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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA E
DO AMBIENTE
AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE APRESUNTADOS, FATIADOS E
COMERCIALIZADOS EM SUPERMERCADOS DE PORTO ALEGRE, RS
Dissertação de Mestrado
Vanessa Daniele Mottin
PORTO ALEGRE
2008
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UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO GRANDE DO SUL
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BÁSICAS DA SAÚDE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM MICROBIOLOGIA AGRÍCOLA E
DO AMBIENTE
AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE APRESUNTADOS, FATIADOS E
COMERCIALIZADOS EM SUPERMERCADOS DE PORTO ALEGRE, RS
Autor: Vanessa Daniele Mottin
Dissertação apresentada como
requisito parcial para obtenção do
grau de Mestre em Microbiologia
Agrícola e do Ambiente.
Orientadora: Profa. Dra. Marisa
Ribeiro de Itapema Cardoso.
Porto Alegre (RS), Brasil
Fevereiro, 2008.
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AVALIAÇÃO MICROBIOLÓGICA DE APRESUNTADOS, FATIADOS E
COMERCIALIZADOS EM SUPERMERCADOS DE PORTO ALEGRE, RS
1
Autor: Vanessa Daniele Mottin
Orientador: Profa. Dra. Marisa Ribeiro de Itapema Cardoso
RESUMO
Os setores de fiambreria dos supermercados fracionam quantidades de alimento
em escala próxima à industrial, estando submetidos ao mesmo risco de manipulação e
contaminação cruzada dos produtos processados. A partir disso, o objetivo desse estudo
foi avaliar as condições microbiológicas de apresuntados fatiados e comercializados
nesse tipo de estabelecimento em Porto Alegre. Em três estabelecimentos comerciais
intencionalmente selecionados, foram coletadas amostras de apresuntado e analisadas
quanto à presença de Coliformes Totais e Termotolerantes, Staphylococcus coagulase
positiva, Listeria monocytogenes e Salmonella sp. Das 100 amostras analisadas por
estabelecimento, 98%, 35% e 67% foram positivas para a presença de Coliformes
Totais, nos estabelecimentos A, B e C, respectivamente. Coliformes Termotolerantes
acima do limite estabelecido pela legislação vigente foram detectados em produtos
oriundos de todos os estabelecimentos, porém em freqüência distinta (A=6; B=1;
C=11). Na avaliação de Staphylococcus coagulase positiva, o estabelecimento A
apresentou 11% de amostras fora do padrão, enquanto o estabelecimento B e C
apresentaram 16% e 21%, respectivamente. Todos os estabelecimentos (A=4; B=2;
C=1) apresentaram amostras positivas para Listeria monocytogenes. Salmonella sp.
esteve ausente em todas as amostras analisadas. Observou-se tendência de concordância
entre o índice elevado de Coliformes Totais e a maior freqüência de isolamento de
Listeria monocytogenes. A partir disso, sugere-se que a manipulação e fatiamento de
produtos constituem um ponto adicional de contaminação dos alimentos, devendo ser
otimizados os protocolos de higienização nesses setores do comércio para aumentar a
segurança dos produtos processados.
1
Dissertação de Mestrado em Microbiologia Agrícola e do Ambiente, Instituto de Ciências Básicas da
Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil (70pg). Março, 2008.
MICROBIOLOGICAL EVALUATION OF HAM, SLICED AND
COMMERCIALIZED IN SUPERMARKETS OF PORTO ALEGRE, RS
2
Author: Vanessa Daniele Mottin
Advisor: Prof. Dr. Marisa Ribeiro de Itapema Cardoso
ABSTRACT
Supermarkets are that retail establishments, process product amounts almost as high as food
industries. Thus, food products processed in these establishments may be exposed to the same
recontamination risk as at the industrial environment. The aim of this study was to conduct a
microbiological evaluation of lunchmeat sliced and sold in supermarkets of Porto Alegre.
Samples were purchased at three previously chosen supermarkets and investigated for the
presence of total and fecal coliforms, coagulase-positive Staphylococcus, Listeria
monocytogenes, and Salmonella sp. Of a total of 100 samples analyzed in each supermarket (A,
B, C) 98%, 35% and 67%, respectively, had total coliforms in variable counts. Samples with
fecal coliforms counts (A=6%, B=1% and C=11%) and coagulase-positive Staphylococcus
counts (11%, B=16% and C=21%) above the legislation limit were also detected. In all
supermarkets (A=4, B=2 and C=1), purchased lunchmeat samples presented Listeria
monocytogenes. Salmonella sp. was absent in all samples. A tendency of agreement between
total coliforms counts and isolation of Listeria monocytogenes was observed. Thus, we suggest
that slicing and manipulation of lunchmeat at supermarkets are an additional hazard points for
food contamination, pointing the need of optimization on cleaning and disinfection protocols
adopted for these food processing areas.
2
Master of Science Dissertation in Agriculture and Environmental Microbiology, Instituto de Ciências
Básicas da Saúde, Universidade Federal do Rio Grande do Sul, Porto Alegre, RS, Brasil (70pg). Março,
2008.
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO .................................................................................................................. 8
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA ......................................................................................... 10
2.1 Microrganismos presentes em alimentos ....................................................................... 10
2.1.1 Microrganismos patogênicos ...................................................................................... 10
2.1.1.1 Salmonella sp. .............................................................................................. 10
2.1.1.2 Listeria monocytogenes................................................................................ 12
2.1.1.3 Staphylococcus sp. ....................................................................................... 14
2.1.2 Microrganismos indicadores de segurança dos alimentos .......................................... 16
2.1.2.1 Grupo dos coliformes................................................................................... 17
2.2 Origens de contaminação dos alimentos........................................................................ 18
2.2.1 Manipuladores como fontes de contaminação ............................................................ 18
2.2.2 Equipamentos e utensílios como fontes de contaminação.......................................... 20
3 MATERIAL E MÉTODOS .............................................................................................. 23
3.1 Amostras ........................................................................................................................ 23
3.1.1 Recepção e preparação da amostra para análise ......................................................... 23
3.2 Avaliação da presença de Coliformes Totais e Coliformes Termotolerantes................ 24
3.3 Avaliação da presença de estafilococos coagulase positiva........................................... 25
3.4 Avaliação da presença de Listeria sp. ............................................................................ 26
3.5 Avaliação da presença de Salmonella sp. ...................................................................... 27
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO...................................................................................... 29
4.1. Amostras fatiadas e embaladas em estabelecimentos comerciais de Porto Alegre ...... 29
4.1.1. Isolamento de Coliformes Totais e Termotolerantes ................................................. 29
4.1.2. Isolamento de Staphylococcus coagulase positiva..................................................... 32
4.1.3. Isolamento de Listeria monocytogenes...................................................................... 35
4.1.4. Isolamento de Salmonella sp...................................................................................... 38
4.2. Amostras fatiadas e embaladas industrialmente e comercializadas em Porto Alegre .. 39
5
5 CONCLUSÃO .................................................................................................................. 41
6 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.............................................................................. 42
Anexo I................................................................................................................................. 61
Anexo II ............................................................................................................................... 67
Anexo III.............................................................................................................................. 69
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Mediana (log
10
Unidades Formadoras de Colônia. g
-1
) de Coliformes Totais em
20 lotes de apresuntado fatiado e embalado adquiridos em três supermercados (A, B, C) de
Porto Alegre em 2007. ......................................................................................................... 30
Tabela 2: Número de amostras de apresuntado fatiado e embalado adquiridos em três
supermercados de Porto Alegre (2007) com contagens de Coliformes Termotolerantes
acima do previsto na RDC 12* e com confirmação de presença de Escherichia coli......... 31
Tabela 3. Número de amostras positivas para determinados patógenos em relação ao
Sistema de Inspeção submetido. .......................................................................................... 40
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Número de isolados de acordo com a espécie de estafilococos coagulase positiva
encontrados em amostras de apresuntado fatiado e embalado em três supermercados de
Porto Alegre, 2007. .............................................................................................................. 34
Figura 2. Número de “pools” de amostras de apresuntado fatiado positivas para espécies de
Listeria sp. em três supermercados de Porto Alegre, 2007.................................................. 36
1 INTRODUÇÃO
Desenvolver produtos com qualidade e que não prejudiquem a saúde do
consumidor é um desafio que as indústrias enfrentam. Em toda a cadeia alimentar, a
manutenção das condições higiênico-sanitárias é um fator fundamental no controle das
doenças transmitidas por alimentos (DTA), sendo que os produtos prontos para o
consumo podem apresentar risco à saúde do consumidor.
Dentre os produtos cárneos industrializados, um dos mais encontrados à
disposição no mercado é o presunto, o qual é preparado exclusivamente de pernil suíno,
desossado, adicionado de ingredientes e submetido a um processo de cozimento. A
designação apresuntado é dada a produtos elaborados com recortes de presunto ou
paleta de suínos, transformados em massa, condimentados, enlatados ou não e
submetidos a tratamento térmico. Produtos cárneos cozidos e curados são geralmente
considerados seguros, no entanto, a recontaminação com patógenos durante o pós-
processamento pode ser a causa de surtos de origem alimentar. Diversos fatores de risco
como contaminação cruzada, falta de higiene na preparação do alimento, processamento
e estocagem inadequados, podem permitir que microrganismos se multipliquem até
atingir doses infectantes. Esta, uma vez atingida, pode fazer com que produtos que não
sofram tratamento térmico posterior, causem surtos de DTA com implicações
imprevisíveis para os consumidores.
A higiene dos alimentos é importante para garantir segurança, salubridade e
sanidade do alimento em todos os estágios de seu desenvolvimento, produção ou
manufatura, até o produto final. Existem inúmeros surtos de doenças de origem
alimentar relacionados à falta de limpeza e desinfecção de equipamentos, utensílios e
superfícies que entram em contato com os alimentos.
A presença de coliformes totais avalia as condições higiênicas, sendo que altas
contagens significam contaminação pós-processamento, limpeza e sanificação
deficientes, tratamentos térmicos ineficientes ou multiplicação durante o processamento
ou estocagem. A presença de coliformes termotolerantes, e principalmente de
Escherichia coli evidencia condições higiênico-sanitárias inadequadas e pode indicar a
presença de enteropatógenos em ambientes ou produtos alimentícios analisados. Listeria
monocytogenes, Salmonella sp. e Staphylococcus aureus são importantes patógenos de
origem alimentar e surtos têm sido associados à ingestão de produtos cárneos. L.
monocytogenes é particularmente problemática na indústria de alimentos por poder ser
9
disseminada no ambiente e também devido à habilidade em crescer em larga faixa de
temperatura.
A pesquisa de L. monocytogenes em produtos prontos para o consumo é de
grande importância, pois é notável que os alimentos envolvidos em surtos e casos
esporádicos de listeriose são aqueles processados industrialmente, mantidos sob
refrigeração, assim oferecendo condições adequadas para multiplicação. S. aureus
também tem a habilidade de crescer em larga faixa de temperatura e pH, e, junto com
Salmonella sp., são os dois principais causadores de DTA no Rio Grande do Sul.
Os supermercados são responsáveis pela manipulação de grandes quantidades de
alimentos e atendem a uma parcela significativa da população. Nos setores de
fatiamento de produtos de fiambreria dos supermercados, não há controle ou inspeção
como é exigido nas indústrias que os produzem. Entretanto, nesse ambiente, os produtos
vindos da indústria são fracionados em grande quantidade, sendo submetidos ao risco de
manipulação e contaminação cruzada da mesma ordem daquele do ambiente industrial.
Sabendo que na maioria das vezes estes produtos não sofrem processamento térmico
posterior, pode-se considerar os setores de fatiamento como potenciais pontos de
contaminação dos produtos com bactérias causadoras de DTA.
Em trabalho anterior realizado em supermercados de Porto Alegre, observou-se
que o ambiente dos setores de fatiamento apresentava indicadores de higienização com
contagens elevadas, demonstrando deficiências nos procedimentos de higienização.
Nesse estudo os produtos fatiados não foram amostrados, sugerindo-se que novos
estudos fossem conduzidos a partir deste ponto para confirmar o impacto das
deficiências detectadas no produto final oferecido ao consumidor.
Sendo assim, o objetivo desse estudo foi avaliar as condições microbiológicas de
embutidos cozidos, fatiados e comercializados em supermercados de Porto Alegre,
elucidando o impacto que a introdução de um novo ponto (fatiamento e manipulação)
pode oferecer para o risco de contaminação do produto, usando o apresuntado como
modelo.
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Microrganismos presentes em alimentos
O alimento propicia a quem o consome um aporte nutricional de fundamental
importância. Por outro lado, essa riqueza em nutrientes faz dele um meio de cultura
ideal para a multiplicação de microrganismos. As carnes em geral apresentam uma
composição química que as tornam excelentes meios de cultura, o que favorece o
crescimento microbiano (FRANCO & LANDGRAF, 2005). Alimentos prontos para o
consumo incluindo carnes vermelhas, aves, frutos do mar e vegetais têm sido
documentados como veículos de muitas bactérias patogênicas e estão envolvidos nas
doenças de origem alimentar (BORCH & ARINDEN, 2002; GODBJORNSDOTTIR et
al., 2004).
Alguns desses microrganismos podem atuar preservando o alimento durante sua
multiplicação, porém outros podem ocasionar sua deterioração. Ao lado disso, são de
grande interesse para a saúde pública microrganismos ou suas toxinas que, quando
presentes nos alimentos, possam ocasionar infecção e/ou intoxicação no indivíduo que o
consome.
2.1.1 Microrganismos patogênicos
2.1.1.1 Salmonella sp.
O gênero Salmonella é dividido em S. bongori e S. enterica, pertence à família
Enterobacteriaceae e compreende bacilos Gram negativos, predominantemente móveis
pela presença de flagelos peritríquios, anaeróbios facultativos, que apresentam
metabolismo respiratório e fermentativo (HOLT et al., 1994). A partir da fermentação
de D-glicose e outros carboidratos produzem ácido e gás (TORTORA, FUNKE &
CASE, 1993). Geralmente não fermentam a lactose. São indol negativos, oxidase
negativos, catalase positivos e produzem gás sulfídrico (HOLT et al., 1994). Salmonella
subterranea, descrita por Shelobolina, et al. (2004), representa uma nova espécie do
gênero Salmonella, sendo que possui 96,4% de seus nucleotídeos idênticos à Salmonella
bongori. No aspecto bioquímico, possui algumas diferenças, tais como a produção de
indol, a não produção de H
2
S, ser citrato negativo, entre outras.
Salmonella sp. pode se desenvolver em temperaturas que variam de 7 °C a 45°C,
sendo resistentes à dessecação e ao congelamento (WILCOCK & SCHWARTZ, 1993).
11
No entanto, é classificada como mesófila, tendo sua temperatura ótima de crescimento à
37°C (FRANCO & LANDGRAF, 2005). É sensível à luz solar e à maioria dos
desinfetantes como fenóis, clorados e iodados (SOBESTIANSKY et al., 1999).
Assim como a temperatura, o pH de crescimento deste gênero pode variar
amplamente, admitindo valores entre 4,5 e 9,0, sendo considerado um pH ótimo para
seu crescimento entre 6,5 e 7,5. Valores inferiores a 4,1 inativam Salmonella sp.
(TORTORA, FUNKE & CASE, 1993).
A Salmonella está bastante difundida, estando presente no solo, no ar, nas águas
residuais e nos equipamentos, mas seu habitat natural é o trato intestinal dos seres
humanos e dos animais, principalmente das aves (SILVA, RAMALHO &
FIGUEIREDO, 2004). Também pode ser isolada de carne crua, incluindo frango e seus
produtos, leite e derivados (GORMAN, BLOOMFIELD & ADLEY, 2002). Além disso,
tem importância também no ambiente de processamento, pois este microrganismo tem a
habilidade de formar biofilmes em superfícies de contato com alimentos (JOSEPH,
OTTA & KARUNASAGAR, 2001). A transmissão de Salmonella sp. ao homem,
através da população animal, pode ocorrer pelo contato direto com os animais tanto nas
granjas como nos frigoríficos. Mais freqüentemente ocorre pela ingestão de produtos
contaminados de origem animal (WEGENER & BAGER, 1997), o que pode resultar em
toxinfecções alimentares (LEITÃO, 1988).
Salmonella sp. é o mais importante contaminante de produtos alimentícios e é
um dos principais agentes bacterianos responsáveis por surtos de toxinfecções
alimentares em diversos paises (LACONHA et al., 2000; LOPALCO et al., 2000).
Dois importantes sorovares transmitidos dos animais para os humanos são Salmonella
Enteritidis e Salmonella Typhimurium (WHO, 2005).
No hemisfério Ocidental e na Europa, S. Enteritidis tornou-se o sorovar
predominante nos surtos investigados, principalmente aqueles associados ao consumo
de aves e ovos (WHO, 2002). Da mesma forma, em estudo realizado por Geimba (2004)
em alimentos envolvidos em surtos no Rio Grande do Sul, houve predomínio de
Salmonella Enteritidis, sendo os alimentos preparados com ovos crus os mais
implicados. Segundo dados levantados junto à Secretaria Municipal de Saúde de Porto
Alegre por Gottardi (2003), o principal agente etiológico identificado nos surtos de
DTA, no período de 1995 a 2002, neste município foi Salmonella sp. seguido por
Staphylococcus aureus. A predominância de Salmonella sp. como a principal causadora
de surtos de DTA também tem sido relatada no Rio Grande do Sul nos últimos anos
12
(COSTALUNGA & TONDO, 2002; NADVORNY, FIQUEIREDO & SCHMIDT,
2004). Segundo a Organização Pan-Americana da Saúde (OPAS), durante 1999,
Salmonella sp. e Staphylococcus aureus foram os agentes bacterianos mais associados a
surtos nos países associados ao seu Sistema Regional de Informação (OPAS-OMS,
2000). No Brasil, no período de 1999 a 2000, os produtos cárneos foram responsáveis
por 11 surtos, envolvendo 690 acometidos, causados por Salmonella sp. (SIRVETA,
2007).
A contaminação dos alimentos pode ocorrer devido ao controle inadequado de
temperatura, manipulação incorreta ou contaminação cruzada (FORSYTHE, 2002).
Para que ocorra uma infecção gastrintestinal de origem alimentar por Salmonella, são
necessárias as seguintes condições: o alimento deve estar contaminado com Salmonella
sp.; essas bactérias devem encontrar-se no alimento em número elevado; os
microrganismos ingeridos devem estar viáveis (FRAZIER & WESTHOFF , 1993).
Wegener & Bager (1997) também ressaltam a importância da composição do produto,
da manipulação e práticas no preparo do alimento, e da suscetibilidade dos
consumidores primários.
No Rio Grande do Sul, Costalunga & Tondo (2002) encontraram as carnes como
um dos principais alimentos incriminados nos surtos investigados entre 1997 e 1999,
sendo que a maionese foi citada como o principal produto. Em contraste a isto,
Salvatori, Bessa & Cardoso (2003), não encontraram tal patógeno nas lingüiças cruas,
salames e lingüiças maturadas comercializadas em Porto Alegre (RS), estudo que está
de acordo com Cereser et al. (2007), os quais não encontraram amostras positivas para
Salmonella sp. em salames analisados em Cruz Alta (RS).
2.1.1.2 Listeria monocytogenes
O gênero Listeria é composto por 6 espécies: L. monocytogenes, L. seeligeri, L.
ivanovii, L. innocua, L. welshimeri e L. grayi (HITCHINS, 2003). A espécie L.
denitrificans foi reclassificada como Jonesia denitrificans e as espécies L. grayi e L.
murrayi foram agrupadas em uma única espécie, L. grayi. A espécie L. ivanovii foi
subdividida em duas subespécies: L. ivanovii subsp. ivanovii e L. ivanovii subsp.
londonienis (FRANCO & LANDGRAF, 2005). Somente uma espécie é potencialmente
patogênica para humano, L. monocytogenes. São bacilos Gram positivos não
formadores de esporos, comuns no ambiente, têm a habilidade de crescer em uma ampla
13
faixa de pH (4,3 a 9,6) e temperatura (1 a 45ºC) e concentração de sal acima de 10%
(SEELIGER & JONES; 1986). São psicrotróficos (SILVA et al., 2003), podendo
sobreviver e crescer em temperatura de refrigeração (4ºC), e crescer em atividade de
água tão baixas quanto 0,83, inibitória para a maioria dos patógenos (ROBERTS &
WIEDMANN, 2003), além de resistir ao congelamento e descongelamento
(GERMANO & GERMANO, 2001). A transmissão deste patógeno por alimento
contaminado foi demonstrada conclusivamente por investigações epidemiológicas e
laboratoriais em 1983 por Schlech et al. (1983).
Na Dinamarca, em meados dos anos 1990, microrganismos patogênicos como L.
monocytogenes e Salmonella sp., foram incluídos nos programas de análises regionais
(ANDERSEN et al., 2007). L. monocytogenes, é um patógeno de grande importância
em saúde pública (FOONG, GONZALES & DICKSON, 2004). A infecção é rara,
porém a alta taxa de mortalidade, entre 20% e 40%, e o elevado número de indivíduos
hospitalizados, que pode chegar a 90% de todos os casos de internação por doença
transmitida por alimento, aumenta sua importância para a saúde pública (ZHANG,
BHUSHAN & STEPHEN, 2004). Segundo Mead et al. (1999), a listeriose é
responsável por 3,8% dos casos relatados de hospitalização por doenças de origem
alimentar e 27,6% de óbitos resultantes dessas enfermidades.
Listeria sp., em particular L. monocytogenes, em virtude da sua habilidade de
sobreviver e multiplicar-se em produtos embalados a vácuo e com atmosfera
modificada sob temperatura de refrigeração, tem sido reportada mundialmente nos
produtos prontos para o consumo (HUSS, JERGENSEN & VOGEL, 2000). Em geral, a
primeira origem de contaminação de alimentos por L. monocytogenes antes de chegar
ao consumidor é o ambiente de processamento (KATHARIOU, 2002).
Produtos cárneos processados podem ser contaminados por L. monocytogenes
em vários estágios: ingredientes crus contaminados, processo insuficiente/inadequado
de esterilização dos produtos, contato com alimentos crus não processados que estão
contaminados ou superfícies e pessoal insuficientemente higienizados
(CHASSEIGNAUX et al., 2001). Reij e Den Aantrekker (2004) apontam a higiene
pessoal inadequada e processamento dos alimentos como modo de transmissão desses
patógenos. A contaminação cruzada pode ocorrer em muitos estágios entre a planta de
processamento de carnes até o consumidor. A limpeza é um passo importante em função
da remoção da matéria orgânica da superfície de processamento (CHASSEIGNAUX et
al., 2001;THEVENOT et al., 2005).
14
O crescimento e sobrevivência deste microrganismo são dependentes de sua
habilidade de vencer as barreiras ambientais encontradas durante o processo de
fabricação e conservação, assim como temperatura, pH, atividade de água e
disponibilidade de nutriente. A maioria das bactérias, incluindo L. monocytogenes, é
geralmente resistente a mudanças pequenas nos parâmetros ambientais específicos, mas
múltiplas mudanças estimulam respostas de estresse as quais geralmente são
direcionadas à sua sobrevivência e não ao seu crescimento (BOOTH, 1998).
Em 1992 ocorreu um surto de listeriose na França em consumidores de um
produto típico da região “pork tongue in jelly” feito a partir de língua cozida de suíno
(SALVAT et al., 1995). Casos esporádicos têm sido reportados por Farber e Peterkin
(1991) com uma variedade de produtos cárneos, incluindo “nuggets” de frango, frango
cozido e resfriado, lingüiça de carne suína, carne cozida de peru, entre outros. Farber &
Daley (1994) encontraram L. monocytogenes em 7 do total de 101 amostras de patês
analisados na sua pesquisa. Carne suína e produtos suínos processados foram
implicados em surtos envolvendo L. monocytogenes na França (JACQUET et al. 1995;
GOULET et al. 1998) e em outros países europeus (JAY, 2005).
No Brasil, Silva e colaboradores (2004) encontraram L. monocytogenes em
amostras analisadas em frigoríficos, tanto na matéria-prima quanto no produto final,
demonstrando a necessidade de readequação nas práticas de limpeza e sanificação das
plantas de processamento, bem como o risco potencial de listeriose ao consumidor.
2.1.1.3 Staphylococcus sp.
Segundo Silva & Gandra (2004) o grupo dos estafilococos coagulase positiva
são os patógenos mais importantes em alimentos, uma vez que sua presença em
alimentos processados pode indicar deficiência no processamento ou condições
higiênicas inadequadas do processo; e suas enterotoxinas, uma vez presentes no
alimento, poderão causar intoxicação alimentar.
As bactérias do gênero Staphylococcus são cocos Gram positivos com diâmetro
variando de 0,5 e 1,5µm, imóveis e não formadoras de esporos. Quando visualizadas em
microscópio, aparecem na forma de cachos de uva, por se dividirem em planos
diferentes; entretanto, dependendo da idade da colônia, podem ser encontradas isoladas,
aos pares, agrupadas em tétrades ou, ainda, em pequenas cadeias. A maior parte das
espécies apresenta metabolismo respiratório e fermentativo e têm capacidade de
15
fermentar uma grande variedade de carboidratos, principalmente em condições de
aerobiose, com produção final de ácido, mas não de gás (SILVA, 1998; KLOOS &
BANNERMAN, 1999; FRANCO & LANDGRAF, 2005).
Staphylococcus aureus assume importância tanto por ser uma bactéria
potencialmente patogênica, como pelo fato de sua presença, em contagens elevadas,
indicar a falta de higiene na manipulação (BANWART, 1989; FRANCO &
LANDGRAF, 2005). Este microrganismo pode existir como membro permanente ou
transitório da microbiota humana, sem causar sintomas (HATAKKA et al., 2000). Os
principais reservatórios são humanos e animais, estando presentes nas vias nasais,
cabelos e pele de indivíduos saudáveis (GENIGEORGIS, 1989). Ao lado disso, são
também encontrados no ar, esgoto, água, leite, alimentos e equipamentos de
processamento de alimentos (SILVA JR & MARTINS, 1991; FORSYTHE, 2002).
Manipuladores infectados, com hábitos de higiene inadequados, são um dos fatores que
contribuem para a contaminação do alimento por S. aureus (JAY, 2005). Sua presença
nas mãos de manipuladores portadores sadios ou assintomáticos constitui fator
epidemiológico importante em surtos causados por produtos cárneos associados a esse
agente (SILVA JR. et al., 1990).
Os estudos relacionados aos fatores extrínsecos e intrínsecos que interferem na
multiplicação destes microrganismos em alimentos foram realizados, em quase sua
totalidade, com S. aureus, devido a esta ser a espécie mais relacionada a casos de
intoxicação alimentar (JAY, 2005; SILVA, JUNQUEIRA & SILVEIRA, 1997). Jay
(2005) relata que S. aureus é capaz de se multiplicar em uma ampla faixa de pH e
temperatura, e Franco e Landgraf (2005) salientam que estes microrganismos
apresentam tolerância a concentrações de 10 a 20% de NaCl, bem como a nitratos e que
têm capacidade de crescer em alimentos com baixa atividade de água (A
a
=0,86).
Quando em condições ideais, conseguem desenvolver-se em A
a
de até 0,83, sem, no
entanto, produzir enterotoxinas. As intoxicações estafilocócicas estão associadas à
ingestão de enterotoxinas produzidas por algumas linhagens de S. aureus que, quando
presentes nos alimentos, tiveram condições de multiplicação. Por essa razão, alimentos
que requerem muita manipulação durante a preparação e são mantidos a temperaturas de
risco são aqueles freqüentemente envolvidos em intoxicações alimentares causadas por
estafilococos (JAY, 2005; HPA, 2006).
A toxina estafilocócica, uma vez produzida, é termoestável e não pode ser
inativada por métodos de cocção padrão (FORSYTHE, 2002) nem mesmo por
16
pasteurização e UHT (SILVA & GANDRA, 2004). As enterotoxinas estafilocócicas
(EE) são proteínas extracelulares hidrossolúveis, cuja composição de aminoácidos,
estrutura molecular e atividades farmacológicas são semelhantes entre si, possuindo,
entretanto, propriedades imunológicas distintas. Não são inativadas por enzimas
proteolíticas, característica que explica a capacidade de permanecerem ativas após
ingestão, resistindo à ação de enzimas produzidas por outros microrganismos e às
enzimas do próprio alimento (SILVA, 1998; NOVAK, 1999).
Franco e Landgraf (2005) relatam que não existe uma concordância sobre a dose
tóxica capaz de causar sintomatologia em seres humanos, porém, de maneira geral,
estima-se que esteja entre 0,015 e 0,375 mg de enterotoxina por Kg de peso corpóreo.
Jay (2005) diz que 200µg seriam suficientes para causar a enfermidade.
Em Pelotas (RS), S. aureus produtor de enterotoxina A foi o causador de um
surto que acometeu 88 pessoas, as quais consumiram sanduíche de galinha em um
restaurante institucional (RODRIGUES et al., 2004). No mesmo estado, pesquisadores
encontraram estafilococos coagulase positiva em algumas amostras de salame
comercializado (CERESER et al., 2007), e, no Recife, Freitas e colaboradores (2004)
encontraram S. aureus em amostras de carcaça de frango.
2.1.2 Microrganismos indicadores de segurança dos alimentos
Alguns microrganismos patogênicos presentes em alimentos são de difícil
detecção na análise de rotina. Por essa razão, microrganismos indicadores são
utilizados, pois sua detecção fornece uma evidência indireta da possível presença de um
patógeno (FORSYTHE, 2002).
Indicador é um microrganismo ou um grupo de microrganismos que são
indicativos de que o alimento foi exposto a condições que propiciaram um aumento no
risco de contaminação por patógenos ou mantido sob condições que permitam a
multiplicação desses microrganismos (JAY, 2005).
Um indicador de segurança dos alimentos, segundo Jay (2005), deve apresentar
algumas características como:
a) Ser detectável de forma fácil e rápida;
b) Ser facilmente distinguível de outros membros da microbiota do alimento;
c) Possuir um histórico de associações constantes com o patógeno cuja presença
visa indicar;
17
d) Estar sempre presente quando o patógeno de interesse estiver presente;
e) Ser um microrganismo cujas contagens sejam correlacionadas às quantidades
do patógeno de interesse;
f) Possuir características e taxas de crescimento equivalentes às do patógeno;
g) Possuir taxa de mortalidade que seja ao menos paralela à do patógeno e, de
preferência, que persista por mais tempo que este último;
h) Estar ausente nos alimentos que estão livres de patógenos, ou se estiver
presente, deverá estar em baixas contagens.
Microrganismos indicadores são utilizados na avaliação da qualidade
microbiológica da água (FRANCO & LANDGRAF, 2005) e também para determinar a
qualidade sanitária de alimentos. Por meio dessa avaliação, podem ser verificadas a
possível contaminação fecal e a presença de patógenos, assim como as condições
sanitárias do processamento, produção e estocagem (BANWART, 1989). Análises de
indicadores são amplamente utilizadas para mensurar a sanitização imprópria. Fazem
parte desse grupo os coliformes totais, coliformes fecais, as bactérias aeróbias
mesófilas, psicrotróficas, estafilococos, entre outros (FRANCO & LANDGRAF, 2005).
2.1.2.1 Grupo dos coliformes
Os coliformes são um grupo de enterobactérias presentes nas fezes, no ambiente,
no solo e na superfície de vegetais, animais e utensílios (RODRIGUES et al., 2003). É
composto por bactérias da família Enterobacteriaceae e é um indicador da qualidade
higiênico-sanitária do alimento (RODRIGUES et al., 2003; FRANCO & LANDGRAF,
2005). São capazes de fermentar a lactose com produção de gás quando incubados a 35-
37ºC por 48 horas. Fazem parte desse grupo, entre outros, os gêneros Escherichia,
Enterobacter, Citrobacter e Klebsiella, sendo que somente a Escherichia coli tem como
habitat primário o trato intestinal dos animais. Os demais, além de serem encontrados
nas fezes, também estão presentes em outros ambientes, onde persistem por tempo
superior ao de bactérias patogênicas de origem intestinal. Logo, a presença de
coliformes totais no alimento não indica necessariamente contaminação fecal recente ou
ocorrência de enteropatógenos (FRANCO & LANDGRAF, 2005).
Os coliformes que apresentam a capacidade de continuar fermentando a lactose
com produção de gás, quando incubados à temperatura de 44-45ºC são denominados
coliformes fecais ou termotolerantes (FRANCO & LANDGRAF, 2005).
18
Os coliformes termotolerantes são encontrados freqüentemente no trato intestinal
do homem e dos animais, sendo a Escherichia coli a principal representante deste grupo.
A presença de coliformes termotolerantes no alimento indica contato direto ou indireto
com microrganismos encontrados no intestino humano ou animal, podendo estar
associada à presença de outros organismos patogênicos (BANWART, 1989; ALMEIDA
et al., 1996).
Em alimentos processados, a presença de um número considerável de coliformes
ou de membros da família Enterobacteriaceae pode indicar processamento inadequado,
recontaminação pós-processamento, sendo os equipamentos sujos ou a manipulação sem
cuidados de higiene, as causas mais freqüentes (BANWART, 1989; FRANCO &
LANDGRAF, 2005), assim como tratamentos térmicos ineficientes ou multiplicação
durante o processamento ou estocagem também são considerados importantes (JAY,
2005).
2.2 Origens de contaminação dos alimentos
2.2.1 Manipuladores como fontes de contaminação
A importância de transmissão de doenças infecciosas pelas mãos de humanos foi
demonstrada há muito por Semmelweis, mas foi Price, que realmente estudou os tipos
de bactérias na pele classificando-as em “residentes e transitórias” (ALMEIDA et al.,
1995). Manipuladores de alimentos têm um papel importante na segurança alimentar e
contribuem na transmissão de agentes causadores de toxinfecções alimentares, por
introduzirem patógenos no alimento durante a produção, processamento e distribuição
(ANGELILLO et al., 2000; ALMEIDA et al., 1995).
Na indústria de alimentos, a higienização é frequentemente negligenciada ou
efetuada em condições inadequadas, mas esta situação pode ser revertida pelos
profissionais que atuam na área. A higienização na indústria de alimentos visa
basicamente a preservação da pureza, da palatabilidade e da qualidade microbiológica
dos alimentos, auxiliando, portanto, na obtenção de produtos que, além das qualidades
nutricionais e sensoriais, tenham uma boa condição higiênico-sanitária, não oferecendo
riscos à saúde do consumidor (ANDRADE & MACÊDO, 1996).
O manipulador é considerado um importante agente contaminante para
alimentos. Na pele, existe uma vasta microbiota que serve como importante fator de
19
contaminação, sendo assim, manipuladores portadores assintomáticos ou doentes podem
disseminar através do alimento, microrganismos como E. coli, Staphylococcus sp.,
Salmonella sp., Clostridium perfringens, Bacillus cereus e estreptococos fecais
(RIBEIRO, REIS & ROSSI, 2000). De acordo com Raddi, Leite & Mendonça (1988),
tendo as mãos como veículo de trabalho, os manipuladores de alimento podem, através
do contado direto ou por perdigotos, perpetuar a cadeia epidemiológica da intoxicação
estafilocócica. Suzuki, Saito & Ishikawa (1999) demonstraram que algumas linhagens
de S. aureus foram isoladas de manipuladores, do alimento e de pacientes de um surto
ocorrido em Aichi-Ken, Japão, indicando que os manipuladores foram a possível
origem de contaminação. Siqueira Jr. (2004), afirma que o homem é considerado a
principal fonte de contaminação por S. aureus, estimando que 30 a 50% das pessoas
sadias são portadoras dessa bactéria.
Em serviços de alimentação é importante verificar se a manipulação dos
alimentos é realizada em condições adequadas. Tradicionalmente, as medidas de
controle incluem a implementação de técnica de lavagem das mãos, treinamento e
conscientização dos profissionais envolvidos no preparo, armazenamento e distribuição
de alimentos. Estudos têm demonstrado a eficácia do uso de antissépticos na
higienização das mãos dos manipuladores de alimentos (SHOJAEI,
SHOOSHTARIPOOR & AMIRI, 2006; AYÇIÇEC et al., 2004).
Os hábitos de higiene pessoal são ferramentas importantes para evitar
contaminações cruzadas (CONTRERAS et al. 2003), sendo que estas constituem um
problema potencial de saúde pública. Cardoso, Chaves & Andrade (1994) afirmam que
existe uma relação direta entre as condições higiênicas dos manipuladores de alimentos
e doenças bacterianas de origem alimentar, onde manipuladores doentes, portadores
assintomáticos, que apresentam hábitos de higiene pessoal inadequados, ou preparam
alimentos com atitudes anti-higiênicas contaminam os alimentos. Ayçiçek et al. (2004)
mostram resultados em sua pesquisa que indicam uma correlação positiva entre
experiência de trabalho e higiene das mãos. A higiene das mãos de manipuladores de
alimentos experientes em um hospital foi muito melhor quando comparada aos
manipuladores sem experiência. Shojaei, Shooshtaripoor & Amiri (2006) demonstram a
eficácia da higiene pessoal em manipuladores de alimentos, antes do início da jornada
de trabalho. Em sua pesquisa, 72,7% do pessoal envolvido antes da intervenção do
estudo, estavam contaminados com uma ou mais bactérias potencialmente patogênicas.
A freqüência de contaminação das mãos dos manipuladores depois dessa intervenção
20
diminuiu para 32%, mostrando a importância da higiene adequada, e ressaltando que, na
maioria das vezes, microrganismos são prontamente removidos com uma lavagem
adequada das mãos.
2.2.2 Equipamentos e utensílios como fontes de contaminação
Microrganismos patogênicos e deteriorantes podem manter-se em partículas de
alimentos ou de água sobre utensílios lavados inadequadamente (SILVA Jr., 1999;
VIALTA, MORENO & VALLE, 2002). Do ponto de vista sanitário, o uso de
recipientes e utensílios contaminados representa um risco, particularmente quando se
refere a alimentos cozidos que não se destinam ao consumo imediato (SILVA Jr., 1999).
A contaminação cruzada por microrganismos patogênicos em alimentos crus ou cozidos
pode ocorrer por contato com superfícies de tábuas de corte, equipamentos e utensílios
durante a sua preparação (ZHAO et al., 2001; BLAIS, 1999).
Segundo Dunsmore (1981), superfícies de equipamentos usadas para
manipulação e preparação de alimentos são reconhecidas fontes de contaminação e
recontaminação microbiana, especialmente quando inadequadamente higienizadas.
Microrganismos patogênicos expostos sobre a superfície de contato podem ser
transferidos para outras superfícies de forma direta ou através de partículas no ar e,
estudos indicam que várias bactérias, incluindo E. coli, S. aureus e Salmonella sp.
sobrevivem em panos e esponjas de limpeza, utensílios e também dinheiro, por horas
ou dias após contaminação inicial (KUSUMANINGRUM et al., 2003). Souza, Silva &
Sousa (2004) relatam a presença de coliformes totais, bactérias aeróbias e anaeróbias
facultativas em amostras de equipamentos, superfícies de pré-preparo e nas mãos dos
manipuladores de alimentos, e Tomkin (2002), diz que Listeria sp. também sobrevive
em uma variedade de superfícies, incluindo esponjas, descascadores de vegetais,
fatiadoras, cortadores, bicos aspersores de mangueiras e correias transportadoras, as
quais são consideradas fontes de contaminação em plantas processadoras de alimentos
cárneos prontos para o consumo.
Conforme WHO (2002), quase 25% das toxinfecções alimentares, na Europa,
podem ter sido causadas por contaminação cruzada. Segundo Reij & Den Aantrekker
(2004) a contaminação cruzada pode ser uma freqüente e importante causa de
toxinfecções alimentares a qual tem ocorrido também como conseqüência de
inadequada limpeza e desinfecção.
21
Superfícies mal higienizadas podem prover o contato inicial necessário para
adesão microbiana (OLIVEIRA et al., 2006). À exemplo disso, aço, vidro,
polipropileno, plástico, borracha, fórmica e ferro podem agregar resíduos orgânicos,
como restos de alimentos decorrentes da má higienização. Esses resíduos constituem
meio de cultura adequado para o crescimento e multiplicação de bactérias e fungos.
Decorrentes dessa multiplicação há formação de polímeros extracelulares e outros
catabólitos que, ao serem formados, juntam-se ao substrato existente, aumentando o
poder de adesão de outros microrganismos. A essa massa de resíduos, microrganismos e
seus produtos extracelulares dá-se o nome de biofilme. Esse biofilme, formado na
superfície de utensílios, pode cristalizar e formar depósitos ou crostas extremamente
aderentes quando submetidas ao calor, protegendo novos microrganismos e dificultando
os procedimentos de lavagem e desinfecção, constituindo pontos de contaminação
(SILVA Jr., 1999). Microrganismos tornam-se mais resistentes à ação dos sanificantes e
outros agentes antimicrobianos quando estão fixados em algumas superfícies (PENG,
TSAI & CHOU, 2002).
Segundo Somers & Wong (2004), a formação de biofilmes é uma preocupação
na indústria de processamento de alimentos devido ao seu potencial como fonte de
contaminação alimentar, podendo levar à diminuição da qualidade e segurança dos
alimentos. Este fato despertou maior interesse com o reconhecimento da L.
monocytogenes como patógeno de origem alimentar, uma vez que é comumente
encontrada no ambiente e já isolada em vários tipos de plantas de processamento de
alimentos. Dados de Wilks, Michels & Keevil (2006) demonstram que a sobrevivência e
a persistência de L. monocytogenes é diferente em diferentes materiais de superfície.
O tempo necessário para a formação desse biofilme depende da freqüência e do
regime de limpeza (GIBBONS et al., 2006). Vialta, Moreno & Valle (2002) relatam que
a adesão ocorre entre vinte minutos a duas horas, ressaltando que fatores como tipo de
superfície, composição do meio, idade e população da bactéria influenciam no processo
de formação do biofilme. O fatiamento de presuntos é uma etapa crucial no controle da
estabilidade microbiana desse alimento, pois, o contato com a superfície do cortador
pode representar uma importante fonte de microrganismos deteriorantes ou patogênicos,
podendo ocasionar, ainda, a formação de biofilmes na superfície do presunto. Segundo
estudos de Muniz et al. (2007), mesmo dentro do prazo de validade, o presunto é um
alimento extremamente susceptível ao desenvolvimento de biofilmes bacterianos e
22
aparenta possuir grande diversidade bacteriana, que pode ter sido originada no processo
de fatiamento da peça no presunto original.
A razão para que se limpem e sanifiquem as superfícies que entram em contato
com os alimentos e o ambiente, deve-se ao fato de que essas operações auxiliam o
controle microbiológico. A limpeza do equipamento contribui direta ou indiretamente,
para o nível de contaminação do alimento, o qual pode influir sobre a sua estabilidade e
inocuidade (GIBBONS et al., 2006). A remoção desses resíduos deve ser feita o mais
rapidamente possível para evitar a formação de biofilmes, que serão mais difíceis de
remover. Logo, aconselha-se que esta limpeza inicie imediatamente após o término do
uso dos equipamentos e utensílios (VIALTA, MORENO & VALLE, 2002).
Falhas nos procedimentos têm sido diretamente associadas à ocorrência de
surtos (Silva Jr., 1999), sendo que a manipulação incorreta e a deficiência nos
procedimentos voltados à garantia da segurança dos alimentos, além da falta de
informação sobre a importância da segurança dos alimentos, levam a ocorrência de
inúmeros casos de intoxicação, contaminação ou infecção (FREO & REOLON, 2006).
Á exemplo disso, um estudo realizado por Haeghebaert et al. (2002) demonstraram que
a contaminação de equipamentos foi o fator desencadeante em 59% dos surtos de
intoxicação alimentar investigados na França durante o ano de 2001. Da mesma forma,
no Rio Grande do Sul, 7,11% dos surtos de DTA que ocorreram entre 1997 e 1999,
estiveram associados à higiene precária de equipamentos e utensílios (COSTALUNGA
& TONDO, 2002).
Neste contexto, estudos realizados por Gottardi et al. (2006) em
estabelecimentos que comercializam alimentos em Porto Alegre (RS) demonstraram
que em alguns casos, houve a introdução de coliformes totais e estafilococos após a
higienização de equipamentos e superfícies, concluindo-se que procedimentos de
treinamento, controle e avaliação devem ser implementados para garantir a segurança
dos alimentos manipulados.
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Amostras
As amostras foram adquiridas em três supermercados da cidade de Porto Alegre,
selecionados entre um grupo de estabelecimentos avaliados anteriormente por Gottardi
(2006) quanto à presença de microrganismos indicadores nas superfícies de
manipulação e equipamentos de fatiamento. Naquele estudo, os três estabelecimentos
não haviam apresentado diferença significativa nas avaliações realizadas tanto entre si,
como com outros estabelecimentos avaliados naquela oportunidade.
O número de amostras foi calculado a partir da fórmula estatística: 1-(1-p)
n
,
sendo p = prevalência e n = número de amostras a serem analisadas.
Segundo BRASIL (2001), “n: é o número de unidades a serem colhidas
aleatoriamente de um mesmo lote e analisadas individualmente. Nos casos nos quais o
padrão estabelecido é ausência em 25g, como para Salmonella sp. e Listeria
monocytogenes, é possível a mistura das alíquotas retiradas de cada unidade amostral,
respeitando-se a proporção p/v (uma parte em peso da amostra, para 10 partes em
volume do meio de cultura em caldo)”.
A partir disso, em cada coleta foram adquiridas cinco unidades amostrais de
aproximadamente 50 g, as quais foram processadas no mesmo dia, correspondendo a
um lote. No caso da análise para Salmonella e Listeria, uma amostra correspondeu ao
“pool” das cinco unidades amostradas, conforme preconizado por BRASIL (2001).
A aquisição das amostras foi realizada em intervalos de sete dias até completar
20 semanas, totalizando 20 lotes em cada um dos estabelecimentos.
Para análise dos produtos fatiados e embalados na indústria foram coletadas
marcas aleatórias de acordo com o sistema de inspeção específico. De acordo com a
disponibilidade dos produtos em cada estabelecimento, as amostras foram coletadas
semanalmente, durante 6 semanas, totalizando 6 lotes (30 unidades amostrais) de
indústrias com Sistema de Inspeção Federal (SIF) e 5 lotes (24 unidades amostrais) de
indústrias com Sistema de Inspeção Estadual (CISPOA).
3.1.1 Recepção e preparação da amostra para análise
Esta etapa foi realizada conforme Silva, Junqueira & Silveira (1997):
a) Abertura da embalagem: Antes de abrir, a área externa da embalagem foi
desinfetada com álcool 70°.
24
b) Retirada da unidade analítica: Foi utilizada uma tesoura estéril para permitir a
retirada de porções aproximadamente iguais de cada uma das embalagens unitárias, até
se obter a quantidade requerida para amostra (25 gramas).
3.2 Avaliação da presença de Coliformes Totais e Coliformes Termotolerantes
Para este trabalho, utilizou-se a metodologia descrita por Brasil (2003):
Uma amostra de 25 g do alimento foi inoculada em 225 mL de água peptonada
0,1% e homogeneizada durante 60 segundos em “stomacher”, sendo esta a diluição 10
-1
.
A partir da diluição inicial, efetuaram-se as demais diluições desejadas em solução
salina peptonada 0,1%.
Após as diluições terem sido preparadas, com o auxílio de um micropipetador
foram inoculadas alíquotas de 1 mL de cada diluição na superfície de placas de petri
esterilizadas. Adicionou-se Violet Red Bile Agar (VRBA) (Biobrás) previamente
fundido, fazendo a homogeneização cuidadosa e posterior repouso para solidificação.
Adicionou-se sobre cada placa, cerca de 10 mL de VRBA (Biobrás) previamente
fundido, formando uma segunda camada de meio. Incubou-se por 18 - 24 horas na
temperatura de 37°C.
Para confirmação de coliformes totais foram selecionadas cinco colônias típicas
e inoculadas, com o auxílio de uma alça de platina previamente esterilizada, em tubos
contendo caldo verde brilhante bile 2% lactose (Merck), incubadas a 37ºC por 24 – 48
horas. Consideraram-se positivas as reações dos tubos com turvação do meio e
formação de gás no interior do tubo de Durhan invertido.
Com o auxílio de alça de platina previamente esterilizada, cinco colônias típicas
foram inoculadas em tubos contendo caldo EC (Merck) e incubadas em banho-maria a
44,5°C por 24 – 48 horas. Consideraram-se positivas as reações dos tubos que tiveram
turvação do meio e formação de gás no interior do tubo de Durhan invertido.
A partir dos isolados de coliformes termotolerantes foram feitos isolamento em
ágar McConkey (Merck) e testes bioquímicos específicos (Produção de Indol, Voges-
Proskauer, Vermelho de Metila e Produção de Citrato) a fim de identificar Escherichia
coli.
Para o cálculo do número de coliformes totais e termotolerantes a seguinte regra
foi utilizada: número de colônias contadas na placa x % de colônias confirmadas x o
inverso da diluição utilizada para a contagem.
25
3.3 Avaliação da presença de estafilococos coagulase positiva
Após as diluições terem sido preparadas, foram inoculadas alíquotas de 0,1 mL
de cada diluição na superfície de placas previamente preparadas e secas de ágar Baird
Parker (Merck). Com alça de Drigalski flambada em álcool, o inóculo foi espalhado em
toda superfície do ágar, obedecendo ao critério de espalhamento das placas de maior
diluição para as placas de menor diluição. Após, as placas foram incubadas invertidas a
37º C por 48 horas em estufa bacteriológica.
Para contagem das colônias presuntivas foram selecionadas placas com 20 a 200
colônias e foram contadas as colônias típicas de Staphylococcus: colônias negras,
circulares, pequenas (máximo 1,5mm de diâmetro), lisas, convexas, com bordas
perfeitas, massa de células esbranquiçadas nas bordas, rodeadas por uma zona opaca
e/ou um halo transparente se estendendo para além da zona opaca.
Foram selecionadas cinco colônias típicas de cada placa para teste da coagulase
e transferidas para tubos com Caldo Infuso Cérebro Coração (BHI) (Difco) incubados
em estufa bacteriológica durante 24 horas a 37º C.
Para o teste da coagulase foram transferidos 0,2mL de cada cultura
obtida em Caldo Infuso Cérebro Coração (BHI) (Difco) para um tubo de ensaio e
adicionados 0,2mL de Plasma-EDTA, homogeneizados com movimentos suaves para
não interferir na coagulação. Foram incubados em estufa bacteriológica a 37º C e
observadas a cada hora a formação do coágulo durante 24 horas. Reações positivas
(formação do coágulo) foram consideradas confirmatórias da presença de estafilococos
coagulase positiva. Para o cálculo do número de estafilococos coagulase positiva foi
utilizado: número de colônias características contadas na placa x % de colônias
confirmadas x o inverso da diluição utilizada para a contagem.
As colônias confirmadas como estafilococos coagulase positiva foram mantidas
em ágar triptona de soja (TSA) (Merck) sob refrigeração, para posterior identificação.
Para diferenciação dos estafilococos coagulase positiva (S. aureus, S. hyicus e S.
intermedius) foram empregados testes, propostos por Kloos & Bannerman (1990):
- a produção de acetoína foi verificada a partir de tubos com caldo à base de
glicose e peptona, que após 48 h de incubação a 37ºC, foram adicionados de 0,6mL de
α-naftol a 5% (p/v) em álcool absoluto e 0,2mL de hidróxido de potássio a 40%
(BARROW & FELTHAM, 1995);
26
- a utilização anaeróbica do manitol foi feita em tubos incubados em sistema
GasPak;
- a atividade da β-galactosidase foi determinada como descrito por Hendrickson
(1985), com o emprego do substrato 2-naftil-β-D-galactopiranosídeo, incubado com
suspensões das bactérias a 37ºC.
- para a identificação de colônias sensíveis à acriflavina, foram utilizadas placas
de petri contendo ágar P (PHILLIPS & NASH, 1985) (Anexo III) ou Baird-Parker,
adicionadas de solução de acriflavina (concentração final no meio de 7μg.mL
-1
,
conforme Devriese (1981). Placas com e sem acriflavina foram inoculadas com
suspensões de bactérias em caldo triptona de soja (TSB) (Merck), incubadas durante 24-
48h a 35ºC e avaliadas quanto à sensibilidade e resistência (BRITO, CAMPO &
BRITTO, 2002).
3.4 Avaliação da presença de Listeria sp.
O isolamento de Listeria monocytogenes foi realizado conforme Brasil (2003):
Uma amostra de 25g do alimento foi adicionada a 225mL de Caldo de
Enriquecimento para Listeria (UVM) (Difco) e colocados em sacos plásticos estéreis
(Bag Stomacher) os quais foram homogeneizados em “Stomacher” (Interscience)
durante 60 segundos e incubados a uma temperatura de 30°C por 24 horas.
A partir do Caldo de Enriquecimento para Listeria (UVM) (Difco), alíquotas de
0,1mL de cada amostra foram inoculadas em 9,9mL de caldo Fraser (Difco) e incubadas
a 35°C por 24 - 26 horas.
Após a incubação, com o auxílio de alça de platina, foram retiradas alíquotas de
cada tubo de enriquecimento seletivo e semeadas em meios seletivos indicadores: ágar
triptose (Merck) com ácido nalidíxico (ATN) e ágar Palcam (AP) (Difco) que foram
incubados por 24 – 48 horas a 35ºC. A seleção no ATN baseou-se nas características
das colônias, quando observadas sob luz oblíqua, em estereoscópio. No AP (Difco),
observou-se a não fermentação do manitol e a formação de esculetina pela hidrólise da
esculina, reação revelada pela presença de ferro trivalente.
Colônias características foram semeadas por esgotamento, em ágar triptose de
soja (Merck) acrescido de 0,6% de extrato de levedura (TSA-YE) e incubadas a 30
o
C
por 24 horas. As placas foram examinadas sob luz oblíqua e selecionadas as colônias
27
que apresentaram coloração azulada típica. As colônias foram transferidas para tubos
contendo TSA-YE inclinado e um tubo com caldo triptona de soja (Merck) com 0,6%
de extrato de levedura (TSB-YE). Estes tubos foram incubados a 30
o
C por 24 horas, a
partir dos quais foram realizados os testes bioquímicos para confirmação do
microrganismo.
Colônias que apresentaram crescimento típico foram submetidas à coloração de
Gram, teste da catalase e provas bioquímicas: TSI (Oxoid), vermelho de metila, Voges-
Proskauer (Oxoid), motilidade (SIM) (Merck), fermentação dos açúcares (glicose,
ramnose, manitol, xilose e maltose) e redução de nitrato, de acordo com Mac Faddin
(1980).
Isolados que apresentaram forma de cocobacilos Gram positivos, catalase
positiva e perfil bioquímico compatível com Listeria sp. foram submetidos ao Teste de
CAMP, realizado em placas contendo ágar sangue e inoculadas culturas de
Staphylococcus aureus (ATCC 49444) e Rhodococcus equi (ATCC 6939). Entre estas
culturas, foram semeadas as culturas suspeitas de Listeria sp.
Segundo Farber et al. (1994), as culturas de Listeria monocytogenes produzem
reação de hemólise discreta, porém nas proximidades da cultura de Staphylococcus
aureus, o halo torna-se maior e mais nítido.
3.5 Avaliação da presença de Salmonella sp.
A metodologia de análise da presença de Salmonella sp. adotada para este
trabalho foi previamente avaliada por Michael et al. (2003), constando de uma etapa de
pré-enriquecimento, seguida do enriquecimento seletivo e do isolamento das colônias
em meio sólido seletivo.
Uma amostra de 25g do alimento foi adicionada a 225mL de água peptonada
tamponada e colocada em sacos plásticos estéreis (Bag Stomacher) os quais foram
homogeneizados em “Stomacher” (Interscience) durante 60 segundos e incubados a
uma temperatura de 37°C por 24 horas.
A partir da água peptonada tamponada, alíquotas de 1mL e 0,1mL de cada
amostra foram inoculadas, respectivamente, em 9 mL de caldo Tetrationato Müller-
Kauffmann (TMK) (Difco) e em 9,9 mL de caldo Rappaport-Vassiliadis (Difco), e
incubadas em banho-maria a 42°C por 24 horas.
Após 24 horas de incubação, com o auxílio de alça de platina, foram retiradas
alíquotas de cada tubo de enriquecimento seletivo e semeadas em meios seletivos
28
indicadores: ágar Xilose Lisina Tergitol-4 (XLT-4) (Merck) e ágar Verde Brilhante
Vermelho de Fenol Lactose Sacarose (BPLS) (Merck) com Novobiocina 0,1%. Ambos
os meios foram incubados por 24 horas a 37°C.
Colônias suspeitas nos meios seletivos foram isoladas em ágar Triptona Soja
(TSA) (Merck) e, após a obtenção de culturas puras, foram submetidas a provas de
triagem. Foram utilizados o ágar Três Açúcares-Ferro (TSI) (Oxoid) e o ágar Lisina-
Ferro (LIA) (Oxoid) para a identificação inicial das colônias suspeitas. Todas as
amostras bacterianas que apresentaram perfil semelhante ao de Salmonella sp., nos
meios de triagem, foram submetidas a outras provas bioquímicas [uréia (Isofar),
fenilalanina (Difco), citrato (Biobrás), ONPG (o-nitrofenil-ß-D-galactopiranosídeo) e
SIM (produção de indol, H
2
S, motilidade) (Biobrás)] e aglutinação com soro somático
polivalente (PROBAC) para confirmação. Os meios foram preparados conforme
instruções do fabricante e interpretados conforme Mac Faddin (1980).
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1. Amostras fatiadas e embaladas em estabelecimentos comerciais de Porto
Alegre
4.1.1. Isolamento de Coliformes Totais e Termotolerantes
Das 300 amostras coletadas, divididas em 20 lotes por estabelecimento, 66,6%
foram positivas para coliformes totais. No estabelecimento A, 98% das amostras tinham
a presença de Coliformes Totais, enquanto nos estabelecimentos B e C, 35% e 67% das
amostras foram positivas, respectivamente. As contagens encontradas variaram entre
estabelecimentos e lotes amostrados, sendo a menor contagem (1,51 log
10
UFC.g
-1
)
observada no estabelecimento C e a maior (7,45 log
10
UFC.g
-1
) no estabelecimento A
(Anexo 1). Observa-se que no estabelecimento A, as medianas encontradas em todos os
lotes foram superiores aos dos demais estabelecimentos (Tabela 1), indicando que nesse
supermercado existiam maiores dificuldades quanto à higiene durante o processo de
fatiamento de apresuntado.
Como Coliformes Totais são bactérias consideradas ambientais, a limpeza e
sanificação dos equipamentos e utensílios de trabalho são passos fundamentais para
uma diminuição considerável de seu número nas amostras. A partir disso, pressupõe-se
que os processos inadequados referentes à higiene de superfícies adotados nos
estabelecimentos visitados permitiram que uma quantidade expressiva de bactérias fosse
transmitida cruzadamente aos alimentos ali manipulados.
Em alimentos processados, a presença de um número elevado de coliformes ou
de membros da família Enterobacteriaceae pode indicar processamento inadequado,
recontaminação pós-processamento, sendo os equipamentos sujos ou a manipulação
sem cuidados de higiene, as causas mais freqüentes (BANWART, 1989; FRANCO &
LANDGRAF, 2005), assim como a multiplicação durante o processamento ou
estocagem. A legislação federal vigente (BRASIL, 2001) não estabelece padrões para
bactérias mesófilas e coliformes totais, sendo estes microrganismos considerados
indicadores de condições higiênico-sanitárias inadequadas (FRANCO & LANDGRAF,
2005) durante o processo e fracionamento, podendo-se citar o fatiador e o manipulador
como potenciais fontes de contaminação (SERIO et al., 2007; SOUZA, SILVA &
SOUSA, 2004).
30
Tabela 1: Mediana (log
10
Unidades Formadoras de Colônia. g
-1
) de Coliformes Totais
em 20 lotes de apresuntado fatiado e embalado adquiridos em três supermercados (A, B,
C) de Porto Alegre em 2007.
Lote* Estabelecimento
A B C
1 5,11 2,18 2,56
2 6,74 2,58 3,09
3 7,18 Neg. 3,65
4 6,27 Neg. 2,28
5 5,40 2,31 3,66
6 5,87 2,30 4,12
7 6,11 4,02 5,00
8 6,80 5,72 5,17
9 4,38 4,80 3,33
10 6,18 Neg. Neg.
11 5,00 Neg. 3,45
12 5,66 Neg. Neg.
13 4,71 3,48 4,05
14 5,69 3,66 Neg.
15 5,11 2,50 3,97
16 4,56 2,33 2,79
17 6,11 3,52 1,62
18 4,97 Neg. 3,72
19 4,95 2,90 Neg.
20 5,28 2,46 3,43
*Lote corresponde a cinco amostras individuais de aproximadamente 50 g.
Os resultados verificados no presente estudo também encontram suporte nos
dados obtidos por Gottardi (2006) em ambientes de fatiamento de supermercados em
Porto Alegre, onde Coliformes Totais foram encontrados tanto em fatiadora de fiambres
(até 45,5 UFC.cm
-2
), quanto na superfície da mesa de manipulação desses produtos (até
6 UFC.cm
-2
).
A presença de Coliformes Termotolerantes acima do previsto na legislação
(>10
3
UFC.g-
1
) (BRASIL, 2001) foi detectada em amostras de apresuntado adquiridas
em todos os estabelecimentos (Tabela 2). Entretanto, os lotes amostrados no
estabelecimento B tiveram estatisticamente (P<0,05) menos amostras com Coliformes
Termotolerantes acima do limite previsto na legislação (BRASIL, 2001). Ao lado disso,
31
a única amostra de Coliforme Termotolerante do estabelecimento B não pôde ser
confirmada como sendo E. coli. Nos estabelecimentos A e C também foi observado que
nem todas as amostras com presença de Coliformes Termotolerantes acima do previsto
na legislação tiveram colônias confirmadas como E.coli, sendo os isolados obtidos
classificados como Klebsiella sp.
Tabela 2: Número de amostras de apresuntado fatiado e embalado adquiridos em três
supermercados de Porto Alegre (2007) com contagens de Coliformes Termotolerantes
acima do previsto na RDC 12* e com confirmação de presença de Escherichia coli.
Estabelecimento
Coliformes
Termotolerantes > 10
3
UFC.g
-1
E. coli
A
6 3
B
1 0
C
11 3
Total
18 6
UFC= Unidades Formadoras de Colônia
* RDC n° 12, de 2 de janeiro de 2001 (BRASIL, 2001).
Enquanto a presença de Coliformes Totais indica condições inadequadas de
higiene do ambiente de processamento e manipulação, a presença de Coliformes
Termotolerantes pode indicar contaminação durante o processo de fatiamento,
determinada pelo manipulador com hábitos de higiene insuficientes. No presente estudo,
houve concordância entre ambos os indicadores, uma vez que o estabelecimento B
apresentou visivelmente as melhores condições considerando ambos os grupos de
microrganismos. Ao contrário, no estabelecimento A, foram encontradas as contagens
mais elevadas de Coliformes Totais e observou-se, proporcionalmente, a maior presença
de E.coli dentre os Coliformes Termotolerantes. No estabelecimento C as contagens de
Coliformes Totais foram relativamente mais baixas quando comparadas ao
estabelecimento A, mas ocorreu um maior número de amostras positivas para
Coliformes Termotolerantes, a maioria não sendo identificadas como E. coli.
Alimentos contaminados com E. coli podem revelar ao consumidor contato
anterior do produto direta ou indiretamente, com o conteúdo fecal, sendo que a bactéria
pode estar presente no ambiente, tendo como origem o trato gastrintestinal. Ao analisar
32
resultados referentes à quantificação de coliformes termotolerantes, Souza, Silva &
Sousa (2004) verificaram que os maiores índices foram encontrados na superfície de
preparo e nas mãos dos manipuladores. Dessa forma, é possível que os manipuladores
tenham sido os responsáveis pela introdução desse grupo de microrganismos nas
amostras analisadas no presente estudo, uma vez que nas superfícies de manipulação e
nos equipamentos a presença de coliformes temotolerantes e E.coli não havia sido
reportada por Gottardi (2006), em supermercados de Porto Alegre.
Ayçiçek et al. (2004) encontraram 7,8% das mãos de manipuladores
contaminadas com E. coli. Souza, Silva & Sousa (2004) encontraram E. coli nas mãos
de funcionários e equipamentos de todos os estabelecimentos amostrados em sua
pesquisa em João Pessoa, PB, enquanto Lues & Tonden (2007), encontraram essa
bactéria em somente um manipulador, entre um total de 50 amostrados. Enquanto
Christison, Lindsay & Holy (2007) observaram que as contagens de coliformes nas
mãos de manipuladores e nas placas de corte foram significativamente mais elevadas do
que as contagens correspondentes obtidas dos utensílios de preparação.
Shojaei, Shooshtaripoor & Amiri (2006) demonstraram a eficácia da higiene
pessoal em manipuladores de alimentos, na redução da contaminação por agentes
potencialmente patogênicos. Neste estudo, a freqüência de E. coli das mãos dos
manipuladores diminuiu de 22% para 3,3% após a correta higienização.
Considerando o total de amostras analisadas, observa-se que 6% (18/300)
estavam fora dos padrões exigidos pela legislação brasileira. Em estudo semelhante
conduzido em Cruz Alta (RS), com amostras de salame produzido sob inspeção, Cereser
et al. (2007) verificaram que 4% de 50 amostras analisadas estavam em desacordo com
os parâmetros da legislação vigente. Ao lado da potencial capacidade da E. coli em
causar gastrenterites, a presença desse microrganismo nesses produtos oferecidos ao
consumidor demonstra a possibilidade de outros patógenos associados ao trato
gastrintestinal estarem presentes. Dessa forma, os presentes dados demonstram que os
consumidores podem estar expostos ao risco de doenças transmitidas por alimentos ao
adquirirem esse produto.
4.1.2. Isolamento de Staphylococcus coagulase positiva
Nas 100 amostras de apresuntado avaliadas em cada estabelecimento, observou-
se a presença de estafilococos coagulase positiva em 16% do total amostrado (Anexo 1).
Entretanto, considerando o limite de 10
3
UFC.g
-1
estabelecido pela legislação (BRASIL,
33
2001), observou-se que no Estabelecimento C, onde havia sido detectado o maior
número de produtos com contagens de coliformes termotolerantes acima do padrão
estabelecido, foi encontrada também a maior freqüência (18%) de amostras em
desacordo com a legislação. Por outro lado, os estabelecimentos A e B, apesar de terem
diferido de forma expressiva nas contagens de coliformes totais e termotolerantes,
apresentaram freqüência semelhante de amostras acima do padrão estabelecido para
estafilococos coagulase positiva (11 e 10%, respectivamente).
A presença de estafilococos coagulase positiva revela a inadequada manipulação
do alimento. Sendo o humano o responsável pela introdução de tal patógeno no
alimento, é presumível que este se encontre em determinados produtos que sofreram
manipulação. Nos estabelecimentos amostrados em Porto Alegre por Gottardi (2006),
detectaram-se falhas no que diz respeito ao processo de higienização, resultando em
utensílios e equipamentos contaminados. Entretanto, a presença de estafilococos
coagulase positiva foi verificada mais freqüentemente após o processo de higienização
das superfícies de trabalho, provavelmente introduzidos pelo contato com a mão dos
funcionários do setor. A alta rotatividade de manipuladores de alimentos, na maioria dos
estabelecimentos, resultando em treinamento inadequado de pessoal, pode ser uma das
razões para as falhas detectadas pelo presente estudo.
Soto et al. (1996) e Van Den Bergh et al. (1999) demonstram que entre 20 e
55% de adultos saudáveis carreiam S. aureus na suas fossas nasais, e Raddi, Leite &
Mendonça (1988) consideram essa área o principal reservatório de estafilococos no
homem e a incidência na população é tal que parece ser impossível sua eliminação.
Acco et al. (2003) isolaram S. aureus em 30% de um total de 47 manipuladores de
alimentos de indústria de cereais e geléia de frutas em Porto Alegre (RS), resultado
muito parecido ao de Figueroa et al. (2002). André et al. (2008), em um total de 92
amostras de mãos e fossas nasais, coletadas de uma equipe de funcionários em uma
fábrica de produtos lácteos, encontraram respectivamente, 30,4% e 32,6% de amostras
com a presença de S. aureus.
S. aureus é a bactéria mais isolada a partir de mucosa nasal e mãos na maioria
dos estudos conduzidos (RADDI, LEITE & MENDONÇA1988; AYÇIÇEK et al.,
2004; BRESOLIN, DALL’STELLA & FONTOURA-DA-SILVA, 2005; LUE &
TONDES, 2007). Shojaei, Shooshtaripoor & Amiri (2006) observaram uma redução
significativa na contaminação por esta bactéria nas mãos dos manipuladores quando
estes foram treinados para realização de higiene pessoal rigorosa, enquanto que
34
Bresolin, Dall’stella & Fontoura-da-Silva (2005) constataram que S. aureus não foi
eliminado das mãos pelo procedimento de lavagem adotado pelos manipuladores em
41,1% dos casos, sendo que em 21,1%, a bactéria apareceu na mão após esse
procedimento, indicando que houve recontaminação.
Apesar de S. aureus ser o principal representante dos estafilococos coagulase
positiva encontrados em alimentos, outras espécies desse gênero (S. intermedius e
S.hyicus) também podem estar presentes, o que foi efetivamente observado no presente
estudo. Ao lado disso, observa-se que de uma mesma amostra houve o isolamento
concomitante de S. aureus, S intermedius e S. hyicus (Figura 1). Esses dados
evidenciam uma recontaminação dos produtos via manipulador e utensílios e uma
contaminação cruzada, hipótese relacionada ao processamento de produtos crus e
cozidos em mesmo equipamento.
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Estabelecimento A Estabelecimento B Estabelecimento C
número de amostras
Staphylococcus coagulase positiva S. aureus S. intermedius S. hyicus
Figura 1. Número de isolados de acordo com a espécie de estafilococos coagulase
positiva encontrados em amostras de apresuntado fatiado e embalado em três
supermercados de Porto Alegre, 2007.
A ocorrência de S. intermedius no produto pode sugerir um prévio contato do
manipulador com animais portadores, ou ainda, contato direto de animais com o
ambiente de manipulação. S. intermedius é considerado um microrganismo patogênico
de interesse veterinário (OLIVEIRA, 2000), encontrado como parte da microbiota da
pele, cavidades orais e nasais de cães, visons, eqüinos e gatos, que pode causar
infecções cutâneas, urinárias, ósseas e do sistema nervoso central, em várias espécies
35
animais (JAY, 2005; KONEMAM et al. 2001). Segundo Jay (2005), S. intermedius,
assim como S. aureus, apresenta a capacidade de produzir enterotoxinas. Khambati,
Bebbet & Shah (1994) relacionaram esse microrganismo com vários surtos de
intoxicação alimentar, principalmente envolvendo produtos de origem animal. No
entanto, Talan et al. (1989), pesquisando esse microrganismo em 144 humanos expostos
frequentemente a cães, isolou somente uma amostra de S. intermedius na nasofaringe,
concluindo que a colonização das mucosas de humanos por essa bactéria não é comum.
S. hyicus, assim como S. intermedius, é considerado um patógeno de
interesse veterinário (OLIVEIRA, 2000), encontrado, principalmente em suínos e
bovinos, freqüentemente associado à epidermite exudativa, uma doença que acomete
suínos lactentes e recém desmamados. Não há relatos na literatura do envolvimento
dessa espécie em intoxicações alimentares. A hipótese sugerida para o isolamento de S.
hyicus nos produtos amostrados que sofrem tratamento térmico na indústria, é que estes
possam ter sido contaminados cruzadamente por outros produtos, inclusive queijos.
Neste caso, produtos que não sofreram tratamento térmico podem ter sido fatiados e
manipulados nos mesmos utensílios posteriormente utilizados para o processamento dos
apresuntados, deixando nestes uma carga microbiana, incluindo o S. hyicus.
4.1.3. Isolamento de Listeria monocytogenes
No presente estudo, dos 60 “pools” de amostras analisadas para presença de
Listeria sp. 16 (26,6%) foram positivas. No estabelecimento A, predominaram amostras
identificadas como L. monocytogenes, enquanto no estabelecimento C, L. innocua foi
mais isolada. Já no estabelecimento B o número de amostras contaminadas com L.
monocytogenes e L. innocua foi igual (Figura 2).
A presença de Listeria sp. está diretamente relacionada às condições higiênicas
do local de processamento dos alimentos, sendo que é capaz de permanecer no
ambiente, sobrevivendo e multiplicando-se em condições adversas. Houve concordância
entre elevadas contagens de Coliformes Totais e presença de Listeria sp. (Anexo I).
Estes resultados podem ser justificados por ambas as bactérias terem como habitat
principal o ambiente. Desta forma, torna-se evidente que o processo de higienização
inadequado utilizado pelos estabelecimentos propiciou contaminação do produto com
um agente causador de DTA.
36
0
1
2
3
4
5
Estabelecimento A Estabelecimento B Estabelecimento C
"pools"
L. monocytogenes L.grayii L. innocua
Figura 2. Número de “pools” de amostras de apresuntado fatiado positivas para espécies
de Listeria sp. em três supermercados de Porto Alegre, 2007.
Apesar dos produtos lácteos serem os mais frequentemente associados à
presença de L. monocytogenes (JAY, 2005) existem vários relatos na literatura sobre o
isolamento desse agente em produtos cárneos. Da mesma forma, o processamento e o
armazenamento como fatores que favorecem a introdução e multiplicação de Listeria
sp. em alimentos cárneos já foram amplamente documentados.
UYTTENDAELE, DE TROY & DEBEVERE (1999) encontraram 1,4% e
6,14% de amostras de presunto cozido positivas antes e depois do fatiamento,
respectivamente, sugerindo uma contaminação durante o processo de fatiamento.
Sergelidis et al. (1997) pesquisaram Listeria sp. em plantas de processamento de
produtos cárneos, encontrando dentre 22 refrigeradores amostrados, uma e oito amostras
positivas para L monocytogenes e L. innocua, respectivamente. No mesmo estudo, L.
monocytogenes foi isolada de um manipulador, dentre 22 amostrados. Em pesquisa
realizada por Azevedo et al. (2005) em Portugal, foram encontradas L. monocytogenes e
L. innocua em três e um dos 86 refrigeradores domésticos analisados, respectivamente.
Estes estudos demonstram a viabilidade de Listeria sp. no ambiente de processamento,
além da importância do fator refrigeração para o crescimento deste gênero.
Assim como no presente estudo, um dos aspectos mais preocupantes
relacionados à presença de L. monocytogenes é que, os produtos contaminados serão
consumidos sem tratamento térmico, o qual destruiria a bactéria. Investigando produtos
cárneos cozidos prontos para consumo, Gibbons et al. (2006) encontraram quatro de 11
amostras contaminadas com Listeria spp., das quais destas duas foram classificadas
como L. monocytogenes. Frizzo et al. (2003) encontraram 22 amostras positivas entre
37
39 analisadas, das quais 54,28% foram classificadas como L. monocytogenes. Este
patógeno também foi encontrado por Cordano & Rocourt (2001) e Thevenot et al.
(2005), em salsichas secas cruas no Chile e na França, respectivamente, na proporção de
10,6% e 10%. Nos Estados Unidos, 22,9% de produtos suínos de criação caseira e
amostras de salsichas estavam contaminadas por este patógeno (DUFFY et al, 2001), e
Farber & Daley (1994) encontraram L. monocytogenes em sete de 101 amostras de patês
analisados. Tobia, Mengoni & Pellon (1997) analisaram 30 amostras de embutidos
termoprocessados embalados a vácuo, conservados refrigerados e que são consumidos
sem cocção provenientes de estabelecimentos comerciais na Argentina, encontrando
16,7% positivas para L. monocytogenes. Em uma pesquisa com produtos prontos para o
consumo, Christison, Lindsay & Holy (2007) encontraram 4% de amostras positivas
para L. monocytogenes. Araújo et al. (2007) encontraram todas as cinco amostras de
lingüiça mista tipo frescal contaminadas com L. monocytogenes e L. innocua.
No presente estudo L. innocua foi encontrada em proporção maior à L.
monocytogenes, o que também ocorreu nos estudos de Sergelidis et al. (1997). Yokota
et al. (2007) não isolaram L. monocytogenes em 83 amostras de produtos cárneos
comercializados no Distrito Federal, no entanto, foi detectada a presença de L. innocua
em cinco amostras, o que pode ser considerado indicativo do risco de L. monocytogenes
estar contaminando o alimento, visto que possuem o mesmo habitat (DUARTE, 2005;
CZAJA, et al., 1993). Fatores como estresse, número inicial relativo de ambas as
bactérias e seleção das colônias somente de L. innocua, visto que são semelhantes,
podem estar relacionados com a não detecção de L. monocytogenes (RYSER &
DONNELLY, 2001).
L. monocytogenes é um patógeno implicado em vários surtos de doenças
transmitidas por alimentos. Embora a listeriose tenha sido freqüentemente relacionada
com o consumo de produtos lácteos, surtos na década de 80 envolveram produtos
cárneos (SCHWARTZ et al., 1988). Estudos retrospectivos de 10 anos na França
revelaram que os produtos cárneos de origem suína estão envolvidos mais
frequentemente em surtos do que os produtos lácteos naquele país (LECLERC et al.,
2002). No presente estudo, presunto suíno cozido mostrou ser um veículo potencial para
a transmissão de L. monocytogenes aos consumidores, especialmente aqueles
pertencentes a grupos de risco.
38
4.1.4. Isolamento de Salmonella sp.
Salmonella sp. não foi isolada nos produtos fatiados amostrados em
estabelecimentos de Porto Alegre. Este resultado pode ser atribuído ao fato de os
produtos amostrados sofrerem tratamento térmico na indústria, que destrói a
Salmonella. A recontaminação durante o processo de manipulação requereria
manipuladores portadores assintomáticos e/ou contaminação cruzada com produtos crus
com a presença da bactéria. Em ambos os casos, supõem-se que seria introduzido um
baixo número de bactérias e, uma vez que Salmonella sp. não apresenta boa capacidade
de multiplicação na temperatura de refrigeração (JAY, 2005), possíveis contaminações
ocorridas passaram desapercebidas. Ao lado disso, Salmonella sp. não é uma boa
competidora, sendo inibida nos casos em que há uma microbiota interferente no
produto. Dessa forma, no presente estudo não pode ser descartada a possibilidade de
que a elevada presença de Coliformes Totais possa ter prejudicado o isolamento de
Salmonella sp.
Produtos prontos para o consumo têm sido reportados como contaminados por
Salmonella sp., enfatizando o risco do consumidor frente a esses alimentos (TSUJI et al,
2002; FAUSTINI, ROSSI & PERUSSI, 2003). Em estudo realizado com produtos
prontos para o consumo, Christison, Lindsay & Holy (2007) no sul da África,
encontraram 16% de positividade para Salmonella sp. Fai et al. (2004), pesquisando
Salmonella sp. em presuntos cozidos comercializados em Fortaleza (CE), encontraram
30% de amostras positivas. Sabendo-se que o processo de cozimento do presunto
destrói essa bactéria, sua presença no produto pode ser atribuída a contaminações
cruzadas durante o manuseio e fatiamento, como pode ser também verificado na
pesquisa realizada por Arumugaswamy et al. (1995), onde alguns alimentos cozidos,
prontos para o consumo, comprados de vendedores de rua estavam contaminados por
Salmonella sp..
Cereser et al. (2007) não encontraram amostras positivas para Salmonella sp.
nos salames analisados em estudo realizado em Cruz Alta (RS), resultado semelhante
ao de Salvatori, Bessa & Cardoso (2003) em Porto Alegre (RS), enquanto Mürmann,
Santos e Cardoso (2005) reportaram 25% de lingüiça frescal de carne suína com
presença de Salmonella sp., na mesma cidade.
39
4.2. Amostras fatiadas e embaladas industrialmente e comercializadas em Porto
Alegre
Este estudo partiu da hipótese que produtos fatiados provenientes da indústria
apresentariam uma carga microbiana baixa, já que sofreram processamento térmico em
sua origem. Dessa forma a hipótese levantada foi que os produtos teriam sido
contaminados durante o processamento e manipulação no estabelecimento comercial.
Para confirmar essa hipótese foram adquiridos apresuntados embalados na indústria e
comercializados nos mesmos estabelecimentos incluídos no estudo.
Das 54 amostras coletadas, 35,2% foram positivas para coliformes totais, sendo
que no Sistema de Inspeção Federal observou-se um número inferior de amostras
contaminadas (23,3%) (Anexo II), justificando a hipótese de que ocorre a introdução de
microrganismos durante o processo de fatiamento e manipulação nos estabelecimentos
comerciais. As contagens encontradas foram variadas entre os sistemas, sendo a menor
contagem (1,34 log
10
.g
-1
) observada em um produto sob SIF e a maior (3,54 log
10
.g
-1
)
em uma amostra de produto sob CISPOA ( Anexo II).
Somente uma amostra apresentou L. monocytogenes e Coliformes
Termotolerantes (tabela 3), sugerindo uma contaminação pós-processamento na
indústria. Fica evidente que o nível de isolamento desses microrganismos foi muito
inferior ao encontrado em produtos fracionados nos supermercados, corroborando a
hipótese de que os mesmos foram introduzidos durante o processamento no comércio.
Ao avaliar a contaminação de produtos por estafilococos coagulase positiva e S.
aureus, observa-se que os índices de isolamento foram semelhantes aos que haviam sido
encontrados nos produtos fracionados no comércio. Entretanto, as freqüências de
isolamento concentraram-se nos produtos originados de indústrias sob inspeção
estadual, tradicionalmente de menor porte e, muitas vezes, com procedimentos de boas
práticas de fabricação deficientes.
Nessa etapa também houve a pesquisa de Salmonella sp., encontrando-se duas
amostras positivas entre os produtos originados de indústria sob Inspeção Federal. A
presença de Salmonella sp. em suínos ao abate e produtos de origem suína tem sido
reportada no Brasil (BESSA, COSTA & CARDOSO, 2004; CASTAGNA et al., 2004;
MURMANN, SANTOS & CARDOSO, 2006), entretanto esse é o primeiro relato de
isolamento em apresuntado. Uma vez que se trata de um produto submetido a
tratamento térmico, provavelmente houve uma recontaminação do produto após o
40
processamento, o que alerta para a necessidade de constante monitoramento dos pontos
críticos de controle, mesmo em indústrias com programas de APPCC instalados.
Tabela 3. Número de amostras positivas para determinados patógenos em relação ao
Sistema de Inspeção submetido.
Amostras
L. monocytogenes*
Coliformes
Termotolerantes**
Staphylococcus
coagulase
positiva**
S.
aureus
Salmonella
sp*.
Inspeção
Federal
30 0 0 2
2 2
Inspeção
Estadual
24 1 1 5
5 0
* “Pools” de amostras.
** Amostras acima do limite considerado aceitável pela legislação vigente.
5 CONCLUSÃO
Nos estabelecimentos avaliados neste estudo estavam sendo comercializados
apresuntados fatiados com elevado número de microrganismos indicadores e presença
de Listeria sp., indicando que a manipulação e fatiamento de produtos podem ser um
ponto adicional de contaminação dos alimentos, e a necessidade de otimização dos
protocolos de higienização nesses setores do comércio para aumentar a segurança dos
produtos processados.
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Applied and Environmental Microbiology. Washington, v.67, n.12, p.5431-5436,
2001.
Anexo I
Resultados obtidos na avaliação do estabelecimento A
Coleta Coliformes Totais Log(10) Coliformes Termorolerantes
E. coli
Estafilococos coag. + Log(10)
Listeria sp.
1 7.150.000 6,85 0 0
1 287.555 5,46 0 0
1 10.000 4,00 0 0
1 7.000 3,85 0 0
1 129.500 5,11 0 0
2 5.100.000 6,71 0 0
2 5.550.000 6,74 0 0
2 4.500.000 6,65 0 0
2 23.400.000 7,37 0 0
2 5.600.000 6,75 0 0
3 15.000.000 7,18 0 0
3 16.000.000 7,20 0 0
3 18.000.000 7,26 0 0
3 10.000.000 7,00 0 0
3 13.400.000 7,13 0 0
4 1.980.000 6,30 0 0
4 760.000 5,88 0 0
4 1.950.000 6,29 0 0
4 300.000 5,48 0 0
4 1.865.000 6,27 0 0
5 250.000 5,40 0 0
5 330.000 5,52 0 0
5 310.000 5,49 0 0
5 202.000 5,31 0 0
5 179.000 5,25 0 0
6 720.000 5,86 0 0
6 825.000 5,92 0 0
6 740.000 5,87 0 0
6 600.000 5,78 0 0
6 830.000 5,92 0 0
7 1.290.000 6,11 0 0
7 1.110.000 6,05
1.110.000
0
7 1.260.000 6,10 0 0
7 8.000.000 6,90
8.000.000 P 16.100.000
7,21
7 7.600.000 6,88 0 0
8 3.000.000 6,48 0 0
8 3.850.000 6,59 0 0
8 27.900.000 7,45 0 0
8 6.400.000 6,81 0 0
8 6.300.000 6,80 0 0
9 30.000 4,48 0 0
9 23.000 4,36 0 0
9 24.000 4,38 0 0
9 158.000 5,20 0 0
9 21.000 4,32 0 0
10 39.000 4,59 0 0
10 1.800.000 6,26 0 0
10 2.170.000 6,34 0
760.000
5,88
10 1.500.000 6,18 0
300.000
5,48
10 234.000 5,37 0 0
P
P
P
P
62
Continuação Anexo I
Resultados obtidos na avaliação do estabelecimento A
Coleta Coliformes Totais Log(10) ColiformesTermotolerantes
E. col
i
Estafilococos coag. + Log(10)
Listeria sp.
11 66.000 4,82 0 0
11 100.000 5,00 0 0
11 207.000 5,32 0 0
11 151.500 5,18
151.500
0
11 80.000 4,90 0 0
12 1.195.000 6,08 0 0
12 460.000 5,66 0 0
12 1.340.000 6,13 0 0
12 290.000 5,46 0 0
12 Ausente 0
480.000
5,68
13 40.500 4,61 0
330.000
0,00
13 51.500 4,71 0 0
13 800.000 5,90 0 0
13 30.000 4,48
30.000 P
0
13 700.000 5,85 0 0
14 520.000 5,72 0 0
14 376.000 5,58 0 0
14 492.000 5,69 0 0
14 810.000 5,91 0 0
14 135.500 5,13 0 0
15 91.000 4,96 0 0
15 133.000 5,12 0 0
15 187.000 5,27 0
890.000
5,95
15 128.000 5,11 0 0
15 89.000 4,95 0 0
16 20.000 4,30 0 0
16 36.000 4,56 0 0
16 48.000 4,68 0 0
16 23.000 4,36 0 0
16 38.000 4,58 0 0
17 1.170.000 6,07 0 0
17 1.350.000 6,13 0 0
17 1.500.000 6,18 0
265.000
5,42
17 1.300.000 6,11 0
795.000
5,90
17 1.270.000 6,10 0
875.000
5,94
18 73.000 4,86 0 0
18 180.000 5,26
180.000 P
0
18 137.500 5,14 0 0
18 72.000 4,86 0 0
18 94.000 4,97 0 0
19 98.000 4,99 0 0
19 67.000 4,83 0 0
19 93.000 4,97 0 0
19 89.000 4,95 0 0
19 58.000 4,76 0 0
20 260.000 5,41 0
200.000
5,30
20 Ausente 0
150.000
5,18
20 190.000 5,28 0 0
20 475.000 5,68
475.000
0
20 150.000 5,18 0 0
P
P
P
63
Continuação Anexo I
Resultados obtidos na avaliação do estabelecimento B
Coleta Coliformes Totais Log(10) ColiformesTermotolerantes E. col
i
Estafilococos coag. + Log(10) Listeria sp.
1 450 2,65 0
1 100 2,00 0
1 150 2,18 0
1 123 2,09 0
1 590 2,77 0
20 0
2 7.050 3,85 0
20 0
20 0
20 0
30 0
30 0
30 0
30 0
30 0
40 0
40 0
40 0
40 0
4 580.000 5,76 0
50 0
5 3.100 3,49 0
5 205 2,31 0
50 2.750 3,44
50 0
60 0
60 0
60 0
60 0
60 0
70 0
70 0
70 47.500 4,68
70 0
70 0
80 0
80 0
80 0
80 0
80 0
90 0
9 175.000 5,24 0
9 62.500 4,80 0
90 0
9 278.000 5,44 0
10 0 0
10 0 0
10 0 0
10 0 0
10 0 0
P
64
Continuação Anexo I
Resultados obtidos na avaliação do estabelecimento B
Coleta Coliformes Totais Log(10) ColiformesTermotolerantes
E. col
i
Estafilococos coag. + Log(10)
Listeria sp.
11 0 0
11 0 0
11 0 0
11 0 5.100 3,71
11 0 0
12 0 0
12 0 0
12 0 0
12 0 0
12 0 0
13 0 0
13 5.350 3,73 0
13 0 0
13 3.000 3,48 0
13 6.200 3,79 0
14 0 10.300 4,01
14 2.500 3,40
5.100
3,71
14 4.550 3,66 0
14 8.750 3,94 0
14 11.920 4,08 12.200 4,09
15 0 0
15 315 2,50 0
15 0 0
15 0 0
15 0 0
16 280 2,45 261.000 5,42
16 0 140.000 5,15
16 0 250.000 5,40
16 215 2,33 180.000 5,26
16 0 240.000 5,38
17 3.300 3,52 0
17 2.600 3,41 440 2,64
17 1.800 3,26 240 2,38
17 7.000 3,85 0
17 3.700 3,57 0
18 0 0
18 0 0
18 0 0
18 0 0
18 0 0
19 330 2,52 0
19 700 2,85 0
19 1.110 3,05 0
19 800 2,90 0
19 900 2,95 0
20 0 2.300 3,36
20 0 2.000 3,30
20 275 2,44 1.450 3,16
20 1.385 3,07 1.385 0
20 675 2,83 0
P
P
P
65
Continuação Anexo I
Resultados obtidos na avaliação do estabelecimento C
Coleta Coliformes Totais Log(10) Coliformes Termotolerantes E. coli Estafilococos coag.+ Log(10)
Listeria sp.
1 760 2,88 0
1 256 2,41 0
1 124 2,09 0
1 365 2,56 0
1 756 2,88 0
2 1.820 3,26 1820 0
2 410 2,61 410 0
2 2.780 3,44 0
2 1.240 3,09 0
2 945 2,98 945 0
3 4.800 3,68 0
3 4.450 3,65 0
3 3.300 3,52 0
3 1.745 3,24 1.745 P 0
3 26.000 4,41 0
40 0
4 37.500 4,57 0
4 405 2,61 1.700 3,23
40 0
402,28 0
5 55.500 4,74 0
5 105.500 5,02 0
5 2.200 3,34 0
5 3.450 3,54 5.000 3,70
5 4.550 3,66 0
6 13.450 4,13 95.000 4,98
6 2.600 3,41 0
60 0
6 13.200 4,12 0
6 2.600 3,41 0
7 99.000 5,00 99.000 0
7 288.000 5,46 288.000 0
7 141.000 5,15 141.000 0
7 22.000 4,34 22.000 0
7 58.500 4,77 58.500 P 0
8 149.000 5,17 570.000 5,76
80 0
80 0
80 0
80 0
90 0
90 0
90 0
90 0
90 0
10 0 0
10 0 0
10 0 0
10 0 0
10 4.500 3,65 0
P
P
P
P
66
Continuação Anexo I
Resultados obtidos na avaliação do estabelecimento C
Coleta Coliformes Totais Log(10) ColiformesTermotolerantes
E. col
i
Estafilococos coag. + Log(10)
Listeria sp.
11 2.850 3,45 0
11 1.550 3,19 0
11 3.500 3,54 0
11 1.650 3,22 0
11 7.350 3,87 0
12 0 1.150 3,06
12 0 0
12 0 0
12 0 0
12 0 0
13 13.000 4,11 0
13 11.200 4,05 0
13 2.000 3,30 0
13 8.700 3,94 0
13 12.450 4,10
4.950
3,69
14 0
6.800
3,83
14 0 0
14 0
13.000
4,11
14 0 0
14 0
10.200
4,01
15 9.300 3,97
9.300
3,97
15 12.700 4,10
20.000
4,30
15 8.750 3,94 0
15 11.450 4,06
7.700
3,89
15 8.300 3,92 0
16 1.170 3,07 0
16 510 2,71 0
16 555 2,74 555
P
0
16 620 2,79 0
16 695 2,84 0
17 515 2,71 2.850 3,45
17 40 1,60
3.500
3,54
17 32 1,51 0
17 42 1,62
5.150
3,71
17 63 1,80
4.350
3,64
18 5.250 3,72 0
18 9.800 3,99 0
18 3.450 3,54
3.450
0
18 3.300 3,52 0
18 0 0
19 0 0
19 0 0
19 0 0
19 0 0
19 0 0
20 4.050 3,61
54.500
4,74
20 2.700 3,43
32.000
4,51
20 1.200 3,08
23.000
4,36
20 4.100 3,61
72.000
4,86
20 1.975 3,30
64.000
4,81
P
Anexo II
Resultados obtidos na avaliação de apresuntados de indústria com SIF
Coleta Coliformes Totais Log (10) Coliformes Termotolerantes Estafilococos coag. + Log (10)
Listeria sp. Salmonella sp.
10 0
10 0
10 0
10 0
10 0
20 0
222 1,34
3.000
3,48
20 0
2 89 1,95 850 2,93
2 120 2,08 980 2,99
30 0
30 0
30 0
30 0
30 0
40 0
40 0
4 260 2,41 1.500 3,18
4 98 1,99 680 2,83
40
3.500
3,54
50 0
50 0
50 0
50 0
50 0
689 1,95 0
6 156 2,19 0
60 1.200 3,08
60 0
60 0
P
P
68
Continuação do Anexo II
Resultados obtidos na avaliação de apresuntados de indústria com CISPOA
Coleta Coliformes Totais Log (10) Coliformes Termotolerantes Estafilococos coag. + Log (10)
Listeria sp. Salmonella sp.
10 1.305 3,12
1 850 2,93 1.350 3,13
1 980 2,99 3.520 3,55
1 1.170 3,07 0
10 0
20 0
20 5.300 3,72
20 0
2 515 2,71 1.500 3,18
20 0
3 962 2,98
3.560
3,55
30 4100 0
3 82 1,91 220 2,34
3 63 1,80 185 2,27
4 250 2,40 0
4 300 2,48 0
40 0
4 120 2,08 0
40
3500
3,54
50 365 2,56
5 3.450 3,54 280 2,45
50 0
5 3.000 3,48 3350 3,53
50 0
P
Anexo III
Agar P
Peptona 10g
Extrato de levedura 5g
Cloridrato de sódio 5g
Glicose 1g
Agar 15g
Água destilada 1L
pH final 7,5 (antes de autoclavar)
Autoclavar a 121°C por 15 min.
70
Catalogação na Publicação
UFRGS/ICBS/Biblioteca Setorial
M922a Mottin, Vanessa Daniele
Avaliação microbiológica de apresuntados, fatiados e comercializados
em
supermercados de Porto Alegre, RS / Vanessa Daniele Mottin. – 2008.
Dissertação (mestrado) – Universidade Federal do Rio Grande do Sul.
Instituto de Ciências Básicas da Saúde. Programa de Pós-Graduação em
Mi-
crobiologia Agrícola e do Ambiente. Porto Alegre, BR-RS, 2008.
Orientação: Profa. Marisa Ribeiro de Itapema Cardoso
1.Microbiologia de alimentos. 2. Contaminação de alimentos. 3.
Apresun-
tados. 4. Fiambres. 5. Higienização. 6. Supermercados. Porto Alegre (RS)
I. Cardoso, Marisa Ribeiro de Itapema, orient. II. Título.
CDU
579.68(043)
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