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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
AVALIAÇÃO HORMONAL, IMUNOISTOQUÍMICA E DA EXPRESSÃO GÊNICA
DE RECEPTORES DE ESTRÓGENO E PROGESTERONA EM CADELAS (
Canis
familiaris
) NAS DIFERENTES FASES DO CICLO ESTRAL E COM PIOMETRA
PRISCILA CARVALHO DE OLIVEIRA
BOTUCATU – SP
JANEIRO – 2008
i
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
FACULDADE DE MEDICINA VETERINÁRIA E ZOOTECNIA
AVALIAÇÃO HORMONAL, IMUNOISTOQUÍMICA E DA EXPRESSÃO GÊNICA
DE RECEPTORES DE ESTRÓGENO E PROGESTERONA EM CADELAS (
Canis
familiaris
) NAS DIFERENTES FASES DO CICLO ESTRAL E COM PIOMETRA
PRISCILA CARVALHO DE OLIVEIRA
Tese apresentada à Faculdade de Medicina
Veterinária e Zootecnia da Universidade
Estadual Paulista “Júlio de Mesquita Filho”,
Campus de Botucatu, junto ao programa de
pós-graduação para obtenção do título de
Doutor em Medicina Veterinária, área de
concentração Reprodução Animal.
Orientadora: Profa. Dra. Maria Denise Lopes
BOTUCATU – SP
JANEIRO – 2008
ii
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FICHA CATALOGRÁFICA ELABORADA PELA SEÇÃO DE AQUIS. E TRAT. DA INFORMAÇÃO
DIVISÃO TÉCNICA DE BIBLIOTECA E DOCUMENTAÇÃO - CAMPUS DE BOTUCATU - UNESP
BIBLIOTECÁRIA RESPONSÁVEL: ROSEMEIRE APARECIDA VICENTE
Oliveira, Priscila Carvalho de.
Avaliação hormonal, imunoistoquímica e da expressão gênica de receptores
de estrógeno e progesterona em cadelas (Canis familiaris) nas diferentes fases
do ciclo estral e com piometra
/
Priscila Carvalho de Oliveira. – Botucatu :
[s.n.], 2008
Tese (doutorado) – Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia,
Universidade Estadual Paulista, 2008.
Orientador: Profª. Drª Maria Denise Lopes
Assunto CAPES: 50504002
1. Cão - Reprodução. 2. Reprodução animal.
CDD 636.70824
Palavras-chave: Cadelas; HCE; Piometra; Receptores hormonais.
iii
Nome do Autor: Priscila Carvalho de Oliveira
Título: AVALIAÇÃO HORMONAL, IMUNOISTOQUÍMICA E DA EXPRESSÃO
GÊNICA DE RECEPTORES DE ESTROGENO E PROGESTERONA EM CADELAS
(
CANIS FAMILIARIS
) NAS DIFERENTES FASES DO CICLO ESTRAL E COM
PIOMETRA
COMISSÃO EXAMINADORA
_____________________________________
Prof
a.
Dr
a
. Maria Denise Lopes
Presidente e Orientadora
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária
FMVZ – UNESP – Botucatu
_____________________________________
Prof. Dr. Nereu Carlos Prestes
Membro
Departamento de Reprodução Animal e Radiologia Veterinária
FMVZ – UNESP – Botucatu
_______________________________________
Prof
a.
Dr
a
. Renée Laufer Amorim
Membro
Departamento de Clínica Veterinária
FMVZ – UNESP – Botucatu
_______________________________________
Prof
a.
Dr
a
. Clair Motos de Oliveira
Membro
Departamento de Reprodução Animal
FMVZ – USP – São Paulo
_________________________________________
Prof. Dr. Gilson Hélio Toniollo
Membro
Departamento de Medicina Veterinária Preventiva e Reprodução Animal
FCAV - UNESP – Jaboticabal
29 de janeiro de 2008.
iv
DEDICATÓRIA
Ao meu marido Julio César de Carvalho Balieiro pela paciência,
compreensão, amor e amizade.
Ao meu filho Arthur que nasceu durante o curso de doutorado e me
mostrou um outro sentido para vida.
Aos meus pais, Maria Lucia e José Eduardo, que sempre me incentivaram
e que são um exemplo de vida. Minha eterna gratidão!
Aos meus irmãos Luciana, Cristina e Joaquim.
v
AGRADECIMENTOS
A Deus pelo dom da vida.
À Faculdade de Medicina Veterinária e Zootecnia da Universidade
Estadual Paulista-Campus Botucatu (FMVZ-UNESP, Botucatu), em particular
aos professores dos Departamentos de Reprodução Animal e Radiologia
Veterinária, que participaram do Programa de Doutorado, pelos ensinamentos.
À Profa. Dra. Maria Denise Lopes pela eficiente orientação, paciência,
amizade, incentivo pela compreensão e ensinamentos transmitidos.
À Profa. Dra. Eunice Oba pelo uso do laboratório de endocrinologia.
Ao Prof. Dr. José Buratini Jr., Dra. Paula Ripamonte Figueiredo, Anthony
Castilho, pelo auxílio na realização das análises de expressão gênica.
Ao Departamento de Patologia Veterinária da UNIFEOB, Prof. Helder
Esteves Thomé e em especial a Profa Dra. Veridiana Moura (UFG, Goiânia)
pelo auxílio na realização das análises de imunoistoquímica.
Aos professores Dra.Maria Denise Lopes (FMVZ/Botucatu), Dr. Nereu
Carlos Prestes (FMVZ/Botucatu), Dra. Renée Laufer Amorim (FMVZ/Botucatu),
Dra. Clair Motos de Oliveira (FMVZ/USP), Dr. Gilson Hélio Toniollo (FCAV-
Jaboticabal) pelas preciosas críticas e sugestões.
Ao Prof. Dr. Julio César de Carvalho Balieiro FZEA/USP-Pirassununga
pelas análises estatísticas.
À UNIFEOB pela liberação de minhas atividades para que pudesse
concluir este doutorado.
Aos colegas de pós-graduação Viviane, Fabiana, Jorge, Ana Isabel e em
especial ao Iam pelo auxílio na realização das dosagens hormonais séricas.
Ao Cristiano de Carvalho Balieiro pelos momentos de descontração e
tensão passados juntos.
À Fundação de Amparo à Pesquisa (FAPESP), pelo auxilio financeiro
concedido.
A todos aqueles que, direta ou indiretamente, colaboraram para realização
deste estudo.
vi
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 - Seqüências dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados no
PCR em tempo real para amplificação dos genes ERα,
ERβ, PR e RPS5 .................................................................. 24
Tabela 2 - Anticorpos e suas características de marcação celular
utilizados na padronização da técnica de imunoistoquímica 27
Tabela 3 - Diluição, recuperação antigênica e soluções tampão
utilizadas na padronização da técnica de imunoistoquímica 27
Tabela 4 - Estimativas de médias e erros padrão para as dosagens
de progesterona nas diferentes fases do ciclo estral, dentro
de cada grupo comparativo avaliado ................................... 32
Tabela 5 - Número de observações (N), estimativas de médias
(MED), erros padrão (EP), valores de mínimos (MIN) e
máximos (MAX) para os receptores de estrógeno ER-α e
ER-β, bem como, para o receptor de progesterona PR
avaliados ..............................................................................
38
Tabela 6 - Distribuição das freqüências observadas para as análises
dos receptores de estrógeno alfa e beta, bem como, para o
receptor de progesterona (ER-α, ER-β e PR) avaliados por
meio de PCR em tempo real, segundo o grupo
comparativo e as fases do ciclo estral .................................
39
Tabela 7 - Estimativas de médias e erros padrão para receptores
hormonais ER-α, ER-β e PR, segundo as diferentes fases
do ciclo estral, dentro de cada grupo comparativo avaliado.
40
vii
LISTA DE TABELAS
Tabela 8 - Número de observações (N), estimativas de médias
(MED), erros padrão (EP), valores mínimos (MIN) e
máximos (MAX) para porcentagens de células
imunopositivas para o receptor hormonal de estrógenos
em escala original (PCPOSIT), após a transformação de
escala (ASPCPOSIT) e os números médios de células
contados (TOTCELS) por campo avaliado na microscopia . 46
Tabela 9 - Estimativas de médias e erros padrão das porcentagens
de células imunopositivas para o receptor de estrógeno,
dentro das diferentes fases e tecidos, segundo os grupos
comparativos avaliados ........................................................ 47
Tabela 10 - Estimativas dos coeficientes de correlação momento-
produto de Pearson entre as dosagens hormonal de
progesterona sérica, da expressão gênica dos receptores
hormonais ER-α, ER-β e PR, bem como, as quantificações
nos diferentes tecidos obtidos pela técnica de
imunoistoquímica, no animais do grupo controle (animais
normais) ...............................................................................
51
Tabela 11 - Estimativas dos coeficientes de correlação momento-
produto de Pearson entre a dosagem hormonal de
progesterona sérica, da expressão gênica dos receptores
hormonais ER-α, ER-β e PR, bem como, as quantificações
nos diferentes tecidos obtidos pela técnica de
imunoistoquímica, no animais do grupo experimental
(animais com piometra) ........................................................
52
viii
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 - Estimativas de médias e erros padrão para os níveis de
progesterona (ng/ml), de acordo com a fase do ciclo estral
e dentro de cada grupo comparativo .................................... 33
Figura 2 - Freqüências de ocorrências de fases do ciclo estral nos
animais controle, segundo os métodos de classificação ...... 34
Figura 3 - Freqüências de ocorrências de fases do ciclo estral nos
animais do grupo experimental, segundo os métodos de
classificação (citologia vaginal e concentração de
progesterona)......................................................................... 34
Figura 4 - Histologia das fases de anestro e pro estro em cadelas do
grupo controle........................................................................ 35
Figura 5 - Histologia das fases de estro e diestro em cadelas do
grupo controle........................................................................ 36
Figura 6 - Histologia das fases de anestro e diestro em cadelas do
grupo experimental................................................................
37
Figura 7 - Estimativas de médias e erros padrão para as expressões
gênicas de ER-α, de acordo com a fase do ciclo estral e
dentro de cada grupo comparativo ......................................
41
Figura 8 - Estimativas de médias e erros padrão para as expressões
gênicas de ER-β, de acordo com a fase do ciclo estral e
dentro de cada grupo comparativo ......................................
41
Figura 9 - Estimativas de médias e erros padrão para as expressões
gênicas de PR de acordo com a fase do ciclo estral e
dentro de cada grupo comparativo ....................................... 42
ix
LISTA DE FIGURAS
Figura 10 - Imunomarcação de endométrio de cadelas na fase de
anestro nos grupos controle e experimental........................ 44
Figura 11 - Imunomarcação de endométrio de cadelas na fase de
diestro nos grupos controle e experimental......................... 45
Figura 12 - Porcentagens de células imunopositivas para o receptor de
estrógeno, dentro das diferentes fases do ciclo estral e
tecidos, bem como, em cada grupo avaliado ....................... 48
x
SUMÁRIO
Página
RESUMO .................................................................................................. xiv
ABSTRACT ............................................................................................... xvi
1. INTRODUÇÃO ...................................................................................... 1
2. REVISÃO DA LITERATURA ................................................................ 3
2.1. Etiopatogenia .................................................................................. 3
2.1.1. Hormônios exógenos .............................................................. 4
2.1.2. Aspectos microbiológicos ....................................................... 5
2.2. Sinais Clínicos ................................................................................. 5
2.3. Exames complementares ............................................................... 6
2.3.1. Exames radiográficos ............................................................. 6
2.3.2. Exames ultra-sonográficos .................................................... 6
2.3.3. Exames hematológicos .......................................................... 7
2.3.4. Exames bioquímicos ............................................................... 7
2.4. Diagnóstico ..................................................................................... 8
2.5. Tratamentos .................................................................................... 9
2.5.1. Tratamento cirúrgico ............................................................... 9
2.5.2. Terapia médica........................................................... 10
2.6. Prognóstico ..................................................................................... 12
2.7. Avaliação de receptores hormonais ................................................ 13
2.7.1. Avaliação molecular de receptores hormonais ...................... 13
2.7.2. Avaliação imunoistoquímica de receptores hormonais .......... 16
3. OBJETIVOS .......................................................................................... 20
3.1 Objetivo Geral................................................................................... 20
3.2 Objetivos específicos........................................................................ 20
4. MATERIAL E MÉTODOS ..................................................................... 21
4.1. Animais ........................................................................................... 21
4.2. Dosagem sérica de progesterona e estrógeno ............................... 21
4.3. Citologia Vaginal ............................................................................. 21
4.4. Exame histológico ........................................................................... 22
xi
SUMÁRIO
Página
4.5 Avaliação da expressão gênica dos receptores de hormônios
sexuais por meio de PCR em tempo real....................................... 22
4.5.1 Extração do RNA e reação de transcrição reversa ................. 22
4.5.2 Caracterização do perfil de expressão gênica por PCR em
tempo real ................................................................................. 23
4.5.3 Determinação da expressão gênica relativa ........................... 24
4.6. Exame de imunoistoquímica para receptores de estrógeno e
progesterona .................................................................................. 25
4.6.1 Padronização da técnica de imunoistoquímica....................... 25
4.7. Análises estatísticas ........................................................................ 28
5. RESULTADOS ..................................................................................... 31
5.1 Avaliação das dosagens hormonais de progesterona e estradiol
séricos .............................................................................................. 31
5.2 Avaliação da citologia vaginal e histopatologia uterina..................... 32
5.3 Avaliação da expressão gênica dos receptores hormonais ............. 38
5.4 Avaliação imunoistoquímica dos receptores hormonais .................. 43
5.4.1 Padronizações das técnicas de imunoistoquímica .................. 43
5.4.2 Avaliação quantitativa das marcações obtidas pela técnica
de imunoistoquímica ................................................................. 43
5.5 Estimativas de correlações entre as avaliações hormonal de
progesterona, da expressão gênica dos receptores hormonais e
das quantificações obtidas pela técnica de imunoistoquímica ......... 49
5.6 Resumo dos resultados .................................................................... 53
xii
SUMÁRIO
Página
6. DISCUSSÃO ......................................................................................... 55
7. CONCLUSÕES ..................................................................................... 65
8. BIBLIOGRAFIA .................................................................................... 66
xiii
RESUMO
Avaliação hormonal, imunoistoquímica e da expressão gênica de
receptores de estrógeno e progesterona em cadelas (
Canis familiaris
)
nas diferentes fases do ciclo estral e com piometra
Os objetivos do presente estudo foram avaliar as concentrações
hormonais séricas de progesterona e estradiol, a expressão gênica de
receptores de estrógeno (ER-α e ER-β) e progesterona (PR), bem como,
expressão de receptores de estrógeno e progesterona por meio de técnicas de
imunoistoquímica, em cadelas normais (grupo controle) e com piometra (grupo
experimental) em diferentes fases do ciclo estral. Foram utilizadas 51 fêmeas
caninas submetidas à ovario-histerectomia, sendo 30 animais de conveniência
e 21 com diagnóstico de piometra. Os níveis de progesterona para os 51
animais variaram entre 0,11 e 38,00 ng/ml, com média e erro padrão de 7,46±
1,52 ng/ml, respectivamente. Foi observado que os animais do grupo controle
apresentaram concentrações séricas de progesterona significativamente
superiores (P<0,01) em relação aos animais do grupo experimental,
particularmente na fase de diestro. Não foram detectadas diferenças
significativas (P>0,05) entre as freqüências de ocorrências nas classificações
citológicas e com base nos níveis de progesterona, para animais normais e
com piometra. Nos animais clinicamente saudáveis, foram observados em
6,6% com Hiperplasia Endometrial Cística (HEC) e 93,4% sem HEC. Para os
animais com piometra, 100% exibiram HEC. Não foram verificadas diferenças
significativas (P>0,05) nas expressões gênicas de receptores ER-α e PR entre
os grupos avaliados nas diferentes fases do ciclo estral. Entretanto, as
expressões gênicas de receptor ER-β apresentaram diferenças significativas
(P<0,01), com os animais do grupo controle exibindo maiores taxas de
transcrição quando comparados aos animais do grupo experimental, na fase de
diestro. As porcentagens de células imunopositivas para o receptor de
estrógeno, obtidos pela técnica de imunoistoquímica, bem como, os escores de
intensidade de marcação, foram significativamente (P<0,01) superiores nos
animais do grupo experimental quando comparados aos animais controle, para
xiv
as fases de anestro e diestro, e para todas as camadas do tecido uterino
avaliados. A correlação obtida entre a concentração de progesterona sérica
(P4) e a expressão gênica do receptor de estrógeno beta (ER-β), assumiu um
valor de 0, 7114, no grupo controle. A etiologia exata da HCE ainda não é
totalmente conhecida nas cadelas e os hormônios esteróides e seus receptores
apresentaram uma importante relação com as alterações histológicas visíveis
no endométrio, durante o ciclo estral. Embora modificações nos receptores de
estrógenos e progesterona tenham sido descritos no endométrio de cadelas
com HCE, provavelmente não são os únicos fatores envolvidos. Outros estudos
são necessários em cadelas normais e com piometra visando o melhor
entendimento da etiologia de piometra, bem como, as relações entre esses e
outros fatores e a expressão de receptores de ER e PR.
Palavras-chave: Hiperplasia endometrial cística; receptores hormonais;
cadelas; piometra.
xv
ABSTRACT
Hormonal evaluation, immunohistochemical analysis and estrogen and
progesterone receptors gene expression in Bitch (Canis familiaris) at
different stages of the estrous cycle and pyometra
The aim of present study were evaluate estradiol and progesterone serum
hormonal levels, estrogen (ER-α e ER-β) and progesterone (PR) receptors
gene expression, as well as estrogen and progesterone receptors expression
by immunohistochemical techniques in health bitches (control group) and
piometra (experimental group) at different stages of the estrous cycle. Fifty one
bitches were submitted to ovariohysterectomy, which thirty normal dogs and
twenty one with pyometra. The progesterone levels for all animals varied
between 0.11 e 38.00 ng/ml, with mean and standard error of 7.46±1.52 ng/ml,
respectively. Control group animals had significantly higher progesterone serum
hormonal levels than experimental groups (P<0.01), specially at diestrus stage.
Significative differences were not detected (P>0.05) for occurred frequencies
between cytological classifications and progesterone levels classifications to the
different groups. To healthy animals were observed only 6.6% with cystic
endometrial hyperplasia (HEC) and 93.4% without HEC. To experimental group,
100% showed HEC. Significative differences were not observed (P>0.05) for
ER-α and PR receptors gene expressions among evaluated groups at different
stages of the estrous cycle. However, ER-β receptor gene expression had
significative difference (P<0.01), with control group animals exhibiting higher
rate of transcription than experimental group in diestrus stage. The percentages
of immunopositive cells for estrogen receptor and stained intensity scores were
significantly higher (P<0.01) to experimental group animals when compared
with control group animals for anestrus and diestrus stages and for all uterine
tissue layers evaluated. The correlation obtained among progesterone serum
hormonal levels (P4) and the estrogen (ER-β) receptors gene expression had a
value of 0.7114 on control group. The HCE right etiology is not totally known in
bitches and the steroids hormones and it’s receptors presented an important
xvi
association with visible endometrium histological alterations during estral stage.
In despite of estrogen and progesterone receptors modifications have been
described on bitches uterine with HCE, probably it is not the unique involved
factors. Further studies need to be done in normal and with piometra dogs
seeking better pyometra etiology knowledge, as well as the relations between
these and others factors and the ER and PR receptors expression.
Keywords: Cystic endometrial hyperplasia; hormonal receptors; bitch,
pyometra.
xvii
1. INTRODUÇÃO
O complexo hiperplasia cística endometrial (HEC) – piometra é uma
síndrome aguda ou crônica, que ocorre após o estro e afeta principalmente
cadelas adultas e nulíparas (JOHNSTON et al., 2001). A patogenia da piometra
não é completamente conhecida, apesar de décadas de estudo direcionados a
etiologia da doença.
A teoria clássica considera que a hiperplasia cística endometrial –
piometra é como uma conseqüência de estímulos hormonais crônicos que
resultam em um quadro de hiperplasia endometrial, aumentando a
susceptibilidade do endométrio à infecção bacteriana secundária. (FELDMAN e
NELSON, 2004). Entretanto, a teoria mais recente sugere que uma infecção
uterina subclínica pode ocorrer primariamente, promovendo estímulos para a
hiperplasia e hipertrofia do endométrio. A associação da hipertrofia com um
aumento da secreção glandular poderia exacerbar a infecção primária levando
a um aumento da secreção pelas glândulas endometriais e células do epitélio
luminal progredindo para piometra (VERSTEGEN e VERSTEGEN-ONCLIN,
2006).
A piometra é fisiopatologicamente distinta de outras infecções uterinas,
como a metrite pós-parto, que ocorrem em outros estágios do ciclo reprodutivo.
Acredita-se que as bactérias envolvidas na piometra sejam microrganismos
oportunistas que ascendem da vagina, visto que, as bactérias mais
frequentemente isoladas da piometra canina são pertencentes a microbiota
vaginal normal. Escherichia coli é isolada na maioria dos casos de piometra
canina (JOHNSTON et al., 2001; FELDMAN e NELSON, 2004).
Segundo FERREIRA e LOPES (2000), existem duas síndromes
distintas da piometra. A primeira é a síndrome da piometra da cadela idosa,
que ocorre em animais com mais de sete ou oito anos de idade, propensos à
hiperplasia cística endometrial e subseqüente piometra. Essa síndrome é o
resultado de exposições sucessivas a progesterona durante as fases de
diestro do ciclo estral normal; sendo, portanto, relacionada à idade. A
1
síndrome da piometra da cadela jovem está relacionada à administração
exógena de estrógenos para prevenir a gestação.
Pelo exposto, observa-se que a etipatogenia da piometra não é
completamente conhecida, apesar de décadas de estudo, fato este que
justifica a importância desse trabalho.
2
2. REVISÃO DA LITERATURA
2.1 Etiopatogenia
Feldman e Nelson (2004) relataram que a piometra em cadelas é uma
desordem do diestro mediada por hormônio. A hiperplasia endometrial é
reconhecidamente causada por uma estimulação crônica da progesterona. A
piometra, entretanto, pode ocorrer sem a HCE, mas é extremamente rara.
A piometra se diferencia da metrite por sua ocorrência e desenvolvimento
durante o ciclo estral. A metrite pós-parto é uma inflamação do útero causado
por infecção bacteriana primária que ocorre normalmente após o parto, quando
os níveis de progesterona estão baixos (JOHNSTON et al. 2001; NOAKES et
al. 2001).
A concentração plasmática de progesterona em cadelas, em anestro, é
baixa (<0,5 ng/mL). A progesterona permanece abaixo de 1,0 ng/mL durante o
pro-estro e então começa a se elevar no início do estro, quando, geralmente,
atinge concentrações superiores a 2,0 ng/mL. Os níveis de progesterona
continuam a aumentar durante o estro e durante as primeiras semanas do
diestro, seguindo dessa forma até atingir um platô de concentração sérica e
então retorna lentamente para concentrações basais. O retorno para uma
concentração inferior a 1,0 ng/mL sinaliza o fim do diestro (FELDMAN E
NELSON, 2004). Normalmente durante 9 a 12 semanas após as ovulações, a
concentração plasmática de progesterona freqüentemente excede 40 ng/mL.
Durante a fase de diestro, a progesterona promove ou fornece suporte ao
crescimento endometrial e a secreção glandular, enquanto suprime a atividade
do miométrio, permitindo o acúmulo de secreções glandulares uterinas. Essas
secreções promovem um excelente meio para o desenvolvimento bacteriano. O
crescimento bacteriano é também favorecido pela inibição da resposta
leucocitária à infecção. Dessa maneira o útero se torna o principal alvo da
colonização bacteriana.
As infecções bacterianas associadas a piometra envolvem as mesmas
bactérias da flora vaginal normal. Essas bactérias freqüentemente ultrapassam
a cérvix e são encontradas no útero durante o pro-estro e estro (FELDMAN e
NELSON, 2004).
3
Noakes et al. (2001) e Fransson e Ragle (2003) consideraram que
hormônios endógenos como a progesterona estimulam a secreção das
glândulas endometriais e suprimem as contrações uterinas, causando um
acúmulo de fluido no interior das glândulas endometriais e lúmen uterino
criando um ambiente intra-uterino predisposto ao crescimento bacteriano.
Entretanto, para que a piometra se desenvolva é necessário que o endométrio
esteja sensibilizado pela ação do estrógeno (DE BOSSCHERE et al., 2001).
Chen et al. (2006) trabalharam com 14 cadelas submetidas à ovariectomia
entre 2 e 4 anos de idade, sem histórico de uso de estrógeno ou progesterona.
O objetivo do estudo foi induzir HEC por meio de sutura com fio de seda em
apenas um corno uterino, sendo o outro, considerado controle e as fêmeas
receberam tratamento com benzoato de estradiol e acetato de megestrol. O
estudo demonstrou que: (i) a HEC foi reversível depois da retirada da
progesterona; (ii) a progesterona mantém a HEC na presença ou ausência do
agente irritante; e (iii) a persistência da irritação endometrial na ausência de
progesterona pode não manter a HEC.
2.1.1 Hormônios Exógenos
Noakes et al., (2001) relataram que as expressões dos receptores de
estrógeno e progesterona são modificadas por hormônios esteróides exógenos,
mas não há evidência que comprovem que mudanças nesses receptores estão
envolvidas na etiopatogenia da piometra.
A hipótese de que o uso de hormônios exógenos cause o complexo HEC/
piometra já foi relatada há muitos anos. A administração de progesterona e
estrógeno juntos ou em seqüência, causando a doença em cadelas intactas ou
submetidas a ovariectomia já foi constatado, entretanto, o uso do estrógeno
isoladamente não foi eficiente para produzir a doença. A administração de
progesterona em cadelas com idade acima de cinco anos foi suficiente para
causar a piometra (NOAKES, et al. 2001). Segundo Nelson e Kelly (1976) a
severidade da doença causada por administração de esteróides exógenos é
dose dependente.
Arora et al. (2006) objetivando desenvolver um modelo para o estudo da
HEC/piometra, trabalharam com 15 cadelas submetidas à ovarectomia e
tratadas com benzoato de estradiol e acetato de megestrol associados à
4
inoculação intravaginal e intra-uterina de E.coli. Esses autores induziram a
HEC/piometra em 100% dos animais, mas não obtiveram resultado positivo
quando inocularam a bactéria por via intravaginal.
2.1.2 Aspectos microbiológicos
As bactérias frequentemente isoladas dos cultivos uterinos em casos de
piometra são microrganismos oportunistas que ascendem da vagina
(SANDHOLM et al., 1975; WADAS et al., 1996; ETTINGER, 1997; JOHNSTON,
et al., 2001; FRANSSON e RAGLE 2003). Escherichia coli é a bactéria isolada
na maioria dos casos de piometra canina. Também ocorrem infecções
bacterianas por Streptococcus hemolítico, Staphylococcus, Klebsiella,
Pasteurella, Pseudomonas, Proteus, Moraxella e infecções mistas. Embora a
infecção bacteriana não seja a causa primária da piometra canina, é causa da
maioria dos casos de morbidade e mortalidade associados à piometra
(ETTINGER, 1997; FRANSSON e RAGLE, 2003).
2.2 Sinais clínicos
Os sinais clínicos da piometra não são limitados ao trato reprodutivo e
variam de acordo com o relaxamento da cervix. Freqüentemente são
reportados sinais de anorexia, vômitos, polidipsia, poliúria, letargia e descarga
vulvar (FERREIRA e LOPES, 2000; JOHNSTON, et al., 2001; NOAKES, et al.
2001; FRANSSON e RAGLE, 2003). Os sinais clínicos são mais severos em
cadelas com piometra fechada e distensão abdominal pelo aumento de volume
uterino. Nesse caso a palpação abdominal está contra indicada pelo risco de
ruptura uterina (FERREIRA e LOPES, 2000).
Em caso de septicemia ou toxemia podem ocorrer sintomas de choque
séptico, com taquicardia, taquipnéia, preenchimento capilar prolongado, pulso
femoral fraco e temperatura retal reduzida (FERREIRA e LOPES 2000;
FRANSSON e RAGLE, 2003).
5
2.3 Exames complementares
2.3.1 Exames radiográficos
Segundo Feldman e Nelson (2004), no exame radiográfico de piometra
observa-se uma estrutura tubular com grande diâmetro, contendo fluido denso,
localizada ventral e caudal ao abdômen, deslocando as alças intestinais crânio-
dorsalmente. Radiografias laterais são mais eficientes no diagnóstico de
aumento de volume uterino, do que as radiografias ventro-dorsais.
2.3.2 Exames ultra-sonográficos (US)
A ultra-sonografia apresenta diversas vantagens sobre o exame
radiográfico, uma vez que, devido à ausência de radiação ionizante, é mais
seguro tanto para o paciente como para o clínico. Além disso, a presença de
fluido abdominal não interfere tanto na imagem ultra-sonográfica como na
radiografia, fornecendo informações não só a respeito da forma e tamanho,
mas também da textura dos tecidos e da conformação dos órgãos (ETTINGER,
1997).
O útero dilatado apresenta imagem ultra-sonográfica de uma estrutura
tubular bem definida com diâmetro entre 0,5 e 4,0 cm, sendo que essa
condição pode variar de acordo com o relaxamento da cérvix. O conteúdo
luminal uterino apresenta menor ecogenicidade que a parede, com cintilações
ecogênicas bem evidentes (RICHARD e COUTO, 2000; JOHNSTON et al.,
2001; NOAKES et al., 2001; FELDMAN e NELSON, 2004).
Bigliardi et al. (2004), realizaram um estudo ultra-sonográfico com 45
cadelas de idade entre 1 e 15 anos, com suspeita clínica de piometra. O útero
foi avaliado quanto à integridade do endométrio, presença de exudato e,
hiperplasia de glândulas endometriais; esses achados foram correlacionados
com o exame histopatológico. Concluíram que a investigação ultra-sonográfica
é um método útil e fidedigno para avaliar alterações patológicas de útero e que
se constitui em uma ferramenta eficiente para classificar a HEC de graus III e
IV, endometrites, piometra hiperplásica e piometra atrófica, segundo
classificação de De Bosschere (2001).
6
A
2.3.3 Exames hematológicos
Os efeitos sistêmicos da piometra podem ser refletidos nos exames
laboratoriais. Por ser uma doença inflamatória crônica, não é surpreendente o
encontro de uma discreta anemia normocítica normocrômica não-regenerativa,
em função de uma diminuição dos eritrócitos. A septicemia ou toxemia
associadas à síndrome podem ser potentes supressores da medula óssea. A
hiperproteinemia (7,5 a 10,0 mg/dl) e a hiperglobulinemia encontradas
resultam, comumente, da desidratação e/ou estimulação antigênica crônica do
sistema imune (ETTINGER, 1997; RICHARD e COUTO, 2000; JOHNSTON, et
al., 2001; NOAKES, et al., 2001; FRANSSON e RAGLE 2003 FELDMAN e
NELSON, 2004).
De acordo com Ettinger (1997), a contagem de células brancas em
cadelas com piometra é variável, geralmente é observada uma neutrofilia
absoluta (usualmente 25.000 células/mm
3
) com graus variáveis de imaturidade
celular, secundária à infecção e septicemia. Se a infecção for severa e/ou
crônica, pode ocorrer um desvio degenerativo para a esquerda, com presença
de neutrófilos tóxicos. Entretanto, alguns resultados demonstraram que nem
sempre há leucocitose em casos de piometra e que o diagnóstico definitivo
pode não ser correto se depender exclusivamente do achado da leucocitose e
da contagem diferencial das células sanguíneas (FALDYMA et al., 2001)
Nas formas fechadas de piometra a leucocitose tende a ser mais grave,
devido ao acúmulo de material purulento quimiotáxico para neutrófilos,
elevando dessa forma a contagem de leucócitos totais. Com a abertura da
cérvix, existe uma diminuição desses fatores quimiotáxicos, podendo inclusive
levar a valores normais de leucócitos.
Perez et al. (2002), comparando hemograma de cadelas com piometra de
cérvix aberta e fechada relataram que encontraram diferença estatisticamente
significativa para as variáveis bastonetes e hemoglobinas, as quais se
encontravam aumentadas em cadelas com piometra fechada.
2.3.4 Exames bioquímicos
O aspartato amino-transferase (AST) é uma enzima intracelular liberada
de hepatócitos e fibras musculares alterados. A similaridade dos valores de
AST em cadelas normais e com piometra sugere que a função hepática
7
comprometida na piometra raramente inclui dano hepatocelular (ETTINGER,
1997).
Elevados níveis de fosfatase alcalina, bilirrubina e colesterol sérico são
considerados como resultados de colestase intra-hepática. A
hipercolesterolemia foi positivamente associada à concentração de fosfatase
alcalina (FA), que por sua vez foi mais pronunciada em pacientes
completamente anoréxicos e especialmente em animais obesos (ETTINGER,
1997).
Dentre as alterações provocadas em outros órgãos pela piometra, a que
mais se salienta é a disfunção renal caracterizada pela filtração glomerular
reduzida e disfunção tubular (ETTINGER, 1997; FELDMAN e NELSON, 2004;
ZARAGOSA et al., 2004). Na fase inicial da doença, a densidade da urina
pode ser maior do que 1.030, simplesmente refletindo a desidratação e uma
resposta fisiológica à conservação de fluidos. A injúria dos túbulos renais
causadas por imunocomplexos é um dos mecanismos propostos para explicar
a poliúria/polidipsia.
Provavelmente como resultado dos diabetes insipidus secundária renal
reversível, a urina torna-se progressivamente mais diluída com densidade entre
1.008 e 1.015 (ETTINGER, 1997; ZARAGOSA et al., 2004).
2.4 Diagnóstico
A suspeita de HCE/piometra é dada pela história clínica e pelos achados
físicos (ETTINGER, 1997; FOSSUM, 2001). O aumento de volume uterino
pode ser palpável, mas preconiza-se sua comprovação por radiografia ou ultra-
sonografia (FERREIRA e LOPES, 2000). Devem ser realizados exames
complementares como: hemograma completo, perfil bioquímico e urinálise para
a detecção de anormalidades metabólicas associadas à septicemia e avaliação
da função renal (; RICHARD e COUTO, 2000; FRANSSON e RAGLE, 2003;
FELDMAN e NELSON, 2004). A vaginoscopia pode ser recomendada, pois,
permite a visualização da mucosa vaginal e a constatação de sinais de
inflamação, presença de massas e a determinação da origem da secreção
vulvar (FERREIRA e LOPES, 2000).
8
O diagnóstico diferencial inclui mucometra, hidrometra, vaginites, metrites,
torção uterina e peritonite (FOSSUM, 2001) e afecções acompanhadas de
síndrome poliúria, polidipsia tais como: diabetes mellitus, Síndrome de
Cushing, nefrite crônica (GILBERT, 1992).
Hagman et al. (2006) mensuraram metabólicos de prostaglandina F2α
para diferenciar a piometra da HEC-mucometra. Verificaram que animais com
piometra possuem níveis plasmáticos de metabólicos de prostaglandina muito
superiores aos animais com HEC-mucometra. Concluíram, desta forma, que a
análise deste metabólico é um valioso método de diagnóstico e predição para
severidade da doença.
2.5 Tratamentos
O tratamento cirúrgico é o mais indicado, a menos que o proprietário
insista na manutenção da atividade reprodutiva da fêmea (FERREIRA e
LOPES, 2000) e deve ser instituído imediatamente, pois a septicemia pode se
desenvolver a qualquer momento, se ainda não estiver presente. Por ser um
tratamento, na maioria das vezes de emergência, a cirurgia é mais eficiente,
segura e a única que permite êxito duradouro.
Cadelas com toxemia grave devem ser tratadas com fluídos politônicos e
antibióticos de amplo espectro, antes de serem submetidas a ovário-
histerectomia (FANTONI et al., 1999; LOPES e BICUDO, 2002).
2.5.1 Tratamento Cirúrgico
A fluidoterapia intravenosa é indicada na correção dos déficits existentes,
para manter a perfusão tecidual adequada e para melhorar a função renal
(FERREIRA e LOPES, 2000). Deve-se também administrar um antibiótico de
amplo espectro eficaz contra E.coli, tais como: cefazolina, cefoxitina,
amoxicilina mais clavulanato, ampicilina ou trimetropin-sulfonamidas. Os
aminoglicosídeos são nefrotóxicos e não são recomendados devido à
prevalência de disfunção renal junto com piometra (FOSSUM, 2001).
Após a cirurgia deve-se continuar com terapia de suporte como fluído e
antibiótico por sete a 10 dias. No entanto, a maioria dos animais demonstra
grande melhora após a remoção do útero, se não houver contaminação
abdominal (BIRCHARD, 1998; FOSSUM, 2001; LOPES e BICUDO, 2002). O
9
controle da função renal e hepática é recomendado, visto que algumas fêmeas
podem apresentar insuficiência renal no período pós-operatório em função da
sobrecarga renal e hepática logo depois da eliminação dos anestésicos e
muitas vezes, o rim já pode estar acometido por uma glomerulonefrite,
complicando ainda mais o funcionamento desse órgão (WANKE e GOBELLO,
2006).
2.5.2 Tratamento terapêutico
O tratamento médico para piometra pode ser apropriado em cadelas com
alto valor zootécnico, que apresentem condições sistêmicas. (NOAKES et al.,
2001).
A terapia da piometra se baseia no uso de agentes farmacológicos para
reduzir a concentração plasmática de progesterona, relaxar a cervix e
promover contração miometrial, resultando em drenagem do conteúdo uterino.
O agente farmacológico mais usado e de resposta mais consistente é a
prostaglandina. Juntamente ao tratamento com prostaglandina devem ser
administrados antibióticos bactericidas de grande espectro, sistêmico que
podem ser determinados por cultivo e sensibilidade (JOHNSTON, et al., 2001;
NOAKES, et al. 2001; FOSSUM, 2001; FRANSSON e RAGLE, 2003).
A prostaglandina F2α (PGF 2α) age proporcionando dilatação cervical,
contração miometrial e em doses altas, luteólise. Os efeitos colaterais da
terapia com prostaglandina são observados rotineiramente, especialmente nas
administrações iniciais. Eles incluem inquietação, respiração ofegante, vômito,
defecação, taquicardia, febre, dor abdominal e salivação. Podem-se reduzir
empiricamente os efeitos colaterais, através de uma caminhada com animal 30
minutos após cada injeção (BIRCHARD, 1998).
Hafez (2002) relatou que o protocolo usado em cadelas é de 0,1 - 0,25
mg/kg de PGF2α subcutâneo, uma vez ao dia, por três a cinco dias. A duração
da terapia é ditada pela resposta, à medida que ocorre a redução do tamanho
uterino. O tipo de corrimento vaginal geralmente mudará para seroso ou sero
sanguinolento antes de desaparecer completamente.
Fransson e Ragle (2003) relataram a administração de PGF2α, intra-
vaginal, usando cateter plástico estéril, na dose de 0,15 mg/kg e obtiveram
sucesso em 13 de 15 cadelas tratadas. Em casos de cadelas refratárias a
10
PGF2α ou com cervix fechada, a drenagem foi realizada usando cateter
plástico no lúmen do útero colocado através da vagina, neste experimento,
nove de 12 cadelas apresentaram bons resultados.
Outros protocolos são descritos para o tratamento de piometra. A
utilização de anti-progestágenos como o RU46534 e aglepristone causam
aumento da contratilidade miometrial e relaxamento cervical, auxiliando no
tratamento (JOHNSTON et al., 2001; NOAKES et al., 2001).
Inibidores da prolactina (cabergolina) na dose de 5,0 µg/kg/dia associado
ao cloprostenol 5,0 µg/kg a cada dois dias durante 10 dias foi descrito com
sucesso (NOAKES et al., 2001).
Corrada et al. (2006), relataram o tratamento de 29 cadelas com
diagnostico de HEC, utilizando diariamente cabergolina na dose de 5 µg/kg VO,
associado ao cloprostenol 1µg/kg SC de 7 a 14 dias. Junto com esse
tratamento os animais receberam antibióticos e fluidoterapia. Vinte e quatro
animais estavam curados entre os dias sete e 14 de tratamento. O diâmetro
uterino começou a diminuir três dias após o inicio do tratamento e continuou
gradativamente até voltar ao tamanho normal por volta do dia 14. Houve
recidiva em seis dos 29 animais.
England et al. (2007) trataram 22 cadelas com diagnóstico de piometra
utilizando a combinação de 5 µg/kg de cabergolina ao dia, com 5 µg/kg de
cloprostenol a cada três dias e sulfonamida, duas vezes ao dia. O perfil
hematológico de 21 cadelas voltou ao normal com seis dias de tratamento, já o
perfil bioquímico em 9 dias; 19 cadelas estavam controladas com 10 dias de
tratamento, duas precisaram de mais três dias e uma cadela com torção parcial
de útero foi realizada cirurgia. Onze de vinte e um animais tratados com
sucesso foram acasalados no estro seguinte, sendo que sete, ficaram prenhes.
Quatro cadelas tratadas apresentaram recorrência de piometra, após o cio
seguinte.
Trasch et al. (2003) utilizaram aglepristone como tratamento terapêutico
de piometra. Relataram que 92,8% das cadelas estavam curadas após três
semanas do inicio do tratamento. Uma fêmea morreu de insuficiência renal e
três não apresentaram corrimento vaginal, assim, a OSH foi recomendada; os
autores concluíram que esse tratamento apresenta uma alta taxa de cura.
11
Fieni (2006) avaliou a eficácia do aglepristone (10 mg/kg nos dias 1, 2 e,
8) para o tratamento de metrite ou piometra em cadelas, com ou sem adição de
baixas doses de cloprostenol (1µg/kg) por cinco dias (dias 3 a 7). Exames
foram realizados nos dias 8,14 e 28, 90, onde foi determinado que a melhora
no tratamento foi mais eficaz entre os dias 14 e 28 em 54 de 67 cadelas. Em
cadelas que não estavam curadas, foi repetido o aglepristone nos dias 14 e 28.
O aglepristone sozinho curou 15 de 15 cadelas com metrite. Em cadelas com
piometra de cervix fechada, houve abertura da mesma, 48 horas após a
administração do aglepristone. De 52 cadelas com piometra de cervix aberta ou
fechada, com o tratamento adicional de cloprostenol entre os dias 3 a 7,
tiveram um aumento significativo na cura, quando comparados com os animais
sem cloprostenol (p<0,05). A contagem de leucócitos e a concentração
plasmática de progesterona diminuíram ao longo do tratamento. A taxa de
recorrência depois de 12 e 24 meses foi de 13% e 19%, respectivamente.
2.6 Prognóstico
O prognóstico da piometra pode variar de reservado a mau, dependendo
da fase de evolução da doença, da função renal e da toxicidade sistêmica
(FOSSUM, 2001).
Do ponto de vista ginecológico é grave, pois os animais são incapazes de
se reproduzirem. Do ponto de vista vital, também é considerado grave, mas
certas observações permitem atenuá-las; os elementos que agravam este
prognóstico é o estado de desidratação, choque, a insuficiência renal e o tempo
da existência da lesão (BIRCHARD, 1998).
O prognóstico para terapia medicamentosa é dependente do relaxamento
cervical, se a piometra é aberta, o prognóstico é bom, mas se a piometra é
fechada o prognóstico é de reservado a mau. Contudo, uma vez que o animal
tenha sido tratado de piometra com prostaglandina, a recidiva é provável
(BIRCHARD, 1998). Segundo Smith (2006) os animais tratados deverão ser
submetidos a uma cultura vaginal, nos cinco primeiros dias do pro-estro
seguinte. Deverão ser tratados com antibióticos e desta forma aumentaremos
as chances de gestação. A taxa de sucesso desse procedimento é de 50 a
65%.
12
2.7 Avaliação de receptores hormonais
O avanço nas técnicas imunoistoquímicas e nas áreas de biotecnologia
molecular, tem auxiliado os pesquisadores a entenderem as relações de causa-
efeito envolvidas na etiopatogenia de diversas doenças. Este fato se deve
principalmente a possibilidade de se avaliar, em um dado momento, diferentes
eventos específicos relacionados à biologia celular, em um determinado tecido
alvo. Estes eventos podem ser avaliados sob os pontos de vista qualitativo e
quantitativo, por meio de instrumentos baseados em microscopia óptica, bem
como por meio de técnicas moleculares simultaneamente.
2.7.1 Avaliação molecular de receptores hormonais
Toshio et al. (2002) estudaram as relações entre a expressão de mRNA
da enzima citocromo P450 aromatase (P450arom) na área mediobasal do
hipotálamo, a atividade ovariana da aromatase e a secreção de estrógeno, ao
longo do ciclo estral de cadelas da raça Beagle. Usando a reação em cadeia de
polimerase (PCR), detectaram o gene transcrito para a P450arom no
hipotálamo de cadelas. Os níveis de mRNA da P450arom no hipotálamo
aumentaram durante a progressão do anestro e declinaram posteriormente. A
atividade ovariana de P450arom foi mensurada e constatada concentração
baixa no anestro, com aumento no pro-estro e um declínio posterior. A
atividade ovariana de P450arom e os níveis plasmáticos de 17β estradiol se
correlacionaram positivamente (r=0,77 e P<0,05). Esses resultados sugerem
que o aumento da expressão gênica da enzima P450arom no hipotálamo está
associado com o término do anestro.
Hewitt e Korach (2003) consideraram o estrógeno como um importante
modulador das funções reprodutivas normais de mamíferos; desta forma,
estudos bioquímicos, fisiológicos e genéticos têm colaborado para o
esclarecimento dos mecanismos básicos de ação estrógeno. O estrógeno
circulante penetra em células específicas, que contém moléculas de receptores
de estrógeno (ER). Na ausência de estrógeno sérico o ER associa-se a uma
molécula co-repressora, a qual inibe a atividade de transcrição do ER. A
ligação do estrógeno sérico causa uma mudança de conformação na molécula
do ER levando a dissociação dos co-repressores e permitindo o recrutamento
13
dos co-ativadores. Os co-ativadores são moléculas que interagem com o ER e
aumentam a taxa de transcrição dos genes que contém ligações fortes com as
seqüências de DNA do ER (EREs).
Os ERs são membros de uma família de receptores nucleares (NR) que
são moduladores de transcrição. Os NRs modulam a transcrição por interação
com seqüências regulatórias de DNA que ligam-se discriminadamente a uma
classe particular de NRs, bem como, com moléculas co-ativadoras e co-
repressoras, visando regular a atividade do complexo RNA polimerase. Outros
exemplos de membros da família NR incluem receptores de hormônios
esteróides adicionais como receptores de progesterona e andrógeno,
receptores para vitaminas e metabólitos, receptores para vitamina D e ácido
retinóico, entre outros (HEWITT e KORACH, 2003).
No caso do ER duas moléculas receptoras têm sido identificadas. O ERα
é encontrado em todos os tecidos reprodutivos, é o mais abundante e foi o
primeiro ER a ser identificado. O ERβ é o produto de um gene diferente e
guarda uma pequena similaridade com a molécula do ERα. No entanto, ambos
ERα e ERβ ligam-se ao estradiol e interagem com as seqüências ERE. Ambos
os receptores têm suas atividades transcricionais distintas, com o ERβ
mostrando uma atividade menos potente que o ERα na maioria do contexto,
assim como, na capacidade de inibir a atividade do ERα. A expressão do ERβ
é mais abundante no ovário, útero, tecido neural, bem como em tecidos
reprodutivos de macho em ratos. No ovário de rata o ERα é expresso
primariamente nas regiões das células da teca e intersticial, enquanto que o ER
β é expresso nas células da granulosa, indicando que embora ambos os ERs
estejam presentes no ovário, não estão presentes nas mesmas células
(HEWITT e KORACH, 2003).
Tani et al. (1997) visando elucidar mudanças na expressão de mRNA de
ER no hipotálamo de cadelas em diferentes fases do ciclo estral, conduziram
dois experimentos com cadelas Beagles normais. No primeiro experimento,
foram determinados os níveis de LH plasmáticos, estradiol e progesterona
séricos, bem como os níveis de mRNA para ER durante o ciclo estral sendo os
animais divididos em seis grupos: início, meio e fim de anestro, pro-estro, estro
14
e diestro. No segundo experimento o efeito do estradiol sobre a expressão de
mRNA de ER foi examinado em animais submetidos a ovariectomia no meio do
anestro. Duas semanas após a cirurgia os animais receberam injeções de 0
(controle), 10 ou 50 µg/kg de benzoato de estradiol. Os resultados do primeiro
experimento demonstraram que houve um aumento dos níveis de mRNA para
ER da fase inicial até o final do anestro. A partir do final do anestro os níveis de
mRNA para ER reduziram no pro-estro, e apresentaram as menores
concentrações nas fases de estro e diestro. Os níveis de LH no plasma e os
níveis de mRNA para ER se correlacionaram positivamente durante as fases
de anestro e pro-estro (r=0,94). Os níveis de E2 aumentaram significativamente
do final do anestro até o final do pro-estro e decresceram significativamente do
estro para o diestro (P<,001). Os níveis de P4 foram baixos durante o anestro e
pro-estro e aumentaram significativamente a partir do pro-estro até o diestro.
No experimento dois, os níveis de mRNA para ER no hipotálamo foram
relativamente baixos e aumentaram significativamente depois do tratamento
com 10 µg/kg de benzoato de estradiol (P<0,01). Para dose de 50 µg/kg de
benzoato de estradiol, entretanto, não foram verificados resultados
significativos (P>0,05) quando comparados ao grupo controle.
Hatoya et al. (2003) mensuraram os níveis de mRNA dos receptores de
estrógeno α (REα) e β (REβ) no hipotálamo, na hipófise anterior e nos ovários
de cadelas da raça Beagle nas diferentes fases do ciclo estral. Por meio de RT-
PCR quantitativo, utilizando a subunidade 18S ribossomal como constitutivo na
expressão dos REα e REβ, detectaram transcritos de REβ em todas as
amostras de tecido. Os níveis hipotalâmicos e hipofisários de mRNAs para RE
α e REβ aumentaram na metade do anestro até o pro-estro e declinaram
posteriormente. No ovário, os níveis de mRNA do REα aumentaram do pro-
estro até o diestro e apresentaram uma correlação positiva com os níveis
plasmáticos de progesterona (r=0,62 e P<0,01). Os níveis de mRNA do REβ
aumentaram da metade do anestro até o pro-estro e tiveram correlação positiva
com os níveis de 17 β estradiol plasmático ( r=0,73 e P<0,001). Pelos
resultados, os autores sugerem que o aumento de mRNAs de REα e REβ no
hipotálamo e hipófise estão associados com o término do anestro, e que o
15
aumento de mRNAs para os REα e REβ nos ovários podem estar envolvidos
com o desenvolvimento folicular e a formação do corpo lúteo.
2.7.2 Avaliação imunoistoquímica de receptores hormonais
Estudos têm avaliado a regulação positiva de receptores de hormônios no
endométrio que conduzem a uma resposta exagerada para progesterona,
estrógeno ou andrógeno, como componente importante no desenvolvimento da
piometra (COCK et al., 1997; VERMEIRSCH et al. 1999).
Cock et al. (1997) com a finalidade de comparar a presença de receptores
de estrógeno no útero de cadelas normais e com HCE, realizaram
imunoistoquímica, utilizando anticorpos monoclonais anti-receptores hormonais
humanos. Concluíram que concentrações anormais de receptores de estrógeno
foram importantes no desenvolvimento do complexo HCE, mas provavelmente,
não são os únicos fatores relacionados à etiologia dessa alteração. Sugeriram
ainda, que a avaliação de receptores de outros hormônios, principalmente
receptores de progesterona poderia trazer informações valiosas.
Vermeirsch et al. (1999) estudaram a concentração dos receptores de
estrógeno durante as fases do ciclo estral nos cornos uterinos, corpo uterino e
cervix. Foi observada uma correlação negativa entre as concentrações de
receptores medidos em escores nos cornos uterinos e os níveis de
progesterona sérica. Foi observado também, um escore maior nos cornos
uterinos durante a fase de pro-estro, com diminuição durante o estro e uma
concentração mais baixa ainda no início do metaestro. Durante a fase de
anestro foram observados escores altos para esses receptores, indicando uma
sensibilidade estrogênica no estágio de quiescência sexual.
Vermeirsch et al. (2000) trabalhando com imunoistoquímica, detectaram a
presença de receptores de estrógeno e progesterona em útero de cadelas
prenhes, incluindo a placenta e o útero pós-parto. Relataram uma marcação
pequena de receptores de estrógeno nos diferentes tipos celulares de úteros
gestantes e no pós-parto. Para o receptor de progesterona a marcação foi
ausente ou fraca nas células epiteliais. Entretanto, uma marcação moderada foi
encontrada em células do estroma endometrial e miométrio, tipos celulares que
desempenham um papel importante na manutenção da gestação. As células
16
estromais são freqüentemente mais marcadas para os receptores de estrógeno
e progesterona do que as células epiteliais, indicando que ambos os hormônios
podem agir indiretamente nas células epiteliais, via células estromais. Os
autores não observaram diferença na distribuição de receptores de
progesterona no tecido uterino entre gestação e o pós-parto, sugerindo que
durante o parto existe um decréscimo nos níveis de progesterona sérica e
concomitantemente um incremento na taxa de estrógeno/progesterona. Essas
alterações são provavelmente mais importantes do que o declínio nos
receptores avaliados.
Na placenta, as células fetais não mostraram evidência de receptores de
estrógeno ou progesterona. Em contraste, ambos receptores estavam
presentes nas células mesenquimais materna que estão localizadas ao redor
da membrana dos vasos sanguíneos. Estas células mostraram sinais de
decidualização (Vermeirsch et al. 2000).
De Bosschere et al. (2001) objetivando estudar as alterações histológicas
no útero de cadelas, trabalharam com cortes histológicos de útero de 26
cadelas saudáveis e 42 fêmeas com suspeita clínica de piometra. Concluíram
que o complexo HCE/piometra pode ser dividido em duas classes: 1) complexo
hiperplasia cística endometrial/mucometra e 2) um complexo
endometrite/piometra. O complexo endometrite/piometra não necessariamente
é seguido do complexo hiperplasia cística endometrial/mucometra, podendo,
entretanto surgir conjuntamente.
Vermeirsch et al. (2002) com o objetivo de estudar receptores de
andrógeno em útero de cadelas, trabalharam com material de 33 animais
saudáveis submetidas a histerectomia. Descreveram a distribuição dos
receptores de andrógeno nos cornos uterinos, corpo e cérvix durante os
diferentes estágios do ciclo estral. Os autores sugeriram que a expressão basal
de receptores de andrógeno no útero de cadelas durante o ciclo estral pode
não ser influenciada por hormônios esteróides sexuais.
De Bosschere et al. (2002) trabalharam com a expressão de receptores
de estrógeno e progesterona em útero de cadelas com complexo hiperplasia
endometrial cística-mucometra (HEC/M) e endometrite/piometra (E/P), em
animais que foram tratados com progestágeno. Observaram que no grupo de
animais com HEC/M os escores de receptores de estrógeno e progesterona
17
foram maiores dos que nos animais com útero normal. Já para o receptor de
estrógeno no grupo E/P os escores foram significativamente menores que em
animais com útero normal e HEC/M. Para os receptores de progesterona foi
observado no grupo E/P uma tendência maior nos escores do que em animais
com útero normal. As cadelas tratadas com progestágenos que apresentavam
HEC/M ou E/P mostraram escores menores de receptores de estrógeno e
progesterona, nas diferentes camadas do útero, quando comparadas com
animais não tratados.
Dhaliwal et al. (2002) estudaram o efeito da escarificação endometrial
sobre receptores de estrógeno e progesterona, mudanças na estrutura
histológica e flora uterina. A base do corno uterino de seis cadelas nulíparas,
foi escarificada, no início do metaestro, bem como foram realizados swabs para
cultura. Após 21dias foi realizada a ovário-histerectomia dos animais.
Observaram que em todos os swabs não houve crescimento bacteriano e em
três das seis cadelas foram relatadas mudanças como distensão do lúmen com
secreção e distensão nas glândulas endometriais do segmento escarificado.
Não foram encontradas diferenças significativas nos escores de receptores de
estrógeno e progesterona entre os segmentos escarificados e não
escarificados, exceto para o receptor de progesterona no epitélio glandular em
que os valores para os segmentos de endométrio escarificados foram
significativamente superiores. Concluíram então, que o trauma pode modificar
a estrutura do endométrio e as características dos receptores de progesterona.
De Bosschere et al. (2003) induziram piometra em cinco cadelas por meio
de inoculação intra-luminal de Escherichia coli, na fase de metaestro, em
apenas um corno uterino, sendo que o outro corno serviu como controle. Por
meio de imunoistoquímica demonstraram que a expressão dos receptores
hormonais nos cornos uterinos inoculados correspondeu com a expressão de
sintomas de piometra espontânea. Concluíram neste estudo que as mudanças
uterinas se devem a uma interação ovário, útero e bactérias que possivelmente
são responsáveis pela hiperplasia no corno inoculado e inatividade no corno
não inoculado.
Kida et al. (2006) estudaram a expressão da lactoferrina no útero de
cadelas com piometra e nas diferentes fases do ciclo estral. Foram
encontradas diferentes marcações de lactoferrina nas células do epitélio
18
luminal e glandular do endométrio nas fases de pro-estro e estro, mas
pequenas marcações foram detectadas até o décimo dia de diestro. Nas
cadelas com piometra, células do epitélio glandular e estroma uterino foram
fortemente marcadas. Quando correlacionados com os níveis de estradiol, os
resultados sugeriram que a expressão da lactoferrina e concentrações séricas
de estrógeno estão relacionadas: na fase inicial do diestro ocorre uma redução
drástica da expressão dessa proteína possivelmente prejudicando o sistema de
defesa antimicrobiano.
Bianchi et al. (2006) avaliaram por meio de biopsia uterina, receptores de
estrógeno e progesterona no endométrio de lhamas durante a fase folicular
(FF) e luteal (FL) do ciclo estral. Demonstraram que os receptores estrogênicos
α (REα) e receptores de progesterona (RP) são maiores durante a fase folicular
do que durante a fase luteal, sugerindo que, como em outros ruminantes, o
estrógeno regula positivamente ambos os receptores enquanto que a
progesterona tem um efeito oposto. Além disso, os resultados suportam a
hipótese de que a regulação de receptores esteróides reprodutivos é tipo
células-específicas nesta espécie.
19
3.OBJETIVOS
3.1 Objetivo Geral
O presente estudo teve por objetivo geral contribuir para um melhor
entendimento da etiopatogenia do complexo HEC/piometra em cadelas, por
meio de determinações das concentrações dos hormônios estrógeno e
progesterona plasmáticos, avaliações histopatológicas e imunoistoquímica
do tecido uterino e pela quantificação da expressão gênica de receptores
dos hormônios sexuais, em animais normais e portadores de piometra.
3.2 Objetivos específcos
Os objetivos específicos foram:
(i) Avaliação das concentrações de estrógeno e progesterona
plasmáticos, nos diferentes fases do ciclo estral, em animais
normais e com piometra;
(ii) Avaliação histopatológica do tecido uterino de animais
normais e com piometra;
(iii) Avaliação por meio de técnica imunoistoquímica dos
receptores de estrógeno e progesterona em animais normais
nos diferentes fases do ciclo estral e com piometra
(iv) Identificação, quantificação e diferenciação da expressão
gênica de receptores de estrógeno e progesterona, no útero
de animais normais, nas diferentes fases do ciclo estral e em
animais com piometra;
(v) Avaliação das inter-relações existentes entre os achados
moleculares, hormonais e o perfil imunoistoquímico dos
animais normais, nas diferentes fases do ciclo estral e em
animais acometidos pela piometra.
20
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1Animais
Foram utilizadas 51 fêmeas caninas submetidas à ovario-histerectomia
(OSH), realizadas no Hospital Veterinário “Vicente Borelli” da UNIFEOB, em
São João da Boa Vista-SP. Das 51 fêmeas utilizadas, 30 foram obtidas em
campanhas de controle populacional e 21 com diagnóstico clínico de piometra,
realizado por meio de exame clínico, radiológico e ultra-sonográfico. Os
animais foram divididos em dois grupos: 1) animais normais (grupo controle),
constituídos de fêmeas, adultas, em diferentes fases do ciclo estral e 2)
animais com piometra (grupo experimental), formado por cadelas com
diagnóstico clínico de piometra. As fases do ciclo estral foram determinadas
pelo histórico clínico anterior, citologia vaginal e dosagem de progesterona
sérica.
4.2 Dosagem sérica de progesterona e estrógeno
Amostras de sangue foram colhidas imediatamente antes da OSH para
determinação dos níveis séricos de progesterona e estradiol. Foi utilizado o
contador Auto Gamma / Cobra II, Packard Bioscience Company, usando a
técnica de radioimunoensaio em fase sólida, por meio dos kits comerciais de
Progesterona e Estradiol COAT-A-COUNT
, DPC – Med Lab. A detecção limite
para progesterona e estradiol foram 0,01233 ng e 0,013 pg, respectivamente. O
coeficiente intra-ensaio foi menor que 8,61% para progesterona e 18,5% e
estradiol. Os animais de cada grupo (normais e com piometra) foram
classificados nas diferentes fases do ciclo estral com base no perfil hormonal
da progesterona, conforme Feldman e Nelson (2004).
4.3 Citologia Vaginal
Imediatamente antes da OSH foram colhidas amostras do epitélio vaginal
para citologia. A citologia vaginal foi realizada com um swab previamente
umidificado com solução fisiológica e, posteriormente introduzido pela
comissura dorsal da vulva, em um ângulo de 45º. O swab foi introduzido o mais
profundamente possível e rotacionado nas paredes da vagina. Após, o material
21
foi imediatamente transferido para uma lâmina de vidro previamente limpa. A
fixação das lâminas foi realizada com álcool absoluto e posteriormente coradas
com Panótico Rápido
. As amostras foram examinadas em microscopia de luz,
onde 100 células foram quantificadas e classificadas de acordo com a sua
morfologia em células parabasais, intermediárias, superficiais e escamas de
acordo com Johnston et al (2001).
4.4 Exame histológico
Após a OSH, amostras de tecido de ambos os cornos uterinos foram
colhidas e fixadas em solução tamponada a 10% de fosfato de formoldeído por
24 horas e processados rotineiramente para análise histológica. As amostras
foram incluídas em parafina, cortadas até 5 µm e coradas com HE
(hematoxilina/eosina) e examinadas histologicamente usando o critério
previamente descrito por Banks (1992).
4.5 Avaliação da expressão gênica dos receptores de hormônios sexuais
por meio de PCR em tempo real
As análises de expressão gênica dos receptores de estrógeno e
progesterona foram realizadas por meio de tecido endometrial, no Laboratório
de Fisiologia Molecular Ovariana no Departamento de Fisiologia do Instituto de
Biociências da UNESP em Botucatu-SP.
4.5.1 Extração do RNA e reação de transcrição reversa
Amostras uterinas foram coletadas e armazenadas individualmente em
nitrogênio líquido até o momento da extração do RNA. O RNA total foi
recuperado a partir de 50-100 mg de tecido uterino imerso em 1ml de solução
Trizol (Invitrogen). Cada amostra de tecido uterino foi triturada em
homogenizador de tecidos (Polytron UltraTurrax T-25), incubada em
clorofórmio 20%, homogeneizada e centrifugada. O sobrenadante foi
transferido para outro tubo em que foi adicionado solução de
clorofórmio:butanol (4:1), homogeneizado e centrifugado. O RNA foi precipitado
com isopropanol (-20°C) e após centrifugação o pellet foi lavado com etanol
75%, seco e diluído em água ultra-pura tratada com dietil pirocarbonato
22
(DEPC). A concentração do RNA total recuperado foi mensurada por
espectrofotometria (Biophotometer-Eppendorf).
Após a mensuração, 1µg do RNA total de cada amostra uterina foi
transcrita reversamente em reações de 20 µl contendo: 1 µl de SuperScript III
(Invitrogen
™
) (200U/µl), 1μl de oligo dT(12-18Ts) (10μM), 2 μl de dNTPs
(2,5mM cada), 2μl de DTT (0,1 M), 1 μl de RNaseOUT
®
(40 U/μl; Invitrogen
™
) e
4 μl de tampão 5X. As reações foram realizadas a 42ºC por 15 minutos, 50ºC
por 50 minutos e 70ºC por 15 minutos para inativação da enzima.
4.5.2 Caracterização do perfil de expressão gênica por PCR em tempo
real
As análises de PCR em tempo real foram realizadas utilizando o sistema
de detecção ABI Prism
®
7500 (Applied Biosystems), em placas de 96 poços
seladas com adesivos ópticos (Applied Biosystems). O desenho e a construção
dos primers para os genes dos receptores de estrógeno alfa (α), beta (β) (ER-α
e ER-β respectivamente) e progesterona (PR) foram realizados com o auxílio
do programa Primer Express™ (Applied Biosystems). Como gene referência
utilizou-se a proteína ribossomal S5 (RPS5) descrita Brinkhof et al. (2006). Na
Tabela 1, são apresentados às seqüências dos oligonucleotídeos iniciadores
(primers) utilizados na PCR em tempo real para amplificação dos genes ER-α,
ER-β, PR e RPS5.
Todas as reações foram preparadas utilizando Power Sybr Green
®
PCR
Master Mix (Applied Biosystems), em 25 µl de volume total. As condições de
amplificação foram: 95°C por 10 minutos, 40 ciclos de 95°C por 15 segundos,
60°C por 1 minuto seguido por curva de dissociação.
23
TABELA 1. Seqüências dos oligonucleotídeos iniciadores utilizados no PCR em
tempo real para amplificação dos genes ERα, ERβ, PR e RPS5.
Genes Seqüências Fragmentos
RPS5 S 5’ TCACTGGTGAGAACCCCCT 3’
A 5’ CCTGATTCACACGGCGTAG 3’
141pb
Erα S 5’ AAC GCC TCT GTC TCG TCT GT 3’
A 5’ GTA CTC AAT GCT CCC CTG GA 3’
113pb
ERβ S 5’ TCCCAGCAGTGCCAATAACTCAGA 3’
A 5’ TGCATACAGAAGTGACGACTGGCA 3’
127pb
PR S 5’ CAAACATGTCAGTGGGCAGATGC 3’
A 5’ CTGCCACATGGTGAGGCATAATGA 3’
106pb
S = “sense”; A = “antisense”; pb = pares de bases
4.5.3 Determinação da expressão gênica relativa
A expressão relativa dos produtos de PCR foi determinada pela equação
descrita por Pfaffl et al. (2001):
)(
)(
)(
)(
amostracontroleCt
referência
amostracontroleCt
alvo
refeência
alvo
E
E
Razão
−∆
−∆
=
em que,
Razão = é a expressão relativa entre o gene alvo e o gene referência;
E
alvo
= é a eficiência da reação de PCR em tempo real do gene alvo;
E
referência
= é a eficiência da reação de PCR em tempo real do gene referência,
ΔCt
alvo
= é desvio de (Ct do controle – amostra do gene alvo transcrito);
ΔCt
referência
= é desvio de (Ct do controle – amostra do gene referência
transcrito).
A média de Ct das amostras de cadela do grupo saudáveis em anestro,
foi utilizada como grupo controle para as comparações entre os outros grupos
amostrais.
24
As eficiências (E) de cada reação de amplificação foram calculadas como
descrita por Rasmussen (2001) segundo a equação:
E=10
[-1/slope]
em que,
slope = é o coeficiente de regressão da curva padrão gerada pela diluição
seriada e calculada automaticamente pelo programa de análise ABI Prism
®
7500 (Applied Biosystems).
Para a construção da curva padrão, quatro diluições seriadas (1:1, 1:2,
1:4, 1:8) foram produzidas para padronização das condições de amplificação.
Todas as amostras uterinas e as diluições padrão foram corridas em duplicata.
A eficiência de cada gene foi calculada pela média das eficiências individuais
de cada tubo utilizando os dados de fluorescência por ciclo de amplificação no
programa LinRegPCR (RAMAKERS et al., 2003).
4.6 Exame de imunoistoquímica para receptores de estrógeno e
progesterona
4.6.1 Padronização da técnica de imunoistoquímica
Os exames de imunoistoquímica foram realizados no Laboratório de
Imunoistoquímica – Departamento de Patologia Veterinária da UNIFEOB em
São João da Boa Vista/SP.
A padronização da técnica de imunoistoquímica foi testada e
fundamentada no princípio da aplicação do polímero marcado com enzima
peroxidase horseradish (HRP), um sistema livre do complexo estreptavidina-
biotina. Para tal foram confeccionados cortes de tecido uterino com 4µm de
espessura. Estes cortes foram distendidos em lâminas histológicas
previamente sinalizadas em organosilano, com o objetivo de promover uma
melhor adesão dos cortes teciduais às lâminas. Em seguida, as lâminas
permaneceram em estufa durante 24 horas, sendo conservada a temperatura
entre 55 e 58ºC.
25
Subseqüentemente, as lâminas foram colocadas em uma cuba de vidro e
diafanizadas em xilol, sendo realizados dois banhos: um de trinta minutos e
outro de vinte minutos a 37ºC. Ainda nessa fase, foram realizadas duas
lavagens rápidas em álcool 95º, para eliminação do excesso de xilol, três
passagens de cinco minutos em álcool absoluto, um banho de cinco minutos
em álcool 95º e um em álcool 85º (cada banho tinha duração de 5 minutos). A
fim de retirarem-se os pigmentos de formol, as lâminas permaneceram 10
minutos submersas em hidróxido de amônia a 10%. Para a hidratação dos
cortes, o material foi lavado em água corrente por 10 minutos e banhado duas
vezes em água destilada.
A recuperação antigênica constitui uma etapa essencial ao êxito da
técnica de imunoistoquímica e tem o propósito de liberar os epítopos
antigênicos do tecido, bloqueados pela solução fixadora (formol tamponado a
10%). Para a padronização da técnica e otimização dos anticorpos testados
neste estudo (Tabela 2), empregaram-se as seguintes soluções tampão na
recuperação em banho-maria a alta temperatura (95ºC): a) citrato 10 mM, pH
6,0; e b) EDTA 100 mM, pH 8,0 (Tabela 3).
As lâminas foram organizadas paralelamente em cubas de vidro
horizontal, submersas na solução tampão, pré-aquecida a 95ºC e incubadas
em banho-maria durante 20 minutos, na mesma temperatura. Após rápido
arrefecimento do material, seguiu-se com lavagem em água corrente (10
minutos) e duas passagens em água destilada.
A fase seguinte consistiu do bloqueio da peroxidase endógena, por
incubação das lâminas em solução de água oxigenada 10 volumes, durante 20
minutos e com uma troca desta solução no intervalo de dez minutos. O material
foi então lavado em água corrente por 10 minutos, mais duas vezes em água
destilada e duas vezes em TRIS; 5 minutos cada lavagem.
Na seqüência testaram-se os anticorpos primários para receptores de
estrógeno e progesterona, diluídos em solução de BSA a 1%, inicialmente na
concentração de 1:50. Após a diluição, cobriram-se os cortes com os
anticorpos primários, os quais foram incubados em câmara úmida por 18 horas
(“overnight”) à temperatura de 4ºC.
26
TABELA 2. Anticorpos e suas características de marcação celular utilizados na
padronização da técnica de imunoistoquímica
Anticorpo Tipo Laboratório Marcação
E
2
″
M- clone 1D5 Dako/M7047
N
••
/EE
E
2
″
Policlonal Labvision/ER/Ab17
N
••
/EE
Pg
♦
M-clone PgR636 Dako/M3569
N
••
/EE
Pg
♦
Monoclonal/Ab8 Labvision/PgR
N
••
/EE
E
2
″
Clone PPG5/10 Dako/M7292
N
••
/EE
Pg
♦
Clone 16 Novocastra/NCL-L-PGR 312
N
••
/EE
″E
2
: Receptor de Estrógeno;
♦
Pg: Receptor de progesterona; M-clone: Ac
Monoclonal; N
••
/EE: Marcação nuclear epitelial e estromal.
TABELA 3. Diluição, recuperação antigênica e soluções tampão utilizadas na
padronização da técnica de imunoistoquímica
Anticorpo Diluição testada Recuperação Soluções tampão
E
2
(1D5) 1:50 BM C, EDTA
E
2
(policlonal) 1:50 BM C, EDTA
Pg (PgR636) 1:50 BM C, EDTA
Pg (monoclonal) 1:50 BM C, EDTA 0
E
2
(M7292) 1:50 BM C, EDTA
E
2
(M7292) 1:50 PP C, EDTA
Pg (PGR 312) 1:50 BM C, EDTA
Pg (PGR 312) 1:50 PP C, EDTA
BM: Banho-Maria; C: Citrato, pH6,0; EDTA: ácido etilenodiaminotetracético, pH8,0.
Na fase seguinte realizaram-se dois banhos de TRIS, de 5 minutos cada e
incubação em um kit de amplificação EnVision + Dual Link System HRP (Dako
K4061), durante 30 minutos, em câmara úmida, a temperatura ambiente. Ao
final da incubação, as lâminas permaneceram em TRIS.
Para a visualização da reação, os cortes foram cobertos com solução de
diaminobenzidina (Liquid DAB+Substrate - Dako 3468), por cinco minutos e,
logo após, lavados duas vezes por cinco minutos cada lavagem, em TRIS, para
interrupção da reação. Em seguida, o material foi lavado em água corrente, por
10 minutos e lavado em água destilada. Prosseguiu-se com a contra-coloração
em Hematoxilina de Mayer, 5 minutos, lavagem em água corrente por 10
27
minutos, passagem em água destilada e desidratação. Nesta última etapa
realizaram-se banhos em álcool 85º, 95º, absoluto I, II, III, xilol I, II e III, com
tempo mínimo de três minutos para cada banho.
A finalização da técnica compreendeu a cobertura dos cortes com resina
sintética (Permount – Fisher Scientific) e com lamínulas de vidro.
Foram analisados dois campos de cada camada, sendo que em cada
campo todas as células foram contadas, diferenciando as marcadas das não
marcadas.
4.7 Análises estatísticas
As análises descritivas foram realizadas por meio de procedimento PROC
UNIVARITE do programa Statistical Analysis System, versão 9.1 (SAS, 1995),
visando obter as estatísticas descritivas para as diferentes variáveis avaliadas,
bem como, a verificação das pressuposições anteriores às análises inferenciais
propriamente ditas.
Os dados relativos às dosagens séricas do hormônio avaliados e às
quantificações das expressões gênicas para os receptores hormonais obtidas
por meio do RT-PCR, foram analisados considerando-se os grupos
comparativos e as fases do ciclo estral por meio da análise de variância,
utilizando o procedimento PROC GLM, do programa acima citado, de acordo
com o modelo estatístico abaixo:
y
ijk
= µ + G
i
+ F(G)
j(i)
+ e
ijk
em que,
y
ijkl
= é o nível de dosagem sérica dos hormônios ou da quantificação das
expressões gênicas para os receptores hormonais observado no animal
k, na fase do ciclo estral j, pertencente ao grupo comparativo i;
µ = constante inerente a todas as observações;
G
i
= efeito de i-ésimo grupo comparativo, sendo i=1(animais controle/normais)
e 2(animais experimentais/com piometra);
F(G)
j(i)
= efeito da j-ésima fase do ciclo estral, dentro de cada grupo i, sendo j =
1 (pro-estro), 2 (estro), 3 (diestro) e 4(anestro);
e
ijk
= efeito aleatório residual associado ao nível de dosagem sérica dos
hormônios ou da quantificação das expressões gênicas para os
28
receptores hormonais observado no animal k, na fase do ciclo estral j,
pertencente ao grupo i;
Os dados relativos às quantificações dos receptores obtidos por meio de
imunoistoquímica, avaliados segundo os grupos comparativos, fases do ciclo
estral e camadas do tecido uterino, foram também analisados por meio da
análise de variância, utilizando o mesmo procedimento e programa acima
citado, porém considerando-se o modelo estatístico abaixo:
y
ijkl
= µ + G
i
+ F(G)
j(i)
+ C(F(G))
k(j(i))
+ e
ijkl
em que,
y
ijkl
= é a porcentagem de células imunopositivas para os receptores hormonais
avaliados imunoistoquimicamente, observado no animal l, na camada
uterina k, na fase do ciclo estral j, pertencente ao grupo comparativo i;
µ = constante inerente a todas as observações;
G
i
= efeito de i-ésimo grupo comparativo, sendo i=1(animais controle/normais)
e 2(animais experimentais/com piometra);
F(G)
j(i)
= efeito da j-ésima fase do ciclo estral, dentro de cada grupo i, sendo j =
1 (pro-estro), 2 (estro), 3 (diestro) e 4(anestro);
C(F(G))
k(j(i))
= efeito da k-ésima camada uterina, dentro de fase do ciclo estral j e
dentro de cada grupo i, sendo k = 1 (epitélio superficial), 2
(epitélio glandular), 3 (estroma) e 4(miométrio);
e
ijk
= efeito aleatório residual associado à porcentagem de células
imunopositivas para os receptores hormonais avaliados
imunoistoquimicamente, observado no animal l, na camada uterina k,
na fase do ciclo estral j, pertencente ao grupo comparativo i;
Na avaliação das porcentagens de células imunopositivas para os
receptores hormonais avaliados, utilizou-se a transformação de escala dos
dados para “arco-seno raiz de porcentagem de células imunopositivas”,
procedendo-se à análise de variância e o procedimento para comparações
múltiplas com os transformados. Para apresentação dos resultados os dados
29
foram expressos na escala original, aplicando as operações inversas à
transformação, conforme recomendações de Banzatto e Kronka (2006).
Em caso de resultados significativos (P<0,05) para as fontes de variações
avaliadas nas análises de variância anteriormente citadas, adotou-se como
procedimento para comparações múltiplas o Teste t de Student.
Na avaliação das classificações realizadas com base na dosagem
hormonal e nos exames citológicos, bem como, na avaliação das intensidades
dos escores de marcação obtidos pelas técnicas de imunoistoquímica, utilizou-
se o método não-paramétrico de Qui-quadrado (
χ
2
) para verificação das
freqüências observadas entre os grupos comparativos. Estas análises foram
realizadas por meio PROC FREQ do programa acima descrito.
Para avaliação das possíveis relações entre as dosagens hormonais,
quantificações das expressões gênicas para os receptores hormonais e para as
quantificações dos receptores obtidos por meio de imunoistoquímica, utilizou-
se análises de correlação Momento-Produto de Pearson por meio do
procedimento PROC CORR do programa anteriormente citado.
30
5. RESULTADOS
As estimativas de média geral de idade (em meses) dos 51 animais, bem
como o erro padrão foi de 68,88 ± 4,93 meses. A idade mínima foi de 6,00
meses e a máxima de 144,00 meses. Para o peso dos animais, verificou-se
uma variação entre 2,30 kg e 52,00 kg, com média e erro padrão de 18,83±
2,00 kg, respectivamente. As informações individuais relacionadas às idades,
raças, peso, bem como, os níveis de progesterona sérica (em ng/ml), a
classificação por meio dos níveis de progesterona sérica e a classificação pela
citologia vaginal, utilizando a recomendações de Feldman e Nelson (2004).
5.1 Avaliação das dosagens hormonais de progesterona e estradiol
séricos
A técnica de radioimunoensaio em fase sólida, por meio do kit comercial
de estradiol utilizado, não permitiu obtenção das estimativas dos níveis de
estradiol séricos nas diferentes fases do ciclo estral. Por este motivo as
informações relacionadas às dosagens de estradiol foram retiradas deste
trabalho.
Os níveis de progesterona para os 51 animais variaram entre 0,11 e 38,00
ng/ml, com média e erro padrão de 7,46±1,52 ng/ml, respectivamente.
A análise de variância revelou resultado altamente significativo (P<0,01)
dos níveis de progesterona para a fonte de variação fases do ciclo estral dentro
dos grupos comparativos.
As estimativas de médias e erros padrão para as dosagens de
progesterona nas diferentes fases do ciclo estral, dos animais do grupo
controle e do grupo experimental, encontram-se na Tabela 4.
Na Tabela 4 verifica-se que, para os animais normais, resultados
significativos (P<0,01) foram observados entre a fase de diestro e as demais
fases. As fases de anestro, pro-estro e estro não diferiram entre si (P>0,05).
Para os animais com piometra, as fases de diestro e anestro demonstraram
diferenças significativas (P<0,01).
31
Não foram verificadas diferenças significativas (P>0,05) entre as
dosagens de progesterona dos animais normais e com piometra para a fase de
anestro.
TABELA 4. Estimativas de médias e erros padrão para as dosagens de
progesterona nas diferentes fases do ciclo estral, dentro de cada
grupo comparativo avaliado
Fase do ciclo
estral
Animais Normais Animais com piometra
MED±EP MED±EP
Anestro
0,38±0,06
b,A
0,57±0,20
b,A
Pro-estro
1,41±0,180
b
Estro
3,26±0,55
b
Diestro
24,79±3,84
a,A
10,55±2,61
a,B
1
Médias em uma mesma coluna e seguida por uma mesma letra minúscula, não
diferem entre si ao nível de 1% de probabilidade pelo teste de t Student;
2
Médias em uma mesma linha e seguida por uma mesma letra maiúscula, não diferem
entre si ao nível de 1% de probabilidade pelo teste de t Student.
Para a fase de diestro foi observado um resultado significativo (P<0,01)
em relação aos grupos comparativos: os níveis de progesterona associados
aos animais normais foram maiores em relação aos animais acometidos com
piometra (Figura 1).
5.2 Avaliação da citologia vaginal e histopatologia uterina
As amostras obtidas por meio de swabs vaginais foram coradas,
examinadas e classificadas de acordo com a morfologia das células do epitélio
vaginal. Com base nos resultados, os animais foram classificados de acordo
com a fase do ciclo estral, sendo que no grupo de animais controle, oito fêmeas
apresentavam-se em pro - estro, cinco em estro, cinco em diestro e 12 em
anestro. Para o grupo de animais com piometra foram observados 17 animais
em diestro e quatro animais em anestro. Observou-se que a classificação das
fases do ciclo estral segundo os níveis de progesterona e os achados
citológicos foram ligeiramente diferentes para animais normais. Entretanto, não
32
foram detectadas diferenças significativas (P>0,05) entre as ocorrências nas
diferentes classificações, segundo o Teste de Qui-quadrado.
0,00
5,00
10,00
15,00
20,00
25,00
30,00
35,00
Anestro Pro estro Estro Diestro
Fase do ciclo estral
[P4], em ng/ml
Animais Normais Animais com piometra
FIGURA 1. Estimativas de médias e erros padrão para os níveis de
progesterona (ng/ml), de acordo com a fase do ciclo estral e
dentro de cada grupo comparativo
Para animais com piometra, não foram observadas discrepâncias entre
as duas classificações (citológica versus progesterona). Nas Figuras 2 e 3 são
apresentadas às freqüências de ocorrências observadas segundo a
classificação com base no nível de progesterona e nos achados da citologia
vaginal, para animais normais e com piometra respectivamente.
As amostras de útero foram examinadas histologicamente conforme
ilustram as figuras 4 e 5 e posteriormente classificados nos seguintes graus de
HEC: discreto, moderado, severo e sem HEC. Nos animais clinicamente
saudáveis 6,6% (N=2) apresentaram grau discreto de HEC e 93.4% (N=28) não
apresentaram nenhum grau de HEC. Nos animais portadores de piometra,
foram observados 23,8% (N=5) com HEC discreta, 28,6% (N=6) com HEC
moderada e 47,6% (N=10) com HEC severa sendo que estes animais
apresentavam-se em anestro ou diestro, conforme observado na Figura 6.
33
FIGURA 2. Freqüências de ocorrências de fases do ciclo estral nos animais do
grupo controle, segundo os métodos de classificação
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
Anestro Diestro
Fases do ciclo estral
%
Classificação por P4 Classificação por citologia vaginal
FIGURA 3. Freqüências de ocorrências de fases do ciclo estral nos animais do
grupo experimental, segundo os métodos de classificação –
citologia vaginal e concentrações de progesterona sérica
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Anestro Pro estro Estro Diestro
Fases do ciclo estral
%
Classificação por P4
34
FIGURA 4. Fotomicrografia de endométrio de cadelas do grupo controle: A.
fase de anestro; B. fase de pro-estro
A
A
A
B
B
B
35
36
A
A
A
B
B
B
FIGURA 5. Fotomicrografia de endométrio de cadelas do grupo controle: A. fase de
estro; B. fase de diestro
FIGURA 6. Fotomicrografia de endométrio de cadelas do grupo experimental:
A. fase de anestro; B. fase de diestro
A
A
A
B
B
B
37
5.3 Avaliação da expressão gênica dos receptores hormonais
Os números de amostras avaliadas e as estimativas de médias, desvios
padrão, valores de mínimos e máximos para as expressões gênicas dos
receptores de estrógeno alfa e beta (ER-α, ER-β) e o receptor de progesterona
(PR), expressos em relação a quantidade de proteína ribossomal S5 (RPS),
estão apresentados na Tabela 5.
TABELA 5. Número de observações (N), estimativas de médias (MED), erros
padrão (EP), valores de mínimos (MIN) e máximos (MAX) para os
receptores de estrógeno ER-α e ER-β, bem como, para o receptor
de progesterona PR avaliados
Receptor N MED EP CV MIN MAX
ER-α
36 0,67 0,99 146,90 0,01 5,34
ER-β
42 3,63 8,75 240,94 0,02 47,80
PR 44 0,84 0,71 84,70 0,00 2,88
Verifica-se na Tabela 5 que os números de observações avaliados não
foram constantes em relação às análises de progesterona sérica (N=51). Este
fato ocorreu em virtude das amostras utilizadas nas análises de expressão
gênica não apresentarem, para algumas amostras, quantidades de mRNA
suficientemente detectáveis para os receptores hormonais investigados.
Entretanto, este fato não se traduziu em problema, uma vez que ocorreram
repetições em todas as fases avaliadas e dentro dos grupos comparativos,
conforme demonstrado na Tabela 6.
Nas análises de variância considerando as fontes de variação grupos
comparativos e fases do ciclo estral dentro de cada grupo comparativo
avaliado, não foram observados resultados significativos (P>0,05) para os
receptores ER-α e PR. Entretanto, para o receptor hormonal ER-β, foi
verificado resultado altamente significativo (P<0,01) para a fonte de variação
fases do ciclo estral dentro de cada grupo comparativo avaliado.
38
TABELA 6. Distribuição das freqüências observadas para as análises dos
receptores de estrógeno alfa e beta, bem como, para o receptor
de progesterona (ER-α, ER-β e PR) avaliados por meio de RT-
PCR, segundo o grupo comparativo e as fases do ciclo estral
Grupo Comparativo
Receptor
avaliado
Fase do ciclo estral
Anestro Pro-estro Estro Diestro
Grupo controle
ER-α
4 7 3 4
ER-β
7 7 3 6
PR 9 7 3 6
Grupo experimental
ER-α
4 --- --- 14
ER-β
4 --- --- 15
PR 4 --- --- 15
As estimativas de médias e erros padrão para receptores de hormonais
ER-α, ER-β e PR nas diferentes fases do ciclo estral e dentro de cada grupo
comparativos avaliado, encontram-se na Tabela 7 e nas Figuras 7, 8 e 9.
Observa-se pela Tabela 7 e Figura 7 que as taxas expressões gênicas do
receptor ER-α oscilaram entre 0,11±0,49 e 0,66±0,49 nas diferentes fases do
ciclo estral para animais normais e de 0,90±0,49 a 1,05±0,26 para animais com
piometra, nas fases de anestro e diestro, respectivamente. Destaca-se que,
apesar das taxas de expressão gênica terem sido ligeiramente superiores em
animais acometidos pela piometra, não foram observadas diferenças
significativas (P>0,05) para as fontes de variação avaliadas.
Para as taxas de expressões gênicas relacionadas ao receptor ER-β,
verificou-se que, para animais normais, menores taxas de expressão desse
receptor ocorreram nas fases de anestro, pro - estro e estro, as quais não
apresentaram diferenças significativas entre si (P>0,05).
TABELA 7. Estimativas de médias e erros padrão para receptores hormonais
ER-α, ER-β e PR, segundo as diferentes fases do ciclo estral,
dentro de cada grupo comparativo avaliado
39
Fase do ciclo
estral
1
Grupo controle Grupo experimental
MED±EP MED±EP
ER-α
Anestro
0,11±0,49
a,A
0,90±0,49
a,A
Pro-estro
0,66±0,49
a
Estro
0,20±0,98
a
Diestro
0,19±0,37
a,A
1,05±0,26
a,A
ER-β
Anestro
0,23±2,66
b,A
0,22±3,52
a,A
Pro-estro
2,55±2,88
b
Estro
1,72±4,07
b
Diestro
16,23±2,66
a,A
1,06±1,82
a,B
PR
Anestro
0,82±0,23
a,A
1,25±0,34
a,A
Pro-estro
1,24±0,28
a
Estro
1,30±0,40
a
Diestro
0,77±0,26
a,A
0,53±0,18
a,A
1
Médias em uma mesma coluna e seguidas por uma mesma letra minúscula,
não diferem entre si ao nível de 1% de probabilidade pelo Teste t de Student;
2
Médias em uma mesma linha e seguidas por uma mesma letra maúscula, não
diferem entre si ao nível de 1% de probabilidade pelo Teste t de Student.
40
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
Anestro Pro-estro Estro Diestro
Fase do ciclo estral
ER-alfa/RPS
Animais Normais Animais com Piometra
FIGURA 7. Estimativas de médias e erros padrão para as expressões gênicas
de ER-α, de acordo com a fase do ciclo estral e dentro de cada
grupo comparativo.
0,00
2,00
4,00
6,00
8,00
10,00
12,00
14,00
16,00
18,00
20,00
Anestro Pro-estro Estro Diestro
Fase do ciclo estral
ER-beta/RPS
Animais Normais Animais com Piometra
FIGURA 8. Estimativas de médias e erros padrão para as expressões gênicas
de ER-β, de acordo com a fase do ciclo estral e dentro de cada
grupo comparativo.
41
0,00
0,50
1,00
1,50
2,00
2,50
3,00
Anestro Pro-estro Estro Diestro
Fase do ciclo estral
P4R/RPS
Animais Normais Animais com Piometra
FIGURA 9. Estimativas de médias e erros padrão para as expressões gênicas
de PR de acordo com a fase do ciclo estral e dentro de cada grupo
comparativo
Entretanto, na fase de diestro, as taxas de expressões gênicas para o
receptor ER-β em animais normais, aumentaram significativamente (P<0,01)
em relação às demais fases do ciclo estral, chegando a atingir 36.866 vezes
mais transcritos para esse mesmo receptor, quando comparado com o grupo
referência (animais normais em fase de anestro), conforme verificado na
Tabela 7 e Figura 8.
Para o receptor hormonal PR, as taxas das expressões gênicas avaliadas,
variaram de 0,82±0,23 a 1,30±0,40 nas diferentes fases do ciclo estral para
animais normais. Já para os animais acometidos pela piometra, foram
observadas variações de 0,53±0,18 a 1,25±0,34, nas fases em que a piometra
se manifesta. Nota-se que, semelhantemente aos resultados verificados para o
receptor ER-α, as taxas de expressão gênica foram também ligeiramente
superiores em animais acometidos pela patologia, porém não foram detectadas
diferenças significativas (P>0,05) para as fontes de variação avaliadas,
conforme as Tabela 7 e Figura 9.
42
5.4 Avaliação imunoistoquímica dos receptores hormonais
5.4.1 Padronizações das técnicas de imunoistoquímica
A padronização da técnica de imunoistoquímica realizada com os clones
de estrógeno M-1D5-Dako/M7047, P-Labvision/ER/Ab17 e de progesterona M-
clone PgR636-Dako/M3569, M-Labvision/PgR/Ab8, Clone 16-Novocastra/NCL-
L-PGR 312 proposta neste estudo e os testes para a otimização dos anticorpos
(anti-estrógeno e anti-progesterona), não foram satisfatórios e definitivos
quanto à diluição, recuperação antigênica e tampões testados. Entretanto
utilizando para estrógeno o Clone PPG5/1-Dako/M7292, os resultados foram
satisfatórios. As lâminas foram analisadas em sua totalidade por microscopia
de luz conforme ilustram as Figuras 10 e 11.
5.4.2 Avaliação quantitativa das marcações obtidas pela técnica de
imunoistoquímica
Os anticorpos utilizados no estudo imunoistoquímico para receptores de
progesterona não apresentaram resultados satisfatórios, sendo as marcações
classificadas como inespecíficas para os três anticorpos testados. Face a este
acontecido, as análises relacionadas com receptor de progesterona avaliados
por imunosistoquímica foram retirados deste trabalho. Para o anticorpo de
estrógeno Anti-E2 clone PPG5/10 foram obtidas marcações específicas e
satisfatórias, fato esse que permitiu análises considerando diferentes tecidos
marcados, dentro das fases do ciclo estral e dentro de cada grupo comparativo
estudado.
Os números de imagens avaliadas e as estimativas de médias, desvios
padrão, valores de mínimos e máximos utilizados nas análises micromor-
fométricas, relacionadas às porcentagens de células imunopositivas para o
receptor hormonal de estrógeno (em escala original e após a transformação de
escala), bem como, os números médios de células quantificadas por campo de
43
FIGURA 10 Fotomicrografia das diferentes camadas de endométrio em
cadelas, na fase de anestro, nos grupos controle (A) e
experimental (B): 1. Epitélio superficial; 2. epitélio glandular; 3.
estroma e 4 miométrio. Observar imunomarcação positiva. Anti-
E2 clone PPG5/10 (DAKO/M792).
A1
A2
A3
A4
B4
B3
B2
B1
44
FIGURA 11 Fotomicrografia das diferentes camadas de endométrio em
cadelas, na fase de diestro, nos grupos controle (A) e
experimental (B): 1. Epitélio superficial; 2. epitélio glandular; 3.
estroma e 4 miométrio. Observar imunomarcação positiva. Anti-
E2 clone PPG5/10 (DAKO/M792).
A1
A2
A3
A4
B1
B2
B3
B4
45
avaliação microscópica, nos diferentes tecidos, fases do ciclo estral e grupos
comparativos avaliados, estão apresentados na Tabela 8.
TABELA 8. Número de observações (N), estimativas de médias (MED), erros
padrão (EP), valores mínimos (MIN) e máximos (MAX) para
porcentagens de células imunopositivas para o receptor hormonal
de estrógenos em escala original (PCPOSIT), após a
transformação de escala (ASPCPOSIT) e os números médios de
células contados (TOTCELS) por campo avaliado na microscopia
Variável N MED DP CV MIN MAX
PCPOSIT
1
195 53,72 22,75 42,34 1,14 98,88
ASPCPOSIT
2
195 47,61 14,53 30,51 6,14 83,92
TOTCELS
3
195 213,24 180,36 84,58 32,00 938,50
1
PCPOSIT= porcentagens de células imunopositivas para o receptor de estrógeno;
2
ASPCPOSIT= arco-seno raiz da porcentagem de células imunopositivas para o receptor de
estrógeno;
3
TOTCELS=número de células quantificadas nos campos avaliados
A análise de variância considerando os efeitos de grupos comparativos,
fase do ciclo estral dentro de cada grupo comparativo, bem como, tecidos
dentro de cada fase e dentro de cada grupo comparativo, apresentou resultado
altamente significativo (P<0,01) para a fonte de variação tecidos dentro de
cada fase e dentro de cada grupo comparativo. As estimativas de médias e
erros padrão para as porcentagens de células imunopositivas para o receptor
de estrógeno, dentro das diferentes fases e tecidos, segundo os grupos
avaliados, são apresentados na Tabela 9 e Figura 12.
Avaliando os animais normais dentro de cada fase e tecido, verificou-se
que nos animais em anestro, pro-estro e estro não apresentaram diferenças
significativas (P>0,05) entre as porcentagens de células imunopositivas para o
receptor de estrógeno, nos tecidos epitelial glandular, estromal e miométrio.
46
Tabela 9. Estimativas de médias e erros padrão das porcentagens de células
imunopositivas para o receptor de estrógeno, dentro das diferentes
fases e tecidos, segundo os grupos comparativos avaliados
Fase do ciclo estral-Tecido
2
Animais Normais
1
Animais com Piometra
1
MED
±
EP MED
±
EP
Anestro-Epitélio Superficial 25,34
±
2,85 b B 73,12
±
4,39 a A
Anestro-Epitélio Glandular 40,60
±
2,84 a B 61,65
±
4,44 a A
Anestro-Estroma 37,09
±
2,86 a,b B 59,04
±
4,42 a A
Anestro-Miométrio 49,48
±
3,42 a B 74,87
±
4,36 a A
Pro-estro- Epitélio Superficial 29,38
±
3,15 b
Pro-estro- Epitélio Glandular 39,96
±
3,12 a,b
Pro-estro-Estroma 44,28
±
3,15 a,b
Pro-estro-Miométrio 56,23
±
3,98 a
Estro- Epitélio Superficial 22,83
±
5,08 b
Estro- Epitélio Glandular 33,90
±
5,09 a,b
Estro-Estroma 46,07
±
5,04 a,b
Estro-Miométrio 47,71
±
5,27 a
Diestro-Epitélio Superficial 28,88
±
3,35 c B 79,77
±
2,32 a A
Diestro- Epitélio Glandular 54,20
±
3,31 a B 75,06
±
2,26 a A
Diestro-Estroma 35,97
±
3,30 b,c B 64,45
±
2,15 b A
Diestro-Miométrio 48,04
±
3,31 a,b B 78,96
±
2,13 a A
1
Médias em uma mesma linha, dentro de um mesmo tecido e grupo, seguidas por
uma mesma letra maiúscula, não diferem entre si ao nível de 1% de probabilidade
pelo Teste t de Student
2
Médias em uma mesma coluna, dentro de mesma fase do ciclo estral e grupo,
seguidas por uma mesma letra minúscula, não diferem entre si ao nível de 1% de
probabilidade pelo Teste t de Student
Entretanto na fase de diestro para animais normais, os tecidos com
maiores porcentagens de células imunopositivas foram o epitelial glandular e o
miométrio, as quais não exibiram diferenças significativas (P>0,05) entre si.
47
0,00
10,00
20,00
30,00
40,00
50,00
60,00
70,00
80,00
90,00
Anestro-Ep.Sup.
Anestro-Ep.Gland.
Anestro-Estroma
Anestro-Miométrio
Pró-estro-Ep.Sup.
Pró-estro-Ep.Gland.
Pró-estro-Estroma
Pró-estro-Miométrio
Estro-Ep.Sup.
Estro-Ep.Gland.
Estro-Estroma
Estro-Miométrio
Diestro-Ep.Sup.
Diestro-Ep.Gland.
Diestro-Estroma
Diestro-Miométrio
Fase e Tecido de avaliação
Porcentagens de células "+"
Animais Normais Animais com Piometra
Figura 12. Porcentagens de células imunopositivas para o receptor de
estrógeno, dentro das diferentes fases do ciclo estral e tecidos,
bem como, em cada grupo avaliado
Para animais com piometra e em anestro, não foram verificados
resultados significativos (P>0,05) entre os tecidos avaliados. Porém na fase de
diestro o tecido estromal apresentou porcentagens de células imunopositivas
para o receptor de estrógeno significativamente inferior (P<0,01) em relação
aos demais tecidos.
Avaliando-se os grupos comparativos dentro de uma mesma fase e
tecido, notou-se que tanto no anestro quanto no diestro os animais acometidos
pela piometra diferiram significativamente (P<0,01) quando comparados com
animais normais, para todos os tecidos avaliados.
Os escores de marcação obtidos por microscopia óptica apresentaram
resultados significativos pelo Teste de Qui-quadrado (P<0,01), quando
considerados todos os animais avaliados (N=51) e os grupos comparativos.
Foram observados que 20,41% demonstraram escores de marcação 1 e
36,73% apresentaram escores de marcação 2 entre os animais controles
(normais). Não foram observados animais do grupo controle (normais) com
escore 3 (0,0%). Contudo, animais acometidos pela piometra, foram verificados
48
escores 1 (4,08%), 2 (20,41%) e 3 (18,37%), em relação ao total de animas
avaliados nos grupos comparativos (controle e experimental)
5.5 Estimativas de correlações entre as avaliações hormonal de
progesterona, da expressão gênica dos receptores hormonais e das
quantificações obtidas pela técnica de imunoistoquímica
As estimativas dos coeficientes de correlação momento-produto de
Pearson entre as dosagens hormonal de progesterona sérica, da expressão
gênica dos receptores hormonais ER-α, ER-β e PR, bem como, as
quantificações nos diferentes tecidos obtidos pela técnica de imunoistoquímica,
segundo os grupos controle (animais normais) e experimental (animais com
piometra), são apresentados nas Tabelas 12 e 13, respectivamente.
Na Tabela 10, observa-se que as estimativas de correlações obtidas entre
as variáveis avaliadas nos animais do grupo controle (normais) foram, de
maneira geral, de baixa a média magnitude, a exceção da correlação obtida
entre as dosagens hormonal de progesterona sérica (P4) e da expressão
gênica do receptor de estrógeno beta (ER-β), que assumiu o valor de 0,7114.
As demais estimativas de correlações para os animais do grupo controle
(normais) oscilaram de -0,4302 entre a porcentagem de células imunopositivas
no epitélio superficial (PPEPSUP) e a expressão gênica para o receptor de
progesterona (PR), até 0,4619 entre a porcentagem de células imunopositivas
no epitélio superficial (PPEPSUP) e os escores de marcação obtidos pela
técnica de imunoistoquímica (ESCORE).
Na Tabela 11, observa-se que as estimativas de correlações obtidas para
os animais do grupo experimental (com piometra) foram também, de maneira
geral, de baixa a média magnitude, excetuando-se as correlações obtidas a
porcentagem de células imunopositivas no epitélio superficial (PPEPSUP) e a
porcentagem de células imunopositivas no epitélio glandular (PPEPGLA), entre
porcentagem de células imunopositivas no epitélio glandular (PPEPGLA) e a
porcentagem de células imunopositivas no estroma (PPESTR) e os escores de
marcação obtidos pela técnica de imunoistoquímica (ESCORE), os quais
assumiram magnitudes de 0,7677, 0,7015 e 0,8272, respectivamente. As
demais estimativas de correlações para os animais do grupo experimental (com
49
piometra) variaram de -0,2638 entre a porcentagem de células imunopositivas
no miométrio (PPMIOM) e a expressão gênica para o receptor de progesterona
(PR), até estimativa de 0,6982 entre a porcentagem de células imunopositivas
no epitélio superficial (PPEPSUP) e a porcentagem de células imunopositivas
no estroma (PPESTR), sendo as demais correlações intermediárias as essas
estimativas.
50
TABELA 10. Estimativas dos coeficientes de correlação momento-produto de Pearson entre as dosagens hormonal de
progesterona sérica, da expressão gênica dos receptores hormonais ER-α, ER-β e PR, bem como, as
quantificações nos diferentes tecidos obtidos pela técnica de imunoistoquímica, no animais do grupo controle
(animais normais)
P4 PPEPSUP PPEPGLA PPESTR PPMIOM ESCORE
ER-α ER-β
PR
P4 1,0000
PPEPSUP 0,0362 1,0000
PPEPGLA 0,1984 0,1421 1,0000
PPESTR 0,0073 0,4312 0,4159 1,0000
PPMIOM 0,2322 0,0171 0,4478 0,3820 1,0000
ESCORE -0,1236 0,4619 -0,2004 0,2079 -0,0764 1,0000
ER-α
-0,1278 0,1162 0,1514 0,1308 0,1812 0,1737 1,0000
ER-β
0,7114 0,1225 0,1680 0,0199 0,4256 -0,0097 0,1284 1,0000
PR -0,1371 -0,4302 -0,0551 0,0489 0,1423 -0,1329 0,4495 -0,0137 1,0000
P4= dosagem hormonal de progesterona sérica; PPEPSUP= porcentagem de células imunopositivas no epitélio superficial; PPEPGLA=
porcentagem de células imunopositivas no epitélio glandular; PPESTR= porcentagem de células imunopositivas no estroma; PPMIOM=
porcentagem de células imunopositivas no miométrio; ESCORE= escore de marcação obtido pela técnica de imunoistoquímica; ER-α=
expressão gênica para o receptor de estrógeno alfa (PR); ER-β= expressão gênica para o receptor de estrógeno beta; PR= expressão gênica
para o receptor de progesterona (PR)
TABELA 11. Estimativas dos coeficientes de correlação momento-produto de Pearson entre a dosagem hormonal de progesterona
sérica, da expressão gênica dos receptores hormonais ER-α, ER-β e PR, bem como, as quantificações nos
51
diferentes tecidos obtidos pela técnica de imunoistoquímica, no animais do grupo experimental (animais com
piometra)
P4 PPEPSUP PPEPGLA PPESTR PPMIOM ESCORE
ER-α ER-β
PR
P4 1,0000
PPEPSUP -0,1018 1,0000
PPEPGLA 0,1656 0,7677 1,0000
PPESTR 0,1917 0,6982 0,7015 1,0000
PPMIOM 0,0649 0,0671 0,2340 0,3108 1,0000
ESCORE 0,0933 0,6591 0,6413 0,8272 -0,0232 1,0000
ER-α
0,3401 0,0018 0,2091 0,1950 0,0326 0,2083 1,0000
ER-β
-0,1220 0,2396 0,2568 -0,1836 0,1497 -0,2153 0,1217 1,0000
PR -0,0403 0,2210 -0,0211 0,2788 -0,2638 0,3055 -0,1726 -0,1449 1,0000
P4= dosagem hormonal de progesterona sérica; PPEPSUP= porcentagem de células imunopositivas no epitélio superficial; PPEPGLA=
porcentagem de células imunopositivas no epitélio glandular; PPESTR= porcentagem de células imunopositivas no estroma; PPMIOM=
porcentagem de células imunopositivas no miométrio; ESCORE= escore de marcação obtido pela técnica de imunoistoquímica; ER-α=
expressão gênica para o receptor de estrógeno alfa (PR); ER-β= expressão gênica para o receptor de estrógeno beta; PR= expressão gênica
para o receptor de progesterona (PR)
52
5.6 Resumo dos resultados
(i) Os níveis de progesterona sérica foram significativamente (P<0,01)
maiores nos animais do grupo controle (normais) do que nos animais do
grupo experimental (com piometra) na fase de diestro;
(ii) Os exames histológicos sugerem que a piometra é precedida da HEC,
uma vez que 100,00% dos animais do grupo experimental (com piometra)
apresentaram histologicamente algum grau de HEC. Este fato é reforçado
quando se observa que, apenas 6,6 % de animais do grupo controle
(normais) apresentaram HEC, porém sem ocorrência de piometra;
(iii) As expressões gênicas de receptores ER-α não apresentaram diferenças
significativas (P>0,05) entre os animais do grupo controle (normais) nas
diferentes fases do ciclo estral e os animais do grupo experimental (com
piometra);
(iv) As expressões gênicas de receptores ER-β apresentaram diferenças
significativas (P<0,01), com os animais do grupo controle exibindo
maiores taxas de transcrição quando comparados aos animais do grupo
experimental, na fase de diestro;
(v) As expressões gênicas de receptores PR não apresentaram diferenças
significativas (P>0,05) entre os animais do grupo controle, nas diferentes
fases do ciclo estral e os animais do grupo experimental;
(vi) As porcentagens de células imunopositivas para o receptor de estrógeno,
obtidos pela técnica de imunoistoquímica, foram significativamente
(P<0,01) superiores nos animais do grupo experimental quando
comparados aos animais controle, para as fases de anestro e diestro, e
para todas as camadas do tecido uterino avaliados;
(vii) A correlação obtida entre a concentração de progesterona sérica (P4) e a
expressão gênica do receptor de estrógeno beta (ER-β), assumiu um valor
de 0, 7114, no grupo controle;
(viii) A correlação entre a porcentagem de células imunopositivas no epitélio
superficial (PPEPSUP) e a porcentagem de células imunopositivas no
epitélio glandular (PPEPGLA), entre porcentagem de células
imunopositivas no epitélio glandular (PPEPGLA) e a porcentagem de
53
células imunopositivas no estroma (PPESTR) e os escores de marcação
obtidos pela técnica de imunoistoquímica (ESCORE), assumiram
magnitudes de 0,7677, 0,7015 e 0,8272, respectivamente, no grupo
experimental.
54
6. DISCUSSÃO
A média de idade dos animais com piometra encontradas neste trabalho
foi de 8,1 anos e estão de acordo com os achados na literatura. Smith (2006)
relatou que a incidência desta doença é maior em fêmeas acima de quatro
anos de idade. Feldman e Nelson (2004) descreveram a ocorrência da afecção
tradicionalmente em fêmeas de meia idade, acima de seis anos. Entretanto,
segundo Johnston et al. (2001), há um aumento na prevalência desta
enfermidade em cadelas acima de 7,5 anos de idade. Contudo, todos os
autores consultados concordam que a exposição do endométrio a progesterona
pode ser uma das possíveis causas do desenvolvimento desta doença.
As médias os níveis de progesterona no presente trabalho, para a
classificação das diferentes fases do ciclo reprodutivo dos animais normais,
seguiram dos limites descritos por Feldman e Nelson (2004). Um aspecto
interessante observado neste trabalho, foi a verificação de diferenças
significativas (P<0,01) entre os níveis de progesterona, dos animais do grupo
controle, os quais apresentaram maiores níveis deste hormônio quando
comparados com os animais do grupo experimental, na fase de diestro.
Cock et al. (1997) publicaram resultados referentes aos níveis de
progesterona, estradiol e testosterona em animais normais e em animais com
HCE. Os animais de ambos os grupos, foram classificados em três subgrupos:
anestro, início do estágio de secreção e estágio final de secreção. Ao analisar
os dados desses autores, considerando um modelo que contempla os efeitos
grupos comparativos e fases de secreção, verificam-se resultados semelhantes
e totalmente concordantes aos observados neste trabalho. Os animais controle
(normais) exibem níveis de progesterona significativamente (P<0,01)
superiores (20,59±3,07 ng/ml, com N=4) quando comparados aos animais
acometidos por HCE (7,11±2,32 ng/ml, com N=7), particularmente na fase de
início do estágio de secreção. Nas fases de anestro e final do estágio de
secreção, também similarmente ao que foi observado nessa pesquisa, não
foram detectadas diferenças significativas (P>0,05) entre animais normais e os
animais com HCE.
As concentrações de progesterona em animais com piometra foram
menores quando comparados com os animais considerados saudáveis, na fase
55
do diestro do ciclo estral (10,55±2,61 ng/mL X 24,79±3,84 ng/mL ). Esses
resultados são no mínimo surpreendentes, uma vez que sendo a piometra uma
doença característica da fase do diestro (JOHNSTON et al., 2001, FELDMAN e
NELSON 2004; SMITH, 2006), seria esperado que os níveis de progesterona
fossem iguais ou até mesmo superiores aos animais não portadores dessa
enfermidade. Hagman et al. (2006) estudaram os níveis 15-Keto-13,14-dihidro-
prostaglandina, um metabólito da prostaglandina, em animais saudáveis e com
piometra, e verificaram que as concentrações desse metabólito foram maiores
em animais com piometra, o que pode sugerir um metabolismo ou lise do corpo
lúteo mais rápido em fêmeas com piometra, explicando, portanto, nossos
resultados.
Ainda nesse contexto, porém considerando o modelo ruminante, a
liberação de PGF2α em animais acometidos com piometra seria prejudicada,
pois sua secreção e ou liberação pelas células do endométrio não ocorreria de
maneira normal, estando comprometida pelo processo inflamatório do
endométrio e pela presença de secreção uterina aumentada. Nesse caso, a
secreção uterina aumentada provocaria uma inibição na liberação de PGF2α
pelo endométrio e uma longevidade maior do corpo lúteo, com conseqüente
produção de progesterona e diestro. Nossos resultados, entretanto, não
confirmam essa hipótese, ao contrário, as concentrações de progesterona nas
cadelas foram inferiores em animais com HCE/piometra. Talvez nas cadelas a
HCE e a infecção bacteriana, seja responsável pela secreção de PGF2α, visto
pelos níveis 15-Keto-13,14-dihidro-prostaglandina aumentados, observados por
Hagman et al. (2006) e conseqüente concentrações menores de progesterona.
Outra possibilidade para explicar as concentrações inferiores de
progesterona em fêmeas com piometra, é se considerar a fase de diestro
nesses animais mais curta, quando comparada com a duração do diestro em
cadelas não acometidas. Da mesma forma, teríamos que considerar a
liberação de um fator luteolítico liberado mais precocemente e influenciando a
secreção de progesterona.
Entretanto, De Bosschere et al. (2001) reportaram que animais com sinais
clínicos de piometra e que tomaram contraceptivos (grupo tratado) e os animais
considerados clinicamente saudáveis (normais), não apresentaram diferenças
56
significativas (P>0,05) nos níveis de progesterona sérica, achados esses, que
discordam dos observados neste trabalho. Nesse caso, os resultados talvez
não apresentaram diferenças significativas, devido à administração exógena de
hormônio, no grupo de animais tratados. Em nosso trabalho as cadelas com
diagnóstico de piometra não receberam administração de contraceptivos.
Quando se avalia apenas os animais do grupo controle (normais), os
resultados observados nesse trabalho são semelhantes aos reportados por
Tani et al, (1997) e Hatoya et al. (2003), os quais mostraram que os níveis de
progesterona na fase de diestro são significativamente maiores (P<0,01) que
nas demais fases (início, meio e fim de anestro, pro-estro e estro). Esses
resultados são consistentes com a literatura e com os conceitos clínicos atuais,
onde a fase secretória do ciclo estral em cadelas – fase do diestro é a fase de
domínio progestacional.
Os resultados citológicos encontrados neste trabalho foram classificados
de acordo com Nelson e Feldman (2004). Quando confrontados com os níveis
de progesterona, demonstraram que em conjunto, apresentam uma boa
concordância na determinação das fases do ciclo estral o que vai ao encontro
dos achados descritos na literatura (JOCHL e ANDERSEN, 1977; ARORA et
al., 2006).
A classificação das fases do ciclo estral tem sido realizada com base em
diferentes exames e critérios. Cock et al. (1997) classificaram animais normais
e em animais com HCE utilizando os níveis de progesterona, estradiol e
testosterona. Já Vermeirsch et al. (1999) descreveram a classificação das
fases do ciclo estral em cadelas saudáveis por meio da dosagem de
progesterona, estrógeno e testosterona, bem como o exame histológico dos
ovários e útero. De Bosschere et al. (2001) classificaram as diferentes fases do
ciclo utilizando somente as dosagens de progesterona e estrógeno. Jochl e
Andersen (1977) relataram que os sinais clínicos apresentados pelos animais,
também são dados importantes para a classificação do ciclo reprodutivo. Arora
et al. (2006) classificaram as fases do ciclo estral de animais saudáveis e com
piometra com base na citologia vaginal e na dosagem de progesterona
plasmática, métodos estes também utilizados no presente trabalho.
Nos animais acometidos pela piometra somente duas fases distintas do
ciclo estral foram evidenciadas. Em ambas as fases, no esfregaço vaginal,
57
foram encontradas células do epitélio vaginal, principalmente células
parabasais e intermediárias, presença de polimorfonucleares e bactérias, como
descrito também por Vannucchi et al. (1997) e Nelson e Feldman (2004).
De acordo com Hehm et al. (2007) para a determinação das fases do ciclo
estral, a observação clínica, os níveis hormonais e esfregaços vaginais devem
ser levados em consideração. A avaliação microscópica da aparência dos
tecidos reprodutivos e glândula mamária quando realizadas, devem ser
considerados como uma única entidade.
Concordamos com os diversos autores citados sobre os métodos e
critérios estabelecidos para a determinação das fases de ciclo estral em
cadelas. Infelizmente o comportamento, uma importante ferramenta para a
identificação, principalmente da fase do pro-estro e estro, não foi utilizada
nessa pesquisa, pois, a maioria dos animais pertencia a um programa de
controle populacional, sendo impossível à obtenção de tais características.
Os achados na histologia uterina de animais saudáveis estão de acordo
com a classificação observada por outros pesquisadores (JOCHL e
ANDERSEN, 1977; BANKS, 1992; COCK et al., 1996; VERMEIRSCH et al.,
1999; De BOSSCHERE et al., 2001). Nos animais com piometra, os exames
histopatológicos do útero não apresentaram diferenças em relação aos
observados por Cock et al., (1997), Vermeirsch et al., (1999), De Bosschere et
al., (2001) e Arora et al., (2006), os quais também trabalharam com animais
normais e com HEC/piometra.
Nosso interesse na avaliação histopatológica do útero era a determinação
da presença ou não da HCE, para confirmar ou não uma alteração inicial do
endométrio, como doença base para o estabelecimento da piometra. Era
importante também, caracterizar a formação dos grupos o que se confirmou
com os resultados obtidos, ou seja, a despeito da variação de idade, apenas
6,6% do útero dos animais controles, apresentaram HCE classificadas como de
grau discreto.
Atualmente os pesquisadores vêm estudando a avaliação da expressão
gênica de receptores hormonais em diferentes tecidos como, por exemplo, no
hipotálamo, hipófise e ovário, e relacionando seus achados com os níveis
séricos de estrógeno e progesterona. Entretanto, nenhum estudo quantificando
expressão gênica de receptores de estrógeno (ER-α, ER-β) e de progesterona
58
(RP) em útero de cadelas normais e acometidos com piometra foi encontrado
na bibliografia consultada.
Os receptores de estrógenos (ERs) são membros de uma família de
receptores nucleares de moduladores de transcrição. Esses receptores agem
por interação com seqüências regulatórias de DNA que se ligam a classes
específicas de receptores nucleares, bem como com moléculas co-ativadoras e
co-repressoras para regular a atividade do complexo RNA polimerase. Outros
exemplos de receptores nucleares incluem receptores de progesterona,
andrógenos, vitaminas, ou receptores órfãos, sem ligação aparente (HEWITT e
KORACH, 2003).
Ainda de acordo com Hewitt e Korach (2003) dois receptores estrogênicos
estão presentes nos tecidos de camundongo, os receptores α e β e cada um
desses receptores exibe um padrão de expressão diferente. O ERα é
encontrado em todos os tecidos reprodutivos e é o mais abundante; o ERβ é
produto de um gene diferente e apresenta pouca similaridade com a molécula
de ERα. Tanto ERα como ERβ se ligam ao estradiol e interagem com uma
seqüência de DNA.
A utilização da técnica de RT-PCR permite a obtenção das taxas de
transcrições de determinado gene alvo em relação a um gene referência (ou
constitutivo), o que possibilita a utilização de análises quantitativas expressas
em relação a um tecido ou amostra controle. Neste estudo foi utilizado como
gene referência a proteína ribossomal S5 (RPS5). Tany et al. (1997)
trabalharam com mRNA de α-tubulina, Inaba et al. (2002) com mRNA de β-
actina e Hatoya et al. (2003) utilizaram o mRNA da subunidade ribossomal
18S. Essas diferenças na utilização dos genes referências não exibem maiores
problemas na interpretação dos resultados obtidos nos diferentes
experimentos. Entretanto, nos trabalhos desses autores, verifica-se ausência
de informações sobre que amostra ou que fase do ciclo estral foi utilizada como
controle. Este fato pode levar diferenças na quantificação das taxas de
transcrição observadas nesse trabalho em relação aos reportados por Tany et
al. (1997), Inaba et al. (2002) e Hatoya et al. (2003).
Neste trabalho, os níveis de mRNA dos ER-α no útero de cadelas do
grupo controle (normais) não apresentaram diferenças significativas (P>0,05)
59
quanto as fases do ciclo estral. Estes resultados contrariam as observações,
tanto de Tani et al. (1997), que avaliaram no tecido hipotalâmico de animais
normais, como as de Hatoya et al. (2003), que trabalharam com amostras de
tecidos do hipotálamo, hipófise e ovários de cadelas normais em diferentes
fases do ciclo reprodutivo, os quais reportaram a existência de diferenças
significativas (P<0,01) para as taxas de transcrição dos ER-α.
A despeito da ausência de trabalhos correlatos, os resultados obtidos
contrariam as expectativas de evidenciar valores superiores de mRNA dos ERα
na fase de pro-estro, uma vez que as concentrações de estradiol nessa fase
são superiores aos demais estágios, chegando a atingir valores da ordem de
70 pg/mL (REHM et al. 2007). Apesar da análise estatística não constatar
diferença significativa entre as fases do ciclo estral, o pro-estro apresentou um
valor 1,45 vezes maior (0,66±0,49) quando comparado com o anestro (0,11±
0,49). Infelizmente as concentrações de estradiol realizadas não foram
consistentes, impedindo observações mais detalhadas.
Para os níveis de mRNA dos ER-β em útero de cadelas normais verificou-
se, no presente trabalho, a ocorrência de diferenças significativas (P<0,01) das
fases de anestro, pro-estro e estro para o diestro. Nas fases de anestro, pro-
estro e estro não foram observadas diferenças significativas (P<0,05). Esses
resultados são semelhantes aos encontrados por Hatoya et al. (2003), em
ovários de cadelas normais nas diferentes fases do ciclo reprodutivo, porém
para o ER-α. Entretanto, para ER-β Hatoya et al. (2003) reportaram a
ocorrência de diferenças significativas (P<0,01), com a fase de pro-estro
apresentando maiores taxas de transcrição para ER-β, em relação às demais
fases, nos tecidos do hipotálamo e hipófise. Já no tecido ovariano, Hatoya et al.
(2003) reportaram maiores taxas de expressão gênica de ER-β nas fases de
final de anestro, pro-estro e estro, as quais não diferiram entre si.
A concentração de mRNA dos ER-β na fase de diestro foi muito alta
quando comparada aos valores das outras fases do ciclo estral. Em se
considerando que os níveis de progesterona são normalmente altos nessa
fase, poderíamos hipotetizar que esses animais talvez estivessem na fase final
do diestro, onde a progesterona já se apresenta em declínio.
60
Chama a atenção, as diferenças entre os valores de ER-β nos animais
controle, na fase de diestro e os animais com piometra (16,23±2,66 versus 1,06±
1,82). Talvez as modificações histológicas características da HCE tenham
alguma influência na diminuição da concentração desses receptores, com
diminuição da taxa metabólica (COCK et al. 1997). Novamente, seriam
essenciais as concentrações de estradiol desses animais para considerações
mais consistentes.
Neste trabalho, os níveis de mRNA dos PR no útero de cadelas, tanto no
grupo controle (normais), como no grupo experimental (com piometra), não
apresentaram diferenças significativas (P>0,05) quanto as fases do ciclo estral
avaliadas. Nenhuma literatura consultada apresenta resultados de expressão
gênica de PR em útero de cadelas, sendo encontrado apenas o trabalho de
Leeuwen et al. (2000), os quais clonaram e localizaram o receptor de
progesterona canino em glândulas mamárias, observando baixa expressão do
gene PR em tecido tumorais, quando comparados aos tecidos normais.
Para a padronização da técnica de imunoistoquímica foram utilizados
diferentes clones, tanto para os receptores de estrógeno, como de
progesterona, a fim de se obter marcações positivas que auxiliassem no
entendimento da etiologia da piometra.
Neste estudo observou-se imunoreatividade apenas para receptor de
estrógeno, utilizando o clone PPG5/10 (Dako/M7292), o que vai de encontro
com a literatura consultada. Cock et al. (1997), Vermeirsch et al. (2000),
Dhalwal et al. (2002) e De Bosschere et al. (2002), relataram sucesso com
clone 1D5 (Dako), onde foram observadas imunoreatividade em tecido uterino
de cadela, porém, esses autores não apresentaram fotodocumentação, a
exceção do trabalho de Dhalwal et al. (2002). Neste trabalho, o clone 1D5 foi
inespecífico e marcações positivas satisfatórias para o receptor de estrógeno
somente foram obtidas com a utilização do clone PPG5/10 (Dako/M7292). Brito
et al. (2006), entretanto, demonstraram resultados extremamente satisfatórios
na utilização de clone para estrógeno 1D5 para a marcação de
imunoreatividade em tecido vaginal de cadelas normais, mas não
demonstraram expressão do ER-α para animais portadores de TVT.
Dhalwal et al. (2002) estudando o efeito da escarificação endometrial
sobre receptores de estrógeno e progesterona, mudanças na estrutura
61
histológica e flora uterina, trabalharam com o clone 16 (Nococastra/NCL-L-PGR
312). Foram reportados maiores escores de marcação para os receptores de
progesterona, resultado este, diferente do encontrado neste trabalho, onde este
clone não respondeu imunoreativamente.
Pesquisadores como Cock et al. (1997) e De Bosschere et al. (2002) vem
trabalhando com a expressão de receptores de estrógeno em útero de cadelas
com complexo hiperplasia endometrial cística e normais. Cock et al. (1997)
observaram que, animais do grupo com HEC apresentaram escores
significativamente (P<0,05) maiores de marcação no epitélio superficial e
glandular na fase final de diestro, quando comparados com animais normais na
mesma fase. Ainda identificou um escore mais pronunciado para receptores
estrogênicos em glândulas endometriais de cadelas tratadas com
progestágenos.
Ainda segundo Cock et al. (1997) na fase de anestro, foram observadas
diferenças significativas (P<0,05) apenas no epitélio glandular em animais com
HCE em relação aos normais. Para os demais tecidos avaliados (estroma e
miométrio), não foram encontradas diferenças significativas (P>0,05) entre os
animais normais e com HCE. Os autores concluíram que a expressão de
receptores de estrógenos foram superiores em cadelas com HCE. Os achados
de Cock et al. (1997) foram semelhantes aos obtidos neste trabalho para a fase
de diestro em alguns tecidos avaliados, o que pode ter ocorrido em virtude
desses autores terem feito uso da avaliação da imunoreatividade utilizando
escores em vez da quantificação das células imunopositivas para o receptor de
estrógeno.
Na avaliação desses resultados e tomando-se como base as
concentrações hormonais que identificam essas fases - diestro e anestro -
podemos considerar que durante a fase secretória do ciclo estral, as
concentrações de progesterona estão altas, principalmente no início, com
níveis aproximados de 20ng/mL. Já as concentrações de estradiol aumentam
novamente no início do diestro, ao redor do 9°dia da onda de LH e
permanecem elevados por toda a fase luteal do ciclo estral, 21 a 42pg/mL; o
tecido ovariano incluindo o corpo lúteo é sugerido como fonte de estradiol que
juntamente com o LH e a Prolactina , podem fazer parte do complexo
luteotrófico na cadela (REHM, et al., 2007).
62
Nossos resultados iniciais determinaram concentrações mais baixas de
progesterona em animais com piometra e uma expressão de receptores de
estrógenos superiores em animais acometidos por HCE. Essas observações
podem ter uma importante implicação na patogênese da piometra, como
resultado de um aumento significativo da expressão de receptor de estrógeno,
o endométrio permanece receptivo para os estrógenos circulantes. Isso pode
propiciar uma proliferação contínua das glândulas endometriais, durante uma
fase do ciclo quando há uma forte influência da progesterona, induzindo a
secreção glandular.
De Bosschere et al. (2002), trabalharam com tecidos uterinos
categorizados em: tecido normal, com HCE-mucometra e com endometrite-
piometra nas fases de anestro e diestro. Observaram que o epitélio superficial
e glandular, bem como, estroma e miométrio, não diferiram significativamente
(P>0,05) entre tecidos uterinos normais e com HCE-mucometra. Entretanto,
esses autores relataram a existência de resultados significativos (P<0,05), com
os escores médios de marcação dos tecidos uterinos normais e com HCE-
mucometra superiores quando comparados aos escores de marcação dos
tecidos uterinos com endometrite-piometra. Esses achados de De Bosschere et
al. (2002), são totalmente contrários aos observados neste trabalho, os quais,
por meio de técnica de quantificação dos receptores nas várias camadas
uterinas, observou que em ambas as fases do ciclo estral, anestro e diestro, as
porcentagens de células imunopositivas para o receptor de estrógeno avaliado,
foram significativamente (P<0,01) superiores em animais do grupo
experimental (com piometra) quando confrontados com os animais do grupo
controle (normais) e ainda, para todas as camadas uterinas avaliadas.
Considerando nossos resultados e os achados de Cock et al. (1997), o
aumento da expressão dos receptores de estrógeno em cadelas acometidas de
HCE/piometra, a despeito da presença e severidade de infecção, suporta a
hipótese de que as bactérias não são as causas primárias da piometra.
Estudando escores de marcação para receptores de estrógeno nas
diferentes fases do ciclo reprodutivo de animais normais, Vermeirsch et al.
(1999) reportam intensidades de marcação maiores nos cornos uterinos
durante a fase de pro-estro, com diminuição durante a fase de estro e início de
diestro, aumentado na fase de final de diestro. Durante a fase de anestro foram
63
observados escores altos para esses receptores, indicando uma sensibilidade
estrogênica no estágio de quiescência sexual. Vermeirsch et al. (1999),
relataram ainda, correlações negativas entre os escores de marcação no útero
e os níveis séricos de progesterona. Neste trabalho, também foi verificado
correlação negativa (-0,1236) entre o escore de marcação e os níveis séricos
de progesterona, porém tal correlação pode ser considerada nula, por estar
muito próximo a zero.
Com base nos resultados deste trabalho e em metanálise para os níveis
de estradiol sérico reportados por Cock et al. (1997), observou-se que o grupo
experimental apresentou níveis maiores de estradiol no final do anestro em
relação aos animais do grupo controle. Este fato sugere que tal hormônio seja
o responsável pela antecipação do processo de transcrição nos animais do
grupo experimental. Estas evidências poderiam explicar os baixos níveis de
expressão gênica dos ERs, principalmente ER-β nas fases avaliadas no grupo
experimental, bem como, altas porcentagens de células marcadas e maiores
escores de marcação por meio de imunoistoquímica para os mesmos
receptores. Contudo, para que esta hipótese seja confirmada faz-se necessária
a dosagem de estradiol dos animais deste trabalho.
A etiologia exata da HCE ainda não é totalmente conhecida nas cadelas;
os hormônios esteróides e seus receptores apresentam uma importante
relação com as alterações histológicas visíveis no endométrio, durante o ciclo
estral. Embora modificações nos receptores de estrógenos e progesterona
tenham sido descritos no útero de cadelas com HCE, provavelmente não são
os únicos fatores envolvidos. É claro que mais pesquisas são necessárias
antes que conclusões possam ser feitas; a determinação de concentrações e
ligações com fatores de crescimento em cães normais e com piometra são
particularmente importantes, desde que, existam relações entre esses fatores e
a expressão de receptores de ER e PR descritas na literatura.
64
7. CONCLUSÕES
Com base nos resultados obtidos neste trabalho, conclui-se que:
(i) Os níveis de progesterona sérica em animais acometidos com piometra são
baixos, quando comparados com animais normais em diestro. Os animais
sem comprometimento uterino apresentam perfil sérico de progesterona
compatível com os descritos na literatura: níveis basais na fase de pro-estro,
em elevação no estro, concentrações máximas no diestro e novamente níveis
basais no anestro.
(ii) Os exames histopatológicos sugerem que a piometra é precedida da HEC.
(iii) As expressões gênicas de receptores ER-α são semelhantes em animais
em atividade cíclica e com piometra.
(iv) As expressões gênicas de receptores ER-β apresentam maiores taxas de
transcrição em animais saudáveis, em diestro.
(v) As expressões gênicas de receptores PR são semelhantes em animais em
atividade cíclica e com piometra.
(vi) As porcentagens de células imunopositivas para o receptor de estrógeno,
obtido pela técnica de imunoistoquímica, são superiores nos animais com
piometra para todas as camadas de tecido uterino avaliados.
(vii) As informações relacionadas às dosagens de estradiol sérico, bem como,
as percentagens de células imunopositivas e os escores de marcação para o
receptor de progesterona entre os grupos comparativos, são de fundamental
importância para o melhor entendimento da etiologia da piometra.
65
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