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CAMILA ROCHA DA SILVA
REMOÇÃO DE GALACTOOLIGOSSACARÍDEOS EM MELAÇO DE SOJA
PARA OBTENÇÃO DE PRODUTOS DE INTERESSE INDUSTRIAL
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das exigências
do Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica Agrícola, para obtenção do título
de Doctor Scientiae.
VIÇOSA
MINAS GERAIS – Brasil
2010
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CAMILA ROCHA DA SILVA
REMOÇÃO DE GALACTOOLIGOSSACARÍDEOS EM MELAÇO DE SOJA
PARA OBTENÇÃO DE PRODUTOS DE INTERESSE INDUSTRIAL
Tese apresentada à Universidade
Federal de Viçosa, como parte das exigências
do Programa de Pós-Graduação em
Bioquímica Agrícola, para obtenção do título
de Doctor Scientiae.
APROVADA: 30 de abril de 2010.
_____________________________
Profª. Maria do Carmo G. Peluzio
(Co-Orientadora)
_____________________________
Prof. José Humberto de Queiroz
_____________________________
Prof. Luciano Gomes Fietto
_____________________________
Profª. Ana Cláudia P. Rodrigues
______________________________
Profª. Valéria Monteze Guimarães
(Orientadora)
ii
Aos meus pais Hélio e Maria
À minha irmã Carolina
O Senhor está comigo entre aqueles que me ajudam; pelo
que verei cumprido o meu desejo sobre os que me aborrecem.
Salmo 118
iii
AGRADECIMENTOS
A Deus, minha fortaleça, meu suporte, meu refúgio, minha inspiração,
enfim minha existência.
À Universidade Federal de Viçosa e ao Departamento de Bioquímica e
Biologia Molecular, pela oportunidade de realização do doutorado.
Ao Conselho de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), pela
concessão da bolsa de estudos.
Ao Departamento de Nutrição e Saúde por disponibilizar os laboratórios
onde parte deste trabalho foi realizada.
Aos Laboratórios de Análises Bioquímicas e Enzimologia do BIOAGRO,
onde a maior parte dos experimentos foi realizada.
À Profª Valéria Monteze Guimarães pela orientação na realização deste
trabalho, pela confiança, pelo profissionalismo e experiências trocadas. Muito
obrigada!
À Profª Maria do Carmo G. Pelúzio pela co-orientação, pela confiança,
pela participação efetiva na realização deste trabalho.
Ao Prof. Luciano Gomes Fietto pela colaboração e sugestões.
Aos Profs. José Humberto Queiroz e Ana Cláudia Peres Rodrigues por
terem aceitado a contribuir por este trabalho participando da banca de defesa.
Aos servidores, laboratoristas meu sincero agradecimento.
Aos meus queridos e amados amigos, meu muito obrigado. Vocês foram
fundamentais na construção dessa obra.
Aos meus pais Hélio e Maria, tudo que sou tudo, que almejo ser tenho
vocês, incansáveis ao meu lado. Meu amor, minha admiração, o meu bem
maior. A vitória é de vocês.
A minha irmã Carolina, conselheira, guerreira, companheira, sem sua
ajuda, sua força, seu exemplo de vida nada disso teria concretizado. Minha
admiração eterna.
À minha família Rocha e Silva, tenho orgulho, admiração dessa linda
família que pertenço.
À Galerinha e Flokinho por divertir a casa e a madrugada também.
A todos que com seus singelos gestos me ajudaram a concretizar este
trabalho. OBRIGADA!!
iv
BIOGRAFIA
Camila Rocha da Silva, filha de Hélio Augusto da Silva e Maria Rocha da
Silva, nasceu em Visconde do Rio Branco, Minas Gerais, em 15 de setembro
de 1978.
Em janeiro de 2004, graduou-se em Ciência e Tecnologia de Laticínios,
pela Universidade Federal de Viçosa (UFV), Minas Gerais.
Em abril de 2006, concluiu o curso de Mestrado em Produção Vegetal,
no Departamento de Produção Vegetal, na Universidade Estadual Norte-
Fluminense “Darcy Ribeiro”, Rio de Janeiro.
Em maio de 2006, iniciou o curso de Doutorado em Bioquímica Agrícola,
no Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, na Universidade Federal
de Viçosa, concluindo os requisitos necessários para obter o título de Doctor
Scientiae, no dia 30 de abril de 2010.
v
SUMÁRIO
Página
RESUMO.................................................................................................. viii
ABSTRACT...............................................................................................
x
INTRODUÇÃO GERAL.............................................................................
1
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS......................................................... 3
CAPÍTULO 1 – Remoção de galactoligossacarídeos em melaço de soja
e avaliação nutricional em ratos......................................
1. INTRODUÇÃO......................................................................................
6
1.1. Objetivo Geral................................................................................. 7
1.2. Objetivos Específicos......................................................................
7
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA................................................................. 8
2.1. Origem e evolução do agronegócio da soja (Glycine max)............ 8
2.2. Melaço de soja................................................................................ 9
2.3. -Galactosidases: definição e importância comercial.....................
10
2.4. -Galactosidases microbianas........................................................
11
2.5. Oligossacarídeos de rafinose e distúrbios intestinais..................... 12
2.6. Redução dos oligossacarídeos de rafinose em produtos
derivados de soja...........................................................................
13
3. MATERIAL E MÉTODOS..................................................................... 15
3.1. Microrganismo e manutenção da cultura........................................ 15
3.2. Determinação das condições de tratamento do melaço de soja
com células viáveis de D. hansenii ...............................................
15
3.3. Determinação da atividade de -galactosidase..............................
16
3.4. Extração dos RO.............................................................................
16
3.5. Determinação do teor de RO por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE)............................................................................
17
3.6. Determinação da composição centesimal do melaço de soja
tratado e não tratado......................................................................
17
3.6.1. Determinação do teor de proteínas......................................
18
3.6.2. Determinação do teor lípídico.............................................. 18
3.6.3. Determinação do conteúdo de cinzas..................................
18
3.6.4. Determinação do teor de carboidratos totais....................... 18
3.7. Ensaios biológicos..........................................................................
18
3.7.1. Preparo das dietas...............................................................
19
vi
3.7.2. Animais................................................................................
20
3.7.3. Coeficiente de eficácia protéica (PER)................................
20
3.7.4. Razão protéica líquida (NPR)..............................................
21
3.7.5. Digestibilidade verdadeira....................................................
21
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO............................................................
22
4.1. Determinação das condições cultivo D. hansenii UFV-1 no
melaço de soja para remoção dos oligossacarídeos de
rafinose...........................................................................................
22
4.2. Composição do melaço de soja dietas........................................... 28
4.3. Efeito do processamento enzimático no valor nutricional do
melaço de soja tratado e não tratado utilizados na dieta de ratos
Wistar.............................................................................................
29
4.3.1. Efeito das dietas nos valores de digestibilidade verdadeira
30
4.3.2. Efeito do processamento enzimático nos valores de ganho
de peso, coeficiente de eficácia protéica (PER) e razão
protéica líquida (NPR).........................................................
33
5.CONCLUSÕES......................................................................................
38
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.........................................................
40
CAPÍTULO 2 – Increase in ethanol production from soy molasses by
treatment with Debaryomyces. hansenii UFV-1 α-
galactosidase…...............................................................
ABSTRACT……………………………………………………………………. 47
1. INTRODUCTION.................................................................................. 48
2. MATERIALS AND METHODS.............................................................. 49
2.1. Microorganisms and Culture Maintenance......................................
49
2.2. Conditions of α-galactosidase Production.......................................
50
2.3. Partial Purification of α-galactosidase………………………………..
50
2.4. α-galactosidase Assay…………………………………………………
50
2.5. Determination of Protein Concentration.......................................... 51
2.6. Determination of the Biochemical Composition of the Soy
Molasses….…………………………………………………………..
51
2.7. Enzymatic Hydrolysis of Oligosaccharides in Soy Molasses……... 51
2.8. HPLC Analysis of Soluble Sugars…………………………………… 51
2.9. Fermentations Tests…………………………………………………... 52
2.10. Determination of Ethanol Concentration....................................... 52
3. RESULTS AND DISCUSSION............................................................. 52
3.1. Partial Purification of α-galactosidase............................................. 52
3.2. Characterization of Soy Molasses…………………………………… 54
vii
3.3. Enzymatic Hydrolysis of Oligosaccharides in Soy Molasses.......... 55
3.4. Fermentation Tests……………………………………………………. 56
4. CONCLUSIONS....................................................................................
57
ACKNOWLEGDEMENT........................................................................... 58
REFERENCES......................................................................................... 58
viii
RESUMO
SILVA, Camila Rocha da, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, abril de 2010.
Remoção de galactooligossacarídeos em melaço de soja para
obtenção de produtos de interesse industrial. Orientadora: Valéria
Monteze Guimarães. Co-orientadores: Maria do Carmo Gouveia Peluzio,
Sebastião Tavares de Rezende e Flávia Maria Lopes Passos.
O melaço de soja é um subproduto do beneficiamento da soja e fonte
concentrada de açúcares fermentáveis e não fermentáveis, dentre eles os
oligossacarídeos rafinose e estaquiose. Os oligossacarídeos de rafinose (RO)
são considerados fatores antinutricionais, pois interferem na absorção de
nutrientes da dieta em humanos e animais monogástricos uma vez que estes
não possuem a enzima α-galactosidase capaz de hidrolisar esses açúcares. O
presente trabalho teve como objetivos estabelecer condições tecnológicas para
a obtenção de um melaço de soja livre de oligossacarídeos de rafinose, através
do tratamento enzimático com α-galactosidases de Debaryomyces hansenii
UFV-1; e estabelecer um processo eficiente para melhorar a produção de
etanol através da fermentação do melaço de soja. Foi avaliado o crescimento
D. hansenii e produção de α-galactosidases nas concentrações de 10-100% de
melaço de soja incubados com 1, 2 e 5% de inóculo contendo células viáveis
da levedura, a 30 ºC, 200 rpm. O uso do melaço de soja 10% e do inóculo 2%
promoveu as melhores condições para crescimento da levedura. A atividade de
α-galactosidase aumentou com o tempo de incubação e a redução total dos RO
foi verificada após 24 h. Os ratos foram alimentados com dietas preparadas
com melaço de soja tratado, sem RO, e não tratado, com RO. Os parâmetros
digestibilidade verdadeira, ganho de peso, coeficiente de eficácia protéica
(PER) e razão protéica líquida (NPR) foram avaliados durante os períodos de 0
a 14 e 14 a 28 dias de experimento. Foi observada uma melhora significativa
na digestibilidade verdadeira para a dieta contendo o melaço soja tratado em
relação à dieta com melaço não tratado, nos dois períodos experimentais. Nos
primeiros 14 dias de experimento, as dietas contendo o melaço de soja com e
sem RO apresentaram valores de ganho de peso, PER e NPR
ix
significativamente menores em relação à dieta controle. Já no período de 14 a
28 dias, as dietas experimentais não diferiram estatisticamente da dieta
controle em relação aos parâmetros ganho de peso, PER e NPR. No
experimento de verificação da produção de etanol, o tratamento do melaço de
soja com α-galactosidase a 60 ºC, 100 rpm, por 12 h, promoveu um aumento
na concentração de sacarose e de açúcares redutores de 22 e 82 %,
respectivamente. O melaço de soja a 5 ºBrix foi fermentado por
Saccharomyces cerevisiae LBM-51 a 30 ºC, 100 rpm. A máxima produção de
etanol para o melaço de soja tratado e não tratado foi de 15,0 e 11,4 g/L,
respectivamente, após 8 h de fermentação. Um aumento de 24 % na
produtividade de etanol foi obtido para a fermentação do melaço de soja
tratado em comparação ao melaço de soja não tratado.
x
ABSTRACT
SILVA, Camila Rocha da, D.Sc., Universidade Federal de Viçosa, April, 2010.
Removal galactooligosaccharide soy molasses for obtaining of
products of industrial interest. Adviser: Valéria Monteze Guimarães. Co-
advisers: Maria do Carmo Gouveia Peluzio, Sebastião Tavares de Rezende
and Flávia Maria Lopes Passos.
Soy molasses is a byproduct of soybean processing and concentrated
source of fermentable and non fermentable sugars, as oligosaccharides
raffinose and stachyose. The raffinose oligosaccharides (RO) are considered
antinutritional factors, interfering in the absorption of diet’s nutrients in humans
and monogastric animals, since they lack the enzyme α-galactosidase able to
hydrolyze these sugars. The objective this work were to establish technological
conditions for obtaining a free soy molasses oligosaccharides raffinose from
enzymatic treatment with Debaryomyces hansenii UFV-1 α-galactosidase, and
to establish an efficient process to improve the ethanol production from soy
molasses fermentation. Concentrations of 10-100% soy molasses were
inoculated with 1, 2 and 5% inoculum containing cells of the yeast, at 30 ºC,
200 rpm. The use of 10% soy molasses and 2% inoculum showed best
conditions for the grown of the yeast. The α-galactosidase activity increased
with the incubation time and the total reduction of RO was observed after 24 h.
The rats were fed with diets prepared with no treated soy molasses and treated.
The parameters true digestibility, weight gain, PER and NPR were evaluated in
the periods 0-14 and 14-28 days. It was observed a significant improve in the
true digestibility from diet containing soy molasses treated in compared to diet
no treated. In the first 14 days experiment, the diets containing soy molasses
treated and no treated presented values weight gain, PER and NPR
significantly lower in compared to control diet. However, in the period of 14-28
days the experimental diets no different of control diet. In the experiment from
ethanol production, soy molasses treatment with α-galactosidase at 60 ºC, 100
rpm, for 12 h, promoted an increase in sucrose and reducing sugars
concentrations of 22 and 82 %, respectively. Soy molasses at 5 ºBrix was
xi
fermented by Saccharomyces cerevisiae LBM-51 at 30 ºC, 100 rpm. The
maximum ethanol production for treated and no treated soy molasses was of
15.0 and 11.4 g/L, respectively, after 8 h fermentation. The increase of 24 % in
ethanol productivity was obtained from treated soy molasses fermentation
compared to no treated soy molasses.
1
INTRODUÇÃO GERAL
A soja constitui um dos produtos de maior importância na economia
brasileira ocupando lugar de destaque na pauta de exportações do país.
Estima-se uma produção de 65,2 milhões de toneladas na safra de 2009/2010,
o que representará cerca de 30% da produção mundial (IBGE 2010).
O melaço de soja é um subproduto da indústria processadora de soja,
rico em carboidratos, tais como sacarose, frutose, glicose, pinitol e os
oligossacarídeos rafinose, estaquiose e verbascose (QURESHI et al., 2001).
Pequena parte do melaço de soja produzido tem sido usada como suplemento
para ração animal, mas a grande maioria é descartada. Entretanto, o melaço
de soja é uma atraente matéria-prima de baixo valor agregado, e poderia ser
usado para reduzir custos de produção em vários processos industriais
(BRAUNEGG et al., 2004). Pesquisas têm sugerido o uso das α-galactosidases
na hidrólise dos oligossacarídeos presentes no melaço de soja, minimizando
assim seus efeitos antinutricionais, caso seja utilizado como suplemento em
rações animais (VIANA et al., 2007). Também tem sido proposto o uso do
melaço de soja em processos fermentativos, devido à sua alta concentração de
açúcares (MONTELONGO et al. 1993; QURESHI et al. 2001; SOLAIMAN et al.
2006; SIQUEIRA et al., 2008).
Nas últimas décadas tem havido um crescente uso da soja e de seus
derivados na alimentação humana e animal, atingindo aumento de 53 % no
consumo anual per capta (GOLBITZ, 2003). Entretanto, o consumo da soja e
derivados é ainda limitado, devido à presença de diversos fatores
antinutricionais, dentre os quais se destaca os oligossacarídeos de rafinose
(RO). Os RO são considerados os principais responsáveis pela indução do
fenômeno de flatulência, diarréia, cólicas e náuseas, associada ao consumo de
produtos de soja (WAGNER et al., 1976; de LUMEN, 1992). Em sementes de
soja na mauridade fisiológica, aproximadamente 12% do peso seco são
carboidratos não estruturais, sendo os mais abundantes, sacarose (41-68%),
estaquiose (12-35%) e rafinose (5-16%) (NIELSEN, 1996).
Vários processos têm sido empregados na tentativa de eliminar ou
reduzir os conteúdos de rafinose e estaquiose em produtos de soja. Entretanto,
2
diversas pesquisas sugerem que a hidrólise enzimática dos RO parece ser a
estratégia mais eficiente para reduzir esses açúcares não digeríveis,
aumentando seu valor nutricional (GUIMARÃES et al., 2001, VIANA et al.,
2007, BRASIL et al. 2010). A hidrólise dos RO pode ser catalisada pelas α-
galactosidases (α-D-galactosídeo galactohidrolase, E.C. 3.2.1.22) ou pelas
invertases (β-D- frutofuranosídeo frutohidrolase, E.C. 3.2.1.26), ou ambas.
α-Galactosidases intracelular e extracelular ocorrem em microrganismos,
plantas e animais. Uma vantagem do uso de leveduras em indústria de
alimentos e farmacêutica é que muitas delas são classificadas como GRAS
(Generally Regarded as Safe), status conferido às cepas que não apresentam
riscos de toxicidade e patogenicidade (HENSING et al., 1995). Debaryomyces
hansenii é a espécie de levedura mais frequentemente encontrada em produtos
fermentados ricos em proteínas como salsicha e queijos (PETERSEN et al.,
2002). Estudos demonstraram que essa levedura secreta α-galactosidases
capazes de hidrolisar RO, melhorando os valores nutricionais de produtos da
soja (VIANA et al., 2007, BRASIL et al., 2010).
Embora o processo fermentativo para produção de etanol seja bem
conhecido, os custos de produção de etanol a partir de biomassa e de resíduos
industriais ainda constituem impedimento para o amplo uso do etanol como
combustível. Assim, o desenvolvimento de processos usando fontes de
carbono econômicas é importante para a produção de etanol em escala
comercial (CAZETTA et al., 2007). A utilização de substratos de baixo custo
oriundos de fontes agrícolas renováveis como material lignocelulósico, bagaço
de cana-de-açúcar e melaço de soja são estudados.
3
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
BRASIL, A.P.R., DE REZENDE, S.T., PELÚZIO, M.C.G., GUIMARÃES, V.M.
Removal of oligosaccharides in soybean flour and nutritional effects in rats.
Food Chemistry 118:251–255, 2010.
BRAUNEGG, G., BONA, R., KOLLER, M. Sustainable polymer production.
Polym.-Plant. Technol. 43:1779-1793, 2004.
CAZETTA, M.L., CELLIGOI, M.A., BUZATO, J.B., SCARMINO, I.S.
Fermentation of molasses by Zymomonas mobilis: effects of temperature and
sugar concentration on ethanol production. Biores. Technol. 98:2824–2828,
2007.
GOLBITZ, P. Whole soybeans as ingredient. A soytech study. Soytech, Inc,
2003.
GUIMARÃES, V.M., DE REZENDE, S.T., MOREIRA, M.A., BARROS, E.G.,
FELIX, C.R. Characterization of α-galactosidases from germinating soybean
seed and their use for hydrolysis of oligosaccharides. Phytochemistry, 58:67-73,
2001.
HENSlNG, M.C.M., BANGMA, K.A., RAAMSDONK, L.M., HULSTER, E., van
DIJEN, J.P., PRONK, J.T. Effects of cultivation conditions on the production of
heterologous α-gaIactosidase by Kluyveromyces lactis. Applied Microbiology
Biotechnology, 43:58-64, 1995.
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (online).
http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/indicadores/agropecuaria/lspa/lspa_200
912comentarios.pdf. (acessado em 08.01.2010).
de LUMEN, B.O. Molecular strategies to improve protein quality and reduced
flatulence in legumes: A review. Food Structure, 11:33-46, 1992.
MONTELONGO, J.L., CHASSY, B.M., MCCORD, J.D. Lactobacillus salivarius
for conversion of soy molasses into lactic acid. Journal of Food Science,
58:863-866, 1993.
NIELSEN, N.C. Soybean: Genetics, Molecular Biology and Biotechnology.
D.P.S. Verma and R.C. Shoemaker (Editors), Cab International, Wallingford,
U.K., 1996.
PETERSEN, K.M., WESTALL, S., JESPERSEN, L. Microbial succession of
Debaryomyces hansenii strains during the production of Danish surface-ripened
cheeses. Journal Dairy Science, 85:478-486, 2002.
4
QURESHI, N., LOLAS, A., BLASCHEK, H.P. Soy molasses as fermentation
substrate for production of butanol using Clostridium beijerinckii BA 101. J. Ind.
Microbiol. Biotechnol. 26:290-295, 2001.
SOLAIMAN, D., ASHBY, R., HOTCHKISS, A., FOGLIA, T. Biosynthesis of
medium-chain-length poly(hydroxyalkanoates) from soy molasses. Biotechnol
Lett., 28:57-162, 2006.
SIQUEIRA, P.F., KARP, S.G., CARVALHO, J.C., STURM, W., RODRÍGUEZ-
LEÓN, J.A., THOLOZAN, J.L., SINGHANIA, R.R., PANDEY, A., SOCCOL, C.R.
Production of bio-ethanol from soybean molasses by Saccharomyces
cerevisiae at laboratory, pilot and industrial scales. Biores.Technol. 99:8156-
8163, 2008.
VIANA, P.A., DE REZENDE, S.T., FALKOSKI, D.L., LEITE, T.A., JOSÉ, I.C.;
MOREIRA, M.A.; GUIMARÃES, V.M. Hidrolysis of oligosaccharides in soybean
products by Debaryomyces hanseni UFV-1 α-galactosidases. Food Chemistry,
103:331-337, 2007.
WAGNER, J.R., BECKER, R., GUMBMANN, R., OLSON, A.C. Hydrogen
production in the rat following ingestion of raffinose, stachyose,
oligosaccharides-free bean residue. Journal Chemistry Technology
Biotechnology, 56:3-13, 1976.
CAPÍTULO 1
Remoção de galactooligossacarídeos em melaço
de soja e avaliação nutricional em ratos
6
1. INTRODUÇÃO
A intensificação do uso de enzimas tem ocorrido principalmente pela
tendência mundial de estabelecer novos processos industriais, especialmente
os biotecnológicos mais específicos, de menor consumo energético e menos
agressivos ao ambiente. Apesar do Brasil utilizar significativamente enzimas,
nossa produção interna é ainda extremamente reduzida. Portanto, a produção
de enzimas tem relevante importância estratégica, pois poderá atender a
demanda interna bem como promoverá economia de divisas, com a
substituição das importações.
Atualmente, o Brasil ocupa posição de destaque entre os principais
países produtores de soja; e a utilização dos grãos de soja e de seus derivados
na alimentação humana e animal vêm crescendo e novas tecnologias têm de
ser desenvolvidas para atender esta demanda. Entretanto, o aumento no
consumo de soja e derivados é limitado pela presença de fatores
antinutricionais, dentre os quais se destaca os oligossacarídeos de rafinose
(RO). Esses açúcares não são hidrolisados por humanos e animais
monogástricos, uma vez que estes não possuem enzimas capazes de
hidrolisar as ligações α-1,6 presentes nesses açúcares. Diversas pesquisas
sugerem que a hidrólise enzimática dos RO parece ser a estratégia mais eficaz
para reduzir esses açúcares e aumentar seu valor nutricional.
As α-galactosidases são enzimas pertencentes à classe das hidrolases e
catalisam a clivagem hidrolítica de resíduos terminais de D-galactose em
ligação α. Elas têm sido aplicadas em processos biocatalíticos para melhorar a
qualidade dos produtos destinados à nutrição humana; e também como
componentes em dietas animais, aumentando a digestibilidade e reduzindo a
fermentação dos açúcares não digeríveis. Há uma grande vantagem na
utilização de α-galactosidases de leveduras na alimentação, pois algumas são
classificadas como GRAS, não apresentando toxicidade e patogenicidade.
A indústria de alimentos, especialmente o setor de derivados da soja,
tem grande interesse nos processos de redução dos oligossacarídeos de
rafinose, que são resistentes ao calor, não sendo inativados durante o
processamento convencional. O melaço de soja, um subproduto da indústria
7
processadora de soja, é uma fonte concentrada de açúcares. Ele é produzido
em quantidade significante, sendo um material de baixo custo comercial,
podendo tornar-se uma atraente reserva alimentar. Porém seu elevado teor de
RO restringe sua utilização na suplementação de rações animais. A utilização
de preparações comerciais de α-galactosidases propicia uma melhora na
absorção dos nutrientes. Este fato é evidenciado por pesquisas que
demonstraram um aumento significativo no peso e digestibilidade dos animais.
Portanto, a utilização de α-galactosidases na hidrólise dos RO presentes no
melaço de soja poderá favorecer o seu uso como suplemento alimentar.
1.1. Objetivo Geral
O presente trabalho teve como objetivo geral estabelecer condições
tecnológicas para a obtenção de um melaço de soja livre de oligossacarídeos
de rafinose, através do tratamento enzimático com α-galactosidases de
Debaryomyces hansenii UFV-1, e avaliar nutricionalmente o produto obtido em
ratos.
1.2. Objetivos Específicos
- Estabelecer as condições de cultivo da levedura Debaryomyces hansenii
UFV-1 em melaço de soja;
- Estudar a fermentação direta do melaço de soja pela levedura D. hansenii
UFV-1;
- Determinar o teor dos RO no melaço de soja tratado e não tratado por
cromatografia líquida de alta eficiência (CLAE);
- Determinar a composição do melaço de soja tratado e não tratado pela
quantificação de proteínas, lipídios, carboidratos e minerais;
- Avaliar a qualidade protéica-energética do melaço de soja tratado e não
tratado, por meio de ensaio biológico com ratos Wistar, determinando o ganho
de peso, consumo protéico, digestibilidade verdadeira, coeficiente de eficácia
protéica (PER) e razão protéica líquida (NPR).
8
2. REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1. Origem e evolução do agronegócio da soja (Glycine max)
A soja (Glycine max) pertence a família das leguminosas, com origem na
China, é um dos mais antigos produtos cultivados pelo homem, embora o seu
potencial para uso na alimentação humana e animal tenha sido evidenciado
somente após a Segunda Guerra Mundial para o ocidente. A soja pode ser
considerada um dos principais alimentos para a população do futuro, devido
suas qualidades nutricionais, facilidade de adaptação a quase todas as regiões,
alta produção e facilidade de cultivo (BELLAVER & SNIZEK, 1999).
A soja constitui um dos produtos de maior importância na economia
brasileira, ocupando lugar de estaque na pauta de exportações do país. Esta
leguminosa foi trazida pelos primeiros imigrantes japoneses em 1908 e sua
expansão ocorreu nos anos 70, com um crescente interesse na indústria de
óleo e na demanda do mercado internacional. Porém, até 1975, toda a
produção brasileira de soja utilizava cultivares e técnicas importadas dos
Estados Unidos, motivo este que levou os estados do Sul do país a
conseguirem boa produtividade em nível de escala comercial, em função das
semelhanças climáticas. Em 1975, criou-se o centro Nacional de Pesquisa de
Soja (Embrapa Soja) onde pesquisadores desenvolveram a primeira cultivar
brasileira. Esse fato permitiu que a soja fosse produzida em regiões tropicais
(Cerrados) onde antes a planta não se desenvolvia. A soja viabilizou a
implantação de indústrias de óleo, fomentou o mercado de sementes e deu
estabilidade à exploração econômica das terras onde antes existiam matas e
cerrados (CHIAPPA, 2007).
No começo de 2000, apoiado pelos serviços nacionais de pesquisa,
ensino e extensão, o Brasil passou a ocupar lugar de destaque no cenário
mundial do agronegócio da soja, como grande produtor e exportador. Tendo
características de grandes propriedades, constituiu-se na maior cultura
nacional em termos de área. Em estimativas realizadas pelo Instituto Brasileiro
de Geografia e Estatística (IBGE) para safra 2009/2010, o Brasil alcançará
valores próximos a 65,2 milhões de toneladas que representará cerca de 30%
9
da produção global de soja, onde ocupa segundo lugar no quadro dos
principais produtores mundiais (IBGE, 2010).
2.2. Melaço de soja
O melaço de soja é um subproduto da indústria processadora de soja,
rico em carboidratos. O melaço é produzido concomitantemente com a
obtenção do concentrado protéico de soja através de uma extração alcoólica
(60-70% etanol aquoso) dos açúcares a partir do farelo de soja
desengordurado. O resultado de todos esses processos de extração e
concentração resulta na obtenção de um xarope marrom escuro, rico em
carboidratos (JOHNSON et al., 1992). Por se tratar de um resíduo
agroindustrial com elevado volume de geração, o melaço de soja é um material
de baixo custo comercial que impõem problemas de descarte ambiental.
Um dos principais constituintes do melaço de soja são os carboidratos,
que representam cerca de 60 % do total dos sólidos solúveis encontrados
nesse produto (CHAJUSS, 2004). Destes, os açúcares digeríveis representam
58 % e incluem a sacarose, glicose, frutose, e galactose. Os açúcares não
digeríveis, representam cerca de 42 % e incluem a rafinose, estaquiose e
verbascose (QURESHI et al., 2001; LOLAS, 1999)
O melaço de soja tem se tornado uma reserva alimentar energética
atraente e de baixo custo (BRAUNEGG, et al., 2004). Sua principal aplicação
tem sido na indústria de alimentos animal, como um ingrediente calórico de
baixo preço (BERK, 1992, QURESHI, et al., 2001; SIQUEIRA, et al., 2008).
Entretanto, a limitação da utilização do melaço de soja como suplemento
energético em ração animal se dá em grande parte pela presença de tri e
tetrassacarídeos como a rafinose e estaquiose, respectivamente (SNYDER &
KWON, 1987). Esses açúcares são digeridos pobremente por animais e
indigeríveis por humanos, devido à incapacidade de sintetizar as α-
galactosidases, enzimas que hidrolisam as ligações α-1,6 presentes nos RO.
Assim os RO promovem aumento da viscosidade do bolo alimentar, interferindo
na digestão dos nutrientes por reduzir sua interação com enzimas digestivas no
intestino (SMITS e ANNISON, 1996). Além disso, a presença de altas
concentrações desses açúcares na dieta pode resultar na retenção de fluidos,
10
acelerando o fluxo digestivo, afetando a utilização e absorção de nutrientes
(WIGGINS, 1984). A ingestão dos RO também pode resultar em flatulência,
náuseas, desconforto abdominal e diarréia.
A indústria de alimentos, especialmente o setor de derivados de soja,
tem grande interesse na redução desses oligossacarídeos, que são resistentes
ao calor e desta forma não são inativados durante o processamento
convencional para tratamento dos demais fatores antinutricionais (SAID e
PIETRO, 2004).
Vianna, et al., (2007) relataram a eficiência da enzima α-galactosidase
de Debaryomyces hansenii UFV-1 para hidrolisar os açúcares rafinose e
estaquiose presentes no melaço de soja. As α-galactosidases vem sendo
indicadas para aplicação em processos biocatalíticos, visando melhorar o valor
nutricional de produtos de soja destinados à nutrição humana e também como
componente na dieta de animais, promovendo aumento na digestibilidade e no
ganho de peso.
2.3. α-Galactosidases: definição e importância comercial
α-Galactosidases são enzimas pertencentes à classe das hidrolases.
São exoglicosidases que catalisam a clivagem hidrolítica de resíduos terminais
de D-galactose em ligação α. Estas enzimas hidrolisam D-galactosídeos
simples, bem como moléculas complexas como oligo e polissacarídeos,
glicoproteínas e outros derivados (MANZANARES, et al., 1998). As α-
galactosidases (α-D-galactosídeo galactohidrolase, E.C. 3.2.1.22) estão
amplamente distribuídas em microrganismos, plantas e animais.
As α-galactosidases estão classificados em 3 famílias distintas de glicosil
hidrolases, baseados na similaridade da estrutura primária e análise de
“clusters” hidrofóbicos. A família 27 de glicosil hidrolases é muito conservada,
incluindo α-galactosidases eucarióticas de plantas, animais, leveduras e fungos
filamentosos. A família 36 contém principalmente α-galactosidases bacterianas,
mas também algumas α-galactosidases eucarióticas (HENRISSAT e
BAIROCH, 1993; MARGOLLES-CLARK, et al, 1996). A família 4 é
caracterizada por conter, até o momento, somente α-galactosidases
bacterianas. A maioria das α-galactosidases pertencentes à família 36 são
11
enzimas maiores, com uma estrutura tetramérica. As α-galactosidases
pertencentes à família 27 são geralmente menores e algumas são monômeros
(ADEMARK, et al., 2001). As diferenças estruturais entre essas enzimas
podem contribuir para diferenças na atividade (LUONTERI, et al., 1998). Em
adição à atividade hidrolítica, algumas α-galactosidases apresentam também
atividade de transgalactosilação.
As α-galactosidases são enzimas de grande importância comercial
devido à sua utilização em vários processos biocatalíticos. Na indústria de
alimentos, estas enzimas constituem uma ferramenta muito útil, uma vez que
participam em diferentes processos para a hidrólise de açúcares contendo
resíduos de galactose. α-Galactosidases promovem a conversão de RO não
digeríveis, indutores de flatulência, presentes em várias leguminosas, em
açúcares digeríveis (GUIMARÃES, et al., 2001). Produtos de soja hidrolisados
com as α-galactosidases, como farinha e leite de soja, apresentam melhores
propriedades nutricionais, o que contribui para ampliação do mercado
consumidor de soja e derivados. Essa enzima também é usada como aditivo
em ração animal à base de leguminosas para reduzir o teor dos RO. No
processo de produção de açúcar de beterraba e mel de abelha, as α-
galactosidases hidrolisam a rafinose presente nos respectivos xaropes,
contribuindo para cristalização dos produtos (KOBAYASHI e SUZUKI, 1972).
Além da utilização das α-galactosidases pelas indústrias alimentícias,
essas enzimas são de grande interesse para a indústria farmacêutica, onde
participam na biocatálise de vários compostos ativos. Estudos indicam que esta
enzima tem uma possível aplicação na biocatálise de oligossacarídeos
complexos, utilizados nas pesquisas médicas e biológicas. Algumas α-
galactosidases de eucariotos são capazes de remover resíduos de galactose
com ligação α-1,3 terminal de glucanas, o que apresenta um potencial uso
médico em terapia de transfusão, na conversão de sangue do grupo B para
sangue do grupo O (ZHU e GOLDSTEIN, 1994; VARBANETS, et al., 2001).
2.4. α-Galactosidases microbianas
Certos microrganismos apresentam a vantagem de produzir α-
galactosidases com alto rendimento. As α-galactosidases fúngicas são
12
indicadas para aplicações tecnológicas devido a sua localização extracelular,
atividade em pH ácido e boa estabilidade (MANZANARES, et al., 1998). Essas
enzimas são produzidas principalmente por fungos dos gêneros Aspergillus,
Trichoderma, Penicillium e Streptomyces.
Dentre as leveduras que produzem essas enzimas, as dos gêneros
Torulaspora, Saccharomyces e Kluyveromyces são as mais utilizadas. Uma
grande vantagem do uso de leveduras é que muitas delas são classificadas
como GRAS (Generally Regarded as Safe), especialmente Saccharomyces
cerevisiae e Kluyveromyces lactis. Organismos com “status” GRAS não
apresentam riscos de toxicidade e patogenicidade, o que permite sua utilização
para aplicações na indústria de alimentos e farmacêutica (HENSING et al,
1995).
Leveduras como Debaryomyces castellii IFO 1359, D. nepalensis IFO
1428, Pichia guillermondii IFO 10106, Saccharomyces cerevisiae IFO 1997 e
Schwanniomyces occidentalis var. occidentalis IFO 1839 apresentam α-
galactosidases intra e extracelulares (YOSHIDA et al., 1997). Viana et al.
(2006) purificaram e caracterizaram α-galactosidases secretadas por
Debaryomyces hansenii UFV-1, cultivada em meio contendo galactose como
fonte de carbono. Falkoski et al. (2006) descreveram a purificação e
caracterização de α-galactosidases de sementes de soja, dos fungos
Aspergillus terreus e Penicillium griseoroseum; além da hidrólise de farinha de
soja e melaço de soja utilizando essa enzima.
2.5. Oligossacarídeos de rafinose e distúrbios intestinais
Os produtos da soja têm uma excelente reputação, devido ao seu
elevado conteúdo protéico e alta qualidade de seus aminoácidos. Entretanto, o
consumo humano desses produtos é ainda limitado devido à presença de
oligossacarídeos de rafinose (RO) presente nos grãos de soja, que não são
eliminados pelo processamento tradicional (LESKE et al., 1991). A rafinose e
estaquiose são açúcares compostos por uma ou duas unidades de galactose
unidas à sacarose por ligações α-1,6, respectivamente.
Os RO não digeríveis são melhores definidos como “carboidratos com
um grau de polimerização de dois ou mais resíduos de galactose, que são
13
solúveis em etanol 80% e não susceptíveis a digestão pancreática e nem por
enzimas da borda em escovas” (QUIGLEY et al. 1999).
A degradação dos RO ocorre na parte posterior do intestino, onde são
fermentados por bactérias anaeróbicas com a liberação de grande quantidade
de CO
2
, H
2
e CH
4
(PRICE et al., 1988), causando desconforto intestinal,
cólicas, flatulência, diarréia e colite em humanos, além de diarréia severa em
animais como suínos e outros (de LUMEN, 1992). Isto ocorre porque a mucosa
do intestino de animais superiores, incluindo humanos, não possui a enzima α-
galactosidase, necessária à hidrólise das ligações α-1,6. Este fato impossibilita
a conversão dos RO em açúcares mais simples e digeríveis. A presença
desses açúcares, rafinose e estaquiose, na dieta alimentar pode resultar na
retenção de fluidos, aumento o fluxo digestivo, afetando a utilização e absorção
de nutrientes (WIGGINS, 1984).
Pesquisas mostram que procedimentos como embebição das sementes
de leguminosas, cocção, extração com solventes, etc, podem reduzir os RO da
dieta. Entretanto os processamentos tradicionais dos produtos derivados de
soja e de outras leguminosas não eliminam esses α-galactosídeos
termoestáveis (NACZK et al., 1997). Experimentos, principalmente com animais
monogástricos, demonstraram que a digestão intestinal desses
oligossacarídeos pode ser aumentada se a dieta animal for suplementada com
α-galactosidase exógena. Assim sendo, o tratamento enzimático desses
produtos, utilizando α-galactosidases, tem demonstrado ser a forma mais
promissora para eliminação ou redução dos RO da dieta (ARANDA et al., 2001;
FALKOSKI et al., 2006; SOUZA JÚNIOR et al., 2009; BRASIL et al., 2010).
2.6. Redução dos oligossacarídeos de rafinose em produtos derivados de
soja
As indústrias alimentícias têm explorado comercialmente o potencial
energético-protéico da soja, estimulando sua produção em larga escala. Além
do óleo que é destinado principalmente ao consumo humano, a fração protéica
é comumente empregada na fabricação da ração animal.
Embora sejam indiscutíveis as vantagens do emprego da soja e de
outras leguminosas na alimentação humana e animal, o uso da soja e
14
derivados tem sido limitado pela necessidade de tratamentos para inativação
dos diversos componentes antinutricionais. Tentativas têm sido feitas para
eliminar ou reduzir os conteúdos de rafinose e estaquiose em produtos de soja
como: embebição das sementes (KAWAMURA e TADA, 1967), embebição e
germinação (KIM et al., 1973), processos de fermentação (MITAL et al., 1975)
e extração dos oligossacarídeos com água (KU et al., 1976). Técnicas como
ultrafiltração do extrato hidrossolúvel de soja para remoção dos
oligossacarídeos de rafinose (OMOSAIYE et al., 1978), e de extração desses
açúcares com etanol a partir de farinha de soja (LESKE et al., 1991; IRISH et
al., 1995) também foram testadas.
Entretanto, diversas pesquisas sugerem que a hidrólise enzimática dos
RO presentes na soja e seus derivados parece ser a estratégia mais eficaz
para reduzir esses açúcares e aumentar seu valor nutricional (CRUZ e PARK,
1982; SANNI, et al., 1997), uma vez que os tratamentos enzimáticos são
extremamente específicos, causando menor alteração nas proporções dos
demais componentes dos derivados de soja (VIANA, 2005).
Viana, et al. (2007) descreveram a aplicação de α-galactosidase
extracelular livre e imobilizada, além de células permeabilizadas de
Debaryomyces hansenii UFV-1 contendo α-galactosidase intracelular no
tratamento de leite e melaço de soja com o objetivo de reduzir a concentração
de RO nesses produtos. Prashanth e Mulimani (2005) relataram uma redução
de 93% no teor de RO presente no extrato hidrossolúvel de soja após 12 h de
incubação com α-galactosidase de Aspergilus oryzae.
α-Galactosidases vegetais também têm sido utilizadas na hidrólise dos
RO em produtos derivados de soja. Guimarães, et al. (2001) demonstraram
que uma forma de α-galactosidase purificada de sementes de soja em
germinação reduziu em 73% e 41% os teores de rafinose e estaquiose,
respectivamente, após incubação do extrato hidrossolúvel de soja com apenas
2 U (unidades) da enzima por 8h a 30°C.
15
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Microrganismo e manutenção da cultura
A fonte de α-galactosidase do presente trabalho foi a cepa de
Debaryomyces hansenii, codificada como UFV-1, que pertence à coleção de
leveduras do Laboratório de Fisiologia de Microrganismos-BIOAGRO-UFV.
Esta cepa foi isolada em ambiente de laticínios da região da Zona da Mata,
Minas Gerais, e identificada pelo Instituto de Identificação de Leveduras,
Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, Holanda como D. hansenii
(Zopf) Lodder & Kreger-van Rij var. fabryi Nakase & Suzuki.
A levedura, mantida a -80 ºC em glicerol 20 % e YPD (1 % de extrato de
levedura, 2 % de peptona e 2 % de glicose), foi estriada em placas contendo
meio YPD (1,5 % ágar) e incubada por 36 h a 30 °C. As placas foram mantidas
a 4 ºC e este estoque foi repicado mensalmente e utilizado para inóculo.
3.2. Determinação das condições de tratamento do melaço de soja com
células viáveis de D. hansenii
A levedura Debaryomyces hansenii, mantida em placas a 4 ºC, foi
ativada em meio YPD líquido, em erlenmeyers de 250 mL, incubada em
Incubator Shaker Series 25D New Brunswick a 30 ºC, 200 rpm, por 12-15 h.
Para determinação das melhores condições para crescimento da
levedura e secreção das α-galactosidases, concentrações iniciais de 1, 2 e 5 %
(v/v) do inóculo, contendo células viáveis de D. hansenii, foram misturadas ao
melaço de soja, fornecido pela empresa BUNGE Alimentos S.A., Esteio-RS,
Brasil. O melaço de soja foi diluído com água destilada e utilizado nas
concentrações de 10, 20, 40, 60, 80 e 100 % (v/v).
As suspensões de melaço de soja foram adicionadas em erlenmeyer de
250 mL, homogeneizadas e esterilizadas em autoclave a 121 ºC por 15
minutos. As células da levedura foram inoculadas nas suspensões de melaço
de soja, e os erlermeyers foram incubados em Incubator Shaker Series 25D
New Brunswick a 200 rpm, 30 ºC por 72 h. Os controles negativos foram
16
preparados como descrito, exceto a inoculação da levedura que não foi feita no
melaço de soja.
Alíquotas foram coletadas nos tempos de 0, 12, 18, 24, 48 e 72 h, para
determinação da atividade de -galactosidase e da porcentagem de hidrólise
dos RO. As alíquotas foram liofilizadas e os RO extraídos de 20-30 mg de pó
obtido. A eficiência da hidrólise foi avaliada pela redução dos níveis dos RO
presentes nas diferentes concentrações de melaço de soja, em função do
tempo de incubação com a levedura.
3.3. Determinação da atividade de -galactosidase
Atividade de -galactosidase foi estimada, determinando-se as taxas de
hidrólise do substrato sintético -nitrofenil--D-galactopiranosídeo (NPGal).
Para o ensaio com o substrato NPGal, a mistura de reação foi composta de
650 L de tampão acetato de sódio 100 mM pH 5,0, 250 L NPGal 2 mM, 100
L de solução de enzima. A reação foi conduzida por 15 minutos em banho-
maria a 40 C e interrompida pela adição de 1 mL de solução de Na
2
CO
3
0,5
M. A coloração desenvolvida foi medida em espectrofotômetro, utilizando
comprimento de onda de 410 nm. Os valores de absorbância em 410 nm foram
transformados em moles de -nitrofenolato (NP), utilizando uma curva
padrão. Uma unidade de enzima foi definida como a quantidade de enzima
necessária para produzir 1 µmol de produto por minuto, nas condições do
ensaio.
3.4. Extração dos RO
O melaço de soja tratado e não tratado com células de D. hansenii UFV-
1 foi liofilizado e os RO extraídos de acordo com a metodologia proposta por
Guimarães et al. (2001).
Aproximadamente 20-30 mg das amostras liofilizadas foram pesadas em
tubos tipo eppendorf e usadas para o processo de extração dos açúcares
solúveis. Os açúcares foram extraídos com 1 mL por ciclo de etanol 80 % num
total de três ciclos em banho fervente por 5 min. Após cada ciclo de extração a
17
mistura foi submetida à centrifugação, em centrífuga modelo Eppendorf 5415C,
14.000 rpm por 5 minutos. O extrato alcoólico total obtido foi evaporado em
estufa a 50 ºC por 12-15 h e após este procedimento os açúcares foram
ressuspendidos em 1 mL de etanol 80 % e congelados a -20 °C. Após 24 h as
amostras foram centrifugadas nas mesmas condições já descritas, filtradas em
filtro Millipore de 0,45 micra de diâmetro e armazenadas a -20 °C, para
posterior análise por Cromatografia Líquida de Alta Eficiência (CLAE).
3.5. Determinação do teor de RO por cromatografia líquida de alta
eficiência (CLAE)
Os RO extraídos do melaço de soja tratado e não tratado foram
analisados por CLAE em cromatógrafo Shimadizu série 10A, equipado com
detector de índice de refração e coluna em aço inox (25 x 0.465 cm) contendo
o grupo aminopropil (-NH2) como fase estacionária. A fase móvel constituiu-se
de uma mistura acetonitrila:água (80:20) em condições isocráticas. As análises
foram realizadas a 35 °C sob um fluxo de 1 mL/min e todo o processo foi
controlado por um computador acoplado ao sistema.
O método foi padronizado para determinar quantitativamente os
açúcares solúveis presentes no melaço de soja. A partir de uma solução
estoque formada pela mistura dos açúcares frutose, glicose, sacarose, rafinose
e estaquiose nas concentrações 4, 4, 4, 8 e 8 % (p/v), respectivamente, foram
feitas diluições para obtenção das soluções padrão. Cada solução foi injetada
no cromatógrafo líquido para obtenção das curvas padrão, correlacionando a
área do pico com a concentração do açúcar na solução. As retas foram obtidas
por regressão linear. Um volume de 20 µL de cada amostra foi injetado no
cromatógrafo e cada açúcar presente foi identificado e quantificado por
comparação com os tempos de retenção e concentrações dos açúcares nas
soluções padrão. Todos os cálculos foram feitos pelo computador acoplado ao
sistema de CLAE equipado com o programa LC-10 versão 2.2 para Windows
®
.
3.6. Determinação da composição centesimal do melaço de soja tratado e
não tratado
18
3.6.1. Determinação do teor de proteínas
O teor de nitrogênio foi determinado, em duplicata, pelo método de
Kjeldahl descrito pela Association of Official Analytical Chemists - AOAC
(1997). Para o cálculo da conversão do nitrogênio em proteína foi utilizado o
fator 6,25.
3.6.2. Determinação do teor lipídico
O teor de lipídeos foi determinado, em duplicata, utilizando aparelho
extrator Soxhlet e éter de petróleo como solvente, com refluxo por 24 h, de
acordo com a AOAC (1997).
3.6.3. Determinação do conteúdo de cinzas
A determinação do conteúdo de cinzas foi conduzida, em duplicata, por
meio da calcinação das amostras a 550 °C em mufla, segundo método descrito
pela AOAC (1997).
3.6.4. Determinação do teor de carboidratos totais
O teor de carboidratos foi determinado por diferença percentual,
considerando os teores de proteínas, lipídeos e cinzas.
3.7. Ensaios biológicos
O melaço de soja tratado e não tratado foram utilizados como fonte
calórica para o preparo de dietas que foram avaliadas por meio de ensaios
biológicos com ratos. Os animais experimentais foram mantidos em gaiolas
individuais no Biotério de Experimentação do Departamento de Educação
Física da Universidade Federal de Viçosa (UFV). As dietas experimentais
foram elaboradas no Laboratório de Nutrição Experimental do Departamento de
Nutrição e Saúde/UFV, adaptadas à composição da dieta de acordo com a
recomendação AIN-93G. Os procedimentos experimentais foram julgados pela
19
Comissão de Ética em Experimentação Animal do Departamento de
Veterinária/UFV.
3.7.1. Preparo das dietas
Foram preparadas as dietas aprotéica, com sacarose (controle) e as
dietas experimentais D1 e D2 (Tabela 1). Para o preparo da dieta D1 foi
utilizado o melaço de soja tratado liofilizado (sem oligossacarídeos de rafinose).
Para o preparo da dieta D2 foi usado o melaço de soja não tratado liofilizado
(com oligossacarídeos de rafinose).
Tabela 1 - Composição das dietas experimentais utilizadas no ensaio biológico
(g/100g de mistura) – AIN-93G*.
Dietas
Ingredientes
Aprotéica Sacarose D1 D2
Caseína
- 11,74 9,95 10,76
Amido dextrinizado
1
13,20 13,20 13,20 13,20
Sacarose
10,0
2
10,0
2
10,0 10,0
Óleo de soja
2
7,00 7,00
7,00
7,00
Fibra
1
(celulose)
5,00 5,00 5,00 5,00
Mistura Mineral
1
3,50 3,50 3,50 3,50
Mistura Vitamínica
1
1,00 1,00 1,00 1,00
Bitartarato de colina
1
0,25 0,25 0,25 0,25
L-cistina
1
0,30 0,30 0,30 0,30
Amido de milho
2
59,75 48,01 49,80 48,99
D1-Dieta contendo melaço de soja sem oligossacarídeos (MST)
D2-Dieta contendo melaço de soja com oligossacarídeos (MSNT)
1
Obtido da RHOSTER – Indústria e Comércio Ltda.
*Segundo Reeves et al. (1993).
2
Obtido no comércio de Viçosa, MG.
A composição das dietas experimentais foi baseada na dieta AIN-93G,
segundo Reeves et al. (1993), com o teor de proteínas ajustado para 9 a 10 %.
Após o preparo, a concentração protéica de cada dieta foi determinada, em
triplicata, pelo método semimicro Kjeldahl, usando-se o fator 6,25 para a
20
obtenção do teor de proteína. As dietas foram acondicionadas em sacos de
polietileno devidamente rotulados e armazenados em refrigerador a 4 ºC.
As quantidades dos componentes, óleo de soja, amido de milho, fibra
alimentar, amido dextrinizado e sacarose foram ajustados, conforme a
composição das fontes protéicas, de modo a obter dietas isocalóricas e
isoprotéicas.
3.7.2. Animais
Foram utilizados ratos machos da raça Wistar, recém-desmamados, com
média de 28 dias de idade, peso variando de 50 a 60 g, provenientes do
Biotério Central do Centro de Ciências Biológicas e da Saúde (CCB) da
Universidade Federal de Viçosa (UFV).
Os animais foram subdivididos em quatro grupos com seis
animais/grupo. Após pesagem, os animais foram distribuídos de modo que a
diferença entre as médias dos pesos e os grupos não excedesse a 5 g. Os
ratos foram alocados em gaiolas individuais, onde receberam água e as dietas
experimentais ad libitum por 28 dias. As condições de temperatura (22 ± 3 ºC)
e luminosidade (fotoperíodo de 12 h) foram controladas, sendo o
monitoramento do consumo alimentar feito semanalmente.
Os animais foram submetidos à eutanásia por inalação com gás
carbônico, e foram determinados os valores de ganho de peso, consumo
protéico, digestibilidade verdadeira, coeficiente de eficácia protéica (PER) e
razão protéica líquida (NPR).
3.7.3. Coeficiente de eficácia protéica (PER)
O PER relaciona o ganho de peso dos animais do grupo teste com o
consumo de proteína do grupo teste.
O cálculo é feito pela seguinte equação (Hegsted, 1977):
ganho de peso do grupo-teste (g)
proteína consumida pelo grupo-teste (g)
PER
=
21
3.7.4. Razão protéica líquida (NPR)
Método original de Bender e Doell (1957). Verifica a capacidade da
proteína de manter o peso do animal e de promover o crescimento deste,
servindo para o crescimento e manutenção. O cálculo é realizado de acordo
com a seguinte equação:
ganho de peso grupo-teste(g) + perda de peso grupo aprotéico(g)
proteína consumida pelo grupo-teste(g)
3.7.5. Digestibilidade verdadeira
É um método que mede a proporção de nitrogênio absorvido após a
digestão. Para a determinação da digestibilidade verdadeira, as dietas foram
marcadas com índigo carmim na proporção de 200 mg/100 g de dieta e
oferecidas aos animais no 7
o
e 10
o
dia. As fezes foram coletadas do 8
o
ao 11
o
dia e acondicionadas em recipientes individuais para cada animal, sendo
mantidas sob refrigeração a 4
o
C.
As fezes foram, posteriormente, secas em estufa com circulação de ar a
105
o
C, por 24 h. Após o resfriamento, as fezes foram pesadas e moídas em
moinho de navalha para determinação do teor de nitrogênio pelo método
semimicro Kjeldahl, com amostras em triplicata, segundo a AOAC (1997).
A determinação da digestibilidade verdadeira foi possível pelo emprego
de um grupo de seis animais com dieta aprotéica. O cálculo foi realizado de
acordo com a seguinte fórmula:
% Digestibilidade =
I
xFKFI 100)(
em que:
I = nitrogênio ingerido pelo grupo com dieta teste;
F = nitrogênio fecal do grupo com dieta teste;
FK = nitrogênio fecal do grupo com dieta aprotéica
NPR
=
22
4. RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Determinação das condições de cultivo de D. hansenii UFV-1 no
melaço de soja para remoção dos oligossacarídeos de rafinose
No presente trabalho, diferentes concentrações de melaço de soja (10,
20, 40, 60, 80 e 100 %) e volumes do inóculo (1, 2 e 5 %) contendo as células
de D. hansenii foram avaliadas com o objetivo de determinar as melhores
condições para o cultivo da levedura no melaço, produção da enzima α-
galactosidase e conseqüente remoção dos RO presentes no melaço de soja.
As condições que promoveram as melhores taxas de remoção dos RO do
melaço de soja foram obtidas quando o melaço foi usado em menores
concentrações (10 e 20 %) e com volume de inoculo de 2 %.
Com o volume de inóculo correspondendo a 1 % (v/v), foram observados
os picos de rafinose (8,52%) e de estaquiose (4,96 %), mesmo após 24 h de
inoculação da levedura no melaço de soja a 20 % (Figura 1A). Entretanto, após
48 h, estaquiose foi completamente hidrolisada, porém o pico de rafinose ainda
foi detectado (3,94 %) (Figura 1B). Quando o melaço de soja a 40 % foi
misturado com 1 % do inóculo, foram detectados os picos referentes à rafinose
(6,86 %) e estaquiose (6,10 %) após 24 h (Figura 1C). Após 48 h de incubação,
as concentrações de rafinose e de estaquiose foram praticamente iguais
aquelas observadas com 24 h de tratamento (Figura 1D). Esses resultados
sugerem que concentrações do melaço de soja acima de 40 % podem causar
inibição do crescimento da levedura e da produção das α-galactosidases, não
havendo desta maneira hidrólise dos RO. Entretanto, a concentração inicial das
células da levedura (inóculo de 1 %) pode ter sido um fator limitante,
contribuindo para a não eficiência de hidrólise dos RO.
23
Figura 1 - Cromatogramas comparativos da hidrólise dos RO no melaço de
soja na concentração de 20 % (A e B) e 40 % (C e D) com tempo de incubação
de 24 h (A e C) e 48 h (B e D), utilizando 1 % de inóculo contendo células
viáveis da levedura Debaryomyces hansenii UFV-1.
Nesse sentido, um inóculo de 2 %, contendo células de D. hansenii, foi
misturado com melaço de soja em três diferentes concentrações: 10, 20 e 40
%, para avaliação da hidrólise dos RO presentes no melaço em função do
tempo de cultivo. Também foi avaliada a atividade da enzima α-galactosidase
secretada na cultura durante esse tempo (Tabela 2).
Sacarose
Rafinose
Estaquiose
24
Tabela 2 - Atividade de -galactosidase (U/mL) no sobrenadante da cultura de
Debaryomyces hansenii UFV-1 (inóculo de 2 %) em diferentes concentrações
de melaço de soja.
Atividade de -galactosidase (U/mL)
Concentração Melaço de soja (%) Tempo de
incubação (h)
10 20 40
0 0,0 0,0 0,0
24 0,09 + 0,0032 0,01 + 0,0017 0,0
48 0,12 + 0,0047 0,05 + 0,0015 0,0
72 0,15 + 0,0028 0,10 + 0,0028 0,0
1U: 1 μmol de ρ-NP formado por minuto
Valores expressos como média±desvio padrão
Quando o melaço de soja foi usado na concentração de 10 % foi
detectada maior atividade de α-galactosidase, seguido pelo melaço a 20 %. Já
no melaço de soja a 40 % não foi detectada a atividade de α-galactosidase.
Estes resultados sugerem que a presença de concentrações elevadas de
açúcares (sacarose, rafinose e estaquiose) no meio pode inibir o crescimento
da levedura e a síntese da enzima.
A máxima atividade de α-galactosidase (0,15 U/mL), verificada no
melaço de soja a 10 %, ocorreu após 72 h de incubação. No mesmo intervalo
de tempo foi observada, para o melaço de soja a 20 %, uma atividade de 0,10
U/mL. Entretanto, no melaço de soja a 10 % após 24 de incubação com a
levedura, a atividade de α-galactosidase (0,09 U/mL) foi semelhante aos
valores de atividade enzimática observados para o melaço de soja a 20 %,
após 72 h de incubação com a levedura. Esses dados sugerem que
concentrações mais diluídas do melaço de soja oferecem melhores condições
para o desenvolvimento da levedura D. hanseni UFV-1 e produção da α-
galactosidase.
Os dados da redução da concentração dos RO no melaço de soja 10 %
em função dos tempos de incubação com o inóculo 2 % estão apresentados na
Tabela 3.
25
Tabela 3 - Concentração de RO no melaço de soja 10 % em função do tempo
de incubação com o inóculo 2 % contendo células viáveis da levedura D.
hansenii UFV-1.
Concentração de açúcares (%) Tempo de
incubação
(h)
Rafinose Estaquiose
0 6,38 + 0,37 9,87 + 0,99
12 8,39 + 1,15 2,11 + 0,14
18 0,80 + 0,01 0,0
24 0,0 0,0
48 0,0 0,0
72 0,0 0,0
Os resultados foram calculados a partir de cromatogramas obtidos pela análise por CLAE.
Valores expressos como média ± desvio padrão.
Observou-se redução de 78,62 % de estaquiose após 12 h de incubação
do melaço com as células da levedura. Neste mesmo período foi observado um
aumento de 31,50 % de rafinose, provavelmente devido ao acúmulo de
rafinose que ocorre após a hidrólise da estaquiose. A remoção total de rafinose
e estaquiose somente foi verificada após um período de 24 h de incubação.
Quando o melaço de soja a 20 % foi misturado com o inoculo a 2 %, após 24 h
de incubação, o teor de estaquiose se igualou a zero, entretanto 79.9 % da
concentração inicial de rafinose foram mantidas. Estes dados indicam que para
utilização do inoculo a 2 %, a concentração do melaço de soja a 10 %
promoveu a maior produção da α-galactosidase pela levedura e
consequentemente a remoção mais rápida (24 h) dos RO do melaço de soja.
Também a utilização do inóculo correspondente a concentração de 2 %
promoveu melhor desempenho da levedura em relação a produção da α-
galactosidase e eficiência na remoção dos RO do melaço, quando comparada
com a concentração de 1 %.
Em termos industriais, para que este processo usando o cultivo direto da
levedura no melaço de soja, seja eficiente para remoção dos RO, seria
interessante que o melaço pudesse ser usado em concentrações mais
elevadas, evitando a etapa de diluição do melaço. Assim, para avaliar a
produção da α-galactosidase pela levedura cultivada em concentrações mais
elevadas do melaço, um inóculo equivalente a 5 % foi utilizado para cultivo no
melaço a 20, 40, 60, 80 e 100 % (Tabela 4).
26
Tabela 4 - Atividade de -galactosidase (U/mL) no sobrenadante da cultura de
Debaryomyces hansenii UFV-1 (inóculo de 5 %) em diferentes concentrações
de melaço de soja.
Atividade de -galactosidase (U/mL)
Concentração Melaço de soja (%) Tempo de
incubação (h)
20 40 60 80 100
0 0 0 0 0 0
24 0,14 + 0,161 0 0 0 0
48 0,38 + 0,009 0 0 0 0
1U: 1μmol de ρ-NP formado por minuto
Valores expressos como média ± desvio padrão
Como demonstrado anteriormente, concentrações do melaço de soja
acima de 40 % inibiram a produção da α-galactosidase. Atividade de α-
galactosidase foi detectada apenas no meio contendo melaço de soja a 20 % e
esta atividade foi maior em comparação as atividades observadas
anteriormente, nos tempos de 24 e 48 h de cultivo.
Entretanto, a hidrólise total de rafinose e estaquiose, utilizando a
concentração de 5 % de inóculo, somente foi verificada após 48 h de cultivo.
Com 24 h de cultivo, a concentração de estaquiose foi nula, mas a
concentração de rafinose foi de 3,85 %. Estes resultados sugerem que apesar
da maior atividade da α-galactosidase, detectada no meio contendo melaço de
soja a 20 % e maior concentração inicial de células da levedura (5 %), esta
condição não foi eficiente para promover completa hidrólise dos RO no tempo
de 24 h.
Desta forma, a condição de cultivo da levedura que promoveu a maior
eficiência de hidrólise dos RO foi aquela utilizando concentração de 10 % do
melaço de soja e 2 % de inóculo.
O uso de α-galactosidase de D. hansenii UFV-1 na hidrólise de RO
presentes na farinha de soja desengordurada foi também relatado por Brasil et
al. (2010), que verificou a completa redução dos açúcares rafinose e
estaquiose, após 36 h de inoculação da suspensão com a levedura. Scalabrini
et al (1998) avaliando o crescimento de Bifidobacterium, relataram que a maior
atividade de α-galactosidase foi verificado no intervalo de 12-24 h de cultivo; e
que esse período corresponderia a fase exponencial de crescimento.
27
No presente estudo, devido à acentuada coloração do melaço de soja
usado como meio de crescimento para a D. hansenii, as leituras de A
600
foram
prejudicadas, não sendo possível construir uma curva de crescimento
microbiano. Entretanto, foi observada uma boa correlação entre a produção de
α-galactosidase com o aumento da turbidez do meio, indicativo de crescimento
celular, e com a hidrólise dos RO. Observações semelhantes foram citadas por
Garro et al. (2004), Yoon e Hwang (2008) e Brasil et al. (2010).
Neste trabalho, não foi detectada atividade de α-galactosidase, quando a
levedura foi cultivada no melaço de soja mais concentrado. Semelhantemente,
Liu e Lin (2000) demonstraram que a adição de 1 % de glicose ou lactose no
meio contendo extrato hidrossolúvel de soja causou um decréscimo na
atividade de α-galactosidase de bactérias ácido-láticas e leveduras
identificadas em grãos de kefir. Segundo Mabinya et al. (2004), a taxa mínima
de crescimento microbiano e de atividade de α-galactosidase observada na
presença de açúcares simples, pode ser causada devido a um efeito de
repressão catabólica pela fonte de carbono. Viana et al. (2006) relataram que
as α-galactosidases de D. hansenii UFV-1 apresentam distinta sensibilidade a
açúcares simples, sendo parcialmente inibidas quando cultivadas na presença
de D-galactose e melibiose. Em cepas de Leuconostoc mesenteriodes e
Lactobacillus curvatus cultivadas em meios suplementados com frutose e
glicose houve inibição do crescimento com consequente inibição da atividade
de α-galactosidases (YOON e HWANG, 2008). No presente trabalho, com o
aumento da concentração de melaço de soja, os teores de galactose, frutose e
glicose também foram aumentados, uma vez que esses açúcares fazem parte
da composição do melaço e desta forma podem ter contribuindo negativamente
para o crescimento da levedura e produção da enzima.
A habilidade da levedura D. hansenii em crescer, produzir α-
galactosidase e utilizar os RO no melaço de soja, indica a possibilidade da
utilização direta dessa levedura para redução dos RO em produtos derivados
de soja. Uma vez que esta levedura é encontrada em vários produtos
alimentícios e não apresenta problemas de toxicidade e patogenicidade, a sua
utilização torna-se vantajosa em termos de facilidade, redução nos custos e
tempo de obtenção da enzima α-galactosidase.
28
4.2. - Composição do melaço de soja
Na Tabela 5 estão apresentados os resultados da composição química
centesimal do melaço de soja tratado e não tratado, utilizados no preparo das
dietas para o ensaio biológico. O cultivo da levedura no melaço de soja (MST)
promoveu aumento de 44,4 % no teor de proteínas e 14,2 % no teor de cinzas
e diminuição de 12,2 % no conteúdo de carboidratos totais em relação ao
melaço de soja com RO (MSNT). Este aumento pode ter sido devido à
presença das células da levedura D. hansenii, utilizadas no tratamento do
melaço. Esses dados sugerem que o tratamento do melaço de soja com
células de D. hansenii pode ser vantajoso do ponto de vista nutricional, uma
vez que elimina os RO, que são considerados fatores antinutricionais e ao
mesmo tempo aumenta o conteúdo de proteínas do melaço de soja.
Tabela 5 - Composição química centesimal dos melaços de soja tratado e não
tratado*, em base seca.
Amostras
Concentração (%)
MST MSNT
Proteína 14,46 ± 0,21 8,04 ± 0,23
Lipídeos 6,44 ± 0.16 6,50 ± 0,13
Cinzas 16,63 ± 0,23 14,26 ± 0,10
Carboidratos Totais 62,47 71,20
MST - Melaço de soja tratado, sem oligossacarídeos.
MSNT - Melaço de soja não tratado, com oligossacarídeos
*Valores expressos como média ± desvio padrão
Os valores apresentados na Tabela 5 estão de acordo com os valores
médios relatados por Karp (2007), Siqueira (2006) e Ayub et al. (2002).
Segundo estes autores, os lipídeos são os componentes que mais sofrem
variação na composição centesimal do melaço de soja. Isso se deve a variação
na etapa industrial de extração de óleo do grão de soja.
Os teores de sacarose, rafinose e estaquiose, presentes no melaço de
soja tratado e não tratado são mostrados na Tabela 6.
29
Tabela 6 – Conteúdo dos açúcares, sacarose, rafinose e estaquiose, presentes
no melaço de soja tratado e não tratado.
Teor de Açúcares (%) Amostra
Sacarose Rafinose Estaquiose
MST 37,34 ± 1,70 0,0 0,0
MSNT 36,25 ± 0,15 8,80 ± 1.05 13,23 ± 0.25
MST - Melaço de soja tratado, sem oligossacarídeos.
MSNT - Melaço de soja não tratado, com oligossacarídeos
*Valores expressos como média ± desvio padrão
No MST, como esperado, rafinose e estaquiose foram completamente
hidrolisados, estando ausentes nesse produto. No MSNT os conteúdos de
rafinose e estaquiose foram 8,80 e 13,23 %, respectivamente. Os teores de
sacarose não diferiram acentuadamente entre os dois tratamentos, sendo de
37,34 e 36,25 % no MST e no MSNT, respectivamente.
Considerando que no melaço de soja a concentração dos açúcares
solúveis foi dada pelo somatório das concentrações de sacarose, rafinose e
estaquiose, sacarose foi equivalente a 62 % desses açúcares enquanto os RO
foram equivalentes a 38 %. De acordo com Cegla et al (2005) a composição do
melaço de soja é aproximadamente 65 % de mono e dissacarídeos e 35 % de
oligossacarídeos. Veldman et al. (1993) citaram uma concentração média de
18 % de oligossacarídeos no melaço de soja.
4.3. Efeito do processamento enzimático no valor nutricional do melaço
de soja tratado e não tratado utilizados na dieta de ratos Wistar.
Como o melaço de soja possui uma quantidade expressiva de
carboidratos digeríveis e não digeríveis, foi conduzido um ensaio biológico com
ratos para avaliação da substituição da fonte calórica da dieta pelo melaço,
sendo utilizado o MST e o MSNT.
As dietas administradas aos animais durante o período experimental
foram elaboradas em duas condições, visando avaliar os parâmetros de
digestibilidade, ganho de peso, consumo protéico, coeficiente de eficácia
protéica (PER) e razão protéica líquida (NPR). Na primeira condição, a fonte de
sacarose que perfaz 10 % da dieta AIN-93G (Tabela 1) foi completamente
substituída pelo MST e pelo MSNT, sem que houvesse correção do teor de
30
sacarose no melaço de soja. Assim, essa dieta foi preparada utilizando a
quantidade em gramas do MST e MSNT liofilizados, equivalentes a 10 % do
peso da dieta. Essa dieta foi administrada aos animais durante os primeiros 14
dias. Na segunda condição, a sacarose também foi completamente substituída
pelo MST e MSNT, porém o teor de sacarose do melaço foi corrigido e
complementado com sacarose comercial. Essa dieta foi administrada aos
animais a partir do 15º dia até completar os 28 dias experimentais.
4.3.1. Efeito das dietas nos valores de digestibilidade verdadeira
Os resultados apresentados nas Tabelas 7 e 8 mostram os valores de
digestibilidade da dieta obtidos ao final dos 14 e 28 dias de experimento.
De acordo com os dados apresentados Tabela 7, foi observada que a
digestibilidade da dieta contendo melaço de soja sem oligossacarídeos (D1)
não diferiu estatisticamente da dieta controle (sacarose), e D1 apresentou um
valor de digestibilidade superior 93,57 % em relação à dieta contendo melaço
de soja com oligossacarídeos (D2), 87,48 %.
Tabela 7 - Digestibilidade protéica verdadeira in vivo absoluta e relativa das
dietas contendo sacarose e melaço de soja no período de 0 - 14 dias de
experimento.
Tratamento Digestibilidade* (%) Digestibilidade Relativa (%)
Sacarose 94,59
a
± 0,89 100
D1 93,57
a
± 0,66 98,61
D2 87,48
b
± 1,73 92,48
D1-Dieta contendo melaço de soja tratado, sem oligossacarídeos (MST)
D2-Dieta contendo melaço de soja não tratado, com oligossacarídeos (MSNT)
As médias seguidas por uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey em nível de
5% de significância.
*Valores expressos como média ± desvio padrão
Aos 28 dias de experimento (Tabela 8), foi observado o mesmo perfil de
digestibilidade verificado com 14 dias. A digestibilidade da dieta D1 não diferiu
estatisticamente da dieta controle, mas foi significativamente diferente da dieta
D2 (p > 0,05). A dieta D1 apresentou valor de digestibilidade verdadeira de
89,63, superior (p < 0,05) em relação à dieta D2, 82,63%.
31
Tabela 8 - Digestibilidade protéica verdadeira in vivo absoluta e relativa das
dietas contendo sacarose e melaço de soja no período de 14 - 28 dias de
experimento.
Tratamento Digestibilidade* (%) Digestibilidade Relativa (%)
Sacarose 93,13
a
± 2,64 100
D1 89, 63
a
± 2,66 96,24
D2 82,63
b
± 1,27 88,72
D1-Dieta contendo melaço de soja tratado, sem oligossacarídeos (MST)
D2-Dieta contendo melaço de soja não tratado, com oligossacarídeos (MSNT)
As médias seguidas por uma mesma letra não diferem entre si pelo teste de Tukey em nível de
5% de significância.
*Valores expressos como média ± desvio padrão
A digestibilidade é uma característica do alimento e indica a quantidade
de nutriente ingerido que se transforma pelo processo digestivo em uma forma
que pode ser absorvido e utilizado pelo organismo. Ela é a medida da
porcentagem das proteínas que são hidrolisadas pelas enzimas digestivas e
absorvidas pelo organismo, na forma de aminoácidos ou de qualquer outro
composto nitrogenado, desde que não haja nenhuma interferência na absorção
destes pelo organismo animal ou humano (SGARBIERI, 1987).
Os resultados apresentados na Tabela 7 e 8 demonstraram que a dieta
D1 contendo o MST, sem os RO, mostrou valores de digestibilidade protéica
superiores aqueles da dieta D2, com os RO. Esses resultados estão de acordo
com alguns autores que sugeriram que a presença de oligossacarídeos e de
outros carboidratos solúveis pode aumentar a viscosidade da digesta,
diminuindo o tempo de retenção desta no trato gastrointestinal, causando uma
redução na absorção dos nutrientes (KLASING, 1998; GRAHAM et al., 2002;
PARIZA et al., 2010).
Estudos nutricionais usando preparações comerciais de α-galactosidase
como suplemento na alimentação de animais monogástricos demonstraram
aumento significativo no peso e na digestibilidade de suínos e galinhas
(SANADA et al., 2009).
Brasil et al. (2010) avaliaram os efeitos da eliminação dos RO na farinha
de soja desengordurada utilizando α-galactosidases de D. hansenii, em ratos
Wistar por um período de 14 dias. Foi verificada menor digestibilidade protéica
(87,14%) para os ratos alimentados com a dieta contendo RO em relação aos
ratos alimentados com a dieta sem RO (91,28%).
32
Apesar do melaço de soja ser citado como um ingrediente de baixo
custo para a alimentação animal (QURESHI et al. 2001; SIQUEIRA et al. 2008),
poucos trabalhos descreveram sua efetiva utilização na suplementação de
rações animais. Veldman et al. (1993) relataram o efeito da adição de 15 % de
melaço de soja contendo 18 % de oligossacarídeos na dieta de suínos.
Observaram que os animais que receberam dietas contendo o melaço de soja
sofreram uma redução de 25 % nos valores de digestibilidade protéica
comparada à dieta controle. Estes autores citaram que a adição da enzima α-
galactosidase melhorou a digestibilidade desses açúcares e das proteínas.
De acordo com Sangeetha et al. (2005), Manning e Gibson (2004)
Bielecka et al. (2002), a fermentação dos oligossacarídeos não digeríveis no
colon cecal por bactérias lá existentes, podem causar vários efeitos, dentre
eles, pode-se verificar aumento no peso seco fecal excretado. Esses autores
relacionaram esse fato ao aumento do número de bactérias que é resultante de
uma extensa fermentação dos oligossacarídeos.
No presente estudo, foi verificado que os animais que receberam a dieta
D2, com RO, por um período de 14 dias, apresentaram um valor de peso seco
fecal excretado maior (2,79 g) do que os animais que ingeriram a dieta D1, sem
RO (2,10 g). No período de 14-28 dias de experimento o peso seco fecal dos
animais alimentados com a dieta D2 foi de 2,61 g, enquanto que nos animais
alimentados com a dieta D1 este valor foi de 2,01 g.
Silva et al. (2006), observaram aumento no valor do peso seco fecal e da
proteína excretada em ratos Wistar recém desmamados alimentos com grãos
de soja e resíduo da soja. Os autores justificaram que a presença de fatores
antinutricionais, como inibidores de proteases e RO, pode prejudicar a
absorção dos nutrientes nitrogenados, levando a diminuição da digestibilidade
protéica. Resultados semelhantes foram observados por Yamka et al. (2003).
Esses autores avaliaram a digestibilidade protéica no intestino delgado de cães
alimentados com farelo de soja e verificaram que, o aumento da concentração
de farelo de soja na dieta favoreceu a redução da digestibilidade protéica no
intestino delgado e aumento da digestibilidade no intestino grosso,
caracterizando maior atividade microbiana nesse local, promovendo aumento
do peso fecal excretado.
33
Portanto, podemos sugerir que a melhora na digestibilidade protéica pela
remoção dos oligossacarídeos rafinose e estaquiose é devido à possibilidade
de redução da viscosidade da digesta, aumentando seu tempo de permanência
no intestino delgado. Além disso, o processo de hidrólise dos oligossacarídeos
diminui a atividade da flora microbiana devido à geração de monossacarídeos
que são digeridos e absorvidos antes de atingirem o intestino grosso.
4.3.2. Efeito do processamento enzimático nos valores de ganho de peso,
coeficiente de eficácia protéica (PER) e razão protéica líquida (NPR)
Os resultados apresentados na Tabelas 9 e 10 referem-se aos valores
de ganho de peso, avaliados durante os períodos de 14 e 28 dias
experimentais, respectivamente. No período experimental de 14 dias, não
houve diferença estatística (p > 0.05) no ganho de peso para os animais
alimentos com as dietas D1 e D2. Entretanto, a dieta controle (sacarose)
promoveu maior ganho de peso nos animais, sendo superior (p < 0,05) em
relação às dietas D1 e D2.
Tabela 9 - Ganho de peso e consumo protéico de ratos alimentados com dietas
contendo sacarose e melaço de soja no período de 0- 14 dias de experimento.
Dietas
Ganho de Peso
(g)*
Consumo Protéico
(g)*
Consumo Alimentar
(g)*
Sacarose 60,20
a
± 8,70
24,87ª ± 1,06 256,95
a
± 10,96
D1 33,80
b
± 6,90 20,57
b
± 0,68 218,87
b
± 7,24
D2 43,20
b
± 3,56 22,80
c
± 1,51 231,24
b
± 15,31
D1-Dieta contendo melaço de soja tratado, sem oligossacarídeos (MST)
D2-Dieta contendo melaço de soja não tratado, com oligossacarídeos (MSNT)
As médias seguidas por uma mesma letra, numa mesma coluna, não diferem entre si pelo
teste de Tukey em nível de 5% de significância.
*Valores expressos como média ± desvio padrão
Uma vez que não houve correção para a concentração de 10 % de
sacarose das dietas D1 e D2 em relação à dieta controle, D1 e D2 continham
reduzida concentração de sacarose comparada à dieta controle. Este fato pode
explicar as diferenças no ganho de peso dos animais alimentados com as
dietas experimentais em relação à dieta controle. Com relação ao consumo
protéico a dieta D1, D2 e controle diferiram entre si estatisticamente. Sendo
que para os animais alimentados com dieta controle o consumo protéico foi
34
maior seguido pela dieta D2 e D1. Pode-se sugerir que neste caso, os
oligossacarídeos por não serem hidrolisados no processo de digestão, atuaram
do mesmo modo que as fibras alimentares, aumentando o peristaltismo
intestinal e consequentemente diminuindo a absorção de nutrientes.
Possivelmente, foi o que ocorreu no grupo D2 quando houve redução de peso
em relação ao controle. No entanto, a presença dos oligossacarídeos na dieta
junto com a restrição de carboidratos pode ter dificultado a absorção dos
mesmos, diminuindo também o ganho de peso. Os resultados observados
estão de acordo com Sowers (2003), quando relata que a restrição de
carboidratos na dieta pode ser efetiva para a perda de peso e redução do risco
de doença cardiovascular.
Os resultados apresentados na tabela 10 referentem-se ao período
experimental de 28 dias. Podemos observar que os parâmetros, ganho de
peso, consumo protéico e alimentar mantiveram perfis semelhantes aos
verificados na tabela 9.
Tabela 10 - Ganho de peso e consumo protéico de ratos alimentados com
dietas contendo sacarose e melaço de soja por um período de 28 dias de
experimento.
Dietas Ganho de Peso (g)* Consumo Protéico
(g)*
Consumo Alimentar
(g)*
Sacarose 102,2
a
± 12,66
45,91ª ± 2,14 474,24
a
± 22,15
D1 75,80
b
± 3,96 36,29
b
± 1,08 410,05
b
± 12,22
D2 83,60
b
± 7,50 39,59
c
± 2,17 426,65
b
± 23,43
D1-Dieta contendo melaço de soja tratado, sem oligossacarídeos (MST)
D2-Dieta contendo melaço de soja não tratado, com oligossacarídeos (MSNT)
As médias seguidas por uma mesma letra, numa mesma coluna, não diferem entre si pelo
teste de Tukey ao nível de 5% de significância.
*Valores expressos como média± desvio padrão
Entretanto, ao analisar o período de 14 - 28 dias de experimento (Tabela
11), verificou-se que o ganho de peso dos animais alimentos com a dieta
controle e as dietas de melaço de soja D1 e D2 não diferiram entre si
estatisticamente em nível de 5 % de probabilidade. No entanto, da mesma
forma que nos períodos de 14 e 28 dias, o consumo protéico foi menor no
grupo D1 e D2 em relação ao controle.
35
Tabela 11 - Ganho de peso e consumo protéico de ratos alimentados com
dietas contendo sacarose e melaço de soja no período de 14 - 28 dias de
experimento.
Dietas
Ganho de Peso
(g)*
Consumo Protéico
(g)*
Consumo Alimentar
(g)*
Sacarose 42,00
a
± 8,72
21,03ª ± 1,28 217,29
a
± 13,25
D1 42,00
a
± 6,04 16,95
b
± 0,54 191,18
b
± 6,15
D2 40,40
a
± 7,40 18,13
b
± 0,78 195,41
b
± 8,38
D1-Dieta contendo melaço de soja tratado, sem oligossacarídeos (MST)
D2-Dieta contendo melaço de soja não tratado, com oligossacarídeos (MSNT)
As médias seguidas por uma mesma letra, numa mesma coluna, não diferem entre si pelo
teste de Tukey em nível de 5% de significância.
*Valores expressos como média± desvio padrão
Após 14 dias de experimentação, os animais receberam a dieta
contendo o melaço de soja suplementado com sacarose para correção da
quantidade de carboidrato recomendada por animal. O fato de não haver
diferença (p > 0,05) quanto ao ganho de peso entre os animais que receberam
a dieta D1 e D2, quando comparados aos animais que receberam a dieta
controle, reforça a constatação de que o desequilíbrio de carboidratos e a
presença dos oligossacarídeos podem ter provocado a perda de peso nos
animais durante os primeiros 14 dias de experimento.
Nas Tabelas 12 e 13 estão apresentados os resultados de PER, PER
relativo (PERR), NPR e NPR relativo (NPRR), durante os períodos de 0 - 14 e
28 dias experimentais.
O coeficiente de eficácia protéica (PER) é uma medida que avalia a
capacidade da proteína em favorecer o crescimento de animais jovens; e é
normalmente expresso em relação ao obtido com a caseína. Já a razão
protéica líquida (NPR) avalia a capacidade da proteína em manter o peso do
animal e promover o seu crescimento.
Os valores de PER e NPR para as dietas D1 e D2 não diferiram entre si
estatisticamente, em nível de 5 % de probabilidade nos primeiros 14 dias de
experimento. Portanto, essas dietas contendo melaço de soja, que sofreram
restrição calórica, apresentaram valores inferiores em relação à dieta controle
(Tabela 12).
36
Tabela 12 - Coeficiente de Eficácia Protéica (PER), PER relativo (PERR),
Razão Protéica Líquida (NPR) e NPR relativo (NPRR) das dietas contendo
sacarose e melaço de soja com 14 dias de experimento.
Dietas PER* PERR (%) NPR* NPRR (%)
Sacarose
2,42
a
± 0,26 100 3,04
a
± 0,23 100
D1 1,64
b
± 0,33 68,08 2,40
b
± 0,33 79,01
D2 1,89
b
± 0,19 78,77 2,59
b
± 0,22 85,10
D1-Dieta contendo melaço de soja tratado, sem oligossacarídeos (MST)
D2-Dieta contendo melaço de soja não tratado, com oligossacarídeos (MSNT)
As médias seguidas por uma mesma letra, numa mesma coluna, não diferem entre si pelo
teste de Tukey ao nível de 5% de significância
*Valores expressos como média ± desvio padrão
No período de 28 dias de experimento, foi verificado que os valores de
PER e NPR para as dietas D1, D2 e controle não diferiram estatisticamente
entre si, em nível de 5 % de probabilidade (Tabela 13).
Tabela 13 - Coeficiente de Eficácia Protéica (PER), PER relativo (PERR),
Razão Protéica Líquida (NPR) e NPR relativo (NPRR) das dietas contendo
sacarose e melaço de soja com 28 dias de experimento.
Dietas PER* PERR (%) NPR* NPRR (%)
Sacarose
2,22
a
± 0,20 100 2,56
a
± 0,20 100
D1 2,09
a
± 0,06 93,93 2,52
a
± 0,05 98,25
D2 2,11
a
± 0,10 94,89 2,51
a
± 0,09 97,71
D1-Dieta contendo melaço de soja tratado, sem oligossacarídeos (MST)
D2-Dieta contendo melaço de soja não tratado, com oligossacarídeos (MSNT)
As médias seguidas por uma mesma letra, numa mesma coluna, não diferem entre si pelo
teste de Tukey ao nível de 5% de significância
*Valores expressos como média± desvio padrão
No atual estudo, foi realizada a substituição da fonte calórica, mantendo
a mesma fonte protéica. Porém observamos que nos diferentes períodos
experimentais (14 e 28 dias) os parâmetros PER e NPR se comportaram
diferentemente. Observamos que a utilização do melaço de soja com e sem
RO nos primeiros 14 dias de experimentação, influenciaram negativamente na
absorção e utilização dos compostos nitrogenados, uma vez que os valores de
PER e NPR foram inferiores aos valores da dieta controle. Neste período os
ratos necessitam de uma maior eficiência protéica para que eles possam
crescer e manter seu peso. Além disso, esses animais necessitam de uma
37
maior biodisponibilidade de aminoácidos sulfurados nesse período, por
exemplo, sua utilização em vias de formação e manutenção dos pêlos.
Já no período de 28 dias, foi verificado que as dietas foram capazes de
manter o crescimento e o peso dos animais, uma vez que as exigências
protéicas são menores em comparação com as dos primeiros 14 dias.
Deste modo, podemos inferir que o equilíbrio dos nutrientes na dieta
experimental é de extrema importância nos primeiros dias de vida do animal,
independente da fonte protéica. Mesmo havendo uma quantidade adequada de
proteínas, se não houver quantidade adequada de carboidrato ou mesmo uma
boa disponibilidade, além da existência de fatores intrínsecos que influenciam
na absorção nutricional, o crescimento e manutenção do animal ficarão
comprometidos.
38
5. CONCLUSÕES
- A levedura Debaryomyces hansenii UFV-1 foi capaz de crescer, produzir α-
galactosidase e hidrolisar os oligossacarídeos de rafinose presentes no melaço
de soja. A utilização direta dessa levedura em preparações alimentícias torna-
se vantajosa em termos de redução de custo e tempo para obtenção da enzima
α-galactosidase, além da segurança por se tratar de uma levedura que não
apresenta problemas de toxicidade e patogenicidade.
- A hidrólise total dos RO foi observada após 24 h de incubação do melaço de
soja a 10 % com 2 % de inóculo contendo células da levedura D. hansenii UFV-
1. Essa condição experimental foi a que proporcionou melhor eficiência no
processo de redução dos RO.
- Concentrações mais diluídas (10 e 20 %) do melaço de soja promoveram
melhores condições para desenvolvimento da levedura D. hansenii UFV-1 e
produção das α-galactosidases; entretanto, concentrações do melaço acima de
40 % inibiram complemente a produção de enzima.
- A digestibilidade protéica verdadeira avaliada nos períodos de 14 e 28 dias de
experimento demonstrou que a dieta contendo melaço de soja sem RO
apresentou uma digestibilidade significativamente melhor do que a dieta
contendo melaço de soja com RO.
- As dietas experimentais promoveram um menor ganho de peso aos animais
em comparação com a dieta controle, nos primeiros 14 dias de experimentos.
Entretanto, no período de 14 – 28 dias não foi verificada diferença significativa
entre as dietas experimentais em relação à dieta controle.
- Nos primeiros 14 dias de experimento, a presença dos RO na dieta contendo
melaço de soja influenciou negativamente nos valores de PER e NPR.
39
- No período de 14 – 28 dias de experimento, após efetuado o balanceamento
de sacarose das dietas experimentais estas não diferiram significativamente
em relação à dieta controle para os valores de PER e NPR.
- Melhoria da ração para uso do melaço de soja para alimentação animal
40
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ADEMARK, P., LARSSON, M., TJERNELD, F., STALBRAND, H. Multiple α-
galactosidases from Aspergillus niger: purification, characterization and
substrate specificities. Enzyme and Microbial Technology, 29: 441-448, 2001.
ARANDA, P., DOSTOLOVA, J., FRIAS, J., LOPEZ JURADO, M.,
KOZLOWSKA, H., POKORNY, J., URBANO, G., VIDAL-VALVERDE, C.,
ZDYUNEZYK, Z. Nutrition. In: CL Hedley Ed. Carbohydrates in grain legume
seeds. Improving Nutritional Quality and Agronomic Characteristics. CAB
International, Wallingford, UK, pp 61-87, 2001.
ASSOCIATION OF OFFICIAL ANALYTICAL CHEMISTS - AOAC. Official
methods of analysis of AOAC International. 16 ed., v.2, Maryland, 1997.
AYUB, M. A. Z. et al. Conversão de resíduos agroindustriais da soja em etanol
e outros solventes orgânicos. Relatório parcial PSPPG, processo 520712/99-4,
2002. 2002. Disponível em: http://www.enq.ufsc.br/labs/probio/Projetos%
20Plano%20Sul/ufrgs_relatorio2002.htm. Acesso em: 21/ 8/ 2008.
BELLAVER, C.; SNIZEK, J.P.N. Soybean processing and its implications on
swine and poultry feeding. CONGRESSO BRASILEIRO DE SOJA, Londrina,
PR. Anais. EMBRAPA-SPI. p.183-199, 1999.
BENDER, A.E., DOELL, B.H. Note on the determination of net protein utilization
by carcass analysis. British Journal Nutrition, 11:138-143, 1957.
BERK, Z. Technology of production of edible flours and protein products from
soybeans. In: FAO Agricultural Services Bulletin Number 97, Food and
Agriculture Organization of the United Nations, Rome, 186p, 1992.
BIELECKA, M. BIEDRZYCKA, E. MAJKOWSKA, A. JUSKIEWICZ, J.,
WRÓBLEWSKA, M. Effect of non-digestible oligosaccharides on gut
microecosystem in rats. Food research International, 35:139-144, 2002.
BRASIL, A.P.R., DE REZENDE, S.T., PELÚZIO, M.C.G., GUIMARÃES, V.M.
Removal of oligosaccharides in soybean flour and nutritional effects in rats.
Food Chemistry 118:251–255, 2010.
BRAUNEGG, G., BONA, R., KOLLER, M. Sustainable polymer production.
Polym.-Plant. Technol. 43:1779-1793, 2004.
CEGLA, U.G., SHUSTER, M. Process for the production of soybean sugars and
the product produced thereof. UNITED STATES PATENT 6,913,771, July 5,
2005.
41
CHAJUSS, D. Soy Molasses: Processing and Utilization as a Functional Food,
in KeShun Liu, Editor, Soybeans as Functional Foods and Ingredients, AOCS
Press, Champaign. Ill., USA, pp. 201-208, 2004.
CHIAPPA, A. da C. Crédito agrícola, produção e exportação de soja.
Agronline.com.br. Disponível em: http://www.agronline.com.br/artigos/
artigo.php?id=1. Acesso em: 18 de junho de 2007.
CRUZ, R., PARK, Y.K. Production of α-galactosidase and its application to
hydrolysis of galactosaccharides in soybean milk. Journal of Food Science
47:1973-1975, 1982.
FALKOSKI, D.L., GUIMARAES, V.M., CALLEGARI, C.M., REIS, A.P.,
BARROS, E.G., de REZENDE, S.T. Processing of soybean products by
semipurified plant and microbial α-galactosidases. J. Agric, Food Chem.
54:10184-10190, 2006.
GARRO, M.S., DE VALDEZ, G.F., OLIVER, G., DE GIORI, G.S. Temperature
effect on the biological activity of Bifidobacterium longum CRL 849 and
Lactobacillus fermentum CRL 251 in pure and mixed cultures grown in soymilk.
Food Microbiol. 21:511–518, 2004.
GRAHAM, K.K., KERLEY, M.S., FIRMAN, J.D., ALLEE, G.L. The effect of
enzyme treatment of soybean meal on oligosaccharide disappearance and
chick growth performance. Poultry Science 81:1014-1019, 2002.
GUIMARÃES, V.M., DE REZENDE, S.T., MOREIRA, M.A., BARROS, E.G.,
FELIX, C.R. Characterization of α-galactosidases from germinating soybean
seed and their use for hydrolysis of oligosaccharides. Phytochemistry 58:67-73,
2001.
HENRISSAT, B., BAIROCH, A. New families in the classification of glycosyl
hydrolases based on amino acid sequence similarities. Biochemistry Journal
293:781-788, 1993.
HENSING, M.C.M., BANGMA, K.A., RAAMSDONK, L.M., HULSTER, E., van
DIJKEN, J.P., PRONK, J.T. Effects of cultivation conditions on the production of
heterologous α-galactosidase by Kluyveromyces lactis. Applied Microbiology
Biotechnology 43:58-64, 1995.
IBGE – Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (online).
http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/indicadores/agropecuaria/lspa/lspa_200
912comentarios.pdf. Acessado em 08 de janeiro de 2010.
IRISH, G.G., BARBOUR, G.W., CLASSEN, H.L. Removal of the α-galactosides
of sucrose from soybean meal using either ethanol extraction or exogenous α-
galactosidase and broiler performance. Poultry Science 74:1484-1494, 1995.
JOHNSON, L.A., MYERS, D.J., BURDEN, D.J. Soy Protein’s History,
Prospectis in Food, Feed. Inform 3:429-444, 1992.
42
KARP, S.G. Production of L-lactic acid from the soybean vinasse. Master
dissertation, Federal University of Paraná/Universities of Provence and of the
Mediterranean Sea, Brazil/France, 2007.
KAWAMURA, S., TADA, M. Isolation and determination of sugars from the
cotyledon, hull, and hypocotyl of soybean by carbon column chromatography.
Tech. Bull. Fac. Agric. Kagawa Univ. 18:138-141, 1967.
KIM, W.J., SMITH, C.J.B., NAKAYAMA, T.O.M. The removal of
oligosaccharides from soybeans. Lebensm. – Wiss. Technol. 6:201-204, 1973.
KLASING, K.C. Comparative Avian Nutrition. CAB International, Wallingford,
UK, 1998.
KOBAYASHI, H., SUZUKI H. Studies on the decomposition of raffinose by α-
galactosidase of mold. II. Formation of mold pellet and its enzyme activity.
Journal Fermentation Technology, 50:625-632, 1972.
KU, S., WEI, L.S., STEIMBERG, M.P., NELSON, A.L., HYMOWITZ, T.
Extraction of oligosaccharides during cooking of whole soybean. Journal Food
Science 41:361-364, 1976.
LESKE, K.L., AKAVANICHAN, O., CHENG, T.K., COON, C.N. Effect of ethanol
extraction on nitrogen-corrected true metabolizable energy for soybean meal
with broilers and roosters. Poultry Science 70:892-895, 1991.
LIU, J.R., LIN, C.-W. Production on kefir from soymilk with or without added
glucose, lactose, or sucrose. J. Food Sci. 65:716–719, 2000.
LOLAS, A. Examination of soy molasses as a fermentation substrate for growth
and butanol production by hyperbutanol-produting Clostridium beijerinckii
BA101. MS Thesis, University of Illinois Urbana, II, USA, 1999.
de LUMEN, B.O. Molecular strategies to improve protein quality and reduced
flatulence in legumes: A review. Food Structure 11:33-46, 1992.
LUONTERI, E., TENKANEN, M., VIIKARI, L. Substrate specificities of
Penicillium simplicissimum α-galactosidases. Enzyme and Microbial Technology
22:192-198, 1998.
MABINYA, L.V., BRAND, J.M., MUYIMA, N.Y.O., PIRONCHEVA, G.L. Kinetic
properties of α-galactosidase and the localization of total proteins in Erwinia
chrysanthemi. Food Technol. Biotechnol. 42:23–26, 2004.
MANNING, T.S., GIBSON, G.R. Prebiotics. Best Practice & Research Clinical
Gastroenterology, 18:287-298, 2004.
43
MANZANARES, P., GRAAFF, L.H., VISSER, J. Characterization of
galactosidases from Aspergillus niger: purification of a novel α-galactosidase
activity. Enzyme and Microbial Technology 22:383-390, 1998.
MARGOLLES-CLARK, E., TENKANEN, M., LUONTERI, E., PENTILÄ, M.
Three α-galactosidases genes of Trichoderma reesei cloned by expression in
yeast. European Journal Biochemistry 240:104-111, 1996.
MITAL, B.K., STEINKRAUS, K.H. Utilization of oligosaccharides by lactic acid
bacteria during fermentation of soy milk. Journal Food Science 40:114-118,
1975.
NACZK, M., AMAROWICZ, R.,SHAHIDI, F. α-galactosides of sucrose in foods:
composition, flatulence causing effects, and removal, in Fereidoom Shahidi
(Ed.). Antinutrients and Phytochemicals in Food 127-151, 1997.
OMOSAIYE, O., CHERYAN, M., MATHEWS, M.E. Removal of oligosaccharides
from soybean water extracts by ultrafiltration. Journal of Food Science 43:354-
360, 1978.
PARIZA, M.W., COOK, M. Determining the safety of enzymes used in animal
feed. Regulatory Toxicology and Pharmacology 5: 332–342, 2010.
PRASHANTH, S.J., MULIMANI, V.H. Soymilk oligosaccharide hydrolysis by
Aspergillus oryzae α-galactosidase immobilized in calcium alginate. Process
Biochemistry 40:1199–1205, 2005.
QUIGLEY, M.E., HUDSON, G.J., ENGLYST, H.N. Determination of resistant
short-chain carbohydrates (non-digestible oligosaccharides) using gas-liquid
chromatography. Food Chemistry 65:381-390, 1999.
QURESHI, N., LOLAS, A., BLASCHEK, H.P. Soy molasses as fermentation
substrate for production of butanol using Clostridium beijerinckii BA101. Journal
of Industrial Microbiology and Biotechnology 26: 290-295, 2001.
REEVES, P.G., NIELSEN, F.H., FAHEY, G. C. Jr. AIN-93 purified diets for
laboratory rodents: final report of the American Institute of Nutrition ad hoc
writing commitee on the reformulation of the AIN-76. A rodent diet. Journal of
Nutrition, 123:1939-1955, 1993.
SAID, S., PIETRO, R.C.L.R. Enzimas como agentes biotecnológicos. Ribeirão
Preto: Legis Summa, 2004.
SANADA, C.T.N.,KARP, S.G., SPIER, M.R., PORTELLA, A.C., GOUVÊIA,
P.M., YAMAGUISHI, C.T., VANDENBERGHE, L.P.S., PANDEY, A., SOCCOL,
C.R. Utilization of soybean vinasse for α-galactosidase production. Food
Research International 42:76–483, 2009.
44
SANGEETHA, P.T., RAMESH, M.N., PRAPULLA, S.G. Recents trends in the
microbial production, analysis and application of fructooligosaccharides. Trends
in Food Science & Technology, 16:442-457, 2005.
SANNI, A.I., ONILUDE, A.A., OGUNDOYE, O.R. Effect of bacterial
galactosidase treatment on the nutritional status of soybean seeds and its milk
derivatives. Nahrung 41:18-21, 1997.
SCALABRINI, P., ROSSI, M., SPETTOI, P., MATTEUZZI, D. Characterization
of Bifidobacterium strains for use in soymilk fermentation. International Journal
of Food Microbiology 39:213-219, 1998.
SGARBIERI, V.C. Métodos de avaliação da qualidade nutricional dos
alimentos. In: SGARBIERI, V.C. Alimentação e Nutrição - Fator de Saúde e
Desenvolvimento. São Paulo, Almed, 250-261, 1987.
SILVA, M.S., NAVES, M.M.V., OLIVEIRA, R.B., LEITE, O.S.M. Composição
química e valor protéico do resíduo de soja em relação ao grão de soja. Ciênc.
Tecnol. Aliment., 26:571-576, 2006.
SIQUEIRA, P.F. Production of bio-ethanol from soybean molasses by
Saccharomyces cerevisiae. Master dissertation. Federal University of Paraná/
Universities of Provence and of the Mediterranean Sea, Brazil/France, 2006.
SIQUEIRA, P.F., KARP, S.G., CARVALHO, J.C., STURM, W., RODRÍGUEZ-
LEÓN, J.A., THOLOZAN, J.L., SINGHANIA, R.R., PANDEY, A., SOCCOL, C.R.
Production of bio-ethanol from soybean molasses by Saccharomyces
cerevisiae at laboratory, pilot and industrial scales. Biores.Technol. 99:8156-
8163, 2008.
SMITS, C.H.M., ANNISON, G. Non-starch plant polysaccharides in broiler
nutrition- towards a physiologically valid approach to their determination.
World’s Poultry Science Journal, 52:204-221, 1996.
SOUZA JÚNIOR, W.C., DE REZENDE, S.T., VIANA, P.A., FLAKOSKI, D.L.,
REIS, A.P., MACHADO, S.G., BARROS, E.G., GUIMARÃES, V.M. Treatment
of soy milk with Debaryomyces hansenii cells immobilised in alginate. Food
Chemistry 114:589–593, 2009.
SOWERS, J.R. Obesity as a cardiovascular risk factor. Am. Jour. Med.
115:37S-41S, 2003.
SNYDER, H.E., KWON, T.W. Soybean utilization. New York: AVI Book 346p,
1987.
VARBANETS, L.D., MALANCHUK, V.M., BUGLOVA, T.T., KUHLMANN, R.A.
Penicillium sp. 23 alpha-galactosidase: purification and substrate specificity.
Carbohydrate Polymers 44:357-363, 2001.
45
VELDMAN, A., VEEN, W.A.G., BARUG, D., VAN PARIDON, P.A. Effect of α-
galactosides and α-galactosidase in feed on ileal piglet digestive physiology.
Journal of Animal Physiology and Animal Nutrition 69:57–65, 1993.
VIANA, S.F., GUIMARÃES, V.M., JOSÉ, I.C., OLIVEIRA, M.G.A., COSTA,
N.M.B., BARROS, E.G., MOREIRA, M.A., REZENDE, S.T. Hydrolysis of
oligosaccharides in soybean flour by soybean α-galactosidase. Food Chemistry
93:665-670, 2005.
VIANA, P.A., de REZENDE, S.T., MARQUES, V.M., TREVIZANO, L.M.,
PASSOS, F.M.L., OLIVEIRA, M.G.A., BEMQUERER, M.P., OLIVEIRA, J.S.,
GUIMARAES, V.M. Extracelular α-galactosidase from Debaryomyces hansenii
UFV-1 and its use in the hydrolysis of raffinose oligosaccharides. J. Agric. Food
Chem. 54:2385-2391, 2006.
VIANA, P.A., DE REZENDE, S.T., FALKOSKI, D.L., LEITE, T.A., JOSÉ, I.C.;
MOREIRA, M.A.; GUIMARÃES, V.M. Hidrolysis of oligosaccharides in soybean
products by Debaryomyces hanseni UFV-1 α-galactosidases. Food Chemistry,
103:331-337, 2007.
WIGGINS, H.S. Nutritional value of sugars and related compounds undigested
in the small gut. Proceedings of the Nutrition Society 43:69-75, 1984.
YAMKA, R.M.,JAMIKORN, U., TRUE, A.D., HARMON, D. Evaluation of
soyabean meal as a protein source in canine foods. Animal Feed Science and
Technology, 109:121–132, 2003.
YOON, M.Y., HWANG, H.J. Reduction of soybean oligosaccharides and
properties of α-D-galactosidase from Lactobacillus curvatus R08 and
Leuconostoc mesenteriodes JK55. Food Microbiology 25:815– 823, 2008.
YOSHIDA, S., TAN, C.H., SHIMOKAWA, T., TURAKAINEN, H., KUSAKABE, I.
Substrate specificities of α-galactosidases from yeasts. Institute of Applied
Biochemistry, University of Tsukuba. Bioscience, Biotechnology and
Biochemistry 61:359-361, 1997.
ZHU, A., GOLDSTEIN, J. Cloning and functional expression of a cDNA
encoding coffee bean α-galactosidase. Gene (Amst.). 140:227-231, 1994.
CAPÍTULO 2
Artigo: Increase in ethanol production from soy
molasses by treatment with Debaryomyces hansenii
UFV-1 α-galactosidase
47
Increase in ethanol production from soy molasses by treatment with
Debaryomyces hansenii UFV-1 α-galactosidase
Camila Rocha da Silvaª, Sebastião Tavares de Rezendeª, Daniel Luciano
Falkoskiª, Luciano Gomes Fiettoª, Valéria Monteze Guimarãesª
,
*
a
Departamento de Bioquímica e Biologia Molecular, Instituto de Biotecnologia
Aplicada à Agropecuária – BIOAGRO – Universidade Federal de Viçosa, Av.
PH Rolfs s/n Campus Universitário, 36570-000 Viçosa MG, Brazil.
* Corresponding author. Tel +55 31 3899 2952; fax +55 31 3899 2373
E-mail adress: [email protected]
Abbreviated title: Increase in ethanol production from soy molasses.
Abstract
The objective of this work was to establish an efficient process to
improve ethanol production from soy molasses via fermentation. This cheap
agro-industrial waste contains a high sucrose concentration (38 %), but also
presents raffinose (8.7 %) and stachyose (21.5 %), which are not fermentable
by several microorganisms without the presence of α-galactosidase. The
enzymatic conversion of these oligosaccharides may be a rational alternative to
improve the amount of fermentable sugar in soy molasses. Debaryomyces
hansenii UFV-1 α-galactosidase was submitted to an ion exchange
chromatography procedure, which resulted in a purification factor of 12.04 and a
71.73% recovery of the α-galactosidase activity. Soy molasses then treatment
with α-galactosidase at 60 ºC for 12 h, promoted total reduction of raffinose and
stachyose contents, and increased sucrose and reducing sugar concentrations
by approximately 22 and 82 %, respectively. Soy molasses at a concentration of
5 °Brix both treated and untreated with α-galactosidase was fermented by
Saccharomyces cerevisiae LBM-51. The maximum ethanol production from
treated soy molasses (15.0 g/L) was detected after 8 h of fermentation, while
the fermentation of untreated soy molasses yielded 11.4 g/L of ethanol. Ethanol
48
productivity could thus be increased by 24 % when treating soy molasses with
α-galactosidase prior to fermentation.
Keywords: α-galactosidase; ethanol production; raffinose oligosaccharides;
Debaryomyces hansenii UFV-1; soy molasses
1. Introduction
The use of biofuels has become an increasingly important topic in
worldwide discussions on energy resources. Bio-ethanol is one of the most
important renewable fuels contributing to the reduction of negative
environmental impacts generated by use of fossil fuels [1].
Global bio-ethanol production reached approximately 81.1 billion liters in
2008, of which 25 billion liters were produced from Brazilian sugarcane [2], and
18 billion liters were produced from maize in the United States [3]. According to
a recent report released by the Brazilian Ministry of Mines and Energy, Brazilian
ethanol production was 26.7 billion liters in 2009, of which 5.16 billion liters were
exported [4]. It is estimated that ethanol production in Brazil will be roughly 104
billion liters in 2025 [5]. Ethanol produced from sugarcane is highly competitive
due to low production costs and high agricultural and industrial productivity
levels [6].
For large-scale biological production of fuel ethanol, low-cost and
abundant substrates are needed. When ethanol is produced from maize or
sugarcane, raw materials constitute about 40–70% of the production cost; thus
by using waste products from forestry, agriculture and industry, feedstock costs
may be reduced [7]. Ethanol production by biotechnological means has been
acquiring considerable importance. In this context, ethanol produced from
renewable and low-cost agro-industrial waste provides an alternative for
utilization and bioconversion of waste into a high value product.
Brazilian soybean production is estimated at 65.2 million tons
(2009/2010) which represents roughly 30% of global production [4]. Soy
molasses, a byproduct of the soybean processing, is generated in the
production of protein-concentrate soybean meal and contains about 57% of
carbohydrates (dry mass). Soy molasses has also been used as an inexpensive
animal feed [8].
49
Sucrose corresponds to 58% of total sugar present in soy molasses, and
the oligosaccharides raffinose [α-D-galactopyranosyl-(1,6)-α-D-glucopyranosyl-
-D-fructofuranoside] and stachyose [α-D-galactopyranosyl-(1,6)-α-D-
galactopyranosyl-(1,6)-α-D-glucopyranosyl--D-fructofuranoside] correspond to
10 and 28 %, respectively [9]. Soy molasses could be used as an inexpensive
fermentation substrate, in processes to produce industrial chemicals such as
lactic acid [10], butanol [11], sophorolipids [12], poly(hydroxyalkanoates) [13]
and ethanol [8]. However, the galacto-oligosaccharides present in soy molasses
are not fermentable by many microorganisms due to the presence of α-1,6
bonds [14].
The enzyme α-galactosidase (α-D-galactoside galactohydrolase, E.C
3.2.1.22) catalyzes the hydrolysis of terminal α-1,6-linked D-galactose residues
present in oligosaccharides such as raffinose and stachyose, producing
galactose and sucrose [15]. This enzyme purified from a Debaryomyces
hansenii UFV-1 culture was highly efficiency for hydrolysis of raffinose and
stachyose present in heavy and light soy molasses [9]. The enzymatic
conversion of these oligosaccharides may be a rational alternative to improve
the amount of fermentable sugar in soy molasses.
The objective of this work was to determine an economic and efficient
process for ethanol production from soy molasses treated with partially purified
Debaryomyces hansenii UFV-1 α-galactosidases.
2. Materials and Methods
2.1. Microorganisms and Culture Maintenance
The Debaryomyces hansenii UFV-1 strain used in this study was isolated
from a dairy environment in Minas Gerais, Brazil, and kept in the culture
collection of the Microbiology Department, Universidade Federal de Viçosa
(Viçosa, MG, Brazil). Taxonomic identification was carried out by the
Centraalbureau voor Schimmelcultures, Utrecht, The Netherlands, as D.
hansenii (Zopf) Lodder & Kreger-van Rij var fabryi Nakase & Suzuki. D.
hansenii UFV-1 stored at -80 °C in glycerol and YPD medium (1% yeast extract,
2% peptone and 2% glucose) was streaked on a YPD agar surface (1.5% agar)
50
and kept in an incubation chamber at 30 ºC for 36 h. The plates were
maintained at 4 ºC and this stock was restreaked monthly.
The Saccharomyces cerevisiae LBM-51 strain was isolated from a fuel
ethanol production plant in Minas Gerais, Brazil, and maintained in the culture
collection of the Molecular Biotechnology Laboratory, Universidade Federal de
Viçosa (Viçosa, MG, Brazil). The same procedure described above was carried
out for maintenance of the S. cerevisiae strain culture.
2.2. Conditions for α-Galactosidase Production.
D. hansenii UFV-1 was activated in YPD liquid medium (1% yeast
extract, 2% peptone, and 1% glucose) and incubated for 12–15 h at 30 ºC and
agitation of 200 rpm. An aliquot of the cells obtained after centrifugation (4000 x
g for 5 min at 4 ºC) was transferred to YP medium containing 10 g/L yeast
extract, 20 g/L peptone and 10 g/L lactose as the carbon source to give a
OD
600nm
of 0.2 (0.053 mg/mL). After incubation at 30 ºC, 200 rpm for 27 h, the
biomass was separated by centrifugation (4000 x g for 5 min at 4 °C) and the
supernatant containing α-galactosidase was stored at 4 ºC.
2.3. Partial Purification of α-Galactosidase
The enzymatic sample stocked at 4 ºC was concentrated 10-fold by the
use of an Amicon ultrafiltration cell model 8400 (Bedford, MA) with a 30 kDa
molecular cutoff PM 30 Amicon membrane. The concentrated fraction was
loaded in a DEAE-Sepharose (Amersham Biosciences) column (25 cm x 2.5
cm) equilibrated with 0.1 M sodium acetate buffer, pH 5.5. Proteins were eluted
at a flow rate of 60 mL/h, using a linear gradient formed with 250 ml of the
sodium acetate buffer and 250 ml of the same buffer containing 1.0 M NaCl.
Purification was then performed at 4 ºC and the fractions were collected, where
those containing α-galactosidase activity were pooled.
2.4. α-Galactosidase Assay
The enzyme was assayed using a reaction system containing 650 µL of
0.1 M sodium acetate buffer (pH 5.0), 100 µL of the enzyme preparation and
250 μL of 2 mM ρ-nitrophenyl α-D-galactopyranoside (ρNPGal). The reaction
was conducted for 15 min at 40 ºC and stopped by the addition of 1 ml of 0.5 M
51
sodium carbonate. The amount of ρ-nitrophenol (ρNP) released was
determined at 410 nm. One unit of enzyme activity (U) was defined as the
amount of protein required to produce 1 μmol of ρ-nitrophenol per minute.
2.5. Determination of Protein Concentration
The protein concentration in the enzymatic extract was determined by the
Coomassie Blue binding method with bovine serum albumin (BSA) as the
standard [16].
2.6. Determination of the Biochemical Composition of the Soy Molasses
Determination of the protein, lipid and ash concentrations in the soy
molasses were performed according to the AOAC method [17]. The reducing
sugar concentration present in soy molasses was encountered using the 3,5-
dinitro salicylic acid (DNS) reagent [18], and sucrose, raffinose and stachyose
were quantified by HPLC, as described in section 2.8.
2.7. Enzymatic Hydrolysis of Oligosaccharides in Soy Molasses
Soy molasses samples were mixed with the enzymatic extract at a
proportion of 1:4 v/v. In this mixture, 1 mL of soy molasses was incubated either
with 4 U of partially purified α-galactosidase (1 U/mL) or the same volume (4
mL) of denatured enzyme (100 °C for 10 min), corresponding to 5 °Brix. In the
second mixture, 4 mL of soy molasses were mixed with 1 mL of the
concentrated α-galactosidase extract (20 U) or the same volume of denatured
enzyme, corresponding to 20 °Brix. The preparations were incubated for 12 h
under agitation (100 rpm) at 60 ºC, and then the reaction mixtures were
collected and the soluble sugars were analyzed by HPLC.
2.8. HPLC Analysis of Soluble Sugars
Initially, the samples of soy molasses untreated and treated with α-
galactosidase were filtered using a hydrophilic PTFE membrane (0.45 µm pore
size, 13 mm diameter, Millipore). The individual soluble sugars of sucrose,
raffinose and stachyose present in soy molasses were quantified by HPLC on a
Shimadzu series 10A chromatograph (Shimadzu Corporation, Kyoto, Japan).
For this purpose, an analytical column [aminopropyl (–NH2)] was used, eluted
52
with an acetonitrile-water isocratic mixture (80:20 v/v) at 35 °C with a flow rate
of 0.7 mL/min, according to Guimarães et al. [15]. The individual sugars were
automatically identified and quantified by comparing the retention times of
standard sugar concentrations. Gentiobiose was used as an internal standard
because it does not interfere with other sugars and is not found in soybean
molasses.
2.9. Fermentation Tests
The percentage (w/v) of soluble solids (º Brix) present in soy molasses
was determined with a portable refractometer for sugar – Pocket Refractometer
PAL 1 (ATAGO).
For fermentation assays, the S. cerevisiae LBM-51 strain was previously
cultivated in YP medium containing 1% sucrose as a carbon source for 12 h. A
culture volume (10 % v/v) was added to Erlenmeyer flasks containing the soy
molasses suspension and incubated in a shaker (New Brunswick Scientific
series 25D) at 30 ºC and 100 rpm for 12 h. Aliquots were collected at time
intervals of 2 h, centrifuged (5000 x g for 5 min) and the supernatant was
filtered using an hydrophilic PTFE membrane (0.45 µm pore size, 13 mm
diameter, Millipore). The fermentative process was evaluated by determination
of the ethanol concentration using HPLC.
2.10. Determination of Ethanol Concentration
Ethanol was quantified by HPLC with RI-detection on a Shimadzu series
10A chromatograph using an Aminex® Carbohydrate HPX-42C column (Bio-
Rad). The operating temperature was 80 ºC and ultra pure water was used as
mobile phase at a flow rate of 0.4 mL/min, according to Klinke et al. [19] with
modifications. The ethanol concentrations were automatically identified and
quantified by comparison with the retention time and standard ethanol
concentration.
3. Results and Discussion
3.1. Partial Purification of α-Galactosidase
53
The yeast D. hansenii UFV-1 produced extracellular α-galactosidase
when grown on YP medium containing lactose as a carbon source, according to
Viana et al. [20]. Results of the partial purification of α-galactosidase from D.
hansenii UFV-1 are summarized in Table 1.
Table 1. Summary of D. hansenii UFV-1 extracellular α-galactosidase partial
purification
Purification
Step
Volume
(mL)
Protein
(mg/mL)
Activity
(U/mL)
Specific Activity
(U/mg protein)
Purification
(fold)
Recovery
(%)
Crude extract
500 0.074 0.051 0.69 1.0 100.0
Ultrafiltration 40 0.56 0.63 1.12 1.6 98.8
DEAE-
Sepharose
31 0.07 0.59 8.42 12.2 71.7
One unit (U) of enzyme activity was defined as the amount of enzyme that released 1 µmol of
ρNP per minute.
The culture supernatant was subjected to an ultrafiltration process in
which the sample was concentrated 12.5-fold and considerable α-galactosidase
activity enrichment was observed (Table 1). The sample was submitted to ion
exchange chromatography on a DEAE-Sepharose column where the fraction
containing α-galactosidase activity, eluted with 0.5 M NaCl, appeared as a
single activity peak (Fig. 1).
Fraction number
0 42 84 126 168
Activity (U.mL
-1
)
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
Protein (mg.mL
-1
)
0,000
0,025
0,050
0,075
0,100
0,125
0,150
NaCl (M)
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
Figure 1. Elution profile of α-galactosidase from D. hansenii UFV-1 on a DEAE-
Sepharose column. α-Galactosidase activity (); protein (); and gradient of
NaCl ().
54
This procedure resulted in a purification factor of 12.04 and a 71.73%
recovery of the original α-galactosidase activity (Table 1). Similar results were
reported for partial purification of Streptomyces griseoloalbus α-galactosidase
[21]. Viana et al. [20] used several steps to purify D. hansenii UFV-1 α-
galactosidase and at the end of the purification process, these authors obtained
a purification factor of 16.7 and activity recovery of 58.3%.
3.2. Characterization of Soy Molasses
The total carbohydrate concentration makes up approximately 71.16 % of
soy molasses dry weight. Fermentable sugars represented about 58 % of the
sugars present in soy molasses, of which the sucrose and reducing sugar
contents were 38.81 % and 2.13 %, respectively (Table 2).
Table 2. Composition (dry basis) of soy molasses
Component
Concentration
(%)
Reducing sugar 2.13 ± 0.0071
Sucrose 38.81 ± 0.0212
Raffinose 8.66 ± 0.3818
Stachyose 21.55 ± 0.7495
Total carbohydrates
a
71.16
Proteins 8.04 ± 0.2263
Lipids 6.50 ± 0.1326
Ash 14.26 ± 0.0989
a
Total carbohydrates (reducing sugars + sucrose + raffinose + stachyose)
The concentration of the stachyose and raffinose were 21.55 % and 8.66
%, respectively. This result showed that approximately 42 % of the sugars
present in soy molasses are represented by raffinose and stachyose, which are
not fermentable by the majority of microorganisms. The presence of α-1,6
bonds in these galactooligosaccharides limits their utilization by many
microorganisms [14]. Hydrolysis of raffinose and stachyose by α-
galactosidases, producing galactose and sucrose, could promote an increase in
the content of fermentable sugars present in soy molasses.
55
3.3. Enzymatic Hydrolysis of Oligosaccharides in Soy Molasses
The treatment of soy molasses with partially purified α-galactosidase
from D. hansenii UFV-1 reduced the stachyose and raffinose concentrations to
zero (Table 3). Nevertheless, the enzyme concentrations in the reaction
mixtures, corresponding to 5 and 20 °Brix with activities of 0.8 and 4.0 U/mL,
respectively, showed the ability to hydrolyze raffinose and stachyose. No
oligosaccharide hydrolysis was detected in control tubes where the enzyme
extracts had been replaced by denatured enzyme extracts. Since the extract
showed no invertase activity, these results indicate that D. hansenii UFV-1 α-
galactosidase acts on the oligosaccharides present in the soy molasses. Heavy
and light soy molasses treated with 10.5 U of D. hansenii α-galactosidase
presented total hydrolysis of stachyose after 2 h of reaction, but an increase in
rafinnose concentration, which accumulated after stachyose hydrolysis [9].
These authors reported that after 6 h of treatment, soy molasses maintained
about 50 % of its initial raffinose concentration. In the present study, the
incubation time period of 12 h was necessary to achieve total reduction of
raffinose and stachyose present in soy molasses, at both 5 and 20 °Brix.
Table 3. Hydrolysis of oligosaccharides presents in soy molasses by
Debaryomyces hansenii UFV-1 α-galactosidase.
Concentration (mg/mL)
Incubation
Time (h)
ºBrix
Reducing
Sugar
Sucrose Raffinose Stachyose
0 1.43 ± 0.0141 19.31 ± 0.1252 4.48 ± 0.0131 10.67 ± 0.2223
12
5
7.96 ± 0.0424 24.79 ± 0.0805 0 0
0 5.96 ± 0.0589 80.98 ± 1.4516 20.59 ± 0.1945
45.50 ± 0.1784
12
20
33.15 ± 0.1915
103.62 ± 0.1156
0 0
Initial concentrations of sucrose in the reaction mixtures, at 5 and 20
°Brix, were 19.31 and 80.98 mg/mL, respectively; and the concentrations of
reducing sugar were 1.43 and 5.96 mg/mL, respectively. Consistently after
enzymatic treatment, sucrose concentration increased approximately 22 % in
both mixtures at 5 and 20 °Brix, and the content of reducing sugar increased 82
% (Table 3). On the other hand, no change in sucrose and reducing sugar
56
amounts were detected in the control tubes, which contained the inactive
enzyme extract. Thermostable Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum α-
galactosidases, used to hydrolyze raffinose and stachyose in soy molasses,
promoted the reduction in the oligosaccharide content by 0.6 % after incubation
at 70 ºC for 1 h [22].
This result showed that treatment of soy molasses with D. hansenii α-
galactosidase was efficient for increasing the concentration of fermentable
sugars, and can thus improve the fermentative potential of soy molasses.
3.4. Fermentation Tests
Fermentation of untreated soy molasses (UTSM) and soy molasses
treated with D. hansenii UFV-1 α-galactosidase (TSM) was evaluated during a
period of 12 h, using the fermentative strain S. cerevisiae LBM-51 which does
not produce α-galactosidase. In this work, fermentation tests were carried out
using UTSM and TSM, at 5 °Brix, measured before treatment with α-
galactosidase.
The profile of ethanol production during fermentation of soy molasses
showed that a greater increase in ethanol concentration was obtained in the first
two hours of fermentation (Fig. 2).
Time (h)
0 2 4 6 8 10 12 14
% Ethanol productivity
0,0
0,3
0,6
0,9
1,2
1,5
1,8
Figure 2. Ethanol productivity from fermentation of soy molasses at 5 ºBrix.
() Untreated soy molasses. () Treated soy molasses.
57
In this time, 14.0 and 12.40 g/L of ethanol were produced from TSM and
UTSM, respectively. After this period, a weak increase in ethanol concentration
was verified during fermentation of TSM and, the maximum ethanol production,
15.0 g/L was detected after 8 h of fermentation. On the other hand, fermentation
of UTSM yielded 11.40 g/L of ethanol in the same time. An increase of 24 % in
ethanol productivity was observed in TSM compared to UTSM. Trace amount of
residual reducing sugars remained after fermentation of both TSM and UTSM,
indicating that practically all sugars were utilized by the yeast during this
process. According to Siqueira et al. [8], fermentation of soy molasses at a
concentration of 20 ºBrix during 20 h by S. cerevisiae LPB-SC, which does not
produce α-galactosidase, yielded 36.5 g/L. However, these authors detected
high concentration of residual raffinose oligosaccharides after fermentation.
Additionally the fermentation of soy molasses at 20 °Brix was tested in this
study (not shown) and compared with the data obtained by Siqueira et al [8].
Fermentation of TSM at 20 °Brix, after 12 h, yielded 59.29 g/L of ethanol, 38 %
greater than the result encountered by Siqueira et al [8]. However, a higher
residual reducing sugar concentration remained after fermentation, indicating
saturation of the process, probably due to fermentation inhibition by the high
concentration of ethanol in the medium. These data suggest that improved
ethanol yields can be achieved with process optimization.
The results obtained in this work indicate that hydrolysis of raffinose
oligosaccharides with D. hansenii α-galactosidase prior to fermentation was
efficient to increase the amount of fermentable sugars present in soy molasses,
consequently promoting greater ethanol yields.
4. Conclusions
Utilization of raffinose oligosaccharides present in soy molasses for
ethanol production was possible after hydrolysis of these sugars by partially
purified D. hansenii UFV-1 α-galactosidase. The enzymatic treatment of soy
molasses was efficient for total removal of raffinose and stachyose, and
increased the amounts of fermentable sugars. An increase in ethanol yield of
24% was obtained from fermentation of treated soy molasses when compared
to untreated soy molasses.
58
Acknowlegdement
This study was supported by grants from the Fundação de Amparo a
Pesquisa do Estado de Minas Gerais - FAPEMIG and Conselho de
Desenvolvimento Científico e Tecnológico - CNPq, Brazil.
References
[1] Cardona CA, Sánchez OJ. Fuel ethanol production: process design trends
and integration opportunities. Bioresour Technol 2007;98:2415–2457.
[2] FO Licht’s World Ethanol 2009. <http://www.sourcejuice.com/1279084/2009/
11/02/Produ%C3%A7%C3%A3o-mundial-etanol-2010-crescer-11/pt/>
(accessed 17.03.2010).
[3] RFA – Renewable Fuels Association (online). <http://www.ethanolrfa.org/>
(accessed 29.02.08).
[4] IBGE 2010. Instituto Brasileiro de Geografia e Estatística (online).
<http://www.ibge.gov.br/home/estatistica/indicadores/agropecuaria/lspa/lspa
_200912comentarios.pdf>. (accessed 08.01.2010)
[5] Cerqueira Leite RC, Leal MRLVL, Cortez LAB, Griffin WM, Scandiffio MIG.
Can Brazil replace 5% of the 2025 gasoline world demand with ethanol?
Energy 2009;34:655–661.
[6] Farinelli B, Carter CA, Lin C-YC, Summer DA. Import demand for Brazilian
ethanol: a cross-country analysis. J Cleaner Prod 2009;17:S9–S17.
[7] Quintero JA, Montoya MI, Sánchez OJ, Giraldo OH, Cardona CA. Fuel
ethanol production from sugarcane and corn: comparative analysis for a
Colombian case. Energy 2008;33:385–399.
[8] Siqueira PF, Karp SG, Carvalho JC, Sturm W, Rodríguez-León JA,
Tholozan JL, Singhania RR, Pandey A, Soccol CR. Production of bio-
ethanol from soybean molasses by Saccharomyces cerevisiae at laboratory,
pilot and industrial scales. Bioresour Technol 2008;99:8156-8163.
[9] Viana PA, de Rezende ST, Falkoski DL, Leite TA, José IC, Moreira MA,
Guimarães VM. Hydrolysis of oligosaccharides in soybean products by
Debaryomyces hansenii UFV-1 α-galactosidases. Food Chem
2007;103:331-337.
59
[10] Montelongo JL, Chassy BM, McCord JD. Lactobacillus salivarius for
Conversion of Soy Molasses into Lactic Acid. J Food Sci 1993;58:863-866.
[11] Qureshi N, Lolas A, Blaschek HP. Soy molasses as fermentation substrate
for production of butanol using Clostridium beijerinckii BA 101. J Ind
Microbiol Biotechnol 2001;26:290-295.
[12] Solaiman DKY, Ashby, RD, Zekowski JA, Foglia TA. Simplified soy
molasses-based medium for reduced-cost production of sophorolipids by
Candida bombicola. Biotechnol Lett 2007;29:1341–7.
[13] Solaiman D, Ashby R, Hotchkiss A, Foglia T. Biosynthesis of medium-
chain-length poly(hydroxyalkanoates) from soy molasses. Biotechnol Lett
2006;28:157-162.
[14] Lan Y, Williams BA, Verstegen MWA, Patterson R, Tamminga S. Soy
oligosaccharides in vitro fermentation characteristics and its effect on
caecal microorganisms of young broiler chickens. Anim Feed Sci Technol
2007;133:286–297.
[15] Guimarães VM, de Rezende ST, Moreira MA, Barros EG, Felix CR.
Characterization of α-galactosidases from germinating soybean seed and
their use for hydrolysis of oligosaccharides. Phytochem 2001;58:67-73.
[16] Bradford MM. A rapid and sensitive method for the quantitation of
microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding.
Anal Biochem 1976;72:248-254.
[17] Association of Official Analytical Chemists Official methods of analysis of
AOAC international. 17th ed. Maryland; 2000.
[18] Miller G. Use of dinitrisalicylic acid reagent for determination of reducing
sugars. Anal Chem 1959;31:426–429.
[19] Klinke HB, Thomsen AB, Ahring BK. Potential inhibitors from wet oxidation
of wheat straw and their effect on growth and ethanol production by
Thermoanaerobacter mathranii. Appl Microbiol Biotechnol 2001;57:631–
638.
[20] Viana PA, de Rezende ST, Marques VM, Trevizano LM, Passos FML,
Oliveira MGA, Bemquerer MP, Oliveira JS, Guimarães VM. Extracellular α-
galactosidase from Debaryomyces hansenii UFV-1 and its use the
hydrolysis of raffinose oligosaccharides. J Agric Food Chem 2006;54:2385-
2391.
60
[21] Anisha GS, Rojan PJ, Nicemol J, Niladevi KN, Prema P. Production and
characterization of partially purified thermostable α-galactosidases from
Streptomyces griseoloalbus for food industrial applications. Food Chem
2008;111:631–635.
[22] King MR, White BA, Blaschek HP, Chassy BM, Mackie RI, Cann IKO.
Purification and Characterization of a Thermostable α-Galactosidase from
Thermoanaerobacterium polysaccharolyticum. J Agric Food Chem
2002;50:5676-5682.
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