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ELAINE CRISTINA DA SILVA FANTINATTI
RELAÇÕES GENÉTICAS DE POPULAÇÕES DE Aedes aegypti Linnaeus, 1762
DO ESTADO DO PARANÁ
Dissertação apresentada à Coordenação do
Curso de Pós-Graduação em Ciências
Biológicas, Área de concentração em
Entomologia, da Universidade Federal do
Paraná, como requisito parcial para a
obtenção do Título de Mestre em Ciências
Biológicas.
Orientador: Dr. Mário A. Navarro da Silva
Co-orientador: Dra. Adriana Lacerda Twerdochlib
Curitiba
2009
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Às criaturas que, juntamente com Deus, me
concederam o direito à vida: meus pais.
iv
AGRADECIMENTOS
Primeiramente a Deus, por todos os instantes de minha vida, não há
palavras para agradecer.
À minha família, mãe, pai, irmão e sobrinha pela compreensão, apoio, amor.
E especialmente à meus pais por sempre terem sido meu porto seguro ao longo de
todo o trabalho e vida, em todos os momentos ao meu lado, auxiliando,
incentivando. Amo vocês!
Ao meu orientador. Dr. Mário Antonio Navarro da Silva e minha co-orientadora
Dra. Adriana Lacerda Twerdochlib pela oportunidade de trabalho e orientação.
Aos meus colegas de curso e amigos: Alessandre, Anderson (o ser mais
apavorado que já conheci), André, Caíto, Carolll (amiga querida companheira de ap),
Danilo, Fernando, Gabrielzinho (amigo mais animado do ap, o cantor da casa),
Netão, Marina (amiga querida de mil coisas), Thiago, Vanusa. Agradeço por todo
incentivo, apoio e por todos os momentos de diversão.
À colega e amiga Cecília Kosmann pela companhia em laboratório, ajuda em
diversas etapas e valiosas conversas sobre nossos trabalhos.
Aos colegas de laboratório, Ana Caroline, Betina, Carla, Daniel, Gisele,
Jonny, Rodrigo, Sullamy.
À amiga e colega de laboratório Milehna M. Guarido pela convivência,
cooperação em várias etapas do trabalho e preciosas conversas acerca de trabalho.
À Carla Cristina Dutra e Camila Meotti (Programa de Pós-graduação em
Entomologia e Conservação da Biodiversidade – UFGD) pela agradável convivência
durante período de intercâmbio na UFPR.
Aos meus amigos do tempo de graduação, em especial Edson, pelo apoio,
conversas e por sempre me ouvir e à Carla (Gaúcha) por sempre estar me
instigando a continuar.
À Paty Zillioto (intrusa querida) pelo apoio e longas conversas na sacada,
sobre o trabalho e a vida.
Ao doutorando André Luis da Costa da Silva (Universidade de São Paulo –
ICB) pela disponibilidade e auxílio com o programa Arlequin.
Ao Msc. José Francisco de Oliveira Neto pelo auxílio com o programa TCS
(Phylogenetic network estimation using statistical parsimony).
v
À Profa. Dra. Vera Margarete Scarpassa (INPA, Manaus) pela ajuda nas
análises da Correção do Bonferroni.
A todos os pesquisadores, além dos já citados anteriormente, que me
auxiliaram de alguma forma na construção deste trabalho, foram inúmeras pessoas
que dispuseram de um pouco de seu tempo para auxiliar, meu muito obrigada.
À Secretaria de Saúde do Estado do Paraná (SESA), na pessoa do Msc.
Alan Martins da Silva, pelo envio do material biológico que permitiu o
desenvolvimento deste projeto.
A todos que, de alguma forma, contribuíram para o desenvolvimento deste
trabalho e também para a minha formação profissional e humana durante estes dois
anos meu muito obrigada!
vi
SUMÁRIO
AGRADECIMENTOS ..................................................................................... iii
LISTA DE FIGURAS ...................................................................................... vii
LISTA DE TABELAS ...................................................................................... ix
LISTA DE ABREVIATURAS........................................................................... x
LISTA DE SIGLAS ......................................................................................... x
RESUMO........................................................................................................ xi
ABSTRACT .................................................................................................... xii
INTRODUÇÃO
1.1. Culicidae....................................................................................... 1
1.2. Aedes aegypti
1.2.1. Origem e dispersão......................................................... 1
1.2.2. Características e biologia ................................................ 3
1.2.3. Infecção por vírus............................................................ 6
1.3. Dengue ......................................................................................... 7
1.4. DNA mitocondrial.......................................................................... 12
1.5. Estudos genéticos em Aedes aegypti........................................... 13
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivo Geral............................................................................... 16
2.2. Objetivos específicos.................................................................... 16
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Obtenção dos espécimes ............................................................ 17
3.2. Localidades amostradas............................................................... 19
3.3. Procedimentos em laboratório
3.3.1. Extração de DNA............................................................. 20
3.3.2. Reação de amplificação .................................................. 20
3.3.3. Purificação dos produtos de PCR ................................... 23
3.3.4. Reações de sequenciamento.......................................... 23
3.4. Análise das sequências ................................................................ 23
3.5. Análises de polimorfismo molecular
3.5.1. Análise de diversidade genética...................................... 24
3.5.2. Testes de Neutralidade ................................................... 24
3.5.3. Análise de Variância Molecular (AMOVA)....................... 25
vii
3.5.4. Estruturação das Populações.......................................... 25
3.5.5. Isolamento por distância ................................................. 25
3.5.6. Análises dos haplótipos................................................... 26
4. RESULTADOS e DISCUSSÃO.................................................................. 27
5. CONCLUSÕES .......................................................................................... 45
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ........................................................... 46
7. ANEXO I..................................................................................................... 56
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Municípios infestados por A. aegypti (porção escura) durante cinco anos
ou mais, no período de 1995 a 2005 (SESA/PR)................................................... 3
Figura 2: Fêmea de Aedes aegypti mostrando tarsos com marcações em forma de
listras brancas e o mesonoto com desenho em forma de lira ................................ 4
Figura 3: Distribuição de casos autóctones de dengue nas dez mesorregiões do
Estado do Paraná (SESA/PR)................................................................................ 9
Figura 4: Incidência de dengue/100.000 habitantes em estudo realizado em todos os
municípios do Estado do Paraná............................................................................ 11
Figura 5: Mapa do Estado do Paraná apresentando as delimitações dos municípios e
a localização dos municípios de: Maringá, Loanda, Ubiratã, Pato Bragado, Santa
Helena, Foz do Iguaçu e Cascavel, onde foram amostradas populações de Aedes
aegypti e Aedes albopictus..................................................................................... 19
Figura 6: Gel de agarose 2%, submetido à eletroforese e corado em brometo de
etídio para confirmação do tamanho do fragmento de NADH4 amplificado e
especificidade dos iniciadores utilizados. Poços 1-5 e 7-11: indivíduos de A. aegypti
de Santa Helena. Poço 6: marcador de massa molecular ..................................... 22
Figura 7: Frequência relativa dos nove haplótipos detectados nas populações de
Aedes aegypti provenientes de Cascavel, Foz do Iguaçu, Loanda, Maringá, Pato
Bragado, Santa Helena e Ubiratã, Paraná
.................................................................. 30
Figura 8: Gráfico de regressão de Mantel para as populações de Aedes aegypti com
uso de Fst par a par. R=-0,0659; p=0,5770........................................................... 40
Figura 9: Gráfico de regressão de Mantel para as populações de mesorregião Oeste
de Aedes aegypti com uso de Fst par a par. R=-0,2027; p=0,5420 ...................... 41
ix
Figura 10: Dendrograma dos nove haplótipos de Aedes aegypti utilizando o método
de Neighbor-Joining (modelo de distância genética de Tamura-Nei), com inclusão de
Ae. albopictus como grupo externo. Os valores de bootstrap encontram-se nos
ramos ..................................................................................................................... 43
Figura 11: Rede de haplótipos com base no método de parcimônia máxima. ...... 44
x
LISTA DE TABELAS
Tabela I: Série histórica de casos de dengue no Estado do Paraná...................... 10
Tabela II: Localização das populações de A. aegypti, distribuição por mesorregião,
coordenadas geográficas, período de instalação, positividade, número de ovos,
adultos e total de A. aegypti preservados .............................................................. 18
Tabela III Localidade de coleta dos indivíduos de A. aegypti sequenciados do
Estado do Paraná, número de indivíduos utilizados e haplótipos resultantes........ 29
Tabela IV: Posição das mudanças nucleotídicas nos nove haplótipos encontrados
nas populações de A. aegypti do Paraná............................................................... 31
Tabela V: Diversidade genética calculada para sete populações de Aedes aegypti
do Paraná............................................................................................................... 32
Tabela VI: Resultado dos testes de neutralidade de populações de A. aegypti do
Estado do Paraná................................................................................................... 34
Tabela VII: Análise de variância molecular (AMOVA) considerando todas as
populações de Aedes aegypti consideradas no Paraná em um único grupo.. ....... 36
Tabela VIII: Análise de variância molecular (AMOVA) considerando as populações
de Aedes aegypti do Estado do Paraná de maneira separada, em agrupamentos por
mesorregiões.......................................................................................................... 36
Tabela IX: Valores de Fst par a par para populações de Aedes aegypti das cidades
estudadas no Estado do Paraná ............................................................................ 39
Tabela X: Valores de Nm (número efetivo de migrantes) entre indivíduos
provenientes das populações de Aedes aegypti das sete cidades paranaenses
estudadas............................................................................................................... 39
xi
LISTA DE ABREVIATURAS
RAPD - Random Amplification of Polymorphic DNA
SSCP - Single Strand Conformation Polymorphism
LISTA DE SIGLAS
Fct - permutação entre os grupos
Fsc - permutação entre populações dentro dos grupos
Fst - permutação dentro das populações
Fst par a par - índice de fixação
Hd - diversidade de haplótipos
K - número médio de diferenças nucleotídicas
Nm - número efetivo de migrantes
Pi - diversidade nucleotídica
xii
RESUMO
Aedes aegypti é um mosquito vetor de grande importância epidemiológica
no Brasil pelo fato de ser transmissor de dengue e de febre amarela em área
urbana. Sua distribuição contempla todo o território brasileiro e no Paraná concentra-
se nas regiões de clima mais quente e úmido. Quanto à doença, o Paraná contribui
com valores crescentes no número de casos que ocorrem anualmente no país.
Diante deste problema pertinente de saúde pública foi realizado estudo do perfil
genético de algumas populações de A. aegypti do Estado do Paraná, baseado na
utilização de fragmento parcial do gene mitocondrial NADH4. Sete municípios de
quatro diferentes mesorregiões foram estudados: Oeste (Cascavel, Foz do Iguaçu,
Pato Bragado e Santa Helena), Noroeste (Loanda), Centro Oriental (Ubiratã) e Norte
Central (Maringá). Os municípios foram escolhidos por apresentar o vetor e
importante incidência de casos de dengue. Vinte e três indivíduos tiveram 343 pares
de bases de NADH4 analisadas, com detecção de nove haplótipos, sendo que oito
destes foram singletons. O haplótipo mais freqüente foi encontrado em Cascavel,
Foz do Iguaçu, Maringá, Pato Bragado e Santa Helena. Um dos haplótipos
singletons foi coincidente com sequência encontrada no GenBank para populações
do Brasil ainda não publicadas, o que demonstra relacionamento de populações
paranaenses com outros locais do território nacional. As populações mostraram-se
altamente estruturadas, com pequena troca de indivíduos por geração. Não há
correlação entre a distância geográfica das localidades amostradas e a distância
genética dos haplótipos presentes em cada local. Testes de neutralidade detectaram
presença de substituições deletérias no total das populações e em Santa Helena,
que evidencia que estas mutações ocorreram recentemente. Dois clusters foram
encontrados entre os haplótipos, sugerindo a possível presença de duas linhagens
distintas de A. aegypti presentes no Estado do Paraná. Estes resultados podem
fornecer subsídios para o entendimento da dinâmica do vetor no estado do Paraná.
xiii
ABSTRACT
Aedes aegypti is a vector mosquito of great epidemiological importance in
Brazil due to be the vector of dengue and yellow fever in urban areas. Its distribution
covers the entire Brazilian territory, and in Paraná it is mainly found on regions of
warmer and wet climate. Paraná contributes with increasing numbers of cases of
dengue that occur annually in the country. Because of the relevant public health
issue, a study of genetic profile of some populations of A. aegypti from the State of
Parana was done, on the basis of partial fragment of the mitochondrial gene NADH4.
Seven cities from four different mesoregions were studied: West (Cascavel, Foz do
Iguaçu, Pato Bragado, and St. Helena), Northwest (Loanda), Central East (Ubirata)
and North Central (Maringa). Cities were chosen for the vector presence and
importance in cases of the issue. Twenty-three individuals had 343 pairs of bases
NADH4 analyzed with detection of nine haplotypes, eight of these being singletons.
The most frequent haplotype was found in Cascavel, Foz do Iguaçu, Maringa, Pato
Bragado, and St. Helena. One of the singletons haplotypes was coincident with
sequences found in the GenBank for the Brazilian population not yet published,
which shows the relationship of populations from Parana with other areas in the
country. The populations were highly structured, with little exchange of individuals
per generation. There is no correlation between geographic distance from the
sampled localities and genetic distance of the haplotypes present in each location.
Neutrality tests detected the presence of deleterious changes in the total of the
populations and in St. Helena, which shows that these mutations occurred recently.
Two clusters were found among haplotypes, suggesting the possible presence of two
distinct strains of A. aegypti in the state of Parana. These results may provide
support to understanding the dynamics of the vector in the state of Parana.
1
1. INTRODUÇÃO
1.1. Culicidae
A família Culicidae, do latim cullex que significa mosquito, é representada
por aproximadamente 3.500 espécies de insetos conhecidos pelo grande público por
mosquitos. A importância da família está relacionada com o fato de grande parte de
seus representantes estarem envolvidos na transmissão de patógenos ao homem.
Sua ocorrência é relatada para quase todo o mundo, com exceção somente para
locais permanentemente congelados (Forattini 2002).
Na subfamília Culicinae estão alocados 35 gêneros, distribuídos em 11
tribos. A tribo Aedini compreende nove gêneros, dentre os quais três tem
representantes na região Neotropical: Aedes, Psorophora e Haemagogus. No Brasil
ocorrem quatro subgêneros do gênero Aedes: Ochlerotatus, Stegomyia, Howardina
e Protomacleaya. Em Stegomyia é importante ressaltar duas espécies de origem no
Velho Mundo que invadiram outras regiões zoogeográficas, inclusive o Brasil: A.
(Stegomyia) aegytpi e A. (Stegomyia) albopictus, apresentando distribuição
descontínua por ter sido disseminada passivamente pelo homem durante suas
migrações (Consoli & Lourenço-de-Oliveira, 1994; Forattini 2002).
1.2. Aedes aegypti
1.2.1. Origem e dispersão
Aedes (Stegomyia) aegypti (Linnaeus, 1762) têm origem no continente
africano (região etiópica) tendo sua primeira descrição feita no Egito. No Brasil está
associado a áreas com grande concentração humana, enquanto no Velho Mundo,
que compreende Europa, África e Ásia, também ocorre em locais afastados de
aglomerados humanos. Hoje é encontrado nas regiões Tropical e Subtropical, entre
os paralelos 45° de latitude Norte e 40° de latitude Sul (Consoli & Lourenço-de-
Oliveira, 1994; Forattini 2002).
2
A ocorrência de epidemias de febre amarela, doença que tem A. aegypti
como transmissor em área urbana, levou ao combate do vetor a partir da década de
1940. A espécie foi erradicada em 1955, voltando a ser detectado em 1967 no
estado do Pará. Em 1973 ocorreu pela segunda vez sua erradicação. Em 1976 foi
novamente detectado em Salvador e a partir de então não mais foi possível sua
eliminação total no país (Tauil 2002). Desde então nenhuma campanha foi eficaz na
erradicação nem pôde conter seu avanço, em área, no território nacional. Hoje a
espécie é encontrada em todos os estados brasileiros, inclusive no distrito federal
(Consoli & Lourenço-de-Oliveira, 1994).
No Paraná não há datação clara sobre a entrada da espécie, porém relatos
de febre amarela, arbovirose também transmitida em ambiente urbano por A.
aegypti, no início do século XVII denotam a presença do vetor nesta época. A
principal via de entrada provavelmente foi o Porto de Paranaguá, que apresentava
intenso tráfego marítimo na época (Roncaglio et al. 2001). Em 1985, após as
erradicações que ocorreram em todo o país, a espécie volta a ser detectada por
Lopes et al. (1993) no Estado, na cidade de Londrina.
No mapa a seguir visualizam-se os locais de ocorrência de A. aegypti no
Estado do Paraná entre os anos de 1995 e 2005 (Figura 1).
3
Figura 1: Municípios infestados por A. aegypti (em escuro) durante cinco anos
ou mais, no período de 1995 a 2005 (SESA/PR).
1.2.2. Características e biologia
A. aegypti é um mosquito de coloração escura (de castanho escuro à preta),
com escamas brancas presentes nas pernas (formando listras transversais) e na
região do escudo torácico, onde formam duas linhas nas porções laterais, resultando
num desenho parecido com uma lira (Figura 2) (Forattini, 2002).
Esta espécie tem hábitos sinantrópicos e antropofílicos, colonizando, no ato
de oviposição, inúmeros recipientes com acúmulo de água, permanentes ou
temporários, encontrados em área urbana. Nesses locais, chamados sítios de
oviposição, ocorrerão os estágios imaturos, larvais e pupal, do inseto.
4
Fonte: BVS/MS
Figura 2: Fêmea de Aedes aegypti mostrando tarsos com
marcações em forma de listras brancas e o mesonoto com
desenho em forma de lira.
Sabe-se que as fêmeas grávidas de A. aegypti respondem a estímulos
visuais, olfativos e quimiotáteis para a realização da oviposição. Em estudos de
preferência a escolha das fêmeas apresentou maior propensão à atração para
oviposição em águas residuais e água de lagos quando estas apresentam coliformes
fecais e coliformes totais, sugerindo que, na verdade, a atração pode estar sendo
exercida por odores emanados por esses locais. Águas que passaram por
tratamento com cloro, como água de torneira e de piscina mostraram-se com ação
repelente quanto à oviposição das fêmeas (Navarro et al. 2003). Também há
estudos que ressaltam a preferência por oviposição em locais externos às
construções, com menor quantidade de ovos observada em locais abrigados (Dibo
et al. 2005).
Mesmo não percorrendo grandes distâncias através de vôo, cerca de 50 a
100 metros no máximo, as fêmeas à procura de locais para ovipositar podem
dispersar rapidamente em detrimento da disponibilidade de sítios para oviposição.
Assim a atividade ovipositora durante um único ciclo gonotrófico pode estender-se
por dias e alcançar uma área de ao menos 840 metros de diâmetro (Reiter et al.
5
1995). Após um repasto sanguíneo (alimentação com sangue realizada pelas
fêmeas) e na ausência de novos repastos a fêmea pode continuar ovipositando por
um período de dez dias, dividido em três ou quatro ciclos de oviposição. Sob
condições de estresse por umidade (seca) e alimentar (alta concentração de açúcar)
a oviposição pode ser atrasada por período de um a quatro dias, que segundo
Canyon et al. (1999) é a extensão máxima de períodos de baixa umidade extrema
na natureza.
Aproximadamente três dias após a oviposição os ovos já tem o embrião
totalmente formado, podendo o tempo de desenvolvimento variar de acordo com as
condições ambientais. A fase aquática compreende quatro estágios larvais e um
pupal. Em ambiente estritamente antrópico, larvas em desenvolvimento e ovos
podem ser encontrados com maior frequência no peridomicílio quando comparado
ao intradomicílio, em vasos e pratos de plantas, ralos, garrafas, plantas que
acumulam água, como bromélias, e as fêmeas parecem ter preferência por
ovipositar em locais com maiores volumes de água (Chiaravalloti-Neto 1997; Zahiri &
Rau, 1998; Forattini & Marques 2000; Calderón-Arguedas et al. 2004; Silva et al.
2006).
No estágio larval o A. aegypti alimenta-se de partículas em suspensão na
água e tem duração de quatro a oito dias. A pupa tem duração de dois dias (Consoli
& Lourenço-de-Oliveira 1994; Forattini, 2002).
Tanto machos quanto fêmeas têm preferência por buscar abrigo no interior
de domicílios (Lima-Camara et al. 2006). Ambos utilizam de fontes alimentares ricas
em sacarose, como alguns recursos vegetais, e apresentam grande resistência na
ausência de alimentação. O estresse fisiológico causado por privação de
alimentação causa mudanças no metabolismo, principalmente nas fêmeas. Estas,
no entanto, necessitam realizar também alimentação sanguínea como fonte de
proteínas a fim de maturar seus ovos. Essa alimentação, chamada repasto
sanguíneo, é realizada preferencialmente no período diurno. Durante esse evento
pode ocorrer a infecção do mosquito por algum vírus ou a transmissão do vírus ao
hospedeiro humano.
Estudos realizados sob condições de laboratório revelam alguns detalhes
importantes quanto ao repasto sanguíneo, como a preferência por sangue humano
frente ao sangue de ratos pelo fato do primeiro apresentar maior quantidade de
glicose quando comparado com o segundo, por exemplo, acarretando aumento de
6
fitness (sucesso reprodutivo) e síntese de reservas energéticas nas fêmeas
(Harrington et al. 2001). A atividade hematofágica é realizada em ambiente
antrópico, preferencialmente no intradomicílio (Gomes et al. 2005).
Todo o período de desenvolvimento da eclosão até a emergência do indivíduo
adulto tem duração de aproximadamente dez dias, o que pode variar conforme
condições ambientais. Em condições de menores temperaturas (17°C) o processo
torna-se mais lento (10 – 17 dias), enquanto em temperaturas mais altas (30°C) o
desenvolvimento pode ocorrer em períodos de 6 a 8 dias (Hien 1975).
1.2.3. Infecção por vírus
A. aegypti participa da transmissão, em ciclos urbanos, dos quatro sorotipos
do vírus da dengue (DEN1, DEN2, DE3 e DEN 4) e do vírus da febre amarela,
ambos da família Flaviviridae, gênero Flavivirus. Vale ressaltar que o vírus da
dengue é o único dentro da família Flaviviridae, gênero Flavivirus, que não necessita
manutenção de ciclos em ambientes silvestres. Os sorotipos são antigenicamente
diferentes, porém apresentam a mesma epidemiologia (Gubler 2002). Os sorotipos
têm história evolutiva relativamente recente, tendo origem há cerca de um século,
somente estabelecendo transmissão endêmica em humanos neste mesmo período
de tempo (Holmes & Twiddy 2003).
Num modelo geral de infecção de A. aegypti por um vírus, há diversos
obstáculos a serem vencidos até o momento de uma fêmea estar apta a infectar um
hospedeiro. Como exemplo a composição do tubo digestivo, uma vez que a matriz
peritrófica é a primeira barreira física que o vírus precisa ultrapassar quando
adquirido pelo vetor (Bosio et al. 2000; García-Franco et al. 2002; Bennett et al.
2002).
Vírus de RNA, como os da família Flaviviridae, tem alta variabilidade
genética por apresentar alta taxa intrínseca de mutação associada a RNA
polimerase, altas taxas de replicação e grande tamanho populacional. Uma vez
adquirido pelo vetor, o vírus permanece nele durante toda sua vida. Esses vírus
ligam-se e aderem-se à membrana das células através da proteína E, porém os
receptores nas células do hospedeiro ainda continuam obscuros, mas são comuns a
todos os sorotipos. Após a ligação, pode ou não ocorrer replicação viral nas células
7
do intestino médio do mosquito, sem prejuízo direto a este. Se ocorrer replicação,
diz-se que o vírus venceu a barreira do intestino médio que é fator determinante no
que diz respeito à competência vetora. Após ultrapassar a barreira do intestino
médio (matriz peritrófica e epitélio intestinal) o vírus tem que ser capaz de sair das
células intestinais onde ocorreu replicação, ganhar a hemocele para poder replicar
novamente, mas agora em células de outros tecidos. Essa é a barreira de evasão do
intestino. Depois de novos ciclos replicativos, o vírus necessita entrar nas glândulas
salivares, ultrapassando as suas barreiras. Esse é o último local que o vírus ocupa
antes de ser ejetado, juntamente com a saliva, em um hospedeiro vertebrado
durante o repasto sanguíneo (Holmes & Twiddy 2003).
1.3. Dengue
A dengue é uma doença reemergente considerada um dos principais
problemas mundiais quando se trata de saúde pública. É endêmica na África, Oeste
do Pacífico, Leste do Mediterrâneo, Sudoeste Asiático e nas Américas (WHO 2003).
Cerca de 2,5 milhões de pessoas que habitam regiões tropicais estão em áreas de
risco de ocorrência da doença, estimando-se infecção de 50 a 100 milhões de
pessoas por ano em todos os continentes com exceção da Europa, com cerca de 20
mil mortos por ano (SVS, Ministério da Saúde, 2008).
É uma arbovirose que por definição requer dois hospedeiros, um vertebrado
e um artrópode. Geralmente o vírus tem que produzir um alto nível de viremia no
hospedeiro vertebrado para que o artrópode possa infectar-se durante o repasto
sanguíneo (Gubler 2002). Estudos filogenéticos utilizando sorotipo 2 do vírus
reforçam a hipótese de que houve adaptação de um vírus silvestre da dengue a
vetores peridomésticos urbanos do gênero Aedes, A. aegypti e A. albopictus. Até
então era mantido ciclo entre o vírus silvestre da dengue com primatas não humanos
e mosquitos do gênero Aedes em áreas de floresta (Moncayo et al. 2004).
O primeiro relato da doença data do final do século XVIII, no Sudoeste
Africano e Estados Unidos, porém somente foi reconhecida como doença pela OMS
no século XX (SVS, Ministério da Saúde, 2008). Nas Américas a dengue ocorre
desde o século XIX, com período de silêncio epidemiológico no início do século XX,
8
com reintrodução dos sorotipos 2 e 3 associado a formas clássicas de manifestação
da doença na década de 60 (Teixeira et al. 1999).
Na década de 1940 a Pan American Health Organization (OPAS) iniciou
programa de erradicação do vetor no Continente Americano, com cobertura de 73%
das áreas infestadas, porém a partir de 1970 houve reinfestação pelo vetor, que
aumentou em densidade juntamente com o crescimento populacional em áreas com
urbanização não planejada, enquanto o transporte facilitou fluxo de genótipos e
cepas do vírus (Gubler 2002).
Os casos de febre hemorrágica da dengue estão aumentando de maneira
exponencial em todo o mundo nas últimas décadas. A expansão da dengue nas
Américas deve-se a diversos fatores como: extensa presença de vetor, controle
ineficiente do mesmo, aumento da densidade humana em áreas urbanas, utilização
de depósitos inapropriados de água, entre outros (CDC, 2008).
No Brasil a doença apresenta padrões sazonais, com maiores índices de
ocorrência nos cinco primeiros meses do ano, correspondendo ao período quente e
úmido do clima tropical. A primeira epidemia, depois de sua reintrodução na década
de 70, ocorreu em Boa Vista (RR), onde foram isolados os sorotipos 1 e 4 em 1981.
A partir de 1986 todas as regiões do país apresentam circulação viral (DEN1) e em
1990 é introduzido o DEN2 no país (Funasa, 1999). Na análise das características
regionais da doença não foram relatadas diferenças qualitativas entre as regiões,
porém quantitativamente os resultados permitiram dividir o país em dois grupos: um
primeiro, com maior número de casos (85,5%), que agrupa Nordeste e Sudeste e
um segundo com quantidades bem menores de ocorrência, que compreende Sul,
Centro-Oeste e Norte. As regiões Nordeste e Sudeste são as que apresentam os
maiores índices de notificação, porém as demais regiões do país não deixam de ter
importância no cenário nacional de dengue por também apresentarem casos da
doença (Câmara et al. 2007).
Os primeiros casos de dengue no Estado do Paraná foram notificados no
ano de 1991, com casos autóctones ocorrendo somente em 1993. A partir de então,
epidemias ocorrem anualmente no Estado. O Paraná apresentou grande número de
casos notificados no ano de 2003, seguido de declínio nos anos seguintes (SESA
Paraná). No ano de 2008 foram notificados 17110 casos, queda de 96,84% em
relação a 2007, com confirmação de 957 casos, (queda de 65,02%), ano em que o
9
Estado contribuiu com 10,2% dos casos que ocorreram no país (Ministério da
Saúde, 2008) (Tabela 1).
Os casos autóctones de dengue no Paraná (Figura 3) distribuem-se nas
mesorregiões Oeste, Nordeste, Centro Oriental, Norte Central e Norte Pioneiro do
Paraná, locais de temperaturas mais elevadas e verões chuvosos. O Norte Pioneiro
é a mesorregião que menos contribui com número de casos dentre as citadas.
Das cidades avaliadas no presente estudo, Foz do Iguaçu (Oeste) é a que
apresenta maior número de casos de dengue por anos consecutivos. Neste
município o controle do vetor merece atenção especial por ser área de grande fluxo
de pessoas em consequência da fronteira com o Paraguai e Argentina.
Após Foz do Iguaçu, Maringá (Norte Central) e Cascavel (Oeste) são as
cidades que apresentam números elevados de casos de dengue. Em 2007 outro
município também com número preocupante de casos foi Ubiratã. .
No ano de 2007 a Secretaria de Saúde alertou para a presença de casos de
febre amarela urbana na cidade de Santa Helena.
Uma visão mais geral dos locais do Estado com maior incidência de casos
de dengue/100.000 habitantes nos últimos dois anos pode ser visualizado na figura
4.
Figura 3: Distribuição de casos autóctones de dengue nas dez mesorregiões que
compõe o Estado do Paraná (SESA/PR).
10
Tabela I: Série histórica de casos de dengue no período de 1991 a 2008 no Estado do
Paraná.
CONFIRMADOS
ANO NOTIFICADOS
AUTÓCTONES IMPORTADOS TOTAL
1991 161 - 16 16
1992 59 - 3 3
1993 59 3 3 6
1994 69 1 7 8
1995 3.595 1.519 342 1.861
1996 5.178 3.049 146 3.195
1997 1.192 3 10 13
1998 2.747 534 49 583
1999 1.314 266 43 309
2000 4.419 1.708 143 1.851
2001 3.845 1.164 124 1.288
2002 13.167 4.731 433 5.164
2003 23.890 9.230 208 9.438
2004 3.392 57 50 107
2005 4.831 882 107 989
2006 5.380 830 311 1.141
2007* 50.160 25.070 918 25.988
2008* 9.849 435 111 546
*Dados de 12/05/2008 sujeitos à alteração
Fonte: SESA/SVS/DEVA/DVDTV
11
Fonte: SESA/SVS/DEVA/DVDTV
Figura 4: Incidência de dengue/100.000 habitantes em estudo realizado em todos os
municípios do Estado do Paraná.
Sem Caso
< 100
100 a 300
> 300
2007
Sem Caso
< 100
100 a 300
> 300
2008
12
1.4. DNA mitocondrial
DNA nuclear e mitocondrial refletem informações da biologia e história
evolutiva da espécie.
O DNA mitocondrial (mtDNA) é uma molécula única e circular em animais,
sendo um genoma pequeno (15 a 20 kb) contendo 37 genes dentre os quais dois
para rRNAs (RNAs ribossomais), 13 para proteínas e 22 para tRNAs (RNAs
transportadores). É de herança materna (uniparental) com ausência de
recombinação e apresenta altas taxas evolutivas, quando comparada com DNA
nuclear (cerca de 10 vezes maior), e por esses motivos mostra-se como uma
importante ferramenta para estudo de relações evolutivas entre indivíduos, espécies
e populações. As altas taxas de mutação no mtDNA estão relacionadas com a
eficiência das enzimas envolvidas no reparo na replicação, enzimas que são
codificadas por genes nucleares (Matioli 2001).
Quando o DNA é não codificador ele tem taxa de evolução cerca de três
vezes mais rápida que DNA codificador e têm maior frequência de indels (inserções
e/ou deleções), porém regiões não codificadoras são raras em genoma de
organelas, como cloroplastos e mitocôndrias (Matioli 2001).
Muitos aspectos ligados à evolução genômica podem ser estudados à luz do
mtDNA em níveis de detalhamento e entendimento não possível atualmente para o
DNA nuclear (Boore 1999).
Os genes codificadores das sete subunidades de nicotinamida adenina
dinucleotídeo desidrogenase (NADH) acumulam rapidamente mudanças de bases,
sendo assim de grande utilidade em estudos populacionais, até mesmo podendo ser
utilizados em locais onde a presença da espécie não ocorre há muito tempo, como
no caso uma espécie invasora de não longa ocorrência na região em questão
(Matiolli 2001).
13
1.5. Estudos com mtDNA em Aedes aegypti
Desde a década de 1950 avanços vêm sendo feitos em estudos genéticos
de mosquitos, principalmente nos gêneros Aedes, Anopheles e Culex, sobretudo no
que diz respeito à estrutura, organização e evolução do genoma, sendo que os
mosquitos representam um dos grupos melhor estudados (Rai 1999).
Estudos apresentam importantes aspectos de populações de A. aegypti em
diversas partes do mundo. Na Tailândia, Chareonviriyaphap & Lerdthusnee (2002)
realizaram estudos com isoenzimas em cinco populações de duas zonas
geográficas, revelando grande migração efetiva entre populações localizadas nas
duas ilhas e nenhuma diferença significativa entre elas. Também com uso de
isoenzimas somado a microsatélites, Huber et al. (2002) estudaram populações
provenientes de diferentes períodos e condições ambientais da cidade de Ho Chi
Minh (Vietnã) revelando grandes diferenças na estruturação genética entre estações
chuvosas e secas, com maior estruturação e aumento populacional durante períodos
chuvosos.
Sete populações de Taiwan puderam ser separadas em dois clados, Nordeste
e Sudeste, com uso de RAPD. Na segunda região as populações apresentavam
isolamento por distância e 84% da variação ocorreu entre populações. O nível de
diferenças genéticas e distâncias genéticas são positivamente correlacionadas (Su
et al. 2003).
No Camboja, estudo realizado através do uso de aloenzimas revelou que o
tipo de sítio de oviposição está relacionado com o grau de diferenciação genética.
Os animais provenientes de reservatórios abandonados, como pneus, garrafas e
outros objetos que podem represar água, apresentaram maior grau de diferenciação
que os de reservatórios domésticos (Paupy et al. 2004). Para o mesmo país,
utilizando-se isoenzimas, foi detectado baixo nível de diferenciação genética e
nenhuma associação significativa entre distância geográfica e diferenciação
genética, que pode ter sido causado, ao menos parcialmente, pela abundância de
criadouros domésticos diminuindo o movimento de A. aegypti e consequentemente
as trocas genéticas (Paupy et al. 2005).
Estudos realizados com 10 populações da costa nordeste do México
revelaram formação de dois clados entre os sete haplótipos mitocondriais
encontrados através do uso de RAPD e SSCP da região do gene mitocondrial
14
NADH4. Dados provenientes da primeira técnica indicaram isolamento por distância
e fluxo gênico em distâncias de até 250 km, o que não foi detectado utilizando dados
de mtDNA (Gorrochotegui-Escalante et al. 2000). Posteriormente, Gorrochotegui-
Escalante et al. (2002) estudaram 38 populações de cidades da costa do país,
realizando SSCP em sequências de NADH4 com detecção de 25 haplótipos. As
populações do Nordeste são mais diferenciadas quando comparadas com as do
Pacífico e Yucatan, apresentando também menor diversidade genética.
Estudos realizados com NADH4 em três localidades do Peru revelaram
presença de três haplótipos, um deles compartilhado por duas localidades, enquanto
na outra dois haplótipos foram detectados. Maior nível de variação molecular
ocorreu dentro das populações, com medidas de distância genética entre haplótipos
sugerindo entrada de duas linhagens de A. aegypti no país (Costa-da-Silva et al.
2005). Na Argentina, Sousa et al. (2001) detectaram altos valores de Fst entre
populações distantes no território, com presença de zonas de maior diversidade
populacional coincidentes com locais de fronteira com outros países onde ocorre A.
aegypti.
Bracco et al. 2007 realizaram estudos com A. aegypti das Américas com uso
de NADH4 como marcador, encontrando 20 haplótipos, sendo 14 exclusivos para
Américas, quatro só para Ásia e África, um compartilhado entre América e África e
um comum às Américas e Ásia. Esses dados evidenciam presença de duas
linhagens: uma relacionada à África (Senegal) e outra África e Ásia (Guiné e
Uganda), sugerindo duas possíveis subespécies circulando nas Américas.
O isolamento por distância também apresentou índices menores no Nordeste
do Brasil do que nas demais regiões do país. O grau de polimorfismo genético foi
alto em trabalho realizado com 15 populações de cinco estados do Brasil com uso
da técnica RAPD. Também foi detectado alto nível de diferenciação genética com
valores maiores que os já encontrados para A. aegypti em outros paises (Ayres et al.
2003). Altos níveis de polimorfismo e diferenciação genética foram detectados em
estudo realizado com RAPD com A. aegypti provenientes de 11 localidades de
quatro regiões do Brasil, sugerindo alta diferenciação nas populações (Paduan et al.
2006).
Estudos realizados no Rio de Janeiro utilizando microsatélites e isoenzimas
revelaram maior eficiência do primeiro marcador, sendo as populações tão variadas
no centro quanto na periferia do município (Costa-Ribeiro et al. 2006). Análises com
15
RAPD realizadas no estado de São Paulo revelaram duas linhagens diferenciadas,
uma que engloba Oeste e outra com animais de laboratório juntamente com animais
de Santos, maior porto da América Latina, não permitindo conclusões acerca da
origem destas linhagens (Santos et al. 2003).
Em vista da grande e fácil movimentação de Aedes aegypti através de
transporte humano é de grande valia o estudo do perfil genético de indivíduos da
espécie. Conhecer as diferenças entre as populações fornece subsídios para o
controle do vetor, uma vez que cada unidade populacional pode ser tratada de
maneira independente. O estudo de haplótipos pode ser indicativo para a
movimentação do vetor e presença de haplótipos únicos indica resposta da
população à pressão seletiva pela qual pode ter passado ou estar passando, o que
pode ser detectado pelo uso de subunidades do gene codificador da nicotinamida
adenina dinucleotídeo desidrogenase (NADH) já que estas acumulam rapidamente
mudanças de bases. Tendo visto a escassez de dados para o Estado do Paraná,
que vêm crescendo em importância no cenário nacional em decorrência do número
de casos de dengue, faz-se necessário estudo das populações do vetor presentes
no Estado, sobretudo nos locais de sua maior ocorrência.
16
2. OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Analisar o perfil genético, baseado em fragmento da subunidade 4 do gene
mitocondrial NADH4, de populações de Aedes aegypti de cidades do Estado do
Paraná.
2.1. Objetivos específicos
Verificar a presença de diferentes haplótipos de A. aegypti dentro das
populações.
Conhecer e comparar o grau de variabilidade inter e intra-populacional de A.
aegypti.
Estimar o fluxo gênico entre as populações de A. aegypti considerando
informações de distância genética e geográfica entre as populações.
17
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1. Obtenção dos espécimes
Espécimes de Aedes aegypti utilizados no presente estudo foram obtidos
através de colaboração entre o Laboratório de Entomologia Médica e Veterinária da
Universidade Federal do Paraná (LEMV) e a Secretaria Estadual de Saúde do
Estado do Paraná (SESA/PR).
Armadilhas de oviposição (ovitrampas) foram instaladas por agentes de
Núcleos de Entomologia da SESA/PR em cidades com importância epidemiológica
no cenário atual de ocorrência de casos de dengue. As cidades amostradas
pertencem a quatro mesorregiões do Estado: Oeste (Cascavel, Foz do Iguaçu, Pato
Bragado e Santa Helena), Noroeste (Loanda), Centro Oriental (Ubiratã) e Norte
Central (Maringá). A data de instalação das ovitrampas, localização das cidades,
bem como maiores detalhes sobre a dinâmica de A. aegypti, e também A.
albopictus, estão disponíveis na tabela 2.
As armadilhas eram formadas por recipientes plásticos escuros (preto) com
capacidade de 500 ml de líquido contendo de 10 a 30% de solução de feno, em
cujas paredes foram afixadas, com auxílio de clipes metálicos, paletas de fibra de
madeira reconstituída (Eucatex® ou Duratex®) (15 cm X 3 cm) ficando cerca de
metade desta imersa na solução. Após cinco dias da instalação em campo, as
armadilhas foram retiradas e levadas ao laboratório do Núcleo de Entomologia da
SESA onde foi realizada busca por ovos utilizando microscópio esteroscópico e
realizando a quantificação dos mesmos. Somente as paletas positivas para ovos
foram enviadas ao LEMV, onde foram colocadas individualmente em recipientes
plásticos (copos com capacidade de 770 ml) com água suficiente para total
submersão das paletas e ração para gatos triturada Purina® Cat Chow® Filhotes
(0,36 g/copo) para induzir a eclosão dos ovos aderidos à parede das paletas.
18
Tabela II: Localização das populações de A. aegypti, distribuição por mesorregião, coordenadas geográficas, período de instalação,
positividade, número de ovos, adultos e total de A. aegypti preservados.
Município
Mesorregião
Coordenadas
Geográficas
Período de
instalação
Positividade
das paletas
N°
ovos
N°
Adultos
Total de
A. aegypti
A. aegypti
preservados*
A.
albopictus
Maringá
Norte
Central
23°25'31"S
51°57'00"O
07/02 - 11/02/2008
62% 2716
1654 1581 77 73
Cascavel Oeste
24°57'21"S
53°27'19"O
30/01 - 04/02/2008
58% 1327
768 700 96 68
Loanda Noroeste
22°55'23"S
53°08'14"O
05/03 - 10/03/2008
70% 2011
515 472 10 43
Pato
Bragado
Oeste
24°37'35"S
54°13'29"O
03/02 - 07/02/2008
60% 2066
649 277 47 372
Ubiratã
Centro
Oriental
24°32'43"S
52°59'16"O
30/04 - 04/05/2007
55% 2746
1948 321 14 1627
Santa
Helena
Oeste
24°51'37"S
54°19'58"O
05/03 - 09/03/2007
78% 2597
972 482 18 490
Foz do
Iguaçu
Oeste
25°32'52"S
54°35'17"O
14/03 - 19/03/2007
63,05% 4874
2566 2339 120 227
*espécimens mantidos em freezer -20°C. Os insetos que não foram preservados foram utilizados para formação de colônias de criação
para outros estudos.
1
9
Diariamente era realizada troca parcial de água e reposição de ração (1
g/dia). Quando atingiam estágio de pupa estas eram transferidas para recipientes
específicos para coleta dos adultos, que eram identificados utilizando chaves de
identificação de Consoli & Lourenço-de-Oliveira (1994) e Forattini (2002). Parte dos
espécimes de A. aegypti foram armazenados em etanol absoluto a -20°C em freezer
apropriado no Laboratório de Biologia Molecular Dra. Danúncia Urban, no
Departamento de Zoologia da Universidade Federal do Paraná. Demais exemplares
de A. aegypti e todos de A. albopictus foram utilizados para formação de colônias
em laboratório para utilização em outros estudos.
3.2. Localidades amostradas
As cidades amostradas e suas localizações estão ilustradas no mapa (Figura
5).
Figura 5: Mapa do Estado do Paraná apresentando as delimitações dos
municípios e a localização dos municípios de: Maringá, Loanda, Ubiratã, Pato
Bragado, Santa Helena, Foz do Iguaçu e Cascavel, onde foram amostradas
populações de Aedes aegypti e Aedes albopictus.
20
3.3. Procedimentos em laboratório
3.3.1. Extração de DNA
A extração de DNA total dos mosquitos seguiu protocolo de Cheung et al.
1993, modificado por França, G. F. (2005) baseado no uso de clorofórmio:álcool
isoamílico. Todos os exemplares utilizados não receberam qualquer tipo de alimento
pré-extração, para minimizar possíveis contaminações no DNA extraído.
Exemplares adultos foram macerados individualmente em tubo de
microcentrífuga de 1.5 ml, contendo 160 µl de tampão de extração (Tris-HCl 200mM
pH 8, NaCl 2M e EDTA 70mM), sendo adicionados 20 µl de SDS 10%. A solução foi
homogeneizada e incubada por 90 minutos a 60
o
C. Após resfriamento a temperatura
ambiente, acrescentou-se 50 µl de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1), centrifugada
por 15 minutos a 13000 rpm. O sobrenadante foi transferido para novo tubo de
microcentrífuga de 1,5 ml, adicionado 80 µl acetato de amônio 7,5M e 300 µl de
etanol 96%. A solução foi homogeneizada por inversão e mantida por 2 horas em
freezer –20
o
C, para precipitação do DNA. Após 15 minutos de centrifugação a 13000
rpm, o sobrenadante foi descartado, o DNA lavado com 1000 µl de etanol 70% e
seco sob estufa a 37°C. O DNA foi ressuspendido em 50 µl de TE (Tris-HCl 10mM e
EDTA 1mM pH8.0) e armazenado a –20
o
C. A quantificação de DNA presente nas
amostras foi realizada em gel de agarose 0.8% por comparação com o padrão de
massa molecular.
3.3.2. Reação de amplificação
Parte do gene que codifica para a subunidade quatro da nicotinamida
adenina dinucleotídeo desidrogenase (NADH4) mitocondrial foi amplificada
utilizando reação em cadeia da polimerase (PCR). A região do DNA mitocondrial que
corresponde ao gene nicotinamida adenina dinucleotídeo desidrogenase tem 1343
pares de bases, entre as posições 8027 – 9370 do genoma mitocondrial de A.
aegypti. As reações de amplificação do gene NADH4 seguiram protocolo
estabelecido por Costa-da-Silva et al. (2005). As reações foram conduzidas em
21
volume final de 50 µl, contendo 20mM de Tris-HCL (pH 8,4), 50mM KCl, 0.5mM de
cada iniciador, 2mM de MgCl
2
, 0.2mM de dNTP, 20 ng de DNA, 2U de Taq DNA
Polimerase e água ultra pura estéril (Milli-Q®) estéril para completar o volume final.
Os iniciadores utilizados nas reações de amplificação, que amplifica região
correspondente aos nucleotídeos 8521-8882 de Aedes albopictus, foram publicados
por Costa-da-Silva et al. (2005) e apresentam as sequências a seguir:
Iniciador universal: 5'-ATTGCCTAAGGCTCATGTAG-3'
Iniciador reverso: 5'- TCGGCTTCCTAGTCGTTCAT-3',
As reações foram realizadas utilizando os seguintes parâmetros: um ciclo de
94
o
C por dois minutos, 35 ciclos de 94
o
C por um minuto, 56
o
C por 30´, 72
o
C por um
minuto e um ciclo de 72
o
C por sete minutos.
Após amplificação, 10% do volume do produto de PCR foi aplicado em gel
de agarose 2%, para confirmação do sucesso da amplificação e verificação do
tamanho do fragmento amplificado, utilizando como marcador de massa molecular
100pb Ladder (Amresco), como ilustrado na figura 6.
22
Figura 6: Gel de agarose 2%, submetido à eletroforese e corado em brometo de
etídio para confirmação do tamanho do fragmento de NADH4 amplificado e
especificidade pos iniciadores utilizados. Poços 1-5 e 7-11: indivíduos de A. aegypti
de Santa Helena. Poço 6: marcador de massa molecular.
23
3.3.3. Purificação dos produtos de PCR
Os produtos de PCR foram purificados utilizando Polietileno Glicol (PEG)
8000 (PEG 20%; NaCl 2,5M), adicionando 1 volume da solução ao produto de PCR,
incubado a 37°C (30 minutos). Em seguida passou por centrifugação a 14.000 rpm,
retirada do sobrenadante, lavagem com etanol 80% gelado e centrifugação por 2
minutos, etapa repetida duas vezes. Ao final o conteúdo foi seco em estufa e
realizada ressuspensão em 8 µl de água ultra pura (obtida do equipamento marca
Milli-Q) livre de DNAase. Esta solução foi levada à geladeira, permanecendo por no
mínimo 16 horas antes da quantificação, que ocorreu com aplicação de 2 µl do
produto em gel de agarose 2% utilizando como parâmetro de comparação o
marcador de massa molecular 100pb Ladder (Amresco).
3.3.4. Reações de sequenciamento
As amostras, com no mínimo trinta nanogramas de amplificado, foram
posteriormente encaminhadas para a empresa Genomic Engenharia Molecular Ltda.
(São Paulo – SP – Brasil) juntamente com os iniciadores citados anteriormente.
Neste estabelecimento foram processadas as reações de sequenciamento das
amostras utilizando BigDye® Terminator v3.1 Cycle Sequencing Kit (Applied
Biosystems). Os produtos de sequenciamento foram submetidos à eletroforese em
sequenciador modelo 3130xl da Applied Biosystems.
3.4. Análise das sequências
As amostras tiveram suas sequências de consenso geradas no Staden
Package, onde foram inspecionadas visualmente os eletroferogramas para busca de
possíveis erros de leitura, inserções e deleções. As sequências obtidas foram
comparadas com aquelas disponíveis no GenBank, utilizando a ferramenta BLAST,
para confirmação da identidade do fragmento gênico amplificado. O alinhamento foi
realizado no programa ClustalX 1.8 (Thompson et al., 1997). As sequências foram
lidas no programa BIOEDIT (Hall,
1999),
sendo novamente inspecionadas
24
visualmente para busca de possíveis erros, bem como para a codificação de
inserções e deleções.
3.5. Análises de Polimorfismo Molecular
3.5.1. Análise de diversidade genética
Haplótipos são conjuntos de sequências que compartilham a mesma
composição e ordenamento de nucleotídeos. Diversidade de haplótipos é definida
como a probabilidade de duas sequências, escolhidas aleatoriamente em uma
população, serem diferentes dentro desta população e diversidade nucleotídica é o
número de nucleotídeos diferentes por sítio entre sequências escolhidas
aleatoriamente. Medidas de diversidade molecular como diversidade de haplótipos
(Hd) e nucleotídica (Pi) foram calculadas utilizando-se o programa DnaSP, versão
4.5 (Rozas et al. 2003), bem como número de haplótipos, número médio de
diferenças nucleotídicas (k). O conteúdo G+C foi calculado utilizando o programa
Arlequin ver. 2000 (Schneider et al. 2000).
3.5.2. Testes de Neutralidade
Segundo a teoria neutra de mutações de Kimura (1968) a maior parte das
substituições de nucleotídeos que ocorrem nos indivíduos de uma população e são
fixadas são neutras em relação ao sucesso reprodutivo (fitness) e sobrevivência da
espécie. Para testar se a substituição de nucleotídeos seguiu essa teoria foram
realizados os teste de D de Tajima (Tajima 1989), F* e D* de seletividade neutra (Fu
& Li 1993) e Fs de Fu (Fu, 1997) com significância em p < 0,05, implementados
pelos programas DnaSP, versão 4.5 (Rozas et al. 2003) e Arlequin ver. 2000
(Schneider et al. 2000).
25
3.5.3. Análise de Variância Molecular (AMOVA)
A análise de variância molecular (AMOVA) foi realizada para verificação de
populações diferenciadas, analisando seu grau de significância intra e
interpopulacional levando em consideração o número de mutações entre haplótipos
moleculares. Estes cálculos são baseados na metodologia descrita por Excoffier et
al. (1992) e estão implementadas no programa Arlequin, ver. 2000 (Schneider et al.
2000). As populações são reunidas em grupos previamente definidos, no caso com
base em critérios geográficos, onde os resultados baseiam-se em permutações
entre os grupos (Fct), depois são obtidos valores para permutação entre populações
dentro dos grupos (Fsc) e o terceiro passo seria permutação dentro das populações
(Fst).
3.5.4. Estruturação das populações
A estruturação das populações foi avaliada por meio do número efetivo de
migrantes (Nm) e valores de índice de fixação (Fst), ambos calculados pelo
programa Arlequin ver. 2000 (Schneider et al. 2000) através de 3000 permutações
paramétricas entre os haplótipos das populações. Estes índices são relacionados,
quando considerados dados haplóides, pela seguinte relação Fst = 1/2 Nm + 1.
3.5.5. Isolamento por distância
O isolamento por distância foi testado através de metodologia desenvolvida
por Mantel (1967), implementado no programa IBDWS - Isolation by Distance web
service versão 3.16 (ibdws.sdsu.edu/). Este método realiza análise de correlação
entre matrizes de similaridade genética e matrizes de distância geográfica. A
distância genética (similaridade) foi obtida no programa Arlequin ver. 2000
(Schneider et al. 2000) e as distâncias geográficas foram obtidas através de cálculos
realizados no programa Google Earth 5.0.
26
3.5.6. Análises dos haplótipos
O programa TCS versão 1.21 (Clement et al. 2000) foi utilizado para
inferência do relacionamento genealógico entre os haplótipos. A formação da rede
de haplótipos dá-se pela utilização de parcimônia máxima
Para avaliar o relacionamento filogenético entre os haplótipos de Ae. aegypti
e verificar se estes compõem somente um ou mais agrupamentos foi construído
dendrograma de haplótipos baseado em Neighbor-Joining utilizando modelo de
distância genética de Tamura-Nei perante 1000 réplicas. Para tal foram utilizadas
ferramentas disponibilizadas pelo programa MEGA versão 4.0 (Tamura et al. 2007).
27
4. RESULTADOS e DISCUSSÃO
As análises foram realizadas a partir de sequências de um fragmento do gene
mitocondrial NADH4 desidrogenase de 47 indivíduos provenientes de sete
populações do Paraná. Todas as sequências passaram por inspeção visual do
posicionamento e confiabilidade das bases ao menos duas vezes antes de serem
utilizadas nas análises estatísticas, descartando as que apresentavam baixa
qualidade, o que resultou em 26 sequências utilizadas (Anexo I).
As sequências tiveram trezentos e quarenta e três nucleotídeos analisados.
Foram utilizados dez indivíduos de Santa Helena, sete de Foz do Iguaçu, dois de
Cascavel, dois de Loanda, dois de Maringá, dois de Pato Bragado e um de Ubiratã
resultando em nove diferentes haplótipos.
Todos os haplótipos encontrados no presente trabalho tiveram suas
sequências submetidas à ferramenta Blast do GenBank para confirmação do
fragmento amplificado como sendo do organismo estudado, bem como realização de
análises de similaridade para detecção de possíveis coincidências com demais
haplótipos de NADH4 de A. aegypti depositadas no banco de dados.
A frequência relativa dos nove haplótipos distribuídos nas sete populações
está ilustrada na figura 7. O haplótipo mais abundante foi o H1 (69,23%), tendo 18
indivíduos distribuídos nas populações de Cascavel (5,5%), Foz do Iguaçu (33,3%),
Maringá (5,5%), Santa Helena (44,7%) e Pato Bragado (11%). Os outros oito
haplótipos referiram-se à haplótipos singletons, ou seja, haplótipos só identificados
em um indivíduo estudado (Tabela 3). Quando submetido à análise de similaridade
com as sequências já depositadas no GenBank não houve similaridade total com
nenhuma das sequências, considerando-se similaridade total como coincidência
entre os trezentos e quarenta e três pares de bases das sequências estudadas e as
que estão depositadas nesse banco de dados.
O grande número de indivíduos distribuídos por diferentes locais do estado
pode ser evidência de que esta é uma linhagem há muito tempo estabelecida. O fato
de não ocorrer em outros locais do país pode ser devido a terem sido realizadas
amostragens insuficientes para detectá-lo ou este ser exclusivo do Paraná,
provavelmente tendo sido originado de outro haplótipo ainda mais antigo. Apenas
dois dos municípios estudados não apresentaram este haplótipo, Loanda e Ubiratã,
28
fato que pode estar relacionado com a recente história da presença do vetor e dos
casos de dengue nesses municípios.
Os demais haplótipos (oito), todos singletons, apresentam-se distribuídos
pelos municípios de Santa Helena (dois), Foz do Iguaçu (um), Cascavel (um),
Loanda (dois), Maringá (um) e Ubiratã (um). Dentre essas seqüências foi verificada
coincidência total entre o haplótipo H5 do presente trabalho, que ocorreu em
indivíduo proveniente do município de Santa Helena, e H10 do trabalho de Costa et
al. 2006 (GenBank #EF153753). Esse fato evidencia a ligação entre indivíduos do
Paraná e de outros locais do país, reforçando o papel do homem como principal
transportador da espécie, uma vez que esta não apresenta grande capacidade de
dispersão, realizando apenas vôos a pequenas distâncias (Reiter et al. 1995).
Outras interpretações sobre a movimentação de A. aegypti no Paraná poderão
receber melhores explicações após publicação em periódico do trabalho de Costa et
al. 2006, permitindo conhecer os locais onde foram coletados indivíduos com o
haplótipo H10 e assim estabelecer relação com a cidade de Santa Helena, município
este de grande importância para o Estado do Paraná e também para todo o país por
terem sido reportados casos de febre amarela no ano de 2007, mesmo ano em que
os espécimes utilizados neste estudo foram coletados.
Uma das possibilidades para presença dos demais haplótipos únicos
encontrados pode ser explicada pelo fato de terem ocorrido mutações recentes que
tenham se fixado nas populações e/ou indivíduos analisados e que ainda não foram
dispersos através das fronteiras dos municípios estudados. Essas mutações em
geral acontecem após períodos de expansão populacional seguidos de efeito
gargalo de garrafa (bottleneck), que são pressões que forçam um abrupto declínio
populacional, selecionando alguns indivíduos ou grupos de indivíduos da população
que sobrevivem. Assim estes indivíduos tornam-se fonte de diversidade para originar
as populações seguintes. Quando se tratam de populações de vetores o grande
declínio das populações está fortemente relacionado às atividades de controle
aplicadas geralmente quando os índices de infestação, muitas vezes realizados com
base em pesquisa larvária ultrapassam níveis estabelecidos pelos órgãos oficiais de
saúde pública. O índice de infestação predial é parâmetro mais usado. Com valores
menores que 1 o índice é considerado satisfatório, entre 1 e 3,9 nível de alerta e
maior que 3,9 há risco de surto da doença (SVS/Ministério da Saúde).
29
Em ações de controle dirigidas aos adultos, indivíduos que causam incômodo
de forma direta aos humanos, o declínio populacional é facilmente visível, porém
devem-se considerar também as formas imaturas. Assim, quando as ações são
dirigidas aos imaturos, ocorre redução de locais para oviposição por ação mecânica
(destruindo potenciais criadouros) além da aplicação de produtos químicos larvicidas
que causam impacto negativo na geração seguinte de adultos, ao mesmo tempo que
fragmenta espacialmente a distribuição do vetor, podendo repercutir na estrutura
genética dessas populações.
Tabela III: Localidade de coleta dos indivíduos de A. aegypti
sequenciados do Estado do Paraná, número de indivíduos utilizados e
haplótipos resultantes.
Cidade N Haplótipos/quantidade
Foz do Iguaçu 7 H1(6), H3(1)
Santa Helena 10 H1(8), H2 (1), H5 (1)
Cascavel 2 H1(1), H4(1)
Pato Bragado 2 H1(2)
Loanda 2 H6(1), H8(1)
Ubiratã 1 H9(1)
Maringá 2 H1(1), H7(1)
N: número de indivíduos estudados
30
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
H1 H2 H3 H4 H5 H6 H7 H8 H9
Figura 7: Frequência relativa dos nove haplótipos
detectados nas populações de Aedes aegypti provenientes
de Cascavel, Foz do Iguaçu, Loanda, Maringá, Pato
Bragado, Santa Helena e Ubiratã, Paraná.
As sequências apresentaram 31 sítios polimórficos (Tabela 4), dos quais 16
foram informativos para parcimônia. A composição de nucleotídeos foi de 9,06%
para citosina (C), 42,81% de timina (T), 27,44% de adenina (A) e 20,69% de guanina
(G), resultando em conteúdo G+C foi de 29,75%, dentro do esperado para Insecta,
que é de aproximadamente 30%.
O número de indivíduos sequenciados (N), o número de haplótipos
encontrados (NH), a diversidade de haplótipos (Hd) e a diversidade de nucleotídeos
(Pi) têm seus valores ilustrados na Tabela 5. O número médio de diferenças
nucleotídicas foi de K=3,93231.
31
Tabela IV: Posição das mudanças nucleotídicas nos nove haplótipos encontrados nas populações de A. aegypti do
Paraná.
Haplótipo
Posições de mudanças nucleotídicas
N°
indivíduos
1
1 1
1
1
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2
2 2
3
3
3 3
3
3
3
3
2
2
3
3
8
2
4 4
5
6
0
3
4
6
7
7
8
9
9
9
9
9 9
0
0
2 3
3
3
4
4
6
9
2
9
3
2
3 6
2
1
0
7
5
6
4
8
1
1
3
6
7
8 9
1
2
3 4
5
9
1
2
H1 T
T
T
T
T
T
C
T
T
A
T
A
T
A
A
A
T
T
A
T
A
C
T
T
A
C
T
A
T
T
T
18
H2 T
T
T
T
T
T
C
T
T
A
T
A
T
C
A
A
T
T
A
C
A
C
T
T
A
C
T
A
T
T
T
1
H3 T
T
T
A
T
T
C
T
T
A
T
A
T
A
A
A
T
T
A
T
A
C
T
T
A
C
T
A
T
T
T
1
H4 T
T
T
T
T
T
C
C
T
A
T
A
T
A
A
A
T
T
A
T
A
C
T
T
A
C
T
A
T
T
T
1
H5 C
T
C
T
C
A
T
T
C
G
C
A
C
A
A
G
A
T
G
T
A
C
T
T
A
T
T
A
T
T
T
1
H6 C
T
C
T
C
A
T
T
C
G
C
A
C
A
T
T
A
T
G
T
A
C
T
T
A
T
A
T
C
C
A
1
H7 T
C
T
T
T
A
C
T
T
A
T
A
T
A
A
A
A
T
A
T
A
C
T
T
A
T
T
A
T
T
T
1
H8 T
T
T
T
T
T
C
T
T
A
T
A
T
A
A
A
T
T
A
T
A
C
T
T
A
C
A
T
C
C
C
1
H9 T
T
T
T
T
T
C
T
T
A
T
T
T
A
A
A
T
G
A
A
T
A
C
C
C
C
T
A
T
T
T
1
32
Tabela V: Diversidade genética calculada para sete populações de
Aedes aegypti do Paraná.
População N NH Hd Pi
Total 26 9 0,529 0,01146
Santa Helena 10 3 0,378 0,00875
Foz do Iguaçu 7 2 0,286 0,00083
Cascavel 2 2 1,000 0,00292
Loanda 2 2 1,000 0,04373
Pato Bragado 2 1 0,000 0,00000
Maringá 2 2 1,000 0,01166
N: número de indivíduos estudados; NH: número de haplótipos
encontrados; Hd: diversidade genética; Pi: diversidade nucleotídica. O
município de Ubiratã não foi incluída nas análises, pois teve um indivíduo
analisado.
A diversidade de haplótipos (Hd) nas populações de A. aegypti apresentou
valores considerados baixos (Hd = 0,5292) quando comparados com outros
trabalhos realizados com a espécie, como 0,66 (Bracco 2004), 0,686 (Costa-da-Silva
et al. 2005). Também, quando este índice foi calculado para as populações dos
municípios separadamente apresentou valores ainda mais baixos, Hd = 0,297 e
0,286 para Santa Helena e Foz do Iguaçu respectivamente, com os demais
municípios apresentando valores iguais a um devido a não repetição de haplótipos.
Outras espécies de culicídeos apresentam em geral valores baixos de diversidade
haplotípica como Anopheles trinkae (Hd = 0,599), A. albimatus (Hd = 0,0045) e A.
nuneztovari (Hd = 0,564), porém para A. darlingi os valores verificados são altos (Hd
= 0,756) (Conn et al. 1997, De Mérida et al. 1999, Scarpassa et al. 2000; Angêlla
2006). Em comparação com outros trabalhos realizados com NADH4 para A. aegypti
como os supra citados, os valores aqui apresentados são menores, porém este
parâmetro deve ser analisado com bastante cuidado, uma vez que a diversidade
haplotípica está relacionada com o tamanho amostral em se tratando de trabalhos
que utilizam como fonte de informação sequências de DNA mitocondrial. Por este
33
fato o uso de valores de diversidade de haplótipos muitas vezes não são sequer
mencionados em muitos trabalhos com mtDNA e os valores de diversidade de
nucleotídeos (Pi) são os mais indicados para comparação em estudos com DNA
mitocondrial. Os altos valores de diversidade haplotípica para as populações de
Cascavel, Maringá, Pato Bragado, Loanda e Ubiratã (Tabela 5) podem significar que
estas populações passaram recentemente por eventos que causaram declínio da
população, como gargalo de garrafa (bottleneck). Esses eventos podem ser
decorrentes do uso de inseticidas, colonização e recolonização.
A diversidade de nucleotídeos (Pi), que reflete a probabilidade de dois
nucleotídeos homólogos, escolhidos ao acaso, serem diferentes em uma população,
é um índice muito explorado em trabalhos com mtDNA. O maior emprego da
diversidade nucleotídica deve-se ao fato de seus valores não estarem vinculados
com o tamanho amostral, como citado para diversidade haplotípica. O valor de
diversidade de nucleotídeos foi de 0,01146 quando considerados todos os
indivíduos, com valores maiores sendo verificados quando analisadas as populações
de maneira separada (Tabela 5). Outros trabalhos realizados com populações
brasileiras obtiveram valores de Pi próximos ao do presente trabalho, como Bracco
et al. (2007), Pi = 0,01997 e Lima-Júnior (2007) com Pi = 0,0113. Para o Peru
(Costa-da-Silva et al. 2005) o valor encontrado foi de Pi = 0,0079, bem menor que os
apresentados pelas populações do Brasil. Dentro de cada município o maior valor de
diversidade nucleotídica foi Loanda (Pi=0,04373) que aparentemente pode ter sido
causado pela detecção de haplótipo único altamente divergente em comparação
com os demais encontrados, seguido de Maringá (Pi=0,01166). Maringá pode estar
apresentando este resultado por ser um grande centro urbano densamente povoado
e apresentar grande fluxo de pessoas por ser um dos principais centros comerciais,
culturais e educacionais na região onde está inserida.
Os valores dos testes de neutralidade, D de Tajima, D* e F* de Fu & Li, e Fs
de Fu e Li foram aplicados à todas as populações em conjunto e também às
populações, uma a uma, mostraram alguns valores significantes considerando 95%
de significância (Tabela 6). Exceto pelo teste D de Tajima, os demais testes
estatísticos mostraram que as substituições de nucleotídeos estão ocorrendo de
acordo com a teoria neutra de substituição de nucleotídeos proposta por Kimura
(1968). O teste Fs de Fu mostra-se como ferramenta promissora na detecção de
processos históricos de expansão populacional, pois considera o fator temporal para
34
classificar as mutações e tem alta sensibilidade para detectar mutações recentes.
Quando analisados somente os valores do teste Fs de Fu podemos verificar que as
populações aqui estudadas não estão passando por processos de expansão
populacional. Isso também é reforçado pelos valores relativamente altos de
diversidade nucleotídica, parâmetro que é indício de declínio ou redução
populacional quando em decréscimo. Para as populações como um todo e para a
cidade de Santa Helena os valores do D de Tajima mostraram valores significativos
(e negativos) que revelam que estariam ocorrendo substituições deletérias nos pares
de bases. A tendência geral na evolução é que a seleção natural elimine este tipo de
mutação. Assim, as mutações deletérias podem ter sido detectadas tão logo
ocorreram, sendo provenientes de haplótipos únicos e que surgiram há pouco tempo
nas populações, uma vez que a seleção natural ainda não foi capaz de eliminá-las
dessas populações.
Tabela VI: Resultado dos testes de neutralidade de populações de A. aegypti do
Estado do Paraná.
População D de Tajima
D* de Fu & Li F* de Fu & Li Fs de Fu
Santa Helena -1,99996* -2,35081 -2,083 -0,093
Foz do Iguaçu -1,00623 -1,04881 -1,10146 -0,095
Cascavel NC NC NC 0
Maringá NC NC NC 1,38629
Loanda NC NC NC 2,70805
Total -2,09099* -1,62725 -2,083 -0,093
As análises estatísticas foram realizadas com 95% de significância. * indica valores
significativos.
As análises de variância molecular revelaram que a maior fonte de variação
genética ocorreu entre populações (56,63%), com valores de Fst (0,56631; P < 10
-5
)
indicando estruturação das populações. Os valores significativos de Fst entre as
populações de Santa Helena e Foz do Iguaçu com as demais populações devem ser
35
fonte desta variação, resultando na estruturação observada (Tabela 7). Um fato
interessante é que na maior parte dos estudos realizados no Brasil a maior
porcentagem da variação entre os indivíduos estar ocorrendo dentro dos grupos
(Bracco et al. 2007, Lima-Júnior 2007, Paduan & Ribolla 2008).
Quando realizada a segunda análise de variância molecular, considerando
quatro grupos distintos de agrupamento de populações, a maior fonte de variação
genética foi encontrada entre as populações dentro dos grupos (68,85%, Fsc:
0,59295, P<10
-5
) (Tabela 8). Este alto valor de variação entre populações dentro
dos grupos pode ser decorrente de valores significativos de Fst de Santa Helena e
Foz do Iguaçu que compõem o grupo Oeste (já evidenciado na primeira AMOVA),
formado por mais duas populações (Cascavel e Pato Bragado) além das já citadas.
Os demais grupos são, cada um, formados por apenas uma população, assim
reforçando o papel da mesorregião Oeste como grupo com grande variabilidade
genética dentre os indivíduos estudados.
Quanto à mesorregião Oeste, podemos destacar seu papel importante por
apresentar área de contato e grande fluxo de pessoas e mercadorias devido à
presença da tríplice fronteira entre Brasil, Paraguai e Argentina, representada pela
cidade de Foz do Iguaçu. Essa cidade, além de ser local de trânsito de mercadorias
e pessoas entre os países, também recebe turistas de diversas partes do mundo
interessados em conhecer o Parque Nacional do Iguaçu e as Cataratas do rio
Iguaçu. Santa Helena também se encontra em limites territoriais do Paraná com o
Paraguai, apresentando também considerável fluxo de pessoas. Importante
acrescentar que ambas cidades são banhadas pelo rio Paraná, por onde Aedes
aegypti pode estar sendo disperso através de transporte náutico, comum na região.
36
Tabela VII: Análise de variância molecular (AMOVA) considerando todas as
populações de Aedes aegypti consideradas no Paraná em um único grupo.
P< 10
-5
Tabela VIII: Análise de variância molecular (AMOVA) considerando as populações de Aedes aegypti do
Estado do Paraná de maneira separada, em agrupamentos por mesorregiões.
Tipo de Variação GL CV % de Variação
Índice de
Fixação
Entre populações 3 -0,07278 -16,11 -0,16108
a
Entre populações dentro dos grupos
3 0,31108 68,85 0,59297
b
Dentro das populações 19 0,21353 47,26 0,52741
b
a
P significativo;
b
P < 10
-5
Tipo de variação GL CV % de variação Índice de fixação
Entre populações 6 6,751 56,63 Fst = 0,56631
Dentro de populações 19 4,057 43,37
37
A diferenciação genética entre as sete populações estudadas foi analisada
levando em consideração os valores par a par de Fst e também pelo número efetivo
de migrantes (Nm) entre as populações, cujos valores são disponibilizados nas
tabelas 09 e 10. Os resultados mostram valores significativos de Fst (P < 0,00238)
após a correção de Bonferroni (Rice, 1989), em comparações principalmente
envolvendo os municípios de Santa Helena e Foz do Iguaçu.
Os valores de número de migrantes por geração (Nm), calculados a partir dos
valores de Fst par a par, revelam valores significativos de troca de indivíduos entre
algumas populações. Estas trocas ocorreram em especial entre Santa Helena e Foz
do Iguaçu com as demais populações, exceto Loanda, que apresentou apenas um
haplótipo singleton, ressaltando a ausência da relação entre as distâncias genéticas
e geográficas entre as populações. A presença de maiores quantidades de
indivíduos do haplótipo H1 pode estar levando a esta situação de fluxo gênico não
relacionado com a distância geográfica.
Os valores de número de migrantes mostram-se baixos quando comparadas
com outros trabalhos, como por exemplo, Lima-Júnior (2007), que calculou mais de
três dezenas de migrantes por geração entre localidades, indicando que as
populações aqui estudadas encontram-se estruturadas. Vale ressaltar que em Lima-
Júnior (2007) a amostragem mostrou-se uniforme entre as localidades amostradas e
também foram encontrados valores menores de número de migrantes entre alguns
pares. Esta situação pode estar acontecendo por vários motivos, porém o que pode
ser muito interessante nesta situação é que a migração de pessoas e mercadorias
por via rodoviária não está sendo fonte de colonização e recolonização de A. aegypti
nos municípios, o que é um fato positivo para o controle da espécie. Outra
explicação para tal estruturação é a de que as populações de Aedes aegypti estão
sendo mantidas, ainda que em pequeno número de indivíduos, mesmo com ações
de controle realizados pelo órgãos oficiais do Estado. Recentemente, Prophiro
(2008) revelou uma menor susceptibilidade de A. aegypti ao temefós no município
de Foz do Iguaçu, dando subsídios à hipótese de que as populações não estão
sendo eliminadas em sua totalidade apesar da aplicação de inseticidas.
O isolamento por distância, definido pela diminuição da similaridade entre
populações à medida que a distância geográfica entre elas aumenta, foi testado
através de metodologia desenvolvida por Mantel. Esta análise revelou que as
populações não apresentaram valor significativo para correlação (R = -0,0659; P =
38
0,5770) entre as distâncias genéticas dos indivíduos e a distância geográfica entre
as cidades onde estes indivíduos foram coletados (Figura 8).
Quando submetidas à mesma metodologia as populações que compõe a
mesorregião Oeste (Foz do Iguaçu, Santa Helena, Cascavel e Pato Bragado) o valor
para correlação entre as distâncias também não apresentou valor significativo (R = -
0,2027; p = 0,5420) (Figura 9).
O isolamento por distância pode estar diretamente relacionado com o
movimento humano, aumentando a similaridade genética entre populações
geograficamente distantes (Wright 1943). Estudos realizados no México corroboram
esta teoria, sugerindo que o fluxo gênico entre as populações de Aedes aegypti do
país diminui com o aumento da distância geográfica (Gorrochotegui-Escalante et al.
2002). Paduan & Ribolla (2008), porém obtiveram dados que revelaram populações
não isoladas por distância. Do mesmo modo, os dados aqui obtidos não
encontraram qualquer relacionamento entre distâncias geográficas e genética.
Assim pode-se inferir que a distância não está se mostrando como fator
determinante no isolamento detectado para as populações paranaenses, talvez por,
na maior parte das vezes, a migração de A. aegypti estar relacionada muito mais a
movimentos antrópicos (que não originam padrão) do que por movimentos do vetor.
Uma maior amostragem nestas e em outras cidades do Paraná também podem ter
grande valor para elucidar este quadro.
39
Tabela IX: Valores de Fst par a par para populações de Aedes aegypti das cidades estudadas no
Estado do Paraná
SH FI C M PB L U
FI 0,66145*
C 0,50450* 0,56465*
M 0,50450* 0,56465* 0,00000 0,00000
PB 0,68165 0,76536* 0,50000 0,50000 0,00000
L 0,50450* 0,56465* 0,00000 0,00000 0,50000 0,00000
U 0,62222 0,71429 0,00000 0,00000 1,00000 0,00000 0,00000
SH – Santa Helena; FI – Foz do Iguaçu, C – Cascavel; M – Maringá; PB – Pato Bragado; L –
Loanda; U – Ubiratã. * valores significativos após correção de Bonferroni.
Tabela X: Valores de Nm (número efetivo de migrantes) entre indivíduos provenientes
das populações de Aedes aegypti das sete cidades paranaenses estudadas.
SH FI C M PB L
FI 0,25591
C 0,49107 0,38551
M 0,49107 0,38551 inf
PB 0,23352 0,15328 0,50000 0,50000
L 0,49107 0,38551 inf inf 0,50000
U 0,30357 0,20000 inf inf 0,00000 inf
40
Figura 8: Gráfico de regressão de Mantel para as populações
de Aedes aegypti com uso de Fst par a par. R=-0,0659;
p=0,5770.
41
Figura 9: Gráfico de regressão de Mantel para as populações de
mesorregião Oeste de Aedes aegypti com uso de Fst par a par.
R=-0,2027; p=0,5420.
Um dendrograma baseado nas sequências dos haplótipos foi gerado
utilizando-se o programa Mega versão 4.0 (Figura 10). As sequências de cada um
dos nove haplótipos foram utilizadas para a realização do mesmo. O resultado
revelou a formação de dois clados distintos com os haplótipos encontrados, um
contendo os haplótipos H5 e H6 (Santa Helena e Loanda) e os outros com todos os
demais haplótipos em concordância com os dados obtidos para populações já
estudadas de A. aegypti em território nacional (Lima-Júnior 2007; Bracco et al. 2007)
que também utilizaram como ferramenta o gene mitocondrial NADH4.
42
Com base no método de parcimônia máxima foi construída uma rede de
haplótipos no programa TCS (Figura 11), onde as elipses e quadrados são
proporcionais ao número de indivíduos pertencentes a cada haplótipo. Este
resultado reforçou os resultados obtidos pelo dendrograma, pois a rede de
haplótipos mostrou os haplótipos H5 e H6 como sendo os mais distantes dos
demais, com maior número de mutações em relação ao provável haplótipo ancestral
H1 (com maior número de indivíduos). Este fato vem sendo atribuído à presença de
duas subespécies no continente africano: Aedes aegypti aegypti e Aedes aegypti
formosus, proposto por Tabachick & Powell (1978). Valores de relógio molecular
calculados no trabalho de Bracco (2004) indicam que estas duas subespécies
separaram-se há 35 milhões de anos. Powell & Tabachick (1980) apresentam a
proposição de que a espécie que inicialmente colonizou as Américas e Caribe nos
séculos XVII e XVIII foi Aedes aegypti aegypti, e então posteriormente teria havido a
entrada de Aedes aegypti formosus nesta região. Mais estudos, em escala mundial,
são necessários para gerar maiores subsídios no sentido de elucidar a possibilidade
de haver duas linhagens mitocondriais distintas de Aedes aegypti.
Diante destes resultados pode-se levantar a hipótese de que as populações
de A. aegypti estudadas no Estado do Paraná apresentam duas linhagens
mitocondriais. A presença de linhagens diferenciadas de Aedes aegypti possui
implicações na epidemiologia da dengue. Failloux et al. (2002) indicaram a detecção
de diferentes taxas de infecção pelo sorotipo DEN-2 entre as subespécies. Deste
modo, Aedes aegypti aegypti apresenta taxas de infecção mais altas quando
comparadas com Aedes aegypti formosus. Também estudos realizados sem
considerar subespécies evidenciam variações na competência vetora no México e
Estados Unidos ao considerar o mesmo sorotipo de dengue (Bennett et al. 2002).
43
Figura 10: Dendrograma dos nove haplótipos de Aedes aegypti utilizando o método de Neighbor-
Joining (modelo de distância genética de Tamura-Nei), com inclusão de A. albopictus como grupo
externo. Os valores de bootstrap encontram-se nos ramos.
44
Figura 11: Rede de haplótipos com
base no método de parcimônia máxima
construída no programa TCS.
45
5. CONCLUSÕES
Foram encontrados nove haplótipos diferentes nas sete populações
paranaenses investigadas no presente estudo.
Destes haplótipos, oito foram singletons e apenas um foi detectado em mais
de um indivíduo e população, ocorrendo em Cascavel, Foz do Iguaçu, Maringá, Pato
Bragado e Santa Helena.
Os resultados dos testes de neutralidade realizados indicam que as
populações paranaenses de A. aegypti não estão passando por processos de
modificação de tamanho populacional e que algumas mutações são deletérias,
podendo indicar que estas ocorreram recentemente ao passo que ainda não
puderam ser eliminadas por seleção natural.
As populações estudadas encontram-se estruturadas, com grande variedade
de haplótipos singletons e valores muito baixos de troca de indivíduos por geração.
O fluxo gênico ocorre em maior proporção entre Foz do Iguaçu e Santa
Helena entre si e com as outras localidades, com valores significativos de Fst par a
par, mostrando estas como as populações menos estruturadas.
Não há correlação entre a distância geográfica entre as populações
analisadas e a distância genética entre estas.
É provável que duas linhagens diferentes de A. aegypti tenham sido
introduzidas no Paraná, evidenciado pela presença de dois grupos distintos no
dendrograma gerado para os haplótipos.
46
6. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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56
ANEXO I
Sequências de NADH4 de Aedes aegypti do Estado do Paraná
57
58
59
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