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UNIVERSIDADE FEDERAL DO PARANÁ
MARÍLIA KAPHAN FREITAS DE CAMPOS
RELAÇÕES HÍDRICAS, TROCAS GASOSAS E ATIVIDADE DE
ENZIMAS ANTIOXIDANTES EM PLANTAS TRANSGÊNICAS DE
CITRUMELO 'SWINGLE' COM ALTO ACÚMULO DE PROLINA
SUBMETIDAS AO DÉFICIT HÍDRICO
CURITIBA
2009
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MARÍLIA KAPHAN FREITAS DE CAMPOS
RELAÇÕES HÍDRICAS, TROCAS GASOSAS E ATIVIDADE DE
ENZIMAS ANTIOXIDANTES EM PLANTAS TRANSGÊNICAS DE
CITRUMELO 'SWINGLE' COM ALTO ACÚMULO DE PROLINA
SUBMETIDAS AO DÉFICIT HÍDRICO
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Agronomia, Área de Concentração em
Produção Vegetal, Departamento de Fitotecnia e
Fitossanitarismo, Setor de Ciências Agrárias,
Universidade Federal do Paraná, como parte das
exigências para obtenção do título de Mestre em
Ciências.
Orientador: Prof. Dr. João Carlos Bespalhok Filho
Coorientador: Dr. Luiz Gonzaga Esteves Vieira
CURITIBA
2009
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À minha querida família, e futura.
DEDICO
i
AGRADECIMENTOS
Aos que contribuíram diretamente para a realização deste trabalho:
Ao Dr. Luiz Gonzaga Esteves Vieira (Santista), pela possibilidade de realizar o
trabalho no Laboratório de Biotecnologia Vegetal do IAPAR, pela orientação que
infelizmente se encerra após cinco anos de valiosos ensinamentos científicos e morais (e
por que não, religiosos?), pelo exemplo, confiança e amizade.
Ao Prof. Dr. João Carlos Bespalhok Filho, pela disponibilidade de orientação no
programa de pós-graduação, pela confiança e amizade.
Ao Dr. Celso Jamil Marur, pela condução das análises fisiológicas durante o
experimento, principalmente pelo comprometimento com o trabalho e sugestões.
Ao Dr. Fábio Suano de Souza, pela participação na banca, também pelo auxílio
nas análises fisiológicas, manipulação dos dados e importantes considerações feitas para
a redação.
À grande amiga Kenia de Carvalho, pela intensa convivência nestes dois anos,
pelos sábados na casa-de-vegetação, cervejinhas, conversas e madrugadas produtivas
(ou nem tanto).
Ao Sr. João Batista da Silva, pelo grande cuidado com as plantas antes e após a
condução do experimento, e pelo divertido trabalho em equipe na casa-de-vegetação.
À Suely Ario e à Gislaine Vasquez, pela “chatice” que contribuiu muito para o bom
funcionamento do laboratório.
À MSc. Ines Fumiko Ubukata Yada, pela realização das análises estatísticas.
Ao Dr. Luiz Filipe P. Pereira, pela ajuda na tomada de decisões, paciência nos
momentos de ‘estresse severo’ e pelas considerações.
Ao Dr. Eduardo Fermino Carlos, pela participação na banca e importantes
considerações feitas.
Ao Dr. Josemir Moura Maia e ao Dr.
Joaquim Albenísio Gomes da Silveira, pelas
metodologias de quantificação de atividade enzimática concedidas.
ii
À Universidade Federal do Paraná, pela possibilidade de realização do mestrado.
À
Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES), pela
concessão de bolsa.
Aos que contribuíram indiretamente, porém não menos importantes:
Aos meus pais, Jennifer e Marcos, meu pleno agradecimento pelo apoio,
incentivo, exemplo... Enfim, por tudo o que eu construí até hoje.
Aos meus irmãos Bárbara, Cláudia, Marquinhos, Veridiana e Elias, e aos meus
sobrinhos, Pedro, Bibi, Bibi e João Marcos, sempre presentes, mesmo que distantes.
Aos meus avós, Cláudio e Ruth, meus exemplos de amor, luta e determinação.
Ao Léo, o maior entusiasta para que eu prossiga na carreira científica.
À tia Marilinha e ao Tozoni, pelos descansos em Botucatu.
Ao Jáder, meu querido companheiro, pelo amor, compreensão, apoio e
principalmente pela paciência na fase final do trabalho.
À Carlise e à Adri, que me acolheram em Curitiba na curta moradia, agradeço pela
eterna amizade.
Aos bons amigos: Sandra, pelo imenso coração; Gislaine, pela amizade e
exemplo de força; Tiago, pelo enorme carinho; Diogo, pelo companheirismo, pelas
viagens à Curitiba e pela, cada vez mais, crescente amizade; Luciana, pelas conversas,
thank you!
A todos os amigos e funcionários do LBI e do Laboratório de Cultura de Tecidos
do IAPAR, ou aos que passaram, meus sinceros agradecimentos.
iii
SUMÁRIO
LISTA DE ABREVIATURAS..........................................................................................
LISTA DE FIGURAS....................................................................................................
RESUMO GERAL........................................................................................................
ABSTRACT..................................................................................................................
1 INTRODUÇÃO GERAL..........................................................................................
2 REVISÃO DE LITERATURA..................................................................................
2.1 PANORAMA MUNDIAL E NACIONAL DA CITRICULTURA...............................
2.2 PORTA-ENXERTOS.................................................................................................
2.2.1 Citrumelo ‘Swingle’................................................................................................
2.3 DÉFICIT HÍDRICO...................................................................................................
2.3.1 Déficit hídrico e suas consequências para a citricultura.......................................
2.3.2 Fisiologia do déficit hídrico....................................................................................
2.3.3 Regulação da resposta ao déficit hídrico..............................................................
2.3.4 Prolina...................................................................................................................
2.4 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E O ESTRESSE OXIDATIVO...................
2.4.1 Sistemas antioxidantes.........................................................................................
2.4.1.1 Enzimas antioxidantes.......................................................................................
2.4.1.2 Antioxidantes não-enzimáticos..........................................................................
2.4.2 Prolina e a proteção contra o estresse oxidativo..................................................
3 REFERÊNCIAS........................................................................................................
4 ARTIGO
Relações hídricas e trocas gasosas em plantas transgênicas de citrumelo
‘Swingle’ com alto acúmulo de prolina submetidas ao déficit hídrico..................
RESUMO........................................................................................................................
ABSTRACT....................................................................................................................
4.1 INTRODUÇÃO.........................................................................................................
4.2 MATERIAL E MÉTODOS........................................................................................
4.2.1 Material vegetal e ensaio de tolerância ao déficit hídrico.....................................
4.2.2 Fotossíntese líquida, transpiração, condutância estomática e eficiência do
uso de água...............................................................................................................
1
4
7
8
9
12
12
13
15
16
16
17
22
23
27
31
31
32
33
36
53
54
55
56
59
59
60
iv
4.2.3 Fluxo de seiva........................................................................................................
4.2.4 Quantificação do teor de prolina............................................................................
4.2.5 Análise estatística.................................................................................................
4.3 RESULTADOS.........................................................................................................
4.3.1 Teor de prolina.......................................................................................................
4.3.2 Relações hídricas na folha.....................................................................................
4.3.3 Fotossíntese líquida, transpiração, condutância estomática e eficiência do
uso de água....................................................................................................................
4.3.4 Fluxo de seiva........................................................................................................
4.4 DISCUSSÃO........................................................................................................
4.5 CONCLUSÕES........................................................................................................
4.6 REFERÊNCIAS........................................................................................................
5 ARTIGO
Alterações na atividade de enzimas antioxidantes em plantas de citrumelo
‘Swingle’ transgênicas com alto acúmulo de prolina em resposta ao déficit
hídrico............................................................................................................................
RESUMO........................................................................................................................
ABSTRACT....................................................................................................................
5.1 INTRODUÇÃO..........................................................................................................
5.2 MATERIAL E MÉTODOS.........................................................................................
5.2.1 Coleta e acondicionamento do material vegetal...................................................
5.2.2 Quantificação do teor de prolina............................................................................
5.2.3 Determinação do conteúdo de malondialdeído (MDA) ........................................
5.2.4 Determinação de antioxidantes totais...................................................................
5.2.5 Atividade de enzimas antioxidantes......................................................................
5.2.5.1 Extração de proteínas........................................................................................
5.2.5.2 Atividade da superóxido dismutase (SOD)........................................................
5.2.5.3 Atividade da catalase (CAT)...........................................................................
5.2.5.4 Atividade da ascorbato peroxidase (APX) ........................................................
5.2.6 Análise estatística................................................................................................
5.3 RESULTADOS..........................................................................................................
5.3.1 Teor de prolina......................................................................................................
5.3.2 Conteúdo de malondialdeído (MDA) ....................................................................
61
61
62
63
63
64
66
69
71
74
75
81
82
83
84
88
88
88
89
90
91
91
91
92
92
93
94
94
95
v
5.3.3 Conteúdo de antioxidantes totais..........................................................................
5.3.4 Atividade da superóxido dismutase (SOD) ..........................................................
5.3.5 Atividade da catalase (CAT).................................................................................
5.3.6 Atividade da ascorbato peroxidase (APX) ...........................................................
5.4 DISCUSSÃO.............................................................................................................
5.5 CONCLUSÕES........................................................................................................
5.6 REFERÊNCIAS........................................................................................................
96
97
98
99
100
106
107
vi
1
LISTA DE ABREVIATURAS
ABTS
ABTS
+
ABA
APX
AS
ATP
BSA
CaMV
CAT
CRA
Cu/ZnSOD
CVC
DNA
EDTA
EM
ES
EUA
FeSOD
GR
GSA
GSH
H
2
O
2
Ka
LEA
MDA
MDHA
MDHAR
MF
MnSOD
2,2´-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico
Radical 2,2´-azinobis-3-etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico
Ácido abscísico
Ascorbato peroxidase
Antisenso (direção)
Trifosfato de adenosina
Albumina de soro bovino
Vírus do mosaico da couve-flor
Catalase
Conteúdo relativo de água
Cobre-zinco superóxido dismutase
Clorose variegada dos citros
Ácido desoxirribonucléico
Ácido etilendiamino tetraacético
Estresse moderado
Estresse severo
Eficiência do uso da água
Ferro superóxido dismutase
Glutationa redutase
Acido glutâmico - γ- semialdeído
Glutationa reduzida
Peróxido de hidrogênio
Constante dielétrica
“Late Abundant Proteins”
Malondialdeído
Monodeidroascorbato
Monodeidroascorbato redutase
Massa fresca
Manganês superóxido dismutase
2
MPa
mRNA
MSC
NADP
+
NADPH
NBT
NO
•
1
O
2
O
2
•−
OH
−
ONOO
−
P2C
P5C
P5CR
P5CS
P5CDH
P5CSF129A
PDH
PSI
PSII
PVP
REC
RFA
ROS
S
SCCL
SE
SOD
TBA
TCA
TDR
UA
Megapascal
RNA mensageiro
Morte súbita dos citros
Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (forma oxidada)
Nicotinamida adenina dinucleotídeo fosfato (forma reduzida)
Nitroblue tetrazolium
Óxido nítrico
Oxigênio singleto
Íon superóxido
Radical hidroxil
Peroxinitrito
Δ
1
- pirrolina - 2 - carboxilato
Δ
1
- pirrolina - 5 - carboxilato
Δ
1
- pirrolina - 5 - carboxilato redutase
Δ
1
- pirrolina - 5 - carboxilato sintetase
Δ
1
- pirrolina - 2 - carboxilato desidrogenase
P5CS mutante de Vigna aconitifolia (ZHANG et al., 1995)
Prolina desidrogenase
Fotossistema I
Fotossistema II
Polivinilpirrolidona
Recuperação
Radiação fotossinteticamente ativa
Espécies reativas de oxigênio
Senso (direção)
Suco concentrado e congelado de laranja
Sem estresse
Superóxido dismutase
Ácido tiobarbitúrico
Ácido tricloroacético
Reflectometria no domínio do tempo
Unidades de atividade
3
UV
Ψ
s
Ψ
t
Ψ
g
Ψ
p
Ψ
τ
Ultra-violeta
Potencial osmótico
Potencial total da água
Potencial gravitacional
Potencial de pressão
Potencial matricial
4
LISTA DE FIGURAS
A
) Esquema da via metabólica da biossíntese de prolina a partir
de glutamato em plantas; B) Compartimentos celulares
envolvidos no processo. (Adaptado de VERBRUGGEN;
HERMANS, 2008)..........................................................................
Esquema indicando alguns dos agentes estressantes indutores
do acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS) e as
consequências biológicas que desencadeiam uma série de
disfunções fisiológicas que podem acarretar em morte celular
(Adaptado de SCANDALIOS, 2005)..............................................
Teor de prolina livre em folhas de plantas transgênicas contendo
o gene P5CSF129A e de plantas controle não transformadas em
quatro condições de suprimento hídrico: SE (Sem estresse; Ψ
t
= -
1,3 MPa), EM (Estresse moderado; Ψ
t
= -2,3 a -2,5 MPa), ES
(Estresse severo; Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa), REC (Recuperação 24 h
após irrigação; Ψ
t
= -1,3 a -1,9 MPa) Valores são apresentados
por médias ± erro padrão (n=4). Letras maiúsculas comparam
plantas controle e transgênicas e letras minúsculas comparam
as condições de suprimento hídrico. Letras iguais não
apresentam diferença pelo teste Tukey a 5% de
probabilidade..................................................................................
A) Potencial hídrico total; B) Potencial osmótico; e C) Potencial
de pressão em plantas transgênicas contendo o gene
P5CSF129A e plantas controle não transformadas, durante o
período de restrição hídrica. Valores são apresentados por
médias ± erro padrão (n=4)...........................................................
A
) Fotossíntese líquida; B) Transpiração; e C) Eficiência do uso
de água (EUA) em plantas transgênicas contendo o gene
P5CSF129A e plantas controle não transformadas, durante o
período de déficit hídrico. Valores são apresentados por médias
± erro padrão (n=4)........................................................................
Condutância estomática em plantas transgênicas contendo o
gene P5CSF129A e plantas controle não transformadas, durante
o período de restrição hídrica. Valores são apresentados por
médias ± erro padrão (n=4)...........................................................
F
FIGURA 07 -
luxo de seiva xilemática em plantas transgênicas contendo o
gene P5CSF129A e em plantas controle não transformadas,
durante o período de restrição hídrica. Valores são
apresentados por médias ± erro padrão (n=4). RFA: Radiação
fotossinteticamente ativa................................................................
FIGURA 01 -
FIGURA 02 -
FIGURA 03 -
FIGURA 04 -
FIGURA 05 -
FIGURA 06 -
25
30
63
65
68
69
70
5
TFIGURA 08 - eor de prolina livre em folhas de plantas controle não
transformadas e de plantas transgênicas contendo o gene
P5CSF129A em quatro condições de suprimento hídrico: SE
(Sem estresse; Ψ
t
= -1,3 MPa), EM (Estresse moderado; Ψ
t
= -2,3
a -2,5 MPa), ES (Estresse severo; Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa), REC
(Recuperação 24 h após irrigação; Ψ
t
= -1,3 a -1,9 MPa). Valores
são apresentados por médias ± erro padrão (n=4). Letras
maiúsculas comparam plantas controle e transgênicas e letras
minúsculas comparam as condições de suprimento hídrico.
Letras iguais não apresentam diferença pelo teste Tukey a 5%
de probabilidade.............................................................................
C
FIGURA 09 -
onteúdo de MDA em folhas de plantas controle não
transformadas e de plantas transgênicas contendo o gene
P5CSF129A em quatro condições de suprimento hídrico: SE
(Sem estresse; Ψ
t
= -1,3 MPa), EM (Estresse moderado; Ψ
t
= -2,3
a -2,5 MPa), ES (Estresse severo; Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa), REC
(Recuperação 24 h após irrigação; Ψ
t
= -1,3 a -1,9 MPa). Valores
são apresentados por médias ± erro padrão (n=4). Letras
maiúsculas comparam plantas controle e transgênicas e letras
minúsculas comparam as condições de suprimento hídrico.
Letras iguais não apresentam diferença pelo teste Tukey a 5%
de probabilidade............................................................................
C
FIGURA 10 -
onteúdo de antioxidantes totais em folhas de plantas controle
não transformadas e de plantas transgênicas contendo o gene
P5CSF129A em quatro condições de suprimento hídrico: SE
(Sem estresse; Ψ
t
= -1,3 MPa), EM (Estresse moderado; Ψ
t
= -2,3
a -2,5 MPa), ES (Estresse severo; Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa), REC
(Recuperação 24 h após irrigação; Ψ
t
= -1,3 a -1,9 MPa). Valores
são apresentados por médias ± erro padrão (n=4). Letras
maiúsculas comparam plantas controle e transgênicas e letras
minúsculas comparam as condições de suprimento hídrico.
Letras iguais não apresentam diferença pelo teste Tukey a 5%
de probabilidade............................................................................
Atividade enzimática de SOD em folhas de plantas controle não
transformadas e de plantas transgênicas contendo o gene
P5CSF129A em quatro condições de suprimento hídrico: SE
(Sem estresse; Ψ
t
= -1,3 MPa), EM (Estresse moderado; Ψ
t
= -2,3
a -2,5 MPa), ES (Estresse severo; Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa), REC
(Recuperação 24 h após irrigação; Ψ
t
= -1,3 a -1,9 MPa). Valores
são apresentados por médias ± erro padrão (n=4). Letras
maiúsculas comparam plantas controle e transgênicas e letras
minúsculas comparam as condições de suprimento hídrico.
Letras iguais não apresentam diferença pelo teste Tukey a 5%
de probabilidade............................................................................
FIGURA 11 -
94
95
96
97
6
A
tividade enzimática da CAT em folhas de plantas controle não
transformadas e de plantas transgênicas contendo o gene
P5CSF129A em quatro condições de suprimento hídrico: SE
(Sem estresse; Ψ
t
= -1,3 MPa), EM (Estresse moderado; Ψ
t
= -2,3
a -2,5 MPa), ES (Estresse severo; Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa), REC
(Recuperação 24 h após irrigação; Ψ
t
= -1,3 a -1,9 MPa). Valores
são apresentados por médias ± erro padrão (n=4). Letras
maiúsculas comparam plantas controle e transgênicas e letras
minúsculas comparam as condições de suprimento hídrico.
Letras iguais não apresentam diferença pelo teste Tukey a 5%
de probabilidade............................................................................
A
tividade enzimática de APX em folhas de plantas controle não
transformadas e de plantas transgênicas contendo o gene
P5CSF129A em quatro condições de suprimento hídrico: SE
(Sem estresse; Ψ
t
= -1,3 MPa), EM (Estresse moderado; Ψ
t
= -2,3
a -2,5 MPa), ES (Estresse severo; Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa), REC
(Recuperação 24 h após irrigação; Ψ
t
= -1,3 a -1,9 MPa). Valores
são apresentados por médias ± erro padrão (n=3). Letras
maiúsculas comparam plantas controle e transgênicas e letras
minúsculas comparam as condições de suprimento hídrico.
Letras iguais não apresentam diferença pelo teste Tukey a 5%
de probabilidade.............................................................................
FIGURA 12 -
FIGURA 13 -
98
99
7
RESUMO GERAL
Neste trabalho foi avaliada a tolerância ao déficit hídrico em plantas do porta-
enxerto para citros citrumelo ‘Swingle’ transformadas geneticamente para
acumular altos níveis de prolina. As plantas contêm o gene mutante de Vigna
aconitifolia P5CSF129A, que codifica para a enzima-chave da biossíntese de
prolina. Além da avaliação da resposta de parâmetros hídricos e de trocas
gasosas sob déficit hídrico em plantas com alto acúmulo de prolina, o objetivo
desse trabalho foi avaliar o efeito que o maior teor de prolina presente nestas
plantas exerce na atividade das enzimas antioxidantes superóxido dismutase
(SOD), catalase (CAT) e ascorbato peroxidase (APX). Plantas controle não
transformadas e plantas transgênicas foram submetidas a um período de 14 e 16
dias sem irrigação, respectivamente. Como parâmetros fisiológicos foram
avaliados os potenciais hídrico, osmótico e total das folhas, taxas fotossintéticas e
de transpiração, condutância estomática e fluxo de seiva do xilema. Os pontos de
coleta para análises bioquímicas foram determinados a partir de medidas de
potencial hídrico total, que representaram os seguintes níveis de estresse: Sem
estresse (SE; Ψ
t
= -1,3 MPa), estresse moderado (EM; Ψ
t
= -2,3 a -2,5 MPa),
estresse severo (ES; Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa) e recuperação (REC; 24 h após
reidratação; Ψ
t
= -1,3 a -1,9 MPa). Folhas foram submetidas às quantificações de
prolina, malondialdeído (MDA), antioxidantes totais e determinação da atividade
das enzimas CAT, SOD e APX. Plantas transgênicas apresentaram valores 2,5
vezes maiores de prolina nas folhas do que plantas controle nas condições sem
estresse e estresse moderado, sendo que plantas controle atingiram níveis
similares somente no estresse severo. Houve ajustamento osmótico em plantas
transgênicas até o 12º dia de restrição de água, enquanto que plantas controle
apresentaram potencial de pressão nulo logo no nono dia. Maiores taxas de
fotossíntese, condutância estomática e transpiração também foram observadas
em plantas transgênicas do que nas plantas controle durante o período de
estresse. Os níveis de MDA foram significativamente maiores em plantas controle
do que em transgênicas nas condições de estresse moderado e severo. O
conteúdo de antioxidantes totais aumentou com o estresse severo, porém não
houve diferença entre os tratamentos em ambos os tipos de plantas. O mesmo
padrão decrescente de atividade da SOD e APX foi observado durante o déficit
hídrico mais acentuadamente em plantas controle, seguida de elevação 24 h após
a reidratação. A CAT foi menos ativa em plantas transgênicas do que nas controle
em todos os pontos de coleta. A atividade desta enzima aumentou
significativamente durante o período de estresse, havendo redução na
recuperação. Tanto resultados das análises fisiológicas como das bioquímicas
sugerem que a prolina desempenha um importante papel na tolerância ao déficit
hídrico. A manutenção do turgor celular e de trocas gasosas, a redução da
peroxidação lipídica e a influência na atividade de enzimas antioxidantes em
plantas transgênicas, provavelmente ocorreu devido à ação conjunta das diversas
funções do aminoácido prolina como osmorregulador, estabilizador de proteínas e
removedor de radicais livres.
Palavras-chave: Estresse oxidativo; osmoproteção; remoção de ROS; P5CS;
tolerância à seca.
8
WATER RELATIONS, GAS EXCHANGE AND ANTIOXIDANT ENZYMES
ACTIVITY IN TRANSGENIC ‘SWINGLE’ CITRUMELO OVERACCUMULATING
PROLINE UNDER DROUGHT STRESS
ABSTRACT
Water deficit tolerance in transgenic ‘Swingle’ citrumelo rootstock was evaluated.
These plants contain the Vigna aconitifolia P5CSF129A transgene coding for the
key-enzyme for proline synthesis. Besides the water relations and gas exchange
analyses, the aim of this work was to investigate proline effect in superoxide
dismutase (SOD), catalase (CAT) and ascorbate peroxidase (APX) antioxidant
enzymes. Non-transformed control and transgenic plants were submitted to a 14
and 16-day period without irrigation, respectively. Total, osmotic and pressure
potentials, photosynthetic and transpiration rates, stomatal conductance and
xylem sap flow were evaluated. For biochemical analysis, leaves were collected
based on their total water potential, representing the following stress levels:
Irrigated (SE; Ψ
t
= -1.3 MPa), moderate stress (EM; Ψ
t
= -2.3 to -2.5 MPa), severe
stress (ES; Ψ
t
= -3.8 to -3.9 MPa) and recovery (REC; 24 h after rehydration; Ψ
t
= -
1.3 to -1.9 MPa). Proline, malondialdehyde (MDA) and total antioxidant contents
were quantified and CAT, SOD and APX activities were also evaluated. Leaves of
transgenic plants accumulated 2.5-fold higher proline content than non-
transformed control plants in moderate and severe stress conditions. Osmotic
adjustment was observed in transgenic plants until 12 days after withholding
water, while non-transformed control plants presented negative pressure potential
after 9 days of water deficit. Higher photosynthetic rates, stomatal conductance
and transpiration were also observed in transgenic plants than non-transformed
control plants during water stress. MDA content was significantly higher in control
during water deficit, in comparison to transgenic plants. Total antioxidant was
increased in severe stress condition, but no difference was observed between
control and transgenic plants. Both APX and SOD activities decreased during
water deficit period, being found in lower amount in control plants, with a following
increase 24 h after water stress recovery. CAT was more active in control than in
transgenic plants in all stress levels; CAT activity increased significantly during
stress period, decreasing after recovery. These physiological and biochemical
results suggest that proline plays an important role for drought stress tolerance in
plants. The pressure potential and photosynthesis maintenance, the reduction in
lipid peroxidation and the proline influence over antioxidant enzymes activity
observed in transgenic plants, occurred probably due to the concerted action of
proline as an osmoprotectant, protein stabilizer and ROS scavenger.
Key-words: Oxidative stress; osmoprotection; ROS scavenger; P5CS; drought
tolerance.
9
1 INTRODUÇÃO GERAL
Os citros são as frutas mais cultivadas mundialmente, sendo produzidas
em mais de 140 países (FAO, 2004). O setor citrícola brasileiro apresenta
números expressivos que traduzem a grande importância econômica e social que
a atividade tem para a economia do país (NEVES; JANK, 2006). O uso de porta-
enxertos na citricultura é importante devido às influências diretas exercidas em
diversos aspectos fisiológicos e de desenvolvimento da copa, assim como na
tolerância a pragas, doenças e estresses ambientais (POMPEU JUNIOR, 2005).
Apesar das regiões citrícolas brasileiras apresentarem boa distribuição de
chuvas (DOORENBOS; KASSAM, 1994), períodos de déficit hídrico são
frequentes e afetam a cultura em diferentes aspectos (ORTOLANI et al., 1991). A
redução de taxas fotossintéticas e de crescimento, a abscisão de folhas, frutos e
flores (SENTELHAS, 2005), além do agravamento de danos causados por
doenças, são os fatores que afetam a produtividade durante a seca.
Em plantas, a resposta ao estresse ocorre a partir de uma série de eventos
envolvidos na ativação de genes e síntese de compostos que induzem
modificações bioquímicas e fisiológicas. A diminuição da condutância estomática
e aumento no comprimento das raízes melhoram o desempenho das espécies
cultivadas durante a imposição à seca. Porém, há menor captação de CO
2
devido
ao fechamento dos estômatos e desvio da energia requerida para o crescimento
de raízes (VERSLUES et al., 2006). Como forma de tolerância em casos de
deficiência hídrica severa, as plantas promovem o influxo de água, através do
acúmulo de solutos na célula, que reduz o potencial osmótico, em processo
denominado ajustamento osmótico (ZHANG et al., 1999).
Danos causados pelo déficit hídrico induzem o estresse oxidativo, resultado
da produção e acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS) (HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 2006), que afetam o metabolismo de plantas através da oxidação
de membranas lipídicas, proteínas e ácidos nucléicos, além de inibir processos
fisiológicos como fotossíntese e respiração (SCANDALIOS, 2005). Enzimas como
a superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e ascorbato peroxidase (APX),
além de compostos não-enzimáticos, compõem sistemas antioxidantes efetivos
na proteção contra o estresse oxidativo (PERL-TREVES; PERL, 2002). O
10
funcionamento desses sistemas, porém, pode ser interrompido em condições de
estresse, como o déficit hídrico, induzindo maior produção de ROS. Essa situação
requer mecanismos que amenizem o processo autocatalítico sofrido pelas
plantas, e o acúmulo de prolina pode desempenhar essa função.
A prolina é acumulada durante estresses ambientais e nessas situações
atua como mediador do ajustamento osmótico, estabilizador de proteínas (VAN
RENSBURG et al., 1993) e removedor de espécies reativas de oxigênio (ROS)
(SMIRNOFF; CUMBES, 1989), entre diversas outras funções. A biossíntese de
prolina em plantas se dá principalmente via glutamato, através de duas reações
que envolvem as enzimas Δ
1
- pirrolina - 5 - carboxilato sintetase (P5CS) e Δ
1
-
pirrolina - 5 - carboxilato redutase (P5CR) (DELAUNEY; VERMA, 1993). A P5CS
é limitante neste processo, sendo inibida pelo acúmulo do aminoácido (ZHANG et
al., 1995). Estes mesmos autores observaram que a enzima mutante P5CSF129A
de Vigna aconitifolia não sofre inibição, promovendo maior acúmulo de prolina nos
tecidos.
Esta e outras enzimas envolvidas no metabolismo de prolina vêm sendo
utilizadas em estudos relacionados à tolerância a estresses abióticos como a seca
e o estresse salino em diversas espécies vegetais (MOLINARI et al., 2004; DE
RONDE et al., 2004; HMIDA-SAYARI et al., 2005). Além disso, nos últimos anos
tem-se dado mais enfoque ao papel que o aminoácido exerce na proteção contra
o estresse oxidativo em plantas, através da manipulação de níveis endógenos e
exógenos de prolina, resultando em dados importantes referentes ao seu efeito
nas atividades das enzimas antioxidantes (KOCSY et al., 2005; HOQUE et al.,
2007a; OZDEN et al., 2009). Os conhecimentos do papel da prolina na remoção
de ROS e na expressão e atividade de enzimas antioxidantes são baseados
essencialmente em estudos que utilizam altas aplicações exógenas desse
aminoácido. Poucos trabalhos abordam essas funções da prolina em sistemas
vegetais com elevada produção endógena (KOCSY et al., 2005; MOLINARI et al.,
2007).
Molinari et al. (2007) observaram que o aumento da prolina em plantas
transgênicas de cana-de-açúcar submetidas ao déficit hídrico atuou mais como
um agente antioxidante do que como um osmoprotetor, já que não ocorreu
ajustamento osmótico nessas plantas em solos secos, havendo, porém, proteção
11
do aparato fotossintético. Por outro lado, plantas de citrange ‘Carrizo’
transgênicas acumularam cerca de cinco vezes mais prolina do que plantas não
transformadas (MOLINARI et al., 2004). Os parâmetros fisiológicos quantificados
nesse trabalho mostraram que o melhor aproveitamento da água por plantas
transgênicas, devido ao ajustamento osmótico, resultou em maiores taxas
fotossintéticas, e por isso apresentaram-se mais tolerantes ao déficit hídrico do
que plantas controle não transformadas. Porém, nesse caso não foi avaliado o
papel adicional da prolina na proteção contra o estresse oxidativo.
O citrange ‘Carrizo’ é amplamente utilizado como modelo para
transformação genética de plantas de citros, já que apresenta grande capacidade
de regeneração in vitro. A sua utilização como porta-enxerto, entretanto, é
bastante limitada devido a algumas características desfavoráveis que afetam seu
desempenho em campo, como por exemplo, a suscetibilidade ao declínio dos
citros (BERETTA et al., 1994). Dessa forma, a utilização de plantas transgênicas
de citrumelo ‘Swingle’ com alto acúmulo de prolina representa uma estratégia
promissora para aumentar a tolerância ao déficit hídrico, além de proporcionar
material importante tanto para estudos de tolerância ao estresse como para a
utilização direta em sistemas produtivos.
Também, plantas cítricas, entre as quais o citrumelo ‘Swingle’, são
conhecidas pela sua capacidade de produzir e acumular altos níveis de prolina
livre nas folhas mesmo em condições normais de crescimento e desenvolvimento
(NOLTE; HANSON, 1997), o que as torna uma planta modelo para estudos sobre
os efeitos de alta concentração de prolina endógena na fisiologia de plantas
Esse trabalho teve como objetivos: avaliar tolerância ao déficit hídrico em
plantas transgênicas de citrumelo ‘Swingle’ superexpressando o gene mutante
P5CSF129A, com alto acúmulo de prolina, através da caracterização das relações
hídricas e de trocas gasosas; e avaliar as alterações na atividade das enzimas
antioxidantes superóxido dismutase, ascorbato peroxidase e catalase, envolvidas
na proteção contra espécies reativas de oxigênio (ROS) tanto em condições
normais de suprimento de água, como em resposta ao déficit hídrico.
12
2 REVISÃO DE LITERATURA
2.1 PANORAMA MUNDIAL E NACIONAL DA CITRICULTURA
As frutas cítricas são cultivadas em mais de 140 países, porém apenas
algumas áreas concentram a maior parte da produção (FAO, 2004). O Brasil
destaca-se nesse cenário por produzir anualmente cerca de 20 milhões de
toneladas de citros, sendo 90% destes representados por laranjas (FAO, 2007).
Estima-se que 18,5 milhões de toneladas da fruta serão colhidas no Brasil na
safra 2008/2009, em uma área de 820 mil hectares (IBGE, 2008).
A produção chinesa igualou-se à do Brasil na safra 2007/2008 (USDA,
2008), entretanto, apenas 14% desse montante refere-se à produção de laranja,
visto que a China é reconhecida como o maior produtor mundial de tangerinas
(FAO, 2007). Os Estados Unidos ocupam o terceiro lugar, tendo colhido 11,5
milhões de toneladas na safra 2007/2008, 73% das quais representadas por
laranjas (USDA, 2008), e o México e a Espanha também apresentam números
expressivos no contexto mundial, respondendo, respectivamente, por 6,5% e
4,2% da produção total (FAO, 2008).
Apenas 20% da laranja produzida no país é destinada ao consumo in
natura, sendo o restante comercializado para industrialização da fruta,
principalmente a produção de suco concentrado e congelado de laranja (SCCL)
(NEVES; JANK, 2006). Na temporada 2007/2008 o Brasil produziu 1,35 milhões
de toneladas dessa commodity, o que representou a fatia de aproximadamente
60% do total mundial. Cerca de 90% do SCCL produzido no Brasil abastece o
mercado externo, sendo a União Européia a principal importadora (60%), seguida
pelo NAFTA (20%). O restante é exportado para os países do Mercosul, Ásia e
Oceania (ABECITRUS, 2008).
O sistema agroindustrial citrícola brasileiro envolve diferentes segmentos
como de insumos, produção, indústria processadora e packing houses,
distribuição e consumo, elos que estabelecem uma cadeia produtiva que
movimenta cerca de R$ 9 bilhões por ano e gera mais de 400 mil empregos
diretos e indiretos (NEVES; JANK, 2006). Esse importante sistema é
13
principalmente representado pelo estado de São Paulo, que produz anualmente
em torno de 14 milhões de toneladas de laranja, 80% da produção nacional, em
mais de 600 mil hectares de área plantada (IEA, 2008). Em segundo lugar
encontra-se o estado da Bahia, responsável por 5% da produção, seguido pelos
estados de Sergipe (4,2%), Minas Gerais (3,2%), Paraná (2,3%) e Rio Grande do
Sul (1,2%) (IBGE, 2006).
A citricultura paranaense se estabeleceu ao final da década de 80, quando
foi rompida a interdição de áreas para o plantio devido à ocorrência de cancro
cítrico. Isso foi possível através de resultados de pesquisa que preconizam uma
produção fundamentada em bases sanitárias e tecnológicas. As regiões Norte e
Noroeste do Estado concentram a produção de laranja para fins industriais,
totalizando 19,4 mil hectares de área plantada, e na região do Vale do Ribeira
estabeleceu-se a exploração de tangerinas para o mercado de frutas frescas em
uma área de 9,5 mil hectares. As indústrias paranaenses estimam para a safra
2008/2009 uma produção de 440 mil toneladas de laranja, que serão
transformadas em 35,8 mil toneladas de suco destinado à exportação. Atualmente
existem três empresas responsáveis pela moagem de laranja, duas ligadas ao
sistema cooperativista, Cocamar e Corol, e a Citri, uma indústria privada de
citricultores (DERAL/SEAB, 2008).
2.2 PORTA-ENXERTOS
A utilização de porta-enxertos na citricultura permite criar uma associação
mutuamente benéfica entre dois organismos geneticamente distintos, cada qual
com suas características, levando à formação de uma nova planta produtiva e
longeva, que irá sofrer influências de sua origem dupla, uma vez que nem sempre
são harmônicas as necessidades da copa e do porta-enxerto (POMPEU JUNIOR,
2005).
Dentre as diversas alterações da copa influenciadas pelo porta-enxerto,
destacam-se as relacionadas ao desenvolvimento, produção, maturação e peso
dos frutos, teores de açúcares, ácidos e outros componentes do suco, absorção,
síntese e utilização de nutrientes, transpiração e tolerância a pragas, doenças e
14
estresses ambientais, como déficit hídrico e salinidade. As influências da copa
sobre o porta-enxerto são menos visíveis, mas ocorrem no desenvolvimento
radicular e na tolerância ao frio, seca, pragas e doenças (POMPEU JUNIOR,
2005).
O limão ‘Cravo’ (Citrus limonia Osbeck) é o principal porta-enxerto utilizado
na citricultura brasileira desde o início da década de 60, já que confere alta
produtividade e precocidade à copa, é compatível com todas as variedades
comerciais de laranja doce, além de ser tolerante ao déficit hídrico
(FUNDECITRUS, 2004). Na década de 1970, devido ao declínio dos Citros, uma
doença que afeta plantas enxertadas em limão ‘Cravo’, iniciou-se uma pequena
diversificação por porta-enxertos tolerantes, liderada pela tangerina ‘Cleópatra’
(Citrus reshni hort. ex Tanaka), seguida por limão ‘Volkameriano’ (Citrus
volkameriana V. Ten. & Pasq.), tangerina ‘Sunki’ (Citrus sunki (Hayata) hort. ex
Tanaka) e citrumelo ‘Swingle’ (Citrus paradisi Macfad. Cv. Duncan x Poncirus
trifoliata (L.) Raf.).
Apesar disso, predominou a utilização do limão ‘Cravo’ em novos plantios,
sendo que em 1999 esse porta-enxerto estava presente em 80% dos pomares
brasileiros (FUNDECITRUS, 2003). Em 2001 foi identificada a Morte Súbita dos
Citros (MSC), uma doença de combinação copa/porta-enxerto que afeta
seriamente as variedades de laranja doce enxertadas em limão ‘Cravo’ e, com
menor intensidade, em limão ‘Volkameriano’. A intolerância destes porta-enxertos
à presença do agente causal da MSC ocasiona a morte das plantas, uma vez que
o fluxo normal de nutrientes da copa para a raiz é aparentemente bloqueado,
levando à consequente diminuição do sistema radicular e da capacidade de
absorção de água e sais minerais (FUNDECITRUS, 2007). Estima-se que 4
milhões de plantas foram erradicadas desde o primeiro levantamento da doença,
em 2002.
Foi observado, porém, que plantas enxertadas em tangerina ‘Cleópatra’ e
citrumelo ‘Swingle’ adjacentes às áreas contaminadas não apresentavam os
sintomas. Assim, o surgimento da MSC acelerou o processo de diversificação de
porta-enxertos, e em 2003 apenas 39,8% das mudas estavam enxertadas em
limão ‘Cravo’. As demais utilizaram tangerina ‘Cleópatra’ (32,6%), citrumelo
‘Swingle’ (13,8%) e tangerina ‘Sunki’ (7,1%) (FUNDECITRUS, 2003).
15
Apesar da tolerância a doenças, os principais porta-enxertos alternativos
ao limão ‘Cravo’ apresentam algumas limitações, como o início de produção tardio
observado em tangerina ‘Cleópatra’, a incompatibilidade de laranja ‘Pêra’ com
citrumelo ‘Swingle’ e principalmente a susceptibilidade à seca em ambos
(POMPEU JUNIOR, 2005).
2.2.1 Citrumelo ‘Swingle’
O citrumelo ‘Swingle’ (Citrus paradisi Macfad. Cv. Duncan x Poncirus
trifoliata (L.) Raf.) é um híbrido originado do cruzamento entre pomelo
‘Duncan’ (Citrus paradisi) e trifoliata (Poncirus trifoliata). A utilização desse porta-
enxerto ocorre principalmente devido à sua alta tolerância a diversas doenças,
como a tristeza, declínio, exocorte e xiloporose, e a resistência à MSC, gomose
de Phytophthora e nematóide dos citros (POMPEU JUNIOR, 2005).
Frutos de laranjeiras enxertadas em citrumelo ‘Swingle’ apresentam boa
qualidade, com altos índices de açúcares e rendimento industrial na extração do
suco. O vigor das plantas é maior do que o observado em mudas enxertadas em
trifoliata, similar ao das enxertadas em citranges e é menor do que o observado
em limão ‘Cravo’ ou tangerina ‘Cleópatra’. Entretanto, a tolerância a doenças
proporcionada pelo citrumelo ‘Swingle’ propicia o desenvolvimento das plantas
enxertadas em árvores de grande porte (POMPEU JUNIOR, 1991).
As principais limitações para o uso do citrumelo ‘Swingle’ são a
suscetibilidade ao déficit hídrico e a incompatibilidade com algumas variedades
comerciais de laranja doce. A intolerância à seca é semelhante ao
comportamento do trifoliata e seus híbridos. Apesar disso, plantas enxertadas em
citrumelo ‘Swingle’ parecem responder bem após o período de seca, emitindo
fortes floradas com bom pegamento dos frutos (CITROLIMA, 2005).
Variedades comerciais de copas como laranja ‘Pêra’, tangor ‘Murcott’ e
alguns limões verdadeiros são incompatíveis com o citrumelo ‘Swingle’. A enxertia
com outras como ‘Bahia’, ‘Valência’, ‘Natal’ e ‘Ponkan’ tem sido utilizada com
sucesso. A incompatibilidade, entretanto, pode ser contornada através do uso de
um interenxerto entre a copa desejada e o porta-enxerto. Mudas de laranja Pêra,
16
por exemplo, enxertadas em brotos de laranja ‘Hamlin’ ou ‘Valência’ previamente
enxertadas em ‘Swingle’ são viáveis e podem ser produzidas comercialmente
(GIRARDI; MOURÃO FILHO, 2006).
2.3 DÉFICIT HÍDRICO
2.3.1 Déficit hídrico e suas consequências para a citricultura
O déficit hídrico é o fator ambiental que frequentemente mais influencia a
produtividade da citricultura brasileira (ORTOLANI et al., 1991). A maioria das
regiões citrícolas no país apresenta condições hídricas favoráveis ao
desenvolvimento da cultura, que demanda precipitação variando de 900 a 1200
mm anuais (DOORENBOS; KASSAM, 1994), em um regime definido no qual
normalmente um período quente e úmido precede outro seco com temperaturas
amenas. Suprimentos hídricos menores que 50 a 60 mm por mês, durante dois a
quatro meses, associados ou não a baixas temperaturas, são essenciais para que
haja redução no metabolismo das plantas, condicionando o período de
dormência, fundamental para a concentração da florada. Entretanto, isso somente
ocorre se houver subsequente suprimento hídrico adequado (DOORENBOS;
KASSAM, 1994). Períodos prolongados de seca prejudicam o desenvolvimento da
cultura, como a estiagem observada entre agosto e outubro de 2007, que levou à
redução de 30% a 40% na produção de variedades precoces no estado de São
Paulo e possivelmente acarretará em redução na safra 2008/2009 (VIANA;
BRAGA, 2007).
As implicações da deficiência hídrica em plantas cítricas dependem da fase
fenológica em que estas se encontram. As respostas dos pomares ao déficit
hídrico iniciam-se com o fechamento dos estômatos e consequente redução na
fotossíntese e crescimento das plantas. Ocorre o encurvamento das folhas e
queda destas e de frutos jovens, ou redução no crescimento dos frutos já
desenvolvidos. Durante o florescimento, a seca leva à queda das flores e
consequentemente à redução na produção, o que também está associado à
redução da translocação de nutrientes, especialmente o nitrogênio, para as
17
plantas (SENTELHAS, 2005). Deficiências hídricas significativas ao longo do
crescimento e desenvolvimento dos frutos, além dos problemas citados, quando
sucedidas por novo período de chuvas, induzem à florada temporã, o que
geralmente resulta na redução do rendimento da florada principal (ORTOLANI et
al., 1991; DOORENBOS; KASSAM, 1994).
Além de afetar a produtividade e a qualidade dos frutos, déficits hídricos
também podem agravar sintomas de doenças, podendo inclusive causar a morte
das plantas doentes. Isso é observado principalmente em doenças vasculares,
como CVC (Clorose Variegada dos Citros) (MEDINA, 2002; MACHADO et al.,
2007) e o declínio dos Citros (BERGUER, 1998).
Ao definir estratégias para reduzir riscos na citricultura, deve-se considerar
que estiagens curtas são mais prováveis e possivelmente contornáveis pela
combinação adequada de práticas de cultivo. Por outro lado, estiagens mais
longas, embora menos frequentes, são mais difíceis de serem contornadas por
simples práticas de manejo (CUNHA; BERGAMASCHI, 1992). Apesar da
incidência de déficits temporários nas regiões produtoras, o Brasil é um dos
países com produção em larga escala caracterizada pela não-irrigação. Embora
tenha ocorrido aumento de áreas irrigadas no norte do estado de São Paulo
(FUNDECITRUS, 2004), como alternativa à diversificação de porta-enxertos
devido à incidência de MSC, o uso de irrigação é ainda pequeno no país,
principalmente devido aos custos da implantação.
2.3.2 Fisiologia do déficit hídrico
A seca é um estresse multidimensional que afeta as plantas em diversos
níveis de organização, sendo definida basicamente como uma circunstância na
qual plantas sofrem redução no seu crescimento e produtividade devido à
insuficiência de suprimento de água no solo, ou a um grande déficit de umidade
do ar (PASSIOURA, 1997). A baixa disponibilidade hídrica é atualmente o
principal fator ambiental que limita o crescimento e a produtividade de plantas em
todo o mundo, e as mudanças climáticas globais provavelmente contribuirão para
18
que a falta de água se torne um fator de restrição ainda maior da produção em
diversas áreas (CHAVES et al., 2003; HAMDY et al., 2003).
Os efeitos do déficit hídrico variam em função de diversos fatores, como a
intensidade do estresse, velocidade de imposição e estágio de desenvolvimento
em que a planta se encontra (KREMER; BOYER, 1995). A redução da
disponibilidade hídrica pode ser determinada pela queda no potencial de água
(Ψ
t
) (KREMER; BOYER, 1995), parâmetro que na maioria dos casos é o primeiro
sinal percebido e evitado pela planta. O conteúdo de água nos tecidos é mantido
em condições não-estressantes de forma que as taxas de perda e captação de
água estejam em equilíbrio, o qual é sustentado em princípio devido ao
movimento estomático. Modificações no desenvolvimento que aumentam a razão
raiz/parte aérea, a capacidade de acumular água nos tecidos, o espessamento da
cutícula e sua permeabilidade também são fatores de grande importância na
manutenção do equilíbrio do teor de água em tecidos vegetais (VERSLUES et al.,
2006).
Durante estágios iniciais do estresse, um pequeno dessecamento do solo é
suficiente para induzir o aumento da concentração de ácido abscísico (ABA) no
xilema (HARTUNG et al., 2002). Também ocorre alteração da condutividade
hidráulica da raiz e do xilema (STEUDLE, 2000; JAVOT; MAUREL, 2002) que, ao
transportar o ABA acumulado, pode levar ao fechamento dos estômatos nas
horas mais quentes do dia (TARDIEU; SIMONNEAU, 1998) e redução no
crescimento das folhas, enquanto que o crescimento das raízes é mantido
(HSIAO; XU, 2000). A manutenção da expansão radicular e a diminuição na
condutância estomática melhoram o desempenho de espécies cultivadas durante
a seca, entretanto, nesses casos ocorre queda nas taxas fotossintéticas devido à
menor captação de CO
2
pelos estômatos, e o crescimento das raízes requer
energia que é desviada de tecidos fotossintéticos e reprodutivos. Além disso, com
o prolongamento do estresse esses mecanismos para evitar a perda de água não
oferecem mais proteção contra os efeitos do baixo potencial hídrico (VERSLUES
et al., 2006).
Com a diminuição da transpiração em casos de déficit hídrico severo, a
planta perde a habilidade de manter o equilíbrio entre a captação e perda de
água, já que os níveis de água tanto no solo quanto nas células são baixos. Como
19
mecanismo de tolerância, as plantas devem evitar a dessecação celular, seja
impedindo o efluxo ou promovendo o influxo de água. O primeiro caso ocorre
devido ao espessamento da parece celular e o segundo é resultado do acúmulo
de solutos na célula, que reduz o potencial osmótico (Ψ
s
), em processo
denominado ajustamento osmótico (ZHANG et al., 1999).
Esses solutos são denominados solutos compatíveis, osmólitos
compatíveis ou osmoprotetores e podem ser acumulados em grandes
quantidades, não interferindo no metabolismo celular, além de apresentarem
outras funções protetoras (YANCEY et al., 1982). Aminoácidos como prolina,
compostos quaternários e outras aminas, como glicinabetaína e poliaminas, e
uma variedade de açúcares e álcoois de açúcar, como manitol, trealose,
galactinol e rafinose, estão entre os principais solutos compatíveis acumulados
durante o estresse (MAHAJAN; TUTEJA, 2005).
A limitação no desenvolvimento das plantas imposta pelo estresse ocorre
principalmente devido à quebra no balanço de carbono, que é dependente das
taxas de fotossíntese e respiração. Mais da metade do total de CO
2
assimilado é
consumido no processo respiratório para manutenção e crescimento, porém, esse
equilíbrio é perdido durante a falta de água (FLEXAS et al., 2006). Atualmente
existe consenso entre autores de que o fator que leva à queda da fotossíntese
nesse caso é a reduzida difusão do CO
2
atmosférico ao sítio de carboxilação
(CHAVES; OLIVEIRA, 2004; FLEXAS et al., 2004), seja devido à resistência
estomática ou menor condutância no mesofilo (WARREN et al., 2004). Além
disso, baixos potenciais hídricos impedem processos fotossintéticos devido a
prejuízos no transporte de elétrons e na fosforilação oxidativa (LARCHER, 2000).
Ainda, quando plantas desidratadas são expostas a outros tipos de
estresse como altas temperaturas ou luminosidade, pode ocorrer fotoinibição, que
é a redução no potencial fotossintético quando a atividade dos fotossistemas é
máxima, produzindo poder redutor (NADPH) e energia química (ATP) que não
são consumidos pelo ciclo de Calvin, devido à baixa disponibilidade de CO
2
(LUDLOW; POWLES, 1988). Como não ocorre a transferência dos elétrons
provenientes da fotólise da água, estes levam à formação de espécies reativas de
oxigênio (ROS), que oxidam inicialmente compostos dos fotossistemas (PS),
como centros de reação do PS II e proteína D1, e também diversas moléculas
20
biológicas (MAXWELL; JOHNSON, 2000), como será discutido posteriormente. O
principal mecanismo de dissipação de energia nesses casos envolve o ciclo das
xantofilas, que atua como uma importante estratégia na tolerância ao estresse
(DEMMING-ADAMS; ADAMS, 1996).
Diversos parâmetros fisiológicos envolvidos na resposta ao déficit hídrico
são passíveis de quantificação. Esse monitoramento promove uma definição
precisa das condições do sistema solo-planta-atmosfera e é pré-requisito para
possibilitar a reprodução e interpretação de experimentos. O estado da água nos
substratos e em tecidos vegetais pode ser determinado diretamente a partir de
medições do conteúdo hídrico, ou por medidas baseadas no estado de energia da
água nesses sistemas (JONES, 2007).
Diversas abordagens e ferramentas podem ser utilizadas para medidas do
conteúdo de água nos substratos. Uma medida básica, que pode ser usada para
calibração de outros métodos, é avaliar diretamente a umidade no solo por
medidas gravimétricas, através da diferença entre o peso dos solos em
capacidade de campo e após a restrição de água (KIRKHAM, 2004). Outras
medidas incluem sensores de capacitância ou eletromagnéticos, como sondas
TDR (reflectometria no domínio do tempo), e baseiam-se no fato de que a
constante dielétrica da água é bastante distinta dos outros componentes do solo,
assim o sinal captado pela sonda pode ser relacionado à umidade (JONES,
2007). No sistema vegetal, pode-se medir diretamente o componente hídrico
através do conteúdo relativo de água (CRA) nas folhas (BARRS, 1968), dado pela
seguinte expressão: CRA = (peso fresco/peso seco) / (peso túrgido/peso seco).
O potencial total da água (Ψ
t
) é um parâmetro de medida baseada no
estado de energia da água. No sistema solo-planta-atmosfera o Ψ
t
é resultado da
soma de diferentes componentes descritos na seguinte expressão: Ψ
t
= Ψ
s
+ Ψ
p
+
Ψ
g
[+ Ψ
τ
], onde Ψ
s
é o potencial osmótico devido aos solutos diluídos, o Ψ
p
é o
potencial de pressão, o Ψ
g
é o potencial gravitacional que reflete a diferença de
elevação entre os níveis de interesse e de referência, relevante apenas ao avaliar
árvores de grande porte, e o Ψ
τ
é o potencial matricial, considerado no potencial
hídrico do solo (KRAMER; BOYER, 1995). As medidas de potencial em plantas
podem ser realizadas por meio de métodos psicrométricos, que envolvem o
equilíbrio do tecido vegetal com o ambiente em uma câmara hermeticamente
21
fechada e a estimação da pressão de vapor utilizando termopares (KRAMER;
BOYER, 1995). O Ψ
t
em folhas de laranjeira ‘Valência’ enxertadas em limoeiro
‘Cravo’ e trifoliata foi de -1,0 a -1,5 MPa, respectivamente, em condições normais
de suprimento de água. Após nove dias sem irrigação, essas plantas
apresentaram potenciais de aproximadamente -2,8 MPa (MEDINA et al., 1999).
Além dos métodos para medição direta das relações hídricas, estudos
utilizam indicadores indiretos do estado da água baseados em análises do
crescimento de plantas ou em respostas fisiológicas conhecidas por serem
indicativas de déficits hídricos (JONES, 2004). As análises de crescimento
incluem avaliações de mudanças morfométricas em ramos, folhas e frutos, assim
como redução da expansão celular e de taxas de crescimento (FERERES;
GOLDHAMER, 2003; NAOR; COHEN, 2003). Já os parâmetros fisiológicos
envolvem respostas como o fechamento estomático e redução de taxas
fotossintéticas (JONES, 2007).
Em folhas de citros expostas à luz saturante, sob condições normais de
suprimento hídrico, a taxa de assimilação de carbono durante a fotossíntese (A)
varia de 4 a 12 μmol CO
2
.m
2
.s
-1
(MACHADO et al., 1994; SYVERTSEN; LLOYD,
1994; MEDINA; MACHADO, 1998). Esses números normalmente são acoplados à
abertura dos estômatos, mensurada pela condutância estomática (g
s
), com
valores de 0,1 a 0,3 μmol H
2
O.m
-2
.s
-1
, e raramente ultrapassam taxas máximas de
0,4 μmol H
2
O.m
-2
.s
-1
em condições naturais. Durante déficits hídricos severos,
plantas de laranjeira enxertadas em limão ‘Cravo’ e trifoliata apresentaram taxas
de fotossíntese de 1,1 e 2,2 μmol CO
2
.m
2
.s
-1
, respectivamente, acompanhadas
por valores praticamente nulos de condutância estomática (MEDINA; MACHADO,
1998).
As taxas de transpiração aumentam linearmente com o aumento da
condutância estomática, e podem ser expressas em mmol H
2
O.m
-2
.s
-1
. A perda de
água para a atmosfera também pode ser estimada através da quantificação do
movimento hídrico nas plantas, pela determinação do fluxo de seiva do xilema.
Essas medidas têm sido realizadas com base em metodologias de fornecimento
de calor no caule e são utilizadas por vários autores, que adotaram este método
tanto em plantas herbáceas (BAKER; VAN BAVEL, 1987; HEILMAN; HAN, 1990;
COHEN et al., 1981), como em plantas lenhosas (ANGELOCCI; VALANCOGNE,
22
1993; MARIN, 2000). Em citros, o fluxo de seiva xilemática pode atingir valores de
150 g.m
-2
.h
-1
, no momento em que há maior demanda evaporativa da atmosfera,
e esses valores podem decair a mais da metade em situações estressantes.
A relação entre a taxa de assimilação de CO
2
pela fotossíntese (A) e a taxa
de perda de água pela transpiração (E) pode ser expressa numericamente pela
razão A/E resultando em um índice denominado “eficiência do uso da água”
(EUA)
(KRAMER; BOYER, 1995). Em citros, embora as taxas de fotossíntese
sejam menores do que outras espécies C
3
, a EUA é considerada alta quando
comparada a outras plantas como macieira ou melão, com valores variando de 1
a 4 μmol CO
2
. mmol H
2
O
-1
, que dependem da hora do dia, em condições normais
de suprimento de água (MEDINA et al., 1999). Estes mesmos autores, porém,
observaram valores de EUA próximos de zero, ao trabalharem com plantas de
laranjeira Valência submetidas ao déficit hídrico.
2.3.3 Regulação da resposta ao déficit hídrico
O estresse em plantas causa mudanças em suas condições de
crescimento que alteram ou prejudicam a homeostase no metabolismo. Tais
mudanças requerem um ajuste das vias metabólicas, visando adquirir um novo
estado de homeostase, em um processo denominado aclimatação ou tolerância
(MITTLER, 2006; SUZUKI; MITTLER, 2006).
De uma forma geral, o processo de aclimatação envolve uma série de
mecanismos complexos que se iniciam com a percepção da planta ao estresse, a
partir da qual ocorre ativação de vias de transdução de sinais que desencadeiam
a síntese de proteínas e outros compostos (SHULAEV et al., 2008). Essas
proteínas e compostos induzem respostas bioquímicas e fisiológicas que
envolvem o fechamento estomático, redução no crescimento celular e na
fotossíntese e ativação da respiração (YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI,
2007).
O déficit hídrico induz a síntese do fitormônio ácido abscísico (ABA),
responsável pelo fechamento dos estômatos e ativação de genes relacionados à
seca. Entretanto, alguns genes envolvidos na resposta ao estresse parecem não
23
responder ao ABA, o que indica a existência de vias ABA-dependentes e ABA-
independentes de ativação de genes induzidos por estresses ambientais
(YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2005).
Muitos desses genes foram identificados por análises de microarrays em
Arabidopsis, e seus produtos podem ser classificados em dois grupos. No
primeiro encontram-se as proteínas que parecem atuar diretamente na tolerância
a estresses abióticos, como chaperonas, proteínas LEA (Late Abundant Proteins),
osmotinas, proteínas anti-congelamento e de ligação a mRNA, enzimas para
biossíntese de osmólitos, aquaporinas, transportadores iônicos, de açúcares e de
aminoácidos, enzimas detoxificadoras e proteases (BRAY et al., 2000). O
segundo grupo contém fatores envolvidos na regulação ou transdução de sinais
durante a resposta ao estresse, sendo denominadas proteínas regulatórias. Estas
incluem os fatores de transcrição, proteínas quinases e fosfatases, enzimas do
metabolismo de fosfolipídeos e outras moléculas sinalizadoras como proteínas de
ligação à calmodulina (YAMAGUCHI-SHINOZAKI; SHINOZAKI, 2007).
2.3.4 Prolina
O acúmulo de prolina em plantas ocorre em resposta a estresses
ambientais como alta salinidade, déficit hídrico, temperaturas extremas, metais
pesados, presença de patógenos, anaerobiose, deficiência nutricional, poluição
atmosférica e radiação UV (HARE; CRESS, 1997; SARADHI et al., 1995;
SIRIPORNADULSIL et al., 2002). A presença do estresse induz a síntese de
prolina e inibe a sua degradação, sendo que a concentração do aminoácido
nessas condições varia entre as espécies vegetais e depende do nível do
estresse ao qual foram expostas (DELAUNEY; VERMA, 1993), podendo acumular
100 vezes mais do que em condições normais (VERBRUGGEN; HERMANS,
2008).
Sabe-se que a prolina desempenha um importante papel adaptativo na
tolerância das plantas ao estresse, principalmente devido à sua propriedade
osmoprotetora. Durante situações de seca e alta salinidade, o seu acúmulo
resulta em aumento na osmolaridade da célula, que leva ao influxo de água ou
24
redução no efluxo e promove a manutenção do turgor necessária para a
expansão celular (KAVI KISHOR et al., 2005). Ainda sob condições de estresse
osmótico, a integridade de membranas deve ser mantida a fim de evitar a
desnaturação protéica. A prolina parece interagir com enzimas e outras proteínas
preservando suas estruturas e atividades.
Além de atuar como mediador do ajustamento osmótico e estabilizador de
estruturas protéicas (VAN RENSBURG et al., 1993), a prolina é um eficiente
removedor de espécies reativas de oxigênio (ROS) (SMIRNOFF; CUMBES,
1989), desempenhando função de detoxificação durante o estresse oxidativo.
Também é fonte de carbono e nitrogênio (HARE; CRESS, 1997), constituinte de
proteínas da parede celular de plantas (NANJO et al., 1999), componente da
cascata de sinalização molecular do estresse (MAGGIO et al., 2002) e a sua
síntese e degradação levam à regulação do pH citoplasmático, promovendo
equilíbrio redox na célula.
Em plantas superiores, a prolina é sintetizada via ácido glutâmico
(glutamato) ou ornitina. A primeira ocorre no citoplasma e em cloroplastos, e é
considerada a principal via, especialmente sob estresse osmótico (DELAUNEY;
VERMA, 1993; DELAUNEY et al., 1993; KAVI KISHOR et al., 1995). A biossíntese
da prolina tem início com a conversão do glutamato a ácido glutâmico - γ -
semialdeído (GSA) pela enzima Δ
1
- pirrolina - 5 - carboxilato sintetase (P5CS). O
GSA é convertido espontaneamente por ciclização a Δ
1
- pirrolina - 5 - carboxilato
(P5C), que é finalmente reduzido à prolina pela P5C redutase (P5CR) (Figura 01).
A partir de ornitina, a prolina pode ser sintetizada por duas rotas, ambas
envolvendo a transaminação da ornitina, seguida pela sua ciclização e redução
(DELAUNEY; VERMA, 1993). O produto da transaminação do grupo α - amino da
ornitina é o
α
- ceto -
δ
- aminovalerato que cicla para Δ
1
- pirrolina - 2 -
carboxilato (P2C), reduzido à prolina. Alternativamente, a transaminação do grupo
δ
- amino produz GSA que é convertido à prolina via P5C.
25
Pirrolina-5-carboxilato
sintase (P5CS)
Prolina desidrogenase
Espontâneo
Pirrolina-5-carboxilato
redutase (P5CR)
Pirrolina-5-carboxilato
desidrogenase (P5CDH)
Glutamato
Glutamato semialdeído
Pirrolina-5-carboxilato
Prolina
A
B
Síntese de prolina (citosol e cloroplastos)
Degradação de prolina (mitocôndrias)
FIGURA 01 - A) Esquema da via metabólica da biossíntese de prolina a partir de
glutamato em plantas; B) Compartimentos celulares envolvidos no processo. (Adaptado
de VERBRUGGEN; HERMANS, 2008).
Hu et al. (1992) demonstraram que a enzima P5CS de Vigna aconitifolia
apresenta dois domínios catalíticos que apresentam as atividades γ - glutamil
quinase e ácido glutâmico - γ - semialdeído desidrogenase, ambas necessárias à
conversão de glutamato a GSA, o que confere sua característica bifuncional. A
P5CS é limitante na biossíntese de prolina, cujo acúmulo inibe por feedback a
atividade γ - glutamil quinase da enzima (ZHANG et al., 1995). Estes mesmos
autores, com o objetivo de aumentar os níveis de prolina acumulados nos tecidos,
fizeram que o mecanismo de feedback fosse praticamente eliminado, ao
substituírem por alanina o aminoácido fenilalanina da posição 129 da enzima
P5CS de V. aconitifolia.
A nova enzima mutante, denominada P5CSF129A, vem sendo utilizada em
diversos estudos que envolvem a tolerância de plantas ao estresse. Plantas
transgênicas de tabaco superexpressando essa enzima, por exemplo,
acumularam duas vezes mais prolina do que plantas expressando a P5CS
selvagem, e essa diferença foi ainda maior sob estresse salino. A presença da
prolina nessas plantas conferiu maior tolerância à salinidade, além de reduzir os
níveis de radicais livres em resposta ao estresse osmótico (HONG et al., 2000).
Plantas transgênicas do porta-enxerto citrange Carrizo contendo o mesmo gene
sob controle de promotor constitutivo 35S CaMV, acumularam cerca de cinco
vezes mais prolina do que plantas não transformadas. Plantas transgênicas
26
apresentaram ajustamento osmótico quando submetidas ao déficit hídrico,
sobrevivendo a um período maior em condições severas do estresse (MOLINARI
et al., 2004).
O catabolismo da prolina é reprimido durante o estresse osmótico em
plantas (DELAUNEY; VERMA, 1993; PENG et al., 1996), porém uma vez
recuperadas, a prolina acumulada durante o estresse é oxidada a P5C pela
prolina desidrogenase (PDH), também chamada de prolina oxidase, a primeira
enzima na via de degradação do aminoácido. O P5C é então convertido a
glutamato pela P5C desidrogenase (P5CDH). Ambas as enzimas atuam em
mitocôndrias e somente a P5CDH também ocorre no citoplasma (KAVI KISHOR
et al., 2005). A via de degradação da prolina também é utilizada para estudos de
tolerância ao estresse. Plantas de A. thaliana antisenso para PDH acumularam
níveis maiores de prolina e apresentaram-se tolerantes ao estresse salino e ao
congelamento (NANJO et al., 1999).
O acúmulo da prolina não ocorre somente como resposta ao estresse.
Estudos demonstram o papel que ela exerce durante o desenvolvimento de
plantas, principalmente no florescimento e formação do grão de pólen (PHANG,
1985). Nesse caso, a prolina atua como fonte de energia, já que a oxidação de
uma molécula resulta em 30 ATPs (HU et al., 1996). Ainda nesse contexto, é
importante saber como a prolina influencia outras vias de energia e metabolismo
do carbono durante condições de estresse e recuperação. A biossíntese da
prolina regula a razão NADP
+
/NADPH, cuja variação afeta o fluxo de carbono pela
via oxidativa da pentose fosfato (HARE; CRESS, 1997). Isso leva à formação de
precursores para síntese de fenilpropanóides ou metabólitos secundários durante
o estresse e consequentemente resulta em mudanças nas propriedades físicas da
parede celular e acúmulo de lignina. Por outro lado, a inversão no fluxo de
carbono pela via da pentose fosfato leva à síntese de purinas que por sua vez
aceleram a divisão celular no período de recuperação.
A ciclagem redox gerada pelo metabolismo da prolina também é um
importante mecanismo de defesa antioxidante sob condições de estresse. Isso
porque moléculas antioxidantes como glutationa e o ascorbato devem ser
mantidas em estado reduzido, e o NADPH gerado a partir da via da pentose
fosfato pode apresentar essa função (HARE, 1998; ALIA et al., 2001).
27
2.4 ESPÉCIES REATIVAS DE OXIGÊNIO E O ESTRESSE OXIDATIVO
O termo radical livre se refere a qualquer átomo ou molécula capaz de
existir independentemente e que possui um ou mais elétrons desemparelhados
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2006). Diversos tipos de radicais livres estão
presentes em sistemas biológicos, dentre eles o hidrogênio atômico, já que possui
apenas um elétron, a maioria dos íons dos metais de transição e o oxigênio
molecular. A terminologia espécies reativas de oxigênio (ROS) inclui os radicais
livres e outras espécies que, embora não possuam elétron desemparelhado, são
muito reativas devido a sua instabilidade (RIBEIRO et al., 2005).
O oxigênio molecular (O
2
) contém dois elétrons desemparelhados e,
apesar de ser considerado um radical livre (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2006),
apresenta baixa reatividade devido à chamada “restrição de spin”. Os elétrons do
oxigênio molecular apresentam spins paralelos e quando o O
2
tenta oxidar outro
átomo ou molécula, os spins destes devem estar na mesma condição, o que
raramente ocorre em sistemas biológicos. A maioria das moléculas são não-
radicais ligadas covalentemente, e os elétrons que formam uma ligação covalente
apresentam spins opostos, ocupando o mesmo orbital molecular (HALLIWELL;
GUTTERIDGE, 2006).
A formação de ROS tem início a partir da eliminação da restrição de spin
do O
2
, que sofre rearranjo em seus elétrons. A nova conformação gera o oxigênio
singleto (
1
O
2
) que, por possuir dois elétrons em spins opostos, apresenta grande
capacidade de oxidação (FOOTE et al., 1985). As outras formas de ROS de
importância biológica são produzidas por reduções parciais do oxigênio e incluem:
íon superóxido (O
2
•−
), peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e radical hidroxil (OH
−
).
Em células de plantas, a produção de ROS se dá em diferentes
localizações. A principal fonte dessas moléculas são os cloroplastos, que
produzem
1
O
2
no fotossistema II e O
2
•−
nos fotossistemas I e II (ASADA, 2006).
Em mitocôndrias ocorre produção de O
2
•−
nos complexos I e III (MØLLER, 2001),
e os peroxissomos são responsáveis pela síntese de O
2
•−
e H
2
O
2
através de
várias reações metabólicas (DEL RIO et al., 2006). Ainda, a NADPH oxidase
presente na membrana plasmática produz O
2
•−
,
que participa em diversos
processos fisiológicos (TORRES; DANGL, 2005). O radical hidroxil pode ser
28
formado a partir da reação entre H
2
O
2
e O
2
•−
em
presença de íons metálicos (Fe
+2
e Cu
+3
) na chamada reação de Haber-Weiss.
A formação dessas moléculas naturalmente acompanha processos
metabólicos em todos os organismos aeróbicos. Sob condições fisiológicas
normais, a produção das ROS é controlada por componentes de defesa
antioxidante (APEL; HIRT, 2004), descritos posteriormente. Entretanto, o
equilíbrio entre a síntese e remoção de ROS pode ser rompido devido ao acúmulo
acelerado de ROS, queda na atividade antioxidante ou em ambas as situações,
ocasionando a condição de estresse oxidativo. Isto é, quando antioxidantes são
esgotados e/ou a formação de ROS aumenta além da capacidade dos sistemas
de defesa, dá-se o estresse oxidativo e suas consequências deletérias
(SCANDALIOS, 2005). Tal estresse ocorre em condições ambientais adversas
como radiação UV, alta luminosidade, temperaturas extremas, estresses
mecânicos, exposição a herbicidas, presença de patógenos e déficit hídrico
(MITTLER, 2006).
Tanto o déficit hídrico quanto a alta salinidade induzem o estresse osmótico
e consequentemente o fechamento estomático, processo este que reduz a
difusão de CO
2
para a fotossíntese. Como resultado dessa condição e sob
luminosidade intensa, a taxa de produção de poder redutor é maior que a taxa de
sua reoxidação, principalmente a partir da redução do CO
2
. Assim, a super-
redução do transporte de elétrons fotossintético leva à formação de excesso de
ROS nos cloroplastos, o que pode resultar em fotoinibição e danos fotooxidativos
(ASADA, 1999).
As consequências do estresse oxidativo ocorrem devido à oxidação de
moléculas biológicas pelas ROS. Como citado anteriormente, a grande maioria
dessas moléculas são não-radicais e quando reagidas com radicais livres, um
novo radical é formado, levando assim à ocorrência de reações em cadeia
(HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2006). Membranas lipídicas, ácidos nucléicos,
proteínas e carboidratos são os principais alvos das ROS.
Os ácidos graxos poli-insaturados são os principais componentes de
membranas presentes em plantas, e são particularmente suscetíveis à oxidação
por
1
O
2
e OH
−
. Os produtos da oxidação desses ácidos graxos envolvem uma
série de hidroperóxidos lipídicos e aldeídos como o malondialdeído (MDA)
29
(ILANGOVAN et al., 2006). A peroxidação dos ácidos graxos poli-insaturados leva
à diminuição de fluidez das membranas, aumento de perda do conteúdo celular
ou da organela, além de causar danos secundários às proteínas de membranas
(HALLIWELL, 2006).
As modificações do DNA causadas pelas ROS envolvem principalmente a
oxidação das bases dos nucleotídeos. Apenas os radicais OH
−
e
1
O
2
são reativos
nesse caso (WISEMAN; HALLIWELL, 1996), e o produto da oxidação de DNA
mais observado é a 8 - hidroxiguanina. Além das alterações diretas, as ROS
também podem modificar indiretamente o DNA. Um tipo comum de dano envolve
a conjugação do MDA, produzido pela peroxidação lipídica, com guanina. Ainda, a
oxidação do DNA pode levar a alterações na metilação de citosinas, que é
importante para a regulação da expressão gênica (HALLIWELL, 2006).
As principais formas de modificações sofridas pelas proteínas através dos
radicais livres são: a oxidação de aminoácidos que contêm enxofre, como cisteína
e metionina; carbonilação de proteínas com resíduos de arginina, histidina, lisina,
prolina e tirosina, cujas oxidações resultam em grupos carbonila livres (LEVINE et
al., 1994); oxidação do triptofano (SHACTER, 2000); e a nitrosilação, que envolve
a formação de peroxinitrito (ONOO
−
) a partir da reação de óxido nítrico (NO
•
) com
O
2
•−
(COSTA et al., 2003). Pode ocorrer ainda a interação dos produtos de
oxidação de ácidos graxos com proteínas, que causam inibição da atividade de
enzimas como, por exemplo, a piruvato desidrogenase em mitocôndrias
(SWEETLOVE et al., 2002). Proteínas do aparato fotossintético são
particularmente sensíveis ao estresse oxidativo, como a proteína D1 do PSII
(SCHELLER; HALDRUP, 2005). Além desta, foi observado que os centros de
reação do PSI são degradados em condições de estresse por frio e alta
luminosidade, liberando íons ferro dos tilacóides para o estroma. Devido à
presença do íon metálico, ocorre a formação de OH
−
, que pode danificar
proteínas do estroma, como a Rubisco (MØLLER et al., 2007).
A oxidação de carboidratos não é considerada deletéria, uma vez que os
produtos não danificam componentes celulares (MØLLER et al., 2007). O radical
hidroxil reage com carboidratos livres como açúcares e polióis, produzindo
principalmente ácido fórmico como produto da oxidação (ISBELL et al., 1973).
Considerando que polióis como o manitol agem como uma primeira barreira
30
contra as ROS, evitando que estas danifiquem moléculas biologicamente mais
importantes (SHEN et al., 1997), a presença de carboidratos pode conferir
proteção contra o estresse oxidativo, o que será discutido em tópicos
subsequentes.
Assim, a oxidação de biomoléculas através do acúmulo de ROS durante o
estresse oxidativo afeta seriamente o metabolismo de plantas, resultando em
alterações celulares como danos em membranas, perda de funções das
organelas, redução na eficiência metabólica e na fixação do carbono, perda de
eletrólitos e mutações, que levam a disfunções fisiológicas, podendo acarretar em
morte celular (Figura 02) (SCANDALIOS, 2005).
Danos em membranas
Descompartimentalização
Redução da Eficiência Metabólica
Reduzida Fixação do Carbono
Perda de eletrólitos
Quebras das Cromátides
Mutações
Agentes estressantes
Senescência
Estresse mecânico
Radiação UV
Luminosidade
Frio e Calor
Patógenos
Déficit hídrico
Metais Pesados
Poluentes
O
3
; SO
2
ROS
OH
−
O
2
•−
H
2
O
2
Estresse
Oxidativo
Lipídeos
Ácidos Graxos
Aminoácidos
Proteínas
Ácidos Nucléicos
Pigmentos
Efeitos Celulares
Morte Celular
Danos Moleculares
FIGURA 02 - Esquema indicando alguns dos agentes estressantes indutores do acúmulo
de espécies reativas de oxigênio (ROS) e as consequências biológicas que
desencadeiam uma série de disfunções fisiológicas que podem acarretar em morte
celular (Adaptado de SCANDALIOS, 2005).
31
2.4.1 Sistemas antioxidantes
Para minimizar os danos causados pelo estresse oxidativo, os organismos
aeróbios desenvolveram múltiplas linhas de defesa que incluem sistemas
antioxidantes enzimáticos e não-enzimáticos. Tal multiplicidade é necessária uma
vez que as ROS são produzidas em diferentes compartimentos celulares e
extracelulares, e também porque as espécies reativas apresentam diferentes
propriedades como solubilidade, capacidade de difusão e nível de reatividade
com moléculas biológicas (PERL-TREVES; PERL, 2002).
2.4.1.1 Enzimas antioxidantes
Uma série de passos de detoxificação é requerida para evitar a conversão
de uma espécie reativa em outra mais nociva. A enzima superóxido dismutase
(SOD) é considerada uma primeira barreira enzimática contra o estresse oxidativo
por converter o O
2
•−
em H
2
O
2
(FRIDOVICH, 1995). Baseando-se no metal co-fator
utilizado pela enzima, as SODs são classificadas em três grupos: Ferro SOD
(FeSOD), localizada nos cloroplastos, manganês SOD (MnSOD) em mitocôndrias,
e cobre-zinco SOD (Cu/ZnSOD), presente em cloroplastos, no citosol e
possivelmente no espaço extracelular (SCANDALIOS, 2005). Em plantas, mais de
uma isoforma das enzimas é encontrada nos diferentes compartimentos celulares,
o que indica uma maior complexidade antioxidante nesses organismos
(SCANDALIOS, 1997).
O produto da dismutação do superóxido pela SOD, o H
2
O
2
, deve ser
removido a fim de evitar sua conversão em radicais mais reativos, como o OH
−
(PERL-TREVES; PERL, 2002). Para isso, diversas enzimas como catalase (CAT)
e ascorbato peroxidase (APX) atuam reduzindo o H
2
O
2
a H
2
O. Assim como as
SODs, a CAT e a APX também apresentam diferentes isoformas. Em plantas, as
CATs são encontradas nos peroxissomos, glioxissomos, citosol e mitocôndrias
(PERL-TREVES; PERL, 2002), e as isoformas da APX estão presentes no citosol,
em membranas dos peroxissomos e em cloroplastos, sendo que nesse caso, uma
32
isoforma está presente no estroma e outra está associada às membranas dos
tilacóides (MIYAKE; ASADA, 1992).
Diferentemente da CAT, que degrada diretamente o H
2
O
2
sem consumir
agentes redutores celulares, a detoxificação pela APX ocorre com a oxidação de
ascorbato, reação que resulta em monodeidroascorbato (MDHA) e H
2
O. A
regeneração do ascorbato é mediada pela monodeidroascorbato redutase
(MDHAR) utilizando NAD(P)H como equivalente redutor (FOYER; HALLIWELL,
1976; NAKANO; ASADA, 1980).
Diversos estudos demonstraram ocorrer mudanças nas atividades das
enzimas antioxidantes de plantas em resposta à seca, altas temperaturas e
salinidade, sugerindo que o aumento dessas atividades possa estar intimamente
relacionado à tolerância a esses estresses. A atividade de SOD, APX e glutationa
redutase (GR), por exemplo, aumentou em genótipos tolerantes de trigo e
manteve-se ou reduziu em genótipos sensíveis em resposta ao déficit hídrico
(LASCANO et al., 2001).
Khanna-Chopra e Selote (2006) também observaram que uma cultivar de
trigo apresentou maior tolerância ao déficit hídrico do que outra suscetível.
Maiores valores de potencial de água e de conteúdo relativo de água observados
nas plantas tolerantes durante o estresse possivelmente ocorreram devido à
maior atividade de enzimas de remoção de H
2
O
2
, como peroxidases, APX e CAT.
2.4.1.2 Antioxidantes não-enzimáticos
Os componentes do sistema não-enzimático de remoção de ROS
envolvem compostos com propriedades antioxidantes intrínsecas, como o
ascorbato (Vitamina C), o α-tocoferol (Vitamina E), carotenóides, a glutationa e
polióis ou alcoóis de açúcar (PERL-TREVES; PERL, 2002).
O ascorbato está presente em toda a célula vegetal e, além de atuar como
substrato para a APX na remoção de H
2
O
2
, também protege por reagir com O
2
•−
,
OH
−
e hidroperóxidos lipídicos (YU, 1994). Apesar de ser solúvel em água, este
também age nas membranas dos tilacóides protegendo ou regenerando
carotenóides e tocoferóis oxidados.
33
O α-tocoferol é encontrado em membranas celulares, principalmente nos
tilacóides. Sua estrutura e localização conferem a sua função de estabilizador de
membranas (HESS, 1993), por capturar radicais peroxilipídicos, auxiliando na
organização da bicamada lipídica. Dentre os carotenóides, o β-caroteno
apresenta função única de proteção aos fotossistemas, tendo nesse caso como
principal papel a captura da energia da clorofila no estado excitado, o que previne
a formação do oxigênio singleto (PARKER; JOYCE, 1967).
A glutationa (GSH) efetivamente reduz e detoxifica diversas espécies
reativas. A GSH também atua como substrato em reações enzimáticas, inclusive
as envolvidas na regeneração do ascorbato (YU, 1994). Os alcoóis de açúcar,
como o manitol, são acumulados durante estresses ambientais. Nessas
situações, essas moléculas não apenas funcionam como osmoprotetores, mas
também como antioxidantes (SMIRNOFF; CUMBES, 1989).
2.4.2 Prolina e a proteção contra o estresse oxidativo
Como foi descrito anteriormente, existe um equilíbrio delicado entre a
síntese e a remoção de ROS nas células vegetais. Esse equilíbrio normalmente é
rompido em condições ambientais adversas, induzindo o estado de estresse
oxidativo, situação que requer mecanismos que amenizem o processo
autocatalítico sofrido pelas plantas (SCANDALIOS, 2005). Durante estresses
abióticos, ocorre acúmulo do aminoácido prolina (DELAUNEY; VERMA, 1993),
adicionalmente à ativação da atividade de enzimas antioxidantes. Dentre os
diversos papéis que a prolina exerce durante a resposta ao estresse, cabe
ressaltar adiante a sua função protetora contra danos oxidativos.
Devido às suas propriedades químicas, a prolina pode remover
1
O
2
(ALIA
et al., 1997) e radicais OH
−
(SMIRNOFF; CUMBES, 1989), sendo por isso capaz
de estabilizar proteínas, DNA e membranas. A pirrolidina, a amina cíclica que
forma o anel de cinco membros da prolina, apresenta IP (capacidade de fornecer
um elétron) consideravelmente baixo, o que confere ao aminoácido a capacidade
de formar complexos de transferência de carga, removendo
1
O
2
com eficiência
(AUE et al., 1976). Além disso, a prolina, assim como o sorbitol, manitol e mio-
34
inositol, reagem com radicais OH
−
formando um radical mais estável (SMIRNOFF;
CUMBES, 1989).
Nos últimos anos, tem-se dado mais enfoque ao papel que a prolina exerce
na proteção contra o estresse oxidativo em diversos organismos. Chen e Dickman
(2005), por exemplo, demonstraram que a presença de prolina inibiu a apoptose
em células do fungo patogênico de alfafa Colletotrichum trifolii, provavelmente por
ativar enzimas antioxidantes como a CAT. Em mamíferos, anormalidades no
metabolismo de prolina têm sido relacionadas ao desenvolvimento de doenças. A
indução de mutações na prolina desidrogenase (PDH), por exemplo, foi associada
à hiperprolinemia em pacientes esquizofrênicos (JACQUET, 2002). Tripathi e
Gaur (2004) também constataram que a presença de prolina aliviou os sintomas
de toxicidade por Cu e Zn em Scenedesmus sp, por remover radicais livres.
Em plantas, a manipulação de níveis endógenos e exógenos de prolina é
amplamente explorada e resulta em dados importantes, porém, bastante variados
entre os pesquisadores, principalmente ao avaliar a relação da prolina às
atividades das enzimas antioxidantes (KOCSY et al., 2005; HOQUE et al., 2007a,
HOQUE et al., 2007b; OZDEN et al., 2009).
Plantas de soja foram transformadas geneticamente com o gene que
codifica para a enzima P5CR, nas direções senso (S) e antisenso (AS), sendo
avaliadas durante e após um período de estresse térmico e déficit hídrico
associado (KOCSY et al., 2005). Nesse trabalho foram avaliadas as atividades
das enzimas SOD, APX e GR, além do conteúdo de ascorbato e glutationa. O
maior acúmulo de prolina obtido em plantas transgênicas S conferiu menor
porcentagem de danos e maior conteúdo relativo de água do que plantas controle
e AS, que apresentaram os maiores danos. Não houve diferença na atividade de
SOD entre as plantas, havendo queda durante o estresse e a recuperação. As
atividades de APX e GR foram significativamente maiores nos transformantes AS.
O maior nível de ascorbato, associado à prolina acumulada nas plantas S parece
ter sido suficiente para a redução efetiva das ROS, não havendo participação das
enzimas antioxidantes nesse caso.
Molinari et al. (2007), ao avaliarem plantas transgênicas de cana-de-açúcar
com expressão estresse-induzida do gene P5CS submetidas ao déficit hídrico,
observaram que a prolina atuou mais como um agente antioxidante do que como
35
um osmoprotetor. Após nove dias sem irrigação, não houve ajustamento osmótico
nessas plantas, porém, elas apresentaram eficiência fotoquímica do PSII 65%
maior do que plantas controle. Além disso, folhas de plantas transgênicas tratadas
com paraquat, um potente gerador de ROS, apresentaram maiores conteúdos de
clorofila, quando comparadas às controle. Esses dados sustentam a hipótese de
que a prolina opera na remoção de radicais livres e consequentemente na
proteção do aparato fotossintético.
A aplicação exógena de prolina também confere proteção contra o estresse
oxidativo em células vegetais. Hoque et al. (2007a; 2007b; 2008) observaram que
a prolina aliviou os sintomas do estresse oxidativo induzido por salinidade em
cultura de células de tabaco. Resultados obtidos nesses trabalhos indicaram que
a prolina levou à ativação de enzimas antioxidantes, como as do ciclo glutationa-
ascorbato (APX, MDHAR e GR, por exemplo) (HOQUE et al., 2007b), CAT e
peroxidase (HOQUE et al., 2007a).
O efeito da prolina exógena no sistema antioxidante de folhas de videira
submetidas ao estresse oxidativo por H
2
O
2
foi avaliado (OZDEN et al., 2009).
Durante a imposição do estresse, menores níveis de peroxidação lipídica foram
observados em presença do aminoácido, onde as atividades de SOD e CAT
foram menores do que na ausência. Porém, as atividades da peroxidase e APX
foram maiores na presença de prolina. Assim, a aplicação de prolina exógena
parece proporcionar um efeito positivo no sistema antioxidante enzimático,
particularmente na ativação de APX e peroxidase em resposta ao estresse
oxidativo ocasionado pelo H
2
O
2
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53
4 ARTIGO
Relações hídricas e trocas gasosas em plantas transgênicas de
citrumelo ‘Swingle’ com alto acúmulo de prolina submetidas ao déficit
hídrico
54
RESUMO
O déficit hídrico é um dos principais fatores abióticos que afetam o desempenho
de diversas espécies cultivadas em todo o mundo. Em plantas, o déficit hídrico
desencadeia respostas bioquímicas e fisiológicas que envolvem o fechamento
estomático, a redução da fotossíntese e o acúmulo de osmoprotetores, como o
aminoácido prolina, que desempenha um papel importante no ajustamento
osmótico, estabilização de proteínas e remoção de radicais livres. Neste trabalho
foi avaliado o efeito da prolina na tolerância ao déficit hídrico em plantas
transgênicas do porta-enxerto para citros citrumelo ‘Swingle’ contendo o gene
mutante P5CSF129A, que codifica para a enzima-chave da biossíntese de
prolina. Plantas controle não transformadas e plantas transgênicas foram
submetidas a um período de 14 e 16 dias sem irrigação, respectivamente. O
potencial hídrico das folhas, taxas fotossintéticas e de transpiração, condutância
estomática e fluxo de seiva do xilema foram avaliados. Os pontos de coleta das
folhas para a determinação do teor de prolina foram determinados a partir de
medidas de potencial total de água, que representaram os seguintes níveis de
estresse: Sem estresse (SE; Ψ
t
= -1,3 MPa), estresse moderado (EM; Ψ
t
= -2,3 a -
2,5 MPa), estresse severo (ES; Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa) e recuperação (REC; 24 h
após reidratação; Ψ
t
= -1,3 a -1,9 MPa). Plantas transgênicas apresentaram
valores 2,5 vezes maiores de prolina do que plantas controle nas condições SE e
EM, sendo que plantas controle atingiram níveis similares somente no ES. Houve
ajustamento osmótico em plantas transgênicas até o 12º dia de restrição de água,
enquanto que plantas controle apresentaram potencial de pressão nulo no nono
dia. Maiores taxas de fotossíntese, condutância estomática e transpiração
também foram quantificadas em plantas transgênicas, indicando melhor
manutenção da abertura estomática e eficiência do uso da água do que em
plantas controle. Estes resultados sugerem que a prolina desempenha um
importante papel na tolerância de plantas ao déficit hídrico, não apenas por
mediar o ajustamento osmótico, mas também devido ao seu papel removedor de
radicais livres.
Palavras-chave: Porta-enxertos; ajustamento osmótico; P5CS; tolerância à seca.
55
Water relations and gas exchange in transgenic ‘Swingle’ citrumelo
overaccumulating proline under drought stress
ABSTRACT
Water deficit is one of the major abiotic factors affecting agriculture in different
areas in the world. In plants, water deficit triggers a series of biochemical and
physiological responses involving stomatal closure, reduction in photosynthesis
rates and production and accumulation of osmolytes, such as proline, which plays
an important role in osmotic adjustment, protein stabilization and ROS scavenging.
This work evaluated proline effect in drought tolerance in transgenic ‘Swingle’
citrumelo rootstocks transformed with the P5CSF129A gene, coding for the key-
enzyme for proline synthesis. Non-transformed control and transgenic plants were
submitted to a 14 and 16-day period, respectively. Leaf water potential,
photosynthetic and transpiration rates, stomatal conductance and xylem sap flow
were evaluated. Proline content was evaluated in leaves collected based on their
total water potential, representing the following stress levels: Irrigated (SE; Ψ
t
= -
1.3 MPa), moderate stress (EM; Ψ
t
= -2.3 to -2.5 MPa), severe stress (ES; Ψ
t
= -
3.8 to -3.9 MPa) and recovery (REC; 24 h after re-irrigation; Ψ
t
= -1.3 to -1.9 MPa).
Transgenic plants accumulated 2.5-fold higher proline content than non-
transformed control plants in the SE and EM conditions. Osmotic adjustment was
observed in transgenic plants until 12 days after withholding water, while non-
transformed control plants presented negative pressure potential after 9 days of
water deficit. Higher photosynthetic rates, stomatal conductance and transpiration
were also observed in transgenic plants, demonstrating better maintenance of
stomatal opening than non-transformed control plants. These results suggest that
proline plays an important role for drought stress tolerance in plants, not only by
mediating osmotic adjustment, but also due to its ROS scavenging function.
Key-words: Rootstocks; osmotic adjustment; P5CS; drought tolerance.
56
4.1 INTRODUÇÃO
Os citros são as frutas mais cultivadas mundialmente, sendo produzidas
em mais de 140 países (FAO, 2004). O setor citrícola brasileiro apresenta
números expressivos que traduzem a grande importância econômica e social que
a atividade tem para a economia do país (NEVES; JANK, 2006). Os porta-
enxertos influenciam diretamente diversos aspectos fisiológicos e de
desenvolvimento da copa, assim como conferem tolerância a pragas, doenças e
estresses ambientais (POMPEU JUNIOR, 2005). A utilização em larga escala de
limão ‘Cravo’, presente em 80% dos pomares, representa uma vulnerabilidade da
citricultura brasileira devido aos potenciais riscos causados por mudanças
climáticas ou pelo surgimento de novas doenças, como foi o caso da Morte Súbita
dos Citros (MSC), o que torna necessário o processo de diversificação de
germoplasma. Dentre os principais porta-enxertos alternativos ao limão ‘Cravo’, o
citrumelo ‘Swingle’ apresenta vantagens como a tolerância à MSC, porém é
sensível à seca (FUNDECITRUS, 2003).
Apesar das regiões citrícolas brasileiras apresentarem boa distribuição de
chuvas (DOORENBOS; KASSAM, 1994), períodos de déficit hídrico são
frequentes e prejudicam a cultura em diferentes aspectos (ORTOLANI et al.,
1991). O fechamento dos estômatos em plantas estressadas leva à diminuição
nas taxas fotossintéticas e de crescimento. A abscisão de folhas, frutos e flores
(SENTELHAS, 2005), além do agravamento de doenças como o declínio
(BERGUER, 1998) e a CVC (MEDINA, 2002; MACHADO et al., 2007), também
são fatores que afetam a produtividade durante a seca.
Em plantas, a resposta ao estresse osmótico inicia-se a partir da percepção
do baixo potencial hídrico nas membranas celulares, que desencadeia uma série
de eventos envolvidos na ativação de genes e síntese de compostos que induzem
uma série de modificações bioquímicas e fisiológicas. Durante o estresse, ocorre
diminuição da condutância estomática e aumento no comprimento das raízes, de
forma a melhorar o desempenho das espécies cultivadas. Porém, há menor
captação de CO
2
e a energia requerida para o crescimento de raízes é desviada
de tecidos fotossintéticos e reprodutivos. Em casos de deficiência hídrica severa,
os mecanismos citados não oferecem mais proteção contra os efeitos do baixo
57
potencial hídrico (VERSLUES et al., 2006). Como forma de tolerância, as plantas
devem evitar a dessecação celular, promovendo o influxo de água, através do
acúmulo de solutos na célula, que reduz o potencial osmótico, em processo
denominado ajustamento osmótico (ZHANG et al., 1999).
Dentre os osmoprotetores, o aminoácido prolina é um dos principais
solutos acumulados durante o estresse, e além de atuar como mediador do
ajustamento osmótico possui função de estabilizar proteínas (VAN RENSBURG et
al., 1993), remover espécies reativas de oxigênio (ROS) (SMIRNOFF; CUMBES,
1989), é fonte de carbono e nitrogênio (HARE; CRESS, 1997), constituinte de
proteínas da parede celular (NANJO et al., 1999), componente da cascata de
sinalização molecular do estresse (MAGGIO et al., 2002) e a sua síntese e
degradação levam à regulação do pH citoplasmático, promovendo equilíbrio redox
na célula.
A principal via de síntese da prolina inicia-se com a conversão do
glutamato a ácido glutâmico - γ - semialdeído (GSA) pela enzima Δ
1
- pirrolina - 5 -
carboxilato sintetase (P5CS). O GSA é convertido espontaneamente a Δ
1
-
pirrolina - 5 - carboxilato (P5C), que é finalmente reduzido à prolina pela P5C
redutase (P5CR) (DELAUNEY; VERMA, 1993). A P5CS é limitante na biossíntese
da prolina, cujo acúmulo inibe a atividade da enzima (ZHANG et al., 1995). Estes
mesmos autores observaram que a enzima mutante P5CSF129A de Vigna
aconitifolia apresenta as mesmas características da P5CS, porém não é inibida
pela prolina, promovendo maior acúmulo do aminoácido nos tecidos.
Esta e outras enzimas envolvidas no metabolismo de prolina vêm sendo
utilizadas em estudos relacionados à tolerância a estresses abióticos como a seca
e o estresse salino em diversas espécies vegetais (KAVI KISHOR et al., 1995;
ZHU et al, 1998; HONG et al., 2000; NANJO et al., 1999; DE RONDE et al., 2004;
HMIDA-SAYARI et al., 2005). Plantas de citrange ‘Carrizo’ transgênicas contendo
o gene P5CSF129A sob controle de promotor constitutivo 35S CaMV,
acumularam cerca de cinco vezes mais prolina do que plantas não transformadas
(MOLINARI et al., 2004a). Os parâmetros fisiológicos quantificados nesse
trabalho mostraram que o melhor aproveitamento da água por plantas
transgênicas durante o déficit hídrico conferiu manutenção da abertura estomática
58
e de taxas fotossintéticas, dessa forma tais plantas sobreviveram a um período
maior de restrição hídrica (MOLINARI et al., 2004a).
O citrange ‘Carrizo’ é amplamente utilizado como modelo para
transformação genética de plantas de citros, já que apresenta grande capacidade
de regeneração in vitro. A sua utilização como porta-enxerto, entretanto, é
bastante limitada devido a algumas características desfavoráveis que afetam seu
desempenho em campo, tais como a susceptibilidade ao déficit hídrico, a solos
salinos e a doenças como o exocorte e o declínio (STANNARD, 1973;
O’BANNON; FORD, 1978; BERETTA et al., 1994). Dessa forma, a utilização de
plantas transgênicas de citrumelo ‘Swingle’ com alto acúmulo de prolina
representa uma estratégia promissora para aumentar a tolerância ao déficit
hídrico, além de proporcionar material importante tanto para estudos de tolerância
ao estresse como para a utilização direta em sistemas produtivos.
Esse trabalho teve como objetivo avaliar tolerância ao déficit hídrico em
plantas transgênicas de citrumelo ‘Swingle’ superexpressando o gene mutante
P5CSF129A, com alto acúmulo de prolina, por meio da análise de relações
hídricas e de trocas gasosas.
59
4.2 MATERIAL E MÉTODOS
4.2.1 Material vegetal e ensaio de tolerância ao déficit hídrico
As avaliações foram realizadas utilizando cinco cópias do evento de
transformação CT-P5-20 de citrumelo ‘Swingle’ (Citrus paradisi Macfad. Cv.
Duncan x Poncirus trifoliata (L.) Raf.) obtido por Molinari (2003), e cinco cópias de
planta controle não transformada. O evento CT-P5-20 foi selecionado para este
estudo por ser o que possui a maior capacidade de acumular prolina livre nas
folhas. As cópias foram obtidos via micropropagação in vitro de acordo com
protocolo estabelecido por Molinari et al. (2004b). As plantas transgênicas contêm
o gene mutante P5CSF129A, que codifica para a enzima-chave para a
biossíntese de prolina Δ
1
- pirrolina - 5 - carboxilato sintetase (P5CS), controlado
por promotor constitutivo CaMV 35S (ZHANG et al., 1995).
Plantas com quatro anos de idade foram dispostas em vasos contendo 15
Kg de substrato (3 terra: 1 areia: 1 composto orgânico), presentes em casa-de-
vegetação do Instituto Agronômico do Paraná (IAPAR), cujas instalações
apresentam as características requeridas pelas normas da CTNBIO para estudos
com organismos geneticamente modificados. Aproximadamente quatro semanas
antes do início do experimento, as plantas foram podadas de forma a promover a
maior uniformidade de massa da parte aérea.
A irrigação das plantas foi suspensa e o tempo de avaliação foi de 14 e 16
dias para plantas controle e transgênicas, respectivamente. O estado hídrico nas
folhas foi monitorado através de psicrômetros de termopar (modelo C-30, Wescor,
Inc., Logan, Ut, U.S.A.) acoplados a um datalogger (Campbell Scientific, Inc.,
Logan, Ut, U.S.A., modelo CR-7). A cada dia de leitura, entre 9h30min e 10h,
discos foliares de aproximadamente 2 cm
2
de cada planta foram dispostos nos
psicrômetros. O datalogger foi programado para que as leituras fossem efetuadas
a cada 10 min até que o equilíbrio da pressão de vapor na câmara fosse
verificado. A microvoltagem fornecida pelo sistema foi convertida em potencial da
água (MPa) em função de prévia calibração dos sensores com soluções de
cloreto de sódio. Após a obtenção do potencial total da água (Ψ
t
), os sensores
foram imersos durante 4 min em nitrogênio líquido e as leituras retomadas para
60
obtenção do potencial osmótico (Ψ
s
). O cálculo do potencial de pressão foi
realizado através de Ψ
t
- Ψ
s
. Após terem atingido potencial total da água de
aproximadamente -4,5 MPa, as plantas foram irrigadas novamente.
4.2.2 Fotossíntese líquida, transpiração, condutância estomática e eficiência do
uso de água
As taxas de fotossíntese líquida foram obtidas utilizando um sistema portátil
de fotossíntese, modelo LI-6200 (LI-COR, Lincoln, NE, EUA), com câmara de 1
litro. As medidas feitas entre 9h30min e 10h em folhas em mesmo estágio de
desenvolvimento do terço médio das plantas e foram expressas em μmol CO
2
.m
-
2
.s
-1
. Além das taxas de fotossíntese líquida (A), o sistema também forneceu
valores de transpiração (E; mmol.m
-2
.s
-1
). A partir desses valores também foi
avaliada a eficiência do uso de água (EUA), que consiste na relação A/E.
A condutância estomática foi avaliada utilizando um porômetro, modelo LI-
1600 (LI-COR, Lincoln, NE, EUA).
4.2.3 Fluxo de seiva
Medidas de fluxo de seiva xilemática foram realizadas utilizando sensores
comerciais de balanço de calor (modelo SGB19; Dynamax Inc.) instalados na
base do caule de quatro plantas controle e quatro plantas transgênicas. O sensor
é formado por uma resistência elétrica de aquecimento (jaqueta térmica), pela
qual é fornecida uma quantidade constante e conhecida de calor a uma seção do
caule, e por um conjunto de termopares que medem a distribuição do calor nas
diferentes direções.
Antes da instalação dos sensores, foi aplicada uma pasta com alta
condutividade térmica (Dow Corning 4, Dow Corning Corporation) para otimizar o
contato entre a fonte de calor e os termopares com o caule, conforme
recomendação do fabricante. Depois da instalação, os sensores foram envolvidos
com três camadas de papel-alumínio, a fim de reduzir o efeito da temperatura
61
devido à radiação incidente. A condutância térmica individual de cada sensor foi
estimada durante as medidas noturnas, entre 4 e 5 h, período em que o fluxo foi
considerado nulo. Adotou-se o valor de 0,42 W.m
-1
.
o
C
-1
como condutividade
térmica para o tronco de laranjeira, conforme Steinberg et al. (1989). Os sensores
foram conectados a um sistema de aquisição de dados formado por um
datalogger CR10X acoplado a um multiplexador AM 416 (Campbell Sci.),
programado para realizar leituras a cada 30 s e armazenar a média dos dados a
cada 15 min. A radiação fotossinteticamente ativa foi monitorada com um
quantômetro acoplado ao sistema de aquisição de dados.
4.2.4 Quantificação do teor de prolina
A determinação do teor de prolina foi feita baseada em metodologia
descrita por Bates (1973), com algumas modificações, em folhas de plantas
controle e transgênicas nas seguintes condições de estresse: Sem estresse (SE;
Ψ
t
= -1,3 MPa), estresse moderado (EM; Ψ
t
= -2,3 a -2,5 MPa), estresse severo
(ES; Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa) e recuperação (REC; 24 h após irrigação efetuada
depois das plantas atingirem o nível severo de estresse; Ψ
t
= -1,3 a-1,9 MPa).
Aproximadamente 30 mg de tecido foliar previamente macerados em N
2
líquido foram homogeneizados em 6 mL de ácido sulfossalicílico 3% (p/v). Após
centrifugação (7500 rpm) por 10 min, 2 mL do extrato foram coletados e
adicionados a 2 mL de solução ácida de ninhidrina (1,25 g de nihidrina; 30 mL de
ácido acético glacial; 20 mL de ácido fosfórico 6 M) e 2 mL de ácido acético
glacial, em tubos de microcentrífuga de 15 mL. As amostras foram incubadas a
100 ºC por 1 h e em seguida colocadas em gelo para paralisar a reação. À
solução foram adicionados 4 mL de tolueno, seguindo de agitação por 20 s para a
completa extração da prolina. O sobrenadante foi utilizado para a leitura em
espectrofotômetro a 520 nm e as absorbâncias comparadas à curva-padrão de
prolina (0 a 100 μg. mL
-1
). As análises foram realizadas em triplicata e os
resultados obtidos expressos em micromol de prolina por grama de massa fresca
(μmol. gMF
-1
).
62
4.2.5 Análise estatística
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com quatro
repetições, em parcelas subdivididas no tempo. As duas parcelas foram
representadas pelas plantas controle e transgênicas e as quatro sub-parcelas
referiram-se às condições de suprimento hídrico (sem estresse, estresse
moderado, estresse severo e recuperação). Após análise de variância, as médias
foram comparadas por teste Tukey a 5% de probabilidade, utilizando o programa
SAS versão 6.4 (SAS, 1995).
63
4.3 RESULTADOS
4.3.1 Teor de prolina
O teor de prolina livre em folhas foi constante em todas as condições de
suprimento hídrico em plantas transgênicas de citrumelo ‘Swingle’, apresentando
valores 2,5 vezes maiores do que plantas controle nas condições sem estresse
(Ψ
t
= -1,3 MPa) e estresse moderado (Ψ
t
= -2,3 a -2,5 MPa). Somente durante o
estresse hídrico severo (Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa) houve acúmulo significativo de
prolina em plantas controle, que atingiram os níveis obtidos em plantas
transgênicas com o gene P5CSF129A.
Ainda em relação às plantas controle, foi observada a redução no conteúdo
do aminoácido durante a recuperação em comparação ao tratamento estresse
hídrico severo, mas com concentração ainda quase duas vezes superior ao obtido
em condição normal de irrigação e sob estresse moderado (Figura 03).
Bb
Ba
Bc
Bc
Aa
Aa
Aa
Aa
0
100
200
300
400
500
600
SE EM ES REC
Prolina (umol.g MF
-1
)
Controle
Transgênica
FIGURA 03 - Teor de prolina livre em folhas de plantas transgênicas contendo o gene
P5CSF129A e de plantas controle não transformadas em quatro condições de suprimento
hídrico: SE (Sem estresse; Ψ
t
= -1,3 MPa), EM (Estresse moderado; Ψ
t
= -2,3 a -2,5 MPa),
ES (Estresse severo; Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa), REC (Recuperação 24 h após irrigação; Ψ
t
= -
1,3 a -1,9 MPa) Valores são apresentados por médias ± erro padrão (n=4). Letras
maiúsculas comparam plantas controle e transgênicas e letras minúsculas comparam as
condições de suprimento hídrico. Letras iguais não apresentam diferença pelo teste
Tukey a 5% de probabilidade.
64
4.3.2 Relações hídricas na folha
Em condições normais de suprimento de água, plantas controle não
transformadas e transgênicas apresentaram potencial hídrico total de -1,3 MPa
(Figura 3A). Nove dias após a suspensão da irrigação houve queda no potencial
hídrico total de ambas as plantas. Nesse dia, entretanto, as controle
apresentaram menores valores (Ψ
t
= -2,5 MPa), já também atingindo valores nulos
de potencial de pressão, o que indica perda de turgor celular (Figura 5C). A partir
desse dia, houve queda acentuada do potencial total em plantas controle, com o
valor de -4,5 MPa no 14º dia de suspensão hídrica, ponto em que estas foram
novamente irrigadas (Figura 5A).
Em relação às plantas transgênicas com alto acúmulo de prolina, a mesma
queda no potencial total ocorreu a partir do 10º dia sem irrigação (Ψ
t
= -2,3 MPa),
entretanto, estas plantas tiveram potencial de pressão nulo somente no 12º dia
(Figura 5A,C). As folhas destas plantas apresentaram potencial total de -4,5 MPa
no 16º dia de restrição hídrica. Após 24 h do momento da re-irrigação, o potencial
hídrico total de plantas controle e transgênicas foi restabelecido em valores de -
1,9 e -1,3 MPa, respectivamente.
Plantas controle e transgênicas apresentaram praticamente o mesmo valor
de potencial osmótico na condição irrigada (Ψ
s
= -1,5 a -1,6 MPa) e nove dias após
a suspensão da irrigação (Ψ
s
= -2,4 a -2,5 MPa) (Figura 5B). A partir do 10º dia,
porém, o potencial osmótico de plantas controle não transformadas continuou em
queda, apresentando valores mínimos de cerca de -4,0 MPa, ponto a partir do
qual estas foram re-irrigadas. Em plantas transgênicas, o potencial osmótico
estabilizou do nono para o 10º dia de restrição hídrica, apresentando gradual
diminuição do 13º ao 16º dia, quando atingiu valores mínimos de
aproximadamente -4,0 MPa. Os potenciais osmóticos de plantas controle e
transgênicas 24 h após a irrigação para recuperação das plantas foram de -2,2 e -
1,6 MPa, respectivamente.
Enquanto as plantas controle apresentaram perda de turgescência aos
nove dias após a suspensão da irrigação (potencial de pressão inferior a zero),
esta condição, em plantas transformadas, foi atingida no 12º dia após o corte do
fornecimento da água.
65
Potencial hídrico total (MPa)
-6
-5
-4
-3
-2
-1
0
Potencial osmótico (MPa)
-5
-4
-3
-2
-1
Dias
0 9 10 11 12 13 14 15 16 17
Potencial de pressão (MPa)
-1,0
-0,5
0,0
0,5
Controle
Transgênica
A
B
C
FIGURA 04 - A) Potencial hídrico total; B) Potencial osmótico; e C) Potencial de pressão
em plantas transgênicas contendo o gene P5CSF129A e plantas controle não
transformadas, durante o período de restrição hídrica. Valores são apresentados por
médias ± erro padrão (n=4).
66
4.3.3 Fotossíntese líquida, transpiração, condutância estomática e eficiência do
uso de água
A taxa fotossintética líquida obtida na condição irrigada foi similar em
plantas controle não transformadas e em transgênicas com alto acúmulo de
prolina, com valores de aproximadamente 13 µmol CO
2
.m
-2
.s
-1
(Figura 6A). Nove
dias após a suspensão da irrigação, em plantas transgênicas foram mantidos os
valores iniciais, porém houve queda significativa nas taxas fotossintéticas de
plantas controle não transformadas (A=8,3 µmol CO
2
.m
-2
.s
-1
), que continuaram a
apresentar decréscimo da fotossíntese até o 12º dia. Nos dias subsequentes até o
final do período de restrição de água, as taxas fotossintéticas em plantas controle
foram mantidas constantes, com cerca de 1,5 µmol CO
2
.m
-2
.s
-1
, sendo que dois
dias após a re-irrigação a fotossíntese foi restabelecida, com valores de
aproximadamente 11 µmol CO
2
.m
-2
.s
-1
. As plantas transgênicas também
apresentaram queda expressiva da fotossíntese a partir do décimo dia, com
valores de 8,5 µmol CO
2
.m
-2
.s
-1
. Houve estabilização das taxas fotossintéticas no
13º dia, com 2,5 µmol CO
2
.m
-2
.s
-1
. Após a re-irrigação, que ocorreu no 16º dia, as
plantas transgênicas apresentaram valores de fotossíntese líquida observados em
condições normais de suprimento de água.
Nas condições iniciais, as taxas de transpiração foram praticamente as
mesmas em plantas controle e transgênicas, com valores em torno de 6,5 mmol
H
2
O.m
-2
.s
-1
(Figura 6B). Logo no nono dia de restrição hídrica, houve queda
expressiva na transpiração de plantas controle não transformadas, o que ocorreu
em plantas transgênicas somente no 11º dia após a suspensão da irrigação. Em
ambas as plantas, as taxas de transpiração se estabilizaram no 13º dia, com
valores mínimos de aproximadamente 2,0 mmol H
2
O.m
-2
.s
-1
. Após a re-irrigação,
a transpiração foi restabelecida em valores similares aos obtidos na condição
normal de suprimento de água.
Os valores de eficiência do uso de água (EUA) relacionam as taxas
fotossintéticas e transpiratórias, e conferem um indicativo da quantidade de
carbono fixado durante a fotossíntese por unidade de água transpirada. O valor
inicial para este parâmetro foi ligeiramente maior em plantas controle do que em
transgênicas, com 2,1 e 1,8 µmol CO
2
.mmol H
2
O
-1
, respectivamente
(Figura 6C).
67
No décimo dia após a suspensão da irrigação, entretanto, a EUA de plantas
controle apresentou queda acentuada, atingindo aproximadamente 0,8 µmol
CO
2
.mmol H
2
O
-1
, valor obtido em plantas transgênicas no 12º dia sem suprimento
de água. Diferentemente de plantas controle, que mantiveram a EUA
praticamente constante até o final do período de restrição hídrica, plantas
transgênicas apresentaram leve aumento dos valores de EUA nesse período.
Após a re-irrigação, a EUA em ambas as plantas foi de cerca de 1,5 µmol
CO
2
.mmol H
2
O
-1
.
Assim como a fotossíntese e a transpiração, a condutância estomática na
condição irrigada foi similar entre plantas controle e transgênicas, apresentando
valores médios de 0,16 mol.m
-2
.s
-1
(Figura 7). No nono dia após a suspensão da
irrigação, houve queda acentuada da condutância estomática nas plantas controle
(g
s
=0,02 mol.m
-2
.s
-1
), que apresentaram valores mínimos de aproximadamente
0,01 mol.m
-2
.s
-1
nos dias subsequentes até o final do período de restrição hídrica.
Após a re-irrigação, a condutância estomática em folhas dessas plantas foi de
0,12 mol.m
-2
.s
-1
.
A queda na condutância estomática em folhas de plantas transgênicas foi
observada somente a partir do décimo dia de restrição hídrica, apresentando
nesse ponto valor de 0,05 mol.m
-2
.s
-1
. Nestas plantas houve decréscimo na
condutância estomática até o 12º dia, a partir do qual esta se estabilizou,
apresentando valores mínimos superiores aos das plantas controle nas mesmas
condições. Após a re-irrigação, plantas transgênicas apresentaram valores de
condutância estomática de aproximadamente 0,10 mol.m
-2
.s
-1
.
68
Dias
0 9 10 11 12 13 14 16 17
EUA (umol CO
2
. mmol H
2
O
-1
)
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Controle
Transgênica
A ( µmol CO
2
m
-2
s
-1
)
2
4
6
8
10
12
14
16
E (mmol. m
-2
s
-1
)
2
4
6
8
10
A
B
C
FIGURA 05 - A) Fotossíntese líquida; B) Transpiração; e C) Eficiência do uso de água
(EUA) em plantas transgênicas contendo o gene P5CSF129A e plantas controle não
transformadas, durante o período de déficit hídrico. Valores são apresentados por médias
± erro padrão (n=4).
69
Dias
0 8 9 1011121314151617
g
s
(mol H
2
O.m
-2
.s
-1
)
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
Controle
Transgênica
FIGURA 06 - Condutância estomática em plantas transgênicas contendo o gene
P5CSF129A e plantas controle não transformadas, durante o período de restrição hídrica.
Valores são apresentados por médias ± erro padrão (n=4).
4.3.4 Fluxo de seiva
Os valores apresentados na figura 07 referem-se ao fluxo diário de água
pelo xilema das plantas durante o período de restrição hídrica. No início do
experimento, o fluxo de seiva em plantas controle e transgênicas foi similar. O
mesmo padrão foi observado até o sétimo dia sem irrigação. No oitavo dia,
mesmo com alta demanda evaporativa indicada pela elevada incidência de
radiação fotossinteticamente ativa (RFA), plantas controle tiveram redução no
fluxo de seiva, o que não ocorreu em plantas transgênicas. No nono dia após a
suspensão da irrigação, houve queda no fluxo em ambas as plantas, sendo que
as controle não transformadas apresentaram nesse dia metade do fluxo
observado em plantas transgênicas.
Após 10 dias de restrição de água, o fluxo de seiva no xilema nas plantas
controle manteve-se relativamente estabilizado em valores baixos até o final do
período de restrição de água, sendo que um dia após a reidratação destas plantas
o fluxo aumentou. Em plantas transgênicas, o fluxo de seiva manteve-se baixo a
partir do 11º dia sem irrigação até o final do período de estresse. Após a irrigação,
70
o fluxo nestas plantas aumentou mesmo levando-se em consideração a baixa
RFA observada nesse dia.
Dias
0 2 4 6 8 1012141618
Fluxo (mL. dia
-1
)
-100
0
100
200
300
400
500
600
RFA (umol. m
-2
.s
-1
)
100
150
200
250
300
350
400
450
Controle
Transgênica
RFA
FIGURA 07 - Fluxo de seiva xilemática em plantas transgênicas contendo o gene
P5CSF129A e em plantas controle não transformadas, durante o período de restrição
hídrica. Valores são apresentados por médias ± erro padrão (n=4). RFA: Radiação
fotossinteticamente ativa.
71
4.4 DISCUSSÃO
O acúmulo de prolina em plantas representa uma importante resposta
adaptativa a estresses abióticos, principalmente devido à sua propriedade
osmoprotetora. Durante situações de seca e alta salinidade, o seu acúmulo reduz
a osmolaridade da célula, promovendo o influxo de água, que por sua vez
promove a manutenção do turgor necessário para a expansão celular e aumento
da rigidez mecânica de células e tecidos (KAVI KISHOR et al., 2005). Diversos
trabalhos associam o acúmulo de níveis elevados de prolina e a tolerância a
estresses osmóticos, como seca e salinidade (HONG et al., 2000).
De fato, plantas transgênicas de citrumelo ‘Swingle’ contendo elevados
teores de prolina apresentaram maior tolerância ao déficit hídrico do que plantas
controle não transformadas. Isso pode ser demonstrado por valores positivos do
potencial de pressão obtidos em folhas de plantas transgênicas até o 12º dia após
a suspensão da irrigação (Figura 4C). A presença de altos níveis de prolina
nessas plantas provavelmente contribuiu para a ocorrência de ajustamento
osmótico, o que não foi observado em plantas controle. Nestas, houve redução
passiva do potencial osmótico (Figura 4B), resultante da perda de água das
células, cujos potenciais de pressão anularam-se logo no nono dia de restrição
hídrica. Esses resultados estão de acordo com os obtidos por Molinari et al.
(2004a), que constataram a presença de ajustamento osmótico durante o déficit
hídrico em plantas transgênicas de citrange ‘Carrizo’ com elevado acúmulo de
prolina.
O principal fator que leva à queda de taxas fotossintéticas durante o déficit
hídrico é a reduzida difusão do CO
2
atmosférico ao sítio de carboxilação (FLEXAS
et al., 2006), em parte devido ao fechamento dos estômatos. A condutância
estomática em plantas transgênicas se manteve superior à observada em plantas
controle, principalmente nos 10 primeiros dias após a suspensão da irrigação
(Figura 6). Os valores obtidos são indicativos de uma maior manutenção da
abertura dos estômatos, o que por sua vez possibilitou melhor desempenho
fotossintético em plantas transgênicas.
Alguns trabalhos contestam o papel benéfico da prolina relacionada à
fotossíntese. Sivakumar et al. (1998) demonstraram que a aplicação exógena de
72
100 mM de prolina suprimiu a atividade da Rubisco em plântulas de mostarda,
Sesbania sesban e arroz, e essa atividade foi reduzida em até 50% quando em
presença de 1 M prolina. A enzima foi sensível ao estresse por NaCl e a prolina
parece ter acelerado a inatividade da Rubisco nessa situação. Além deste, outros
trabalhos sugerem que a presença do aminoácido em concentrações milimolares
tem efeitos tóxicos para membranas de cloroplastos e mitocôndrias como, por
exemplo, em arabidopsis (HARE et al., 2001). Por outro lado, a aplicação de 200
mM de prolina em plantas de Tamarix jordanis sob estresse salino aliviou a
inibição da atividade da Rubisco (SOLOMON et al., 1994). Além disso, plantas
transgênicas de tabaco com alto acúmulo de prolina não mostraram danos em
estruturas subcelulares como cloroplastos e mitocôndrias através de microscopia
eletrônica de varredura (BORGO, 2004).
Estes resultados divergem primariamente devido à forma de utilização do
aminoácido (manipulação exógena ou endógena), à variação da concentração de
prolina aplicada e principalmente devido às espécies vegetais utilizadas, uma vez
que cada uma apresenta um determinado potencial de acúmulo e degradação da
prolina, sem que haja custos metabólicos para a planta. Folhas de tabaco, por
exemplo, acumulam naturalmente cerca de 4 μM. gMF
-1
(HONG et al., 2000),
enquanto que em folhas de citros em condições irrigadas foram detectados até
mais de 200 μM. gMF
-1
(MOLINARI et al., 2004).
Apesar de não terem sido realizadas análises da ultra-estrutura de
organelas e a determinação da atividade da Rubisco, neste estudo provavelmente
não houve repressão da atividade da Rubisco nem danos em cloroplastos pela
prolina presente nos tecidos de plantas transgênicas, já que estas apresentaram
maiores taxas fotossintéticas observadas em relação às controle não
transformadas durante a restrição hídrica (Figura 5A).
Assim como a fotossíntese, a transpiração também foi afetada pela
condutância estomática. Plantas transgênicas apresentaram queda nas taxas
transpiratórias no 11º dia após a suspensão da irrigação, enquanto que em
plantas controle não transformadas isso foi observado já no nono dia (Figura 5B).
A amplitude da diferença entre as taxas transpiratórias de plantas controle e
transgênicas, porém, foi menor do que a observada em relação às taxas
fotossintéticas, e os resultados de eficiência do uso da água (EUA) demonstram
73
esta variação. Menores valores da EUA de plantas controle a partir do nono dia
de restrição hídrica indicaram que houve menor assimilação de CO
2
por unidade
de H
2
O transpirada do que em plantas transgênicas, mesmo em condições
similares de transpiração observadas a partir do 11º dia (Figura 5C). Isto pode ser
consequência de limitações impostas pela deficiência hídrica na atividade
metabólica da fotossíntese em plantas controle. Por outro lado, a manutenção da
EUA em plantas transgênicas provavelmente ocorreu devido à presença da
prolina em folhas destas plantas, o que favoreceu a assimilação de CO
2
com
melhor aproveitamento da água.
Além de contribuir para o ajustamento osmótico, os elevados teores de
prolina presentes em plantas transgênicas de citrumelo ‘Swingle’ podem ter
desempenhado um papel adicional de proteção das plantas durante o déficit
hídrico. A biossíntese de prolina a partir do glutamato envolve a utilização de
poder redutor (NADPH) e energia química (ATP) que não são consumidos devido
à redução da disponibilidade de CO
2
intracelular em folhas estressadas (HARE;
CRESS, 1997). Ainda, a prolina pode ter contribuído para a estabilização de
proteínas (VANRENSBURG et al., 1993), como enzimas envolvidas nas reações
fotossintéticas, além de remover radicais livres que prejudicam o transporte de
elétrons (SMIRNOFF; CUMBES, 1989).
74
4.5 CONCLUSÕES
A presença de elevados níveis endógenos de prolina confere maior
tolerância ao déficit hídrico em plantas transgênicas de citrumelo ‘Swingle’ do que
em plantas não transformadas, devido à contribuição do aminoácido para a
ocorrência de ajustamento osmótico e consequente manutenção da turgescência
das folhas. Esta manutenção de turgor em plantas transgênicas ainda influencia a
condutância estomática, resultando em melhor desempenho fotossintético e de
eficiência do uso da água nestas plantas do que em plantas controle não
transformadas.
75
4.6 REFERÊNCIAS
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1
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81
5 ARTIGO
Atividade de enzimas antioxidantes em plantas de citrumelo ‘Swingle’
transgênicas com alto acúmulo de prolina em resposta ao déficit
hídrico
82
RESUMO
O déficit hídrico é um dos principais fatores abióticos que afetam o desempenho
de diversas espécies cultivadas em todo o mundo. Em plantas, o déficit hídrico
induz a produção de espécies reativas de oxigênio (ROS) como íons superóxido,
peróxido de hidrogênio e radicais hidroxil, que prejudicam o metabolismo celular
através da oxidação de membranas lipídicas, proteínas e ácidos nucléicos.
Sistemas antioxidantes são conhecidos por atenuar os efeitos do estresse
oxidativo, como as enzimas superóxido dismutase (SOD), catalase (CAT) e
ascorbato peroxidase (APX), assim como antioxidantes não enzimáticos. Em
resposta a estresses abióticos, plantas acumulam osmoprotetores, como o
aminoácido prolina, que desempenha um papel importante no ajustamento
osmótico e remoção de radicais livres. Neste trabalho foi avaliado o efeito da
prolina na atividade das enzimas antioxidantes SOD, CAT e APX em plantas
transgênicas do porta-enxerto para citros citrumelo ‘Swingle’ contendo o gene
mutante P5CSF129A, que codifica para a enzima-chave da biossíntese de
prolina, submetidas ao déficit hídrico. Plantas controle não transformadas e
plantas transgênicas foram submetidas a um período de 14 e 16 dias sem
irrigação, respectivamente. Os pontos de coleta foram determinados a partir de
medidas de potencial total de água, que representaram os seguintes níveis de
estresse: Sem estresse (SE; Ψ
t
= -1,3 MPa), estresse moderado (EM; Ψ
t
= -2,3 a -
2,5 MPa), estresse severo (ES; Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa) e recuperação (REC; 24 h
após re-irrigação; Ψ
t
= -1,3 a -1,9 MPa). Folhas foram submetidas às
quantificações de prolina, malondialdeído (MDA), antioxidantes totais e das
atividades das enzimas CAT, SOD e APX. Plantas transgênicas apresentaram
valores 2,5 vezes maiores de prolina do que em plantas controle nas condições
sem estresse e estresse moderado, sendo que plantas controle atingiram níveis
similares somente no estresse severo. Os níveis de MDA foram significativamente
maiores em plantas controle do que em transgênicas nas condições de estresse
moderado e severo. O conteúdo de antioxidantes totais aumentou com o estresse
severo, porém não houve diferença entre plantas controle e transgênicas. O
mesmo comportamento foi observado nas atividades da SOD e APX, que
apresentaram redução durante o déficit hídrico em maior proporção em plantas
controle, seguida de elevação 24 h após a reidratação. A CAT foi mais ativa em
plantas controle do que em transgênicas em todos os pontos de coleta. A
atividade desta enzima aumentou significativamente durante o período de
estresse, tendo redução durante a recuperação. Estes resultados sugerem que a
prolina desempenha um importante papel no combate ao estresse oxidativo por
atuar diretamente na proteção contra a peroxidação lipídica induzida pelo déficit
hídrico. Além disso, ela influencia a atividade de enzimas antioxidantes,
provavelmente devido ao seu papel estabilizador de proteínas e removedor de
radicais livres.
Palavras-chave: Estresse oxidativo; remoção de ROS; P5CS; tolerância à seca.
83
Antioxidant enzymatic activity in transgenic ‘Swingle’ citrumelo
overaccumulating proline under drought stress
ABSTRACT
Water deficit is one of the major abiotic factors affecting agriculture in different
areas in the world. In plants, drought stress leads to the accumulation of reactive
oxygen species (ROS), such as superoxide, hydrogen peroxide and hydroxyl
radicals, which initiate destructive oxidative processes in lipid membranes,
proteins and nucleic acids. In order to cope with oxidative stress, plants developed
antioxidant defenses, including enzymatic activity of superoxide dismutase (SOD),
catalase (CAT), ascorbate peroxidase (APX), and non-enzymatic compounds.
Water deficit also induces the production and accumulation of osmolytes, such as
proline, which plays an important role in osmotic adjustment and ROS scavenging.
This study investigated proline effect in SOD, APX and CAT activities in leaves of
‘Swingle’ citrumelo rootstocks transformed with the P5CSF129A gene, coding for
the key-enzyme for proline synthesis, under drought stress. Non-transformed
control and transgenic plants were submitted to a 14 and 16-day period without
irrigation, respectively. Leaves were collected based on their total water potential,
representing the following stress levels: Irrigated (SE; Ψ
t
= -1.3 MPa), moderate
stress (EM; Ψ
t
= -2.3 to -2.5 MPa), severe stress (ES; Ψ
t
= -3.8 to -3.9 MPa) and
recovery (REC; 24 h after rehydration; Ψ
t
= -1.3 to -1.9 MPa). Proline, MDA and
total antioxidant contents were quantified in leaves, and CAT, SOD and APX
activities were also evaluated. Transgenic plants accumulated 2.5-fold higher
proline content than non-transformed control plants in the SE and EM conditions.
During the ES, control plants presented similar proline levels observed in
transgenic leaves. MDA content was significantly higher in control plants during
water deficit, in comparison to transgenic plants. Total antioxidant increased in ES
condition, but no difference was observed between control and transgenic plants.
Both APX and SOD activities decreased during moderate and severe stress, in
higher amount in control plants, with a following increase 24 h after rehydration.
CAT was more active in control than in transgenic plants in all stress levels; CAT
activity increased significantly during the stress period, decreasing after recovery.
These results suggest that proline plays an important role during oxidative stress
by acting directly in water deficit induced lipid peroxidation. Besides, proline
influences antioxidant enzyme activities, probably either by its protein stabilization
or ROS scavenging functions.
Key-words: Oxidative stress; ROS scavenger; P5CS; drought tolerance.
84
5.1 INTRODUÇÃO
Os citros são as frutas mais cultivadas mundialmente, sendo produzidas
em mais de 140 países (FAO, 2004). O setor citrícola brasileiro apresenta
números expressivos que traduzem a grande importância econômica e social que
a atividade tem para a economia do país (NEVES; JANK, 2006). Os porta-
enxertos influenciam diretamente diversos aspectos fisiológicos e de
desenvolvimento da copa, assim como conferem tolerância a pragas, doenças e
estresses ambientais (POMPEU JUNIOR, 2005). A utilização em larga escala de
limão ‘Cravo’, presente em 80% dos pomares, representa uma vulnerabilidade da
citricultura brasileira devido aos potenciais riscos causados por mudanças
climáticas ou pelo surgimento de novas doenças, como foi o caso da Morte Súbita
dos Citros (MSC), o que torna necessário o processo de diversificação de
germoplasma. Dentre os principais porta-enxertos alternativos ao limão ‘Cravo’, o
citrumelo ‘Swingle’ apresenta vantagens como a tolerância à MSC, porém é
sensível à seca (FUNDECITRUS, 2003).
Apesar das regiões citrícolas brasileiras apresentarem boa distribuição de
chuvas (DOORENBOS; KASSAM, 1994), períodos de déficit hídrico são
frequentes e prejudicam a cultura em diferentes aspectos (ORTOLANI, et al.,
1991). O fechamento dos estômatos em plantas estressadas leva à diminuição
nas taxas fotossintéticas e de crescimento. A abscisão de folhas, frutos e flores
(SENTELHAS, 2005), além do agravamento de danos causados por doenças
como o declínio (BERGUER, 1998) e a CVC (MEDINA, 2002; MACHADO et al.,
2007), também são fatores que afetam a produtividade durante a seca.
Em plantas, a resposta ao estresse inicia-se a partir da percepção do baixo
potencial hídrico nas membranas celulares, que desencadeia uma série de
eventos envolvidos na ativação de genes e síntese de compostos que induzem
uma série de modificações bioquímicas e fisiológicas. Durante o estresse, ocorre
diminuição da condutância estomática e aumento no comprimento das raízes, de
forma a melhorar o desempenho das espécies cultivadas. Porém, há menor
captação de CO
2
devido ao fechamento dos estômatos, e a energia requerida
para o crescimento de raízes é desviada de tecidos fotossintéticos e reprodutivos.
Em casos de deficiência hídrica severa, os mecanismos citados não oferecem
85
mais proteção contra os efeitos do baixo potencial hídrico (VERSLUES et al.,
2006). Como forma de tolerância, as plantas devem evitar a dessecação celular,
promovendo o influxo de água, através do acúmulo de solutos na célula, que
reduz o potencial osmótico, em processo denominado ajustamento osmótico
(ZHANG et al., 1999).
Danos causados pelo déficit hídrico induzem o estresse oxidativo, resultado
da produção e acúmulo de espécies reativas de oxigênio (ROS), como o oxigênio
singleto (
1
O
2
), radical superóxido (O
2
⋅-
), peróxido de hidrogênio (H
2
O
2
) e radical
hidroxil (OH
-
) (HALLIWELL; GUTTERIDGE, 2006). Essas ROS afetam o
metabolismo de plantas através da oxidação de membranas lipídicas, proteínas e
ácidos nucléicos, além de inibir processos fisiológicos como fotossíntese e
respiração, podendo acarretar em morte celular (SCANDALIOS, 2005).
Para minimizar os danos causados pelo estresse oxidativo, as plantas
desenvolveram múltiplas linhas de defesa que incluem sistemas antioxidantes
enzimáticos e não-enzimáticos. A enzima superóxido dismutase (SOD), por
exemplo, catalisa O
2
⋅-
em H
2
O
2
e O
2
, e as enzimas catalase (CAT) e ascorbato
peroxidase (APX) apresentam função de remover H
2
O
2
(PERL-TREVES; PERL,
2002). Entretanto, o funcionamento desses sistemas pode ser interrompido em
condições de estresse, como o déficit hídrico, induzindo maior acúmulo de ROS.
Essa situação requer mecanismos que amenizem o processo autocatalítico
sofrido pelas plantas (SCANDALIOS, 2005).
Durante estresses abióticos, ocorre acúmulo do aminoácido prolina,
adicionalmente à ativação da atividade de enzimas antioxidantes. Dentre os
diversos papéis que a prolina exerce na célula, incluindo a mediação do
ajustamento osmótico e estabilização de proteínas (VAN RENSBURG et al.,
1993), ela promove a proteção contra o estresse oxidativo por remover radicais
livres com eficiência e por ativar enzimas antioxidantes (SMIRNOFF; CUMBES,
1989). A principal via de síntese da prolina durante o estresse ocorre com a
conversão do glutamato a ácido glutâmico - γ - semialdeído (GSA) pela enzima Δ
1
- pirrolina - 5 - carboxilato sintetase (P5CS). O GSA é convertido
espontaneamente a Δ
1
- pirrolina - 5 - carboxilato (P5C), que é reduzido à prolina
pela P5C redutase (P5CR) (DELAUNEY; VERMA, 1993). A P5CS é limitante na
biossíntese da prolina, cujo acúmulo inibe a atividade da enzima (ZHANG et al.,
86
1995). Estes mesmos autores observaram que a enzima mutante P5CSF129A de
Vigna aconitifolia apresenta as mesmas características da P5CS, porém não é
inibida pela prolina, promovendo maior acúmulo do aminoácido nos tecidos.
Esta e outras enzimas envolvidas no metabolismo de prolina vêm sendo
utilizadas em estudos de tolerância a diferentes estresses, como seca e
salinidade (KAVI KISHOR et al., 1995; ZHU et al, 1998; HONG et al., 2000;
NANJO et al., 1999; DE RONDE et al., 2004; HMIDA-SAYARI et al., 2005). Além
disso, nos últimos anos tem-se dado mais enfoque ao papel que a prolina exerce
na proteção contra o estresse oxidativo em diversos organismos (CHEN;
DICKMAN, 2005; JACQUET, 2002; TRIPATHI E GAUR 2004). Em plantas, a
manipulação de níveis endógenos e exógenos de prolina tem sido amplamente
explorada, resultando em dados importantes, porém, bastante variados,
principalmente ao avaliar o efeito da prolina nas atividades das enzimas
antioxidantes (KOCSY et al., 2005; HOQUE et al., 2007a; HOQUE et al., 2007b;
OZDEN et al., 2009).
A aplicação exógena de prolina aliviou os sintomas do estresse oxidativo
induzido por salinidade em células de tabaco (HOQUE et al., 2007a; 2007b; 2008)
devido à ativação de enzimas antioxidantes, como as do ciclo glutationa-
ascorbato (APX, monodeidroascorbato redutase - MDHAR e glutationa redutase -
GR) (HOQUE et al., 2007b), CAT e peroxidase (HOQUE et al., 2007a). O
emprego de prolina exógena também proporcionou um efeito positivo no sistema
antioxidante enzimático em folhas de videira, particularmente na ativação de APX
e peroxidase em resposta ao estresse oxidativo ocasionado pelo H
2
O
2
(OZDEN et
al., 2009).
O maior acúmulo de prolina obtido em plantas de soja transgênicas com o
gene P5CR na direção senso (S) conferiu menor porcentagem de danos e maior
conteúdo relativo de água do que plantas controle e antisenso (AS), após um
período de estresse térmico e déficit hídrico associado (KOCSY et al., 2005). Ao
avaliar aspectos dos sistemas antioxidantes, foi observado nesse trabalho que
não houve diferença na atividade de SOD entre as plantas e que as atividades de
APX e GR foram significativamente maiores nos transformantes AS. O maior nível
de ascorbato, associado à prolina acumulada nas plantas S parece ter sido
87
suficiente para a redução efetiva das ROS, não havendo participação das
enzimas antioxidantes nesse caso.
Molinari et al. (2007) observaram que o aumento da prolina presente em
plantas transgênicas de cana-de-açúcar submetidas ao déficit hídrico atuou mais
como um agente antioxidante do que como um osmoprotetor. Não houve
ajustamento osmótico nessas plantas em solos secos, porém elas apresentaram
melhor eficiência fotoquímica do PSII e maior conteúdo de clorofila do que plantas
controle não transformadas, dados que sustentam a hipótese de que a prolina
opera na proteção do aparato fotossintético através da remoção de radicais livres.
Por outro lado, plantas de citrange ‘Carrizo’ transgênicas contendo o gene
P5CSF129A acumularam cerca de cinco vezes mais prolina do que plantas não
transformadas (MOLINARI et al., 2004), e por isso apresentaram ajustamento
osmótico durante déficit hídrico, apresentando-se mais tolerantes do que as
plantas controle. Porém, nesse caso não foi avaliado o papel adicional da prolina
na proteção contra o estresse oxidativo.
O conhecimento do papel da prolina na remoção de ROS e ativação de
enzimas antioxidantes é baseado em estudos que utilizam altas aplicações
exógenas desse aminoácido. Poucos trabalhos abordam essas funções da prolina
em sistemas vegetais com elevada produção endógena (KOCSY et al., 2005;
MOLINARI et al., 2007). Além disso, as espécies utilizadas nestes trabalhos
caracterizam-se por naturalmente acumularem baixas concentrações de prolina,
em comparação às plantas de citros (NOLTE; HANSON, 1997).
O objetivo desse trabalho, portanto, foi avaliar as alterações na atividade
de enzimas antioxidantes em um modelo vegetal reconhecido por acumular alto
conteúdo de prolina. Para isso, foram utilizadas plantas transgênicas de citrumelo
‘Swingle’, porta-enxerto de citros que apresenta altos níveis de prolina nas folhas,
contendo o transgene P5CSF129A sob controle do promotor 35S CaMV. Nestas
plantas foram analisadas as atividades das enzimas superóxido dismutase,
ascorbato peroxidase e catalase, tanto em condições normais de suprimento de
água, como em resposta ao déficit hídrico.
88
5.2 MATERIAL E MÉTODOS
5.2.1 Coleta e acondicionamento do material vegetal
Os pontos de coleta do material foliar para análises bioquímicas foram
determinados pelas medidas de parâmetros hídricos, como potencial hídrico total
e conteúdo de água no substrato, obtidos no ensaio de tolerância ao estresse (p.
59). Cerca de cinco folhas em mesmo estágio de desenvolvimento de cada clone
de planta controle e do evento transgênico foram coletadas, imediatamente
imersas em N
2
líquido e transferidas para freezer a -80 ºC. A escolha dos pontos
a serem avaliados baseou-se nos valores de potencial total de água. As análises
foram realizadas em folhas de plantas controle e transgênicas quando estas
apresentaram potenciais hídricos similares, o que ocorreu em dias distintos após
o início do estresse. Dessa forma, foi possível analisar respostas das plantas em
condições de turgor semelhantes, permitindo a avaliação de todos os parâmetros
em nível celular.
Os tratamentos foram denominados ‘sem estresse’ (SE), ‘estresse
moderado’ (EM), ‘estresse severo’ (ES) e ‘recuperação’ (REC) e referem-se às
condições normais de suprimento de água (Ψ
t
= -1,3 MPa), estresse moderado (Ψ
t
= -2,3 a -2,5 MPa), estresse severo (Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa) e 24 h após a irrigação
efetuada depois das plantas atingirem o nível severo de estresse (Ψ
t
= -1,3 a -1,9
MPa), respectivamente. As repetições biológicas foram representadas por quatro
pools de folhas das plantas controle e quatro pools de folhas das plantas do
evento transgênico. Cada pool consistiu em uma folha de cada uma das cinco
plantas, juntamente maceradas em N
2
líquido nos respectivos pontos de coleta. O
material foliar macerado foi acondicionado em freezer -80 ºC até o momento das
análises.
5.2.2 Quantificação do teor de prolina
A determinação do teor de prolina foi feita baseada em metodologia
descrita por Bates (1973), com algumas modificações. Aproximadamente 30 mg
89
de tecido foliar previamente macerados em N
2
líquido foram homogeneizados em
6 mL de ácido sulfossalicílico 3% (p/v). Após centrifugação (7500 rpm) por 10 min,
2 mL do extrato foram coletados e adicionados a 2 mL de solução ácida de
ninhidrina (1,25 g de nihidrina; 30 mL de ácido acético glacial; 20 mL de ácido
fosfórico 6M) e 2 mL de ácido acético glacial, em tubos de microcentrífuga de 15
mL. As amostras foram incubadas a 100 ºC por 1 h e em seguida colocadas em
gelo para finalizar a reação. À solução foram adicionados 4 mL de tolueno,
seguindo de agitação por 20 s para a completa extração da prolina.
O sobrenadante foi utilizado para a leitura em espectrofotômetro a 520 nm
e as absorbâncias comparadas à curva-padrão de prolina (0 a 100 μg. mL
-1
). As
análises foram realizadas em triplicata e os resultados obtidos expressos em
micromol de prolina por grama de massa fresca (μmol. g MF
-1
).
5.2.3 Determinação do conteúdo de malondialdeído (MDA)
O malondialdeído, um produto secundário da oxidação de ácidos graxos
poli-insaturados, atua como um indicativo de peroxidação lipídica. A metodologia
utilizada para a quantificação de MDA baseou-se em protocolo descrito por Heath;
Packer (1968). Cerca de 100 mg de tecido foliar macerado foi homogeneizado em
6,5 mL de etanol 80% (v/v) e em seguida a solução foi centrifugada a 5200 rpm
por 10 min. Desse extrato foi coletado 1 mL e transferido para outro tubo de
microcentrífuga de 15 mL contendo 1 mL de ácido tiobarbitúrico (TBA) 0,65% (p/v)
em ácido tricloroacético (TCA) 20% (p/v). As amostras foram incubadas a 95 ºC
durante 25 min, transferidas para o gelo e centrifugadas novamente para realizar
leitura em espectrofotômetro nos comprimentos de onda de 532 nm e 600 nm.
Os equivalentes de MDA foram calculados através da seguinte
expressão:
Equivalentes MDA= [(A
532
-A
600
) / 155000] x 10
6
Onde A
532
indica a absorbância máxima do complexo MDA-TBA a 532 nm, A
600
é
a absorbância a 600 nm, que corrige interferentes não-especícficos e 155000 é o
90
coeficiente de extinção molar para o MDA. O ensaio foi realizado em triplicata e
os valores expressos em nanomol de MDA por grama de massa fresca (nmol.g
MF
-1
).
5.2.4 Determinação de antioxidantes totais
O método para determinação de antioxidantes totais foi realizado seguindo
Re et al. (1999), e fundamenta-se na captura do radical 2,2´-azinobis-3-
etilbenzotiazolina-6-ácido sulfônico (ABTS
+
), gerado através da reação entre
ABTS e persulfato de potássio. O cromóforo azul escuro apresentado pelo radical
é consumido na medida em que os antioxidantes presentes nas amostras
reduzem o ABTS
+
a ABTS.
Para a obtenção dos extratos, 100 mg de tecido foliar macerado foram
homogeneizados em 2 mL de metanol 50% (v/v), em tubos de microcentrífuga de
15 mL. A solução foi mantida em temperatura ambiente por 1 h e centrifugada a
9500 rpm por 15 min. O sobrenadante foi transferido para um novo tubo e
reservado, e ao precipitado foram adicionados 2 mL de acetona 70% (v/v),
incubando por mais 1 h em temperatura ambiente, seguido de centrifugação. O
sobrenadante foi misturado à primeira solução e o volume completado para 5 mL
de água destilada.
O radical ABTS
+
foi preparado adicionando 88 μL de persulfato de potássio
140 mM em 5 mL de ABTS 7 mM. A solução foi mantida no escuro por 12-16 h
para a completa oxidação de ABTS em ABTS
+
, sendo posteriormente diluída em
etanol 100%, até atingir absorbância de 0,700 ( ± 0,020) em 734 nm. O ensaio foi
realizado com a adição de 10 μL do extrato em 1 mL da solução de radical ABTS
+
diluída e após 30 min a 30 ºC a absorbância foi determinada em
espectrofotômetro a 734 nm. Os resultados foram comparados com curva-padrão
de solução de Trolox em etanol (0 - 2 mM). As análises foram feitas em triplicata e
os valores expressos em milimol equivalentes de Trolox por grama de massa
fresca (mM equivalentes trolox.gMF
-1
).
91
5.2.5 Atividade de enzimas antioxidantes
5.2.5.1 Extração de proteínas
Aproximadamente 70 mg de tecido foliar macerado foram homogeneizados
em 2 mL tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 7,3), PVP 1% (p/v) e EDTA 0,1
mM, previamente resfriado a 4 ºC. Após centrifugação por 10 min a 4 ºC em 7500
rpm, o sobrenadante foi transferido a um novo tubo e mantido no gelo até o
momento das análises. Os extratos foram submetidos à quantificação de
proteínas totais, realizada pelo método Bradford (1976), utilizando albumina de
soro bovino (BSA 0 – 15 μg. μL
-1
) como padrão.
5.2.5.2 Atividade da superóxido dismutase (SOD)
A atividade de superóxido dismutase é medida através da habilidade da
enzima em inibir a redução fotoquímica do NBT (Nitroblue tetrazolium), que leva à
formação de um precipitado de cor azul denominado formazana. Íons superóxido
são responsáveis pela redução do NBT, sendo formados pela riboflavina
fotoquimicamente reduzida pela metionina a uma semiquinona, a qual doa um
elétron para o oxigênio, reduzindo-o a superóxido (BEAUCHAMP; FRIDOVICH,
1971).
Em tubos de ensaio cobertos com papel alumínio foram adicionados
sequencialmente 1660 μL de tampão de ensaio, que consiste em tampão fosfato
de potássio 50 mM (pH 7,8), EDTA 0,1 mM e metionina 13 mM, 200 μL de NBT
750 μM, 100 μL do extrato enzimático ou tampão de extração (para os brancos) e
40 μL riboflavina 1 mM. Os tubos foram descobertos (exceto o branco do escuro)
e transferidos a um aparato montado 30 cm abaixo de duas lâmpadas
fluorescentes de 20 W. Após 6 min de iluminação, a reação foi finalizada ao
apagar as lâmpadas e as amostras lidas em espectrofotômetro a 560 nm.
O branco do claro, que consiste em tampão de ensaio sem o extrato
enzimático submetido à iluminação, indica 100% da formação da formazana, ou
seja, a completa fotorredução do NBT pelo superóxido. Os valores foram
92
expressos em unidade de atividade por minuto por miligrama de proteína (UA.min
-
1
.mg proteína
-1
), sendo que uma unidade de atividade corresponde a 50% da
inibição da redução do NBT. As análises foram realizadas em triplicata.
5.2.5.3 Atividade da catalase (CAT)
A atividade da catalase foi determinada através do consumo de H
2
O
2
monitorado por espectrofotometria a 240 nm, considerando o coeficiente de
extinção molar do H
2
O
2
de 43,6 M
-1
.cm
-1
(PATTERSON et al., 1984). A solução de
reação consistiu em tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 7,3) e H
2
O
2
10,5 mM.
O ensaio teve início com a adição de 50 μL do extrato enzimático diluído contendo
20 μg de proteína à solução de reação, em cuveta de quartzo de 1,5 mL. Foi
realizada leitura em 240 nm imediatamente após a adição do extrato e novamente
após 2 min de reação.
A diferença na absorbância (ΔA
240
) foi multiplicada pelo coeficiente de
extinção molar do H
2
O
2
e a atividade da enzima expressa em milimol de H
2
O
2
consumido por minuto por miligrama de proteína (mmol H
2
O
2
.min
-1
.mg
proteína
-1
).
As análises foram realizadas em triplicata.
5.2.5.4 Atividade da ascorbato peroxidase (APX)
A enzima ascorbato peroxidase catalisa a redução de H
2
O
2
a H
2
O
através
da oxidação do ascorbato. A atividade de APX foi determinada seguindo
metodologia descrita por Nakano; Asada (1981), com algumas modificações. A
solução de reação consistiu em tampão fosfato de potássio 50 mM (pH 7,3), H
2
O
2
2 mM, ascorbato 0,5 mM e 100 μL do extrato enzimático. Foi realizada leitura em
espectrofotômetro a 290 nm, um minuto após a adição do H
2
O
2
no tampão
contendo ascorbato e o extrato enzimático.
Também foram realizadas leituras da solução de reação sem o extrato
enzimático (branco do reagente) e do tampão fosfato sem ascorbato, contendo
apenas H
2
O
2
2 mM e 100 μL do extrato de cada amostra (branco da amostra),
93
ambas em 290 nm, para correção dos cálculos. A análise foi realizada em
triplicata e os valores expressos em unidades de atividade por minuto por
miligrama de proteína (UA.min
-1
.mg proteína
-1
), sendo uma unidade de atividade
representada pela quantidade de enzima que catalisa a oxidação de um micromol
de ascorbato.
5.2.6 Análise estatística
O delineamento experimental foi inteiramente casualizado com quatro
repetições, em parcelas subdivididas no tempo. As duas parcelas foram
representadas pelas plantas controle e transgênicas e as quatro sub-parcelas
referiram-se às condições de suprimento hídrico (sem estresse, estresse
moderado, estresse severo e recuperação). Após análise de variância, as médias
foram comparadas por teste Tukey a 5% de probabilidade, utilizando o programa
SAS versão 6.4 (SAS, 1995).
94
5.3 RESULTADOS
5.3.1 Teor de prolina
O teor de prolina livre em folhas manteve-se constante em todas as
condições de suprimento hídrico em plantas transgênicas, apresentando valores
2,5 vezes maiores do que plantas controle nas condições sem estresse e estresse
moderado. Somente durante o estresse hídrico severo houve acúmulo
significativo de prolina em plantas controle, que atingiram os níveis obtidos em
plantas transgênicas com o gene P5CSF129A. Ainda em relação às plantas
controle, foi observada a redução no conteúdo do aminoácido durante a
recuperação em comparação ao tratamento estresse hídrico severo, mas com
concentração ainda quase duas vezes superior ao obtido em condição normal de
irrigação e sob estresse moderado (Figura 9).
Bb
Ba
Bc
Bc
Aa
Aa
Aa
Aa
0
100
200
300
400
500
600
SE EM ES REC
Prolina (umol.g MF
-1
)
Controle
Transgênica
FIGURA 08 - Teor de prolina livre em folhas de plantas controle não transformadas e de
plantas transgênicas contendo o gene
P5CSF129A em quatro condições de suprimento
hídrico: SE (Sem estresse;
Ψ
t
= -1,3 MPa), EM (Estresse moderado; Ψ
t
= -2,3 a -2,5 MPa),
ES (Estresse severo;
Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa), REC (Recuperação 24 h após irrigação; Ψ
t
= -
1,3 -1,9 MPa). Valores são apresentados por médias ± erro padrão (n=4). Letras
maiúsculas comparam plantas controle e transgênicas e letras minúsculas comparam as
condições de suprimento hídrico. Letras iguais não apresentam diferença pelo teste
Tukey a 5% de probabilidade.
95
5.3.2 Conteúdo de malondialdeído (MDA)
Os mesmos níveis de MDA foram obtidos em folhas de ambas as plantas
na condição irrigada. Com a imposição do estresse houve aumento significativo
de MDA em plantas controle, que atingiram uma quantidade cerca de duas vezes
maior no estresse hídrico severo, em comparação à condição normal de
suprimento de água (Figura 10). Durante a recuperação, essas plantas
apresentaram queda nos níveis de MDA, com valores similares à condição de
estresse moderado.
A elevação da peroxidação lipídica foi observada em plantas transgênicas
somente a partir do estresse hídrico severo, porém com níveis de MDA atingindo
cerca de 1,5 vezes mais do que na condição irrigada. Durante o estresse severo,
houve diferença significativa entre essas plantas e as controle não transformadas,
que apresentaram acúmulo 1,3 vezes maior quando comparadas às transgênicas
com alto acúmulo de prolina. Houve ligeira queda na quantidade de MDA em
plantas transgênicas no período de recuperação, sendo que estas apresentaram
valores similares aos das plantas controle não transformadas (Figura 10).
Ab
Aa
Ab
Ac
Aab
Ba
Bb
Ab
0
10
20
30
40
50
60
SE EM ES REC
MDA (nmol.g MF
-1
)
Controle
Transgênica
FIGURA 09 - Conteúdo de MDA em folhas de plantas controle não transformadas e de
plantas transgênicas contendo o gene
P5CSF129A em quatro condições de suprimento
hídrico: SE (Sem estresse;
Ψ
t
= -1,3 MPa), EM (Estresse moderado; Ψ
t
= -2,3 a -2,5 MPa),
ES (Estresse severo;
Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa), REC (Recuperação 24 h após irrigação; Ψ
t
= -
1,3 a -1,9 MPa). Valores são apresentados por médias ± erro padrão (n=4). Letras
maiúsculas comparam plantas controle e transgênicas e letras minúsculas comparam as
96
condições de suprimento hídrico. Letras iguais não apresentam diferença pelo teste
Tukey a 5% de probabilidade
.
5.3.3 Conteúdo de antioxidantes totais
Somente durante o estresse moderado, as plantas transgênicas com alta
produção de prolina apresentaram uma pequena, mas significativa, diferença na
quantidade de antioxidantes totais em relação às plantas controle. O estresse
hídrico severo resultou em um aumento significativo do acúmulo de antioxidantes
totais em ambas as plantas, que atingiram os mesmos níveis nessa condição.
Durante a recuperação, houve decréscimo tanto em controle quanto em
transgênicas, e ambas apresentaram valores similares de antioxidantes totais
(Figura 11).
Bb
Ab
Aa
Ab
Ab
Ab
Aa
Ab
0
2
4
6
8
10
12
14
SE EM ES REC
Antioxidantes totais (mM equiv. Trolox.g MF
-1
)
Controle
Transgênica
FIGURA 10 - Conteúdo de antioxidantes totais em folhas de plantas controle não
transformadas e de plantas transgênicas contendo o gene
P5CSF129A em quatro
condições de suprimento hídrico: SE (Sem estresse;
Ψ
t
= -1,3 MPa), EM (Estresse
moderado;
Ψ
t
= -2,3 a -2,5 MPa), ES (Estresse severo; Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa), REC
(Recuperação 24 h após irrigação;
Ψ
t
= -1,3 a -1,9 MPa). Valores são apresentados por
médias ± erro padrão (n=4). Letras maiúsculas comparam plantas controle e transgênicas
e letras minúsculas comparam as condições de suprimento hídrico. Letras iguais não
apresentam diferença pelo teste Tukey a 5% de probabilidade.
97
5.3.4 Atividade da superóxido dismutase (SOD)
A atividade da enzima SOD antes do início do estresse hídrico foi similar
em plantas controle e transgênicas. Durante o estresse moderado, houve queda
significativa da atividade em plantas controle, o que ocorreu em plantas
transgênicas com o gene P5CSF129A somente no estresse severo. Nesse
tratamento, foram obtidos os mesmos níveis de atividade da SOD em plantas
controle e transgênicas. Plantas transgênicas apresentaram maior atividade da
SOD durante a recuperação, tanto em relação aos outros níveis de estresse
hídrico como também em relação aos níveis de atividade observados nas plantas
controle (Figura 12).
Aa
Bb
Aab
Bab
Aa
Ac
Abc
Aab
0
5
10
15
20
25
30
35
40
SE EM ES REC
SOD (UA.mg de proteína
-1
)
Controle
Transgênica
FIGURA 11 - Atividade enzimática de SOD em folhas de plantas controle não
transformadas e de plantas transgênicas contendo o gene
P5CSF129A em quatro
condições de suprimento hídrico: SE (Sem estresse;
Ψ
t
= -1,3 MPa), EM (Estresse
moderado;
Ψ
t
= -2,3 a -2,5 MPa), ES (Estresse severo; Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa), REC
(Recuperação 24 h após irrigação;
Ψ
t
= -1,3 a -1,9 MPa). Valores são apresentados por
médias ± erro padrão (n=4). Letras maiúsculas comparam plantas controle e transgênicas
e letras minúsculas comparam as condições de suprimento hídrico. Letras iguais não
apresentam diferença pelo teste Tukey a 5% de probabilidade.
98
5.3.5 Atividade da catalase (CAT)
Plantas controle não transformadas apresentaram atividades
significativamente maiores da enzima CAT do que as observadas em plantas
transgênicas mesmo sob condições normais de suprimento de água. Esta
diferença foi observada durante os estresses moderado e severo, sendo que
nestes últimos tratamentos houve ainda um aumento significativo na atividade
enzimática em plantas controle em relação à condição inicial não estressada. Por
outro lado, em plantas transgênicas não houve alteração da atividade da CAT
com a submissão ao estresse hídrico, a não ser durante a recuperação. Nesta
condição, a atividade da CAT sofreu queda não somente em plantas transgênicas
como também nas plantas controle (Figura 13).
Ac
Aa
Aa
Ab
Ab
Ba
Ba
Ba
0,0
1,0
2,0
3,0
4,0
5,0
6,0
7,0
8,0
9,0
10,0
SE EM ES REC
CAT (mmol H
2
O
2 .
min
-1
.mg de proteína
-1
)
Controle
Transgênica
FIGURA 12 - Atividade enzimática da CAT em folhas de plantas controle não
transformadas e de plantas transgênicas contendo o gene
P5CSF129A em quatro
condições de suprimento hídrico: SE (Sem estresse;
Ψ
t
= -1,3 MPa), EM (Estresse
moderado;
Ψ
t
= -2,3 a -2,5 MPa), ES (Estresse severo; Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa), REC
(Recuperação 24 h após irrigação;
Ψ
t
= 1,3 a -1,9 MPa). Valores são apresentados por
médias ± erro padrão (n=4). Letras maiúsculas comparam plantas controle e transgênicas
e letras minúsculas comparam as condições de suprimento hídrico. Letras iguais não
apresentam diferença pelo teste Tukey a 5% de probabilidade.
99
5.3.6 Atividade da ascorbato peroxidase (APX)
A atividade da APX no início do experimento foi similar em plantas controle
e transgênicas com alto acúmulo de prolina. Em plantas controle houve queda na
atividade de APX com a imposição do estresse moderado, ponto em que valores
obtidos foram significativamente menores do que os observados nas plantas
transgênicas. Durante o estresse severo, porém, plantas controle mostraram um
aumento na atividade desta enzima. Na recuperação das plantas após o estresse
severo, as plantas não transformadas retornaram ao nível de atividade de APX
apresentado na condição normal de suprimento de água estabelecida no início do
experimento. Nesse ponto, a atividade da APX em plantas transgênicas com o
gene P5CS apresentou aumento significativo em relação às duas condições de
estresse hídrico (moderado e severo), sendo também maior do que em plantas
controle (Figura 14).
Ba
Aab
Bb
Aa
Aa
Ab
Ab
Aab
0
1
2
3
4
5
6
SE EM ES REC
APX (UA.min
-1
.mg de proteína
-1
)
Controle
Transgênica
FIGURA 13 - Atividade enzimática de APX em folhas de plantas controle não
transformadas e de plantas transgênicas contendo o gene
P5CSF129A em quatro
condições de suprimento hídrico: SE (Sem estresse;
Ψ
t
= -1,3 MPa), EM (Estresse
moderado;
Ψ
t
= -2,3 a -2,5 MPa), ES (Estresse severo; Ψ
t
= -3,8 a -3,9 MPa), REC
(Recuperação 24 h após irrigação;
Ψ
t
= -1,3 a -1,9 MPa). Valores são apresentados por
médias ± erro padrão (n=3). Letras maiúsculas comparam plantas controle e transgênicas
e letras minúsculas comparam as condições de suprimento hídrico. Letras iguais não
apresentam diferença pelo teste Tukey a 5% de probabilidade.
100
5.4 DISCUSSÃO
A relação entre a presença de prolina em tecidos vegetais e a proteção
contra o estresse oxidativo vem sendo demonstrada por diversos autores (HONG
et al., 2000; KOCSY et al., 2005; MOLINARI et al., 2007), entretanto, as espécies
vegetais utilizadas são conhecidas por naturalmente acumularem baixos níveis de
prolina em comparação às plantas de citros (KOCSY et al., 2005; MOLINARI et
al., 2007). Também, os estudos sobre os efeitos da prolina são baseados
essencialmente em experimentos que utilizam altas aplicações exógenas desse
aminoácido (HOQUE et al., 2007a; HOQUE et al., 2007b; OZDEN et al., 2009).
Este trabalho utilizou o porta-enxerto citrumelo ‘Swingle’, reconhecido por
sua alta capacidade de produção e acúmulo de prolina nas folhas mesmo em
condições não estressantes (NOLTE; HANSON, 1997). Além disto, a obtenção de
plantas transformadas deste híbrido contendo o gene mutante P5CSF1291 de V.
aconitifolia (ZHANG et al., 1995) possibilitou a obtenção de um evento de
transformação capaz de acumular até 500 μM. gMF
-1
de prolina livre nas folhas.
Assim, neste estudo foi avaliado o papel da prolina na proteção contra ROS e na
atividade de enzimas antioxidantes em um modelo vegetal com alta concentração
de prolina endógena submetidas a duas condições de déficit hídrico e após a
recuperação.
O elevado teor de prolina acumulado em plantas transgênicas de citrumelo
‘Swingle’ (2,5 vezes maior do que plantas não transformadas) apresentou papel
determinante na proteção contra o estresse oxidativo induzido por déficit hídrico.
Isto foi demonstrado pelo maior conteúdo de malondialdeído (MDA) obtido em
folhas de plantas controle não transformadas do que em plantas transgênicas
durante a imposição do estresse (Figura 09). O MDA é um produto secundário da
peroxidação de ácidos graxos poli-insaturados, processo mediado pelas espécies
reativas de oxigênio (ROS) (ILANGOVAN et al., 2006). A peroxidação lipídica
induz o aumento da permeabilidade de membranas, levando à perda de eletrólitos
e funções celulares. Aumentos nos níveis de MDA estão de acordo com
resultados obtidos em outros trabalhos (MORAN et al., 1994; PINHEIRO et al.,
2004; MOLINARI et al., 2007), e sustentam a hipótese de que a peroxidação
101
lipídica é induzida por déficit hídrico em sistemas vegetais que não apresentam
algum mecanismo de tolerância.
A alteração nos níveis de MDA em plantas controle ocorreu logo durante o
estresse moderado, atingindo valores máximos no estresse severo. As plantas
transgênicas, entretanto, tiveram os níveis de MDA elevados somente no estresse
severo, ainda com valores significativamente menores do que em plantas
controle. O alto teor de prolina em plantas transgênicas provavelmente atuou na
proteção contra a peroxidação lipídica, por ativar ou mesmo atuar diretamente na
remoção das ROS.
Ainda, cabe ressaltar a importância da expressão constitutiva do transgene
P5CSF129A pelo promotor CaMV 35S, uma vez que plantas transgênicas
mantiveram constantemente elevados os níveis de prolina, mesmo na condição
irrigada. O teor de prolina em plantas controle no estresse severo foi similar ao de
plantas transgênicas, e nem por isso houve redução nos níveis de MDA nessa
situação. Possivelmente, a prolina atuou na remoção dos radicais livres desde os
estágios iniciais do déficit hídrico, impedindo a ocorrência de danos celulares com
o prolongamento do estresse.
O aumento do teor da prolina observado em plantas controle durante o
estresse severo (Figura 08) ocorreu como uma resposta natural à imposição ao
estresse, já que a síntese da prolina é ativada em condições ambientais adversas
como a seca, salinidade, temperaturas extremas e radiação UV, entre outras
(DELAUNEY; VERMA, 1993). Além disto, a expressão de transcritos da enzima
prolina desidrogenase (PRODH), principal responsável pelo catabolismo deste
aminoácido, sofre repressão acentuada em condições de estresse, possibilitando
o acúmulo de prolina (VERBRUGGEN et al., 1996).
O gene P5CSF129A foi utilizado para transformar geneticamente plantas
de tabaco (HONG et al., 2000), que acumularam duas vezes mais prolina do que
plantas não transformadas. Quando cultivadas em presença de 200 mM NaCl,
plantas controle apresentaram maior acúmulo de MDA do que plantas
transgênicas. Esses autores também observaram que a aplicação exógena de
120 mM de prolina em células de tabaco não transgênicas aliviou os sintomas do
estresse oxidativo na mesma proporção do que em plantas sintetizando altos
níveis de prolina endogenamente. Entretanto, estes dados estão em desacordo
102
com o observado por Hare et al. (2002) em arabidopsis, que mostraram um efeito
tóxico da aplicação exógena de prolina avaliado pela degradação de cloroplastos
e mitocôndrias.
Ozden et al. (2009) também constataram uma relação inversa entre níveis
de prolina e MDA em folhas de videira submetidas ao estresse por H
2
O
2
. Ainda, o
acúmulo estresse-induzido de prolina em plantas transgênicas de cana-de-açúcar
resultou em menores níveis de MDA do que em plantas não transformadas, mais
uma vez constatando o importante papel da prolina na ação contra a peroxidação
lipídica (MOLINARI et al., 2007).
Os antioxidantes não-enzimáticos são acumulados em resposta ao
estresse oxidativo, e envolvem compostos com capacidade antioxidante
intrínseca como o ascorbato, o α-tocoferol, carotenóides, a glutationa e polióis ou
alcoóis de açúcar (PERL-TREVES; PERL, 2002). Houve elevação dos níveis
destes compostos durante o estresse hídrico severo em plantas de citrumelo
‘Swingle’, seguida por redução durante a recuperação. Entretanto, não houve
diferença no conteúdo de antioxidantes totais entre plantas controle não-
transformadas e transgênicas com alto acúmulo de prolina (Figura 10). Esse
resultado indica que a presença do aminoácido não interfere em sistemas
antioxidantes não-enzimáticos.
Diversos estudos demonstram ocorrer alterações na atividade das enzimas
antioxidantes de plantas em resposta à seca, frio, salinidade e metais pesados,
sugerindo que possa haver íntima relação do aumento dessas atividades à
tolerância aos estresses (LASCANO et al., 2001; KHANNA-CHOPRA; SELOTE,
2006). Ainda neste contexto, outros trabalhos relacionam essa tolerância à
influência que a prolina exerce na atividade das enzimas antioxidantes (KOCSY et
al., 2005; HOQUE et al., 2007a; HOQUE et al., 2007b; OZDEN et al., 2009).
A superóxido dismutase (SOD) atua como uma primeira barreira enzimática
contra o estresse oxidativo por converter o O
2
•−
em H
2
O
2
(FRIDOVICH, 1995).
Alguns trabalhos observaram aumento na atividade da SOD em resposta a
estresses abióticos como déficit hídrico (JUNG, 2004) e alagamento (ARBONA et
al., 2007) e outros constatam o inverso. A atividade da SOD em células de
tabaco, por exemplo, teve redução de aproximadamente 50% quando submetidas
103
ao estresse salino, com ou sem aplicação exógena de prolina (HOQUE et al.,
2007b).
A presença de prolina per se não alterou a atividade da SOD em plantas de
citrumelo ‘Swingle’, já que em condições normais de suprimento hídrico a
atividade da enzima foi similar entre plantas controle e transgênicas (Figura 11).
Porém, a prolina parece influenciar a atividade enzimática com a imposição do
estresse. Isso porque, em plantas controle, mesmo não havendo variação do teor
de prolina obtido na condição inicial, durante o estresse moderado houve queda
significativa na atividade da SOD e ligeiro aumento no estresse severo, ponto em
que se igualou à atividade observada em plantas transgênicas. É válido lembrar
que nesta situação o teor de prolina foi similar em ambas as plantas. Durante a
recuperação, a atividade aumentou significativamente em plantas transgênicas,
tanto em relação às controle quanto aos outros níveis de estresse. Kang e Saltveit
(2001) observaram um comportamento semelhante desta enzima em plântulas de
pepino previamente tratadas com choque térmico, o que lhes conferiu tolerância
ao frio. Quando submetidas a baixas temperaturas, estas tiveram pequena
alteração na atividade da SOD, com aumento significativo somente após a
recuperação.
Diferentemente da SOD, a atividade da catalase (CAT) nas folhas parece
ser diminuída por altos níveis de prolina livre mesmo em condições irrigadas.
Plantas transgênicas tiveram menor atividade da enzima do que plantas controle
não transformadas em todos os pontos de coleta. A atividade da CAT em plantas
controle se apresentou elevada durante o déficit hídrico, havendo significativa
redução 24 h após a irrigação. Plantas transgênicas com alto acúmulo de prolina
não apresentaram alterações na atividade da CAT, a não ser durante a
recuperação, quando houve significativa queda na atividade da enzima (Figura
12).
Esses resultados contrastam com os obtidos por Hoque et al. (2007a), que
observaram queda na atividade da CAT em células de tabaco submetidas a
estresse salino e aumento significativo na atividade enzimática nessas células
quando em presença de 20 mM de prolina exógena. Além de tratar-se de espécie
diferente da utilizada neste trabalho, convém ressaltar que a alta concentração de
prolina exógena utilizada por esses autores não é encontrada em células
104
vegetais. Altas doses de prolina exógena devem induzir a sua degradação em
mitocôndrias, ativando a cadeia de transporte de elétrons. Isso faz com que haja
um excesso de liberação de poder redutor que leva à geração de ROS, havendo
consequente necessidade de ativação de enzimas antioxidantes, como a CAT
(HARE et al., 2002).
A ascorbato peroxidase (APX), assim como a CAT, opera na remoção do
H
2
O
2
(PERL-TREVES; PERL, 2002). A atividade da APX apresentou
comportamento bastante semelhante ao da SOD em plantas de citrumelo
‘Swingle’. Na condição irrigada não houve diferença entre a atividade da enzima
em plantas controle e transgênicas. Com a imposição ao déficit hídrico moderado,
plantas controle tiveram decréscimo significativo na atividade da APX, seguido por
um leve aumento no estresse severo, quando níveis de prolina também se
elevaram nestas plantas. Plantas transgênicas, por outro lado, tiveram ligeira
queda na atividade da APX durante o estresse, havendo significativo aumento
durante a recuperação (Figura 13).
Resultados similares foram observados em plantas transgênicas de soja
expressando o gene P5CR nas orientações senso e antisenso submetidas ao
déficit hídrico. Tanto os transformantes senso com maior teor de prolina, quanto
plantas não transformadas apresentaram queda na atividade da APX durante o
estresse, com seguido aumento na recuperação. Porém, nesse caso, atividade da
enzima foi ligeiramente maior em plantas controle do que em plantas transgênicas
(KOCSY et al., 2005), sugerindo que a proteção contra o estresse oxidativo
ocorreu devido ao papel da prolina como removedor de ROS, não havendo, nesse
caso, participação de enzimas antioxidantes.
O aumento na atividade da APX muitas vezes é proporcional ao de outras
enzimas como a SOD, a CAT e a glutationa redutase (GR) em resposta a
diversos fatores ambientais, sugerindo uma co-regulação entre os componentes
dos sistemas de remoção de ROS (SHIGEOKA et al., 2002). Neste trabalho, uma
relação entre as atividades de APX e SOD foi de fato observada, porém a
atividade da CAT apresentou comportamento inverso ao das demais enzimas. O
íon superóxido produzido durante o estresse é convertido a H
2
O
2
espontaneamente ou pela atividade da SOD. Com a imposição do estresse, a
queda na atividade da SOD pode ter ocorrido devido ao acúmulo de H
2
O
2
(PERL-
105
TREVES; PERL, 2002), que por sua vez induz à elevação da atividade da CAT,
como foi observado nos estresses moderado e severo de plantas controle. A
manutenção da atividade dessa enzima em plantas transgênicas durante a
deficiência hídrica comprova que níveis elevados de prolina não induzem o
aumento da atividade da CAT, como demonstrado por Hoque et al. (2007a), e
essa estabilidade provavelmente ocorreu devido à remoção direta de ROS pelo
alto teor de prolina presente nessas plantas.
O período de recuperação ao estresse parece ser um estágio delicado que
pode ser acompanhado pelo estresse oxidativo, sendo requerida a indução dos
sistemas de defesa (MITTLER; ZILINSKAS, 1994). Alguns trabalhos utilizam essa
abordagem por observarem a ativação de enzimas antioxidantes somente após a
recuperação ao estresse por frio, por exemplo (KANG; SALTVEIT, 2001). Plantas
de citrumelo ‘Swingle’ apresentaram expressivo aumento na atividade de SOD e
APX 24 h após a irrigação, havendo, porém, significativa redução na atividade da
CAT. Isso provavelmente ocorreu devido a um mecanismo compensatório entre a
APX e a CAT, uma vez que ambas as enzimas apresentam função removedora
do H
2
O
2
resultante da atividade da SOD.
Essa ativação das enzimas durante a recuperação foi mais evidente em
plantas transgênicas superexpressando o gene P5CSF129A. Sabe-se que os
mecanismos de degradação da prolina são ativados após a recuperação ao
estresse, e que este processo leva à geração de poder redutor (HARE, 1998). O
catabolismo dos altos níveis de prolina em plantas transgênicas, portanto, pode
ter gerado NADPH
2
, que está intimamente ligado ao processo de regeneração do
ascorbato, substrato da APX (SHIGEOKA et al., 2002). Ainda, devido à sua
propriedade estabilizadora de proteínas (VAN RENSBURG et al., 1993), a prolina
presente em plantas transgênicas pode ter contribuído para a atividade de
enzimas, como a APX e SOD.
106
5.5 CONCLUSÕES
Os altos níveis de prolina em plantas transgênicas contribuem para a
proteção contra a peroxidação lipídica resultante do estresse oxidativo
induzido por déficit hídrico;
A prolina não interfere no acúmulo de antioxidantes não-enzimáticos;
As atividades das enzimas APX e SOD são influenciadas pela prolina
durante a imposição do déficit hídrico;
A atividade da CAT é reprimida pela prolina em condições normais de
suprimento hídrico e durante o déficit hídrico;
A prolina parece desempenhar um importante papel no processo de
recuperação ao déficit hídrico, por induzir um aumento na atividade da APX
e SOD.
107
5.6 REFERÊNCIAS
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