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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS,
DIVERSIDADE E RELAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA
DE Salmonella spp. ISOLADAS NA GRANJA DE
TERMINAÇÃO E ABATE DE SUÍNOS
Adélia Rodrigues Guimarães
Médica Veterinária
UBERLÂNDIA – MINAS GERAIS – BRASIL
Agosto de 2010
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Livros Grátis
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UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS,
DIVERSIDADE E RELAÇÃO EPIDEMIOLÓGICA
DE Salmonella spp. ISOLADAS NA GRANJA DE
TERMINAÇÃO E ABATE DE SUÍNOS
Adélia Rodrigues Guimarães
Orientadora: Profa. Dra. Daise Aparecida Rossi
Dissertação apresentada à Faculdade de
Medicina Veterinária – UFU, como parte das
exigências para a obtenção do título de Mestre
em Ciências Veterinárias (Produção Animal).
UBERLÂNDIA – MINAS GERAIS – BRASIL
Agosto de 2010
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Dados Internacionais de Catalogação na Publicação (CIP)
Sistema de Bibliotecas da UFU, MG, Brasil.
G324a Guimarães, Adélia Rodrigues, 1967-
“Resistência aos antimicrobianos, diversidade e relação epide-
miológica de bactérias do gênero Salmonella spp isoladas na granja
de terminação e abate de suínos” [manuscrito] / Adélia Rodrigues
Guimarães. - 2010.
56 f. : il.
Orientadora: Daise Aparecida Rossi.
Dissertação (mestrado) - Universidade Federal de Uberlândia,
Programa de Pós-Graduação em Ciências Veterinárias.
Inclui bibliografia.
1. Microbiologia veterinária - Teses. I. Rossi, Daise Aparecida.
II.Universidade Federal de Uberlândia. Programa de Pós-Graduação
em Ciências Veterinárias. III.Título.
CDU: 579.62
UNIVERSIDADE FEDERAL DE UBERLÂNDIA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA
Programa de Pós-graduação em Ciências Veterinárias – Produção Animal
Dissertação defendida e aprovada em 25 de agosto de 2010, pela comissão
examinadora constituída por:
Profa. Dra. Daise Aparecida Rossi
Universidade Federal de Uberlândia
Profa. Dra. Maria Teresa Destro
Universidade de São Paulo
Profa. Dra. Rosineide Marques Ribas
Universidade Federal de Uberlândia
Prof. Dr. André Luiz Quagliato Santos
Coordenador do Programa de Pós-graduação Ciências Veterinárias
“O verdadeiro
caminho da sabedoria é
não ter medo de errar e
ter perseverança na
conquista de nossos
objetivos.”
AGRADECIMENTOS
Agradeço a Deus pela vida, pelas pessoas especiais e oportunidades de
aprendizagem colocadas em meu caminho.
Aos meus pais, Maria da Conceição R. Guimarães e Arnaldo Borges
Guimarães (in memorian) pelo amor, carinho e dedicação à família e pelos
exemplos de perseverança e fé que sempre demonstraram na conquista de
seus objetivos na vida.
Aos meus filhos, Eduardo Guimarães L. Paula, Enrique Guimarães L. Paula,
pelo carinho e alegria que me proporcionam em todo momento.
Ao meu esposo, Eudes L. de Paula, pelo carinho, apoio e companheirismo que
sempre teve comigo na alegria e nas adversidades da vida.
Aos funcionários do LABIO, Francesca e Liliane, pela amizade e ensinamentos
que me proporcionaram ao longo da nossa convivência. Aos amigos e
estagiários do LABIO, Eliane, Roberta, Belchiolina (Bia), Guilherme e Pedro
pelo trabalho em equipe e colaborações prestadas durante a realização do meu
projeto de pesquisa.
À Faculdade de Medicina Veterinária, em particular funcionários e docentes da
Pós-Graduação, por tornar possível a realização do meu Mestrado e à
FAPEMIG pelo financiamento desta pesquisa.
Em especial agradeço minha orientadora, Daise Aparecida Rossi, pela
compreensão, amizade, apoio incondicional e aprendizagem proporcionada ao
longo da nossa convivência e, sobretudo na realização deste trabalho. Para
mim, é um exemplo de ética, competência e sabedoria na arte de ensinar.
Dedico este trabalho a minha mãe, Maria da Conceição R. Guimarães, pelo
incentivo, apoio e por acreditar na concretização do meu mestrado. Pelos
exemplos de luta, paciência e tolerância nas adversidades da vida, que me
ensinaram a importância de ter perseverança e coragem na conquista de
nossos sonhos.
SUMÁRIO
Página
RESUMO ..................................................................................
vii
ABSTRACT .............................................................................. ix
1 INTRODUÇÃO ......................................................................... 1
2
2.1
2.2
3
OBJETIVOS .............................................................................
Objetivos gerais ........................................................................
Objetivos específicos ...............................................................
REFERENCIAL TEÓRICO .......................................................
3
3
3
4
3.1 Salmonella spp..........................................................................
4
3.2
3.2.1
3.3
Saúde pública e Salmonella spp. na cadeia produtiva de
suínos ......................................................................................
Resistência aos antimicrobianos ..............................................
Randon Amplified Polymorfic DNA(RAPD-PCR) ………………
6
11
15
4.
4.1
4.2
4.3
MATERIAIS E MÉTODOS .......................................................
Local ........................................................................................
Amostras utilizadas no estudo..................................................
Processamento das amostras .................................................
17
17
17
19
4.3.1
Identificação sorológica preliminar e completa.........................
20
4.4 Suscetibilidade aos antimicrobianos ........................................ 21
4.5
4.6
5.
Relação filogenética entre os isolados ....................................
Análise dos resultados ............................................................
RESULTADOS E DISCUSSÃO ...............................................
21
22
23
5.1 Identificação dos isolados ........................................................ 23
5.2
6.
7.
Perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos............................
CONCLUSÕES ........................................................................
TRABALHOS FUTUROS..........................................................
37
43
44
REFERÊNCIAS ........................................................................
45
RESISTÊNCIA AOS ANTIMICROBIANOS, DIVERSIDADE E RELAÇÃO
EPIDEMIOLÓGICA DE Salmonella spp. ISOLADAS NA GRANJA DE
TERMINAÇÃO E ABATE DE SUÍNOS
RESUMO - Salmonella spp. é um importante patógeno zoonótico que pode ser
disseminado ao longo da cadeia produtiva de suínos. Sua presença na carne
destes animais é causa de preocupação para os frigoríficos e risco para a
saúde pública. Foram utilizadas 86 amostras de Salmonella spp. previamente
isoladas na cadeia produtiva de suínos, provenientes de 90 amostras de fezes
suínas, 135 carcaças e 24 amostras ambientais. Objetivou-se determinar a
resistência aos antimicrobianos, identificar os sorovares e estabelecer a
relação filogenética entre eles pela técnica de RAPD-PCR. Foi realizada a
identificação sorológica preliminar com o antissoro polivalente somático “O” e
os monovalentes B, C e D, e em paralelo, foi realizada a caracterização
antigênica definitiva em laboratório oficial. A resistência aos antimicrobianos foi
determinada pelo método de difusão em discos, e a similaridade filogenética
entre isolados pela técnica de RAPD-PCR. Os sorovares identificados foram:
Typhimurium (32,55%), Agona (23,26%), Infantis (19,77%), Minnesota
(17,44%) e Panama (6,98%). Os dendrogramas demonstraram homologia
entre isolados dos diferentes sorovares agrupados em clusters. A similaridade
foi independente do local de isolamento, comprovando a presença de clones
ao longo da cadeia de produção. Indicaram também, que suínos excretando S.
Typhimurium nas fezes contribuem para a contaminação da carcaça e para a
contaminação cruzada, e que as condições de abate limitaram a sobrevivência
de S. Agona. Para estes dois sorovares, a ração possivelmente foi a fonte
primária de infecção dos animais na granja. Foi observada contaminação da
depiladeira com o mesmo clone de S. Minnesota identificado nas fezes, porém,
não houve isolamento nas carcaças. S. Panamá nas carcaças aparentemente
não está relacionada à infecção prévia dos animais. Isolamentos de S. Infantis
nas fezes foram relacionados à contaminação ambiental da granja ou à
infecção em etapas anteriores à terminação dos animais. Foi observado
padrão de multirresistência aos antimicrobianos testados para todos os
sorovares, com mais de 50% apresentando resistência a nove dos 11
antibióticos testados. As drogas mais efetivas foram o sulfazotrim e a
norfloxacina, com resistência de 16,3% e 54,6%, respectivamente. S.
Minnesota e S. Infantis apresentaram os mais elevados perfis de resistência ao
sulfazotrim. Os resultados desse estudo demonstram a necessidade de
monitoramento da resistência aos antimicrobianos de bactérias zoonóticas e
implantação de medidas de controle mais eficazes para controlar a presença e
persistência de Salmonella ao longo do processo produtivo de suínos como
forma de garantir a inocuidade do alimento e segurança do consumidor.
Palavras-chave: Salmonella, RAPD, suínos, resistência aos antimicrobianos
ANTIMICROBIAL RESISTANCE, DIVERSITY AND EPIDEMIOLOGICAL
RELATION OF Salmonella spp. ISOLATED FROM A FINISHING PORK
FARM SLAUGHTERHOUSE
ABSTRACT - Salmonella spp. constitute an important zoonotic pathogen that
may be disseminated widespread in the pork production chain. Its presence in
the meat of these animals is cause of concern to slaughterhouses and a risk to
human health. Eighty six samples of Salmonella spp. were used, previously
isolated from the pork production chain, from 90 samples of swine feces, 135
carcasses and 24 environmental samples. The objective of this study was to
determine the antimicrobial resistance, to identify the serotypes and to establish
the phylogenetic relationship among them through RAPD-PCR technique. The
serological identification was previously performed through O-somatic
polyvalent antiserum and B, C and D monovalent ones, and concomitantly, the
definite antigenic characterization tests were undertaken in official laboratory.
The antimicrobial resistance was determined through disk diffusion antibiotic
sensitivity testing, and the phylogenetic similarity among isolate samples
through RAPD-PCR technique. The identified serotypes as follows:
Typhimurium (32.55%), Agona (23.26%), Infantis (19.77%), Minnesota
(17.44%) and Panama (6.98%). The dendrograms demonstrated homology
among isolate samples from different serotypes grouped in clusters. The
similarity was independent from the place of isolation confirming the presence
of clones along the production chain. They also indicated swine that excrete
Salmonella Typhimurium in feces contribute to the contamination of carcasses
and to the cross contamination, and the slaughtering conditions limited the
survival of Salmonella Agona. In regard to those two serotypes, the animal feed
was probably the primary source of animal infection within the farm.
Contamination was observed in the pork’s epilator, where the same clone of
Salmonella Minnesota identified in swine feces was present, but there were no
isolate samples among carcasses. Salmonella Panamá among carcasses is
apparently not related to the previous infection of animals. Isolate samples of
Salmonella Infantis in swine feces were related to tenvironmental infection of
the farm or to the infection during anterior stages in relation to finishing animals.
Multiresistance pattern to antimicrobials was observed in all serotypes tested,
being more than 50% with resistance to nine out of the eleven tested
antibiotics. The most effective drugs were the Sulfazotrim and the Norfloxacin,
with resistance from 16.3% to 54.6%, respectively. Salmonella Minnesota and
Salmonella Infantis presented the most elevated pattern of resistance to
Sulfazotrim. The results of this study demonstrated the necessity of monitoring
the antimicrobial resistance of zoonotic bacteria and the implantation of more
effective manners to control the presence and persistence of Salmonella along
the pork production chain as a way to guarantee the innocuity of food and
consumer safety.
Keywords: Salmonella, RAPD-PCR, pork, antimicrobial resistance
1. INTRODUÇÃO
Salmonella é considerado o gênero mais complexo da família
Enterobacteriaceae, sendo descritos mais de 2500 sorovares (GRIMONT, WEILL
2007). Trata-se de um problema de saúde pública, considerando-se sua ampla
distribuição na natureza, seu caráter zoonótico e principalmente por acometer seres
humanos e animais indistintamente, tanto em países desenvolvidos como em
desenvolvimento (WEISS et al., 2002; EFSA, 2009).
A diversificação da produção industrial de alimentos de origem suína e o
intercâmbio comercial de animais e seus derivados destinados ao consumo humano
podem ser importantes disseminadores de sorovares de Salmonella spp. na cadeia
alimentar. Dessa forma, a presença desse microrganismo no processo de produção
representa uma importante barreira sanitária para o comércio de animais e seus
subprodutos (ALMEIDA et al., 2000; SEIXAS et al., 2009).
Produtos de origem suína merecem atenção como fontes potenciais de
salmoneloses que acometem humanos. A preocupação aumentou depois que surtos
de infecção alimentar ocorridos na Dinamarca tiveram sua origem associada ao
consumo destes produtos (FEDORKA-CRAY, 1996). Mais recentemente, Hill et al.
(2008) relataram que de 1% a 10% das salmoneloses humanas são atribuídas ao
consumo de carne suína e que 17% dos suínos em idade de abate podem estar
infectados por Salmonella spp. e 4% deles excretando o microrganismo nas fezes.
Diversos países possuem programas de controle para prevenir a
salmonelose, que incluem estudos que determinam a prevalência do microrganismo,
seus sorovares e biótipos como forma de subsídio às medidas de seu controle nos
rebanhos e na garantia da qualidade dos produtos oferecidos nos mercados
internos ou externos (EFSA, 2008a).
Segundo relatórios da EFSA (2008a), nos países da União Européia, em
2007, houve uma diminuição de 13,5% nos relatos de salmonelose em humanos em
relação a 2007. Porém, esta zoonose continua sendo a causa mais frequente de
infecções alimentares notificadas, representado 35% do total, seguida por vírus e
toxinas bacterianas. Entre as fontes alimentares mais comuns, a carne suína e seus
subprodutos foi a segunda mais incriminada representando 10% do total.
Em suínos, poucos sorovares de Salmonella spp. causa doença, como S.
Choleraesuis e S. Typhimurium, e podem se manifestar como uma septicemia
aguda ou como uma enterocolite aguda ou crônica (BARCELLOS et al., 1984;
SOBESTIANSKY et al., 1999). Porém, estudos demonstram que sorovares
considerados específicos de uma espécie animal, como S. Choleraesuis para
suínos e S. Pullorum para galinhas, apesar de causar doença clínica, não são os
principais envolvidos na contaminação da carne e de seus produtos (WILCOCK,
SCHWARTZ, 1993; FEDORKA-CRAY, GRAY, 1996). Isso ressalta a importância de
animais com infecção assintomática.
Bactérias do gênero Salmonella são isoladas em todo o mundo, no entanto,
em áreas de criação animal intensiva, principalmente de suínos e aves, os relatos
são ainda mais frequentes (OIE, 2004). O aumento da densidade e o uso
indiscriminado de antibióticos, inseridos no processo de produção de alimentos de
origem animal, podem funcionar como pressão de seleção para alguns sorovares e
para a resistência desses aos antimicrobianos.
Segundo Wray e Sojka (1977) é amplamente aceito que os animais
infectados com Salmonella são as maiores fontes de infecção para outros animais e
seres humanos. Assim, é importante o monitoramento constante com identificação
dos sorovares e estabelecimento da relação epidemiológica desses ao longo da
cadeia de produção. A resistência aos antimicrobianos também deve ser
determinada para verificar se há aquisição e disseminação desse perfil (EFSA,
2008b).
Conhecer resistência às drogas antimicrobianas, sorovares e relação
filogenética entre espécimes de Salmonella spp. isolados nos diferentes pontos da
cadeia produtiva de suínos poderá contribuir para o melhor entendimento do
comportamento do microrganismo e gerar informações que podem auxiliar na
implantação de medidas de controle efetivas para a produção de alimentos seguros.
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral
Estabelecer a relação entre espécies de Salmonella spp. isoladas em granja
de terminação de suínos e no frigorífico, sua disseminação e presença na carne
produzida.
2.2. Objetivos específicos
Avaliar Salmonella spp. provenientes de swabs retais e de carcaças suínas,
isoladas por meio da:
- identificação dos sorovares mais frequentes em fezes de animais vivos nas
granjas produtoras e após o transporte ao frigorífico;
- avaliação de sorovares mais frequentemente isolados nas etapas de abate,
após depilação, em linfonodos da cadeia mesentérica e após serragem da carcaça;
- determinação da susceptibilidade dos isolados frente aos antimicrobianos;
- identificação dos sorovares em ração e utensílios utilizados no abate, e
discussão da sua relação com os isolados em animais vivos e em carcaças;
- comparação dos resultados obtidos na sorologia preliminar com antisoros B, C
e D e identificação antigênica em laboratório oficial;
- avaliação da relação filogenética entre os microrganismos isolados.
3. REFERENCIAL TEÓRICO
3.1. Salmonella spp.
O gênero Salmonella pertence à família Enterobacteriaceae. São bacilos
gram negativos, anaeróbios facultativos e não formadores de esporos. Fermentam
glicose, reduzem nitratos a nitritos e não produzem citocromo oxidase. A maioria é
móvel por possuírem flagelos peritríquios (FORBES, 2002; MARTINEZ, 2006;
LOUREIRO et. al, 2010).
Métodos moleculares demonstram que o gênero consiste de duas espécies:
S. enterica e S. bongori (LE MINOR e POPOFF, 1987; REEVES et al., 1989). Uma
terceira espécie denominada de S. subterrânea foi descrita por Shelobolina et al.
(2004), mas, segundo Grimont e Weill (2007), esta não pertence ao gênero
Salmonella.
Baseado em reações bioquímicas, por meio da utilização de carboidratos,
proteínas e produção de gás, a espécie enterica foi subdividida em seis
subespécies: I- enterica; II- salamae; IIIa - arizonae; IIIb- diarizonae; IV- houtenae;
V- indica (TOZETTO, 2006; LOUREIRO et al., 2010).
A forma de citação para designar membros do gênero Salmonella é a
seguinte: Salmonella enterica subsp. enterica sorovar Typhimurium ou,
simplesmente, Salmonella Typhimurium, com o nome do gênero, espécie e
subespécie em itálico e do sorovar em tipo romano. Na rotina, utiliza-se o esquema
de Kauffmann-White na caracterização antigênica de bactérias do gênero,
determinando-se as frações dos antígenos somáticos (O) de natureza
polissacarídica, e as nove estruturas flagelares (H), que são de natureza protéica
(LOUREIRO et al, 2010).
De acordo com Grimont e Weill (2007) há um total de 2.579 sorovares
isolados de Salmonella spp. Desses, 22 pertencem à espécie S. bongori e a maior
parte, à espécie enterica subsp. enterica com 1.531 espécimes.
Salmonella spp. está amplamente difundida na natureza, sendo encontrada
no trato gastrointestinal de mamíferos, aves, répteis e insetos. Em seres humanos
podem causar doenças como a febre tifóide, bacteremia, gastroenterite e infecções
focais. Alguns sorovares têm seu hábitat limitado, sendo denominados hospedeiros-
específicos, como os sorovares Typhi e Paratyphi A para seres humanos,
Abortusovis para ovelhas, Gallinarum e Pullorum para aves e Choleraesuis para
suínos. Porém há sorovares que podem infectar animais e seres humanos
indistintamente (LOUREIRO et al., 2010).
O consumo de alimentos contendo bactérias patogênicas em doses
infectantes é um problema de saúde pública. Alimentos a base de carne e ovos têm
sido os mais correlacionados como veiculadores da salmonelose para seres
humanos, embora muitos outros alimentos possam ser contaminados
secundariamente (EFSA, 2009).
A frequência de isolamento de Salmonella spp. em alimentos é um fator de
risco de infecção alimentar para seres humanos. A avaliação dos sorovares de
Salmonella spp. isolados de alimentos foi relatada por vários autores.
Dezessete sorovares de Salmonella spp. foram identificados na Região de
São José do Rio Preto-SP entre os anos de 1990 a 1999 a partir de fezes de
humanos com infecção clínica. Foi observado aumento na freqüência de isolamento
de S. Enteritidis a partir de 1992. Nos isolados fecais, verificou-se uma
predominância de S. Enteritidis (76,3%) e o surgimento de outros sorovares, embora
em porcentagens menores: S. Emek, S. Agona, S. Ohio, S. Bredeney e S. Javiana.
Em alimentos envolvidos em doenças, S. Enteritidis também foi a mais frequente
(56,2%) havendo uma maior diversificação de sorovares em carnes e especiarias.
S. Oranienburg foi detectada somente em especiarias e temperos. Nas carnes e
derivados foram identificados S. Enteritidis, S. Albany, S. Agona, S. Infantis e S.
Mbandaka (ALMEIDA et al., 2000).
Gutiérrez et al. (2000) identificaram antigenicamente como Salmonella,
24.394 microrganismos isolados nos serviços públicos do México durante os anos
de 1972 a 1999. Destes, 15.843 (64,9%) possuíam origem humana e 8.551 (35,1%)
eram de fonte não humana. Foram identificados 199 sorovares, sendo os mais
frequentes em amostras clínicas humanas: S. Typhimurium (20,4%), S. Enteritidis
(18,3%), S. Agona (5,4%), S. Newport (5,6%), S. Derby (4,2%), S. Anatum (3,8%) e
S. Heidelberg (3,9%). Já em amostras não humanas as mais frequentes foram: S.
Derby (13,8%), S. Anatum (8,7%), S. Agona (7,5%), S. Typhimurium (6,8%), S.
Enteritidis (6,7%), S. Newport (2,7%) e S. Heidelberg (2,5%). Dos isolamentos de
amostras não humanas, 57,6% foram oriundos de alimentos, dentre eles, 51% de
alimentos prontos para consumo, 4,5% de água e 37,9% de amostras ambientais.
Os autores destacaram como importante o isolamento de S. Worthington nas
amostras provenientes de seres humanos (2,2%), pois há seu relato em 1975 em
amostra de água e os níveis de isolamento mantiveram-se em menos de 1% em
1991.
3.2. Saúde pública e Salmonella spp. na cadeia produtiva de suínos
A salmonelose é uma das principais causas de gastroenterite em humanos
veiculada por alimentos em todo o mundo, sendo considerada um importante
problema de saúde pública tanto em países industrializados como em
desenvolvimento (EFSA, 2009; EFSA, 2010; LOUREIRO et al, 2010).
Segundo dados da Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA)
divulgados no Global Salmonella Surveillance no Rio de Janeiro, Salmonella spp. foi
o agente etiológico mais prevalente nas doenças transmitidas por alimentos no
período de 1999 a 2004 no Brasil. Os sorovares mais frequentemente envolvidos
foram: S. Enteritidis, S. Typhimurium, S. Panama, S. Agona, S. Mbandaka, S.
Senftenberg, S. Infantis, S. Hadar e S. Anatum (RODRIGUES, 2005).
Tozetto (2006) identificou 102 estirpes de Salmonella enterica isoladas no
período de outubro de 2002 a maio de 2004 no Estado do Paraná, provenientes de
22 surtos notificados de doença gastrointestinal e 26 casos de infecção esporádica
(duas meningites, uma bacteremia, uma infecção urinária e 22 gastroenterites). Os
sorovares mais prevalentes foram: S. Enteritidis (82,36%), S. Livingstone (4,90%),
S. Muenster (2,94%), S. Panama (1,96%), já S. Typhimurium, S. London, S. Derby,
S. Saintpaul, S. Weltevreden e a soma de S. Newport e S. Javiana representaram
0,98% dos isolamentos.
Borch et al. (1996) relacionaram na Dinamarca, a contaminação bacteriana
de carcaças suínas durante o abate com casos de infecções humanas de causa
alimentar. Salmonella spp., Campylobacter jejuni e/ou C. coli e Yersínia
enterocolítica foram os patógenos mais predominantes em fezes e carcaças de
suínos e em amostras ambientais provenientes de abatedouros. No mesmo ano,
1994, 85% dos casos de gastroenterites de origem alimentar em seres humanos
naquele país foram causados por Salmonella spp.
Em países da União Européia, segundo a EFSA (2009), Salmonella spp. foi a
maior causa de surtos de infecção alimentar notificados em seres humanos. Animais
de produção e seus subprodutos foram as principais fontes de disseminação desses
patógenos. Neste mesmo relatório, há registros de que, no ano de 2008, nos 21
países membros da União Européia, 28,7% e 33,3% das propriedades criadoras
comerciais e produtoras de suínos, respectivamente, foram positivas para
Salmonella spp.
O relatório da EFSA (2008a) sobre fontes de salmonelose humana demonstra
que o consumo de alimentos de origem animal foi responsável por 90% a 95% dos
casos. Apesar de ovos e seus subprodutos serem as fontes mais frequentemente
implicadas, a carne também representa um importante veículo de disseminação,
com aves e suínos apresentando maior envolvimento nos casos de surtos. Para a
infecção com S. Typhimurium, a exposição ocupacional e o consumo de carne crua
foram identificados como principais fatores de risco.
De acordo com o CDC (2006), somente nos Estados Unidos são constatados,
por ano, cerca de 76 milhões de casos de doenças atribuídas ao consumo de
alimentos contaminados, com 325 mil hospitalizações e morte de 5,2 mil pessoas.
Além das perdas humanas, há também prejuízos na forma de custos, com gastos
de sete bilhões de dólares com despesas médicas e na diminuição da
produtividade, que equivale a 37 bilhões de dólares. Segundo esta instituição norte-
americana somente a Salmonella spp. é responsável por 1,4 milhões casos de
infecção alimentar por ano, ocasionando cerca de mil óbitos.
A infecção dos animais ou a contaminação das carcaças de suínos por
Salmonella spp. pode ocorrer nas diferentes etapas da produção de suínos.
Primariamente, as fontes de infecção podem ser animais pertencentes ao próprio
grupo, animais de outros grupos da mesma granja ou fatores externos como ração,
pessoal ou vetores, como roedores (VAN DER GAAG et al., 2004).
Suínos que apresentam Salmonella spp. em linfonodos mesentéricos podem
ser considerados portadores de infecção prévia ocorrida na granja produtora. Esses
animais podem excretar Salmonella spp. nas fezes e contaminar outros suínos, que
albergam a bactéria no conteúdo intestinal, tornando-se disseminadores passivos
(MORROW, DAVIES, 2000).
A maioria dos sorovares de Salmonella spp. que infectam suínos não causam
doença clínica nesses animais. Todavia, mesmo animais aparentemente saudáveis
podem excretar a bactéria de forma intermitente pelas fezes e, assim, contaminar o
ambiente e outros animais (WILCOCK; SCHWARTZ, 1993; CASTAGNA, et al.,
2004).
Os principais veículos de Salmonella que causam infecções em seres
humanos são os alimentos de origem animal e as granjas de criação (EFSA, 2009).
Segundo esse órgão, na União Européia em 2008, a prevalência de Salmonella spp.
foi maior que 50% nas propriedades produtoras e criadoras de suínos abrangendo
diferentes etapas da cadeia produtiva. Os sorovares mais frequentes foram S. Derby
(29% dos criadores e 28,5% produtores) e S. Typhimurium (25,4% dos criadores e
20,1% dos produtores); os sorovares S. Rissen e S. Infantis representaram cerca de
7% das identificações em ambos os tipos de propriedades. Já nos casos de
salmonelose humana, S. Typhimurium foi o sorovar mais isolado na União Européia
no mesmo ano.
Espécimes de Salmonella spp. isoladas de diversas amostras de suínos,
entre os anos de 1997 a 2002 na Espanha, foram armazenadas e sorotipadas na
Faculdade de Medicina Veterinária da Universidade Autônima de Barcelona. De um
total de 135 isolados de Salmonella enterica subsp. enterica, 25 foram variantes do
sorovar Typhimurium estando em fase flagelar invertida, pois aparentemente
possuíam apenas uma das fases e não as duas, característica desse sorovar; 25
identificadas como S. Anatum, 12 como S. Tilburg, sete como S. Virchow , seis
como Choleraesuis e uma como Salmonella enterica subsp. enterica (4,5,12:-:-),
esta última pertencente ao sorogrupo B (DE LA TORRE et al., 2005).
Hill et al. (2008) estudaram a dinâmica da transmissão de Salmonella spp. na
cadeia produtiva de suínos na Inglaterra. Verificaram que de 1% a 10% das
salmoneloses que acometeram seres humanos, foram atribuídas ao consumo de
carne suína. No mesmo estudo, os autores classificaram os suínos em susceptíveis,
portadores, excretores e imunes. Segundo eles, a via oral-fecal é a principal forma
de infecção entre suínos, que a adquirem do ambiente nos primeiros estágios de
produção na granja. Desta forma, acreditam que 17% dos suínos em idade de abate
podem estar infectados por Salmonella spp. e 4% deles, eliminando o
microrganismo.
Um estudo realizado para verificar a presença de Salmonella spp. em três
frigoríficos do Estado do Rio Grande do Sul foi conduzido com amostras de fezes e
linfonodos de suínos coletados no momento do abate. A incidência de isolamentos
foi de 55,66% (125/226), sendo identificados 26 sorovares diferentes entre os 226
isolados. Os sorovares mais prevalentes foram: Typhimurium (24,3%), Agona
(19,9%), Derby (13,2%) e Bredeney (12%). Outros sorovares foram encontrados em
frequências menores (total 30%) como Panama, Newport, Anatum, Enteritidis,
Heidelberg, Infantis e Senftenberg. Também foi observado nesse estudo que S.
Choleraesuis, considerado o sorovar mais adaptado aos suínos e que está mais
correlacionado a sintomas clínicos, não foi isolado em nenhuma das amostras
pesquisadas (BESSA et al., 2004).
Também no Estado do Rio Grande do Sul, Weiss et al. (2002) coletaram
amostras de fezes por meio de swab retal em suínos em granjas de terminação. No
abatedouro coletaram linfonodos e conteúdo intestinal desses mesmos animais e
observaram a presença de Salmonella spp. em 6,4% das amostras de fezes, em
5,6% dos linfonodos e em 5,3% no conteúdo intestinal analisado. Porém, nas
amostras de swabs retais não houve isolamento de Salmonella spp., indicando que
esse tipo de material não foi o mais indicado para detectar animais excretores deste
agente. Foram identificados oito sorovares de Salmonella spp.: Agona, Bredeney,
Lexington, London, Mbandaka, Panama, Schwarzengrund, e os que não puderam
ser sorotipificados foram classificados como Salmonella spp. Os sorovares mais
prevalentes foram Agona e Bredeney.
Outro estudo correlacionou a presença de Salmonella spp. em amostras de
swabs de carcaças suínas durante o abate e de sangue dos mesmos animais
coletados durante a sangria em um frigorífico localizado no Estado de Santa
Catarina. Observou-se que elevado número de animais já chegavam ao abate
soropositivos para Salmonella spp. (71,1% das amostras de sangue coletadas),
sugerindo que a infecção foi adquirida no início da produção (creche, matrizes) ou
na terminação. Na sorotipagem dos isolados provenientes de carcaças houve
prevalência dos sorovares S. Typhimurium (46%) e S. Derby (26,7%) (SEIXAS et
al., 2009).
A investigação sobre a presença de Salmonella spp. em linguiça frescal suína
no Município de Lages em Santa Catarina, revelou que 27% das 200 amostras
coletadas em diferentes estabelecimentos comerciais apresentaram positividade
para esse agente. Dentre os isolados foram identificados diferentes sorovares:
Panama, Agona, Anatum, London, Infantis, Heidelberg, Schwarzengrund, e com
maior prevalência, S. Typhimurium e S. Derby (SPRICIGO et al., 2008).
A importância da qualidade das matérias-primas utilizadas na fabricação de
ração para animais de produção, do controle ambiental interno e do alimento
destinado aos animais, foi destacada no trabalho de Albuquerque et al. (1999).
Nesse estudo, foram analisadas 136 amostras de ingredientes utilizados para
fabricação de rações para animais e 43 amostras de rações prontas para o
consumo de aves e suínos. Salmonella spp. foi isolada em 19,85% das matérias-
primas, sendo que nos subprodutos de origem animal a presença foi de 50%, nos
derivados vegetais e industriais 12,5% e nos derivados lácteos 7,5%. Em rações
prontas, a bactéria foi isolada em 4,65% das amostras destinadas à alimentação de
aves e suínos. Os sorovares mais frequentes foram: S. Anatum, S. Senftenberg, S.
Newlands, S. Mbandaka, S. Cerro e S. Mokola.
Borch et al. (1996) relacionaram a contaminação de Salmonella spp. em
carcaças suínas durante o abate com os casos de infecções em seres humanos
causadas por alimentos contaminados pela mesma bactéria em países como
Dinamarca, Noruega e Suécia. Segundo os autores, as principais fontes de infecção
de Salmonella spp. para suínos são a ração, o ambiente e o contato com fezes
contaminadas. Também citaram que o estresse durante a produção é um fator
agravante, pois torna os animais mais vulneráveis a infecção. Contudo, os
programas de controle de pontos críticos e de higienização na produção e durante o
abate de suínos são importantes na prevenção desses patógenos.
3.2.1. Resistência aos antimicrobianos
O tratamento da salmonelose com medicamentos antimicrobianos não é
recomendado para a maioria dos casos que acometem indivíduos saudáveis. No
entanto, em idosos, pacientes muito jovens ou imunocomprometidos e quando há
infecção extra-intestinal, o uso de um antimicrobiano adequado é essencial. A
infecção com Salmonella resistente aos antimicrobianos pode representar um risco
para a saúde pública adicional àquele observado em infecções em que os
microrganismos são suscetíveis (EFSA, 2008b).
O alimento é considerado uma importante via de infecção por Salmonella,
incluindo cepas de Salmonella multirresistentes aos antimicrobianos. Surtos com
envolvimento destes microrganismos, onde o agente etiológico foi isolado de
animais, dos alimentos e dos pacientes são descritos por vários autores ao longo do
tempo. S. Typhimurium multirresistente, com resistência adicional a quinolona, foi
isolada de um surto em 1998 cuja fonte foi identificada na cadeia produtiva de
suínos (MOLBAK et al., 1999), e no mesmo ano, no Reino Unido, houve um surto
que envolveu mais de 200 pessoas, em que o veículo de infecção foi o leite
contaminado com S. Typhimurium DT 104, multirresistente, oriundo de uma fazenda
(WALKER et al., 2000).
Salmonella Typhimurium DT 104 é um fagotipo multirresistente epidêmico
(THRELFALL, 2000). Apesar de atualmente apresentar baixa incidência na Europa,
ainda representa risco significativo à saúde pública mundial. A cepa é tipicamente
resistente a ampicilina, cloranfenicol, florfenicol, espectinomicina, estreptomicina,
sulfonamidas e tetraciclinas (EFSA, 2008b).
Microrganismos patogênicos, resistentes aos antimicrobianos, veiculados por
alimentos são uma preocupação mundial. Wegener et al. (1999) já atribuíram o
aumento da resistência ao uso indiscriminado de antimicrobianos como promotores
de crescimento na produção animal e posterior disseminação dos genes que
carreiam esta resistência a outros microrganismos. Os autores recomendaram o uso
de redes de vigilância como forma de monitoramento e prevenção. Desde então, o
problema vem se agravando.
Hopkins et al. (2010) relataram a prevalência de S. enterica sorovar
4,{5},12:i:-, com resistência a ampicilina, estreptomicina, sulfonamidas e tetraciclina
em vários países europeus. As amostras eram provenientes de humanos, de suínos
e de produtos de origem suína entre 2006 e 2008. Os autores argumentaram que
este sorovar pode ser uma variante genética da S. Typhimurium DT 104, que teve
seus índices de isolamento reduzidos na Europa a partir de 2006.
Vários países ou associações monitoram a resistência aos antimicrobianos
de microrganismos transmitidos pelos alimentos. A resistência aos antimicrobianos
em Salmonella spp. isolada de carne suína foi relatada em cinco países membros
da União Européia. Os isolados, incluindo os sorovares Derby, Enteritidis, Infantis,
Londres, Saintpaul, Senftenberg, Typhimurium e Virchow e outros não identificados,
demonstraram resistência à ampicilina variando de 21% a 35%, sulfonamidas (36%
a 52%) e tetraciclina (38% a 59%). A resistência à ciprofloxacina e à enrofloxacina
foi observada na Dinamarca e Itália, respectivamente, em taxas de 1% e 0,6%
(EFSA, 2006).
No Brasil, entre os anos de 2004 a 2006 houve a implementação pelo
Ministério da Saúde do Programa PREBAF - Programa Nacional de Monitoramento
da Prevalência e da Resistência Bacteriana em Frango (carcaças congeladas),
como parte do conjunto de estratégias de ação definidas pela ANVISA para a área
de alimentos. O estudo foi realizado de acordo com recomendações do Codex
Alimentarius para programas de vigilância e controle sobre a resistência microbiana
em microrganismos zoonóticos transmitidos por alimentos (BRASIL, 2008).
O PREBAF permitiu o conhecimento de dados de pesquisa em vigilância
sanitária até então inexistentes, e seus resultados demonstraram os maiores
percentuais de resistência de Salmonella isolada de carcaças de frango para as
drogas: estreptomicina (89,3%), sulfonamida (72,4%), florfenicol (59,2%), ampicilina
(44,8%), ácido nalidixico (44,0%), ceftiofur (22,8%), aztreonam (20,4%),
enrofloxacina (18,4%), cefoxitina (17,3%) e cefalotina (12,4%). A determinação da
concentração inibitória mínima revelou que a totalidade das cepas apresentou
resistência a uma ou mais drogas, tendo sido reconhecidos 98 perfis de
multirresistência (>2 classes de antimicrobianos) em 192 (76,8%) cepas (BRASIL,
2008).
A sorotipagem pode fornecer informações úteis durante a investigação de
surtos, mas também sobre os riscos à população. A identificação antigênica tem
demonstrado que alguns sorotipos de Salmonella são mais observados em
determinados animais e/ou alimentos. Hald et al. (2007) verificaram que a
resistência de Salmonella aos antimicrobianos podia ser associada a sorovares
específicos e ao tipo de alimento onde era realizado o isolamento. Os autores
observaram na Dinamarca, em cepas isoladas de infecções, que havia
predominância de S. Typhimurium resistente às quinolonas em isolados
provenientes de ovos, carne de porco e carne bovina importados e carne suína
dinamarquesa.
Fernandes et al. (1992) selecionaram aleatoriamente 734 isolados de S.
Typhimurium e 631 de S. Agona provenientes de alimentos, ambiente, fezes e urina
humana, sangue, vísceras de animais, água de esgoto, ração animal e secreções,
no Instituto de Medicina Tropical de São Paulo entre os anos de 1971 a 1987.
Nestas amostras foram identificados 65 biótipos de S. Typhimurium e um biótipo de
S. Agona, sendo a maioria dos isolados multiresistentes a sulfonamidas e ao
sulfazotrim. Segundo os autores a maioria das infecções hospitalares adquiridas nas
enfermarias da pediatria nesse período, em São Paulo, foi causada por S.
Typhimurium multiresistente.
Um estudo para verificar a resistência aos antimicrobianos em Salmonella
spp. foi realizado na Alemanha no período de 2000 e 2002 no National Veterinary
Reference Laboratory for Salmonella. Dos isolados provenientes de alimentos
processados, 64% foram de origem avícola, 28% de origem bovina e 24% de origem
suína. A maioria dos isolados (63%) foi resistente a uma das drogas testadas e,
40% resistente a mais de um antibiótico. O sorovar mais frequentemente isolado de
suínos e produtos derivados foi S. Typhimurium, predominando na Germânia o
fagotipo DT104 (SCHROETER et al., 2004).
Nas regiões de Marche e Úmbria na Itália, foi pesquisada a prevalência de
Salmonella spp. em casos de enterites suínas. Os sorovares mais frequentes e a
sensibilidade aos aminoglicosídeos mais usados em animais nessas regiões. Dos
79 isolados, 47 foram identificados como Salmonella spp., prevalecendo os
sorovares Typhimurium (69%), Panama (7%) e outros (4%). Quanto à sensibilidade
antimicrobiana, 92,4% dos isolados foram sensíveis a apramicina, 77,25% à
gentamicina e 67,1% à tobramicina, mas 35,4% foram resistentes à estreptomicina
(MAGISTRALI et al., 2006).
Weiss et al. (2002) analisaram Salmonella spp. isoladas de amostras de
fezes, linfonodos e conteúdo intestinal de suínos de terminação no Rio Grande do
Sul, Brasil. Os testes de resistência aos antimicrobianos demonstraram 97% de
resistência à sulfonamida, 82,6% à estreptomicina, 36,9% à tetraciclina e 15,2% ao
sulfazotrim.
Em Santa Catarina, Menin et al. (2008) verificaram que as infecções entéricas
em suínos são responsáveis por 30% das perdas econômicas na suinocultura
industrial e 60% dos gastos com antimicrobianos na produção, sendo a Salmonella
spp. um dos principais patógenos envolvidos em casos de diarréia em suínos nas
diferentes faixas etárias. Nas amostras de Salmonella spp. isoladas houve maior
resistência aos antimicrobianos oxitetraciclina (77%) e tetraciclina (42,1%); e menor
resistência a gentamicina (3,5%) e amoxicilina (4,8%).
Tessmann et al. (2008) verificaram a susceptibilidade aos antimicrobianos de
S. Typhimurium, S. Panama e S. Infantis isoladas de cortes de carne suína
adquiridas em feiras-livres em Pelotas. Todos os isolados foram sensíveis aos
antimicrobianos trimetropim e cefoxitina e 39,1% dos isolados apresentaram padrão
de multirresistência. Todos os sorovares de S. Typhimurium e o isolado de S.
Panama apresentaram resistência a três ou mais antibióticos. Resistência a
tetraciclina foi observada em 100% dos isolados identificados como S. Typhimurium
e 7% de S. Infantis.
Spricigo et al. (2008) isolaram Salmonella de linguiça frescal suína no
Paraná, Brasil. Entre os isolados foi observada a resistência aos antimicrobianos,
sendo que 56,7% apresentaram resistência a pelo menos um dos 14
antimicrobianos testados e 20% apresentaram perfil de multirresistência (a quatro
ou mais antimicrobianos). Os maiores índices de resistência foram às sulfonamidas
(45%) e à tetraciclina (41,67%), enquanto nenhuma amostra foi resistente à
amoxicilina, gentamicina, neomicina, cefaclor e tobramicina. Um isolado, identificado
como sorovar Schwarzengrund apresentou resistência ao maior número de
antimicrobianos testados (50%), assim como os isolados identificados como sorovar
Typhimurium que apresentaram alta porcentagem (41,67%) de amostras
multiresistentes.
3.3. Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD-PCR)
Técnicas moleculares são cada vez mais utilizadas para estabelecer a
relação filogenética entre isolados bacterianos e fornecem importantes dados para o
entendimento da epidemiologia.
A técnica de Random Amplified Polymorphic DNA (RAPD-PCR) constitui uma
ferramenta amplamente utilizada em estudos de tipagem molecular de
microrganismos patogênicos, inclusive Salmonella, principalmente pela sua rapidez
(BETANCOR et al., 2004). Segundo LIN et al. (1996), os problemas de
reprodutibilidade podem ser superados com uso de primers apropriados.
As técnicas de RAPD-PCR e Salmonella Enteritidis Repeat Element (SERE-
PCR) foram utilizadas por Tozetto (2006) para analisar isolados de Salmonella spp.
em amostras clínicas de sete regiões do Estado do Paraná entre os anos de 2002 e
2004. Segundo o autor, a técnica de RAPD-PCR foi um método rápido,
relativamente barato e aplicável à tipagem de Salmonella, pois apresentou boa
reprodutibilidade e bom poder discriminatório, distinguindo 84 estirpes de
Salmonella Enteritidis e classificando-as em 11 grupos. Já a técnica de SERE-PCR
gerou perfis distintos para os diferentes sorovares de Salmonella, mas não foi capaz
de determinar diferenças entre os isolados de um mesmo sorovar, concluindo que o
RAPD-PCR apresenta maior nível de discriminação que SERE-PCR.
Oliveira et al. (2007) estudaram o envolvimento de S. Enteritidis em surtos de
origem alimentar no Rio Grande do Sul no período de 2001 a 2002 com o uso de
técnicas moleculares de ribotipagem e RAPD. Os autores concluíram que as
técnicas de ribotipagem e RAPD possuem bom poder discriminatório para avaliar
relação entre sorovares de Salmonella spp., ótima reprodutibilidade e apresentam
resultados semelhantes entre si. Citam ainda, que segundo Hudson et al. (2001), o
RAPD é um método rápido e poderoso, que demonstra grande poder discriminatório
entre sorovares de Salmonella spp., com resultados semelhantes aos obtidos na
técnica de PFGE (Pulsed Field Gel Electrophoresis). Segundo os autores é
importante a utilização de técnicas moleculares em diagnósticos, pois possibilitam
estudos epidemiológicos mais abrangentes dentro da cadeia produtiva.
A importância da otimização da técnica de RAPD-PCR foi ressaltada por
Tozetto (2006). O autor relatou que há alguns parâmetros que podem afetar a
análise por RAPD-PCR, como a temperatura baixa de anelamento entre 25ºC a
40ºC para a amplificação adequada, componentes do tampão como Mg
2+
, números
de ciclos entre 35 a 50, pois números menores resultam na ausência de algumas
bandas e padronização da técnica (preparo do DNA, volumes e concentrações
consistentes dos reagentes). Oliveira et al. (2007) complementaram que a
otimização cuidadosa dos fatores que podem interferir na reprodutibilidade do
método inclui a concentração de DNA alvo, primer e concentração de cloreto de
magnésio (MgCl
2
).
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Local
As fezes foram coletadas em uma granja de terminação de suínos e na
pocilga de espera de um frigorífico não exportador e sob inspeção municipal, ambos
em Uberlândia-MG, onde também foram coletadas as amostras das carcaças
suínas durante o abate. A coleta e isolamento de Salmonella spp. foram realizados
por Pacheco (2009).
Os isolados foram armazenados sob congelamento (-20ºC) no Laboratório de
Biotecnologia Animal Aplicada (LABIO-UFU), onde também foram realizados as
análises laboratoriais do presente estudo. A sorotipagem foi realizada no setor de
Enterobactérias da Fundação Osvaldo Cruz (FIOCRUZ) no Estado do Rio de
Janeiro.
4.2. Amostras utilizadas no estudo
Foram utilizados neste estudo 86 culturas de Salmonella spp. previamente
isoladas por Pacheco (2009), mantidas congeladas em caldo BHI (Difco®) com 15%
de glicerol. O tipo e número de amostras inicialmente coletadas por Pacheco (2009)
em cada etapa e o número de isolados estão discriminados na Tabela 1. As culturas
de Salmonella spp. foram isoladas em três lotes diferentes em coletas distintas,
onde foram amostrados fezes, ambiente, ração, água e swabs de carcaças. Em
cada um dos lotes foram coletadas amostras de 15 animais, sendo estes animais
amostrados brincados para identificação. As coletas subseqüentes nos pontos pré-
determinados foram sempre realizadas nos mesmos animais.
Tabela 1. Salmonella spp. isoladas de suínos, discriminadas por etapa de coleta, tipo de amostra e
local de colheita
Isolamentos
Amostras coletadas
Local de colheita
1ª
etapa
2ª
etapa
3ª
etapa
TOTAL
P (%)
Fezes-Swab retal (n=45) Granja (terminação) 9 9 7 25 (29,07)
Ração (n=3) Granja (terminação) 1 1 0 2 (2,33)
Água (n=3) Granja (terminação) 0 0 0 0
Swab arrasto (n=3) Granja (terminação) 0 0 0 0
Fezes-Swab retal (n=45) Pocilga de espera 7 8 7 22 (25,58)
Swab arrasto (n=3) Pocilga de espera 0 0 1 1 (1,16)
Carcaça após depilação (n=45) Frigorífico (abate) 7 3 0 10 (11,63)
Linfonodos cadeia mesentérica (n=45) Frigorífico (abate) 3 6 2 11 (12,79)
Carcaça após serragem (n=45) Frigorífico (abate) 7 3 3 13 (15,12)
Swab superfície depiladeira (n=3) Frigorífico (abate) 0 0 1 1 (1,16)
Swab superfície serra (n=3) Frigorífico (abate) 1 0 0 1 (1,16)
Swab superfície faca (n=3) Frigorífico (abate) 0 0 0 0
Swab superfície mesa toalete (n=3) Frigorífico (abate) 0 0 0 0
TOTAL (n= 249) 35 30 21 86 (100)
n= número de amostras analisadas; P= amostras positivas para Salmonella spp.; % - porcentagem
de amostras positivas por amostra em relação ao total isolado.
Fonte: compilado de PACHECO (2009).
Um fluxograma (Figura 1) ilustra a cadeia de produção de suínos com os pontos
de coleta das amostras em que Pacheco (2009) isolou Salmonella spp., que foram
estudadas no presente trabalho.
Figura 1. Fluxograma das etapas de produção de suínos com especificação dos pontos de coleta de
amostra. 1- Granja de terminação de suínos. 2- Pré-abate de suínos (pocilga de espera). 3.
Abate de suínos (frigorífico). Compilado de Pacheco (2009).
4.3. Processamento das amostras
As amostras previamente identificadas como Salmonella spp. e mantidas
congeladas foram reativadas e confirmadas quanto a pureza. Após descongelamento
em temperatura ambiente, uma alíquota de cada amostra foi transferida para caldo de
infusão cérebro-coração (BHI) (Oxoid®), seguida de incubação a 37ºC por 24 horas.
Após, foi repicada em agar xilose-lisina desoxicolato (XLD) (DIFCO®) e incubada a
37ºC por 24 horas. Uma colônia isolada foi repicada em dois tubos contendo ágar
nutriente (DIFCO®) inclinado e incubada a 37ºC por 24 horas.
4.3.1. Identificação sorológica preliminar e completa
A identificação sorológica do gênero foi realizada com o antisoro polivalente
somático “O” (BIOBRÁS®) e a caracterização preliminar dos grupos com os
antisoros monovalentes somáticos B, C e D (BIORAD®). Foi utilizada a
metodologia de aglutinação em placa conforme protocolo recomendado no PNSA -
Programa Nacional de Sanidade Avícola, em 1994 do Ministério da Agricultura,
Pecuária e Abastecimento (BRASIL, 1994).
Adicionou-se ao cultivo bacteriano em ágar nutriente (DIFCO®), 1,0mL de
solução salina a 0,85% estéril e a mistura foi homogeneizada (suspensão
bacteriana). Em uma lâmina de microscópio foram depositadas em paralelo, uma
gota de NaCl 2% estéril e uma gota de soro anti-somático “O” polivalente, e após,
adicionou-se uma gota da suspensão bacteriana em cada uma delas. Após
homogeneização, a observação de aglutinação foi realizada em 30 a 60 segundos,
com iluminação sob o fundo escuro. Foi considerada positiva a amostra que
apresentou aglutinação na mistura cultura + soro anti-Salmonella e ausência de
aglutinação na solução de NaCl 2%. No caso de aglutinação em ambas as misturas
(cultura + soro anti-Salmonella e cultura + NaCl 2%), a caracterização antigênica foi
inviabilizada por tratar-se de cepa rugosa (autoaglutinável).
As cepas não rugosas que apresentaram resultado positivo frente ao soro
anti-somático “O” polivalente foram caracterizadas antigenicamente com os soros
anti-somáticos “B”, “C” e “D”, da mesma forma como o descrito para o antisoro
polivalente. Os isolados não rugosos e que não reagiram com os anti-somáticos ”B”,
“C” ou “D” foram consideradas Salmonella spp.
Em paralelo, o segundo tubo da mesma amostra em ágar nutriente foi
enviado ao Setor de Enterobactérias da Fundação Osvaldo Cruz (FIOCRUZ) para a
caracterização antigênica completa.
4.4. Suscetibilidade aos antimicrobianos
A técnica utilizada foi a de difusão de discos (BAUER et al., 1966). Para o
teste, 3 a 5 colônias puras de Salmonella spp. em agar nutriente (DIFCO®) foram
inoculadas em 5 mL de caldo BHI (Difco®) e incubadas a 37ºC até atingir a turvação
0,5 na escala de MacFarland (aproximadamente 10
8
UFC.mL
-1
). Em seguida, com
auxílio de um swab estéril, a cultura foi semeada na superfície do ágar Muller Hinton
(Difco®). Aguardou-se a secagem das placas e em seguida, com auxílio de uma
pinça estéril, foram depositados sobre a superfície de cada placa inoculada discos
impregnados com os seguintes antimicrobianos/concentrações: amoxicilina 10µg,
norfloxacina 10µg, gentamicina 10µg, eritromicina 15µg, ácido nalidíxico 30µg,
tetraciclina 30µg e sulfazotrim 25µg (Laborclin®); ceftiofur 10µg, enrofloxacina 5 µg
e lincomicina 2 µg (Sensifar®). A cepa de E. coli ATCC 25922 foi utilizada como
controle. As placas foram incubadas a 37ºC por 18 a 20 horas, e depois foi realizada
a medida dos halos de sensibilidade (em milímetros) com auxílio de um paquímetro
e posterior classificação do microrganismo como sensível, intermediário ou
resistente ao antimicrobiano testado.
4.5. Relação filogenética entre os isolados
Isolados identificados como pertencentes ao mesmo sorovar pelo teste de
sorotipificação antigênica foram agrupados e submetidos à análise gênica por RAPD
(Random Amplified Polymorphic DNA) utilizando o protocolo descrito por Oliveira et
al. (2007), com algumas modificações.
O DNA foi extraído por lise térmica de um volume de 5mL de um cultivo de 24
horas em BHI (Difco®) e centrifugado a 12.000g por dois minutos; o sobrenadante
foi desprezado. Ao pellet, foi adicionado 800µL de água ultrapura e centrifugado
novamente a 12.000g por dois minutos. O sobrenadante foi descartado e o pellet
ressuspendido em 200µL de água ultrapura e aquecido a 95ºC por 10 minutos com
auxílio de bloco aquecedor, resfriado e, por fim, congelado para posterior utilização.
A quantificação do DNA foi feita em espectrofotômetro (Femto 750
®
) com
comprimento de onda de 280nm
Foi utilizado o primer P1254 (5’ CCGCAGCCAA 3’), recomendado por
OLIVEIRA et al. (2007). A reação de PCR foi realizada em um volume final de 25µL
por amostra, contendo: 100 mmol Tris HCl, 750 mmol KCl pH 8,8, 10 mmol
dNTPs (5 mmol de cada dATP, dCTP, dGTP e dTTP), 50 mmol MgCl2, 40 pmol do
primer, 1 U de Taq DNA Polymerase 5 U/µL (Invitrogen) e 30 ng de DNA. A
reação PCR foi conduzida dentro das seguintes condições: um ciclo de 95ºC por 5
minutos, seguido de 40 ciclos de 95ºC por 1 minuto, 30ºC por 1 minuto, 72ºC for 1
minuto, e extensão final a 72º C por 5 minutos.
Todas as reações de PCR foram realizadas no termociclador (Eppendorf) e
os produtos amplificados separados por eletroforese em gel de agarose a 1,5%. O
gel foi corado com Syber Safe (Invitrogen, São Paulo, Brasil) e visualizado em luz
ultravioleta. A análise foi realizada em paralelo com a cepa ATCC 13076 de
Salmonella Enteritidis e incluiu um controle negativo composto de água ultrapura em
substituição ao DNA alvo.
As análises foram realizadas utilizando o coeficiente de similaridade de Dice,
com tolerância de 1,5% na comparação da posição de bandas e o dendograma
formado com base no método UPGMA (Unweighted Pair Group Method with
Arithmetic Mean - agrupamento pareado não ponderado baseado na média
aritmética) com otimização do gel de 0,80%. Estes procedimentos e a construção do
dendograma foram realizados com o software BioNumerics.
4.6. Análise dos resultados
Os resultados obtidos com a tipificação antigênica foram tabulados e
submetidos à estatística descritiva.
A resistência aos antimicrobianos testados entre os diferentes sorovares foi
comparada utilizando o teste do χ2 com 95% de confiança. Os cálculos foram
realizados com o auxílio do programa Biostat 5.0. (AYRES, 2007).
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
No total foram descongeladas e utilizadas, neste estudo, 86 amostras de
Salmonella spp. previamente isoladas por Pacheco (2009). Destas, 25 (29,07%)
foram isoladas de fezes e duas (2,33%) de ração, ambas na granja de terminação,
22 (25,59%) nas fezes dos mesmos animais na pocilga de espera do frigorífico e,
neste ambiente, uma (1,16%) recuperada por meio de swab de arrasto. No
frigorífico, 34 (39,53%) foram isoladas das carcaças durante o abate e duas (2,32%)
de equipamentos (depiladeira e serra).
5.1. Identificação dos isolados
O uso do antisoro “O” confirmou os 86 isolados como Salmonella spp. A
análise com os antisoros B, C e D apresentou resultados concordantes com os
obtidos na identificação oficial realizada no Laboratório de Enterobactérias da
FIOCRUZ (Tabela 2).
Tabela 2. Sorologia preliminar com antisoros B, C e D e caracterização antigênica completa em
Laboratório oficial de 86 isolados de Salmonella spp.
Sorologia Preliminar Caracterização Antigênica – FIOCRUZ
Sorogrupo N (%) Sorovar N (%)
B 48 (55,8)
S. Typhimurium
S. Agona
28 (32,55)
20 (23,26)
C 17 (19,77) S. Infantis 17 (19,77)
D 6 (6,98) S. Panama 6 (6,98)
Salmonella spp. 15 (17,44) S. Minnesota 15 (17,44)
N (%) – número de amostras positivas e porcentagem em relação ao total de cepas de Salmonella
spp.
Apesar de estudos epidemiológicos necessitarem da identificação antigênica
definitiva nos laboratórios oficiais, a sorotipificação preliminar nos laboratórios das
indústrias de alimentos imediatamente após o isolamento é muito importante,
principalmente, do ponto de vista da sanidade animal. Por meio da classificação
preliminar é possível realizar uma comparação inicial entre os sorovares isolados
em diferentes pontos da produção dos animais, estabelecendo possíveis rotas de
infecção. Com esta informação é possível também o uso mais racional da
antibioticoterapia em doença clínica nos plantéis, já que há drogas de escolha para
determinados grupos antigênicos.
As indústrias, para garantir a qualidade do produto final, devem possuir
ferramentas que permitam analisar se há correlação entre os isolamentos de
Salmonella ao longo da cadeia produtiva e a sorotipificação preliminar é uma delas.
O resultado desta análise permite associar rapidamente contaminações de produtos
com possíveis fontes de infecção como a ração animal, instrumentos e
equipamentos. Pode também fornecer indícios da forma de transmissão do
microrganismo, vertical ou horizontal, e, desta forma, orientar as medidas de
controle imediatas que devem ser introduzidas ou reforçadas.
Todos os sorovares foram isolados tanto na granja quanto no frigorífico, com
exceção de S. Panama que não foi encontrada em amostras de fezes coletadas na
granja de terminação (Tabela 3). Considerando somente as amostras de fezes, S.
Agona foi o mais identificado, mas nas amostras de animais abatidos houve maior
incidência de S. Typhimurium, evidenciando maior resistência deste sorovar às
condições encontradas nas etapas de abate.
A diversidade de sorovares identificados em fezes e carcaças suínas, com
maior incidência de S. Typhimuirium também foi observada em outro estudo. Bessa
et al. (2004), no Rio Grande do Sul, identificaram 26 sorovares diferentes em 226
isolados de 300 suínos abatidos em três frigoríficos. Os sorovares mais prevalentes
foram: Typhimurium (24,3%), Agona (19,9%), Derby (13,2%) e Bredeney (12%). S.
Panama e S. Infantis também foram identificados, porém com menor frequência,
5,75% e 0,88%, respectivamente.
Weiss et al. (2002) também verificaram diversidade ao identificarem no Rio
Grande do Sul, oito sorovares diferentes de Salmonella em amostras de fezes
coletadas por swab retal, conteúdo intestinal e linfonodos mesentéricos. As
amostras foram colhidas na granja de terminação e durante o abate dos mesmos
animais num frigorífico no Rio Grande do Sul. Os sorovares identificados foram
Agona, Bredeney, Lexington, London, Mabandaka, Panama e Schwartzengrund. A
maior prevalência observada foi para S. Agona nas propriedades de terminação e
de S. Agona e S. Bredeney nas amostras colhidas no frigorífico. S. Typhimurium
não foi identificado em nenhuma das amostras.
Tabela 3. Sorovares de Salmonella isolados em granja de terminação, pocilga de espera e durante
etapas do abate de suínos
Sorovar
Granja de
terminação
Pocilga de
espera
(frigorífico)
Etapas do abate
(frigorífico)
TOTAL
N (%) N (%) N (%) N (%)
S. Typhimurium 8 (9,30) 5 (5,81) 15 (17,44) 28 (32,56)
S. Agona 9 (10,46) 6 (6,98) 5 (5,81) 20 (23,25)
S. Infantis 4 (4,65) 5 (5,81) 8 (9,30) 17 (19,77)
S. Minnesota 6 (6,98) 6 (6,98) 3 (3,49) 15 (17,44)
S. Panama -- 1 (1,16) 5 (5,81) 6 (6,98)
TOTAL 27 (31,40) 23 (26,74) 36 (41,86) 86 (100)
N (%) – número de amostras positivas de cada sorovar e porcentagem em relação ao total de
amostras identificadas como Salmonella spp.
O maior número de isolados neste estudo de S. Typhimurium (32,56%) atenta
para o possível risco de enterocolite no rebanho, já que este sorovar, juntamente
com S. Cholerasuis são os mais incriminados em doença clínica (HURD et al.,
2001). Também, S. Agona, o segundo sorovar mais isolado, tem sido relatado junto
a S. Derby como sorovares relacionados à doença clínica que têm aumentado
significativamente, principalmente nos Estados Unidos (OLIVEIRA e CARVALHO,
2003). Porém, a identificação de casos clínicos de salmonelose no rebanho não foi
pesquisada no presente estudo.
S. Typhimurium, S. Agona e S. Infantis foram os sorotipos mais isolados
neste estudo. De acordo com Loureiro et al. (2010) e Weiss et al. (2002), estes
sorovares estão associados a casos de salmonelose humana no Brasil. Já nos
Estados Unidos, os três sorotipos mais frequentemente isolados em humanos com
salmonelose são Typhimurium, Enteritidis e Newport, denotando o risco potencial
desses agentes (CDC, 2005).
S. Typhimurium é um dos principais sorovares isolados em casos
esporádicos e surtos de gastrenterite no Brasil. Está também associado a
meningites, especialmente em crianças. Este sorotipo representa risco devido ao
seu potencial invasivo e eminentemente patogênico. O fagotipo DT 104 do sorotipo
Typhimurium é considerado um patógeno altamente virulento e com elevada
resistência a antibióticos (DDTHA, 2005).
S. Infantis e S. Agona também são reconhecidos por seu potencial
patogênico, o qual, além do quadro gastroentérico, pode determinar infecção
septicêmica nos animais jovens e homem, principalmente em casos de infecções
graves em crianças (FONSECA et al., 2006; TESSMANN et al., 2008).
Os resultados da sorotipificação definitiva por colheita, animal e local de
isolamento podem ser observados nas Tabelas 4, 5 e 6. De forma geral, a
incidência de um mesmo sorovar pôde ser associada ao lote, sendo o mesmo
isolado ao longo da cadeia.
Tabela 4. Identificação antigênica de Salmonella por suíno amostrado, de acordo com o local de
isolamento, desde a granja até o final do abate (1ª colheita)
LOCAL DE ISOLAMENTO
FAZENDA FRIGORÍFICO
Amostra Fezes Animais abatidos
Animal
Granja
Terminação
Pocilga
Espera
Após
Depilação
Linfonodos
Mesentéricos
Após
Evisceração
1 S. Typhimurium N N N S. Typhimurium
2 N S. Typhimurium N N N
3 N N S. Agona N N
4 S. Typhimurium N N N S. Typhimurium
5 S. Typhimurium S. Typhimurium S. Typhimurium S. Typhimurium S. Typhimurium
6 S. Typhimurium N S. Typhimurium N N
7 N S. Typhimurium N N S. Typhimurium
8 S. Typhimurium S. Typhimurium N N S. Typhimurium
9 N S. Agona S. Agona N N
10 S. Agona S. Agona S. Agona N N
11 N S. Typhimurium S. Typhimurium S. Typhimurium N
12 S. Agona N N N N
13 S. Typhimurium N N N N
14 S. Typhimurium N S. Typhimurium S. Typhimurium S. Typhimurium
15 N N N N S. Typhimurium
N= não houve isolamento.
Os mesmos sorovares foram identificados ao longo da cadeia de produção e
nos mesmos suínos. Das 75 amostras provenientes dos animais analisadas na
primeira colheita, Salmonella spp. foi isolada em 33 (44%) ocasiões, sendo 16
provenientes das fezes e 17 nas carcaças. S. Typhimurium foi o sorovar mais
prevalente, representando 78,8% (26/33) dos isolamentos, seguido de S. Agona,
que foi isolada em 21,2% (7/33) das amostras.
Tabela 5. Identificação antigênica de Salmonella por suíno amostrado, de acordo com o local de
isolamento, desde a granja até o final do abate (2ª colheita)
LOCAL DE ISOLAMENTO
FAZENDA FRIGORÍFICO (Abate)
Animal
Granja
Terminação
Pocilga
Espera
Após
Depilação
Linfonodos
mesentéricos
Após
Evisceração
16 S. Infantis S. Infantis N N N
17 N S. Infantis N S. Infantis N
18 N N N S.Panama S.Panama
19 N S. Agona N N N
20 S. Agona S.Panama N N S.Panama
21 S. Agona S. Agona S.Panama S.Panama N
22 S. Infantis N N S. Infantis N
23 N N S. Infantis N N
24 N S. Infantis N N N
25 S. Agona N N S. Agona N
26 S. Agona S. Agona N N N
27 S. Agona N N N N
28 N N S. Infantis S. Agona S. Infantis
29 S. Agona S. Agona N N N
30 S. Infantis N N N N
Na segunda colheita, a positividade para Salmonella foi de 38,67% (29/75).
Destas, 41,38% (12/29) foram identificadas sorologicamente como S. Agona, 37,93%
(11/29) como S. Infantis e 20,69% (6/29) como S. Panamá.
S. Agona e S. Infantis foram os sorovares mais incidentes nas fezes e S. Infantis
e S. Panamá os mais identificados nas amostras de animais abatidos. Apesar de os
mesmos sorovares terem sido identificados nos mesmos animais, no 20º e 21º suínos,
os sorovares Agona e Panama foram identificados em diferentes pontos da coleta.
Tabela 6. Identificação antigênica de Salmonella por suíno amostrado, de acordo com o local de
isolamento, desde a granja até o final do abate (3ª colheita)
LOCAL DE ISOLAMENTO
FAZENDA
FRIGORÍFICO (Abate)
Animal
Granja
Terminação
Pocilga
Espera
Após
Depilação
Linfonodos
mesentéricos
Após
Evisceração
31 N S. Minnesota N N N
32 N N N N S. Minnesota
33 N S. Minnesota N N N
34 S. Minnesota S. Minnesota N N N
35 N S. Infantis N N N
36 S. Minnesota S. Minnesota N N N
37 S. Minnesota N N N N
38 S. Minnesota N N N N
39 S. Infantis N N N N
40 N N N N S. Infantis
41 N S. Infantis N N N
42 S. Minnesota S. Minnesota N N N
43 N N N S. Minnesota S. Infantis
44 N N N S. Infantis N
45 S. Minnesota N N N N
Salmonella foi isolada em 28% (21/75) amostras na terceira colheita, sendo
71,43% (15/21) identificadas sorologicamente como S. Minnesota e 28,57% (6/21)
como S. Infantis.
O maior número de isolamentos foi observado nas fezes dos animais, sendo
S. Minnesota o mais identificado.
A homologia entre isolados identificados como de um mesmo sorovar,
comparados pelo coeficiente de similaridade de Dice e agrupados em dendograma,
estão ilustrados nas Figuras 2, 3, 4, 5.
Figura 2. Dendrograma comparativo dos isolados identificados como S. Typhimurium, utilizando
coeficiente de similaridade de Dice com tolerância de 1,5% e método UPGMA com
otimização de 0,80%. Perfil A – cluster com 92,3% de homologia; Perfil B – cluster com
93,9% de homologia; Perfil C – cluster com 93,3% de similaridade; Perfil D – cluster com
80% de similaridade.
Figura 3. Dendrograma comparativo dos isolados identificados como S. Agona utilizando coeficiente
de similaridade de Dice com tolerância de 1,5% e método UPGMA com otimização de
0,80%. Perfil A e B – diferentes grupos clonais.
Figura 4. Dendrograma comparativo dos isolados identificados como S. Minnesota utilizando
coeficiente de similaridade de Dice com tolerância de 1,5% e método UPGMA com
otimização de 0,80%. Perfil A e B – diferentes grupos clonais, pertencentes ao cluster com
homologia de 80%.
Figura 5. Dendrograma comparativo dos isolados identificados como S. Panama utilizando
coeficiente de similaridade de Dice com tolerância de 1,5% e método UPGMA com
otimização de 0,80%. Perfil A – cluster de dois grupos clonais com 96% de similaridade.
Figura 6. Dendrograma comparativo dos isolados identificados como S. Infantis utilizando coeficiente de
similaridade de Dice com tolerância de 1,5% e método UPGMA com otimização de 0,80%. Perfil
A – grupo clonal.
Os géis originais utilizados para a construção dos dendrogramas estão
representados na Figura 7.
Figura 7. Géis de RAPD para S. Typhimurium (1), S. Agona (2), S. Minnesota (3), S. Infantis (4) e S.
Panama (5).
A análise dos dendrogramas demonstrou as porcentagens de similaridade
entre isolados que foram agrupados em clusters. A similaridade entre espécimes foi
independente do local de isolamento, ou seja, carcaças ou fezes, com exceção do
sorovar Panama, onde foi observado um grupo com cinco isolados provenientes de
carcaça e uma amostra proveniente de fezes com perfil distinto.
Foram discriminados cinco grupos clones em S. Typhimurium e três isolados
apresentaram perfil distinto, todos da primeira coleta, porém com similaridade maior
que 80% com pelo menos um dos clones (Figura 2). Observou-se a formação de
quatro clusters, com homologia maior ou igual a 80%. Os resultados indicam que
animais positivos nas fezes com S. Typhimurium contribuem para um produto final
contaminado e demonstra que medidas de controle no campo, se eficientes na
redução da presença deste patógeno no conteúdo intestinal dos animais, também
auxiliam na diminuição do mesmo durante as etapas de abate e no risco de
transmissão de doença aos seres humanos. Esse fato pode ser evidenciado ao
analisar o suíno de número cinco, em que S. Typhimurium foi identificado ao longo
de toda cadeia produtiva.
S. Agona foi agrupada em dois grupos clonais distintos com similaridade de
78,7%, um com quatro e outro com 16 isolados, provenientes da primeira e segunda
coleta (Figura 3). Apesar de este sorovar ter sido isolado tanto de animais vivos
como de carcaças, não foi identificado após evisceração. É provável que as
condições de processamento pós-abate tenham limitado sua sobrevivência e
multiplicação, e isso explica, em parte, sua ausência nas carcaças após a serragem.
Das amostras ambientais, S. Typhimurium e S. Agona foram isoladas de
ração na primeira e segunda coleta, respectivamente. A análise do dendrograma
indica que possivelmente esta foi a fonte primária de infecção dos animais na
granja, pois S. Typhimurium isolado da ração apresentou homologia de 92,3% com
sete amostras isoladas de fezes (Figura 2). No caso do sorovar Agona, a amostra
de ração está inserida no perfil B (grupo clonal), com mais 15 isolados, sendo 11
provenientes de fezes (Figura 3). As amostras de ração, das quais foram isolados
os sorovares identificados neste estudo foram originalmente coletadas por Pacheco
(2009), imediatamente após a saída do silo, sem contato com os animais ou seus
excrementos. A importância da ração como veículo de infecção para os suínos
concorda com resultados de estudos de vários pesquisadores (STÄRK et al., 2002;
LO FO WONG et al., 2004; KICH et al., 2005; SILVA et al., 2006).
A classificação dentro de um mesmo grupo clonal de S. Agona isolados de
fezes de lotes sucessivos de animais alojados na granja (primeira e segunda
coletas) sugere negligência a normas de biosseguridade, que podem contribuir para
a manutenção do microrganismo no ambiente. Porém, este comportamento não se
repetiu para S. Typhimurium, o mais prevalente na primeira coleta. Assim, é
possível que os animais amostrados já estivessem infectados com S. Agona em
etapas de criação anteriores como desmame e creche. Esta hipótese concorda com
Muller et al. (2009), que relataram que, entre as fontes mais importantes de
contaminação por Salmonella na produção de suínos, podem ser destacadas o
alojamento de animais portadores que sofreram a infecção na fase de creche, e a
contaminação residual das instalações.
A alta porcentagem de isolados de S. Typhimurium durante todas as etapas
de abate concorda com o fato de este ser o sorovar mais isolado em alimentos de
origem suína no Brasil (SPRICIGO et al., 2008). Porém, outros fatores parecem
influenciar na disseminação do sorovar Agona. Apesar de ser o segundo mais
frequente neste estudo, a positividade concentrou-se nas amostras de fezes, com
baixo isolamento durante as etapas de abate.
A contaminação cruzada também parece ser importante na disseminação de
S. Typhimurium ao longo da cadeia de produção. O espécime identificado na serra
pertence ao mesmo grupo clonal que quatro isolados de fezes provenientes da
pocilga do frigorífico e 93,9% com outro grupo clonal que envolve seis estirpes
isoladas de amostras coletadas após depilação, em linfonodos ou após evisceração,
inserido no cluster B.
S. Minnessota apresentou dois grupos clonais com similaridade de 80%, um
agrupando 12 isolados e outro dois. Um isolado apresentou padrão distinto dos
demais (Figura 4). Entre as seis amostras ambientais da segunda coleta, este
sorovar foi identificado em duas ocasiões, uma de swab de arrasto da pocilga no
frigorífico e uma da superfície da depiladeira. A homologia de 100% da amostra
isolada na superfície da depiladeira com 10 isolados de fezes demonstra que a
infecção dos animais é a fonte de contaminação do ambiente do abate. Porém, o
número de isolamentos deste sorovar foi baixo durante o abate, com positividade
somente em uma amostra de linfonodo (suíno 43) e uma de carcaça após
evisceração (suíno 32). Isto sugere que, apesar da boa adaptação ambiental que
permite sua permanência no ecossistema, o perfil que englobou o maior número dos
isolados deste sorovar não permanece nas carcaças ou sofre injúria durante o
processo de abate, permanecendo em números não detectáveis na técnica de
isolamento tradicional utilizada neste estudo.
Outra hipótese para explicar o baixo número de isolamentos de S. Minnesota
nas etapas de abate é a possibilidade de que algum evento especificamente ligado
a este abate tenha influenciado nos resultados, como o número de animais
abatidos, a ordem de abate dos animais amostrados em relação aos demais ou
mudanças dos procedimentos internos. Não havia controle por parte dos
pesquisadores com relação à estes eventos ou informação sobre mudanças na
concentração de cloro da água de lavagem ou quantidade/tipo de agentes químicos
utilizados para a limpeza e desinfecção. Assim, não foi possível determinar se
houve alguma mudança nos procedimentos em relação aos outros procedimentos
de abate.
Os seis isolados identificados como S. Panama formaram um clusters com
96% de similaridade e um isolado não foi agrupado em nenhum deles. Todos os
isolados eram provenientes da segunda coleta. Dos seis isolamentos, somente uma
amostra foi proveniente de fezes (suíno 20) e apresentou 84,2% de homologia com
as demais. Estes resultados demonstram que a contaminação da carcaça durante
as etapas de abate provavelmente não está relacionada à infecção prévia dos
animais como sugere a observação dos suínos 18, 20 e 21 (Figura 5).
A maior similaridade entre os isolados foi observada para S. Infantis, com 16
espécimes da segunda e terceira coleta pertencentes a um mesmo grupo clonal. A
exceção foi um espécime com perfil distinto, isolado do suíno 28, que era
proveniente da segunda coleta (Figura 6).
É possível que a presença do sorovar Infantis nas amostras de fezes esteja
relacionada à contaminação ambiental na granja ou infecção dos animais em etapas
anteriores à terminação, já que os isolados da segunda e terceira coleta pertencem
ao mesmo grupo clonal. Porém, este sorovar não foi isolado no swab de arrasto
realizado na granja que alojava os animais. Esta correlação entre isolamento em
amostra ambiental e nos animais deve ser analisada levando-se em consideração
que somente uma amostra foi coletada, podendo não refletir com segurança a
ausência do microrganismo no ambiente.
Os sorovares mais isolados nas amostras de carcaças na segunda coleta, S.
Infantis e S. Panama, estão, segundo a ANVISA, incluídos entre os sorotipos mais
frequentemente identificados em amostras humanas oriundas de surtos de doenças
transmitidas pelos alimentos no Brasil (RODRIGUES, 2005). Spricigo et al. (2008)
relatam que S. Panama, S. Agona e S. Infantis foram os sorovares mais
identificados em amostras de linguiça suína em Santa Catarina, referendando a
importância destes sorovares na saúde pública.
Os resultados obtidos neste estudo reforçam a necessidade de
monitoramento da presença de Salmonella, já que vários autores relatam sua
suscetibilidade à contaminação de carcaças e risco de infecção aos lotes de suínos.
Indicam também que o monitoramento e controle devem acontecer em todas as
etapas de produção, pois diferentes fatores parecem influenciar a permanência ou
não de determinados sorovares na carne.
Considerando somente as amostras de fezes S. Agona e S. Typhimurium
foram os mais isolados. S. Agona também foi o sorovar mais prevalente em
amostras de fezes suínas em trabalho realizado por Weiss (2002) e a segunda mais
prevalente em estudo conduzido por Bessa et al. (2004). Esse sorovar foi
identificado em 7% dos isolamentos em propriedades criadoras e produtoras de
suínos na Europa no ano de 2008 (EFSA, 2009).
5.2. Perfil de suscetibilidade aos antimicrobianos
A resistência/suscetibilidade a 11 antimicrobianos determinada no teste de
difusão em discos para os 86 isolados de Salmonella spp. está apresentada na
Tabela 7.
Tabela 7. Perfil de sensibilidade aos antimicrobianos de 86 cepas de Salmonella spp. isoladas de
amostras ambientais, fezes e carcaças suínas
Antimicrobiano Sensível Intermediário Resistente
N (%) N (%) N (%)
Lincomicina 0 0 86 (100)
Ceftiofur 0 2 (2,30) 84 (97,70)
Tetraciclina 3 (3,49) 2 (2,32) 81 (94,19)
Eritromicina 0 7 (8,10) 79 (91,90)
Neomicina 1 (1,20) 8 (9,30) 77 (89,50)
Gentamicina 6 (7,00) 5 (5,80) 75 (87,20)
Amoxicilina 1 (1,20) 13 (15,10) 72 (83,70)
Ácido nalidíxico 3 (3,5) 14 (16,3) 69 (80,2)
Enrofloxacina 4 (4,70) 17 (19,80) 64 (74,40)
Norfloxacina 12 (14,0) 27 (31,4) 47 (54,6)
Sulfazotrim 19 (22,1) 53 (61,6) 14 (16,3)
N (%) – número de amostras e porcentagem em relação ao total de identificados como Salmonella spp.
A característica de multirresistência aos antibióticos no gênero Salmonella é
uma tendência mundial e apresenta conformidade com o presente trabalho, já que a
maioria dos isolados demonstrou esse perfil. Dos isolados estudados, mais de 50%
apresentaram resistência a nove dos 11 antibióticos testados. As drogas com
maiores percentuais de sensibilidade foram o sulfazotrim e a norfloxacina, 22,1% e
14%, respectivamente. Porém, mesmo para estes antimicrobianos, os índices de
sensibilidade intermediária observados foram considerados altos, o que pode indicar
desenvolvimento de resistência em médio prazo.
No relatório da PREBAF (BRASIL, 2008), sobre monitoramento da resistência
aos antimicrobianos de Salmonella e Enterococos isolados de carcaças de frango,
comenta-se que o tratamento de infecções por enteropatógenos com o emprego de
fluoroquinolonas e cefalosporinas de terceira geração tem “perspectiva sombria”. O
perfil de resistência observado neste estudo confirma que esta é uma realidade
também para infecção causada por Salmonella isolada de suínos. Nenhum
espécime foi sensível ao ceftiofur (cefalosporina de terceira geração) e somente
quatro (4,7%) isolados foram sensíveis à enrofloxacina (fluorquinolona). A
norfloxacina (fluorquinolona de segunda geração), mesmo sendo a segunda droga
mais efetiva neste estudo, teve somente 12 (14,0%) dos isolados classificados como
sensível.
Vários autores e organizações têm relatado um aumento expressivo na
identificação de microrganismos isolados de animais e alimentos que são
resistentes aos antimicrobianos de (SCHMIDT, CARDOSO, 2003; TESSMANN et
al., 2008; HOPKINS et al., 2010). Muitos afirmam que esta ocorrência é
particularmente associada ao emprego de doses terapêuticas e subterapêuticas de
antibióticos nos animais e ao uso indiscriminado de antimicrobianos na medicina
humana, tanto nos hospitais como na comunidade (SOLARI et al., 1986; SCHMIDT
e CARDOSO, 2003; BEGUM et al., 2010).
A resistência determinada para cada um dos sorovares identificados (Tabela
8) demonstrou que houve variação de resistência aos antimicrobianos testados
quando analisados pelo teste do quiquadrado.
Tabela 8. Resistência de Salmonella isolada de fezes e carcaças suínas aos antimicrobianos
Sorovares (N=86)
Typhimurium Agona Infantis Panama Minnesota
Antimicrobiano
N=28 N=20 N=17 N=6 N=15
Amoxicilina 27 (96,4) 10 (50,0) 15 (88,2) 5 (83,3) 13 (86,7)
Gentamicina 27 (96,4) 14 (70,0) 15 (88,2) 6 (100,0) 13 (86,7)
Norfloxacina 20 (71,4) 7 (35,00) 11 (64,7) 6 (100,0) 4 (26,7)
Neomicina 28 (100,0) 14 (70,0) 15 (88,2) 6 (100,0) 14 (93,3)
Licomicina 28 (100,0) 20 (100,0) 17 (100,0) 6 (100,0) 15 (100,0)
Ceftiofur 28 (100,0) 20 (100,0) 17 (100,0) 6 (100,0) 13 (86,7)
Tetraciclina 27 (96,4) 16 (80,0) 17 (100,0) 6 (100,0) 15 (100,0)
Sulfazotrim 0 2 (10,0) 4 (23,5) 0 8 (53,3)
Eritromicina 26 (92,9) 15 (75,0) 17 (100,0) 6 (100,0) 15 (100,0)
Ác. Nalidíxico 18 (64,3) 17 (85,0) 15 (88,2) 6 (100,0) 13 (86,7)
Enrofloxacina 28 (100,0) 14 (70,0) 12 (70,6) 6 (100,0) 5 (33,33)
N (%) – número de amostras e porcentagem em relação ao sorovar especificado.
S. Typhimurium foi o sorovar que mais demonstrou diferença em relação aos
outros estudados, apresentando maior resistência à amoxacilina, à neomicina e à
enrofloxacina quando comparado a S. Agona (P<0,01); à enrofloxacina em relação
aos sorovares Minnesota (P<0,01) e Infantis (P<0,05) e à norfloxacina em
comparação à Minnesota (P<0,05).
S. Typhimurium foi classificado como multiresistente, por apresentar
resistência a três ou mais classes de antimicrobianos. Todos os isolados
demonstraram resistência a neomicina (aminoglicosídeo), lincomicina (lincosamida),
ceftiofur (cefalosporina) e enrofloxacina (fluorquinolona) e mais de 96%
apresentaram resistência a amoxacilina (betalactâmico), gentamicina
(aminoglicosídeo) e tetraciclina. Porém, todos foram sensíveis ao sulfazotrim. Neste
estudo, a resistência do sorovar Typhimurium ao sulfazotrim foi significativamente
menor que as observadas para os sorovares Infantis (P<0,05) e Minnesota
(P<0,01).
A resistência à tetraciclina em 96,4% dos isolados de S. Typhimurium foi
maior que o observado em outros trabalhos realizados no Brasil em amostras
suínas, como Weiss (2002) que determinou 36,9% de resistência em fezes e
linfonodos, Menin (2008) que observou 42,1% de resistência em isolados de
infecções entéricas e 41,67% em linguiça fresca por Spricigo (2008). Estudos na
Europa com isolados de carne suína comercializadas nos países membros em que
nem todos os sorovares foram identificados, mas incluía o S. Typhimurium também
demonstraram resistência inferior aos deste estudo, com índices de variando de
36,05% a 59% (EFSA, 2006; EFSA, 2008b). Porém, concorda com análise deste
sorovar isolado de cortes suínos coletados em feira livre de Pelotas, Rio Grande do
Sul, no Brasil, que mostrou resistência de 100% à tetraciclina (TESSMANN, 2008).
Schmidt et al. (2003) também observaram 99,4% de resistência a este
antimicrobiano em S. Typhimurium isolada de sistema de tratamento de dejetos
suínos. A resistência a tetraciclina é também o padrão observado na cepa
epidêmica multiresistente DT 104 (EFSA, 2008b).
O aumento nos níveis de resistência à ampicilina, tetraciclina e cloranfenicol
desde 1996 em Salmonella isoladas de humanos, suínos e frangos caracteriza a
emergência de S. Typhimurium multi-resistente (BEGUM et al., 2010). Porém este
autor relata que isolados com estas características são também resistentes à
associação sulfa e trimetropim (sulfazotrim), que não foi observado neste estudo.
Não houve diferença entre a resistência determinada no sorovar Agona em
relação aos outros isolados para os antimicrobianos: gentamicina, lincomicina,
ceftiofur, tetraciclina, eritromicina, ácido nalidíxico e enrofloxacina. Porém, este
sorovar demonstrou menor número de isolados resistentes a amoxacilina e
neomicina em relação ao sorovar Typhimurium (P<0,01), à norfloxacina em relação
ao Panama (P<0,01); e ao sulfazotrim em comparação ao Minnesota (P<0,05).
Apesar de ser frequentemente isolado de alimentos e ambiente e em
algumas amostras clínicas, há poucos relatos sobre a resistência ou multiresistencia
em S. Agona. Neste estudo, este sorovar foi o que apresentou as menores
porcentagens de isolados resistentes às drogas testadas.
S. Panama apresentou perfil semelhante ao observado para o sorovar
Typhimurium, com 100% de resistência a nove dos antimicrobianos testados e
83,3% dos isolados resistentes à amoxacilina, mas 100% sensíveis ao sulfazotrim,
Em relação aos outros sorovares, S. Panama mostrou-se mais resistente a
enrofloxacina quando comparada a S. Minnesota (P<0,05) e à norfloxacina em
relação ao sorovar Agona (P<0,01). Houve menor resistência ao sulfazotrim pelos
isolados quando comparados aos identificados como S. Minnesota (P<0,05).
O perfil de resistência determinado para o sorovar Panama neste estudo é
diferente do observado por CASTAGNA et al. (2001) em isolados de fezes e
linfonodos mesentéricos de suínos ao abate em três frigoríficos do sul do Brasil. Dos
seis isolados identificados como S. Panama naquele estudo, somente foi observada
resistência a ampicilina, tetraciclina e cotrimoxazol (um isolado cada) e à
sulfonamida (cinco isolados). Aqueles autores também testaram os antimicrobianos:
neomicina, gentamicina e ácido nalidixo, porém ao contrário dos resultados obtidos
neste estudo, os isolados foram 100% sensíveis. Os autores concluíram que S.
Panama apresentou perfil de resistência estatisticamente menor que S.
Typhimurium. Porém, Tessmann et al. (2008) também observaram perfil de
multiresistencia (ampicilina, carbenicilina, cloranfenicol e tetraciclina) em S. Panama
isolada de carne suína vendida em feiras livres no sul do país.
Isolados identificados como S. Infantis apresentaram menor percentual de
resistência a enrofloxacina em relação ao sorovar Typhimurium, mas maior número
de isolados resistentes ao sulfazotrim, em comparação a este mesmo sorovar
(P<0,05). Todos os isolados foram resistentes a lincomicina, ceftiofur, tetraciclina e
eritromicina. A resistência aos antimicrobianos de S. Infantis deste estudo foram
superiores às observadas por TESSMANN (2008). Estes autores determinaram
sensibilidade de 100% e 43% para o ácido nalídixo e tetraciclina, respectivamente,
em S. Infantis isoladas de cortes de carne suína de feiras-livres de Pelotas, RS.
Os isolados identificados como S. Minnesota foram menos resistentes a
norfloxacina em relação a S. Typhimurium e à enrofloxacina em relação a S.
Panama (P<0,05), mas apresentou maior resistência ao sulfazotrim em comparação
ao sorovar Typhimurium (P<0,01). Este sorovar é considerado como um agente
etiológico emergente da salmonelose humana (WHO, 2005)
No Brasil é permitido o uso dos antimicrobianos avilamicina, bacitracina,
colistina clorexidina, flavomicina, clorohidroxiquinolina, tilosina, lincomicina e
eritromicina como aditivos na alimentação de suínos em terminação (BRASIL,
1998). Destes, foram testados neste estudo os dois últimos. Com exceção de 8,1%
dos isolados de S. Typhimurium e 25% de S. Agona, que apresentaram perfil
classificado como intermediário à eritromicina, todos os isolados foram 100%
resistentes a estas drogas.
O conjunto de resultados deste estudo mostra que independente das
diferenças identificadas entre os sorovares para alguns antimicrobianos, os isolados
apresentaram perfil de multiresistência, principalmente para aquelas mais usadas
em tratamentos clínicos nas granjas de produção, como enrofloxacina, lincomicina,
amoxicilina, tetraciclina, eritromicina, norfloxania, ceftiofur e sulfazotrim, sendo
provável que as disparidades observadas sejam mais associadas à casuística que
ao sorovar. A resistência é preocupante e demonstra que é necessária a redução do
uso de antimicrobianos na produção animal como forma de reduzir a pressão de
seleção a que estes microrganismos são submetidos. Alerta também para as
dificuldades que pode representar o tratamento de infecções extra-intestinais e em
grupos de risco, onde é necessária a antibiotecoterapia e para a necessidade de
vigilância da resistência aos antimicrobianos em bactérias zoonóticas transmitidas
por alimentos.
Iniciativas como o monitoramento da resistência de Salmonella isoladas de
carcaças congeladas de frango em todo o país, realizada pela ANVISA no projeto
PREBAF (BRASIL, 2008) fornecem dados importantes. As informações geradas
permitem a visualização adequada do problema e fornece subsídio para as medidas
de controle necessárias. Esta pesquisa deve ser ampliada para todos os produtos
de origem animal.
6. CONCLUSÕES
A multiplicidade de sorovares de Salmonella identificados nos pontos
analisados do processo produtivo, S. Typhimurium, S. Agona, S. Infantis, S.
Minnesota e S. Panama indica que diferentes fatores influenciam na infecção dos
suínos e na presença e persistência destes microrganismos na cadeia produtiva.
Isto reforça a importância de um monitoramento rigoroso que permita subsidiar
ações que promovam o controle adequado destes patógenos desde a granja até as
etapas de abate e garantam a saúde do consumidor.
A relação filogenética entre os isolados indicou que o consumo de ração
contaminada é uma fonte de infecção dos animais pelos sorovares Agona e
Typhimurium. A contaminação cruzada também contribuiu para a disseminação de
S. Typhimurium durante as etapas de abate, aumentando o risco de contaminação
da carne e de infecções em humanos.
O padrão de multirresistência determinado para os diferentes sorovares alerta
para a necessidade de implantação de monitoramento sistemático da resposta aos
antimicrobianos em bactérias zoonóticas transmitidas pelos alimentos. Deve-se
ampliar os programas institucionais como o Nacional de Monitoramento da
Prevalência e da Resistência Bacteriana em Frango para alimentos de origem
suína, para subsidiar a discussão e instituição de políticas públicas sobre o uso de
antimicrobianos na produção animal.
7. TRABALHOS FUTUROS
A técnica de RAPD-PCR é uma ferramenta amplamente utilizada nos estudos
de tipagem molecular de microrganismos patogênicos e já foi testada para
Salmonella spp. com poder de discriminação semelhante à ribotipagem. Pretende-se
realizar técnicas como REP (Repetitive Extragenic Polindromic) e ERIC-PCR
(Enterobacterial Repetitive Intergenic Consensus) para comparar aos resultados
obtidos neste estudo.
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