRACT: Physiological responses of sugarcane under different salt levels and forms of
application of stress in vitro were evaluated in view of the effect of salinity on antioxidant
system and in sodium and potassium. Two genotypes of sugarcane (RB931011 and
RB872552), were subjected to two concentrations of NaCl (56 mM and 112 mM) in a
gradual and sudden. Were observed at 30 days of experiment, enzyme activities (CAT,
POX, APX, PPO), levels of sodium (Na
+
), potassium (K
+
), soluble protein content and free
proline. The analysis was performed by the program Assistat 7.5 beta. In this study we
observed differences in responses of varieties depending on the condition of induced salt
stress, shock or gradual, rather than depending on the concentration of NaCl in the culture
medium. The stress response is therefore not only conditioned by salt concentration, but by
way of exposure to salt.
Key words: ascorbate peroxidase; catalase, polyphenoloxidase; proline; specific ions;
Saccharum officinarum
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
39
RESPOSTA ANTIOXIDATIVA QUANTO AO ESTRESSE GRADATIVO E
SÚBITO PROVOCADO PELO NACL DURANTE O CULTIVO IN VITRO
NAS VARIEDADES RB872552 E RB931011 DE CANA-DE-AÇÚCAR
RESUMO: Respostas fisiológicas em cana-de-açúcar submetidas a diferentes níveis de sal
e formas de aplicação do estresse in vitro foram avaliados, tendo em vista o efeito da
salinidade no sistema antioxidante e nos teores de Na
+
e K
+
. Dois genótipos de cana-de-
açúcar (RB931011 e RB872552), foram submetidas a duas concentrações de NaCl (56mM
e 112mM) de forma gradativa e repentina. Foram observadas, aos 30 dias de experimento,
atividades enzimáticas (CAT, POX, APX, PPO), teores de sódio (Na
+
),
potássio (K
+
),
concentração de proteínas solúveis e prolina livre. E os dados quantitativos foram
analisados pelo programa estatístico ASSISTAT 7,5 beta. Analisando os resultados, foi
possível observar diferenças nas respostas dos genótipos RB872552 e RB931011 em
função da condição de indução do estresse salino, gradativo ou por choque, mais do que em
função das concentrações de NaCl no meio de cultura. A resposta ao estresse é, portanto,
condicionada não só pela concentração salina do meio de cultivo, mas pela forma que as
células do explante são expostas ao sal.
Palavras-chave: ascorbato peroxidase, catalase, polifenoloxidase, prolina, Saccharum
officinarum
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
40
INTRODUÇÃO
A cana-de-açúcar (Saccharum officinarum) é uma gramínea considerada
moderadamente sensível à salinidade, apresentando diminuição do rendimento de até 50%
em solos com condutividade elétrica de 10,4 dS m
-1
. Embora tradicionalmente cultivada nas
zonas úmidas de Mata e Litoral da região Nordeste, o cultivo da cana-de-açúcar vem se
expandindo para regiões semi-áridas. Devido à má qualidade da água de irrigação, altas
taxas de evaporação e baixa precipitação pluviométrica, aliada ao material de origem
contribuem para o processo de salinização dos solos do semi–árido. Estudos em relação à
tolerância da cana-de-açúcar à salinidade estão se tornando cada vez mais freqüentes na
última década tendo em vista o interesse nessa cultura para a produção de bioenergia e
outros subprodutos. O desenvolvimento e a seleção de genótipos envolvem estudos sobre
os mecanismos de tolerância da cultura e para isso, é necessário o conhecimento dos
mecanismos fisiológicos com os quais as plantas enfrentam o estresse salino. As técnicas de
cultivo in vitro de tecidos vegetais para estudos de fisiologia e bioquímica de plantas em
condições de estresse são importantes ferramentas por permitirem o controle e
homogeneidade das condições de cultivo. Dois genótipos de cana-de-açúcar desenvolvidos
dentro do Programa de Melhoramento Genético da Cana-de-Açúcar da RIDESA, para a
região Nordeste foram avaliados quanto à ação gradativa e repentina do estresse salino,
induzido pelo acréscimo de NaCl ao meio de cultura durante o desenvolvimento in vitro das
plantas. Aspectos bioquímicos dos dois genótipos de cana-de-açúcar foram avaliados com o
intuito de averiguar seu efeito sobre a natureza oxidativa do estresse salino e a capacidade
dos genótipos em manter a sua homeostase iônica e redox.
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
41
MATERIAL E MÉTODOS
Material vegetal e cultivo dos genótipos in vitro
Os experimentos in vitro foram conduzidos no Laboratório de Cultura de Tecidos
Vegetais (LCTV) da UFRPE. Foram utilizados dois genótipos de cana-de-açúcar:
RB931011 e RB872552 desenvolvidos pela RIDESA desenvolvidos através do Programa
de Melhoramento Genético da Cana-de-Açúcar, para a região Nordeste, As plantas dos
genótipos supracitados foram provenientes do cultivo in vitro em Sistema de Imersão
Temporária, da Biofábrica Governador Miguel Arraes, do Centro de Tecnologias
Estratégicas do Nordeste (CETENE).
Condições de cultivo e meio de cultura
As plantas provenientes do sistema de imersão temporária foram cultivadas em
sistema de propagação convencional utilizando o meio nutritivo MS (Murashige & Skoog
1962) na forma líquida e acrescido de sacarose (3%). O pH do meio foi ajustado para 5,8
antes da autoclavagem a 120ºC, 104 kPa, durante 20 minutos, o qual foi distribuído em
frascos com capacidade para 250 mL, onde cada frasco recebeu 20 mL de meio.
Um total de 1200 plantas foram utilizadas, sendo 600 plantas do genótipo RB
931011 e 600 do genótipo RB872552. As plantas, na fase final de enraizamento, oriundas
da Biofábrica foram selecionadas e adaptadas em frascos com meio nutritivo MS líquido
por um mês antes da aplicação dos tratamentos.
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
42
Após o período de adaptação, foram selecionadas cinco plantas e transferidas para
outro frasco contendo cinco mL de meio MS com 8mM e 16mM de NaCl, nos tratamentos
T1 e T2 respectivamente, na condição gradativa. Na condição de choque, os frascos
continham 30 mL do meio MS com as concentrações de 56mM e 112mM, para os
tratamentos T1 e T2, respectivamente. O experimento foi mantido por 35 dias em sala de
crescimento a uma temperatura de 27 ± 2°C com fotoperíodo de 16 horas, intensidade
luminosa de 50 µmol.m
-2
s
-1
fornecida por luz branca fria.
A unidade experimental foi um frasco com cinco plantas e foram mantidas 20
repetições por tratamento. Dois tratamentos salinos foram estabelecidos (T1 = 56 mM de
NaCl; T2 = 112 mM de NaCl) e um tratamento controle (T0) sem adição de NaCl. As
plantas foram individualizadas nos potes contendo os tratamentos iniciais (T0 = controle;
T1 = 8 mM de NaCl e T2 = 16 mM de NaCl). A partir disso, gradativamente a cada cinco
dias, foram adicionados cinco ml de meio, aumentando a concentração salina (T1 em 8
vezes e T2 em 16 vezes), até alcançar as concentrações finais de cada tratamento (T1 = 56
mM e T2 = 112 mM), conforme ilustrado na Tabela 1. Na condição de choque osmótico, os
tratamentos foram as concentrações finais (T0 = controle; T1 = 56 mM e T2 = 112 mM de
NaCl).
Tabela 1. Descrição da adição de NaCl na condição gradativa para o estabelecimento final dos tratamentos.
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
43
A coleta de matéria fresca e seca para a realização das análises enzimáticas e
bioquímicas foram realizadas ao final do experimento (35 dias). As plantas de cada
tratamento foram utilizadas para avaliação da resposta antioxidativa através de ensaios
enzimáticos, determinação dos teores de prolina e teores de Na
+
e K
+
para cálculo da
relação Na
+
/K
+
. Das 20 repetições de cada tratamento, 15 foram utilizadas para
determinação dos teores de prolina e Na
+
e K
+
, as demais foram usadas para análises
enzimáticas e bioquímicas: polifenoloxidase, ascorbato peroxidase, peroxidase, proteínas
totais solúveis, catalase.
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado, com 20 repetições por
tratamento, num fatorial 3x2x2, onde foram analisados os níveis de salinidade, a condição
do estresse (gradativo ou choque) e os dois genótipos.
Análises bioquímicas
Os extratos enzimáticos foram obtidos a partir da maceração de 0,2g de folhas
previamente congeladas em nitrogênio líquido e armazenadas em congelador a – 20°C até o
momento da preparação dos extratos. Foi utilizado tampão fosfato (Fosfato monobásico
100 mM, 50 mg de PVP, pH 6,5). O macerado foi centrifugado a 10.000 rpm a 4ºC por 10
mim e o sobrenadante transferido para novos tubos e conservados a -20ºC para posterior
utilização (Azevedo et al., 1998). Todas as análises enzimáticas foram realizadas por meio
de espectrofotometria.
O método de extração para as análises enzimáticas seguiu a metodologia de
Azevedo et al. (1998). Todas as etapas foram realizadas a frio (em banho de gelo).
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
44
Determinação de proteínas solúveis totais
A quantificação das proteínas foi realizada pela metodologia descrita por Bradford
(Bradford, 1976). Em tubos de ensaio de 15 mL depositou-se 100 L de cada amostra
juntamente com 2 mL do Reagente de Bradford, após agitação, ficou em repouso por 15
min. Após isso, procederam-se as leituras a 595nm. As absorbâncias obtidas foram
comparadas com a curva padrão (solução estoque de albumina bovina - 1 mg/mL) e os
dados expressos em mg de proteínas totais /g de matéria fresca.
Determinação da atividade enzimática
Catalase (E.C. 1.11.1.6)
Para análise desta enzima aqueceu previamente a solução tampão fosfato de
potássio (0,1 M, pH 7,0) por 20 min a 30ºC. A seguir, adicionou-se 1390μL do tampão, 50
μL do extrato e 60 μL de peróxido de hidrogênio (0,5 M) (Beers e Sizer, 1952). Após
agitacão realizaram-se duas leituras a 240 nm, sendo uma no momento inicial (Ti) e a outra
após 1 minuto (Tf). Para cálculo desta enzima utilizou-se a diferenças entre as médias. Uma
unidade de atividade foi definida como a quantidade de enzima que causou o aumento de
0,001 unidade de absorbância por minuto nas condições utilizadas no experimento.
Peroxidase (E.C. 1.11.1.7)
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
45
Para a quantificação desta enzima utilizou-se a metodologia descrita por Fatibello &
Vieira, 2002. Ao tubo de ensaio adicionou-se 1350 μL de guaiacol (0,05 M), 100 μL da
amostra e 50 μL de peróxido de hidrogênio (0,1 M). Após agitação registrou-se os valores
da primeira leitura, sendo a segunda efetuada 1 minuto após.
A determinação da atividade foi feita medindo-se a variação de absorbância a 470
nm da substância formada na reação enzimática (tetraguaiacol). Uma unidade de atividade
foi definida como a quantidade de enzima que causou o aumento de 0,001 unidade de
absorbância por minuto nas condições citadas anteriormente.
Ascorbato Peroxidase (E.C. 1.11.1.1)
Foi utilizada a metodologia descrita por Nakano e Asada (1981). O tampão utilizado
foi o fosfato de potássio (0,05M, 0,001 M EDTA, pH 6,0). Para a leitura, em cubetas de
quartzo, foi adicionado 1335 μL de tampão, 75 μL da amostra, 75 μL de ascorbato (0,01 M)
e 15 μL de peróxido de hidrogênio (0,1 M). Após agitação registrou-se os valores da
primeira leitura, sendo a segunda efetuada após 1 minuto. A determinação da atividade foi
feita medindo-se a variação de absorbância a 290 nm do tempo inicial e após 1 minuto.
Polifenoloxidase (E.C. 1.14.18.1)
Para a determinação dessa enzima foi utilizada a metodologia de Kar & Mishra
(1976). Em cubetas de quartzo adicionou-se 1 ml de pirogalol (50μM) e 0,25 mL da
amostra, após 5 minutos a reação foi interrompida com a adição de 0,25 mL de ácido
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
46
sulfúrico a 5%. Agitou-se a cubeta e rapidamente fez a leitura. O cálculo da atividade
específica foi realizado dividindo-se a atividade total pelo conteúdo protéico.
Prolina livre
Para análise deste iminoácido adicionou-se 1,0 mL do extrato enzimático em tubos
de ensaio de 15 mL rosqueáveis contendo 1,0 mL de ninhidrina ácida e 1,0 mL de ácido
acético glacial concentrado (Bates, 1973). Os tubos foram acondicionados em banho-maria,
a 100°C, por 1 h. A reação foi interrompida colocando-se os tubos em banho-maria a 2°C.
Em seguida, uma alíquota de 2,0 mL de tolueno foi adicionada ao tubo que em seguida foi
agitado. A fase aquosa superior (cromóforo + tolueno) foi recuperada e submetida à leitura
a 520 nm. Os valores obtidos foram comparados com a curva padrão de prolina (0,0115g de
prolina em um volume final de 100 mL com água deionizada) e os resultados expressos em
mg de prolina /g de matéria fresca.
Determinação dos teores de Na
+
e K
+
Os teores de sódio e potássio da parte aérea foram analisados após digestão
nitroperclórica do material seco, por espectrofotometria de chama (Malavolta, 1989). As
amostras de plantas foram secas em estufa com aeração, a 65 5°C, por 24h. Em seguida
as amostras foram trituradas e para as análises foram utilizadas 100mg de matéria seca
moída.
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
47
Análises estatísticas
Os dados quantitativos foram submetidos à análise de variância e as médias
comparadas pelo teste de Tukey, ao nível de 5% de probabilidade, utilizando-se o programa
ASSISTAT Versão 7.5 beta (Silva, 2008).
RESULTADOS E DISCUSSÃO
Catalase (CAT)
A atividade da catalase nas plantas tratadas com 112 mM superou a das plantas dos
demais tratamentos (Figura 1A).
Figura 1. Atividade da CAT e POX em duas variedades de cana-de-açúcar (RB931011 e RB872552)
cultivadas in vitro sob dois níveis de NaCl (T1 = 56 mM e T2 = 112 mM de NaCl). Letras distintas sobre as
colunas indicam diferença estatística ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
O estresse salino, como outros estresses ambientais, ocasiona um desequilíbrio na
produção e seqüestro de espécies reativas de oxigênio (ROS), provocando um aumento
b
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
48
desordenado dessas espécies oxidantes nos tecidos da planta que pode levar a danos severos
para o vegetal (Mittler, 2002). O mecanismo enzimático de detoxificação das ROS pode
ocorrer de forma seqüencial ou simultânea mediante a atividade de diversas enzimas. A
CAT, uma das mais eficientes enzimas que existe (Koolman & Roehm, 2005), está entre as
de maior importância na regulação dos níveis intracelulares de H
2
O
2
(McKersie & Leshem,
1994; Noctor & Foyer, 1998). Uma única molécula de CAT pode converter mais de 100
milhões de moléculas de H
2
O
2
/segundo, produzindo H
2
O e O
2
(Koolman & Roehm, 2005).
Apesar de ser encontrada predominantemente nos peroxissomos onde atua na remoção do
H
2
O
2
formado durante a fotorrespiração (Morita et al., 1994), a CAT é indispensável na
detoxificação das ROS durante o estresse, quando elas são geradas em excesso. Há
evidências de que essa enzima protege a célula dos efeitos do H
2
O
2
produzido fora dos
peroxissomos e que poderia estar envolvida na remoção do peróxido de hidrogênio gerado
em outros compartimentos celulares (Willekens et al., 1997). O estresse oxidativo provoca
a proliferação de peroxissomos, e um adensamento dessa organela pode aumentar a
eficiência no seqüestro das ROS, em especial do H
2
O
2
que se difunde do citosol para os
peroxissomos (Mittler, 2002).
Em relação às variedades e a forma de aplicação do estresse, registrou-se efeito
significativo da interação (Figura 2A). A atividade da catalase na variedade RB872552
aumentou quando o estresse foi imposto de forma não gradativa, superando os valores da
atividade enzimática da variedade RB 931011.
No que se refere à condição de indução do estresse salino, observou-se que as
variedades estudadas responderam de forma distinta. Na variedade RB872552 a adição não
fracionada de NaCl causou um aumento na atividade da CAT. Nessa condição a atividade
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
49
da enzima foi maior do que no estresse gradativo dessa variedade e também superior em
relação a variedade RB931011. A severidade do estresse pode ser determinada tanto pela
intensidade quanto por sua duração. O brusco aumento da concentração de NaCl pode ter
provocado um súbito aumento do teor das ROS e sinalizado para a ativação da CAT para
assegurar a detoxificação do H
2
O
2
, na variedade RB872552. Essa resposta pode representar
o que se conhece por „burst‟ oxidativo, que se caracteriza por um súbito e passageiro
aumento do teor das ROS, sem que se instale o estresse oxidativo (Gaspar et al., 2002).
Diferentes genótipos podem responder de forma diferenciada ao estresse abiótico, podendo
evitar o estresse oxidativo. O aumento da atividade da CAT supõe uma possível adaptação
para superar os danos causados pelo acúmulo de H
2
O
2
produzido durante o metabolismo,
sendo mais observados em genótipos tolerantes ao sal em relação aos genótipos sensíveis
(Sairam et al., 1997). Costa et al (2005) registraram resultados semelhantes com um
aumento da CAT em folhas de genótipo de sorgo tolerante à salinidade, enquanto no
genótipo sensível não houve variação. Resultados similares foram relatados na comparação
de genótipos de arroz (Sudhakar et al., 2001) e trigo (Sairam et al., 2002). Por outro lado,
folhas de feijoeiros submetidos à salinidade exibiram uma diminuição na atividade da CAT
em relação a plantas mantidas sem sal (Cavalcanti et al., 2004).
Peroxidase (POX)
Houve efeito significativo dos tratamentos salinos, das formas de aplicação do
estresse e das variedades sobre a atividade da peroxidase. Os tratamentos salinos causaram
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
50
uma diminuição da atividade da POX em relação ao controle, em ambas as variedades, mas
não houve diferença entre os tratamentos com 56 e 112 mM de NaCl (Figura 1B).
No que se refere à forma de aplicação do estresse, observou-se que a atividade da
POX na variedade RB931011 foi maior quando o estresse foi imposto gradativamente e
superou a da variedade RB872552. Quando a adição de NaCl ao meio de cultura não foi
gradual, a atividade da POX não diferiu entre as variedades. Não se observou efeito da
forma de indução do estresse sobre a variedade RB872552. As peroxidases (POD) são
óxido-redutases capazes de catalisar a transferência do hidrogênio de um doador de
elétrons, diferente do ascorbato, para o H
2
O
2
. Em plantas, a ação constitui uma proteção
antioxidativa, embora em seu ciclo hidroxílico haja geração de ROS (Bor et al., 2003,
Raven, 2003). A adição de NaCl ao meio de cultura coincidiu com uma diminuição na
atividade da POD representada, principalmente, pela queda na atividade da enzima na
variedade RB931011 quando o estresse foi imposto na condição de choque.
Ascorbato peroxidase (APX)
A análise da interação entre variedades e níveis de NaCl demonstrou que a
atividade da ascorbato peroxidase (APX) da variedade RB931011 não variou em função da
presença de NaCl. Por outro lado, na variedade RB872552 a atividade enzimática foi maior
nas plantas submetidas a 112 mM de NaCl do que naquelas dos demais tratamentos, bem
como superou a variedade RB931011 quando submetida ao nível mais alto de NaCl
(Figura 3A).
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
51
O efeito da interação entre as variedades e a condição de indução do estresse salino
foi significativo (Figura 2C). Na variedade RB931011 a atividade da peroxidase do
ascorbato maior quando o aumento da concentração de NaCl foi gradativo. A variedade
RB872552, entretanto, apresentou maior atividade enzimática quando submetida ao choque
osmótico do que quando tratada com aumento gradativo da concentração salina do meio de
cultura.
Figura 2. Atividade da CAT, POX E APX em duas variedades de cana-de-açúcar (RB931011 e RB872552)
cultivadas in vitro em resposta à condição de aplicação (Gradativa ou Choque) do estresse salino. Letras
idênticas, maiúsculas entre variedades e minúsculas entre condição de aplicação do estresse, não diferem
entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
52
Figura 3. Atividade da APX e PPO em duas variedades de cana-de-açúcar (RB931011 e RB872552)
cultivadas in vitro sob duas concentrações de NaCl (T1 = 56 mM e T2 = 112 mM). Letras idênticas,
maiúsculas entre variedades e minúsculas entre os níveis de NaCl, não diferem entre si pelo teste de Tukey a
5% de probabilidade.
Outra enzima que participa ativamente da remoção do H
2
O
2
é a peroxidase do
ascorbato (APX). A atividade da CAT e da APX não é redundante porque elas não
compensam totalmente uma à outra e, atualmente, tem-se concluído que o citosol, com a
atuação da APX no ciclo do ascorbato-glutationa, e os peroxissomos com a CAT, podem
servir de zona tampão para controlar a superprodução de ROS que atingem distintos
compartimentos celulares durante as situações de estresse (Mittler, 2002).
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
53
A atividade da APX aumentou na variedade RB872552 quando as plantas foram
submetidas à concentração de 112 mM de NaCl no meio de cultura e quando o estresse não
foi gradativo. Por outro lado, na variedade RB931011 a atividade da APX foi menor do que
na RB872552 e não variou em função da presença de NaCl no meio de cultura. A atividade
da APX é uma rota chave de tolerância de citrus em resposta ao estresse salino,
comparando a resposta dessa enzima em plantas tolerantes e sensíveis ao sal (Getha-Dahan
et al., 1997). A ativação da APX também foi muito superior em cultivares de trigo
tolerantes ao sal (Mandhania et al., 2006). Encontrada predominantemente no citosol,
mitocôndrias e cloroplastos, a APX utiliza o ascorbato como doador de elétrons para
neutralizar o H
2
O
2
, atuando no ciclo do ascorbato-glutationa (Shigeoka et al., 2002). A
ocorrência desse ciclo em cloroplastos, citosol, mitocôndrias, apoplasto e peroxissomos,
associada à alta afinidade da APX pelo H
2
O
2
conferem a essa enzima um papel crucial no
controle do nível de ROS na célula vegetal (Mittler, 2002).
Polifenoloxidase (PPO)
Observou-se interação significativa entre os efeitos dos níveis de NaCl e a forma de
adição desse sal ao meio de cultura (Figura 4). O aumento gradativo da concentração de
NaCl no meio de cultura não provocou alteração na atividade da PPO, entretanto, no
tratamento com 112 mM de NaCl quando o sal foi adicionado de uma só vez (condição
indutora de choque osmótico), a atividade da PPO aumentou em relação aos outros dois
níveis de salinidade e foi superior também à atividade da PPO das plantas que receberam
com 112 mM de forma gradativa.
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
54
Figura 4. Atividade da PPO de duas variedades de cana-de-açúcar (RB931011 e RB872552) cultivadas in
vitro em resposta à concentração de NaCl (T1 = 56 mM e T2 = 112 mM) e à condição de aplicação
(Gradativa ou Choque) do estresse salino. Letras idênticas, maiúsculas entre as condições de indução do
estresse salino e minúsculas entre os níveis de NaCl, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de
probabilidade.
As variedades responderam de forma distinta à ação do NaCl sobre a atividade da
PPO. Na variedade RB931011 foi observado um incremento da atividade enzimática nas
plantas dos tratamentos com NaCl, em relação àquelas tratadas sem acréscimo de sal. A
variedade RB872552, entretanto, não apresentou diferença entre os tratamentos com NaCl e
o tratamento controle. Por outro lado, nessa variedade as plantas submetidas à concentração
de 56 mM exibiram menor atividade enzimática do que nos tratamentos com 112 mM de
NaCl (Figura 3B). Houve aumento na atividade da PPO e não variou na imposição
gradativa do estresse. Essa condição estressante parece ser bastante agressiva e difere da
aplicação gradativa do estresse, disparando a resposta antioxidativa. A condição de indução
do estresse permitiu distinguir uma maior eficiência defensiva, em especial na variedade
RB931011.
aA
bA
aA
aB
aA
bA
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
55
O aumento na atividade da PPO em tratamentos com NaCl já tinha sido registrado
por Agarwal & Pandey (2004) em folhas de Cassia angustifolia e em plântulas de feijão
(Demir & Koçaliskan, 2001) sob condições salinas. A POD e a PPO são as duas principais
enzimas responsáveis pela oxidação de compostos fenólicos (Sheen & Calvert, 1969) e
podem desempenhar um importante papel de defesa contra o estresse salino (Agarwal &
Pandey, 2004). Os dados obtidos neste trabalho, no qual ambas as variedades (RB931011 e
RB872552) apresentaram aumento da atividade da PPO, sugerem que a defesa enzimática
contra o estresse, com a utilização de compostos fenólicos como redutores do H
2
O
2
se dá
pela ação da PPO e não da POD.
Proteínas solúveis totais
O teor de proteínas solúveis totais caiu nas plantas submetidas ao tratamento com
112 mM de NaCl (Figura 5A). Essa queda no teor protéico foi decorrente, principalmente,
da indução brusca do estresse, uma vez que não se verificou alteração no teor de proteínas
solúveis quando o estresse foi induzido gradativamente (Figura 6A).
Em relação às variedades, na RB931011 o teor de proteínas decresceu com a
presença de NaCl no meio de cultura. Essa tendência também foi observada na variedade
RB872552, mas não de forma significativa. Não se observou diferença entre o teor de
proteínas solúveis das variedades quando estiveram sob tratamento salino (Figura 6B).
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
56
Figura 5. Teor de proteínas solúveis e prolina em duas variedades de cana-de-açúcar (RB931011 e
RB872552) cultivadas in vitro sob dois níveis de NaCl (T1 = 56 mM e T2 = 112 mM de NaCl). Letras
distintas sobre as colunas indicam diferença estatística ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
Figura 6. Teor de proteínas solúveis em duas variedades de cana-de-açúcar (RB931011 e RB872552)
cultivadas in vitro sob duas concentrações de NaCl (T1 = 56 mM e T2 =112 mM) e condições do estresse
salino. Letras idênticas, maiúsculas entre variedades ou condição do estresse e minúsculas entre os níveis de
NaCl, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
As proteínas são freqüentemente degradadas e restabelecidas de forma a assegurar a
reutilização de aminoácidos e adequar o conteúdo protéico para fazer frente às condições
ambientais (Piza et al., 2003). Segundo Levitt (1980), o NaCl provoca diminuição da
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
57
síntese de proteína e aumenta a hidrólise protéica em grande grupo de plantas, sendo a
hidrólise considerada o efeito primário do sal. O decréscimo no conteúdo de proteína pode
refletir retardamento na síntese protéica ou aceleração na sua degradação, levando ao
aumento na quantidade de aminoácidos livres ou à inibição da incorporação destes
aminoácidos nas proteínas.
Prolina
O teor de prolina aumentou apenas nas plantas submetidas ao tratamento com 112
mM de NaCl (Figura 5B), independente da variedade e da condição de indução do estresse.
No presente estudo o teor de prolina aumentou com os níveis de NaCl utilizados,
conferindo maior proteção às variedades de cana-de-açúcar frente ao estresse salino. Porém
não variou em relação à forma do estresse e nem entre variedades. Segundo Cavalcanti et al
2004 o teor de prolina, em folhas de feijão, aumentou progressivamente devido ao choque
osmótico e também foi observado, em arroz, aumento de prolina na cultivar mais sensível
ao sal. O efeito do aumento da concentração de prolina, no estresse salino, tem sido
extensivamente estudado em outras plantas. Em alguns legumes (alfalfa, soja) tem-se
observado que o estresse salino também resultou em uma acumulação desse aminoácido
(Tramontano & Jouve, 1997). Os solutos compatíveis, como a prolina, atuam como
osmoprotetores de macromoléculas e de membranas. Por seu caráter hidrofílico, a prolina
pode substituir a água na superfície das proteínas e agir, não enzimaticamente, como
chaperonas de baixo peso molecular (Timesheff & Arakawa, 1989; Hasegawa et al., 2000).
O acúmulo de prolina, e outros osmólitos, ainda é um tema controverso. As rotas
metabólicas que conduzem à síntese de osmólitos estão conectadas às rotas do metabolismo
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
58
básico. As enzimas requeridas para essas extensões das rotas metabólicas são induzidas
pelo estresse. Greenway & Munns (1980) apontam a favor da visão do osmólito como um
dreno de poder redutor resultante de um distúrbio metabólico. A rota que leva à síntese de
um osmólito particular pode ser mais importante do que a acumulação per se (Bohnert &
Shen, 1999; Nuccio et al., 1999). O acúmulo de prolina é um exemplo. Sob estresse, o
desequilíbrio entre geração e utilização de NADPH pode alterar o estado redox celular. A
síntese de prolina, seguindo a ativação transcricional da P5CS (P5C sintetase) dependente
de NADPH, poderia atuar como uma válvula protetora por meio da qual a regeneração do
NADP
+
proporcionaria o efeito protetor observado (Nelson et al., 1998).
Sódio (Na
+
), Potássio (K
+
) e relação Na
+
/K
+
Figura 7 mostra o aumento (7,8 vezes) no teor de Na
+
e o decréscimo (1,7 vezes) no
de K
+
, com consequente incremento na relação Na
+
/K
+
ocasionados pela adição de NaCl no
meio de cultivo in vitro.
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
59
Figura 7. Concentração dos íons Na
+
e K
+
e relação Na
+
/K
+
em duas variedades de cana-de-açúcar
(RB931011 e RB872552) cultivadas in vitro sob diferentes níveis de NaCl. Letras distintas sobre as colunas
indicam diferença signifivativa pelo teste de Tukey a 5%.
Houve correlação positiva entre a concentração de NaCl no meio de cultivo e o teor
do íon sódio (Na
+
) registrando acúmulo na parte aérea das variedades analisadas.
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
60
Resultados similares em plântula de milho também foram registrados por Azevedo Neto &
Tabosa (2000), e por Cavalcanti et al. (2004) em folhas de feijão. O acúmulo de íons Na
+
na célula pode gerar distúrbios metabólicos que são em parte causados pela competição
com íons K
+
pelos sítios enzimáticos ativos no citoplasma (Blumwald et al., 2000) e nos
ribossomos (Tester e Davenport, 2003).
Na indução não gradual do estresse salino o acúmulo de Na
+
e a relação Na
+
/K
+
foram superiores ao das plantas submetidas ao estresse gradativo (Figura 8) em ambas as
variedades. Por outro lado, a concentração de K
+
foi maior na variedade RB872552 do que
na variedade RB931011 (Figura 9).
Figura 8. Teor de Na
+
e relação Na
+
/K
+
em duas variedades de cana-de-açúcar (RB931011 e RB872552)
cultivadas in vitro sob diferentes formas de indução do estresse salino. Letras distintas sobre as colunas
indicam diferença estatística ao nível de 5% de probabilidade pelo teste de Tukey.
Na forma de indução não gradual houve maior acúmulo desse íon sugerindo que o
aumento brusco na concentração de sal no meio de cultivo favorece o influxo de sódio
pelas raízes, resultando em maior acúmulo de sódio na parte aérea e maior toxidez para a
planta. Em trigo, o aumento repentino na concentração de NaCl causou maior acúmulo de
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
61
Na
+
e redução no crescimento do que na indução de estresse gradativo (Almansouri et al.,
1999). Provavelmente, quantidades anormais de sais atinjam a parte aérea pela via
apoplástica causada pela plasmólise. O transporte extra de sais para a parte aérea pode
exercer um efeito tóxico por um tempo prolongado, uma vez que após atingir a parte aérea
há poucas chances de ser removido (Munns, 2002).
Figura 9. Teor de K
+
em duas variedades de cana-de-açúcar (RB931011 e RB872552) cultivadas in vitro sob
estresse salino. Letras distintas sobre as colunas indicam diferença estatística ao nível de 5% de probabilidade
pelo teste de Tukey.
Os íons potássio desempenham um importante papel na regulação do potencial
osmótico das células vegetais, além de ativar muitas enzimas envolvidas na respiração e na
fotossíntese (Taiz & Zeiger, 2004). No presente estudo, a salinidade reduziu os teores de
potássio nas folhas das variedades analisadas. Resultados semelhantes foram encontrados
em folhas de sorgo (Lacerda et al., 2001). O aumento da concentração de Na
+
no meio
radicular pode inibir o influxo de K
+
evidenciando o efeito competitivo entre esses cátions.
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
62
A seletividade por esses íons está relacionada com a sensibilidade das plantas à salinidade
(Willadino et al., 1999; Azevedo Neto & Tabosa, 2000).
O efeito da interação entre os níveis de NaCl e a condição de indução do estresse foi
significativo para os teores de Na
+
, K
+
e Na
+
/ K
+
. A adição de NaCl ocasionou o acúmulo
de Na
+
em relação ao controle. O acúmulo desse cátion foi superior nas plantas em que a
adição de NaCl se fez de uma só vez (Figura 10A). O efeito sobre o teor de K
+
também foi
mais intenso na indução de choque osmótico. Nesse caso, o teor de K
+
decresceu com o
aumento da salinidade no meio de cultura, enquanto que na adição gradativa de NaCl ao
meio de cultivo a concentração do cátion no tecido das plantas tratadas com sal foi inferior
ao das plantas não estressadas mas não diferiu entre as plantas dos tratamentos salino (56 e
112 mM de NaCl). Plantas submetidas ao tratamento com 100 mM de NaCl aplicado
gradativamente apresentaram um teor de K
+
1,6 vezes inferior em comparação às plantas do
tratamento controle, mas esse teor era maior do que nas planta que foram submetidas à
mesma concentração salina de forma repentina (Figura 10B). As alterações nos teores de
Na
+
e de K
+
nos tecidos das plantas submetidas ao incremento brusco da concentração de
NaCl no meio de cultivo acarretaram um incremento de nove vezes na relação Na
+
/K
+
,
enquanto que na forma não gradual esse aumento foi de 17,8 vezes em comparação ao
controle (Figura 10C).
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
63
Figura 10. Teores de Na
+
, K
+
e Na
+
/K
+
de duas variedades de cana-de-açúcar (RB931011 e RB872552)
cultivadas in vitro em resposta à concentração (T1 = 56 mM e T2 = 112 mM de NaCl) e à condição de
aplicação (Gradativa ou Choque) do estresse salino. Letras idênticas, maiúsculas entre as condições de
indução do estresse salino e minúsculas entre os níveis de NaCl, não diferem entre si pelo teste de Tukey a
5% de probabilidade.
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
64
Na variedade RB872552 a relação Na
+
/K
+
apresentou valor maior do que na
variedade RB931011, havendo diferença a partir do tratamento de 56 mM de NaCl em
relação ao controle (Figura 11).
Figura 11. Relação Na
+
/K
+
em duas variedades de cana-de-açúcar (RB930100 e RB872552) cultivadas in
vitro sob dois tratamentos salinos (T1 = 56 mM e T2 = 112 mM). Letras idênticas, maiúsculas entre
variedades e minúsculas entre níveis de NaCl, não diferem entre si pelo teste de Tukey a 5% de probabilidade.
A indução gradual do estresse não foi tão prejudicial à absorção do K
+
pelas raízes
como a indução do estresse por choque osmótico. Storey & Wyn Jones (1978)
demonstraram que o estresse salino induzido por choque osmótico acarretou maior acúmulo
de Na
+
e maior efluxo de K
+
.
A adição de NaCl na concentração de 100 mM de NaCl, de uma só vez, corresponde
a uma pressão de turgor da ordem de 0,5 MPa. Essa pressão é capaz de plasmolizar as
células em contato com a solução salina. A plasmólise ocorre quando a pressão osmótica do
meio circundante é superior a das células, cujo turgor é da ordem de 0,4 MPa. Com a
plasmólise a membrana separa da parede celular e formam-se grandes espaços entre elas, e
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
65
se cria uma via apoplástica artificial, por meio da qual os sais se movem radialmente
através da raiz (ou das células em contato com o meio salino). Genótipos que tenham uma
elevada taxa de absorção ou não sejam capazes de uma compartimentalização vacuolar
adequada desenvolvem efeitos específicos dos sais e sofrem com o acúmulo de íons tóxicos
que gera um estresse adicional sobre a planta acarretam falha na produção de
fotoassimilados e consequente desenvolvimento de estresse oxidativo (Munns 2002;
Bratosz, 1997).
A relação Na
+
/K
+
é um dos fatores intimamente relacionados ao grau de tolerância à
salinidade. Desta forma, ela pode ser utilizada como índice para toxicidade de sódio, devido
ao fato deste íon inibir a atividade das enzimas que requerem potássio (Greenway &
Munns, 1980). Os autores reportaram, ainda, que relações Na
+
/K
+
iguais ou menores que
0,6 são necessárias para uma ótima eficiência metabólica em não-halófitas. Os dados do
estudo registraram um aumento da relação nas folhas de cana-de-açúcar com o incremento
da salinidade. Garcia et al., (2007) e Azevedo Neto & Tabosa (2000), apresentaram
resultados similares em folhas de milho. O incremento mais significativo na forma de
indução não gradativa resulta na maior concentração de íons Na
+
no meio de cultivo
permitindo sua maior absorção na planta devido ao choque osmótico ocasionado. O
aumento da relação Na
+
/K
+
indica um acréscimo na absorção de sódio, prejudicando a
entrada de outros nutrientes, conduzindo a um desequilíbrio iônico nas plantas (Cusido et
al., 1987). Este desequilíbrio na absorção iônica é resultado, provavelmente, da decorrente
perda da integridade das membranas devido ao acúmulo de Na
+
nas raízes (Cramer et al.,
1985).
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
66
A manutenção da homeostase redox é essencial para evitar que se instale o estresse
oxidativo decorrente da desproporção entre formação e sequestro de espécies reativas de
oxigênio. Na busca pela homeostase a planta pode lançar mão de metabólitos e enzimas,
como discutido neste trabalho.
A duração e a intensidade da ação de um agente estressor, bem como a associação
de mais de um fator definem a severidade do estresse e condicionam a reação das plantas.
Os sensores do estresse, ou seja, os locais de uma célula onde ocorrem alterações no status
redox e geração de ROS são responsáveis pela indução da via de ativação de genes de
resposta ao estresse (Bartosz, 1997; Bray et al., 2000; Gaspar et al., 2002). Essas vias e seus
produtos diferem nas células sob estresse moderado ou severo. Neste trabalho, foi possível
observar diferenças nas respostas das variedades em função da condição de indução do
estresse salino, gradativo ou por choque, mais do que em função das concentrações de NaCl
no meio de cultura. A resposta ao estresse é, portanto, condicionada não só pela
concentração salina, mas pela forma de exposição ao sal.
CONCLUSÃO
As variedades diferiram entre si em função do estresse salino induzido in vitro. O
padrão de resposta de um genótipo ao estresse salino é condicionado não só pela
concentração salina, mas pela condição de exposição ao NaCl – gradativa ou por choque
osmótico. A defesa enzimática é mais responsiva pela ação da enzima ascorbato
peroxidase.
RESPOSTA DO SISTEMA ANTIOXIDATIVO À INDUÇÃO DO ESTRESSE... GRANJA, M.M.C
67
AGRADECIMENTOS
À Coordenação de Aperfeiçoamento Pessoal de Nível Superior (CAPES) pela
concessão da bolsa de mestrado, ao Centro de Tecnologias Estratégicas para o Nordeste
(CETENE) pela concessão do material vegetal e à Universidade Federal Rural de
Pernambuco (UFRPE) pela estrutura física para o desenvolvimento do trabalho.
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