( PDF ) Relação entre fatores morfofisiológicos e indicadores de desempenho derivados do modelo de carga crítica na natação em ratos Wistar

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CENTRO DE EDUCAÇÃO FÍSICA E ESPORTE

Londrina

200

PATRICIA CHIMIN

RELAÇÃO ENTRE FATORES

MORFOFISIOLÓGICOS E

INDICADORES DE DESEMPENHO

DERIVADOS DO MODELO DE

CARGA CRÍTICA NA NATAÇÃO

EM RATOS WISTAR

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Dissertação de Mestrado apresentada ao

Programa de Pós-Graduação Associado

em Educação Física – UEM/UEL para

tenção do título de Mestre em

Educação Física.

Londrina

200

PATRICIA CHIMIN

RELAÇÃO ENTRE FATORES

MORFOFISIOLÓGICOS E

INDICADORES DE DESEMPENHO

DERIVADOS DO MODELO DE

CARGA CRÍTICA NA NATAÇÃO

EM RATOS WISTAR

Orientador:

Prof. Dr.

Fábio Yuzo Nakamura

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COMISSÃO JULGADORA

Prof. Dr.

Fábio Yuzo Nakamura

Orientador

Prof

. Dr

Solange Marta Franzói de

Moraes

Prof. Dr.

Claudio Alex

andre Gobatto

iii

Dedicatória

Dedico

este trabalho aos meus pais, José Carlos e Maria

de Lourdes e também aos meus irmãos, Robson e Caio

por todo o apoio que me deram durante toda essa

jornad

Agradecimentos

Agradeço

primeiramente a Deus por iluminar meu caminho e me dar

forças para continuar.

Agradeço também imensamente minha família (pais e irmãos) por todo

o apoio durante o tempo que estive longe,

tanto

nos momentos bons quanto

nos momentos não tão bons. Agradeço também pelo apoio da minha avó

Aparecida, mesmo que às vezes não entendesse o porquê de eu estar tão

longe. Muito obrigada mesmo!

Não poderia deixar de agradecer ao meu namorado Luiz Augusto (Lulo)

por toda a ajuda quando me mudei para Londrina, e também durante todo o

mestrado. Obrigada pelo carinho e pelas conversas! Da mesma forma, tenho

uma imensa gratidão por toda sua família: Jair, Maria Angélica e João Paulo.

Obrigada por sempre se preocuparem comigo e por me tratarem como uma

filha também!

Ao Prof. Dr. Fábio Yuzo Nakamura pela orientação, conversas

ensinamentos

e por toda confiança depositada em mim.

À professora Jeane Barcelos pela amizade, pelas conversas, conselhos

e por me mostrar que ainda há muito q

ue se fazer pela área.

Ao professor Jefferson Cardoso Rosa pelas aulas de estatística e pela

amizade.

Ao meu companheiro de mestrado Lúcio Flávio pelos risos no

laboratório e por toda a ajuda, e também ao Nilo

Massaru

Okuno por todas

as conversas e

pelo

apoio.

Obrigada também ao GEAFIT e aos seus

integrantes

las

apresentações de trabalhos e amizade. Com certeza foi

uma experiência muito boa para minha formação.

À professora Solange Marta Franzói de Moraes, assim também como

toda sua família, por ter me recebido em sua casa, por toda a ajuda durante

as coletas e pela amizade. Sua

ajuda

foi

fundamental para a realização

desse trabalho

agradecimento

especial para o pessoal da Universidade Esta

dual

de Maringá, principalmente ao agora mestre, Felipe Natali, que deixava suas

coisas de lado para

auxiliar

durante as análises dos meus dados e pela

amizade.

Às

écnica

s Elizete Rosa dos Santos e Valéria Schoffen Romão

Carrascoza

pela

ajuda durante as coletas e

também

pela amizade no tempo

que estive em M

aringá

. Aos professores Célia Regina de Godoy Gomes e

Celso Ivan Conegero

pelo auxílio nas análises

o Renato

Nachbar

e ao ICB

USP pela análise enzimática

Aos amigos Rômulo Fernandes, Marcio Kawano, Diego Leite, Cássio

Gustavo

, Aline Gerage

Débora

Alo

nso

e Camilla Kawanishi pelo apoio

durante a realização do mestrado. E um agradecimento especial para Camila

Rosa pela amizade e pela companhia nas corridas de quarta

feira.

Aos meus amigos de longa data, que mesmo longe sempre me deram

muito

apoio.

À todos que de uma maneira ou de outra participaram para meu

crescimento e desenvolvimento

acadêmico

, muito obrigada!

CHIMIN

Patricia

Relação entre fatores morfofisiológicos e indicadores de

desempenho derivados do modelo de Carga Crítica na natação em ratos W

istar

200

f. Dissertação (Mestrado em Educação Física) – Centro de Educação Física e

Esportes

. Universidade Estadual de

Londrina

, 200

RESUMO

O teste de Potência Crítica (PC) tem sido muito usado nos últimos anos, e vários

estudos vêm buscando compreender o real significado fisiológico de seus índices

aeróbio e anaeróbio. Testes realizados até exaustão na intensidade do índice aeróbio

obtido por esse modelo de PC foram realizados, entretanto, as variáveis fisiológicas

medidas durante os esforços não se mantiveram em estado estável, além dos sujeitos

não suportarem longos períodos de tempo, como seria esperado. Como ainda não há

um consenso sobre as variáveis fisiológicas que determinam o tempo de exercício na

intensidade da PC, outras variáveis, como, por exemplo, variáveis morfofisiológicas

que sejam capazes de predizê-la, tornam-se importantes para o melhor entendimento

de seu significado. Dessa forma, os objetivos do presente estudo foram: (1) verificar

tempo de tolerância na intensidade de 100% da Carga Crítica (Ccrit) individual, e (2)

erificar

se os

parâmetros

morfofisiológicos têm alguma relação com o desempenho e

o tempo de tolerância na natação. Vinte ratos machos da linhagem Wistar,

previamente adaptados ao exercício de natação, foram submetidos a testes preditivos

para o cálculo da Ccrit e da capacidade de nado anaeróbio (CNA), pela equação não-

linear, e subsequentemente, foram submetidos a exercício suportando 100% da Ccrit

até a exaustão. Vinte e quatro horas após o exercício, os animais foram anestesiados

para a coleta de sangue e tecidos para posterior análise de hematócrito, contagem de

hemácias, relação capilar/fibra, área

transversal

da fibra muscular do sóleo e do

gastrocnêmio

, tipagem de fibra e atividade da citrato sintase. Os resultados mostraram

que os valores de Ccrit variaram de 3,7 a 7,1% do peso corporal, enquanto que o

tempo de tolerância variou entre 350 e 2853 segundos. Foram encontradas fortes

correlações entre os próprios indicadores (Ccrit, CNA e tempo de tolerância), sendo

que todos atingiram significância estatística (P < 0,05). A Ccrit e o tempo de tolerância

se correlacionaram com a porcentagem de fibras oxidativas (r = 0,473; P = 0,035 e

r = -

0,473;

P = 0,035

respectivamente)

e com a porcentagem de fibras glicolíticas

(r = -

0,590;

P = 0,006 e r = 0,590; P = 0,006, respectivamente). A CNA apresentou

correlação moderada com a porcentagem de fibras glicolíticas, porém não significante

(r = 0,41; P = 0,1654). Somente o tempo de tolerância se correlacionou com a área

média das fibras do músculo sóleo (r = 0,569; P = 0,009). As demais variáveis

apresentaram correlações fracas com a Ccrit e o tempo de tolerância. A partir dos

resultados, pode-se concluir que o modelo de Ccrit para natação em ratos deve ser

usado com cautela, uma vez que parece não estimar a intensidade do

limiar

aeróbio. Além disso, as correlações com as variáveis morfofisiológicas indicam que

nenhuma delas pode

explicar sozinha

o desempenho

na intensidade da Ccrit.

Palavras

Chave:

carga crítica, desempenho, medidas morfofisiológicas, natação, ratos

Wistar.

vii

CHIMIN

Patricia

Relation among morphophysiologycal factors and performance

indexes derived from critical load model in swimming Wistar rats.

200

Dissertação (Mestrado em Educação Física) – Centro de Educação Física e Esportes

Universidade Estadual de

Londrina

, 200

ABSTRACT

Critical Power test (CP) has been

very

used in the last few years, and a lot of studies

seek to understand the real physiological

mean

ing

of its aerobic and anaerobic

indexes. Exhaustion tests on the

intensity

of the aerobic index given by this CP model

were done, however, the physiological variables measured during work were not

stable, besides the subjects could not take long times of exercise, as expected. As

there is not a consensus about the physiological variables that determine the time of

exercise on the CP intensity, others variables, for example, morphophysiologycal that

could be able to predict it, become important to better un

derst

and its meaning

So, the

aims of the present study were: (1) verify the time to exhaustion on 100% of individual

critical load (CL) intensity, and (2) verify if morphophysiologycal parameters correlate

with performance and time to exhaustion in swimming. Twenty male Wistar rats,

previously adapted to swimming exercise, were submitted to predictive tests to

calculate CL and anaerobic swim capacity (ASC), by non-linear equation

ubsequently, they were submitted to an exercise bearing 100% of CL

until ex

haustion.

Twenty four hours later, the animals were anaesthetize for blood and tissue collection

and later analysis of hematocrit, red blood cells count, capillary-

-fiber relationship,

soleus and gastrocnemius cross sectional area, fiber type and citrate synthase

analysis. The results showed that the CL values varied from 3.7 to 7.1% of body mass

while time to exhaustion varied from 350 to 2853 seconds. Strong relationships were

found among the own indexes (CL, ASC and time to exhaustion), and all of the

presented statistical significance (P < 0.05). CL and time to exhaustion were correlated

with proportion

oxidative

fiber

type

(r = 0.

473;

P = 0.035 and r = -

473;

P = 0.

035,

respectiv

ely

) and with proportion of

glycolytic

fiber type (r = - 0.590; P = 0.006 and

r = 0.

590;

= 0.

006, respective

)

. ASC presented moderate correlation

with

proportion

glycolytic

fiber type, but it was not significant (r = 0.

41;

P = 0.

1654

). Only time to

exhaustion

was

correlated

with cross sectional area of soleus muscle (r = 0.

569;

P = 0.

009)

. The others variables presented weak correlations with CL and time to

exhaustion. From these results, we can conclude that CL model to swimming rats

should be used carefully, since it does not seem to

estimate

the

anaerobic threshold

intensity. Besides, the correlations with the morphophysiological variables indicate that

none of them can explain itself the performance at CL intensity.

Keywords:

critical load, performance, morphophysiologycal measeures, swim

ming,

Wistar rats.

viii

LISTA DE FIGURAS

Figura 1

Representação gráfica do cálculo

da Ccrit

..........

...........

............

..........

Figura 2

Demonstração dos capilares encontrados entre as

fibras..............................................

................

..................

.....................

Figura 3

Demonstração da análise das imagens para o cálculo da área da fibra

do músculo sóleo e do músculo gastrocnêmio......

..................

..............

Figura 4

Imagem demonstrativa de lâmina corada para a técnica de NADH-

TR....................................................................................

.......................

Figura 5

Sistema

teste de ciclóides.............................................

..............

.........

Figura 6

orrelação

Spearman

entre

a Ccrit e o tempo de

tolerância................................

.............................

.......

........................

...

Figura 7

Correlação de

Spearman

entre o tempo de tolerância e a

CNA

...

........................................................

....

...

.................

..............

...

Figura 8

orrelação de

Spearman

entre a Ccrit e a CNA......

......................

.....

Figura 9

Correlação de

Spearman

entre a Ccrit e a porcentagem de fibras

oxidativas........

......................

.................................................................

Figura 10

Correlação de

Spearman

entre a Ccrit e a porcentagem de fibras

glicolíticas...................................

............................................................

Figura 11

Correlação de

Pearson

entre o tempo de tolerância e a porcentagem

de fibras oxidativas.................................................................................

Figur

a 12

Correlação de

Pearson

entre o tempo de tolerância e a porcentagem

de fibras glicolíticas................................................................................

Figura 13

Correlação de

Pearson

entre a CNA e a porcentagem de fibras

gli

colíticas...............................................................................................

LISTA DE TABELAS

Tabela 1

Dados descritivos dos valores de Ccrit e de tempo de tolerância (n =

)........................

..............

.....................................................................

Tabela 2

Valores dos coeficientes de correlação das comparações entre a

Ccrit, tempo de tolerância, área médias das fibras do músculo sóleo

área média das fibras do músculo gastrocnêmio

(µm

)..........................

Tabela 3

Coeficiente

s de correlação das comparações entre Ccrit e tempo de

tolerância com relação C/F,

hematócrito

(%) e número de

hemácias.........

...................................................................

..................

...

LISTA DE SIGLAS E ABREVIATURAS

Porcento

Porcentagem do peso corporal

%pc*s

Porcentagem do peso corporal por segundo

[la]

Concentração de lactato sanguíneo

°C

Graus Celsius

Acetil

CoA

Acetilcoenzima

Carga

C/F

Relação capilar por fibra

Ccrit

Carga Crítica

Centímetro

CNA

Capacidade de Nado Anaeróbio

Citrato Sintase

CTA

Capacidade de Trabalho Anaeróbio

Coeficiente de variação

dias.semana

-1

Dias por semana

Desvio

padrão

DTNB

Áci

do 5,5-

ditiobis(2

nitroenzóico)

EDTA

Ácido etilenodiamino tetra

acético

Gramas

Hora

xii

H.E.

Hematoxilina e Eosina

HCL

Ácido clorídrico

Hexoquinase

LACmin

Lactato mínimo

Lan

Limiar anaeróbio

MEEL

Máximo Estado Estável de Lactato

MEELv

Velocida

de do Máximo Estado Estável de Lactato

Miligramas

Mililitros

ml O

min

-1

.ml

-1

Mililitros de oxigênio por minuto por mililitros

Milimolar

mmol.l

-1

Milimol por litro

NADH

Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo – Tetrazolium

Reductase

Nanom

etro

Potência

Significância estatística

Potência Crítica

Peso corporal

Potêncial de hidrogênio

Número de pontos que tocam a estrutura em estudo

Número total de pontos do sistema teste

Coeficiente de correlação

xiii

Coeficiente d

e determinação

Segundos

Tlim

Tempo limite

Tris

Tris (Hidroximetil) Aminometano

Velocidade Crítica

Vmáx

Velocidade máxima

Consumo de oxigênio

2máx

Consumo máximo de oxigênio

Densidade de volume

µl

Microlitro

µm

Micrômetro

µm

Micrômetro ao quadrado

xiv

SUMÁRIO

1 INTRODUÇÃO ..................................................................................................

2 REVISÃO DA LITERATURA

...

.....................

.....................................................

2.1

Avanços experimentais para determinação do limiar anaeróbio.

............

2.2

Potência Crítica

.............................................................................

..............

2.3 Respostas fisiológicas durante

exrecício na intensidade da PC

..........

2.4

Indicadores de capacidade aeróbia

.....

....

....................................................

3 JUSTIFICATIVA

...

...............................................

...

...........................................

4 OBJETIVOS

...

.................

.................................................................................

4.1 Objetivo geral

.......................................................................

..........................

4.2 Objetivos específicos

....................................................................................

MÉTODOS

....

............................

......................................................................

....

5.1 Animais e tratamento

....................................................................................

5.2

Adaptação ao meio líquido

.........

..................................................................

5.3 Determinação da Carga Crtítica (Ccrit) e da Capacidade de Nado

Anaeróbio (CNA)

...

................................

...............................................................

5.4 Intensidade do exercício

.......

..........................................................

............

5.5

Coleta do material

.........................................................................................

5.6

Contagem de hemácias no sangue

....

.....................................................

5.7

Hematócrito

...

.....

..........................................

..................................................

5.8

Análises histoenzimológica e morfológica

...

.....

.........................................

5.9

Preparo dos cortes histológicos

........................

........................................

5.10

Análise histomorfométrica

.........................................................................

5.11

Sobre as imagens obtidas

..........................................................................

5.12 Preparo histoenzimológico das fibras musculares

..............................

5.13

Estudo estereológico

.....

...........................................................................

5.14 Análise da Citrato Sintase

..................

........................................................

5.15 Análise estatística

....................................................................................

6 RESULTADOS

...

........................

........................................

................................

7 DISCUSSÃO......................................................................................................

8 CONCLU

SÕES

.........................................................................................

.........

9 REFERÊNCIAS

...

...................................

............................................................

ANEXOS

................................................................................................................

Ane

xo A –

Parecer do Comitê de Ética

.............................................................

Anexo B

–

Hematoxilina e Eosina

......................................................................

Anexo C –

NADH

-TR (Nicotinamida Adenina Dinucleotíd

– Tetrazolium

Recuctase)

...........................................................................................................

1 INTRODUÇÃO

A maleabilidade do músculo esquelético, a qual permite a remodelagem

estrutural do músculo de acordo com alterações na demanda (energética, metabólica,

etc), é um fenômeno particular do reino animal. Esta plasticidade é refletida pelos

ajustes observáveis na força, resistência e velocidade de contração do músculo

esquelético, como resultado da modificação da micro-estrutura muscular, em função da

alteração na demanda ambiental. No entanto, há restrições impostas pela relação

“custo

-benefício” em que quanto maior ou mais complexo o órgão, maior será o “custo”

para manutenção orgânica.

Uma teoria unificadora sobre as adaptações estruturais e o mecanismo

molecular que conectam o estímulo único do exercício aos ajustes múltiplos que

ocorrem após o impacto repetido do estresse muscular ainda não foi identificada

A partir disso, especula-se que se diferentes pessoas apresentam

diferentes performances, mesmo sendo treinadas de maneira similar, essas poderiam

apresentar algumas adaptações morfofisiológicas distintas. Uma boa maneira de se

testar essa hipótese é realizando exercícios na intensidade do limiar anaeróbio (Lan),

em que se espera manutenção por tempo prolongado, sem que haja acúmulo de lactato

sanguíneo

2,3

A intensidade do Lan é uma boa carga para se testar essa hipótese, pois

também já foi mostrado que no término do exercício nessa intensidade, havia estado

estável nas respostas de todos os sistemas corporais estudados, a saber:

cardiorespiratório, metabólico e equilíbrio ácido-

base

. Além disso, ela respeita a

individualidade biológica, e permite a “normalização” das cargas de trabalho.

Teste invasivos e não invasivos como os utilizados para determinação

do máximo estado estável de lactato (MEEL) e potência crítica (PC), respectivamente,

buscam encontrar essa intensidade. Poucos pesquisadores investigaram, em humanos,

os tempos de tolerância determinados a partir do testes de potência crítica e

encontraram resultados conflitantes em relação ao tempo de duração, que variou entre

20 e 40 minutos

5,6,7

. Em em mamíferos, não foram encontrados estudos sobre o tempo

de tolerância na intensidade de potênc

ia crítica.

Também já se buscou verificar se seriam fatores fisiológicos (por

exemplo,

concentração de lactato sanguíneo ([la]), piruvato, estado de reoxidação,

concentrações de amônia, concentrações de bicarbonato, etc) que influenciariam a

duração dos exercícios nessa intensidade

, porém, ainda não se identificou qual a

causa fisiológica do término do exercício.

2 REVISÃO DA LITERATURA

2.1 Avanços experimentais para determinação do limiar anaeróbio

Com a necessidade de se compreender o metabolismo durante o

exercício, diferentes testes e protocolos são utilizados. Com a possibilidade do uso de

animais para realizar medidas invasivas, esses testes têm sido adaptados a eles.

Dentre os testes utilizados pode-se citar o teste do

MEEL

, o teste do lactato mínimo

(LACmin)

e o teste de

O conceito de MEEL foi proposto primeiramente por Margaria et al.

Saiki

et al.

, usando de cinco a oito cargas de exercícios constantes e independentes

para determiná-lo. Esse teste consiste em realizar esforços durante determinado

período de tempo (geralmente 30 minutos)

, em que a concentração de lactato

sanguíneo não exceda um valor pré-determinado durante um intervalo de tempo. Em

2001, Gobatto et al.

determinaram o MEEL na natação em ratos sedentários e

treinados. O teste envolveu esforços contínuos e com apresentação aleatória das

cargas equivalentes a 5, 6, 7, 8, 9 e 10% do peso corporal (pc), durante 20 minutos. Os

animais realizaram uma carga por dia, em dias alternados. Notou-se que os ratos

seden

tários apresentavam MEEL a 5,5 mmol.l

-1

de lactato sanguíneo, com sobrecarga

de 5 e 6% do pc. Com as outras cargas houve um aumento progressivo da

concentração de lactato. Já os ratos treinados alcançavam o MEEL com uma

sobrecarga de 8% do pc.

Tegtbur

et al.

desenvolveram um teste chamado de teste do

LACmin

para determinar o MEEL em humanos. O teste de LACmin consiste na realização de

uma indução à acidose, por meio de exercício de curta duração e intensidade

supramáxima, elevando a concentração sanguínea de lactato. Após oito minutos da

indução à acidose, o protocolo de teste prevê o início de um protocolo incremental. Nas

cargas inferiores a do MEEL, o lactato produzido durante a indução anaeróbia tende a

ser oxidado, reduzindo a concentração no sangue. Quando a intensidade referente ao

MEEL é atingida, a produção de lactato é igual sua remoção. Assim, cargas

imediatamente mais intensas passam a produzir lactato em relação à carga anterior,

invertendo a fase da cinética. Portanto, o ponto mínimo que o lactato sanguíneo

assume na curva em “U” da lactacidemia em função da intensidade de exercício,

corresponde à intensidade do LACmin.

Em 2002, Voltarelli et al.

adaptaram o teste de LACmin para ratos

durante a natação. Este protocolo foi novamente adaptado e ajustado por Araujo et al.

. Após testar 4 diferentes protocolos de indução à acidose, os autores verificaram que

o melhor protocolo de teste consiste em os animais realizarem dois esforços, com

sobrecarga de 13% do pc, separados por repouso passivo de 30 segundos, sendo o

primeiro esforço de 30 segundos e o segundo esforço até

a e

xaustão, para elevação da

[la].

Após 9 minutos de

recuperação

, os animais iniciaram o protocolo progressivo. O

Lan foi obtido a

5,76

± 0,

mmol.l

-1

de lactato sangüíneo, e não foi diferente do valor

do MEEL (que ocorreu entre 4,5 e 5,5% do pc).

Estudos utilizando-

de meios não invasivos para se avaliar o

desempenho também foram feitos. Dentre eles pode

se citar o teste de potência crítica.

2.2 Potência Crítica

Em experimento utilizando pequenos grupos musculares em diferentes

cargas constantes que levavam a exaustão, Monod e Scherrer

identificaram uma

relação hiperbólica entre a potência realizada e o tempo até a exaustão. A partir daí, a

assíntota dessa relação foi denominada PC, e representa a carga que teoricamente um

grupo muscular pode manter sem que ocorra a fadiga.

PC é um conceito teórico que representa a maior potência proveniente

de fontes energéticas aeróbias, e que pode ser mantida por tempo indeterminado.

Des

ta forma, sugere-se que quando a carga é inferior ou igual a PC, não ocorre

exaustão

Um segundo parâmetro que pode ser estimado a partir da relação entre

intensidade de exercício e tempo é a capacidade de trabalho anaeróbio (CTA). A CTA

corresponde ao trabalho total realizado acima da PC proveniente das reservas

energéticas intramusculares, incluindo glicogênio e o oxigênio vindo da mioglobina

10,17

representando desta forma uma medida da capacidade anaeróbia do indivíduo

18,19

Em uma tentativa de estender o conceito de PC para exercícios que

envolviam grandes grupos musculares, Moritani

et al.

aplicaram o modelo de potência

crítica em cicloergômetro. Foram realizados testes em que os sujeitos inspiravam

concentrações normais de oxigênio e algumas concentrações menores, que

permaneciam dentro de uma Bolsa de Douglas durante o exercício. Foi encontrado que

quando os indivíduos realizavam o exercício inspirando gases com menores

concentrações de oxigênio, houve uma concomitante redução na inclinação da relação

potência e tempo, enquanto o intercepto não foi alterado. A partir daí, foi evidenciado a

natureza aeróbia do parâmetro PC. Além do cicloergômetro, o conceito de PC foi

aplicado em exercício na esteira

, no caiaque

e na natação

. Como nessa

modalidades a variável que indica a intensidade é a velocidade, o parâmetro aeróbio

estimado é chamado velocidade crítica (VC).

Três equações matemáticas equivalentes têm sido utilizadas para

estimar a PC e CTA. As três equações são: Tlim=CTA/(P-PC) – não linear;

P=PC+(CTA.1/Tlim)

– linear potência-1/tempo e P=CTA+(PC.Tlim) –

linear

trabalho-

tempo

. Gaesser

et al.

compararam as estimativas de PC a partir das três equações,

e verificaram que cada equação fornece uma estimativa diferente dos parâmetros

Dessa forma, os dados devem ser tratados respeitando-se a alocação das variáveis

como dependentes e independentes.

A utilização do modelo de potência crítica é atrativa porque estima os

parâmetros PC e CTA utilizando apenas um ergômetro e um cronômetro. Apesar dessa

fácil aplicabilidade, surge uma consideração acerca da duração dos testes e sobre as

cargas a serem utilizadas. Como a PC é significantemente influenciada pela duração

dos testes preditivos, então, sugere-se que ela deve ser calculada a partir de uma

ampla duração de testes para que a inércia aeróbia seja minimizada

19,25

. A inércia

aeróbia refere-se ao atraso do metabolismo aeróbio em se ajustar ao seu valor de

estado estável, sendo caracterizada pelo aumento exponencial do consumo de oxigênio

(VO

) no início do exercício.

Vários estudos compararam os resultados nos testes de PC com o

MEEL, que é considerado um método “padrão ouro” para determinação da transição de

exercício

aeróbio-

anaeróbio

13,26,27,28

. Além disso, a PC é altamente relacionada com o

consumo

máximo de oxigênio (VO

2máx

)

20,29,30

e com o limiar

ventilatório

Na tentativa de verificar a relação entre a VC e a velocidade do máximo

estado estável de lactato (MEELv), Smith e Jones

submeteram oito sujeitos do sexo

masculino a um protocolo incremental para determinação do

n e do VO

2máx

, e mais

oito sessões subseqüentes para a determinação da VC e da MEELv. Não foi

encontrada diferença significativa entre os parâmetros analisados, sugerindo que essas

variáveis

ocorrem na mesma faixa de intensidade. Porém, o intervalo de confiança

(95%) demonstrou baixa concordância entre

elas

. Apesar de não ter sido encontrada

diferença significativa, houve uma tendência de a VC superestimar a MEELv.

Dekerle

et al.

investigaram se a VC da natação correspondia a

MEELv. Para isso oito nadadores participaram do estudo. O protocolo foi realizado

dentro de 14 dias, em que os sujeitos realizaram um teste máximo de 400m para

estimar a velocidade máxima (Vmáx); três a quatro testes submáximos (75-90% V

máx)

para determinar a MEELv, e quatro testes exaustivos (95, 100, 105 e 110% da Vmáx)

para o cálculo da VC. O principal resultado encontrado foi que a VC parece não

representar a velocidade máxima que pode ser mantida durante a natação por um

longo períod

o de tempo

sem aumento

concomitante

na concentração de lactato.

Em 2002, Marangon et al.

submeteram ratos Wistar sedentários a

quatro testes de natação com cargas (C) contínuas de 9, 11, 13 e 15% do pc,

distribuídas aleatoriamente e em dias consecutivos, nadando em cada uma delas até a

exaustão. Com isso, foram verificados os tempos-limite (Tlim) em cada intensidade e

aplicados à equação C = Ccrit + CTA. 1/Tlim, em que a carga crítica (Ccrit)

correspondeu ao y-intercepto e a CTA ao coeficiente angular da reta de regressão.

Para a verificação do MEEL em 20 minutos, os animais nadaram em quatro

intensidades contínuas baseadas nos resultados anteriormente obtidos (90% da Ccrit,

100% da Ccrit, Tlim20 e Tlim15). Os autores observaram que o MEEL correspondeu

intensidade de carga crítica.

Em 2005, Billat et al.

verificaram se a VC poderia ser utilizada como

indicador de desempenho e se havia diferenças entre três diferentes linhagens de

animais e entre os gêneros. O protocolo utilizado foi semelhante ao usado para

humanos consistindo de quatro cargas em dias diferentes. O procedimento descrito no

estudo demonstrou que a VC pode ser aplicada a modelos animais. Os autores não

encontraram diferenças significativas entre a VC e o MEEL na intensidade estimada a

75% do VO

2máx

, porém

houve diferença entre as linhagens

mas não

entre os gêneros.

A determinação da Ccrit em modelos animais é relevante, pois permite

que os conhecimentos sejam aplicados em humanos

Eles também permitem

procedimentos invasivos que possib

ilitam

o entendimento de mecanismos celulares e

moleculares relacionados ao exercício.

Além

disso, com a adaptação do modelo animal

para estudo de doenças endócrino-metabólicas, o desenvolvimento de testes

representam uma importante conquista para a avaliação acurada dos esforços feitos

por esses animais, e como consequência, uma avaliação das respostas fisiológicas ao

exercício.

2.3 Respostas fisiológicas durante exercício na intensidade da PC

Poucos estudos têm analisado as respostas fisiológicas na i

ntesidade da

PC. O tempo até a exaustão na PC tem sido reportado

entre

10 e 60 minutos,

dependendo em parte do modelo de exercício e da amostra de sujeitos

5,8,35,36,37

. A

identificação de um marcador de intensidade no qual o exercício é sustentável

por

mpo prolongado é útil para prescrição de treinamento ou para acessar mudanças

após intervenções. Portanto, o tempo até que a exaustão voluntária ocorra tem sido

considerado

um indicador relevante da habilidade do atleta sustentar o exercício. No

entanto, os fatores fisiológicos determinantes desse tempo de tolerância são pouco

conhecidos.

Numerosos estudos têm examinado o conceito de PC em relação ao

tempo de tolerância, mas poucos examinaram as respostas fisiológicas nest

intensidade

. O primeiro estudo a verificar essas respostas foi de Housh et al.

. Os

autores investigaram o VO

, a frenquência cardíaca e a resposta do lactato plasmático

no limiar de fadiga (similar a PC), e estimaram o tempo que podia ser tolerado nessa

intensidade. Os resultados encontrados não suportaram a validade do limiar de fadiga

como uma intensidade que poderia ser mantida por longo período de tempo sem que

ocorresse fadiga, pois houve aumento dos índices avaliados e o tempo de tolerância no

exercício

permaneceu

entre

10 e 17

inutos.

Em 2002,

Brickley

et al.

recrutaram homens treinados que realizaram

testes preditivos para o cálculo da PC individual, e em uma outra ocasião, esses

indivíduos realizaram um exercício até a exaustão na intensidade da PC, todos

realizados em cicloergômetro. Foram analisados a frequência cardíaca, o VO

e a [la]

durante todo o teste. Todas as variáveis aumentaram com o passar do tempo sem

sinais de estado estável, e o tempo de permanência no exercício variou entre 20

minutos.

Com isso, os auto

res refutaram a afirmação que a PC é uma intensidade

que pode ser mantida por “longo período de tempo”

e corrobora

ram

o estudo de

Jenkins e Quigley

em que o exercício na intensidade da PC pode somente ser

mantido por aproximadamente 30 minutos

, em mé

dia

Baron

et al.

também verificaram as respostas fisiológicas do exercício

realizado até a exaustão na intensidade da PC em ciclistas. Eles encontraram que o

tempo de tolerância nessa intensidade foi em média de 22 minutos, dentro da faixa

reportada pre

viamente

O exercício até a exaustão na PC foi associado com mudanças na [la],

na relação lactato/piruvato, concentração de amônia, variáveis respiratórias, entre

outras; e dessa forma suporta a idéia de que a PC não representa uma intensidade de

exerc

ício estável.

Em 2006 Okudan et al.

investigaram as relações entre a PC, potência

aeróbia máxima e Lan, além de verificarem se o tempo de exercício até a exaustão na

intensidade da PC poderia se usado como um índice para determinação de endurance

Os au

tores

encontraram que a PC foi menor que a carga correspondente ao VO

2máx

mas foi maior que a carga correspondente ao Lan. Também encontraram que o tempo

de exercício nessa intensidade foi em média 21 minutos e não foi correlacionado tanto

com o VO

2máx

, quanto com o Lan. Os autores concluíram que a partir dessa falta de

correlação entre esses parâmetros, a CP não pode ser usada como um índice para

determinação da

performance.

A partir desses estudos, uma definição mais apropriada para a PC

seria

“a maior intensidade não estável que pode ser mantida por um período de tempo que

exceda 20 minutos, mas geralmente não mais que 40 minutos”, assim como já

foi

observado

por Brickley et al.

Como ainda não há um consenso sobre as variáveis fisiológicas que

determ

inam o tempo de exercício na intensidade da PC, outras variáveis, como, por

exemplo

, variáveis morfofisiológicas que sejam capazes de predizê-la, tornam-

importante

para o melhor entendimento de seu significado.

2.4 Indicadores de capacidade aeróbia

As estruturas dos humanos e animais são desenhadas de forma a

serem econômicas, ou seja, devem ser ajustadas

sua demanda funcional. Isso sugere

uma relação “custo-benefício” em que quanto maior o órgão, maior será o “custo” em

termos de construção e manu

tenção orgânica.

Basicamente, nenhuma estrutura extra é formada e/ou mantida a menos

que seja requerida para satisfazer às necessidades funcionais do organismo

Essa

relação foi vista, primeiramente, em estudo sobre a relação entre estrutura e função do

sistema respiratório dos mamíferos, e tem sido estabelecido como uma hipótese de

desenho econômico desde então

. Esse desenho ótimo significa um ajuste fino entre

estrutura e função. Como resultado, uma característica estrutural torna-se um fator que

ssa a determinar, juntamente com outras, o desempenho funcional. Para se testar

essa hipótese, a relação com o VO

2máx

tem sido usada em todos os modelos de

variação

(comparação intra-e

interespécies

de diferentes tamanhos e desempenhos).

Tem sido demonstrado que as características morfométricas estão relacionadas com a

potência aeróbia

O músculo esquelético representa cerca de 50% de toda a massa

corporal na maioria dos mamíferos, dependendo do seu tamanho. Durante o repouso, a

musculatura é responsável por somente uma fração do gasto energético, já durante o

exercício, cerca de 90% do oxigênio e do fluxo sanguíneo são redistribuídos para os

membros ativos

42,43,44

. A entrega de oxigênio para os músculos deve ocorrer de

maneira específica ao tipo de fibra, volume de mitocôndria, densidade capilar e

concentração de

enzimas

oxidativas

Poole e Mathieu-

Costello

observaram que ratos treinados em corrida

apresentaram maior relação de capilares por fibra muscular nos músculos sóleo e

plantar que os ratos sedentários. Verificaram também que a relação de capilares por

fibra e o volume mitocondrial foram significantemente correlacionados para ambos os

músculos, suportando a hipótese que o leito capilar dos músculos é desenhado

primeiramente para atender ao requerimento de oxigênio da fibra. O treinamento

também aumentou a atividade da enzima citrato sintase (CS).

Hoppeler

analisou o VO

2máx

durante a corrida e estimou o volume

mitocondrial da musculatura esquelética de oito espécies de mamíferos (alcançando em

tamanho desde o rato até o cavalo), e mostrou que a mitocôndria consumia 4,56 ± 0,61

ml O

min

-1

.ml

de volume mitocôndrial, e a fração da fibra muscular ocupada pela

mitocôndria foi usada para descrever sua capacidade oxidativa. Com isso o autor pôde

ncluir que a capacidade oxidativa do músculo é linearmente dependente do volume

absoluto de mitocôndrias que contém.

A capacidade de entrega de oxigênio para as células pode ser

modificada tanto pelo aumento da densidade capilar quanto pela alteração da

mposição sanguínea (concentração de hemoglobina). Conley

et al.

e Kayar

et al.

compararam espécies “atléticas” com “não-atléticas” cujo VO

2máx

diferia em até 2,5

vezes. Foi encontrado que o volume dos capilares era maior em espécies atléticas,

assim

como também foi verificado que elas possuíam hematócrito 1,8 vezes maior que

as espécies não atléticas.

Em estudo de revisão, Weibel et al.

concluíram que as mitocôndrias e

os capilares sanguíneos juntos determinavam a capacidade aeróbia do músculo entr

várias espécies de mamíferos. Já Rivero

et al.

verificaram que o fator que determina o

sucesso na corrida em cavalos é a composição e o tamanho das fibras

musculares

Howlett

et al.

tentaram explicar as diferenças instrínsecas na

capacidade de endurance na corrida em ratos selecionados para baixa e alta

capacidade de corrida ao longo de sete gerações. Dentre várias diferenças, os autores

identificaram que a concentração de algumas enzimas, como a CS e ß-

hidroxiacil

CoA

desidrogenase, eram 40% maiores nos animais selecionados para alta capacidade de

endurance

, enquanto que fosfofrutoquinase foi significantemente maior nos animais

com baixa capacidade para corrida. Já a concentração de hexoquinase (HK) foi a

mesma para ambos os grupos. Segundo os autores, essa maior concentração de

enzimas oxidativas nos animais com alta capacidade de corrida, proporcionou uma

maior capacidade para utilizar oxigênio.

Em contraste, Fueger et al.

verificaram se a capacidade de realizar

exercício era dependente da atividade da HK II. A partir de manupulação genética, os

autores desenvolveram camundongos que expressavam 50% menos de HK II, outros

que expressavam 3 vezes a mais que o normal, e testaram também animais sem

qualquer manipulação. Ao realizar o teste de

enduran

(corrida em esteira a

aproximadamente 75% do VO

2máx

), os autores verificaram que os animais que

possuíam maior expressão da HK II apresentaram maior habilidade para sustentar o

exercício de intensidade moderada do que os animais com menor atividade.

Ess

a maior

atividade enzimática, ou seja, a maior fosforilação da glicose a tornou mais acessível ao

músculo, e foi um determinante crítico para o desempenho.

Examinando os potenciais processos para o melhoramento das vias

metabólicas, principalmente após estímulos repetidos, foi observado que ocorriam

regulações específicas nos processos oxidativos do músculo esquelético. Schmitt et al.

verificaram que no músculo tibial anterior de biatletas havia uma melhora nos níveis

de transcrição gênica para fatores envolvidos com a mobilização de gorduras (lipase

hormônio

sensível

, lipoproteína lipase), comparado com sujeitos sedentários. A

combinação desses ajustes nos passos sequênciais da cascata de oxigênio nos grupos

musculares recrutados, é visto refletir um nível de coordenação local, o qual contribui

para melhorias sistêmicas no caminho do oxigênio com o treinamento de

endurance

3 JUSTIFICATIVA

A maioria dos estudos que verificam os indicadores de capacidade

aeróbia tem seu foco no VO

2máx

e na produção de lactato, que são índices válidos,

porém necessitam de equipamentos específicos e de alto custo para sua determinação.

Dessa forma, o desenvolvimento de testes não invasivos e de fácil aplicação auxiliam

na avaliação e prescrição de exercícios

O teste de PC tem sido muito usado nos últimos anos, e vários estudos

vêm buscando compreender o real significado fisiológico de seus índices aeróbio e

anaeróbio. Testes realizados até exaustão na intensidade do índice aeróbio obtido pelo

modelo de PC foram realizados. Entretanto, as variáveis fisiológicas medidas durante

os esforços (VO

, [la], relação lactato/piruvato, concentração de amônia, variáveis

respiratórias, entre outras) não se mantiveram em estado estável, além dos sujeitos não

suportarem lon

gos períodos de tempo (em média 30 minutos) como seria esperado.

Dessa forma, uma alternativa para entender o real significado fisiológico

dos índices aeróbio e anaeróbio obtidos pelo modelo de PC, seria estabelecer relações

entre eles e variáveis morfofisiológicas (como por exemplo, tipo e tamanho de fibras,

componentes sanguíneos, atividade enzimática, entre outros). Em tese, indicadores da

função aeróbia devem se relacionar à PC e ao tempo limite nesta intensidade. Devido à

dificuldade da estimativa das variáveis morfofisiológicas em seres humanos, seria mais

adequada a aplicação do protocolo de pesquisa em modelo animal, uma vez que já foi

demonstrado que o modelo PC pode ser aplicado em ratos

istar.

4 OBJETIVOS

.1 Objetivo geral

O objetivo do pre

sente estudo foi verificar as possíveis relações entre

fatores morfofisiológicos e indicadores da Ccrit durante natação em ratos Wistar.

4.2

Objetivo

s específicos

Verificar

o tempo de tolerância na intensidade de

100% da Ccrit individual;

Verificar

os índices morfofisiológicos têm alguma

relação com o desempenho e o tempo de tolerância na natação.

5 MÉTODOS

Animais e tratamento

Foram utilizados 20 ratos machos da linhagem Wistar, com 60 dias de

idade, provenientes do Biotério Central da Universidade Estadual de Maringá, que

foram mantidos em gaiolas coletivas (cinco ratos por gaiola), a 25°C em uma sala com

iluminação das 6:00 às 18:00 h. Os animais foram alimentados com dieta comercial

para roedores e também receberam água ad libitum durante todo o experimento. Os

procedimentos adotados nesta investigação foram aprovados pelo comitê de ética da

instituição (Protocolo: 023/2007

– adendo ao parecer 042/2007 –

Anexo A

5.2

Adaptação ao meio líquido

Todos os animais foram submetidos à adaptação ao meio líquido, que

foi realizado em tanque medindo 60 cm de profundidade, por um período de duas

semanas, sendo cinco dias.semana

-1

. A primeira semana de adaptação foi realizada

sem

colocação de carga, sendo que a profundidade da água e o tempo f

oram

aumentados progressivamente. Já na segunda semana, os animais nadaram com

incrementos de 2% do pc e com o tempo sendo ainda progressivamente aumentado,

porém não ultrapassando os 10 minutos. A temperatura da água foi mantida a

1°C,

tanto durante a adaptação quanto nos testes de determinação da carga crítica (Ccrit) e

durante o exercício na intensidade equivalente a 100% da Ccrit. A proposta da

adaptação teve por objetivo reduzir os efeitos do estresse do animal ao contato com o

meio líquido

sem p

romover alterações fisiológicas

relacionadas a treinamento

5.3 Determinação da Carga Crítica (Ccrit) e da Capacidade de Nado Anaeróbio

(CNA)

Inicialmente os animais foram submetidos a um protocolo composto por

quatro testes de natação em intensidades distintas, suportando cargas mantidas

continuamente,

que foram distribuídas entre 7 a 13% do pc atadas ao dorso (adaptado

de Marangon et al.

Os testes foram realizados em quatro dias consecutivos, sendo

uma carga por dia.

ara

cada carga houve o regist

ro, em segundos, do tempo individual

de exaustão (Tlim), caracterizado como a não manutenção da atividade na água (mais

de 5 segundos abaixo da superfície) e mudança no padrão de nado dos animais. As

cargas foram selecionadas para que o tempo de duração entre a carga mais leve e a

mais intensa permanecesse entre 1 e 20 minutos. Como na avaliação em humanos, a

Ccrit e a CNA foram determinadas a partir da relação entre intensidade do exercício (C-

Carga) e

Tlim

por meio da

função hiperbólica:

Tlim = CNA / (C

–

Ccrit), em que a Ccrit é

a assíntota da hipérbole e a CNA grau de curvatura da hipérbole

(figura

Carga Crítica

250

500

750

1000

1250

1500

1750

2000

6 7 8 9

Carga (% pc)

Tempo (s)

Ccrit

CNA

Figura 1.

Representação gráfica do cálculo da Ccrit.

5.4 Intensidade do exercício

Após realizar o teste de Ccrit, os animais foram colocados para

nadar na intensidade equivalente a 100% da Ccrit individual até a exaustão. Vinte e

quatro horas após esse exercício, os animais foram eutanasiados.

.5 Coleta do material

Para coleta do material, os animais foram sacrificados por meio de

anestesia com pentobarbital sódico (Hypinol

3%, 4 mg/100g pc, intravenosa), e em

seguida se realizou laparotomia mediana para a coleta de sangue (3 ml) da veia cava

inferior e remoção de tecidos.

.6 Contagem de hemácias no sangue

O sangue foi coletado da veia cava inferior do animal e colocado em

tubos de vidro contendo EDTA 10% para evitar a coagulação. A contagem das

hemácias foi realizada em câmaras de Neubauer, a partir de amostras de sangue

diluídas na proporção de 1:20 em líquido de Hayem. Para diluição, foram

utilizadas

pipetas conta glóbulos de Thomas. As células foram contadas em microscópio óptico

usando

se objetiva de 40x.

5.7

Hematócrito

O hematócrito foi analisado a partir do sangue coletado e estocado, pela

técnica do microhematócrito. O sangue foi colocado em tubos capilares não

heparinizados com uma das extremidades seladas. Após cinco minutos na centrífuga,

os capilares foram retirados e a leitura foi feita através da escala própria.

5.8

Análises histoenzimológica e morfológica

O músculo sóleo direito foi congelado em nitrogênio líquido e estocado

em freezer a – 80ºC para posterior homogeneização e preparação histoenzimológica, e

os músculos sóleo e gastrocnêmio esquerdos foram estocados em formol até a

preparação histológica.

5.9

Preparo dos corte

s histológicos

Amostras dos músculos sóleo e gastrocnêmio esquerdos de cada animal

foram coletadas, abertas, lavadas em solução salina, fixadas em

bouin

, desidratadas

em série de concentrações crescentes de álcool, diafanizadas em xilol e incluídas em

para

fina, para realização de cortes de 7 µm posteriormente corados com Hematoxilina e

Eosina (H.E.).

A partir dos cortes corados com H.E., foram evidenciados aspectos

morfológicos gerais dos tecidos estudados. A partir dos cortes com H.E., foi feita

também a contagem do número de capilares em relação aos de fibras, somente no

músculo sóleo,

obtendo

-se assim um coeficiente referido como relação capilar por fibra

(C/F) (figura 2)

Figura 2.

Demonstração dos capilares encontrados entre as

fibras do músculo sóleo.

–

capilar com hemácia em seu interior, b

–

capilar sem hemácia em seu interior.

Análise histomorfométrica

Para se averiguar o trofismo das fibras musculares, foram utilizados os

cortes corados pela técnica H.E. descrita acima. Foram capturadas imagens das

lâminas confeccionadas, e analisadas através do software

Image

Pro

Plus, version

4.5.0.29 for Windows. Para cada lâmina, foram fotografadas 4 imagens diferentes, para

a realização da mensuração das áreas musculares, identificadas pelo

software

Para cada lâmina, referente a um único músculo, buscou-se identificar

100 fibras musculares (25 fibras por imagem), as quais foram selecionadas

manualmente, com o auxílio do

mouse

para mensuração das respectivas áreas

. Os

dados

numéricos foram transferidos para o

software

Microsoft

Excel

–

2002

Sobre as imagens obtidas

Para a captura das imagens das fibras musculares foram utilizadas

lentes para um aumento de 330 vezes (microscópio óptico). Além disso, buscou-

evitar q

ue a mesma área fosse fotografada duas vezes.

Realizou

-se a calibração do programa para compilação dos dados

(medidas em micrômetros) e prontamente iniciou-se a mensuração das fibras

visualizadas integralmente. Todas as lâminas confeccionadas proporcionaram uma

eficiente definição das células musculares e não houve dificuldade para diferenciação

destas, como pode ser observado na figura 2. Além disso, o programa oferece uma

tabela onde todos os dados foram armazenados e posteriormente transferidos para o

ograma

Excel

, constando a área de cada fibra muscular identificada, como

exemplificado na figura 3.

Figura 3.

Demonstração da análise das imagens para o cálculo da área da fibra do

músculo sóleo e do músculo gastrocnêmio, H.E. 330x.

5.12

Preparo histoen

zimológico das fibras musculares

Para o estudo das fibras musculares, o sóleo direito do animal foi

retirado e então coberto com talco para a preservação do tecido, de acordo com técnica

de Moline e Glenner

e congelado em nitrogênio líquido. Os músculos foram mantidos

–

80°C até preparação histoenzimológica.

Durante a preparação, o músculo foi mantido em criostato (LEICA CM –

1850

– Alemanha) a temperatura de – 21°C. Os blocos de tecidos musculares foram

fixados em suportes metálicos do criostato através de pequenas quantidades de

adesivo (OCT – Tissue Tek Compound), e posteriormente foram realizados cortes

transversais com 7

µm de espessura.

Após o preparo das lâminas, elas foram coradas pelo método da

Nicotinamida Adenina Dinucleotídeo – Tetrazolium Reductase (NADH-TR), conforme

técnica de Pearse

modificada por Dubowitz e Brooke

, em que foi analisado o

metabolismo oxidativo e glicolítico (figura 4).

Figura 4.

Imagem demonstrativa de lâmina corada para a técnica de NAD

H-

TR.

fibra oxidativa,

fibra glicolítica.

Como a classificação das fibras com intensidade de coloração

intermediária de NADH-TR é arbitrária

57,58

, as fibras foram classificadas somente como

oxidativas e glicolíticas

Os procedimentos necessários para a coloração das lâminas por este

método e pelo método do H.E. estão descritos no anexo (

B e C

5.13

Estudo estereológico

A quantificação da densidade do volume (Vv) de fibras oxidativas e

glicolíticas do músculo sóleo foi realizada através de objetiva de 10x e sistema de

vídeo

-microscópio, composto por microscópio acolpado a um sistema de imagem e

monitor. Para cada animal, foram estudados 5 cortes histológicos (corados com NADH-

TR) em um campo microscópico aleatório. Foram capturadas 15 imagens de c

ada

músculo, sempre com o cuidado de não fotografar duas vezes a mesma área. A

contagem de pontos foi realizada através

do sistema

teste de ciclóides

59,60

(figura 5).

Figura 5.

Sistema

teste de ciclóides.

Vv foi calculada a partir da fórmul

onde: P

é o número de pontos que tocam a estrutura em estudo (fibras musculares);

Pt é o número total de pontos do sistema-teste (igual a 16) multiplicado pelo

número de campos

(15 campos)

Vv =

Pp %

As proporções dos tipos de fibra estão apresentadas em porção

numérica (o número específico do tipo de fibra/número total de fibras contadas).

5.14 Análise da Citrato Sintase

Para determinar a atividade máxima da CS, o músculo sóleo foi

homogenado por 20 s em gelo, usando um homogenizador de tecidos (Ultra-Turrax T8,

Ika

Werke, Staufen,

Alemanha

) na solução de extração específica.

O tampão de extração

continha 0,5 mM

de Tris

HCL e 1,

0 mM de EDTA,

7,4, e o tampão da substância analisada continha Tris/aminometano (100 mM),

DTNB (0,2 mM), acetil-CoA (0,1 mM), e Triton X-100 (0,1%

), pH 8,1. A reação foi

iniciada pela adição de 10 µl do extrato do tecido e 50 µl do ácido oxaloacético

(concentração final de 10 mM). A absorbância a 412 nm (25°C) foi

espectrofotome

tricamente medida durante 5 min como já descrito anteriormente

. A

ati

vidade da enzima foi expressa com base de mg de proteína.

5.15 Análise estatística

A normalidade dos dados foi verificada por meio do teste de

Shapiro

Wilk

. Para verificar as relações entre as variáveis histológicas e morfológicas com os

parâmetros do modelo de Ccrit e o tempo até a exaustão, foi aplicado o coeficiente de

correlação de

Pearson

quando os dados foram paramétricos, e o coeficiente de

correlação de

Spearman

quando os dados foram não-paramétricos. A significância foi

fixada em

< 0,05. O soft

ware utilizado foi o SPSS 13.0

for Windows

6 RESULTADOS

Para todos os animais, os testes preditivos para a determinação da Ccrit

resultaram em exaustão entre 2 e 20 minutos. O modelo hiperbólico usado para a

determinação da Ccrit

obteve excelente ajuste dos dados (R

= 0,98 ± 0,02).

animais apresentaram valores de Ccrit

que

variaram entre 3,7 e 7,1

% pc. Já os tempos de tolerância variaram entre 350 e 2853 s. Os valores

mínim

máximo e médio, assim como o coeficiente de variação entre os animais estão

apresentados na tabela 1.

Tabela 1.

Dados descritivos dos valores de Ccrit e

tempo de tolerância

(n = 20).

Valor mínimo

Valor máximo

Média (DP)

CV (%)

Ccrit (%pc)

3,7 7,1

4,3 (1,4)

Tempo (s)

350

2853

1328 (670)

–

desvio

padrão, CV

– coeficiente de variação

A Ccrit e o tempo até a exaustão dos animais apresentaram

correlação

negativa (r =

0,724;

= 0,000) (figura 6).

300

600 900

1200 1500

1800

2100 2400 2700

3000

r = - 0,724

= 0,5414

Tempo de tolerância (s)

Ccrit (% pc)

Figura 6.

orrelação de

Spearman

entre a Ccrit e o tempo de to

lerância (

= 0,000

ambém foi encontrada

correlação

entre o tempo de tolerância e a CNA,

que representa as reservas anaeróbias do organismo (r = 0,699; P = 0,001) (figura 7).

Houve

correlação negativa entre Ccrit e a CNA (r = -

0,847;

P = 0,000), indicando que

quanto menor a capacidade aeróbia do animal, maior sua reserva anaeróbia (figura 8).

1000

1200

1400

1600

1800 2000 2200 2400

2600

300

600

900

1200

1500

1800

2100

2400

2700

3000

r = 0,699

= 0,3662

CNA (% pc*s)

Tempo de tolerância (s)

Figura

. C

orrelação de

Spearman

entre o tempo de tolerância e a CNA (

= 0,001).

1000 1200 1400 1600 1800 2000 2200 2400 2600

r = - 0,847

= 0,6003

CNA (% pc*s)

Ccrit (% pc)

Figura

8. Co

rrelação de

Spearman

entre a Ccrit e a CNA (

= 0,000

As figuras 9 e 10 apresentam as correlações significantes entre a

porcentagem de fibras oxidativas e glicolíticas com a Ccrit, sendo a última negativa (r =

0,473;

P = 0,035 e r = -

0,473

;

P = 0,035

respectivamente).

A atividade da CS não

apresentou correlação com a Ccrit e também com o tempo até a exaustão (r = 0,279; P

= 0,234 e r =

0,255;

= 0,278, respectivamente).

45 50 55 60 65 70

r = 0,473

= 0,2097

Fibras oxidativas (%)

Ccrit (% pc)

Figura

9. Correlação de

Spearman

entre a Ccrit e a porcentagem de fibras oxidativas

= 0,0

35).

40 45 50

r = - 0,473

= 0,2097

Fibras glicolíticas (%)

Ccrit (% pc)

Figura

10. Correlação de

Spearman

entre a Ccrit e a porcentagem de fibras glicolíticas

= 0,0

35).

As porcentagens de fibras também apresentaram correlaç

ões

significati

s com o tempo de tolerância. Mas em relação ao tempo, as fibras oxidativas

apresentaram correlação negativa, enquanto as fibras glicolíticas apresentaram

correlação positiva (r = -

0,590;

P = 0,006 e r = 0,590; P = 0,006, respectivamente

)

(figuras 11 e 1

2).

55 60 65 70

300

600

900

1200

1500

1800

2100

2400

2700

3000

r = - 0,59

= 0,3484

Fibras oxidativas (%)

Tempo de tolerância (s)

Figura

. Correlação de

Pearson

entre o tempo de tolerância e a porcentagem de

fibras oxidativas (

= 0,00

6).

30 35

50 55

300

600

900

1200

1500

1800

2100

2400

2700

3000

r = 0,59

= 0,3484

Fibras glicolíticas (%)

Tempo de tolerância (s)

Figura

12. Correlação de Pearson entre o tempo de tolerância e a porcentagem de

fibras glicolíticas (

= 0,00

6).

A CNA e a porcentagem de fibras glicolíticas correlacionaram-

positivamente, porém

a mesma

não foi significante (figura 13).

35 40

1000

1200

1400

1600

1800

2000

2200

2400

2600

r = 0,41

= 0,1654

Fibras glicolíticas (%)

CNA (% pc*s)

Figura

Correlação de

Pearson

entre a CNA e o t

empo de tolerância (

= 0,0

75).

Em relação à hipertrofia muscular, a área das fibras do músculo sóleo

apresentaram correlação significativa com o tempo de tolerância, já em relação à Ccrit

não houve correlação. A área das fibras do músculo gastrocnêmio

resentaram

correlação não significante com o tempo de tolerância e porém não apresentou

correlação com a Ccrit (tabela 2).

Tabela 2. Valores dos coeficientes de correlação das comparações entre Ccrit, tempo

de tolerância, área média das fibras do músculo sóleo e área média das fibras do

músculo gastrocnêmio (

µm

Ccrit x área do sóleo

- 0,275

Ccrit x área do gastrocnêmio

- 0,188

tempo x área do sóleo

0,569*

tempo x área do gastrocnêmio

0,434

coeficiente de correlação de

Spearman

coeficiente de correlação de

Pearson

P = 0,009.

O parâmetro C/F no músculo sóleo não apresentou correlação tanto com

a Ccrit quanto com o tempo de tolerância, porém o número de hemácias foi

inversamente correlacionado com a Ccrit e diretamente corre

lacionado com o tempo até

a exasutão (tabela 3). O hematócrito não apresentou correlação com ambas as

variáveis

Tabela 3.

Coeficiente

s de correlação das comparações entre Ccrit e tempo de

tolerância

com

relação C/F,

hematócrito

(%) e

número de

hemác

ias

C/F

Hematócrito

Hemácias

Ccrit (%)

0,170

- 0,290 -

0,691*

Tempo (s)

0,135

0,269

0,648*

< 0,05

7 DISCUSSÃO

O presente estudo correlacionou os índices morfofisiológicos com o

desempenho (Ccrit) e o tempo de tolerância nessa intensidade durante a natação em

ratos Wistar. Os principais achados

deste

estudo foram as correlações encontradas

entre os próprios parâmetros (

Ccrit

versus CNA,

Ccrit

versus tempo de tolerância

CNA

versus tempo de tolerância). Esses resultados não corroboram os pressupostos do

modelo

de carga crítica para natação em ratos Wistar. Além disso, também foram

encontradas

algumas

correlações os índices morfofisiológicos e os parâmetros da Ccrit.

Segundo um dos pressupostos do modelo de Ccrit, não deve have

correlação entre a Ccrit e o tempo de tolerância, pois ela representa a intensidade do

Lan

, e

como

no presente estudo essa intensidade foi individualizada, a carga interna

imposta

deveria ser a mesma para todos os animais; logo, esperava-se que os tem

pos

de tolerância fossem dispersos de tal forma a não se observar relação entre a Ccrit e o

tempo tolerado. A correlação inversa encontrada entre a Ccrit e o tempo de tolerância

contesta esse pressuposto,

sugerindo

que alguns dos animais se exercitaram em

intensidade acima do Lan.

Vários estudos realizados em humanos

5,6,38

e em animais

62,63

já

observaram que a intensidade da PC superestima a intensidade do Lan. Ao analisar a

correlação entre a Ccrit e o tempo até a exaustão, observa-

novamente que essa

intensidade superestimou a intensidade correspondente ao Lan para alguns animais.

Nossos resultados estão de acordo com os encontrados por Poole et al.

30,64

em que o

tempo até exaustão atingido em potências acima da PC foi inversamente relacionado

com a t

axa metabólica que foi excedida.

A Ccrit representa o maior limite para a estabilidade do VO

; porém a

partir dos resultados do presente estudo, especula

se que nessa intensidade não houve

um estado estável, levando o VO

ao máximo para alguns animais, daí a correlação

inversa entre a Ccrit e o tempo de tolerância. Esse fato corrobora os estudos de Billat

al.

que encontraram correlação inversa entre a potência (e velocidade) do VO

2máx

e o

tempo de tolerância em atletas de diferentes modalidades, a

ssim como Fernandes

et al.

66,67

verificaram em nadadores.

Outro resultado que não atendeu aos pressupostos do conceito de PC

foi

a correlação inversa e significante entre a Ccrit e a CNA. A CNA é matematicamente

definida como uma reserva energética intramuscular disponível previamente ao

exercício

10,17

; logo, ela deve ser independente da Ccrit. Da mesma forma, o tempo de

tolerância na Ccrit não deve sofrer influência da CNA, ou seja, deve ser independente

da CNA

, o que não foi observado pelo presente estudo. Houve correlação positiva e

significante entre a CNA e o tempo de tolerância na Ccrit. Dessa forma, a partir dos

nossos resultados, ficou clara a dependência dos parâmetros analisados com a CNA.

Vários pequisadores já se propuseram comparar a PC com os limiares

metabólicos

6,17

e as respectivas respostas fisiológicas nessa intensidade de exercício

5,8,36

. Os estudos não ofereceram evidências suficientes para aceitar ou rejeitar a PC

como uma potência que pode ser mantida por longo período de tempo ou como um

índice de endurance. Portanto, a investigação de outros mecanismos que podem estar

envolvidos com a manutenção desse exercício torna-se importante. Isso mostra a

importância e originalidade do presente estudo.

A Ccrit apresentou correlação

posit

iva e significante com a porcentagem

de fibras oxidativas dos animais, enquanto que a correlação com a porcentagem de

fibras glicolíticas foi negativa, o que indica que a Ccrit é um parâmetro aeróbio, e

corrobora os trabalhos de Moritani et al.

, Gaesser e Wilson

, Poole et al.

Hughson

et al.

entre outros.

Apesar da correlação entre a porcentagem de fibras oxidativas e a Ccrit,

a atividade da CS não apresentou a mesma relação. Esse resultado não era esperado,

uma vez que, segundo Howlett et al.

, uma das características que difere os animais

com alta e baixa capacidade para a realização de exercício, é a atividade 40% maior

dessa enzima. Possivelmente, a baixa proporção de fibras oxidativas, como também a

idade dos nossos animais, pode ter influenciado esse resultado. Sakuma et al.

mostraram que a transformação das fibras tipo II para as fibras tipo I no músculo sóleo

de ratos ocorre ao longo do desenvolvimento do animal e difere entre os segmentos

proximal, medial e distal. A partir dessa diferença no desenvolvimento, sugere-se que

as mitocôndrias musculares presentes nesses animais não estavam totalmente

desenvolvidas.

Já em relação ao tempo de tolerância, o resultado foi inverso. A

correlação entre a porcentagem de fibras oxidativas e o tem

po de tolerância foi negativa

e significante, e entre a porcentagem de fibras glicolíticas

foi

positiva e significante,

indicando que a intensidade de exercício realizado no presente estudo não foi

totalmente

aeróbia. Uma correlação de – 0,47 entre o tempo de tolerância e a

proporção de fibras tipo I do músculo sóleo também foi encontrada por Totsuka et al.

em quatro linhagens diferentes de camundongos ao se exercitarem na esteira. A

diferença entre o presente estudo e o de Totsuka et al.

foi a forma de exercício,

sendo um em cargas retangulares e outro protocolo incremental, respectivamente. Mais

uma vez, há uma indicação que a Ccrit superestimou a intensidade do Lan para alguns

animais

, ao observar os resultados de Totsuka et al.

, pois ao aplicar um exercício

incremental, eles encontraram a mesma correlação inversa entre os parâmetros tempo

de tolerância e proporção de fibras oxidativas.

Um dos resultados que podemos destacar foi a correlação direta entre a

CNA e a porcentagem de fibras glicolíticas. Essa correlação indica que os animais com

a maior porcentagem de fibras glicolíticas apresenta

m maiores valores de CNA.

Apesar dessa correlação ter sido fraca e não significante, ela

acresenta robustez

idéia

de que a CNA é um indicador anaeróbio, o

que

reforça os dados dos estudos de

Nebelsick

Gullett

et al.

, Jenkins e Quigley

, Miura et al.

73,74

, que encontraram

correlações entre indicadores anaeróbios e a CTA, porém, muitas delas também não

foram significantes.

Não foram encontradas correlações entre a Ccrit e a área da fibra

muscular, tanto do músculo sóleo quanto do músculo gastrocnêmio. Nossos resultados

são semelhantes aos de Maughan e Nimmo

, realizados em humanos e Garland

al.

, realizados em camundongos, que também não encontraram correlação entre a

área transversal das fibras da coxa e a força realizada; e entre as fibras do músculo

gast

rocnêm

io e a velocidade máxima de

sprint

, respectivamente. Essa falta de

correlação indica que outros fatores

são responsáveis

pel

a determinaç

ão da Ccrit.

Já entre o tempo de tolerância e as áreas das fibras musculares houve

correlação

direta

,, sendo a correlação com a área da fibra do músculo sóleo,

significante.

Isso indica que a demanda funcional pode ter influência no diâmetro da

fibra, pois para se manter a força por período prolongado de tempo, há necessidade de

mais unidades motoras, como mostrado por Barnard et al.

. Esse resultado era

esperado, pois para a manutenção de uma carga ao longo do tempo, é preciso que haja

grande número de elementos contráteis. Assim como o presente estudo, Rivero et al.

Totsuka

et al.

também encontraram que cavalos e camundongos que suportaram

maiores tempos na corrida foram os que apresentaram maiores áreas tranversais das

fibras dos músculos.

Vári

os estudos indicam que a capacidade aeróbia de um músculo deve

estar relacionada com o suprimento capilar que ele comporta

45,47

. No presente estudo,

tanto a Ccrit, que é um parâmetro aeróbio, quanto o tempo de tolerância, não se

correlacionaram com a relacão C/F do músculo sóleo, o que corrobora o estudo de

Maxwell

et al.

que não encontraram relações entre a capacidade oxidativa do fluxo

sanguíneo e a capilaridade de todo o músculo.

Esperavam

algumas correlações

entre esses índices, pois, além da função de entrega de nutrientes para o metabolismo

aeróbio,

os capilares também têm papel de remover os produtos do metabolismo

anaeróbio

. Entretanto, esse resultado deve ser visto com cautela, pois o uso de

somente um índice para se verificar o fluxo sanguíneo não é fidedigno, como foi

mostrado por Hudlika

et al.

, o que pode ser uma explicação para a falta de correlação

encontrada no presente estudo. Índices como densidade capilar, tortuosidade do

leito

capilar e a área capilar também devem

avaliadas

em es

tudos futuros.

Variáveis sanguíneas têm sido reportadas por estarem diretamente

relacionadas com o consumo de oxigênio, portanto, esperava-se que os valores de

hematócrio se correlacionassem com a Ccrit e com o tempo de tolerância. Porém, no

presente estudo, os valores de hematócrito não apresentaram correlação com esses

parâmetros. Conley et al.

e Kayar et al.

verificaram que espécies atléticas

apresentaram hematócrito que diferia em até 1,8 vezes, porém, nos animais do

presente estudo essa diferença não foi encontrada. Logo, o valor de hematócrito não

parece ser um dos determinante

s do

desempenho

entre animais d

mesma espécie.

A correlação inversa e significante encontrada entre a Ccrit, e direta e

significante encontrada entre o tempo de tolerância e o número de hemácias não era

esperada, já que quanto melhor o metabolismo aeróbio do animal, maior deveria ser o

aporte de oxigênio, e não o contrário. Porém, outros fatores também interferem na

concentração das variáveis hematólógicas, como por exemplo, o volume plasmático.

Schumacher

et al.

não encontraram qualquer correlação entre variáveis

hematológicas, como a contagem de células vermelhas, e o VO

2máx

estabelecido em

atletas de várias modalidades, além de encontrar baixos níveis de hemácias em a

tletas

treinados em endurance. Logo, somente a contagem de hemácias não parece ser um

bom índice para a análise de parâmetros aeróbios.

8 CONCLUSÕES

A partir dos resultados do presente estudo pode-se concluir que o

modelo de Ccrit para natação em ratos deve ser usado com cautela, uma vez que

parece não estimar a intensidade do Lan. O tempo de tolerância na Ccrit

apresentou

dentro da faixa já reportada na literatura. Os índices morfofisiológicos apresentaram

correlações

fraca

moderada

s, indicando que nenhum deles pode responder sozinho

pelo

desempenho

na intensidade da Ccrit. Porém, eles

forneceram

indicativos

de que a

Ccrit é um parâmetro aeróbio e a CNA um parâmetro anaeróbio; além de indicar que a

intensidade do exercício (representado pelo tempo de tolerência) não parece ser uma

intensidade

totalmente

aeróbia.

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875.

ANEXOS

ANEXO A

Parecer do comitê de ética

ANEXO B

Hematoxilina e Eosina

Colocar as lâminas prontas na estufa até derreter a parafina

15 min

uto em xilol

–

desparafinar

20 minutos em xilol II –

desparafinar

2 minutos em álcool 100% I

2 minutos em álcool 100% II

2 minutos em álcool 90%

Álcool 80% (até ficar branco)

1 minuto em super cola

deixar secar

2 minutos em álcool 10%

2 minutos em água de

stilada

40 segundos em Hematoxilina

lavar 4x

10 minutos na água

20 segundos em Eosina

lavar 1x

Passar em álcool 90%

5 segundos em álcool 100% I

5 segundos em álcool 100% II

passar em xilol

álcool

5 minutos em xilol II

Xilol

–

emblocar até montar as lâminas

Montar as lâminas com Permont

Anexo C:

NADH

TR (Nicotinamida Adenina Dinucleotídio

–

Tetrazolium Recuctase)

–

Incubação dos cortes durante 30 minutos à 37°C, no seguinte meio:

NADH

Diaforase

8,0

Nitro

Blue_

Tetrazolium (NBT) 10,0

Tampão Tris 0,2M pH

7,4 10,0

–

Lavagem dos cortes em água destilada

–

Fixação durante 5 minutos em formol a 5% tamponado (pH 7,0)

–

Lavagem em água destilada

–

Desidratação, diafaniza

ção e montagem com Permount

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