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UNIVERSIDADE DE BRASÍLIA
INSTITUTO DE CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
CURSO DE PÓS-GRADUAÇÃO EM BIOLOGIA
ANIMAL
AVALIAÇÃO IN VITRO DA
CITOTOXICIDADE E
GENOTOXICIDADE DOS POLÍMEROS
DE ALBUMINA MAGNÉTICOS
CAMILA DE ARRUDA SALDANHA
BRASÍLIA – DF
2007
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CAMILA DE ARRUDA SALDANHA
AVALIAÇÃO IN VITRO DA
CITOTOXICIDADE E
GENOTOXICIDADE DOS POLÍMEROS
DE ALBUMINA MAGNÉTICOS
Dissertação apresentada ao curso de Pós-
Graduação em Biologia Animal, do Instituto de
Ciências Biológicas da Universidade de Brasília,
para obtenção do Grau de Mestre.
Orientadoras: Profa. Dra. Zulmira Guerrero
Marques Lacava
Profa. Dra. Maria de Fátima Menezes Almeida
Santos
Brasília – DF
Dezembro- 2007
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DEDICATÓRIA
Dedico este trabalho à minha
família (Amariles, Délcio, Caroline
e Felipe) pelo carinho, incentivo e
dedicação prestados a mim hoje e
sempre.
AGRADECIMENTOS
À Deus pela oportunidade diária de vida e graças recebidas diariamente;
Às professoras Zulmira Guerrero Marques Lacava e Maria de Fátima M. A. Santos pela
oportunidade, paciência, incentivo e orientação;
Aos meus pais pela confiança e apoio nos momentos necessários;
Aos colegas Bruno Lacava, Andreza Simioni e A. C. Tedesco por gentilmente ter cedido a
amostra de polímeros de albumina magnético;
À Luciana Pereira pela grande ajuda na elaboração do trabalho;
À professora Isabel pela grande ajuda para análise da estatística dos meus dados;
Aos professores César Grisólia e Ricardo Bentes por me ajudarem nos momentos que
precisei;
Aos meus colegas queridos (Luciana, Dani, Júlia, Neda, Mirian, Débora, Elisa, Grazi e
Carol) por tudo de bom que vocês me proporcionaram durante estes dois anos. Obrigada
pelos ensinamentos, carinho, amizade, gargalhadas (que foram muitas), companhia e
respeito que vocês sempre tiveram por mim. Adoro vocês;
Aos técnicos Djalma, Felipe e Ornil por toda ajuda e dicas no laboratório;
E todos aqueles que de alguma forma convivem comigo e me auxiliam.
ÍNDICE
ABREVIATURAS
RESUMO
ABSTRACT
1 INTRODUÇÃO................................................................................................................01
2 OBJETIVO.......................................................................................................................07
3 MATERIAL E MÉTODOS............................................................................................09
3.1 Polímeros de Albumina Magnéticos...............................................................................10
3.2 Caracterização das partículas de maghemita dispersa em solução aquosa de albumina
bovina por Microscopia Eletrônica de Transmissão.............................................................11
3.3. Manutenção e propagação das células submandibulares humana – HSG - e das células
mesangiais humanas – CM....................................................................................................11
3.4 Determinação das concentrações de PAM a ser administradas às células HSG e CM...11
3.5 Tratamento das células HSG e CM com PAM para os ensaios de toxicidade e
genotoxicidade......................................................................................................................12
3.6 Distinção entre apoptose e necrose das células HSG e CM por meio de ensaio de
coloração com alaranjado de acridina e brometo de etídeo..................................................13
3.6.1 Critérios para classificação das células em apoptóticas, necróticas ou viáveis...........14
3.6.2 Análise estatística........................................................................................................14
3.7 Avaliação dos danos no DNA por meio de eletroforese de células isoladas em microgel
– “Ensaio Cometa”................................................................................................................15
3.7.1 Critérios para análise dos danos no DNA....................................................................16
3.7.2 Análise Estatística.......................................................................................................18
3.8 Análise da morfologia das células HSG e CM tratadas com PAM................................18
3.8.1 Processamento das células HSG e CM para análise da morfologia celular em
microscopia de luz ...............................................................................................................18
3.8.2 Processamento das células HSG e CM para análise da morfologia celular em
microscopia eletrônica de transmissão..................................................................................19
4 RESULTADOS................................................................................................................21
4.1 Caracterização das nanopartículas magnéticas...............................................................22
4.1.1 Determinação do diâmetro das amostras do FMF.......................................................22
4.2 Efeitos da amostra de polímeros de albumina magnéticos sobre a viabilidade das células
HSG e CM ...........................................................................................................................23
4.2.1 Células HSG.................................................................................................................24
4.2.2 Células CM..................................................................................................................24
4.3 Distinção entre apoptose e necrose das células HSG e CM por meio de ensaio de
coloração de alaranjado de acridina e brometo de etídeo.....................................................25
4.3.1 Células HSG.................................................................................................................25
4.3.2 Células CM..................................................................................................................27
4.4 Avaliação dos danos no DNA em células HSG e CM tratadas com polímeros de
albumina magnéticos (PAM)................................................................................................28
4.4.1 Células HSG.................................................................................................................28
4.4.2 Células CM..................................................................................................................30
4.5 Análise da morfologia e da ultra-estrutura das células HSG e CM tratadas com
polímeros de albumina magnéticos.......................................................................................32
4.5.1 Análise da morfologia das células HSG - microscopia de luz.....................................32
4.5.2 Análise da morfologia das células CM - microscopia de luz.......................................34
4.5.3 Análise da morfologia das células HSG – Microscopia Eletrônica de
Transmissão...........................................................................................................................35
4.5.4 Análise da morfologia das células CM por Microscopia Eletrônica de Transmissão..35
5 DISCUSSÃO.....................................................................................................................38
6 CONCLUSÂO..................................................................................................................48
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .........................................................................50
ABREVIATURAS
AA – Alaranjado de acridina
BE – Brometo de etídio
CM – Célula mesangial
DNA – Ácido desoxirribonucléico
DMSA - Ácido dimercapto succínico
HCL – Ácido clorídrico
HSG – Células ductais de glândula salivar humana irradiada
ID – Índice de danos no DNA
MET – Microscópio eletrônico de Transmissão
NPM – Nanopartículas magnéticas
PAM – Polímeros de albumina magnéticos
RNA – Ácido ribonucléico
UA – unidade arbitraria
I. RESUMO
A nanotecnologia tem despertado crescente interesse na área biomédica. Materiais
nanoestruturados e, em particular fluidos magnéticos, magnetolipossomas e polímeros
magnéticos, constituídos a partir de nanopartículas magnéticas (NPM) têm sido propostos
como entregadores de drogas, para separação de células, diagnóstico in vitro ou in vivo, e
para o tratamento de diversas patologias. Uma nova amostra magnética que possa efetuar
estes procedimentos foi desenvolvida: polímeros de albumina magnéticos (PAM) contendo
nanopartículas de maghemita (diâmetro 9,2nm; 2,46 × 10
14
partículas/mg). Para atender aos
requisitos de que os efeitos biológicos de um novo material sejam conhecidos antes que
sejam testados clinicamente, este trabalho teve como objetivo a avaliação, in vitro, de
possíveis efeitos citotóxicos e genotóxicos dos polímeros de albumina magnéticos (PAM).
Células de glândula submandibular humana (HSG) e células mesangiais (CM) foram
cultivadas na presença da amostra PAM em três diferentes concentrações (250µg/mL,
150µg/mL e 75µg/mL) por 24 horas. A citotoxicidade foi avaliada por meio de ensaio de
coloração de alaranjado de acridina/brometo de etídio e a genotoxicidade por meio de
ensaio de cometa. Além disso, foram realizadas análises morfológicas em microscopia de
luz e da ultra-estrutura em microscopia eletrônica de transmissão. Os resultados mostraram
que a amostra PAM: (1) apresenta citotoxicidade relacionada à concentração da amostra e
tipo celular; (2) induz, como principal via de degeneração, a apoptose, que é sempre menor
do que 20%; (3) tem atividade genotóxica, mas, em sua maioria, os danos são de
intensidade leve (classe 1 e 2); (4) em concentrações menores, pode apresentar atividade
genotóxica e não ter correspondente atividade citotóxica; (5) não apresentou alterações na
morfologia ou ultra-estrutura de ambas as células; (6) teve suas NPM interiorizadas por
algumas células. A citotoxicidade e genotoxicidade observadas podem ter relação com
radicais livres induzidos pela presença de ferro nas NPM. Esses resultados sugerem uma
possível biocompatibilidade da amostra PAM, sugerindo que testes in vivo sejam realizados
para aprofundar o entendimento das interações entre os polímeros de albumina –
nanopartículas de maghemita e as células-tecidos animais.
II. ABSTRACT
Nanotechnology is marked by an increasing interest in the biomedical field.
Nanostructured materials, such as magnetic fluids, magnetoliposomes, and magnetic
polymers, composed of magnetic nanoparticles (NPM’s) have been proposed for several
applications: drug delivery systems, cell sorter, in vitro and in vivo diagnosis, and also for
the treatment of several pathologies. A new sample, the magnetic albumin polymers (PAM)
composed of maghemite nanoparticles (diameter 9.2nm; 2.46 × 10
14
particle/mg) has been
developed for biomedical applications purposes. New materials have to be biologically
investigated before their clinical tests. In accordance with this requirement, the aim of this
work was to evaluate, in vitro, the cytotoxicity and genotoxicity degrees of PAM sample.
Human submandibular duct cells (HSG) and mesangial cells (CM) were cultivated during
24 hours in the presence of the PAM sample at three different concentrations (250µg/mL,
150µg/mL e 75µg/mL). The cytotoxicity was evaluated through acridine orange/ethidium
bromide staining assay. The genotoxicity was investigated through the comet assay.
Further, cells morphology and ultra structure were investigated by both light and
transmission electronic microscopes analyses. The data show that the sample PAM (1)
presents cytotoxicity related to the sample concentration and cellular type; (2) conducts less
than 20% of cell to death; death are mainly by apoptosis; (3) presents genotoxic activity but
the induced damage s are not intense (classes 1 and 2); (4) at the minor concentrations may
present genotoxic activity without parallel cytotoxicity; (5) does not induce morphological
or ultra structural alterations on both cellular types; (6) NPM’s may be internalized by HSG
and CM cells. The PAM cytotoxicity and genotoxicity activities may be related to the free
radical production induced by the NPM’s iron content. The results suggest that PAM is
possibly biocompatible and also that this sample deserves to be investigated through in vivo
tests that can elucidate the albumin polymers-maghemite particles and animal cell-tissues
interactions.
1. INTRODUÇÃO
Nas últimas décadas, a área da ciência denominada nanotecnologia tem
despertado interesse crescente, pois utiliza materiais e sistemas cujas estruturas e
componentes exibem propriedades físicas, químicas e/ou bio lógicas significativamente
novas. Muitas dessas novas propriedades surgem em função do tamanho extremamente
pequeno das nanopartículas que, de forma ideal, varia entre 1 e 100 nm (Reith, 2003;
Chan, 2006; Naschie, 2006). Dentre os materiais nanoestruturados, as nanopartículas
magnéticas (NPM) têm se destacado nas áreas biomédicas por apresentarem
características como alta proporção na relação superfície/volume e capacidade de
responder a um gradiente de campo magnético. Além disso, quando em escala
nanométrica, esses materiais se comportam como partículas superparamagnéticas, ou
seja, não retém magnetismo após a remoção do campo magnético (Berry & Curtis,
2003a; Gupta & Gupta, 2005b).
Dentre as várias aplicações biomédicas das NPM destacam-se a separação, a
purificação e a concentração de biomoléculas e de células, diagnóstico por imagem de
ressonância magnética, sistema de entrega de drogas em sítios específicos, indução de
hipertermia para tratamento de diversas patologias, em particular o câncer.
Para separar, purificar e concentrar biomoléculas e células, as NPM são,
usualmente, associadas a moléculas que possam identificá-las. Quando adicionadas a
uma solução, ou suspensão, contendo essas biomoléculas e/ou células, as NPM formam
um complexo que pode ser recolhido por meio de um separador magnético. Um caso
particular de separação de células pode ser obtido ao ligar-se as NPM a um anticorpo
específico. Quando as células alvo são reconhecidas pelo anticorpo ficam marcadas
magneticamente e, dessa forma, são separadas por meio de colunas magnéticas e
removidas com o auxílio de um magneto externo (Safarik & Safarikova, 1999).
Utilizando essa tecnologia de separação imunomagnética, em 2006, Matsunaga e
colaboradores, conseguiram isolar células CD14
+
para serem posteriormente
diferenciadas em células dendríticas. Também em 2006, Chen e colaboradores isolaram
células CD34
+
umbilicais de um pool de células hematopoiéticas com o objetivo de
utilizá-las em terapias de transplante celular.
As NPM são capazes de funcionar como agente de contraste nas imagens por
ressonância magnética (MRI), aumentando a sensibilidade do diagnóstico (Berry &
Curtis, 2003a; Ito et al., 2005; Neuberger et al., 2005). Para tanto, basta que as
nanopartículas, mesmo em baixas concentrações, sejam capturadas pelas células e nelas
permaneçam pelo tempo necessário para o diagnóstico. A eficácia das NPM como
agentes de contraste depende de suas propriedades físico-químicas como tamanho e da
ligação que estabelecem com outras moléculas, como por exemplo, aquelas utilizadas
para recobrí-las, o que afetará sua farmacocinética e biodistribuição (Berry & Curtis,
2003a; Neuberger et al., 2005). NPM específicas para o fígado foram utilizadas como
agente de contraste pela primeira vez na Europa, em 1995. Desde então, vários trabalhos
têm mostrado que NPM, principalmente as de óxido de ferro, são veiculadas espontânea
e preferencialmente para nódulos linfáticos. Assim, por meio de MRI, podem ser
detectadas, em fase precoce, metástases para nódulos linfáticos dos tumores de testículo
(Harisinghani et al., 2005), bexiga, próstata, uretra, mama, cólon (Harisinghani et al.,
2004) e gástricos (Tatsumi et al., 2006). Esse método é mais específico e mais sensível
do que o método convencional, que considera somente o tamanho do nódulo linfático.
Em 2005, Harisinghani e colaboradores observaram que na detecção de nódulos
linfáticos malignos em pacientes com câncer de testículo, a MRI com nanopartículas
mostrava sensibilidade e especificidade de 88,2% e 92%, enquanto no critério
convencional esses parâmetros são de 70,5% e 78%, respectivamente.
As NPM também podem ser utilizadas como sistemas entregadores de drogas em
sítios específicos, para tratamento de diversas doenças, entre elas o câncer. Assim, as
nanopartículas associadas a quimioterápicos podem ser levadas a um local específico por
meio de um campo magnético externo, aumentando a eficácia do tratamento e reduzindo
os efeitos colaterais em tecidos normais (Arruebo et al., 2007). A primeira tentativa
clínica que utilizou NPM como entregadores de drogas foi realizada por Lübbe e
colaboradores (1996). Esses autores utilizaram nanopartículas de óxido de ferro
associadas ao quimioterápico Epirrubicina em pacientes com tumores sólidos e
demonstraram que o complexo nanopartículas-quimioterápico não era tóxico e
acumulava-se no tecido tumoral. Mais recentemente, Alexiou e colaboradores (2005)
administraram nanopartículas conjugadas ao quimioterápico Mitoxantrona em coelhos e
observaram que este complexo aparecia mais concentrado no tecido tumoral, mesmo
quando apenas 50% da dose do quimioterápico livre era aplicada.
Além das aplicações já citadas, as NPM podem ser utilizadas para destruir
células tumorais (magnetotermocitólise), pois quando submetidas a um campo
magnético de freqüência alternada, absorvem energia que é convertida em calor,
induzindo hipertermia (Hilger et al., 2005; Wang, Gu et al., 2005). Na hipertermia
gerada magneticamente, processo denominado magnetohipertermia (Guedes et al.,
2005), a temperatura nas células tumorais pode chegar até 41º - 45ºC (Lee et al., 2007),
calor suficiente para destruí-las. O calor é normalmente dissipado pela circulação
sanguínea, mas os tecidos tumorais possuem uma rede de vasos sanguíneos desordenada,
o que torna a circulação do sangue lenta e irregular, tornando as células mais
susceptíveis ao calor (BSD Medical Corporation, 2002; Hildebrandt et al., 2002). Vários
trabalhos mostram que a hipertermia induz danos no citoesqueleto, na membrana
citoplasmática e nas membranas de organelas, como as das mitocôndrias, lisossomas e
retículo endoplasmático. Além disso, aumenta a imunogenicidade do tumor, potencializa
os efeitos da radioterapia e aumenta a ação de drogas antineoplásicas (BSD Medical
Corporation, 2002; Hildebrandt et al., 2002; Wust et al., 2002; Tanaka et al., 2005). Seu
papel sobre os efeitos da radioterapia e das drogas antineoplásicas é provavelmente
devido ao aumento da perfusão tecidual, indução da dispersão de radicais de oxigênio na
radioterapia e distribuição mais adequada da droga antineoplásica (Hildebrandt et al.,
2002; Wust et al., 2002; Sreenivasa et al., 2006).
Consideradas não tóxicas, as NPM mais testadas nas aplicações biomédicas são
as de óxido de ferro, quer na forma de magnetita (Fe
3
O
4
) ou em sua forma oxidada, a
maghemita (?Fe
2
O
3
). Quando dispersas em soluções coloidais, constituem os fluidos
magnéticos, que podem ser iônicos, quando a estabilidade coloidal é controlada por uma
maior ou menor repulsão eletrostática entre as nanopartículas, surfactantes, quando as
NPM são recobertas por uma camada molecular (que pode ser de cadeias carbônicas
relativamente longas), ou ainda iônico-surfactantes.
Com o propósito de realizar aplicações biomédicas das NPM, pesquisadores do
Centro de Nanociência e Nanobiotecnologia da UnB (CNANO) desenvolveram um
fluido magnético iônico constituído por nanopartículas de maghemita que,
subseqüentemente, foram encapsuladas em polímeros de albumina (PAM) que
apresentaram alta susceptibilidade magnética. Devido a essa característica, esse novo
material deve possibilitar a magnetohipertermia, como também favorecer a entrega de
drogas sítio-específica. Antes de sua utilização em aplicações biomédicas, entretanto, os
efeitos da administração de novos materiais devem ser testados em sistemas biológicos.
A genotoxicidade e a citotoxidade de uma substância podem ser avaliadas por
meio de estudos que envolvam a análise de danos no DNA. Um deles é o ensaio de
eletroforese de células isoladas em microgel – Ensaio Cometa – o qual envolve lise e
eletroforese de células embebidas em agarose, tornando possível a detecção de quebras
no DNA de núcleos interfásicos. Neste método, células com maior quantidade de danos
no DNA apresentam migração mais rápida do material genético durante a eletroforese,
sendo a extensão do dano avaliada pelo deslocamento do material genético (cauda do
cometa formada) em relação ao núcleo (Oliver et al., 1990; Lee, Kwon & Chung, 2003).
A realização dessa técnica em condições alcalinas permite mensurar não somente
quebras nas duas fitas do DNA, mas também em uma única fita do DNA de núcleos
interfásicos, além de permitir detectar sítios susceptíveis a ataques alcalinos. Apresenta
várias vantagens em relação a outros testes de genotoxicidade, como requerimento de
pequena quantidade de células que não precisam estar em proliferação, baixo custo,
facilidade e rapidez, e alta sensibilidade na detecção de baixos níveis de danos no DNA
(Tice et al., 2000). Essas características validam o ensaio cometa como uma ferramenta
eficiente em estudos de toxicologia genética, como monitoramento de lesões e reparos
de DNA de vários tipos celulares (Fracasso et al., 2004; Choy, Benzie & Cho, 2005). O
presente momento parece ser pioneiro na utilização deste ensaio na investigação de
materiais nanoestruturados.
Quebras no DNA podem ser originadas no processo apoptótico e, dessa forma, a
interpretação dos resultados obtidos por meio de ensaio cometa pode ser mais precisa
quando essa técnica é associada a testes de detecção de células em apoptose (Lee et al.,
2003). Um procedimento simples para isso consiste na coloração das células com
alaranjado de acridina associado ao brometo de etídio, o que permite a distinção de
células viáveis, apoptóticas e necróticas (Kosmider et al., 2004). Outro estudo de grande
importância na avaliação da biocompatibilidade e citotoxicidade de células expostas a
novos materiais é a análise da morfologia e ultra-estrutura das células.
A avaliação de danos ao material genético utiliza uma variedade de sistemas
biológicos que incluem células da medula óssea de roedores, linfócitos e várias outras
linhagens celulares cultivadas in vitro (Carrano & Natarajan, 1988). Dentre os modelos
experimentais in vitro, diferentes linhagens celulares podem ser utilizadas, incluindo
células ductais de glândula submandibular humana (HSG) e células mesangiais humanas
(CM).
Estabelecida em 1981, a partir de uma glândula salivar humana irradiada
(Shirasuna, Sato & Miyazaky, 1981), a linhagem de células HSG tem sido utilizada em
testes de citotoxicidade e genotoxicidade de substâncias terapêuticas (Atsumi et al.,
2001; Kaneko et al., 2001) e em estudos de diferenciação celular (Daniels et al., 2000).
Por sua vez, a linhagem de células CM foi imortalizada a partir de uma cultura de
células primárias, conforme descrito por Banas e colaboradores (1999). É um dos tipos
celulares encontrados nos glomérulos dos rins, nos espaços intercapilares imersos em
uma matriz mesangial. Elas participam, por contração, da hemodinâmica intraglomerular
e do ritmo da filtração glomerular, além de apresentar funções fagocitárias e de
depuração de substâncias como imunocomplexos (Menezes, 2005). Células mesangiais
têm sido utilizadas em testes de citotoxicidade de citocinas (Lang et al., 2002; Wörnle et
al., 2004).
A incidência crescente do câncer tem estimulado a busca de processos de diagnóstico e
terapia alternativos mais efetivos que possam minimizar os efeitos colaterais severos dos
procedimentos convencionais, cirurgia, quimioterapia e radioterapia. Neste contexto,
materiais em escala nanométrica, como os polímeros de albumina magnéticos, têm sido
desenvolvidos com estes propósitos. A necessidade de se entender os mecanismos de
interações entre as nanopartículas e as células, bem como conhecer os efeitos biológicos
resultantes dessa interação, justificam esta pesquisa.
2. OBJETIVOS
Considerando que os polímeros de albumina magnéticos, amostra recentemente
desenvolvida, apresentam alta susceptibilidade magnética e, por conseguinte, grande
potencial para aplicações biomédicas, seja como sistema entregador de fármacos ou no
processo de magnetohipertermia, procedimentos promissores na terapia do câncer, e
considerando ainda que os efeitos biológicos de novos materiais precisam ser
conhecidos antes que possam ser testados clinicamente, este trabalho tem como objetivo
geral avaliar os efeitos in vitro dos polímeros de albumina magnéticos (PAM) e como
objetivos específicos:
1- Determinar o diâmetro modal das NPM constituintes de PAM;
2- Avaliar possível efeito citotóxico de diferentes concentrações de PAM em células
HSG e CM, por meio de ensaio de coloração de alaranjado de acridina/brometo de
etídio;
3- Determinar a principal via de degeneração celular após tratamento com PAM;
4- Avaliar possível efeito genotóxico do PAM em células HSG e CM, por meio do
ensaio cometa;
5- Verificar uma possível relação entre citotoxicidade e genotoxicidade de PAM;
6- Investigar ocorrência de alterações morfológicas e ultra-estruturais e interiorização
de NPM nas células HSG e CM tratadas com PAM.
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Polímeros de Albumina Magnéticos
Nanopartículas de maghemita (?-Fe
2
O
3
) de uma amostra de fluido magnético
iônico (2,28 × 10
17
partículas/mL) foram dispersas em solução aquosa de albumina
bovina e posteriormente liofilizadas, tendo concentração final de 2,46 × 10
14
partículas/mg. O fluido magnético iônico foi sintetizado no laboratório de Química do
Instituto de Física da UnB e suas nanopartículas foram encapsuladas em polímeros de
albumina (Figura 1) pelo Grupo de Fotobiologia e Fotomedicina do Departamento de
Química da Faculdade de Filosofia, Ciências e Letras de Ribeirão Preto – USP.
Para o tratamento das células, os polímeros de albumina magnéticos (PAM)
foram diluídos em meio de cultura DMEM (GIBCO-BRL,USA), de forma a se obter
diferentes concentrações, conforme descrito nos itens a seguir.
Figura 1. Desenho ilustrativo dos polímeros de albumina magnéticos (Simioni et al., 2006)
Albumina bovina
Ligação da albumina
com NPM
NPM
3.2 Caracterização das nanopartículas da amostra PAM por microscopia eletrônica
de transmissão
Para determinar o diâmetro das NPM, a amostra PAM foi solubilizada em
tampão fosfato pH 2,6 para aumentar a dispersão e facilitar a contagem. As
nanopartículas foram analisadas e fotografadas em MET JEOL 1001, no laboratório de
microscopia eletrônica da Universidade de Brasília. Das fotos, foram mensurados os
diâmetros das nanopartículas (n=500) por meio do programa ImagePro Plus 5.1. A
distribuição das partículas foi conseguida utilizando-se o melhor ajuste lognormal.
3.3 Manutenção e propagação das células submandibulares humana – HSG - e das
células mesangiais humanas – CM
As células HSG e CM foram mantidas em meio de cultura DMEM (GIBCO-BRL)
suplementado com 10% de soro bovino fetal (GIBCO-BRL), 1% de penicilina-
estreptomicina, tamponado com bicarbonato de sódio, sendo o pH 7,4 ajustado pela
adição de ácido clorídrico (HCl).
As culturas foram estabelecidas a partir de uma passagem inicial de 2 ×10
5
células em
frascos de cultura de 75 cm
2
e mantidas em estufa a 37°C, em uma atmosfera
de 5% de CO
2
e umidade saturada. Uma vez atingido 80-90% de confluência, as células
eram liberadas do fundo do frasco de cultura por tratamento com solução de tripsina
0,125%/EDTA 0,02% por dois minutos, centrifugadas a 175g por cinco minutos,
contadas em câmara de Neubauer e passadas para novo frasco de cultura.
3.4 Determinação das concentrações de PAM a serem administradas às células
HSG e CM
De modo a determinar as concentrações dos polímeros de albumina magnéticos
(PAM) a serem administradas às células para a realização dos ensaios biológicos foram
realizados, em triplicata, testes de viabilidade celular. Para isso, as culturas foram
mantidas conforme item 3.3 em placas de 9 poços contendo, inicialmente, 2 × 10
5
células.
As concentrações iniciais de PAM foram definidas a partir das concentrações
testadas, previamente, por Simioni e colaboradores (2006), em cultura de melanócitos. A
amostra PAM foi diluída em meio de cultura, de forma que se obtivessem as duas
concentrações de partículas magnéticas a serem testadas, como mostra a Tabela 1.
Tabela 1. Tratamentos administrados às células HSG e CM para o teste de viabilidade
celular na presença de PAM
Tratamento
Concentração (µg/mL)
Sem tratamento -
PAM 250
PAM 125
PAM = polímeros de albumina magnéticos (2,46 × 10
14
partículas/mg)
Após 24 horas de cultivo na presença da amostra PAM, as células foram
tripsinizadas, centrifugadas e ressuspensas em dois mL de meio de cultura. A seguir, a
uma alíquota de 10 µL dessa suspensão celular foram adicionados 40 µL do corante azul
de tripan a 0,4%, de modo a efetuar-se, em câmara de Neubauer, a contagem das células
viáveis. O corante azul de tripan penetra apenas nas células não viáveis, ou seja, as que
perderam a integridade da membrana citoplasmática, de modo que, enquanto essas se
coram, as células viáveis que mantêm a membrana citoplasmática íntegra, permanecem
transparentes (Strober et al., 1997).
3.5 Tratamento das células HSG e CM com PAM
Com base nas concentrações de PAM utilizadas nos testes de viabilidade e seus
resultados, foram estabelecidas as concentrações a serem adicionadas às culturas,
mantidas por 24 horas nas condições descritas no item 3.4, conforme mostra a Tabela 2.
Os ensaios biológicos foram realizados 24 horas após o cultivo das células. De modo a
seguir os padrões estabelecidos nos estudos de genotoxicidade e citotoxicidade, foi
incluído o controle positivo, constituído por grupo de células tratadas por uma hora com
peróxido de hidrogênio na concentração final de 1mM (20 µg/mL).
Tabela 2. Grupos experimentais para avaliação dos efeitos do PAM sobre as células
HSG e CM
Tratamento (µg/mL)
Grupo
PAM H
2
O
2
Controle negativo - -
Controle positivo - 20
PAM – I (6 x 10
13
p/mL) 250 -
PAM – II (3,7 x 10
13
p/mL) 150 -
PAM – III (1,9 x 10
13
p/mL) 75 -
PAM = polímeros de albumina magnéticos (2,46 × 10
14
partículas/mg)
3.6 Distinção entre as vias de degeneração apoptose e necrose por meio de ensaio de
coloração com alaranjado de acridina e brometo de etídio
Para o ensaio de coloração com alaranjado de acridina (AA) e brometo de etídio
(BE), realizado em triplicata, células HSG e CM foram cultivadas e mantidas segundo os
procedimentos descritos no item 3.5. Após 24 horas da passagem das células, cada grupo
experimental recebeu o respectivo tratamento, conforme descrito na Tabela 2 e, depois
de 24 horas de tratamento, as células em suspensão e as aderidas aos frascos foram
coletadas, submetidas à centrifugação a 750g por 5 minutos e ressuspensas em 100 µL
de meio de cultura. De cada amostra foram retirados 20 µL aos quais foram
subseqüentemente adicionados 2 µL de uma mistura recém preparada dos corantes de
alaranjado de acridina (100 µL/mL água) e brometo de etídio (100 µL/mL água), na
proporção 1:1.
As células coradas foram então imediatamente colocadas sobre lâminas de
microscopia (26 × 76 mm), previamente lavadas e identificadas e, após montagem com
lamínulas (24 × 24 mm), foram analisadas por meio de teste cego, em microscópio de
fluorescência (Olympus, filtro de barragem de 530nm) do Laboratório de Genética da
Universidade de Brasília. De cada tratamento foram analisadas cerca de 300 células, 100
células em cada uma das triplicatas, no mínimo.
3.6.1 Critérios para classificação das células em apoptóticas, necróticas ou viáveis
As análises para detecção e quantificação de células em apoptose e necrose
foram realizadas por meio dos parâmetros cor e aspecto morfológico do núcleo, além da
condensação e fragmentação da cromatina. Esta distinção é possível porque, enquanto o
alaranjado de acridina (AA) penetra nas células vivas e mortas, resultando na emissão da
fluorescência verde por intercalar no DNA e laranja, no RNA, o brometo de etídio (BE)
só penetra nas células que já possuem alteração na membrana (apoptose tardia ou
necrose), emitindo uma fluorescência laranja ao intercalar no DNA. Dessa forma,
segundo Takahashi e colaboradores (2004) e Kosmider e colaboradores (2004),
diferentes padrões celulares (representados na Figura 2) podem ser observados e
classificados:
i) Células vivas possuem núcleo verde uniforme (Figura 2a);
ii) Células em fases iniciais de apoptose ainda possuem suas membranas intactas e,
portanto, apresentam núcleo verde, porém não uniformemente corado. Nelas
ocorrem condensações da cromatina, clivagem do DNA e/ou fragmentação
nuclear (Figura 2b);
iii) Células em fases tardias de apoptose apresentam condensação da cromatina e
áreas alaranjadas no núcleo (Figura 2c), pois nas etapas finais do processo já
perderam a integridade da membrana e o BE predomina sobre o AA. Células
apoptóticas podem ainda apresentar corpos apoptóticos (Liu et al., 2004), como
pode ser observado na Figura 2d;
iv) Células necróticas perderam a integridade da membrana e por isso apresentam
núcleo alaranjado uniforme (Figura 2e).
3.6.2 Análise estatística
Para análise dos dados foi aplicado o teste não paramétrico Kruskal-Wallis (ANOVA).
Figura 2. Análise em microscopia de fluorescência de células HSG classificadas em padrões
pré-estabelecidos: (a) célula viável; (b), (c) e (d) células em apoptose; (e) célula em necrose.
Aumento total de 400× (Campos da Paz, 2005).
3.7 Avaliação dos danos no DNA por meio de eletroforese de células isoladas em
microgel – “Ensaio Cometa”
O ensaio cometa foi realizado em triplicata, segundo técnica descrita por Singh e
colaboradores (1988), modificada por Oliver e colaboradores (1990). Para esse ensaio,
as células HSG e CM foram cultivadas e mantidas segundo os procedimentos descritos
no item 3.3. Após 24 horas de cultivo, cada grupo experimental recebeu o respectivo
tratamento, conforme apresentado na Tabela 2.
Depois de 24 horas de tratamento, o meio de cultura foi retirado e colocado em
frascos de centrífuga aos quais foram adicionadas as células depois de liberadas do
fundo da placa. As amostras foram, então, centrifugadas a 750g, por 5 minutos e as
células ressuspensas em 1 (um) mL de PBS. Esse procedimento foi repetido por duas
vezes. As células foram ressuspensas em 20 µL de agarose de baixo ponto de fusão (Low
melting point - LPM-Sigma, USA) a 0,5% em PBS e aquecidas a 37 °C em banho-maria.
Imediatamente após esse procedimento, 130 µL dessa mistura foram gotejados em uma
lâmina de vidro 26 × 76 mm, previamente preparada. A preparação das lâminas foi feita
imergindo-as em agarose tipo II diluída em PBS a 1,5% e depois mantendo-as à
temperatura ambiente, por um período de 12 horas. Após o gotejamento das células em
agarose LPM sobre as lâminas, uma lamínula foi acoplada a cada lâmina e o conjunto
foi levado à geladeira. Para evitar novas quebras no DNA, a partir desta etapa as lâminas
estiveram sempre protegidas da luz.
Após cinco minutos na geladeira a 4°C, as lamínulas foram removidas e as
lâminas mergulhadas em um Koplin contendo solução de lise final gelada ((2,2 M de
NaCl, 89,0 mM de EDTA, 8,9 mM de Tris (pH 10), 1% de Triton X-100 e 10% de
DMSO) e coberto com papel alumínio.
Depois de 1 (uma) hora no tampão de lise, a 4º C, as lâminas foram colocadas em
uma cuba horizontal de eletroforese contendo tampão de eletroforese (300 mM NaOH,
1mM EDTA) fresco, pH 13. Após 25 minutos em repouso, procedeu-se a eletroforese a
25 V (0,86 V/cm) e 300 mA por um período de 25 minutos. Uma vez concluída a
eletroforese, as lâminas foram lavadas com solução tampão neutralizadora (0,4M Tris,
pH 7,5). Esse processo foi repetido três vezes, em intervalos de 5 minutos.
As lâminas foram guardadas a 4º C e os nucleóides foram corados no momento da
análise. A coloração dos nucleóides foi realizada gotejando-se sobre as lâminas 50 µL de
solução aquosa de brometo de etídio 2%.
3.7.1 Critérios para análise dos danos no DNA
A avaliação dos danos no DNA foi feita utilizando-se um microscópio de
fluorêscencia, Axioplan-Carl Zeiss, filtro de 510-560 nm, barreira do filtro de 590 nm e
aumento total de 400×, no Laboratório de Genética da Universidade de Brasília.
De cada tratamento, cerca de 300 nucleóides, 100 em cada uma das triplicatas, no
mínimo, foram analisados em teste cego e classificados de acordo com o comprimento da
cauda do nucleóide, segundo critério descrito por Jalonszynski e colaboradores (1997),
em que os nucleóides analisados são classificados de 0 a 4, segundo seu grau de lesão,
conforme ilustra a Figura 3.
Figura 3. Análise em microscopia de fluorescência de núcleos de células HSG classificados em
padrões preestabelecidos: (A) Classe 0; (B) Classe 1; (C) Classe 2; (D) Classe 3; (E) Classe 4.
Aumento total de 400× (Campos da Paz, 2005).
Para a quantificação dos danos no DNA, o escore total para os 300 nucleóides
analisados varia de 0 (dano mínimo = nenhuma célula danificada) a 400 (dano máximo =
todos os nucleóides com dano de classe 4), sendo estimado a partir da fórmula:
ID (ua) = N
1
+ 2N
2
+ 3N
3
+ 4N
4
?/100
onde,
ID = índice de danos no DNA;
ua= unidade arbitrária;
N
1
.... N
4
= nucleóides classificados como de classe 1, 2, 3 ou 4;
? = número de nucleóides analisados, incluindo os da classe zero.
3.7.2 Análise Estatística
Para a análise estatística dos índices de danos no DNA verificados nas células
HSG, foi aplicada a análise de variância (ANOVA). Aos casos em que foram detectadas
diferenças entre os tratamentos, foi aplicado o teste Fisher em nível de significância 5%
(p<0,05). Nas células CM foi utilizada a transformação “box cox”, adequada para
números absolutos e, em seguida, foi aplicada a análise de variância (ANOVA). Do
mesmo modo do que o empregado para as células HSG, quando foram detectadas
diferenças entre os tratamentos nas células CM, foi aplicado o teste Fisher em nível de
significância 5% (p<0,05).
Para a análise estatística da freqüência de células com danos no DNA verificadas
nas células HSG, foi também aplicada a análise de variância (ANOVA) e, quando
detectadas diferenças entre os tratamentos, aplicado o teste Fisher em nível de
significância 5% (p<0,05). No caso das células CM, as diferenças nas freqüências de
células com danos no DNA foram analisadas pelo teste não paramétrico Kruskal-Wallis
(ANOVA).
3.8 Análise da morfologia e da ultra-estrutura das células HSG e CM tratadas com
PAM
3.8.1 Processamento das células HSG e CM para análise da morfologia celular em
microscopia de luz
As células foram preparadas para análise morfológica em uma placa de cultura de
seis poços, contendo uma lamínula de microscopia (18 × 18mm) em cada poço. Foram
cultivadas inicialmente 2 ×10
5
células que cresceram aderidas às lamínulas. Após 24
horas, cada grupo experimental recebeu tratamento com a amostra PAM, conforme
descrito na Tabela 2. Os testes foram realizados em duplicata. Após o tempo de
tratamento, o meio de cultura foi retirado e as células lavadas três vezes com PBS (NaCl
0,154 M; Na
2
HPO
4
0,1 M; pH 7,4).
As células aderidas a uma das lamínulas foram fixadas com paraformaldeído 2%
em tampão fosfato por 10 minutos. Depois de lavadas com PBS, as células foram coradas
com solução de violeta de cresilo 0,2% em etanol 20%, por cinco minutos. As células
aderidas à outra lamínula, em cada um dos grupos experimentais, foram coradas com
solução de Giemsa 4% em metanol, por 5 minutos, sem que passassem por processo de
fixação. Após serem lavadas com PBS, as lamínulas foram retiradas dos poços e
montadas sobre lâminas de vidro para microscopia (26 × 76 mm), com a face contendo as
células coradas em contato com a lâmina. As células foram imediatamente analisadas e
fotografadas em microscópio Zeiss Axiophot, com ocular de 10× e objetiva de 100×, no
Laboratório de Genética da Universidade de Brasília.
3.8.2 Processamento das células HSG e CM para análise da morfologia celular em
microscopia eletrônica de transmissão
Para a análise da ultra-estrutura em microscopia eletrônica de transmissão, as
culturas de células foram mantidas segundo os procedimentos descritos no item 3.3. Após
a adesão das células ao fundo do frasco, foi adicionada a amostra PAM ao meio de
cultura, conforme descrito na Tabela 02. Após 48 horas de tratamento, o meio de cultura
foi retirado e colocado em frascos de centrífuga aos quais foram adicionadas as células
previamente tripsinizadas. As amostras foram, então, centrifugadas a 750g por 5 minutos
e as células ressuspensas em 1(um) mL de PBS. Esse procedimento foi repetido duas
vezes.
As células, depois de tripsinizadas e centrifugadas, foram processadas de acordo
com o protocolo utilizado por Silveira e colaboradores (2003), com algumas
modificações. As células foram ressuspensas em 1 mL de fixador constituído de
glutaraldeído 2%, paraformaldeído 4%, diluído em tampão cacodilato de sódio 0,1 M, pH
7,4, e de sacarose 3%. Após uma hora, as amo stras foram centrifugadas a 750g e lavadas,
por 10 minutos, com tampão cacodilato de sódio (0,1 M, pH 7,4) acrescido de sacarose
3%. Esse procedimento foi repetido duas vezes. Em seguida, as amostras foram pós-
fixadas por uma hora, protegidas da luz, na mistura composta por tetróxido de ósmio 1%,
ferricianeto de potássio 0,8% e cloreto de cálcio 5mM diluído em tampão de sódio (0,1
M, pH 7,4). Após serem lavadas duas vezes com tampão cacodilato de sódio por 10
minutos, as células foram contrastadas in bloch com acetato de uranila aquoso 0,5% por
uma hora, protegidas da luz. Em seguida, foram lavadas com tampão cacodilato de sódio,
por dez minutos e, posteriormente, com água destilada. As células foram então
desidratadas em concentrações crescentes de acetona: 30%, 50%, 70%, 90% e 100% (esta
última repetida três vezes). O tempo de desidratação foi de dez minutos para cada uma
das concentrações de acetona.
Após a desidratação, as amostras foram infiltradas na mistura resina: acetona em
concentrações crescentes de resina Spurr e decrescentes de acetona, em movimento
giratório. Cada infiltração teve duração de, aproximadamente, 12 horas. Uma última
infiltração foi feita somente com resina Spurr, por 7 a 8 horas, com o tubo aberto de
modo a facilitar a evaporação da acetona remanescente. Em seguida, as amostras foram
incluídas em formas de emblocamento contendo nova resina. O material foi mantido em
estufa a 57 ºC, por aproximadamente 72 horas.
Os blocos contendo as células foram levados a um ultramicrótomo Reichert
Supernova com navalha de diamante para obtenção de cortes ultrafinos, que foram
colhidos em telas de cobre de 400 Mesh. A contrastação das amostras foi feita protegida
da luz, colocando-se primeiramente as telinhas em contato com solução de acetato de
uranila 3% durante 25 minutos. Depois de lavadas em água destilada, as mesmas foram
colocadas em contato com citrato de chumbo por 5 minutos. Após as telinhas serem
lavadas em água destilada e deixadas secar por pelo menos 12 horas, as células foram
observadas e fotografadas em microscópio eletrônico de transmissão JEOL 1001 do
Laboratório de Microscopia Eletrônica da Universidade de Brasília.
4. RESULTADOS
No presente estudo, com o intuito de avaliar os efeitos biológicos de
nanopartículas magnéticas contidas em polímeros de albumina bovinos, foram
realizados diferentes ensaios biológicos, cujos resultados estão descritos abaixo e
ilustrados nas Figuras 4 a 17.
4.1 Caracterização das nanopartículas magnéticas
4.1.1 Determinação do diâmetro das amostras do PAM
Uma das abordagens experimentais inicialmente realizadas foi a determinação do
diâmetro das partículas de maghemita presentes na amostra PAM, o que foi realizada
por meio de análise ao microscópio eletrônico de transmissão (MET). Ao MET, as
nanopartículas mostraram-se ligeiramente esféricas (Figura 4). A análise de 500
partículas nas fotomicrografias mostrou diâmetros que variavam entre 4 e 154nm, o que
demonstra que essas partículas são polidispersas (Figura 5).
Figura 4 Fotomicrografia eletrônica mostrando nanopartículas magnéticas da amostra PAM.
A Figura 5 ilustra que diâmetro modal (D
M
) das partículas é 9,2 nm e o desvio
padrão (σ) 0,34.
0 5 10 15 20 25 30 35
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
D
M
= 9.2 nm
σ = 0.34
Counts
Diameter (nm)
Diâmetro (nm)
Contagens
0 5 10 15 20 25 30 35
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
D
M
= 9.2 nm
σ = 0.34
Counts
Diameter (nm)
Diâmetro (nm)
Contagens
Figura 5 Histograma de distribuição dos diâmetros do PAM. A linha cheia representa o melhor
ajuste para a polidispersão segundo uma lognormal.
4.2 Efeitos da amostra de polímeros de albumina magnéticos sobre a
viabilidade das células HSG e CM
Para determinar a concentração dos polímeros de albumina magnéticos (PAM) a
ser administrada às células nos testes de genotoxicidade, foram realizados, em triplicata,
testes de viabilidade com as linhagens celulares HSG e CM.
4.2.1 Células HSG
Como mostra a Figura 6, os polímeros de albumina magnéticos na concentração
125 µg/mL permitiram sobrevivência de aproximadamente 70% das células HSG,
enquanto que na concentração de 250 µg/mL, sua taxa de sobrevivência foi de 50%.
0
1
2
3
4
5
6
7
Controle negativo PAM 125 µg/mL PAM 250 µg/mL
Número de células viáveis (x 10
5
)
Figura 6 Número de células HSG viáveis após cultivo com diferentes concentrações do
PAM. Letras diferentes nas colunas denotam diferença significativa (p<0,05)
Com bases nesses dados, decidiu-se utilizar o PAM na concentração 250 µg/mL,
pois o número de células viáveis ou em degeneração seria suficiente para análise de
genotoxicidade e citotoxicidade induzidas pelos polímeros de albumina magnéticos.
Além dessa, foram utilizadas também outras duas concentrações, 150 e 75 µg/mL, que
correspondem, respectivamente, a 60% e 30% daquela concentração que permitiu
aproximadamente a viabilidade de 50% das células (250 µg/mL).
4.2.2 Células CM
Para as células CM, como mostra a Figura 7, nos grupos tratados com 250 e
125µg/mL, a taxa de sobrevivência das células foi de aproximadamente 70 e 60%
respectivamente. Pelo fato de não ter sido encontrada diferença significativa na
a
a
b
freqüência de células viáveis com estas duas concentrações diferentes, optou-se por
utilizar nos experimentos com as células CM, as mesmas concentrações utilizadas nos
testes com as células HSG (250, 150 e 75 µg/mL).
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
Controle negativo PAM 125 µg/mL PAM 250 µg/mL
Número de células viáveis (x 10
5
)
Figura 7 Número de células CM viáveis após cultivo com diferentes concentrações do PAM.
Letras diferentes nas colunas denotam diferença significativa (p<0,05)
4.3 Distinção entre apoptose e necrose por meio de ensaio de coloração de alaranjado
de acridina e brometo de etídio
O ensaio de coloração com alaranjado de acridina e brometo de etídio, permitiu a
distinção entre células viáveis, necróticas e apoptóticas, em cada um dos grupos
experimentais.
4.3.1 Células HSG
A Figura 8 ilustra a freqüência de células HSG em processo de degeneração, bem
como sua via de degeneração. Pode-se observar que a freqüência de células em
degeneração foi significativamente maior nos grupos tratados com PAM na
a
a
a
concentração 250µg/mL e 150µg/mL (17,66% e 12,66%, respectivamente) quando
comparado à freqüência de células em degeneração no grupo controle negativo (6,33%).
Embora a freqüência de células em degeneração no grupo tratado com PAM na
concentração 75µg/mL (11%) não tenha se mostrado significativamente diferente
daquela do controle negativo, ela também não foi significativamente diferente da
freqüência induzida pelas concentrações maiores (250µg/mL e 150µg/mL de PAM). Em
relação às vias de degeneração pode-se observar que, a exemplo do controle negativo,
em todos os grupos tratados com PAM (250µg/mL, 150µg/mL e 75µg/mL), a via de
degeneração mais freqüente foi a apoptose. Esta só é menor do que a necrose no controle
positivo.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle
negativo
PAM
75
µg/mL
PAM
150
µg/mL
PAM
250
µg/mL
Controle
positivo
Frequência de Células HSG em
Degeneração (%)
Necrose
Apoptose
Figura 8 Efeitos do tratamento com PAM (24h) sobre a freqüência de células HSG nas vias de
degeneração necrose e apoptose.Letras diferentes nas colunas denotam diferença significativa
(p<0,05).
b
b
c
a
a,b
4.3.2 Células CM
As células CM também foram avaliadas quanto à degeneração celular e os
resultados estão ilustrados na Figura 9. Diferentemente do ocorrido nas células HSG, nas
células CM apenas na concentração 250µg/mL o PAM induziu freqüência de células em
degeneração (24,3%) significativamente maior que o controle negativo (11,6%). Vale
ressaltar que, a freqüência de células em degeneração no grupo tratado com 150µg/mL
de PAM (16,3%) não foi significativamente diferente daquela observada no grupo
tratado com a concentração de 250µg/mL de PAM.
Assim como nas células HSG, nas células CM a via de degeneração mais
freqüente, tanto nos grupos tratados com PAM, como no sem tratamento foi a apoptose,
excetuando-se o controle positivo (Figura 9).
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Controle
negativo
PAM 75
µg/mL
PAM 150
µg/mL
PAM 250
µg/mL
Controle
positivo
Frequência de Células CM em degeneração (%)
Necrose
Apoptose
Figura 9 Efeitos do tratamento com PAM (24h) sobre a freqüência de células CM nas vias de
degeneração necrose e apoptose. Letras diferentes nas colunas denotam diferença (p<0,02).
a
a
ab
b
c
4.4 Efeitos dos polímeros de albumina magnéticos - PAM sobre os danos no DNA
No ensaio cometa, para cada linhagem celular, foram analisados cerca de 300
nucléoides por tratamento. As diferentes classes de cometa, descritas no item 3.7.1 do
capítulo Material e Métodos, foram detectadas em quase todos os grupos experimentais.
É importante salientar que os danos observados estavam, em sua maioria, concentrados
nas classes 1 e 2.
Os resultados obtidos para cada linhagem celular estão apresentados de duas
formas: i) freqüência de células com danos no DNA, o que indica a freqüência de células
em cada grupo experimental, classificadas como cometas de classe 1, 2, 3 e 4; ii) índice de
danos no DNA, o que reflete a intensidade do dano no DNA das células.
4.4.1 Células HSG
A freqüência de células HSG com danos no DNA está representada na Figura 10.
Pode-se observar que nos grupos tratados com PAM, nas diferentes concentrações, foi
significativamente maior que no grupo sem tratamento, o controle negativo (7%).
O PAM na maior concentração (250µg/mL), induziu freqüência de células com
danos no DNA (84,33%) significativamente maior do que nas concentrações 150µg/mL
e 75µg/mL (45,33% e 36,33%, respectivamente), que não se mostraram
significativamente diferentes entre si.
A Figura 11 ilustra a intensidade de danos no DNA apresentados pelas células
HSG. Todos os grupos de células tratadas com PAM nas diferentes concentrações 250,
150 e 75µg/mL apresentaram índice de danos (120, 57 e 41 ua, respectivamente)
significativamente maior do que o apresentado pelo controle negativo (7 ua). Vale
ressaltar que o índice de danos no DNA das células tratadas com o PAM nas
concentrações 150 e 75µg/mL não diferiram significativamente entre si.
A tabela 3 mostra a percentagem de danos no DNA leves e intensos encontrados
em cada tratamento.
Tabela 3. Percentagem de danos no DNA leves e intensos nos tratamentos utilizados
Tratamento Danos leves (classe 1 e 2) Danos intensos (classe 3 e 4)
Controle negativo 7% 0%
PAM 75µg/mL
35% 1,3%
PAM 150µg/mL
43,3% 2,3%
PAM 250µg/mL
80,6% 7%
Controle positivo 45,3% 8%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle
negativo
PAM 75
µg/mL
PAM 150
µg/mL
PAM 250
µg/mL
Controle
positivo
Frequência de Células com Danos no
DNA (%)
Figura 10 Efeito do tratamento com PAM sobre a freqüência de células HSG com danos no
DNA. Letras diferentes nas colunas denotam diferença significativa (p<0,05).
a
c
d
b,d
b
0
20
40
60
80
100
120
140
Controle
negativo
PAM 75
µg/mL
PAM 150
µg/mL
PAM 250
µg/mL
Controle
positivo
Índice de Danos no DNA (ua)
Figura 11 Efeito do tratamento com PAM nas células HSG sobre o índice de danos no DNA.
Letras diferentes nas colunas denotam diferença significativa (p<0,05).
4.4.2 Células CM
Em relação à freqüência de células CM com danos no DNA (Figura 12), a análise
dos dados mostrou que o PAM, em todas as concentrações utilizadas (250µg/mL,
150µg/mL e 75µg/mL) induziu freqüência de células com danos no DNA (81%, 82,66%
e 80,66%, respectivamente) significativamente maior que o grupo controle negativo
(3,33%).
Em relação ao índice de danos no DNA apresentados pelas células CM (Figura
13), a análise dos dados mostrou que o índice dos grupos tratados com PAM
(250µg/mL, 150µg/mL e 75µg/mL – 85, 89 e 81, respectivamente) é significativamente
maior que o do grupo controle (3,33ua).
A tabela 4 mostra a percentagem de danos no DNA leve e intensos encontrados
em cada tratamento.
b
d
c
b
a
Tabela 4. Percentagem de danos no DNA leves e intensos nos tratamentos utilizados
Tratamento Danos leves (classe 1 e 2) Danos intensos (classe 3 e 4)
Controle negativo 3,3% 0%
PAM 75µg/mL
80,6% 0%
PAM 150µg/mL
82,3% 0,7%
PAM 250µg/mL
79,3% 1%
Controle positivo 21,3% 11%
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Controle
negativo
PAM 75
µg/mL
PAM 150
µg/mL
PAM 250
µg/mL
Controle
positivo
Frequência de Células com Danos no DNA
(%)
Figura 12 Efeito do tratamento com PAM sobre a freqüência de células CM com danos no
DNA. Letras diferentes nas colunas denotam diferença significativa (p<0,025).
a
b
b
b
a
0
20
40
60
80
100
120
Controle
negativo
PAM 75
µg/mL
PAM 150
µg/mL
PAM 250
µg/mL
Controle
positivo
Índice de Danos no DNA (ua)
Figura 13 Efeito do tratamento com PAM nas células CM sobre o índice de danos no DNA.
Letras diferentes nas colunas denotam diferença significativa (p<0,05).
4.5 Efeitos do tratamento com polímeros de albumina magnéticos sobre a morfologia e
a ultra-estrutura das células HSG e CM
De modo a verificar se o PAM induzia alterações na morfologia e na ultra-- estrutura das
células, as mesmas foram analisadas ao microscópio de luz e ao microscópio eletrônico
de transmissão.
4.5.1 Análise da morfologia das células HSG - microscopia de luz
Ao microscópio de luz, as células HSG sem tratamento apresentam forma
poligonal que pode variar de um pouco alongada a mais arredondada de acordo com a
confluência da cultura e projeções citoplasmáticas que ligam uma célula à outra. O
núcleo dessas células é esférico ou ovóide, sendo evidente um ou outro nucléolo (Figura
a
b
b
b
b
14a e 14b). O tratamento com o PAM, nas diferentes concentrações, não induziu
alterações na morfologia dessas células, como ilustra a Figura 14 (c, d).
Figura 14. Fotomicrografias de células HSG submetidas a diferentes tratamentos: (a) controle
negativo, lâmina fixada e corada com Violeta de Cresil; (b) controle negativo, corada com Giemsa;
(c) e (d) 250 µg/mL de PAM, corada com Giemsa. Aumento 1000 x.
b
c
a
10
µ
m
10
µ
m
10
µ
m
10
µ
m
b
d
4.5.2 Análise da morfologia das células CM - microscopia de luz
As células CM apresentam-se de forma irregular, possuem prolongamentos
citoplasmáticos, denominados de processos citoplasmáticos primários, o que lhes
confere um aspecto estrelado. Apresentam o núcleo oval, central com nucléolos
evidentes (Figura 15a e 15b).
Quando tratadas com a amostra PAM, as células CM não apresentaram
alterações morfológicas (Figura 15c). Entretanto, foram encontrados aglomerados de
polímeros de albumina magnéticos, aparentemente não interiorizados pelas células
(Figura 15d).
Figura 11.Fotomicrografias de células CM submetidas a diversos tratamentos: (a) controle
negativo, fixado e corado com Violeta de Cresil; (b) controle negativo lâmina corada com Giemsa;
(c) 250 µg/mL de PAM, corada com Giemsa (aumento total de 100x); (d) 250 µg/mL de PAM,
corada com Giemsa (aumento total de 1000x); (c) e (d) setas indicam presença de aglomerados de
nanopartículas magnéticas.
a
b
c
d
10 µm 10 µm
10 µm
100 µm
4.5.3 Análise da ultra-estrutura das células HSG – microscopia eletrônica de transmissão
Para elucidar os efeitos de PAM sobre a ultra-estrutura das células e investigar uma
possível interiorização de nanopartículas magnéticas foi feito um estudo por MET.
Ao MET, as células HSG apresentam forma irregular, núcleo volumoso e
numerosas projeções citoplasmáticas. Seus citoplasmas são ricos em organelas
membranosas, mantendo o padrão ultra-estrutural característico de células secretoras.
Quando tratadas com PAM, essas células não mostravam alterações na ultra-
estrutura. Entretanto, apesar de ao microscópio de luz, não serem visualizadas
nanopartículas de PAM associadas às células, ao microscópio eletrônico essas células
apresentavam alguns aglomerados de nanopartículas no seu interior, alguns localizados nas
projeções citoplasmáticas, como pode ser visualizado na Figura 16c e 16d. Aglomerados de
NPM foram observados em maior quantidade quando dispersos no exterior das células
(Figura 16f).
4.5.4 Análise da ultra-estrutura das células CM – Microscopia Eletrônica de Transmissão
Ao MET, as células CM se caracterizam por apresentarem superfície irregular
com protrusões, núcleo volumoso e irregular com nucléolos evidentes. O citoplasma é
rico em organelas membranosas como retículo endoplasmático, mitocôndrias ovais e
complexo de Golgi desenvolvido.
Quando tratadas com PAM, as células CM também não mostravam alterações na
ultra-estrutura, mas apresentavam aglomerados de nanopartículas no seu interior (Figura
17e e 17f). As micrografias mostravam maior quantidade de aglomerados de NPM no
exterior das células (Figura 17d).
Figura 16.Fotomicrografias da ultraestrututa das células HSG submetidas a diferentes
tratamentos: (a) controle negativo (aumento total 10000x); (b) 75 µg/mL de PAM (aumento total
10000x); (c) 75 µg/mL de PAM (aumento total 8000x); (d) 250 µg/mL de PAM (aumento total
30000x); (e) 175 µg/mL de PAM (aumento total 80000x); (f) 250 µg/mL de PAM (aumento
total 80000x); (c), (d), (e) e (f) setas indicam presença de aglomerados de nanopartículas
magnéticas.
a b
c d
e
f
Figura 17.Fotomicrografias da ultraestrututa das células CM submetidas a diferentes
tratamentos: (a) controle negativo (aumento total 10000x); (b) 250 µg/mL de PAM (aumento
total 10000x); (c) 75 µg/mL de PAM – célula em apoptose (aumento total 12000x); (d) 75
µg/mL de PAM (aumento total 20000x); (e) 250 µg/mL de PAM (aumento total 120000x); (f)
250 µg/mL de PAM (aumento total 100000x); (c), (d), (e) e (f) setas indicam presença de
aglomerados de nanopartículas magnéticas.
a
c
b
d
e
f
5. DISCUSSÃO
Nas últimas décadas, a nanotecnologia intensificou o desenvolvimento de materiais
e sistemas nanoestruturados que possam ser utilizados no tratamento de diversas patologias.
Uma classe particularmente interessante de material nanoestruturado é constituída pelas
nanopartículas magnéticas. No Brasil, pesquisadores do Centro de Nanociência e
Nanobiotecnologia da UnB (CNANO) desenvolveram uma amostra de fluido magnético
iônico constituído por nanopartículas de maghemita (?-Fe
2
O
3
), que, subseqüentemente,
foram encapsuladas em polímeros de albumina (PAM). A albumina é a proteína plasmática
cuja seqüência é conservada entre as albuminas de mamíferos. A albumina humana, por
exemplo, apresenta aproximadamente 75% de homologia com as seqüências das albuminas
bovina e eqüina (Carter & Ho, 1994). Sua função fisiológica inclui o controle da pressão
osmótica do sangue e o transporte, metabolismo e distribuição de várias substâncias
endógenas ou exógenas, como hormônios, aminoácidos, ácidos graxos e íons metálicos e
drogas (He & Carter, 1992). Sendo a proteína mais abundante do plasma sanguíneo, o
encapsulamento das NPM em polímeros constituídos por essa proteína poderia conferir alto
grau de biocompatibilidade à amostra.
Sintetizados a partir de uma amostra de fluido magnético iônico caracterizado por
ter alta susceptibilidade magnética, os polímeros de albumina magnéticos também
apresentam essa característica e, por conseguinte, grande potencial para aplicações
biomédicas, seja como sistema entregador de fármacos ou no processo de
magnetohipertermia, procedimentos promissores na terapia do câncer.
Os polímeros de albumina magnéticos utilizados neste estudo são constituídos de
maghemita, óxido de ferro que se encontra na forma oxidada. O fato de estar na forma
oxidada torna a maghemita menos reativa, ou seja, com menor potencial de toxicidade às
células. Como demonstrado por Brugin (2007), nanopartículas de maghemita apresentam
menor toxicidade do que as de magnetita, óxido de ferro que se encontra na forma reduzida.
Para serem utilizadas na área biomédica, é interessante que, no organismo, as
nanopartículas magnéticas atravessem a barreira endotelial e se acumulem especificamente
nas células-alvo, sem induzir dano às células normais . As nanopartículas devem, portanto,
apresentar características que levam à sua biocompatibilidade (Chouly et al., 1996; Gupta
& Gupta, 2005a). Dentre essas características destacam-se a natureza química das
nanoparticulas e sua cobertura. Em 2007, Giri e colaboradores demonstraram que
nanopartículas de natureza química diferente, mas complexadas com a mesma cobertura, o
ácido láurico, induziam, em células HeLa, índices de toxicidade diferentes. Quando as
nanoparticulas de óxido de ferro estavam livres ou associadas a um átomo de manganês,
induziam toxicidade dose-dependente e, quando associadas a um átomo de cobalto, a
toxicidade era maior. Da mesma forma, Berry e colaboradores (2003b) demonstraram que
nanopartículas de mesma natureza química (magnetita), mas recobertas com diferentes
coberturas induziam resultados também diferentes. Esses autores mostraram que
nanopartículas de magnetita recobertas com dextran induziam toxicidade em fibroblastos da
linhagem HTERT-BJ1. Contudo, quando eram recobertas com albumina, induziam
aumento no índice de proliferação celular.
Outro fator importante é o tamanho das nanopartículas; é necessário que as
nanopartículas sejam pequenas o suficiente para que não haja precipitação, permitindo que
o movimento browniano atue como agente dispersor (Silveira, 2006). Vale ressaltar que o
tamanho das partículas pode também influenciar na velocidade e no tempo que essas
nanopartículas levam para ultrapassar a barreira endotelial (Moghimi et al., 2001). De
modo geral, nanoparticulas de tamanhos reduzidos podem ser rapidamente interiorizadas
pelas células. Além disso, o tamanho reduzido das partículas pode também dificultar o seu
reconhecimento pelo sistema fagocitário mononuclear.
Usando a microscopia eletrônica de transmissão (Giri et al.,2003; Hergt et al.,
2004), determinou-se que o diâmetro modal das nanopartículas de maghemita encapsuladas
em PAM é de 9,2 nm. Este tamanho é similar ao de amostras de nanopartículas já testadas
in vitro (Giri et al., 2003; Gupta & Gupta, 2005b; Simioni et al., 2006; Phadran, 2007), com
variados graus de compatibilidade. Alguns estudos in vivo (Lacava, informação pessoal)
mostram que NPM com diâmetro na faixa 8-10nm apresentam características mais
favoráveis às suas aplicações.
A biocompatibilidade de uma nanopartícula é também determinada pela sua
incapacidade de induzir danos nas células normais. Assim, faz-se necessário a realização de
testes biológicos capazes de determinar a toxicidade e a genotoxicidade das nanopartículas.
Nesse contexto, visando determinar a biocompatibilidade dos polímeros de
albumina magnéticos (PAM) foram realizados no presente estudo, ensaios de toxicidade e
genotoxicidade; além da avaliação da morfologia e da ultra-estrutura de células CM e HSG
cultivadas na presença de PAM. Para isso, foi necessário determinar a concentração dos
polímeros a ser administrado às células; o que foi feito por meio de testes de viabilidade
celular realizados por exclusão, utilizando o corante vital azul de tripan.
A partir do teste de viabilidade com azul de tripan, definiu-se que as células seriam
cultivadas na presença de PAM na concentração de 250 µg/mL, por ter sido nessa
concentração que a amostra de PAM induziu uma redução significativa de
aproximadamente 50% e 60%, na viabilidade das células HSG e CM, respectivamente.
Quando se visa analisar in vitro os efeitos genotóxicos de um composto, a concentração a
ser utilizada deve ser definida em testes de citotoxicidade. Dessa forma, é possível
estabelecer as respostas de um único composto em diferentes sistemas ou de vários
compostos em um único sistema (Eisenbrand et al., 2002). Contudo, em estudos de
genotoxicidade, é necessário avaliar os possíveis efeitos de concentrações mais baixas do
que a citotóxica, uma vez que podem ocorrer danos ao ma terial genético, sem
necessariamente afetar a viabilidade celular. Assim sendo, neste estudo, com o objetivo de
determinar se os possíveis efeitos da amostra de PAM eram dose-dependentes, também se
utilizou a amostra de PAM em outras duas concentrações que correspondiam a 30% e 60%
daquela que permitiu aproximadamente a viabilidade de 50% das células (250 µg/mL).
A toxicidade celular pode ser avaliada por vários testes como o de exclusão com
azul de tripan (Sestier et al, 2002) e o ensaio MTT, que utiliza o sal de tetrazólio (3-(4,5-
dimetiltiazol-2-il)-2,5-difenil brometo tetrazólico) como marcador (Häfeli & Pauer, 1999).
Este último ensaio, no entanto, não tem sido indicado para avaliar a toxicidade das
nanopartículas, pois a cor delas, tanto das que se encontram no meio de cultura, como das
que estão no interior das células, interfere na leitura no espectrofotômetro. Empregado
neste trabalho, outro teste muito utilizado para análise de citotoxicidade é o ensaio de
coloração de alaranjado de acridina e brometo de etídio, vantajoso porque além de permitir
a análise da citotoxicidade, permite distinguir simultaneamente células viáveis, apoptóticas
e necróticas.
Usando esse ensaio, foi possível constatar que os polímeros de albumina magnéticos
apresentaram efeitos citotóxicos nas células HSG e CM. Nas células CM, a amostra PAM
induziu toxicidade somente na maior concentração (250µg/mL), enquanto nas células HSG,
esse efeito foi também observado com a concentração intermediária. Em um estudo similar,
Simioni e colaboradores (2006) demonstraram que a citotoxicidade de amostra de
partículas de maghemita encapsuladas com albumina para fibroblastos da linhagem J774-
A1 era dose-dependente. Sovinco e colaboradores (2005) mostraram ligeira citotoxicidade
(sobrevivência celular superior a 75%) em três linhagens de células (HeLa, Kb e MCF7)
tratadas com nanopartículas de maghemita recobertas com folato. É bom lembrar que uma
substância pode ser ou não tóxica, a depender das condições, tipo celular ou dose utilizadas
(Sestier et al., 2002).
O fato de a amostra PAM ter sido citotóxica para as células HSG, também na
concentração intermediária, muito provavelmente reflete a maior instabilidade genética
apresentada por essas células, detectável pela variabilidade no número de cromossomos
(Daniels et al, 1999; Campos da Paz, 2005). É plausível supor que a instabilidade genética
das células HSG é decorrente do fato de serem derivadas de tumor (Michor et al, 2005). Por
outro lado, a linhagem de células CM, imortalizada a partir de uma cultura de células
primárias (Banas et al., 1999), apresenta o número modal de cromossomos igual a 46,
característico das células humanas não tumorais.
A citotoxicidade induzida pela amostra PAM nas duas linhagens celulares (HSG e
CM) resulta de apoptose. Este tipo de morte celular ocorre individualmente, ou seja, a
morte de uma célula não leva à morte de outras. A apoptose caracteriza-se por apresentar
uma seqüência de alterações morfológicas bem definidas e repetitivas, tais como a redução
de volume celular, formação de vacúolos e de corpos apoptóticos, além de fragmentação do
DNA. Estes eventos são dependentes de energia e, ao contrário da morte celular acidental,
necrose, ocorrem de forma programada. A morte celular por necrose ocorre geralmente em
resposta a injúrias severas às células e caracteriza-se morfologicamente por intumescimento
citoplasmático e mitocondrial, ruptura da membrana plasmática e liberação do conteúdo
citoplasmático. Estes eventos podem causar injúria e até a morte de células vizinhas, o que
significa que na necrose uma grande quantidade de células é afetada e lesada ao mesmo
tempo (Curtin et al., 2002).
Quando a morte celular apresenta todas as características morfológicas e
bioquímicas de apoptose, mas foi induzida por um determinado composto ou por estímulo
físico, não constitui um processo programado e sim uma resposta celular às mudanças
ambientais (Anazetti & Melo, 2007). As nanopartículas utilizadas neste estudo apresentam
ferro em sua constituição. Sabe-se que o ferro, embora seja um elemento essencial para o
organismo, quando em excesso pode causar estresse oxidativo nas células, levando a
formação de radicais hidroxilas e superóxido, provocando danos à membrana celular,
proteínas e DNA (Halliwell & Gutteridge, 1984; Puntarulo, 2005). Desse modo, a
citotoxicidade e a apoptose detectadas neste estudo podem ter sido desencadeadas por
radicais livres induzidos pela presença de ferro no PAM. Em acordo, o uso de um quelante
de ferro diminuiu drasticamente a toxicidade celular em estudos do efeito de NPM à base
de magnetita recobertas com ácido dimercapto succínico (DMSA) (Sestier et al., 2002).
A associação entre citotoxicidade e genotoxicidade está bem estabelecida, pois
danos no DNA são considerados como um importante mecanismo indutor de apoptose e
necrose. Por outro lado, determinadas concentrações de diversos compostos podem induzir
danos no material genético das células sem necessariamente induzí-las à morte celular,
razão pela qual, neste trabalho, foram realizados testes de genotoxicidade, a fim de verificar
se as concentrações da amostra PAM que não causaram citotoxicidade induziriam danos ao
DNA.
O ensaio cometa tem sido considerado um dos melhores métodos para quantificar
danos ao DNA, pois como Pereira (2006) discute possui uma grande sensibilidade,
permitindo mensurar não somente quebras de fita dupla, mas também de fita simples, além
de sítios suscetíveis a ataques alcalinos, danos oxidativos ao DNA e ligações cruzadas.
Além disso, testes de genotoxicidade como o de micronúcleo e análise citogenética não
seriam apropriados em linhagens celulares com instabilidade cromossômica, como as
células HSG, uma vez que essa instabilidade dificultaria a distinção entre danos intrínsecos
ou provocados por um tratamento experimental (Campos da Paz, 2005).
Os dados do cometa podem ser coletados por sistemas computacionais de análise de
imagem, nos quais podem ser considerados diferentes parâmetros, como o comprimento da
cauda formada, a porcentagem do DNA na cauda ou o momento cauda, que é produto dos
dois parâmetros anteriores. Devido à indisponibilidade deste programa computacional,
neste estudo foi realizada análise visual, conforme descrito por Jalonszynski e
colaboradores (1997). Nessa análise é considerada apenas a extensão da cauda formada,
sendo os nucleóides classificados de 0 a 4 de acordo com o comprimento da cauda. Os
nucleóides classificados como de classe 1 e 2 representam nucleóides com fragmentação
moderada e os classificados como de classes 3 e 4 representam nucleóides com
fragmentação intensa.
No ensaio de cometa realizado, os grupos controle negativo das células HSG e CM
mostraram freqüências basais de células com danos de 7% e 3,33%, respectivamente. O
fato de esses parâmetros serem duas vezes maiores nas células HSG do que nas células CM
confirma a maior instabilidade intrínseca das primeiras. Células geneticamente instáveis
apresentam maior freqüência de quebras no DNA, visto que esse tipo de alteração é o
primeiro passo para os rearranjos cromossômicos e conseqüentemente, da instabilidade
(Morgan et al., 1998).
Nas células HSG e CM, o tratamento com a amostra PAM induziu aumento nas
freqüências de células com danos no DNA e também no índice desses danos. Nas células
HSG, este aumento foi significativo para todas as concentrações testadas, sendo os
resultados com a amostra PAM na maior concentração, significativamente maiores do que
os obtidos com as outras duas concentrações. Se somados com os dados de citotoxicidade
obtidos pelo ensaio de coloração, pode-se concluir que nas células HSG pode haver
genotoxicidade sem que haja citotoxicidade significativa. Esta conclusão pode também ser
obtida nas células CM em que a amostra PAM induziu aumento similar nas freqüências de
células com danos no DNA e também no índice desses danos, enquanto a citotoxicidade
significativa só é verificada na maior concentração de PAM. Até o momento não existem
relatos na literatura sobre a genotoxicidade in vitro de nanoparticulas magnéticas.
Entretanto, é possível que a fragmentação do DNA induzida pela amostra PAM possa estar
relacionada com a formação de radicais livres. Almeida e colaboradores (2006) mostraram
intensa fragmentação do DNA quando incubaram mitocôndrias na presença do complexo
Fe
2+
-citrato e atribuíram esses danos no DNA ao ataque direto de espécies reativas de
oxigênio geradas pela peroxidação lipídica mediada pelo ferro.
Para lidar com danos no DNA, as células eucarióticas tem como estratégias três
componentes: o reconhecimento do DNA lesionado, um período para avaliação dos danos e
a implementação de uma resposta adequada. Uma vez constatados os danos no DNA, a
célula tem dois possíveis destinos: (1) interromper temporariamente o ciclo celular para
tentar reparar os danos; (2) interromper o ciclo celular e entrar em apoptose. A escolha do
destino celular em função do dano no DNA depende de uma rede complexa, que integra
sinais de monitoramento da integridade genômica e da disponibilidade de energia na célula.
Segundo Bernstein e colaboradores (2002), se o processo de reparo de DNA, pela sua
magnitude, consumir muito ATP, o que poderia ser energeticamente desfavorável, a
apoptose é priorizada por meio de clivagem de proteínas pertencentes ao sistema de reparo.
Apoptose foi a principal via de degeneração celular observada neste trabalho. A
literatura revela que este mecanismo está associado à frequência de células nas classes 3 e 4
(Yasuhara et a., 2003). Neste trabalho, nas células HSG tratadas com as concentrações
maior, intermediária ou menor da amostra PAM, os cometas de classe 3 e 4 (danos
intensos) representavam 7%, 2,3% ou 1,3%, respectivamente, do total de células com danos
em cada grupo experimental. Nas células CM estes valores eram 1%, 0,7% e 0%,
respectivamente. Estes valores não têm relação direta com as maiores porcentagens de
apoptose apresentadas por ambos os tipos celulares após os tratamentos com PAM. Várias
razões poderiam explicar este fato: a presença continuada de radicais livres, a possibilidade
de que células das classes 1 e 2 também levem as células à apoptose, alterações nos
mecanismos de reparo que os tornem ineficientes.
As alterações morfológicas indicativas de apoptose detectadas nas células HSG e
CM pelo ensaio de coloração alaranjado de acridina e brometo de etídio, não se confirmou
ao microscópio de luz. É plausível que os dados desses dois ensaios tenham sido
controversos porque as células em fase tardia da apoptose se depreendem das lamínulas,
ficando suspensas no meio de cultura e, subsequentemente, sendo perdidas nas diversas
lavagens no decorrer da preparação das células para a microscopia de luz. Vale lembrar que
pelo ensaio de alaranjado de acridina e brometo de etídio, as células detectadas em
apoptose se encontravam, em sua grande maioria, em apoptose tardia. É possível que no
início da apoptose as células não apresentem as alterações características desse processo, ou
que essas alterações sejam muito sutis e por isso não possam ser visualizadas ao
microscópio de luz. É provável que as células analisadas ao microscópio de luz
representassem o conjunto de células viáveis e células em fase inicial da apoptose, já que
não apresentavam nenhuma alteração morfológica evidente.
Ao microscópio de luz não foram encontradas alterações morfológicas, o que é um
resultado interessante no que tange ao uso deste material nanoestruturado em aplicações
biomédicas. Esta observação foi confirmada pelas análises ao microscópio eletrônico de
transmissão, mesmo na presença de alguns aglomerados de NPM interiorizados em ambos
os tipos celulares. Ao microscópio de luz não foi observada a interiorização de NPM, o que
pode refletir a limitação em detectar as NPM pelas colorações utilizadas ou ainda a morte
das células que haviam endocitado NPM e subseqüente perda da capacidade de adesão das
mesmas às lamínulas investigadas.
Segundo discute Azevedo e colaboradores (2003), a interiorização das
nanopartículas pelas células é um processo ativo, sendo as nanopartículas magnéticas,
como todas as outras nanopartículas, seletivamente incorporadas pela membrana
plasmática, em um processo que depende da estrutura molecular da membrana plasmática.
Outras explicações para a interiorização de NPM têm sido descritas. Em particular, Pradhan
e colaboradores (2007) discutem que este processo está relacionado com a estrutura da
cobertura. No presente estudo, as nanopartículas foram encapsuladas com albumina. A
utilização de albuminas (rato, bovina, ou humana) como sistemas entregadores de drogas
para células tumorais é bastante conhecida (Stehle et al, 1999). As células podem endocitar
as moléculas ligadas à albumina que são subsequentemente hidrolisadas nos lisossomos e
liberadas dentro do citossol, onde exercem sua ação biológica (Stehle et al, 1999). Embora
NPM tenham sido visualizadas, ao MET, dentro das células, é importante observar que
essas não apresentavam vesículas de absorção, uma característica do processo de
endocitose.
Em síntese, este estudo mostrou que o PAM (1) apresenta citotoxicidade
relacionada à concentração da amostra e tipo celular; (2) induz, como principal via de
degeneração, a apoptose, que é sempre menor do que 20%; (3) tem atividade genotóxica,
mas, em sua maioria, os danos são de intensidade leve (classe 1 e 2); (4) em concentrações
menores, pode apresentar atividade genotóxica e não ter correspondente atividade
citotóxica; (5) não apresentou alterações na morfologia ou ultra-estrutura de ambas as
células; (6) teve suas NPM interiorizadas por algumas células.
Nos estudos das interações nanopartícula-células realizados in vitro é plausível
esperar efeitos mais severos do que nos efetuados in vivo, uma vez que os organismos vivos
dispõem de uma série de mecanismos para restabelecer o equilíbrio homeostásico, os quais
estão ausentes em culturas de células e que, portanto, descrevem uma situação de
citotoxicidade aguda. Conquanto os resultados obtidos neste trabalho apontem para a
biocompatibilidade da amostra de polímeros de albumina magnéticos, outros estudos
deverão ser realizados de modo a estabelecer um modelo experimental in vivo para
esclarecer melhor sobre a biocompatibilidade dos polímeros de albumina magnéticos.
6. CONCLUSÃO
Com bases nos resultados obtidos neste estudo, é possível concluir que, nas condições
experimentais utilizadas, a amostra PAM:
1 possui nanopartículas magnéticas com diâmetro modal igual a 9,2nm;
2 apresenta citotoxicidade relacionada à concentração da amostra e tipo celular;
3 induz apoptose, sempre em menos de 20%, tanto nas células HSG, quanto nas CM,
evidenciáveis pelo ensaio de colo ração e análise ao MET;
4 tem atividade genotóxica nas células HSG e CM, mas, em sua maioria, os danos são
de intensidade leve (classe 1 e 2);
5 em concentrações menores, pode apresentar atividade genotóxica e não ter
correspondente atividade citotóxica;
6 nã o induz alterações morfológicas nas células HSG ou CM aderidas às lamínulas de
vidro, evidenciáveis ao microscópio de luz;
7 não induz alterações ultra-estruturais na maioria das células HSG e CM,
evidenciáveis ao MET;
8 é interiorizado nas células HSG e CM, conforme revelado pela presença de pequeno
número de corpos eletron-densos, característicos de nanopartículas, ao MET;
9 tem potencial para uso em aplicações biomédicas e, portanto, deve ser investigada
por testes in vivo.
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