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Universidade de São Paulo
Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz”
Centro de Energia Nuclear na Agricultura
Resposta antioxidativa de aguapé sob estresse por cádmio
Fabrício de Souza Delite
Tese apresentada para obtenção do título de
Doutor em Ecologia Aplicada
Piracicaba
2007
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Fabrício de Souza Delite
Licenciado em Ciências Biológicas
Resposta antioxidativa de aguapé sob estresse por cádmio
Orientador:
Prof. Dr. RICARDO ANTUNES DE AZEVEDO
Tese apresentada para obtenção do título de
Doutor em Ecologia Aplicada
Piracicaba
2007
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Dados
Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
DIVISÃO DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - ESALQ/USP
Delite, Fabrício de Souza
Resposta antioxidativa de aguapé sob estresse por cádmio / Fabrício de Souza
Delite. - - Piracicaba, 2007.
101p. : il.
Tese (Doutorado) - - Escola Superior de Agricultura Luiz de Queiroz, 2007.
Bibliografia.
1. Aminoácidos 2. Cádmio 3. Estresse oxidativo 4. Metais 5. Nitrogênio
6. Plantas aquáticas I. Título
CDD 584.32
“Permitida a cópia total ou parcial deste documento, desde que citada a fonte – O autor”
3
Aos meus pais, Sérgio e Ondina pelo amor e confiança incondicionais mesmo em
meus momentos de maior descrença.
Dedico.
4
AGRADECIMENTOS
A Deus pela coragem, força, paciência e discernimento a mim concedidos nestes cinco
anos de doutorado.
A Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” (ESALQ-USP) e ao Centro de
Energia Nuclear na Agricultura (CENA-USP) pela oportunidade de realização do curso.
Ao CNPq pela bolsa concedida (Processo 141270/2004-7) e a FAPESP pelo apoio
financeiro ao projeto (Processo 2004/08444-6).
Ao Prof. Dr. Ricardo Antunes de Azevedo pela orientação e apoio durante o
desenvolvimento desta tese.
Aos Professores, Dr.Leandro Ferreira de Aguiar, Dra Silvia Maria Guerra Molina e Dr.
Victor Alexandre Vitorello, pelo apoio e fundamental participação neste trabalho de tese.
Ao amigo e irmão Dr. Renato Rodrigues Ferreira, pela sabedoria, competência e amizade
incondicional, sem a qual este trabalho não teria sido concretizado.
Aos meus irmãos Fabiano, “Nenha” e a minha “irmã” Cíntia em razão da sua existência
tornar a minha vida melhor.
Aos meus herdeiros Felipe de Souza Delite e Lucas de Souza Delite, por me ensinarem o
que é o amor incondicional.
A toda a minha família principalmente aos meus pais Sérgio e Ondina por apoiarem as
minhas escolhas e decisões.
Aos meus GRANDES amigos Alejandro, Ariane, Carmezini, Diego, Fabiana, Geórgia,
Guilherme, Juliana, Liliane, Marcelo, Maurício, Thaís, Valteir, Vanderlei e Wander por
permitirem que eu faça parte de suas vidas e serem uma parte muito importante na minha.
Aos amigos de laboratório Priscila, Paula, Gicka, Carolzinha, Rui Alberto, Salete, Rico,
Leo, Carlos, Flávia, Luciana, Cadú, Bertha, Iolanda e Patrícia pela maravilhosa convivência.
Aos Professores da ESALQ e do CENA pelos conhecimentos compartilhados.
A todos os mestres que passaram pela minha vida participaram na construção da pessoa
que me tornei.
5
SUMÁRIO
RESUMO ........................................................................................................................................ 8
ABSTRACT .................................................................................................................................... 9
1 INTRODUÇÃO.......................................................................................................................... 10
2 DESENVOLVIMENTO............................................................................................................. 12
2.1 Revisão de literatura ................................................................................................................ 12
2.1.1 Aguapé.................................................................................................................................. 12
2.1.2 Metais pesados...................................................................................................................... 15
2.1.3 Cádmio ................................................................................................................................. 16
2.1.4 Estresse oxidativo................................................................................................................. 20
2.1.3.1 Sistema antioxidante não enzimático ................................................................................ 23
2.1.4.1 Enzimas antioxidantes....................................................................................................... 26
2.1.4.1.1 Superóxido Desmutase ................................................................................................... 27
2.1.4.1.2 Catalase........................................................................................................................... 28
2.1.4.1.3 Glutationa Redutase........................................................................................................ 28
2.1.4.1.4 Glutationa S-transferase ................................................................................................. 29
2.1.4.1.5 Ascorbato Peroxidase ..................................................................................................... 29
2.1.4.1.6 Guaiacol Peroxidase ....................................................................................................... 30
2.1.5 Metabolismo de nitrogênio................................................................................................... 32
2.1.6 Nitrato redutase..................................................................................................................... 33
2.1.7 Aminoácidos......................................................................................................................... 34
2.2 Material e métodos .................................................................................................................. 36
2.2.1 Material vegetal .................................................................................................................... 36
2.2.2 Condução experimental ........................................................................................................ 36
2.2.3 Extração protéica .................................................................................................................. 36
2.2.4 Determinação de proteína..................................................................................................... 37
2.2.4.1 Método de Bradford........................................................................................................... 37
2.2.4.2 SDS-PAGE........................................................................................................................ 37
2.2.5 Atividade das enzimas antioxidantes.................................................................................... 38
2.2.5.1 Atividade de superóxido dismutase (SOD) ....................................................................... 38
6
2.2.5.1.1 Atividade em PAGE não-desnaturante........................................................................... 38
2.2.5.1.2 Determinação das isoformas de SOD............................................................................. 39
2.2.5.2 Atividade de catalase (CAT) ............................................................................................. 39
2.2.5.2.1 Atividade em espectrofotômetro .................................................................................... 40
2.2.5.2.2 Atividade em PAGE não-desnaturante........................................................................... 40
2.2.5.3 Atividade de glutationa redutase (GR).............................................................................. 40
2.2.5.3.1 Atividade em espectrofotômetro .................................................................................... 40
2.2.5.3.2 Atividade em PAGE não-desnaturante........................................................................... 41
2.2.5.4 Atividade de glutationa-S-transferase (GST) .................................................................... 41
2.2.5.4.1 Atividade em espectrofotômetro .................................................................................... 41
2.2.6 Peroxidação de lipídios......................................................................................................... 41
2.2.7 Extração de compostos nitrogenados para quantificação e análise qualitativa de
aminoácidos................................................................................................................................... 42
2.2.8 Quantificação de compostos nitrogenados ........................................................................... 42
2.2.8.1 Análise quantitativa de aminoácidos................................................................................. 42
2.2.8.2 Análise qualitativa de aminoácidos por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)
....................................................................................................................................................... 43
2.2.8.3 Análise quantitativa de nitrato........................................................................................... 43
2.2.8.4 Determinação de nitrogênio total ...................................................................................... 44
2.2.9 Atividade de nitrato redutase (NR)....................................................................................... 44
2.2.10 Avaliação do conteúdo de clorofila por unidades de SPAD .............................................. 45
2.2.11 Determinação de massa fresca............................................................................................ 45
2.3 Resultados e discussão ............................................................................................................ 47
2.3.1 Atividade de SOD................................................................................................................. 47
2.3.1.1 Determinação da atividade de SOD em PAGE não desnaturante ..................................... 50
2.3.1.2 Determinação de isoformas de SOD ................................................................................. 51
2.3.2 Atividade de catalase............................................................................................................ 51
2.3.2.1 Determinação da atividade da CAT em espectrofotômetro............................................... 54
2.3.2.2 Determinação da atividade de CAT em PAGE não desnaturante ..................................... 55
2.3.3 Atividade de glutationa redutase .......................................................................................... 56
2.3.3.1 Determinação da atividade de GR em PAGE não desnaturante........................................ 58
7
2.3.4 Atividade de GST ................................................................................................................. 59
2.3.4.1 Determinação da atividade da GST em espectrofotômetro............................................... 60
2.3.6 Peroxidação de lipídios......................................................................................................... 60
2.3.1 Determinação de proteína..................................................................................................... 62
2.3.1.1 Método de Bradford........................................................................................................... 64
2.3.1.2 SDS-PAGE........................................................................................................................ 65
2.3.7 Quantificação de compostos nitrogenados ........................................................................... 66
2.3.7.1 Análise quantitativa de aminoácidos................................................................................. 66
2.3.7.2 Análise qualitativa de aminoácidos por cromatografia líquida de alto desempenho (HPLC)
....................................................................................................................................................... 68
2.3.7.3 Análise quantitativa de nitrato........................................................................................... 71
2.3.7.4 Determinação de nitrogênio total ...................................................................................... 73
2.3.8 Atividade de nitrato redutase................................................................................................ 75
2.3.9 Avaliação do conteúdo de clorofila por unidades de SPAD ................................................ 77
2.3.10 Determinação de massa fresca............................................................................................ 78
2.4 Connsiderações finais.............................................................................................................. 80
3 CONCLUSÕES.......................................................................................................................... 81
REFERÊNCIAS ............................................................................................................................ 82
8
Resposta antioxidativa de aguapé sob estresse por cádmio
RESUMO
As plantas de aguapé foram cultivadas em por oito dias em água contendo 0,05 e 0,50
mM de CdCl
2
. A relação entre a toxicidade do cádmio (Cd) e as reações oxidativas foram
estudadas, bem como os efeitos do metal no metabolismo de nitrogênio. A atividade da
superóxido dismutase foi alterada pelo metal, com o desaparecimento de isoformas após oito dias
de tratamento, A atividade da catalase em folhas aumentou durantes os dois primeiros dias
tratamento a após este período foi registrado queda na atividade da enzima, em raízes a atividade
foi detectada somente em plantas expostas ao metal por um dia e apresentou um aumento. A
glutationa redutase de modo geral apresentou uma queda na atividade durante os tratamentos. A
atividade da glutationa S-transferase aumentou com um e quatro dias de tratamento e mostrou
diminuição em plantas coletadas com dois e oito dias. Foram encontrados indícios de maior
peroxidação lipídica em plantas submetidas a maior dose do metal por quatro dias. Com relação
ao metabolismo de nitrogênio as plantas apresentaram uma atividade da enzima nitrato redutase
mais elevada em folhas após oito dias de exposição. A quantidade de nitrato foi encontrada nas
folhas foi menor que a encontrada em raiz exceto em plantas submetidas à dose maior do metal
por oito dias. A concentração de aminoácidos solúveis foi maior nas folhas com destaque para as
folhas das plantas expostas por oito dias a maior concentração de Cd. O metal pesado provocou
queda nos níveis de clorofila das plantas, acentuada após oito dias de exposição. O mesmo foi
notado para o acúmulo de biomassa, plantas submetidas a menor dose de Cd tiveram menor
crescimento enquanto plantas expostas a maior dose praticamente não cresceram ou tiveram
perdas de matéria fresca. O percentual de nitrogênio foi maior em folhas com valores variando
em torno de 4% enquanto em raízes o percentual de nitrogênio se manteve em torno de 2%. De
acordo com os dados podemos concluir que o Cd induziu fitotoxicidade em plantas de aguapé,
interferindo em vários processos metabólicos.
Palavras chaves: metal pesado, aguapé, estresse oxidativo, cádmio, nitrogênio, aminoácidos.
9
Antioxidative responses of water hyacinth under cadmium stress
ABSTRACT
Plants of hyancinth were treated during 8 days in water containing 0,05 and 0,50 mM of
CdCl
2
under natural light in a glasshouse maintained at 25-32ºC with a 16 h photoperiod. The
effect of cadmium on oxidative enzymes and nitrogen metabolism was studied. After 8 days an
alteration on SOD activity was observed when the pattern of bands was analyzed by
electrophoresis. The activity of catalase in the leaves increased after 2 days of exposition to the
metal followed by a decreasing after this period, whereas in the roots the activity was detected
only in the first day being higher in the plants exposed to the metal when compared to the control.
The activity of glutathione reductase decreased during the experiment, whereas the activity of
glutathione S-transferase increased in the 1st and 4
th
days and decreased in the 2
nd
and 8
th
days.
The results suggest a lipidic peroxidation in the plants exposed during four days to the highest
metal concentration. When the nitrogen metabolism was concerned, the activity of nitrate
reductase was shown to be changed as an effect of the metal toxicity, being predominant in the
leaves in the beginning of the experiment, but in the 8
th
day the roots appeared to take over this
function. The highest concentration of nitrate was observed in the roots, except for the plants
exposed to the highest metal concentration, whereas the highest soluble amino acids
concentration was observed in the leaves. Also the effect of the metal was observed on the
chlorophyll content and the biomass accumulation. The highest nitrogen content was observed in
the leaves showing an average of 4%, whilst the roots showed an average of 2%. According to
our results the Cd inducing phytotoxicity on water hyacinth plants interfering in several
physiologic processes.
Key words: Heavy metal, water hyacinth, oxidative stress, cadmium, nitrogen, amino acids.
10
1 INTRODUÇÃO
A poluição ambiental sem dúvida é um dos maiores problemas que se impõe a
humanidade atualmente, sendo agravada por uma série de fatores, como por exemplo, o aumento
populacional registrado nos últimos dois séculos e uma maior demanda por recursos, onde nunca
tantos recursos foram utilizados e de forma tão exaustiva. O aumento da queima de combustíveis
fósseis, intenso processo de industrialização e desmatamentos de grandes áreas para o avanço da
fronteira agrícola, contribuem efetivamente para o agravamento dos problemas ambientais atuais.
Dentre os poluentes de maior impacto ambiental, destacam-se os metais pesados, cada vez mais
presentes em concentrações maiores nos mais diversos ambientes.
Os metais pesados são elementos químicos que naturalmente se apresentam em
concentrações traço na crosta terrestre, porém nas últimas décadas, a quantidade desses
elementos nos mais diversos ambientes vem sendo largamente aumentada, principalmente devido
a atividades antropogênicas. Dentre os metais pesados, o cádmio é um dos mais tóxicos e
prejudiciais ao desenvolvimento dos organismos vegetais. Este metal é utilizado em várias áreas
da indústria, tais como fabricação de pigmentos, produção de eletrônicos ou mesmo atividades
mineradoras, sendo atualmente foco de grande preocupação da comunidade científica.
Como resposta ao crescente número de problemas ambientais, como assoreamento de
rios, perdas de grandes áreas agrícolas por erosão, contaminação de rios e lagos por dejetos
industriais entre outros, nas últimas décadas as causas ambientais têm sido encaradas com maior
seriedade. Estudos foram conduzidos no intuito de descobrir soluções para as delicadas questões
envolvendo os desequilíbrios do ambiente e novas tecnologias surgiram para a recuperação de
ambientes degradados, dentre elas, destaca-se a biorremediação, técnica caracterizada pelo uso de
organismos vivos para a retirada, imobilização, ou inativação de poluentes, quando nesses
processos são utilizados organismos vegetais denominamos fitorremediação. Várias espécies
vegetais vêm sendo testadas como potenciais fitorremediadoras, dentre elas o aguapé, que possui
uma série de características particulares que fazem deste vegetal, um organismo promissor para a
fitorremediação, principalmente devido ao potencial de geração de biomassa.
Embora seja uma espécie bastante utilizada na fitorremediação pouco se sabe sobre os
mecanismos que possibilitam ao aguapé crescer em ambientes poluídos ou mesmo justifiquem
sua elevada taxa reprodutiva e de geração de biomassa.
11
Diante deste cenário, enfocaram-se como objetivos deste trabalho, o estudo do sistema
antioxidante enzimático do aguapé em resposta a exposição ao cádmio, bem como a relação com
a assimilação de nitrogênio, aminoácidos e proteínas.
12
2 DESENVOLVIMENTO
2.1 Revisão de literatura
2.1.1 Aguapé
O aguapé (Eichornia crassipes) pertence à família das Pontederiaceae, formada por quatro
gêneros: Pontideria, Eichornia, Heteranthera e Monochoria, com aproximadamente 30 espécies,
todas herbáceas com representantes anuais e outros perenes, as plantas variam em tamanho de
uns poucos centímetros a mais de um metro de altura, possui folhas grossas e penadas com cerca
de 20 cm de comprimento e entre 5 e 15 cm de largura, com um pecíolo de diâmetro avantajado
devido o parênquima esponjoso, são originárias do Brasil (Figura 1) (JOLY, 2002).
Figura 1 - Planta de aguapé em tanque de triagem
13
A planta apresenta heretofolia, podendo apresentar folhas diferentes em virtude do
ambiente em que se encontra, pecíolos espessos e um comprimento não maior que 20 cm em
águas profundas pra facilitar a flutuação, ou na diminuição do nível de água, as folhas podem se
alongar até mais de um metro de comprimento e os pecíolos se alongarem e diminuírem em
diâmetro visto que as plantas em águas rasas se apóiam no fundo e não necessitam mais flutuar.
Essa elongação dos pecíolos é utilizada para melhorar a captação de luz em populações com
grande número de indivíduos (JOLY, 2002).
As raízes do aguapé são escuras e ramificadas, saindo da base da planta e formando um
ambiente favorável à reprodução de pequenos peixes ou insetos, muitas vezes fornecendo
proteção e/ou alimento. A inflorescência é uma espiga alongada com flores variando de azul claro
ao violeta, ou ainda ocasionalmente brancas, cada flor possui seis pétalas com a base formando
um curto tubo, depois de fecundadas o escape floral se alonga em direção a água e o
desenvolvimento do fruto se dará dentro de água (JOLY, 2002). O fruto é uma cápsula com três
celas contendo muitas sementes diminutas com alto poder germinativo, que podem se manter
viáveis por mais de seis anos (LEE, 1979). Possui uma produção biológica primária das mais
altas encontradas na natureza, com um grande potencial reprodutivo e de geração de biomassa,
podendo produzir até 88 ton de massa seca/ha/ano podendo duplicar o número de plantas em uma
semana sob condições ideais de temperatura e umidade (TAG EL-DIN, 1992).
O aguapé é listado como uma das plantas aquáticas que mais causam problemas no
mundo, pois forma uma densa cobertura em lagos e rios, interferindo com a navegação,
recreação, irrigação e geração de energia em hidroelétricas, devido à dificuldade de manejo,
aliada a grande capacidade reprodutiva e a ausências de inimigos naturais nos locais onde foi
introduzida ao redor do mundo (INVASIVE SPECIES SPECIALISTS GROUP, 2007).
Este vegetal tem uma grande capacidade de absorção de poluentes do ambiente,
acumulando-os em concentrações muito maiores que as encontradas no ambiente onde se
desenvolve (GUNNARSSON; PETRERSEN, 2007), conhecido também por possuir uma boa
relação C/N, onde a porcentagem de nitrogênio pode chegar a 3,2 % da massa seca, desta forma a
planta pode ser utilizada para a recuperação de ambientes poluídos retirando o excesso de
nitrogênio e fósforo (JAYAWEERA; KASTURIARACHCHI, 2004), ambos nutrientes que
favorecem a eutrofização quando encontrados em quantidades elevadas, como também pode ser
utilizado para fins de adubação devolvendo ao ambiente o nutriente absorvido de forma gradual
14
minimizando o impacto ambiental. O sistema radicular do aguapé tem sido usado para remover o
arsênico de água em paises em desenvolvimento, onde a concentração desse elemento tem
aumentado visivelmente (AL RMALLI et al., 2005), a técnica tem se mostrado eficaz com
redução total da concentração de arsênico na água a custo praticamente zero, mas a eficiência
depende de uma série de fatores, tais como, quantidade de plantas utilizadas e concentração de
arsênico na água, bem como o tempo de exposição e a disponibilidade de luz e oxigênio
(MISBAHUNDDIN; FARIDUDDIN, 2002).
Outro ponto importante a ser destacado é a efetividade do aguapé na remoção de metais
pesados de ambientes aquáticos poluídos. Essa capacidade está ligada à concentração do metal no
meio e também aos níveis de macronutrientes disponíveis para a planta, sendo que a eficiência da
remoção é maior em concentrações baixas do metal e altas concentrações de macronutrientes
(INGOLE; BHOLE, 2003), em elevadas concentrações de metais a taxa de crescimento é
reduzida, prejudicando desta forma a remoção do metal (HASAN et al., 2003). Uma vez
absorvidos esses metais seguem dois possíveis destinos, podem permanecer na raiz ou translocar-
se para as folhas, os níveis de metais encontrados nas raízes das plantas de aguapé chegam a ser
de 3 a 15 vezes maior do que os encontrados nas folhas (LIAO; CHANG, 2004).
Além dos metais pesados o aguapé pode também ser usado para a extração de sais de
recursos hídricos, em áreas agrícolas é comum o processo de correção e adubação do solo a cada
plantio, parte deste adubo é lixiviado para os corpos de água causando prejuízo aos produtores e
danos ao ambiente, uma vez que tais nutrientes contribuem para a eutrofização, desta forma o
aguapé tem sido usado em paises pobres como a Nigéria para fazer a recuperação destes
nutrientes, principalmente o potássio (ADEOYE et al., 2001), que é devolvido ao solo na forma
de cinzas das plantas, este processo se destaca pelo baixíssimo custo e pela grande quantidade de
potássio recuperada. Em outras partes do mundo outros nutrientes como o cálcio e o magnésio
têm sido recuperados através do uso do aguapé, porém a eficiência na recuperação destes
nutrientes depende do pH da solução em que as plantas se desenvolvem, apresentando eficiência
máxima em pH básico (ZHOU et al., 2007).
Os pesticidas fosforados são altamente tóxicos e com um tempo de permanência no
ambiente muito longo, além disso, a retirada destes pesticidas é dispendiosa, deste modo, a
utilização do aguapé para a remoção deste poluente se mostra muito promissora devido ao baixo
custo e a eficiência do processo. Xia e Ma em 2006, mostraram que em ambientes poluídos 69%
15
da retirada e posterior fitodegradação dos resíduos foi realizada por plantas aguapé, enquanto
bactérias contribuíram com apenas 12% da remoção, os níveis do poluente foram maiores nas
raízes das plantas testadas, quando comparados com as folhas, sugerindo que a fitodegradação
seria a principal maneira da planta se livrar do poluente.
Kumar em 2005 realizou estudos visando à utilização do aguapé para produção de
biocombustível. As plantas utilizadas em técnicas de fitorremediação têm um rendimento maior
na produção de biocombustível e isso pode ser explicado pela alteração nas taxas de carbono e
nitrogênio nas plantas expostas aos poluentes (GUNNARSSON; PETRERSEN, 2007), uma das
vantagens da técnica é a simplicidade da tecnologia envolvida, podendo ser facilmente instalada
em propriedades rurais e favorecendo um grupo de pessoas que tem um acesso limitado a fontes
de energia (KUMAR, 2005).
2.1.2 Metais pesados
O termo “metal pesado” é aplicado a um grupo heterogêneo de elementos, incluindo
metais, semimetais e não metais (MELO et al., 1997), que possuem número atômico maior que
20 ou peso específico maior que 5 g.cm
-3
(MALAVOLTA, 1994). Alguns deles são nutrientes
essenciais aos vegetais, como o Cu, Fe, Mn, Ni, Mo e Zn, outros são benéficos ao crescimento
das plantas, como o Co, e outros não são essenciais ou não apresentam função, caso do Al, Cd,
Cr, Se, Hg e Pb (MELO et al., 1997). São também conhecidos por “elementos traços” ou ainda
“metais traços”, por serem naturalmente encontrados em concentrações de poucas partes por
milhão (MATTIAZZO-PREZOTTO, 1994).
Alguns desses elementos passaram a ser essenciais devido às suas propriedades químicas
e principalmente a sua atividade redox sob condições fisiológicas, porém essa mesma
propriedade que tornou tais metais indispensáveis à vida das plantas os torna tóxicos quando
encontrados em altas concentrações dentro dos organismos (CLEMENS, 2006).
A atividade redox destes íons metálicos os leva a participar das reações de Haber-Weiss e
de Fenton, gerando uma grande quantidade de radicais hidroxilas, que pode causar grandes
distúrbios celulares (CLEMENS, 2006). As propriedades químicas não foram unicamente
decisivas para a determinação dos íons metálicos como essenciais, sendo que sua abundância na
crosta terrestre e disponibilidade para as plantas, também foram fatores decisivos para o processo.
Como exemplo, podemos citar o caso do Cd, pertencente à mesma família do Zn, com
16
propriedades similares, porém o Cd é muito mais escasso que o elemento mais leve.
Similarmente, o Se que pertence ao mesmo grupo do S, também se apresenta em concentrações
baixas. E ambos os casos, notamos que, evolutivamente, foram selecionados os íons mais
abundantes, mesmo pertencentes à mesma família da tabela periódica e compartilharem de
características similares (CLEMENS, 2006).
A disponibilidade dos metais pesados sempre foi pequena na superfície, porém,
atualmente a concentração destes íons metálicos vem aumentando muito rapidamente, cada vez
mais encontramos ecossistemas poluídos por essas substâncias, onde a grande fonte de produção
são os processos industriais, atividades agrícolas e mineradoras (GHOSHROY et al., 1998).
A poluição ambiental é o grande problema resultante da atividade antrópica e tem se
tornado cada vez maior com o crescente aumento da população humana no globo acompanhada
do aumento das atividades produtivas, sejam elas agrícolas, industriais ou mineradoras, visando
suprir uma demanda sempre crescente por recursos.
Desta forma os organismos encontram-se muito expostos a esse tipo de poluente, uma vez
dentro da planta esses íons metálicos têm efeitos nocivos para as células, os sintomas da
fitotoxicidade por metal pesado têm sido estudados em vários sistemas de plantas e sob varias
concentrações de metais (DI TOPPI; GABRIELLI, 1999).
Entretanto as plantas apresentam diversos mecanismos para responder, combater e superar
as adversidades ambientais como a presença de metais pesados, reduzindo sua fitotoxicidade
devido a mecanismos que variam desde adaptações, limitação da absorção, desintoxicação ou até
mesmo a resistência genética (GRATÃO et al., 2005).
2.1.3 Cádmio
O Cd, metal da família IIB da tabela periódica, denominado um metal de transição, junto
ao Cd na família se encontram o Zn e o Hg, com número atômico 48 e uma massa atômica de
112,411 u.m.a., é considerado um metal pesado. Naturalmente o Cd é encontrado em pequenas
concentrações na superfície da Terra, porém atualmente com o crescente aumento da atividade
humana, cada vez mais esse elemento é liberado no ambiente e sua concentração tem aumentado
tanto no solo quanto em corpos de água. O aumento dessa concentração se deve principalmente a
fundição de ferro, mineração de zinco, fertilizantes fosfatados e nas atividades industriais onde
17
são necessárias resistência ao calor, frio ou condições de luminosidade intensa (YANG et al.,
2002).
Atualmente, os níveis de cádmio no ambiente podem ser obtidos através da International
Cadmium Association (ICA) (Tabela 1). Segundo a ICA, aproximadamente três quartos de todo o
Cd produzido é utilizado na fabricação de baterias recarregavéis do tipo Ni/Cd e com o crescente
consumo de dispositivos que empregam esse tipo de bateria, a produção tem sido aumentada.
Mais recentemente alguns fabricantes passaram a adotar outro tipo de bateria produzidas com íon
de lítio, mas nem todos os dispositivos são compativeis com esse novo tipo de bateria, com isso a
demanda por baterias tipo Ni/Cd continua grande. O outro quarto da produção mundial do metal,
utilizam-no nos mais variados processos industriais, alguns sais de Cd são usados como
pigmentos na industria de cerâmicas, como por exemplo o sulfato de cádmio utilizado na
obtenção do pigmento amarelo. O Cd devido a seu baixo coeficiente de fricção é muito resistente
a fadiga sendo desta forma utilizado na confecção de almofadas de cadeiras. Compostos
fluorescentes a base de Cd são utilizados na fabricação de televisores e com este aumento da
concentração aumenta também sua disponibilidade para os organismos em geral (ICA, 2007).
No ambiente o Cd pode ser encontrado na atmosfera, na terra e na água, sob varias formas
químicas, sendo que a maioria delas permanece no ambiente por longos períodos, o elemento
também pode ser encontrado como Cd metálico que não se degrada na natureza, as partículas de
Cd suspensas na atmosfera podem retornar ao solo na forma de poeira, dissolvido na umidade
atmosférica e quando esta se precipita na forma de chuva ou neve, um composto de Cd que venha
a entrar na água pode permanecer nela por tempo indeterminado(Agency for Toxic Substances
and Disease Registry – ATSDR, 1999).
Tabela 1 - Níveis naturais do cádmio no meio ambiente
Atmosfera 0,1 a 5 ng/m
3
Crosta terrestre 0,1 a 0,5 mg/g
Sedimento marinho ~1 mg/g
Água do mar ~ 0,1 mg/L
Água doce ~1µg/L
Fonte: International Cadmium Association (ICA), Bélgica e CETESB, Brasil, 2007
18
Nas plantas o metal é preferencialmente absorvido através do sistema radicular e essa
absorção é influenciada por fatores como, concentração no solo e biodisponibilidade, sendo que
esta última é modulada pela presença de matéria orgânica, pH, temperatura, potencial redox, ou
pela concentração de outros elementos (DI TOPPI; GABBRIELLI, 1999). Uma vez dentro da
raiz o Cd pode se dirigir ao xilema via apoplasto ou mesmo via simplasto (Salt et al., 1995).
Normamente a maior parte do metal absorvido é retido na raiz e somente uma pequena porção é
translocada para a parte superior da planta (VITÓRIA et al., 2001).
O Cd
2+
é um dos íons mais vastamente estudado, quando usado em altas concentrações
provoca efeitos danosos em plantas, entre eles destaca-se a diminuição da taxa fotossintética,
devido à inibição da produção de clorofila, induzindo uma perturbação no balanço hídrico da
planta, uma vez que a abertura e o fechamento dos estômatos são afetados. Altas concentrações
de Cd
2+
afetam também os fotossistemas do aparato fotossintético (SCHÜTZENDÜBEL;
POLLE, 2002; GRATÃO et al., 2005; GOMES-JUNIOR et al., 2006).
O estresse oxidativo tem sido apontado como um dos efeitos primários da exposição ao
Cd, mesmo este elemento não tendo potencial redox, uma vez que em meio fisiológico só se
apresenta com Nox +2, sendo desta forma incapaz de participar diretamente das reações de
Fenton e Haber-Weiss, no entanto esses sintomas de estresse oxidativo bem como a peroxidação
lipídica, são conseqüências da diminuição dos níveis de glutationa utilizadas para a produção de
fitoquelatinas na tentativa de inativar os íons de Cd (SCHÜTZENDÜBEL; POLLE 2002).
Outros possíveis alvos da ação do Cd seriam as moléculas dependentes e as ligadas a
zinco, devido às similaridades químicas entre os dois íons Cd
2+
e Zn
2+
, o Cd pode substituir o Zn
e interferir em processos dependentes do Zn (CLEMENS, 2006). O mesmo pode ocorrer com
moléculas dependentes ou ligadas a íons de Ca
2+
, podendo, desta forma, alterar a cascata de
sinalização celular (REA et al., 2004).
Efeitos genéticos e citotóxicos foram notados em plantas expostas ao metal, onde o Cd
inibiu a divisão celular, promoveu alterações nos cromossomos (aberrações cromossômicas) e
induziu picnose nas células das raízes (DAS; SAMANTARAY; ROUT, 1997). O Cd ainda pode
provocar danos à transpiração, translocação através do floema, respiração, relações hídricas,
reprodução, mudanças em certas organelas, rompimento estrutural e funcional das membranas
celulares e danos às raízes (ROSSI et al., 1998). Também, o aparecimento de uma coloração
marrom avermelhada nas margens das folhas e nervuras (SCHICKLER; CASPI, 1999) e clorose
foliar, apontadas como um dos sintomas mais característicos de plantas intoxicadas por este metal
19
(DAS; SAMANTARAY; ROUT, 1997), devido ao fato do Cd facilmente interagir e competir
com o Fe (SIEDLECKA; KRUPA, 1999), Ni (BACCOUCH et al., 1998) e Cu (MOCQUOT et
al., 1996) por sítios de absorção na membrana plasmática (NASCIMENTO; PEREIRA, 1997),
suprimindo a absorção desses elementos e induzindo uma deficiência de Fe neste órgão,
favorecendo uma senescência acelerada das folhas (SIEDLECKA; KRUPA, 1999).
O Cd reduz o crescimento radicular, bem como o crescimento da parte aérea
(SCHÜTZENDÜBEL et al., 2001; LIU et al., 2007), promovendo também a desestruturação dos
grana nos cloroplastos e a redução da sintese de clorofila (SIEDLECKA; KRUPA, 1999;
SOMASSHEKARAIAH et al., 1992). Este metal interfere também em uma série de processos
enzimáticos, como por exemplo no ciclo de Calvim (SANDALIO et al., 2001). O metabolismo de
nitrogênio também é afetado pelo metal (BOUSSAMA et al., 1999) assim como o metabolismo
de açúcar (VERMA; DUBEY, 2001), ou mesmo a assimilação de enxofre (LEE; LEUSTEK,
1999).
Ao Cd também é atribuido o papel de interferência na absorção e distribuição dos macro e
micronutrientes (SANDALIO et al., 2001), balanço hormonal (POSCHENRIEDER; BARCELÓ,
1999). O verdadeiro papel do Cd ainda não está muito definido, alguns estudos demostram que
concentrações acima de 1 µM de Cd inibe o crescimento celular como a sintese de DNA, em
contrapartida concentrações muito baixas do metal podem estimular o crescimento de células de
cana-de açúcar (FORNAZIER et al., 2002a) e do fungo Aspergillus nidulans (GUELFI et al.,
2003).
Nos humanos e em outros animais de modo geral, o Cd é absorvido pela ingestão de água
ou comida contaminada, por possuir uma meia vida relatimamente alta possuindo alguns isótopos
muito estáveis, o Cd tem a capacidade de se bioacumular e se concentrar em níveis mais altos da
cadeia trófica, o metal não apresenta função fisiológica, mas pode interfirir nas funções
biológicas de outros metais bivalentes essenciais para a manutenção do funcionamento do
organismo, como o Ca
2+
por exemplo, e como permanece no organismo por muitos anos é
considerado altamente tóxico (KLASSEN, 2001), dentre os danos causados aos humanos
destacam-se danos aos rins, ao fígado e aos óssos, alterações no sistema cardiovascular
(ZALUPS; KOROPATNICK, 2000), o metal também é classificado como cancerígeno por iduzir
a formação de tumor em ratos e considerado mutagênico, por interferir no processo de reparo da
síntese de DNA (LIU et al, 2007).
20
2.1.4 Estresse oxidativo
O surgimento de organismos capazes de realizar fotossíntese levou a um acúmulo de O
2
na atmosfera, este oxigênio passou então a ser utilizado por indivíduos aeróbios como aceptor
final de elétrons na obtenção de energia dos alimentos adicionando uma vantagem evolucionária
a estes indivíduos, já que através do metabolismo aeróbico uma molécula de glicose produz 28
moléculas de ATP enquanto o processo anaeróbico produz apenas oito moléculas (FOYER;
NOCTOR, 2000).
Ao mesmo tempo que a utilização do oxigênio trouxe beneficios as espécies aeróbias,
inconvenientes surgiram como resultado do metabolismos aeróbico, como por exemplo o
surgimento das espécies ativas de oxigênio (EAO). No estado molecular o O
2
é pouco reativo,
porém o metabolismo aeróbico produz inevitavelmente EAOs como o superóxido (O
2
•-
) dotado
de baixa capacidade oxidativa, peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) capaz de romper a membrana
nuclear e causar danos ao DNA, radicais hidroxil (
•
OH) possuindo uma baixa capacidade de
difusão, porém é a mais reativa das EAOs provocando lesões em uma serie de moleculas em
meio celular e oxigênio “singlet” (O
2
1
) (SCANDALIOS, 1993). Em plantas as EAOs podem se
produzidas em reações ocorridas na mitocôndria, cloroplastos e peroxissomos (FOYER;
NOCTOR, 2000) em todos os orgãos incluindo nódulos fixadores de nitrogênio, muitas vezes as
EAOs são utilizadas como armas contra patógenos invasores (MOLLER, 2001).
O radical superóxido é formado geralmente através do direcionamento errôneo de elétrons
em cadeias transportadoras(MOLLER, 2001), duas destas cadeias são notórias produtoras de
EAOs, tanto na cadeia transportadora presente nas mitocondrias quanto na cadeia presente nos
cloroplastos ocorre a formação de radicais superóxidos, destacando se ainda a formação de
oxigênio “singlet” nos cloroplastos na transferência da energia de excitação da clorofila para o
oxigênio (BOWLER et al., 1992), os cloroplastos são alvos da toxidez das EAOs uma vez que o
radical superóxido produzido pode ser convertido a H
2
O
2
nos tilacóides (MEHLER, 1951).
Uma mitocondria ativa gera uma grande quantidade de EAOs, estima-se que em uma
célula vegetal 1% do consumo de oxigênio tenha esse fim, em células de mamíferos as
mitocondrias são as fontes primarias de EAOs e sugere-se também que o mesmo ocorre em
células vegetais não fotossintetizantes (MOLLER, 2001). Nas cadeias transportadoras tanto
respiratória quanto fotossintética as casacatas redox não somente fornecem energia ao
metabolismo como também geram sinais redox (FOYER; NOCTOR, 2003; APEL; HIRT, 2004).
21
O H
2
O
2
é produzido através das reações de fotorrespiração dos peroxissomos ou ainda
pode ser produto da β-oxidação associada a micropartículas de ácidos gráxos (SCANDALIOS,
1993). Os peroxissomos são organelas com metabolismo essencialmente oxidativo e assim como
os cloroplastos e as mitocôndrias produzem O
2
•-
e são encontrados preferencialmente em regiões
da célula com grande produção deste radical, como as membranas peroximais dependentes de
NAD(P)H, nestas membranas, três polipeptídeos integrais com massas moleculares de 18, 29 e
32 kDa, de uma pequena cadeia transportadora de elétrons, são envolvidas na geração de radicais
O
2
•-
e sob certas condições de estresse ao vegetal, a liberação de O
2
•-
gerado pela membrana
peroximal pode ser aumentada, produzindo estresse oxidativo (DEL RIO et al., 2002). Também é
atribuido aos peroxissomos o papel de conectar importantes vias metabólicas tanto de síntese
quanto oxidativas e compartimentalizar passos letais do metabolismo como produção de EAOs e
glioxilato, desta forma eles evitam o envenamento celular ou ainda a reciclagem desnecessária de
certos compostos (IGAMBERDIEV; LEA, 2002).
Todas as EAOs são extremamente reativas e citotóxicas, o
•
OH e o O
2
1
são tão reativos
que suas produções devem ser minimizadas rapidamente, o H
2
O
2
quando em alta concentração na
celula inibe a fixação de carbono, uma vez que muitas enzimas do ciclo de Calvin são
extremamente sensíveis ao H
2
O
2
(SCANDALIOS, 1993). Quando comparado aos demais
radicais o o O
2
•-
e o H
2
O
2
são relativamente pouco reativos, mas quando em presença de ions
metálicos como o Fe, por exemplo, ativam uma sequência de reações que levam a formação de
•
OH na reação de Haber-Weiss (BOWLER et al., 1992), o
•
OH sim tem um grande potencial
oxidativo atacando rapidamente e sem discriminação qualquer macromolécula levando a sérios
danos celulares (SCANDALIOS, 1993), causando peroxidação lipídica, desnaturação protéica, e
mutação no DNA (BOWLER et al., 1992), podendo levar a disfunções metabólicas irreparáveis e
morte celular (SCANDALIOS, 1993). O O
2
1
, formado a partir da transferencia da energia de
ativação para o O
2
, também produz efeitos deletérios (BOWLER et al., 1992). Em vegetais
superiores, esta energia é prontamente obtida via quanta luminoso por moléculas de transferência
como a clorofila (SCANDALIOS, 1993). O O
2
1
pode transferir esta energia de excitação para
outras moléculas biológicas ou reagir com elas, formando endoperóxidos ou hidroperóxidos
(BOWLER et al., 1992).
A produção continua de EAOs pelo metabolismo aeróbico levou os organismos a
desenvolverem uma série de mecanismos para combater a o potencial oxidativo das EAOs, os
22
antioxidantes agem mantendo baixo o nível celular destes compostos oxidantes impedindo assim
que danos sejam causados na célula, o desequilibrio entre os compostos oxidantes e antioxidantes
geram o estresse oxidativo (SIES, 1993) e esse desequilibrio pode ser gerado como resposta dos
organismos a estressores do ambiente, que pertubam a homeostase das células e aumentam a
produção de EAOs de tal forma que o aparato antioxidante não é suficiente para a manutenção
dos níveis aceitáveis, surgindo então os danos causados pelo estresse oxidativo.
São inúmeros os fatores que podem contribuir para o aumento dos níveis de EAOs,
radiação UV, luminosidade intensa, hebicidas, ataque de patógenos, certas injúrias, hiperoxia,
ozônio, flutuações na temperatura (SCANDALIOS, 1994), seca, concentração elevada de sais,
extremos de temperatura, poluição do ar (MALLICK; MOHN, 2000). Os metais são indutores
conhecidos da produção de EAOs podendo causar em certas circunstâncias estresse oxidativo, o
aumento deste estresse na célula é proporcional ao nível das substancias reativas ao ácido
tiubarbitúrico (TBARS), substâncias essas que indicam a ocorrência de peroxidação lipídica
(BHATTACHARJEE, 1998).
Associado ao estresse oxidativo uma série de efeitos metabólicos são notados nos
organismos, o estresse causado pelo Cd, por exemplo, leva ao fechamento dos estômatos,
interferindo desta forma na assimilação de CO
2
(SANDALIO, 2001), em células
fotossintetizantes ocorre fotoinibição e fotoxidação em cloroplastos que tem a produção de EAOs
aumentada por exposição a alta luminosidade (SCANDALIOS, 1993), o aumento da
concentração de EAOs provocado por ação de patógenos gera sinais que desencadeiam uma serie
de respostas defensivas como morte celular, expressão gênica regulada pela oxirredução e a ação
de kinases e fosfatases na tradução de sinais redox (VRANOVÁ et al., 2002).
Dentre os danos caudados pelas EAOs a peroxidação lipídica é sem dúvida um dos mais
graves, as EAOs reagem com os ácidos graxos insaturados das membranas celulares
(SCANDALIOS, 1993). Baccouch (2001) relata que este seria o primeiro efeito da toxidez
causada pela exposição a metais pesados, enfatizando seu aparecimento bem antes do surgimento
de sintomas visíveis. A peroxidação dos lipídios constituintes das membranas celulares afeta a
funcionalidade e a estrutura celular, esta fica suscetível a extravasamento de íons como o K+ e
outros, podendo finalmente causar a morte celular (CHAOUI et al., 1997)
23
O malondaldeído é um dos vários compostos de baixo peso molecular formado via
decomposição de produtos da peroxidação lipídica e também é o principal componente das
substâncias reativas ao ácido barbitúrico TBARS.
Assim, uma vez tendo adotado o modo vida aeróbico os organismos vêm vivendo o
desafio de equilibrar os níveis de EAOs, visto que a sua produção é inevitável. O oxigênio
essencial para garantir a eficiência na obtenção de energia pode se tornar tóxico sob uma série de
circunstâncias, principalmente para os vegetais, uma vez que além de absorver o oxigênio da
atmosfera eles também o produzem através do metabolismo fotossintético, além disso, os
vegetais, salvo raras exceções, vivem fixos a algum tipo de substrato ficando desta forma muito
mais expostos a alterações ambientais, que são possíveis causadoras de estresse (SCANDALIOS,
1993).
2.1.3.1 Sistema antioxidante não enzimático
Como resposta à produção de EAOs os organismos tiveram de desenvolver mecanismos
eficientes para a sua remoção, ou mesmo minimizar os danos causados por elas, denominamos
esse conjunto de mecanismos de sistema antioxidante. O termo antioxidante descreve qualquer
componente capaz de neutralizar as EAOs sem sua conversão a radicais destrutivos. Os
compostos antioxidantes não enzimáticos mais conhecidos são o ascorbato e a glutationa (GSH),
mas também encontramos flavanóides, alcalóides, compostos fenólicos, aminoácidos não
protéicos, tocoferol e carotenóides. A oxidação da GSH pelas EAOs produz a glutationa
dissulfeto (GSSG) e o ascorbato, quando oxidado forma o monodehidroascorbato (MDHA) e o
dehidroascorbato (DHA) (GRATÃO et al., 2005), assim como a GSSG, MDHA e DHA podem
ser reduzidos a GSH e ascorbato através do ciclo ascorbato-glutationa.
A GSH é de fato um tripepitídio, γ-glutamilcisteinilglicina, envolvido em uma série de
rotas importantes (NOCTOR; FOYER, 1998), como a rota principal do transporte de enxofre
responsável pelo controle da translocação do sulfato na raiz (CREISSEN et al., 1994), uma vez
que a GSH é a maior fonte não protéica de tiol em células vegetais (XIANG; OLIVER, 1998),
além do transporte de enxofre esta é também uma rota central no mecanismo de defesa das
plantas. GSH também é precursor de fitoquelatinas, peptídeo envolvido no sequestro e quelação
de metais, bem como serve de sustrato para a enzima glutationa S-transferase responsável pela
24
neutralização de xenobióticos potencialmente tóxicos (BECK et al., 2003), participa da retirada
do H
2
O
2
das células vegetais via ciclo ascorbato-glutationa, existem ainda evidências apontando
para o envolvimento da GSH no controle redox da divisão celular (NOCTOR; FOYER, 1998).
A rota de síntese de GSH parece ser comum a todos os organismos (NOCTOR; FOYER,
1998), o tripepitídeo é sintetizado a partir de glutamato, cisteína e glicina através de reações
dependentes de ATP, em uma primeira reação ocorre entre o glutamato e a cisteína, levando a
formação de γ-glutamilcysteina (γ-EC), reação catalizada pela enzima γ-glutamilcisteina sintase
(γ-ECS) com o consumo de uma molécula de ATP, em um segundo passo a γ-EC é ligada a
glicina em reação catalizada pela enzima glutationa sintase com energia obtida de uma molécula
de ATP (XIANG; OLIVER, 1998). A sintese da GSH em plantas pode ocorrer tanto em
cloroplastos quanto em mitocôndrias (MORAN et al., 2000), em cloroplastos o nível de GSH é
elevado devido a participação da GSH no ciclo ascorbato-glutationa (Figura 2).
Várias evidências levam a crer que o concentração de GSH nas células é controlada em
múltiplos níveis, como por exemplo o fato de em resposta ao estresse plantas poderem aumentar
a atividade das enzimas ligadas a biossíntese de GSH (VERNOUX et al., 2000) e
consequentemente os níveis de GSH (NOCTOR et al., 2002).
A concentração de cisteína é o passo limitante para a síntese de GSH e consequentemente
fitoquelatinas, uma vez que o aumento nos níveis de cisteina leva a um aumento da concentração
de GSH (GOLDSBROUGH, 1998), a biossíntese de cisteína via rota do enxofre envolve a
principio seis enzimas, e sendo uma molécula que contém enxofre e nitrogênio é requerida para a
sintese de uma grande quantidade de metabólitos em uma série de vias distintas (HESSE et al.,
2004).
O ascorbato é outro importante antioxidante que reage diretamente com
•
OH, O
2
•-
e O
2
1
, e
também pode agir como antioxidante secundário reduzindo a forma oxidada do α-tocoferol,
antioxidante importante em fase não aquosa, o ascorbato ainda participa do ciclo ascorbato-
glutationa e preserva a atividade das enzimas que contém metais de transição como íons
prostéticos (NOCTOR; FOYER, 1998).
As duas formas oxidadas do ascorbato (MDHA e DHA) são instáveis em meio aquoso
(SMIRNOFF et al., 2001) e podem ser convertidas em moléculas de quatro carbonos como o
oxalato ou tartarato que podem ser acumulados em altas concentrações (LOEWUS, 1988).
25
As fitoquelatinas (PC) são antioxidantes não enzimáticos também de grande importância,
são peptídios ricos em enxofre com capacidade de complexar metais pesados e se acumular no
vacúolo contribuindo para a desintoxicação das células uma vez que diminuem o quantidade de
metal livre no meio celular (GRATÃO et al., 2005).
A estrutura química das fitoquelatinas sugere que elas são produtos de uma cadeia
biossintética e não resultado direto da expressão de um gene (COBBETT; GOLDSBROUGH
2002), enzima responsável pela síntese de fitoquelatina, foi caracterizada como uma específica γ-
glutamil cysteina dipeptidil transpeptidase, denominada comumente de fitoquelatina sintase
(PCS) (VATAMANIUK et al., 2004), na realidade esta enzima promove a conversão da GSH a
PC. Cobbet em 2000 demostrou que esta conversão é estimulada pelo Cd. A PCS é encontrada
constitutivamente na maioria dos organismos, como também é comum verificar o acúmulo de PC
poucos minutos depois da exposição ao Cd ou mesmo outros metais pesados, indicando que a
regulação da PCS pode ser feita através da ativação da enzima de uma proteína pré-formada
(COBBETT; GOLDSBROUGH, 2002)
Na presença de íons de Cd ocorre um estimulo na sintese de PC levando a formação de
complexos de baixo peso molecular, estes adiquirem enxofre (S
2-
) e são convertidos a complexos
de alto peso molecular com grande afinidade para íons de Cd, no vacúolo o complexo de alto
peso molecular se dissocia do Cd, que é complexado por ácidos orgânicos vacuolares, desta
forma, o vacúolo torna-se o grande depósio de Cd dentro da celula, evitando assim a ação tóxica
do íons em outro compartimento da célula (CLEMENS, 2006)
Outras substancias atuam como antioxidantes no metabolismo celular como por exemplo
alguns alcalóide, o β-caroteno, cisteina, hidroquinonas, manitol ou ainda vitamina E (GRATÃO
et al.. 2005) , os carotenóides são componentes essenciais das membranas dos tilacóides e podem
neutralizar eficientemente o O
2
1
(SCANDALIOS, 1993).
Compostos fenólicos podem atuar como antioxidantes, protegendo contra o estresse
causado por Al (GRATÃO et al., 2005) aminoácidos não protéicos como a nicotiamina podem
complexar íons de metais pesados atuando assim como antioxidantes (WEBER et al., 2004),
antocianinas são considerados importantes antioxidantas na defesa contra injurias fotoxidativas
nas folhas, protegendo os cloroplastos da clorofila excessivamente excitada pelos quanta
luminosos (NEIL; GOULD 2003).
26
2.1.4.1 Enzimas antioxidantes
A inativação efetiva das EAOs exigem a ação de uma série de enzimas trabalhando em
sincronia. As enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT), ascorbato peroxidase
(APX), dehidroascorbato redutase (DHAR), monodehidroascorbato redutase (MDHAR),
glutationa redutase (GR), glutationa peroxidase (GPX) e guaiacol peroxidase (GOPX)estão
envolvidas no mecanismos de destruição das EAOs.
Os metais pesados levam ao estresse celular que promove o acúmulo das EAOs, este leva
a alteração da atividade das enzimas citadas anteriormente (CREISSEN et al., 1994). As
diferentes formas de EAOs são inativadas por diferentes enzimas, o H
2
O
2
pode , por exemplo, ser
diretamente metabolizados pelas peroxidases, principalmente as de parede ou mesmo pela
catalase (CAT) nos peroxissomas (GRATÃO et al., 2005). O O
2
•-
produzido nos cloroplastos são
convertidos a H
2
O
2
pela superóxido dismutase (SOD) e prontamente convertido a H
2
O e O
2
pelo
ciclo ascorbato-glutationa que envolve diversas enzimas entre elas a glutationa redutase (GR)
(NOCTOR et al., 2002). Além disso encontramos nas cadeias transportadoras, tanto de
cloroplasto quanto de mitocôndria, sistemas canalizadores de elétrons alternativos que reduzem a
formação de EAOs pela ação das oxidases alternativas (AOXs) que reduzem oxigênio a água.
(MAXWELL et al., 1999).
A desintoxicação do H
2
O
2
pela ascorbato peroxidase (APX) ocorre através da oxidação do
ascorbato a MDHA que pode ser regenerado a ascorbato pela MDHAR usando o poder redutor da
molécula de NAD(P)H, o MDHA pode ser espontaneamente convertido a DHA. O ascorbato é
regenerado pela ação da DHAR, utilizando a energia produzida pela oxidação da GSH em GSSG
(MITTLER, 2002).
O equilibrio entre as ativadades da CAT, SOD e APX é essencial para manter as EAOS
num nível aceitável e não prejudicar o funcionamento celular, mecanismos compensatórios são
ativados se este balanço for alterado, se por exemplo a atividade da CAT for reduzidas em
plantas, outras enzimas responsáveis pela inativação do H
2
O
2,
como a APX, GPX terão suas
atividades aumentadas. (GRATÃO et al., 2005).
27
2.1.4.1.1 Superóxido Desmutase
A Superoxido dismutase (SOD, EC 1.15.1.1), foi isolada primeiramente por Mann e
Keilin em 1938 em sangue bovino, acreditava-se na época que a enzima era ligada ao processo de
estogem de Cu, deste então foi atribuido a enzima diversas funções como indofenol oxidase e
tetrazolio oxidase ou mesmo classificada como eritrocupreina (SCANDALIOS, 1993). Sua
função catalítica foi descoberta em 1969 por McCord e Fridovich sendo atribuida a enzima a
classificação de proteína Cu/Zn. Com o decorrer dos anos várias proteínas Cu/Zn com atividade
de SOD foram descobertas em outros organismos eucarióticos, enquanto enzimas contendo Mn
com função de SOD foram descobertas em procariotos e em mitocôndrias e ainda proteínas
contendo Fe coma atividade catalítica de SOD foram encontradas em Escherichia coli e algas
(OLMOS et al., 2003). Mais recentemente uma nova classe da enzima contendo Ni foi
encontrada em Streptomyces e cyanobactéria (BARONDEAU et al., 2004). As várias isoformas
da SOD são amplamente distribuídas entre os organismos aeróbicos e os organismos anaeróbicos
aerotolerantes e ainda entre os anaeróbicos obrigatórios (OLMOS et al., 2003).
A SOD é considerada a primeira linha de defesa com os danos causados pelas EAOs, a
enzima atua dismutando o O
2
•-
em H
2
O
2
(ALSCHER al., 2002) (Figura 2), desta forma a
atividade da enzima interfere na concentração das duas EAOs envolvidas na reação de Haber-
Weiss, fazendo parte do mecanismo central de defesa dos organismos, evitando a formação do
radical
•
OH (LEÓN et al., 2002).
A Cu/Zn-SOD é encontrada no estroma dos cloroplastos e é sensível ao radical cianeto
(CN
-
), a Mn-SOD e a Fe-SOD não são sensíveis ao CN
-
e são escontradas tantos em células
eucarióticas quanto em procarióticas, na matriz mitocondrial (MALLICK; MOHN, 2000), a Fe-
SOD e a Cu-SOD são inativados pelo H
2
O
2
(ASADA, 1999).
O número e o tipo distinto de cada isoenzimas varia entre as espécies vegetais, a Cu-SOD
por exemplo já foi encontrada em arroz e também em mitocondrias de girassol, ou ainda em
cloroplasto de arabidopsis (CORPAS et al., 1991; PAN; YAU, 1991; KLIEBENSTEIN et al.,
1998), a Mn-SOD foi encontrada em mitocôndrias de aveia e feijão (SEHMER;
DIZENGREMEL, 1998; CORPAS et al., 1991), a Fe-SOD é rara em plantas, mas foi encontrada
em arabidopsis (KLIEBENSTEIN et al., 1998).
28
2.1.4.1.2 Catalase
A catalase (CAT, EC 1.11.1.6) enzima encontrada nos peroxissomos é responsável pela
inativação do H
2
O
2
formado durante a conversão do glicolato a glioxalato que ocorre durante a
fotorrespiração, onde o peróxido é convertido pela enzima a H
2
O e O
2
(IGAMBERDIEV; LEA,
2002). A catalase pode também decompor o peróxido formado durante a β-oxidação de ácidos
graxos nos glioxissomos em tecido de armazenamento de gordura (HOLTMAN et al., 1994).
A CAT tem uma taxa catalítica máxima muito alta, em contrapartida tem uma baixa
afinidade pelo seu substrato, visto que são necessárias duas moléculas de peróxido no sítio ativo
para que a reação ocorra (ZÁMOCKÝ; KOLLER, 1999) (Figura 2).
A enzima é preferencialmente encontrada nos peroxissomos, mas também podem estar
presentes em mitocondrias e no citoplasma (MONTAVON et al., 2007), os cloroplastos não
possuem a enzima (ASADA, 1999), ela foi localizada em mitocondrias de células cardiacas de
ratos (MOLLER, 2001).
Em plantas de milhos três isoformas distintas foram encontradas (SCANDALIOS et al.,
2000), mas somente duas foram encontradas em pêssego (BAGNOLI et al 2004) e cevada
(SKADSEN et al., 1995). Em Arabidopsis thaliana a CAT é codificada por uma familia
multigênica, formada por três genes CAT1, CAT2 e CAT3, estes três genes são altamente
expressos nas inflorescências da planta, porém somente os genes CAT2 e CAT3 são altamente
expressos em folhas e ambos são controlados pelo ciclo circadiano (FRUGOLI et al., 1996).
2.1.4.1.3 Glutationa Redutase
A glutationa redutase (GR, EC 1.6.4.2) é uma flavoproteína responsável por catalizar a
redução da GSSG para GSH, esta reação é dependente de NADPH (figura 2). A GR pode ser
encontrada tanto em cloroplasto quanto em mitocôndria, mas sua sintese ocorre no citoplasma da
célula de onde é direcionada para as organelas (MULLINEAUX; CREISSEN, 1997), possui
ocorrência quase universal, distribuída em procariotos e eucariotos, desde bactérias heterotróficas
e fotossintetizantes até plantas e animais superiores (FOYER et al., 1997).
A enzima desempenha um papel importante na defesa contra o estresse oxidativo, pois
mantém o equilíbrio entre os níveis de GSSG e GSH na célula. A GSH é uma molécula
29
importante dentro do sistema celular, participando inclusive do ciclo ascorbato-glutationa
(NOCTOR et al., 2002), ou ainda da síntese de fitoquelatinas (GRATÃO et al., 2005).
2.1.4.1.4 Glutationa S-transferase
As glutationa S-transferases (GST, EC 2.5.1.18) são enzimas que catalisam a adição de
GSH para substratos hidrofóbicos eletrofílicos (DIXON et al., 2002a), são proteínas diméricas
encontradas preferencialmente no citoplasma, sua identificação em plantas ocorreu devido a sua
associação com mecanismos de resistência ao herbicida atrazina em milho (MARRS, 1996),
Várias classes de GST foram identificadas em plantas respondendo aos mais diversos tipos de
estressores bióticos ou abióticos inclusive metais pesados, em plantas foram encontradas quatro
classes de GST, Phi, Zeta, Tau e Theta (DIXON et al., 2002b).
A atividade desta enzima leva a desintoxicação dos produtos da peroxidação lipídica,
desta forma as enzimas são ativadas pelo estresse oxidativo. A enzima remove também metal
pesado, herbicidas e outros xenobióticos e é a principal responsável pela eliminação de
endógenos como metabólitos secundários (Foyer et al., 1997).
2.1.4.1.5 Ascorbato Peroxidase
A ascorbato peroxidase (APX, EC 1.11.1.11) é responsável pela degradação do H
2
O
2
utilizando o ascorbato como substrato (figura 2), a enzima é importante na defesa de tecidos
fotossíntético contra o estresse fotoxidativo, a APX é encontrada também no citosol das células
não fotossíntetizantes atuando na redução dos níveis de EAOs (ASADA, 1992).
A APX é uma heme proteína que ocorre também em mamíferos, é inibida cianeto, azida,
reagentes modificadores de tiol, hidroxiuréia, ρ-aminofenol, seu ciclo catalítico é denominado
mecanismo peroxidase ping-pong , uma vez que na redução do H
2
O
2
a APX convertida em em
composto oxidado em 2 elétrons, uma vez formado esse composto, oxida o ascorbato formando o
MDHA e a enzima volta a sua forma original (ASADA, 1999).
Quando comparada a CAT a APX tem um K
m
menor sendo desta forma atribuído a APX
um controle mais refinado dos níveis de H
2
O
2
ou mesmo sinalização (Mittler, 2002), são
30
encontradas 5 isoformas de APX (ASADA, 1999) encontradas em tilacóide, estroma, citossol,
peroxissomo e apoplasto (MIYAKE; ASADA, 1992; JIMÉNEZ ET AL., 1997).
2.1.4.1.6 Guaiacol Peroxidase
A guaiacol peroxidase (GOPX, EC 1.11.1.7) é também uma heme proteína, porém é bem
distinta da APX tanto na sequência de aminoácidos quanto nas funções biológicas, a GOPX
participa da decomposição do ácido indol acético (AIA), da biossíntese de lignina e defesa contra
patógenos, mas não está envolvida na remoção de H
2
O
2
, a enzima apresenta o mesmo mecanismo
peroxidadse das APXs mas, prefere utilizar como doador de elétron compostos aromáticos como
o guaiacol (ASADA, 1999).
31
Figura 2 - Via de produção e desintoxicação das EAOs em organismos vegetais
31
32
2.1.5 Metabolismo de nitrogênio
O nitrogênio juntamente com o fósforo e o potássio são denominados macronutrientes,
uma vez que a demanda por estes elementos é grande, o nitrogênio limita mais fortemente o
crescimento das plantas em comparação com os outros macronutrientes (DATE, 1973; HARDY;
HAVELKA, 1975).
O nitrogênio pode ser encontrado no ambiente na forma de nitrato, amônia, uréia ou
aminoácidos, de todas as formas o nitrato é o mais encontrado nos diversos ambientes, visto que
as outras formas são utilizadas por bactérias do solo tendo o nitrato como produto final
(WILLIANS; MILLER, 2001).
O nitrogênio é muito abundante na atmosfera na forma de N
2
, todavia, poucos organismos
são capazes de utilizar o nitrogênio nessa forma devido à estabilidade da molécula formada pela
tripla ligação entre os átomos de nitrogênio, estes organismos ocupam um nicho de grande
importância fixando o nitrogênio atmosférico e disponibilizando-o em vários ecossistemas
(HALBLEIB; LUDDEN, 2000) (Figura 3).
O nitrogênio deve ser reduzido a amônio NH
4
+
para que possa ser incorporado a um
esqueleto de carbono, uma vez formado NH
4
+
deve ser rapidamente incorporado, pois é tóxico
causando o desacoplamento de membranas celulares (TAIZ; ZEIGER, 2004) (Figura 3).
Quando o nitrogênio é absorvido na forma de nitrato ele é reduzido a nitrito (NO
2
-
),
primeiro passo para assimilação do nitrogênio, em relação catalisada pela enzima nitrato redutase
presente no citoplasma celular (OAKS 1994). Uma vez na forma de nitrito é reduzido a amônio
pela enzima nitrito redutase encontrada em cloroplastos em células de folha e em plastídios nas
células radiculares, as duas organelas possuem isoformas distintas da enzima, porém ambas
formadas por um peptídeo e dois grupos prostáticos (SIEGEL; WILKERSON 1989).
Finalmente na forma de amônio o nitrogênio pode ser assimilado, quando o nitrato é
absorvido em pequenas quantidades ele é reduzido na própria raiz e então transportado para a
parte aérea da planta, porém quando absorvido em quantidades maiores, o íon é transportado para
a parte aérea e reduzido nas folhas (MARSCHNER 1995).
Os íons amônios devem ser rapidamente convertidos a aminoácidos para evitar seus
efeitos tóxicos às células, a incorporação do nitrato aos esqueletos de carbono é feita pelo sistema
enzimático GS/GOGAT formado pelas enzimas glutamina sintetase (GS) e glutamato sintase
33
(GOGAT) (LEA et al., 1992). A GS combina o amônio e o glutamato para formar glutamina,
reação catalítica e com consumo de ATP, enquanto a GOGAT transfere o grupo amina da
glutamina para o oxoglutarato formando duas moléculas de glutamato. As plantas possuem dois
tipos de GOGAT, uma presente em cloroplastos que utiliza o poder redutor do NAPH e outra
encontrada em plastídios de tecidos não fotossintetizantes que utiliza ferridoxina como doador de
elétron (TAIZ; ZEIGER, 2004).
Existe uma via alternativa de assimilação de nitrogênio a GDH catalisa a reação reversível
do oxoglutarado com o amônio produzindo glutamato e água, existe uma GDH NADH-
dependente em cloroplastos e uma NADPH-dependente em mitocôndrias, embora sejam
relativamente abundantes, as duas formas não podem substituir a GS-GOGAT na via de
assimilação de amônio, visto que a função primária da GDH é a desaminação do glutamato
(TAIZ; ZEIGER, 2004).
2.1.6 Nitrato redutase
A enzima nitrato redutase (NR, EC 1.6.1.1) catalisa o primeiro passo na via de redução de
nitrato, reduzindo-o a nitrito, e é encontrada no citoplasma, porém evidências apontam para a
existência de NR associada à membrana plasmática, sua atividade é tida como limitante para a
assimilação de nitrogênio (TISCHNER, 2000).
A síntese da NR é induzida pela presença de nitrato e sua requer a presença de luz em
tecidos fotossintetisantes, a indícios da repressão da síntese quando a amônia é utilizada como
fonte de nitrogênio ou ainda com o aumento da concentração interna de compostos nitrogenados,
não são necessárias grandes quantidades de nitrato para a indução da síntese da enzima, tem sido
demonstrado que pequenas quantidades do íon promovem a síntese da enzima (TISCHNER,
2000), em sementes de cevada RNAm para a síntese de NR foi detectado 40 minutos após de
adição de nitrato e o nível máximo da concentração de RNAm foi atingido após 3 horas da adição
do nutriente (TAIZ; ZEIGER, 2004).
A NR é um dos melhores exemplos de enzimas induzidas pelo substrato sendo
praticamente inexistente ou indetectável na ausência de nitrato externo na maioria das plantas
superiores (ANDREWS et al., 1990; AIDAR et al., 2003).
34
2.1.7 Aminoácidos
Aminoácidos são as subunidades monoméricas simples e capazes de formar a estrutura de
milhares de proteínas distintas, todas as proteínas das mais primitivas bactérias até as das mais
complexas formas de vida são formadas pelo mesmo conjunto de 20 aminoácidos (LEHNINGER,
2002).
As plantas são capazes de sintetizar todos os aminoácidos enquanto animais necessitam
obter alguns através da alimentação estes são chamados aminoácidos essenciais. Os aminoácidos
podem ser agrupados de acordo com a sua afinidade pela água, desta forma existem os polares ou
hidrofílicos como glutamina e serina e os apolares ou hidrofóbicos como cisteína e prolina,
podem também serem ácidos como o aspartato ou básico como a lisina. (LEHNINGER, 2002).
Existem aminoácidos que atuam como antioxidantes como o caso da prolina
(SCANDALIOS, 1993), foi verificado um aumento nos níveis de prolina livre
em folhas de plantas de milho submetidas a estresse hídrico (FEREIRA et al., 2002a).
35
Figura 3 - Via de assimilação de nitrogênio
36
2.2 Material e métodos
Os experimentos foram conduzidos no Laboratório de Genética Bioquímica de Plantas e
em casa de vegetação, pertencentes ao Departamento de Genética da ESALQ-USP.
2.2.1 Material vegetal
As plantas de Aguapé foram coletadas em uma lagoa no bairro de Santa Rita no
município de Piracicaba – SP.
2.2.2 Condução experimental
As plantas coletadas foram transferidas ao tanque de triagem onde foram selecionadas
pelo número de folhas e tamanho. Aquelas selecionadas foram acondicionadas em reservatórios
em casa de vegetação, após cinco dias de aclimatação, passaram a receber solução nutritiva de
Hoagland (1938) e depois de 15 dias, as plantas foram selecionadas novamente para a realização
dos experimentos.
Durante o período experimental, três plantas foram mantidas em recipientes (10 L) e
tratadas com solução nutritiva. Foram realizados testes preliminares para a determinação da
concentração de CdCl
2
a ser utilizada e do tempo de exposição das plantas ao metal,
posteriormente as plantas foram submetidas a três concentrações do metal, 0, 0,05 e 0,50 mM de
CdCl
2
ficando expostas por 8 dias, com as coletas para análises posteriores sendo realizadas no
período de 0, 1, 2, 4 e 8 dias.
Todos os experimentos, bem como todos os ensaios foram realizados em triplicata.
2.2.3 Extração protéica
As amostras de cada tratamento foram maceradas em nitrogênio líquido, até formar uma
farinha homogênea e, em seguida, foi adicionado o tampão de extração (1 g de tecido/1,7 mL de
tampão). Para este procedimento, foi utilizado o tampão fosfato de potássio 100 mM fosfato de
potássio (pH 7,5), contendo fosfato de potássio dibásico (K
2
HPO
4
) (14,52 g/L), fosfato de
37
potássio monobásico (KH
2
PO
4
) (2,27 g/L), 1 mM ácido etileno diamino tetracético (EDTA)
(0,372 g/L), 3 mM ditiotreitol (DTT) (0,462 g /L) e 4% (p/v) de polivinilpolipirrolidona (PVPP).
O homogeneizado foi centrifugado à 10.000 rpm, por 30 minutos, à 4°C. O sobrenadante
foi coletado, alíquotado e estocado em freezer -80°C até o momento das análises.
2.2.4 Determinação de proteína
2.2.4.1 Método de Bradford
A determinação das concentrações de proteínas solúveis totais foi realizada pelo método
de Bradford (1976), utilizando-se soro albumina bovina (BSA) como padrão.
2.2.4.2 SDS-PAGE
A eletroforese em sistemas SDS-PAGE é empregada em estudos de proteínas, o qual
utiliza um agente dissociante para desnaturá-las em subunidades. O agente dissociante
comumente utilizado é o detergente iônico dodecil sulfato de sódio (SDS). A mistura de proteína
é desnaturada pelo aquecimento, na presença do SDS e mercaptoetanol, cuja função é quebrar as
ligações dissulfeto. Esta eletroforese ocorre em cuba vertical, em sistema de tampão descontínuo
e desnaturante, utilizando-se mini-gel no tamanho de 8,3 x 10,2 cm na concentração de
acrilamida de acordo com Laemmli (1970). As soluções estoques são descritas como segue.
O tampão de corrida (5x concentrado) contém 25 mM TRIS, 192 mM de glicina pH 8,3 e
1% SDS (10%). O tampão do gel principal contém 3 M TRIS (pH 8,9) e o tampão do gel de
empacotamento 0,5 M TRIS (pH 6,7). O tampão foi diluído (5x) na hora do uso.
Para a preparação de 2 géis na concentração de 10% de acrilamida, foram utilizados no
gel de resolução (principal) 5 mL de acrilamida/bis-acrilamida (40%), 5 mL do tampão do gel
principal, 10 mL de H
2
O destilada, 200 L SDS (10%), 38 L de TEMED e 50 L de PA (10%).
Para o gel de empacotamento, 1 mL de acrilamida/bis-acrilamida (40%), 2,5 mL de
tampão de empacotamento, 5,5 mL de H
2
O destilada, 100 L de SDS (10%), 20 L de TEMED e
100 L de PA (10%).
38
O tampão de amostra contém 3,0 mL de H
2
O destilada, 1,0 mL de tampão de
empacotamento, 1,6 mL de glicerol, 1,6 mL de SDS (10%), 0,4 mL de solução 0,5% de azul de
bromofenol e 0,4 mL mercaptoetanol. A corrida foi realizada em amperagem constante de 20 mA
por placa.
2.2.5 Atividade das enzimas antioxidantes
Para os ensaios enzimáticos foram utilizados extratos provenientes de plantas de aguapé
expostas as concentrações de 0; 0,05 e 0,50 mM de CdCl
2
, nos períodos de 0, 1, 2, 4 e 8 dias,
congelados a -80°C.
2.2.5.1 Atividade de superóxido dismutase (SOD)
A atividade de SOD foi determinada por eletroforese em gel de poliacrilamida (PAGE)
não-desnaturante de acordo com Beuchamp; Fridovick (1971).
2.2.5.1.1 Atividade em PAGE não-desnaturante
A atividade de SOD em PAGE não-desnaturante foi determinada utilizando-se extratos
vegetais, cujas proteínas foram separadas por eletroforese em gel (10%). O gel separador foi
confeccionado com espessura de 3 mm conforme descrito anteriormente no item 2.2.4.2 sem
adição de SDS.
A eletroforese foi realizada a 4°C em corrente constante de 20 mA, por placa. O tampão
de eletrodo continha 15,2 g de TRIS 250 mM (pH 8,3) e 72 g de glicina (Gly) (192 mM), onde,
150 mL deste tampão foram misturados em 600,0 mL de água d.d. O padrão utilizado foi duas
unidades de SOD de fígado de boi (Sigma) e a concentração de proteínas das amostras foi de 100
g.
Após a separação das proteínas por eletroforese, a atividade de SOD foi determinada
como descrito por Beuchamp; Fridovick (1971). Os géis foram lavados em água d.d. e incubados
no escuro à temperatura ambiente em uma mistura de reação contendo tampão fosfato de potássio
39
50 mM potássio (pH 7,8), 1 mM EDTA, 0,05 mM riboflavina, 0,1 mM nitro blue tetrazolium
(NBT) e 0,3% de TEMED.
Depois de 30 minutos, a mistura da reação foi removida, os géis lavados com água d.d. e
colocados sob iluminação até o aparecimento das bandas negativas sob fundo roxo. Nestas
condições, ocorre a fotoxidação do gel com a formação de uma coloração púrpura e as bandas
correspondentes à atividade de SOD permanecem sem fotoxidar, promovendo uma revelação
negativa. A fotoxidação é interrompida com solução de solução de ácido acético 7%.
2.2.5.1.2 Determinação das isoformas de SOD
Para a determinação das isoformas de SOD foi realizada uma eletroforese com 100 µg de
proteína do tratamento 0 mM de CdCl
2
, 0 h, nas condições anteriormente descritas para SOD.
Em seguida, o gel foi dividido verticalmente em três partes. Uma delas foi mantida à 4°C em
tampão fosfato de potássio, pH 7,8. Outra foi imersa em 100 mL do mesmo tampão contendo
0,0292 g de EDTA e 0,0130 g de KCN e a terceira, imersa em 100 mL do tampão acrescido de
0,0292 g de EDTA e 70 µL de H
2
O
2
. Todos os passos descritos foram realizados no escuro.
Após 20 minutos nestas soluções, os géis foram submetidos foram revelados em NBT e
riboflavina, como citado anteriormente. Ao final da revelação, foi analisada a presença ou
ausência de bandas no controle, e nos tratamentos com KCN e H
2
O
2
. As bandas foram então
classificadas como Cu/Zn-SOD, Fe-SOD ou Mn-SOD. A Cu/Zn-SOD é inativada por KCN e
H
2
O
2
e em geral ocorre no citoplasma e no cloroplasto. Fe-SOD é inativada por H
2
O
2
e resistente
a KCN, ocorrendo no cloroplasto. A forma Mn-SOD é resistente a ambos (KCN e H
2
O
2
) e está
presente nas mitocôndrias (Azevedo et al., 1998).
2.2.5.2 Atividade de catalase (CAT)
A atividade de catalase foi determinada por espectrofotometria e eletroforese em gel de
poliacrilamida (PAGE) não-desnaturante.
40
2.2.5.2.1 Atividade em espectrofotômetro
A atividade de catalase foi determinada segundo Kraus et al. (1995) com algumas
modificações conforme Azevedo et al. (1998).
Em espectrofotômetro, a atividade da catalase foi determinada à 25°C, em solução
contendo 1 mL de tampão fosfato de potássio 100 mM (pH 7,5) e 0,025 mL de H
2
O
2
(solução
0,25%) preparado imediatamente antes do uso. A reação foi iniciada pela adição de 0,015 mL de
extrato vegetal e a atividade determinada seguindo-se a decomposição de H
2
O
2
por 1 minuto,
através das alterações na absorbância à 240 nm. Os resultados foram expressos em mol/min/mg
de proteína.
2.2.5.2.2 Atividade em PAGE não-desnaturante
A eletroforese foi realizada em PAGE (10%), como descrito para SOD. Para cada gel,
foram aplicadas amostras de duas unidades de padrão de CAT de fígado de boi (Sigma) e 2 g de
proteína dos extratos dos tratamentos com CdCl
2
.
A revelação para a atividade de CAT foi realizada após a lavagem do gel por 45 minutos
em água d.d. (3x15 min) e incubação do mesmo por 10 minutos em H
2
O
2
(0,003%), à
temperatura ambiente, com agitação constante. Após este período, o gel foi lavado em água d.d. e
colocado em solução 1% de cloreto férrico (FeCl
3
) (p/v) e 1% ferricianeto de potássio
(K
2
Fe[CN
6
]) (p/v), por 10 minutos, com agitação. A solução foi retirada e o gel lavado com água
d.d.. Para a fixação, utilizou-se solução de ácido acético 7%.
2.2.5.3 Atividade de glutationa redutase (GR)
A atividade da GR foi determinada por espectrofotometria e em PAGE não-desnaturante.
2.2.5.3.1 Atividade em espectrofotômetro
A atividade da GR foi determinada de acordo com Smith et al. (1988), com algumas
modificações. Em espectrofotômetro, a 30°C, em uma solução contendo 1 mL de tampão fosfato
41
de potássio 100 mM (pH 7,5), 0,5 mL de 5,5' ditiobis (2-ácido nitrobenzóico) (DTNB) 1mM, 0,1
mL de GSSG 1 mM e 0,1 mL de NADPH 0,1 mM. A reação foi iniciada com a adição de 0,05
mL de extrato vegetal. A atividade da GR foi estimada pela redução da GSSG, acompanhada pelo
monitoramento na alteração da absorbância a 412 nm. Os valores de atividade foram expressos
em mol/min/mg de proteína.
2.2.5.3.2 Atividade em PAGE não-desnaturante
A atividade da GR foi revelada segundo Lee (2000). Depois da eletroforese em PAGE
(10%), como descrito em SOD, utilizando-se como padrão uma unidade de GR, o gel foi lavado
com água d.d. e incubado em temperatura ambiente em 50 mL de solução contendo 0,25 M de
TRIS (pH 7,5) (1,514 g), 10 mg de MTT, 10 mg de dicloroindolacético (DPIP), 2,4 mM GSSG
(0,1041g) e 0,5 mM de NADPH (0,0208g). A reação foi interrompida com ácido acético 7%,
após o aparecimento das bandas.
2.2.5.4 Atividade de glutationa-S-transferase (GST)
A atividade da GST foi determinada por espectrofotometria.
2.2.5.4.1 Atividade em espectrofotômetro
A atividade de GST foi determinada como descrito por Anderson (1995), com algumas
modificações. Em solução contendo 0,9 mL de 100 mM GSH, foram adicionados 0,025 mL de
amostra e 0,025 mL de 40 mM 1-cloro 2,4-dinitrobenzeno (CDNB) 40 mM, à 30°C. O
monitoramento da absorbância foi feito por 10 minutos, a 340 nm. A atividade foi expressa em
mol/min/mg de proteína.
2.2.6 Peroxidação de lipídios
A peroxidação de lipídios foi determinada através da produção de metabólitos reativos a
ácido 2-tiobarbitúrico (TBA), principalmente o malonaldeído (MDA), segundo Heath; Packer
42
(1968). Amostras pesando 0,1 g foram maceradas com 1,3 mL de TCA (0,1%) juntamente com
20% de PVPP. Após a homogeneização, 1,0 mL foi transferido para tubos eppendorf e
centrifugados a 10.000 rpm por 5 minutos. Do sobrenadante, foi retirado 0,25 mL ao qual foi
adicionado 1,0 mL de TCA 20% e TBA 0,5%. A mistura foi colocada em banho seco por 30
minutos, a 95°C e resfriada em gelo, na seqüência. As amostras foram centrifugadas por 10
minutos a 10.000 rpm. A leitura foi realizada em espectrofotômetro a 535 e 600 m. A
quantidade de MDA é expressa em mmol/mg de tecido fresco.
2.2.7 Extração de compostos nitrogenados para quantificação e análise qualitativa de
aminoácidos
Através do método descrito por Bieleski e Turner (1966) os compostos nitrogenados
foram extraídos para as análises posteriores. Para 1g de material fresco, acrescentaram-se 10 mL
de solução MCW (60% metanol, 25% clorofórmio, 15% H
2
O).
O material foi homogeneizado em mortar e em seguida centrifugado. Após centrifugação,
acrescentaram-se 1 mL clorofórmio + 1,5 mL H
2
O, para cada 4 mL sobrenadante, e agitou-se
vigorosamente em funil de separação. Após a separação de fases e utilizou-se a fase hidrossolúvel
para análise compostos nitrogenados (aminoácidos, ureídeos, amônia e nitrato).
2.2.8 Quantificação de compostos nitrogenados
2.2.8.1 Análise quantitativa de aminoácidos
Foi utilizado o método de Yemm e Cocking (1955) para se quantificar as variações na
concentração de aminoácidos solúveis totais presentes nos diferentes tecidos.
Ao extrato de tecido, juntou-se 500 µL tampão citrato 0,2 M pH 5,0 e 200 µL solução 5%
ninhidrina em éter monometílico de etilenoglicol + 1 mL solução 0,0002 M. KCN O ensaio foi
aquecido a 100ºC (banho-maria com água fervente) por 20 minutos e, após, resfriado por 10
minutos em água corrente. Acrescentou-se 1 mL de álcool etílico 60%, seguindo-se leitura em
43
espectrofotômetro a 570 nm.
A concentração de aminoácidos solúveis totais foi avaliada utilizando-se curva padrão de
solução leucina (de 0 a 0,6 µmoles).
2.2.8.2 Análise qualitativa de aminoácidos por cromatografia líquida de alto desempenho
(HPLC)
Após a quantificação de aminoácidos solúveis totais, as amostras foram liofilizadas para
remoção do solvente, ressuspendidas em água Milli-Q a uma concentração de 500 nmoles de
aminoácidos/mL e filtradas em filtro Millipore 0,2 µm. Os aminoácidos solúveis foram separados
e analisados por HPLC de fase reversa como seus derivados de OPA (-phthaldialdeido), baseado
no método descrito por Jarret et al. (1986). Foi utilizada uma coluna Spherisorb ODS-2 C18 e
eluição em um gradiente linear formado pelas soluções de metanol 65 % e tampão fosfato pH 7,5
(50 mM de acetato de sódio, 50 mM de fosfato disódico, 1,5 mL de ácido acético, 20 mL de
tetraidrofurano, 20 mL de metanol) num fluxo de 0,8 mL/min. O gradiente incrementou a
proporção de metanol de 20 % a 28 % entre 0 e 5 min, de 28 % a 58 % entre 5 e 35 min, de 58 %
a 75 % entre 35 e 40 min, 75 % a 95 % entre 40 e 56 min, 95 % a 96 % entre 56 a 60 min e 96 %
a 100 % entre 60 e 61 min. O fluído da coluna foi monitorado por um detector de fluorescência
Shimatdzu (model RF550), operando em comprimento de onda de excitação de 250 nm e um
comprimento de onda de emissão de 480 nm. Os aminoácidos foram derivatizados utilizando-se
20 µL da amostra e 60 µL do reagente OPA. Após 2 minutos, foram injetados 20 µL no aparelho
de HPLC. Os picos foram identificados com base em um padrão de aminoácidos Sigma (AAS-
18) acrescido de asparagina, glutamina e Gaba. Os dados foram expressos em mol% (excluindo-
se prolina e cisteína por não formarem um derivado estável com OPA).
2.2.8.3 Análise quantitativa de nitrato
Foi utilizado o método de Cataldo et al. (1975) para quantificar as variações na
concentração de nitrato presente nos diferentes tecidos.
Do extrato de tecido ou seiva de xilema devidamente diluídos em água, em volume de 0,1
44
mL adicionou-se 0,4 mL ácido salicílico 5% em H
2
SO
4
(p/v). Após 20 minutos em temperatura
ambiente, acrescentou-se 9,5 mL de NaOH 2N, lentamente. Após resfriar a temperatura
ambiente, seguiu-se a leitura em espectrofotômetro a 410 nm. A concentração de nitrato foi
avaliada utilizando-se curva padrão de solução nitrato. (de 0 a 4 moles)
2.2.8.4 Determinação de nitrogênio total
O conteúdo de nitrogênio total das amostras foi determinado pelo método de Kjeldahl
(YASUHARA; NOKIHARA 2001), as amostras foram liofilizadas, maceradas e 100 mg foram
transferidas para tubos de digestão juntamente com 1,5 mg de catalisador e 2 mL de H
2
SO
4
.
Iniciou-se a digestão à 100ºC e gradativamente a temperatura foi aumentada até alcançar 300ºC, a
digestão foi completada em 6 horas.
Após a digestão as amostras foram colocadas em destilador que continha em seu
condensador um erlermeyer com 20 mL de 4% H
3
BO
3
e 12 gotas de 0,1% azul de bromofenol foi
adicionado ao destilador 25 mL de 50% NaOH.
As amostras foram retiradas do destilador quando o volume do destilado atingiu 50 mL e
tituladas com HCl 0,1 N.
2.2.9 Atividade de nitrato redutase (NR)
A atividade da NR foi determinada nos diferentes tecido das plantas de aguapé segundo
método descrito por Radin (1973), foram coletadas amostras de tecido fresco e colocadas em
tubos contendo 10 mL de solução tampão fosfato 0,1 M pH 7,5 + 0,75g de KNO
3
; os tubos foram
submetidos a vácuo para que a solução penetrasse o tecido, a seguir as amostras foram incubadas
no escuro a 30° C, em banho-maria, por 1 hora.
Em seguida, foram coletados 2 mL do sobrenadante, ao qual se acrescentou 1 mL de
sulfanilamida 1% em HCl e 1 mL de solução naftil etileno 0,02%. Segue-se leitura em
espectrofotômetro a λ = 540 nm.
A atividade da NR foi determinada pela quantidade de nitrito produzida, utilizando-se
curva padrão de solução Nitrito.
45
2.2.10 Avaliação do conteúdo de clorofila por unidades de SPAD
A quantificação de clorofila foi determinada em unidades de SPAD em todos os
tratamentos utilizando-se o equipamento SPAD–502, Minolta Corp. Ramsey, pertencente ao
Laboratório de Genética e Bioquímica de Plantas ESALQ/USP (Figura 4).
2.2.11 Determinação de massa fresca
O efeito do Cd no desenvolvimento e acúmulo de biomassa nas plantas de aguapé foi
determinado pela pesagem das amostras coletadas nos diferentes tratamentos e tempos de
amostragem.
46
Figura 4 – Determinação de clorofila em folhas de aguapé submetidas a diferentes concentrações de CdCl
2
,
utilizando aparelho SPAD Minolta 502. (A) Determinação do quadrante de leitura na área folear, (B)
dispositvo no momento da leitura e determinação de clorofila
A
B
47
2.3 Resultados e discussão
2.3.1 Atividade de SOD
A atividade da SOD em aguapé foi determinada em PAGE não desnaturante. Foi
encontrado um grande número de isoformas, o mesmo foi relatado para outras espécies vegetais
como soja (FERREIRA et al., 2002b), calos de cana-de-açúcar (FORNAZIER et al., 2002a),
Crotalaria sp (PEREIRA et al., 2003) ou mesmo culturas de células de café (GOMES-JUNIOR
et al., 2006). As duas doses de Cd utilizadas interferiram na atividade das dez isoformas SOD
encontradas nas plantas de aguapé.
A SOD é amplamente encontrada em todos os organismos aeróbicos, em plantas
superiores encontramos em compartimentos distintos da célula três tipos de isoformas de SOD
que são classificadas de acordo com o cofator metálico, Mn, Fe e Cu/Zn (ALSCHER et al.,
2002). A Mn-SOD é encontrada em mitocôndrias e em peroxissomos (DEL RIO et al., 2002;
2003), a Fe-SOD pode ser encontrada em cloroplastos (ALSCHER et al., 2002), enquanto a
Cu/Zn-SOD pode estar associada a cloroplastos e peroxissomos ou ainda ser encontrada no
citosol de células vegetais (DEL RIO et al., 2002).
A SOD é uma enzima fundamental no processo de remoção das EAOs, visto que é a única
enzima que interfere ao mesmo tempo na concentração de O
2
•-
e de H
2
O
2
, dois substratos da
reação de Haber-Weiss, sendo assim importante na prevenção da formação do radical
•
OH
(Gratão et al., 2005).
Em aguapé as bandas I,II, III, VI, VIII, IX e X, são encontradas em todos os tratamentos e
tempos, indicando serem as maiores responsáveis pela atividade total de SOD na planta, destas
isoformas que se destacaram a maioria é constituída de Cu/Zn-SOD, com exceção da banda III
caracterizada como Mn-SOD (Figura 5 e 6).
Nas plantas com um dia de exposição ao metal não foram verificadas grandes alterações
na atividade da SOD em função da dose de Cd (figura 5A), evidenciando que este período de
exposição não provocou alterações suficientes nos níveis de EAOs para que fosse detectada uma
alteração na atividade da enzima. Mesmo em nível constitutivo, a isoforma Cu/Zn-SOD detectada
na banda X, se mostrou com maior atividade.
48
Em plantas coletadas após dois dias de exposição ao Cd, foram notadas alterações na
atividade da SOD, com um visível aumento em plantas submetidas a 0,05 mM Cd, entretanto em
plantas submetidas a 0,50 mM Cd foi mostrada uma redução expressiva na atividade da enzima,
caracterizado pela menor intensidade das bandas e pelo desaparecimento de banda IV
identificada como uma Cu/Zn-SOD (Figura 5B).
Após quatro dias as plantas de aguapé submetidas a maior dose do metal apresentaram
uma maior intensidade das bandas, evidenciando um aumento na atividade da SOD, com
destaque para a banda III, caracterizada como Mn-SOD, e para as bandas IX e X (Cu/Zn-SOD),
que apresentaram um aumento expressivo na intensidade, caracterizando um aumento da
atividade destas isoenzimas.
A atividade da enzima apresentou um pequeno aumento em plantas expostas a menor
dose do metal, evidenciado através das bandas IX e X, todavia a banda IV não foi encontrada
nestas plantas, desta forma a atividade da SOD se manteve muito próxima à atividade constitutiva
encontrada nas plantas controle (Figura 5C).
Finalmente em plantas coletadas após oito dias de exposição a menor dose do metal, a
atividade da SOD apresentou um expressivo aumento, com maior intensidade de todas as bandas,
com destaque para as bandas III, VI, VII, IX e X. Nestas plantas foram encontradas as mais altas
taxas de atividade da SOD de todo o experimento. Em contrapartida nas plantas tratadas com a
dose maior de Cd, a atividade da SOD foi reduzida de maneira acentuada como demonstrado pela
menor intensidade das bandas e ainda com o desaparecimento das bandas I, IV, V e VIII (Figura
5D).
Em aguapé, a atividade da SOD parece estar ligada a geração de O
2
•-
, o incremento da
atividade da enzima seria uma resposta da planta a geração de EAOs na tentativa de evitar o
estresse oxitadivo. O Cd demonstrou aumentar a geração e acúmulo de O
2
•-
em plântulas de O.
sativa (SHAH et al., 2001) e folhas de P. sativum (ROMERO-PUERTAS et al., 2004) e H
2
O
2
em
folhas de P. sativum (ROMERO-PUERTAS et al., 2004), raízes de Triticum aestivum (RANIERI
et al., 2005), raízes de Populus x canescens, um híbrido de Populus tremula x Populus alba
(SCHÜTZENDÜBEL et al., 2002) e em A. thaliana (CHO; SEO, 2005), o mesmo parece ter
ocorrido em aguapé, onde a menor dose do metal mostrou uma elevação nas taxas de atividade da
SOD e esta pareceu eficaz na retirada de O
2
•-
, visto que não foi verificado nas plantas sintomas
críticos de estresse oxidativo, como peroxidação lipídica (Figura 10), quedas acentuadas no teor
49
de clorofila (Figura 22), ou mesmo redução no acúmulo de biomassa (Figura 24), porém em
plantas de aguapé submetidas a maior dose de Cd, a produção de O
2
•-
e possivelmente outras
EAOs parece ter sido maior que a capacidade da planta em se recuperar e vários dos sintomas
citados acima foram nelas observados.
A Atividade da SOD em resposta ao Cd varia bastante em plantas dependendo da espécie,
do tempo de exposição ou mesmo do tecido avaliado, em Hordeum vulgare (GUO et al., 2004),
folhas de arroz (HSU; KAO, 2007), Allium sativum (ZHANG et al., 2005), Miscanthus sinensis
(SCEBBA et al., 2006), A. thaliana (CHO; SEO, 2005), o Cd provocou o aumento da atividade
da SOD total, ainda a isoforma Mn-SOD de Pisum sativum L. (RODRIGUEZ-SERRANO et al.,
2006) teve sua atividade aumentada, entretanto a isoforma Cu/Zn-SOD da mesma planta teve sua
atividade reduzida (RODRIGUEZ-SERRANO et al., 2006) o mesmo ocorreu em Phragmitis
australis (IANNELLI et al., 2002), pimenta (LEÓN et al., 2002), Populus x Canescens
(SCHÜTZENDÜBEL et al., 2002), existem ainda espécies como o H. annuus em que o metal não
altera a atividade da enzima (GALLEGO et al.,1999).
50
2.3.1.1 Determinação da atividade de SOD em PAGE não desnaturante
Figura 5 - Perfil eletroforético de atividade de SOD em folhas de aguapé submetidas a diferentes concentrações de
CdCl
2
, sendo: P Padrão; 1 Controle; 2 0,05 mM de CdCl2; 3 0,5 mM de CdCl2; 4 controle; 5 0,05 mM de
CdCl2; 6 0,5 mM de CdCl2; (A) 1 dia; (B) 2 dias; (C) 4 dias e (D) 8 dias
.
A
B
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
I
II
III
IV
V
VI
VII
VIII
IX
X
P 1 2 3 P 1 2 3
B A
C D
51
2.3.1.2 Determinação de isoformas de SOD
As isoformas de SOD foram determinadas em gel de PAGE desnaturante, foram
encontradas isoformas do tipo Cu/Zn-SOD ( I, II, IV, V, VI, VII, VII, IX, e X) e uma do tipo Mn-
SOD (III), não foram encontradas isoformas do tipo Fe-SOD (Figura 5).
Figura 6 - Perfil eletroforético das isoformas de SOD encontradas em folhas de aguapé submetidas a diferentes
concentrações de CdCl
2
. (C) controle; (H
2
O
2
) tratamento com peróxido de hidrogênio e (KCN) tratamento
com cianeto de potássio
2.3.2 Atividade de catalase
A catalase (CAT) é uma enzima Fe porfirina tetramérica que catalisa a conversão do H
2
O
2
em H
2
O e O
2
. A enzima é um dos principais constituintes da matriz dos peroxissomos em tecidos
fotossintetizantes (IGAMBERDIEV; LEA, 2002; REUMANN; WEBER, 2006).
H
2
O
2
C
I
II
III
IV
KCN
V
VI
VII
VIII
IX
X
52
Em folhas de aguapé expostas ao metal foi observado um aumento da atividade da CAT
nas doses 0,05 e 0,50 mM de Cd, sendo que nas plantas submetidas a maior dose foram
verificadas as maiores atividades da enzima (Figura 7A).
Com dois dias de exposição as plantas submetidas a dose menor tiveram a atividade da
enzima reduzida ao nível do controle em folhas, enquanto que a dose maior de Cd promoveu um
expressivo aumento da atividade da enzima (Figura 7A), este comportamento foi mantido pelas
plantas no decorrer do experimento, embora a partir do segundo dia de exposição à maior dose do
metal, a atividade da CAT tenha revelado uma pequena diminuição. Nossos resultados sugerem
que o Cd levou a um aumento de H
2
O
2
e consequentemente a uma elevação na atividade de CAT
na tentativa de reduzir os danos causado pelas EAOs.
Em raízes este padrão se repetiu, a atividade da CAT apresentou um aumento em plantas
expostas a dose maior do metal depois de um dia de exposição, enquanto nas plantas expostas a
dose menor a enzima apresentou uma queda na atividade (Figura 7B). Nos demais tempos de
exposição ao Cd a atividade da enzima não foi detectada (Figura 7B).
A elevação na atividade da CAT foi associada à toxicidez de Cd em Agropyron repens
(BREJ, 1998), H. vulgare (WU et al., 2003), B. juncea (SINGH.; TEWARI, 2003), H. annuus
(GALLEGO et al., 1999), nódulos de G. max (BALESTRASSE et al., 2001), variedades
tolerantes de S. tuberosum (STROINSKI; KOZLOWSKA, 1997), raízes de plântulas de rabanete
(VITÓRIA et al., 2001), culturas de calos de cana-de-açúcar (FORNAZIER ET AL., 2002a) e
células de café. (GOMES-JUNIOR, et al., 2006), por outro lado diversas culturas apresentaram
queda na atividade da CAT, como por exemplo, em folhas de girassol (GALLEGO et al., 1996),
Phaseolus vulgaris (CHAOUI et al., 1997), Phaseolus aureus (SHAW, 1995), Pisum sativum
(DALURZO et al., 1997), Lemna minor (MOHAN; HOSSETTI, 1997), Amaranthus lividus
(BHATTACHARJEE, 1998), raízes de soja (BALESTRASSE, 2001), Phragmitis australis
(IANNELLI et al., 2002) e pimentas (LEÓN et al., 2002).
Em plantas de aguapé foram identificadas duas isoformas de CAT em PAGE (Figura 8),
com uma diferença na intensidade das bandas, evidenciando a existência de uma isoenzima com
maior participação na atividade total da CAT (Figura 8). O número de isoformas não foi alterado
pela presença de Cd (Figura 8).
As plantas superiores contêm múltiplas isoenzimas de CAT, desde uma em cana-de-
açúcar (FORNAZIER et al., 2002b), uma em células de café (GOMES-JUNIOR et al., 2006),
53
uma em soja (FERREIRA et al., 2002b), uma em Crotalaria juncea (PEREIRA et al., 2002) uma
em raízes de Euphorbia millii (DEWIR et al., 2006), cinco em cultura de calos de cana-de-açúcar
(FORNAZIER et al., 2002a), até mais de doze em Brassica. juncea (FRUGOLI et al., 1996).
54
2.3.2.1 Determinação da atividade da CAT em espectrofotômetro
Figura 7 - Atividade específica de catalase em (A) folhas e (B) raizes de plantas de aguapé submetidas a diferentes
concentrações de CdCl
2
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
50
100
150
200
250
300
350
Catalase (
µ
µ
µ
µ
mol/min/mg Prot)
Tempo (Dias)
A
B
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
50
100
150
200
250
300
350
Catalase (
µ
µ
µ
µ
mol/min/mg Prot)
Tempo (Dias)
Controle
0.05 mM
0.50 mM
55
2.3.2.2 Determinação da atividade de CAT em PAGE não desnaturante
Figura 8 - Perfil eletroforético de atividade de CAT em folhas de aguapé submetidas a diferentes concentrações de
CdCl
2
, sendo: P Padrão; 1 Controle 1 dia; 2 0,05 mM de CdCl
2
1 dia; 3 0,5 mM de CdCl
2
1 dia; 4
controle 2 dias; 5 0,05 mM de CdCl
2
2 dias; 6 0,5 mM de CdCl
2
2 dias. 7 Controle 4 dias; 8 0,05 mM de
CdCl
2
4 dias; 9 0,5 mM de CdCl
2
4 dias; 10 controle 8 dias; 11 0,05 mM de CdCl
2
8 dias; 12 0,5 mM de
CdCl
2
8 dias
P 7 8 9 10 11 12
I
II
B
4 dias 8 dias
I
II
P 1 2 3 4 5 6
A
1 dia 2 dias
56
2.3.3 Atividade de glutationa redutase
Em plantas a atividade de glutationa redutase (GR) em resposta ao Cd tem se mostrado
influenciada pela dose e pelo tempo de exposição, um aumento na atividade da enzima é
fundamental para a manutenção dos níveis de glutationa reduzida nas células vegetais, a
glutationa é essencial para a incorporação do Cd em fitoquelatinas ou mesmo para a ativação e
manutenção do ciclo ascorbato-glutationa (GRATÃO et al., 2005).
Em plantas de aguapé, a atividade da GR não foi detectada em espectrofotômetro em
nenhum dos tecidos testados, sendo somente determinada em PAGE não-desnaturante. Em folhas
a atividade de GR foi aumentada em resposta às duas doses de Cd utilizadas, o aumento foi
verificado nas plantas coletadas após um e dois dias de exposição, a atividade se mostrou
ligeiramente maior em plantas expostas a menor dose do metal (Figura 9A), o aumento da
atividade da GR em resposta a exposição inicial tem sido atribuído ao aumento nos níveis de
GSSG conseqüente da ativação do ciclo ascorbato-glutationa, a atividade da GR seria aumentada
na tentativa de manter os níveis de GSH através da reciclagem da GSSG (COBBETT;
GOLDSBROUGH, 2002; BECK et al., 2003). O aumento da atividade de GR pode mostrar uma
forte ligação com a síntese de fitoquelatinas, sendo necessária à identificação e posterior
quantificação deste composto para comprovar tal hipótese.
Em plantas expostas ao metal por quatro dias foi detectada uma queda na atividade da GR
nas duas doses do metal (Figura 9B), consequentemente levando a uma diminuição nos níveis de
GSH disponíveis para o ciclo ascorbato-glutationa, síntese de fitoquelatinas e/ou substrato para a
atuação da glutationa S-transferase.
Após oito dias de exposição, na menor dose do metal foi possível observar um aumento
na atividade da GR, diferentemente do observado nas plantas submetidas a maior dose de Cd,
onde a atividade da enzima apresentou uma queda acentuada (Figura 9B).
A atividade da GR aumentou em resposta ao Cd em várias espécies vegetais, como por
exemplo, rabanete (VITÓRIA et al., 2001), arroz (CARDOSO et al., 2002), crotalaria (PEREIRA
et al., 2002), Solanum tuberosum (STROINSKI et al., 1999), Capsicum annuum (LEÓN et al.,
2002), soja (FERREIRA et al., 2002b) e Phaeodactylum tricomutum (MORELLI; SCARANO,
2004), Bacopa monnieri L. (MISHRA et al., 2006), raízes de trigo (YANNARELLI et al., 2007),
57
Arabidopsis (CHO; SEO, 2005; SEMANE et al., 2007,). A atividade da GR diminuiu também em
Pisum sativum L. (RODRIGUEZ-SERRANO et al., 2006).
Foram encontradas em folhas de aguapé pelo menos seis isoformas da GR, duas
apresentaram uma intensidade maior de bandas no gel (I e II), sendo responsáveis por grande
parte da atividade total da enzima (Figura 9).
58
2.3.3.1 Determinação da atividade de GR em PAGE não desnaturante
Figura 9 - Perfil eletroforético de atividade de CAT em folhas de aguapé submetidas a diferentes concentrações de
CdCl
2
, sendo: P Padrão; 1 Controle 1 dia; 2 0,05 mM de CdCl
2
1 dia; 3 0,5 mM de CdCl
2
1 dia; 4
controle 2 dias; 5 0,05 mM de CdCl
2
2 dias; 6 0,5 mM de CdCl
2
2 dias. 7 Controle 4 dias; 8 0,05 mM de
CdCl
2
4 dias; 9 0,5 mM de CdCl
2
4 dias; 10 controle 8 dias; 11 0,05 mM de CdCl
2
8 dias; 12 0,5 mM de
CdCl
2
8 dias
P 1 2 3 4 5 6
I
II
III
IV
V
VI
P 7 8 9 10 11 12
I
II
III
IV
V
VI
A
B
4 dias
8 dias
1 dia
2 dias
59
2.3.4 Atividade de GST
As GSTs catalisam a adição da GSH para substratos hidrofóbicos eletrofílicos, sendo
induzidas em resposta ao estresse oxidativo, removendo metais pesados, herbicidas e outros
xenobióticos e é responsável pela principal via da eliminação de moléculas endógenas, como
metabólitos secundários (FOYER et al., 1997; DIXON et al., 2002).
A GSH é um antioxidante importante na defesa contra EAOs, utilizada na síntese
fitoquelatinas (PC), como poder redutor no ciclo ascorbato-glutationa, além disso a GSH é
utilizada como substrato para as GSTs na redução do H
2
O
2
(GRATÃO et al., 2005). A defesa
contra o estresse oxidativo exercida pela GSH está intimamente ligada aos seus níveis celulares, o
balanço GSSG/GSH é controlado em grande parte pela GR em células vegetais (NOCTOR et al.,
2002).
A atividade da GST foi determinada em folhas de aguapé (Figura 9) e apresentou um
aumento no primeiro dia de exposição ao metal em todas as doses utilizadas com destaque para
0,50 mM Cd. No mesmo período amostrado foi observado um aumento na atividade da GR
(Figura 8) corroborando a hipótese de que estes resultados levam a um acúmulo de GSH, o que
pode estar relacionado com a alta atividade da GST encontrada nestas plantas.
Nos demais tempos amostrados foi nítida a diminuição expressiva da atividade específica
da GST (Figura 10), indicando que em folhas de aguapé, possivelmente outra rota de
desintoxicação de Cd está atuando após o primeiro dia de exposição.
O aumento da atividade de GST em resposta ao Cd foi observado em raízes de
Phragmites australis (IANNELLI et al., 2002), bem como em folhas de Pisum sativum L. cv.
Azad (DIXIT et al., 2001).
60
2.3.4.1 Determinação da atividade da GST em espectrofotômetro
Figura 10 - Atividade especifica de GST em folhas de aguapé submetidas a diferentes concentrações de CdCl
2
2.3.6 Peroxidação de lipídios
A peroxidação de lipídios é um dos mais danosos efeitos do estresse provocado pelas
EAOs, causando danos as membranas celulares, podendo resultar em danos irreversíveis às
funções celulares. A peroxidação de lipídios pode ser provocada por radicais livres ou mesmo
H
2
O
2
que se acumulam nos tecidos das plantas onde a atividade das principais enzimas
antioxidantes, como as peroxidases, CAT e SOD, estejam suprimidas (SCANDALIOS, 1994;
FEUSSNER; WASTERNACK, 2002).
Neste estudo, danos nas membranas celulares das folhas de aguapé foram estimados
através da quantificação do ácido 2-tiobarbitúrico (TBARS), que reage com as EAOs e produz o
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
GST (unid. GST / mg Prot)
Tempo (Dias)
Controle
0,05 mM
0,50 mM
61
malondialdeído (MDA), um dos muitos produtos de baixo peso molecular formado pela
decomposição de compostos resultantes da peroxidação de lipídios e frequentemente utilizado
para determinar os níveis da peroxidação lipídica resultante dos danos oxidativos (DEWIR et al.,
2006).
Em folhas de aguapé, após dois dias de exposição ao Cd, foi possível observar um
aumento similar na concentração de TBARS nas duas concentrações do metal (Figura 10).
Diferentemente do ocorrido no quarto dia, onde houve um expressivo aumento de TBARS
somente nas plantas submetidas a maior concentração de Cd (Figura 11). Entretanto, no oitavo
dia de exposição ao metal, foi observada uma diminuição similar na concentração do composto
nas duas doses do metal, porém ainda neste período a concentração de TBARS foi maior nas
plantas tratadas em relação aquelas sem a presença de Cd (Figura 11). Diante disso, podemos
concluir que a maior taxa de peroxidação lipídica encontrada em folhas de aguapé foi observada
com quatro dias de exposição, o que pode ser relacionado com a diminuição da atividade
específica da CAT observada no mesmo tempo de amostragem, que provavelmente levou a um
aumento nos níveis de H
2
O
2
(Figura 7A).
O aumento nos níveis de TBARS relacionado à peroxidação lipídica em resposta ao
estresse por Cd tem sido relatado em várias espécies vegetais como em Helianthus annuus
(GALLEGO et al., 1996), Phaseolus vulgaris (CHAOUI et al., 1997), Pisum sativum
(SANDALIO et al., 2001), Brassica juncea (SINGH; TEWARI, 2003), A. thaliana (CHO; SEO,
2005), em folhas (HSU; KAO, 2007), e raízes de O. sativa (GUO et al, 2007), Hordeum vulgare
(WU et al., 2003), plântulas de tomate (MEDIOUNI et al., 2006), Phaseolus coccineus
(SKORZYNSKA-POLIT, KRUPA, 2006) e Bacopa monnieri L (MISHRA et al., 2006).
62
Figura 11 – Determinação indireta da peroxidação lipídica através de TBARS em folhas de aguapé submetidas a
diferentes concentrações de CdCl
2
2.3.1 Determinação de proteína
Em plantas de ervilhas expostas a diferentes concentrações de cádmio (Cd), níquel (Ni),
chumbo (Pb) e molibdênio (Mo), foi observada a queda na concentração de proteínas, esta variou
de acordo com o metal sendo que entre eles, o mais danoso foi Cd seguido do Pb, Ni e Mo
(KEVRESAN et al., 2001).
As EAOs podem afetar a funcionalidade das proteínas, oxidando suas cadeias laterais de
aminoácidos e/ou por reações secundárias com produtos aldeídicos da peroxidação lipídica,
reações primárias e secundárias, resultantes do estresse causado pelas EAOs, foram observadas
em ervilhas possivelmente induzindo a formação de grupos carbonil em suas proteínas
modificando sua estrutura e em conseqüência sua função (REINHECKEL et al., 1998;
SCANDALIOS et al., 2000).
Em folhas de aguapé a concentração de proteínas foi reduzida em plantas submetidas a
1 2 3 4
0,0000
0,0005
0,0010
0,0015
0,0020
0,0025
0,0030
0,0035
0,0040
0,0045
0,0050
TBARS (mmol/MF)
Tempo (Dias)
Controle
0.05 mM
0.50 mM
1 2
4 8
63
0,05 mM e a 0,50 mM de CdCl
2
após um dia de exposição, sendo a menor concentração
encontrada na dose menor do metal (Figura 12A), o mesmo comportamento foi observado nas
raízes, no mesmo tempo de amostragem (Figura 12B).
A partir de dois dias de exposição ao metal a concentração de proteína se manteve similar
em todos os tratamentos com exceção das plantas expostas a dose menor do metal por dois dias e
as plantas expostas a dose maior de Cd por quatro dias que apresentaram aumento na
concentração de proteínas.
A duas doses do metal reduziram a concentração de proteína em raízes de aguapé
impossibilitando a detecção pelo método utilizado a partir do segundo dia de exposição (Figura
12B), a diminuição na concentração de proteína em situações de estresse foi observado também
em folhas de arroz (HSU; KAO, 2007)
O perfil protéico das folhas de aguapé foi determinado em SDS-PAGE, onde foram
observadas diferenças entre os tratamentos, com ulteração no perfil de bandas em função das
doses de Cd utilizadas. Em folhas submetidas a 0,05 mM de Cd após oito dias de tratamento
ocorreu o desaparecimento de pelo menos duas bandas de 50 e 60 kDa e de um agrupamento de
bandas compreendido entre 160 e 220 kDa (Figura 13), entretanto uma análise densitométrica se
faz necessário para a confirmação destas alterações.
64
2.3.1.1 Método de Bradford
Figura 12 - Concentração de proteína total solúvel em plantas de aguapé submetidas a diferentes concentrações de
CdCl
2
,
determinada pelo método de Bradford. (A) folhas e (B) raízes
1 2 3 4
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Proteína (mg/mL)
Tempo (Dias)
Controle
0,05 mM
0,50 mM
1 2 4 8
A
1 2 3 4
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Proteína (mg/mL)
Tempo (Dias)
Controle
0,05 mM
0,50 mM
B
1 2 4 8
65
2.3.1.2 SDS-PAGE
O perfil protéico das amostras de folha de aguapé foi determinado através de um gel SDS-
PAGE, foram encontradas grandes variações no número, ou na intensidade das bandas (Figura
14).
Figura 13 – Perfil protéico em gel de poliacrilamida (SDS-PAGE) de folhas de aguapé submetidas a diferentes
concentrações de CdCl
2
. P padrão, 1-controle 1 dia, 2-0,05 mM de CdCl
2
1 dia, 3-0,50 mM de CdCl
2
1
dia, 4-controle 2 dias, 5-0,05 mM de CdCl
2
2 dias, 6-0,50 mM de CdCl
2
2 dias, 7-controle 4 dias, 8-
0,05 mM de CdCl
2
4 dias, 9-0,50 mM de CdCl
2
4 dias, 10-controle 8 dias, 11-0,05 mM de CdCl
2
8
dias, 12-0,50 mM de CdCl
2
8 dias
1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 P
220
160
120
100
90
50
70
60
80
40
30
25
20
10
15
8 dias
4 dias
2 dias 1 dia
66
2.3.7 Quantificação de compostos nitrogenados
2.3.7.1 Análise quantitativa de aminoácidos
Metais pesados quando em excesso nas células vegetais, causam danos no metabolismo
de macromoléculas como proteínas, alterando a atividade de enzimas chave para o perfeito
funcionamento do metabolismo, levando a uma alteração na concentração de proteínas e
aminoácidos solúveis (JHA; DUBEY, 2004; SHARMA; DUBEY, 2005).
O acúmulo de soluto é uma estratégia importante para a resistência e sobrevivência das
plantas ao estresse (SAKAMOTO; MURATA, 2000), um aumento nos níveis de aminoácidos
solúveis tem sido relatado como sinalizador de danos em plantas submetidas a algum tipo de
estresse (EL-SHINTINAWY; EL-ANSARY, 2000).
A concentração de aminoácidos se mostrou maior em folhas (Figura 14A) quando
comparados com raízes (Figura 14B), de maneira geral o metal aumentou a concentração de
aminoácidos solúveis em folhas e diminuiu em raízes, com exceção para as quedas encontradas
em folhas submetidas a 0,50 mM de CdCl
2
por 4 dias e a 0,05 mM de CdCl
2
por 8 dias, ou ainda
em raízes submetidas a menor dose do metal por um e oito dias que apresentaram um aumento na
concentração de aminoácidos.
O tempo de exposição também influenciou a concentração de aminoácidos solúveis em
folhas de aguapé, em plantas expostas por oito dias ao metal foi observado a maior concentração
do metal (Figura 14A), resultados que possivelmente estão ligados a um aumento da hidrólise de
proteínas nas células submetidas ao metal, a atividade das proteases é elevada em plantas
expostas a estresse, na tentativa de aumentar o suprimento de aminoácidos solúveis, utilizados na
síntese de novas proteínas ou mesmo na sinalização para propagação (VIESTRA, 1996).
Foi observado o aumento da concentração de aminoácidos solúveis foi como resposta ao
estresse por Cd em raízes de cevada (WU et al., 2004), folhas de arroz (HSU; KAO, 2004), em
plantas de tomate (CHAFFEI, et al., 2004).
67
Figura 14 – Determinação da concentração de aminoácidos solúveis em plantas de aguapé submetidas a diferentes
concentrações de CdCl
2
,(A) folha e (B) raízes
1 Dia 2 Dias 4 Dias 8 Dias
0
500
1000
1500
2000
2500
Aminoácidos (
µ
µ
µ
µ
mol/mL)
Tempo (Dias)
Controle
0,05 mM
0,50 mM
1 2 4 8
B
1 Dia 2 Dias 4 Dias 8 Dias
0
500
1000
1500
2000
2500
Aminoácidos (
µ
µ
µ
µ
mol/mL)
Tempo (Dias)
Controle
0,05 mM
0,50 mM
1 2
4 8
A
68
2.3.7.2 Análise qualitativa de aminoácidos por cromatografia líquida de alto desempenho
(HPLC)
Aminoácidos são compostos fundamentais no metabolismo de nitrogênio, produtos
primários da assimilação do nitrogênio inorgânico e precursores de macromoléculas como
proteína e ácidos nucléicos, representam um papel essencial no metabolismo vegetal (HSU;
KAO, 2003).
Em função da relação direta com a assimilação do nitrogênio, os aminoácidos glutamato
(Glu), glutamina (Gln), aspartato (Asp) e asparagina (Asn) serão enfatizados na apresentação dos
dados.
A alteração na concentração dos aminoácidos foi verificada em folhas de aguapé
submetidas ao metal, com elevação de Asn nas folhas expostas a 0,05 e 0,50 mM de Cd após um
e quatro dias (Figura 15A,C) e a dose maior após oito dias (Figura 15B). O acúmulo de Asn na
parte aérea é importante para o metabolismo de nitrogênio, uma vez que o aminoácido está
envolvido na regulação e controle da atividade da nitrato redutase (NR), onde uma alta
concentração do aminoácido leva a uma redução na atividade enzimática, consequentemente
diminuindo a assimilação de nitrogênio na planta (BACANAMWO; HARPER, 1997, VADEZ et
al. 2000).
A concentração de Gln foi elevada em folhas de aguapé em resposta ao metal nos dois
primeiros tempos amostrais (Figura 15A,B) e reduzida nos dois últimos (Figura 15C,D). Segundo
Amarante (2002), a queda nos níveis de Gln está correlacionada a um aumento de Asn em plantas
de soja, similarmente ao observado em aguapé.
Altos níveis de Asn levam a uma queda na concentração de Asp em milho (LOHAUS,
1998), em folhas de aguapé o comportamento foi confirmado, a concentração de Asp foi reduzida
em resposta à exposição ao metal (Figura 15A,C,D), com exceção das folhas expostas a menor
dose após dois dias, onde foi observado um aumento da concentração de Asp e uma redução de
Asn (Figura 15B). A queda nos níveis de Asp em resposta ao Cd foi observada em folhas de
cevada (WU et al., 2004) e de tomate (CHAFFEI et al., 2004).
A concentração de Glu apresentou uma redução em folhas de aguapé expostas ao metal
após quatro e oito dias (Figura 15C,D), indicando uma possível interferência do metal no
metabolismo de assimilação do nitrogênio.
69
Em raízes de aguapé a concentração dos aminoácidos de forma geral foi reduzida em
resposta à exposição ao metal (Figura 16A,B,C,D), comportamento inverso ao encontrado em
raízes de cevada submetidas ao Cd (WU et al., 2004).
Figura 15 – Determinação da concentração dos aminoácidos solúveis presentes em folhas de aguapé submetidas a
diferentes concentrações de CdCl
2
. D Aspartato, E Glutamato, N Asparagina, S Serina, Q Glutamina, H
Histidina, G Glicina, T Treonima, R Arginina, A Alanina, Y Tirosina, M Metionina, V Valina, F
fenilalanina, I Isoleucina, L Leucina e K Lisina (A) 1 dia, (B) 2 dias, (C) 4 dias e (D) 8 dias de
exposição ao CdCl
2
D E N S Q H G T R A Y M V F I L K
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
Concentração (nmol/mL)
Aminoácidos
Controle
0,05 mM
0,50 mM
D E N S Q H G T R A Y M V F I L K
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
Aminoácidos
Concentração (nmol/mL)
Controle
0,05 mM
0,50 mM
A B
D E N S Q H G T R A Y M V F I L K
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
Concentração (nmol/mL)
Aminoácidos
Controle
0,05 mM
0,50 mM
D E N S Q H G T R A Y M V F I L K
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
Concentração (nmol/mL)
Aminoácidos
Controle
0,05 mM
0,50 mM
C D
70
Figura 16 - Determinação da concentração dos aminoácidos solúveis presentes em raízes de aguapé submetidas a
diferentes concentrações de CdCl
2
. D Aspartato, E Glutamato, N Asparagina, S Serina, Q Glutamina, H
Histidina, G Glicina, T Treonima, R Arginina, A Alanina, Y Tirosina, M Metionina, V Valina, F
fenilalanina, I Isoleucina, L Leucina e K Lisina (A) 1 dia, (B) 2 dias, (C) 4 dias e (D) 8 dias de
exposição ao CdCl
2
D E N S Q H G T R A Y M V F I L K
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
Aminoácidos
Concentração (nmol/mL)
Controle
0,05 mM
0,50 mM
D E N S Q H G T R A Y M V F I L K
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
Concentração (mmol/mL)
Aminoácidos
Controle
0,05 mM
0,50 mM
C
D E N S Q H G T R A Y M V F I L K
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
Concentração (nmol/mL)
Aminoácidos
Controle
0,05 mM
0,50 mM
D
D E N S Q H G T R A Y M V F I L K
0
30
60
90
120
150
180
210
240
270
300
330
Concentração (nmol/mL)
Aminoácidos
Controle
0,05 mM
0,50 mM
A
B
71
2.3.7.3 Análise quantitativa de nitrato
O íon nitrato (NO
3
-
) é uma das muitas formas de nitrogênio disponíveis para a absorção
no solo (WILLIANS; MILLER, 2001), considerado juntamente com a Gln reguladores do
processo de assimilação de nitrogênio, visto que seus níveis celulares interferem na atividade de
enzimas chave da via de assimilação do nutriente (KAISER et al., 1999).
Em plantas de aguapé expostas ao Cd a concentração de nitrato se mostrou maior em
raízes (figura 17B) quando comparada com folhas (figura 17A). Uma elevação na concentração
do íon foi observada em folhas expostas a 0,05 e 0,50 mM de CdCl
2
após quatro dias (Figura
16A), similarmente ao observado naquelas submetidas a dose maior do metal após oito dias de
exposição (Figura 17A). Altas concentrações de nitrato nas células de aguapé indicam que o íons
foram absorvidos e translocados, revelando que o Cd possivelmente interferiu na assimilação do
nutriente, concomitantemente, os baixos níveis de Glu e Gln encontrados nas folhas de aguapé
corroboram com esta hipótese (Figura 15C,D).
Em raízes de aguapé a concentração de nitrato foi elevada em resposta às duas doses de
Cd já no primeiro tempo de amostragem (Figura 17B), evidenciando os danos ao metabolismo de
nitrogênio. A queda nos níveis de Glu e Gln nestas plantas sugere uma redução na assimilação do
íon (Figura 16A). Um aumento na concentração de nitrato foi observado também em raízes de
aguapé expostas ao Cd após quatro dias e a maior dose do metal após oito dias (Figura 17B). Esta
redução, associada aos baixos níveis de Glu e Gln observados (Figura 16C,D), pode indicar uma
interferência do metal na assimilação do nitrogênio.
72
Figura 17 – Determinação da concentração de nitrato em plantas de aguapé submetidas a diferentes concentrações de
CdCl
2
. (A) Folhas (B) Raízes.
1 Dia 2 Dias 4 Dias 8 Dias
0
10
20
30
40
50
60
Nitrato (
µ
µ
µ
µ
mol/g MF)
Tempo Dias
Controle
0,05 mM
0,50 mM
1
2 4 8
A
1 Dia 2 Dias 4 Dias 8 Dias
0
10
20
30
40
50
60
Nitrato (
µ
µ
µ
µ
mol/g MF)
Tempo (Dias)
Controle
0,05 mM
0,50 mM
1 2 4 8
B
73
2.3.7.4 Determinação de nitrogênio total
A alta relação C/N encontrada em plantas de aguapé possibilita a utilização da planta em
técnicas de compostagem para a produção de abudo orgânico, na alimentação animal, produção
de biodisel (JAYAWEERA; KASTURIARACHCHI, 2004).
A porcentagem de nitrogênio total em plantas de aguapé foi maior em folhas (Figura 18A)
em comparação com raízes (Figura 18B), a exposição ao metal não provocou alteração
expressiva nos diferentes tecidos avaliados, a maior alteração foi observada em folhas expostas
ao metal por 8 dias (Figura 18A), provavelmente em função de uma redução na absorção de
nitrato causado pela debilitação do sistema radicular das plantas expostas ao metal (Figura 22F).
Independentemente da variação nos niveis de nitrato (Figura 17) ou ainda da concentração
de aminoácidos solúveis (Figura 14) a concentração de nitrogênio total não foi influenciada pelo
dose de Cd ou mesmo tempo de exposição ao metal (Figura 18A,B).
74
Figura 18 – Determinação da porcentagem de nitrogênio total em plantas de aguapé submetidas a diferentes
concentrações de CdCl
2
. (A) folhas e (B) raízes
1 2 3 4
0
2
4
6
8
10
Nitrogênio (% MS)
Tempo (Dias)
Controle
0,05 mM
0,50 mM
1
2 4 8
A
1 dia 2 dias 4 dias 8 dias
0
2
4
6
8
10
Nitrogênio (% MS)
Tempo (Dias)
Controle
0,05 mM
0,50 mM
1 2 4 8
B
75
2.3.8 Atividade de nitrato redutase
A enzima nitrato redutase (NR) catalisa a redução do nitrato a nitrito, sendo a primeira
enzima na via de assimilação de nitrogênio e tem a sua atividade regulada por sinais metabólicos
e ambientais (KAISER et al., 1999). Compostos como o nitrato, substrato da NR, e a Gln,
produto final da via de assimilação do nitrogênio, regulam a atividade da enzima (McKINTOSH
et al., 1995).
Em folha de aguapé submetidas a 0,50 mM de CdCl
2
até dois dias foi observado um
aumento na atividade da NR (Figura 19A), após este período, foi observado uma redução
expressiva na atividade da NR, juntamente com a diminuição da concentração de Glu e Gln
(Figura 15C,D), produtos primários da assimilação do nitrogênio e aumento de Asn, considerado
inibidor da atividade da enzima (SIVASANKAR; OAKS, 1995; CAMARGOS et al., 2006).
Em raízes de aguapé, a exposição às duas doses do metal, provocou uma redução na
atividade de NR em todos os tempos amostrais (Figura 19B). Após quatro dias foi observada uma
alteração do sitio de redução do nitrato com uma queda na atividade da NR observado nas raízes
de todas as plantas e um aumento na atividade da enzima em folhas, provavelmente essa
alteração de sitio se deve a concentração de NO
3
-
na solução fornecida as plantas, visto que o
sitio de redução NO
3
-
pode ser determinado pela disponibilidade do íon (DRUART et al 2000).
76
Figura 19 – Determinação indireta da atividade de nitrato redutase, pela quantificação de nitrito em plantas de
aguapé submetidas a diferentes concentrações de CdCl
2
. (A) folhas e (B) raízes
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
20
40
60
80
100
Nitrito (
µ
µ
µ
µ
mol/g tec. fresco)
Tempo (Dias)
Controle
0,05 mM
0,50 mM
0 1 2 3 4 5 6 7 8
0
20
40
60
80
100
Nitrito (
µ
µ
µ
µ
mol/g tec. fresco)
Tempo (Dias)
Controle
0,05 mM
0,50 mM
A
B
77
2.3.9 Avaliação do conteúdo de clorofila por unidades de SPAD
A exposição ao Cd tem sido associada à diminuição nos níveis de clorofila e aumentos na
atividade de proteases semelhante aos níveis encontrados em tecidos senescentes (BOUSSAMA
et al., 1999). Em plantas de aguapé expostas ao metal foram notados sinais de senescência e
alteração no conteúdo de clorofila (Figura 22).
Em plantas de aguapé submetidas a 0,05 e 0,50 mM CdCl
2
a concentração de clorofila foi
expressivamente reduzida após oito dias de exposição ao Cd, com destaque para a dose maior que
apresentou uma queda mais acentuada (Figura 20), indicando uma redução acentuada na taxa
fotossintética induzida pelo Cd.
Figura 20 – Determinação de clorofilfa em folhas de Aguapé submetidas a diferentes concentrações de CdCl
2
.
1 dia 2 dias 4 dias 8 dias
0
20
40
60
80
100
120
140
Clorofila (Unid. SPAD)
Tempo (Dias)
Controle
0,05 mM
0,50 mM
1
2 4 8
78
2.3.10 Determinação de massa fresca
A geração de biomassa é umas das características mais acentuada em plantas de aguapé
(TAG EL-DIN, 1992), durante a condução deste estudo foi observado o aumento em 50% da
biomassa das plantas com oito dias de cultivo sem a presença do metal (Figura 21).
Visualmente as plantas de aguapé foram afetadas pelo Cd apresentando sinais de
senescência, deterioração do sistema radicular (Figura 22F) e diminuição de biomassa (Figura
21).
As plantas submetidas a 0,50 mM de Cd foram as mais afetadas apresentando sintomas de
senescência mais acentuados (Figura 22C) e as menores taxas de crescimento (figura 21).
Figura 21 - Efeito do Cd no desenvolvimento e acúmulo de biomassa em plantas de aguapé submetidos a diferentes
concentrações de CdCl
2
1 dia 2 dias 4 dias 8 dias
0
50
100
150
200
250
Massa Fresca (g)
Tempo (Dias)
Controle
0,05 mM
0,50 mM
1 2 4 8
79
1.
Figura 22 - Efeito do Cd no desenvolvimento de diferentes tecido de aguapé submetidos a diferentes concentrações
de CdCl
2
, após 8 dias de exposição. (A) Folhas controle, (B) folhas 0,05 mM de CdCl
2
, (C) folhas 0,50
mM de CdCl
2
, (D) raízes controle, (E) raízes 0,05 mM de CdCl
2
, (F) raízes 0,50 mM de CdCl
2
D
A B C
E
F
80
2.4 Connsiderações finais
A exposição ao Cd promoveu respostas distintas em plantas de aguapé em função da dose
utilizada e do tempo de exposição, plantas submetidas a 0,50 mM de CdCl
2
, apresentaram danos
mais expressivos e alterações mais acentuados no metabolismo antioxidante e de nitrogênio. A
diferença na dimensão dos danos causados pelo Cd foi também observada nos diferentes tecidos
analisados, aparentemente a raiz se mostrou mais sensível ao metal, sendo primeiramente afetada
e apresentando uma maior extensão dos danos. As alterações provocadas pelo metal, tanto no
crescimento como no acúmulo de biomassa em plantas de aguapé, poderão interferir no papel
fitorremediador desta espécie vegetal.
As pequenas alterações metabólicas e nas taxas de crescimento das plantas de aguapé
expostas a 0,05 mM de CdCl
2
credenciam a planta para o uso na fitorremediação, contudo a
eficiência do aguapé como ferramenta nesta tecnologia está diretamente ligada a sua capacidade
reprodutiva e de acúmulo de biomassa, características que dificultam o manejo, fazendo
necessário o desenvolvimento de técnicas mais aprimoradas.
O sucesso do uso do aguapé em uma infinidade de aplicações deixa clara a importância da
planta para a solução potencial de vários problemas ambientais, porém estudos adicionais são
necessários para um maior entendimento do seu metabolismo e para que os eventuais problemas
ocasionados pelo uso da planta possam ser contornados.
81
3 CONCLUSÕES
1 – 0,50 mM de CdCl
2
induziu estresse oxidativo acima da capacidade de recuperação das plantas
de aguapé.
2 –0,05 mM de CdCl
2
não promoveu danos oxidativos irreversíveis na plantas de aguapé.
3 – A SOD, CAT e GR foram mais efetivas no combate as EAOs provocadas por Cd.
4 – 0,50 mM de CdCl
2
induziu peroxidação lipidica em folhas de aguapé.
5 – A assimilação de nitrogênio em plantas de aguapé foi diminuída pelo Cd.
6 – O estresse oxidativo induzido pelo Cd provocou diminuição no conteúdo de clorofila total.
7 – O estresse oxidativo provocado pelo Cd promoveu a diminuição no acúmulo de biomassa.
82
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