Download PDF
ads:
Avaliação
i
n
vitr
o
da viabilidade de
E
nterococcus
faecalis
e
Candida albicans
nos túbulos dentinários após
a aplicação de hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2%
Bauru
2007
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia de Bauru, Universidade de São
Paulo, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em
Odontologia, na área de Endodontia.
RONAN JACQUES REZENDE DELGADO
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
ads:
Avaliação
in vitro
da viabilidade de
Enterococcus
faecalis
e
Candida albicans
nos túbulos dentinários após
a aplicação de hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2%
RONAN JACQUES REZENDE DELGADO
Dissertação apresentada à Faculdade de
Odontologia de Bauru, da Universidade de São
Paulo, como parte dos requisitos necessários
para obtenção do título de Mestre em
Odontologia, área de Endodontia.
Orientador: Prof. Dr. Norberti Bernardineli
Bauru
2007
Delgado, Ronan Jacques Rezende
D378a Avaliação in vitro da viabilidade de Enterococcus
faecalis e Candida albicans nos túbulos dentinários
após a aplicação de hidróxido de cálcio e clorexidina
gel 2%/ Ronan Jacques Rezende Delgado -- Bauru,
2007. xxviii, 184 p. : il. ; 30 cm.
Dissertação (Mestrado) -- Faculdade de
Odontologia de Bauru. Universidade de São Paulo.
Orientador: Prof. Dr. Norberti Bernardineli
Autorizo, exclusivamente pra fins acadêmicos e científicos, a
reprodução total ou parcial desta tese, por processos
fotocopiadores e/ou meios eletrônicos.
Assinatura do autor:
Data: 23/05/07
Comitê de Ética no Ensino e Pesquisa em Animais da FOB-
USP: projeto de pesquisa aprovado em 20 de setembro de
2005.
Número do protocolo: 28/2006
Ronan Jacques Rezende Delgado
Dados Curriculares
02 de julho de 1978
Belo Horizonte - MG
Nascimento
Romeu Jacques Delgado
Maria do Rosário Rezende Delgado
Filiação
Graduação em Odontologia pela
Universidade Federal de Minas Gerais
1997 - 2001
Aperfeiçoamento em Endodontia pelo
Centro de Odontologia Avançada de
Belo Horizonte – MG
2002 - 2002
Especialização em Endodontia pela
Faculdade de Odontologia de Bauru da
Universidade de São Paulo
2003 - 2004
Mestrado em Endodontia pela Faculdade
de Odontologia de Bauru da
Universidade de São Paulo.
2005 - 2007
CROMG – Conselho Regional de
Odontologia de Minas Gerais
SBPqO – Sociedade Brasileira de
Pesquisa Odontológica
ABOMG – Associação Brasileira de
Odontologia Seção de Minas Gerais.
Associações
iii
“Vence na vida
q
uem diz sim”
Chico Buar
q
ue e Rui Guerra
Dedicatória
______________________________________________________________________
Dedicatória
A Minha Queridíssima Mãe...
.
..Meu Maior
E
xem
p
lo...
“Tu és a mais bela composição divina,
De grandeza inexplicável e superioridade
absoluta.
Tu alternas e temperas
A guerreira e o anjo,
A firmeza e a ternura
A força e a sensibilidade
O poder e o amor.
Estás sempre ali,
Protegendo estes filhos teus
Que para ti, são trunfos, glórias.
Amas mais e sempre,
E este teu amor nos conforta
E nos enche da coragem necessária
Para seguirmos em frente.
Acabas por fim,
Sendo o retrato vivo da perseverança,
Da esperança
E da luta por um mundo melhor.”
Minha querida mãe, mais uma etapa se cumpriu e novamente
nada disso seria possível sem o seu apoio e sua presença. Tê-la
por perto nos trás segurança e confiança para seguirmos sempre
em frente. A sua personalidade forte e intensa ilumina a todos,
nos abastece de energia e nos enche de coragem para nunca
recuar. Durante estes dois anos os desafios foram muitos e a
saudade enorme. Obrigado pela confiança em mim depositada e
por compreender minha ausência nestes anos tão difíceis.
Agradeço pela doação extremada superando inúmeras
dificuldades, para que seus filhos realizassem seus sonhos. A
senhora sempre nos transmitiu valores como a dedicação ao
trabalho, a honestidade e o respeito ao semelhante. Esta vitória
também é sua. Amo-te eternamente.
______________________________________________________________________
vi
Ao Meu
Q
uerido PAI (in memoriam)
“Enquanto houver você do outro lado
Aqui do outro eu consigo me orientar
A cena repete a cena se inverte
enchendo a minha alma d'aquilo que outrora
eu deixei de acreditar
tua palavra, tua história
tua verdade fazendo escola
e tua ausência fazendo silêncio em todo lugar
metade de mim
agora é assim
de um lado a poesia o verbo a saudade
do outro a luta, a força e a coragem pra chegar no fim
e o fim é belo incerto... depende de como você vê
o novo, o credo, a fé que você deposita em você e só
Só enquanto eu respirar
Vou me lembrar de você”
O Anjo mais velho
O Teatro Mágico
Mais um dia especial e importante pra mim e o senhor novamente não está
aqui presente pra me abraçar. Justo você que sempre se desdobrou para dar
a mim e ao meu irmão tudo que precisávamos. Justo na hora de colher os
frutos de tanto trabalho, você não está aqui para desfrutar de uma vitória
que também é sua. Infelizmente não houve tempo, o inevitável nos separou.
Já se passaram 8 anos de sua ausência e continuamente diversas situações
do dia-dia me remetem ao senhor. Não há um único dia em que você não
povoe meus pensamentos. A sua origem simples e a juventude difícil, de
muito sacrifício, mostraram-lhe que a educação seria a única alternativa
honesta para busca de um futuro melhor. Agradeço por sempre acreditar
incondicionalmente em mim. Obrigado por transformar minhas pequenas
vitórias em grandes acontecimentos, a fim de reforçar o meu potencial e
estimular minha autoconfiança. O senhor estará sempre presente em minha
memória e em meu coração.
______________________________________________________________________
vii
______________________________________________________________________
Dedicatória
Ao Meu Queridíssimo Irmão....
Agradeço por compreender meu sonho e minha ausência, respeitando
minhas decisões, e por ajudar, a sua maneira, sempre que preciso. Agradeço
especialmente por ter segurado toda a barra destes anos difíceis que nossa família
passou. Obrigado por sempre me receber de forma alegre e carinhosa em minhas
idas a BH. Tenho enorme carinho, respeito e consideração por você.
“Dois irmãos,
q
uando vai alta a madrugada
E a teus pés vão-se encontrar os instrumentos
Aprendi a respeitar tua prumada
E a desconfiar do teu silêncio”
Morro dois irmãos / Chico Buarque
A Minha Queridíssima Karina Simone....
Obrigado por estar sempre disponível, por me escutar sem que eu precisasse
medir palavras. Por respeitar e apoiar minhas decisões e por proporcionar todo o
suporte emocional necessário para superar os momentos mais difíceis. Obrigado
por fazer de meus problemas, seus problemas, por ser uma parceira incondicional
em todos os momentos. Desculpe pela minha ausência e por não ter estado
presente fisicamente nesse período tanto quanto gostaríamos. Obrigado pelos
inúmeros momentos felizes que dividimos juntos e que reafirmaram nossos laços de
afeto, cumplicidade e carinho. Saiba que você sempre esteve comigo em meus
pensamentos e em meu coração apesar da distância. Certamente não teria vencido
sem você.
“Na minha idéia vives plenamente
És a pessoa
Com todas as canções
Os momentos bons
E as horas más
Que a memória
coa
”
______________________________________________________________________
viii
A
mo todos você
s
eternamente....
Romance / Enriquez, Bardotti, Chico Buarque
Agradecimentos
______________________________________________________________________
Ag
radecimento
s
A Deus....
“E tudo
q
ue eu criar pra mim, vai me abraçar de novo na semana
q
ue vem”
Criador – O teatro mágico
Agradeço pela saúde concedida ao longo desses anos, pré-requisito
necessário para vencer qualquer desafio. Obrigado pela maravilhosa
oportunidade de aprender a cada dia e pelas pessoas maravilhosas que
cruzaram meu caminho aqui em Bauru. Agradeço acima de tudo por ter olhado
pelo bem mais precioso durante minha ausência: minha família, especialmente
por minha mãe.
Aos Meus Familiares....
Agradeço à minha avó pelo exemplo de coragem , firmeza e dedicação na
difícil missão de criar seus nove filhos e a todos os tios, tias, primos e primas de
nossa grande família.
Agradeço em especial aos meus padrinhos José Reis e Dagna pela forma
carinhosa e interessada com que sempre se colocaram. Gostaria de manifestar
minha eterna gratidão pelo apoio irrestrito dado por vocês a minha querida mãe
nesse período tão difícil. Em todos os momentos vocês estiveram firmes dando
todo apoio e suporte emocional necessários. Devo a conclusão deste mestrado
também a vocês, que fizeram o meu papel junto à ela durante minha ausência.
Vocês são pessoas muito especiais para todos nós e a liderança e doação
desempenhada por vocês são fundamentais para união de nossa grande família.
Agradeço também aos meus queridos primos: Cristiane, Flávia e Gustavo.
Agradeço ao Eros Damasceno companheiro incondicional de minha mãe,
por ter cuidado dela com tamanho zelo, amor e carinho nestes anos tão difíceis. A
sua alegria e amor verdadeiro deram todo o suporte emocional que ela precisava
para vencer mais este desafio. A conclusão deste mestrado também se deve a
você. A sua presença ao lado dela permitiu que eu permanecesse em Bauru para
finalizar meu Mestrado. Receba meu muito obrigado e minha eterna gratidão!
À Lo
u
rdinha e Raimundo pela atenção, confiança, carinho e respeito com que
sempre me tiveram. Obrigado por compreenderem minha ausência durante este
período.
______________________________________________________________________
x
______________________________________________________________________
Ag
radecimento
s
Ao Prof. Dr. Norberti Bernardineli....
Agradeço ao meu orientador pela oportunidade de concretizar um sonho
profissional tão almejado e pelo aprendizado diário ao longo destes anos. Levarei
como exemplo sua forma tranqüila, humilde e imparcial de lidar com seus alunos,
sempre privilegiando o respeito a suas individualidades e a liberdade de suas
decisões, acreditando que a independência e autonomia são partes fundamentais
para o aprendizado. Espero ter sido digno da confiança em mim depositada.
Obrigado por sua amizade, cordialidade e disponibilidade.
À Profª. Drª. Ana Paula Campanelli....
Agradeço pela confiança e pela recepção carinhosa e atenta em seu
laboratório. Obrigado por permitir o livre acesso às dependências do departamento
e por me tratar de forma indiferenciada em relação a seus alunos. A sua
participação foi indispensável e decisiva para concretização deste projeto. Obrigado
por estar sempre disponível e pela maravilhosa oportunidade de dividir junto a você
e seus orientados um ambiente de pesquisa. Agradeço pelo incentivo constante e
pelo respeito às minhas limitações. Levarei como exemplo sua forma dedicada,
sincera e amistosa de lidar com seus alunos. Quero que saiba que tenho enorme
gratidão, admiração e carinho por você.
Aos Professores da Disciplina de Endodontia....
Agradeço ao Prof. Dr. Ivaldo Gomes de Morais pela acolhida sempre
amistosa, pela atenção, disponibilidade e pelo exemplo de humildade, correção e de
amor à docência. Ao
Prof. Dr. Clóvis Monteiro Bramante pelo exemplo de
dedicação diária e extremada à carreira docente. Sua competência e credibilidade
certamente serão referenciais para todos os seus alunos. Ao
Prof. Dr. Roberto
Brandão
Garcia por sua imensa disponibilidade, interesse e preocupação com o
bem estar de seus alunos. Sua simplicidade, cordialidade e polidez serão exemplos a
serem seguidos em minha vida profissional.
Agradeço a todos os senhores, acima de tudo, pela oportunidade de trabalho
e aprendizado concedidos ao longo destes anos. A vocês minha eterna gratidão!
______________________________________________________________________
xi
______________________________________________________________________
Ag
radecimento
s
Aos Meus Amigos Especiais...
...o Maior Presente que Bauru me Proporcionou...
À querida CARLA SIPERT agradeço pelos inúmeros sorrisos e discussões que
dividimos juntos. Obrigado por estar sempre disposta a escutar, mesmo tendo
sempre tanto a dizer. Pela amizade honesta, sincera e verdadeira. Por estar sempre
disponível antes mesmo de lhe pedir auxílio. Aprendi com você em cada minuto de
convivência. Saiba que minha admiração e carinho por você são imensos. Parabéns
pela pessoa encantadora e radiante que você é. Tenho certeza que um futuro
p
romissor está reservado
p
ra você.
Á querida MARCELA CLAUDINO agradeço por estar sempre por perto desde o início.
Pelos almoços e jantares em que fomos felizes, simplesmente pelo prazer de
estarmos todos juntos. Não há ninguém que não se renda ao seu carisma, ao seu
jeito doce de tratar a todos e a sua lealdade. Saiba que tenho enorme consideração e
carinho por você. Obrigado por sempre zelar por nossa amizade e parabéns pela
família maravilhosa que você tem.
Ao meu querido amigo WAGNER BASEGGIO agradeço pelo privilégio de sua amizade
ao longo destes anos. Sua inteligência e capacidade diferenciadas são reconhecidas
por todos aqueles que apreciam e compreendem o seu verdadeiro valor. O valor de
um amigo companheiro, disponível e leal. Aprendi muito com você e obrigado por
estar sempre por perto
.
Á querida CLARICE ELOY agradeço pela alegria contagiante e pelo exemplo de
entrega à vida de peito aberto. É maravilhoso poder ter seu sorriso fácil por perto.
Obrigado pelos muitos momentos divertidos e pelos problemas que dividimos e
su
p
eramos
j
untos.
Ao meu querido amigo FERNANDO OROSCO
agradeço pela preciosa amizade construída ao
longo destes anos. Meu amigo, sempre que
precisei você esteve disponível para ajudar no
que fosse preciso e com um sorriso aberto no
rosto. Você é um grande exemplo de doação
desinteressada pelo outro. Obrigado pelos bons
momentos que dividimos juntos e saiba que
tenho enorme apreço e consideração por você.
“Todos juntos somos fortes
Somos flecha e somos arco
Todos nós no mesmo barco
Não há nada pra temer
Ao meu lado há um amigo
Que é preciso proteger
À querida THAÍS GASPAROTO pela afinidade
intensa e instantânea que nos uniu. Além de
minha enorme admiração por sua competência
e dedicação gostaria de ressaltar o enorme
carinho que tenho por você. É impressionante
como pessoas felizes precisam de muito pouco
para se divertirem juntas. Agradeço pela
amizade permanente, sincera e
desinteressada. Obrigado por proporcionar
alegria mesmo nos momentos mais difíceis.
Todos juntos somos fortes
Não há nada pra temer.”
Todos Juntos
Chico Buarque, Enriquez, Bardotti
______________________________________________________________________
xii
______________________________________________________________________
Ag
radecimento
s
Agradeço Também....
Aos funcionários da disciplina de Endodontia Dona Neide Leandro, Edmauro
de Andrade, Suely Bettio, Patrícia Lopes e Cleide. Pela forma carinhosa e cordial com
que sempre me trataram. Obrigado por se colocarem disponíveis para nos ajudar
sempre que preciso. Saibam que terão sempre meu carinho e mina consideração.
Obrigado por tudo!!!
Aos funcionários da disciplina de Microbiologia e Imunologia Dalva Oliveira,
Cláudia Gimenez e Marilza. Pela maravilhosa acolhida recebida durante minha
passagem pelo departamento. Agradeço por todo apoio e atenção durante o
desenvolvimento deste projeto de pesquisa. Agradeço em especial ao responsável
pelo Laboratório de Microbiologia André Luis da Silva pelas valiosas informações e
pelo treinamento transmitido no início da execução deste projeto, que foram
fundamentais para sua conclusão. Obrigado pela disponibilidade e paciência.
Gostaria de ressaltar o meu carinho e apreço por todos vocês.
Aos queridos amigos da
t
urma de Mestrado em Endodontia Patrícia
Coneglian, Bruno Vasconcelos, Roberta Garcia, Márcia Magro e Ramiro Oropeza.
Agradeço pela maravilhosa convivência, recheada de bons momentos, que levarei
sempre comigo e dos quais sentirei imensa saudade. Obrigado por todo
aprendizado e auxílio conferido ao longo destes anos. Todos vocês, cada um a sua
maneira, foram especiais pra mim.
Aos queridos amigos de Pós-Graduação do Departamento de Imunologia e
Microbiologia Valéria Gelani, Eduardo Figueira e Tatiana Salles. Obrigado por me
receberem com tamanho carinho, atenção e respeito durante minha passagem pelo
laboratório. Aprendi muito com cada um de vocês durante todo este período.
Agradeço por toda colaboração no desenvolvimento desta dissertação. Terão
sempre minha gratidão e admiração.
Aos alunos de iniciação científica e estagiários do departamento de
Imunologia e Microbiologia, Michelle Sabrina, Rodrigo, Ana Paula, Vanessa e Rodolfo
pela convivência alegre, amistosa e respeitosa que tivemos durante este período.
Obrigado pela disponibilidade, por todo auxílio e principalmente pela oportunidade
de aprender sempre.
______________________________________________________________________
xiii
______________________________________________________________________
Ag
radecimento
s
Aos queridos amigos da Pós-Graduação, Janine Araki, Luciana Pinto, Kátia
Reis, Ericson Janólio, Danielle Albuquerque, Flora Távora e Renata Cordeiro que
foram fundamentais para preencher o vazio deixado pela ausência da família.
Agradeço pelos vários momentos felizes e de muito aprendizado que dividimos
juntos. Obrigado pelos sorrisos sinceros compartilhados.
Aos funcionários da biblioteca
–
FOB / USP, Rita Paglione, Ademir Padilha,
Cybelle Fontes, Valéria Ferraz, Vera Boccato, Ana Paula Moço, César Campos,
Maria Caetano, Jane Nogueira e Maria Formenti pela acolhida amistosa e pelo
suporte fundamental para a conclusão deste trabalho.
Ao Centro Integrado de pesquisa (CIP) na figura de seu coordenador Prof.
Dr, Vinícius Carvalho Porto e de seus funcionários Marcelo e Dona Neuza pela
confiança, disponibilidade e pela concessão ao acesso às dependências do CIP.
Agradeço em especial à funcionária Márcia, responsável pelo setor de
microscopia, pela disponibilidade, empenho e paciência na capturação das
imagens junto ao confocal.
À Eliana Soares (TECA) funcionária do Setor de Tecnologia Educacional pela
colaboração e atenção na confecção das imagens das culturas microbiológicas. À
Sandra Guazi funcionária da Assistência Técnica Financeira pela atenção
disponibilizada na aquisição dos marcadores fluorescentes.
Ao Prof. Dr. José Roberto Lauris da disciplina de Sa
ú
de Coletiva pela
colaboração na análise estatística deste trabalho e à Profª. Drª. Vanessa Soares
Lara da disciplina de Patologia pela disponibilidade e colaboração.
Ao núcleo de apoio à pesquisa/ microscopia eletrônica aplicada à pesquisa
agropecuária (NAP/MEPA) da Escola Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” da
Universidade de São Paulo (ESALQ/USP) na figura do Prof. Dr. Elliot Watanabe Kitajima
pelo auxílio e permissão para utilização do centro de microscopia eletrônica de
v
arredura.
Ao Instituto Lauro de Souza Lima pela atenção e disponibilidade na doação
de sangue de carneiro para preparação de meio de cultura.
______________________________________________________________________
xiv
Aos alunos do curso de doutorado em Endodontia Augusto
Bodanezi, Ricardo
Bernardes, Adriana Lustosa, Fausto Victorino e Jarcio Baldi pelo convívio e experiência
profissional compartilhados.
______________________________________________________________________
Ag
radecimento
s
À Minke Gasparoto pela amizade verdadeira e pelos momentos divertidos
que dividimos juntos.
À Aline Araújo e Angélica Lopes pela amizade sincera e honesta construída
ao longo da graduação. Nem a distância nem o tempo apagaram a admiração,
carinho e respeito que sentimos uns pelos outros.
Aos amigos Ludmilla Moreira, Thereza Cristina Silvestri e Ângelo Basso do
curso de Especialização em Endodontia pelos momentos de amizade e aprendizado
que dividimos juntos.
À Faculdade de Odontologia de Bauru da Universidade de São Paulo na figura
de seu Diretor Prof. Dr. Luiz Fernando Pegoraro e de seu Vice-Diretor Prof. Dr. José
Carlos Pereira.
À comissão de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Bauru da
Universidade de São Paulo na figura da Presidente Profª. Drª. Maria Aparecida de
Andrade Moreira Machado e do Vice-Presidente Prof. Dr. Paulo César Rodrigues
Conti.
À secretaria de Pós-Graduação da Faculdade de Odontologia de Bauru da
Universidade de São Paulo na figura das funcionárias Giane Quintela, Ana Letícia
Momesso e Maria Margareth Mokarzel.
À Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES)
pelo auxílio pecuniário concedido, fundamental para conclusão deste curso.
______________________________________________________________________
xv
______________________________________________________________________
Ag
radecimento
s
Minha gratidão e admiração.....
Ao Prof. Dr. Alceu Berbert exemplo de dedicação, entusiasmo e amor a
profissão. Infelizmente não tivemos o privilégio de sua convivência durante o curso
de mestrado, mas certamente sua competência e amor à docência serão
referenciais em minha carreira. Minha grande admiração!
Ao Prof. Luiz Carlos Feitosa Henriques docente do Departamento de
Odontologia Restauradora da Faculdade de Odontologia da Universidade Federal de
Minas Gerais. Agradeço a este educador exemplar, que tive a felicidade de conhecer
ainda no meu curso de graduação, pelo aprendizado, pelos conselhos e por ter me
estendido à mão no momento em que era apenas um ex-aluno, que não tinha nada
a oferecer além do meu esforço e dedicação. Obrigado por sempre ter acreditado
em meu potencial e por despertar em mim o interesse pela docência. Seu exemplo
de humildade, equidade, respeito e polidez ao se relacionar com seus alunos serão
referenciais em minha futura carreira docente. A concretização desta etapa deve-se
também a todo o suporte fornecido por você. Minha eterna gratidão e admiração.
Obrigado!
À Profª. Drª. Efigênia Ferreira e Ferreira docente do Departamento de
Odontologia Social e Preventiva da Faculdade de Odontologia da Universidade
Federal de Minas Gerais. Agradeço por despertar em mim o interesse pela pesquisa
ainda nos tempos de iniciação científica durante a graduação. Obrigado pela
disponibilidade, pelo apoio e pela forma atenciosa com que sempre me tratou.
______________________________________________________________________
xvi
______________________________________________________________________
Sumário
Sumário
RESUMO xxvii
1 INTRODUÇÃO 3
2 REVISÃO DE LITERATURA 11
2.1 Microbiologia das infecções endodônticas...............................................................13
2.2 Distribuição dos microorganismos no sistema de canais radiculares........................24
2.3 Medicação intracanal................................................................................................31
2.3.1 Relevância do emprego de medicação intracanal em endodontia .........................31
2.3.2 Hidróxido de cálcio ...............................................................................................36
2.3.3 Clorexidina ............................................................................................................40
2.3.4 Hidróxido de cálcio associado à clorexidina..........................................................44
2.3.5 Comparação da eficácia antimicrobiana entre as medicações intracanais..............45
2.4 Caracterização e análise de viabilidade microbiana..................................................55
3 PROPOSIÇÃO 63
4 MATERIAL E MÉTODOS 67
4.1 Seleção e preparo dos dentes.....................................................................................67
4.2 Contaminação dos espécimes....................................................................................71
4.3 Divisão, preparo e aplicação das medicações intracanais .........................................75
4.4 Coleta das amostras ...................................................................................................79
4.5 Processamento das amostras para cultura microbiológica ........................................80
4.6 Processamento das amostras para microscopia de fluorescência..............................85
4.7 Microscopia eletrônica de varredura .........................................................................89
4.8 Análise estatística ......................................................................................................90
xvii
______________________________________________________________________
Sumário
5 RESULTADOS 93
5.1 Avaliação da atividade antimicrobiana das medicações intracanais
sobre Enterococcus faecalis através da contagem de UFC.......................................93
5.2 Avaliação da atividade antimicrobiana das medicações intracanais
sobre Enterococcus faecalis através de microscopia de fluorescência....................101
5.3 Avaliação da atividade antimicrobiana das medicações intracanais
sobre Candida albicans através da contagem de UFC............................................109
5.4 Avaliação da atividade antimicrobiana das medicações intracanais
sobre Candida albicans através de microscopia de fluorescência...........................117
5.5 Microscopia eletrônica de varredura.......................................................................125
6 DISCUSSÃO 131
7 CONCLUSÕES 147
ANEXOS 151
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 159
ABSTRACT 183
______________________________________________________________________
xviii
______________________________________________________________________
L
ista de Fi
g
ura
s
Lista de Figuras
FIGURA 1 Seleção e preparo dos espécimes. ...............................................................69
FIGURA 2 Contaminação dos espécimes
. ....................................................................73
FIGURA 3 Aplicação das medicações intracanais........................................................77
FIGURA 4 Coleta das amostras ....................................................................................81
FIGURA 5 Processamento das amostras para cultura microbiológica..........................83
FIGURA 6 Processamento das amostras para microscopia de fluorescência ...............87
FIGURA 7 Avaliação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais
sobre Enterococcus faecalis presentes nos túbulos dentinários através da contagem
de UFC.............................................................................................................................97
FIGURA 8 Culturas de Enterococcus faecalis...............................................................99
FIGURA 9 Avaliação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais sobre
Enterococcus faecalis presente nos túbulos dentinários através da análise por
microscopia de fluorescência.........................................................................................105
FIGURA 10 Fotomicrografias de Enterococcus faecalis após aplicação de medicação
intracanal.......................................................................................................................107
FIGURA 11 Avaliação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais
sobre Candida albicans presente nos túbulos dentinários através da contagem de
UFC...............................................................................................................................113
FIGURA 12 Culturas de Candida albicans.................................................................115
______________________________________________________________________
xix
______________________________________________________________________
L
ista de Fi
g
ura
s
FIGURA 13 Desempenho antimicrobiano das medicações intracanais sobre Candida
albicans presente nos túbulos dentinários através da análise por microscopia de
fluorescência..................................................................................................................121
FIGURA 14 Fotomicrografias de Candida albicans após 14 dias de aplicação de
medicação intracanal.....................................................................................................123
FIGURA 15 Microscopia eletrônica de varredura de dentina radicular humana
submetida à remoção de smear layer e à contaminação por Enterococcus faecalis e
Candida albicans...........................................................................................................127
______________________________________________________________________
xx
______________________________________________________________________
L
ista de Tabela
s
Lista de Tabelas
TABELA 1 Distribuição e agrupamento dos espécimes em função do microorganismo e
medicação avaliados..........................................................................................................75
TABELA 2 Substâncias neutralizadoras recomendadas em função das medicações
intracanais avaliadas..........................................................................................................79
TABELA 3 Distribuição dos espécimes para análise em MEV........................................89
TABELA 4 Avaliação da atividade antimicrobiana de hidróxido de cálcio,
clorexidina gel 2% e da associação hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sobre
Enterococcus faecalis através da contagem de UFC.........................................................94
TABELA 5 Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações
intracanais sobre E. faecalis, através das médias de logUFC registradas na extensão de
0 – 100 µm da dentina radicular........................................................................................95
TABELA 6 Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações
intracanais sobre E. faecalis, através das médias de logUFC registradas na extensão de
100 – 200 µm da dentina radicular....................................................................................95
TABELA 7 Avaliação da atividade antimicrobiana da pasta de hidróxido de cálcio,
clorexidina gel 2% e da associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sobre
Enterococcus faecalis pela determinação de bactérias viáveis e não viáveis através da
análise em microscopia de fluorescência de amostras da dentina radicular referentes à
extensão de 0 - 100 µm....................................................................................................103
TABELA 8 Avaliação da atividade antimicrobiana da pasta de hidróxido de cálcio,
clorexidina gel 2% e da associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sobre
Enterococcus faecalis pela determinação de bactérias viáveis e não viáveis através da
análise em microscopia de fluorescência de amostras da dentina radicular referentes à
extensão de 100 - 200 µm................................................................................................103
______________________________________________________________________
xxi
______________________________________________________________________
L
ista de Tabela
s
TABELA 9 Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais
sobre E. faecalis, através da média de porcentagem de bactérias viáveis registradas na
extensão de 0 – 100 µm da dentina radicular...................................................................104
TABELA 10 Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais
sobre E. faecalis, através da média de porcentagem de bactérias viáveis registradas na
extensão de 100 – 200 µm da dentina radicular...............................................................104
TABELA 11 Avaliação da atividade antimicrobiana da pasta de hidróxido de cálcio,
clorexidina gel 2% e da associação hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sobre
Candida albicans através da contagem de UFC..............................................................110
TABELA 12 Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais
sobre C. albicans, através das médias de logUFC registradas na extensão de 0 – 100 µm
da dentina radicular..........................................................................................................111
TABELA 13 Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais
sobre C. albicans, através das médias de logUFC registradas na extensão de 100 – 200
µm da dentina radicular...................................................................................................111
TABELA 14 Avaliação da atividade antimicrobiana da pasta de hidróxido de cálcio,
clorexidina gel 2% e da associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sobre
Candida albicans pela determinação de fungos viáveis e não viáveis através da análise
em microscopia de fluorescência de amostras da dentina radicular referêntes a extensão
de 0 - 100 µm...................................................................................................................119
TABELA 15 Avaliação da atividade antimicrobiana da pasta de hidróxido de cálcio,
clorexidina gel 2% e da associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sobre
Candida albicans pela determinação de fungos viáveis e não viáveis através da análise
em microscopia de fluorescência de amostras da dentina radicular referêntes a extensão
de 100 - 200 µm.............................................................................................................119
______________________________________________________________________
xxii
______________________________________________________________________
L
ista de Tabela
s
TABELA 16 Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais
sobre C. albicans, através da média da porcentagem de fungos viáveis registradas na
extensão de 0 – 100 µm da dentina radicular...................................................................120
TABELA 17 Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais
sobre C. albicans, através da média da porcentagem de fungos viáveis registradas na
extensão de 100 – 200 µm da dentina radicular...............................................................120
______________________________________________________________________
xxiii
______________________________________________________________________
Lista de Abreviatura
s
Lista de Abreviaturas
• % = por cento
• ° = graus
• AM = acetoximetil éster
• ATCC = The American Type Culture Collections
• atm = atmosfera
• ATP = do inglês “adenosine tri-phosfate” traduzido como adenosina tri-fosfato
• ATPase = do inglês “adenosine tri-phosfatase” traduzido como adenosina tri-
fosfatase
• BHI = do inglês “brain heart infusion” traduzido como infusão de cérebro e
coração
• C. albicans = Candida albicans
• C = Celsius
• Ca (OH)
2
= hidróxido de cálcio
• CO
2
= dióxido de carbono
• DNA = do inglês “deoxyribonucleic Acid” traduzido como ácido
desoxirribonucleico
• DP = desvio padrão
• E. faecalis = Enterococcus faecalis
• EDTA = do inglês “ethylenediaminetetracetic acid” traduzido como ácido
etilenodiamino tetra-acético
• et al = e colaboradores
• G = grupos
• g = gramas
• g = aceleração da gravidade
• g/L = gramas por litro
• IL = do inglês “interleukin” traduzido como interleucina
• log = logarítimo
• LPS = do inglês lipopolysaccharide traduzido como lipopolissacarídeo
• LTA = do inglês lipoteichhoic acid traduzido como ácido lipoteicóico
• M = concentração molar
______________________________________________________________________
xxiv
______________________________________________________________________
Lista de Abreviatura
s
• MEV = .microscópio eletrônico de varredura
• mg/L = miligramas por litro
• mL = mililitro
• mm = milímetros
• mm
2
= milímetros quadrados
• n = número de espécimes da amostra
• N = Newtons
• NaOCl = hipoclorito de sódio
• nm = nanômetro
• OsO4 = tetróxido de ósmio
• p = nível de significância, probabilidade
• pa = pró-análise
• PBS = do inglês “phosphate buffer solution” traduzido como solução de tampão
fosfato
• PCR = do inglês “polymerase chain reaction” traduzido como reação em cadeia da
polimerase
• pH = potencial hidrogeniônico
• PMCC = .paramonoclorofenol canforado
• rpm = rotações por minuto
• TNF = do inglês “tumor necrosis factor” traduzido como fator de necrose tumoral
• UFC = unidade formadora de colônia
• USP = Universidade de São Paulo
• VBNC = do inglês “viable but nonculturable” traduzido como viável, mas não
cultivável.
• µg = micrograma
• µL = microlitro
• µm = micrometro
______________________________________________________________________
xxv
Resumo
______________________________________________________________________
Resumo
RESUMO
Uma infecção pulpar pode resultar na colonização microbiana de todo sistema de
canais radiculares incluindo os túbulos dentinários. Estes microorganismos e seus
produtos tóxicos são responsáveis pelo desenvolvimento e persistência da periodontite
apical de origem endodôntica. O presente estudo objetivou avaliar a viabilidade de E.
faecalis e C. albicans em túbulos dentinários após a aplicação de hidróxido de cálcio,
clorexidina gel 2%, hidróxido de cálcio associado à clorexidina gel 2% e soro
fisiológico, através da análise por cultura microbiológica e microscopia de
fluorescência. Para tanto 120 raízes de dentes humanos foram padronizadas e
autoclavadas, sendo posteriormente divididas em 2 grupos (n= 60) para contaminação
com E. faecalis e C. albicans por 21 dias. Em seguida, foram divididas em 8 grupos (n=
15) para aplicação das substâncias antimicrobianas nos canais radiculares e posterior
incubação em estufa por 14 dias. Amostras da dentina radicular na extensão de 0 – 100
µm e de 100 - 200 µm foram coletadas e submetidas à cultura microbiológica através do
plaqueamento em meios de cultura. Após 48 horas de incubação promoveu-se a
avaliação das UFC. Paralelamente, as amostras foram processadas para análise em
microscopia de fluorescência com auxílio de marcadores fluorescentes específicos, a
fim de se determinar a proporção de microorganismos viáveis e não viáveis. Outros 6
espécimes foram preparados para análise em MEV. Os resultados mostraram uma maior
capacidade de penetração intratubular para E. faecalis quando comparado a C. albicans.
A aplicação de medicação intracanal resultou em significativa redução da viabilidade
dos microorganismos quando comparado ao grupo controle independente da medicação
aplicada e em ambas as porções da dentina radicular avaliadas. Entretanto, ao
compararmos individualmente as medicações, observamos o melhor desempenho da
clorexidina gel 2 % e da associação de hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sem
diferença significante entre elas. O hidróxido de cálcio apresentou os piores resultados
para desinfecção dos canais radiculares contaminados com E. faecalis e C. albicans.
Estes achados foram confirmados tanto pela cultura microbiológica quanto pela
microscopia de fluorescência. A cultura microbiológica e a microscopia de
fluorescência são métodos adequados e complementares para avaliação da viabilidade
de E. faecalis e C. albicans e a eficácia da clorexidina gel 2% e da associação hidróxido
xxvii
______________________________________________________________________
Resumo
de cálcio e clorexidina gel 2% justificam seu uso em endodontia como medicação
intracanal.
Palavras chave: Enterococcus faecalis. Candida albicans. Hidróxido de cálcio.
Clorexidina. Viabilidade microbiana. Infecção do canal radicular. Microscopia de
fluorescência. Endodontia.
______________________________________________________________________
xxviii
Introdução
______________________________________________________________________
Introdução
3
1. INTRODUÇÃO
As patologias pulpares e perirradiculares são usualmente de natureza
inflamatória e de etiologia microbiana. Microorganismos e seus produtos exercem um
papel fundamental na indução e, principalmente, na perpetuação de tais doenças
(KAKEHASHI; STANLEY; FITZGERALD
101
, 1965, SUNDQVIST
236
, 1976,
MÖLLER et al.
151
, 1981, TAKAHASHI
245
, 1998). O tratamento endodôntico tem como
principais objetivos a máxima eliminação da infecção instalada no sistema de canais
radiculares e a prevenção da introdução de novos microrganismos durante e após o
tratamento. A eliminação da infecção do canal radicular propicia um ambiente
favorável ao reparo das lesões periapicais, enquanto a persistência de microrganismos
exerce um papel relevante nas falhas do tratamento endodôntico (SJÖGREN et al.
227
,
1997).
Embora fatores não-microbianos endógenos ou exógenos possam estar
envolvidos em casos de insucesso endodôntico, microorganismos e seus produtos são
os principais responsáveis pelo fracasso da terapia. Na maioria das vezes, uma infecção
persistente do canal radicular é resultante de um preparo químico-mecânico e de uma
medicação intracanal inadequados. Entretanto, em algumas situações, a despeito da
realização adequada das medidas de controle da infecção endodôntica, uma infecção
persistente pode se desenvolver (CARD et al.
28
, 2002). Estes microorganismos
usualmente estão presentes em áreas do canal inacessíveis aos procedimentos de
desinfecção e são resistentes aos agentes químicos empregados. A neutralização destes
agentes pelas condições ambientais na região do canal onde os microorganismos estão
alojados compromete sua eficácia (PORTENIER et al.
182
, 2001).
A morfologia complexa do sistema de canais radiculares determina áreas
inacessíveis ao preparo biomecânico como canais laterais, acessórios, secundários,
intercondutos, deltas apicais e túbulos dentinários contribuindo para a permanência de
microrganismos nessas regiões (McCOMB; SMITH
141
, 1975, NAIR et al.
154
, 1990, LIN
et al.
125
, 1991, SIQUEIRA; UZEDA; FONSECA
219
, 1996). De acordo com SJÖGREN
et al.
228
, em 1991, o número de microorganismos em um sistema de canais radiculares
infectado pode variar de 1x10
2
a 1x10
8
microorganismos. Estes estão distribuídos por
______________________________________________________________________
4
Introdução
todo sistema de canais radiculares, podendo ser encontrados em profundidades variadas
nos túbulos dentinários, atingindo a superfície radicular externa em alguns casos
(HORIBA et al.
95
, 1992). Possivelmente, por potencializar a eliminação de
microorganismos, o emprego de medicação intracanal está diretamente relacionado a
uma melhor reparação dos tecidos periapicais e, consequentemente, a um maior índice
de sucesso da terapia de dentes com canais infectados (BYSTRÖM et al.
21
, 1987,
SJÖGREN et al.
229
, 1990, TROPE; DELANO; ØRSTAVIK
252
, 1999, KATEBZADEH;
SIGURDSSON; TROPE
107
, 2000).
A microbiota presente em canais radiculares obturados com insucesso
endodôntico difere tanto quantitativa quanto qualitativamente daquela normalmente
encontrada em dentes necrosados e não tratados. Observa-se nas infecções secundárias
e persistentes um número limitado de microorganismos com predominância de
anaeróbios facultativos gram-positivos. Já uma infecção polimicrobiana com
predominância de anaeróbios estritos gram-negativos, está comumente associada a
canais não tratados endodonticamente (SUNDQUIST et al.
237
, 1998, MOLANDER et
al.
150
, 1998).
A recuperação freqüente de Enterococcus faecalis de canais radiculares com
insucesso do tratamento endodôntico tem sido amplamente relatada. Tais estudos
demonstraram uma prevalência de 29 - 77% no isolamento desta bactéria
(ENGSTRÖM
44
, 1964, GOLDMAN; PEARSON
63
, 1969, FABRICIUS et al.
52
, 1982,
GOMES; DRUCKER; LILEY
64
, 1996, SUNDQUIVIST et al.
237
, 1998, MOLANDER
et al.
150
, 1998, PECIULIENE et al.
172
, 2000, PECIULIENE et al.
173
, 2001, PINHEIRO
et al.
179
, 2003). Entretanto, enterococos não são favorecidos pelas condições presentes
em canais radiculares não tratados endodonticamente e quando presentes eles
usualmente compõem uma pequena porção da microbiota presente no canal radicular.
Enterococcus faecalis parece ter alta resistência a medicamentos usados durante o
tratamento, sendo um dos poucos microrganismos que demonstrou in vitro resistir a
uma ampla variedade de agentes antimicrobianos principalmente ao hidróxido de cálcio
(HOELLMAN et al.
92
, 1998, DAHLÉN et al.
34
, 2000; NODA et al.
157
, 2000,
SHEPARD; GILMORE
203
, 2002; PINHEIRO et al.
180
, 2003).
______________________________________________________________________
Introdução
5
A ocorrência de fungos nas infecções dos canais radiculares tem sido cada vez
mais relatada, contribuindo para o crescente interesse em se determinar o seu real papel
nas infecções endodônticas (NAIR et al.
76
, 1990, SEN; PISKIN; DEMIRCI
94
, 1995,
WALTIMO et al.
123
, 1997, BAUMGARTNER; WATTS; XIA
5
, 2000). A maioria dos
fungos isolados pertence ao gênero Candida, sendo a espécie Candida albicans a mais
freqüente. Embora ainda pouco estudado, já existem trabalhos mostrando semelhança
entre C. albicans e E. faecalis em resistir à ação de alguns agentes antimicrobianos
utilizados em endodontia (WALTIMO et al.
122
, 1999).
Alguns materiais já estão consagrados no meio endodôntico para utilização
como medicação intracanal, entretanto, encontrar novas alternativas é fundamental para
combater a resistência apresentada por alguns microorganismos. A clorexidina tem sido
amplamente sugerida como material para anti-sepsia de canais radiculares, seja como
substância química auxiliar durante o preparo químico-mecânico (FERRAZ et al.
55
,
2001, GOMES et al.
69
, 2001, DAMETTO et al.
36
, 2005) ou como medicação intracanal
entre sessões (SIQUEIRA; UZEDA
221
, 1997, SCHÄFER; BOSSMANN
196
, 2001,
GOMES et al.
73
, 2003). A clorexidina possui ação antimicrobiana imediata, amplo
espectro de ação, relativa ausência de toxicidade, capacidade de adsorção pela dentina e
lenta liberação de substância ativa, prolongando sua atividade antimicrobiana residual
(GREENSTEIN; BERMAN; JAFFEN
75
, 1986, WHITE; HAYS; JANER
269
, 1997).
Mesmo apresentando a desvantagem de ser incapaz de dissolver tecido orgânico, a
clorexidina se consolidou como material promissor para desinfecção dos canais
radiculares (FERRAZ et al.
55
, 2001, OKINO et al.
162
, 2004).
O hidróxido de cálcio, por seu poder alcalinizante, tem sido um dos principais
materiais de escolha para medicação intracanal. O seu representativo destaque entre os
fármacos endodônticos deve-se graças a duas expressivas propriedades enzimáticas: a
primeira é a inibição de enzimas bacterianas, a partir da ação em nível de membrana
citoplasmática conduzindo ao efeito antimicrobiano e a segunda é a ativação enzimática
tecidual, observada por sua ação sobre a fosfatase alcalina gerando efeito
mineralizador. Estas propriedades são decorrentes de seu elevado pH, com valores
aproximados de 12.6, o que estabelece alta liberação de íons hidroxila (ESTRELA et
al.
49
, 1994). Apesar de sua ampla utilização, alguns microorganismos como E. faecalis
______________________________________________________________________
6
Introdução
e C. albicans têm apresentado resistência aos seus efeitos mesmo após a aplicação por
período de tempo prolongado questionado sua eficácia (SIQUEIRA; UZEDA
220
, 1996,
WALTIMO et al.
263
, 1999). Além dos microorganismos apresentarem mecanismos de
defesa próprios para escaparem da ação deste medicamento, o aumento do pH é
tamponado pela dentina (PORTENIER et al.
182
, 2001), produtos ácidos bacteianos, e
concentração de CO
2
(NAKAJO et al.
155
, 2004).
Consequentemente, microorganismos
capazes de sobreviver a um pH de 9 - 10 podem permanecer viáveis nos canais
radiculares a despeito da presença de hidróxido de cálcio.
Novas formulações e associações têm sido sugeridas, a fim de se encontrar
uma alternativa mais eficaz para combate à infecção do canal radicular. A associação
da clorexidina gel 2% ao hidróxido de cálcio tem como objetivo incrementar suas
propriedades antimicrobianas. O hidróxido de cálcio tem a habilidade de induzir a
formação de tecido duro, promover o preenchimento do canal, dissolver tecido orgânico
e mediar à neutralização de LPS (SAFAVI; NICHOLS
192
, 1994, GOMES et al.
70
,
2002). Entretanto, o medicamento não é igualmente eficaz contra todas as bactérias
encontradas no canal radicular (GOMES et al.
67
, 2002). A adição de clorexidina
objetiva propiciar um aumento da atividade antimicrobiana tornando o medicamento
mais eficaz contra microorganismos resistentes como E. faecalis (GOMES et al.
73
,
2003) e C. albicans.
A multiplicação bacteriana é um importante indicador de viabilidade celular e
pode ser observada através de técnicas de cultura microbiológica convencionais. A
correta manipulação e o emprego de meios de cultura específicos, associados às
adequadas condições de incubação permitem a recuperação de diversos
microorganismos. Entretanto, a viabilidade microbiana não se caracteriza apenas pela
capacidade de multiplicação. Outros aspectos como respiração, atividade enzimática e
integridade da membrana citoplasmática são importantes referências para se determinar
viabilidade (WEIGER et al.
266
, 2002). Microorganismos viáveis não se restringem
apenas aqueles cultiváveis, já que algumas espécies sob condições ambientais
estressantes podem reter certas funções fisiológicas, mas não podem ser cultivados sob
condições normais de cultura, impedindo sua detecção. O estado denominado de
“viable but nonculturable” (VBNC) é um mecanismo de sobrevivência adotado por
______________________________________________________________________
Introdução
7
alguns microorganismos quando expostos às condições ambientais adversas. Neste
estágio o microorganismo perde a capacidade de crescimento em meio de cultura, mas
mantém a viabilidade e patogenicidade e em algumas situações é capaz de retomar a
divisão celular após a restituição de condições normais para o crescimento (MASON;
HAMER; BRYERS
137
, 1986, KAPRELYANTS; GOTTSCHAL; KELL
103
, 1993,
OLIVER; BOCKIAN
163
, 1995, KELL et al.
109
, 1998, WEIGER et al.
267
, 2002).
Para estudar a efetividade de agentes antimicrobianos, a identificação e
quantificação de microorganismos viáveis e não viáveis é essencial. A técnica mais
frequentemente usada nestes estudos é o método da cultura microbiológica (CVEK;
NORD; HOLLENDER
32
, 1976, BYSTRÖM; SUNDQVIST
24
, 1985, ØRSTAVIK;
KEREKES; MOLVEN
168
, 1991, SJÖGREN et al.
228
, 1991, SJÖGREN et al.
227
, 1997,
DALTON et al.
35
, 1998, SHUPING et al.
206
, 2000, PETERS et al.
176
, 2002). Contudo,
apenas microorganismos viáveis são identificados por esse método. Diversos estudos já
demonstraram que apenas uma pequena parte dos microorganismos são cultiváveis
laboratorialmente em meios de cultura convencionais prejudicando sua identificação
(HYSEK et al.
96
, 1991, WALKER et al.
258
, 2000). A microscopia de fluorescência tem
se revelado um método mais sensível e complementar para caracterização da
viabilidade de microorganismos (KARLSSON; MALMBERG
104
, 1989; HYSEK et
al.
96
, 1991, WALKER et al.
258
, 2000, DECKER
39
, 2001, BERNARDEAU;
VERNOUX; GUEGUEN
14
, 2001, WEIGER et al.
266
, 2002). Através da coloração
atribuída por marcadores fluorescentes específicos é possível se determinar a
viabilidade microbiana tendo como parâmetro a integridade da membrana
citoplasmática que é imprescindível para manutenção da viabilidade celular.
A possibilidade de investigar a viabilidade de E. faecalis e C. albicans de
forma mais abrangente nos motivaram a analisar o efeito de alguns materiais
empregados na terapia endodôntica como medicação intracanal, a fim de verificar a
ação antimicrobiana destes medicamentos sobre microorganismos localizados no
interior dos túbulos dentinários em diferentes profundidades da dentina radicular. Para
tal avaliação, foram empregados dois métodos para determinação da viabilidade de
microorganismos: a cultura microbiológica através da contagem de UFC e a
______________________________________________________________________
8
Introdução
microscopia de fluorescência através da determinação da proporção de
microorganismos viáveis e não viáveis.
REVISÃO DA
LITERATURA
______________________________________________________________________
11
Revisão de Literatura
2. REVISÃO DA LITERATURA
A necrose pulpar é a morte da polpa, significando a cessação dos processos
metabólicos desse tecido, com conseqüente perda de sua estrutura, bem como de suas
defesas naturais (KUTTLER
113
, 1961). Como exemplo, pode-se mencionar as necroses
causadas por traumatismos que levam ao rompimento do feixe vásculo nervoso, aquelas
causadas pelas restaurações com materiais irritantes pulpares como adesivos dentinários e
resinas compostas sem a devida proteção pulpar, e ainda as que ocorrem como
conseqüência de preparos cavitários extensos, em que os cuidados de refrigeração foram
negligenciados. Nesses casos, a morte da polpa ocorre, em sua maioria, em condições
assépticas podendo ocorrer, a seguir, a invasão microbiana. Embora fatores químicos e
físicos possam induzir a necrose pulpar e inflamação periapical, é evidente que os agentes
microbianos resultantes da evolução de um processo de cárie dentária, por exemplo,
desempenham papel crucial para a propagação e perpetuação de doenças inflamatórias
periapicais.
O controle da infecção endodôntica permanece como um grande desafio para a
endodontia moderna. Apesar dos constantes avanços na evolução dos materiais utilizados
para modelagem, desinfecção e obturação do canal, o combate à infecção permanece
desafiador devido à complexidade e peculiaridade deste ambiente. O sucesso do
tratamento endodôntico está diretamente relacionado à máxima eliminação de
microorganismos presente no sistema de canais radiculares previamente a obturação
(ZELDOW; INGLE
275
, 1963; BYSTRÖM et al.
21
, 1987; SJÖGREN et al.
227
, 1997).
Mesmo com todas as dificuldades inerentes ao combate da infecção no sistema de
canais radiculares, estudos confirmam uma alta taxa de sucesso do tratamento
endodôntico entre 85% a 95% (SWARTZ; SKIDMORE; GRIFFIN
243
, 1983; SJÖGREN
et al.
229
, 1990; SMITH; SETCHELL; HARTY
230
, 1993). Entretanto, ALLEN;
NEWTON; BROWN
3
(1989) e HEPWORTH; FRIEDMAN
90
(1997), analisando o
sucesso do retratamento endodôntico, encontraram uma taxa de aproximadamente 66%.
Esse índice se apresenta modesto quando comparado com a alta taxa de sucesso do
tratamento inicial. O menor índice de sucesso do retratamento pode indicar além de
______________________________________________________________________
12
Revisão de literatura
dificuldades técnicas, devido a fatores iatrogênicos do tratamento anterior, uma
dificuldade na eliminação da microbiota do canal radicular de dentes com insucesso
endodôntico (MOLANDER et al.
150
, 1998; SUNDQVIST et al.
237
, 1998).
Os microrganismos presentes nos canais de dentes tratados endodonticamente que
fracassaram podem ser derivados daqueles originalmente presentes no canal radicular
infectado, de microorganismos introduzidos no canal por procedimentos inadequados
durante o tratamento (SIREN et al.
225
, 1997) ou pela infiltração devido ao selamento
coronário deficiente (CHEUNG
29
, 1996).
O saneamento do sistema de canais radiculares pode ser obtido pelos efeitos
químicos e mecânicos da instrumentação e irrigação. Entretanto, microorganismos podem
encontrar-se em regiões inacessíveis ao preparo biomecânico ou apresentarem
resistências às substâncias anti-sépticas comumente utilizadas. Por permanecer no interior
do canal radicular por mais tempo, um medicamento intracanal dotado de ação
antimicrobiana tem maiores chances de atingir áreas não afetadas pela instrumentação
como istmos, ramificações, reentrâncias e túbulos dentinários. Sua ação antimicrobiana
potencializa a redução da microbiota endodôntica proporcionando melhor reparação dos
tecidos perirradiculares e, consequentemente, um maior índice de sucesso da terapia
endodôntica (LOPES; SIQUEIRA
130
, 2004).
O desenvolvimento de um protocolo efetivamente eficaz para desinfecção do
sistema de canais radiculares está intimamente atrelado ao avanço da microbiologia como
ciência. O emprego de métodos mais precisos e eficazes para identificação, isolamento,
cultivo e análise de microorganismos contribuiu enormemente para melhor compreender
estes inimigos do sucesso da terapia endodôntica. Entender os fatores de virulência e os
motivos que levam estes patógenos a resistir à ação de antimicrobianos, buscando
alternativas para o seu combate, certamente constitui-se no principal objetivo deste
fascinante desafio da endodontia.
______________________________________________________________________
13
Revisão de Literatura
2.1 Microbiologia das infecções endodônticas
As primeiras pesquisas que demonstraram a presença de bactérias no interior do
sistema de canais radiculares ocorreram no século XIX quando MILLER
148
, em 1894,
relatou a associação entre bactérias e as patologias pulpar e perirradicular. O
estabelecimento de uma relação causal entre microorganismos e as patologias de origem
endodôntica só foi efetivamente comprovado, no entanto, em 1965 em estudo realizado
por KAKEHASHI; STANLEY; FITZGERALD
101
. Os autores verificaram que nenhuma
alteração patológica ocorria quando da exposição dos tecidos pulpares e periapicais de
ratos livres de germes. Ocorria, inclusive, a reparação do tecido pulpar pela deposição de
dentina neoformada na área da exposição, isolando o tecido pulpar da cavidade oral. Por
outro lado, em animais convencionais, a exposição pulpar levou à necrose e à formação
de lesão periapical, concluindo-se que a presença da microbiota é o fator mais
determinante no aparecimento da lesão periapical.
A confirmação do importante papel desempenhado pelos microorganismos
despertou o interesse de vários pesquisadores em identificar as principais espécies
envolvidas, suas vias de acesso ao sistema de canais radiculares, o padrão de colonização
e as conseqüências da infecção endodôntica para o hospedeiro.
Até meados da década de 70, as pesquisas realizadas para identificação dos
agentes etiológicos das infecções pulpares apresentavam resultados bastante variados e
imprecisos. Esta condição se deve, em parte, às diferentes técnicas bacteriológicas
empregadas e às limitações existentes nas técnicas de cultivo e armazenamento. Os
estudos microbiológicos das infecções endodônticas indicavam o predomínio de bactérias
aeróbias e anaeróbias facultativas relegando menor importância às anaeróbias estritas
(BROWN; RUDOLF
19
, 1957). Contudo, o desenvolvimento das técnicas de cultivo de
anaeróbios estimulou o interesse pela avaliação da porcentagem de bactérias anaeróbias
presentes em dentes com necrose pulpar e periapicopatias. A partir de então, começaram
a surgir os primeiros trabalhos indicando uma maior participação dos anaeróbios nas
infecções primárias (MÖLLER
152
, 1966; ARANKI et al
6
, 1969; KANTZ; HENRY
102
,
1974, WITTGOW; SABISTON
271
, 1975).
______________________________________________________________________
14
Revisão de literatura
O aprimoramento das técnicas de isolamento, transporte e cultivo de anaeróbios
permitiu que, em 1976, SUNDQVIST
236
revolucionasse os conceitos vigentes até então
permitindo uma compreensão mais verdadeira da composição e implicação da microbiota
nas infecções endodônticas. Neste estudo foram avaliadas as condições bacteriológicas
de 32 canais de dentes unirradiculares com polpas necrosadas e coroas intactas, sem
cáries ou restaurações. A perda da vitalidade pulpar foi em decorrência de injúria
traumática e não havia a presença de doença periodontal ou fístula envolvida. Em 19
dentes foi detectada, radiograficamente, a presença de lesão perirradicular. Após coleta e
processamento microbiológico das amostras os resultados evidenciaram a presença de
bactérias apenas em casos de dentes com lesões perirradiculares associadas, ou seja, em
18 dos 19 casos. Este achado confirmou o importante papel desempenhado por bactérias
na etiopatogenia destas lesões, além de combater o conceito de que o tecido pulpar
necrosado, mesmo na ausência de microorganismos, fosse um irritante tecidual. Dos 18
canais infectados foram isoladas um total de 88 cepas bacterianas. Destas, apenas 5 foram
anaeróbias facultativas. Assim bactérias anaeróbias estritas representaram 94,3% das
cepas isoladas. Este achado modificou o conceito de que os principais patógenos
endodônticos eram bactérias facultativas. O número de espécimes identificadas em cada
um dos canais variou de 1 a 12. Houve correlação positiva entre o tamanho da lesão
perirradicular e a densidade e número de espécies bacterianas presentes no canal. Além
disso, os casos sintomáticos foram diretamente relacionados a um maior número de
bactérias. A incidência de agudecimentos e a presença de determinadas espécies de
microorganismos foi comprovada pela identificação de Bacteróides melaninogenicus em
7 casos onde houve a presença de sinais e sintomas de inflamação aguda perirradicular.
A melhor caracterização da microbiota endodôntica permitiu que novos
questionamentos fossem levantados a respeito de como ocorreria o processo de
colonização e evolução da infecção endodôntica, a fim de compreender o motivo da
prevalência de anaeróbios. Apesar de grande número de espécies microbianas
colonizarem a cavidade oral, um grupo relativamente pequeno era detectado em canais
radiculares infectados. Diversos fatores seletivos atuam sobre os microorganismos que
colonizam o sistema de canais radiculares como: nutrição, potencial de óxido redução,
pH, temperatura, interações entre os microorganismos, além dos mecanismos de defesa
______________________________________________________________________
15
Revisão de Literatura
do hospedeiro e presença de agentes antimicrobianos e inibidores (MARSH;
MARTIN
136
, 1992, GOMES; DRUCKER; LILEY
64
, 1996).
A elevada concentração de oxigênio presentes nos tecidos nos estágios iniciais
favorece a prevalência de bactérias aeróbias e facultativas. A partir da necrose tecidual, a
tensão de oxigênio é reduzida pela ausência da microcirculação. Observa-se, então, uma
redução no potencial de óxido-redução proporcionando uma elevação na quantidade de
microorganismos anaeróbios estritos (LOPES; SIQUEIRA
130
, 2004). Outro aspecto
importante na seleção de microorganismos seria o pH tecidual. Os tecidos necrosados
apresentam pH ligeiramente ácido, aproximadamente 6, o que favorece a colonização
bacteriana. Por outro lado, em tecidos sadios, o pH é de aproximadamente 7.2 a 7.4, ou
seja, ligeiramente básico o que dificulta a ação de enzimas bacterianas (TRONSTAD et
al.
250
, em 1990).
A disponibilidade nutricional é de extrema importância na composição da
microbiota das infecções endodônticas (SUNDQVIST
240
, 1992). O nutriente obtido por
bactérias no interior do sistema de canais radiculares advém de produtos da desintegração
celular, fluidos teciduais e componentes do tecido conjuntivo. No período inicial observa-
se a prevalência de uma microbiota sacarolítica ocorrendo o rápido esgotamento dos
carboidratos disponíveis. A partir de então, instala-se uma microbiota proteolítica capaz
de metabolizar proteínas e aminoácidos que se torna a fonte de energia disponível no
ambiente (STEEG; HOEVEN
232
, 1989). Neste momento, predominam as espécies
pertencentes aos gêneros Prevotella, Porphyromonas, Eubacterium e Fusobacterium
(JANSEN; VAN DER HOEVEN
98
, 1997, LOPES; SIQUEIRA
130
, 2004).
Outro aspecto determinante na sucessão microbiana é a interação entre
microorganismos. A presença de uma determinada espécie pode contribuir ou inviabilizar
a sobrevivência de outra(s). Um dos primeiros estudos a avaliar a interação microbiana
em infecções endodônticas foi o desenvolvido por FABRICIUS et al.
52
em 1982. Os
autores avaliaram a capacidade de 11 cepas bacterianas, em culturas puras e mistas, de
induzir lesão periapical em macacos. Setenta e cinco dentes tiveram suas polpas
desvitalizadas mecanicamente seguidas pela inoculação de cepas bacterianas, puras ou
em combinações, com posterior selamento das câmaras pulpares por 6 meses. Após o
______________________________________________________________________
16
Revisão de literatura
término do período experimental, foi verificado um predomínio de Bacteroides oralis na
maioria dos canais com infecções mistas. Em contraste, estes Bacteróides não foram
reisolados em nenhum canal inoculado com cultura pura. Já os Enterococcus foram
recuperados em todos os canais em que foram inoculados isoladamente demonstrando
habilidade para sobreviver sozinho no interior do canal radicular sem o suporte de outras
bactérias. Outros estudos também mostraram a importância de determinadas combinações
microbianas para a sobrevivência das espécies envolvidas e para sua patogenicidade
(SUNDQVIST et al.
242
, 1979, MAYRAND; MCBRIDE
140
, 1980, GRENIER;
MAYRAND
76
, 1986, MAYRAND; HOLT
139
, 1988, BAUMGARTNER; FALKER;
BECKERMAN
11
, 1992, SUNDQVIST
241
, 1993).
As interações entre as espécies bacterianas presentes no canal radicular podem ser
consideradas positivas ou negativas. As positivas (mutualismo e comensalismo) ocorrem
quando ambas as espécies são beneficiadas ou apenas uma se beneficia sem que a outra
seja afetada. As negativas (antagonismo e competição) ocorrem quando uma determinada
bactéria se beneficia da outra disputando espaços e nutrientes no interior do canal
radicular ou pela liberação de substâncias (bacteriocinas ou metabólitos) que inibem o
crescimento de outras espécies (GOMES; DRUCKER; LILEY
66
, 1994, GOMES;
DRUCKER; LILEY
64
, 1996, SIQUEIRA et al.
213
, 2002). Relação positiva é a observada
entre os bacilos produtores de pigmento negro (Bacteroides melaninogenicus) que
necessitam de vitamina K que é fornecida por veillonella spp.; hemina, fornecida por
Campylobacter spp., e succinato fornecido por fusobacterium spp., Eubacterium spp.,
Peptostreptococcus spp., Capnocytophaga spp., Eikenella corrodens, Streptococcus spp.
e Actinomyces spp., como subprodutos metabólicos (MAYRAND; MCBRIDE
140
, 1980,
GOMES; DRUCKER; LILEY
65
, 1994, GOMES; LILEY; DRUCKER
64
, 1996). Relação
negativa é encontrada nos facultativos Streptococcus sanguinis, que produzem uma
enzima denominada bacteriocina (sanguina). Essa inibe o crescimento de bactérias
anaeróbias estritas como Prevotella spp. e CO
2
dependentes como Capnocyphaga spp.
(SUNDQVIST
239
, 1992, GOMES; DRUCKER; LILEY
65
, 1994).
Vários outros trabalhos vieram a confirmar o predomínio das espécies anaeróbias
estritas nas infecções endodônticas primárias. Estudos utilizando o método de cultura
microbiológica ou técnicas moleculares, como o PCR, revelaram que as espécies mais
______________________________________________________________________
17
Revisão de Literatura
comumente isoladas de infecções endodônticas primárias pertencem aos gêneros
Fusobacterium, Prevotella, Porphyromonas, Streptococcus, Peptostreptococcus,
Eubacterium, Actinomyces, Propionibacterium, Campylobacter e Selenomonas
(HAAPASALO et al.
79
, 1986, SUNDQVIST; JOHNANSSON; SJÖGREN
238
, 1989,
FUKUSHIMA et al.
58
, 1990, SUNDQVIST
240
, 1992, TANI-ISHII et al.
246
, 1994,
BRAUNER; CONRADS
18
, 1995, WEIGER; WERNER; LÖST
268
, 1995, LE GOFF et
al.
117
, 1997, WADE et al.
257
, 1997, WILLIAMS et al.
270
, 1997, DOUGHERTY et al.
42
,
1998, LANA et al.
114
, 2001, JACINTO et al.
97
, 2003, SOUSA et al.
231
, 2003, GOMES et
al.
71
, 2004).
Investigações procurando caracterizar a microbiota associada a dentes com o
insucesso do tratamento endodôntico mostraram diferenças marcantes em relação aos
casos de infecção primária. MÖLLER
152
(1966) verificou um menor número de
microorganismos presentes no canal radicular de dentes com fracasso da terapia
endodôntica quando comparados aos dentes com polpas necróticas. A média de
microorganismos encontrados nos 120 casos que apresentaram cultura positiva foi de 1,6
espécies por canal. Quanto à composição verificaram um equilíbrio entre as bactérias
anaeróbias facultativas e estritas e um predomínio das gram-positivas correspondendo a
80% das isoladas. Entre as isoladas, o Enterococcus faecalis apresentou uma incidência
de 29% dos casos que apresentaram culturas positivas. ENGSTRÖM
44
, em 1964, também
avaliou a prevalência do gênero Enterococcus spp nas infecções endodônticas e verificou
uma maior prevalência destes microorganismos em canais com tratamento endodôntico
prévio (20,9%) que em canais com necrose pulpar (12,1%).
SUNDQVIST et al.
237
, em 1998, avaliou a flora microbiana presente em dentes
que apresentaram insucesso no tratamento endodôntico. Para tal estudo foram
selecionados 54 pacientes que apresentaram insucesso do tratamento endodôntico
realizado por um período superior a 4 anos. Os casos selecionados para o estudo
apresentavam lesão óssea periapical radiograficamente visível caracterizando a
necessidade de retratamento. Inicialmente procedeu-se a total remoção do material
obturador permitindo que amostras do conteúdo microbiano do canal fossem analisadas.
Em seguida o dente foi retratado e acompanhado por um período de 5 anos. Os resultados
detectaram na maioria dos casos uma monoinfecção constituída principalmente de
______________________________________________________________________
18
Revisão de literatura
microrganismos gram-positivos (87% das bactéris isoladas), com proporções semelhantes
de bactérias anaeróbias facultativas (58%) e estritas (42%). O microrganismo mais
comumente recuperado foi o Enterococcus faecalis isolado em 38% dos canais com
cultura positiva. O tamanho da lesão e a presença de infecção no momento da obturação
tiveram influência negativa sobre o prognóstico. De cada quatro dentes retratados, três
apresentaram sucesso. A presença de Candida spp. foi detectada em 2 casos.
MOLANDER et al.
150
, em 1998, examinaram a condição microbiológica de 100
dentes tratados endodonticamente com periodontite apical radiograficamente visível e 20
dentes sem sinais de patologia periapical. No grupo de dentes com lesão periapical visível
radiograficamente foram isoladas 117 cepas microbianas sendo 114 bactérias e 3 fungos
recuperados em 68 dentes. Na maioria dos casos analisados 1 ou 2 cepas foram
encontradas (85%). As bactérias anaeróbias facultativas gram-positivas foram as
predominantes entre as isoladas (69%). O crescimento bacteriano foi classificado como
esparso ou muito esparso em 53% e como intenso ou muito intenso em 42%.
Enterococcus foi o gênero bacteriano mais encontrado, mostrando crescimento intenso ou
muito intenso em 25 dos 32 casos analisados (78%). Em 11 dentes do grupo sem lesão
periapical visível nenhuma bactéria foi recuperada, enquanto que nos 9 restantes foram
isoladas 13 cepas microbianas, 8 delas tiveram crescimento muito esparso.
A microbiota dos dentes tratados endodonticamente se diferencia, tanto
quantitativamente quanto qualitativamente, dos dentes com polpas necrosadas. A
infecção primária é caracterizada por uma infecção mista na qual predominam bactérias
anaeróbias estritas gram-negativas, a secundária ou persistente é composta de poucas
espécies bacterianas, geralmente gram-positivas anaeróbias facultativas (SIQUEIRA
222
,
2002).
A freqüente correlação entre Enterococcus faecalis e insucesso do tratamento
endodôntico despertou enorme interesse no meio científico desencadeando a realização
de vários trabalhos tendo esta espécie como foco de estudo. PECIULIENE et al.
172
(2000)
investigando 25 dentes tratados endodonticamente, assintomáticos e com periodontites
apicais visíveis radiograficamente encontraram Enterococcus faecalis em 70% das
amostras com crescimento microbiano. Os mesmos autores, em 2001, ampliando a
______________________________________________________________________
19
Revisão de Literatura
amostra do estudo anterior, investigaram a ocorrência de fungos, bacilos entéricos Gram-
negativos e Enterococcus spp. Foram encontrados microorganismos em 33 dos 40 dentes
avaliados. Candida albicans estavam presentes em 6 canais (18% das culturas positivas).
Bacilos entéricos gram-negativos estavam presentes em apenas 3 casos. Enterococcus
spp. estavam presentes em 21 canais (64%), sendo o único componente da microbiota em
11 casos. Todas as cepas foram identificadas como Enterococcus faecalis (PECIULIENE
et al.
173
, 2001).
HANCOCK et al.
81
(2001) avaliaram a composição da microbiota presente em 54
dentes com insucesso do tratamento endodôntico. Foi detectado crescimento bacteriano
em 34 casos. A microbiota era composta predominantemente de microorganismos gram-
positivos (80,4%) com uma única espécie isolada ou em combinações de 2 espécies. Os
gêneros mais isolados foram: Actinomyces, Enterococcus, Peptostreptococcus e
Streptococcus. Candida albicans foi detectada em apenas 1 caso. Dentre as espécies
bacterianas, o E. faecalis foi o mais frequentemente isolado estando presente em 30% das
amostras com crescimento bacteriano.
PINHEIRO et al.
179
(2003) através da avaliação microbiológica de canais
radiculares que necessitavam de retratamento endodôntico verificaram que o E. faecalis
foi a espécie bacteriana mais comumente recuperada sendo identificada em 52,94% (27
casos) dos canais radiculares com crescimento microbiano. O estudo revelou um dos
maiores índices de cultura pura de E.faecalis já publicados. Dos 27 casos em que foram
identificados, 18 tiveram esta espécie como único microorganismo identificado.
Durante o desenvolvimento de estudos que utilizam o método de cultura
microbiológica como forma de identificação de microorganismos uma porcentagem de
culturas negativas pode ser observada. O número de células coletadas pode estar abaixo
do nível de detecção do método, inviabilizando o isolamento de determinadas espécies. A
utilização de métodos genéticos, em especial o PCR, permite a detecção do DNA das
espécies bacterianas, sendo, portanto, mais sensíveis que o método da cultura, além de
poder identificar cepas de cultivo difícil ou até mesmo impossível (SIQUEIRA;
ROÇAS
218
, 2004). ROLPH et al.
190
(2001) compararam os métodos de cultura e PCR para
identificação da microbiota de canais radiculares com polpas necrosadas e com
______________________________________________________________________
20
Revisão de literatura
tratamento endodôntico prévio. Os autores relataram que houve um maior número de
resultados positivos pelo método do PCR do que pela cultura, especialmente em casos de
retratamento. RÔÇAS; SIQUEIRA; SANTOS
188
(2004) utilizando o PCR compararam a
prevalência do Enterococcus faecalis em canais não tratados e em canais com tratamento
endodôntico prévio associados a lesões periapicais crônicas. O E. faecalis foi isolado em
20 dos 30 dentes com insucesso do tratamento endodôntico (67%) e em 9 dos 50 casos de
infecções primárias (18%).
SIQUEIRA; RÔÇAS
218
(2004) investigaram a ocorrência de 19 espécies
microbianas em 22 amostras de canais radiculares de dentes com insucesso do tratamento
endodôntico. Todas as amostras foram positivas para pelo menos uma das seguintes
bactérias gram-positivas: Enterococcus faecalis, Pseudoramibacter alactolyticus ou
Propionibacterium propionicum. E. faecalis foi a espécie mais prevalente, ocorrendo em
77% dos casos. Candida albicans foi isolada em 9% das amostras.
GOMES et al.
72
(2006) investigaram a prevalência do Enterococcus faecalis em
canais com necrose pulpar e em canais com insucesso do tratamento endodôntico
utilizando a cultura e o PCR como métodos de avaliação. Para o estudo foram
selecionados 50 dentes com insucesso endodôntico e 50 dentes com infecções primárias.
Nos casos de retratamento, Enterococus faecalis foi encontrado em 21casos (42%) pela
cultura e em 38 casos (76%) pela análise do PCR. Já nos 50 casos de infecção primária,
esta espécie esteve presente em 2 (4%) e 41 (82%) canais, respectivamente, pela cultura e
PCR. Esses resultados mostraram que o E. faecalis está presente em canais com polpas
necrosadas, porém em quantidades bem pequenas, não detectáveis pelo método da
cultura. Segundo os autores, o crescimento dessa espécie bacteriana pode ser favorecido
por mudanças ecológicas no canal radicular após o preparo químico-mecânico ou
obturação deficiente do canal radicular, tornando possível sua detecção nas culturas
microbiológicas nesses casos.
A microbiota associada a dentes tratados endodonticamente é resultado da ação de
fatores seletivos que determinam à persistência de determinadas espécies. Geralmente as
bactérias anaeróbias facultativas são mais resistentes aos procedimentos antimicrobianos
e medicamentosos utilizados na terapia endodôntica que as bactérias anaeróbias estritas.
______________________________________________________________________
21
Revisão de Literatura
Além disso, são capazes de sobreviver em um ambiente escasso de nutrientes
permanecendo em uma fase latente, com uma baixa atividade metabólica a espreita de
melhores condições para ativar o seu crescimento (MOLANDER et al.
150
, 1998;
SUNDQVIST et al.
237
, 1998). Outras possibilidades seriam a de que estes
microorganismos penetram no canal radicular durante o tratamento endodôntico através
de um isolamento inadequado do campo operatório, infiltração advinda de um material
restaurador temporário ou quando o canal é deixado aberto para uma suposta drenagem
do canal (ENGSTRÖN
44
, 1964, SIRÉN et al
225
, 1997, WALTIMO et al.
264
, 1997;
HEILING et al.
87
, 2002).
A virulência do Enterococcus faecalis pode ser explicada pela produção de
elastase, proteases e hemolisinas que possuem papéis relevantes na patogênese das
periodontites. Além destes fatores, várias cepas podem produzir betalactamase, tornando-
os capazes de causar infecções difíceis de serem tratadas (RAMS et al.
185
, 1992,
SUNDQVIST
239
, 1992). A aderência a células teciduais, a expressão de proteínas que
asseguram a sobrevivência celular frente a alterações no suprimento nutricional, a
habilidade de competir com outras células bacterianas e de alterar a resposta tecidual e
ambiental são exemplos de fatores de virulência que permitem a persistência dos
Enterococcus (KAYAOGLU; ØRSTAVIK
108
, 2004).
A parede celular das bactérias Gram-positivas também está envolvida em
processos infecciosos e “flare-ups” dos canais radiculares exercendo importante papel na
patogenicidade destes microorganismos. A parede celular é constituída quimicamente de
peptideoglicano e ácido lipoteicóico. A inflamação aguda induzida pelos componentes da
parede celular pode evoluir para um processo crônico, com um curso prolongado. Ácido
lipoteicoico isolados de cepas de E. faecalis ou de outras bactérias gram-positivas tem a
capacidade de estimular leucócitos a liberarem diversos mediadores que exercem papéis
relevantes em diversas fases do processo inflamatório. Frente à estimulação com LTA,
culturas de monócitos humanos liberam TNF-α, IL-1β e IL-6 (BHAKDI et al.
15
, 1991) e
leucócitos do sangue liberam IL-8 (SAETRE et al.
191
2001). A liberação de PGE2 por
macrófagos peritoniais de camundongos (CARD; JASUJA; GUSTAFSON
27
, 1994), de
enzimas lizossomais por macrófagos peritoniais de ratos (HARROP et al.
82
, 1980) e de
íon superóxido pelos monócitos humanos, também tem sido relatadas (LEVY et al.
123
,
______________________________________________________________________
22
Revisão de literatura
1990). Além disso, ativa o sistema complemento e atua como um estimulador policlonal
de linfócitos B (SCHONFELD et al.
198
, 1982). O ácido lipoteicóico induz reabsorção
óssea em culturas de tecido (MEIKLE et al.
143
, 1982).
Fungos podem ser isolados de canais radiculares infectados em culturas puras e
associados a bactérias. A ocorrência em culturas puras em casos de periodontite apical
indica o potencial patogênico destes microorganismos em canais radiculares infectados.
A habilidade de espécies de Candida para sobreviver em um ambiente com escassez de
nutrientes e de resistir à ação de medicamentos comumente utilizados na endodontia
podem fornecer importante vantagem ecológica para sobrevivência deste grupo de
microorganismos nos canais radiculares (WALTIMO et al.
262
, 2003). Alguns fatores de
virulência apresentados pelos fungos contribuem para sua capacidade de infectar o tecido
pulpar e a dentina. A aderência permite a colonização de tecidos dentais duros, a
formação de hifas determina um incremento na patogenicidade, o tigmotropismo
favorece a invasão de túbulos dentinários, a secreção de proteases que digerem uma
variedade de proteínas teciduais e contribuem para sobrevivência em períodos de baixa
oferta nutricional e alterações fenotípicas que permitem a sua adaptação em condições
ambientais desfavoráveis. (SWEET
244
, 1997).
Os fungos são patógenos oportunistas e a espécie Candida albicans é a mais
comumente associada a infecções em humanos. A ocorrência de fungos em canais
radiculares infectados tem sido relatada por estudos empregando cultura microbiológica,
microscopia óptica e eletrônica ou métodos moleculares. SEN et al.
201
(1995) observaram
por microscopia eletrônica de varredura a colonização maciça de leveduras em 4 de 10
dentes extraídos associados a lesões perirradiculares. Em um espécime hifas também
foram visualizadas. SIQUEIRA et al.
215
(2002) investigaram o padrão de colonização
microbiana em infecções endodônticas primárias através de microscopia eletrônica de
varredura e encontraram fungos em forma de leveduras em 1 de 15 espécimes avaliados.
BAUMGARTHER et al.
12
(2000) detectaram C. albicans utilizando PCR em 21% das
amostras coletadas de canais radiculares infectados. Por sua vez, SIQUEIRA et al.
216
(2002) utilizando o mesmo método de avaliação detectaram fungos em apenas 2% dos
casos de infecção endodôntica primária.
______________________________________________________________________
23
Revisão de Literatura
Embora fungos sejam apenas ocasionalmente encontrados em infecções
endodônticas primárias, estes microorganismos têm sido mais freqüentemente isolados
em casos de infecções endodônticas secundárias ou persistentes, muitas vezes associadas
ao fracasso da terapia endodôntica. Utilizando microscopia óptica e de varredura, NAIR
et al.
154
(1990) encontraram leveduras em 2 de 9 espécimes de lesões refratárias à terapia
endodôntica. WALTIMO et al.
264
(1997) analisando 967 amostras de canais radiculares
que não responderam positivamente ao tratamento endodôntico, relataram a ocorrência de
fungos em 7% dos casos com cultura positiva. Em 6 casos os fungos foram isolados em
culturas puras e em 41 estavam associados a bactérias. Outras espécies de fungos, como
Candida glabrata, Candida guilliermondii, Candida inconspicua e Geotrichium
candidum, também foram encontradas. SUNDQVIST et al.
237
(1998) isolaram C.
albicans em 2 de 24 canais (8,3%), enquanto que MOLANDER et al.
150
(1998)
encontraram fungos em 3 de 68 canais (4,4%). HANCOCK et al.
81
(2001) isolaram C.
albicans de 3% dos casos de fracasso da terapia endodôntica. Por sua vez, PECIULIENE
et al.
173
(2001) isolaram C. albicans de 18% dos casos em que a terapia endodôntica
fracassou, sempre associada com bactérias. SIQUEIRA; RÔÇAS
218
(2004) detectaram C.
albicans em 9% dos casos de fracasso da terapia endodôntica por meio de PCR. Tais
relatos sugerem que fungos podem ser resistentes à terapia endodôntica. De fato, tem sido
demonstrado que espécies de Candida podem ser resistentes a medicamentos e
substâncias comumente empregados em Endodontia, como o hidróxido de cálcio
associado a veículos inertes (WALTIMO et al.
259
2000).
Tanto E. faecalis como C.albicans, pela capacidade de resistir ao tratamento
endodôntico, têm sido utilizados em vários estudos como parâmetro para verificar a
efetividade de procedimentos antimicrobianos (HAPAPASALO; ØRSTAVIK
78
, 1987,
SAFAVI et al.
194
, 1990, ØRSTAVIK; HAPAPASALO
167
,
1990, SIQUEIRA et al.
220
,
1996, GOMES et al.
69
, 2001, SIQUEIRA et al.
214
, 2003).
______________________________________________________________________
24
Revisão de literatura
2.1 Distribuição dos microorganismos no sistema de canais radiculares
O microambiente endodôntico devido a sua anatomia complexa e singular faz
com que a infecção instalada no sistema de canais radiculares possua algumas
peculiaridades que a tornam diferente de outras regiões do organismo. Uma vez
estabelecida ela não é passível de remissão espontânea pela ação de mecanismos de
defesa do hospedeiro e tampouco pode ser tratada por antibioticoterapia sistêmica. A
polpa necrosada é desprovida de irrigação sanguínea inviabilizando que células e
moléculas de defesa, assim como antibióticos sistêmicos, possam atingir o sítio infectado.
As defesas do hospedeiro são apenas eficazes em impedir a disseminação da infecção,
mas não são capazes de eliminá-la. A maioria das células microbianas encontra-se em
suspensão nos fluidos presentes na luz do canal principal. Entretanto, agregados
microbianos são usualmente visualizados colonizando as paredes do canal formando
multicamadas celulares. A infecção pode também se propagar para túbulos dentinários e
para variações da anatomia interna, as quais consistem mais em regra do que em exceção,
principalmente no terço apical do canal. Além disso, esses microorganismos podem
colonizar a superfície radicular externa próximo ao forame apical se organizando em
verdadeiros biofilmes dificultando bastante seu combate e contribuindo para o insucesso
endodôntico (LOPES; SIQUEIRA
130
, 2004).
A dentina é um tecido conjuntivo mineralizado de estrutura não maciça. Túbulos
dentinários percorrem toda sua extensão, desde a junção dentino-pulpar até as junções
amelo-dentinária e cemento-dentinária. O diâmetro dos túbulos dentinários é inteiramente
compatível com o da maior parte das bactérias presentes na cavidade oral, variando de
2,5 µm próximo à polpa, 1,2 µm na dentina mediana e 0,9 µm próximo ao cemento
(GARBEROGLIO; BRANNSTRÖM
60
, 1976). Os túbulos dentinários também variam na
sua quantidade dependendo da localização. Na junção dentino-pulpar, os túbulos
dentinários atingem aproximadamente 45.000 túbulos/mm
2
. A área ocupada pelos túbulos
nesta região corresponde a 22% da superfície total. À medida que se distancia da polpa,
em direção à periferia, a densidade tubular diminui podendo alcançar cerca de 15.000
túbulos/mm
2
cerca de 1% da superfície total. A dentina exposta, devido ao seu diâmetro e
quantidade de túbulos, permite que microorganismos invadam e multipliquem-se no seu
interior, caso encontrem condições favoráveis. A penetração bacteriana intratubular foi
______________________________________________________________________
25
Revisão de Literatura
confirmada por vários estudos (AKPATA; BLECHMAN
1
, 1982, STEVENS;
GROSSMAN
233
, 1983, BYSTRÖN; CLAESSON; SUNDQVIST
20
, 1985, MERYON;
JAKEMAN; BROWNE
145
, 1986, MICHELICH et al.
147
, 1980, HAAPASALO;
ØRSTAVIK
78
, 1987, ANDO; HOSHINO
5
, 1990, PEREZ et al.
175
, 1993, LOVE
131
, 1996,
SIQUEIRA et al.
219
, 1996). Além de bactérias, fungos também já foram observados no
interior de túbulos dentinários (SEN et al.
201
, 1995, SIQUEIRA; SEN
223
, 2004).
Os túbulos dentinários sadios são preenchidos em seu interior por prolongamentos
odontoblásticos, fibras colágenas, fluido dentinário e algumas vezes fibras nervosas. O
fluido dentinário ocupa cerca de 22% do volume da dentina e consiste em um transudato
de plasma oriundo da microcirculação pulpar que banha toda a extensão tubular. Sua
composição é similar ao fluido intercelular contendo basicamente água, íons e moléculas.
Devido à ação da pressão intrapulpar, o fluxo do fluido dentinário tem direção periférica
dificultando a penetração microbiana em dentes vitais (PASHLEY
171
, 1996).
Um dos primeiros estudos divulgados na literatura que buscava avaliar a
disseminação da infecção no sistema de canais radiculares foi o desenvolvido por
SHOVELTON
205
(1964). Foram selecionados 97 dentes de pacientes, clinicamente sem
vitalidade pulpar, decorrentes de cárie ou trauma, os quais foram extraídos e cortados
transversal e longitudinalmente nos terços cervical, médio e apical. Após o
processamento histológico para avaliação microscópica, verificou-se um menor número
de microorganismos na região apical quando comparados ao terço médio e,
principalmente, com o terço cervical. Os dentes relacionados a casos de agudecimentos,
sempre apresentaram bactérias no canal radicular, mas a porção de invasão dentinária era
menor do que nos dentes com processos crônicos como granulomas e lesão apical
radiograficamente visível. Estes achados foram extremamente significativos para a
endodontia, dando origem às técnicas escalonadas, reforçando a preocupação com a
desinfecção, visto que essas promovem maior desgaste a nível dos terços cervicais e
médios, os mais contaminados.
O microambiente dos túbulos dentinários parece favorecer o crescimento de
algumas espécies bacterianas sem restrições à natureza da causa do processo infeccioso.
Estas constituem um importante reservatório bacteriano dos canais radiculares infectados,
______________________________________________________________________
26
Revisão de literatura
sendo capazes de reinfectá-lo durante ou após o tratamento endodôntico. O caminho da
reinfecção parece estar relacionado com infiltrações coronárias causadas por restaurações
temporárias ou permanentes inadequadas, e possivelmente de bactérias alojadas nos
túbulos dentinários, multiplicando-se em condições favoráveis (OGUNTEBI
159
, 1994).
A capacidade microbiana de invasão em túbulos dentinários é influenciada
diretamente pela presença ou ausência de vitalidade pulpar. Através de microscopia
óptica e eletrônica de varredura NAGAOKA et al.
153
, em 1995, verificaram os efeitos da
polpa dentária sobre a penetração bacteriana nos túbulos dentinários. Os autores
analisaram o grau de invasão tubular de dentes vitais e desvitalizados quando expostos ao
meio bucal por 30 e 150 dias. Observaram que o tempo de exposição e a ausência de
vitalidade pulpar favorecem a penetração. A presença de prolongamentos
odontoblásticos, de fibras colágenas, da lâmina limitante e do fluido dentinário em
túbulos de uma dentina vital pode retardar a invasão intratubular. Por outro lado, túbulos
dentinários de dentes tratados endodônticamente ou com polpa necrosada são facilmente
invadidos por bactérias. Outros fatores, tais como esclerose dentinária, dentina
reparadora, smear layer e a deposição de proteínas plasmáticas, como o fibrinogênio nas
paredes tubulares, podem limitar ou impedir o avanço bacteriano via túbulos dentinários.
Anticorpos e componentes do sistema complemento presentes no fluido dentinário
também podem ajudar a conter a invasão bacteriana (KIM et al.
110
, 2002).
A profundidade de penetração bacteriana também tem sido bastante avaliada.
Apesar de uma penetração mais superficial ser o achado mais comum, há regiões em que
bactérias são visualizadas a uma profundidade de 300 - 400 µm no interior tubular.
PETERS et al.
177
(2001), em estudo in vivo, isolaram e identificaram bactérias presentes
em túbulos dentinários em diferentes profundidades. O maior número de células
bacterianas foi detectado próximo à luz do canal principal, mas bactérias também foram
detectadas em 62% dos dentes em amostras de dentina mais periférica, próxima ao
cemento. LOPES; SIQUEIRA
130
(2004) ressaltam que a infecção tubular não é uniforme.
Enquanto alguns túbulos podem ser densamente infectados, a maioria dos túbulos
adjacentes mantém-se livres de infecção. A razão para isto não é aparente, mas pode estar
relacionada a fatores nutricionais, anatômicos e aos tipos de espécies microbianas que
estão infectando o canal. A multiplicação celular é decisiva para o alcance de maior
______________________________________________________________________
27
Revisão de Literatura
profundidade de penetração nos túbulos. A observação de bactérias se dividindo no
ambiente intratubular indica a presença de nutrientes disponíveis nesta região.
Com o propósito de investigar a distribuição da microbiota dos canais radiculares
infectados e o grau de penetração bacteriana nos túbulos dentinários SEN et al.
201
, em
1995, examinaram pela microscopia eletrônica de varredura 20 dentes humanos recém-
extraídos. Constatou-se em seis espécimes, a presença acentuada de bactérias em forma
de cocos e bastonetes, constituindo-se em colônias, principalmente nas paredes dos
canais, e também, em grau variado, penetrando nos túbulos dentinários dos terços médio
e apical das raízes. A profundidade atingida pelas bactérias nos túbulos dentinários foi em
média de 50µm, somente em dois espécimes algumas atingiram 150 µm de profundidade.
Penetração bacteriana não foi comum a todos os túbulos dentinários, enquanto
aglomerados bacterianos eram evidentes em alguns túbulos, outros permaneciam isentos
de suas presenças. Além de cocos e bastonetes, observaram-se fungos em 4 espécimes, e
estes encontravam-se juntos às paredes dos canais. Os autores sugeriram o emprego de
agentes antimicrobianos intracanal entre sessões, como terapia complementar.
Estudando a capacidade da distribuição bacteriana nos túbulos dentinários,
LOVE
131
, em 1996, avaliou os terços cervical, médio e apical da dentina radicular de
dentes humanos recém-extraídos e isentos de cárie. Após preparo, padronização e
esterilização, os espécimes foram inoculados com Streptococcus gordonii e incubados em
meio de cultura em anaerobiose por sete dias. Os resultados mostraram um padrão similar
de invasão tubular nos terços cervical e médio das raízes, caracterizada por uma intensa
camada superficial de penetração envolvendo a maioria dos túbulos, mas com
distribuição e profundidade variáveis. Diferentemente, no terço apical, observou-se
poucos túbulos infectados, salvo em um caso onde a dentina da camada superficial
externa encontrava-se desnuda, devido à reabsorção externa. A extensão média de
penetração bacteriana nos terços médio e cervical foi de 200 µm e no apical 60 µm. Os
resultados indicam que há uma variação na extensão de invasão bacteriana de túbulos
dentinários de canais radiculares infectados. O padrão de invasão favorecia uma técnica
de instrumentação endodôntica que resultasse em preparação apical mínima, devido à
mínima e limitada penetração, mas que o alargamento no sentido coronal removesse a
grande quantidade de dentina infectada nos terços cervical e médio.
______________________________________________________________________
28
Revisão de literatura
A capacidade de penetração bacteriana nos túbulos dentinários foi avaliada por
SIQUEIRA et al.
219
(1996) utilizando cilindros de dentina obtidos a partir de incisivos
bovinos recém-extraídos. Após a padronização e preparo dos espécimes, estes foram
submetidos à contaminação pelas seguintes bactérias: Porphyromonas endodontalis,
Porphyromonas gingivalis, Fusobacterium nucleatum, Actinomyces israelli,
Propionibacterium acnes e Enterococcus faecalis. A análise através de microscopia
eletrônica de varredura mostrou que todas as espécies bacterianas foram capazes de
penetrar nos túbulos dentinários em diferentes profundidades. A maioria dos túbulos
dentinários continha células bacterianas em seu interior a uma grande extensão. Bactérias
localizadas nos túbulos dentinários a uma pequena distância da superfície pulpar podem
ser removidas pela preparação mecânica dos canais radiculares ou serem destruídas pela
ação química das soluções irrigadoras; opostamente, aquelas localizadas mais
profundamente podem sobreviver.
RIBEIRO
186
(1997) por meio da análise histológica de 32 raízes dentárias com
lesões periapicais, firmemente aderidas em seus ápices, e de 16 lesões isoladas, verificou
a alta freqüência de bactérias gram-positivas e gram-negativas no lume dos canais
principais e das ramificações constituintes do delta apical e, também, em menor
proporção, nos túbulos dentinários, nos cementoplastos, na superfície externa e nos
granulomas. Concluiu, portanto, que nos casos de necrose pulpar e granulomas
periapicais as bactérias poderiam envolver todo o sistema de canais radiculares. Enfatizou
ainda a necessidade do auxilio de substâncias químicas no preparo biomecânico, emprego
de curativos entre sessões, além do saneamento adequado durante o tratamento.
A penetração intratubular do Enterococcus faecalis e da Candida albicans foi
avaliada por WALTIMO et al.
261
, em 2000, através de um modelo experimental
utilizando dentes humanos. Os autores verificaram a penetração dentinária de C.albicans
em seis dos 12 espécimes analisados, num intervalo de 3 a 14 dias, enquanto que o E.
faecalis penetrou francamente em todas as amostras num período de 1 a 5 dias.
MATSUO et al.
138
(2003) relataram as espécies microbianas mais frequentemente
isoladas do interior dos túbulos dentinários. Através de análise imuno-histológica de
______________________________________________________________________
29
Revisão de Literatura
dentes extraídos que apresentavam infecção endodôntica primária, relataram que 70 %
dos casos apresentavam bactérias invadindo túbulos dentinários. As espécies mais
encontradas foram F. nucleatum, Pseudoramibacter alactolyticus, Eubacterium nodatum,
Lactobacillus casei e Peptostreptococcus micros.
Além da colonização em todo o sistema de canais radiculares, outro importante
sítio de instalação da infecção em dentes com necrose pulpar e lesão periapical
radiograficamente visível é a superfície radicular externa. Recentemente, importante
atenção tem sido dispensada para o estudo dos biofilmes microbianos. POTERA
183
, em
1996, observou que nos biofilmes as bactérias encontram-se coagregadas em torno de
uma trama perfurada de fibras entrelaçadas de polissacarídeos, conectando cordões de
células a uma superfície dura. No interior desse microcosmo, bactérias aeróbicas e
anaeróbicas prosperam lado a lado, compartilhando de água e de uma estrutura complexa.
Enquanto alguns microrganismos liberam hidrogênio, outros o ingerem para reduzir
dióxido de carbono a metano. A camada de polissacarídeo funciona como um escudo
resistente à ação de antibióticos e grandes o suficiente para frustrar o sistema imune.
Bactérias dos biofilmes são morfologicamente distintas daquelas livres e qualquer
bactéria tem a capacidade de formá-lo diante de condições favoráveis podendo atingir 50
a 100µm de diâmetro em média.
TRONSTAD; BARNETT; CERVONE
250
, em 1990, estudaram a superfície
radicular dos terços apicais, de dez dentes portadores de lesões periapicais persistentes
após tratamento endodôntico convencional, removidos cirurgicamente. Observaram-se
microorganismos em todos os espécimes analisados ora formando colônias, ora
agregados localizados em áreas irregulares da superfície radicular entre feixes de fibras
colágenas e células. Além de cocos e bacilos, formas filamentosas ou fibrilares foram
também identificadas.
SIQUEIRA; LOPES
211
(2001) relataram baixa incidência de biofilmes
perirradiculares em dentes não tratados endodonticamente com lesão periapical (4% dos
casos). Já em estudo realizado em 2002, LEONARDO
120
et al. verificaram a formação de
biofilmes periapicais em dentes com necrose pulpar, com e sem lesão radiograficamente
visível, e em dentes vitais. Foram utilizados no estudo 21 dentes extraídos sendo que 8
______________________________________________________________________
30
Revisão de literatura
apresentavam necrose pulpar e lesão periapical, 8 com necrose pulpar sem lesão
radiograficamente visível e 5 com polpa vital. As raízes foram seccionadas e os três
milímetros apicais processados para microscopia eletrônica de varredura. As superfícies
radiculares foram avaliadas quanto a presença de microrganismos, reabsorção radicular e
biofilme. Os resultados demonstraram não existir microrganismos na superfície radicular
apical de nenhum dente com polpa vital ou com poupa necrosada sem lesão periapical
radiograficamente visível. Já para dentes com necrose pulpar e lesão periapical
radiograficamente visível foram observados microrganismos em todas as amostras. Estes
incluem cocos, bacilos, filamentosos e a presença de um biofilme apical.
______________________________________________________________________
31
Revisão de Literatura
2.3 Medicação intracanal
2.3.1 Relevância do emprego de medicação intracanal em endodontia
Embora uma redução significativa no número de microorganismos na luz do canal
principal possa ser obtida pelos efeitos químicos e mecânicos da irrigação e
instrumentação, alguns patógenos podem permanecer viáveis em regiões inacessíveis a
estas manobras. A medicação intracanal para uso endodôntico deve possuir ação
antimicrobiana, com potencial para eliminar microorganismos remanescentes ao preparo
químico-mecânico. Diversos patógenos, inclusive E. faecalis e C. albicans, têm
demonstrado a capacidade de invadir túbulos da dentina radicular e de instalar uma
infecção intratubular, sendo freqüentemente associados a casos de insucesso do
tratamento. Possivelmente, por potencializar a eliminação de microorganismos, o
emprego de medicamentos intracanais está diretamente relacionado a uma melhor
reparação dos tecidos periapicais e, consequentemente, a um maior índice de sucesso da
terapia de dentes com canais infectados (BYSTRÖM et al.
21
, 1987, SJÖGREN et al.
279
,
1990, HOLLAND; SOARES; SOARES
94
, 1992, KATEBZADEH; HUPP; TROPE
106
,
1999, TROPE; DELANO; ØRSTAVIK
252
, 1999, KATEBZADEH; SIGURDSSON;
TROPE
107
, 2000).
Microorganismos que sobrevivem no sistema de canais radiculares após o preparo
químico-mecânico têm demonstrado um rápido crescimento quando o canal é deixado
vazio sem nenhum medicamento entre as sessões de trabalho (SJÖGREN et al.
228
, 1991,
TROPE; BERGENHOLTZ
251
, 2002). Este crescimento é sustentado pela restauração de
um ambiente favorável à proliferação de anaeróbios e pela possível infiltração de fluidos
teciduais após o selamento do canal com material restaurador provisório.
Medicamentos aplicados em toda a extensão do canal radicular funcionam como
uma barreira física impedindo o suprimento de substrato e ocupando espaços, a fim de
limitar a multiplicação microbiana (CHONG; PITT FORD
31
, 1992). As pastas de
hidróxido de cálcio funcionam como uma barreira físico-química, retardando
significativamente a recontaminação do canal, quando da exposição à saliva por perda do
selador coronário.
______________________________________________________________________
32
Revisão de literatura
Além dos efeitos antimicrobianos, outras características são importantes para a
seleção de um bom curativo intracanal. A redução da inflamação periapical é importante
objetivo a ser alcançado tanto na periodontite apical aguda, reduzindo a sintomatologia,
quanto na periodontite apical crônica favorecendo o processo de reparo. Outro importante
aspecto seria a solubilização de matéria orgânica, já que a permanência de resíduos
poderia funcionar como reservatório de microorganismos, comprometendo o sucesso da
terapia endodôntica a longo prazo (LOPES; SIQUEIRA
130
, 2004).
A medicação intracanal ideal deve também apresentar a propriedade de
neutralização de produtos tóxicos. Devido a grande presença de bactérias gram-negativas
entre os patógenos endodônticos, a neutralização de LPS pelo medicamento pode ser
determinante para o sucesso da terapia, já que esta endotoxina exerce importante papel na
etiopatogenia das doenças da polpa e dos tecidos perirradiculares (TANOMARU et al.
248
,
2003). Entre outros aspectos apontados como objetivos para utilização de medicação
intracanal pode-se destacar a eliminação de exsudatos persistentes criando condições
favoráveis para obturação, a não agressão aos tecidos periapicais, a estimulação à
reparação por tecido mineralizado e o combate à reabsorção dentinária inflamatória
(LOPES; SIQUEIRA
130
, 2004).
A demonstração da importância do emprego do curativo de demora para
reparação foi feita por KATEBZADEH; HUPP; TROPE
106
(1999) em estudo histológico
em dentes de cães. Os autores avaliaram o reparo de lesões perirradiculares após o
tratamento endodôntico efetuado em uma e duas sessões. Os canais foram irrigados com
solução salina e no grupo de duas sessões foi utilizada medicação com hidróxido de
cálcio. Após 6 meses, a análise histológica revelou que houve significativamente menos
inflamação perirradicular no grupo tratado em duas sessões. Em outro estudo também em
cães, mas realizando análise radiográfica do sucesso, KATEBZADEH; SIGURDSSON;
TROPE
107
(2000) revelaram melhores resultados também para o grupo de duas sessões
(15,8%), o qual apresentou um significativo menor número de casos de insucesso que o
grupo de sessão única (41,2%).
Em estudo clínico, TROPE; DELANO; ØRSTAVIK
252
(1999) compararam
radiograficamente o sucesso de dentes tratados em sessão única ou em duas sessões.
______________________________________________________________________
33
Revisão de Literatura
Todos os tratamentos foram efetuados pelo mesmo operador, empregando sempre a
mesma técnica de instrumentação e o mesmo tipo de solução irrigadora (NaOCl 2,5%).
No grupo de duas sessões, o hidróxido de cálcio foi a medicação utilizada por no mínimo
uma semana. A proservação de 1 ano revelou um índice de sucesso de 64% dos casos
concluídos em sessão única e 74% para os efetuados em duas sessões. A ação
desinfetante adicional da medicação intracanal elevou em 10% o índice de sucesso do
tratamento. Tal diferença foi considerada clinicamente relevante.
LEONARDO et al.
121
(2002) avaliaram a reparação apical e periapical utilizando
curativos de demora para canais radiculares à base de hidróxido de cálcio por diferentes
períodos de tempo em dentes com lesões periapicais induzidas. Um total de 61 canais
radiculares de pré-molares superiores e inferiores de 4 cães foram utilizados. Após o
preparo biomecânico dos canais radiculares através de técnica coroa-ápice e emprego de
hipoclorito de sódio a 5,25% como solução irrigadora, os forames apicais foram
alargados em todos os casos. Foi aplicado curativo de demora à base de hidróxido de
cálcio, sendo que o grupo controle não recebeu medicamento. Os animais foram mortos
após 7, 15, 30 dias. Após preparação histológica, secções seriadas foram coradas com
hematoxilina e eosina e tricrômico de Mallory. Os autores concluíram que os melhores
resultados histopatológicos ocorreram aos 15 e 30 dias, e os piores resultados aos 7 dias e
com o grupo controle.
HOLLAND et al.
93
(2003) realizaram estudo objetivando analisar o processo de
reparo em dentes com periodontite apical após o tratamento do canal radicular em uma ou
duas sessões. Pré-molares e dentes anteriores de cães (n = 60) foram expostos à cavidade
bucal por 6 meses para o desenvolvimento de lesões periapicais. Após o período de
contaminação, os canais foram submetidos ao preparo químico-mecânico utilizando
NaOCl 2,5% como solução irrigadora. Os dentes foram obturados empregando-se guta-
percha e cimento Sealapex através da técnica de condensação lateral. Vinte dentes foram
obturados em sessão única, imediatamente após a instrumentação. Os demais 40 dentes
foram divididos em dois grupos onde o hidróxido de cálcio foi utilizado como medicação
intracanal por 7 e 14 dias. Após 6 meses, os animais foram sacrificados e os tecidos
preparados para análise histomorfológica. Os melhores resultados foram verificados para
os espécimes submetidos ao hidróxido de cálcio por 14 dias, seguido pelo emprego por 7
______________________________________________________________________
34
Revisão de literatura
dias e pela obturação em sessão única. Foi concluído que o uso do curativo de hidróxido
de cálcio favorece a obtenção de melhores resultados que a obturação em sessão única.
Questionamentos sobre o papel dos microorganismos sobreviventes às medidas de
desinfecção têm sido relatados declarando que a quantidade de nutrientes disponíveis e a
capacidade de sobreviver em condições de carência nutricional são fundamentais para
manutenção da viabilidade (PETERS; WESSELINK; MOORER
178
, 1995). O fracasso da
terapia endodôntica somente poderá ser atribuído a estes microorganismos se for possível
o acesso aos tecidos periapicais, se forem patogênicos e se estiverem em número
suficiente para induzir ou perpetuar uma lesão periapical (LOPES; SIQUEIRA
130
, 2004).
Portanto, alguns pesquisadores defendem a não utilização de medicação intracanal
procedendo-se à obturação em sessão única.
WEIGER; ROSENDAHL; LÖST
267
(2000) realizaram estudo clínico, a fim de
explorar a influência do curativo de hidróxido de cálcio no reparo de lesões periapicais
em dentes que não haviam sido previamente tratados endodonticamente. Após a
instrumentação dos canais radiculares utilizando o NaOCl 1% como solução irrigadora,
31 dentes foram submetidos a aplicação de medicação intracanal por pelo menos 1
semana. Outros 36 dentes foram submetidos ao tratamento em sessão única. Os critérios
para caracterização do sucesso foram clínicos e radiográficos, através da ausência de
sintomas e da presença de espessura normal do ligamento periodontal. Os resultados
demonstraram que ambas as formas de tratamento apresentaram possibilidade de sucesso
superior a 90% dentro de um período de 5 anos de proservação. Não foi observada
diferença estatisticamente significante entre os dois grupos. Portanto, do ponto de vista
microbiológico, o tratamento em sessão única proporciona condições ambientais
favoráveis ao reparo da mesma forma que aquelas obtidas pelo tratamento em duas
sessões utilizando o hidróxido de cálcio como medicação intracanal.
KVIST et al.
114
(2004) compararam a eficácia antimicrobiana do tratamento
endodôntico realizado em uma única sessão e em duas sessões com a aplicação de
hidróxido de cálcio como medicação intracanal. Dentes com periodontite apical (n = 96)
foram divididos em dois grupos e submetidos à coleta de amostras para cultura antes e
depois da instrumentação e após a aplicação de medicação intracanal. Amostras coletadas
______________________________________________________________________
35
Revisão de Literatura
previamente à instrumentação detectaram microorganismos em 98 % dos dentes. A
instrumentação promoveu significativa redução de microorganismos. Após a aplicação de
medicação, microorganismos residuais foram detectados em 36% dos casos tratados em
duas sessões e em 29% daqueles tratados em sessão única. Nenhuma diferença estatística
entre os grupos foi encontrada. É importante ressaltar que no grupo de sessão única uma
desinfecção final do canal foi realizada através da aplicação de iodeto de potássio
iodetado a 5% por 10 minutos. Os autores concluíram que do ponto de vista
microbiológico, o tratamento de dentes com periodontite apical realizado em duas sessões
não foi mais efetivo que aquele realizado em sessão única.
PETERS et al.
176
(2005) avaliaram o efeito da aplicação ou não de hidróxido de
cálcio como medicação intracanal em dentes com infecção pulpar e lesão periapical
associada. Amostras dos canais radiculares dos 42 dentes selecionados foram coletadas
antes (amostra 1) e após (amostra 2) o tratamento durante a primeira sessão; e antes
(amostra 3) e após (amostra 4) o tratamento durante a segunda sessão. Na primeira sessão
os dentes foram instrumentados e metade deles obturados com pasta de hidróxido de
cálcio e a outra metade obturada definitivamente com guta-percha e cimento AH-26.
Após intervalo de quatro semanas de ação dos medicamentos procedeu-se à obturação
definitiva do canal. A média das unidades formadoras de colônia nas culturas positivas
diminuiu significativamente após a preparação do canal radicular durante a primeira
visita de 1,0 x 10
6
(amostra 1) para 1,8 x 10
3
(amostra 2). Entre as sessões, observou-se
um aumento no número de microorganismos para 9,3 x 10
3
(amostra 3). Não houve
diferença significativa no número de UFC entre as amostras coletadas ao fim da primeira
(amostra 2) e segunda sessão (amostra 4). As espécies mais frequentemente isoladas
foram Prevotella intermedia, Capnocytophaga spp., Actinomyces odontolyticus,
Propionibacterium acnes e Peptostreptococcus micros. Apesar do uso de pasta de
hidróxido de cálcio entre sessões, detectou-se um aumento de culturas positivas. Os
autores concluíram que a pasta de hidróxido de cálcio limita, mas não previne totalmente
o crescimento bacteriano.
______________________________________________________________________
36
Revisão de literatura
2.3.2 Hidróxido de cálcio
O primeiro relato do emprego de hidróxido de cálcio contra as afecções
infecciosas dos dentes ocorreu em 1838 para tratamento de fístula dentalis. Entretanto,
foi em 1920 que o hidróxido de cálcio na forma de uma pasta denominada Calxyl foi
introduzida na odontologia por HERMANN
91
. A partir de então, este medicamento
começou a ser cientificamente pesquisado e empregado para capeamento de polpas
expostas observando-se processo de reparo.
A recomendação do hidróxido de cálcio como possível alternativa para medicação
intracanal ocorreu em 1975 com os trabalhos de HEITHERSAY
85
e STEWART
234
. Os
autores relataram os benefícios do emprego de hidróxido de cálcio em dentes humanos
portadores de polpa necrótica e lesão periapical, concluindo que seu emprego simplifica o
tratamento e também colabora com a reparação tecidual. A inclusão definitiva do
hidróxido de cálcio como parte do arsenal endodôntico para a desinfecção dos canais
radiculares, ocorreu em 1985 com o trabalho de BYSTRÖM et al.
20
. Em estudo in vivo,
utilizando 65 dentes humanos com reação periapical radiograficamente evidente,
avaliaram o efeito antimicrobiano dos curativos de demora: PMCC, fenol canforado e
hidróxido de cálcio. Os resultados mostraram a recuperação de bactérias após a
medicação em apenas um dos 35 casos tratados com hidróxido de cálcio, já para aqueles
tratados com medicamentos fenólicos foram recuperadas bactérias em 10 dos 30 casos.
O hidróxido de cálcio apresenta-se como um pó branco, alcalino (pH 12,8), pouco
solúvel em água (solubilidade de 1,2g/L de água, à temperatura de 25°C). Trata-se de
uma base forte obtida a partir da calcinação (aquecimento) do carbonato de cálcio, até sua
transformação em óxido de cálcio (cal viva). Com a hidratação do óxido de cálcio chega-
se ao hidróxido de cálcio e a reação entre este e o gás carbônico leva à formação do
carbonato de cálcio (LOPES; SIQUEIRA
130
, 2004).
As propriedades do hidróxido de cálcio derivam de sua dissociação iônica em íons
cálcio e hidroxila, sendo que as ações destes íons sobre os tecidos e os microorganismos
explicam as propriedades biológicas e antimicrobianas desta substância. De acordo com
ESTRELA; PESCE
47
(1996) a dissociação iônica do hidróxido de cálcio proporciona
______________________________________________________________________
37
Revisão de Literatura
45,89% de íons hidroxila e 54,11% de íons cálcio. Como o hidróxido de cálcio p.a. se
apresenta na forma de pó, é necessária uma substância que permita sua veiculação para o
interior dos canais radiculares. A composição da pasta e a natureza do veículo podem
influenciar diretamente as atividades do hidróxido de cálcio quando este é empregado
como medicação intracanal (SIQUEIRA; UZEDA
224
, 1998).
Uma importante característica apresentada pela pasta de hidróxido de cálcio é a
sua atividade antiexsudativa determinada por sua propriedade higroscópica. O hidróxido
de cálcio por ser hipertônico em relação ao meio, absorve o exsudato inflamatório quando
em contato com os tecidos reduzindo a pressão hidrostática tecidual. Além disso, o
hidróxido de cálcio inibe a ação da fosfolipase A2 e C interrompendo a síntese de
prostaglandinas. Esta inibição, entretanto, se dá de modo inespecífico, resultado da
elevação do pH tecidual e conseqüente inativação da enzima. Apesar do hidróxido de
cálcio proporcionar efeitos semelhantes ao de um antiinflamatório, esta substância não
pode ser caracterizada como um antiinflamatório verdadeiro (LOPES; SIQUEIRA
130
,
2004).
Apesar de o pH alcalino ser um fator prejudicial à sobrevivência de
microorganismos, muitas espécies implicadas em infecções dos canais radiculares
conseguem manter sua viabilidade frente a alterações no pH. Alguns microorganismos
como E. faecalis e C. albicans podem sobreviver em meio extremamente alcalino.
McHUGH et al.
142
(2004) avaliaram o comportamento do E. faecalis frente a diferentes
intervalos de pH. Os resultados demonstraram que na faixa de pH 10,5 a 11,0 o
crescimento de E. faecalis é retardado, enquanto que em pH 11,5 ou acima deste valor
nenhum crescimento é verificado. Apesar da maior resistência do E. faecalis, o pH do
hidróxido de cálcio é de cerca de 12,5 depreendendo-se que todas as espécies bacterianas
já isoladas de canais radiculares infectados são susceptíveis aos seus efeitos, sendo
eliminadas em curto período de tempo quando em contato direto com esta substância.
A variação do pH reflete na viabilidade bacteriana, uma vez que influencia a
atividade enzimática. Todo o metabolismo celular é dependente da ação de enzimas, as
quais possuem uma faixa estreita de pH onde a atividade ou estabilidade é ótima girando
em torno da neutralidade (PADAN et al.
169
, 1981). A alcalinização promovida pelo
______________________________________________________________________
38
Revisão de literatura
hidróxido de cálcio induz a desnaturação de enzimas, alterando sua estrutura
tridimensional, resultando na perda de sua atividade biológica e consequentemente
comprometendo a atividade microbiana.
Outro efeito da ação do hidróxido de cálcio sobre os microorganismos seria a
perda da integridade da membrana citoplasmática resultante do processo de peroxidação
lipídica, que resulta na destruição de fosfolipídios componentes estruturais da membrana
(FREEMAN; CRAPO
57
, 1982). O dano à membrana citoplasmática exerce papel
importante na lise e morte do microorganismo, visto que esta estrutura é responsável por
uma série de funções biológicas como: barreira osmótica regulando a entrada e saída de
substâncias para o citoplasma, respiração celular, excreção de exoenzimas para clivagem
de polímeros orgânicos macromoleculares para obtenção de nutrientes e biossíntese da
parede celular. Além disso, o hidróxido de cálcio pode danificar o DNA bacteriano
inibindo sua replicação e desarranjando a atividade celular.
Devido a estas propriedades antimicrobianas é inegável o poder letal do hidróxido
de cálcio. No entanto, para que todo este potencial de desinfecção seja exercido é
necessário um contato direto do medicamento com os microorganismos. Esta situação
proporciona uma concentração máxima de íons hidroxila disponível no ambiente
tornando inviável a sobrevivência. Estudos avaliando o efeito do hidróxido de cálcio à
distância não têm demonstrado os mesmos resultados. Devido a sua baixa solubilidade, a
difusão de íons hidroxila para alcançar microorganismos à distância fica prejudicada.
Estudos utilizando teste de difusão em ágar demonstraram que pastas de hidróxido de
cálcio que empregaram água destilada ou glicerina como veículos foram ineficazes em
inibir o crescimento de várias espécies bacterianas anaeróbias estritas e facultativas
(SIQUEIRA; UZEDA
221
, 1997; GOMES et al.
67
, 2002).
A ação antimicrobiana do hidróxido de cálcio também tem se mostrado
insatisfatória para eliminação de microorganismos locados no interior dos túbulos
dentinários. Além de sua baixa solubilidade, outro fator importante que prejudica sua
ação é que a hidroxiapatita, principal componente inorgânico da dentina, tem efeito
tampão para substâncias alcalinas, devido à presença de doadores de prótons em sua
camada hidratada (WANG; HUME
265
, 1988, NERWICH et al.
156
, 1993). Outro aspecto
______________________________________________________________________
39
Revisão de Literatura
seria o arranjo das células bacterianas colonizando as paredes do canal, prejudicando um
efeito em profundidade do hidróxido de cálcio, uma vez que células da periferia da
colônia poderiam proteger aquelas localizadas mais profundamente no interior dos
túbulos (SIQUEIRA; UZEDA
220
, 1996).
Alguns microorganismos, entre eles E. faecalis e C. albicans, apresentam maior
resistência aos efeitos antimicrobianos do hidróxido de cálcio. Além de fatores como
baixa solubilidade e inativação pela dentina ou outros componentes teciduais, alguns
microorganismos possuem sofisticados mecanismos para regulação do pH
intracitoplasmático para níveis compatíveis com a sobrevivência, a despeito de alterações
do pH no ambiente (BOOTH
17
, 1985).
Tem sido relatado o isolamento de E. faecalis mesmo em ambientes com pH 11,5.
Esta resistência do E. faecalis ao hidróxido de cálcio está relacionada a uma bomba de
prótons ativa, que reduz o pH intracitoplasmático por bombear prótons para o interior da
célula (EVANS et al.
50
, 2002). C. albicans também tem demonstrado resistência ao efeito
do hidróxido de cálcio. WALTIMO et al.
263
(1999) avaliaram a susceptibilidade de
espécies orais de Candida ao hidróxido de cálcio. As espécies testadas foram C. albicans,
C. glabrata, C. guilliermondii, C. krusei, C. tropicalis. A susceptibilidade do E. faecalis
também foi avaliada para comparação. Os microorganismos permanecem em contato
com hidróxido de cálcio (pH 12,4) por 5 minutos a 6 horas. Comparadas ao E. faecalis
todas as espécies de Candida apresentaram resistência igualmente alta ou até mesmo
maior ao hidróxido de cálcio.
A neutralização de endotoxinas é outra importante característica apresentada pelo
hidróxido de cálcio. Os LPS são importantes fatores de virulência que apresentados por
bactérias gram-negativas desempenhando papel relevante na etiopatogenia das doenças
da polpa e dos tecidos perirradiculares. A porção lipídica do LPS conhecida como lipídio
A é a principal responsável por seus efeitos biológicos. Foi demonstrado que o hidróxido
de cálcio pode promover a hidrólise do lipídio A, destruindo ligações éster dentro da
molécula de LPS, promovendo, assim, a liberação de ácidos graxos hidroxilados.
Consequentemente, a molécula de LPS é inativada, perdendo seus efeitos tóxicos
(SAFAVI; NICHOLS
193
, 1993, SAFAVI; NICHOLS
192
, 1994).
______________________________________________________________________
40
Revisão de literatura
2.3.3 Clorexidina
O surgimento de um maior interesse na endodontia pela utilização da clorexidina
como agente de desinfecção dos canais radiculares ocorreu a partir da ineficiência do
hidróxido de cálcio contra algumas cepas de microorganismos. A identificação de
determinadas espécies microbianas resistentes aos efeitos antimicrobianos do hidróxido
de cálcio, bem como seu freqüente isolamento em casos de insucesso endodôntico,
determinaram a necessidade de busca por novas alternativas de substâncias desinfetantes.
A clorexidina surgiu durante investigações para o desenvolvimento de agentes
antivirais. Entretanto, esta substância acabou por demonstrar baixa atividade antiviral,
mas apresentou boa eficácia antibacteriana. A clorexidina tem sido bastante aplicada em
tratamentos ginecológicos, urológicos e oftalmológicos bem como para anti-sepsia de
pele (FARDAL; TURNBULL
53
, 1986).
A clorexidina é composta estruturalmente por dois anéis clorofenólicos nas
extremidades, ligados a um grupamento biguanida de cada lado, conectados por uma
cadeia central de hexametileno (DENTON
41
, 1991). Esta bisbiguanida catiônica
(carregada positivamente) é uma base forte, sendo praticamente insolúvel em água. A
clorexidina é largamente empregada na odontologia, principalmente, como auxiliar na
terapia periodontal (RÖLLA; MELSEN
189
, 1975). Esta substância tem importante papel
na inibição e prevenção da placa dental e foi sugerida como agente antiplaca e antitártaro.
Devido a sua baixa solubilidade a clorexidina utilizada em odontologia tem sido
proposta na forma de sal de digluconato, a fim de proporcionar melhor solubilidade em
água (DELANY et al.
40
, 1982). As soluções aquosas de clorexidina são mais estáveis em
pH de 5 a 8. Acima disto, há precipitação, enquanto que em pH ácido, há deterioração da
atividade, devido à perda da estabilidade da solução. Em pH fisiológico, esta substância
exerce excelente atividade antimicrobiana, dissociando-se e liberando moléculas de carga
positiva (PARSON et al.
170
, 1980, RINGEL et al.
187
, 1982).
As concentrações de clorexidina normalmente utilizadas variam entre 0,12% e
2,0%. Nestas concentrações, apresenta nível extremamente baixo de toxicidade tecidual e
______________________________________________________________________
41
Revisão de Literatura
sistêmica. A clorexidina 2% tem sido empregada como irrigante subgengival sem
apresentar toxicidade aos tecidos gengivais (LÖE
129
, 1973). Quando utilizada como anti-
séptico bucal em pacientes submetidos à cirurgia periodontal tem permitido o reparo
tecidual. Portanto, uma boa tolerância dos tecidos periapicais à clorexidina 2% pode ser
esperada, similarmente aos tecidos gengivais (JEANSONNE; WHITE
99
, 1994). Casos
reportados de reação alérgica à clorexidina são raros na população em geral (OKANO et
al.
161
, 1989, GARVEY et al.
61
, 2001).
O uso da clorexidina em endodontia tem sido proposto na forma de líquido ou gel
em diferentes concentrações tanto como agente irrigante dos canais radiculares
(PARSON et al.
170
, 1980, DELANY et al.
40
, 1982, GREENSTEIN; BERMAN;
JAFFIN
75
, 1986, FARDAL; TURNBULL
53
, 1986, VAHDATY; PITT FORD;
WILSON
253
, 1993, JEANSONNE; WHITE
99
, 1994, LEONARDO et al.
122
, 1999,
FERRAZ et al.
55
, 2001, ÖNÇAG et al.
165
, 2003, ZAMANY et al.
273
, 2003, DAMETTO et
al.
36
, 2005, ERCAN et al.
45
, 2006) quanto como medicação intracanal (HELING et al.
88
,
1992, BARBOSA et al.
7
, 1997, SIQUEIRA; UZEDA
221
, 1997, LINDSKOG et al.
126
,
1998, GOMES et al.
73
, 2003).
O digluconato de clorexidina é um agente antibacteriano de amplo espectro
efetivo contra bactérias gram-positivas e gram-negativas, fungos, vírus e esporos
(HENNESSEY
89
, 1973, DAVIES
37
, 1973, DENTON
41
, 1991). O efeito antimicrobiano
da clorexidina se dá pela atração e adsorção das moléculas catiônicas da clorexidina à
superfície celular dos microorganismos que é carregada negativamente. Esta interação
promove a alteração da permeabilidade da membrana celular, o que resulta na perda dos
componentes intracelulares e no desequilíbrio osmótico da célula (HENNESSEY
89
,
1973).
A clorexidina em baixas concentrações é bacteriostática, enquanto que em
concentrações mais elevadas é bactericida. O efeito bacteriostático da clorexidina é
manifestado pela saída das substâncias de baixo peso molecular, como potássio e fósforo.
Além disso, em nível de membrana, a clorexidina pode inibir a atividade de determinadas
enzimas, como a adenosina trifosfatase (ATPase). Já o efeito bactericida da clorexidina é
observado em concentrações mais altas, quando se verifica que o dano à membrana
______________________________________________________________________
42
Revisão de literatura
citoplasmática é mais severo, levando ao extravasamento de conteúdo citoplasmático de
maior peso molecular como ácidos nucléicos. Entretanto, em concentrações
suficientemente elevadas (100 a 500 mg/L), não ocorre extravasamento do conteúdo
citoplasmático, mas sim a sua precipitação resultado da reação da clorexidina com
compostos fosfatados, como ATP e ácidos nucléicos. A maior parte das soluções de
clorexidina utilizadas em odontologia é bactericida (DENTON
41
, 1991).
Em pH neutro, a clorexidina é rapidamente adsordida à superfície celular dos
microorganismos fazendo com que a concentração de moléculas livres de clorexidina na
solução seja baixa. Em condições ácidas, a superfície ionizada da bactéria é suprimida,
reduzindo o efeito bactericida da clorexidina (DAVIES
37
, 1973, BONESVOLL et al.
16
,
1974).
Além de possuir atividade antimicrobiana de amplo espectro, a clorexidina
apresenta outra importante característica: a substantividade. Devido à sua propriedade
catiônica, a clorexidina se liga à hidroxiapatita do esmalte ou dentina e a grupos
aniônicos ácidos de glicoproteínas, sendo lentamente liberada para o ambiente, à medida
que sua concentração no meio decresce, permitindo desse modo um tempo de atuação
prolongado. A substantividade da clorexidina sustenta a atividade antimicrobiana por um
período de 48 horas (SCHAFER; BOSSMANN
195
, 2005), 72 horas (SIRÉN et al.
226
,
2004) e de até 7 dias (BASRANI et al.
9
, 2002, DAMETTO et al.
36
, 2005) após serem
removidos do canal radicular. Esta propriedade a difere de outros desinfetantes que
rapidamente se dissipam e não têm efeito antimicrobiano residual (MESSER; CHEN
146
,
1984).
Duas formulações têm sido propostas para o uso da clorexidina, a líquida e o gel.
Alguns estudos demonstraram que a atividade antimicrobiana da clorexidina líquida é
igual ou superior ao gel quando o contato direto é utilizado como metodologia (FERRAZ
et al.
55
, 2001, GOMES et al.
69
, 2001, VIANNA et al.
255
, 2004). Em contrapartida, a
clorexidina gel facilita a instrumentação, lubrificando a luz do canal radicular, o que
diminui o atrito entre parede e instrumentos no interior do sistema de canais radiculares.
Além disso, ao facilitar a instrumentação, a clorexidina gel termina por melhorar a
capacidade dos instrumentos em eliminar tecidos orgânicos, o que compensa sua
______________________________________________________________________
43
Revisão de Literatura
incapacidade de dissolvê-lo. Outra vantagem da clorexidina gel sobre a líquida seria a
diminuição da formação de smear layer (FERRAZ et al.
55
, 2001), o que não acontece
com a líquida.
Alguns estudos têm relevado um maior potencial de desinfecção da clorexidina
quando comparado ao hidróxido de cálcio sobre C. albicans e E. faecalis (WALTIMO et
al.
260
, 1999, LIMA et al.
124
, 2001). Como estes dois microorganismos têm sido
identificados como patógenos endodônticos, que podem resistir ao protocolo
convencional de desinfecção do canal radicular, clorexidina pode oferecer um benefício
clinicamente significante se aplicado na terapia endodôntica.
______________________________________________________________________
44
Revisão de literatura
2.3.4 Hidróxido de cálcio associado à clorexidina
A associação da clorexidina ao hidróxido de cálcio como possível alternativa para
medicação intracanal objetiva incrementar as propriedades antimicrobianas do hidróxido
de cálcio. Apesar das já relatadas propriedades antimicrobianas desta substância, esta não
pode ser considerada como uma medicação intracanal universal, já que não é igualmente
efetiva contra todos os microorganismos envolvidos nas infecções endodônticas
(GOMES et al.
67
, 2002). Alguns microorganismos têm mostrado capacidade de
sobrevivência mesmo em pH alcalino, revelando, desta forma, resistência aos efeitos
antimicrobianos do hidróxido de cálcio. A adição da clorexidina poderia proporcionar
maior atividade antimicrobiana, devido seu amplo espectro de atuação, tornando o
medicamento mais efetivo contra E. faecalis e C. albicans. Além disso, poderia conferir
maior substantividade à formulação, devido a sua capacidade de adsorção e lenta
liberação de moléculas ativas pela dentina, mesmo após sua remoção do canal radicular
(TANOMARU et al.
247
, 2002).
O hidróxido de cálcio, no entanto, apresenta algumas propriedades importantes
para um bom curativo intracanal não apresentadas pela clorexidina. O hidróxido de cálcio
tem a habilidade de induzir a formação de tecido duro, de preencher fisicamente o canal
prevenindo a recontaminação, de dissolver tecido orgânico e de mediar à neutralização de
LPS. O pH alcançado pela combinação dos medicamentos é maior do que o apresentado
pelo uso isolado da clorexidina, o que poderia auxiliar no controle da reabsorção
radicular externa inflamatória (BELTES et al.
13
, 1997).
A associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina foi avaliada por BASRANI;
GHANEM; TJÄDERHANE
8
, em 2004, a fim de determinar se esta formulação
apresentava as propriedades físico-químicas adequadas para um bom curativo intracanal.
Os resultados mostraram que a adição da clorexidina ao hidróxido de cálcio não afetou
seu pH, radiopacidade e tempo de trabalho. Contudo, a adição da clorexidina diminuiu a
tensão superficial e aumentou a viscosidade do hidróxido de cálcio significativamente.
Estes achados confirmaram que a clorexidina em diferentes concentrações e em
combinação com hidróxido de cálcio tem propriedades físico-químicas satisfatórias para
serem usadas como medicação intracanal.
______________________________________________________________________
45
Revisão de Literatura
2.3.5 Comparação da eficácia antimicrobiana entre as medicações intracanais
Divergências quanto ao desempenho antimicrobiano apresentado por algumas
medicações podem ser explicados por diferentes modelos experimentais adotados, pelos
veículos associados aos medicamentos ou pelas diversas concentrações empregadas.
Vários estudos disponíveis na literatura tiveram como objetivo avaliar o papel do
hidróxido de cálcio, clorexidina e hidróxido de cálcio associado à clorexidina como
medicação intracanal.
A susceptibilidade de C. albicans frente a alguns medicamentos como iodeto de
potássio iodetado, acetato de clorexidina 0,5%, hipoclorito de sódio 5% e hidróxido de
cálcio isoladamente ou em combinações foi avaliada por WALTIMO et al.
260
(1999). As
substâncias foram colocadas em contato direto com o microorganismo e os seguintes
períodos de ação foram avaliados: 30 segundos, 5 minutos, 1 hora e 24 horas. Os
resultados revelaram alta resistência de C. albicans ao hidróxido de cálcio mostrando
apenas uma pequena redução após 1 hora e 24 horas de contato. Hipoclorito de sódio e
iodeto de potássio iodetado eliminaram C. albicans com 30 segundos, enquanto que o
acetato de clorexidina após 5 minutos de contato. As combinações das medicações não
promoveram melhor eficácia na desinfecção dos canais radiculares. Este estudo indicou
que hipoclorito de sódio, iodeto de potássio iodetado e acetato de clorexidina foram mais
efetivos, que o hidróxido de cálcio, na eliminação de C. albicans in vitro.
A eficácia de alguns irrigantes e medicações intracanal sobre C. albicans foi
também avaliada por FERGUSON; HATTON; GILLESPIE
54
(2002). O objetivo deste
estudo foi determinar a concentração inibitória mínima de hipoclorito de sódio, peróxido
de hidrogênio, digluconato de clorexidina e solução aquosa de hidróxido de cálcio que é
requerido para eliminar um inóculo padronizado de C. albicans. O crescimento
microbiano foi determinado pela densidade óptica. Os resultados demonstraram que
hipoclorito de sódio, peróxido de hidrogênio e clorexidina foram fungicidas eficazes com
uma concentração inibitória mínima de < 10 µg/mL, 234 µg/mL e < 0,63 µg/mL,
respectivamente. Solução aquosa de hidróxido de cálcio não foi eficaz na eliminação de
C. albicans. Paralelamente, a atividade antimicrobiana através da técnica de contato
direto foi avaliada entre pasta de hidróxido de cálcio confeccionada com água esterilizada
______________________________________________________________________
46
Revisão de literatura
(1:1) e PMCC. O tempo de atuação das medicações foi de 48 horas, após este período
amostras foram preparadas microbiologicamente para determinação das unidades
formadoras de colônias. A pasta de hidróxido de cálcio e o PMCC quando mantidos em
contato direto com C. albicans foram efetivos como agentes antifúngicos.
WEIGER et al.
266
, em 2002, propõem um método alternativo para caracterizar a
viabilidade bacteriana na dentina radicular humana infectada através da determinação da
proporção de microorganismos viáveis e não viáveis. Para este estudo foram selecionados
24 dentes humanos que tiveram o diâmetro e extensão dos canais padronizados sendo, em
seguida, esterilizados. Os espécimes foram divididos em dois grupos (n = 12) para
contaminação com Enterococcus faecalis e Streptococcus sanguinis por 8 semanas. Cada
um dos grupos foi subdividido em 1 grupo controle (n = 6) e 1 grupo teste (n = 6).
Amostras da dentina radicular, através da ampliação padronizada do canal radicular,
foram coletadas para se determinar o padrão de contaminação após 4 semanas. Estas
foram comparadas com amostras coletadas na 8ª semana (grupo controle) e com aquelas
coletadas na 12ª semana (grupo teste) após 28 dias de aplicação de curativo de hidróxido
de cálcio. As amostras foram analisadas pela microscopia de fluorescência para
determinação da proporção de bactérias viáveis e não viáveis e através da contagem de
unidades formadoras de colônia. Bactérias viáveis e não viáveis foram identificadas em
todas as amostras da dentina radicular. Nos grupos controles a proporção de bactérias
viáveis e a avaliação das UFC não apresentaram grandes variações entre as amostras
coletadas na 4ª e 8ª semana. Para o grupo teste, contaminado com S. sanguinis, uma
média de 27% de bactérias viáveis e 0 logUFC foi detectada após 4 semanas de curativo
com hidróxido de cálcio. Para E. faecalis observou-se 56,2 % de bactérias viáveis e
média de 5.3 logUFC. A viabilidade do E. faecalis não foi afetada pela ação do hidróxido
de cálcio. Os autores concluíram que a microscopia de fluorescência proporciona
importantes informações a respeito da viabilidade de microorganismos quando
comparada ao método de cultura microbiológica.
Utilizando modelo experimental de contaminação in vitro da dentina radicular
EVANS et al.
51
(2003) compararam o efeito antimicrobiano da pasta de hidróxido de
cálcio e da associação hidróxido de cálcio e clorexidina 2%. A partir de incisivos bovinos
foram confeccionados 24 cilindros de dentina que foram padronizados e contaminados
______________________________________________________________________
47
Revisão de Literatura
com E. faecalis. As medicações intracanais avaliadas foram aplicadas por 1 semana.
Após este período, raspas de dentina foram coletadas, suspendidas em solução e
semeadas em BHI ágar. Após incubação, procedeu-se à contagem das unidades
formadoras de colônias. A associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina foi
significativamente mais eficaz na eliminação de E. faecalis que o uso isolado de
hidróxido de cálcio.
LYNNE et al.
133
(2003) avaliaram a atividade antimicrobiana de pasta de
hidróxido de cálcio (1 g de Ca (0H)
2
em 10 mL de água destilada), hidróxido de cálcio
associado à clorexidina (1g de Ca (OH)
2
em 10 mL de digluconato de clorexidina 0,12%)
e clorexidina 0,12% sobre a dentina radicular infectada com E. faecalis. Cilindros de
dentina, obtidos a partir de raízes de incisivos bovinos, foram padronizados em extensão
e diâmetro do canal radicular sendo em seguida esterilizados. Em seguida, foram
contaminados com E. faecalis (7,0 x 10
4
UFC/mL) por 24 horas. Após a contaminação,
os medicamentos foram aplicados no canal radicular e os espécimes foram incubados por
24 horas. Amostras da dentina radicular foram obtidas através da ampliação seqüencial e
padronizada do diâmetro do canal sendo posteriormente cultivadas. Os resultados
demonstraram uma superioridade do hidróxido de cálcio na desinfecção dos canais
radiculares em relação a sua associação com a clorexidina e também quanto ao uso
isolado de clorexidina 0,12%.
BASRANI et al.
10
(2003) utilizaram diferentes modelos experimentais para
avaliação do desempenho antimicrobiano da clorexidina (0,2% e 2% líquida ou gel) e
hidróxido de cálcio (isolado ou associado à clorexidina gel 0,2%) contra Enterococcus
faecalis. Os medicamentos foram analisados através do teste de difusão em ágar por 48
horas ou pelo método de desinfecção da dentina radicular humana in vitro após 7 dias de
aplicação das medicações. O teste de difusão em ágar revelou uma superioridade da
clorexidina gel 2 % e da solução de clorexidina 2% sem diferença estatística entre elas. O
hidróxido de cálcio apresentou os piores resultados. Para o teste de desinfecção da
dentina radicular todas as formulações de clorexidina apresentaram melhor desempenho
antimicrobiano sem diferença estatística entre elas. O uso isolado de hidróxido de cálcio
apresentou os piores resultados. A clorexidina é significativamente mais efetiva para
eliminação de E. faecalis in vitro.
______________________________________________________________________
48
Revisão de literatura
Preocupados com possíveis prejuízos às propriedades do hidróxido de cálcio a
partir de sua associação com outras substâncias HAENNI et al.
80
(2003) avaliaram o
efeito químico e antimicrobiano de pastas de hidróxido de cálcio confeccionadas com:
clorexidina 0,5%, hipoclorito de sódio 1% e iodeto de potássio. Formulações isoladas
destas medicações foram também avaliadas e comparadas à pasta convencional de
hidróxido de cálcio com solução salina quanto à habilidade de elevar o pH na dentina
radicular. As medicações foram aplicadas no interior do canal radicular de dentes
unirradiculados humanos previamente padronizados. Alterações no pH durante 1 e 3 dias
e 1, 2, 3 e 5 semanas foram mensuradas com um microeletrodo colocado em uma
cavidade feita na superfície radicular externa. Além disso, a eficácia antimicrobiana sobre
E. faecalis e C. albicans foi avaliada pelo teste de difusão em ágar. Os resultados
demonstraram que a habilidade do hidróxido de cálcio de elevar o pH na dentina
radicular foi mantida quando usada a mistura de hidróxido de cálcio com clorexidina,
hipoclorito de sódio e iodeto de potássio iodetado. Todas as combinações do hidróxido de
cálcio apresentaram eficácia semelhante à pasta preparada em solução salina quanto ao
potencial antimicrobiano. A efetividade da clorexidina foi reduzida quando associada ao
hidróxido de cálcio em comparação ao seu uso isolado. Nenhum incremento na atividade
antimicrobiana do iodeto de potássio iodetado e do hipoclorito de sódio foi observada
quando associado ao hidróxido de cálcio. Os autores concluiram que o hidróxido de
cálcio é fortemente alcalino e que a adição de ácidos fracos ou de substâncias alcalinas
em suspensão aquosa não altera seu pH. A associação do hidróxido de cálcio com outras
substâncias não proporcionou um melhor desempenho de sua atividade antimicrobiana.
O desempenho antimicrobiano in vitro de quatro medicações intracanais para
desinfecção da dentina radicular bovina contaminada com C. albicans foi avaliado por
SIQUEIRA et al.
214
(2003). Cilindros de dentina contaminados foram expostos aos
seguintes medicamentos: hidróxido de cálcio e glicerina, hidróxido de cálcio e
clorexidina 0,12%, hidróxido de cálcio e glicerina associado ao PMCC e clorexidina
0,12% associada ao óxido de zinco. Os espécimes foram deixados em contato com as
medicações por 1 hora, 2 dias e 7 dias. A viabilidade de C. albicans após a exposição foi
avaliada através da incubação em meio de cultura para comparação da efetividade das
medicações na desinfecção da dentina. Os resultados mostraram que os espécimes
tratados com hidróxido de cálcio e glicerina associado ao PMCC e clorexidina 0,12%
______________________________________________________________________
49
Revisão de Literatura
associada ao óxido de zinco foram eficazes na desinfecção da dentina radicular com 1
hora de aplicação. Já a pasta de hidróxido de cálcio e glicerina só foi eficaz na eliminação
de C. albicans após 7 dias de exposição. Já o hidróxido de cálcio combinado à
clorexidina 0,12% foi ineficaz na desinfecção da dentina mesmo após 1 semana de
contato.
GOMES et al.
73
(2003) avaliaram a eficácia de clorexidina gel 2% e hidróxido de
cálcio como medicação intracanal contra E. faecalis. Foram preparados 108 cilindros de
dentina obtidos a partir de incisivos bovinos que foram infectados com E. faecalis por 7
dias. Os espécimes foram divididos em quatro grupos de acordo com a medicação
intracanal utilizada: clorexidina gel 2%, pasta de hidróxido de cálcio utilizando
polietilenoglicol como veículo, associação de hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2%
(1:1) e meio de cultura em caldo como controle. Os medicamentos foram aplicados nos
canais radiculares permanecendo por um período experimental de 1, 2, 7, 15, e 30 dias.
Amostras seqüenciais da dentina radicular foram coletadas através da ampliação
padronizada do diâmetro do canal e acondicionadas em tubos contendo caldo BHI. Os
tubos foram incubados e o crescimento bacteriano verificado diariamente através da
turbidez do meio. O gel de clorexidina 2% inibiu completamente o crescimento de E.
faecalis após 1, 2, 7 e 15 dias. O hidróxido de cálcio permitiu o crescimento microbiano
em todos os períodos experimentais avaliados. A combinação do hidróxido de cálcio e
clorexidina demonstrou 100% de atividade antibacteriana após 1 e 2 dias de aplicação,
contudo, esta atividade decresceu entre 7 e 15 dias. Os resultados deste estudo sugerem
que clorexidina gel 2% apresenta maior atividade antimicrobiana contra E. faecalis que
hidróxido de cálcio, mas sua propriedade antimicrobiana é diminuída se utilizada por
longos períodos.
SIRÉN et al.
226
(2004) avaliaram o desempenho antimicrobiano in vitro de
hidróxido de cálcio, clorexidina, iodeto de potássio iodetado e da associação de ambos os
medicamentos ao hidróxido de cálcio. Para o estudo, foram selecionados blocos de
dentina obtidos de incisivos bovinos que foram contaminados com E. faecalis por 2
semanas. Dois períodos de ação dos medicamentos foram avaliados: 1 e 7 dias. Raspas de
dentina resultantes da ampliação padronizada e seqüencial do canal radicular foram
coletadas em meio TSB e incubadas por 5 dias para detecção de crescimento bacteriano.
______________________________________________________________________
50
Revisão de literatura
Após 1 dia de aplicação, a substância mais efetiva foi o iodeto de potássio iodetado, o
qual desinfetou a dentina radicular numa profundidade de 700 µm. Já a clorexidina, a
associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina e entre hidróxido de cálcio e iodeto de
potássio iodetado promover desinfecção até uma profundidade de 200 µm. Após 7 dias de
ação, amostras provenientes de dentes tratados com clorexidina, iodeto de potássio
iodetado e hidróxido de cálcio associado a ambos os medicamentos não apresentaram
crescimento bacteriano até a profundidade de 950 µm. O hidróxido de cálcio não foi
eficaz na eliminação em nenhuma profundidade para 1 e 7 dias de aplicação. A
associação do hidróxido de cálcio à clorexidina e ao iodeto de potássio iodetado trouxe
bons benefícios para atividade antimicrobiana.
A desinfecção dos canais radiculares em dentes que apresentaram insucesso do
tratamento endodôntico foi avaliada por ZARELLA; FOUND; SPĂNGBERG
274
(2005).
O objetivo deste estudo in vivo foi comparar o efeito antimicrobiano do hidróxido de
cálcio associado à clorexidina 2% e de seu uso isolado como medicação intracanal em
dentes submetidos ao retratamento endodôntico. Os 40 dentes selecionados para o estudo
apresentavam insucesso do tratamento endodôntico e lesão perirradicular associada. O
tratamento foi realizado em 3 sessões sendo que na primeira e segunda sessão foram
aplicadas as medicações avaliadas permanecendo por um intervalo de 7 a 10 dias e na
terceira sessão procedeu-se à obturação definitiva. Amostras bacteriológicas do canal
foram coletadas em cada uma das visitas. Dos 40 dentes avaliados, 12 (30%)
apresentaram cultura positiva na terceira sessão antes da obturação do canal. Para os 20
dentes submetidos ao tratamento com hidróxido de cálcio, 12 (60%) apresentaram cultura
negativa, enquanto que para aqueles submetidos à medicação com hidróxido de cálcio
associado à clorexidina 2%, 16 (80%) foram eficientemente desinfectados. Quanto à
eficácia na eliminação de enterococccus, os autores verificaram que no grupo em que o
hidróxido de cálcio foi utilizado 2 dentes ainda apresentaram cultura positiva mesmo
após 2 sessões de aplicação. Para o grupo em que se avaliou a associação das duas
medicações nenhum dos dentes apresentou cultura positiva após duas sessões de
aplicação.
Analisando a realização do tratamento endodôntico em uma ou duas sessões e a
efetividade do hidróxido de cálcio como medicação intracanal VIVACQUA-GOMES et
______________________________________________________________________
51
Revisão de Literatura
al.
256
, em 2005, realizaram um estudo ex vivo para determinar o efeito de diferentes
formas de tratamento sobre E. faecalis em dentes humanos. Foram selecionados 45 pré-
molares que foram padronizados, esterilizados e contaminados com E. faecalis por 60
dias. Os canais foram preparados utilizando técnica coroa-ápice e clorexidina gel 2%
como irrigante sob condições assépticas. Em seguida, os espécimes foram divididos em 5
grupos: 1) clorexidina gel 2% como irrigante e obturação imediata, 2) irrigação com
clorexidina gel 2% e obturação 14 dias após aplicação de curativo de hidróxido de cálcio,
3) irrigação com clorexidina gel 2% e obturação após 7 dias sem medicação intracanal, 4)
irrigação com solução salina e obturação após 7 dias sem medicação intracanal e 5)
irrigação com solução salina e obturação imediata sem cimento. Os grupos 1 e 2
continham 15 espécimes cada, enquanto que os demais grupos 5. Os espécimes foram
incubados a 37° C por 60 dias após a execução do respectivo tratamento. Posteriormente,
amostras da dentina radicular foram removidas e processadas microbiologicamente para
determinação das unidades formadoras de colônia. E. faecalis foram recuperados em 20%
dos espécimes do grupo1, 25% do grupo 2, 40% do grupo 3, 60% do grupo 4 e de 100%
do grupo 5. Nenhuma das formas de tratamento do canal radicular, seja em única ou
múltipla sessão, eliminou completamente E. faecalis dos túbulos dentinários. Mesmo
com 60 dias de obturação do canal radicular E. faecalis permaneceram viáveis no interior
dos túbulos dentinários. Quando nenhum cimento obturador foi usado, E. faecalis
apresentou alta taxa de crescimento.
SCHÄFER; BÖSSMANN
195
(2005) investigaram a eficácia antimicrobiana da
clorexidina e do hidróxido de cálcio contra Enterococcus faecalis in vitro. Quarenta
dentes humanos foram padronizados e esterilizados sendo, em seguida, infectados
laboratorialmente com E. faecalis por 9 dias. Após o período de contaminação, os
espécimes foram divididos em grupos (n = 10) para preenchimento do canal com os
seguintes medicamentos: pasta de hidróxido de cálcio, solução de clorexidina 2%,
associação do hidróxido de cálcio à solução de clorexidina 2% (1:1) e água destilada. Os
medicamentos permaneceram nos canais durante um intervalo de 3 dias. Após este
período, amostras da dentina radicular foram removidas e analisadas
microbiologicamente. Clorexidina 2% foi significativamente mais eficaz que a pasta de
hidróxido de cálcio e que a associação de ambos os medicamentos em eliminar E.
______________________________________________________________________
52
Revisão de literatura
faecalis. Não foi observado um aumento na eficácia antimicrobiana do hidróxido de
cálcio quando combinado à clorexidina 2%.
ERCAN et al.
45
(2006) compararam a efetividade de vários medicamentos
incluindo hidóxido de cálcio, clorexidina gel 2% e a associação de ambos os
medicamentos contra E. faecalis e C. albicans in vitro. Oitenta dentes humanos
unirradiculados foram selecionados, padronizados e esterilizados. Em seguida, procedeu-
se à divisão dos espécimes em partes iguais para contaminação com E. faecalis e C.
albicans por 5 dias. Após este período, os dentes foram randomicamente divididos em 4
grupos de acordo com a medicação intracanal avaliada: 1) hidróxido de cálcio (2 g de
hidróxido de cálcio para 1 mL de água), 2) hidróxido de cálcio associado à clorexidina (2
g de hidróxido de cálcio para 1 mL de clorexidina 2%), 3) clorexidina gel 2% e 4) soro
fisiológico. Os medicamentos foram aplicados no canal radicular com auxilio de espiral
lentulo sendo, em seguida, incubados aerobicamente a 37° C por 7, 15 e 30 dias. Seis
espécimes de cada grupo foram reservados para cada um dos períodos avaliados. Dois
espécimes foram deixados com os canais vazios como controle. Após o vencimento de
cada período de avaliação, as medicações foram removidas e amostras da dentina
radicular foram coletadas com auxilio de brocas Gates-Glidden n° 4, 5 e 6 e examinadas
microbiologicamente. As amostras foram plaqueadas, a fim de se determinar o número de
UFC por mg de dentina. Os resultados mostraram que a clorexidina gel 2% foi
significativamente mais eficiente que os demais grupos na eliminação de ambos os
microorganismos. O efeito antimicrobiano do hidróxido de cálcio é significativamente
elevado quando misturados com clorexidina.
GOMES et al.
74
(2006) investigaram a atividade antimicrobiana da associação
entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% contra alguns patógenos endodônticos e a
compararam com o uso isolado de cada um dos medicamentos. Foram utilizados os
métodos de difusão em ágar e de contato direto para análise do desempenho
antimicrobiano. O hidróxido de cálcio associado à clorexidina gel 2% produziu zonas de
inibição variando de 2,84 a 6,5 mm e necessitou de 30 segundos a 6 horas para eliminar
todos os microorganismos testados. Entretanto, clorexidina gel 2% mostrou maior zona
de inibição de crescimento microbiano variando de 4,33 a 21,67 mm, e necessitou de
menos de 1 minuto para eliminar todos os microorganismos. A pasta de hidróxido de
______________________________________________________________________
53
Revisão de Literatura
cálcio inibiu o crescimento apenas de microorganismos em íntimo contato e necessitou de
30 segundos a 24 horas para destruir todas as espécies avaliadas. Em conclusão,
clorexidina gel 2% associado ao hidróxido de cálcio apresentou melhor atividade
antimicrobiana que a pasta de hidróxido de cálcio.
Hidróxido de cálcio, clorexidina gel 2% e a associação entre ambos os
medicamentos foram analisadas como medicação intracanal em dentes com periodontite
apical crônica (MANZUR et al.
135
, 2007). Trinta e três canais foram instrumentados,
randomicamente divididos em três grupos e medicados com as substâncias testadas.
Amostras bacteriológicas dos canais foram obtidas antes (A1) e depois (A2) da
instrumentação na primeira sessão de tratamento e 1 semana após a ação da medicação
intracanal (A3). O crescimento microbiano foi avaliado através da turbidez do meio e
através da contagem de unidades formadoras de colônia. O crescimento bacteriano e a
contagem de UFC regrediu significativamente entre as amostras A1 e A2. Entretanto,
nenhuma diferença estatística foi verificada entre os três grupos de medicamentos
avaliados entre as amostras A2 e A3. Foi concluído que a eficácia antimicrobiana do
hidróxido de cálcio, clorexidina gel 2% e da combinação dos medicamentos é semelhante
quando utilizada por um período de 1 semana em dentes com infecção primária.
SIQUEIRA; PAIVA; RÔÇAS
209
, em 2007, avaliaram clinicamente a redução
bacteriana provocada pelo preparo químico-mecânico utilizando solução de clorexidina
0,12% como substância irrigadora e o efeito antibacteriano adicional alcançado pelo
emprego de hidróxido de cálcio associado à clorexidina gel 0,12% como medicação
intracanal. Treze dentes com infecção primária e periodontite apical crônica foram
selecionados para o estudo. Amostras bacteriológicas do canal radicular foram coletadas
antes (A1) e depois (A2) do preparo químico mecânico e após 7 dias de aplicação de
medicação intracanal (A3). Bactérias cultiváveis recuperadas dos canais radiculares nas
três colheitas foram contadas através das unidades formadoras de colônia e identificadas
através da técnica de seqüenciamento do gene RNA ribossomal 16S. As amostras
coletadas em A1 apresentaram crescimento bacteriano em 100% dos casos com uma
média de 3,5 espécies por canal. Em A2, 7 casos (53,8%) continuaram abrigando
bactérias cultiváveis, com uma média de 1,7 por canal. Já em A3, apenas 1 caso (7,7%)
abrigou bactérias cultiváveis com predominância de gram-positivas. Uma significativa
______________________________________________________________________
54
Revisão de literatura
redução na contagem de bactérias foi verificada entre A1 e A2 e entre A1 e A3. O
preparo químico mecânico com solução de clorexidina 0,12% reduz significativamente o
número de bactérias no canal, mas falha em deixar o canal livre de microorganismos em
aproximadamente metade dos casos. A aplicação de um curativo intracanal por 7 dias a
base de hidróxido de cálcio e clorexidina 0,12% aumentam significativamente o número
de canais com culturas negativas.
A clorexidina tem se mostrado como uma importante alternativa para medicação
intracanal, já que os microorganismos freqüentemente implicados em infecções
secundárias e responsáveis pelo insuceeso endodôntico podem apresentar resistência aos
efeitos antimicrobianso do hidróxido de cálcio. A clorexidina tem apresentado resultados
promissores que a qualificam como auxiliar importante na desinfecção dos canais
radiculares.
______________________________________________________________________
55
Revisão de Literatura
2.4 Caracterização e análise de viabilidade microbiana
Nos processos infecciosos de longa duração a proliferação microbiana no interior
do canal radicular é intensa, abrangendo não apenas a luz do canal, mas todo o sistema de
canais radiculares. Assim sendo, por mais apropriado que seja a realização do preparo
biomecânico, associado às substâncias irrigadoras energéticas e por mais eficiente que
seja a desinfecção através da aplicação de uma medicação intracanal, haverá sempre a
possibilidade de permanência de microorganismos nos túbulos dentinários e ramificações
do canal radicular (BYSTRÖM; SUNDQVIST
24
, 1985, CARD et al.
28
, 2002).
A obturação do canal objetiva selar túbulos dentinários, ramificações e a união
cemento dentina canal, com o objetivo de impedir a passagem de microorganismos que,
por ventura, tenham escapado à terapêutica endodôntica e possam proliferar e irritar a
região periapical. Além disso, objetiva limitar o aporte de nutrientes e o espaço
disponível para proliferação destes microorganismos proporcionando um ambiente
desfavorável à sobrevivência (SUNDQVIST et al.
237
, 1998, SIQUEIRA
222
, 2002). Uma
vez segregados nestas regiões, muitos microorganismos poderão sucumbir por carência
de substrato. Outros, porém, podem permanecer quiescentes e, se por ventura tiverem
acesso a nutrientes, podem proliferar e causar danos aos tecidos perirradiculares.
Contudo, não se tem informações sobre quanto tempo estes microorganismos
conseguiriam permanecer viáveis diante de condições ambientais desfavoráveis.
Buscando avaliar a possibilidade de sobrevivência de microorganismos após a
obturação do canal radicular SEDLEY; LENNAN; APPELBE
200
(2005) realizaram
estudo ex vivo para determinar a capacidade de sobrevivência do E. faecalis após a
obturação definitiva do canal sem aporte nutricional adicional. Os resultados mostraram
que após períodos de incubação de 6 meses e 1 ano E. faecalis foi recuperado em 100%
dos casos. Estes resultados demonstram a ampla capacidade deste microorganismo de
sobreviver a grandes desafios ambientais e de permanecer por um longo período viável
no interior de canais radiculares obturados podendo comprometer o tratamento.
Mecanismos de defesa apresentados pelos microorganismos serão decisivos para
suportar as pressões seletivas impostas no sistema de canais radiculares durante e após o
______________________________________________________________________
56
Revisão de literatura
tratamento endodôntico. E. faecalis e C. albicans têm sido relacionados como um dos
principais microorganismos isolados em casos de insucesso endodôntico. A Baixa
sensibilidade aos agentes antimicrobianos empregados e a habilidade de inativa-los são
importantes para a seleção destas espécies (DAHLÉN et al.
34
, 2000, PORTENIER et
al.
181
, 2002). Entretanto, a sobrevivência destas espécies implica na necessidade de
adaptação ao desafio de um suprimento nutricional deficiente. Enterococcus possui
alguns fatores de virulência que contribuem para sua sobrevida no canal radicular como:
adesão celular (KREFT et al.
112
, 1992), expressão de proteínas que asseguram sua
sobrevivência a um suprimento nutricional deficiente (GIARD et al.
62
, 1997), capacidade
de competir com outras células bacterianas (GALVÉZ et al.
59
, 1991) e de alterar a
resposta do hospedeiro (MIYAZAKI et al.
149
, 1993) e do ambiente (HASE;
FINKELSTEIN
84
, 1993).
Candida albicans também apresenta a capacidade de sobreviver em condiçoes
ambientais desfavoráveis e em ambientes de alta alcalinidade contribuindo para sua
presença em infecções persistents do canal radicular. Alguns fatores de virulência
apresentados pelos fungos contribuem para sua sobrevivência em condições ambientais
hostis. A expressão de monoproteínas de parede celular permite a adesão as células do
hospedeiro e a colonização de tecidos dentais duros. A formação de hifas determina um
incremento na patogenicidade e o tigmotropismo favorece a invasão de túbulos
dentinários. A secreção de proteases digere uma variedade de proteínas teciduais e
contribue para sobrevivência em períodos de baixa oferta nutricional e alterações
fenotípicas são processadas para adaptação em condições ambientais desfavoráveis.
(WALTIMO et al.
262
, 2003).
Diversos estudos têm demonstrado a capacidade do E. faecalis de sobreviver aos
mais diferentes desafios ambientais (LAPLACE et al.
116
, 1997, HARTKE et al.
83
, 1998,
CAPIAUX et al.
26
, 2000). Uma outra importante característica seria a capacidade
apresentada pelo E. faecalis de permanecer e de se restabelecer do estágio denominado
VBNC. Esta é uma estratégia de sobrevivência adotada por muitas bactérias quando
expostas às condições ambientais adversas. Neste estágio, o microorganismo perde a
habilidade de crescer em meios de cultura convencionais, mas mantém a viabilidade e
patogenicidade, e em alguns casos, pode retomar a divisão quando da restauração de
______________________________________________________________________
57
Revisão de Literatura
condições ambientais favoráveis ao crescimento. O estágio VBNC é desencadeado frente
a algumas formas de estresse natural como carência nutricional e alterações na
concentração de oxigênio, osmolaridade e temperatura do meio (OLIVER
164
, 2005).
No estágio VBNC observa-se a manutenção da integridade da parede celular do
microorganismo assim como a capacidade de se ligar e invadir células eucarióticas
(LLEÒ; TAFI; CANEPARI et al.
128
, 1998, PRUZZO et al.
184
, 2002). Neste estágio
objetivando a economia de energia ocorre uma redução da atividade metabólica celular.
Entretanto, a síntese macromolecular e a expressão gênica são preservadas durante o
estágio VBNC e a divisão celular pode ser restabelecida quando condições favoráveis
forem restabelecidas (LLEÒ et al.
127
, 2001). E. faecalis desenvolve também alterações
específicas na parede celular dobrando a expressão de LTA durante o estágio VBNC
refletindo num aumento de sua patogenicidade (SIGNORETTO et al.
207
, 2000).
Considerando que diante de alterações ambientais microorganismos podem alterar
seu estado fisiológico interrompendo a divisão celular, mas mantendo suas atividades
metabólicas, a determinação de viabilidade microbiana deve abranger outros aspectos
além da proliferação celular. Características como permeabilidade ou potencial de
membrana plasmática, respiração e atividade enzimática podem ser utilizadas como
parâmetros para determinação de viabilidade de microorganismos (WEIGER et al.
266
,
2002).
O método de contagem das unidades formadoras de colônia aplicados em muitos
estudos proporciona informações a respeito de microorganismos hábeis à divisão celular
a uma taxa suficiente para formar colônias sob condições laboratoriais específicas.
Estudos utilizando métodos de cultura foram fundamentais para a determinação de
patógenos relacionados à maioria das doenças infecciosas que conhecemos. No caso das
infecções endodônticas não foi diferente. O estabelecimento da relação entre
microorganismos e as doenças da polpa e dos tecidos perirradiculares e a efetividade de
algumas substâncias antimicrobianas foram determinados através de estudos que se
baseavam em procedimentos de cultivo. Entretanto, alguns microorganismos são de
difícil cultivo reduzindo seu isolamento em condições laboratoriais específicas e
subestimando sua presença na amostra processada (OLIVER
164
, 1995, WALKER
258
,
______________________________________________________________________
58
Revisão de literatura
2000). Além disso, a técnica de cultura microbiológica apresenta um limiar para
detecção, necessitando de uma concentração mínima de microorganismos para serem
isolados (HYSEK et al.
96
, 1991, WALKER et al.
258
, 2000).
Para a avaliação da efetividade de agentes antimicrobianos a identificação e
enumeração de microorganismos viáveis e não viáveis é fundamental. A técnica mais
frequentemente utilizada é o método de cultura microbiológica (BYSTRÖM,
CLAESSON, SUNDQVIST
20
, 1985, SJÖGREN et al.
227
, 1997, SHUPING et al.
206
, 2000,
PETERS et al.
176
, 2002). Contudo, apenas bactérias viáveis com capacidade de
multiplicação e em número compatível ao limiar de detecção da técnica serão
identificadas. A microscopia de fluorescência proporciona a identificação de
microorganismos viáveis e não viáveis permitindo, inclusive, estimar o número de
microorganismos totais presentes na amostra. Este método tem se mostrado bastante
sensível e apropriado para a caracterização de viabilidade microbiana (KARLSSON;
MALMBERG
104
, 1989, HYSEK et al.
96
, 1991, WALKER et al.
258
, 2000, BERNARDEU
et al.
14
, 2001, DECKER
39
, 2001, WEIGER et al.
266
, 2002).
A determinação da viabilidade celular através da microscopia de fluorescência se
dá pelo uso de fluorocromos que são marcadores fluorescentes específicos permitindo
que aspectos funcionais ou estruturais da célula sejam avaliados. Fluoróforo é a parte
presente no fluorocromo responsável pela produção de fluorescência. A fluorescência
ocorre por um fenômeno onde elétrons do fluoróforo absorvem fótons provindos de uma
fonte (lâmpada ou feixe laser) e passam de um estado fundamental de energia mais baixa
para um estado excitado de energia mais elevada. Nesse estado o fluoróforo passa por
uma mudança em sua conformação e pode interagir com uma série de moléculas ao seu
redor. Com isso a energia deste estado excitado é dissipada em forma de fóton e o elétron
retorna novamente para o estado de menor energia. A técnica de microscopia de
fluorescência consiste justamente em captar este fóton que é emitido e através dele gerar
uma imagem (ALBERTS et al.
2
, 2004).
A integridade da membrana citoplasmática pode ser avaliada através de alguns
marcadores proporcionando uma importante informação, já que esta é um elemento chave
para determinação da viabilidade celular. Entre estes marcadores podemos destacar, a
______________________________________________________________________
59
Revisão de Literatura
dupla marcação com diacetato de fluoresceína e brometo de etídio ou calceína-AM e
iodeto de propídeo. A utilização de claceína-AM e iodeto de propídio tem sido proposta
por diversos estudos apresentando bons resultados para caracterização da viabilidade
bacteriana (MAGARIÑOS et al., 1997, SGORBATTI et al.
202
, 1998, CHITARRA et al.
30
,
2006). Para caracterização da viabilidade de fungos outros marcadores fluorescentes
podem ser empregados como o diacetato de fluoresceína e brometo de etídeo (CALICH;
PURCHIO; PAULA
25
, 1978, SHIKANAI-YASUDA et al.
204
, 1991, OPROMOLLA;
MADEIRA; BELONE
166
, 1999).
O diacetato de fluoresceína é um composto não fluorescente que atravessa a
membrana celular e uma vez no citoplasma é hidrolisado por ação de esterases em acetato
e fluoresceína. A fluoresceína é um composto fluorescente que quando excitado a 490 nm
apresenta um máximo de emissão a 545 nm. Estando as células avaliadas
metabolicamente ativas, com atividade esterásica e membrana celular íntegra, aparecem
marcadas de verde e designam-se por diacetato de fluoresceína positivas. Caso contrário,
não apresentam fluorescência e designam-se por diacetato de fluoresceína negativas. A
presença de atividade enzimática e integridade da membrana celular são importantes
indicadores de viabilidade.
O iodeto de propídeo é um corante com elevado peso molecular com afinidade
pelos ácidos nucléicos. As células com membrana celular alterada podem incorporar o
iodeto de propídeo e aparecem marcadas de vermelho (excitação 535 nm e emissão 617
nm) designando-se por iodeto de propídeo positivas. As células com a membrana celular
intacta não são permeáveis ao marcador não apresentando fluorescência vermelha e
designando-se iodeto de propídeo negativas.
Calceína-AM denominada de acetoximetil éster de calceína é lipofílica sendo
altamente permeável à membrana citoplasmática. Seu mecanismo de ação é similar ao
diacetato de fluoresceína, sendo necessária sua modificação no citoplasma por ação de
esterases para emitir fluorescência. A calceína-AM emite forte sinal fluorescente
(excitação 490 nm e emissão 515 nm) marcando células viáveis em verde.
______________________________________________________________________
60
Revisão de literatura
Brometo de etídio é um composto fluorescente, cujo mecanismo de ação é similar
ao iodeto de propídeo. Esta substância apresenta a capacidade de penetrar em células com
dano na membrana celular formando complexo fluorescente com o material nuclear
através da ligação ao DNA por intercalação. As células marcadas com brometo de etídio
apresentam fluorescência vermelha (excitação 485 nm e emissão 585 nm).
Proposição
______________________________________________________________________
63
Pro
p
osição
3. PROPOSIÇÃO
Considerando a ação antimicrobiana do hidróxido de cálcio e da clorexidina gel 2% e
da possibilidade de associação de ambas as substâncias para medicação intracanal, este
estudo objetivou:
3.1- Avaliar a capacidade de penetração intratubular de Enterococcus faecalis e
Candida albicans.
3.2- Avaliar o desempenho antimicrobiano destas medicações sobre Enterococcus
faecalis e Candida albicans situados nos túbulos dentinários nas profundidades de 0 -
100 µm e 100 – 200 µm da dentina radicular.
3.2- Avaliar a eficácia da cultura microbiológica e microscopia de fluorescência
como métodos para determinação da viabilidade destes microorganismos.
MateriaL e
Métodos
______________________________________________________________________
67
Material e Método
s
4. MATERIAL E MÉTODOS
4.1 Seleção e preparo dos dentes
Para a realização do estudo foram utilizados 120 dentes humanos recém extraídos,
que permaneceram estocados em solução de formaldeído a 10% até o início de sua
preparação. Foram incluídos na amostra apenas dentes extraídos por motivos
ortodônticos e periodontais e a sua utilização foi aprovada pelo Comitê de Ética em
Pesquisa em Seres Humanos da Faculdade de Odontologia de Bauru – USP. Os restos de
tecido periodontal ou ósseo que, por ventura, estavam aderidos às superfícies radiculares
foram removidos por raspagem com curetas periodontais. Dentes unirradiculados, com
um único canal, ápice radicular completo, e raízes retas ou com discreta curvatura apical
foram selecionados para participarem do estudo. Devido ao grande achatamento no
sentido mesiodistal, incisivos inferiores foram excluídos. Os dentes selecionados foram
radiografados para certificação de que o canal radicular encontrava-se livre de
calcificações ou bifurcações.
Concluída a seleção, iniciaram-se os procedimentos para padronização do
comprimento dos espécimes. Os dentes foram seccionados 2 a 3 mm abaixo da junção
cemento esmalte e de 3 a 5 mm do ápice de forma a se obter um segmento intermediário
da raiz com 8 mm de extensão. Os cortes das porções coronária e apical foram realizados
por discos de carborundum (KG Sorensen Ind. Com. Ltda. - Barueri, SP) e a aferição da
extensão do segmento radicular obtido através de um espessímetro (Buffalo Dental Mfg.
Co. - New York, USA). Após este processo, as raízes foram armazenadas em frascos com
solução fisiológica a 0,9%, a fim de permanecerem constantemente hidratadas até o início
do experimento.
A preparação dos espécimes foi realizada a partir da adaptação do modelo
proposto por HAAPASALO; ØRSTAVIK
78
(1987), que foram os primeiros
pesquisadores a introduzir um modelo para infecção e desinfecção da dentina radicular,
in vitro, através de cilindros de dentina obtidos de raízes de incisivos bovinos.
A padronização do diâmetro do canal radicular objetivou alcançar, ao final da
modelagem, um diâmetro do canal compatível ao apresentado pela broca Gates-Glidden #
______________________________________________________________________
68
Material e Método
s
4 (Dentsply Ind. Com. Ltda. - Petrópolis, RJ). Para tanto, os canais foram
progressivamente dilatados valendo-se de limas tipo K- File 1ª série (# 15 - # 40) de aço
inoxidável (Dentsply Ind. Com. Ltda. - Petrópolis, RJ) e brocas Gates-Glidden # 2 e # 3.
Para finalização do preparo empregou-se broca Gates-Glidden # 4 em toda a extensão do
canal radicular. Durante a preparação, soro fisiológico 0,9% foi utilizado como irrigante a
cada troca de instrumento. Os dentes foram mantidos em gazes umedecidas durante todo
o procedimento para se evitar a desidratação.
Para eliminação da smear layer gerada durante os procedimentos de modelagem,
todos os dentes foram submetidos a um banho ultrassônico (Ultrasonic – L&R Man. Co. -
Kearny, USA) em EDTA 17% (Flor&ser – Farmácia de Manipulação – Bauru,SP),
seguido de NaOCl a 5,25% (Flor&ser – Farmácia de Manipulação – Bauru,SP) ambos
por 10 minutos (PEREZ et al.
175
, 1993). Uma nova lavagem com solução de fosfato
tamponado por 10 minutos, seguida de água destilada por 1 hora, foi realizada
posteriormente para remoção de resíduos de EDTA e NaOCl (FERRAZ et al.
55
, 2001).
A impermeabilização dos espécimes consistiu na aplicação de uma camada de
adesivo epóxi Araldite (BRASCOLA, São Bernardo do Campo, SP) em toda a
superfície radicular externa, exceto na porção correspondente ao acesso coronário e
apical. Inicialmente, procedeu-se à secagem das raízes com gaze e cone de papel
absorvente. Posteriormente, um cone de papel compatível ao diâmetro do canal foi
inserido na sua luz de forma a ocupar este espaço durante todo o processo de
impermeabilização, impedindo que o adesivo adentrasse ao canal. Após o período de
secagem do impermeabilizante, os dentes foram estocados em solução fisiológica 0,9%.
Para esterilização dos espécimes, os 120 dentes foram aleatoriamente distribuídos
em grupos de 5 e acondicionados em tubos de vidro com tampas rosqueáveis contendo
5 mL de meio de cultura em caldo. A esterilização procedeu-se em autoclave (Sercon -
Modelo HS – Mogi das Cruzes, SP) por 30 minutos a 121° C e 1 atm. Finalmente, após
a autoclavagem, os dentes foram mantidos por 48 horas em incubadora (Fanem Ltda. –
Modelo 002 CB – São Paulo,SP) a 37° C para confirmação do processo de
esterilização, que se caracterizou pela ausência de turbidez do meio.
______________________________________________________________________
69
Material e Método
s
C
A
B
D
E F G
H
I
J
K L
C
B
A
D
E F G
I
J
H
K L M
FIGURA 1: Seleção e preparo dos espécimes. Os dentes selecionados para o estudo tiveram o
seu comprimento padronizado através da marcação (A) e secção (B) da porção apical de 3 a 5 mm do
ápice e a porção cervical de 2 a 3 mm abaixo da junção cemento esmalte, de forma a proporcionar um
segmento intermediário da raiz com aproximadamente 8 mm de extensão (C e D). O diâmetro dos canais
foi padronizado através do emprego de broca Gates-glidden # 4 em toda a extensão do canal radicular
(E – G). Para eliminação da smear layer os espécimes foram submetidos a banho ultrassônico em EDTA
17% e NaOCl a 5,25% (I e J) por 10 minutos cada. As raízes tiveram a superfície externa coberta com
adesivo epóxi (K) antes de serem esterilizadas em autoclave (L) a 121° C, a 1 atm e por 30 minutos. Após
a esterilização os espécimes foram incubados por 48 horas em estufa a 37° C para checagem da
esterilização (M).
______________________________________________________________________
71
Material e Método
s
4.2 Contaminação dos espécimes
Para a contaminação dos espécimes foram utilizadas culturas puras de E. faecalis
(ATCC 29212) em caldo BHI (BD Co. - Maryland, USA) e de C. albicans (ATCC
10231) em caldo Sabouraud (LABm – London, UK).
Enterococcus faecalis foi inicialmente cultivado em BHI agar (BD Co. –
Maryland, USA) + 5% de sangue de carneiro desfibrinado e incubado a 37° C por 48
horas. Decorrido o tempo de incubação, as colônias foram isoladas e transportadas para
tubos rosqueáveis contendo 5,0 mL de BHI caldo, respeitando o padrão de concentração
de 0,5 da escala McFarland (1,5 x 10
8
bact/mL), com absorbância de 800 nm através do
espectofotômetro (Pharmacia Biotech – Ultraspec 100 – New Jersey, USA).
O preparo do inóculo de Candidia albicans se deu inicialmente pelo isolamento
de colônias previamente cultivadas em tubos com agar sabouraud inclinado. As colônias
foram dispersas em tubos contendo caldo sabouraud e reservadas por 48 horas à
temperatura ambiente. Posteriormente, procedeu-se a centrifugação (Eppendorf – 5415C
– Hamburg, GE) a 600 g por 5 minutos para separação dos microorganismos do meio de
cultura. Os fungos isolados foram lavados 2 vezes em PBS para remoção de impurezas e
o pelet final resuspenso para a contagem dos microorganismos em câmara de neubauer
(Propper Manufacturin – Long Island City, USA). A partir do número de
microorganismos presentes na solução foram feitas diluições de modo a ajustá-la à
concentração de 1,5 x 10
8
fungos/mL.
Para a contaminação dos espécimes procedeu-se à agitação mecânica dos tubos
contendo o inóculo microbiano previamente preparado. Posteriormente, realizou-se a
substituição dos 5 mL de meio de cultura em caldo, nos quais os espécimes haviam sido
esterilizados, pelos 5 mL (1,5 x 10
8
microorgismo/mL) da suspensão de
microorganismos. Cada espécie de microorganismo avaliada contaminou 60 raízes,
totalizando as 120 selecionadas. Posteriormente, os frascos foram vedados e incubados
em estufa a 37° C por 21 dias. Renovações de 2 mL do meio de cultura contaminado por
______________________________________________________________________
72
Material e Método
s
2 mL de meio de cultura estéril foram realizadas a cada 2 dias para evitar a saturação do
meio.
A avaliação de crescimento microbiano foi realizada através da presença de
turbidez do meio. A pureza das culturas foi confirmada semanalmente pela morfologia
das colônias plaqueadas em BHI agar sangue para E. faecalis ou agar sabouraud para C.
albicans. Além disso, foram aplicados teste de coloração de gram e teste da catalase.
______________________________________________________________________
73
Material e Método
s
A B C
D E F
G H I
M
J K
L
FIGURA 2: Contaminação dos espécimes. Para a contaminação das raízes foram
utilizadas culturas puras de E. faecalis e C. albicans. Após o cultivo por 48 horas de E.
faecalis (A) em BHI ágar sangue e C. albicans (B) em agar sabouraud, colônias foram
isoladas e transportadas para meio de cultura em caldo (C). A concentração do inóculo de E.
faecalis foi ajustada em 0,5 da escala de Macfarland através de espectofotômetro (D) e a de
C. albicans através da contagem de microorganismos em câmara de Neubauer (E).
Padronizou-se a concentração em 1,5 x 10
8
microorg/mL para ambas as espécies e, em
seguida, procedeu-se a contaminação das raízes (F). Os frascos foram vedados, identificados
e incubados em estufa a 37° C por 21 dias (G e H). Procedeu-se à renovação periódica de 2
mL de meio de cultura em caldo a cada 2 dias para se evitar a saturação do meio (I).
Semanalmente foram realizadas inspeções para confirmação da pureza das culturas através
do plaqueamento em meio de cultura específico para análise da morfologia das colônias pela
coloração de gram e pelo teste da catalase (E. faecalis J e K e C. albicans L e M).
______________________________________________________________________
75
Material e Método
s
4.3 Divisão, preparo e aplicação das medicações intracanais
Inicialmente, procedeu-se à divisão dos 120 espécimes contaminados com E.
faecalis e C. albicans em 8 grupos (n= 15) em função das substâncias antimicrobianas
avaliadas. Para este estudo foram selecionados o hidróxido de cálcio, a clorexidina gel
2% e a associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% para avaliação do
desempenho antimicrobiano como medicação intracanal. O soro fisiológico 0,9% foi
utilizado como controle positivo. A distribuição dos grupos será explanada a seguir
(Tabela 1).
TABELA 1: Distribuição e agrupamento dos espécimes em função do microorganismo e
medicação avaliados.
Grupos Substância química intracanal aplicada
Microorganismo Espécimes (n)
1 Soro fisiológico estéril 0,9%
Enter coccus faecalis o
15
2 Hidróxido de cálcio
Enter coccus faecalis o
15
3 Clorexidina gel 2%
Enter coccus faecalis o
15
4 Hidróxido de cálcio + Clorexidina gel 2%
Enter coccus faecalis o
15
5 Soro fisiológico estéril 0,9%
Candida albicans
15
6 Hidróxido de cálcio
Candida albicans
15
7 Clorexidina gel 2%
Candida albicans
15
8 Hidróxido de cálcio + Clorexidina gel 2%
Candida albicans
15
A formulação de hidróxido de cálcio avaliada neste estudo foi a Pasta Calen,
sendo esta disponível comercialmente (S.S.WHITE Artigos dentários Ltda., Rio de
Janeiro, RJ). A clorexidina gel 2% foi obtida junto à farmácia de manipulação (Flor&ser -
Farmácia de Manipulação – Bauru, SP) e utilizada num período máximo de 72 horas após
o seu preparo. A associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% foi preparada
______________________________________________________________________
76
Material e Método
s
imediatamente antes de sua aplicação, no interior da câmara de fluxo laminar, valendo-se
de balança de precisão (ACCULAB - V200). Inicialmente preparou-se uma pasta de
hidróxido de cálcio de espessa consistência adicionando-se hidróxido de cálcio pa
(IODON Ltda. – Porto Alegre, RS) ao soro fisiológico 0,9%. A pasta obtida foi então
associada à clorexidina gel 2% na proporção de 1:1 e manipulada com auxílio de placa de
vidro e espátula.
A aplicação das medicações intracanais ocorreu em câmara de fluxo laminar após
o período de 21 dias de contaminação dos espécimes. Durante a aplicação, utilizou-se
uma pinça de Ális para manipulação das raízes e procedeu-se inicialmente à lavagem do
canal radicular com 5 mL de soro fisiológico 0,9% estéril. Após a irrigação, os dentes
foram secos na superfície externa e interna com gaze e cone de papel absorvente
(TANARI Ind. Ltda. – Manacapuru, AM). As medicações foram empregadas com
seringas e agulhas compatíveis ao diâmetro do canal. Os medicamentos foram injetados
no canal radicular até que ocorresse o extravasamento da medicação na extremidade
oposta da raiz. O excesso de material foi removido com gaze e ambos os acessos,
coronário e apical, selados com cimento cimpat (Septodont – Saint-Maur-des-Fosses,
FR). Posteriormente, os espécimes foram acomodados em gazes umedecidas
posicionadas no interior de placas de Petri (90 x 15 mm) que foram vedadas,
identificadas e incubadas a 37° C por 14 dias para avaliação da ação antimicrobiana.
______________________________________________________________________
77
Material e Método
s
A B C
E F
D
G H I
J
L
K
M
N O
FIGURA 3: Aplicação das medicações intracanais. Após 21 dias de contaminação,
procedeu-se à aplicação das medicações avaliadas em câmara de fluxo laminar (A). Os medicamentos
selecionados para avaliação da ação antimicrobiana foram: hidróxido de cálcio na formulação Calen
®
(B), clorexidina gel 2% (C) e a associação de ambas as substâncias. O soro fisiológico 0,9% foi
utilizado como controle positivo (D). Inicialmente, os espécimes tiveram o canal radicular irrigado com
5 mL de solução fisiológica estéril (E) e foram secos internamente com cones de papel absorvente (F).
Para aplicação das medicações foram utilizadas seringas e agulhas compatíveis ao diâmetro do canal
radicular (G e H). O excesso de material foi removido com gaze (I e J) e ambos os acessos, coronário e
apical, selados com cimento cimpat (K e L). Os espécimes foram acondicionados em placas de Petri
com gazes umedecidas (M – O) e incubados a 37° C por 14 dias.
______________________________________________________________________
79
Material e Método
s
4.4 Coleta das amostras
Concluído o período de 14 dias de contato com as substâncias antimicrobianas, os
espécimes foram removidos da incubadora e procedeu-se à coleta das amostras em
câmara de fluxo laminar. Os espécimes foram apreendidos com pinça de Ális e tiveram o
selamento com cimento provisório removido em ambas as extremidades. Posteriormente,
procedeu-se a remoção do medicamento e lavagem do canal radicular com 5 mL de soro
fisiológico 0,9% estéril. Uma nova irrigação com 1 mL de neutralizador específico
(SIQUEIRA et al.
210
, 1998) para cada uma das substâncias testadas foi realizada, a fim de
se evitar a ação residual das medicações intracanais (Tabela 3). Por fim, utilizou-se 1 mL
de soro fisiológico 0,9% estéril como irrigação final e o canal e a superfície externa das
raízes foram secos novamente.
TABELA 2: Substâncias neutralizadoras recomendadas em função das medicações
intracanais avaliadas.
Fármaco Neutralizador
Hidróxido de cálcio 0,5% de ácido cítrico
Clorexidina gel 2% Tween 80 a 0,5% + Lecitina de soja a 0,07%
Hidróxido de cálcio +
clorexidina gel 2%
Tween 80 a 0,5% + Lecitina de soja a 0,07%
Para a coleta das amostras foram utilizadas brocas tipo Gates-Glidden # 5 e # 6,
que, quando acionadas por motor elétrico (K Driller endo Plus) com 500 rpm e torque de
1 N, promoveram o corte da dentina numa extensão de 0 – 100 µm e de 100 – 200 µm
respectivamente. Portanto, as amostras obtidas consistiram em raspas de dentina advindas
do processo de ampliação padronizada do diâmetro do canal radicular. Para o
recolhimento das amostras, os espécimes apreendidos em pinça de Ális foram
posicionados sobre a abertura de tubos de eppendorf que continham 1 mL de meio de
cultura em caldo. Em seguida, a broca Gates-Glidden foi ativada penetrando em toda a
______________________________________________________________________
80
Material e Método
s
extensão do canal até que sua parte ativa ultrapassasse a extremidade oposta da raiz. Esta
manobra foi realizada 3 vezes em cada espécime criando um espaço compatível ao
diâmetro da broca. Portanto, para cada um dos espécimes foram obtidas 2 amostras de
raspas de dentina correspondentes a profundidades seqüenciais da dentina radicular.
4.5 Processamento das amostras para cultura microbiológica
Imediatamente após a coleta, as amostras foram agitadas mecanicamente por 1
minuto em vortex (Leucotron Eq. Ltda. – Santa Rita do Sapucaí, MG). Após a
homogeneização, 25 µL da suspensão presente nos tubos de eppendorf foram plaqueados
em triplicata em placas de Petri (60x15 mm) contendo BHI agar sangue para amostras
contaminadas com E. faecalis e agar sabouraud para aquelas com C. albicans. As placas
foram incubadas em estufa a 37° C durante 48 horas em condições de aerobiose.
Decorridos o período de incubação procedeu-se à contagem das colônias de
microorganismos, com auxílio de Contador de Colônias CP 600 (Quimis – Aparelhos
científicos – Diadema, SP), determinando-se o número de UFC.
Para a determinação da UFC/mL, as UFC obtidas na contagem das placas foram
multiplicadas por 40, já que foram plaqueados 25µL, ou seja, 40 vezes menor que 1,0mL.
A mediana das 3 placas foi utilizada como valor final de contagem. Os valores obtidos
foram devidamente catalogados para posterior avaliação estatística.
A pureza das culturas foi confirmada através da morfologia das colônias, da
coloração de Gram e pelo teste da catalase.
______________________________________________________________________
81
Material e Método
s
A B C
D E F
I
G H
J
K
L
FIGURA 4: Coleta das amostras. Concluído o período de 14 dias de avaliação das
medicações, as raízes foram submetidas à coleta das amostras em câmara de fluxo laminar (A).
Inicialmente, procedeu-se à remoção do selamento provisório (C) e da medicação intracanal (D). A
ação antimicrobiana das medicações foi neutralizada através da irrigação com 1 mL de neutralizador
específico (E) e da subseqüente lavagem do canal com 5 mL de soro fisiológico 0,9% (F) e da
secagem com cones de papel absorvente (G). Foram coletadas amostras de dentina correspondentes à
extensão de 0 – 100 µm e 100 – 200 µm, através do desgaste seqüencial e padronizado da dentina
radicular com brocas Gates-Glidden # 5 e # 6 (H). As brocas quando acionadas percorreram toda a
extensão do canal até a ultrapassagem na extremidade oposta da raiz (I - K). As amostras recolhidas
(L) foram reservadas para imediato processamento microbiológico.
______________________________________________________________________
83
Material e Método
s
A B
C D
E F
G H
FIGURA 5: Processamento das amostras para cultura microbiológica.
Imediatamente após a coleta, as amostras foram agitadas mecanicamente em vortex (A).
Posteriormente, 25 µL foram pipetados (B) e distribuídos em triplicata em placas petri contendo
meios de cultura específicos. Para E. faecalis foi utilizado BHIA sangue (C e D) e para C.
albicans sabouraud Agar (E e F). Após a distribuição, as placas foram devidamente identificadas
(G) e incubadas em estufa a 37° C, durante 48 horas, para avaliar o desempenho antimicrobiano
das medicações através da contagem de UFC (H).
______________________________________________________________________
85
Material e Método
s
4.6 Processamento das amostras para microscopia de fluorescência
Após a remoção das alíquotas destinadas à cultura microbiológica, todo o restante
das amostras foi encaminhado para processamento imediato e análise em microscopia de
fluorescência.
Inicialmente, procedeu-se à agitação mecânica, em vortex, por 30 segundos para
homogeneização das amostras. Imediatamente ao término da agitação, raspas de dentina
mais espessas que precipitaram-se ao fundo dos tubos de eppendorf foram descartadas.
Essas raspas, por incorporarem grande quantidade de substância marcadora, emitem
intenso sinal fluorescente mascarando os microorganismos durante a análise.
Seguidamente, promoveu-se o isolamento dos microorganismos do meio de cultura
através de centrifugação por 5 minutos a 600 g. O pellet obtido foi diluído em 1ml de
PBS 1x, agitado mecanicamente por 30 segundos para suspensão do material e
encaminhado para novo ciclo de centrifugação. A execução desta etapa objetivou a
lavagem do material para remoção de impurezas e resquícios de meio de cultura. Foi
realizado um total de 3 ciclos de lavagem para cada amostra.
O pellet final obtido após as lavagens foi diluído em 25 µL de PBS 1x que
funcionou como base para diluição dos corantes aplicados nas amostras. Em seguida, o
pellet foi novamente ressuspendido através de agitador mecânico por 30 segundos e os
tubos de ependorff envoltos em papel alumínio para proteção contra luz ambiente.
Para marcação das amostras envolvendo E.faecalis foram utilizadas calceina-AM
e iodeto de propídio como substâncias fluorescentes. Para cada uma das amostras foi
acrescido 2,5 µL de calceína e 1µL de iodeto de propídio. Posteriormente, os tubos foram
agitados manualmente e estocados em estufa a 37° C para incorporação dos reagentes.
Decorridos 15 minutos, as amostras foram novamente centrifugadas e o pellet obtido
montado em lâmina para microscopia. A calceína-AM permitiu a identificação de
bactérias viáveis, enquanto que o iodeto de propídio permitiu a detecção de bactérias não
viáveis. A determinação da viabilidade bacteriana é possível devido à diferença na
coloração atribuída ao sinal fluorescente emitido por cada microorganismo. As bactérias
______________________________________________________________________
86
Material e Método
s
viáveis emitem um sinal detectado na leitura pelo microscópio de fluorescência na cor
verde e as bactérias não viáveis são identificadas pela cor vermelha.
Já para as amostras contendo C. albicans foram utilizados o diacetato de
fluoreceína e o brometo de etídio como marcadores fluorescentes. A fluoresceína
proporcionou a marcação de fungos viáveis em verde, enquanto que o brometo de etídio
permitiu a identificação de fungos não viáveis em vermelho. O processamento das
amostras para microscopia procedeu-se de maneira idêntica aos adotados para E.faecalis
alterando-se, apenas, a alíquota dos reagentes utilizados. A alíquota de diacetato de
fluoresceína e de brometo de etídio acrescida às amostras foi de 25 µL para ambos os
reagentes.
A análise ao microscópio de fluorescência (Microscópio Confocal – Leica
TCS_nt) ocorreu imediatamente após a montagem das lâminas. Para a contagem de
microorganismos viáveis e não viáveis foram selecionados aleatoriamente 3 campos com
magnificação de 100x associado a óleo de imersão. Os valores encontrados foram
catalogados para posterior análise estatística. A partir do número total de
microorganismos computados nos três campos selecionados foi determinada a
porcentagem de microorganismos viáveis e não viáveis encontradas nas amostras.
______________________________________________________________________
87
Material e Método
s
A B C
D E F
G H I
J
L
K
M N O
FIGURA 6: Processamento das amostras para microscopia de fluorescência. As
amostras foram resuspensas em vortex e, posteriormente, o meio de cultura foi isolado, deixando as raspas
de dentina precipitadas ao fundo para descarte (A e B). O meio de cultura aspergido foi depositado em
novo tubo de eppendorf (C) e encaminhado à centrifugação para isolamento dos microorganismos (D). O
pelet obtido foi isolado pelo descarte do meio de cultura (E e F) e encaminhado, em seguida, para 3 ciclos
de lavagens. O pelet final obtido foi diluído em 25 µL de PBS 1X (G) e acrescido dos marcadores
fluorescentes. Para E. faecalis optou-se pela calceina-AM (H) e iodeto de propídio (I), já para C. albicans
empregou-se diacetato de fluoresceína e brometo de etídio (J). Após a adição dos marcadores (K), as
amostras foram incubadas em estufa a 37° C. Finalmente, as amostras foram centrifugadas e o pelet
obtido montado em lâminas para microscopia (L – N) e a análise efetuada em microscópio confocal (O).
______________________________________________________________________
Material e Método
s
89
4.7 Microscopia eletrônica de varredura
Durante o desenvolvimento deste estudo, outros 6 espécimes foram igualmente
preparados e reservados para análise em MEV. Esta avaliação verificou a eficácia dos
procedimentos adotados para remoção de smear layer e contaminação dos espécimes
(Tabela 3).
TABELA 3: Distribuição dos espécimes para análise em MEV.
Espécimes (n) Objetivo da análise em MEV
2 Remoção de smear-layer
2 Contaminação por
E. f ecalis
após 21 dias
a
2 Contaminação por
C. albicans
após 21 dias
As análises em MEV foram realizadas junto ao Núcleo de Apoio à Pesquisa/
Microscopia Eletrônica Aplicada à Pesquisa Agropecuária (NAP/MEPA) da Escola
Superior de Agricultura “Luiz de Queiroz” da Universidade de São Paulo (ESALQ/USP).
As raízes foram inicialmente lavadas em solução fisiológica e encaminhadas para
fixação em solução de Karnovsky Modificada (KARNOVSKY
105
, 1965). A solução
apresenta em sua composição glutaraldeído 2,5%, formaldeído 2,5% em tampão
cacodilato de sódio 0,05M, pH 7,2 e cloreto de cálcio 0,001M. Após o período de fixação
de 48 horas, os dentes foram lavados por 10 minutos em tampão cacodilato 0,05M e
imersos em solução de OsO
4
2% em tampão cacodilato 0,1M por 1 hora.
As amostras fixadas em OsO
4
foram lavadas em água destilada e a seguir
submetidas a soluções de concentração crescente de acetona (30, 50, 70, 90 e 100%) para
desidratação. Os espécimes permaneceram em contato com cada uma das soluções por 10
minutos e posteriormente foram encaminhados para complementação da secagem em
aparelho de ponto crítico (Balzers - CPD 050). Com auxílio de uma morsa, os dentes
foram clivados aleatoriamente e os fragmentos montados em stubs com auxílio de fita
______________________________________________________________________
______________________________________________________________________
Material e Método
s
90
adesiva. A seguir os espéciemes foram metalizados (Balzers – MED 010) e analisados
em microscópio eletrônico de varredura (Zeiss – DSM 900).
4.8 Análise estatística
Para facilitar a análise estatística e obter uma maior normalização e
homogeinização dos dados, realizou-se a transformação do número de UFC para
logarítimos decimais.
Os valores obtidos pela cultura microbiológica e pela microscopia de
fluorescência, relativos ao desempenho antimicrobiano das medicações intracanais
avaliadas sobre E. faecalis e C. albicans, foram analisados através do teste não
paramétrico de Kruskal-Wallis e pelo teste de Miller para as comparações individuais
com nível de significância estabelecido em 5% (p<0,05).
______________________________________________________________________
Resultados
______________________________________________________________________
93
Resultado
s
5. RESULTADOS
5.1 Avaliação da atividade antimicrobiana das medicações intracanais sobre
Enterococcus faecalis através da contagem de UFC.
A eficácia antimicrobiana do hidróxido de cálcio, da clorexidina gel 2% e da
associação hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sobre E. faecalis foi avaliada pela
contagem do número de UFC obtidas após o cultivo de amostras coletadas ao término
de 14 dias de ação dos medicamentos (Tabela 4). Os resultados alcançados
demonstraram que E. faecalis apresentou boa capacidade de penetração intratubular
infectando intensamente os túbulos dentinários em ambas as profundidades da dentina
radicular avaliadas. Na ausência de substância antimicrobiana, registrou-se uma média
de 7,91 logUFC para a profundidade de 0 – 100 µm e de 6,03 logUFC para 100 - 200
µm. A contaminação mostrou-se mais intensa na extensão mais superficial da dentina,
devido ao maior diâmetro dos túbulos dentinários e a maior proximidade com o canal
principal.
A aplicação de medicação no canal radicular proporcionou uma significativa
redução na contagem de UFC em relação ao grupo controle independente da substância
antimicrobiana utilizada e em ambas as profundidades de dentina avaliadas. Entretanto,
a comparação entre as medicações revelou uma variação no desempenho antimicrobiano
sobre E. faecalis (Tabela 5 e 6). A pasta de hidróxido de cálcio apresentou desinfecção
significativamente menor em relação à clorexidina gel 2% e ao hidróxido de cálcio
associado à clorexidina (Figura 7 e 8). As amostras recolhidas de dentes submetidos à
ação do hidróxido de cálcio apresentaram uma média de 4.06 logUFC para a extensão
de 0 – 100 µm e de 3.70 logUFC para 100 – 200 µm, revelando maior resistência de E.
faecalis ao efeito deste medicamento após 14 dias de exposição.
Amostras provenientes de dentes submetidos à ação da clorexidina gel 2%
produziram em sua maioria culturas negativas em ambas as profundidades da dentina
radicular pesquisadas. Os resultados obtidos para clorexidina gel 2% foram de 1,03
logUFC para as amostras recolhidas na porção mais superficial e mais profunda da
______________________________________________________________________
94
Resultado
s
dentina, ambas apresentando diferença estatisticamente significante em relação ao
hidróxido de cálcio. Já a comparação do desempenho antimicrobiano da clorexidina gel
2% isoladamente e de sua associação com o hidróxido de cálcio não revelou diferença
estatisticamente significante independente da porção dentinária avaliada. A associação
ente hidróxido de cálcio e clorexidina apresentou média de 0,49 logUFC para amostras
referentes à extensão de 0 – 100 µm e de 0,79 logUFC para 100 – 200 µm. A adição do
hidróxido de cálcio à clorexidina gel 2% não proporcionou um aumento significativo do
desempenho antimicrobiano, quando comparado ao uso isolado da clorexidina.
Entretanto, a adição de clorexidina gel 2% à pasta de hidróxido de cálcio promoveu uma
melhora significativa na atividade antimicrobiana desta pasta sobre E. faecalis tanto na
dentina mais superficial quanto na mais profunda. Os resultados demonstraram uma
maior eficácia antimicrobiana da clorexidina gel 2% sobre E. faecalis.
TABELA 4: Avaliação da atividade antimicrobiana de hidróxido de cálcio, clorexidina
gel 2% e da associação hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sobre Enterococcus
faecalis através da contagem de UFC.
Grupos
Média
0-100 100-200
D.P.
0-100 100-200
Máximo
0-100 100-200
Mínimo
0-100 100-200
Número
G1 7.91 6.03 0.50 1.00 8.48 7.50 6.87 4.39 15
G2 4.06 3.70 1.72 1.55 5.30 4.79 0.00 0.00 15
G3 1.03 1.03 1.78 1.78 4.39 4.39 0.00 0.00 15
G4 0.49 0.79 1.30 1.64 3.71 4.39 0.00 0.00 15
G1: Grupo controle; G2: Hidróxido de cálcio; G3: Clorexidina gel 2%; G4: Hidróxido de
cálcio + clorexidina gel 2%; D.P.: Desvio Padrão.
______________________________________________________________________
95
Resultado
s
TABELA 5: Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais
sobre E. faecalis, através das médias de logUFC registradas na extensão de 0 – 100 µm
da dentina radicular.
Grupos Média D.P. Média D.P. Diferença Significância
G1 x G2
7.91 0.50 4.06 1.72 17.93 Significante
G1 x G3
7.91 0.50 1.03 1.78 34.77 Significante
G1 x G4
7.91 0.50 0.49 1.30 37.30 Significante
G2 x G3
4.06 1.72 1.03 1.78 16.83 Significante
G2 x G4
4.06 1.72 0.49 1.30 19.36 Significante
G3 x G4
1.03 1.78 0.49 1.30 2.53 Não significante
G1: Grupo controle; G2: Hidróxido de cálcio; G3: Clorexidina gel 2%; G4: Hidróxido de
cálcio + clorexidina gel 2%; D.P.: Desvio Padrão. Diferenças estatísticas em função de
p< 0,05, com valor crítico de 16,38.
TABELA 6: Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais
sobre E. faecalis, através das médias de logUFC registradas na extensão de 100 – 200 µm
da dentina radicular.
Grupos Média D.P. Média D.P. Diferença Significância
G1 x G2
6.03 1.00 3.70 1.55 17.13 Significante
G1 x G3
6.03 1.00 1.03 1.78 33.80 Significante
G1 x G4
6.03 1.00 0.79 1.64 34.93 Significante
G2 x G3
3.70 1.55 1.03 1.78 16.67 Significante
G2 x G4
3.70 1.55 0.79 1.64 17.80 Significante
G3 x G4
1.03 1.78 0.79 1.64 1.13 Não significante
G1: Grupo controle; G2: Hidróxido de cálcio; G3: Clorexidina gel 2%; G4: Hidróxido de
cálcio + clorexidina gel 2%; D.P.: Desvio Padrão. Diferenças estatísticas em função de
p< 0,05, com valor crítico de 16,38.
______________________________________________________________________
97
Resultado
s
A
G1 G2 G3 G4
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
UFC
Grupos
B
G1 G2 G3 G4
0
1
2
3
4
5
6
7
UFC
Grupos
FIGURA 7: Avaliação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais
sobre Enterococcus faecalis presentes nos túbulos dentinários através da contagem
de UFC. Sessenta raízes de dentes humanos foram infectadas com E. faecalis na
concentração de 1,5x10
8
bactérias/mL. Após 21 dias de contaminação, os medicamentos
foram aplicados no interior dos canais radiculares permanecendo por 14 dias. As
amostras avaliadas consistiram em raspas de dentina obtidas do processo de ampliação
padronizada do diâmetro do canal radicular. As amostras foram submetidas à cultura
microbiológica em triplicata e após 48 horas de incubação promoveu-se a avaliação das
UFC considerando a mediana das 3 placas como valor final. As barras representam o
log das médias de UFC obtidas para cada um dos grupos (G1– Controle; G2– Hidróxido
de cálcio; G3– Clorexidina; G4 – Hidróxido de cálcio + Clorexidina) em profundidades
de 0 – 100 µm (A) e 100 – 200 µm (B). Para análise estatística empregou-se o teste
não paramétrico de Kruskal Wallis e o teste de Miller para as comparações
individuais. O valor de p foi considerado significante quando p< 0,05.
______________________________________________________________________
99
Resultado
s
FIGURA 8: Culturas de Enterococcus faecalis. Concluído o período de 14 dias de
aplicação das medicações as amostras coletadas foram imediatamente processadas
para cultura microbiológica. Alíquotas de 25 µL foram cultivadas em triplicata em
meio de cultura BHIA sangue e incubadas em condições de aerobiose por 48 horas.
Posteriormente, procedeu-se a contagem das UFC e a mediana das três placas
considerada como valor final.
0
- 100µm
Enterococcus faecalis
100-
2
00
µm
G1
- Controle
G2
– Hidróxido de cálcio
G3
– Clorexidina Gel 2%
G4 – Hidróxido de cálcio +
Clorexidina Gel 2%
______________________________________________________________________
101
Resultado
s
5.2 Avaliação da atividade antimicrobiana das medicações intracanais sobre
Enterococcus faecalis através de microscopia de fluorescência.
Para avaliar se a atividade antimicrobiana do hidróxido de cálcio, da clorexidina
gel 2% e da associação hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% exercem influência na
viabilidade de E. faecalis, as amostras coletadas, após 14 dias de ação dos
medicamentos, foram submetidas à análise em microscopia de fluorescência, a fim de se
determinar a diferenciação entre bactérias viáveis e não viáveis (Tabela 7 e 8).
Os resultados alcançados demonstraram que a grande maioria das bactérias
presentes em amostras não submetidas à ação de substâncias antimicrobianas eram
viáveis. A proporção de bactérias viáveis e não viáveis na extensão de 0 – 100 µm foi de
73,96% e 26,04%, enquanto que na extensão de 100 – 200 µm a proporção foi de
76,95% e 23,05%. Os resultados de microscopia de fluorescência também confirmaram
a infecção dos túbulos dentinários por E. faecalis em ambas as extensões de dentina
radicular avaliadas.
A aplicação de medicação no canal radicular proporcionou uma significativa
alteração na proporção de bactérias viáveis e não viáveis encontradas nas amostras de
ambas as profundidades da dentina radicular (Figura 9). Devido ao efeito
antimicrobiano das substâncias, a proporção de bactérias viáveis foi reduzida a menos
da metade daquela presente no grupo controle. Entretanto, ao compararmos cada uma
das medicações avaliadas observamos uma variação no desempenho antimicrobiano
sobre E. faecalis (Tabela 9 e 10). A pasta de hidróxido de cálcio apresentou desinfecção
significativamente menor em relação à clorexidina gel 2% e à associação hidróxido de
cálcio e clorexidina gel 2%. As amostras recolhidas de dentes submetidos à ação do
hidróxido de cálcio apresentaram em média uma relação de bactérias viáveis e não
viáveis de 25,02% e 74,98% para amostras de 0 – 100 µm e de 24,59% e 75,41% para
amostras de 100 – 200 µm. Estes achados revelaram uma taxa de sobrevivência em
torno de ¼ das bactérias presentes nos túbulos dentinários mesmo após a aplicação do
medicamento por 14 dias.
______________________________________________________________________
102
Resultado
s
A análise dos resultados alcançados pela clorexidina gel 2% revelaram que esta
foi significativamente mais eficaz na eliminação de E. faecalis quando comparada à
pasta de hidróxido de cálcio. Os resultados demonstraram uma superioridade na
desinfecção dos túbulos dentinários nas duas profundidades pesquisadas com uma
média de bactérias viáveis e não-viáveis de 6,90% e 93,10% para amostras de 0 – 100
µm e de 6,55% e 93,45% para amostras de 100 – 200 µm. Resultados semelhantes
foram encontrados para a associação hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2 %
demonstrando que a adição do hidróxido de cálcio à clorexidina não incrementou
significativamente a sua atividade antimicrobiana. O hidróxido de cálcio associado à
clorexidina apresentou média de 4,54% de bactérias viáveis e 95,46% de bactérias não
viáveis para amostras de 0 - 100 µm e de 5,88% e 94,12% para 100 - 200 µm.
Entretanto, a combinação de ambos os medicamentos apresentou superioridade
antimicrobiana significativa em relação ao uso isolado do hidróxido de cálcio, revelando
que a adição de clorexidina gel 2% à pasta de hidróxido de cálcio imprimiu maior
atividade bactericida sobre E. faecalis tanto na dentina mais superficial quanto na mais
profunda. Portanto, os resultados demonstraram uma maior susceptibilidade de E.
faecalis à ação antimicrobiana da clorexidina gel 2%.
Outro achado importante obtido através da análise em microscopia de
fluorescência foi a identificação de bactérias viáveis em amostras que apresentaram
crescimento nulo nas culturas microbiológicas. A figura 10 consiste em
fotomicrografias de E. faecalis obtidas após 14 dias de ação dos medicamentos.
______________________________________________________________________
103
Resultado
s
TABELA 7: Avaliação da atividade antimicrobiana da pasta de hidróxido de cálcio,
clorexidina gel 2% e da associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sobre
Enterococcus faecalis pela determinação de bactérias viáveis e não viáveis através da
análise em microscopia de fluorescência de amostras da dentina radicular referentes à
extensão de 0 - 100 µm.
Grupos
Média
Viáveis Não Viáveis
D.P.
Viáveis Não Viáveis
Máximo
Viáveis Não Viáveis
Mínimo
Viáveis Não Viáveis
Número
G1 73.96% 26.04% 6.07% 6.07% 86.36% 34.04% 65.96% 13.64% 15
G2 25.02% 74.98% 10.87% 10.87% 40.54% 100.00% 0.00% 59.46% 15
G3 6.90% 93.10% 8.25% 8.25% 20.69% 100.00% 0.00% 79.31% 15
G4 4.54% 95.46% 6.50% 6.50% 21.43% 100.00% 0.00% 78.57% 15
G1: Grupo controle; G2: Hidróxido de cálcio; G3: Clorexidina gel 2%; G4: Hidróxido de cálcio +
clorexidina gel 2%; D.P.: Desvio Padrão.
TABELA 8: Avaliação da atividade antimicrobiana da pasta de hidróxido de cálcio,
clorexidina gel 2% e da associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sobre
Enterococcus faecalis pela determinação de bactérias viáveis e não viáveis através da
análise em microscopia de fluorescência de amostras da dentina radicular referentes à
extensão de 100 - 200 µm.
Grupos
Média
Viáveis Não Viáveis
D.P.
Viáveis Não Viáveis
Máximo
Viáveis Não Viáveis
Mínimo
Viáveis Não Viáveis
Número
G1 76.95% 23.05% 5.59% 5.59% 86.36% 31.25% 68.75% 13.64% 15
G2 24.59% 75.41% 9.23% 9.23% 35.71% 100.00% 0.00% 64.29% 15
G3 6.55% 93.45% 9.57% 9.57% 28.57% 100.00% 0.00% 71.43% 15
G4 5.88% 94.12% 9.50% 9.50% 25.00% 100.00% 0.00% 75.00% 15
G1: Grupo controle; G2: Hidróxido de cálcio; G3: Clorexidina gel 2%; G4: Hidróxido de cálcio +
clorexidina gel 2%; D.P.: Desvio Padrão.
______________________________________________________________________
104
Resultado
s
TABELA 9: Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais
sobre E. faecalis, através da média de porcentagem de bactérias viáveis registradas na
extensão de 0 – 100 µm da dentina radicular.
Grupos Média D.P. Média D.P. Diferença Significância
G1 x G2
73.96% 6.07% 25.02% 10.87% 17.43% Significante
G1 x G3
73.96% 6.07% 6.90% 8.25% 35.20% Significante
G1 x G4
73.96% 6.07% 4.54% 6.50% 37.37% Significante
G2 x G3
25.02% 10.87% 6.90% 8.25% 17.77% Significante
G2 x G4
25.02% 10.87% 4.54% 6.50% 19.93% Significante
G3 x G4
6.90% 8.25% 4.54% 6.50% 2.17% Não significante
G1: Grupo controle; G2: Hidróxido de cálcio; G3: Clorexidina gel 2%; G4: Hidróxido de
cálcio + clorexidina gel 2%; D.P.: Desvio Padrão. Diferenças estatísticas em função de
p< 0,05, com valor crítico de 16,38.
TABELA 10: Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais
sobre E. faecalis, através da média de porcentagem de bactérias viáveis registradas na
extensão de 100 – 200 µm da dentina radicular.
Grupos Média D.P. Média D.P. Diferença Significância
G1 x G2
76.94% 5.59% 24.58% 9.23% 18.33% Significante
G1 x G3
76.94% 5.59% 6.55% 9.57% 35.47% Significante
G1 x G4
76.94% 5.59% 5.88% 9.50% 36.20% Significante
G2 x G3
24.58% 9.23% 6.55% 9.57% 17.13% Significante
G2 x G4
24.58% 9.23% 5.88% 9.50% 17.87% Significante
G3 x G4
6.55% 9.57% 5.88% 9.50% 0.73% Não significante
G1: Grupo controle; G2: Hidróxido de cálcio; G3: Clorexidina gel 2%; G4: Hidróxido de
cálcio + clorexidina gel 2%; D.P.: Desvio Padrão. Diferenças estatísticas em função de
p< 0,05, com valor crítico de 16,38.
______________________________________________________________________
105
Resultado
s
FIGURA 9: Avaliação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais
sobre Enterococcus faecalis presente nos túbulos dentinários através da análise por
microscopia de fluorescência. Sessenta raízes de dentes humanos foram infectadas
com E. faecalis na concentração de 1,5x10
8
bactérias/mL. Após 21 dias de
contaminação, os medicamentos foram aplicados no interior dos canais radiculares
permanecendo por 14 dias. As amostras avaliadas consistiram em raspas de dentina
obtidas do processo de ampliação padronizada do diâmetro do canal radicular. Após a
coleta, as amostras foram processadas imediatamente para análise em microscopia de
fluorescência. A análise microscópica consistiu na seleção aleatória de 3 campos para
determinação da porcentagem de bactérias viáveis e não viáveis para cada uma das
amostras. As barras representam as médias, em porcentagem, de bactérias viáveis e não
viáveis em cada um dos grupos (G1– Controle; G2– Hidróxido de cálcio; G3–
Clorexidina; G4 – Hidróxido de cálcio + Clorexidina) em profundidades de 0 – 100 µm
(A) e 100 – 200 µm (B). A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste não
paramétrico de Kruskal Wallis e o teste de Miller para as comparações
individuais. O valor de p foi considerado significante quando p< 0,05.
G1 G2 G3 G4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Grupos
(%) Viabilidade
B
G1 G2 G3 G4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
(%) Viabilidade
A
Viáveis
Não viáveis
Viáveis
Não viáveis
Grupos
______________________________________________________________________
107
Resultado
s
A
B
C D
Enterococcus faecalis
FIGURA 13: Fotomicrografias de E. faecalis após aplicação de medicação intracanal. Concluído o
período de 14 dias de aplicação das medicações as amostras coletadas foram imediatamente processadas para
análise em microscopia de fluorescência. Após os procedimentos de isolamento e lavagem dos
microorganismos, marcadores fluorescentes foram adicionados às amostras objetivando a diferenciação entre
células viáveis e não viáveis. As substâncias fluorescentes utilizadas foram calceína-AM para identificação de
bactérias viáveis em verde e iodeto de propídio para marcação de bactérias não viáveis em vermelho. As
amostras previamente diluídas em 25 µL de PBS receberam 2,5 µL de calceína-AM e 1,0 µL de iodeto de
propídio para marcação das bactérias. As amostras foram incubadas a 37°C por 15 minutos para incorporação
dos marcadores. Novamente procedeu-se à centrifugação e o pellet final obtido montado em lâmina para
análise em microscópio confocal. A porcentagem de fungos viáveis e não viáveis presentes nas amostras foi
determinada após a contagem dos microorganismos encontrados em 3 campos selecionados aleatoriamente. As
fotomicrografias representam a viabilidade de E. faecalis após 14 dias de ação das substâncias antimicrobianas
(A-Soro fisiológico 0,9%, B- Hidróxido de cálcio, C- Clorexidina gel 2%, D- Hidróxido de cálcio +
Clorexidina gel 2%).
______________________________________________________________________
109
Resultado
s
5.3 Avaliação da atividade antimicrobiana das medicações intracanais sobre
Candida albicans através da contagem de UFC.
A eficácia antimicrobiana do hidróxido de cálcio, da clorexidina gel 2% e da
associação hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% foi avaliada através da contagem do
número de ufc obtidas após o cultivo de amostras coletadas em dentes infectados com
C. albicans e submetidos à ação de medicamentos por um período de 14 dias (Tabela
11). Os resultados alcançados pelo grupo controle demonstraram que C. albicans
apresentou um padrão de penetração tubular diferente daquele apresentado por E.
faecalis. Candida albicans infectou mais intensamente apenas a porção mais superficial
da dentina radicular encontrando dificuldade para atingir a extensão de 100 – 200 µm. A
média de contaminação obtida para a extensão de 0 – 100 µm foi de 6,64 logUFC e para
a extensão de 100 – 200 µm 3,62 logUFC.
A aplicação de medicação no canal radicular proporcionou uma significativa
redução na contagem de UFC em relação ao grupo controle independente da substância
utilizada e para ambas as profundidades de dentina avaliadas (Figura 11 e 12).
Entretanto, ao compararmos cada uma das medicações avaliadas observamos uma
variação no desempenho antimicrobiano sobre C. albicans apenas na porção de dentina
mais superficial (Tabela 12 e 13).
Para amostras correspondentes a extensão de 0 – 100 µm a pasta de hidróxido
de cálcio apresentou desinfecção significativamente menor em relação à clorexidina gel
2% e à associação hidróxido de cálcio e clorexidina. As amostras recolhidas de dentes
submetidos à ação do hidróxido de cálcio apresentaram uma média de 3,62 log UFC
revelando uma maior resistência de C. albicans ao efeito deste medicamento após 14
dias de exposição.
Amostras provenientes de dentes submetidos à ação da clorexidina gel 2%
produziram em sua maioria culturas negativas. Os resultados obtidos foram de 0,49 log
UFC apresentando diferença estatisticamente significante em relação ao hidróxido de
cálcio. Já ao compararmos o desempenho antimicrobiano da clorexidina gel 2%
isoladamente e de sua associação com o hidróxido de cálcio não observamos diferença
______________________________________________________________________
110
Resultado
s
significante. O hidróxido de cálcio associado à clorexidina apresentou média de 0,25 log
UFC, indicando que a adição do hidróxido de cálcio à clorexidina não representou um
aumento significativo no desempenho antimicrobiano, quando comparado ao uso
isolado da clorexidina gel 2%. Entretanto, a adição de clorexidina à pasta de hidróxido
de cálcio promoveu uma melhora significativa na atividade antimicrobiana desta pasta,
proporcionando maior efetividade contra C. albicans. Os resultados demonstraram uma
maior eficácia antimicrobiana da clorexidina gel 2% sobre C. albicans.
Para amostras correspondentes a extensão de 100 – 200 µm, devido a menor
penetração de C. albicans, não houve diferença significante entre os três medicamentos
avaliados. As médias encontradas para amostras correspondentes a extensão de 100 –
200 µm foi de 1,28 logUFC para o hidróxido de cálcio, 0,49 logUFC para clorexidina
gel 2% e de 0,25 logUFC para a associação hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2%.
TABELA 11: Avaliação da atividade antimicrobiana da pasta de hidróxido de cálcio,
clorexidina gel 2% e da associação hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sobre
Candida albicans através da contagem de UFC .
Grupos
Média
0-100 100-200
D.P.
0-100 100-200
Máximo
0-100 100-200
Mínimo
0-100 100-200
Número
G1 6.64 3.55 0.20 1.91 6.91 5.08 6.25 0.00 15
G2 3.62 1.28 1.94 1.88 5.30 4.39 0.00 0.00 15
G3 0.49 0.49 1.30 1.30 3.71 3.71 0.00 0.00 15
G4 0.25 0.25 0.96 0.96 3.71 3.71 0.00 0.00 15
G1: Grupo controle; G2: Hidróxido de cálcio; G3: Clorexidina gel 2%; G4: Hidróxido de
cálcio + clorexidina gel 2%; D.P.: Desvio Padrão.
______________________________________________________________________
111
Resultado
s
TABELA 12: Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais
sobre C. albicans, através das médias de logUFC registradas na extensão de 0 – 100 µm
da dentina radicular.
Grupos Média D.P. Média D.P. Diferença Significância
G1 x G2
6.64 0.20 3.62 1.94 18.60 Significante
G1 x G3
6.64 0.20 0.49 1.30 35.10 Significante
G1 x G4
6.64 0.20 0.25 0.96 36.30 Significante
G2 x G3
3.62 1.94 0.49 1.30 16.50 Significante
G2 x G4
3.62 1.94 0.25 0.96 17.70 Significante
G3 x G4
0.49 1.30 0.25 0.96 1.20 Não significante
G1: Grupo controle; G2: Hidróxido de cálcio; G3: Clorexidina gel 2%; G4: Hidróxido de
cálcio + clorexidina gel 2%; D.P.: Desvio Padrão. Diferenças estatísticas em função de
p< 0,05, com valor crítico de 16,38.
TABELA 13: Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais
sobre C. albicans, através das médias de logUFC registradas na extensão de 100 – 200
µm da dentina radicular.
Grupos Média D.P. Média D.P. Diferença Significância
G1 x G2
3.55 1.91 1.28 1.88 16.97 Significante
G1 x G3
3.55 1.91 0.49 1.30 22.53 Significante
G1 x G4
3.55 1.91 0.25 0.96 24.23 Significante
G2 x G3
1.28 1.88 0.49 1.30 5.57 Não Significante
G2 x G4
1.28 1.88 0.25 0.96 7.27 Não Significante
G3 x G4
0.49 1.30 0.25 0.96 1.70 Não significante
G1: Grupo controle; G2: Hidróxido de cálcio; G3: Clorexidina gel 2%; G4: Hidróxido de
cálcio + clorexidina gel 2%; D.P.: Desvio Padrão. Diferenças estatísticas em função de
p< 0,05, com valor crítico de 16,38.
______________________________________________________________________
113
Resultado
s
A
G1 G2 G3 G4
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
UFC
Grupos
B
G1 G2 G3 G4
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
4.5
UFC
Grupos
FIGURA 11: Avaliação do desempenho antimicrobiano das medicações
intracanais sobre Candida albicans presente nos túbulos dentinários através da
contagem de UFC. Sessenta raízes de dentes humanos foram infectadas com
C. albicans na concentração de 1,5 x 10
8
fungos/mL. Após 21 dias de contaminação, os
medicamentos foram aplicados no interior dos canais radiculares permanecendo por 14
dias. As amostras avaliadas consistiram em raspas de dentina obtidas do processo de
ampliação padronizada do diâmetro do canal radicular. As amostras foram submetidas à
cultura microbiológica em triplicata e após 48 horas de incubação promoveu-se a
avaliação das UFC considerando a mediana das 3 placas como valor final. As barras
representam as médias de log UFC obtidas para cada um dos grupos (G1– Controle;
G2– Hidróxido de cálcio; G3– Clorexidina; G4 – Hidróxido de cálcio + Clorexidina) em
profundidades de 0 – 100 µm (A) e 100 – 200 µm (B). Para análise estatística
empregou-se o teste não paramétrico de Kruskal Wallis e o teste de Miller para as
comparações individuais. O valor de p foi considerado significante quando p< 0,05.
______________________________________________________________________
115
Resultado
s
0
- 100µm
Candida albicans
100-
2
00
µm
G1
- Controle
G2
– Hidróxido de cálcio
G3
– Clorexidina Gel 2%
G4 – Hidróxido de cálcio +
Clorexidina Gel 2%
FIGURA 12: Culturas de Candida albicans. Concluído o período de 14 dias de
aplicação das medicações as amostras coletadas foram imediatamente processadas para
cultura microbiológica. Alíquotas de 25 µL foram cultivadas em triplicata em meio de
cultura sabouraud Agar e incubadas em condições de aerobiose por 48 horas.
Posteriormente, procedeu-se a contagem das UFC e a mediana das três placas
considerada como valor final.
______________________________________________________________________
117
Resultado
s
5.4 Avaliação da atividade antimicrobiana das medicações intracanais sobre
Candida albicans através de microscopia de fluorescência.
Para avaliar se a atividade antimicrobiana do hidróxido de cálcio, da clorexidina
gel 2% e da associação hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% exercem influência na
viabilidade de C. albicans, as amostras coletadas, após 14 dias de ação dos
medicamentos, foram submetidas à análise em microscopia de fluorescência, a fim de se
determinar a diferenciação entre fungos viáveis e não viáveis (Tabela 14 e 15).
Os resultados alcançados pelo grupo controle demonstraram que a grande
maioria dos fungos presentes em amostras não submetidas à ação de substâncias
antimicrobianas consistia em células viáveis. Observou-se uma proporção de 63,13% e
36,87% de fungos viáveis e não viáveis na extensão de 0 – 100 µm e de 63,89% e
36,11% na extensão de 100 – 200 µm. Os resultados da microscopia de fluorescência
também confirmaram a infecção dos túbulos dentinários por C. albicans observando-se
proporção semelhante entre fungos viáveis e não viáveis nas duas porções de dentina
radicular avaliadas.
A aplicação de medicação no canal radicular proporcionou uma significativa
alteração na proporção de fungos viáveis e não viáveis encontrados nas amostras de
ambas as profundidades da dentina radicular (Figura 13). Devido ao efeito
antimicrobiano das substâncias, a proporção de fungos viáveis foi reduzida a menos da
metade daquela presente no grupo controle. Entretanto, ao compararmos cada uma das
medicações avaliadas observamos uma variação no desempenho antimicrobiano sobre
C. albicans apenas entre as amostras coletadas na porção mais superficial da dentina
(Tabela 16 e 17).
Considerando as amostras de 0 – 100 µm, a pasta de hidróxido de cálcio
apresentou desinfecção significativamente menor em relação à clorexidina gel 2% e à
associação hidróxido de cálcio e clorexidina. As amostras recolhidas de dentes
submetidos à ação do hidróxido de cálcio apresentaram em média uma relação de
fungos viáveis e não viáveis de 23,34% e 76,66%. Estes achados revelaram uma taxa de
______________________________________________________________________
118
Resultado
s
sobrevivência em torno de ¼ dos fungos presentes nos túbulos dentinários, mesmo após
a ação do medicamento por 14 dias.
Ao analisarmos os resultados alcançados pela clorexidina gel 2% observou-se
que esta foi significativamente mais eficaz na eliminação de C. albicans quando
comparada à pasta de hidróxido de cálcio. Os resultados demonstraram uma
superioridade na desinfecção dos túbulos dentinários com uma média de fungos viáveis
e não-viáveis de 4,05% e 95,95%. Resultados semelhantes foram encontrados para a
associação hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% demonstrando que a adição do
hidróxido de cálcio à clorexidina não incrementou significativamente a sua atividade
antimicrobiana. O hidróxido de cálcio associado à clorexidina apresentou média de
2,67% de fungos viáveis e 97,33% de fungos não viáveis. Entretanto, o grupo 4
apresentou superioridade antimicrobiana significativa em relação ao grupo 2 revelando
que a adição de clorexidina gel 2% à pasta de hidróxido de cálcio imprimiu maior
atividade fungicida sobre C. albicans para desinfecção da dentina mais superficial.
Portanto, os resultados demonstraram uma maior susceptibilidade de E. faecalis à ação
antimicrobiana da clorexidina gel 2%.
Considerando as amostras de 100 – 200 µm, devido a menor penetração
intratubular de C. albicans, não houve diferença significante entre os três medicamentos
avaliados. As médias de fungos viáveis e não viáveis encontradas foram de 16,89% e
83,11% para hidróxido de cálcio, 2,48% e 97,52% para a clorexidina gel 2% e 1,04% e
98,96% para a associação hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2%.
A identificação de células viáveis em amostras que apresentaram crescimento
nulo nas culturas microbiológicas também ocorreu nas amostras contaminadas com
C. albicans, entretanto, este achado foi menos freqüente que aqueles observados com
E. faecalis. A figura 14 consiste em fotomicrografias de C. albicans obtidas após 14
dias de ação dos medicamentos.
______________________________________________________________________
119
Resultado
s
TABELA 14: Avaliação da atividade antimicrobiana da pasta de hidróxido de cálcio,
clorexidina gel 2% e da associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sobre
Candida albicans pela determinação de fungos viáveis e não viáveis através da análise
em microscopia de fluorescênciade amostras de dentina radicular referêntes a extensão de
0 - 100 µm.
Grupos
Média
Viáveis Não Viáveis
D.P.
Viáveis Não Viáveis
Máximo
Viáveis Não Viáveis
Mínimo
Viáveis Não Viáveis
Número
G1 63.13% 36.87% 5.76% 5.76% 71.43% 47.83% 52.17% 28.57% 15
G2 23.34% 76.66% 10.87% 10.87% 38.10% 100.00% 0.00% 61.90% 15
G3 4.05% 95.95% 7.05% 7.05% 18.18% 100.00% 0.00% 81.82% 15
G4 2.67% 97.33% 5.66% 5.66% 16.67% 100.00% 0.00% 83.33% 15
TABELA 15: Avaliação da atividade antimicrobiana da pasta de hidróxido de cálcio,
clorexidina gel 2% e da associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% sobre
Candida albicans pela determinação de bactérias viáveis e não viáveis através da análise
em microscopia de fluorescência de amostras da dentina radicular referêntes a extensão
de 100 - 200 µm.
Grupos
Média
Viáveis Não Viáveis
D.P.
Viáveis Não Viáveis
Máximo
Viáveis Não Viáveis
Mínimo
Viáveis Não Viáveis
Número
G1 63.89% 36.11% 5.14% 5.14% 75.00% 42.86% 57.14% 25.00% 12
G2 16.89% 83.11% 16.89% 16.89% 40.00% 100.00% 0.00% 60.00% 11
G3 2.48% 97.52% 5.88% 5.88% 18.18% 100.00% 0.00% 81.82% 11
G4 1.04% 98.96% 3.61% 3.61% 12.50% 100.00% 0.00% 87.50% 12
G1: Grupo controle; G2: Hidróxido de cálcio; G3: Clorexidina gel 2%; G4: Hidróxido de cálcio +
clorexidina
g
el 2
%;
D.P.: Desvio Padrão.
G1: Grupo controle; G2: Hidróxido de cálcio; G3: Clorexidina gel 2%; G4: Hidróxido de cálcio +
clorexidina
g
el 2
%;
D.P.: Desvio Padrão.
.
______________________________________________________________________
120
Resultado
s
TABELA 16: Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais
sobre C. albicans, através da média da porcentagem de fungos viáveis registradas na
extensão de 0 – 100 µm da dentina radicular.
Grupos Média D.P. Média D.P. Diferença Significância
G1 x G2
63.13% 5.76% 23.34% 10.87% 17.67% Significante
G1 x G3
63.13% 5.76% 4.05% 7.05% 35.47% Significante
G1 x G4
63.13% 5.76% 2.67% 5.66% 36.87% Significante
G2 x G3
23.34% 10.87% 4.05% 7.05% 17.80% Significante
G2 x G4
23.34% 10.87% 2.67% 5.66% 19.20% Significante
G3 x G4
4.05% 7.05% 2.67% 5.66% 1.40% Não significante
G1: Grupo controle; G2: Hidróxido de cálcio; G3: Clorexidina gel 2%; G4: Hidróxido de
cálcio + clorexidina gel 2%; D.P.: Desvio Padrão. Diferenças estatísticas em função de
p< 0,05, com valor crítico de 16,38.
TABELA 17: Comparação do desempenho antimicrobiano das medicações intracanais
sobre C. albicans, através da média da porcentagem de fungos viáveis e registradas na
extensão de 100 – 200 µm da dentina radicular.
Grupos Média D.P. Média D.P. Diferença Significância
G1 x G2
63.89% 5.14% 16.89% 16.89% 17.41% Significante
G1 x G3
63.89% 5.14% 2.48% 5.88% 24.95% Significante
G1 x G4
63.89% 5.14% 1.04% 3.61% 26.33% Significante
G2 x G3
16.89% 16.89% 2.48% 5.88% 7.54% Não significante
G2 x G4
16.89% 16.89% 1.04% 3.61% 8.92% Não significante
G3 x G4
2.48% 5.88% 1.04% 3.61% 1.38% Não significante
G1: Grupo controle; G2: Hidróxido de cálcio; G3: Clorexidina gel 2%; G4: Hidróxido de
cálcio + clorexidina gel 2%; D.P.: Desvio Padrão. Diferenças estatísticas em função de
p< 0,05, com valor crítico de 14,78.
______________________________________________________________________
121
Resultado
s
FIGURA 13: Desempenho antimicrobiano das medicações intracanais sobre
Candida albicans presente nos túbulos dentinários através da análise por
microscopia de fluorescência. Sessenta raízes de dentes humanos foram infectadas
com C. albicans numa concentração de 1,5 x 10
8
fungos/mL. Após 21 dias de
contaminação, os medicamentos foram aplicados no interior dos canais radiculares
permanecendo por 14 dias. As amostras avaliadas consistiram em raspas de dentina
obtidas do processo de ampliação padronizada do diâmetro do canal radicular. Após a
coleta, as amostras foram processadas imediatamente para análise em microscopia de
fluorescência. A análise microscópica consistiu na seleção aleatória de 3 campos
para determinação da porcentagem de fungos viáveis e não viáveis nas amostras.
As barras representam as médias, em porcentagem, de fungos viáveis e não
viáveis em cada um dos grupos (G1– Controle; G2– Hidróxido de cálcio; G3–
Clorexidina; G4– Hidróxido de cálcio + Clorexidina) em profundidades de 0 – 100
µm (A) e 100 – 200 µm (B). A análise estatística foi realizada utilizando-se o teste
não paramétrico de Kruskal Wallis e o teste de Miller para as comparações
individuais. O valor de p foi considerado significante quando p< 0,05.
G1 G2 G3 G4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
(%) Viabilidade
A
Viáveis
Não viáveis
Viáveis
Não viáveis
Grupos
G1 G2 G3 G4
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
(%) Viabilidade
B
Grupos
______________________________________________________________________
123
Resultado
s
A
B
C
D
Candida Albicans
FIGURA 14: Fotomicrografias de C. albicans após aplicação de medicação intracanal. Concluído o
período de 14 dias de aplicação das medicações as amostras coletadas foram imediatamente processadas
para análise em microscopia de fluorescência. Após os procedimentos de isolamento e lavagem dos
microorganismos, marcadores fluorescentes foram adicionados às amostras objetivando a diferenciação
entre células viáveis e não viáveis. As substâncias fluorescentes utilizadas foram o diacetato de fluoresceína
para identificação de fungos viáveis em verde e brometo de etídio para marcação de fungos não viáveis em
vermelho. Vinte e cinco µL de cada um dos reagentes foi adicionado à amostra previamente diluída em 25
µL de PBS 1X. As amostras foram incubadas a 37°C por 15 minutos para incorporação dos marcadores.
Novamente procedeu-se à centrifugação e o pellet final obtido montado em lâmina para análise em
microscópio confocal. A porcentagem de fungos viáveis e não viáveis foi determinada após a contagem dos
microorganismos encontrados em 3 campos selecionados aleatoriamente. As fotomicrografias representam
a viabilidade de C. albicans após 14 dias de ação das substâncias antimicrobianas (A-Soro fisiológico
0,9%, B- Hidróxido de cálcio, C- Clorexidina gel 2%, D- Hidróxido de cálcio + Clorexidina gel 2%).
______________________________________________________________________
125
Re
s
ultado
s
5.5 Microscopia eletrônica de varredura
A análise das raízes em MEV objetivou atestar a eficácia dos procedimentos de
remoção de smear layer e de contaminação adotados (Figura 13).
O tratamento inicial dos espécimes, utilizando EDTA 17% e hipoclorito de sódio
5,25% combinados com ultra-som, mostrou-se eficiente na remoção de restos pulpares e
detritos. A superfície do canal radicular apresentou-se limpa, evidenciando a patência dos
túbulos dentinários, não havendo obstruções para a livre colonização de
microorganismos.
Nos espécimes contaminados com Enterococcus faecalis observou-se densa
colonização bacteriana na superfície das paredes do canal radicular, após o período de 21
dias de incubação. Esse período mostrou-se suficiente para que as bactérias penetrassem
no interior dos túbulos dentinários. No entanto, a penetração intratubular apresentou-se
bastante variável, tendo túbulos com a penetração de numerosas bactérias e outros com
ausência de microorganismos.
A infecção promovida por Candida albicans mostrou-se bastante intensa na
superfície do canal radicular. As células de C. albicans parecem obliterar a entrada dos
túbulos dentinários, devido ao seu diâmetro que é muito maior que o de uma célula de E.
faecalis. Porém, embora muito menos freqüente que a penetração por E.faecalis, a
infecção intratubular por C. albicans também pôde ser observadas nos espécimes.
______________________________________________________________________
127
Resultado
s
Remoção Smear La
y
er
Enterococcus faecali
s
Candida albican
s
15 KV Dentina Radicular x2000 5µm
15 KV
Enterococcus faecalis x3000 5µm 15 KV
Enterococcus faecalis x5000 2µm
15 KV Candida albicans x2000 5µm 15 KV Candida albicans x5000 2µm
Figura 15: Microscopia eletrônica de varredura de dentina radicular humana
submetida à remoção de smear layer e à contaminação por Enterococcus
faecalis e Candida albicans. Os espéciems destinados à avaliação de remoção de
smear layer foram submetidos a banho ultrassônico com EDTA 17% e NaOCl
5,25% por 10 minutos. Já os selecionados para avaliação da contaminação com E.
faecalis e C. albicans foram infectados com 1,5x10
8
microorganismos/mL por 21
dias
p
ara avalia
ç
ão da
p
enetra
ç
ão intratubular.
Discussão
______________________________________________________________________
Discussão
131
6. DISCUSSÃO
Infecções endodônticas a longo prazo permitem que microorganismos se
propagem em todo sistema de canais radiculares desempenhando papel fundamental nas
patologias pulpoperiodontais (KAKEHASHI; STANLEY; FITZGERALD
101
, 1965). A
instrumentação dos canais radiculares com auxílio de soluções irrigadoras com
potencial antimicrobiano pode falhar na eliminação de microorganismos da dentina
radicular (BYSTRÖM; SUNDQVIST
22
, 1981, BYSTRÖN; SUNDQVIST
24
, 1985,
SIQUEIRA et al.
217
, 2002). Microorganismos residuais nos túbulos dentinários podem
se multiplicar e afetar negativamente o reparo na região periapical. O uso de medicação
intracanal permite propriedades antimicrobianas entre sessões podendo reduzir ou
eliminar microorganismos residuais no sistema de canais radiculares elevando os
índices de sucesso (BYSTRÖN; CLAESSON; SUNDQVIST
20
, 1985, KATEBZADEH;
HUPP
106
; TROPE, 1999, KATEBZADEH; SIGURDSSON; TROPE
107
, 2000,
ZARELLA; FOUAD; SPÅNGBERG
274
, 2005, SIQUEIRA; PAIVA; RÔÇAS
209
, 2007).
O modelo experimental utilizado neste estudo foi uma adaptação do ensaio
originalmente proposto por HAAPASALO; ØRSTAVIK
78
, em 1987, para infecção e
desinfecção da dentina radicular in vitro. O modelo originalmente proposto e adotado
por diversos pesquisadores recomenda a utilização de incisivos bovinos (ØRSTAVIK;
HAAPASALO
167
, 1990, VAHDATY; PITT FORD; WILSON
253
, 1993, PEREZ et
al.
174
, 1996, SIQUEIRA; UZEDA
220
, 1996, HELING; CHANDLER
86
, 1998,
KOMOROWSKI et al.
111
, 2000, GOMES et al.
73
, 2003, SIRÉN et al.
226
, 2004).
Entretanto, a dentina radicular bovina difere marcadamente da dentina radicular humana
principalmente devido ao maior diâmetro dos túbulos dentinários (PEREZ
175
, 1993,
SCHILKE et al.
197
, 2000). Esta diferença certamente influencia na construção do
microambiente da dentina tubular afetando a disponibilidade de nutrientes, penetração
de microorganismos e difusão de substâncias antimicrobianas aplicadas no canal
radicular (KADO
100
, 2004). Apesar das dificuldades na aquisição de dentes humanos,
seu emprego é fundamental para garantir a reprodução das condições anatômicas
encontradas durante o tratamento endodôntico e, consequentemente, para obtenção de
resultados mais verossímeis.
______________________________________________________________________
Discussão
132
A secção da porção apical das raízes, durante a preparação dos espécimes,
objetivou uma maior padronização do estudo, já que o terço apical da raiz, denominado
por DE DEUS
38
(1992) de zona crítica apical, possui maior variação anatômica que os
terços médio e cervical. Além disso, o terço apical apresenta uma espessura insuficiente
para comportar um desgaste da dentina radicular até a extensão de 200 µm. A
impermeabilização das raízes na superfície externa garantiu que durante os
procedimentos de contaminação, o acesso dos microorganismos aos túbulos dentinários
se desse apenas via canal radicular simulando uma infecção de origem endodôntica.
Além disso, ajudou a impedir a desidratação dos espécimes durante os 14 dias de
incubação em estufa para avaliação do desempenho antimicrobiano dos medicamentos.
A remoção da smear-layer previamente à contaminação das raízes foi realizada
de acordo com as recomendações propostas por PEREZ et al.
175
, 1993. A execução de
banho ultrassônico em NaOCl 5,25% e EDTA 17% removeu eficientemente a smear-
layer, promovendo a completa exposição da abertura dos túbulos dentinários,
favorecendo a livre penetração dos microorganismos. A eficácia do procedimento foi
confirmada através de MEV. A permanência de smear-layer na parede dos canais
certamente influenciaria os resultados obtidos, já que prejudicaria a invasão tubular e a
ação das substâncias antimicrobianas avaliadas (FOSTER; KULILD; WELLER
56
,
1993).
Enterococcus faecalis constituem uma pequena porcentagem das espécies
microbianas isoladas dos canais radiculares de dentes com necrose pulpar. Entretanto,
são comumente isolados de canais radiculares com falha no tratamento endodôntico.
Estudos investigando a ocorrência de E. faecalis em canais com insucesso do tratamento
e lesão periapical associada têm demonstrado uma prevalência variando de 24 a 77%. A
ampla variação na detecção de E. faecalis entre os estudos pode ser atribuída às
diferentes técnicas de identificação utilizadas, diferenças geográficas ou no tamanho das
amostras (MOLANDER et al.
150
, 1998, PECIULIENE et al.
172
, 2000, HANCOCK et
al.
81
, 2001, PECIULIENE et al.
173
, 2001, PINHEIRO et al.
179
, 2003, RÔÇAS;
SIQUEIRA; SANTOS
188
, 2004, SIQUEIRA; RÔÇAS
218
, 2004, GOMES et al.
71
, 2004,
SEDGLEY et al.
199
, 2006). E. faecalis apresenta considerável resistência a substâncias
______________________________________________________________________
Discussão
133
químicas auxiliares e medicações comumente utilizadas em endodontia, é um
microorganismo anaeróbio facultativo relativamente fácil de ser cultivado e de alta
relevância clínica (LOVE
132
, 2001, GOMES et al.
73
, 2003). Outra espécie bacteriana
poderia requerer simbiose de outro microorganismo para sobreviver no interior dos
túbulos dentinários, enquanto E. faecalis tem a capacidade de se estabelecer e
sobreviver sozinho com aporte nutricional limitado por longos períodos (DAHLEN;
HAAPASALO
33
, 1998, VIVACQUA-GOMES et al.
256
, 2005). Esta bactéria é
encontrada como monoinfecção principalmente em casos de dentes com necessidades
de retratamento na presença de lesões periapicais (SUNDQVIST et al.
237
, 1998,
PECIULIENE et al.
173
, 2001, PINHEIRO et al.
179
, 2003).
A detecção de fungos nos canais radiculares tem sido reportada por diversos
estudos. Candida albicans é a espécie mais frequentemente isolada e sua ocorrência está
particularmente associada a casos que apresentam insucesso do tratamento, variando de
7 a 21% dos microorganismos isolados (NAIR et al.
154
, 1990, SEN; PISKIN;
DEMIRCI
201
, 1995, WALTIMO et al.
264
, 1997, BAUMGARTNER; WATTS; XIA
12
,
2000, PECIULIENE et al.
173
, 2001) estando geralmente em associação com outra
bactéria. Uma das combinações mais freqüentes é a associação entre C. albicans e E.
faecalis (PECIULIENE et al.
173
, 2001). Mesmo quando em contato direto com o
microorganismo, C. albicans tem apresentado resistência a substâncias comumente
utilizadas como medicação intracanal, alem de possui capacidade de penetração
intratubular (WALTIMO et al.
260
, 1999, WALTIMO et al.
262
, 2003, SIQUEIRA et al.
214
,
2003, GOMES et al.
74
, 2006). Ambos os fatores podem ajudar a explicar sua freqüente
detecção em casos de insucesso do tratamento endodôntico.
O freqüente relato de isolamento de Enterococcus faecalis e Candida albicans a
partir de amostras recolhidas de canais radiculares que apresentaram insucesso no
tratamento endodôntico, motivaram a seleção destes microorganismos para participarem
deste estudo. Outros trabalhos também selecionaram estas espécies como parâmetro
para testar a efetividade de processos de desinfecção utilizados durante a terapia
endodôntica (HAAPASALO; ØRSTAVIK
78
, 1987, SAFAVI; SPÅNGBERG;
LANGELAND
194
, 1990, ØRSTAVIK; HAAPASALO
167
, 1990, VAHDATY; PITT
FORD; WILSON
253
, 1993, SIQUEIRA; UZEDA
220
, 1996, BARBOSA et al.
7
, 1997,
______________________________________________________________________
Discussão
134
SIQUEIRA et al.
221
, 1997, TANRIVERDI et al.
249
, 1997, SIQUEIRA et al.
224
, 1998,
WALTIMO et al.
260
, 1999, WALTIMO et al.
259
, 2000, DAHLÉN et al.
34
, 2000,
KOMOROWSKI et al.
111
, 2000, FERRAZ et al.
55
, 2001, GOMES et al.
68
, 2001,
BASRANI et al.
10
, 2003, GOMES et al.
73
, 2003, MENEZES et al.
144
, 2004, DAMETO
et al.
36
, 2005, GOMES et al.
74
, 2006).
Para a contaminação dos espécimes com E. faecalis e C. albicans optou-se pela
padronização do inóculo em 1,5 x 10
8
microorganismos/mL, correspondente ao padrão
0,5 da escala de McFarland, já que esta é uma concentração freqüentemente utilizada
entre os pesquisadores (BASRANI et al.
10
, 2003; GOMES et al.
73
, 2003, MENEZES et
al.
144
, 2004). Entretanto, observa-se uma grande variedade entre os ensaios na
concentração do inócolo microbiano empregado, o que pode explicar divergências entre
alguns resultados encontrados. Uma concentração microbiana elevada pode favorecer
uma contaminação mais intensa e extensa dos túbulos dentinários influenciando a ação
das substâncias antimicrobianas avaliadas.
O tempo de contaminação dos espécimes foi estabelecido em 21 dias de acordo
com HAAPASALO; ØRSTAVIK
78
, 1987. Estes autores verificaram através de
microscopia eletrônica de varredura e Brown-Brenn a completa contaminação dos
túbulos dentinários. Um tempo de infecção prolongado leva a uma maior quantidade de
túbulos infectados considerando que a profundidade média de penetração microbiana
aumenta vagarosamente com o tempo e é resultado da multiplicação celular. Os
resultados obtidos em nosso estudo demonstraram que o período de 21 dias foi
adequado para promover a contaminação da dentina radicular por E. faecalis e C.
albicans até a extensão de 200 µm da dentina radicular. Outros autores, no entanto,
relatam ter alcançado extensa penetração de microorganismos com um período de
contaminação de 24 horas (LYNEE et al.
133
, 2003), 7 dias (SUKAWAT;
SRISUWAN
235
, 2002; GOMES et al.
73
, 2003; DAMETTO et al.
36
, 2005) e 9 dias
(SCHÄFER; BÖSSMANN
195
, 2005).
Várias metodologias podem ser empregadas para avaliar a atividade
antimicrobiana de medicamentos destinados ao uso intracanal. Portanto, o método de
avaliação pode ser a possível explicação para as diferenças encontradas nos resultados
______________________________________________________________________
Discussão
135
entre os estudos. Algumas metodologias permitem o contato direto das substâncias com
os microorganismos como nas técnicas de difusão em ágar ou do “contato direto”
(WALTIMO et al.
263
, 1999, GOMES et al.
69
, 2001, FERGUSON; HATTON;
GILLESPIE
54
, 2002, BASRANI et al.
10
, 2003, VIANNA et al.
255
, 2004, GOMES et
al.
74
, 2006). Em outras, como neste estudo, microorganismos estavam locados no
interior dos túbulos dentinários e as substâncias antimicrobianas foram aplicadas no
interior do canal radicular, pressupondo-se a necessidade de difusão da medicação pela
dentina para exercer seus efeitos. Esta situação mimetiza o desafio clínico encontrado
em dentes com canais infectados, pois muitos dos microorganismos remanescentes ao
preparo químico-mecânico estão alojados em áreas impossíveis ao contato direto com as
medicações. Portanto, uma substância que apresentou ótimo desempenho
antimicrobiano em ensaios de difusão em ágar e de contato direto, não necessariamente
repetirá a mesma performance em ensaios de descontaminação da dentina radicular in
vitro e in vivo.
A desinfecção do sistema de canais radiculares é preocupação constante para a
terapia endodôntica. O papel desempenhado por microorganismos residuais alojados no
interior de túbulos dentinários e o seu efeito potencial sobre o sucesso do tratamento
endodôntico a longo prazo ainda é assunto controverso entre os pesquisadores
(PETERS; WESSELINK; MOORER
178
, 1995). A completa desinfecção dos canais
radiculares favorece o sucesso do tratamento e diversos estudos têm mostrado a
importância da aplicação de uma medicação intracanal para alcançar este objetivo
(BYSTRÖM; SUNDQVIST
23
, 1983, BYSTRÖM; CLAESSON; SUNDQVIST
20
, 1985,
SIQUEIRA; LOPES
212
, 1999, SIQUEIRA et al.
217
, 2002, ZARELLA; FOUAD;
SPÅNGBERG
274
, 2005, SIQUEIRA; PAIVA; RÔÇAS
209
, 2007).
O hidróxido de cálcio é uma alternativa medicamentosa altamente empregada e
consolidada na endodontia. Diversos estudos ressaltam a efetividade do hidróxido de
cálcio na desinfecção dos canais radiculares (BYSTRÖM; SUNDQVIST
23
, 1983,
BYSTRÖM; CLAESSON; SUNDQVIST
20
, 1985, SJÖGREN et al.
229
, 1990, MANZUR
et al.
135
, 2007). Contudo, alguns resultados têm evidenciado uma eficácia
antimicrobiana insuficiente desta substância contra E. faecalis (STEVENS;
GROSSMAN
233
, 1983, ØRSTAVIK; HAAPASALO
167
, 1990, SIQUEIRA; UZEDA
220
,
______________________________________________________________________
Discussão
136
1996, VALERA et al.
254
, 2001, FERGUSON; HATTON; GILLESPIE
54
, 2002, PETERS
et al.
176
, 2002) e C. albicans (WALTIMO et al.
259
, 2000, WALTIMO et al.
260
, 1999,
SIQUEIRA et al.
214
, 2003).
A dissociação iônica do hidróxido de cálcio em íons cálcio e hidroxila é
fundamental para que este medicamento exerça seu efeito mineralizador e
antimicrobiano. A viscosidade e hidrossolubilidade das formulações das pastas de
hidróxido de cálcio podem influenciar diretamente essa dissociação interferindo no seu
efeito biológico. Para o presente estudo optou-se pelo emprego da pasta Calen
®
(S.S.
WHITE), uma formulação disponível comercialmente composta de hidróxido de cálcio
p.a. e polietilenoglicol 400 como veículo. A penetrabilidade desta pasta na dentina
radicular foi avaliada experimentalmente em dentes humanos e apresentou resultados
semelhantes à formulação do hidróxido de cálcio associado à água destilada
(LEONARDO; LEAL; SIMÕES FILHO
119
, 1980). A utilização de uma medicação
intracanal previamente manipulada e consagrada pelo uso clínico garantiu uma maior
padronização na avaliação, já que a proporção pó/veículo influencia diretamente na
atividade antimicrobiana.
A clorexidina tem apresentado algumas propriedades que a habilitam como
importante alternativa para medicação intracanal. Comparada ao hidróxido de cálcio, a
clorexidina apresenta amplo espectro antimicrobiano (DENTON
41
, 1991) e mesmo em
altas concentrações tem apresentado baixa citotoxicidade (LÖE
129
, 1973; YESILSOY et
al.
272
, 1995). Devido as suas propriedades catiônicas, a clorexidina é adsordida à
hidroxiapatita da dentina podendo ser subsequentemente liberada (NORDBO
158
, 1972;
EMILSON et al.
43
, 1973). Este processo confere substantividade à atividade
antimicrobiana da clorexidina (PARSON et al.
170
, 1980), protegendo a dentina radicular
contra a colonização microbiana além do período de aplicação da medicação
(KOMOROWSKI et al.
111
, 2000; LENET et al.
118
, 2000; BASRANI et al.
9
, 2002).
Diversos trabalhos têm proposto a utilização da clorexidina como medicação intracanal
(HELING
88
, 1992, OHARA; TORABINEJAD; KETTING
160
, 1993, SIQUEIRA;
UZEDA
221
, 1997, SUKAWAT; SRISUWAN
235
, 2002, GOMES et al.
73
, 2003) e alguns
resultados evidenciaram uma maior efetividade da clorexidina sobre E. faecalis e C.
albicans quando comparada ao hidróxido de cálcio (GOMES et al.
68
, 2001;
______________________________________________________________________
Discussão
137
ALMYROUD et al.
4
, 2002; GOMES et al.
73
, 2003). A atividade antimicrobiana da
clorexidina pode ser limitada pela inativação da matriz dentinária e albumina sérica
(PORTENIER et al.
182
, 2001, PORTENIER et al.
181
, 2002).
A clorexidina 2% pode ser empregada como medicação intracanal na forma gel
ou líquida. Para este estudo optou-se pela formulação da clorexidina 2% em gel, já que
esta apresentou bons resultados em estudos anteriores (DELANY et al.
40
, 1982;
LINDSKOG et al.
126
, 1997; BARBOSA et al.
7
, 1997; SIQUEIRA; UZEDA
221
, 1997). O
gel de natrosol utilizado como gel-base para a clorexidina é solúvel em água e
amplamente utilizado em formulações de xampus, géis e sabões. A solubilidade em
água permite que a clorexidina e os debris sejam removidos fisicamente pela irrigação
com solução salina. A formulação em gel pode manter o princípio ativo do gluconato de
clorexidina por mais tempo na dentina radicular inibindo o crescimento microbiano
(FERRAZ et al.
55
, 2001). Devido à inexistência de uma formulação comercialmente
disponibilizada para emprego como medicação intracanal, optou-se pelo seu preparo
prévio em farmácia de manipulação.
A combinação da clorexidina gel 2% ao hidróxido de cálcio teve como objetivo
a tentativa de somatização dos benefícios antimicrobianos apresentados por cada uma
destas medicações isoladamente. O hidróxido de cálcio tem a habilidade de indução da
formação de tecido duro, de dissolução de tecido orgânico, de neutralização de
lipopolissacarídeo e de preenchimento do canal radicular durante o período de aplicação
da medicação prevenindo a sua recontaminação. (SAFAVI; NICHOLS
192
, 1994;
GOMES et al.
67
, 2002a). Entretanto, ele não é igualmente eficaz contra todos os
microorganismos encontrados no canal radicular (GOMES et al.
70
, 2002). A adição da
clorexidina poderia aumentar a atividade antimicrobiana e promover maior
substantividade fazendo desta associação uma medicação mais eficiente contra
microorganismos resistentes como E.faecalis e C. albicans. Para o preparo da
medicação padronizou-se a proporção de 1:1 entre a pasta de hidróxido de cálcio e
clorexidina gel 2%, a fim de se obter uma pasta de fácil inserção no canal radicular e
que apresentasse uma mesma concentração de ambos os medicamentos.
______________________________________________________________________
Discussão
138
O tempo de aplicação de uma medicação intracanal certamente interfere em sua
atividade antimicrobiana, visto que, na maioria dos casos, quanto maior o tempo de
permanência do medicamento no canal radicular, melhor será sua ação. Portanto, para
uma maior padronização do estudo e para garantir condições semelhantes para todas as
substâncias avaliadas optou-se pelo tempo de aplicação de 14 dias. Estudos anteriores
que avaliaram o desempenho antimicrobiano do hidróxido de cálcio, como medicação
intracanal, mostraram que períodos inferiores a 14 dias não devem ser indicados para o
“curativo de demora” no tratamento de dentes com necrose pulpar e reação periapical
crônica (NERWICH; FIGDOR; MESSER
156
, 1993; TAKAHASHI et al.
245
, 1996;
SILVEIRIRA
208
, 1997).
Neutralizadores específicos foram aplicados, após a remoção da medicação
intracanal e previamente à coleta das amostras, para assegurar que nenhum vestígio da
medicação fosse transferido para o meio de cultura comprometendo o crescimento
microbiano. Portanto, os resultados obtidos para cada uma das substâncias
antimicrobianas refletem apenas o período de aplicação intracanal (SIQUEIRA et al.
210
,
1998).
Para a coleta das amostras optou-se pelo emprego de brocas para a realização do
desgaste da dentina contrariando alguns pesquisadores que preconizam o emprego de
instrumentos manuais (WEIGER et al.
266
, 2002). A opção por brocas Gattes-Glidden
certamente proporcionou uma maior padronização do procedimento, já que através da
utilização de instrumentos manuais não seria possível imprimir um desgaste uniforme
entre os espécimes.
Para caracterização da viabilidade dos microorganismos isolados optou-se pela
associação dos ensaios de cultura microbiológica e microscopia de fluorescência. A
avaliação da viabilidade de microorganismos através da cultura convencional das
amostras é amplamente realizada e constitui-se num importante instrumento para
determinação de viabilidade. Entretanto, microorganismos viáveis não se restringem
apenas aqueles cultiváveis, já que alguns microorganismos sob condições ambientais
estressantes podem reter certas funções fisiológicas, mas não podem ser cultivados sob
condições normais de cultura impedindo sua detecção. O estado denominado de “viable
______________________________________________________________________
Discussão
139
but nonculturable” (VBNC) é um mecanismo de sobrevivência adotado por alguns
microorganismos quando expostos às condições ambientais adversas. Neste estágio o
microorganismo perde a sua capacidade de crescimento em meio de cultura, mas
mantém a viabilidade e patogenicidade e em algumas situações são capazes de retomar
a divisão celular após a restituição de condições normais para o crecimento (KELL et
al.
109
, 1998, WEIGER et al.
266
, 2002, OLIVER
164
, 2005). Além disso, é importante
ressaltar que a técnica de cultura microbiológica apresenta um limiar para detecção,
necessitando de uma concentração mínima de microorganismos para serem isolados
(HYSEK et al.
96
, 1991, WALKER et al.
258
, 2000).
A técnica da microscopia de fluorescência permite a identificação e
diferenciação entre microorganismos viáveis e não viáveis independentemente de sua
capacidade de divisão celular. Os marcadores fluorescentes empregados neste estudo
avaliam a integridade da membrana citoplasmática, já que marcadores como iodeto de
propídio e brometo de etídio só penetram no interior da célula se houver danos na
membrana citoplasmática, enquanto calceína e fluoresceína possuem a capacidade de
permeá-la. Alguns estudos demonstraram que a microscopia de fluorescência pode ser
um importante auxiliar na melhor caracterização da viabilidade de microorganismos
sendo um método bastante sensível e específico (KARLSSON; MALMBERG
104
, 1989,
HYSEK et al.
96
, 1991, WALKER et al.
258
, 2000, BERNADEU et al.
14
, 2001,
DECKER
39
, 2001, WEIGER et al.
266
, 2002).
A presença de raspas de dentina nas amostras não prejudicou sua análise pela
cultura microbiológica. Entretanto, para análise em microscopia de fluorescência a
presença de grandes raspas de dentina constituiu-se num inconveniente, já que os
marcadores fluorescentes também são incorporados pela dentina podendo mascarar a
presença de bactérias e fungos prejudicando a identificação (WEIGER et al.
266
, 2002).
Para contornar este problema, optou-se pelo descarte da dentina sedimentada após a sua
agitação em vortex, a fim de se eliminar grandes raspas de dentina que poderiam
comprometer as análises.
A capacidade de penetração do E. faecalis e C. albicans nos túbulos dentinários
foi confirmada através dos resultados encontrados pela cultura microbiológica,
______________________________________________________________________
Discussão
140
microscopia de fluorescência e microscopia eletrônica de varredura, estando de acordo
com os achados de outros autores (HAAPASALO; ØRSTAVIK
78
, 1987, SAFAVI;
SPĂNBERG; LANGELAND
194
, 1990, ØRSTAVIK; HAAPASALO
167
, 1990, SEM;
PISKIN; DEMIRCI
201
, 1995, SIQUEIRA; UZEDA; FONSECA
219
, 1996, WALTIMO
et al.
261
, 2000). Entretanto, esses dois microorganismos apresentam características de
penetração intratubular distintas, como também foi observado por WALTIMO et al.
259
,
2000. A penetração intratubular de E. faecalis foi mais intensa, alcançando áreas
profundas da matriz dentinária. O diâmetro celular de menos de 1 µm é fator favorável à
sua penetração no interior dos túbulos dentinários. Os resultados encontrados
demonstraram uma concentração bacteriana semelhante entre as profundidades de 0 -
100 µm e 100 - 200 µm demonstrando a franca penetração de E. faecalis em ambas as
extensões da dentina radicular (Tabela 4). Já a invasão de C. albicans mostrou-se mais
escassa com poucas células penetrando no interior dos túbulos dentinários. O diâmetro
médio destas células fúngicas, de até 3,5 µm, é fator limitador à sua penetração
intratubular, já que os túbulos dentinários humanos apresentam 2,5 µm de diâmetro em
média (GARBEROGLIO; BRÄNNSTRÖM
60
, 1976). Os resultados demonstraram uma
diferença na concentração de microorganismos de aproximadamente 50% entre as
profundidades de 0 - 100 µm e 100 - 200 µm revelando uma maior dificuldade na
penetração intratubular deste microorganismo. C.albicans infectou mais intensamente
os túbulos dentinários apenas na porção mais superficial da dentina radicular (Tabela
11).
Através da análise em microscopia de fluorescência foi possível confirmar a
ausência de microorganismos em algumas amostras referentes à porção de 100 - 200 µm
em espécimes contaminados com C.albicans. Estas amostras apresentaram crescimento
negativo quando submetidas à cultura, mas somente através da microscopia de
fluorescência é que se confirmou à inexistência de microorganismos. Estes achados
podem explicar a ausência de diferença estatisticamente significante encontrada entre as
substâncias antimicrobianas avaliadas, tanto pela análise em cultura microbiológica
(Tabela 13) quanto pela microscopia de fluorescência (Tabela 17), de amostras
provenientes desta porção da dentina radicular.
______________________________________________________________________
Discussão
141
A aplicação de medicação intracanal por 14 dias promoveu intensa redução de E.
faecalis (Figuras 7 e 9) e C. albicans (Figuras 10 e 12) independente da substância
antimicrobiana utilizada para ambas as extensões de dentina avaliadas. Estes achados
foram confirmados por ambas as técnicas de avaliação de viabilidade empregadas
(Tabelas 4, 7, 8, 11, 14 e 15). Os resultados exaltam a importância da utilização de
medicação intracanal para eliminação de microorganismos locados no interior dos
túbulos dentinários e corroboram com os achados encontrados por outros pesquisadores
que defendem o emprego de medicação intracanal entre sessões (BYSTRÖM;
SUNDQVIST
23
, 1983; BYSTRÖM; CLAESSON; SUNDQVIST
20
, 1985; SIQUEIRA;
LOPES
212
, 1999; SIQUEIRA et al.
217
, 2002; ZARELLA; FOUAD; SPÅNGBERG
274
,
2005).
Ao analisarmos o desempenho antimicrobiano apresentado por cada um dos
medicamentos pesquisados observamos que o hidróxido de cálcio foi a substância
menos eficaz na desinfecção dos túbulos dentinários para ambos os microorganismos
avaliados (Figuras 7, 9, 11 e 13). O desempenho inferior da pasta de hidróxido de cálcio
foi verificado em ambos os ensaios para determinação da viabilidade de
microorganismos (Tabelas 5, 6, 9, 10, 12, 13 e 16). A maior resistência de E. faecalis e
C.albicans à ação antimicrobiana do hidróxido de cálcio também foi verificada por
outros pesquisadores (STEVENS; GROSSMAN
233
, 1983, HAAPASALO;
ØRSTAVIK
78
, 1987, ØRSTAVIK; HAAPASALO
167
, 1990, SAFAVI; SPĂNBERG et
al.
194
, 1990, SIQUEIRA; UZEDA
220
, 1996, TANRIVERDI et al.
249
, 1997, ESTRELA et
al.
48
, 1999, HAAPASALO et al.
77
, 2000, GOMES et al.
68
, 2001, GOMES et al.
69
, 2001,
EVANS et al.
50
, 2002, SUKAWAT; SRISUWAN
235
, 2002). A dentina possui potencial
tampão funcionando como doador de prótons, reduzindo o pH e diminuindo a eficácia
antimicrobiana do hidróxido de cálcio no interior dos túbulos dentinários (NERWICH;
FIGDOR; MESSER
156
, 1993). Além disso, em ambientes alcalinos, foi verificado que
E. faecalis possui uma bomba de prótons que promove a entrada de íons para o interior
da célula acidificando o citoplasma e contribuindo para a sobrevivência deste
microorganismo (SIQUEIRA; LOPES
212
, 1999, EVANS et al.
50
, 2002). Este
mecanismo associado ao potencial tampão da dentina pode explicar a resistência
apresentada pelo E. faecalis ao uso isolado do hidróxido de cálcio. Entretanto, alguns
estudos têm demonstrado ótimos índices de desinfecção para o hidróxido de cálcio sem
______________________________________________________________________
Discussão
142
encontrar diferença estatisticamente significante em relação a outros medicamentos
(ESTRELA et al.
46
, 2001, LYNNE et al.
133
, 2003 SCHÄFER; BÖSSMANN
195
, 2005).
A clorexidina gel 2% apresentou ótimos índices de redução de microorganismos
destacando-a como importante alternativa para medicação intracanal, já que E. faecalis
(Figuras 7 e 9) e C. albicans (Figuras 11 e 13) apresentaram maior vulnerabilidade ao
seu efeito antimicrobiano. A clorexidina gel 2% mostrou-se superior ao hidróxido de
cálcio na desinfecção da dentina radicular em ambas as técnicas de avaliação de
viabilidade adotadas (Tabelas 5, 6, 9, 10, 12, 13 e 16). Outros trabalhos também
verificaram a eficiência antimicrobiana apresentada pela clorexidina gel 2%
corroborando com estes resultados (DELANY et al.
40
, 1982, HELING et al.
88
, 1992,
BARBOSA et al.
7
, 1997, SIQUEIRA; UZEDA
221
, 1997, HAAPASALO et al.
77
, 2000,
KOMOROWSKI et al.
111
, 2000). Alguns pesquisadores colocaram em dúvida a
utilização clínica da clorexidina na formulação gel, relatando uma maior dificuldade na
sua remoção do canal o que poderia comprometer o selamento durante a obturação
(BASRANI et al.
9
, 2002). Entretanto, o gel de natrosol é solúvel em água podendo ser
removido fiisicamente do interior do canal radicular pela irrigação com solução salina
(FERRAZ et al.
55
, 2001, GOMES et al.
68
, 2001).
O bom desempenho antimicrobiano da clorexidina gel 2% pode ser atribuído a
sua boa difusibilidade na dentina radicular, atingindo áreas além de 400 µm de extensão
nos túbulos dentinários, num curto período de aplicação no canal radicular (GOMES et
al.
73
, 2003). O seu amplo espectro de atuação e sua substantividade credenciam esta
substância como uma importante auxiliar na desinfecção da dentina radicular
principalmente nos casos de insucesso do tratamento endodôntico (PARSONS et al.
170
,
1980, SIQUEIRA; UZEDA
221
, 1997).
A associação clorexidina gel 2% e hidróxido de cálcio também apresentou
ótimos resultados quanto à sua ação antimicrobiana para ambos os microorganismos
avaliados (Figuras 7, 9, 11 e 13). O desempenho antimicrobiano da associação foi
similar ao da clorexidina gel 2% e superior ao apresentado pelo uso isolado do
hidróxido de cálcio, por ambas as técnicas de avaliação de viabilidade empregadas
(Tabelas 5, 6, 9, 10, 12, 13 e 16). Os benefícios desta associação também foram
______________________________________________________________________
Discussão
143
evidenciados por outros estudos corroborando com estes resultados (BASRANI et al.
10
,
2003, EVANS et al.
51
, 2003, ZARELLA; FOUAD; SPÅNGBERG
274
, 2005, GOMES et
al.
74
, 2006).
Entre os benefícios alcançados pela inclusão do hidróxido de cálcio à clorexidina
gel 2% pode-se destacar a obtenção de uma pasta de maior consistência atuando como
uma barreira fisiológica impedindo a recontaminação do canal durante sua aplicação. O
pH alcançado pela combinação é maior que o obtido pelo uso isolado da clorexidina gel
2%, podendo auxiliar no combate da reabsorção inflamatória interna e externa
(BELTES et al.
13
, 1997). Já a adição da clorexidina gel 2% ao hidróxido de cálcio
proporcionou uma maior substantividade à formulação, devido a sua capacidade de
adsorção à dentina contribuindo para manutenção do canal livre de microorganismos
mesmo após sua remoção (TANOMARU et al.
247
, 2002).
A utilização de microscopia de fluorescência como uma das técnicas para
determinação de viabilidade propiciou a identificação de microorganismos viáveis em
amostras que apresentaram crescimento negativo na cultura microbiológica. O pequeno
número de microorganismos viáveis remanescentes após a aplicação das medicações
pode ser uma das possíveis explicações, já que a cultura microbiológica apresenta um
limiar para detecção. Apesar de não comprovada, a existência de VBNC pode ser
sugerida contribuindo para identificação de microorganismos viáveis em amostras com
crescimento negativo. Estas evidências confirmam a necessidade de associação de mais
de um ensaio para avaliação da viabilidade de microorganismos e a microscopia de
fluorescência comportou-se como uma boa alternativa de avaliação.
Estudos futuros são necessários para corroborarem estes e outros resultados
sugestivos dos benefícios apresentados pela clorexidina gel 2% e pela associação
hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% na desinfecção dos canais radiculares. Como a
maioria dos estudos tem sido realizada in vitro, com simulação limitada da infecção
clinicamente encontrada nos canais radiculares, estudos in vivo são necessários para
confirmar e aprimorar a eficácia antimicrobiana destes medicamentos. Os resultados
obtidos neste estudo indicam que a eficácia da clorexidina gel 2% e da associação
______________________________________________________________________
Discussão
144
hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% justificam seu uso em endodontia como
medicação intracanal .
conclusão
______________________________________________________________________
Conclusão
147
7. CONCLUSÃO
Com base nos resultados obtidos e nas condições experimentais utilizadas neste
estudo, podemos concluir que:
1. Enterococcus faecalis possui maior capacidade de penetração nos túbulos
dentinários que Candida albicans.
2. A aplicação de medicação intracanal por 14 dias reduz consistentemente o
número de Enterococcus faecalis e Candida albicans viáveis presentes nos
túbulos dentinários em ambas as porções da dentina radicular avaliadas.
3. A clorexidina gel 2% e a associação entre hidróxido de cálcio e clorexidina gel
2% apresentaram melhor desempenho antimicrobiano na desinfecção de canais
radiculares infectados com Enterococcus faecalis e Candida albicans.
4. O hidróxido de cálcio apresentou o pior desempenho antimicrobiano entre as
medicações avaliadas para o combate a Enterococcus faecalis e Candida
albicans.
5. A associação de clorexidina gel 2% ao hidróxido de cálcio incrementou
significativamente sua atividade antimicrobiana contra E. faecalis e C. albicans.
6. A cultura microbiológica e a microscopia de fluorescência são métodos
adequados e complementares para determinação da viabilidade de Enterococcus
faecalis e Candida albicans.
Anexos
______________________________________________________________________
A
nexo
s
151
Espécimes
logUFC
0-100 100-200
%Viáveis
0-100 100-200
%Não Viáveis
0-100 100-200
01 7.75 5.64 76.92 82.22 23.08 17.78
02 7.40 4.39 75.00 75.00 25.00 25.00
03 8.13 4.39 70.00 71.87 30.00 28.13
04 7.98 7.50 73.33 72.73 26.67 27.27
05 8.30 6.63 68.18 68.75 31.82 31.25
06 8.48 6.25 86.36 83.33 13.64 16.67
07 8.07 5.64 69.81 73.33 30.19 26.67
08 7.89 4.79 75.00 85.71 25.00 14.29
09 8.07 5.64 65.96 81.25 34.04 18.75
10 8.44 6.63 70.97 75.00 29.03 25.00
11 8.33 7.38 77.78 73.33 22.22 26.67
12 8.29 7.21 69.44 70.59 30.56 29.41
13 6.87 6.09 86.36 76.92 13.64 23.08
14 6.95 5.64 75.00 77.78 25.00 22.22
15 7.64 6.63 69.23 86.36 30.77 13.64
16 4.79 4.79 28.20 22.22 71.80 77.78
17 4.39 4.39 10.34 35.71 89.66 64.29
18 3.71 0.00 21.05 25.00 78.95 75.00
19 0.00 3.71 0.00 33.33 100.00 66.67
20 5.08 4.39 32.26 20.00 67.74 80.00
21 4.79 4.39 37.71 16.67 62.29 83.33
22 3.71 3.71 22.50 34.21 77.50 65.79
23 4.79 3.71 28.13 29.27 71.87 70.73
24 5.08 0.00 40.54 0.00 59.46 100.00
25 4.79 4.39 25.58 31.43 74.42 68.57
26 5.30 4.79 25.81 27.78 74.19 72.22
27 4.79 4.79 33.33 22.22 66.67 77.78
28 5.30 3.71 30.23 32.26 69.77 67.74
29 0.00 4.39 10.71 17.24 89.29 82.76
30 4.39 4.39 28.95 21.43 71.05 78.57
ANEXO I: Resultados individuais da avaliação do desempenho antimicrobiano
do soro fisiológico 0,9% e hidróxido de cálcio sobre Enterococcus faecalis pela
cultura microbiológica e microscopia de fluorescência.
Grupo 1: Soro fisiológico 0,9% (01 - 15), Grupo 2: Hidróxido de cálcio (16 – 30).
______________________________________________________________________
______
A
nexo
s
152
Espécimes
logUFC
0-100 100-200
Viáveis
0-100 100-200
Não Viáveis
0-100 100-200
31 0.00 0.00 7.41 9.09 92.59 90.91
32 4.39 3.71 20.69 10.81 79.31 89.19
33 0.00 0.00 9.37 0.00 90.63 100.00
34 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
35 3.71 3.71 18.42 23.08 81.58 76.92
36 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
37 3.71 0.00 16.67 0.00 83.33 100.00
38 0.00 3.71 0.00 16.67 100.00 83.33
39 0.00 0.00 16.22 0.00 83.78 100.00
40 0.00 0.00 0.00 10.00 100.00 90.00
41 3.71 0.00 14.70 0.00 85.30 100.00
42 0.00 4.39 0.00 28.57 100.00 71.43
43 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
44 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
45 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
46 0.00 0.00 9.52 0.00 90.48 100.00
47 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
48 0.00 4.39 0.00 25.00 100.00 75.00
49 0.00 0.00 7.69 12.50 92.31 87.50
50 0.00 3.71 0.00 17.65 100.00 82.35
51 0.00 3.71 0.00 25.00 100.00 75.00
52 3.71 0.00 10.81 0.00 89.19 100.00
53 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
54 0.00 0.00 10.00 0.00 90.00 100.00
55 0.00 0.00 0.00 8.11 100.00 91.89
56 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
57 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
58 3.71 0.00 21.43 0.00 78.57 100.00
59 0.00 0.00 8.57 0.00 91.43 100.00
60 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
ANEXO II: Resultados individuais da avaliação do desempenho antimicrobiano
de clorexidina gel 2% e hidróxido de cálcio associado à clorexidina gel 2% sobre
Enterococcus faecalis pela cultura microbiológica e microscopia de fluorescência.
Grupo 3: Clorexidina gel 2% (31 - 45), Grupo 4: Hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% (46 – 60).
______________________________________________________________________
A
nexo
s
153
Espécimes
logUFC
0-100 100-200
% Viáveis
0-100 100-200
% Não Viáveis
0-100 100-200
61 6.78 4.39 61.90 66.67 38.10 33.33
62 6.87 4.79 66.67 66.67 33.33 33.33
63 6.46 0.00 63.64 Ausente 36.36 Ausente
64 6.87 5.08 66.67 75.00 33.33 25.00
65 6.73 4.79 52.17 66.67 47.83 33.33
66 6.46 3.71 71.43 60.00 28.57 40.00
67 6.87 3.71 68.97 62.55 31.03 37.50
68 6.40 0.00 64.70 Ausente 35.30 Ausente
69 6.46 3.71 60.00 61.54 40.00 38.46
70 6.25 3.71 64.00 60.00 36.00 40.00
71 6.91 5.08 63.16 66.67 36.84 33.33
72 6.68 4.79 70.59 57.14 29.41 42.86
73 6.52 4.39 57.14 66.67 42.86 33.33
74 6.73 0.00 52.63 Ausente 47.37 Ausente
75 6.68 5.08 63.33 57.14 36.67 42.86
76 5.08 0.00 25.00 Ausente 75.00 Ausente
77 4.39 0.00 18.75 0.00 81.25 100.00
78 3.71 0.00 33.33 0.00 66.67 100.00
79 4.79 3.71 30.00 33.33 70.00 66.67
80 4.39 0.00 29.41 Ausente 70.59 Ausente
81 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
82 0.00 0.00 0.00 Ausente 100.00 Ausente
83 3.71 0.00 25.00 25.00 75.00 75.00
84 0.00 0.00 15.38 0.00 84.62 100.00
85 3.71 0.00 28.57 0.00 71.43 100.00
86 4.39 4.39 26.67 40.00 73.33 60.00
87 5.30 3.71 28.57 25.00 71.43 75.00
88 5.08 0.00 38.10 Ausente 61.90 Ausente
89 5.30 3.71 25.00 25.00 75.00 75.00
90 4.39 3.71 26.32 37.50 73.68 62.50
ANEXO III: Resultados individuais da avaliação do desempenho antimicrobiano do
soro fisiológico 0,9% e hidróxido de cálcio sobre Candida albicans pela cultura
microbiológica e microscopia de fluorescência.
Gru
p
o 1: Soro fisioló
g
ico 0
,
9%
(
61 - 75
),
Gru
p
o 2: Hidróxido de cálcio
(
76
–
90
)
.
______________________________________________________________________
_____
A
nexo
s
154
Espécimes
logUFC
0-100 100-200
% Viáveis
0-100 100-200
% Não Viáveis
0-100 100-200
91 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
92 0.00 3.71 0.00 9.09 100.00 90.91
93 0.00 0.00 0.00 Ausente 100.00 Ausente
94 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
95 3.71 0.00 16.67 0.00 83.33 100.00
96 3.71 0.00 13.33 0.00 86.67 100.00
97 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
98 0.00 0.00 0.00 Ausente 100.00 Ausente
99 0.00 3.71 12.50 18.18 87.50 81.82
100 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
101 0.00 0.00 18.18 0.00 81.82 100.00
102 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
103 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
104 0.00 0.00 0.00 Ausente 100.00 Ausente
105 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
106 3.71 0.00 16.67 Ausente 83.33 Ausente
107 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
108 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
109 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
110 0.00 0.00 0.00 Ausente 100.00 Ausente
111 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
112 0.00 0.00 0.00 Ausente 100.00 Ausente
113 0.00 0.00 10.00 0.00 90.00 100.00
114 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
115 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
116 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
117 0.00 0.00 13.33 0.00 86.67 100.00
118 0.00 0.00 0.00 Ausente 100.00 Ausente
119 0.00 3.71 0.00 12.50 100.00 87.50
120 0.00 0.00 0.00 0.00 100.00 100.00
ANEXO IV: Resultados individuais da avaliação do desempenho antimicrobiano de
clorexidina gel 2% e hidróxido de cálcio associado à clorexidina gel 2% sobre
Candida albicans pela cultura microbiológica e microscopia de fluorescência.
Grupo 3: Clorexidina gel 2% (91 - 105), Grupo 4: Hidróxido de cálcio e clorexidina gel 2% (106 –120).
A
ne
x
o
s
155
ANEXO V – Parecer do Comitê de Ética em Pesquisa
Referências
bibliográficas
______________________________________________________________________
Referências Biblio
g
ráfica
s
1
59
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Akpata ES, Blechman H. Bacterial invasion of pulpal dentin wall in vitro. J Dent
Res. 1982; 61: 435-8.
2. Alberts B. Biologia Molecular da célula. 4 ed. Porto Alegre: Artmed; 2004.
3. Allen RK, Newton CW, Bröwn CE. A statistical analysis of surgical and
nonsurgical endodontic retreatment cases. J Endod. 1989; 15: 261-6.
4. Almyroudi A, Mackenzie D, McHugh S, Saunders WP. The effectiveness of various
disinfectants used as endodontic intracanal medications: an in vitro study. J Endod.
2002; 28: 163-7.
5. Ando N, Hoshino E. Predominant obligate anaerobes invading the deep layers of
root canal dentine. Int Endod J. 1990; 23: 20-7.
6. Aranki A, Syed SA, Kenney EB, Freter R. Isolation of anaerobic bacteria from
human gingiva and mouse cecum by means of simplified glove box procedure. Appl
Microbiol. 1969; 17:568-76.
7. Barbosa CAM, Gonçalves RB, Siqueira Jr JF, Uzeda M. Evaluation of the
antibacterial activities of calcium hydroxide, chlorhexidine, and camphorated
paramonochlorophenol as intracanal medicament. A clinical and laboratory study. J
Endod. 1997; 23: 297-300.
8. Basrani B, Ghanem A, Tjäderhane L. Physical and chemical properties of
chlorhexidine and calcium hydroxide-containing medications. J Endod. 2004; 30:
413-7.
9. Basrani B, Santos JM, Tjäderhane L, Grad H, Gorduysus O, Huang J, Lawrence HP,
Friedman S. Substantive antimicrobial activity in chlorhexidine-treated human root
dentin. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2002; 94: 240-5.
10. Basrani B, Tjäderhane L, Santos JM, Pascon E, Grad H, Lawrence HP, Friedman S.
Efficacy of chlorhexidine- and calcium hydroxide-containing medicaments against
Enterococcus faecalis in vitro. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod.
2003; 96: 618-24.
11. Baumgartner JC, Falkler Jr WA, Beckerman T. Experimentally induced infection by
oral anaerobic microorganisms in a mouse model. Oral Microbiol Immunol 1992; 7:
253-6.
12. Baumgartner JC, Watts CM, Xia T. Occurrence of Candida albicans in infections of
endodontic origin. J Endod. 2000; 26: 695-8.
______________________________________________________________________
_____
Referências Biblio
g
ráfica
s
160
13. Beltes PG, Pissiotis E, Koulaouzidou E, Kortsaris AH. In vivo evaluation of
chlorhexidine solution and sodium hypochlorite solution as root canal irrigants. J
Endod. 1997; 8: 200-4.
14. Bernardeu M, Vernoux JP, Gueguen M. Usefulness of epifluorescence for
quantitative analysis of lactobacilli in probiotic feed. J Appl Microbiol. 2001; 91:
1103-9.
15. Bhakdi S, Klonisch T, Nuber P, Fischer W. Stimulation of monokine production by
lipoteichoic acids. Infect Immun. 1991; 59:4614-20.
16. Bonesvoll P, Lokken P, Rölla G, Paus PN. Retention of chlorhexidine in the human
oral cavity after mouth rinses. Arch Oral Biol. 1974; 19: 209-12.
17. Booth IR. Regulation of cytoplasmic pH in bacteria. Microbiol Rev. 1985; 49: 359-
78.
18. Brauner AW, Conrads G. Studies into the microbial spectrum of apical
periodontitis. Int Endod J. 1995; 28: 244-8.
19. Brown Jr LR, Rudolph CE. Isolation and identification of microorganisms from
unexposed canals of pulp-involved teeth. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 1957; 10:
1094-9.
20. Byström A, Claesson R, Sundqvist G. The antibacterial effect of camphorated
paramonochlorophenol, camphorated phenol and calcium hydroxide in treatment of
infected root canals. Endod Dent Traumatol. 1985; 1: 170-5.
21. Byström A, Happonen RP, Sjögren U, Sundqvist G. Healing of periapical lesions of
pulpless teeth after endodontic treatment with controlled asepsis. Endod Dent
Traumatol. 1987; 3: 58-63.
22. Byström A, Sundqvist G. Bacteriologic evaluation of the efficacy of mechanical
root canal instrumentation in endodontic therapy. Scand J Dent Res. 1981; 89: 321-
8.
23. Byström A, Sundqvist G. Bacteriological evaluation of the effect of 0.5 percent
sodium hypochlorite in endodontic therapy. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 1983;
55: 307-12.
24. Byström A, Sundqvist G. The antibacterial action of sodium hypoclorite and EDTA
in 60 cases of endodontic therapy. Int Endod J. 1985; 18:35-40.
25. Calich, VLG; Pruchio A, Paula CR. A new fluorescent viability test for fungi cells
mycopathologia. 1978; 66: 175-7.
26. Capiaux H, Giard JC, Lemarinier S, Auffray Y. Characterization and analysis of a
new gene involved in glucose starvation response in Enterococcus faecalis. Int J
Food Microbiol. 2000; 55: 99-102.
______________________________________________________________________
Referências Biblio
g
ráfica
s
16
1
27. Card GL, Jasuja RR, Gustafson GL. Activation of arachidonic acid metabolism in
mouse macrophages by bacterial amphiphiles. J Leukoc Biol. 1994; 56: 723-8.
28. Card SJ, Sigurdsson A, Ørstavik D, Trope M. The effectiveness in increased apical
enlargement in reducing intracanal bacteria. J Endod. 2002; 28: 779-83.
29. Cheung GS. Endodontic failures - changing the approach. Int Dent J. 1996; 46: 131-
8.
30. Chitarra LG, Breeuwer P, Abee T, Beelk RW. The use of fluorescent probes to
assess viability of the plant pathogenic bacterium Clavibacter michiganensis subsp.
Michiganensis by flow cytometry. Fisiopatol Bras. 2006; 31: 349-56.
31. Chong BS, Pitt Ford TR. The role of intracanal medication in root canal treatment.
Int Endod J. 1992; 25: 97-106.
32. Cvek M, Nord CE, Hollender L. Antimicrobial effect of root canal debridement in
teeth with immature root. A clinical and microbiologic study. Odontol Revy. 1976;
27: 1-10.
33. Dahlén G, Haapasalo M. Microbiological of apical periodontitis. In: Ørstavik D, Pitt
Ford TR, eds Essential Endodontology: Prevention and treatment of apical
periodontitis (1998). 1
st
edn. Oxford, UK: Blackwell Sciences Ltd., 106-25.
34. Dahlén G, Samuelsson W, Molander A, Reit C. Identification and antimicrobial
susceptibility of enterococci isolated from the root canal. Oral Microbiol Immunol.
2000; 15: 309-12.
35. Dalton BC, Orstavik D, Phillips C, Pettiette M, Trope M. Bacterial reduction with
nickel-titanium rotary instrumentation. J Endod. 1998; 24: 763-7.
36. Dametto FR, Ferraz CCR, Gomes BPFA, Zaia AA, Teixeira FB, Souza-Filho FJ. In
vitro assessment of the immediate and prolonged antimicrobial action of
chlorhexidine gel as an endodontic irrigant against Enterococcus faecalis. Oral Surg
Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2005; 99: 768-72.
37. Davies A. The mode of action of chlorhexidine. J Periodontol Res. 1973; 8 (suppl
12): 68-75.
38. De Deus QD. Endodontia. 5th ed. Rio de Janeiro: Medsi; 1992.
39. Decker EM. The ability of direct fluorescence-based, two-colour assays to detect
different physiological states of oral streptococci. Lett Appl Microbiol. 2001; 33:
188-92.
40. Delany GM, Patterson SS, Miller CH, Newton CW. The effect of chlorhexidine
gluconate irrigation on the root canal flora of freshly extracted necrotic. Oral Surg
Oral Med Oral Pathol. 1982; 53: 518-23.
______________________________________________________________________
Referências Biblio
g
ráfica
s
16
2
41. Denton GW. Chlorhexidine. Philadelphia: Block SS; 1991. p. 276-7.
42. Dougherty WJ, Bae KS, Watkins BJ, Baumgartner JC. Black-pigmented bacteria in
coronal and apical segments of infected root canals. J Endod. 1998; 24: 356-8.
43. Emilson GG, Ericson T, heyden G, Magnusson BC. Uptake of chlorhexidine to
hydroxyapatite. J Periodontol Res Suppl. 1973; 12: 17-21.
44. Engström B. The significance of enterococci in root canal treatment. Odont Revy.
1964; 15: 87-106.
45. Ercan E, Dalli M, Dülgergil ÇT. In vitro of the effectiveness of chlorhexidine gel
and calcium hydroxide paste with chlorhexidine against Enterococcus faecalis and
Candida albicans. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2006; 102:
27-31.
46. Estrela C, Bammann LL, Pimenta PC, Pecora JD. Control of microorganisms in
vitro by calcium hydroxide pastes. Int Endod J. 2001; 34: 341-5.
47. Estrela C, Pesce HF. Chemical analysis of the liberation of calcium and hydroxyl
ions of calcium hydroxide pastes in the presence of connective tissue of the dog.
Part I. Braz Dent J. 1996; 7: 41-6.
48. Estrela C, Pimenta FC, Ito IY, Bammann LL. Antimicrobial evaluation of calcium
hydroxide in infected dentinal tubules. J Endod. 1999; 25: 416-8.
49. Estrela C, Sydney GB, Bammann LL, Felippe Jr O. Estudo do efeito biológico do
pH na atividade enzimática de bactérias anaeróbias. Rev Fac Odontol Bauru 1994;
2(4): 31-8.
50. Evans M, Davies JK, Sundqvist G, Figdor D. Mechanisms involved in the resistance
of Enterococcus faecalis to calcium hydroxide. Int Endod J. 2002; 35: 221-8.
51. Evans MD, Baumgartner JC, Khemaleelakul S, Xia T. Efficacy of calcium
hydroxide: chlorhexidine paste as an intracanal medication in bovine dentin. J
Endod. 2003; 29: 338-9.
52. Fabricius L, Dahlén G, Holm SE, Möller AJR. Influence of combinations of oral
bacteria on periapical tissues of monkeys. Scand J Dent Res. 1982; 90: 200-6.
53. Fardal O, Turnbull RS. A review of the literature on use of chlorhexidine in
dentistry. JADA. 1986; 112: 863-9.
54. Ferguson JW, Hatton JF, Gillespie J. Effectiveness of intracanal irrigants and
medications against the yeast Candida albicans. J Endod. 2002; 28: 68-71.
55. Ferraz CCR, Gomes BPFA, Zaia AA, Teixeira FB, Souza-Filho FJ. In vitro
assessment of the antimicrobial action and the mechanical ability of chlorhexidine
gel as an endodontic irrigant. J Endod. 2001; 27: 452-5.
______________________________________________________________________
_____
Referências Biblio
g
ráfica
s
163
56. Foster KH, Kullid JC, Weller RN. Effect of smear layer removal on the diffusion of
calcium hydroxide through radicular dentine. J Endod. 1993; 19: 136-40.
57. Freeman BA, Crapo JD. Biology of disease. Free radicals and tissue injury. Lab
Invest. 1982; 47: 412-24.
58. Fukushima H, Yamamoto K, Sagawa H, Leung KP, Walker CB. Localization and
identification of root canal bacteria in clinically asymptomatic periapical pathology.
J Endod. 1990; 16: 534-8.
59. Gálvez A, Maqueda M, Mártinez-Bueno M, Valdivia E. Permeation of bacterial
cells, permeation of cytoplasmic and artificial membrane vesicles, and channel
formation on lipid bilayers of peptide antibiotic AS-48. J Bacteriol. 1991; 173: 886-
92.
60. Garberoglio R, Brännström M. Scanning electron microscopic investigation of
human dentinal tubules. Archs Oral Biol. 1976; 21: 355-62.
61. Garvey LH, Roed-Petersen J, Husum B. Anaphylactic reactions in anaesthetized
patients – four cases of chlorhexidine allergy. Acta Anaesthesiol Scand. 2001; 45:
1290-4.
62. Giard JC, Hartke A, Flahaut S, Boutibonnes P, Auffray Y. Glucose starvation
response in Enterococcus faecalis JH2-2: survival and protein analysis. Res
Microbiol. 1997; 148: 27-35.
63. Goldman M, Pearson AH. Postdebridement bacterial flora and antibiotic sensivity.
Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 1969; 28: 897-905.
64. Gomes BPFA, Drucker DB, Liley JD. Association of endodontic symptoms and
signs with particular combinations of specific bacteria. Int Endod J. 1996; 29: 69-75.
65. Gomes BPFA, Drucker DB, Liley JD. Association of specific bacteria with some
endodontic sings and symptoms. Int Endod J. 1994; 27: 291-8.
66. Gomes BPFA, Drucker DB, Liley JD. Negative and positive associations between
bacterial species in root canals. Microbios. 1994; 80: 231-43.
67. Gomes BPFA, Ferraz CCR, Garrido FD, Rosaten PL, Zaia AA, Teixeira FB, Souza-
Filho FJ. Microbial susceptibility to calcium hydroxide pastes and their vehicles. J
Endod. 2002; 28: 758-61.
68. Gomes BPFA, Ferraz CCR, Sousa SFC, Zaia AA, Teixeira FB, Souza-Filho FJ. In
vitro antibacterial activity of chlorhexidine gel and calcium hydroxide separately
and combined in infected bovine root dentine. J Endod. 2001; 27: 333.
69. Gomes BPFA, Ferraz CCR, Vianna ME, Berber VB, Teixeira FB, Souza-Filho FJ.
In vitro antibicrobial activity of several concentrations of sodium hypochlorite and
chlorhexidine gluconate in the elimination of Enterococcus faecalis. Int Endod J.
2001; 34: 424-28.
______________________________________________________________________
Referências Biblio
g
ráfica
s
164
70. Gomes BPFA, Ferraz CCR, Vianna ME, Rosalen PL, Zaia AA, Teixeira FB, Souza-
Filho FJ. In vitro antimicrobial activity of calcium hydroxide pastes and their
vehicles against selected microorganisms. Braz Dent J. 2002; 13: 155-61.
71. Gomes BPFA, Pinheiro ET, Gadê-Neto CR, Sousa ELR, Ferraz CCR, Zaia AA,
Teixeira FB, Souza-Filho FJ. Microbiological examination of infected dental root
canals. Oral Microbiol Immunol. 2004; 19: 71-6.
72. Gomes BPFA, Pinheiro ET, Sousa ELR, Jacinto RC, Zaia AA, Souza-Filho FJ,
Ferraz CCR. Enterococcus faecalis in dental root canals detected by culture and
polymerase chain reaction anlysis. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol
Endod. 2006; 102: 247-53.
73. Gomes BPFA, Souza SFC, Ferraz CCR, Teixeira F, Zaia AA, Valdrighi L, Souza-
Filho FJ. Effectiveness of 2% chlorhexidine gel and calcium hydroxide against
Enterococcus faecalis in bovine root dentine in vitro. Int Endod J. 2003; 36: 267-75.
74. Gomes BPFA, Vianna ME, Sena NT, Zaia AA, Ferraz CCR, Souza-Filho FJ. In
vitro evaluation of the antimicrobial activity of calcium hydroxide combined with
chlorhexidine gel used as intracanal medicament. Oral Surg Oral Med Oral Pathol
Oral Radiol Endod. 2006; 102: 544-50.
75. Greenstein G, Berman C, Jaffin R. Chlorhexidine. An adjunct to periodontal
therapy. J Periodontol. 1986; 57: 370-7.
76. Grenier D, Mayrand D. Nutritional relationships between oral bacteria. Infect
Immun. 1986; 53: 616-20.
77. Haapasalo HK, Sirén EK, Waltimo TMT, Ørstavik D, Haapasalo MPP. Inactivation
of local root canal medicaments by dentine: an in vitro study. Int Endod J. 2000; 32:
421-9.
78. Haapasalo M, Ørstavik D. In vitro infection and desinfection of dentinal tubules. J
Dent Res. 1987; 66: 1375-9.
79. Haapasalo M, Ranta H, Ranta K, Shah H. Black-pigmented Bacteroides spp. in
human apical periodontitis. Infect Immun. 1986; 53: 149-53.
80. Haenni S, Schmidlin PR, Mueller B, Sener B, Zehnder M. Chemical and
antimicrobial properties of calcium hydroxide mixed with irrigating solutions. Int
Endod J. 2003; 36: 100-5.
81. Hancock III HH, Sigurdsson A, Trope M, Moiseiwitsch J. Bacteria isolated after
unsuccessful endodontic treatment in a North America population. Oral Surg Oral
Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2001; 91: 579-86.
82. Harrop PJ, O'Grady RL, Knox KW, Wicken AJ. Stimulation of lysosomal enzyme
release from macrophages by lipoteichoic acid. J Periodontal Res 1980; 15:492-501.
______________________________________________________________________
_____
Referências Biblio
g
ráfica
s
165
83. Hartke A, Giard JC, Laplace JM, Auffray Y. Survival of Enterococcus faecalis in an
oligotrophic microcosm: changes in morphology, development of general stress
resistance and analysis of protein syntesis. Appl Environ Microbiol. 1998; 64: 4238-
45.
84. Hase CC, Finkelstein RA. Bacterial extracellular zinc-containing metalloproteases.
Microbiol Rev. 1993; 57: 823-37.
85. Heithersay GS. Calcium hydroxide in the treatment of pulpless teeth with associated
pathology. J Brit Endod Soc. 1975; 8: 74-92.
86. Heling I, Chandler NP. Antimicrobial effects of irrigant combinations within
dentinal tubules. Int Endod J 1998; 31: 8-14.
87. Heling I, Gorfil C, Slutzky H, Kopolovic K, Zalkind M, Slutzky-Goldber I.
Endodontic failure caused by inadequate restorative procedures: Review and
treatment recomendations. J Prost Dent 2002; 87: 674-8.
88. Heling M, Steinberg D, Kenig S, Gavrilovich I, Sela MN, Friedman M. Efficacy of
a sustained-release device containing chlorhexidine and calcium hydroxide in
preventing secondary infection of dentinal tubules. Int Endod J. 1992; 25: 20-4.
89. Henessey TS. Some antibacterial properties of chlorhexidine. J Periodontol Res.
1973; 8 (suppl 12): 61-7.
90. Hepworth MJ, Friedman S. Treatment outcome of surgical and non-surgical
management of endodontic failures. J Can Dent Assoc. 1997; 63: 364-71.
91. Hermann BW. Calciumhydrodyd als mittel zum behandeln und füllen von
zahnwurzelkanälen. Würzburg: Med Diss. 1920. 48p.
92. Hoellman DB, Visalli MA, Jacobs MR, Appelbaum PC. Activities and time-kill
studies of selected penicillins, β-lactamase inhibitor combinations and glycopeptides
against Enterococcus faecalis. Antimicrob Agents Chemother. 1998; 42: 857-61.
93. Holland R, Otoboni Filho JA, Souza V, Nery MJ, Barnabé PFE, Dezan Jr E. A
comparison of one versus two appointment endodontic therapy in dogs’ teeth with
apical periodontitis. J Endod. 2003; 29: 121-4.
94. Holland R, Soares IJ, Soares IM. Influence of irrigation and intracanal dressing on
the healing process of dog’s teeth with apical periodontitis. Endod Dental
Traumatol. 1992; 8: 223-9.
95. Horiba N, Maekawa Y, Yamauchi Y, Ito M, Matsumoto T, Nakamura H.
Complement activation by lipopolysaccharides purified form gram-negative bacteria
isolated from infected root canals. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 1992; 74: 648-
51.
______________________________________________________________________
Referências Biblio
g
ráfica
s
16
6
96. Hysek J, Fisar Z, Zizka Z, Kofronova O, Binek B. Airborne microorganism
monitoring: a comparison of several methods, including a new direct counting
technique. Zentralbl Mikrobiol. 1991; 146: 435-43.
97. Jacinto RC, Gomes BPFA, Ferraz CCR, Zaia AA, Souza-Filho FJ. Microbiological
analysis of infected root canals from symptomatic and asymptomatic teeth with
periapical periodontitis and the antimicrobial susceptibility of some isolated
anaerobic bacteria. Oral Microbiol Immunol. 2003; 18: 285-92.
98. Jansen HJ, Hoeven JSVD. Protein degradation by Prevotella intermedia and
Actinomyces meyeri supports the growth of non-protein-cleaving oral bacteria in
serum. J Clin Periodontol. 1997; 24: 346-53.
99. Jeansonne MJ, White RR. A comparison of 2.0% chlorhexidine gluconate and
5.25% sodium hypochlorite as antimicrobial endodontic irrigant. J Endod. 1994; 20:
276-8.
100. Kado ES. Avaliação microbiológica e por microscopia eletrônica de varredura da
efetividade de diferentes substâncias químicas auxiliares utilizadas durante
tratamento endodôntico em dentes humanos infectados por Enterococcus faecalis
e Candida albicans: Estudo in vitro [Dissertação]. São Paulo (SP): Instituto de
Ciências Biomédicas da Universidade de São Paulo; 2004.
101. Kakehashi S, Staley HR, Fitzgerald RJ. The effects of surgical exposures of dental
pulps in germ-free and conventional laboratory rats. Oral Surg Oral Med Oral
Pathol. 1965; 20: 340-9.
102. Kantz WE, Henry CA. Isolation and classification of anaerobic bacteria from
intact chambers of non-vital teeth in man. Arch Oral Biol. 1974; 19: 91-6.
103. Kaprelyants AS, Gottschal JC, Kell DB. Dormancy in non-sporulating bacteria.
FEMS Microbiol Rev. 1993; 104: 271-86.
104. Karlsson K, Malmberg P. Characterization of exposure to molds and actinomycets
in agricultural dusts by scanning electron microscopy, fluorescence microscopy
and the culture method. Scand J Work Environ Health 1989; 15: 353-9.
105. Karnovsky MJ. A formaldehyde-glutaraldehyde fixative of high osmolarity for use
in electron microscopy. J Cell Biol 1965; 27:137-138.
106. Katebzadeh N, Hupp J, Trope M. Histological periapical repair after obturation of
infected root canals in dogs. J Endod. 1999; 25: 364-8.
107. Katebzadeh N, Sigurdsson A, Trope M. Radiographic evaluation of periapical
healing after obturation of infected root canals: an
in vivo study. Int Endod J.
2000; 33: 60-5.
108. Kayaoglu G, Ørstavik D. Virulence factors of Enterococcus faecalis: Relationship
to Endodontic Disease. Crit Rev Oral Biol Med. 2004; 15: 308-320.
______________________________________________________________________
_____
Referências Biblio
g
ráfica
s
167
109. Kell DB, Kapreylants AS, Weichart DH, Harwood CL, Barer MR. Viability and
activity in readily culturable bacteria: a review and discussion of the practical
issues. Ant van Leeuvenhoek. 1998; 73: 169-87.
110. Kim S, Trowbridge HO. Pulpal reactions to caries and dental procedures. In:
Cohen S, Burns RC. Pathways of the pulp. 8th ed. St. Louis: Mosby, 2002. p. 573-
600.
111. Komorowski R, Grad H, Wu XY, Friedman S. Antimicrobial substantivity of
chlorhexidine treated bovine root dentin. J Endod. 2000; 26: 315-7.
112. Kreft B, Marre R, Schramm U, Wirth R. Aggregation substance of Enterococcus
faecalis mediates adhesion to cultured renal tubular cells. Infect Immun 1992; 60:
25-30.
113. Kuttler Y. Endodoncia prática. México: Alpha; 1961. p. 217-9.
114. Kvist T, Molander A, Dahlén G, Reit C. Microbiological evaluation of one- and
two-visit endodontic treatment of teeth with apical periodontitis: a randomized,
clinical trial. J Endod. 2004; 30: 572-6.
115. Lana MA, Ribeiro-Sobrinho AP, Stehling R, Garcia GD, Silva BKC, Hamdan JS,
Nicoli JR, Carvalho MAR, Farias LM. Oral Microbiol Immunol. 2001; 16: 100-5.
116. Laplace JM, Thuault M, Hartke A, Boutibonnes P, Auffray Y. Sodium
hypochlorite stress in Enterococcus faecalis: influence of antecedent growth
conditions and induced proteins. Curr Microbiol. 1997; 34: 284-9.
117. Le Goff A, Bunetel L, Mouton C, Bonnaure-Mallet M. Evaluation of root canal
bacteria and their antimicrobial susceptibility in teeth with necrotic pulp. Oral
Microbiol Immunol. 1997; 12: 318-22.
118. Lenet BJ, Komorowski R, Wu XY, Huang J, Grad H, Lawrence HP, Friedman S.
Antimicrobial substantivity of bovine root dentin exposed to different
chlorhexidine delivery vehicles. J Endod. 2000; 11: 652-5.
119. Leonardo MR, Leal JM, Simões Filho AP. Pulpectomy: immediate root canal
filling with calcium hydroxide. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 1980; 49: 441-
50.
120. Leonardo MR, Rossi MA, Silva LAB, Ito IY, Bonifácio KC. EM evaluation of
bacterial biofilm and microorganisms on the apical external root surface of human
teeth. J Endod. 2002; 28: 815-8.
121. Leonardo MR, Silveira FF, Silva LAB, Tanomaru Filho M, Utrilla LS. Calcium
hydroxide root canal dressing histopatological evaluation of periapical repair at
different time periods. Braz Dent J. 2002; 13: 17-22.
______________________________________________________________________
Referências Biblio
g
ráfica
s
168
122. Leonardo MR, Tanomaru Filho M, Silva LAB, Nelson Filho P, Bonifácio KC, Ito
IY. In vivo antimicrobial activity of 2% chlorhexidine used as root canal irrigating
solution. J Endod. 1999; 3: 167-71.
123. Levy R, Kotb M, Nagauker O, Majumdar G, Alkan M, Ofek I. Stimulation of
oxidative burst in human monocytes by lipoteichoic acids. Infect Immunol. 1990;
50: 566-8.
124. Lima KC, Fava LRG, Siqueira Jr JF. Susceptibilities of Enterococcus faecalis
biofilms to some antimicrobial medications. J Endod 2001; 27: 616-9.
125. Lin ML, Pascon EA, Skribner J, Gangler P, Langeland K. Clinical, radiographic
and histologic study of endodontic treatment failures. Oral Surg Oral Med Oral
Pathol. 1991; 71: 603-11.
126. Lindkog S, Pierce AM, Blomlöf L. Chlorhexidine as root canal medicament for
treating inflammatory lesions in the periodontal space. Endod Dent Traumatol.
1998; 14: 186-90.
127. Lleò MM, Bonato B, Tafi MC, Signoretto C, Boaretti M, Canepari P.
Resuscitation rate in different enterococcal species in viable but non-culturable
state. J App Microbiol. 2001; 91: 1095-102.
128. Lléo MM, Tafi MC, Canepari P. Nonculturable Enterococcus faecalis cells are
metabolically active and capable of resuming active growth. Syst Appl Microbiol.
1998; 21: 333-9.
129. Löe H. Does chlorhexidine have a place in the prophylaxis of dental disease? J
Periodontal Res. 1973; 12: 93-9.
130. Lopes, HP, Siqueira Jr JF. Endodontia: Biologia e Técnica. Rio de Janeiro:
Guanabara Koogan; 2004.
131. Love RM. Clinical management of infected root canal dentin. Pract Periodontics
Aesthet Dent. 1996; 8: 581-4.
132. Love RM. Enterococcus faecalis – a mechanism for its role in endodontic failure.
Int Endod J. 2001; 34: 399-405.
133. Lynne RE, Liewehr FR, West LA, Patton WR, Buxton TB, McPherson JC. In
vitro antimicrobial activity of various medication preparations on E. faecalis in
root canal dentin. J Endod. 2003; 29: 187-90.
134. Magariños B, Romalde JL, Cid A, Toranzo AE. Viability of starved Pasteurella
piscicida in seawater monitored by flow cytometry and the effect of antibiotics on
its resuscitation. Lett Appl Microbiol. 1997; 24: 122-6.
______________________________________________________________________
Referências Biblio
g
ráfica
s
169
135. Manzur A, González AM, Pozos A, Silva-Herzog D, Friedman S. Bacterial
quantification in teeth with apical periodontitis related to instrumentation and
different intracanal medications: a randomized clinical trial. J Endod. 2007; 33:
114-8.
136. Marsh P, Martin M. Oral Microbiol. London: Champan and Hall; 1992.
137. Mason CA, Hamer G, Bryers JD. The death and lysis of microorganisms in
environmental processes. FEMS Microbiol Rev. 1986; 39: 373-401.
138. Matsuo T, Shirakami T, Ozaki K, Nakanishi T, Yumoto H, Ebisu S. An
immunohistological study of the localization of bacteria invading root pulpal walls
of teeth with periapical lesions. J Endod. 2003; 29: 194-200.
139. Mayrand D, Holt SC. Biology of asaccharolytic black-pigmented Bacteroides
species. Microbiol Rev. 1988; 52:134-152.
140. Mayrand D, McBride BC. Ecological relationships of bacteria involved in a
simple, mixed anaerobic infection. Infect Immun 1980; 27:44-50.
141. McComb D, Smith DC. A preliminary scanning electron microscopic study of
root canals after endodontic procedures. J Endod. 1975; 1: 238-42.
142. McHugh CP, Zhang P, Michalek S, Eleazer PD. pH required to kill Enterococcus
faecalis in vitro. J Endod. 2004; 30: 218-9.
143. Meikle MC, Gowen M, Reynolds JJ. Effect of streptococal cell wall components
on bone cell metabolisms in vitro. Calcif Tiss Int 1982; 34:359-364.
144. Menezes MM, Valera MC, Jorge AOC, Koga-Ito CY, Camargo CHR, Mancini
MNG. In vitro evaluation of the effectiveness of irrigants and intracanal
medicaments on microorganisms within root canal. Int Endod J. 2004; 37: 311-9.
145. Meryon SD, Jakeman HJ, Browne RM. Penetration in vitro of numan and ferret
dentine by three bacterial species in relation to their potential role in pulpal
inflammation. Int Endod J 1986; 19: 213-20.
146. Messer HH, Chen RS. The duration of the effectiveness of canal root
medicaments. J Endod. 1984; 6: 240-5.
147. Michelich VJ, Schuster GS, Pashley DH. Bacterial penetration of human dentin in
vitro. J Dent Res. 1980; 34: 102-8.
148. Miller WD. An introduction to the study of the bacterio-pathology of the dental
pulp. Dent Cosmos 1894; 36: 505-28.
149. Miyazaki S, Ohno A, Kobayashi I, Uji T, Yamaguchi K, Goto S. Cytotoxic effect
of hemolytic culture supernatant from Enterococcus faecalis on mouse
polymorphonuclear neutrophils and macrophages. Microbiol Immunol. 1993; 37:
265-70.
______________________________________________________________________
_____
Referências Biblio
g
ráfica
s
170
150. Molander A, Reit C, Dahlén G, Kvist T. Microbiological status of root-filled teeth
with apical periodontitis. Int Endod J. 1998; 31: 1-7.
151. Möller AJR, Fabricius L, Dahlén G, Öhman AE, Heyden G. Influence on
periapical tissues of indigenous oral bacteria and necrotic pulp tissue in monkeys.
Scand J Dent Res. 1981; 89: 475-484.
152. Möller AJR. Microbiological examination of root canals and periapical tissues of
human teeth: methodological studies. Odontol Tidskr. 1966; 74: 1-380.
153. Nagaoka S, Miyazaki Y, Liu HJ, Iwamoto Y, Kitano M, Kawagoe M. Bacterial
invasion into dentinal tubules of human vital and nonvital teeth. J Endod. 1995;
21: 70-3.
154. Nair PN, Sjögren U, Krey G, Kahnberg KE, Sundqvist G. Intraradicular bacteria
and fungi in root-filled, asymptomatic human teeth with therapy-resistant
periapical lesions: a long-term light and electron microscopic follow-up study. J
Endod. 1990; 16: 580-8.
155. Nakajo K, Nakazawa F, Iwaku M, Hoshino E. Alkali-resistant bacteria in root
canal systems. Oral Microbiol Immunol. 2004; 19:390-4.
156. Nerwich A, Figdor D, Messer HH. pH changes in root dentine over a 4-week
period following root canal dressing with calcium hydroxide. J Endod 1993; 19:
302-6.
157. Noda M, Komatsu H, Inoue S, Sano H. Antibiotic susceptibility of bacteria
detected from the root canal exudate of persistent apical periodontitis. J Endod.
2000; 26: 221-4.
158. Nordbö H. The affinity of chlorhexidine for Hydroxyapatite and tooth surfaces.
Scand J Dent Res. 1972; 80: 465-73.
159. Oguntebi BR. Dentine tubule infection and endodontic therapy implications. Int
Endod J. 1994; 27: 218-22.
160. Ohara P, Torabinejad M, Kettering JD. Antimicrobial effects of various
endodontic irrigants on selected anaerobic bacteria. Endod Dent Traumatol. 1993;
9: 95-100.
161. Okano M, Nomura M, Hata S, Okada N, Sato K, Kitano Y, Tashiro M, Yoshimoto
Y, Hama R, Aoki T. Anaphylactic symptoms due to chlorhexidine gluconate.
Arch Dermatol. 1989; 125: 50-2.
162. Okino LA, Siqueira EL, Santos M, Bombana AC, Figueiredo JAP. Dissolution of
pulp tissue by aqueous solution of chlorhexidine digluconate and chlorhexidine
digluconate gel. Int Endod J. 2004; 37: 38-41.
______________________________________________________________________
Referências Biblio
g
ráfica
s
171
163. Oliver JD, Bockain R. In vivo resuscitation, and virulence towards mice, of viable
but nonculturable cells of Vibrio vulnificus. Appl Environ Microbiol 1995; 61:
2620-3.
164. Oliver JD. The viable but nonculturable state in bacteria. Microbiol Soc Korea.
2005; 43: 93-100.
165. Önçag Ö, Hosgör M, Hilmioglu S, Zekioglu O, Eronat C, Burhanoglu D.
Comparison of antibacterial and toxic effects of various root canal irrigants. Int
Endod J. 2003; 36: 423-32.
166. Opromolla DVA, Madeira S, Belone AFF. Jorge Lobos disease: experimental
inoculation in swiss mice. Rev Inst Med Trop S Paulo. 1999; 41: 359-64.
167. Ørstavik D, Haapasalo M. Disinfection by endodontic irrigants and dressings of
experimentally infected dentinal tubules. Endod Dent Traumatol. 1990; 6: 142-9.
168. Ørstavik D, Kerekes K, Molven O. Effects of extensive apical reaming and
calcium hydroxide dressing on bacterial infection during treatment of apical
periodontitis: a pilot study. Int Endod J. 1991; 24: 1-7.
169. Padan E et al. pH homeostasis in bacteria. Biochim Biophys Acta. 1981; 650: 151-
66.
170. Parsons GJ, Patterson SS, Miller CH, Katz S, Kafrawy AH, Newton CW. Uptake
and release of chlorhexidine by bovine pulp and dentin specimens and their
subsequent acquisition of antibacterial properties. Oral Surg Oral Med Oral
Pathol. 1980; 49: 455-9.
171. Pashley DH. Dynamics of the pulpo-dentin complex. Crit Rev Oral Biol Med.
1996; 7: 104-33.
172. Peciuliene V, Balciuniene I, Eriksen HM, Haapasalo M. Isolation of Enterococcus
faecalis in previously root-filled canals in Lithuanian populations. J Endod. 2000;
26: 593-5.
173. Peciuliene V, Reynaud AH, Balciuniene I, Haapasalo M. Isolation of yeasts and
enteric bacteria in root-filled teeth with chronic apical periodontitis. J Endod.
2001; 34: 429-34.
174. Perez F, Calas P, Rochd T. Effect of dentin treatment on in vitro root tubule
bacterial invasion. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 1996; 82:
466-51.
175. Perez F, Rochd T, Lodter JP. In vitro study of penetration of three bacterial strains
into root dentine. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 1993; 76: 97-103.
176. Peters LB, VanWinkelhoff AJ, Buijs JF, Wesselink PR. Effects of
instrumentation, irrigation and dressing with calcium hydroxide on infection in
pulpless teeth with periapical bone lesions. Int Endod J. 2002; 35: 13-21.
______________________________________________________________________
_____
Referências Biblio
g
ráfica
s
172
177. Peters LB, Wesselink PR, Buijs JF, Winkelhoff AJV. Viable bacteria in root
dentinal tubules of teeth with apical periodontitis. J Endod. 2001; 27: 76-81.
178. Peters LB, Wesselink PR, Moorer WR. The fate and role of bacteria left in root
dentinal tubules. Int Endod J. 1995; 28: 95-9.
179. Pinheiro ET, Gomes BPFA, Ferraz CCR, Sousa ELR, Teixeira FB, Souza-Filho
FJ. Microorganisms from canals of root-filled teeth with periapical lesions. Int
Endod J 2003; 36: 1-11.
180. Pinheiro ET, Gomes BPFA, Ferraz CCR, Teixeira FB, Zaia AA, Souza-Filho FJ.
Evaluation of root canal microorganisms isolated from teeth with endodontic
failure and their antimicrobial susceptibility. Oral Microbiol Immunol. 2003; 18:
100-3.
181. Portenier I, Haapasalo H, Ørstavik D, Yamauchi M, Haapasalo M. Inactivation of
the antibacterial activity of iodide potassium iodide and chlorhexidine digluconate
against Enterococcus faecalis by dentin, dentin matrix, type-I collagen, and heat-
killed microbial whole cells. J Endod. 2002; 28: 634-7.
182. Portenier I, Haapasalo H, Rye A, Waltimo T, Ørstavik D, Haapasalo M.
Inactivation of root canal medicaments by dentine, hydroxylapatite and bovine
serum albumin. Int Endod J. 2001; 34: 184-8.
183. Potera C. Biofilms invade microbiology. Science. 1996; 273: 1795-7.
184. Pruzzo C, Tarsi R, Lleò MM, Signoretto C, Zampini M, Colwell RR, Canepari P.
Rapid assessment of physiological status in Escherichia coli using fluorescent
probes. Curr Microbiol. 2002; 45: 105-10.
185. Rams TE, Feik D, Young V, Hammond BF, Slots J. Enterococci in human
periodontitis. Oral Microbiol Immunol. 1992; 7: 249-52.
186. Ribeiro FC. Distribuição das bactérias nas estruturas mineralizadas de dentes com
necrose pulpar e granulomas apical [Dissertação]. Bauru (SP): Faculdade de
Odontologia de Bauru, Universidade de São Paulo; 1997.
187. Ringel AM, Patterson SS, Newton CW, Miller CH, Mulhern JM. In vitro
evaluation of chlorhexidine gluconate solution and sodium hypochlorite solution
as root canal irrigants. J Endod. 1982; 8: 200-4.
188. Rôças IN, Siqueira Jr JF, Santos KRN. Association of Enterococcus faecalis with
different forms of perirradicular disease. J Endod. 2004; 30: 315-20.
189. Rölla G, Melsen B. On the mechanism of the plaque inhibition by chlorhexidine. J
Dent Res. 1975; 54: 57-62.
190. Rolph HJ, Lennon A, Riggio MP, Saunders WP, Mackenzie D, Coldero L, Bagg J.
Molecular identification of microorganisms from endodontic infections. J Clin
Microbiol. 2001; 39: 3282-9.
______________________________________________________________________
Referências Biblio
g
ráfica
s
173
191. Saetre T, Kähler H, Foster, SJ, Lyberg T. Aminoethyl-isothiourea inhibits
leukocyte production of reactive oxygen species and proinflammatory cytokines
induced by streptococcal cell wall components in human whole blood. Shock.
2001; 15:455-60.
192. Safavi KE, Nichols FC. Alteration of biological properties of bacterial
lipopolysaccharide by calcium hydroxide treatment. J Endod. 1994; 20: 127-9.
193. Safavi KE, Nichols FC. Effect of calcium hydroxide on bacterial
lipopolysaccharide. J Endod. 1993; 19: 76-8.
194. Safavi KE, Spångberg LSW, Langeland K. Root canal dentinal tubule
disinfection. J Endod. 1990; 16: 207-210.
195. Schafër E, Bössmann K. Antimicrobial efficacy of chlorhexidine and two calcium
hydroxide formulations against Enterococcus faecalis. J Endod. 2005; 31: 53-6.
196. Schäfer E, Bössmann K. Antimicrobial efficacy of chloroxylenol and
chlorhexidine in the treatment of infected root canals. Am J Dent 2001; 14: 233-7.
197. Schilke R, Lisson JA, Baub O, Geurtsen W. Comparison of the number and
diameter of dentinal tubules in human and bovine dentine by scanning electron
microscopic investigation. Arch oral Biol. 2000; 45: 355-61.
198. Schonfeld SE, Greening AB, Glick DH, Frank AL, Simon JH, Herles SM.
Endotoxic activity in periapical lesion. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 1982; 53:
82-7.
199. Sedgley C, Nagel A, Dahlén G, Reit C, Molander A. Real-time quantitative
polymerase chain reaction and culture analyses of Enterococcus faecalis in root
canals. J Endod. 2006; 32: 173-77.
200. Sedgley CM; Lennan SL; Appelbe OK. Survival of Enterococcus faecalis in root
canals ex vivo. Int Endod J. 2005; 38: 735-42.
201. Sen BH, Piskin B, Demirci T. Observation of bacteria na fungi in infected root
canals and dentinal tubules by SEM. Endod Dent Traumatol. 1995; 11: 6-9.
202. Sgorbatti S, Barbesti S, Citterio S, Besbetti G, Vecchi R. Characterization of
number, DNA content, viability and size of bacteria from natural environments
using DAPI/PI dual staining and flow cytometry. Minerva Biotecnol. 1998; 8: 9-
15.
203. Shepard BD, Gilmore MS. Antibiotic-resistant enterococci: The mechanisms and
dynamics of drug introduction and resistance. Microbes Infect. 2002; 4: 215-24.
204. Shikanai-Yasuda MA, Tagochi RT, Sato MK, Melo NT, Assis CM, Nigro RC,
Camargo EE, Lacaz CS, Amato Neto V, Sesso A. In vitro action of some
desinfectants on Paracoccidioides brasiliensis. Rev Inst Med Trop S Paulo. 1991;
33: 37-43.
______________________________________________________________________
Referências Biblio
g
ráfica
s
174
205. Shovelton DS. The presence and distribution of microorganisms within non-vital
teeth. Br Dent J. 1964; 117: 101-7.
206. Shuping GB, Ørstavik D, Sigurdsson A, Trope M. Reduction of intracanal bacteria
using nickel-titanium rotary instrumentation and various medications. J Endod.
2000; 26: 751-5.
207. Signoretto C, Lleò MM, Tafi MC, Canepari P. Cell wal chemical composition of
Enterococcus faecalis in the viable but nonculturable state. Appl Environ
Microbiol. 2000; 66: 1953-9.
208. Silveira FF. Efeito do tempo de ação do “curativo de demora” à base de hidróxido
de cálcio, utilizado em canais radiculares de dentes de cães com lesão periapical
crônica induzida: análise histológica e microbiológica [Dissertação]. Faculdade de
Odontologia de Araraquara da Universidade Estadual de São Paulo; 1997.
209. Siqueira Jr JF, Paiva SSM, RÔÇAS IN. Reduction in the cultivable bacterial
populations in infected root canals by a chlorhexidine-based antimicrobial
protocol. J Endod. 2007; 33: 541-7.
210. Siqueira Jr JF, Pereira da Silva CHF, Cerqueira MDO, Lopes HP, Uzeda M.
Effectiveness of four chemical solutions in eliminating Bacillus Subtilis spores on
gutta-percha cones. Endod Dent Traumatol. 1998; 14: 124-6.
211. Siqueira Jr JF, Lopes HP. Bacteria on the apical root surfaces of untreated teeth
with periradicular lesions: a scanning electron microscopy study. Int Endod J.
2001; 34: 216-220.
212. Siqueira Jr JF, Lopes HP. Mechanisms of antimicrobial activity of calcium
hydroxide: a critical review. Int Endod J. 1999; 32: 361-9.
213. Siqueira Jr JF, Rôças IN, Favieri A, Machado AG, Gahywa SM, Oliveira JCM,
Abad EC. Incidence of postoperative pain after intracanal procedures based on
antimicrobial strategy. J Endod. 2002; 28: 457-60.
214. Siqueira Jr JF, Rôças IN, Lopes HP, Magalhães FAC, Uzeda M. Elimination of
Candida albicans infection of the radicular Dentin by Intracanal Medications. J
Endod. 2003; 29: 501-4.
215. Siqueira Jr JF, Rôças IN, Lopes HP. Patterns of microbial colonization in primary
root canal infections. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2002;
93: 174-8.
216. Siqueira Jr JF, Rôças IN, Moraes SR, Santos KRN. Direct amplification of rRNA
gene sequences for detection of putative oral pathogens in root canal infections.
Int Endod J. 2002; 35: 345-51.
______________________________________________________________________
Referências Biblio
g
ráfica
s
175
217. Siqueira Jr JF, Rôças IN, Santos SRLD, Lima KC, Magalhães FAC, Uzeda M.
Efficacy of instrumentation techniques and irrigation regimes in reducing the
bacterial population within root canals. J Endod. 2002; 28: 181-4.
218. Siqueira Jr JF, Rôças IN. Polymerase chain reaction-based analysis of
microorganisms associated with failed endodontic treatment. Oral Surg Oral Med
Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2004; 97: 85-94.
219. Siqueira Jr JF, Uzeda M, Fonseca MEF. A scanning electron microscopic
evaluation of in vitro dentinal tubules penetration by selected anaerobic bacteria. J
Endod. 1996; 22: 308-10.
220. Siqueira Jr JF, Uzeda M. Disinfection by calcium hydroxide pastes of dentinal
tubules infected with two obligate and one facultative anaerobic bacteria. J Endod.
1996; 22: 674-6.
221. Siqueira Jr JF, Uzeda M. Intracanal medicaments: evaluation of the antibacterial
effects of chlorhexidine, metronidazole and calcium hydroxide associated with
three vehicles. J Endod 1997; 23: 167-9.
222. Siqueira Jr JF. Endodontic infections: Concepts, paradigms and perspectives. Oral
Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2002; 94: 281-93.
223. Siqueira Jr JF, Sen BH. Fungi in endodontic infections. Oral Surg Oral Med Oral
Pathol Oral Radiol Endod. 2004; 97: 632-41.
224. Siqueira Jr JF, Uzeda M. Influence of different vehicles on the antibacterial effects
of calcium hydroxide. J Endod. 1998; 24: 663-5.
225. Sirén EK, Haapasalo MPP, Ranta K, Salmi P, Kerosuo ENJ. Microbiological
findings and clinical treatment procedures in endodontic cases selected for
microbiological investigation. Int Endod J. 1997; 30: 91-5.
226. Sirén EK, Haapasalo MPP, Waltimo TMT, Ørstavik D. In vitro effect of calcium
hydroxide combined with chlorhexidine or iodine potassium iodide on
Enterococcus faecalis. Eur J Oral Sci. 2004; 112: 326-31.
227. Sjögren U, Figdor D, Persson S, Sundqvist G. Influence of infection at the time of
root filling on the outcome of endodontic treatment of teeth with apical
periodontitis. Int Endod J. 1997; 30: 297-306.
228. Sjögren U, Figdor D, Spångberg L, Sundqvist G. The antimicrobial effect of
calcium hydroxide as a short-term intracanal dressing. Int Endod J. 1991; 24: 119-
25.
229. Sjögren U, Hägglund B, Sundqvist G, Wing K. Factors affecting the long-term
results of endodontic treatment. J Endod. 1990; 16:498-504.
230. Smith CS, Setchell DJ, Harty FJ. Factors influencing the success of conventional
root canal therapy - a five-year retrospective study. Int Endod J. 1993; 26: 321-3.
______________________________________________________________________
_____
Referências Biblio
g
ráfica
s
176
231. Sousa ELR, Ferraz CCR, Gomes BPFA, Pinheiro ET, Teixeira F, Souza-Filho FJ.
Bacteriologic study of root canals with periapical abscesses. Oral Surg Oral Med
Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2003; 96: 332-9.
232. Steeg PFT, Hoeven JSVD. Development of periodontal microflora on human
serum. Microbial Ecol Health DIs. 1989; 2: 1-10.
233. Stevens RH, Grossman LI. Evaluation of the antimicrobial potential of calcium
hydroxide as an intracanal medicament. J Endod. 1983; 9: 372-4.
234. Stewart GG. Calcium hydroxide-induced root healing. J Am Dent Assoc. 1975;
90: 793-800.
235. Sukawat C, Srisuwan T. A comparison of the antimicrobial efficacy of three
calcium hydroxide formulations on human dentin infected with Enterococcus
faecalis. J Endod. 2002; 28: 102-4.
236. Sundquvist G. Bacteriological studies of necrotic dental pulps [Dissertation].
Umea, Sweden: University of Umea, 1976.
237. Sundqvist G, Figdor D, Person S, Sjögren U. Microbiologic analysis of teeth with
failed endodontic treatment and the outcome of conservative re-treatment. Oral
Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 1998; 85: 86-93.
238. Sundqvist G, Johansson E, Sjögren U. Prevalence of black-pigmented Bacteroides
species in root canal infections. J Endod. 1989; 15: 13-9.
239. Sundqvist G. Association between microbial species in dental root canal
infections. Oral Microbiol Immunol. 1992; 7: 257-62.
240. Sundqvist G. Ecology of the root canal flora. J Endod 1992; 18:427-430.
241. Sundqvist G. Pathogenicity and virulence of black-pigmented Gram-negative
anaerobes. FEMS Immunol Med Microbiol. 1993; 6:125-38.
242. Sundqvist GK, Eckerbom ML, Larsson AP, Sjögren UF. Capacity of anaerobic
bacteria from necrotic dental pulps to induce purulent infections. Infect Immun.
1979; 25: 685-93.
243. Swartz DB, Skidmore AE, Griffin JA. Twenty years of endodontic success and
failure. J Endod. 1983; 9: 198-202.
244. Sweet SP. Selection and pathogenicity of Candida albicans in HIV infection. Oral
Dis. 1997; 3(Suppl. 1): 88-95.
245. Takahashi K. Microbiological, pathological, inflammatory, immunological and
molecular biological aspects of periradicular disease. Int Endod J. 1998; 31: 311-
25.
______________________________________________________________________
Referências Biblio
g
ráfica
s
177
246. Tani-Ishii N, Wang CY, Tanner A, Stashenko P. Changes in root canal microbiota
during the development of rat periapical lesions. Oral Microbiol Immunol. 1994;
9:129-35.
247. Tanomaru Filho M, Leonardo MR, Silva LAB, Anibal EF, Faccioli LH.
Inflammatory response to different endodontic irrigating solutions. Int Endod J.
2002; 35: 735-9.
248. Tanomaru JMG, Leonardo MR, Tanomaru Filho M, Boneti Filho I, Silva LBA.
Effect of different irrigation solutions and calcium hydroxide on bacterial LPS. Int
Endod J. 2003; 36: 733-9.
249. Tanriverdi F, Esener T, Erganis O, Bellis S. An in vitro test model for
investigation of disinfection of dentinal tubules infected with Enterococcus
faecalis. Braz Dent J. 1997; 2: 67-72.
250. Tronstad L, Barnett F, Cervone F. Periapical bacterial plaque in teeth refractory to
endodontic treatment. Endod Dent Traumatol 1990; 6: 73-7.
251. Trope M, Bergenholtz G. Microbiological basis for endodontic treatment: can a
maximal outcome be achieved in one visit? Endod Top. 2002; 1: 40-53.
252. Trope M, Delano EO, Ørstavik D. Endodontic treatment of teeth with apical
periodontitis: single vs. multivisit treatment. J Endod. 1999; 25: 345-50.
253. Vahdaty A, Pitt Ford TR, Wilson RF. Efficacy of chlorhexidine in disinfecting
dentinal tubules in vitro. Endod Dent Traumatol. 1993; 9: 243-8.
254. Valera MC, de Moraes Rego J, Jorge AO. Effect of sodium hypochlorite and five
intra-canal medications on Candida albicans in root canals. J Endod. 2001; 27:
401-3.
255. Vianna ME, Gomes BPFA, Berber VB, Zaia AA, Ferraz CCR, Souza-Filho FJ. In
vitro evaluation of the antimicrobial activity of chlorhexidine and sodium
hypochlorite. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2004; 97: 79-
84.
256. Vivacqua-Gomes N, Gurgel-Filho ED, Gomes BPFA, Ferraz CCR, Zaia AA,
Souza-Filho FJ. Recovery of Enterococcus faecalis after single- or multiple-visit
root canal treatments carried out in infected teeth ex vivo. Int Endod J. 2005; 38:
697-704.
257. Wade WG, Spratt DA, Dymock D, Weightman AJ. Molecular detection of novel
anaerobic species in dentoalveolar abcesses. Clin Infect Dis. 1997; 25(Suppl. 2):
235-6.
258. Walker JT, Bradshaw DJ, Bennet AM, Fulford MR, Martin MV, Marsh PD.
Microbial biofilm formation and contamination of dental-unit water systems in
general dental practice. Appl Environ Microbiol. 2000; 66: 3363-7.
______________________________________________________________________
Referências Biblio
g
ráfica
s
178
259. Waltimo TMT, Ørstavik D, Meurman JH, Samaranayake LP, Haapasalo MPP. In
vitro susceptibility of C. albicans isolates from apical and marginal periodontitis
to common antifungal agents. Oral Microbiol Immunol. 2000; 15: 245-8.
260. Waltimo TMT, Ørstavik D, Sirén EK, Haapasalo MPP. In vitro susceptibility of
Candida albicans to four disinfectants and their combinations. Int Endod J. 1999
32: 421-9.
261. Waltimo TMT, Ørstavik D, Sirén EK, Haapasalo MPP. In vitro yeast infection of
human dentin. J Endod. 2000; 26: 207-9.
262. Waltimo TMT, Sen BH, Meurman JH, Ørstavik D, Haapasalo MPP. Yeasts in
apical periodontitis. Crit Rev Oral Biol Med. 2003; 14: 128-37.
263. Waltimo TN, Sirén EK, Ørstavik D, Haapasalo MPP. Susceptibility of oral
candida species to calcium hydroxide in vitro. Int Endod J. 1999; 32: 94-8.
264. Waltimo TN, Sirén EK, Torkko HLK, Olsen I, Haapasalo MPP. Fungi in therapy-
resistant periodontitis. Int Endod J. 1997; 30: 96-101.
265. Wang JD, Hume WR. Diffusion of hydrogen ion and hydroxyl ion from various
sources though dentine. Int Endod J. 1988; 21: 17-26.
266. Weiger R, De Lucena J, Decker HE, Löst C. Vitality status of microorganisms in
infected human root dentine. Int Endod J. 2002; 35: 166-71.
267. Weiger R, Rosendahi R, Löst C. Influence of calcium hydroxide intracanal
dressings on the prognosis of teeth with endodontically induced periapical lesions.
Int Endod J. 2000; 33: 219-26.
268. Weiger RMB, Werner H, Löst C. Microbial flora of sinus tract and root canals of
non-vital teeth. Endod Dent Traumatol. 1995; 11: 15-9.
269. White RR, Hays GL, Janer LR. Residual antimicrobial activity after canal
irrigation with chlorhexidine. J Endod. 1997; 23: 229-31.
270. Williams JC, Gharbia SE, Gulabivala K, Rajendram D, Mehta N, Huttsen R,
Collins MD, Shah HN. Noncultivable microbial communities in dentine and
cementum: a molecular analytical approach. Clin Infect Dis. 1997; 25 (Suppl. 2):
233-4.
271. Wittgow Jr WC, Sabiston Jr CB. Microorganisms from pulpal chambers of intact
teeth with necrotic pulps. J Endod. 1975; 1: 168-71.
272. Yesilsoy C, Whitaker E, Cleveland D, Phillips E, Trope M. Antimicrobial and
toxic effects of established and potential root canal irrigants. J Endod. 1995; 21:
513-5.
______________________________________________________________________
Referências Biblio
g
ráfica
s
179
273. Zamany A, Safavi K, Spångberg LSW. The effect of chlorhexidine as an
endodontic disinfectant. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod.
2003; 96: 578-81.
274. Zarella JA, Fouad AF, Spångberg LSW. Effectiveness of calcium hydroxide and
chlorhexidine digluconate mixture as disinfectant during retreatment of failed
endodontic cases. Oral Surg Oral Med Oral Pathol Oral Radiol Endod. 2005; 100:
756-61.
275. Zeldow BJ, Ingle JI. Management of periapical infection: antibiotic sensivity of
bacteria isolated from root canals. Oral Surg Oral Med Oral Pathol. 1962; 15: 721-
6.
ABSTRACT
______________________________________________________________________
A
bstract
1
8
3
ABSTRACT
In vitro evauluation of the viability of Enterococcus faecalis and Candida albicans in
dentinal tubules after placement of calcium hydroxide and chlorhexidine gel 2%.
A pulp infection can result in a microbial colonization of the entire root canals
system, including dentinal tubules. These microorganisms and their toxic product are
responsible for the development and persistence of apical periondontitis from
endodontic source. The present study aimed to evaluate E. faecalis and C. albicans
viability in dentinal tubules after the application of calcium hydroxide, chlorhexidine
gel 2%, calcium hydroxide associated to chlorhexidine gel 2% and physiological
solution, through the analysis by microbiological culture and fluorescence microscopy.
For that, 120 human teeth root were standardized and submitted to autoclave, and after
ere divided into 2 groups (n=60) for E. faecalis and C. albicans contamination for 21
days. Following this, they were divided into 8 groups (n=15) for application of
antimicrobial substances in the root canals and subsequent incubation for 14 days.
Samples from root dentin with 0 – 100 µm and 100 – 200 µm of extension were
collected and submitted to microbiological culture.After 48 hours of incubation, it was
performed the evaluation of colony-forming units (CFU). At the same time, the samples
were processed for fluorescence microscopic analysis with the assistance of specific
fluorescent markers, in order to determine the proportion of viable and non-viable
microorganisms. Other 6 specimens were prepared for the analysis of scanning electron
microscopy. Results demonstrated a higher capacity of penetration in the tubules for E.
faecalis than for C. albicans. The application of intracanal medication resulted in
significant reduction of microorganisms viability when compared to the control groups
independently of the medication used and in both evaluated portions of root dentin.
However, when one compares individually the medications, it was observed a better
performance of chlorhexidine gel 2% and the association of calcium hydroxide with
chlorhexidine gel 2% without a significant difference between them. Calcium hydroxide
had the worst results for disinfection of root canal contaminated with E. faecalis and C.
albicans. These findings were confirmed for the microbiological culture as well as for
the fluorescence microscopy. The microbiological culture and the fluorescence
microscopy are adequate methods and complementary for the evaluation of E. faecalis
and C. albicans viability and the efficacy of chlorhexidine gel 2% and the association of
______________________________________________________________________
_____
A
bstract
184
calcium hydroxide with chlorhexidine gel 2% warrant their use in Endodontics as an
intracanal medication.
Key words: Enterococcus faecalis. Candida albicans. Calcium hydroxide.
Chlorhexidine. Microbial viability. Root canal infection. Fluorescence microscopy.
Endodontics.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo