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ii
AVALIAÇÃO MORFOFUNCIONAL DO POTENCIAL DE
REVERSÃO ESPONTÂNEA DA CIRROSE HEPÁTICA INDUZIDA
EM MURINOS PELA ASSOCIAÇÃO DE TETRACLORETO DE
CARBONO E ETANOL
JULIANA VIEIRA DIAS
Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Clínica Médica, da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Setor de
Gastroenterologia, como parte dos pré-requisitos necessários à obtenção do
grau de mestre em Ciências da Saúde.
Rio de Janeiro
Dezembro, 2006
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iii
AVALIAÇÃO MORFOFUNCIONAL DO POTENCIAL DE
REVERSÃO ESPONTÂNEA DA CIRROSE HEPÁTICA INDUZIDA
EM MURINOS PELA ASSOCIAÇÃO DE TETRACLORETO DE
CARBONO E ETANOL
JULIANA VIEIRA DIAS
Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Clínica Médica, da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Setor de
Gastroenterologia, como parte dos pré-requisitos necessários à obtenção do
grau de mestre em Ciências da Saúde.
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Cardiologia Celular e Molecular do
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho – IBCCF.
Orientadores: Prof. Henrique Sérgio Moraes Coelho
Prof. Guilherme Ferreira da Mota Rezende
Co-orientadora: Regina Coeli dos Santos Goldenberg
Rio de Janeiro
Dezembro,2006
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iv
Aos meus queridos pais por terem me dedicado tanto amor e apoio.
Á meu irmão por simplesmente fazer parte da minha vida.
v
vi
AGRADECIMENTOS
Quero agradecer a todos que fizeram parte desse trabalho e que no fim se
tornaram amigos:
Ao professor Guilherme por ter tornado tudo isso possível, apesar de ter quase
me desorientado!
À professora Regina Coeli por ser minha conselheira profissional e pessoal. Te
gosto muito Rê.
Ao professor Antônio Carlos por ter me apoiado quando quase desisti.
À professora Cristina Takyia por ter me ensinado tudo o que sei sobre
histologia.
À Dr (tia).Léa que me apresentou o hospital universitário e que sempre
acreditou no meu potencial.
À minha grande amiga Verônica pelo apoio incondicional desde os primórdios
da faculdade.
Ao meu querido amigo Nobrux por toda a ajuda profissional e por todos os
bons momentos passados juntos. Valeu garoto!
A todos os hepáticos: Luiz, Adriana, Leandro, Taís, Celinha, Andréia. Obrigada
por sermos um grupo tão unido. Amo vocês!
Aos meus amigos do laboratório de cardiologia: Débora, João, Nessa, Patrícia,
Ramon, Juliana, Carol e Esporcate. Apesar de gostarem de músculos e
corações, agradeço imensamente pela constante alegria que cerca nosso
laboratório. Somos uma grande equipe.
Á galera do laboratório de Fisiologia Renal e de Anatomia. Aprendi muito com
todos vocês.
A toda minha família amada que tanto torce por mim. Não existe no mundo
família melhor que a minha!
vii
FOLHA DE APROVAÇÃO
AVALIAÇÃO MORFOFUNCIONAL DO POTENCIAL DE
REVERSÃO ESPONTÂNEA DA CIRROSE HEPÁTICA INDUZIDA
EM RATOS PELA ASSOCIAÇÃO DE TETRACLORETO DE
CARBONO E ETANOL
JULIANA VIEIRA DIAS
Orientadores: Prof. Henrique Sérgio Moraes Coelho
Prof. Guilherme Ferreira da Mota Rezende
Dissertação submetida ao Programa de Pós-graduação em Clínica Médica, da
Faculdade de Medicina da Universidade Federal do Rio de Janeiro, Setor de
Gastroenterologia, como parte dos pré-requisitos necessários à obtenção do
grau de mestre em Ciências da Saúde.
Aprovada em _____de_______________de________.
Banca examinadora:
____________________________________________________
Prof
a
Renata de Mello Perez
____________________________________________________
Prof. João Pedro Werneck de Castro
____________________________________________________
Prof. Carlos Alberto de Oliveira Basílio
Rio de Janeiro
Dezembro,2006
viii
Dias, Juliana Vieira
Avaliação morfofuncional do potencial de reversão espontânea da cirrose
hepática induzida em ratos pela associação de tetracloreto de carbono e
etanol / Juliana Vieira Dias. – Rio de Janeiro: UFRJ / Faculdade de Medicina,
2006.
xiii, 102 f.: il. ; 31 cm
Orientadores: Henrique Sérgio Moraes Coelho e Guilherme Ferreira da
Mota Rezende
Dissertação (mestrado) –UFRJ / Faculdade de Medicina, Programa de
Pós-graduação em Clínica Médica, 2006.
Referências bibliográficas: f. 63-78
1. Cirrose hepática experimental –
induzido quimicamente. 2.
Tetracloreto de carbono. 3. Etanol. 4. Colágeno. 5. Ratos Wistar. 6. Clínica
Médica -
Tese. I. Coelho, Henrique Sérgio Moraes. II. Rezende, Guilherme
Ferreira da Mota
. III. Universidade Federal do Rio de Janeiro, Faculdade de
Medicina, Clínica Médica. IV. Título.
ix
ÍNDICE
1. INTRODUÇÃO................................................................................................
p.1
1.1. Panorama das Hepatopatias p. 1
1.2. Epidemiologia das Hepatopatias Crônicas p. 2
1.3. O Fígado
1.3.1. Anatomia, Função e Estrutura..............................................................
p. 3
1.3.2. Microambiente Hepático....................................................................... p.7
1.4. Regeneração Hepática............................................................................... p.10
1.5. Cirrose Hepática
1.5.1. Definição de Cirrose............................................................................. p.11
1.5.2. Aspectos Morfológicos..........................................................................
p.12
1.5.3. Aspectos Clínicos................................................................................. p.16
1.6. Modelos Experimentais de Cirrose Hepática..............................................
p.18
2. OBJETIVOS
p.25
3. MATERIAIS E MÉTODOS..............................................................................
p.26
3.1. Animais....................................................................................................... p.26
3.2. Confecção da Dieta Líquida Alcoólica e Não – Alcoólica........................... p.26
3.3. Grupos........................................................................................................ p.27
3.4. Protocolo Experimental...............................................................................
p.28
3.5. Análise Histológica..................................................................................... p.30
3.5.1. Coloração por Hematoxilina & Eosina.................................................. p.31
3.5.2. Coloração por Picrosirius......................................................................
p.31
3.6. Análise Morfométrica.................................................................................. p.32
3.7. Ensaio de Hidroxiprolina............................................................................. p.32
3.8. Imunofluorescência Indireta........................................................................
p.33
3.8. Análise Bioquímica..................................................................................... p.34
3.9. Análise Estatística...................................................................................... p.35
4. RESULTADOS................................................................................................
p.36
4.1. Peso dos Animais....................................................................................... p.36
4.2. Consumo de Dieta Líquida e Ingestão de Etanol....................................... p.39
4.3. Análise Histológica..................................................................................... p.41
4.4. Análise Morfométrica.................................................................................. p.45
4.5. Ensaio de Hidroxiprolina............................................................................. p.46
4.6. Imunofluorescência Indireta........................................................................
p.48
4.7. Análise Bioquímica..................................................................................... p.51
5. DISCUSSÃO...................................................................................................
p.54
6. CONCLUSÃO.................................................................................................
p.62
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS p.63
8. ANEXOS
p.79
x
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 – Representação esquemática da anatomia dos lobos hepáticos
(adaptado de SHERLOCK&DOOLEY, 2002)....................................................p.4
Figura 2 – Representação esquemática dos vasos sanguíneos hepáticos.
(adquirida no site: www.hepcentro.com.br)......................................................p.5
Figura 3 – Representação esquemática do lóbulo Hepático (bordas azuis), com
uma veia centro-lobular ao centro e delimitado por tratos portais na sua periferia
e do ácino hepático com suas zonas: a zona acinar 1 (bordas amarela), zona
acinar 2 (borda laranja) e zona acinar 3 (borda vermelha). (adaptado de 3B
Scientific microanatomy ™, 2002)...................................................................p.6
Figura 4 – Representação esquemática das modificações ocorridas no fígado
normal após a lesão hepática crônica (adaptado de FRIEDMAN,
2000)...............................................................................................................p.13
Figura 5 – Representação esquemática dos principais mecanismos envolvidos
na fibrogênese hepática induzida por etanol e por CCl
4.
(adaptado de ROJKIND
& GREENWEL, 2001).....................................................................................p.23
Figura 6 - Protocolo experimental de indução de cirrose hepática.................p.30
Figura 7 – Pesos médios dos animais por grupo experimental nos períodos de 0
semana (A), 4 semanas (B), 8 semanas (C) e 15 semanas (D) de protocolo
experimental..................................................................................................p.38
Figura 8 – Consumo médio de dieta líquida ao final de 15 semanas de
xi
experimento...................................................................................................
p.39
Figura 9: Macro e microscopia dos animais experimentais...........................p.43
Figura 10: Microscopia dos grupos intoxicados com CCl
4
isolado ou associado
ao etanol........................................................................................................p.44
Figura 11: Análise morfométrica....................................................................p.46
Figura 12: Ensaio de hidroxiprolina...............................................................p.47
Figura 13: Imunofluorescência......................................................................p.49
Figura 14: Qualificação (A-C) e quantificação (D) de tTG2...........................p.50
Figura 15: Análise bioquímica.......................................................................p.53
xii
Tabela 1 – Metabolismo dos hepatócitos relacionado à zona acinar (adaptado
de SHERLOCK & DOOLEY, 2002).............................................................p.7
Tabela 2 – Principais Causas de Cirrose Hepática (SHERLOCK & DOOLEY,
2002)...........................................................................................................p.26
Tabela 3 – Composição da dieta líquida de Lieber-DeCarli modificada
(adaptado de LIEBER & DeCARLI, 1989)..................................................p.27
Tabela 4 – Grupos experimentais de acordo com a dieta e injeção
intraperitoneal (i.p.)....................................................................................p.27
Tabela 5 – Grupos da recuperação hepática espontânea.........................p.29
Tabela 6 – Peso dos animais.....................................................................p.36
Tabela 7 – Consumo médio de dieta líquida por grupo experimental ao longo
de 15 semanas de experimento.................................................................p.40
Tabela 8 – Dose média de etanol por grupo ao longo das 15 semanas de
experimento................................................................................................p.41
Tabela 9 – Valores da análise de morfometria dos grupos intoxicados com
CCl4 e associado ao etanol........................................................................p.45
Tabela 10 – Valores do ensaio de hidroxiprolina dos grupos intoxicados com
etanol e CCl
4
.............................................................................................p.47
Tabela 11 – Valores da quantificação de tTG pela morfometria dos grupos
intoxicados com CCl
4
e etanol..................................................................p.51
Tabela 12 – Valores dos parâmetros bioquímicos de ALT (A), AST (B), ALB
(C) e BilT (D).............................................................................................p.52
LISTA DE TABELAS
xiii
LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ALT - alanina aminotransferase
AST - aspartato aminotrasferase
ALB – albumina
AIH – alteração por internação hospitalar
BilT – bilirrubina total
CCl
4
- tetracloreto de carbono
CTRL - dieta líquida controle
CTRL+Azeite - dieta líquida controle e injeções intraperitoneais de azeite
CTRL+CCl
4
- dieta líquida controle e injeções intraperitoneais CCl
4
CTRL+CCl
4
/8sR - Ração padrão e água por 8 semanas após a interrupção da
indução
CFCs - cloro-flúor-carbonos
CYP2E1 - citocromo P450 2E1
DNA - ácido desoxiribonucléico
EtOH - dieta líquida alcoólica
EtOH+Azeite - dieta líquida alcoólica e injeções intraperitoneais de azeite
EtOH+CCl
4
dieta líquida alcoólica e injeções intraperitoneais CCl
4
EGF – fator de crescimento epidérmico (do inglês epidermal growth factor)
EtOH+CCl
4
/8sR - Ração padrão e água por 8 semanas após interrupção da
indução
FITC – isotiocianato de fluoresceína (do inglês fluorescein isothiocyanate)
HGF – fator de crescimento de hepatócitos (do inglês hepatic growth factor)
CHC – hepatocarcinoma
HSCs – células estreladas hepáticas (do inglês hepatic stellate cells)
IL-6 – interleucina-6 (do inglês interleucine-6)
i.p. - intraperitoneal
IAM – infarto agudo do miocárdio
KCs – células de kuppfer (do inglês kuppfer cells)
MS - Ministério da Saúde
xiv
MEC - matriz extracelular
MMPs - metaloproteases da matrix extracelular.
MEOS – sistema oxidativo enzimático microssomal (do ingles microssomal
enzimatic oxidative sistem)
NIH – Instituto Nacional de Saúde (do inglês National Institute of Health)
OMS – Organização Mundial de Saúde
PA – para análise
PDGF – fator de crescimento derivado de plaquetas (do inglês platelet-derived
growth factor)
SUS – Sistema Único de Saúde
SVS - Sistema de Vigilância em Saúde
SECs – células endoteliais sinusoidais (do inglês sinusoidal endothelial cells)
TIMPs - tecido inibidor de metaloprotease
TNF-α – fator- α de necrose tumoral (do inglês tumor necrose factor-α)
TGF- α – fato transformador do crescimento (do inglês transformer growth
factor-α)
TGF- β – fato transformador do crescimento (do inglês transformer growth
factor-β
tTG – tissue transglutaminase
tTG2 - tissue transglutaminase 2
γ-GT - γ-glutamiltranspeptidase (do ingles γ-glutamyltranspeptidase)
HBV – vírus da hepatite B
HCV – vírus da hepatite C
xv
RESUMO
Introdução: O desenvolvimento de um modelo animal adequado de cirrose
hepática que reproduza um padrão histológico irreversível da doença humana é
uma importante ferramenta para o estudo dos mecanismos morfofuncionais
dessa doença e para a avaliação de potenciais terapias. Nosso estudo buscou
estabelecer um modelo experimental através da associação de tetracloreto de
carbono (CCl
4
) e etanol, e investigar o potencial de reversibilidade espontânea
após a retirada das hepatotoxinas através das alterações histológicas e
bioquímicas dos fígados cirróticos.
Métodos: Ratos Wistar fêmeas pesando entre 150-200g foram divididos de
acordo com a dieta líquida de Lieber-DeCarli e a administração de injeções
intraperitoneais (i.p.): NORMAL - ração padrão e água filtrada; CTRL - dieta
líquida controle (sem adição álcool); CTRL+Azeite - dieta líquida controle e i.p.
de azeite; CTRL+CCl
4
– dieta líquida controle e i.p. de CCl
4
; EtOH – dieta
líquida alcoólica; EtOH+Azeite - dieta líquida alcoólica e i.p. de azeite;
EtOH+CCl
4
– dieta líquida alcoólica e i.p. de CCl
4
. A dieta foi administrada ad
libitum. O CCl
4
foi injetado em uma solução a 20% (dose = 0,05ml/kg de peso
corporal) diluído em veículo (azeite de oliva), três vezes por semana. Os
animais foram sacrificados ao fim de 15 semanas de indução. Alguns animais
dos grupos CTRL+CCl
4
e EtOH+CCl
4
foram mantidos com ração padrão e água
e sacrificados 8 semanas após o fim da interrupção da intoxicação.
Cortes
histológicos de 5µm corados com hematoxilina&eosina e picrosirius foram
realizados para a análise morfológica da arquitetura e da fibrose hepática,
respectivamente. A fibrose foi quantificada pela morfometria das lâminas de
picrosirius e pelo ensaio de hidroxiprolina. A imunofluorescência indireta foi
realizada para detectar colágenos I e III e a quantidade de tranglutaminase
tecidual 2 (tTG2). O soro foi coletado para as avaliações funcionais das
enzimas de lesão hepática - alanina aminotransferase (ALT) e aspartato
aminotransferase (AST) e de função hepática – bilirrubina (BilT) e albumina
(ALB).
Resultados: Ao final de 15 semanas de indução os animais dos grupos CTRL,
CTRL+Azeite, EtOH, EtOH+Azeite apresentaram padrões histológicos normais
quando comparados ao grupo NORMAL. Já os animais dos grupos CTRL+CCl
4
e
EtOH+CCl
4
demonstraram padrão de cirrose hepática, apresentando septos
fibrosos e nódulos de regeneração, que permaneceu alterado até 8 semanas
após a interrupção da agressão. O aumento no conteúdo de colágeno
analisado pela morfometria foi observado em ambos os grupos agredidos com
CCl
4
no final de 15 semanas (NORMAL - 2,25±1,21; CTRL+CCl
4
– 9,83±3,85;
EtOH+CCl
4
- 12,68±2,64), porém, quando analisados 8 semanas após a
interrrupção, os animais associados com CCl
4
e etanol (10,38±1,36)
permaneceram com um grau de fibrose maior que o grupo CTRL+CCl
4
(6,99±0,88). Este resultado nos encorajou a focalizar as investigações no grupo
que associou CCl
4
e etanol. O aumento da detecção do colágeno no grupo
EtOH+CCl
4
se manteve 8 semanas após a suspensão da indução como
evidenciado pelo ensaio de hidroxiprolina (NORMAL - 1,2±0,17; EtOH+CCl
4
-
1,9±0,03; EtOH+CCl
4
/8sR - 1,6±0,18) e pela imunofluorescência. A
imunofluorescência realizada para a tTG2 também demonstrou um aumento na
detecção e na quantidade dessa enzima que permaneceu elevado após 8
xvi
semanas da retirada das hepatotoxinas (NORMAL - 7,90±0,83; EtOH+CCl
4
-
66,43±8,00; ETOH+CCl
4
/8sR - 56,82±21,10). Os valores de AST (NORMAL –
62,20±14,15; EtOH+CCl
4
(582,4±297,2), ALT (NORMAL – 12,0±2,9;
EtOH+CCl
4
– 102,0±83,47), BilT (NORMAL – 0,02±0,04; EtOH+CCl
4
-
0,15±0,18) e ALB (NORMAL – 4,32±0,22; EtOH+CCl
4
– 2,96±0,32) estavam
alterados na 15
a
semana de indução, porém retornaram aos níveis normais 8
semanas após interrupção da intoxicação.
Conclusão: A associação de CCl
4
e etanol induziu cirrose hepática em ratos
representativa dos aspectos fisiopatológicos e clínicos da doença humana e foi
capaz de sustentar as alterações histopatológicas por um longo tempo após a
retirada dos agentes agressores, embora os parâmetros funcionais tenham
sido normalizados.
xvii
ABSTRACT
Introduction: The development of an adequate animal model of hepatic
cirrhosis that reproduces an irreversible histological standard of human is an
extremely important tool for the study of the morphofunctional mechanisms of
this illness and for evaluation of potential therapies. Our study searched to
establish an associated CCl
4
–ethanol-induced cirrhosis model and investigate
the spontaneous recovery potential after the withdrawal of the aggressive
agents through histological and biochemistry alterations of cirrhotic livers.
Methods: Female Wistar rats weighting between 150–200g were divided in
accordance with the Lieber-DeCarli liquid diet and the intraperitonial injections
(i.p.): NORMAL - standard rat chow and filtered water; CTRL - control (non-
alcohol) Liber-DeCarli liquid diet; CTRL+Oil - control Liber-DeCarli liquid diet
and i.p. of oil; CTRL+CCl
4
- control Liber-DeCarli liquid diet and i.p. of CCl
4
;
EtOH – alcoholic Liber-DeCarli liquid diet; EtOH+Oil - alcoholic Liber-DeCarli
liquid diet and i.p. of oil; EtOH+CCl
4
- alcoholic Liber-DeCarli liquid diet and i.p.
of CCl
4
. The diet was administrated ad libitum. The CCl
4
was injected in a 20%
solution (dose = 0.05mL/kg body weight) diluted in vehicle (olive oil), three
times weekly throughout 15 weeks. Some animals of groups CTRL+CCl
4
and
EtOH+CCl
4
were fed with standard chow and water and were sacrificed 8
weeks after interruption of insult. Hepatic architecture and fibrous septa were
analyzed in liver slices of 5µm stained with Hematoxilin&Eosin and Sirius Red,
respectively. Fibrosis quantification was measured by morphometry and
hydroxyproline assay. Indirect immunofluorescence was performed to detect
collagens type I and III and the amount of tissue transglutaminase 2 (tTG2). The
serum was collected for hepatic injury enzymes evaluations - alanine
aminotransferase (ALT) and aspartate aminotransferase (AST), and hepatic
function - total bilirubin (BilT) and albumin (ALB).
Results: At the end of 15 weeks of chronic hepatic injury, animals from groups
CTRL, CTRL+OIL, EtOH, EtOH+OIL presented a normal liver pattern when
compared to NORMAL group. In contrast, rats in groups CTRL+CCl
4
and
EtOH+CCl
4
showed a cirrhosis pattern, with fibrous septa and regenerative
nodules in that were sustained by 8 weeks after interruption of injury. The
increase in the content of collagen analyzed by morphometry was observed in
both the groups intoxicated with CCl
4
in the end of 15 weeks (NORMAL –
2.25±1.21; CTRL+CCl
4
– 9.83±3.85; EtOH+CCl
4
– 12.68±2.64), however,
fibrosis quantification at 8
th
week after interruption of intoxication remained
higher in EtOH+CCl
4
/8wR (10.38±1.36) group when compared with
CTRL+CCl
4
/8wR group (6.99±0.88). This result encouraged us to focus
investigation on CCl
4
and ethanol intoxicated animals. The EtOH+CCl
4
group
presented an increase in collagen content remained until 8 weeks after
inteerruption of intoxication as evidenced by assay of hydroxyproline (NORMAL
- 1,2±0.17; EtOH+CCl
4
- 1,9±0.03; EtOH+CCl
4
/8sR – 1.6±0.18) and by
immunofluorescence. The immunofluorescence performed by tTG2 also
demonstrated an increase in detection and the amount of this enzyme that
remained high after the interruption of the hepatotoxins (NORMAL – 7.90±0.83;
EtOH+CCl
4
– 66.43±8.00; EtOH+CCl
4
/8wR – 56.82±21.10). Values of AST
(NORMAL – 62.20±14.15; EtOH+CCl
4
(582.4±297.2), ALT (NORMAL –
12.0±2.9; EtOH+CCl
4
– 102.0±83.47), BilT (NORMAL – 0.02±0.04; EtOH+CCl
4
-
xviii
0.15±0.18) and ALB (NORMAL - 4.32±0.22; EtOH+CCl
4
– 2.96±0.32) were
altered at 15
a
week of induction but returned to normal levels 8 weeks after
interruption of intoxication.
Conclusion: Carbon tetrachloride-ethanol association induced hepatic cirrhosis
in rats representative of physiopathologic and clinic aspects of human disease
and sustained cirrhosis morphology over a wider period of time, although
functional parameters may normalize.
xix
1. INTRODUÇÃO
1.1. PANORAMA GERAL DAS HEPATOPATIAS CRÔNICAS
A doença hepática crônica é uma enfermidade que acomete grande
parcela da população mundial, atingindo cerca de 1,5 milhões de pessoas
por ano, segundo dados da Organização Mundial de Saúde (OMS, 2004).
Dentre as diversas etiologias que podem levar às hepatopatias
crônicas as hepatites virais e o álcool são as mais prevalentes. A OMS
relatou que mais de 2 bilhões de pessoas foram infectadas pelo vírus da
hepatite B (HBV), desses aproximadamente 15% poderiam desenvolver
hepatite crônica ou cirrose hepática. Apesar da infecção pelo vírus da
hepatite C (HCV) ser menos freqüente, estima-se que 180 milhões de
pessoas no mundo estão infectadas, sendo que cerca de 72%
desenvolvem hepatopatias crônicas evoluindo na maioria das vezes para
a cirrose (OMS, 2000).
Em se tratando do etanol, estima-se que de dois bilhões de
pessoas que consomem bebidas alcoólicas, cerca de 76 milhões têm
diagnóstico de desordem de consumo de álcool (OMS, 2004). O
alcoolismo foi responsável por cerca de 30% dos casos de cirrose
hepática no ano de 2005 de acordo com a OMS (ROOM e cols., 2005).
O hepatocarcinoma (CHC) causa 1 milhão de mortes anualmente
no mundo (WU e cols., 2006). Dos pacientes infectados pelo HBV, cerca
de 10% evoluem para o CHC em populações de baixo risco e em regiões
xx
de grande incidência do vírus cerca de 56% da população é acometida
pelo câncer (BOSCH e cols., 2004).
No Brasil o panorama também é preocupante. No ano de 2002 o
SUS apontou 9.731 (12%) óbitos em 76.628 internações devido a
doenças do fígado. Dentre esses óbitos, 21,1% foram atribuídos a
doenças relacionadas ao consumo excessivo de álcool. Para
compreender a relevância desses dados, basta analisar que as mortes
ocasionadas por infarto do miocárdio (IM), a maior causa de óbitos no
país, representaram cerca de 15,6% das internações ocorridas. Além
disso, os gastos com o pagamento de autorizações de internação
hospitalar (AIH) para as doenças hepáticas não são muito menores do
que os gastos com as mesmas AIH para o infarto agudo do miocárdio
(IAM). Enquanto o IAM custou ao SUS 55 milhões de reais em 2002, as
doenças hepáticas consumiram quase 53 milhões de reais
(DATASUS/MS, 2002).
1.2. EPIDEMIOLOGIA DA CIRROSE HEPÁTICA
A cirrose é uma doença grave, pois pode comprometer a função
hepática e levar à falência do órgão. Segundo dados do ano de 2001 da
Organização Mundial de Saúde, estima-se que a cirrose hepática foi
responsável pela morte de aproximadamente 796.000 pessoas em todo o
mundo, sendo classificada como a décima quinta causa de mortalidade no
mundo [OMS, 2003].
xxi
No Brasil, os dados de mortalidade provenientes do Sistema de
Vigilância em Saúde do Ministério da Saúde do governo brasileiro (SVS)
indicam as doenças do aparelho digestivo como a oitava maior causa de
mortalidade, sendo que aproximadamente 30% dos óbitos que se
enquadram nessa categoria têm como causa a cirrose hepática [SVS/MS,
2004].
Os indicadores de mortalidade do Departamento de Informação e
Informática do Sistema Único de Saúde (DATASUS/MS) referentes ao período
de 2002 demonstram que a taxa de mortalidade específica por cirrose hepática
é de 7,79 óbitos para cada 100.000 habitantes e que o número de óbitos por
essa doença tende a crescer em proporção ao aumento da população do país
[DATASUS/MS, 2002].
Diversas tentativas de tratamento têm sido realizadas para mudar esse
quadro, porém ainda esbarramos no transplante hepático como única
alternativa, cuja viabilidade está sujeita à presença de uma política sistemática
e eficiente de doação de órgãos no país.
1.3. O FÍGADO
1.3.1. Anatomia, Função e Estrutura
O fígado é o maior órgão do corpo humano, representando cerca de 2%
a 5% do peso corporal total no adulto (DESMET, 2001). Está localizado na
parte superior da cavidade abdominal abaixo do diafragma. Anatomicamente o
fígado é dividido em dois lobos principais, o direito e o esquerdo separados
xxii
pelo ligamento falciforme, ambos os lobos com quatro segmentos cada. (Figura
1) (SHERLOCK&DOOLEY, 2002).
Figura 1 – Representação esquemática da anatomia dos lobos hepáticos
(adaptado de SHERLOCK&DOOLEY, 2002)
O aporte sanguíneo é realizado por duas vias: a artéria hepática e a veia
porta (SHERLOCK&DOOLEY, 2002). A artéria hepática possui a função de
manter o suprimento sanguíneo rico em oxigênio e nutrientes vindos da aorta.
A veia porta transporta cerca de 80% do sangue vindo do tubo digestivo, baço
e pâncreas, sendo responsável pela regulação do microambiente metabólico
do hepatócito. A drenagem venosa é realizada pela veia central que passa o
sangue pela veia cava inferior levando-o de volta ao coração. A bile secretada
pelos hepatócitos é excretada através dos ductos biliares. (Figura 2) (ARIAS,
2001).
Lobo Direito
Diafragma
Lobo Esquerdo
Ligamento
Falciforme
Vesícula Biliar
xxiii
Figura 2 – Representação esquemática dos vasos sanguíneos hepáticos.
(adquirida no site: www.hepcentro.com.br).
Além de sintetizar e secretar o produto biliar, o fígado desenvolve
diversas funções tais como: absorção e armazenamento de substâncias da
dieta (carboidratos, proteínas, lipídeos, minerais e vitaminas), transporte e
regulação de volume sanguíneo e depuração de toxinas. O fígado também
participa dos mecanismos de fagocitose, hematopoiese e coagulação
(DESMET, 2001).
A divisão clássica da unidade hepática, o lóbulo, é baseada na visão
estrutural de veias hepáticas tributárias localizadas na posição central (veias
centrais) e, na periferia encontram-se os tratos portais. Esses vasos são
xxiv
delineados por hepatócitos e sinusóides desenhando uma estrutura hexagonal
(Figura 3) (DESMET, 2001).
Porém, em 1976, RAPPAPORT descreveu o fígado de uma maneira
mais complexa considerando a parte estrutural e funcional, criando assim o
ácino hepático. Esse conceito se baseia na divisão do parênquima hepático em
três zonas, de acordo com a proximidade dos hepatócitos e fluxos sanguíneos
originários de espaços-porta (ramos terminais da veia porta, artéria hepática e
ducto biliar) e veias centro lobular (Figura 3) (SHERLOCK&DOOLEY, 2002)
Figura 3 – Representação esquemática do lóbulo Hepático (bordas azuis),
com uma veia centro-lobular ao centro e delimitado por tratos portais na
sua periferia e do ácino hepático com suas zonas: a zona acinar 1 (bordas
amarela), zona acinar 2 (borda laranja) e zona acinar 3 (borda vermelha).
(adaptado de 3B Scientific microanatomy ™, 2002).
Lóbulo Hepático
Trato Portal
Ácino
Hepático
Veia Centrolobular
Zona Acinar 1
Zona Acinar 2
Zona Acinar 3
Sinusóides
xxv
A zona 1 (peri-portal) é a primeira a receber o sangue com alto
conteúdo de oxigênio e nutrientes, sendo considerada a região mais ativa e
resistente. É o local com grandes concentrações de enzimas pertencentes ao
ciclo de Krebs. A zona 2 (medio-lobular) recebe o sangue com conteúdo
intermediário de oxigênio. A zona 3 (peri-venular) é a última a ser irrigada,
recebendo assim, o sangue mais pobre em oxigênio e substratos. É uma região
responsável pela detoxicação, possuindo grandes quantidades da enzima
microssomal citocromo P450. Cada zona possui características funcionais
distintas que caracterizam a heterogeneidade do parênquima hepático
(TABELA 1) (SHERLOCK & DOOLEY, 2002)
Tabela 1 – Metabolismo dos hepatócitos relacionado à zona acinar
(adaptado de SHERLOCK & DOOLEY, 2002).
Durante o processo de injúria as zonas 1 e 2 possuem maior capacidade
de regeneração que a zona 3 que, devido às suas características, é mais
propensa a morte celular (SHERLOCK&DOOLEY, 2002).
Zona 1 Zona 3
Carboidratos Gliconeogênese Glicólise
Proteínas Albumina
Fibrinogênio
Albumina
Fibrinogênio
Citocromo P450 Após fenobarbital +
+
++
++++++++
Suprimento de oxigênio +++ +
Formação de bile
dependente de sais biliares
não dependente de sais biliares
++
-
-
++
Sinusóides Estreito e anastomótico Direto e radial
xxvi
1.3.2. Microambiente Hepático
Os hepatócitos (células hepáticas) constituem cerca de 60% da
população do fígado. Apresentam uma membrana plasmática com três
superfícies: uma sinusoidal conectando o espaço de Disse e indiretamente o
sangue, a segunda intercelular ligando hepatócitos vizinhos e a terceira
canalicular biliar (SCHACHTER, 2001).
As diferentes conexões dos hepatócitos com o meio externo permitem o
desenvolvimento de variadas funções tais como secreção de proteínas
plasmáticas para o sangue (SCHACHTER, 2001), sinalização intercelular e
controle de crescimento celular (KOJIMA e cols., 2003) e secreção da bile para
os canalículos biliares (SCHACHTER, 2001).
Os hepatócitos são organizados em cordões separados entre si por
sinusóides - unidades microvasculares. Os sinusóides são delineados por
células endoteliais sinusoidais (do inglês sinusoidal endothelial cells - SECs),
que formam uma barreira porosa com suas fenestras, permitindo a troca de
materiais entre o sangue e o epitélio (FRIEDMAN, 2000).
Além do endotélio propriamente dito existem outros tipos celulares que
junto dos hepatócitos formam a unidade funcional e histológica do fígado. As
células de Kupffer (do inglês kuppfer cells - KCs) e células estreladas hepáticas
(do inglês hepatic stellate cells - HSCs) são células não parênquimatosas que
participam ativamente da regulação da matriz extracelular (MEC)
(SHERLOCK&DOOLEY, 2002).
As KCs estão acopladas aos sinusóides sendo localizadas
particularmente na região peri-portal. Essas células participam da resposta
xxvii
imunológica realizando endocitose. (SHERLOCK&DOOLEY, 2002). Atualmente
tem sido descrito que esses macrófagos participam da ativação de células
estreladas, visto que a produção de fibrose requer um ambiente com células
inflamatórias. (FRIEDMAN, 2005)
As HSCs, também denominadas lipócitos, células de Ito, células fat-
storing ou células perissinusoidais, estão presentes no espaço de Disse, região
localizada entre os hepatócitos e o endotélio sinusoidal. São as principais
reguladoras da MEC do fígado normal e possuem um papel fundamental na
resposta à injúria (SATO e cols., 2003; GEERTS, 2001; MABUCHI e cols.,
2004). Essas células produzem grande variedade de componentes da MEC
incluindo colágenos tipo I, III, IV e V; glicoproteínas e proteoglicanos. Em
estado fisiológico, as HSCs se encontram quiescentes e são responsáveis pelo
estoque e transporte de retinóide (vitamina A) (LI e FRIEDMAN, 2001). Em
resposta à lesão hepática, essas células se ativam, perdem retinóide e seu
fenótipo se torna de uma célula contrátil semelhante a um miofibroblasto
(WANG e cols., 2004; MABUCHI e cols., 2004). A partir desse momento as
HSCs aumentam a produção de componentes da MEC e alteram a sua
composição, gerando principalmente colágenos fibrilares do tipo I e III (LI e
FRIEDMAN, 2001; WANG e cols., 2004). Além disso, as HSCs são fonte de
enzimas proteolíticas, as metaloproteases da matriz extracelular (MMPs). As
MMPs também conhecidas como colagenases e gelatinases dependendo do
substrato, são responsáveis pela degradação do colágeno basal e intersticial. A
maioria é sintetizada e secretada pelas HSCs sendo que durante a lesão
ocorre aumento da secreção dessas enzimas, principalmente MMP-1 e -2 e de
xxviii
seus inibidores (tecido inibidor de metaloprotease - TIMPs), TIMP-1 e -2 (LI e
FRIEDMAN, 2001).
A MEC que compõe o espaço de Disse é de grande importância para a
manutenção da homeostasia hepática, pois é fonte de diversas moléculas e
substâncias, dentre elas: colágenos fibrilares (tipo I, III e V) e não-fibrilares (tipo
VI), colágenos de membrana basal (tipo IV e XVIII), glicoproteínas estruturais
(laminina, fibronectina), proteoglicanos (decorina, tenascina-C, entactina,
heparan sulfato, condroitinas e outros) além de citocinas e fatores de
crescimento (SATO e cols., 2003).
1.4. REGENERAÇÃO HEPÁTICA
Desde os tempos da Grécia antiga é sabido que o fígado possui uma
extraordinária capacidade de regeneração espontânea, realizando hiperplasia e
hipertrofia compensatória para restauração da massa e da função hepática. O
modelo experimental de hepatectomia parcial (retirada de 70% do fígado) em
ratos é um dos estudos pioneiros e mais bem sucedidos de regeneração
hepática, descrito em 1931 por Higgins e Anderson (citado por
MICHALOPOULOS & DeFRANCES, 1997).
Tanto na hepatectomia quanto na injúria tóxica, os hepatócitos são as
primeiras células que proliferam para substituir o tecido lesado, saindo do
estado quiescente, estimuladas por fatores de crescimento e citocinas (JESUS
e cols., 2000; HIRONOBU e cols., 2006).
O fator de necrose tumoral tipo-α (do inglês tumor necrose factor-α -
TNF-α) e a interleucina-6 (do inglês interleucine - IL-6) são citocinas que atuam,
xxix
de maneira parácrina, como “gatilhos” iniciais na cascata de regeneração
estimulando a entrada dos hepatócitos no ciclo celular (G
0
G
1
). (YANG e
cols., 1998; PAHLAVAN e cols., 2006).
O fator de crescimento do hepatócito (do inglês hepatic growth factor -
HGF) produzido pelas KCs, HSCs e SECs e o fator transformador do
crescimento-α (do inglês transformer growth factor-α – TGF- α) sintetizado
pelos hepatócitos, são os principais agentes envolvidos no direcionamento
dessas células para a síntese de DNA (G
1
S) (HIRONOBU e cols., 2006). A
replicação inicia de uma maneira quase sincronizada atingindo o pico de
síntese de DNA após 24 horas, quando cerca de 35% dos hepatócitos estão
envolvidos ativamente na divisão celular. O pico de mitose ocorre 6-8 h após a
injúria (FAUSTO, 2001; JESUS e cols., 2000).
O processo de término da proliferação é vagamente conhecido, porém
sabe-se que o fator de crescimento transformador tipo β (do inglês transformer
growth factor-β - TGF- β) secretado por KCs, SECs e HSCs, inibe tanto a ação
do HGF quanto do TGF- α, fatores pró-mitóticos, e interrompe a proliferação
modulando assim a resposta tardia. (YANG e cols., 2006). O TGF- β inibe a
síntese de DNA do hepatócito, tanto em cultura como in vivo, podendo estar
atuando na regulação da regeneração e da fibrogênese hepática
(WOLLENBERG e cols., 1987; RUSSELL e cols., 1988). GREESNER e cols
(2002) demonstraram que o TGF- β participa da transdiferenciação das HSCs
em miofibroblastos, evidenciando sua ação anti - mitótica durante a lesão
hepática.
O reparo hepático basicamente envolve hepatócitos adultos,
principalmente células tetraplóides (FAUSTO, 2001). No entanto, numa
Excluído:
<sp>
xxx
situação em que o dano impede a capacidade proliferativa do hepatócito,
ocorre a replicação de células ovais consideradas células tronco do fígado.
Essa população endotelial foi descoberta nos canais de Hering e é capaz de se
diferenciar em células hepáticas e células de ducto biliar (PAHLAVAN e cols.,
2006).
O transplante de fragmentos de fígado e o transplante de doador vivo
têm sido utilizados clinicamente e podem resultar na completa recuperação do
órgão em ambos, doador e receptor. Desde que o primeiro transplante de
fígado humano foi realizado por Starzl em 1963 (citado em FERREIRA e cols.,
2000), projetos experimentais têm evoluído com o objetivo de descobrir uma
terapia efetiva no tratamento das doenças hepáticas crônicas.
1.5. CIRROSE HEPÁTICA
1.5.1. Definição de Cirrose
A cirrose hepática é definida como um processo crônico caracterizado
histologicamente pela presença de fibrose e nódulos de regeneração e
funcionalmente pela ocorrência de hipertensão porta. Esses fatores integrados
levam à falência do órgão. (SHERLOCK&DOOLEY, 2002).
É uma doença de caráter irreversível que reduz a qualidade de vida do
paciente que possui, na maioria das vezes, como única alternativa o
transplante do fígado e dependendo do grau da complicação, pode levar ao
óbito.
1.5.2. Aspectos Morfológicos
xxxi
O surgimento da cirrose hepática ocorre por mecanismos de fibrose
desenvolvidos por um complexo processo no qual envolve principalmente
HSCs, citocinas, MMPs e TIMPs.
Após a lesão hepática aguda hepatócitos sobreviventes são capazes de
regenerar o órgão. Porém, lesões crônicas causadas por diversos agentes
como HBV, HCV, abuso de álcool e drogas resultam em quebra da
homeostasia com posterior deposição de componentes da MEC
(principalmente colágeno), desenvolvendo a fibrose hepática (BATALLER e
BRENNER, 2005).
A fibrose hepática pode ser considerada um processo reversível quando
o agente causador é interrompido (OKAZAKI e cols., 2001). No entanto,
quando a agressão é mantida, o colágeno se deposita continuamente formando
septos fibrosos que evoluem para nódulos de regeneração, estabelecendo o
quadro de cirrose hepática. Esse quadro é irreversível e cursa com a distorção
da arquitetura hepática, perda de função hepatocelular e de fenestras
sinusoidais (FRIEDMAN, 1999; ROJKIND, 2001).
Na fibrogênese, as HSCs modificam seu fenótipo para células tipo
miofibroblastos e tornam-se as principais produtoras de MEC, principalmente
de colágeno. As etapas envolvidas nesse processo em que as células perdem
a capacidade de estocar vitamina A e se tornam ativadas são reguladas por
diferentes células, fatores de crescimento e citocinas. (Figura 4) (FRIEDMAN,
2000; BATALLER e BRENNER, 2005).
xxxii
Figura 4 – Representação esquemática das modificações ocorridas no
fígado normal após a lesão hepática crônica (adaptado de FRIEDMAN,
2000).
A ativação das HSCs pode ser conceituada em duas etapas: iniciação e
perpetuação. A primeira é regulada por mecanismos parácrinos que
desencadeiam mudanças genotípicas e fenotípicas do início da cascata
fibrogênica. A segunda é regulada por mecanismos autócrinos e parácrinos
que permitem o estado ativado estável de produção de fibrose. (LI e
FRIEDMAN, 2001). O TGF
β
1 produzido por KCs, SECs e HSCs parece ser um
importante regulador da cascata fibrogênica e participa de ambas as etapas de
ativação. Ele atua sobre as KCs induzindo a expressão de TGF
β
1 e sobre as
HSCs estimulando a síntese e inibindo a degradação da MEC. (FRIEDMAN,
1999; BATALLER e BRENNER 2005). Além disso, ele induz acúmulo de H
2
O
2
Espaço de Disse com matriz extracelular
de baixa densidade, célula estrelada
hepática em estado quiescente e com
acúmulo de retinóides, hepatócitos com
microvilos e células endoteliais
sinusoidais com poros.
Matriz extracelular com depósito de
fibras de colágeno, células estreladas
hepáticas ativadas em proliferação e
fibrogênicas, perda dos microvilos dos
hepatócitos, perda dos poros das
células endoteliais sinusoidais.
xxxiii
em varias células, causando estresse oxidativo que estimula a ativação das
HSCs. (DOMINGUEZ-ROSALEZ e cols., 1997). O fator de crescimento
derivado de plaquetas (PDGF) e o fator de crescimento epidérmico (EGF)
ambos produzidos por plaquetas, são descritos como importantes mitogénos
das HSCs (SHERLOCK&DOOLEY, 2002).
O acúmulo de MEC produzido pela ativação das HSCs seguindo a injúria
crônica gera um aumento de até 6 vezes no conteúdo de componentes
protéicos, sendo que os colágenos nas formas fibrilares (I e III) apresentam um
aumento de até 7 vezes (BATALLER e BRENNER, 2005). Dois fatores
importantes para a persistência do colágeno depositado podem ser
estabelecidos: o primeiro é a redução da atividade de proteases (MMPs) e o
segundo é a capacidade do colágeno resistir à degradação dessas proteases.
Um dos fatores que determinam o completo desequilíbrio na síntese e
na degradação dos colágenos é a atividade reduzida das MMPs devido
principalmente a superexpressão de seus inibidores - TIMPs (BATALLER e
BRENNER, 2005). A expressão de MMP-1 e MMP-13 são aumentadas na fase
inicial da injúria, porém são rapidamente reduzidas pelo aumento da expressão
de TIMP-1, TIMP-2 que mantém os colágeno tipo I e tipo III depositados em
grande quantidade. Já as MMP-2, MMP-3, MMP-9 e MMP-10 têm a expressão
aumentada gradualmente durante a fibrogênese, resultando no aumento da
degradação de componentes da membrana basal, incluindo colágeno tipo IV
(ROJKIND e GREENWEL, 2001).
O segundo ponto importante é a resistência do colágeno a degradação
pelas MMPs. A ligação cruzada covalente entre as proteínas de colágeno
(cross-linking) é realizada pelas transglutaminases teciduais (tTG), uma grande
xxxiv
família de enzimas que catalisam reações dependentes de Ca
2+
. Essas
enzimas são localizadas no sangue e em espaços intra - e extracelulares além
de atuarem em diversos processos bioquímicos, tais como, coagulação,
remodelamento tecidual, estabilização da matriz e morte celular (GRIFIN e
cols., 2002).
A transglutaminase tecidual 2 (tTG2 ou TG2) é a enzima mais conhecida
no envolvimento da fibrogênese. Ela catalisa a reação entre grupamentos γ-
carboxiamida e polipeptídeos ligados a um resíduo de lisina para formar um
isopeptídeo N
ε
(γ glutamil) lisina (LORAND e GRAHAM, 2003). Essa reação
química estabiliza as fibras de colágeno, aumentando a resistência à
degradação por enzimas proteolíticas. Com a agressão crônica, essas fibras se
tornam espessas e formam septos que irão circundar nódulos de regeneração,
caracterizando a cirrose hepática (WU e ZERN, 2004).
1.5.3. Aspectos Clínicos
A cirrose possui diferentes etiologias (Tabela 2) com características
peculiares, porém resultando em um quadro clínico comum: insuficiência
hepatocelular e hipertensão porta.
Etiologia da Cirrose Hepática
Hepatite Viral (B, C e D)
Etanol
Metabólica
Colestática
Bloqueio de Fluxo Venoso Hepático
Hepatite Auto-Imune
Toxinas e drogas
Criptogênica
xxxv
Tabela 2 – Principais Causas de Cirrose Hepática (SHERLOCK & DOOLEY,
2002).
As complicações mais graves são: desnutrição, ascite, peritonite
bacteriana, varizes e sangramento no esôfago, insuficiência hepatorenal,
síndrome hepatopulmonar e carcinoma hepatocelular (SHERLOCK &
DOOLEY, 2002).
O diagnóstico padrão de cirrose hepática ainda é histológico (biópsia
hepática). Outra forma de avaliação da doença se faz através de análises
bioquímicas na qual se avalia a presença de disfunção hepatocelular.
As aminotranferases são enzimas que catalisam reações de
transaminação. O aumento dessas enzimas indica lesão hepatocelular
(necrose). A alanina aminotransferase (ALT) é mitocôndrial, encontrada
exclusivamente nos hepatócitos. Já a aspartato aminotransferase (AST) é
citosólica, encontrada em vários órgãos: coração, músculo, rins, pâncreas e
fígado.A fosfatase alcalina, γ-glutamiltranspeptidase (γ-GT) e 5`nucleotidase
são importantes na detecção de colestase. (KAPLAN, 1993)
Outras substâncias são úteis na avaliação da função hepática. A
bilirrubina indireta ou não conjugada é um produto do metabolismo do heme
(eritrócitos), posteriormente conjugada em bilirrubina direta no fígado. A
elevação da concentração de bilirrubina direta no sangue representa disfunção
hepática ou obstrução dos ductos biliares. O aumento da bilirrubina indireta ou
não conjugada no sangue pode estar associado ao aumento da oferta de heme
(hemólise), à diminuição da captação hepática ou à diminuição da conjugação
hepática (deficiência da enzima glicuroniltransferase). A albumina é uma
xxxvi
proteína plasmática sintetizada exclusivamente pelas células hepáticas e a
diminuição nos níveis séricos dessa substância indicam baixa síntese e
concomitante secreção pelos hepatócitos (DAVERN, 2002).
Pacientes capazes de remover o agente causador da agressão hepática
vivem com a cirrose sem grandes complicações. Essa característica de cirrose
compensada é um estado clinico em que permanecem os padrões
histopatológicos, mas a função hepática melhora. A cirrose descompensada
poderá levar o paciente ao óbito. Quando o paciente atinge o estágio de
cirrose descompensada, a única terapia definitiva ainda é o transplante
hepático (DAVIS e cols., 2003; D’AMICO e cols., 2006). Embora muitos
esforços tenham sido feitos para aumentar a doação, a disponibilidade de
órgãos é muito pequena. Assim, é necessária a busca de novas terapias
capazes de aumentar a taxa de sobrevivência desses pacientes, para garantir
que estejam aptos para aguardar um transplante.
1.6. MODELO EXPERIMENTAL DE CIRROSE HEPÁTICA
Diversas abordagens metodológicas têm sido propostas para o
desenvolvimento experimental de fibrose e cirrose em ratos. Os principais
estudos o fazem através da obstrução do ducto biliar ou por administração de
substâncias hepatotóxicas como dimetilnitrosamina, tioacetamida e tetracloreto
de carbono (CCl
4
).
A obstrução do ducto biliar é um procedimento cirúrgico traumático
realizado em modelos animais por um período considerado curto (algumas
horas ou até 30 dias de oclusão) para o desenvolvimento de cirrose, sendo
xxxvii
portanto utilizado no estudo dos mecanismos de fibrogênese hepática
(modulação de MMps, TIMPs e citocinas) ocorridos na MEC (BISSELL e cols.,
1995; IREDALE e cols., 1996; KOSSAKOWSKA e cols., 1998)). KAMATH e
cols (1999) realizaram um estudo de hipertensão porta relatando alta
mortalidade e um percentual pouco significante ou ausente de fibrose após a
oclusão biliar de oito semanas.
MADDDEN e cols relataram em 1970 que a dimetilnitrosamina é fatal ao
homem mesmo em pequenas quantidades, necessitando muito cuidado na sua
manipulação. Haney e cols (1972) administraram dimetilnitrosamina em ratos
por gavagem levando a cirrose hepática em 4 semanas. No entanto esse
mesmo estudo demonstrou regeneração espontânea e mortalidade de 25% dos
animais. Jezequel e cols (1989) em um modelo de lesão hepática crônica
descreveram a produção de cirrose micronodular num período de 3 semanas.
Em ambos os trabalhos o período de indução de cirrose hepática foi muito
curto para reproduzir no animal as características representativas da doença
em humanos, a irreversibilidade.
Em um estudo de Li e cols (2002) a tioacetamida foi administrada
oralmente (diluída em água) por 12 semanas, desenvolvendo cirrose hepática.
Porém nesse mesmo trabalho foi relatado que para a reprodução da lesão
hepática crônica em 100% dos animais, deve haver um ajuste de dose de
acordo com a variação de peso do animal.
O CCl
4
tem sido utilizado por décadas no estudo das lesões hepáticas
crônicas em diversos modelos experimentais. O primeiro relato de
desenvolvimento de cirrose hepática induzida por CCl
4
foi proposto por
CAMERON E KARUNARATNE em 1936 (citado por McLEAN, e cols., 1969)
xxxviii
que estabeleceram a morfologia e os padrões de condições experimentais
dessa hepatotoxina. Esse estudo foi criticado por haver lento processo de
indução, alta taxa de mortalidade devido às altas doses administradas e um
padrão heterogêneo de lesão, visto que uma proporção dos ratos
sobreviventes não desenvolvia cirrose (McLEAN et al. 1969, PEREZ-TAMAYO,
1983).
Para reduzir tais problemas, foi proposta por McLean em 1969 a
administração simultânea de fenobarbital e CCl
4
em que se observou a
redução da mortalidade e do tempo de agressão necessário para a indução de
cirrose e um aumento da proporção de animais cirróticos.
O fenobarbital foi associado ao CCl
4
no desenvolvimento de cirrose
hepática por sua capacidade de aumentar a síntese do sistema oxidativo
enzimático microssomal (MEOS) ou sistema enzimático do citocromo P450,
enzima pela qual o CCl
4
é metabolizado, potencializando sua hepatoxicidade
(McLEAN e cols., 1969; CASTILLO e cols., 1992). No entanto, é descrito que
após a suspensão da indução ocorre regeneração hepática e reparo tecidual
(KODAVANTI e cols., 1992; HASHIMOTO e cols., 1999).
Sabe-se que a cirrose hepática em humanos é uma doença irreversível.
Portanto a escolha de um modelo que demonstre esse padrão de lesão é
essencial para o estudo de seu mecanismo fisiopatológico. Tamayo (1983), em
seu estudo de revisão, critica a cirrose hepática produzida pelo CCl
4
,
baseando-se em achados anteriores que mostraram reversibilidade da lesão
hepática produzida em um mês de indução, quando a toxina foi suspensa. O
autor sugere que, para obter uma cirrose estável, a agressão deveria ser
xxxix
prolongada por um período maior de tempo, porém, podendo acarretar alta
mortalidade.
O CCl
4
é um líquido incolor e hidrofóbico, produzido a partir de outros
hidrocarbonetos, que libera vapor de odor etéreo. Hoje em dia, é utilizado
apenas como solvente industrial, mas foi utilizado largamente na produção de
cloro-flúor-carbonos (CFCs) para fluído refrigerante e propelente de aerossóis,
como pesticida e como solvente de limpeza doméstica. Sua produção e
utilização foram reduzidas após a constatação de seus efeitos deletérios tanto
à saúde humana bem como ao meio ambiente (ATSDR, 2005).
O fígado é um órgão especialmente vulnerável a essa hepatotoxina
devido à abundância da isoenzima do MEOS mais envolvida nesse processo, a
citocromo P450 2E1 (CYP2E1), presente no retículo endoplasmático liso de
hepatócitos (RECKANEL e cols., 1989).
A metabolização do CCl
4
pela CYP2E1 causa a quebra da ligação C-Cl
gerando o radical livre triclorometil (●CCl
3
). Esse radical livre reage
rapidamente ao oxigênio, formando um radical ainda mais reativo, o
triclorometilperoxi (CCl
3
O
2
●) (LAI e cols. 1978). Esses intermediários tóxicos
reativos causam lesão hepatocelular através da peroxidação lipídica e reações
autocatalíticas que resultam na perda da integridade da membrana. Além
disso, geram acúmulo de lipídios devido a incapacidade dos hepatócitos de
sintetizar apoproteína, proteína que se liga aos triglicerídedeos e facilita a
exportação de lipoproteínas. Essa alteração gordurosa caracteriza a esteatose
hepática (ROBBINS, 2001).
A ingestão de etanol foi utilizada em modelos experimentais de lesão
hepática aguda por ser um método simples de administração através da
xl
diluição na água do animal. No entanto para o desenvolvimento de um estudo
de lesão crônica existem alguns obstáculos quanto a essa forma de ingestão
tais como: aversão do animal ao álcool, desnutrição devido a ingestão de
nutrientes não balanceados e baixos níveis de etanol no sangue (PONNAPA e
RUBIN, 2000; HALL e cols., 2001). Devido a essas limitações foi desenvolvida
uma dieta líquida alcoólica que garantia todos os nutrientes necessários e um
considerável consumo de etanol (HALL e cols., 2001). Tsukamoto e cols
administraram por via gástrica etanol em dieta líquida em ratos e observaram a
presença de esteatose e fibrose, mas não relataram o desenvolvimento de
cirrose hepática. (Tsukamoto e cols (1985) – citado em Hall 2001). Enomoto e
cols (1999 – citado em PONNAPA e RUBIN, 2000) relataram um outro modelo
em que o etanol foi administrado pela mesma via diariamente por 4 semanas,
porém causando os mesmos danos hepáticos relatados no estudo descrito
acima.
O etanol tem sido associado ao CCl
4
em alguns modelos de lesão
hepática crônica devido a sua capacidade de potencializar a hepatotoxicidade
do CCl
4
. Além de ser um agente hepatotóxico direto, principalmente quando
administrado em grandes doses (HALL e cols., 2001), a detoxicação do etanol
ativa a mesma via que metaboliza o CCl
4
, a citocromo P450, podendo
exarcebar a a ação da CYP2E1 em até seis vezes. (LIEBER 1988 – citado em
HALL 2001). O aumento da bioativação de radicais livres do CCl
4
causa
estresse oxidativo e peroxidação de lipídios de membrana culminando na lesão
hepatocelular (HASUMURA e cols., 1974; CASTILLO e cols., 1992; LIEBER,
1997). Outra via de detoxicação do etanol é através das enzimas álcool
desidrogenase e aldeído desidrogenase que produzem respectivamente,
xli
acetaldeído e acetato. Essas duas reações também geram moléculas reativas
de oxigênio aumentando o dano causado ao hepatócito (PONNAPPA e
RUBIN, 2000). Finalmente, o estímulo patogênico mediado pela associação de
ambas hepatotoxinas irá disparar uma cascata de eventos que culminarão na
deposição de colágeno, levando ao desenvolvimento de fibrose e cirrose
hepática. (Figura 5)
●
CCl
3
xlii
Figura 5 – Representação esquemática dos principais mecanismos
envolvidos na fibrogênese hepática induzida por etanol e por CCl
4.
(adaptado de ROJKIND & GREENWEL, 2001).
●
CCl
3
+
HEPATÓCITO
Etanol
Álcoo
l
Desidrogenase
CCl
4
CYP2E1
Estresse
H2O2
Acetaldeíd
o
Lesão
membrana
hepatócito
Depósito colágeno
HSC
Síntese colágeno
Espaço de Disse
KCs
TGF
-β
Sinusóide
FIBROSE
HEPÁTICA
xliii
Hall e cols (1991) comprovaram esse mecanismo através da produção
de um modelo de fibrose e cirrose após administração crônica de vapor de
CCl
4
em baixas doses e etanol em dieta líquida durante 10 semanas. Plummer
e cols (1994) relataram que a associação dessas toxinas contribuiu para a
lesão hepática de maneira dose-relacionada. A dose mínima de etanol
(2,29g/Kg/dia) associada a uma dose elevada de CCl
4
(240 ppm/hora)
desenvolveu cirrose hepática em um tempo longo (20 semanas) e com uma
incidência reduzida enquanto que a dose elevada de CCl
4
combinada a maior
dose de etanol (8,16g/Kg/dia) produziu a lesão em um período menor (10
semanas).
De acordo com os relatos demonstrados na literatura ainda não se tem
um modelo estabelecido de cirrose hepática capaz de reproduzir os aspectos
clínicos e fisiopatológicos da doença, sendo essencial o desenvolvimento de
modelos mais eficazes. Além disso, é muito importante a avaliação do potencial
de regeneração do parênquima hepático para o estudo de novas abordagens
terapêuticas.
xliv
2. OBJETIVOS
GERAL:
Desenvolver um modelo de cirrose hepática em ratos com baixo
potencial de reversibilidade espontânea, através da administração simultânea
de etanol e de baixas doses de CCl
4
.
ESPECÍFICOS:
Avaliar as alterações histológicas hepáticas relacionadas à exposição
crônica ao etanol e ao CCl
4
, isolados e em associação.
Comparar o potencial de reversão espontânea da cirrose hepática
induzida por CCl
4
e pela associação de etanol com CCl
4
.
Avaliar as características funcionais da cirrose hepática induzida pela
associação de etanol com CCl
4
.
xlv
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. ANIMAIS
Os animais utilizados no estudo foram ratos fêmeas Wistar adultos
pesando entre 150g e 250g adquiridos no biotério do Instituto de Biofísica
Carlos Chagas Filho (IBCCF) – UFRJ/RJ. Foram mantidos em caixas de
polipropileno, forradas com lascas de madeira esterilizadas, em ambiente com
temperatura controlada (entre 22ºC e 24ºC) e com ciclos claro/escuro natural
(12:12). Foram respeitados os preceitos do “Guia para o Uso e Cuidado de
Animais de Laboratório” (Publicação do NIH n
o
85-23, revisada em 1985, USA).
A pesquisa foi aprovada pelo comitê de ética da instituição (protocolo no. 021).
3.2. CONFECÇÃO DA DIETA LÍQUIDA ALCOÓLICA E NÃO-ALCOÓLICA
A dieta líquida foi realizada baseada na dieta de LIEBER-DeCARLI
descrita previamente (HALL, 2001), porém com algumas modificações no
preparo e em sua composição final. Seus ingredientes garantem aos animais
uma alimentação balanceada permitindo a substituição da ração padrão, sem
acarretar danos nutricionais. Alguns ingredientes foram pesados
separadamente, outros foram comprados prontos (Tabela 3).
A dieta líquida sem etanol foi realizada com a diluição de todos os
ingredientes em água filtrada e conseqüente homogeneização no liquidificador.
A dieta líquida alcoólica foi realizada com bebida alcoólica destilada
comercial – aguardente (Companhia Muller de Bebidas) - cuja composição
essencial é de água e etanol a 42% GL. A aguardente era adicionada durante a
preparação da dieta e a concentração final do etanol era de 5,5% (m/v).
xlvi
Tabela 3 – Composição da dieta líquida de Lieber-DeCarli modificada
(adaptado de LIEBER & DeCARLI, 1989).
3.3. GRUPOS EXPERIMENTAIS
Diversos grupos controles experimentais foram utilizados com o objetivo
de garantir que nenhum componente (azeite ou etanol) causaria lesão hepática
na ausência do CCl
4.
(Tabela 4).
Tabela 4 – Grupos experimentais de acordo com a dieta e injeção
intraperitoneal (i.p.)
Concentração para preparação de 1 Litro de dieta líquida
Albumina - 41,4 g Maltose Dextran - 115,2 g Vitamina A – 6000 UI Ácido Nicotínico – 7,5 mg
Cisteína – 0,5 g Colina – 5,68 g Vitamina B1 – 1,5 mg Pantetonato de Cálcio – 4 mg
Metionina - 0,3 g Carbonato de Cálcio – 2,7 g Vitamina B6 – 1,75 mg Inositol – 25 mg
Goma Xantina - 3g Cloreto de Sódio – 0,81 g Vitamina B12 – 25 µg Riboflavina - 1,5 mg
Celulose – 10g Fosfato de Sódio – 0,92 g Vitamina D - 400 UI Biotina – 50 µg
Azeite de Oliva – 28,4 g Fosfato de Potássio – 3,5 g Vitamina E – 30 UI Menadiona - 125 µg
Óleo de Milho - 8,5 g Sulfato Ferroso - 0,044g Ácido Fólico - 0,5 mg
Óleo de Girassol – 2,7 g Sulfato de Magnésio - 2,56g Ácido Parabenzóico – 12,5 mg Aguardente comercial – 160mL
NORMAL
Dieta de ração padrão e água filtrada; n = 7
CTRL
Dieta líquida sem etanol; n = 4
CTRL+Azeite
Dieta líquida sem etanol + injeção i.p. de azeite de oliva; n = 4
CTRL+CCl
4
Dieta líquida sem etanol + injeção i.p. de CCl
4
; n = 9
EtOH
Dieta líquida alcoólica; n = 5
EtOH+Azeite
Dieta líquida alcoólica + injeção i.p. de azeite de oliva; n = 11
EtOH+CCl
4
Dieta líquida alcoólica + injeção i.p. de CCl
4
; n= 7
* adicionado para constituir a dieta líquida alcoólica a 5,5%
xlvii
3.4. PROTOCOLO EXPERIMENTAL
O experimento foi dividido em 3 etapas: Adaptação – substituição da
ração pela dieta líquida; Indução da cirrose – substituição da dieta controle
pela dieta líquida alcoólica e injeção de CCl
4
; Interrupção da indução –
suspensão da dieta alcoólica e do CCl
4
. Na 1ª semana, etapa de adaptação,
todos os grupos receberam a dieta líquida sem etanol (dieta controle) com
exceção do grupo NORMAL que recebeu apenas ração padrão e água durante
todo o protocolo. Os grupos CTRL, CTRL+Azeite e CTRL+CCl
4
permaneceram
com essa alimentação até o fim do protocolo. Na 2ª semana os grupos EtOH,
EtOH+Azeite e EtOH+CCl
4
passaram a receber dieta alcoólica para se
adaptarem à presença do etanol. Na 3ª semana, etapa de indução da cirrose,
os grupos CTRL+Azeite e EtOH +Azeite iniciaram as injeções i.p. de 50µL de
azeite de oliva puro e os grupos CTRL+ CCl
4
e EtOH+CCl
4
iniciaram as
injeções i.p. de 0,05 mL/kg de CCl
4
a 20% diluído em azeite de oliva. As
injeções foram administradas três vezes por semana em dias alternados
durante 15 semanas.
Ao final da 15ª semana de experimento, todos os animais dos grupos
controles (NORMAL, CTRL, CTRL+Azeite,
EtOH, EtOH+Azeite) e alguns
animais dos grupos CTRL+CCl
4
e
EtOH+CCl
4
foram anestesiados com éter e
sacrificados por deslocamento cervical.
A partir desse momento iniciou-se a etapa de interrupção da indução
para avaliar as mudanças espontâneas morfológicas e funcionais ocorridas no
fígado dos animais. Para tal, a dieta alcoólica e as injeções i.p. foram
interrompidas nos animais remanescentes dos grupos CTRL+CCl
4
e
EtOH+CCl
4
que passaram a se alimentar de ração padrão e água. Ambos os
xlviii
grupos foram sacrificados com 8 semanas após a interrupção da indução
(Tabela 5).
Tabela 5 – Grupos da recuperação hepática espontânea
No presente estudo a pesagem foi importante para avaliar se a
substituição da ração pela dieta líquida acarretaria danos nutricionais aos
animais. Para tanto, os animais foram pesados antes do inicio da indução, 4
semanas de indução, 8 semanas de indução, 15 semanas de indução.
Com o objetivo de comparar o consumo da dieta-controle e da dieta-
alcoólica, mensuramos (mL) o consumo médio diário por caixa experimental,
cada uma contendo cinco animais. As aferições foram realizadas na 4
a
, 8
a
e
15
a
semana de indução.
A dose média de etanol ingerida pelos animais dos grupos EtOH,
EtOH+Azeite e EtOH+CCl
4
foi estimada com base na concentração de etanol
(5,5% m/v) na dieta-alcoólica e nos valores do consumo médio de dieta líquida
alcoólica, em relação ao peso médio dos animais de cada grupo experimental.
A média do consumo de etanol foi aferida na 4
a
, 8
a
e 15
a
semana de indução.
As análises histológicas foram realizadas antes do início da indução, na
4
a
, 8
a
e 15
a
semana de indução e na 8
a
semana após a interrupção da indução.
As análises bioquímicas foram realizadas antes do início da indução, na 15
a
CTRL+CCl
4
/8sR
Ração padrão e água por 8 semanas após a interrupção da
indução; n=4
EtOH+CCl
4
/8sR
Ração padrão e água por 8 semanas após interrupção da
indução; n = 6
xlix
semana de indução e na 8
a
semana após a interrupção da indução. O
protocolo experimental está ilustrado na figura 6.
Figura 6 - Protocolo experimental de indução de cirrose hepática
3.5. ANÁLISE HISTOLÓGICA
A histologia foi realizada em todos os grupos experimentais. A análise
nos períodos de 4 e 8 semanas de indução são oriundas de resultados de
trabalhos anteriores que geraram uma tese de mestrado intitulada “Modelo
Dieta controle + CCl
4
(CTRL+CCl
4
- n=9)
Dieta alcoólica + CCl
4
(EtOH + CCl
4
- n=11)
2 semanas de adaptação à
dieta líquida
15 semanas de indução
8 semanas de interrupção da
intoxicação com CCl
4
e etanol
Bioquímica
Sacrifício
4s 8s 15s
8s
2s
2s
2s
Injeções de azeite e/ou CCl
4
3x por
semana em dias alternados
Grupos controles
(n=25)
4s 8s 15s
4s 8s 15s
l
Experimental para Lesão Hepática Crônica Induzida por Tetracloreto de
Carbono e Álcool: avaliação de parâmetros para diagnóstico indireto de
cirrose”.
Retirada, lavagem, fixação e inclusão: As peças hepáticas foram
lavadas em salina tamponada 1X (PBS) para remoção do excesso de sangue.
Em seguida foram fatiadas e fixadas em solução Bouin por 4h e logo após em
solução de formaldeído 10% por 24h. Em seguida foram desidratadas em
quantidades graduais de etanol (70%, e 2 vezes em 100%), clarificados em
xilol por 2 vezes, e impregnados em parafina 2 vezes para a inclusão; cada
etapa durou 30 minutos. Corte: Os blocos incluídos em parafina foram
seccionados no micrótomo obtendo-se cortes de 5µm de espessura.
Colorações: As colorações realizadas foram de hematoxilina&eosina para
avaliação da arquitetura hepática e Picrosirius para avaliação do conteúdo de
colágeno.
3.5.1 - Coloração por Hematoxilina e Eosina
Para promover a desparafinização dos cortes, as lâminas foram
incubadas em estufa a 60ºC por 20 minutos. Em seguida, foram feitos três
banhos sucessivos de xilol PA por 3 minutos. Os cortes foram hidratados em
banhos de concentrações decrescentes de álcool (álcool 100%, 95%, e 90%)
por 3 minutos e, em seguida, foram lavados em água destilada por 3 minutos.
As lâminas foram incubadas em solução de Hematoxilina de Harris por 10
minutos e lavados em água corrente por 10 minutos. A diferenciação foi
realizada com solução de álcool clorídrico. Realizamos a lavagem das lâminas
li
em água corrente por 5 minutos e água destilada por 3 minutos. Em seguida,
as lâminas foram incubadas em solução de eosina por 10 minutos e, logo após,
foram lavadas rapidamente em água corrente. Os cortes foram então
desidratados em soluções crescentes de álcool (álcool 95%, 95%, 100% e
100%) por 3 minutos em cada solução. Fizemos a clarificação dos cortes em 3
banhos de xilol durante 5 minutos cada. As lâminas foram montadas com
Entellan e observadas em microscópio óptico Axioplan 100 (Zeiss) com
objetivas de 10X e 40X.
3.5.2 - Coloração por Picrosírius
As lâminas emblocadas em parafina foram colocadas na estufa a 60ºC
durante 20 minutos para facilitar a retirada da parafina. Os cortes histológicos
foram submetidos a três banhos de xilol PA por 5 minutos. O material foi
hidratado através de banhos de 5 minutos em soluções decrescentes de álcool
(100%, 95%, 90% e 70%) e depois lavados em água destilada por 10 minutos.
As lâminas foram incubadas em solução de ácido fosfomolíbdico 0,2% por 1
minuto e em seguida incubadas em solução de picrosírius por 90 minutos.
Após a incubação, as lâminas foram lavadas em ácido clorídrico 0,01N por 2
minutos e em álcool 70% durante 45 segundos. O material foi desidratado com
duas lavagens sucessivas de 5 minutos em álcool 95% e 100%. Os cortes
foram clarificados através de duas lavagens com xilol por 5 minutos. As
lâminas foram montadas com Entellan e observadas em microscópio óptico
Axioplan 100 (Zeiss) com objetivas de 10X e 40X.
lii
3.6. ANÁLISE MORFOMÉTRICA
A morfometria é uma técnica vastamente utilizada para quantificação do
grau de fibrose hepática em lâminas teciduais coradas com picrosirius. Foram
analisados por esse método o grupo NORMAL e os grupos intoxicados por
CCl
4
durante 15 semanas (CTRL+CCl
4
e EtOH+CCl
4
) e após 8 semanas de
interrupção da agressão (CTRL+CCl
4
/8sR e EtOH+CCl
4
/8sR).
Esta análise utiliza a coloração de picrosirius calculando a área de tecido
fibroso em secções hepáticas de 5µm, coradas em vermelho, como
porcentagem da área total. Dez campos foram fotografados randomicamente
num aumento de 100x e foram analisados no programa Image-Pro Plus 5.0
(MediaCybernetics, USA).
3.7. ENSAIO DE HIDROXIPROLINA
A análise de hidroxiprolina foi realizada em animais do grupo NORMAL e
intoxicados com CCl
4
e etanol durante 15 semanas (EtOH+CCl
4
) e após 8
semanas de interrupção da agressão (EtOH+CCl
4
/8sR).
É um método bioquímico que permite a análise direta do conteúdo de
fibrose através da quantificação desse aminoácido em tecido hepático total.
Para quantificá-lo, aproximadamente 2g de tecido hepático fresco (de
cada animal), foram desidratados em acetona por 48hrs. Depois, foram
colocados em estufa a 60
º
C por 24hrs, macerados, pesados e estocados a 4
º
C.
Cerca de 10 mg foram então hidrolisados com HCl 6M por 18 horas, à 107C. O
ácido foi removido por evaporação e o material hidrolisado foi ressuspendido
em 200µL de tampão de reação (5% de ácido cítrico monoidratado, 1,2% de
liii
ácido acético, 12% de acetato de sódio 3H
2
O, 3,4% de hidróxido de sódio, pH
6.0), diluído 1:10, no momento do uso. A solução foi então incubada com 1mL
de solução cloramina-T (60mM in 50% n-propanol, pH 6.0) por 20 minutos, à
temperatura ambiente. Ao produto da reação foi adicionado 1mL da solução
aldeído/ácido perclórico (1M 4-(Dimethylamino)-benzaldehyde in 16% ácido
perclórico and 60% n-propanol), permanecendo por 20 minutos à 60
o
C. A
densidade óptica foi lida a λ=595nm usando um espectrofotômetro (GE
Healthcare do Brasil, Brasil). A concentração foi determinada pela equação
linear tendo como base uma curva de calibração padrão de 4-hidroxiprolina
(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA).
3.8. IMUNOFLUORESCÊNCIA INDIRETA
Foram realizados ensaios de imunofluorescência dos grupos NORMAL e
que associaram CCl
4
e etanol intoxicados durante 15 semanas (EtOH+CCl
4
) e
após 8 semanas de interrupção da agressão (EtOH+CCl
4
/8sR).
A detecção foi realizada para qualificar o padrão de distribuição dos
isotipos de colágenos I e III, componentes mais elevados durante a fase de
lesão hepática, e o isopeptideo
ε
(
γ
-glutamil) lysine, produto da tTG2, uma
enzima que atua na reação cruzada (cross-linking) de fibras colágenas. A
detecção do cross-linking de fibras de colágeno depositadas na matriz
caracteriza uma resistência maior à degradação por colagenases teciduais.
Para tanto, peças hepáticas foram embebidas em um criopreservador
(TISSUE-TEK OCT) e congeladas a - 70°C. Cortes de 6µm foram realizadas no
criostato a -20ºC e em seguida fixados em acetona. Os anticorpos primários
foram: transglutaminase tecidual (tTG2 - Stratech Scientific) - 1:40 e colágenos
liv
tipo I e III (CHEMICON International, Temecula, CA) - 1:30. Os anticorpos
secundários foram: FITC goat anti-mouse IgG (H+L) conjugate (ZYMED) 1:50
for tTG2 e FITC goat anti-rabbit IgG (H+L) conjugate (ZYMED) 1:50 para
colágenos tipo I e III (ISSA e cols., 2004; GRENARD e cols., 2001).
Após a revelação do cross-linking de colágeno mediado por tTG2,
realizamos a quantificação dessa enzima pela análise morfométrica, calculando
a área marcada com FITC. Dez campos de cada lâmina foram fotografados e
analisados usando o programa Image-Pro Plus 5.0 (MediaCybernetics, USA).
3.9. ANÁLISE BIOQUÍMICA
A avaliação dos parâmetros bioquímicos foi realizada nos grupos
NORMAL, EtOH+CCl
4
e EtOH+CCl
4
/8sR. Os animais foram anestesiados e 1
mL de sangue foi retirado da veia caudal. As amostras foram centrifugadas a
3584 x g por 10 minutos. O soro foi separado da fração celular e congelado a
−70°C. As amostras foram analisadas pelo Analyst Vet 16 (Hemagen),
aparelho de uso veterinário que contém um sistema de padronização
bioquímico interno. Em nosso estudo foram analisados marcadores séricos de
lesão hepática - alanina aminotransferase (ALT) e aspartato aminotransferase
(AST) - e marcadores séricos de função hepática - bilirrubina total (BilT) e
albumina (ALB).
3.10. ANÁLISE ESTATÍSTICA
lv
Todas as variáveis analisadas eram numéricas. A comparação entre os
grupos foi realizada usando ANOVA com o teste de Tukey`s para múltiplas
comparações e teste “t” de student quando comparamos dois grupos. P<0,05
foi considerado estatisticamente significativo. Os dados foram apresentados
como média ± DP.
A análise de regressão foi realizada para avaliar a diferença no grau de
reversibilidade espontânea entre os dois modelos de indução com CCl
4
.
lvi
4 – RESULTADOS
4.1 Peso dos animais
Os resultados demonstraram que não houve diferença significativa entre
os pesos médios dos grupos CTRL, CTRL+Azeite, CTRL+CCl
4
, EtOH,
EtOH+Azeite e EtOH+CCl
4
nas semanas 0 (Figura 7A) e 4 (Figura 7B) quando
comparados ao grupo NORMAL. É importante notar que em ambos os
períodos, os grupos que receberam dieta líquida apresentaram valores de peso
médio relativamente próximos, na faixa dos 180 a 190g. (Tabela 6).
Tabela 6 – Peso dos animais
semanas de experimento Grupos
0 4 8 15
NORMAL
192,2
±4,3 (n= 7) 194,4
±8,6 (n= 5) 199,5
±3,3 (n= 5) 200,4
±3,5 (n= 5)
CTRL
182,3
±11,8 (n= 4) 184,8
±9,3 (n= 4) 190,1
±10,6 (n= 4) 194,8
±8,2 (n= 4)
CTRL+ Azeite
184,5
±2,1 (n= 4) 185,1
±5,8 (n= 4) 193,6
±9,3 (n= 4) 196,2
±2,3 (n= 4)
CTRL+ CCl
4
187,4
±6,5 (n= 5) 186,3
±3,0 (n= 5) 175,4
±7,0
a
(n= 5) 166,6
±2,7
a
(n= 4)
EtOH
187,5
±8,3 (n= 5) 188,6
±7,6 (n= 5) 185,1
±5,3 (n= 5) 185,5
±10,8 (n= 5)
EtOH+Azeite
188,1
±9,9 (n= 5) 185,9
±4,5 (n= 5) 185,5
±12,4 (n= 5) 183,2
±8,9 (n= 5)
EtOH +CCl
4
190,7
±5,8 (n=49) 189,6
±6,8 (n=42) 162,8
±13,5
b
(n=29) 154,4
±23,8
b
(n=17)
Valores expressos como média ± desvio padrão em gramas (g)
Após 8 semanas (Tabela 6 e Figura 7C) observamos que os grupos
CTRL, CTRL+Azeite, EtOH e EtOH+Azeite continuaram sem alteração do
peso. Porém, o grupo CTRL+CCl
4
apresentou queda significativa de peso
a
p<0,05 vs grupo NORMAL
b
p<0,001 vs grupo NORMAL
lvii
médio (p<0,05) em relação ao grupo NORMAL. Já o grupo EtOH+CCl
4
apresentou queda significativa dos pesos médios em relação aos grupos
NORMAL e CTRL+Azeite (p<0,001), CTRL, EtOH e EtOH+Azeite (p<0,01).
Não foi observada diferença significativa entre o peso médio dos grupos
CTRL+CCl
4
e EtOH+CCl
4
indicando que somente a adição de CCl
4
foi
responsável pela perda de peso.
Após 15 semanas de experimento (Tabela 6 e Figura 7D), os grupos
CTRL, CTRL+Azeite, EtOH e EtOH+Azeite ainda se mantiveram sem variação
nos pesos médios. E novamente observamos uma queda significativa dos
pesos médios dos grupos CTRL+CCl
4
e EtOH+CCl
4
. O grupo CTRL+CCl
4
apresentou queda significativa (p<0,05) de peso médio em relação ao grupo
NORMAL. O grupo EtOH+CCl
4
apresentou queda significativa dos pesos
médios em relação aos grupos NORMAL, CTRL e CTRL+Azeite (p<0,001),
EtOH (p<0,01) e EtOH+Azeite (p<0,05).
Esses dados demonstraram, que dentre os períodos analisados, só foi
possível observar os efeitos da toxicidade do CCl
4
sobre o peso médio dos
animais após 8 semanas de intoxicação.
lviii
Figura 7 – Pesos médios dos animais por grupo experimental nos
períodos de 0 semana (A), 4 semanas (B), 8 semanas (C) e 15 semanas (D)
de protocolo experimental. Em (A) e (B), não houve diferença significativa
nos pesos médios dos animais em todos os grupos analisados. Em (C) e
(D), houve uma queda significativa do peso médio nos grupos CTRL+CCl
4
e EtOH+CCl
4
. Os grupos CTRL, CTRL+Azeite, EtOH e EtOH+Azeite
mantiveram seus pesos médios sem alterações ao longo do experimento.
Peso médio (0 semanas)
NORMAL
CTRL
CT
RL
+A
ze
ite
4
C
TR
L
+CCl
Et
OH
E
tOH
+
Aze
ite
4
Et
O
H+CCl
100
120
140
160
180
200
220
Grupos
A
gramas
Peso médio (4 semanas)
NO
R
MAL
C
TRL
CT
RL
+A
zei
te
4
CTRL+CCl
EtO
H
Et
OH
+Az
eit
e
4
E
t
OH+CCl
100
120
140
160
180
200
220
Grupos
B
gramas
Peso médio (8 semanas)
N
O
RMA
L
C
T
RL
C
TR
L+A
z
eit
e
4
CTRL+CCl
E
tOH
E
tO
H+A
ze
ite
4
E
tOH
+
CCl
100
120
140
160
180
200
220
#
**/***
Grupos
C
gramas
Peso médio (15 semanas)
NORMAL
CTRL
C
TRL+Aze
i
te
4
CT
R
L
+
CC
L
EtO
H
E
tOH+Azeite
4
E
tOH+CC
l
100
120
140
160
180
200
220
#
*/**/***
Grupos
D
gramas
# p<0,05 vs grupo NORMAL
** p<0,01 vs grupo CTRL, grupo EtOH e grupo
EtOH+Azeite
*** p<0,001 vs grupo NORMAL e grupo CTRL+Azeite
#
p<0,05 vs grupo NORMAL
* p<0,05 vs grupo EtOH
** p<0,01 vs grupo EtOH+Azeite
*** p<0,001 vs grupo NORMAL, grupo CTRL, e grupo
CTRL+Azeite
lix
4.2 – Consumo de dieta líquida e ingestão de etanol
Os resultados demonstraram que a diferença entre o consumo médio
diário das dietas líquidas foi menor (p<0,01) nos grupos que receberam dieta -
alcoólica (62,1±25,9; grupos EtOH, EtOH+Azeite, e EtOH+CCl
4
) que nos
grupos que receberam dieta-controle (82,9±26,9; grupos CTRL, CTRL+Azeite e
CTRL+CCl
4
), no decorrer das 15 semanas de experimento (Figura 8).
Figura 8 – Consumo médio de dieta líquida ao final de 15 semanas de
experimento. O consumo médio de dieta líquida alcoólica foi
significativamente menor (p<0,01) que o consumo médio de dieta líquida
controle.
Ao analisarmos o consumo médio de dieta líquida por grupo (Tabela 7),
verificamos que o consumo médio das dietas líquidas foi semelhante entre os
grupos CTRL (67,4±21,2mL), CTRL+Azeite (68,7±17,4mL) e CTRL+CCl
4
(67,8±22,9mL) após 4 semanas de experimento. Após 8 semanas, o grupo
CTRL (97,8±33,9mL), grupo CTRL+Azeite (101,6±32,3mL) e grupo CTRL+CCl
4
(103,3±31,1mL) apresentaram aumento significativo de consumo médio
(p<0,001) em relação ao período anterior. Após 15 semanas, o consumo médio
dos grupos CTRL (80,7±23,4mL), CTRL+Azeite (81,7±15,5mL) e CTRL+CCl
4
(84,1±15,7mL) apresentou uma queda significativa (p<0,05) em relação ao
Consumo médio
Controle Alcoólica
0
20
40
60
80
100
120
*
*
p<0,01
Dieta Líquida
mL
n=17
n=23
lx
período de 8 semanas. Esses resultados sugerem que a suplementação de
etanol na dieta pode ter contribuído significativamente para a diminuição do
consumo da dieta liquida.
Tabela 7 – Consumo médio de dieta líquida por grupo experimental ao
longo de 15 semanas de experimento.
A tabela abaixo (tabela 8) demonstra os resultados obtidos do consumo
de etanol. Observamos que a dose média de etanol ingerida pelos animais dos
grupos EtOH, EtOH+Azeite e EtOH+CCl
4
se manteve entre 16,4±7,4g/Kg/dia e
22,2±7,8g/Kg/dia, sem apresentar diferenças significativas entre os grupos e
entre os períodos analisados.
Tabela 8 – Dose média de etanol por grupo ao longo das 15 semanas de
experimento.
semanas de experimento Grupos
4 8 15
semanas de experimento Grupos
4 8 15
CTRL
67,4±21,2 97,8±33,9
a
80,7±23,4
b
CTRL+Azeite
68,7±17,4 101,6±32,3
a
81,7±15,5
b
CTRL+CCl
4
67,8±22,9 103,3±31,1
a
84,1±15,7
b
EtOH
67,8±30,1 64,6±28,3
55,3±17,9
EtOH+Azeite
62,8±26,5 58,8±27,9
62,4±24,2
EtOH+CCl
4
60,5±24,2 65,8±23,2
52,6±25,8
valores expressos como média ± desvio padrão em mililitros (mL)
a p<0,001 vs 4 semanas
b p<0,05 vs 8 semanas
Excluído:
<sp>
lxi
EtOH
19,8
±8,6
18,8
±10,3 16,4
±7,4
EtOH+Azeite
18,6
±7,6
17,4
±8,0 18,7
±7,1
EtOH+CCl
4
17,6
±7,0
22,2
±7,8
18,7
±9,2
valores expressos como média ± desvio padrão
em gramas por quilograma ao dia (g/kg/dia)
4.3 – Análise Histológica
Os animais do grupo NORMAL (n=5) sacrificados no final da 15ª semana
de experimento apresentaram na macroscopia uma superfície lisa, cor marrom
avermelhada, ausência de septos e consistência friável, características também
observadas em fígados de ratos saudáveis sacrificados antes do início do
experimento (Figura 9A). Na microscopia, observamos placas hepatocitárias
arranjadas radialmente em relação a veia centrolobular e aos sinusóides.
(Figura 9B). A coloração de picrosirius somente aparece ao redor dos espaços
porta e de veias centrolobulares (Figura 9C). Os fígados dos ratos dos grupos
CTRL (n=4), CTRL+Azeite (n=4), EtOH (n=5) e EtOH+Azeite (n=5),
sacrificados no mesmo período, apresentaram os mesmos padrões
morfológicos do grupo NORMAL.
Os fígados dos ratos sacrificados do grupo CTRL+CCl
4
e EtOH+CCl
4
após 4 semanas de indução de cirrose apresentaram na macroscopia
alterações na superfície hepática que se tornou irregular e friável. Notamos
também um aspecto adiposo e coloração leitosa, características relacionadas
ao padrão de esteatose hepática em humanos (Figura 9D). Na microscopia
observamos a desorganização das placas hepáticas devido à tumefação de
hepatócitos e acúmulo de vacúolos lipídicos (esteatose) (Figura 9E). Os
espaços porta se tornaram alargados formando septos fibrosos finos e
lxii
incompletos alguns deles iniciando a formação de pontes entre espaços porta
(Figura 9F).
Ao final da 8ª semana, macroscopicamente a superfície hepática se
tornou mais irregular com a presença de alguns nódulos. Apresentaram
consistência mais rugosa e coloração rósea (Figura 9G). Observamos
microscopicamente que a desestruturação do parênquima hepático se tornou
mais evidente apresentando esteatose nos hepatócitos. Nos espaços porta,
notamos a presença de proliferação de ductos biliares e infiltrados inflamatório
(Figura 9H). Há formação de septos fibrosos com espessura fina e delimitados
por nódulos de regeneração, a principal característica da cirrose (Figura 9I).
Já com 15 semanas de intoxicação, os fígados apresentaram uma clara
evidência de cirrose hepática macronodular. O tamanho do órgão foi reduzido
(atrofia) e a superfície se tornou irregular com múltiplos nódulos. Apresentaram
também consistência rígida e coloração avermelhada, características padrões
da cirrose hepática em humanos (Figura 9J). A análise histológica também
comprovou a indução da cirrose, caracterizada pela perda total da arquitetura
do parênquima, redução do acúmulo de lipídeos, infiltrado inflamatório
moderado de proliferação de ductos biliares (Figura 9K). Observamos também
a presença de nódulos de regeneração formados por septos fibróticos
espessos e uma intensa deposição de colágeno na região peri-portal (Figura
9L).
Esses dados revelam que a intoxicação com o CCl
4
e etanol e com CCl
4
isoladamente induziu cirrose hepática com características comparáveis a lesão
em humanos.
lxiii
Figura
9
: Macro e microscopia dos animais experimentais
. A
-
C:
A
-
Macroscopia do fígado
normal demonstrando superfície lisa e coloração marrom-avermelhada. B -
Microscopia do
fígado normal (H&E 200x) mostrando um parênq
uima homogêneo, com hepatócitos arranjados
radialmente ao redor dos sinusóides (setas). C -
Coloração de Picrosirius mostrando colágeno
em vermelho. A deposição ocorre somente nos vasos (tríade portal – seta; veia central –
cabeças de seta, 40x). Após 4 semanas de indução: D -
Macroscopia apresentando superfície
hepática rugosa e coloração pálida, características típicas de esteatose. E -
Microscopia
mostrando múltiplas vesículas lipídicas confirmando a presença de esteatose (setas; H&E 200x).
F - Em vermel
ho é possível visualizar o início da formação do septo fibroso (Picrosirius 100x,
setas). Após 8 semanas de indução: G-
Fígado com superfície irregular apresentando alguns
nódulos de regeneração (setas). H - Microscopia mostrando a desorganização do parênq
uima,
esteatose (setas pretas) e proliferação de ducto biliar (setas vermelhas) (H&E 200x). I -
A
deposição de colágeno (em vermelho) é mais intensa e os septos são finos estão começando a
formar nódulos de regeneração (Picrosirius 100x). Após 15 semanas de indução: J -
Macroscopia mostrando cirrose hepática: superfície irregular e múltiplos nódulos (setas). K -
Microscopia demonstrando a modificação da estrutura hepática normal, com infiltrado
inflamatório (cabeças de seta) e necrose tecidual (seta; H&E 200x). L -
Coloração de Picrosirius
mostrando deposição de colágeno em septos espessos, formando nódulos de regeneração
completos. (100x).
A
B
C
D
E
F
G
H
I
K
L
J
NORMAL
4 semanas de indução
8 semanas de indução
15 semanas de indução
lxiv
Animais de ambos os grupos CTRL+CCl
4
/8sR e EtOH+CCl
4
/8sR
apresentaram o mesmo padrão histopatológico daquele encontrado após 15
semanas de indução, indicando a permanência da cirrose (Figura 10).
Figura 10: Microscopia dos grupos in
toxicados com CCl
4
isolado ou
associado ao etanol.
Microscopia dos animais intoxicados somente com CCl
4
(A) ou associado ao etanol (C
) apresentando nódulos completos e septos
espessos na 15
a
semana de indução que se mantiveram após 8 semanas de
interrupção da agressão tanto no grupo intoxicado com CCl
4
isolado (B
) ou
associado com ambos agentes (D). Picrosirius 100x.
A
B
C
D
lxv
4.4 - Análise morfométrica
Os dados de morfometria mostraram que houve aumento do conteúdo
de colágeno hepático em todos os animais analisados: CTRL+CCl
4
(9,83±3,85), CTRL+CCl
4
/8sR (6,99±0,88), EtOH+CCl
4
(12,68±2,64) e
EtOH+CCl
4
/8sR (10,38±1,36) quando comparados ao grupo NORMAL
(2,25±1,21). Embora a comparação da morfometria entre os grupos de animais
com 15 semanas de agressão (CTRL+CCl
4
vs
EtOH+CCl
4
) não tenha mostrado
diferença, observou-se, na 8ª semana após a interrupção da indução, maior
quantidade de fibrose no grupo que associou CCl4 e etanol em relação ao
grupo que foi induzido com CCl
4
puro, (CTRL+CCl
4
/8sR vs EtOH+CCl
4
/8sR, p<
0,001). Contudo, não se observou diferença na variação do grau de fibrose
entre a 15ª semana de indução e a 8
a
semana após a interrupção da agressão
(Figura 11) entre os dois protocolos de indução.
Portanto seguimos nosso estudo focando no grupo que administrou
simultaneamente CCl
4
e etanol. Os dados da análise morfométrica dos grupos
experimentais estão disponíveis na tabela 9.
Tabela 9 – Valores da análise de morfometria dos grupos
intoxicados com CCl4 e associado ao etanol
GRUPOS NORMAL CTRL+CCl4 CTRL+CCl4/8sR
EtOH+CCl4 EtOH+CCl4/8sR
VALORES
(%)
1,60
4,80
1,00
1,90
2,40
2,28
13,90
5,50
12,58
11,19
6,00
6,97
7,67
7,78
5,57
13,16
14,34
14,59
8,07
13,04
8,10
10,30
10,00
11,40
12,10
10,40
lxvi
4.5 – Ensaio de Hidroxiprolina
Os resultados dessa análise demonstraram que houve um aumento da
concentração de hidroxiprolina nos grupos EtOH+CCl
4
(1,9±0,035) e
EtOH+CCl
4
/8sR (1,6±0,18) quando comparados ao grupo NORMAL (1,2±0,17).
Esses dados demonstram que o conteúdo de fibrose se manteve aumentado
no final da indução e após a retirada dos agentes tóxicos. Nenhuma diferença
foi encontrada entre esses grupos (Figura 12). Os valores do ensaio de
hidroxiprolina estão disponíveis na tabela 10.
Figura 11: Análise morfométrica:
A indução crônica por 15 semanas com CCl
4
puro
ou assoc
iado ao etanol levou a um aumento na quantidade de fibrose quando
comparado aos animais normais. O conteúdo de fibrose foi mantido por 8 semanas
após a interrupção da intoxicação por CCl
4
puro ou associado ao etanol. Entretanto no
grupo que associou ambos
hepatotóxicos observamos uma quantidade maior de
colágeno quando comparado ao grupo que administrou CCl
4
puro.
N
O
R
MA
L
4
C
T
R
L
+CCl
/8sR
4
CTRL+CCl
4
EtO
H
+C
Cl
/
8
s
R
4
EtOH+C
C
l
0
5
10
15
% fibrose vs área nos grupos com 15 semanas de indução e com
8 semanas de reversão espontânea
Grupos
***a= p<0,001 em relação ao demais grupos;
***b= p<0,001 em relação ao grupo CTRL+CCl
4
/8sR
***a
***b
NORMAL (n=7)
CTRL+CCl
4
(n=5)
CTRL+CCl
4
/8sR (n=4)
EtOH+CCl
4
(n-5)
EtOH+CCl
4
8sR (n=6)
lxvii
Tabela 10 – Valores do ensaio de hidroxiprolina dos grupos intoxicados
com etanol e CCl
4
GRUPOS NORMAL EtOH+CCl
4
EtOH+CCl
4
/8sR
VALORES (%) 1,389
1,412
1,171
0,999
1,051
1,213
2,197
1,399
1,688
2,088
2,160
1,722
1,878
1,416
1,519
1,687
1,467
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
***a
*b
Hidroxiprolina
***a p<0,001 e *b p<0,05 quando comparado
ao grupo normal
HO-Pro(µg)/Peso seco (mg)
NORMAL (n=6)
EtOH+CCl
4
(n=5)
EtOH+CCl
4
/8sR (n=6)
Figura 12:
Ensaio de hidroxiprolina
. A indução crônica por 15 semanas
com CCl
4
e etanol levou ao aumento do conte
údo de fibrose em tecido
hepático total pela análise bioquímica. Após 8 semanas de interrupção da
intoxicação os valores se mantiveram aumentados.
lxviii
4.6 – Imunofluorescência Indireta
No grupo NORMAL, ambos os colágenos foram detectados nos
espaços-porta e como finas fibrilas no lóbulo hepático (Figura 13A e 13B) Nos
grupos ETOH+CCl
4
(Figuras 13C e 13D), ETOH+CCl
4
/8sR (Figuras 13E e 13F)
foi observada uma forte reatividade para ambos isotipos nos septos fibróticos,
indicando o acúmulo dessas proteínas durante a fase de intoxicação e de
interrupção do etanol e CCl
4
.
Na figura 14A observamos o fígado normal com deposição de
ε
(
γ
-
glutamil) lysine somente nas regiões perivasculares. No grupo EtOH+CCl
4
(15
semanas de indução) observamos intensa deposição
ε
(
γ
-glutamil) lysine,
indicando forte ligação de fibras colágenas nos septos fibrosos (Figura 14B).
No grupo ETOH+CCl
4
/8sR este padrão permaneceu, demonstrando que a
deposição de colágeno se manteve 8 semanas após a retirada do etanol e CCl
4
(Figura 14C).
A fim de confirmar os achados imunohistológicos de reação cruzada do
colágeno realizamos a quantificação da tTG2 através da técnica morfométrica.
O resultado demonstrou um aumento do cross-linking de colágeno no grupo
EtOH+CCl
4
(66,43±8,00) quando comparado ao grupo NORMAL (7,90±0,83).
Além disso, também observamos um aumento no grupo ETOH+CCl
4
/8sR
(56,82±21,10) quando comparado ao grupo NORMAL, revelando que após a
interrupção da intoxicação as fibras colágenas resistiram a degradação. Não
obseravmos diferença entre os grupos EtOH+CCl
4
e ETOH+CCl
4
/8sR (Figura
14D). Os valores na quantificação morfométrica da tTG2 estão disponíveis na
tabela 11.
lxix
Figura 1
3
:
Imunofluorescência
.
A
,
C
e
E
: Colágeno tipo I;
B
,
D
e
F
: Colágeno tipo
III. A - B: Detecção de colágeno no parênquima hepático de rato normal. C - D
:
Grupo intoxicado com etanol e CCl
4
por 15 semanas (EtOH+CCl
4
). E - F
: Grupo
intoxicado com etanol e CCl
4
por 15 semanas e interrupção da indução por 8
semanas (EtOH+CCl
4
/8wR). Ambos os grupos intoxicados apresentaram deposição
de colágenos tipo I e III formando nódulos hepáticos. Aumento de 100x.
Colágeno tipo I Colágeno tipo III
NORMAL EtOH + CCl
4
EtOH + CCl
4
/8sR
E
F
C
D
A
B
lxx
A
B
C
NORMAL
EtOH + CCl
4
EtOH + CCl
4
/8sR
Transglutaminase tecidual (tTG)
0
10
20
30
40
50
60
70
80
** P<0,01 compared to grupo NORMAL
**
**
Transglutaminase tecidual (tTG)
D
NORMAL (n=3)
EtOH+CCl
4
(n=4)
EtOH+CCl
4
/8sR(n=5)
%tTG vs área
Figura 14
:
Qualificação (A
-
C) e quantificação (D) de
tTG2
.
Imunoensaio mostrando
cross-linking de colágeno. A – Cross-linking
de colágeno somente ao redor de vasos
no grupo NORMAL. B – Septos formando nódu
los completos apresentando aumento
do cross-linking no grupo com 15 semanas de indução. C –
Nódulo hepático
mostrando ainda o aumento de crosslinking no grupo analisado após 8 semanas de
interrupção da indução, indicando que o colágeno não foi degradado. D
: A análise
morfométrica mostrou que houve aumento de cross-linking
de colágeno em ambos os
grupos intoxicados com CCl
4
e etanol quando comparado ao grupo NORMAL.
lxxi
Tabela 11 – Valores da quantificação de tTG pela morfometria dos grupos
intoxicados com CCl
4
e etanol.
GRUPOS NORMAL EtOH+CCl
4
EtOH+CCl
4
/8sR
VALORES (%)
7,54
8,86
7,32
61,87
57,93
75,60
70,30
56,32
27,09
86,75
56,31
57,62
4.7 – Análise bioquímica
No grupo EtOH+CCl
4
(15 semanas de indução) os valores de ALT
(Figura 15A) e AST (Figura 15B) se elevaram. Além disso, observamos
redução de albumina (Figura 15C) e aumento de bilirrubina (Figura 15D). Esses
dados indicam alterações funcionais características de cirrose hepática. No
entanto, após 8 semanas de interrupção dos agentes hepatotóxicos, todos os
parâmetros voltaram aos níveis basais. O nível de bilirrubina não foi
representado no grupo ETOH+CCl
4
/8sR devido ao fato que os valores
detectados estavam abaixo da sensibilidade do método. Os valores
bioquímicos estão disponíveis nas tabelas a seguir:
lxxii
Tabela 12 – Valores dos parâmetros bioquímicos de ALT (A), AST
(B), ALB (C) e BilT (D).
GRUPOS
NORMAL
EtOH+CCl
4
EtOH+CCl
4
/8sR
VALORES
ALT (U/L)
8
14
13
10
15
63
43
39
237
128
19
21
54
48
24
69
GRUPOS
NORMAL EtOH+CCl
4
EtOH+CCl
4
/8sR
VALORES
AST (U/L)
38
63
70
74
66
794
231
935
614
338
124
95
153
183
100
201
GRUPOS
NORMAL
EtOH+CCl
4
EtOH+CCl
4
/8sR
VALORES
ALB
(g/dL)
4,3
4,7
4,3
4,1
4,2
3,0
3,0
3,2
3,2
2,4
4,3
4,8
4,3
3,5
4,2
4,9
GRUPOS
NORMAL EtOH+CCl
4
VALORES
BilT
(mg/dL)
0,0
0,0
0,0
0,0
0,1
0,5
0,1
0,1
0,1
0,1
0,0
C
A
D
B
lxxiii
0
50
100
150
200
P<0.05 comparado ao grupo NORMAL
*
*
Alanina Aminotransferase (ALT)
A
U/L
Aspartato Aminotransferase (AST)
0
250
500
750
1000
***
*** P<0.001 comparado ao grupo NORMAL
**
** P<0.01 comparado ao grupo ETOH+CCl
4
B
NORMAL (n=5)
EtOH+CCl
4
(n=5)
EtOH+CCl
4
/8sR (n=6)
U/L
ALB
0
1
2
3
4
5
6
***a P<0.001 comparado ao grupo NORMAL
***a
***b
***b P<0.001 comparado ao grupo ETOH+CCl
4
C
g/dL
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
*
BilT
* P<0.05
D
#
mg/dl
Figura 15
. Análise
bioquímica.
O grupo EtOH+CCl
4
(15 semanas de indução)
apresentou aumento nos valores de AST (A), ALT (B) e BilT (D
) e diminuição nos
níveis de ALB (C
) quando comparado ao grupo NORMAL. Porém no grupo
EtOH+CCl
4
/8sR (8 semanas após a interrupção de etanol e CCl
4
) todos os
parâmetros retornaram aos valores normais.
lxxiv
DISCUSSÃO
Não há descrição na literatura de modelos animais que reproduzam a
principal característica clínica da cirrose hepática encontrada em humanos: a
irreversibilidade histológica da lesão. Esse fator no levou ao desenvolvimento
de um modelo experimental adequado que investigasse o potencial de
reversibilidade do fígado após a suspensão da indução crônica.
É bem descrita na literatura a capacidade do CCl
4
de produzir cirrose
hepática, porém este modelo de cirrose é criticado devido a variabilidade nas
características histopatológicas e relatos de regeneração hepática espontânea
após a sua suspensão (TAMAYO, 1983). McLEAN e cols (1969) propuseram a
associação do CCl
4
com fenobarbital buscando a potencialização da toxicidade
do primeiro pela ativação da via microssomal da citocromo P450. HASHIMOTO
e cols (1999) demonstraram que a cirrose induzida pela associação de CCl
4
e
fenobarbital por 10 semanas reverteu após a retirada das toxinas.
Buscando solucionar essas questões, nosso grupo decidiu associar
etanol e CCl
4
, visto que o primeiro é um potente inibidor da proliferação de
hepatócitos (WU e cols., 2000), capaz de exacerbar a hepatotoxicidade do CCl
4
ativando a via microssomal da citocromo P450 (HALL e cols., 1991).
Nosso modelo de indução de lesão hepática crônica em ratos revelou
que a administração i.p. de CCl
4
associada à ingestão de etanol em dieta
líquida desenvolveu cirrose hepática com características histopatológicas
semelhante àquelas da doença humana, as quais se mantiveram mesmo após
a retirada das toxinas. O modelo escolhido se baseou no trabalho de HALL e
cols (1991) que desenvolveram fibrose e cirrose hepática através da inalação
lxxv
de baixas doses de vapor de CCl
4
associada à ingestão de dieta líquida
alcoólica.
A administração i.p. de CCl
4
foi utilizada por ser um método
relativamente simples e de risco controlável comparado à via inalatória, já que
o vapor de CCl
4
requer maiores cuidados com a biossegurança. A dose de
CCl
4
administrada foi então calculada baseada nas concentrações do modelo
descrito por HALL e cols. (1991) que demonstrou que animais tratados
somente com uma dose média diária de vapor de CCl
4
de 480ppm/h
apresentaram alterações histopatológicas como esteatose, necrose
hepatocelular e apoptose, porém sem desenvolver fibrose. SANZGIRI e cols.
(1997) demonstraram que a exposição dos animais a 1000ppm de CCl
4
por 2
horas equivale a uma absorção total de 179mg ou 1,1mL de CCl
4
/kg de peso
corporal. Neste mesmo estudo, também demonstraram que a concentração
máxima de CCl
4
é 3 vezes maior no fígado após a administração oral em bolus
quando comparada à inalação, ou seja, uma quantidade maior de CCl
4
é
absorvida pelo sistema gastrointestinal, permitindo maior ação do CCl
4
e
resultando em uma lesão hepática maior.
Em nossos ensaios preliminares, utilizamos a dose de 1,0mL de CCl
4
/kg
de peso corporal associada à ingestão de etanol, e observamos a mortalidade
de aproximadamente 80% dos animais. Sendo assim, decidimos reduzir a dose
administrada, baseados também nos achados de RAO e cols. (1997), que
demonstraram que a administração de dose única de 0,1mL/kg resultou em
mínimas alterações no tecido hepático.
lxxvi
No entanto, utilizamos uma dose 20 a 40 vezes menor (0,05mL/kg) que
as descritas em modelos de fibrose hepática (IREDALE e cols., 1998; ZHOU e
cols., 2004) e atingimos o grau de cirrose em 15 semanas em todos os animas
dos grupos CTRL+CCl
4
e EtOH+CCl
4
, com 100% de sobrevivência.
A ingestão do etanol em dieta líquida é uma técnica descrita há décadas
por LIEBER-DeCARLI (citado em HALL, 2001), criada pela necessidade de
desenvolver um modelo animal adequado de doença hepática alcoólica, em
que o consumo de etanol fosse mais eficiente que a administração em água,
garantindo as necessidades nutricionais aos animais. Em nosso estudo,
substituímos alguns dos ingredientes da fórmula estabelecida por LIEBER &
DeCARLI (1989) por componentes equivalentes (ex. caseína por albumina).
HALL e cols. (1991) demonstraram que o consumo de dieta líquida
controle permite o crescimento normal dos animais enquanto a dieta líquida
alcoólica reduz o ganho de peso dos animais. Em nossos achados observamos
que os grupos EtOH e EtOH+Azeite mantiveram seus pesos, sem apresentar
alterações nutricionais. A redução do peso foi somente observada nos grupos
CTRL+CCl
4
e EtOH+CCl
4
a partir da oitava semana de experimento. Esse dado
demonstra que a dieta líquida mesmo modificada permitiu a substituição da
ração sem danos nutricionais, ocasionando alteração no peso somente em
animais intoxicados com CCl
4.
Para que a administração de etanol fosse suficiente para potencializar o
efeito do CCl
4
e induzir lesão hepática crônica foi necessário garantir que a
ingestão diária de etanol fosse acima de 8g/kg de peso corporal por dia
(PLUMMER e cols., 1994). Em nosso estudo, embora o consumo de dieta
líquida alcoólica (62,1±25,9) tenha sido menor que o consumo de dieta líquida
lxxvii
controle (82,9±26,9) (Figura 8), a ingestão média diária de etanol foi acima dos
valores estabelecidos por LIEBER & DeCARLI (1989), HALL e cols., (1991) e
PLUMMER e cols., (1994) em todos os grupos, indicando que a ingestão diária
de etanol de nossos animais foi adequada. (Tabela 7).
A análise histológica é o critério diagnóstico padrão da confirmação de
cirrose hepática. Nossos resultados demonstraram que após 15 semanas de
indução, os grupos CTRL+CCl
4
e EtOH+CCl
4
apresentaram características
morfológicas comparáveis na análise histopatológica corada com Picrosirius
(Figuras 10A e 10C). Após 8 semanas de interrupção da indução todos os
animais se mantiveram com o padrão histológico de cirrose. Tal achado
poderia nos fazer concluir que não há qualquer benefício na associação de
etanol ao CCl
4.
Contudo a análise detalhada do grau de fibrose proporcionada pela
morfometria nos forneceu dados que parecem necessitar de interpretação mais
criteriosa. Se, por um lado, não se mostrou diferenças entre os grupos na
morfometria com 15 semanas (ANOVA p>0,05) e na variação do grau de
fibrose após interrupção da indução (análise por regressão), por outro lado, foi
identificada diferença na 8ª semana após interrupção da agressão, com os
animais que receberam etanol (EtOH+CCl
4
/8sR) apresentando maior conteúdo
de fibrose (Figura 11). Este dado sugere haver uma maior consistência da
fibrose no grupo que associou ambas as hepatotoxinas.
Podemos argumentar que a incapacidade de identificar diferenças na
intensidade da fibrose na 15ª semana assim como na variação do grau de
fibrose, após interrupção da indução, entre os dois modelos de agressão
crônica a diferentes causas:
lxxviii
1) o número de animais em cada grupo foi insuficiente para
demonstrar todas as diferenças existentes entre os grupos
2) embora o teste ANOVA e a análise por regressão não tenham
demonstrado, respectivamente, diferenças entre os grupos na
15ª semana de indução e na variação da fibrose após
interrupção da indução, o Box Plot sugere que os animais que
receberam etanol apresentaram maior quantidade de colágeno
e menor variação da fibrose no período de repouso. Um maior
grau de fibrose com 15 semanas e uma menor capacidade de
reversão da mesma neste grupo, não perceptíveis pelos testes
estatísticos convencionais, combinaram-se, tornando evidente
o efeito da adição de etanol ao CCl
4
somente ao final de 8
semanas (ANOVA p<0,05).
3) o consumo de etanol não foi quantificado por animal, mas por
caixas de 5 animais. Caso a variação de consumo entre os
animais de uma mesma caixa tenha sido grande, alguns
animais poderiam ter sido expostos a quantidades demasiado
pequenas de etanol, insuficientes para potencializar os efeitos
tóxicos do CCl4, aproximando os resultados de ambos os
protocolos
ISSA e cols (2004) mostraram reversibilidade espontânea da cirrose
hepática induzida com injeções i.p. de CCl
4,
isoladamente, durante 12
semanas. Após 4 semanas de interrupção da agressão os animais
apresentaram redução na quantificação dos níveis de fibrose evidenciado pela
morfometria. Em outro estudo recente, VINICIUS e cols (2005) relataram
lxxix
características histológicas de cirrose septal incompleta (diminuição dos
septos) após quatro semanas de suspensão da indução em animais
intoxicados com CCl
4
puro por 16 semanas.
Um dos principais mecanismo envolvidos no equilíbrio de síntese e
degradação de componentes da fibrose hepática é a ativação das HSCs.
Greenweel e cols (1999) demonstraram que o acetaldeído, primeiro produto do
metabolismo do etanol, é envolvido na ativação de HSCs in vitro (CHEN, 2002)
aumentando assim a deposição de colágeno na matriz, com aumento da
fibrose hepática. Considerando essas observações, enfatizamos que o etanol
parece ter um importante papel na fibrogenêse hepática durante o período de
intoxicação, potencializando o efeito do CCl
4
permitindo assim que a fibrose se
mantenha após a interrupção da indução hepática crônica.
Pelas evidências morfométricas de um maior conteúdo de fibrose no
grupo EtOH+CCl
4
/8sR comparado ao grupo CTRL+CCl
4
/8sR e pelo relato da
literatura de que a intoxicação com CCl
4
puro permite a reversão espontânea,
fomos encorajados a enfocar nossas investigações nos animais intoxicados
com CCl
4
e etanol.
A quantificação de colágeno pelo ensaio de hidroxiprolina mostrou
elevado conteúdo desse aminoácido no grupo EtOH+CCl
4
e se manteve após 8
semanas de interrupção. Mais uma vez nossos dados diferem dos modelos que
avaliaram a reversibilidade espontânea da cirrose induzida com CCl
4
puro, os
quais demostraram a diminuição nos níveis de hidroxiprolina após a retirada da
hepatotoxina (IREDALE e cols., 1998; ISSA e cols., 2004; VINICIUS e cols.,
2005).
lxxx
Colágenos tipo I e III apresentam um aumento de 3 a 8 vezes na injuria
hepática (SHERLOCK&DOOLEY 2002). Kato e cols (2003) descreveram que o
etanol induz a expressão de TGF- β que estimula a ativação das HSCs levando
ao aumento da síntese de colágeno fibrilar tipo I, principal componente da
fibrose. Corroborando esses estudos, nossos achados mostraram um aumento
significativo de ambos os colágenos após 15 semanas de indução (Figuras 13C
e 13D) e 8 semanas após a interrupção da intoxicação, ambos localizados no
septo fibroso envolvendo nódulos (Figuras 13E e 13F).
WU e cols (2000) demonstraram que a administração de etanol aumenta
a expressão de tTG em células estreladas hepáticas e exacerba a atividade da
tTG2 em níveis que inibem a proliferação dos hepatócitos in vitro. Em 2004 WU
e cols descreveram que um dos principais mecanismos pela qual a tTG2 é
envolvida na inibição da síntese e proliferação celular de hepatócitos está
relacionado ao fato do cross-linking de colágeno estimular a secreção de TGF-
β, um importante inibidor de replicação do hepatócito, por componentes da
MEC em ratos. A tTG2 contribui para a formação de cross-linking de colágeno,
garantindo resistência à degradação por colagenases (Wu e cols., 2000). Em
nossos resultados observamos que a tTG2 estava localizada nos septos
fibrosos da mesma forma que o colágeno após 15 semanas de indução (Figure
14B) e este padrão foi sustentado após 8 semanas de interrupção da agressão
(Figure 14C). Com a finalidade de confirmar esses dados, foi realizada a
quantificação da tTG2 por morfometria, o que não demonstrou diferença entre
ambos os grupos (Figure 14D). Isto indica que a expressão de tTG2 continuou
após a interrupção da intoxicação, contribuindo para a resistência do septo
lxxxi
fibroso e mantendo a quantidade de fibrose, como observado pela análise
histopatológica.
O parâmetro funcional de nosso estudo foi a análise bioquímica utilizada
rotineiramente para a avaliação da função hepática em humanos.
Estabelecemos os valores normais dos parâmetros bioquímicos analisados e
observamos que os valores obtidos se encontraram semelhantes aos relatados
em outros estudos (FIGUERAS e cols., 1996; DIAZ-GIL e cols., 1999; KUS e
cols., 2004; LUO e cols., 2004).
Nossos resultados demonstraram que, em 15 semanas de indução, os
níveis séricos de AST, ALT e BilT aumentaram, e houve diminuição dos níveis
séricos de ALB. Porém esses valores retornaram aos níveis basais oito
semanas após a retirada dos agentes tóxicos (Figura 15).
Podemos explicar o retorno dos parâmetros bioquímicos à normalidade
baseando-nos nos estudos de lesão hepática cronica em pacientes cirróticos. A
albumina e bilirrubina séricas são componentes do escore Child-Pugh (PUGH,
1973), um sistema para avaliação de função hepática bastante utilizado em
pacientes cirróticos (CHOLONGITAS, 2006). O aumento da bilirrubina total e a
diminuição dos níveis de albumina são características típicas de cirrose
hepática descompensada. Pacientes com cirrose hepática compensada
geralmente apresentam testes funcionais normais visto que a capacidade de
síntese esta preservada (D'AMICO, 2006).
A elevação dos níveis de aminostransferases (AST/ALT) revela necrose
hepatocelular, típica das hepatites agudas (DAVERN, 2002) e fracamente
correlacionadas com o estágio da fibrose (AFDHAl, 2004). Em nosso modelo
lxxxii
experimental, os marcadores bioquímicos de função e lesão hepatocelular se
alteraram logo no início do período de indução, mas retornaram aos níveis
normais após 8 semanas de interrupção do insulto (Figura 1). Similarmente,
pacientes com cirrose hepática alcoólica geralmente apresentam níveis de
aminotransferases normais após a suspensão da ingestão alcoólica, razão pela
qual essas enzimas possuem baixa sensibilidade em detectar hepatopatias
crônicas em pacientes alcoólatras que não estejam consumindo álcool
(THABUT, 2006) Quando encaminhados ao programa de transplante hepático,
a maioria desses pacientes apresenta progressiva melhora da função hepática
enquanto abstinentes, e alguns deles podem ser retirados da lista devido à
melhora significativa (VELDT, 2002).
Portanto, podemos inferir que o comportamento dos marcadores
bioquímicos do nosso experimento assemelha-se àquele dos pacientes
alcoólatras com doença avançada, sugerindo que esse é um modelo animal de
cirrose hepática adequado.
lxxxiii
CONCLUSÕES:
Diante dos resultados obtidos em nossos estudos, podemos concluir que:
• A administração de CCl
4
na dose de 0,05mL/kg de peso corporal,
associada ou não à ingestão crônica de etanol, induz lesões hepáticas
crônicas que progridem para cirrose hepática ao fim de 15 semanas;
• Os animais analisados após a suspensão do CCl
4
isolado e do CCl
4
associado ao etanol mantiveram os padrões histopatológicos de cirrose
hepática;
• Em comparação ao modelo pré-estabelecido de indução de cirrose por
CCl
4
isolado, nosso modelo demonstrou ser menos suscetível a reversão
espontânea por manter o grau de fibrose maior no período da retirada das
toxinas.
• Os animais tratados com CCl
4
associado ao etanol apresentaram
alterações significativas nos parâmetros bioquímicos (AST, ALT, BilT e Alb)
relacionados aos achados histopatológicos.
• Os parâmetros bioquímicos retornaram ao níveis basais após 8 semanas
de interrupção da agressão.
• Estabelecemos um modelo animal de cirrose hepática reprodutível dos
aspectos fisiopatológicos e clínicos da cirrose hepática que foi capaz de
sustentar as alterações histopatológicas por um período de 8 semanas
após a retirada dos agentes agressores.
lxxxiv
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