ads:
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO
unesp
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
( MICROBIOLOGIA APLICADA)
PRODUÇÃO DE POLIGALACTURONASE TERMOESTÁVEL PELO FUNGO
Rhizomucor pusillus A 13.36 EM FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO,
PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA ENZIMA
PAULA MENDES DE FREITAS
Tese apresentada ao Instituto de
Biociências da Universidade Estadual
Paulista “Julio de Mesquita
Filho”,
Campus de Rio Claro, como parte dos
requisitos para obtenção do título de
Doutor em Ciências Biológicas (Área de
Concentração: Microbiologia Aplicada).
Rio Claro
Estado de São Paulo
Novembro de 2009
ads:
Livros Grátis
http://www.livrosgratis.com.br
Milhares de livros grátis para download.
UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA
“JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
INSTITUTO DE BIOCIÊNCIAS – RIO CLARO
Une
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS
(MICROBIOLOGIA APLICADA)
PRODUÇÃO DE POLIGALACTURONASE TERMOESTÁVEL PELO FUNGO
Rhizomucor pusillus A 13.36 EM FERMENTAÇÃO EM ESTADO SÓLIDO,
PURIFICAÇÃO E CARACTERIZAÇÃO DA ENZIMA
PAULA MENDES DE FREITAS
Orientadora: Prof
a
Dr
a
Eleni Gomes
Tese apresentada ao Instituto de
Biociências da Universidade Estadual
Paulista “Julio de Mesquita Filho”,
Campus de Rio
Claro, como parte dos
requisitos para obtenção do título de
Doutor em Ciências Biológicas (Área de
Concentração: Microbiologia Aplicada).
Rio Claro
Estado de São Paulo
Novembro de 2009
ads:
Dedico:
Aos meus pais,, Heloisa (in memorian) e Paulo,,
por toda uma vida de dedicação.
À minha irmã,, Helaine,, pela valiosa amizade de
uma vida inteira.
Ao meu marido,, Luiz Henrique,, pelo incansável
companheirismo e incentivo em
todos os
momentos.
À minha filha,, Flaviana,, por ser minha eterna
fonte de amor.
AGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOSAGRADECIMENTOS
AGRADECIMENTOS
A Deus, sempre!
A minha orientadora, Profa. Dra. Eleni Gomes, por ter aceitado me orientar.
Ao Prof. Dr. Roberto da Silva que nunca recusou esclarecer qualquer dúvida ou
problemas que surgissem no laboratório.
A Rodrigo Simões Pereira Leite pela colaboração através de sugestões e dicas sempre
me orientando, nos últimos meses deste trabalho.
A Natalia Martin que sempre dividiu sua experiência no laboratório comigo, me
amparando com sua amizade em todos os momentos necessários.
A Hamilton Cabral pelos inúmeros esclarecimentos, conselhos e pela amizade recente
conseqüente dessa convivência.
Ao grande amigo, Alexandre Monteiro, pelo companheirismo no laboratório e auxílio no
computador, durante a primeira parte deste trabalho e principalmente pela nossa amizade
sincera que perdura até hoje.
Aos demais amigos de laboratório que, ao longo destes anos, me ajudaram de maneira
indireta através da amizade, do bem-querer e da ajuda mútua como a Aline Zorzeto,
Marcia Moretti, Ellen Lago, Fabiana Pavezzi, Gisele Cucolo, Carol Merheb, Andréia
Jacomassi, Lívia Fagali, Lílian, Rodolfo, Heloiza Ferreira e Dênis Silva.
A Alessandro pelo seu eficiente trabalho com o computador todas as vezes que precisei.
Ao Claudinei por seu trabalho técnico no laboratório de Microbiologia Aplicada.
A coordenadora Sandra Mara Martins Franchetti que tantas vezes me atendeu
solicitamente resolvendo inúmeros problemas.
Aos funcionários da Secretária de Pós-Graduação em Ciências Biológicas do Instituto
de Biociências de Rio Claro, pela eficiência e boa vontade com que trabalham.
Ao CNPq pela concessão de bolsa.
A CAPES e FAPESP pelo suporte financeiro.
A todos aqueles que de alguma forma colaboraram para a realização deste trabalho.
Obrigada!
“Sonhe com aquilo que você quiser.
Seja o que você quer ser,
porque você possui apenas uma vida
e nela só se tem uma chance
de fazer aquilo que quer.
Tenha felicidade bastante para fazê-la doce.
Dificuldades para fazê-la forte.
Tristeza para fazê-la humana.
E esperança suficiente para fazê-la feliz.
As pessoas mais felizes não têm as melhores coisas.
Elas sabem fazer o melhor das oportunidades que
aparecem em seus caminhos.
A felicidade aparece para aqueles que choram.
Para aqueles que se machucam.
Para aqueles que buscam e tentam sempre.
E para aqueles que reconhecem a importância das
pessoas que passam por suas vidas.”
Clarice Lispector
RESUMO
O fungo Rhizomucor pusillus A 13.36, quando cultivado por fermentação em
estado sólido utilizando farelo de algodão como fonte de carbono por 72 horas,
produziu altos níveis de poligalacturonase (18,6U/g). Essa enzima apresentou
atividade máxima em pH 5,5 e em 55
o
C. A poligalacturonase bruta apresentou
estabilidade na faixa de pH entre 4,5 e 6,5, com uma atividade residual de 91,3% no
pH 6,5, e também até 70
o
C por 1h, com atividade residual de 80% nas temperaturas
de 55 a 60
o
C. Esta enzima foi purificada por concentração e uma combinação de
procedimentos de gel filtração e cromatografia de troca-iônica. A massa molecular
da enzima foi 53,7kDa. A focalização isoelétrica mostrou uma única banda cujo
ponto isoelétrico (pI) foi 3,8. A atividade máxima da enzima purificada também
ocorreu em pH 5,5 e a 55
o
C. A enzima purificada foi estável na faixa de pH 4,5 a 6,5,
com atividade residual na faixa de 80 a 100%, e também até 70
o
C por 1h, com
atividade residual de 100% nas temperaturas de 55 a 60
o
C. A enzima purificada foi
totalmente inibida por Ca
2+
, Cu
2+
, Hg
2+
e 80% inibida por Fe
2+
e Ag
+
. Mg
2+
estimulou
a atividade da poligalacturonase em 100%. Entre os substratos avaliados, a pectina
de citrus (D.E. 92%) foi o que mais estimulou a ação da enzima. A afinidade por
pectinas de alta esterificação e a ausência de atividade quando o ácido
poligalacturônico foi usado como substrato, indica que a enzima purificada é uma
polimetilgalacturonase. Os resultados obtidos pela cromatografia de papel
demonstraram que a polimetilgalacturonase purificada possui o modo de clivagem
endo/exo misto. O K
m
com pectina de citrus foi 10,78mg mL
-1
e a V
max
foi
2379,04µmolmin
-1
mg
-1
. As possíveis aplicações desta enzima incluem composição
de detergentes, processamento têxtil e de fibras de celulose, degradação ou
modificação de material vegetal, aditivo para alimentação animal e no
processamento de vinhos e sucos.
Palavras-chave: Rhizomucor pusillus, fungo termotolerante, pectinase,
poligalacturonase, polimetilgalacturonase, purificação, termoestabilidade.
ABSTRACT
Rhizomucor pusillus A 13.36 produced high levels of polygalacturonase
(18.6U/g) in solid state fermentation in medium composed by cotton bran for 72
hours. This enzyme showed maximal activity at pH 5.5 and 55
o
C. Crude
polygalacturonase was stable from pH 4.5 to 6.5, with remaining activity of 91,3% at
pH 6.5, and stable until 70
o
C for 1h, with remaining activity of 80% at 55-60
o
C. This
enzyme was purified by concentration and a combination of gel filtration and ion
exchange chromatographic procedures. The molecular mass of the enzyme was
53.7kDa. Isoelectric focusing showed a single band with an isoelectric point (pI) of
3.8. The purified enzyme also showed maximum activity at pH 5.5 and 55
o
C. The
purified enzyme was stable from pH 4.5 to 6.5, with remaining activity range of 80 to
100%, and stable until 70
o
C for 1h, with remaining activity of 100% at 55-60
o
C. The
purified enzyme was totally inhibited by Ca
2+
, Cu
2+
, Hg
2+
and 80% inhibited by Fe
2+
and Ag
+
. Mg
2+
increased poligalacturonase activity in 100%. Citrus pectin (D.E. 92%)
was found to be the preferred substrate among the different substrates tested in the
enzyme assay. The affinity for high pectin esterification and the lack of activity when
polygalacturonic acid was used as substrate, indicates that the enzyme is a
polymethylgalacturonase. The results obtained by paper chromatography showed
that the purified polymethylgalacturonase has the mixed endo/exo mode of cleavage.
The K
m
with citrus pectin was 10.78mg mL
-1
and the V
max
was 2379.04µmolmin
-1
mg
-
1
. The possible applications of this enzyme include the composition of detergents,
textile and cellulosic fiber processing, degradation or modification of plant material,
animal feed additive and wine and juice processing.
Keywords: Rhizomucor pusillus, thermotolerant fungus, pectinase,
polygalacturonase, polymethylgalacturonase, purification, thermostability.
LISTA DE FIGURAS
Figura 01: Representação esquemática de alguns
processos de micro-escala que ocorrem durante a FES...........................................19
Figura 02: A) Molécula de homogalacturonana. B) Molé-
cula de ramnogalacturonana. C) Neutralização das cargas
negativas de moléculas de homogalacturonana por íons
Ca
2+
............................................................................................................................25
Figura 03: A estrutura básica da pectina. Representações
esquemáticas das estruturas da pectina convencional (A)
e da alternativa proposta recentemente (B)...............................................................26
Figura 04: Produção de PGs por R. pusillus A 13.36
utilizando fermentação em estado sólido com farelo de
algodão, farelo de trigo e misturas de farelo de trigo e
sabugo de milho.........................................................................................................57
Figura 05: Perfil de eluição de PGs da coluna
cromatográfica Sephadex G-150 previamente
equilibrada com 30mM de tampão MES em pH 6,5..................................................59
Figura 06: Perfil de eluição de PGs da coluna
cromatográfica Q-Sepharose previamente equilibrada
com 30mM de tampão MES em pH 6,5 com gradiente de
NaCl (0-1M)................................................................................................................60
Figura 07: Perfil de eluição de PGs da coluna
cromatográfica Sephacryl S-100 previamente equilibrada
com 20mM de tampão MES em pH 6,5 com 150mM de
NaCl............................................................................................................................61
Figura 08: SDS-PAGE da PG produzida pelo fungo
R. pusillus A 13.36 sob FES.......................................................................................64
Figura 09: Efeito do pH sobre a atividade da PG produzida
pelo fungo R. pusillus A 13.36....................................................................................66
Figura 10: Efeito da temperatura sobre a atividade da PG
produzida pelo fungo R. pusillus A. 13.36..................................................................67
Figura 11: Efeito do pH sobre a estabilidade da PG
produzida pelo fungo R. pusillus A 13.36...................................................................69
Figura 12: Efeito da temperatura sobre a estabilidade da PG
produzida pelo fungo R. pusillus A 13.36...................................................................70
Figura 13: Especificidade ao substrato da enzima
polimetilgalacturonase produzida por R. pusillus A 13.36..........................................74
Figura 14: Cromatografia de papel dos produtos de hidrólise
da polimetilgalacturonase purificada utilizando pectina de
citrus (92% D.E.)........................................................................................................76
LISTA DE TABELAS
Tabela 01: Quantidade das principais culturas e tipo dos
resíduos produzidos no Brasil....................................................................................21
Tabela 02: Componente da parede celular de algumas
culturas do Brasil........................................................................................................22
Tabela 03: Vantagens e desvantagens da FES....................................23
Tabela 04: Funções e aplicações das pectinases na
indústria de alimentos e vinhos...............................................................................35
Tabela 05: Propriedades bioquímicas e físico-químicas de
algumas pectinases....................................................................................................46
Tabela 06: Produção de pectinase por R. pusillus A 13.36
em FES.......................................................................................................................56
Tabela 07: Síntese dos dados do processo de purificação
da PG produzida por R. pusillus A 13.36 sob FES....................................................63
Tabela 08: Efeito de potenciais inibidores e estimuladores
sobre a atividade da PG produzida por R. pusillus A 13.36.......................................72
Tabela 09: Propriedades da polimetilgalacturonase purifica-
da produzida por R. pusillus A 13.36........................................................................77
LISTA DE ABREVIATURAS E SÍMBOLOS
Da: daltons
D.E.: Grau de esterificação (do inglês: degree of esterification)
DTT: 1,4-ditiotreitol
Endo-PG: endopoligalacturonase
Exo-PG: exopoligalacturonase
FES: Fermentação em estado sólido
GRAS: generally regarded as safe
HEPES: ácido etanossulfônico de 4-2 hidroxietil-piperazina-1
HG: homogalacturonana
IEF: Focalização isoelétrica
K
m
: constante de Michaelis
MES: ácido 4-morfolinoetanossulfônico
PG: poligalacturonase
pI: ponto isoelétrico
PL: pectina liase
RGI: ramnogalacturonana I
RG II: ramnogalacturonana II
rpm: rotações por minuto
SDS-PAGE: Eletroforese em gel de poliacrilamida contendo dodecil sulfato de sódio
TAPS: ácido N-[tris-(hidroximetil)-metil]-3-aminopropanossulfônico
t
1/2
: tempo de meia vida
Tris: tris (hidroximetil) aminometano
U: unidade de PG
V
max
: velocidade máxima
SUMÁRIO
Página
1.INTRODUÇÃO........................................................................................................14
2.REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...................................................................................17
2.1.Fermentação em Estado Sólido (FES) utilizando
resíduos agro-industriais...........................................................................17
2.2.Pectina e classificação de pectinases.......................................................24
2.2.1.Protopectinases...........................................................................27
2.2.2.Esterases.....................................................................................27
2.2.3.Pectina acetil esterases...............................................................28
2.2.4.Polimetilgalacturonases...............................................................28
2.2.5.Poligalacturonases.......................................................................28
2.2.6.Liases...........................................................................................29
2.2.7.Pectato-liase................................................................................29
2.2.8.Pectina-liase.................................................................................29
2.2.9.RG ramnohidrolase......................................................................30
2.2.10.RG galacturonohidrolase...........................................................30
2.2.11.RG hidrolase..............................................................................30
2.2.12.RG liase.....................................................................................30
2.2.13.RG acetilesterases.....................................................................30
2.2.14 RG xilogalacturonase.................................................................31
2.3.Pectinases produzidas por microrganismos e sua
importância industrial.................................................................................31
2.4.Microrganismos termofílicos e enzimas
termoestáveis............................................................................................37
2.5.Purificação de pectinases..........................................................................43
3.OBJETIVOS............................................................................................................48
3.1.Objetivo geral.............................................................................................48
3.2.Objetivos específicos.................................................................................48
4.MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................49
4.1.Microrganismo...........................................................................................49
4.2.Obtenção da enzima por FES...................................................................49
4.3.Medida da atividade enzimática (PG)........................................................50
4.4.Determinação de proteínas totais..............................................................50
4.5.Purificação da enzima...............................................................................50
4.5.1.Concentração da enzima e cromatografia
de filtração em gel – Sephadex G-150.........................................50
4.5.2.Ultrafiltração e cromatografia de troca
aniônica – Q-Sepharose..............................................................51
4.5.3.Concentração e cromatografia de filtração
em gel – Sephacryl S-100............................................................51
4.6.SDS-PAGE......................................................................................51
4.7.Focalização isoelétrica..............................................................................52
4.8.Caracterização da PG purificada...............................................................52
4.8.1. Determinação do pH e temperatura
ótimos para a atividade da enzima..............................................52
4.8.2.Determinação da estabilidade da enzima
frente a variações de temperatura................................................53
4.8.3.Determinação da estabilidade da enzima
frente a variações de pH..............................................................53
4.8.4.Determinação do efeito de íons metal e
reagentes sobre a atividade da PG..............................................53
4.8.5.Determinação da especificidade ao
substrato.......................................................................................53
4.8.6. Identificação dos produtos de hidrólise..................................54
4.8.7.Determinação do K
m
e V
max
..........................................................54
5.RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................55
6.CONCLUSÕES.......................................................................................................78
7.REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.......................................................................79
14
1.INTRODUÇÃO
A economia brasileira é uma das mais importantes economias do mundo
baseadas na agricultura, produzindo e exportando café, açúcar de cana, soja,
mandioca, frutas, entre outros. Entretanto, a grande produção desses produtos
agrícolas gera uma grande quantidade de resíduos. Nos últimos anos houve um
aumento na tentativa de tornar mais eficiente a utilização desses resíduos, cuja
disposição no meio ambiente causa sérios problemas de poluição. Com o advento da
inovação biotecnológica na área de enzimas e tecnologia das fermentações, novas
perspectivas estão sendo criadas. Umas das aplicações em potencial desses
resíduos pode ser sua utilização como fonte de carbono em bioprocessos para
obtenção de produtos químicos e de produtos de maior valor agregado, como
enzimas, álcoois, proteínas, ácidos orgânicos, aminoácidos, metabólitos secundários
biologicamente ativos e compostos de aroma (UENOJO e PASTORE, 2007). A
utilização de enzimas aumentou acentuadamente nas indústrias farmacêutica,
alimentícia, de papel e têxtil (GRAMINHA et al, 2008).
Com relação às técnicas de fermentação, a FES (Fermentação em Estado
Sólido) geralmente é preferida por permitir a produção de enzimas brutas mais
concentradas e, conseqüentemente, com menores custos de extração e purificação
(UENOJO e PASTORE, 2007). A FES têm sido usada para a produção de enzimas
por fungos. Até o presente momento a maior parte deste trabalho têm sido feita em
escala laboratorial, onde é mais fácil controlar a temperatura ótima de crescimento.
Entretanto, nos bioreatores de FES em larga escala, o substrato frequentemente
atinge temperaturas acima da ótima para o processo, devido a dificuldades de
remover calor dos substratos sólidos de baixo conteúdo de água (SANTOS et al,
2004)
Uma das vantagens da FES é a possibilidade de utilização dos resíduos
sólidos agrícolas e agroindustriais como meio para o crescimento microbiano. Tais
resíduos têm dado bons resultados na produção de enzimas incluindo pectinases,
celulases, xilanases, amilases, ligninases, inulinases, quitinases e fitases
(GRAMINHA et al, 2008).
As pectinases constituem um grupo heterogêneo de enzimas que catalizam a
degradação das pectinas, as quais são polissacarídeos estruturais presentes nas
células vegetais e responsáveis pela manutenção da integridade dos tecidos
15
vegetais (COUTO e SANROMÁN, 2006). A classificação destas enzimas é baseada
no modo de ataque à cadeia de ácido poligalacturônico dos polímeros pécticos,
sendo descritos três tipos de enzimas: as esterases, as despolimerizantes
(hidrolases e liases) e as protopectinases. A classificação ainda pode ser baseada
na afinidade pelo substrato (pectina ou pectato) e na região em que atuam na
molécula, podendo, neste caso, atuar de forma randômica (atividade endo), a partir
da extremidade não redutora da molécula (atividade exo) ou pelo modo de clivagem
endo/exo misto (FOGARTY e WARD, 1972; PILNIK e ROMBOUTS, 1981; SAKAI et
al, 1993; ALKORTA et al, 1998; KYRIAKIDIS, 1999; COOK et al, 1999; KASHYAP et
al., 2001).
As enzimas termoestáveis, de maneira geral, apresentam vantagens para a
aplicação na indústria, visto que processos biotecnológicos conduzidos em elevadas
temperaturas têm um risco significativamente reduzido de contaminação por
microrganismos mesófilos, que são a maioria em um ambiente industrial. As
temperaturas mais elevadas favorecem a solubilidade de substratos e produtos e
aumentam as taxas de reação por redução da viscosidade e por aumento do
coeficiente de difusão dos substratos. Além disso, as enzimas termoestáveis
apresentam maior resistência à ação de proteases e à desnaturação por alguns
solventes orgânicos. Ainda, as enzimas extracelulares constituem importante modelo
para entendimento dos mecanismos de termoestabilidade e de atividade em altas
temperaturas, os quais são usados nos processos de engenharia de proteínas
(GOMES et al, 2007).
Existe uma estreita relação entre o nicho ocupado por um microrganismo e as
características de suas enzimas intra e extracelulares. Espera-se que
microrganismos termofílicos produzam enzimas extracelulares capazes de tolerar
uma temperatura correspondente a, no mínimo, aquela ótima para seu crescimento,
ou seja, acima de 45
o
C. Estudos com enzimas de termofílicos têm mostrado que
essa relação é verdadeira, estimulando o isolamento de novas linhagens
termofílicas, assim como a caracterização das enzimas produzidas e o entendimento
dos fatores que levam a sua termoestabilidade (GOMES et al, 2007).
Durante o estudo de uma enzima, a fim de aumentar sua estabilidade,
atividade e especificidade, torna-se necessário sua purificação. A otimização de um
protocolo de purificação envolve muita experimentação do tipo tentativa e erro,
mesmo quando se conhecem as características físico-químicas da proteína a ser
16
purificada e muitas vezes é imprevisível seu comportamento no decorrer do processo
de purificação. O grande desafio deste processo é o trabalho para se encontrar as
melhores estratégias e, se for o caso, adequar a metodologia para a escala de
produção pretendida, garantindo que o produto final tenha todas as características
necessárias para a sua aplicação (MALLER, 2008).
A purificação e o avanço do conhecimento sobre as propriedades bioquímicas
das pectinases são essenciais para pesquisas relacionadas ao seu modo de ação e
para uma aplicação industrial mais eficiente (MALLER, 2008).
Os estudos com produção, purificação e caracterização de enzimas
pectinolíticas microbianas são extensivamente relatados. A produção de pectinases
ocupa cerca de 10% da produção total de preparações de enzimas. Estas enzimas
têm grande importância nas indústrias onde possuem várias aplicações incluindo o
amadurecimento de frutas, a clarificação e redução da viscosidade em sucos de
frutas, tratamento preliminar do suco de uva para indústrias vinícolas, extração de
polpa de tomate, fermentação de chá e café, degomagem de fibras na indústria têxtil
e de papel, nutrição animal, enriquecimento protéico de alimentos infantis e extração
de óleos. Entretanto, há poucos estudos sobre produção de poligalacturonases por
fungos do gênero Rhizomucor. Apesar de R. pusillus ter sido isolado pela primeira
vez há mais de um século, sendo o primeiro fungo termofílico a ser descrito, não há
nenhum relato na literatura de purificação de poligalacturonase desta espécie.
Resultados anteriores demonstraram que R. pusillus A 13.36 é um excelente
produtor de poligalacturonases por fermentação em estado sólido. Com base nestes
fatos e levando-se em conta a importância dos trabalhos de purificação e
caracterização de enzimas de microrganismos termofílicos ou termotolerantes, como
fungos e bactérias, esse trabalho foi desenvolvido com a intenção de produzir e
purificar uma possível poligalacturonase do fungo Rhizomucor pusillus A 13.36
visando-se avaliar as propriedades bioquímicas da enzima.
17
2.REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1.Fermentação em Estado Sólido (FES) utilizando resíduos agro-industriais
O aumento da demanda por energia tem focalizado a atenção do mundo na
utilização de recursos renováveis, particularmente resíduos agrícolas e
agroindustriais. A matéria orgânica contida em materiais, como farelo de trigo, casca
de arroz, palha de milho, sabugo de milho, cascas e sementes de frutas, bagaços de
laranja e de cana-de-açúcar e resíduos da indústria de papel, tem como
componentes a celulose, amido, lignina, xilana e pectina. Diversos microrganismos
são capazes de usar estas substâncias como fonte de energia e de carbono e
produzir enzimas e outros produtos de alto valor (ANTRANIKIAN, 1992; DA SILVA,
1997).
Entre os processos usados para a produção de enzimas microbianas, a
fermentação em estado sólido (FES), a qual pode ser definida como o crescimento
de microrganismos (principalmente fungos) em materiais sólidos úmidos em
ausência de água livre abundante entre as partículas, tem sido efetiva para produção
de pectinase por fungos, uma vez que o baixo teor de água disponível é similar ao
habitat natural desses microrganismos, o que os torna o grupo mais adaptado a esse
processo (BEROVIC e OSTROVERSNIK, 1997; MAMMA et al, 2008). O processo de
fermentação em estado sólido é um atrativo porque apresenta alta produtividade por
volume de reator, baixo capital e custos operacionais, menor requerimento de
espaço, equipamento simplificado e processamento “downstream”* mais fácil em
comparação com aquele da fermentação submersa. Há também evidência que
algumas enzimas são menos afetadas pela repressão catabólica, do que as obtidas
por fermentação submersa. O uso de FES para produção de pectinase foi proposto
usando diferentes resíduos agrícolas e agroindustriais como substratos sólidos como
farelo de trigo, farelo de soja, bagaço de maçã, bagaço de morango, polpa de
beterraba, polpa e casca de café, cacau, casca de limão e laranja e bagaço de cana
de açúcar (MAMMA et al, 2008).
* O grupo de técnicas, tais como a centrifugação, filtração e cromatografia, usadas para recuperar e
purificar os produtos de uma conversão enzimática ou de um processo de produção microbiológica
http://files.efbpublic.org/downloads/whatswhat_in_biotech_Portuguese.pdf.
18
Os fungos são considerados os microrganismos mais adaptados para
FES pois suas hifas podem crescer nas superfícies das partículas e penetrar nos
espaços interpartículas colonizando os substratos sólidos (SANTOS et al, 2004;
GRAMINHA et al, 2008). A Figura 1 mostra um esquema de alguns dos processos
que ocorrem durante a FES. Após a esporulação, a hifa do fungo se desenvolve em
um emaranhado micelial, este por sua vez, pode projetar-se formando hifas aéreas
ou penetrar o substrato. Os espaços vazios entre as hifas aéreas são
frequentemente preenchidos por gás (g), enquanto que os espaços vazios entre o
emaranhado micelial e entre os substratos são preenchidos por líquido (l). A
atividade metabólica ocorre principalmente próxima à superfície do substrato e entre
os poros, contudo regiões expostas do micélio (hifas aéreas), também mostram
metabolismo e servem como transportadoras de substâncias para as hifas
penetrativas. Enzimas hidrolíticas (azul) são produzidas pelo micélio difundem para a
matriz sólida e catalisam a degradação de macromoléculas em unidades menores
(verde). O O
2
é consumido e o CO
2
, H
2
O, calor e produtos bioquímicos interessantes
são produzidos durante a fermentação. Portanto, gradientes se desenvolvem dentro
de biofilmes que, por exemplo, forçam o O
2
a se difundir para a fase gasosa em
regiões mais profundas do biofilme (lilás) e o CO
2
difunde para fases mais gasosas
(vermelha). O desenvolvimento de calor (Q) faz com que ocorra rapidamente um
aumento na temperatura (T), que é um sério problema durante a FES. O calor é
removido do substrato via condução e evaporação (azul escuro). O sistema de
equilíbrio da H
2
O também inclui a H
2
O que passa lentamente pelo micélio, o
consumo de H
2
O durante as reações de hidrólise e a produção da mesma durante a
respiração. Outro importante fator é o pH local, que pode ser mudado devido a
liberação de ácidos carbônicos e troca de amônia (cinza) (HÖLKER e LENZ, 2005).
Os processos de FES simulam o habitat de muitos fungos filamentosos como
ascomicetos, deuteromicetos e basidiomicetos que se desenvolveram em ambientes
terrestres em substratos úmidos. Estes fungos e as suas enzimas, bem como seus
esporos ou metabólitos, são bem ajustados ao crescimento em substratos sólidos
úmidos. Os esporos de fungos produzidos por FES mostram estabilidade mais alta,
são mais resistentes à secagem e exibem taxas de germinação mais altas por
períodos de tempo extensos depois da liofilização do que esporos produzidos por
fermentação submersa. Isto pode ser atribuído ao fato de que conidiósporos
produzidos em FES tem uma alta hidrofobicidade causada por uma proteína tipo
19
hidrofobina ou também por possuírem uma parede celular mais forte e um volume
celular menor. A fermentação em estado sólido só encontrou aplicações restritas em
processos que usam organismos unicelulares (PEDROLLI et al, 2009). Como os
processos de FES são executados em baixa atividade de água, o crescimento de
bactérias e leveduras contaminantes é minimizado (HÖLKER e LENZ, 2005).
Figura 1: Representação esquemática de alguns processos de micro-escala que
ocorrem durante a FES (legenda no texto) (HÖLKER e LENZ, 2005).
Desde 1986, no Brasil, uma série de projetos de pesquisa visando a adição de
valor a produtos agrícolas tropicais, por FES, foi desenvolvida devido aos altos
montantes de resíduos agrícolas gerados no país (SOCCOL e VANDENBERGHE,
2003). Assim, produtos químicos, etanol, proteína celular (SPC), cogumelos,
enzimas, ácidos orgânicos, aminoácidos, metabólitos secundários biologicamente
ativos, foram obtidos a partir dessas matérias-primas por meio da técnica de FES
(COUTO e SANROMÁN, 2006).
Nos últimos anos, FES recebeu mais interesse de pesquisadores, desde que
vários estudos de enzimas e outras substâncias mostraram que FES pode dar
rendimentos mais altos ou produtos com melhores características do que a
fermentação submersa. Além do mais, os custos são muito mais baixos devido à
utilização eficiente e a adição de valor de resíduos. A grande vantagem dos
processos de FES é a matéria-prima extremamente barata usada como substrato
principal. Por isso, a FES é certamente um bom modo de utilizar os resíduos sólidos
20
ricos e nutritivos como substrato. Resíduos agrícolas são produzidos em enormes
montantes e desde que eles são ricos em carboidratos e outros nutrientes, eles
podem servir de substrato para a produção de químicos e enzimas usando a técnica
de FES (COUTO e SANROMÁN, 2006).
A natureza do substrato sólido empregado é o fator mais importante que afeta
processos de FES e a sua seleção depende de vários fatores, principalmente
relacionados com preço e disponibilidade podendo, assim, implicar o refugo de
vários resíduos agro-industriais. No processo de FES o substrato sólido não só
fornece os nutrientes à cultura, mas também funciona como suporte para as células
microbianas. Entre vários fatores, que são importantes para o crescimento
microbiano e a atividade em um determinado substrato, o tamanho da partícula e a
atividade de água/nível de umidade são os mais críticos (COUTO e SANROMÁN,
2006).
Geralmente, as menores partículas do substrato fornecem uma área
superficial maior para o ataque microbiano, mas se elas forem pequenas demais
pode resultar em aglomeração do substrato bem como um crescimento limitado. Ao
contrário, partículas maiores fornecem melhor aeração, mas uma superfície limitada
para o ataque microbiano. Por isso, um tamanho de partícula ideal deve ser
selecionado para cada processo determinado (PANDEY et al, 1999).
A utilização desses resíduos agroindustriais, de um lado, fornece substrato a
um custo acessível e, no outro, ajuda na solução de problemas de poluição, que
acabariam causando se não fossem usados (PANDEY et al, 1999). Devido ao fato
desses resíduos serem nutritivos, uma pequena porção é usada diretamente como
alimento ou como componente para dietas de ruminantes formuladas
industrialmente. A tabela 1 apresenta as principais culturas cultivadas no Brasil e o
tipo de resíduos produzidos (GRAMINHA et al, 2008).
21
Tabela 1: Quantidade das principais culturas e tipo dos resíduos produzidos no
Brasil (GRAMINHA et al, 2008).
Espécies Culturas Quantidade
(kg matéria
seca/toneladas)
Resíduos
Produzidos
Gossypium spp.
Algodão 530 Semente, farelo e
cera
Arachis
hypogaea
Amendoim 740 Casca e cera
Glycine max
Soja 750 Casca e cera
Oryza sativa
Arroz 557 Palha e farelo
Triticum spp.
Trigo 475 Palha e farelo
Hordeum
vulgare
Cevada 492 Palha e farelo
Zea mays
Milho 550 Colmo, folha e
sabugo
Saccharum spp.
Cana-de-
açúcar
150 Bagaço de cana
Segundo Graminha e colaboradores (2008) atividades agroindustriais
produzem dois grupos de resíduos, os resíduos fibrosos e os farelos. Os resíduos
fibrosos incluem: polpa de citrus, farelo de glúten de milho, casca de soja, resíduos
da fabricação da cerveja (cevada), bagaço da cana-de-açúcar, palha de milho, palha
de soja, palha de algodão, casca de algodão, casca de soja, casca de amendoim e
restos de colheita de sementes de gramíneas forrageiras. Os farelos incluem arroz,
amendoim, soja e algodão.
Fibras são a fração predominante da parede celular de plantas e consistem
principalmente de carboidratos. Os principais componentes das fibras são celulose,
hemicelulose e lignina. Celulose e hemicelulose representam a maior fração da
parede celular de plantas e dos resíduos agrícolas como palha do trigo, do milho, do
arroz, da soja, do algodão, bagaço da cana-de-açúcar e bagaço de laranja
(GRAMINHA et al, 2008). A tabela 2 mostra os principais componentes da parede
celular de algumas culturas do Brasil (modificado de GRAMINHA et al, 2008).
22
Tabela 2: Componentes da parede celular (g/kg matéria seca) de algumas
culturas do Brasil ( modificado de GRAMINHA et al, 2008)
Culturas Celulose Hemicelulose
Lignina
Milho
Palha 335 249 78
Pedúnculo 336 237 87
Folha 245 273 54
Sabugo 377 396 73
Farelo 338 393 49
Fibra de coco 360-430 15-25 410-450
Palha de trigo 330-380 260-320 170-190
Farelo de trigo 300 500 150
Farelo de arroz 350 250 170
Palha de arroz 280-360 230-280 120-140
Farelo de cevada 230 320 214
Palha de cevada 310-450 270-380 140-190
Farelo de aveia 493 250 180
Palha de aveia 300 220 85
Semente de uva 71 311 435
O farelo de trigo é um dos substratos ideais para a produção de enzimas, pois
seus constituintes são soltos e fácil de ventilar, tem uma área de superfície grande e
é abundante em nitrogênio, carbono e sais inorgânicos (DEBING et al, 2006).
O meio sólido deve ser considerado um meio heterogêneo em termos de
população microbiana e concentração de solutos. Quanto maior for a
heterogeneidade da mistura na fermentação sólida, menos precisos são os
resultados. Para reduzir essa heterogeneidade pode-se usar sistema com
misturador, microrganismos com maior capacidade de expansão do crescimento no
substrato, como fungos filamentosos e a aeração forçada para remover o CO
2
,
dissipar calor e distribuir umidade (GRIFFIN, 1981; GERVAIS e MOLIN, 2003).
Uma grande limitação da FES é a dificuldade de remoção do excesso de calor
gerado pelo metabolismo do microrganismo, devido à baixa condutividade térmica do
meio sólido. Na prática, a FES requer aeração como veículo de dissipação de calor,
muito mais do que para suprimento de O
2
. O aumento da temperatura num biorreator
23
provoca a desnaturação do produto, principalmente de substâncias termolábeis
(VIESTURS et al, 1981; SANTOS et al, 2004)
Apesar das inúmeras vantagens a FES no âmbito industrial é, no momento,
de difícil aplicação. Os principais obstáculos são a baixa receptividade do processo à
regulação, as condições de fermentação fortemente heterogêneas e daí muitas
vezes insatisfatória reprodutibilidade dos resultados, difícil extrapolação,
determinação da biomassa frequentemente inviável e a complicada purificação dos
produtos por processos “downstream” decorrente do uso de substratos orgânicos
(HÖLKER E LENZ, 2005; PEDROLLI et al, 2009). A tabela 3 resume as vantagens e
desvantagens da FES (COUTO e SANROMÁN, 2006).
Tabela 3: Vantagens e desvantagens da FES (COUTO e SANROMÁN, 2006).
Vantagens Desvantagens
Alta produtividade Dificuldades no aumento da escala de produção
Boa circulação de oxigênio “Mix “ de baixa eficácia
Baixo custo Difícil controle dos parâmetros do processo (pH,
calor, umidade, condições nutricionais,...)
Requerimentos de energia e
custos reduzidos
Problemas com acúmulo de calor
Tecnologia simples Produto de maior impureza, aumentando os
custos de recuperação do produto
Problemas operacionais escassos
Assemelha o habitat natural para
muitos microrganismos.
Uma analise crítica da literatura mostra que a produção de compostos
relevantes para a indústria de processamento de alimentos, por FES oferece muitas
vantagens. A produção de enzima por FES é muito mais alta do que a obtida por
fermentação submersa. Entre os inúmeros metabólitos produzidos por FES estão as
enzimas (α-amilase, frutosil transferase, lipase, pectinase), ácidos orgânicos (ácido
láctico, ácido cítrico) e goma xantana (COUTO e SANROMÁN, 2006).
A FES representa uma solução em potencial para alimentação de animais em
países em desenvolvimento devido a alta quantidade de resíduos produzidos em
diversos países (~3,5 bilhões de toneladas por ano). A vantagem do uso da FES é o
24
sistema que requer pouca tecnologia e a possibilidade de ser realizada nas próprias
fazendas (GRAMINHA et al, 2008).
2.2.Pectina e classificação de pectinases
A parede celular das plantas é uma estrutura biológica complexa contendo
polímeros e outras moléculas cujas proporções e organização estrutural varia com o
tipo e a idade da planta. O crescimento da parede primária começa com a elongação
da célula da planta. Durante o progressivo espessamento da parede secundária, a
deposição de celulose excede a de xilana, pectina e ácido ferrúlico, os quais
deixaram de ser adicionados à parede e começa a deposição de lignina (GRAMINHA
et al, 2008).
As pectinas são uma família de polissacarídeos complexos que promovem a
aderência das paredes celulares entre células vegetais adjacentes formando uma
estrutura rígida pela interação com a celulose, a hemicelulose e a lignina (FRY,
1986; MC NEILL et al, 1984; FOGARTY e WARD, 1972). Polissacarídeos pécticos
são formados por duas regiões interligadas: a homogalacturonana e a
ramnogalacturonana (Figura 2). A primeira é um homopolímero formado por uma
cadeia linear de resíduos de ácido D-galactopiranosilurônico unidos por ligações α-
1,4-D-glicosídicas. Esses resíduos de ácido D-galacturônico podem ter alguns de
seus grupos carboxila metil-esterificados ou O-acetilados nos carbonos 3 ou 2
(Figura 2). A ramnogalacturonana é um heteropolímero que tem a estrutura principal
formada por repetidas unidades de ácido galactopiranosilurônico ligado à ramnose
por ligações β–(1→2) e β–(1→4) e cadeias laterais consistindo de arabinose e
galactose (RIDLEY et al, 2001; PÉREZ et al, 2000). Estes polissacarídeos acídicos,
negativamente carregados podem ser neutralizados por íons, principalmente Ca
2+
(Figura 2C) (JAYANI et al, 2005)
Resíduos de ácido D-galacturônico podem ter substituintes como metanol,
ácido acético e xilose, nas regiões “lisas” (homogalacturonana) e heterogêneas
(ramnogalacturonana). Os grupos carboxila da pectina podem estar parcialmente
esterificados com metanol (PILNIK e VORAGEN, 1970) e os grupos hidroxila, na
posição 2 e/ou 3 de resíduos de ácido galacturônico são, algumas vezes, acetilados
(ROMBOULTS e THIBAULT, 1986). Os níveis de metilação ou acetilação são
25
definidos como o número de grupos carboxila ou hidroxila esterificado por 100
unidades de ácido galacturônico (BELDMAN, 1996).
A)
B)
C)
Figura 2: A) Molécula de Homogalacturonana. B) Molécula de Ramnogalacturonana.
C) Neutralização das cargas negativas de moléculas de homogalacturonana por íons
Ca2+. (figuras originais: http://www.uky.edu/~dhild/biochem/11B/lect11B.html)
Pedrolli e colaboradores (2009) relatam três grupos maiores de
polissacarídeos pécticos:
A homogalacturonana (HG) é um polímero linear formado por ácido D-
galacturônico o qual pode ser acetilado e/ou metil esterificado.
26
A ramnogalacturonana I (RGI) é composta de repetidos dissacarídeos ácido
galacturônico-ramnose. Os resíduos galacturônicos podem ser acetilados e ambos
os resíduos podem carregar cadeias laterais de açúcares neutros como galactose,
arabinose e xilose.
A ramnogalacturonana II (RGII) é uma cadeia de homogalacturonana com
cadeias laterais complexas ligadas aos resíduos galacturônicos.
A Figura 3 é uma representação esquemática da estrutura básica da pectina
mostrando estes grupos de polissacarídeos pécticos.
Figura 3: A estrutura básica da pectina. Representações esquemáticas das
estruturas da pectina: convencional (A) e da alternativa proposta recentemente (B)
(WILLATS et al, 2006).
Homogalacturonana
Ramnogalacturonana II
Ramnogalacturonana I
Acetil ester
Metil ester
Ácido galacturônico
Ramnose
Apiose
Fucose
Ácido acérico
Galactose
Arabinose
Xilose
Ácido glucurônico
Ácido cetodeoximano-
octulopiranosilônico
Ácido Deoxilixo-
heptulopiranosilárico
Homogalacturonana
Ramnogalacturonana II
Ramnogalacturonana I
Acetil ester
Metil ester
Ácido galacturônico
Ramnose
Apiose
Fucose
Ácido acérico
Galactose
Arabinose
Xilose
Ácido glucurônico
Ácido cetodeoximano-
octulopiranosilônico
Ácido Deoxilixo-
heptulopiranosilárico
27
Enzimas pectinolíticas ou pectinases atuam sobre substâncias pectinolíticas
através de diferentes mecanismos de reação, preferências por substratos e padrões
de ação.
Existem três tipos de pectinases: Protopectinases, Esterases e
Despolimerizantes.
2.2.1. Protopectinases
São enzimas que solubilizam protopectinas (substância péctica insolúvel em
água presente no tecido intacto). Liberam pectinas solúveis e altamente
polimerizadas a partir da protopectina (ALKORTA et al, 1998; KASHYAP et al, 2001).
São classificadas em dois tipos: um reage com a região do ácido poligalacturônico
da protopectina (tipo A) e outro com cadeias de polissacarídeo que podem conectar
o ácido poligalacturônico com os constituintes da parede celular (tipo B) (SAKAI et al,
1993).
2.2.2. Esterases
As pectina-esterases (EC 3.1.1.11) são conhecidas também como pectina-
metil-esterases, pectase, pectina metoxilase ou pectina-metilhidrolases
(KYRIAKIDIS, 1999).
As pectina-esterases catalisam a desesterificação do grupo metoxila da
pectina formando ácido péctico e metanol (KASHYAP et al, 2001). As pectina-
esterases são as primeiras enzimas a atuar na degradação da pectina (SAKAI et al,
1993), permitindo que poligalacturonases (HUBER, 1983) e liases atuem no produto
(SAKAI et al, 1993). Biologicamente, são de grande importância, pois permitem a
ação posterior de pectinases que só atuam sobre compostos pécticos com menor
grau de esterificação. São produzidas por fungos filamentosos, leveduras, bactérias
e vegetais superiores (SAKAI et al, 1993), nos quais ocorrem em diversos tecidos,
especialmente nos frutos (BARON E THIBAULT, 1985). Estão classificadas na
família 8 das carbohidrato-esterases (PEDROLLI et al, 2009).
28
2.2.3. Pectina acetil esterases
As pectina acetil esterases (EC 3.1.1.-) hidrolizam o éster acetil da pectina
formando ácido péctico e acetato. Estão classificadas nas famílias 12 e 13 das
carbohidrato-esterases (PEDROLLI et al, 2009).
2.2.4. Polimetilgalacturonases
As polimetilgalacturonases catalizam a clivagem hidrolítica das ligações
glicosídicas α(1→4) na estrutura da pectina, preferencialmente de alta esterificação,
formando 6-metil-D-galacturonato. As endopolimetilgalacturonases catalizam a
clivagem do substrato de forma randômica. As exopolimetilgalacturonases catalizam
a clivagem hidrolítica do substrato a partir da extremidade não redutora produzindo
monogalacturonato ou digalacturonato em alguns casos (PEDROLLI et al, 2009).
2.2.5. Poligalacturonases
As poligalacturonases catalisam a hidrólise das ligações glicosídicas α(1→4)
no ácido péctico ou poligalacturônico, preferencialmente, o qual é produzido por
demetilação da pectina pela pectinesterase. As endopoligalacturonases (EC
3.2.1.15) atuam pela hidrólise das ligações glicosídicas α(1→4) internas entre os
ácidos galacturônicos de forma randômica e seus produtos primários são
oligogalacturonatos, enquanto as exopoligalacturonases são subdivididas em Exo-
PG-1 (E.C. 3.2.1.67), que hidrolisa as ligações sucessivas do ácido poligalacturônico
a partir da extremidade não redutora, liberando ácidos galacturônicos livres e Exo-
PG-2 (E.C. 3.2.1.82), que hidrolisa as ligações alternadas do ácido poligalacturônico
a partir da extremidade não redutora, liberando ácidos digalacturônicos livres
(REXOVA-BENKOVA e MARKOVIC, 1976; PILNIK e ROMBOUTS, 1981; DA SILVA
et al, 1997; JAYANI et al, 2005). As poligalacturonases produzidas por
microrganismos foram caracterizadas e classificadas como família 28 das hidrolase
glicosídicas (DEVI e RAO, 1996; NAGAI et al, 2000).
29
2.2.6. Liases
São enzimas despolimerizantes que clivam as ligações α-1-4 de pectatos ou
pectinatos por transeliminação de hidrogênio, o que resulta em galacturonídeos com
ligação insaturada entre C4 e C5, na terminação não redutora do ácido galacturônico
formado (SAKAI et al, 1993; KASHYAP et al, 2001).
2.2.7. Pectato-liase
A pectato-liase (EC 4.2.2.2) é a enzima mais bem estudada entre as
pectinases. As pectato-liases clivam ligações glicosídicas preferencialmente no ácido
poligalacturônico formando produtos insaturados (∆-4,5-D-galacturonato) através de
reação de transeliminação. São dependentes de Ca
2+
para atividade e, portanto são
fortemente inibidas por agentes quelantes como EDTA (PEDROLLI et al, 2009).
Podem ser classificadas em dois tipos de acordo com o modo de ataque ao
substrato:
Endo-poligalacturonato liase: ataca o ácido péctico aleatoriamente, liberando
oligogalacturonatos insaturados (JAYANI et al, 2005).
Exo-poligalacturonato liase: ataca o ácido péctico a partir da terminação
redutora, liberando 4-5 digalacturonatos (JAYANI et al, 2005) e 4-5 trigalacturonatos
insaturados (SATO e KAJI, 1977).
2.2.8. Pectina-liase
A pectina-liase catalisa a clivagem de forma randômica da pectina,
preferencialmente de alta metilação, produzindo metiloligogalacturonatos através da
transeliminação das ligações glicosídicas. A pectina-liase não necessita de cálcio
para sua atividade, mas é estimulada por este e outros cátions. Até o presente
momento todas as pectina-liases descritas são endopectina-liases (EC 4.2.2.10)
(PEDROLLI et al, 2009)
A completa degradação do substrato péctico ainda necessita de enzimas que
clivem a cadeia de ramnogalacturonana:
30
2.2.9. Ramnogalacturonana ramnohidrolase ou Ramnopiranohidrolase
A ramnopiranohidrolase (EC 3.2.1.40) catalisa a clivagem hidrolítica da cadeia
de ramnogalacturonana pela extremidade não redutora produzindo ramnose. Essas
enzimas estão classificadas nas famílias 28, 78 e 106 das glicosil hidrolases
(PEDROLLI et al, 2009).
2.2.10. Ramnogalacturonana galacturonohidrolase
A RG galacturonohidrolase (EC 3.2.1.-) catalisa a clivagem hidrolítica da
cadeia de ramnogalacturonana pela extremidade não redutora produzindo
monogalacturonato. Está classificada na família 28 das glicosil hidrolases
(PEDROLLI et al, 2009).
2.2.11. Ramnogalacturonana hidrolase
A RG hidrolase hidrolisa ao acaso a cadeia de ramnogalacturonana
produzindo oligogalacturonatos (PEDROLLI et al, 2009).
2.2.12.Ramnogalacturonana liase
A RG liase (EC 4.2.2.-) catalisa a transeliminação, ao acaso, da ligação
ramnose-galacturonato da cadeia ramnogalacturonana, produzindo um galacturonato
insaturado na extremidade não redutora de um oligômero e um segundo oligômero
contendo ramnose como o resíduo da extremidade redutora. Essas enzimas estão
classificadas nas famílias 4 e 11 das polissacarídeo-liases (PEDROLLI et al, 2009).
2.2.13. Ramnogalacturonana acetilesterases
A RG acetilesterase (EC 3.1.1.-) catalisa a clivagem de grupos acetil da
cadeia de ramnogalacturonana. Está classificada na família 12 das carbohidrato-
esterases (PEDROLLI et al, 2009).
31
2.2.14. Xilogalacturonase
A xilogalacturonase (EC 3.2.1.-) catalisa a clivagem hidrolítica das ligações
glicosídicas entre dois resíduos galacturonato na cadeia de ramnogalacturonana
substituída por xilose, produzindo dímeros xilose-galacturonato. Essas enzimas
estão classificadas na família 28 das glicosil hidrolases (PEDROLLI et al, 2009).
2.3.Pectinases produzidas por microrganismos e sua importância industrial
Enzimas microbianas que catalisam a degradação de polissacarídeos pécticos
são importantes para a indústria alimentícia, desde que são usadas para extração,
clarificação e depectinizaçao de sucos de frutas, maceração de vegetais e frutas e
extração de óleo vegetal (JAIN et al, 1990). Além disso, pectinases também são
aplicáveis na degomagem de produtos de fibras naturais, como o rami, pela indústria
têxtil; na preservação da madeira; na fermentação do café e do chá; na manufatura
de papel e polpa e na produção de ração para aves domésticas (HOONDAL et al,
2002; GUMMADI e PANDA, 2003).
A habilidade para sintetizar pectinases é comum entre todos os grupos de
microrganismos, porém para propósitos industriais, os fungos são preferidos porque
cerca de 90% de suas enzimas podem ser secretadas no meio de cultura (SOLIS et
al, 1990). Além disso, as poligalacturonases produzidas por fungos possuem alta
atividade enzimática e atividade ótima a um baixo pH, apropriado para a maioria dos
processos industriais aplicados em frutas e vegetais (DZIEZAK, 1991). Os gêneros
Aspergillus, Rhizopus e Trichoderma são as principais fontes de enzimas
pectinolíticas. A. niger é um dos mais importantes microrganismos utilizados em
biotecnologia e tem sido usado por muitas décadas para produzir muitas enzimas
extracelulares e ácido cítrico. Esse microrganismo é considerado GRAS (generally
regarded as safe) pelo United States Food and Drug Administration (SCHUSTER et
al, 2002).
Encontra-se na literatura vários trabalhos sobre pectinases produzidas por
Aspergillus. Pashova e colaboradores (1999) estudaram o envolvimento do
mecanismo de regulação da indução da biossíntese da polimetilgalacturonase por
células imobilizadas de Aspergillus niger 26. A imobilização alterou o perfil de
enzimas pectinolíticas. As culturas de células produzem quatro pectinases,
32
polimetilgalacturonase (174,3U/mg), poligalacturonase (34,5U/mg), pectina esterase
(8,1U/mg) e pectina liase (6,1U/mg) enquanto que as células imobilizadas sintetizam
somente a polimetilgalacturonase (458,3U/mg) e a poligalacturonase (82,9U/mg),
porém com um rendimento bem maior destas enzimas. O melhor indutor para a
síntese de polimetilgalacturonase foi a pectina de maça de alta esterificação (92%
D.E.) e a presença deste foi obrigatória para a síntese da enzima.
Bai e colaboradores (2004) relataram a produção de pectinase através de
FES por Aspergillus niger. A polpa de beterraba foi utilizada como fonte de carbono e
as águas residuais da produção de glutamato monosódico foram utilizadas como
fonte de nitrogênio e água. A produção máxima de endopectinase foi de 15000
AJDAµ/g de polpa de beterraba seca [Uma unidade (AJDAµ) de atividade
endopectinase é definida como a quantia de enzima que deve degradar 1mg de
pectina no pH 4,2 em 40
o
C em meia hora] e ocorreu depois de 96h de cultivo. A
pectinase bruta, extraída do material em fermentação, pode induzir resistência a
doenças em mudas de pepino e tomate.
Panda e colaboradores (2004) usaram como fonte de carbono o milho e a
glicose para a produção de enzimas pectinolíticas por Aspergillus niger NCIM 548.
Embora a glicose em adição ao milho seja um componente necessário para a
produção das enzimas pectinolíticas, elas só serão substancialmente sintetizadas
quando a glicose for reduzida a concentrações inferiores a 5g/L. A síntese máxima
das enzimas foi 1,59U de polimetilgalacturonase em 144h, 1,84U de
poligalacturonase em 132h e 0,016U em 96h. A glicose é um inibidor competitivo da
síntese de polimetilgalacturonase e poligalacturonase por Aspergillus niger NCIM
548, enquanto a síntese de pectina liase pelo mesmo microrganismo não foi afetada,
quando foram feitas comparações com os controles de cada enzima.
Debing e colaboradores (2006) produziram pectinase por Aspergillus niger
A2.26 em FES utilizando dextrose de arroz, farelo de trigo, sulfato de amônia e
Tween 80. A atividade máxima de pectinase foi 391,7U/g de matéria seca e ocorreu
em 84h de fermentação. Os substratos foram escolhidos devido ao fato de serem
abundantes, de possuírem baixo custo e de não serem tóxicos para animais. Altas
concentrações de sulfato de amônia levam a atividade de exopectinase e o Tween
80, um surfactante típico, estimula a produção de enzima.
No gênero Penicillium, várias espécies são potentes pectinolíticas. A espécie
Penicillium daleae foi capaz de degradar à estrutura monomérica
33
ramnogalacturonana-II (mRG-II), que é resistente a todas as enzimas pectinolíticas
usadas na indústria de processamento de frutas e vegetais, indicando que esta
linhagem é uma fonte potencial de novas pectinases, cujo modo de ação requer
elucidação (VIDAL et al, 1999).
Embora a maioria dos trabalhos tenha se centrado no estudo de pectinases
de deuteromicetos, essas enzimas também são produzidas por basidiomicetos
(XAVIER-SANTOS et al, 2004; SCHNITZHOFER et al, 2007; SOUZA et al, 2008) e
ascomicetos (FREITAS et al, 2006). Segundo Freitas e colaboradores (2006), a
linhagem Aspergillus sp N12 produziu poligalacturonases em FES empregando como
fontes de carbono misturas de farelo de trigo e bagaço de laranja. O fungo chegou a
produzir 10U/mL após 72h de incubação a 45ºC. A exopoligalacturonase produzida
pela linhagem mostrou atividade ótima em pH 5,5 e temperatura a 50ºC. Esta enzima
foi estável em pH 4,0 e termoestável até 50ºC por 1h. Também houve produção de
endopoligalacturonase pelo fungo utilizando a mesma mistura de farelo de trigo e
bagaço de laranja. A produção de endo-PG por Aspergillus sp N12 foi 1,9U/mL após
72h de incubação a 45
o
C.
As aplicações comerciais das pectinases foram realizadas nas preparações de
vinhos e sucos de frutas ao redor de 1930 e somente a partir de 1960, quando os
estudos sobre a natureza química dos tecidos vegetais se tornaram mais aparentes,
é que os cientistas começaram a utilizar as enzimas mais eficientemente (KASHYAP
et al, 2001). Diversas companhias na Europa, Estados Unidos e no Japão produzem
pectinases e preparações comerciais de pectinases. Atualmente, essas enzimas
correspondem a cerca de 25% do mercado mundial de enzimas (UENOJO e
PASTORE, 2007).
As pectinas contribuem para a viscosidade e turbidez dos sucos das frutas. As
pectinases misturadas com outras enzimas são utilizadas na extração e clarificação
dos sucos de frutas diminuindo o tempo de filtração em até 50%. O tratamento das
polpas das frutas com pectinases mostrou um aumento no volume dos sucos de
frutas de bananas, uvas e maçãs (JAYANI et al, 2005).
A combinação de pectinases, celulases e hemicelulases, chamadas
coletivamente de enzimas de maceração, é usada na extração e clarificação de
sucos de frutas e vegetais (UENOJO e PASTORE, 2007). As pectinases são usadas
para reduzir a viscosidade, consistência e turbidez, aumentando o rendimento do
34
suco e facilitando a clarificação e a concentração, aumentando a velocidade de
prensagem e liberação de açúcares. As hemicelulases em combinação com as
pectinases aumentam muito pouco a liberação de açúcares mas são importantes no
processo de liquefação pois facilitam a separação do suco dos sólidos. Após a
trituração, os sucos ficam frequentemente muito viscosos e os sólidos
remanescentes são difíceis de separar do suco. A presença de celulase na mistura
de enzimas exerce um efeito favorável na melhoria da viscosidade e filtrabilidade do
suco de banana (KAUR et al, 2004). A adição de α-amilase e amiloglicosidase,
ativas a pH ácido, é usada no processamento de frutas contendo amido,
especialmente maçã, para prevenir turvação (UENOJO e PASTORE, 2007).
O tratamento enzimático conduz a uma extensa degradação da lamela média
e da pectina das paredes celulares por ação da poligalacturonase, pectina metil
esterase e pectina liase(UENOJO e PASTORE, 2007).
As pectinases, em conjunto com β-glucanases e hemicelulases, tem sido
utilizadas na produção de vinho. As vantagens do uso das três enzimas são: melhor
maceração da casca e aumento da extração de pigmentos, facilita a clarificação e a
filtração do mosto e aumenta a qualidade e a estabilidade do vinho. A adição de
pectinases durante o esmagamento das uvas ou no mosto do vinho melhora a
extração do suco, reduz o tempo de clarificação e aumenta o conteúdo de terpenos
no vinho. Preparações comerciais de pectinases com alta atividade de pectina liase e
baixa atividade de pectina metil esterase são preferidas por minimizarem a liberação
de metanol dos ácidos poligalacturônicos metilados durante a produção de vinho.
Algumas aplicações das pectinases na indústria de alimentos e vinhos estão
resumidas na tabela 4 (UENOJO e PASTORE, 2007).
As pectinases desempenham um importante papel na fermentação do café e
do chá. Na produção do chá o tratamento enzimático acelera a fermentação e
melhora as propriedades dos chás em pó instantâneos, devido a degradação da
pectina. A fermentação do café utilizando microrganismos pectinolíticos é feita para
remover a camada de mucilagem dos grãos de café. Enzimas pécticas também são
adicionadas para remover a camada de mucilagem dos grãos, constituída de três
quartos de substâncias pécticas. As celulases e hemicelulases presentes na
preparação enzimática ajudam na digestão da mucilagem (KASHYAP et al, 2001;
JAYANI et al, 2005).
35
Tabela 4: Funções e aplicações das pectinases na indústria de alimentos e vinhos
(UENOJO e PASTORE, 2007).
Enzima Função Aplicação
Enzimas de maceração
(pectinases, celulases e
hemicelulases).
Hidrólise de pectina solúvel e
de componentes de paredes
celulares, diminuição de
viscosidade e manutenção de
textura de sucos de frutas.
Melhoramento na extração
de sucos de frutas e de
óleo de oliva, liberação de
aromas, enzimas,
proteínas, polissacarídeos,
amido e agar.
Pectinase ácida e termo-
estável com
poligalacturonase, pectina
esterase e pectina
transeliminase.
Rápida diminuição de
viscosidade e quebra dos
tecidos vegetais.
Melhora o rompimento da
fruta e aumenta a extração
de pigmentos de cor.
Poligalacturonase com
alta atividade de pró-
pectinase e baixa
celulase.
Hidrólise parcial de pró-
pectina.
Produção de purês com alta
viscosidade.
Poligalacturonase e
pectina transeliminase
com baixa atividade de
pectina esterase e
hemicelulase.
Hidrólise parcial de pró-
pectina e de pectina solúvel
em fragmentos de tamanho
médio, formação de
precipitado e remoção de
hidrocolóides de celulose.
Produção de sucos
vegetais não clarificados de
baixa viscosidade.
Poligalacturonase, pectina
transeliminase e
hemicelulase.
Hidrólise completa de pectina
e de polissacarídeos
ramificados.
Clarificação de sucos de
frutas.
Pectinase e β-glicosidase.
Infusão de pectinase e
glicosidase para facilitar o
descascamento e melhorar a
firmeza de frutas e vegetais.
Alteração das propriedades
sensoriais de frutas e
vegetais.
Pectina esterase com
atividade de
poligalacturonase e de
pectina liase.
Processamento de frutas. Produção de “ketchup” de
alta qualidade e de polpas
de frutas.
Pectina esterase. Desesterificação e
geleificação de pectina.
Melhoramento na
clarificação de cidra.
Enzimas de maceração
(pectinases, celulases e
hemicelulases).
Hidrólise de polissacarídeos
das paredes celulares
vegetais.
Melhoramento da
maceração da casca e
extração de pigmentos de
cor de uvas, qualidade,
estabilidade, filtração e
clarificação de vinhos.
36
Óleos de canola, girassol, palma e de oliva entre outros são tradicionalmente
produzidos pela extração com solventes orgânicos. O solvente mais utilizado é o
hexano, o qual é potencialmente carcinógeno. Enzimas que degradam a parede
celular, incluindo a pectinase, podem ser utilizadas para extrair óleo vegetal em um
processo aquoso pela liquefação dos componentes estruturais das paredes celulares
das sementes que contêm óleo (KASHYAP et al, 2001).
Pectinases são utilizadas em conjunto com outras enzimas para reduzir a
viscosidade da ração animal aumentando assim a absorção e a liberação de
nutrientes quer pela hidrólise das fibras não biodegradáveis ou por liberação dos
nutrientes bloqueados pelas fibras (JAYANI et al, 2005).
A aplicação de pectinases na indústria têxtil facilita a separação das fibras de
celulose pela degradação das moléculas de pectina interligadas à hemicelulose.
Essas enzimas vêm sendo aplicadas na degomagem de fibras derivadas da juta,
rami e outros vegetais, utilizados na fabricação de diversos materiais, como roupas,
fio e lonas. Essas fibras contem aproximadamente 20% a 35% de material gomoso
incrustado constituído principalmente de pectina, o qual precisa ser removido para a
utilização industrial das mesmas. Tradicionalmente, a remoção é feita por processos
de degomagem química com soluções alcalinas aquecidas, que geram resíduos
prejudiciais ao ambiente e apresentam um alto consumo de energia. Uma das
soluções para estes problemas é a utilização de processos biotecnológicos que
envolvem a utilização de pectinases ou combinações de pectinases e xilanases, que,
além de representar uma alternativa econômica, não provoca danos ao ambiente
(KAPOOR et al, 2001).
As fibras liberianas são fibras moles formadas em grupos fora do xilema,
floema ou periciclo como o rami e o cânhamo. As fibras contêm goma que deve ser
removida antes da sua utilização para manufatura de têxteis. O tratamento químico
de degomagem é poluente, tóxico e não biodegradável. A degomagem
biotecnológica usando pectinases em combinação com xilanases apresenta uma
alternativa favorável do ponto de vista ecológico e econômico para este problema
(JAYANI et al, 2005).
Durante a fabricação de papel, pectinases podem despolimerizar pectinas e
subsequentemente diminuir a demanda catiônica das soluções pécticas e do filtrado
resultantes do branqueamento com peróxido (JAYANI et al, 2005).
37
Convencionalmente, nas indústrias de processamento de citrus o tratamento
de águas residuais, contendo substâncias pécticas, é realizado em várias etapas que
levam à formação de metano. Esse tipo de tratamento tem algumas desvantagens
como o alto custo e o longo período de tratamento, além da poluição ambiental
resultante da utilização de produtos químicos. Assim, uma alternativa eficaz
econômica e ambientalmente é a utilização de pectinases de bactérias que
seletivamente removem as substâncias pécticas das águas resíduas (HOONDAL et
al, 2002).
Aranda e colaboradores (2004) investigaram a importância das enzimas
hidrolíticas produzidas por fungos saprófitas na degradação de substâncias solúveis
em água de resíduos secos da extração de óleo da oliva (ADOR). Estas substâncias
são utilizadas como fertilizantes devido ao alto conteúdo orgânico, entretanto são
fitotóxicas e a contaminação dos solos com este resíduo se tornou um grave
problema. Contudo a biorremediação é possível com a utilização de fungos
saprófitas que na presença de ADOR produziram endopolimetilgalacturonase
(pectinase) e endoglucanase que degradaram as substâncias fitotóxicas presentes
nos resíduos da extração de óleo. Os fungos utilizados neste processo foram
Penicillium chrysogenum, Fusarium lateritum e Fusarium oxysporum. Existe uma
correlação entre a diminuição da fitotoxicidade de ADOR e a produção de enzimas
solúveis pelos fungos saprófitas. O fungo F. oxysporum, que produziu menor
quantidade de enzimas hidrolíticas (especialmente endopolimetilgalacturonase que
não chegou a 1 unidade/mg de proteína), não foi capaz de diminuir a fitotoxicidade
de ADOR 5%. A incubação com o fungo F lateritum, o qual produziu mais enzimas
hidrolíticas do que F. oxysporum, diminuiu a fitotoxicidade de ADOR 5%. O fungo P.
chrysogenum, o qual produziu a maior quantidade de enzimas hidrolíticas, foi capaz
de diminuir a fitotoxicidade de ADOR 15%.
2.4.Microrganismos termofílicos e enzimas termoestáveis
A temperatura tem grande influência no funcionamento de moléculas e
estruturas biológicas. De fato, a maioria dos organismos atualmente conhecidos
pode crescer somente dentro de uma faixa estreita de temperatura. Entretanto, a
existência de ambientes geotermicamente estáveis tem permitido a seleção, ou a
persistência, de microrganismos que não apenas resistem, mas também requerem
38
altas temperaturas para sobreviver. Estes organismos são chamados de termófilos
ou termofílicos (BROCK e MADIGAN, 2001).
Os organismos que crescem em temperaturas elevadas são classificados em
(MADIGAN e ORENT, 1999):
1. Termofílicos moderados: incluem organismos com faixa de crescimento entre
um mínimo de 20ºC e um máximo de 55ºC, sendo, as temperaturas ótimas
entre 40 e 50
o
C. Nesse grupo estão incluídos os procariotos dos Domínios
Bactéria e Archaea e os eucariotos (Domínio Eukarya - fungos filamentosos).
2. Termofílicos extremos: incluem microrganismos capazes de crescer
otimamente em temperaturas entre 65 a 85
o
C. Esse grupo é representado
pelos procariotos dos Domínios Bactéria e Archaea.
3. Hipertermofílicos: Aqui estão as Archae com temperaturas ótimas de
crescimento entre 85 e 110
o
C.
Enzimas termoestáveis ou termozimas são geralmente definidas como
aquelas com uma temperatura ótima acima da máxima para o crescimento de um
organismo ou com excepcional estabilidade acima de 50ºC em um período
prolongado de tempo (SINGH et al, 2000).
A termoestabilidade das enzimas engloba a termoestabilidade dinâmica e a
estabilidade cinética. A termoestabilidade dinâmica é definida pela energia livre de
estabilização da enzima ∆G
stab
(ou a mudança de energia livre para a reação “estado
dobrado ↔ desdobrado” sob condições fisiológicas) e pela temperatura de fusão
(T
m
). A estabilidade cinética depende da barreira de energia para desdobramento (a
energia de ativação do desdobramento E
a
). A estabilidade cinética da enzima é
frequentemente expressa como sua meia-vida (t
1/2
) em temperaturas definidas. Na
maioria dos casos a ∆G
stab
de uma enzima termoestável é 5-20kcal/mol mais alta do
que a de proteínas mesofílicas a 25
o
C. Valores de ∆G
stab
tão pequenos quanto 3,0-
6,5kcal/mol podem ser responsáveis por aumentos de termoestabilidade de até
12
o
C. A presença de algumas ligações hidrofóbicas adicionais na molécula aumenta
a energia livre em 5-7kcal/mole. Portanto, mudanças menores na estrutura da
enzima podem levar a grandes mudanças na termoestabilidade (VIEILLE e ZEIKUS,
2001; LI et al, 2005).
A atividade e a estabilidade das enzimas termofílicas em altas temperaturas
são o resultado de várias propriedades como estabilidade do dobramento e rigidez
da molécula que são determinadas pela composição e distribuição de aminoácidos,
39
pontes dissulfeto, interações hidrofóbicas e aromáticas, pontes de hidrogênio, pares
de íons, estabilização do dipolo da α-hélice, estabilização de “loops”, modificações
pós-tradução (glicosilação) e parâmetros extrínsecos (sais inorgânicos, substrato,
pressão e chaperoninas) (VIEILLE e ZEIKUS, 1996; DAS e GERSTEIN, 2000;
VIEILLE e ZEIKUS, 2001; BRUINS et al, 2001; HAKI e RAKSHIT, 2003).
Kumar e Nussinov (2001) mostraram que as ligações iônicas e as ligações de
hidrogênio entre cadeias laterais aumentam a estabilidade na maioria das proteínas
termofílicas.
Em 2003, Yano e Poulos compilaram os fatores que são reportados como
importantes para o aumento da estabilidade da proteína. Foi mencionado que as
interações eletrostáticas, as interações cátion-pi, as interações aromáticas e
hidrofóbicas realçariam a estabilidade (GROMIHA et al, 2002; PAIARDINI et al,
2003).
Saraboji e colaboradores (2005) analisaram 23 famílias termofílicas diferentes
e seus homólogos mesofílicos para estudar a termoestabilização das suas proteínas.
Nesta análise, a grande maioria das proteínas termofílicas adota a contribuição de
energia livre ligeiramente menor do que as suas contrapartes mesofílicas. A
observação principal deste estudo é a menor contribuição de energia livre hidrofóbica
devido à cadeia principal de átomos de carbono e nitrogênio em todas as proteínas
termofílicas aumentando a estabilidade destas proteínas. A combinação possível dos
diferentes termos de energia livre mostra que a maioria das proteínas termofílicas
tem estratégia de energia livre menor que seus homólogos mesofílicos. Os
resultados obtidos mostram que a energia hidrofóbica livre devido a átomos de
carbono e nitrogênio e tais combinações de componentes de energia livre
desempenham um papel vital na termoestabilização dessas proteínas.
Boutz e colaboradores (2007) apresentaram a primeira análise proteômica das
ligações dissulfeto intracelulares no hipertermofílico Pyrobaculum aerophilum. Este
estudo revelou que a utilização de ligações dissulfeto se estende além das proteínas
individuais para incluir muitos complexos de proteína-proteína. O homodímero da
citrato sintase, complexo mostrado neste estudo, contém duas ligações dissulfeto
intramoleculares, uma por subunidade, que resultam na ciclização de cada cadeia de
proteína de tal modo que as duas cadeias são topologicamente ligadas, ficando
inseparáveis. Cadeias de proteínas topologicamente ligadas são extremamente raras
entre proteínas naturais. Embora a estrutura da citrato sintase P. aerophilum (PaCS)
40
seja somente o segundo caso observado de uma proteína natural que forma um
catenano pela ligação dissulfeto, parece improvável que esses sejam os únicos
casos presentes na natureza. Como mais estruturas de proteínas termofílicas estão
sendo determinadas, é provável que outros exemplos ou que outros mecanismos
semelhantes do embaraço topológico sejam descobertos.
A identificação das estratégias moleculares adotadas pela evolução para
realçar a termoestabilidade na interface das enzimas oligoméricas foi analisada por
Maugini e colaboradores (2009). A variação de algumas propriedades estruturais
relacionadas à estabilidade da proteína foi testada nas interfaces das subunidades
de oligômeros termofílicos e hipertermofílicos. As diferenças das características
estruturais das interfaces observadas entre as enzimas termofílicas e
hipertermofílicas foram comparadas com as diferenças das mesmas propriedades
calculadas por comparações pareadas com proteínas oligoméricas mesofílicas
contidas em um banco de dados referência. A significância das diferenças de
propriedades estruturais observadas foi medida por um teste t. A diferença mais
significante encontrada foi a área de contato hidrofóbico que é o fator de
estabilização mais freqüente na interface das subunidades de oligômeros
termofílicos e hipertermofílicos. A compacidade da interface também parece
aumentar nas proteínas hipertermofílicas. As variações da composição de
aminoácidos nas interfaces refletem a variação das propriedades da interface. Os
resultados sugerem que o número de ligações de hidrogênio diminui na interface de
hipertermofílicos e termofílicos e, por isso, elas não parecem ser essenciais para
manter a estabilidade da interface. Do mesmo modo, o número de pares de íons não
varia significativamente nas interfaces das subunidades de enzimas hipertermofílicas
e termofílicas.
Proteínas de microrganismos termofílicos geralmente apresentam maior
termoestabilidade intrínseca que sua equivalente mesofílica, embora mantenham a
estrutura básica particular da família a que pertencem. Embora o mecanismo
molecular da termoestabilização tenha sido foco de inúmeras teorias e pesquisas,
ainda não é completamente entendido. Entretanto, algumas diferenças na
seqüência, estrutura, função, propriedades dinâmicas e termodinâmicas foram
constatadas entre enzimas de psicrofílicos, mesofílicos e termofílicos. Um dos mais
significativos meios de adaptação à termofilia são os mecanismos intrínsecos,
relacionados às estruturas primárias e secundárias das proteínas. Embora ainda não
41
tenha sido estabelecido um padrão para a termoestabilidade das proteínas, existem
claras diferenças estruturais entre as proteínas de organismos mesófilos e aquelas
de termófilos moderados e hipertermófilos. Por outro lado, considerando-se a
complexidade da estrutura de uma molécula de proteína é provável que não exista
um mecanismo universal de termoestabilização. Deve ser destacado, porém, que as
diferenças observadas nas seqüências das proteínas nem sempre podem ser
relacionadas com termoestabilidade, considerando-se que uma combinação de
fatores de pressão seletiva atuaram sobre as proteínas por milhões de anos
(pressão, pH, temperatura), além das mutações que se acumularam. Dessa forma,
para elucidar o mecanismo adaptativo é importante distinguir o comportamento da
enzima que é ditado pela biologia daquele que é ditado pela físico-química
(termoestabilidade e propriedades catalíticas) (GOMES et al, 2007).
As enzimas termoestáveis despertaram um amplo interesse industrial e
biotecnológico devido ao fato de que estas enzimas são bem mais adequadas aos
processos industriais nos quais condições desnaturantes de proteínas são utilizadas
(HAKI e RAKSHIT, 2003). Sob o ponto de vista industrial, várias são as razões para
a seleção e estudo de enzimas termoestáveis produzidas por microrganismos
termofílicos ou termotolerantes, tais como (BRUINS et al, 2001; HAKI e RAKSHIT,
2003):
1)-Apresentam uma alta estabilidade à temperatura e geralmente são mais
resistentes a agentes detergentes e a enzimas proteolíticas.
2)-Em processos que ocorrem em altas temperaturas, o risco de
contaminação por microrganismos mesofílicos é reduzido.
3)-Em processos com substratos fluidos, em altas temperaturas a viscosidade
do substrato é reduzida, facilitando o seu bombeamento, filtração e centrifugação e
permitindo o uso de menor quantidade de água, o que consequentemente reduz os
custos de produção.
4)-Mais substrato pode ser dissolvido em altas temperaturas, proporcionando
um maior rendimento e menor tempo necessário para os processos.
5)-Devido à boa estabilidade em amplas faixas de pH, típica das termozimas,
estas podem ser usadas no processamento de vários tipos de sucos e vegetais.
O uso de temperaturas elevadas durante o processamento de suco e outros
produtos vegetais são etapas importantes dos processos industriais e têm diversas
finalidades. Na maceração da uva para extração de suco, a incubação a 60-65
o
C
42
promove a plasmólise da membrana e rupturas na parede celular do fruto, facilitando
a liberação do líquido e de antocianinas responsáveis pela cor do suco. Na extração
de sucos de uva para produção de vinhos, a fruta macerada é tratada a 80
o
C para,
além de facilitar a maceração, desnaturar oxidases que causam perda da cor do
vinho durante a estocagem. Na extração do “pulp wash”, a polpa da laranja (mistura
de polpa e semente), resultante do peneiramento do suco de primeira, é aquecida a
90
o
C para desnaturar a pectina esterase da fruta, que causa problemas de
coagulação da pectina. Além das funções citadas, o tratamento térmico ainda tem
por finalidade a pasteurização dos sucos e mostos visando a redução da microbiota
contaminante, principalmente de leveduras. Em todos esses processos citados, o
material submetido ao aquecimento precisa ser posteriormente resfriado a 50
o
C para
tratamento com pectinases comerciais, as quais são termolábeis. O uso de
pectinases termoestáveis evitaria a etapa de resfriamento, reduzindo tempo e custo
dos processos (GOMES et al, 2007).
A produção de enzimas pectinolíticas tem sido amplamente reportada em
bactérias e fungos filamentosos. Entretanto são poucos os trabalhos na produção e
principalmente na purificação de pectinases por fungos termofílicos.
A habilidade de 17 linhagens T. lanuginosus de produzir enzimas
pectinolíticas foi examinada depois do crescimento em meio a 45-50
o
C com extrato
de levedura contendo pectina de citrus ou polpa da beterraba de açúcar, sendo que
a maioria delas produziu maiores quantidades da enzima no último substrato
(PUCHART et al, 1999).
Martins e colaboradores (2002) produziram poligalacturonase (PG) e pectina
liase (PL) por Thermoascus aurantiacus 179-5 utilizando fermentação em estado
sólido com bagaço de laranja, bagaço de cana de açúcar e farelo de trigo como fonte
de carbono. PG e PL apresentaram atividade ótima em pH 5,0 e 10,5-11,0,
respectivamente. A atividade máxima das enzimas foi determinada a 65ºC. PG foi
estável na faixa de pH ácida a neutra e a 60ºC por 1h, enquanto PL foi estável em
pH ácido e a 60ºC por 5h.
Kaur e colaboradores (2004) mostraram que a poligalacturonase termoestável
produzida pelo fungo Sporotrichum thermophile Apinis, utilizando fermentação
submersa com agitação, foi otimamente ativa em pH 7,0 a 55ºC e exibiu t
1/2
de 4h a
65ºC. Os valores de K
m
e V
max
da enzima (com pectina) foram 0,416mg ml
-1
e
0,52µmol mg
-1
min
-1
, respectivamente. A atividade da poligalacturonase foi
43
estimulada por Mn
2+
e Fe
2+
, mas fortemente inibida por Mg
2+
e fracamente inibida por
Tween 80 e Triton X-100. β-mercaptoethanol exerceu um forte efeito inibitório
sugerindo o papel crítico das ligações dissulfeto em manter a conformação adequada
da enzima. A utilização da mistura das enzimas (pectinase, xilanases e celulase)
produzidas por S. thermophile nas polpas de frutas causou um aumento no
rendimento dos sucos de banana, uva e maçã.
Monteiro (2008) relatou para o fungo termodúrico Aspergillus. fumigatus, a
presença de atividade enzimática a partir do primeiro dia, sendo obtidos dois picos
de produção, um no 6º dia (53,3U/g) e outro do 12º ao 13º dia (59,4U/g). A atividade
foi ótima em pH 5,0-5,5. A enzima teve mais de 80% de sua atividade original
preservada na faixa de pH 4,0-11,0. Os dados de Monteiro (2008) também mostram
que o fungo Rhizomucor. pusillus apresentou produção expressiva de
poligalacturonase a partir do 3º dia, atingindo um pico de produção de 16,3 U/g no 6º
dia de fermentação utilizando farelo de trigo como fonte de carbono. A PG do fungo
R. pusillus apresentou atividade máxima em pH 5,0. A estabilidade da PG foi
superior a 80% em pH 3,0 a 8,5. A enzima perdeu drasticamente sua atividade em
pHs superiores a 8,5. A temperatura ótima para atividade de PGs de R. pusillus foi
de 50ºC a 60ºC, com atividade ligeiramente maior a 60ºC, similar ao observado para
as PGs de A. fumigatus. Com relação a termoestabilidade em ausência de substrato,
as PGs de R. pusillus foram estáveis até 40ºC, preservando 80% da atividade
original. Entretanto, as PGs perderam completamente a atividade quando incubadas
a 50ºC. Para as PGs de A. fumigatus houve manutenção de praticamente 100% da
atividade original até 50ºC, com drástica perda de atividade em temperaturas
superiores a esta.
2.5.Purificação de pectinases
Um melhor entendimento das propriedades de pectinases é importante na
comercialização dessas enzimas em vários campos. A purificação da enzima é
necessária antes da caracterização porque a enzima bruta pode conter componentes
de estabilização diferentes e, portanto as propriedades podem variar muito (JACOB
et al, 2008). A purificação de pectinases tem sido realizada por combinações de
procedimentos cromatográficos diferentes (CELESTINO et al, 2006;
SCHNITZHOFER et al, 2007) ou procedimentos únicos como sistemas de fase
44
aquosa (LIMA et al, 2002) ou precipitação por afinidade (MONDAL et al, 2004;
JACOB et al, 2008).
Uma exopolimetilgalacturonase foi purificada a partir de Sclerotinia
sclerotiorum por precipitação por sulfato de amônia e cromatografias em colunas de
Ultrogel Aca 34, DEAE Bio-Gel A e Ultrogel AcC 44. A purificação desta enzima foi
obtida com um fator de purificação de 50,8 vezes e um rendimento de 47% (RIOU e
colaboradores, 1992).
Uma poligalacturonase do fungo termofílico, Thermomyces lanuginosus, foi
purificada por ultrafiltração, precipitação por acetona e cromatografia de troca-iônica
com um fator de purificação de 45,4 vezes e um rendimento de 20% (KUMAR e
PALANIVELU, 1999).
Isshiki e colaboradores (2000) purificaram uma exopoligalacturonase e três
endo poligalacturonases a partir dos ascomicetos patógenos da casca de pêra,
Venturia pirina e V. nashicola, respectivamente, por cromatografia em CM-
sepharose, concentração em Centripep e cromatografia em HPLC TSK SP-5PW. A
purificação da exopoligalacturonase foi obtida com um fator de purificação de 10
vezes e um rendimento de 11,9%. Para as três endopoligalacturonases os valores
para o fator de purificação foram 5; 6; 3 vezes e para o rendimento foram 9,1%;
7,2%; e 5,4% (ISSHIKI et al, 2000).
Esquivel e Voget (2004) purificaram 470 vezes uma endopoligalacturonase
(PGI) de uma cultura de Aspergillus kawakii com uma recuperação de 8,6% da
atividade inicial em três passos: precipitação por acetona, colunas cromatográficas
Q-sepharose e Sephacryl S-100.
Celestino e colaboradores (2006) purificaram 9,37 vezes uma pectinase
produzida por Acrophialophora nainiana a qual tem atividade de
exopoligalacturonase e pectina liase. 60,6% da enzima foram recuperados depois de
três passos: gel filtração Sephacryl S-100, troca iônica DEAE-Sepharose e outra gel
filtração em Sephadex G-50.
Uma poligalacturonase de Thermoascus aurantiacus CBMAI-756 foi purificada
por filtração em gel Sephadex G-75 e cromatografia de troca-iônica SP-sepharose
com um fator de purificação de 21,0 vezes e um rendimento de 24,6% (MARTINS et
al, 2007).
Silva e colaboradores (2007) purificaram uma poligalacturonase produzida por
Penicillium viridicatum RFC sob fermentação em estado sólido através de tratamento
45
com caolin, ultrafiltração e cromatografia em coluna Sephadex G50 obtendo um
rendimento de 6,5% e um fator de purificação de 31,1 vezes.
A purificação de uma poligalacturonase produzida por Streptomyces lydicus
foi obtida através de ultrafiltração e da combinação dos procedimentos de
cromatografia de troca-iônica em CM-celulose e gel filtração em Sephadex G-100. O
rendimento da poligalacturonase purificada foi 57,1% com um fator de purificação de
54,9 vezes (JACOB et al, 2008).
Existem poucos estudos com purificação de pectinases de zigomicetos.
Chitradon e colaboradores (1996) purificaram uma pectinase de Rhizopus sp 26R
através de concentração por sulfato de amônia, cromatografias de troca iônica em
DEAE e CM-celulose e cromatografia em coluna de hidroxiapatita com um fator de
purificação de 277,3 vezes e um rendimento de 11,8%. Essa enzima tem a
capacidade de intensificar a hidrólise do amido cru do tubérculo de mandioca quando
utilizada misturada com a glicoamilase de Aspergillus niger J8. A mistura das
enzimas obteve uma digestibilidade mais eficiente com uma taxa de hidrólise duas
vezes mais rápida do que quando a glicoamilase foi utilizada sozinha e três vezes
mais rápida do que quando apenas pectinases foram utilizadas. Uma
poligalacturonase do fungo Rhizopus oryzae NBRC 4707 foi purificada por Saito e
colaboradores (2004) utilizando processos cromatográficos em colunas CM-
Toyopearl 650M e hidroxiapatita com um rendimento de 41,1% e um fator de
purificação de 188 vezes.
Como demonstrado, procedimentos convencionais simples foram
eficientemente usados para purificar pectinases. A tabela 5 apresenta algumas
propriedades de poligalacturonases purificadas.
46
Tabela 5: Propriedades bioquímicas e físico-químicas de algumas pectinases
Microrganismo
Produtor
Massa
mole-
cular
(kDa)
pI Atividade
específica
(U mg
-1
)
K
m
(mg
mL
-1
)
V
max
(µmol/min/
mg prot.)
Tempe-
ratura
ótima
(
o
C)
pH
ótimo
Temperatura
de
estabilidade
pH de
estabili-
dade
Referências
Sclerotinia
sclerotiorum
74 __ 259,1 __ __ 45
o
C 5,0 45
o
C após 4h.
A 60
o
C reteve
50% de sua
atividade
após 4h.
50% da
ativida-
de
máxima
foi
encon-
trada no
pH 7,5.
Riou et al, 1992.
Rhizopus sp. 26R 43 __ 1386,5 __ __ 50
o
C 5,25 25-40
o
C. A
45
o
C a
atividade
permaneceu
80%.
8,0 Chitradon et al,
1996.
Thermomyces
lanuginosus
59 __ 209,0 0,67 7,2x10
5
60
o
C 5,5 65
o
C após 2h.
A 50
o
C reteve
50% de sua
atividade por
6h.
7-11,0 Kumar e
Palanivelu, 1999.
Venturia pirina
V. nashicola
43
42
__ 4,0
5,0; 9,0 e
11,0
0,08 4,44x10
-3
__ 5,0 __ __ Isshiki et al, 2000.
47
Aspergillus
kawachii IFO
4033
60 3,55 430,0 __ __ __ 4,5 Termoestável
em pH > 4,0,
enquanto em
valores mais
baixos de pH
é inativada.
4,5-5,0 Esquivel e Voget,
2004.
Rhizopus oryzae
NBRC 4707
31 __ 75,3 __ __ 45 4,5 Até 55
o
C. 4-6,0 Saito et al, 2004.
Acrophialophora
nainiana
35,5 __ 286,63 4,22 1,83nknat
al
60 8,0 37
o
C
conservando
100% da sua
atividade
inicial após 9
dias.
Em pHs
alcali-
nos. Em
pH 9,0 a
enzima
retém
mais de
50% da
ativida-
de.
Celestino et al,
2006.
Thermoascus
aurantiacus
CBMAI-756
30 __ 7843,0 1,46 2433,3 60-65 5,5 50
o
C. 5-5,5 Martins et al,
2007.
Penicillium
viridicatum RFC
24,1 6,5 1400,0 1,82 81 60 6,0 45
o
C
conservando
60-75% da
sua atividade
original por
1h.
7-10,0 Silva et al, 2007.
Streptomyces
lydicus MTCC
7505
43 3,9 504,8 1,63 677,8 50 6,0 45
o
C ou
abaixo por 90
min.
4-7,0 Jacob et al, 2008.
48
3. OBJETIVOS
3.1. Objetivo geral
Produção de poligalacturonase pelo fungo Rhizomucor pusillus A 13.36,
purificação e caracterização da mesma.
3.2. Objetivos específicos
1)-Produzir poligalacturonase por R. pusillus A 13.36 por meio de fermentação
em estado sólido usando farelo de algodão, farelo de trigo e misturas de farelo de
trigo e sabugo de milho como meio de cultivo;
2)-purificar a enzima produzida;
3)-caracterizar físico-quimicamente a enzima purificada.
49
4. MATERIAIS E MÉTODOS
4.1. Microrganismo
O fungo termofílico Rhizomucor pusillus A 13.36 foi isolado em trabalho
anterior (RABALHO, 2002) a partir de solo de plantação de mandioca - São José do
Rio Preto - SP. A linhagem foi identificada na Divisão de Recursos Microbianos –
CPQBA/UNICAMP e mantida em tubo de ensaio com meio de cultura PDA (Potato
Dextrose Agar- Oxoid) inclinado, coberto com água e filme de óleo mineral, a
temperatura ambiente.
4.2. Obtenção da enzima por fermentação em estado sólido
Para a fermentação em estado sólido por R. pusillus A 13.36 foram utilizados
como substratos o farelo de trigo, o sabugo de milho e o farelo de algodão. As
seguintes proporções foram testadas: 90% sabugo de milho + 10% farelo de trigo;
100% farelo de trigo; 50% sabugo de milho + 50% farelo de trigo; 100% farelo de
algodão. Os erlenmeyers contendo as misturas apropriadas foram esterilizados em
autoclave a 120ºC, por 30min.
A fermentação ocorreu em frascos erlenmeyer de 250 ml contendo 5g de
substrato.
O fungo R. pusillus foi repicado em meio PDA (“potato dextrose agar”) e
incubado a 45
o
C para crescimento. Após 3 dias 100mL de solução nutriente estéril
pH 5,5 ( 0,2% (NH
4
)
2
SO
4
.7H
2
O, 0,1% Mg
2
SO
4
.7H
2
O e 0,5% elemento traço) foram
adicionados e a suspensão de esporos e micélio foi feita com a alça de repique. Em
seguida 10mL dessa suspensão (inóculo) foram adicionados aos erlens contendo 5g
de substrato. O volume de suspensão usado proporcionou uma umidade de 70% do
substrato. As incubações foram feitas a 45
o
C com intervalos de tempo de 24 a
168hs.
Após este período, foram adicionados 40ml de água destilada ao material
fermentado, sendo posteriormente homogeneizado por 30min em shaker, a 100 rpm.
O material foi então filtrado e centrifugado a 25.000g* durante 20min a 5ºC e o
sobrenadante foi utilizado como solução enzimática bruta.
*A centrífuga utilizada foi Beckman Coulter Avanti J-25 High-Performance Centrifuge com o rotor JA-
14 cuja capacidade máxima (Max RCF) é 30100(xg).
50
4.3. Medida da atividade enzimática (PG)
A atividade da possível poligalacturonase, cuja identidade foi esclarecida
apenas após o experimento de especificidade ao substrato com a enzima purificada,
foi avaliada numa mistura contendo 0,9mL de tampão acetato de sódio 0,2M, pH 5,5,
contendo 1% de pectina de Citrus (Sigma) com 92% ou 26% de esterificação e
0,1mL de solução enzimática bruta ou purificada. O açúcar redutor liberado (ácido D-
galacturônico), após a incubação da mistura de reação a 55º C por 10 min., foi
quantificado pelo método proposto por Nelson (1944). Uma unidade de PG foi
definida como a quantidade de enzima capaz de liberar 1µmol de açúcar redutor por
minuto, nas condições de reação.
4.4. Determinação de proteínas totais
A quantificação de proteínas foi realizada segundo a metodologia descrita por
Hartree (1972), utilizando-se albumina de soro bovino como padrão. A unidade
protéica foi definida como mg de proteína/mL.
4.5. Purificação da enzima
Os processos de cromatografia foram realizados utilizando dois métodos
básicos para a purificação da proteína, a filtração em gel e a troca iônica,
combinados com procedimentos de concentração e ultrafiltração de enzimas,
descritos a seguir.
4.5.1. Concentração da enzima e Cromatografia de filtração em gel – Sephadex
G-150
A solução enzimática bruta, obtida após 72h de fermentação com farelo de
algodão, foi dialisada em tampão acetato de sódio 20mM pH 5,5 com quatro trocas
por 24h a 4 ºC. O material dialisado foi congelado em nitrogênio líquido e
posteriormente liofilizado. O material foi suspendido em 6mL de tampão MES 30mM
pH 6,5 de modo a apresentar concentração de 20x do material dializado. A amostra
foi submetida à cromatografia de filtração em gel em coluna (2,6 x 90cm) contendo
51
resina Sephadex G-150 (GE Healthcare) equilibrada com tampão MES 30mM pH
6,5. Para a eluição foi usado o mesmo tampão. O fluxo foi de 0,3mL min
-1
e foram
coletados 3,8mL por tubo. O perfil de eluição das proteínas foi acompanhado a
280nm e a atividade enzimática PG foi determinada nas frações eluídas.
4.5.2. Ultrafiltração e Cromatografia de troca aniônica – Q-Sepharose
Para dar continuidade à purificação, as frações com atividade enzimática PG,
obtidas na cromatografia de filtração em gel, foram reunidas e concentradas por
ultrafiltração utilizando a membrana de 10kDa Millipore. Após este procedimento o
concentrado foi aplicado em uma coluna (0,5 x 9cm) contendo a resina de troca
aniônica Q-Sepharose (GE Healthcare) equilibrada com tampão MES 30mM pH 6,5.
A eluição foi realizada com gradiente de NaCl escalonado de 0 a 1M (6mL para cada
molaridade). O fluxo foi mantido em 0,25mL min
-1
e foi coletado 1mL por tubo.
4.5.3.Concentração e Cromatografia de filtração em gel – Sephacryl S-100
As frações com atividade enzimática PG, obtidas na cromatografia de
troca aniônica, foram reunidas e a amostra resultante foi concentrada através de
centrifugação a 2.500g em Centripep (YM-10 - 10,000 MWCO).
O concentrado com NaCl 150mM foi aplicado em coluna (1,6 x 58cm)
contendo a resina Sephacryl S-100 (GE Healthcare) equilibrada com tampão MES
20mM pH 6,5 com NaCl 150mM. A eluição foi realizada com o mesmo tampão e foi
coletado 1mL/tubo a um fluxo de 0,3mL min
-1
. O perfil de eluição das proteínas foi
acompanhado a 280nm e a atividade enzimática PG foi determinada nas frações
eluídas.
4.6. Eletroforese em gel de poliacrilamida com dodecil sulfato de sódio (SDS-
PAGE)
As amostras coletadas das etapas de cromatografia foram analisadas por
meio de eletroforese em gel desnaturante de poliacrilamida – dodecil sulfato de sódio
(SDS-PAGE) em tampão Tris/glicina pH 8,3, segundo Laemmli (1970). As proteínas
foram desnaturadas por fervura a 100°C por 5min em tampão de amostra composto
por Tris-HCl 0,1M, pH 6,8, 2% de SDS, 10% de glicerol, DTT a 0,1M e azul de
52
bromofenol a 0,001M. O gel de corrida foi preparado na concentração de 10% e o
gel de empilhamento na concentração de 4% como indicado em Sambrook e Russel
(2001). O marcador de massa molecular Sigma M6539 (6,5 a 180kDa) foi usado.
Para a revelação do gel foi utilizado o método com nitrato de prata de acordo com
Blum e colaboradores (1987).
4.7. Focalização isoelétrica
A enzima purificada foi submetida à eletroforese bidimensional para
determinação do ponto isoelétrico de acordo com Gygi e colaboradores (2000). A
focalização isoelétrica (IEF), usando Ettan IPGphor II Isoelectric Focusing system
(Amersham), foi conduzida em tiras contendo gradiente imobilizado de pH linear 3,0
a 10,0 em gel de poliacrilamida a 10% (14cm x 15cm) contendo 0,5% de Pharmalyte
(GE Healthcare). Após a IEF, as tiras foram submetidas à segunda dimensão em
eletroforese em gel de poliacrilamida na presença de SDS (SDS-PAGE) de acordo
com Laemmli (1970). O gel foi corado com nitrato de prata para revelar proteína.
4.8. Caracterização da PG purificada
4.8.1. Determinação do pH e temperatura ótimos para a atividade da enzima
O comportamento da atividade da enzima em função do pH foi estudado
incubando-se a amostra enzimática e substrato (1% de pectina de citrus da Sigma
D.E 10%) em tampões: ácido acético-NaOH pH 4,0 -5,5; MES pH 5,5 – 7,0; HEPES
pH 7,0 – 8,0; TAPS pH 8,0 – 9,0 e glicina-NaOH pH 9,0 – 10,0, sendo dosada a
atividade a 55
o
C .
O efeito da temperatura sobre a atividade enzimática foi determinado em
tampão acetato usando o mesmo substrato com 26% de esterificação (D.E),
incubando-se a mistura de reação em temperaturas de 10
o
C e de 30 a 70ºC no pH
determinado como ótimo.
53
4.8.2. Determinação da estabilidade da enzima frente a variações de
temperatura
A enzima foi mantida por uma hora, em ausência de substrato, em
temperaturas de 40 a 80ºC. Após esse período, foram tomadas amostras para a
atividade enzimática nas condições de pH e temperatura ótimos, usando pectina de
citrus 26% D.E como substrato.
4.8.3. Determinação da estabilidade da enzima frente a variações de pH
A estabilidade em diferentes valores de pH foi avaliada pela mistura (1:1 v/v)
da solução enzimática em 0,1M dos mesmos tampões usados para atividade ótima
(pH 4,0-10,0) e mantendo essas soluções, sem substrato, po 24h a 27ºC
(temperatura ambiente, para avaliar apenas a influência do pH e não da
temperatura). Após esse período, foram tomadas amostras para ensaiar a atividade
enzimática nas condições de pH e temperatura determinados como ótimos, usando
pectina de citrus 26% D.E como substrato.
4.8.4. Determinação do efeito de íons metal e reagentes sobre a atividade da
enzima
O efeito de vários reagentes na atividade da PG foi determinado pela
incubação da enzima com as diferentes soluções: Ag
+
, Ba
2+
, Ca
2+
, Co
2+
, Cu
2+
, Fe
3+
,
Hg
2+
, Mg
2+
, Mn
2+
, Ni
2+
, Zn
2+
, Trealose, Triton X-100, Tween 20, Tween 80, β-
mercaptoetanol, EDTA, Glicerol e SDS de modo que as concentrações finais, na
mistura de reação, foram as indicadas na tabela de resultados. Após 5min de
incubação a temperatura ambiente, a atividade residual das enzimas foi medida no
pH e temperatura ótimos, usando pectina de citrus 26% D.E como substrato.
4.8.5. Determinação da especificidade ao substrato
As amostras enzimáticas purificada e bruta foram incubadas frente à pectina
de citrus de alta e baixa esterificação, 92% e 26% de esterificação (Sigma),
respectivamente, pectina de maçã (87% D.E., Sigma) e ácido poligalacturônico
(Sigma) como substratos no pH e temperatura ótimos para a atividade enzimática.
54
4.8.6. Identificação dos produtos de hidrólise
Para a análise dos produtos de hidrólise 0,1mL de enzima foram adicionados
a 0,4mL de tampão acetato 0,2M pH 5,5 contendo pectina de citrus da Sigma 1%
(92% D.E.). A hidrólise ocorreu a 55
o
C por 10, 30 e 60min. Após esses intervalos de
tempo, alíquotas foram retiradas e fervidas a fim de parar a reação. Foram aplicados,
em cromatografia de papel (Whatman N
o
1), 25µL de cada alíquota e 5 µL dos ácidos
mono, di e trigalacturônico da Sigma como padrões. A cromatografia de papel foi
realizada pelo método descendente usando como solvente para a fase móvel n-
butanol (Merck)/ácido acético (Dinâmica)/água (5:3:2 por volume). Para a revelação
foi utilizado nitrato de prata (Across organics)em 0,5mL de água até saturação,
sendo esta solução transferida para 300mL de acetona (J.T.Baker) com posterior
acréscimo de água até dissolução do precipitado formado. Em seguida realiza-se as
lavagens, primeiramente com NaOH (Synth) alcoólico 0,5N - 4g em 200mL de etanol
(J.T.Baker), depois com tiossulfato de sódio 0,4N.
4.8.7. Determinação do K
m
e V
máx.
As constantes cinéticas foram determinadas conforme procedimento gráfico
proposto por Lineweaver e Burk (1934). Foi construído um gráfico baseado na
atividade da enzima medida com pectina de citrus da Sigma 92% D.E., como
substrato, nas concentrações entre 2,0 e 19,0 mg mL
-1
, em pH e temperatura ótimos.
55
5. RESULTADOS E DISCUSSÃO
A escolha dos substratos para a produção de pectinase por Rhizomucor
pusillus A 13.36 utilizando fermentação em estado sólido foi feita com base em
pesquisas buscando não só uma boa produção da enzima como também um extrato
enzimático claro para minimizar possíveis problemas com pigmentos nas resinas
cromatográficas.
Analisando a tabela 6 (GRAMINHA – dados não publicados) observou-se uma
excelente produção de pectinase de 22,64U/g utilizando farelo de amendoim.
Entretanto, para obter essa produção foi necessário um tempo demasiado longo de
fermentação, o que não é interessante para posterior purificação, pois o fungo pode
produzir uma maior diversidade de enzimas, inclusive proteases. Além disso,
segundo Graminha, a cor do extrato enzimático bruto obtido através de fermentação
em farelo de amendoim foi demasiado escura, o que também não é interessante
para a purificação, pois os métodos conhecidos de clareamento como caulin, carvão
vegetal, celite, acetona e álcool, entre outros, nem sempre funcionam (presença de
ligação covalente) e os pigmentos podem se ligar de maneira irreversível às resinas
cromatográficas impossibilitando a purificação. A produção de pectinase utilizando os
substratos casca de soja e casca de arroz foi muito baixa, com exceção da produção
com casca de soja obtida em 216hs que foi igual a 21,92U/g, entretanto, como já
discutido, é um tempo longo demais. Já a excelente produção de pectinase com
farelo de algodão e o sabugo de milho foi de 19,60U/g e 18,72U/g, respectivamente,
em um tempo curto de fermentação (72hs), o que economiza tempo de cultivo e
agiliza os experimentos, e as cores dos extratos enzimáticos obtidos foram claras. A
melhor produção de pectinase utilizando farelo de trigo ocorreu em 168hs (19,52U/g)
e foi igual à produção obtida com farelo de algodão em 72hs (19,60U/g). Entretanto,
em tempos menores de fermentação a produção de pectinase com este substrato
não diminuiu muito.
Com base nesta análise foram escolhidos farelo de algodão, farelo de trigo e
sabugo de milho para serem testados (Figura 4).
56
Tabela 6: Produção de pectinase (U/g) por Rhizomucor pusillus A 13.36 em FES
Horas
Farelo de
amendoim
Farelo de
trigo
Farelo de
algodão
Sabugo de
milho
Casca de
soja
Casca de
arroz
24 0 6,80 7,76 2,08 4,56 0
72 14,24 13,28 19,60 18,72 4,72 3,60
120 7,92 17,76 12,40 8,24 7,84 9,44
168 22,64 19,52 7,36 16,80 7,04 0
216 7,20 8,08 0 2,80 21,92 6,56
O extrato enzimático bruto obtido através de fermentação em farelo de trigo
durante 168hs apresentou excelente atividade enzimática PG, entretanto com um
período de fermentação prolongado e uma cor mais escura que a obtida com o farelo
de algodão (Figura 4). Já o extrato enzimático bruto obtido através de fermentação
em farelo de algodão durante 72hs apresentou também uma alta atividade
enzimática PG, uma cor clara e a vantagem de ser obtido com apenas três dias de
cultivo, sendo escolhido para dar continuidade ao processo de purificação. As
características deste extrato, denominado PG bruta, foram analisadas e serão
demonstradas paralelamente às da amostra enzimática depois de purificada (PG
purificada) para melhor comparação (Figuras 9 a 12 e Tabela 7).
Monteiro (2008) relatou que o fungo R. pusillus produziu poligalacturonase a
partir das 72h, atingindo um pico de produção de 16, 3U g
-1
com 144h de
fermentação utilizando farelo de trigo. Os resultados apresentados aqui mostram
uma produção similar de 18U g
-1
com o mesmo tempo (144hs) de fermentação
utilizando farelo de trigo (Figura 4).
57
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
20
22
FA FT FT+SM(1:1) FT+SM(1+9)
Substrato
Atividade Enzimática PG (U g
-1
)
24hs
48hs
72hs
96hs
120hs
144hs
168hs
Figura 4: Produção de PG por Rhizomucor pusillus A 13.36 utilizando fermentação
em estado sólido com Farelo de Algodão, Farelo de Trigo e misturas de Farelo de
Trigo e Sabugo de Milho.
FA: 100% Farelo de Algodão
FT: 100% Farelo de Trigo
FT+SM (1:1): 50% Farelo de Trigo + 50% Sabugo de Milho
FT+ SM (1:9): 10% Farelo de Trigo + 90% Sabugo de Milho.
58
Maller (2008) encontrou os seguintes valores para a produção de
poligalacturonase por Aspergillus niveus em meio substrato sólido (composto por 2g
de fonte de carbono acrescido de 4mL de água destilada, por 168hs a 40
o
C)
utilizando como fonte de carbono: pectina SIGMA (1020U totais), pectina 8003 CP
Kelco Brasil S/A (840U totais), casca de limão-tahiti (1324U totais), casca de laranja-
pera (495U totais), casca de maracujá (960U totais), farelo de trigo (407U totais),
sabugo de milho (416Utotais), bagaço de cana (272U totais) e palha de arroz (318U
totais). As fontes que mais se destacaram como indutores da produção de
poligalacturonases em meio substrato sólido foram a casca de limão-tahiti, a pectina
SIGMA e depois a casca de maracujá. A pectina é um bom indutor para a produção
de pectinases. Entretanto, o setor industrial necessita de substratos mais baratos e
que tenham uma boa indução para a produção de enzimas. Neste caso, a utilização
de resíduos como fonte de carbono pelas indústrias seria muito útil, uma vez que seu
aproveitamento atuaria reduzindo custos e também agregaria valor a estes restos
orgânicos, trazendo benefícios ao meio ambiente e ao empresário (MALLER, 2008).
Um volume de 6,4 mL da solução enzimática bruta obtida após 72hs de FES
utilizando farelo de algodão, em seguida dialisada e concentrada por liofilização, foi
aplicado em uma coluna de filtração em gel Sephadex G-150. A eluição resultou em
dois picos de atividade enzimática (Figura 5).
Neste processo cromatográfico (Figura 5) pode-se notar pelo
acompanhamento da absorbância a 280nm a presença de dois picos bem
separados. O primeiro pico possui um aspecto leitoso e o segundo é extremamente
pigmentado. Justamente no intervalo destes picos surgiram os picos de atividade
enzimática. Esta cromatografia inicial já separou totalmente os pigmentos contidos
no extrato enzimático bruto da atividade enzimática PG e obteve uma excelente
recuperação de 91% (Tabela 7).
59
0
1
2
3
4
5
6
7
167 209 244 265 286 307 328 349 370 391 412 433
Volume de eluição (mL)
Atividade PG (U mL
-1
)
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
ABS 280 nm
Atividade PG (U/mL) ABS280nm
Figura 5: Perfil de eluição de PGs da coluna cromatográfica Sephadex G-150
previamente equilibrada com 30mM de tampão MES em pH 6,5.
As frações obtidas da Sephadex G-150, apresentando atividade enzimática
PG, correspondentes ao volume de eluição 321 a 367, foram reunidas resultando em
45,5mL que foram concentrados por ultrafiltração. Desse concentrado 7,5mL foram
aplicados na coluna de troca aniônica Q-sepharose.
A PG foi retida na coluna de troca aniônica e coletada pela eluição com
gradiente de NaCl (Figura 6). Pode-se observar que foi eluído apenas um pico de
atividade enzimática em 0,1M do gradiente salino. A enzima foi purificada 45,6 vezes
com um rendimento de 8,8% e uma atividade específica de 123,2U/mg (Tabela 7).
60
0
2
4
6
8
10
12
14
16
18
2 6 10 14 18 22 26 30 34 38 42 46 50 54 58 62 66
Volume de eluição (mL)
Atividade PG (U mL
-1
)
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
ABS 280 nm, Gradiente NaCl
Atividade PG (U/mL) ABS 280 nm Gradiente NaCl
Figura 6: Perfil de eluição de PGs da coluna cromatográfica Q-Sepharose
previamente equilibrada com 30mM de tampão MES em pH 6,5 com gradiente de
NaCl (0-1M).
Para dar continuidade ao processo de purificação, as frações obtidas da
cromatografia em Q-Sepharose, com atividade enzimática PG, correspondente ao
volume de eluição 16 a 19, foram reunidas (2,75mL) e concentradas por
centrifugação em centripep resultando em um volume de 750µL que foi aplicado em
coluna cromatográfica Sephacryl S-100 (Figura 7). Novamente, pode-se observar a
eluição de apenas um pico de atividade enzimática, cujas frações foram submetidas
à SDS-PAGE para verificar o grau de pureza (Figura 8). Como pode ser confirmado
pela figura 7 a PG foi eluída completamente purificada da coluna Sephacryl S-100.
61
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
23 29 35 41 47 53 59 65 71 77 83 89 95 101
Volume de eluição (mL)
Atividade PG (U mL-1)
0
0,01
0,02
0,03
0,04
0,05
0,06
0,07
ABS 280 nm
Atividade PG (U/mL) ABS280nm
Figura 7: Perfil de eluição de PGs da coluna cromatográfica Sephacryl S-100
previamente equilibrada com 20mM de tampão MES em pH 6,5 com 150mM de
NaCl.
A purificação da PG produzida pelo fungo R. pusillus A 13.36 foi obtida em 6
etapas de purificação sendo liofilização, filtração em gel, ultrafiltração, troca iônica e
uma concentração por centripep antes da última filtração em gel.
Analisando a tabela 7 pode-se observar que a ultrafiltração pode ser
considerada como uma etapa de purificação com um fator de purificação de 45,5
vezes enquanto o da etapa anterior foi de 31,7 vezes.
A etapa de purificação utilizando a cromatografia em coluna de Q-sepharose,
apesar de ter apresentado uma baixa recuperação e um fator de purificação igual ao
da etapa anterior foi considerada importante, pois promoveu uma grande separação
62
de outras proteínas, tornando possível a purificação da PG na próxima cromatografia
(Tabela 7).
O processo de purificação pode ter retirado do meio algum componente como,
proteína, carboidrato, íon, entre outros, que exercia efeito inibitório sobre a PG. Isto
explicaria o aumento de unidade total na amostra purificada da Sephacryl S-100. O
aumento na unidade total para 89,64U ocorreu após cromatografia em coluna
Sephacryl S-100 na presença de NaCl 150mM, o que poderia ter liberado
componentes inibitórios (Tabela 7).
A atividade específica alta, 1080U/mg, encontrada para a amostra obtida da
Sephacryl S-100 é reflexo de uma amostra totalmente pura cuja proteína, em mg/mL,
foi naturalmente baixa (Tabela 7).
O fator de purificação elevado encontrado para a amostra obtida da Sephacryl
S-100 justifica-se pela atividade específica alta que foi base para cálculo desse fator.
(Tabela 7)
Outros trabalhos da literatura apresentam também valores altos. Jacob e
colaboradores (2008) purificaram uma poligalacturonase, produzida por
Streptomyces lydicus, através de ultrafiltração e uma combinação de procedimentos
cromatográficos de troca iônica e filtração em gel, obtendo uma atividade específica
de 504,8U/mg, fator de purificação de 54,9 e um rendimento de 57,1%. Martins e
colaboradores (2007) obtiveram a purificação de uma poligalacturonase produzida
pelo fungo termofílico Thermoascus aurantiacus, através de gel filtração e
cromatografia de troca iônica, com atividade específica de 7843U/mg, fator de
purificação de 21,0 e rendimento de 24,6%. Uma poligalacturonase do fungo
Aspergillus kawachii foi purificada, por Esquivel e Voget (2004), mais do que 400
vezes com um rendimento final de 40% e uma atividade específica de 430U/mg,
utilizando 5 etapas de purificação.
63
Tabela 7: Síntese dos dados do processo de purificação da PG produzida por R.
pusillus A 13.36 sob FES.
V(mL)
Proteína
(mg/mL)
Prot.
total
(mg)
U/mL U total Atividade
específ.
(U/mg
proteína)
Fat.
purif.
Recup
(%)
Liofilizado
6,4
15,4
98,56
41,4
264,96
2,7
1
100
Sephadex
G-150
45,5
0,062
2,82
5,3
241,1
85,5
31,7
91,0
Ultrafiltração
7,5
0,20
1,5
24,6
184,5
123
45,5
69,6
Q-sepharose
2,75
0,069
0,19
8,5
23,4
123,2
45,6
8,8
Sephacryl
S-100
8,3
0,010
0,083
10,8
89,64
1080
400
33,8
Análises realizadas por eletroforese (SDS-PAGE) após a conclusão dos
processos cromatográficos, possibilitaram a observação de uma única banda
protéica demonstrando que uma PG foi purificada. A enzima apresentou massa
molecular de 53700Da (Figura 8). Este valor está de acordo com os relatados por
Jayani e colaboradores (2005) para a massa molecular de diferentes
poligalacturanases na faixa de 35000 a 79000Da. A homogeneidade da PG de R.
pusillus A 13.36 foi confirmada pela focalização isoelétrica, a qual revelou uma única
banda cujo ponto isoelétrico (pI) foi 3,8 (Figura não apresentada)e este valor foi
similar aos citados para o pI de poligalacturonases variando de 3,3 a 8,5 (JAYANI et
al, 2005).
64
O fato da PG não ter saído no “void” da Sephacryl S-100 (Figura 7) indica sua
natureza monomérica, o que foi confirmado pela massa molecular de 53700Da
obtida por SDS-PAGE (Figura 8). A Sephacryl S-100 fraciona proteínas na faixa de
100 a 100000Da. Se a proteína fosse dimérica ela teria uma massa molecular duas
vezes maior e teria saído no void da Sephacryl S-100.
116 000-
97 400-
66 000-
48 500-
29 000-
-53 700
*
PG
116 000-
97 400-
66 000-
48 500-
29 000-
-53 700
*
PG
Figura 8: SDS-PAGE da PG produzida por R. pusillus A 13.36 sob FES. *: Marcador
molecular (SIGMA) em Daltons (Da).
A inativação e a estabilidade das enzimas são consideradas as maiores
restrições ao rápido desenvolvimento dos processos biotecnológicos. Estudos de
estabilidade fornecem informações importantes sobre a estrutura e a função das
enzimas. Dois pontos importantes a se considerar ao selecionar pectinases para
aplicações industriais são a estabilidade e a manutenção do nível desejado de
atividade por um longo período. A estabilidade de pectinases é afetada por
parâmetros físicos (pH e temperatura) e parâmetros químicos (inibidores e
estimuladores) (GUMMADI e PANDA, 2003).
65
Para ambas as PGs, purificada e bruta, de R. pusillus A 13.36 o pH ótimo foi
5,5 e a temperatura ótima foi 55
o
C (Figuras 9 e 10). Estes resultados estão de
acordo com a literatura onde a maior parte das poligalacturonases fúngicas possui
pH ótimo na faixa ácida e temperaturas ótimas na faixa de 30 a 69
o
C (JAYANI et al,
2005). Nossos resultados são similares aos de Monteiro (2008) que relatou que a
poligalacturonase do fungo R. pusillus apresentou atividade máxima em pH 5,0 e em
temperaturas de 50 a 60
o
C, com atividade ligeiramente maior a 60
o
C. A diferença
pode ser explicada pela utilização de um substrato diferente, o farelo de trigo,
durante a fermentação e pelo tempo requerido para a mesma, 6 dias, que também
não foi igual. Com um tempo maior de fermentação o fungo pode produzir enzimas
diferentes e isoformas. Foda e colaboradores (1984) obtiveram máxima atividade da
poligalacturonase de R. pusillus a 60
o
C. Martins e colaboradores (2007) obtiveram
um pH ótimo de 5,5 e uma temperatura ótima de 65
o
C para a poligalacturonase
purificada a partir de Thermoascus aurantiacus. Para duas poligalacturonases de
Sclerotium rolfsii, Schnitzhofer e colaboradores (2007) encontraram como pH ótimo
5,0 e 4,5 e como temperatura ótima 60
o
C e 55
o
C. A poligalacturonase produzida por
Aspergillus sp N12 (A. fumigatus) possui pH e temperatura ótimos 5,5 e 50
o
C
(FREITAS et al, 2006). Phutela e colaboradores (2005) estudaram uma
poligalacturonase produzida por Aspergillus fumigatus cuja atividade máxima foi em
pH 5,0 e a 50
o
C. A poligalacturonase produzida por Sporotrichum thermophile Apinis
foi otimamente ativa em pH 7,0 e a 55
o
C (KAUR et al, 2004). Kumar e Palanivelu
(1999) encontraram para a poligalacturonase purificada do fungo Thermomyces
lanuginosus, pH ótimo de 5,5 e temperatura ótima de 60
o
C.
66
0
0,5
1
1,5
2
2,5
3
3,5
4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10
pH
Atividade PG purificada (U mL
-1
)
0
7
14
21
28
35
42
49
Atividade PG Bruta (U mL-1)
PG Purificada PG Bruta
Figura 9: Efeito do pH sobre a atividade da PG produzida pelo fungo R. pusillus A
13.36. Tampões utilizados: Ácido Acético-NaOH pH 4,0 -5,5; MES pH 5,5 – 7,0;
HEPES pH 7,0 – 8,0; TAPS pH 8,0 – 9,0; Glicina-NaOH pH 9,0 – 10,0.
67
0
1
2
3
4
5
6
10 30 35 40 45 50 55 60 65 70
Temperatura (
o
C)
Atividade PG Purificada (U mL
-1
)
0
10
20
30
40
50
60
Atividade PG Bruta (U mL
-1
)
PG purificada PG bruta
Figura 10: Efeito da temperatura sobre a atividade da PG produzida pelo fungo R.
pusillus A 13.36.
68
A PG purificada de R. pusillus A 13.36 foi estável por 1h na faixa de pH de 4,5
a 6,5 com uma atividade residual na faixa de 80 a 100% (Figura 11). Este resultado
pode ser comparado ao obtido por Monteiro (2008) para a poligalacturonase
produzida por R. pusillus em 6 dias de FES, cuja estabilidade da enzima foi superior
a 80% em pH 3,0 a 8,5. Jacob e colaboradores (2008) relatam que, para a
poligalacturonase purificada de Streptomyces lydicus, a faixa de estabilidade ao pH
foi de 4,0 a 7,0. A PG bruta também apresentou estabilidade na faixa de pH entre 4,5
e 6,5 com uma atividade residual de 91,3% no pH 6,5 (Figura 11). Durante a
purificação optamos por utilizar o pH 6,5 nos tampões por ser o pH em que a enzima
demonstrou ser mais estável (Figura 11). A estabilidade ao pH das
poligalacturonases pode variar de 2,5 a 12 (JAYANI et al, 2005).
Tanto a PG purificada quanto a bruta exibiram termoestabilidade até 70
o
C.
Para a PG purificada a atividade residual ficou em 100% em 55-60
o
C e para a PG
bruta ficou em 80% nas mesmas temperaturas. Geralmente, a enzima bruta
apresenta uma estabilidade maior que a purificada. Entretanto, os resultados
demonstraram uma estabilidade maior da enzima purificada, que pode ter acontecido
devido à retirada de inibidores no processo de purificação. A 75
o
C as enzimas
perderam completamente a atividade (Figura 12). Para uma poligalacturonase de
Sclerotium rolfsii, Schnitzhofer e colaboradores (2007) encontraram um pH de 6,5
para as temperaturas de 50 e 70
o
C com meia-vida de 80 e 20min, respectivamente.
A estabilidade à temperatura das poligalacturonases pode variar até 75
o
C (JAYANI
et al, 2005). Apesar de estar dentro da faixa referida pela literatura, os dados
encontrados por Monteiro (2008) para as poligalacturonases de R. pusillus diferem
dos resultados discutidos aqui. Com relação a termoestabilidade em ausência de
substrato, as poligalacturonases foram estáveis somente até 40
o
C, preservando 80%
da atividade original (MONTEIRO, 2008).
69
0
20
40
60
80
100
120
4 4,5 5 5,5 6 6,5 7 7,5 8 8,5 9 9,5 10
pH
Atividade Relativa (%).
PG bruta PG purificada
Figura 11: Efeito do pH sobre a estabilidade da PG produzida pelo fungo R. pusillus
A 13.36. Tampões utilizados: Ácido Acético-NaOH pH 4,0 -5,5; MES pH 5,5 – 7,0;
HEPES pH 7,0 – 8,0; TAPS pH 8,0 – 9,0; Glicina-NaOH pH 9,0 – 10,0.
70
0
20
40
60
80
100
120
40 45 50 55 60 65 70 75 80
Temperatura (
o
C)
Atividade Relativa (%)
PG bruta PG purificada
Figura 12: Efeito da temperatura sobre a estabilidade da PG produzida pelo fungo R.
pusillus A 13.36.
O íon Ca
2+
inibiu totalmente a atividade da PG purificada e provocou 70% de
inibição da atividade da PG bruta (Tabela 8). Cabanne e Donèche (2002) estudaram
a inibição por íons cálcio da atividade da poligalacturonase de Botrytis cinerea. Eles
chegaram à conclusão que o cálcio atua como um inibidor competitivo ocupando os
sítios que o ácido poligalacturônico normalmente se ligaria à poligalacturonase.
Os íons Cu
2+
e Hg
2+
provocaram inibição total na atividade da PG purificada e
inibiram 30% e 40%, respectivamente, da atividade da PG bruta. Já o Mn
2+
inibiu
apenas a PG purificada em 60%, não apresentando efeito na atividade da PG bruta
(Tabela 8). Silva e colaboradores (2007) encontraram uma inibição por íons Cu
2+
,
Hg
2+
e Mn
2+
de 92% da atividade da poligalacturonase purificada a partir de
71
Penicillium viridicatum. Os íons Hg
2+,
Mn
2+
, e Zn
2+
inibiram 100, 75 e 50%,
respectivamente da atividade da poligalacturonase purificada a partir de
Thermoascus aurantiacus (MARTINS et al, 2007). A inibição por agentes
bloqueadores do grupo tiol, tais como Hg
2+
e Cu
2+
mostra o envolvimento desse
grupo no sítio ativo da enzima (MACIEIRA et al,1997; VIEILLE e ZEIKUS, 2001;
MARTINS et al, 2007; SILVA et al,2007). Apesar do SDS inibir em apenas 15% a
atividade da PG purificada, causou uma inibição de 35% na atividade da PG bruta
(Tabela 8). Foi relatada uma inibição total por SDS da atividade da poligalacturonase
purificada de Streptomyces lydicus (JACOB et al, 2008). O íon Fe
3+
inibiu 80% da
atividade da PG purificada e 30% da PG bruta (Tabela 8). Uma inibição de 60% na
atividade de poligalacturonase provocada por íons Fe
2+
foi encontrada por Silva e
colaboradores (2007). O íon Ag
+
inibiu em cerca de 80% a atividade da PG purificada
e em 94% a atividade da PG bruta (Tabela 8). O EDTA provocou uma inibição parcial
da atividade o que sugere, segundo Silva e colaboradores (2007), que a atividade é
cátion dependente. O β-mercaptoetanol teve um efeito adverso inibindo em 70% a
atividade da PG purificada e estimulando em 50% a PG bruta (Tabela 8). A
estimulação por β-mercaptoetanol é consistente com os dados de Jacob e
colaboradores (2008). Os reagentes triton X-100 e tween 20 inibiram em 60 e 40%,
respectivamente, a atividade da PG bruta, mas ambos causaram um estímulo de
30% na atividade da PG purificada (Tabela 8).
Vários reagentes estimularam a atividade da PG purificada numa faixa de 12 a
104% de estimulação. São estes: Co
2+
, Mg
2+
, glicerol, triton X-100, tween 20 e tween
80. Os reagentes que estimularam a atividade da PG bruta numa faixa de 37 a 53%
de estimulação são β-mercaptoetanol, glicerol e trehalose. Curiosamente os
reagentes que estimularam a PG purificada não são os mesmos que estimularam a
PG bruta e vice-versa, com exceção do glicerol (Tabela 8). As variações observadas
entre a enzima bruta e a purificada podem estar ocorrendo devido ao fato de que a
enzima bruta contém vários componentes que interferem diferentemente na atividade
da PG, o que já não ocorre na amostra com a presença apenas da PG purificada.
72
Tabela 8: Efeito de potenciais inibidores e estimuladores sobre a atividade da PG
produzida por R. pusillus A 13.36.
Reagentes Atividade Residual (%)
PG bruta
Atividade Residual (%)
PG purificada
Controle 100,0 100,0
Ag
+
5mM 6,1 22,5
Ba
2+
5mM 85,4 95,5
Ca
2+
5mM 29,6 0
Co
2+
5mM 104,5 118,0
Cu
2+
5 mM 64,0 0
Fe
3+
5mM 69,9 18,7
Hg
2+
5mM 60,0 0
Mg
2+
5mM 84,0 204,1
Mn
2+
5mM 103,2 39,3
Ni
2+
5mM 77,0 93,6
Zn
2+
5mM 97,5 78,6
Trehalose 1% 143,0 73,0
Triton X-100 0,5% 38,7 131,1
Tween 20 0,5% 61,5 136,7
Tween 80 0,5% 91,6 123,6
β-mercaptoetanol 5mM
153,7 33,7
EDTA 0,25% 65,0 72,0
Glicerol 1% 137,0 112,3
SDS 0,5% 65,2 86,1
A análise dos resultados obtidos com o experimento de especifidade ao
substrato (Figura 13) mostrou que a PG purificada é uma polimetilgalacturonase.
Ambas as enzimas, PGs purificada e bruta, tiveram uma maior afinidade por pectinas
de alta esterificação: de citrus (92% D.E.) com 13,5U mL
-1
, comercial (87% D.E) com
12,5U mL
-1
e de maçã (87% D.E) com 9,8U mL
-1
. A maior atividade enzimática
ocorreu utilizando a pectina de citrus com 92% de esterificação. A afinidade por
pectinas de alta esterificação e a ausência de atividade quando o ácido
73
poligalacturônico foi usado como substrato indica que a enzima purificada é uma
polimetilgalacturonase e não uma poligalacturonase.
Fogarty e Ward (1972) relatam a classificação das pectina depolimerases de
acordo com o seguinte critério: a preferência por pectina ou pectato como substrato,
a cisão hidrolítica ou transeliminativa das ligações glicosídicas e o mecanismo endo
ou exo de ação da enzima. Segundo Fogarty e Ward (1972) a hidrolase que atua
principalmente em ácidos galacturônicos altamente metilesterificados pode ser
chamada de polimetilgalacturonase.
Ohtsuki e colaboradores (1995) investigaram a especificidade ao substrato de
uma polimetilgalacturonase purificada do pólen do cedro japonês. Esta enzima teve
atividade na pectina e nenhuma atividade no ácido poligalacturônico. A atividade da
polimetilgalacturonase foi observada quando o ácido galacturônico foi
metilesterificado e aumentou gradualmente à medida que o grau de
metilesterificação aumentou e alcançou um máximo de 50–60% de
metilesterificação.
Segundo Silva e colaboradores (2007) uma poligalacturonase foi purificada a
partir de Penicillium viridicatum. Entretanto, com relação à especificidade ao
substrato essa enzima exibiu maior atividade em pectinas de alta esterificação de
maçã (87% D.E.), de citrus (92% D.E.) e de citrus comercial (87% D.E.), na ordem
citada, indicando uma possível classificação dessa enzima como
polimetilgalacturonase.
O ácido poligalacturônico foi o substrato pelo qual a poligalacturonase
purificada de Streptomyces lydicus teve maior afinidade (JACOB et al, 2008).
Martins e colaboradores (2007) purificaram uma poligalacturonase produzida
por Thermoascus aurantiacus cujo substrato que a enzima teve maior afinidade foi a
pectina de citrus de baixa esterificação (26%).
A análise da especificidade ao substrato mostrou que a poligalacturonase
purificada de Aspergillus kawachii hidrolisa melhor o ácido poligalacturônico do que a
pectina parcialmente esterificada e é praticamente inativa contra a pectina de alta
esterificação (92%) (ESQUIVEL e VOGET, 2004).
74
0
2
4
6
8
10
12
14
16
Pectina Citrus
Alta
Esterificação
92% D.E.
Pectina Citrus
Baixa
Esterificação
26% D.E.
Pectina Maçã
87% D.E.
Ác.
Poligalacturônico
Pectina Citrus
Alta Esterificação
Comercial
Atividade PG (U mL
-1
)
PG purificada
0
10
20
30
40
50
60
70
Pectina Citrus
Alta
Esterificação
92% D.E.
Pectina Citrus
Baixa
Esterificação
26% D.E.
Pectina Maçã
87% D.E.
Ác.
Poligalacturônico
Pectina Citrus
Alta Esterificação
Comercial
Atividade PG (U mL
-1
)
PG bruta
Figura 13:
Especificidade ao substrato da polimetilgalacturonase produzida pelo
fungo
R. pusillus
A 13.36.
75
A polimetilgalacturonase purificada foi incubada por 10, 30 e 60min a 55
o
C
com pectina de citrus 1% (92% D.E.). Observando o cromatograma (Figura 14)
verifica-se que a enzima liberou ácidos monogalacturônico, digalacturônico e
trigalacturônico em qualquer um dos tempos observados. Oligogalacturonatos
maiores podem ser melhor observados no período inicial de incubação. O fato da
enzima ter liberado monogalacturonatos e digalacturonatos no período inicial de
incubação sugere que a enzima degradou o substrato por múltiplos ataques. Neste
mecanismo, a enzima pode catalisar a hidrólise de várias ligações antes de se
dissociar e formar um novo complexo ativo com outro polímero (ESQUIVEL e
VOGET, 2004). Cook e colaboradores (1999) descreveram este mecanismo de
degradação alternativo como modo de clivagem endo/exo misto da
poligalacturonase. A poligalacturonase de Colletotrichum lindemuthianum hidrolisou
o ácido poligalacturônico e tanto os produtos iniciais como os produtos finais de
hidrólise foram ácido monogalacturônico, digalacturônico e trigalacturônico indicando
um modo de clivagem endo/exo misto (ENGLISH et al, 1972). Este modo misto de
clivagem também foi relatado para a poligalacturonase purificada a partir de
Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici (PIETRO e RONCERO, 1996). A
poligalacturonase purificada a partir de Thermoascus aurantiacus CBMAI-756
apresentou o modo de ação endo/exo misto da poligalacturonase. Esta enzima foi
incubada com pectina de citrus 1% (26 D.E.) e liberou uma mistura de monômero,
dímero, trimêro e oligômeros de ácido galacturônico como produtos de hidrólise
depois de 5min de reação, sendo que di e monogalacturonatos foram liberados na
etapa inicial do período de incubação (MARTINS et al, 2007). Não existem muitos
estudos com caracterização de polimetilgalacturonases. Riou e colaboradores (1992)
relataram que a polimetilgalacturonase purificada a partir de Sclerotinia sclerotiorum
apresentou o modo de ação exo liberando produtos de hidrólise de baixa massa
molecular observados em cromatografia de camada delgada.
76
Figura 14: Cromatografia de papel dos produtos de hidrólise da
polimetilgalacturonase purificada utilizando pectina de citrus (92% D.E.). (H10’),
(H30’) e (H60’) são os hidrolisados com 10, 30 e 60min de incubação,
respectivamente. 1G, 2G e 3G são os padrões de ácido monogalacturônico,
digalacturônico e trigalacturônico, respectivamente.
O cálculo dos parâmetros cinéticos foi realizado com uma amostra de PG
purificada obtida pela repetição do processo de purificação e não com a mesma
amostra utilizada para o cálculo da tabela 7. Isto explica o fato do valor obtido para
atividade específica (1080U/mg) não ter sido o mesmo que o obtido para a V
max
(2379,04µmolmin
-1
mg
-1
- Tabela 9). A pectina de alta esterificação (92%) (Sigma) foi
utilizada e o ensaio foi realizado nas condições ótimas de atividade. Os valores para
a constante de Michaelis-Menten (K
m
) e para velocidade máxima (V
max
) de uma
enzima são determinados pela medida das velocidades iniciais para várias
concentrações de substrato.
A afinidade da polimetilgalacturonase pura por pectina de citrus de alta
esterificação (92% - Sigma) foi analisada pelo gráfico duplo-recíproco de Lineweaver
e Burk através do programa Origin 6,0. Os valores obtidos para K
m
e velocidade
máxima foram 10,78mg/mL e 2379,04
µmolAG/min/mg, respectivamente e estão
apresentados na Tabela 9. O K
m
encontrado é elevado, o que reflete uma baixa
77
afinidade da enzima ao substrato, neste caso à pectina de alta metilação de citrus,
pois uma concentração elevada de substrato é necessária para atingir uma
velocidade que é ½ V
max
.
Tabela 9: Propriedades da polimetilgalacturonase purificada produzida por R.
pusillus A 13.36.
K
m
10,78mg mL
-1
V
max
2379,04µmolmin
-1
mg
-1
Massa Molecular (SDS-PAGE)
53,700Da
pI
3,8
Segundo Jayani e colaboradores (2005) os valores de K
m
para pectinases
variam de 0,059 a 4,7mg/mL, porém encontramos na literatura valores bem mais
elevados que estes. Freixo e colaboradores (2008) encontraram um K
m
de
13,23mg/mL para a poligalacturonase purificada de Pleurotus ostreatus. Lei e
colaboradores (2007) encontraram para a poligalacturonase (Fluka Chemical Co.)
um K
m
de 8,28g/mL. Uma pectinase de Penicillium italicum foi purificada por Alana e
colaboradores (1991) e obtiveram um K
m
de 15mg/mL. Assim, deduzimos que não
existe um intervalo definido onde os valores de K
m
de pectinases microbianas devam
ficar limitados. Estes valores são característicos para cada enzima.
78
6. CONCLUSÃO
A PG purificada foi identificada, no final deste trabalho, como uma
polimetilgalacturonase devido a sua maior afinidade por pectinas de alta
esterificação. Entretanto, não existem muitos relatos na literatura caracterizando
polimetilgalacturonases e sim, poligalacturonases. Por esta razão, este trabalho foi
baseado em estudos anteriores com produção e purificação de poligalacturonases.
Isso porque as poligalacturonases e as polimetilgalacturonases têm características
muito similares, o que dificultou a identificação da enzima.
A purificação da polimetilgalacturonase produzida pelo fungo R. pusillus A
13.36 foi obtida através de procedimentos simples, apresentando temperatura e pH
ótimos de 55
o
C e 5,5. A polimetilgalacturonase purificada exibiu termoestabilidade
até 70
o
C com uma atividade residual de 100% a 55-60
o
C. Essas condições são
excelentes para a utilização desta enzima no setor industrial, pois a alta temperatura
é tecnicamente e economicamente interessante, pois reduz o risco de contaminação,
reduz a viscosidade e aumenta a solubilidade do substrato. Entretanto, quando
comparada com mesofílicos, a biomassa alcançada por organismos termofílicos é
muito baixa. O baixo rendimento das células levanta problemas para a produção
tanto em escala laboratorial quanto em larga escala comercial, o que dificulta
estudos extensivos de suas enzimas. Apesar das dificuldades, as
polimetilgalacturonases podem ser aplicadas na indústria de processamento têxtil e
de fibras de celulose, na composição de detergentes, na degradação ou modificação
de material vegetal, aditivo para alimentação animal e no processamento de vinhos e
sucos. Uma alternativa para a redução dos custos de produção de enzimas
termofílicas em escala industrial e aumento do rendimento é o uso da tecnologia do
DNA recombinante. Uma grande variedade de enzimas termoestáveis foram
clonadas e expressas com sucesso em organismos mesofílicos, tais como
Escherichia coli, Saccharomyces cerevisae e Aspergillus oryzae. Portanto, este
trabalho pode dar continuidade a uma série de estudos aplicados com a
polimetilgalacturonase.
79
7. REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
ALANA, A.; LLARNA, M.J.; SERRA, J.L. Purification and some properties of the
pectin lyase from Penicillium italicum. FEBS Letters, v.280, p.335-340, 1991.
ALKORTA, I.; GARBISU, C.; LLAMA, M.J.; SERRA, J.L. Industrial applications of
pectic enzymes: a review. Process Biochemistry, v.33, p.21-28, 1998.
ANTRANIKIAN, G. Microbial Degradation of Starch. In: Winkelmann, G. (ed).
Microbial Degradation of Natural Products. UCH, Weinheim, Germany, p.27-51,
1992.
ARANDA, E.; SAMPEDRO, I.; OCAMPO, J.A.; GARCÍA-ROMERA, I. Contribution of
hydrolytic enzymes produced by saprophytic fungi to the decrease in plant toxicity
caused by water-soluble substances in olive mill dry residue. Applied Microbiology
and Biotechnology, v.64, p.132-135, 2004.
BAI, Z.H.; ZHANG, H.X.; QI, H.Y.; PENG, X.W.; LI, B.J. Pectinase production by
Aspergillus niger using wastewater in solid state fermentation for eliciting plant
disease resistance. Bioresource Technology, v.95, p.49-52, 2004.
BARON, A. & THIBAULT, J.F., Les enzymes pectolytiques. In: Hydrolases et
Dépolimérases, ed. A. Mouranche & C.Costes. Gauthier-Villars, Paris, p.143-164,
1985.
80
BELDMAN, G.; VAN DEN BROEK, L.A.M.; SCHOLS, H.A.; SEARLE-VAN
LEEUWEN, M.J.F.; VAN LAERE, K.M.J.; VORAGEN, A.G.J. Biotechnology Letters,
v.18, p.707-712, 1996.
BEROVIC, M.; OSTROVERSNIK, H. Production of Aspergillus niger pectolytic
enzymes by solid state bioprocessing of apple pomace. Journal of Biotechnology,
v.53, p.47-53, 1997.
BLUM, H.; BIER, H.; GROSS, H.J. Improved silver staining of plant-proteins, RNA
and DNA in polyacrylamide gels. Electrophoresis, v.8, p.93-99, 1987.
BOUTZ, D.R.; CASCIO, D.; WHITELEGGE, J.; PERRY, L.J.; YEATES, T.O.
Discovery of a thermophilic protein complex stabilized by topologically interlinked
chains. Journal of Molecular Biology, v.368, p.1332-1344, 2007.
BROCK, D.T.; MADIGAN, M.T. Biology of Microrganisms, Prentice Hall
International Inc., New York, 6ª ed., 2001.
BRUINS, M. E.; JANSSEN, A. E. M.; BOOM, R. M. Thermozymes and their
applications. Applied Biochemistry and Biotechnology, v.90, p.155-185, 2001.
CABANNE, C.; DONÈCHE, B. Purification and characterization of two izozymes of
polygalacturonase from Botrytis cinerea. Effect of calcium ions on polygalacturonase
activity. Microbiological Research, v.157, p.183-189, 2002.
81
CELESTINO, S.M.C.; FREITAS, S.M.; MEDRANO, F.J.; SOUZA, M.V.; FERREIRA
FILHO, E.X. Purification and characterization of a novel pectinase from
Acrophialophora nainiana with emphasis on its physicochemical properties. Journal
of Biotechnology, v.123, p.33-42, 2006.
CHITRADON, L.; POONPAIROJ, P.; MAHAKHAN, P.; KITPREECHAVANICH, V.;
LOTONG, N. Pectinases from Rhizopus sp. Efficient in enhancing the hydrolyzation
of raw cassava starch: purification and characterization. Pectin and Pectinases, J.
Visser and A.G.J. Voragen (Editors), p.715-722, 1996.
COOK, B.J.; CLAY, R.P.; BERGMANN, C.W.; ALBERSHEIM, P.; DARVILL, A.G.;
Fungal polygalacturonases exhibit different substrate degradation patterns and differ
in their susceptibilities to polygalacturonase-inhibiting proteins. Molecular Plant-
Microbe Interactions, v.12, p.703-711, 1999.
COUTO, S.R.; SANROMÁN, M.A. Application of solid-state fermentation to food
industry – A review. Journal of Food Engineering, v.76, p.291-302, 2006.
DAS, R.; GERSTEIN, M. The stability of thermophilic proteins: a study based on
comprehensive genome comparison. Functional Integrate Genomics, v.1; p.76-88,
2000.
DA SILVA, R.; FRANCO, C.M.L.; GOMES, E. Pectinases, hemicelulases e celulases,
ação, produção e aplicação no processamento de alimentos: Revisão. Boletim da
SBCTA, v.31(2), p.249-260, 1997.
82
DEBING, J.; PEIJUN, L.; STAGNITTI, F.; XIANZHE, X.; LI, L. Pectinase production
by solid fermentation from Aspergillus niger by a new prescription experiment.
Ecotoxicology and Environmental Safety, v.64, p.244-250, 2006.
DEVI, N.A.; RAO, A.G.A. Fractionation, purification, and preliminary characterization
of polygalacturonases produced by Aspergillus carbonarius. Enzyme and Microbial
Technology, v.18, p.59-65, 1996.
DZIEZAK, J.D. Enzymes: catalyst for food processes. Food Technology, v.45, p.78-
85, 1991.
ENGLISH, P.D.; MAGLOTHIN, A.; KEEGSTRA, K. A cell wall-degrading
endopolygalacturonase secreted by Colletotrichum lindemuthianum. Plant
physiology, v.49, p.293-297, 1972.
ESQUIVEL, J.C.C.; VOGET, C.E. Purification and partial characterization of an acidic
polygalacturonase from Aspergillus kawachii. Journal of Biotechnology, v.110;
p.21-28, 2004.
FODA, M.S.; RIZK, I.R.S.; GIBRIEL, A.Y.; BASHA, S.I. Biochemical properties of
polygalacturonase, produced by Aspergillus aculeatus and Mucor pusillus.
Zentralblatt fuer Mikrobiologie, v.139, p.463-469, 1984.
FOGARTY, W.M.; WARD, O.P. Pectic substances and pectinolytic enzymes.
Process Biochemistry, v.7, p.13-17, 1972.
83
FREITAS, P.M.; MARTIN, N.; SILVA, D.; DA SILVA, R.; GOMES, E. Production and
partial characterization of polygalacturonases produced by thermophilic Monascus sp
N8 and by thermotolerant Aspergillus sp N12 on solid-state fermentation. Brazilian
Journal of Microbiology, v.37, p.302-306, 2006.
FREIXO, M.R.; KARMALI, A.; ARTEIRO, J.M. Production and chromatographic
behaviour of polygalacturonase from Pleurotus ostreatus on immobilized metal
chelates. Process Biochemistry, v.43, p.531-539, 2008.
FRY, S.C. Cross-linking of matrix polymers in the growing cell walls of angiosperms.
Annual Review Plant Physiology, v.37, p.165-186, 1986.
GERVAIS, P.; MOLIN, P. The role of water in solid-state fermentation. Biochemical
Engineering Journal, v.13, p.85-101, 2003.
GOMES, E.; GUEZ, M.A.U.; MARTIN, N.; SILVA, R. Enzimas termoestáveis:
fontes,produção e aplicação industrial. Química Nova, v.30, No.1, p,136-145, 2007.
GRAMINHA, E.B.N.; GONÇALVES, A.Z.L.; PIROTA, R.D.P.B.; BALSALOBRE,
M.A.A.; DA SILVA, R.; GOMES, E. Enzyme production by solid-state fermentation:
Application to animal nutrition. Animal Feed Science and Technology, v.144, p.1-
22, 2008.
GRIFFIN, D.M. Water and microbial stress. Advances in Microbial Ecology, v.5,
p.91-136, 1981.
84
GROMIHA, M.M.; THOMAS, S.; SANTHOSH, C. Role of cation-π interactions to the
stability of thermophilic proteins. Preparative Biochemistry and Biotechnology,
v.32, n.4, p. 355-362, 2002.
GUMMADI, S.N.; PANDA, T. Purification and biochemical properties of microbial
pectinases – a review. Process Biochemistry, v.38, p.987-996, 2003.
GYGI, S.P.; CORTHALS, G.L.; ZHANG, Y.; ROCHON, Y.; AEBERSOLD, R.
Evaluation of two-dimensional gel electrophoresis-based proteome analysis
technology. Proceedings of the National Academy of Sciences, v.97, p.9390-
9395, 2000.
HAKI, G.D.; RAKSHIT, S.K. Developments in industrially important thermostable
enzymes: a review. Bioresource Technology, v.89, p.17-34, 2003.
HARTREE, E.E. Determination of protein: A modification of the Lowry method that
gives a linear photometric response. Analytical Biochemistry, v.48, p.422-427,
1972.
HÖLKER, U.; LENZ, J. Solid-state fermentation – are there any biotechnological
advantages? Current Opinion in Microbiology, v.8, p.301-306, 2005.
HOONDAL, G.S.; TIWARI, R.P.; TEWARI, R.; DAHIYA, N.; BEG, Q.K. Microbial
alkaline pectinases and their industrial applications: a review. Applied Microbiology
and Biotechnology, v.59, p.409-418, 2002.
85
HUBER, D.J. The role of cell wall hydrolases in fruit softening. Horticultural reviews,
v.5, p.169-219, 1983.
ISSHIKI, A.; AKIMITSU, K.; ISHII, H.; YAMAMOTO, H. Purification of
polygalacturonases produced by the pear scab pathogens, Venturia nashicola and
Venturia pirina. Physiological and Molecular Plant Pathology, v.56, p.263-271,
2000.
JACOB, N.; POORNA, C.A.; PREMA, P.P. Purification and partial characterization of
polygalacturonase from Streptomyces lydicus. Bioresource Technology, v.99,
p.6697-6701, 2008.
JAIN, S.; DURAND, H.; TIRABY, G. Production of extracellular pectinase enzymes by
a mutant (Po16) of Penicillium occitanis. Applied. Microbiology and
Biotechnology, v.34, p.308-312, 1990.
JAYANI, R.S.; SAXENA, S.; GUPTA, R. Microbial pectinolytic enzymes: a review.
Process Biochemistry, v.40, p.2931-2944, 2005.
KAPOOR, M.; BEG, Q.W.; BHUSHAN, B.; DADHICH, K.S.; HOONDAL, G.S.
Application of an alkaline and thermostable polygalacturonase from Bacillus sp MG-
cp-2 in degumming of ramie (Boehmeria nivea) and sun hemp (Crotalaria juncea)
bast fibres. Process Biochemistry, v.36, p.803-807, 2001.
KASHYAP, D.R.; VOHRA, P.K.; CHOPRA, S.;TEWARI, R. Applications of pectinases
in the commercial sector: a review. Bioresource Technology, v.77, p.215-227,
2001.
86
KAUR, G.; KUMAR, S.; SATYANARAYANA, T. Production, characterization and
application of a thermostable polygalacturonase of a thermophilic mould
Sporotrichum thermophile Apinis. Bioresource Technology, v.94, p.239-243, 2004.
KUMAR, S.; NUSSINOV, R. Fluctuations in ion pairs and their stabilities in proteins.
Proteins: Structure, Function, and Genetics, v.43, p.433-454, 2001.
KUMAR, S.S.; PALANIVELU, P. Purification and characterization of an extracellular
polygalacturonase from the thermophilic fungus, Thermomyces lanuginosus. World
Journal of Microbiology & Biotechnology, v.15, p.643-646, 1999.
KYRIAKIDIS, N.B. Use of pectinesterase for detection of hidrocolloids addition in
natural orange juice. Food Hidrocolloids, v.19, p.497-500, 1999.
LAEMMLI, U.K. Cleavage of structural protein during the assembly of head of
bacteriophage T4. Nature, v.227, p.680-685, 1970.
LEI, Z.; BI, S.; YANG, H. Chitosan-tethered the silica particle from a layer-by-layer
approach for pectinase immobilization. Food Chemistry, v.104, p.577-584, 2007.
LI, W.F.; ZHOU, X.X.; LU, P. Structural features of Thermozymes. Biotechnology
Advances, v.23, p.271-281, 2005.
LIMA, A.S.; ALEGRE, R.M.; MEIRELLES, A.J.A. Partitioning of pectinolytic enzymes
in polyethylene glycol/potassium phosphate aqueous two-phase systems.
Carbohydrate Polymers, v.50, p.63-68, 2002.
87
LINEWEAVER, H.; BURK, D. The determination of enzyme dissociation constants.
Journal of the American Chemical Society, v.56, p.658-666, 1934.
MACIEIRA, F.I.G.; PIETRO, A.D.; RONCERO, I.G. Purification and characterization
of novel exopolygalacturonase from Fusarium oxysporum f. sp. lycopersici. FEMS
Microbiology Letters, v.154, p.37-43, 1997.
MADIGAN,M.T.; ORENT, A. Thermophilic and halophilic extremophiles. Current
Opinion in Microbiology, v.2, n.3, p.265-269, 1999.
MALLER, A. Produção, purificação e caracterização do complexo pectinolítico
do fungo Aspergillus niveus. 2008. 98 f. Dissertação (Mestrado em Bioquímica) –
Faculdade de Medicina de Ribeirão Preto – USP, Ribeirão Preto.
MC NEILL, M.; DARVILL, A.G.; FRY, S.C.; ALBERSHELM, P. Structure and function
of the primary cell walls of plants. Annual Review Biochemistry, v.53, p.625-663,
1984.
MAMMA, D.; KOURTOGLOU, E.; CHRISTAKOPOULOS, P. Fungal multienzyme
production on industrial by-products of the citrus- processing industry. Bioresource
Technology, v.99, p.2373-2383, 2008.
MARTINS, E.S.; SILVA, D.; DA SILVA, R.; GOMES, E. Solid state production of
thermostable pectinases by thermophilic Thermoascus aurantiacus. Process
Biochemistry, v.37, p.949-954, 2002.
88
MARTINS, E.S.; SILVA, D.; LEITE, R.S.R.; GOMES, E. Purification and
characterization of poligalacturonase produced by thermophilic Thermoascus
aurantiacus CBMAI-756 in submerged fermentation. Antonie van Leeuwenhoek,
v.91, p.291-299, 2007.
MAUGINI, E.; TRONELLI, D.; BOSSA, F.; PASCARELLA, S. Structural adaptation of
the subunit interface of oligomeric thermophilic and hiperthermophilic enzymes.
Computational Biology and Chemistry, v.33, p.137-148, 2009.
MONDAL, K.; MEHTA, P.; GUPTA, N. Affinity precipitation of Aspergillus niger
pectinase by microwave-treated alginate. Protein Expression and Purification,
v.33, p.104-109, 2004.
MONTEIRO, A.C. Produção de poligalacturonases por fungos termofílicos e
mesofílicos em fermentação em estado sólido e comparação das isoformas da
enzima produzidas por cada grupo. 2008. 80 f. Dissertação (Mestrado em
Microbiologia Aplicada) – Instituto de Biociências. Universidade Estadual Paulista,
Rio Claro.
NAGAI, M.; KATSURAGI, T.; TERASHITA, T.; YOSHIKAWA, K.; SAKAI, T.
Purification and Characterization of an endo-polygalacturonase from Aspergillus
awamori. Bioscience Biotechnology and Biochemistry, v.64, p.1729-1732, 2000.
NELSON, N. A photometric adaptation of the Somogyi method for the determination
of glucose. Journal of Biological Chemistry, v.153, p.375-380, 1944.
89
OHTSUKI, T.; TANIGUCHI, Y.; KOHNO, K.; FUKUDA, S.; USUI, M.; KURIMOTO, M.
Cry j 2, a major allerjen of Japanese cedar pollen, shows polymethylgalacturonase
activity. Allergy, v.50, p.483-488, 1995.
PAIARDINI, A.; GIANESE, G.; BOSSA, F.; PASCARELLA, S. Structural plasticity of
thermophilic serine hydroxymethyltransferases. Proteins: Structure, Function and
Genetics, v.50, p.122-134, 2003.
PANDA, T.; NAIR, S.R.; KUMAR, M.P. Regulation of synthesis of the pectolytic
enzymes of Aspergillus niger. Enzyme and Microbial Technology, v.34, p.466-473,
2004.
PANDEY, A.; SELVAKUMAR, P.; SOCCOL, C.R.; NIGAM, P. Solid state
fermentation for the production of industrial enzymes. Current Science, v.77, p.149-
162, 1999.
PASHOVA, S.; SLOKOSKA, L.; KRUMOVA, E.; ANGELOVA, M. Induction of
polymethilgalacturonase biosynthesis by immobilized cells of Aspergillus niger 26.
Enzyme and Microbial Technology, v.24, p.535-540, 1999.
PEDROLLI, D.B.; MONTEIRO, A.C.; GOMES, E.; CARMONA, E.C. Pectin and
pectinases: production, characterization and industrial apllication of microbial
pectinolytic enzymes. The Open Biotechnology Journal, v.3, p.9-18, 2009.
PERÉZ, S.; MAZEAU, K.; HERVE DU PENHOAT, C. The three dimensional
structures of the pectic polysaccharides. Plant Physiology Biochemistry, v.38,
p.37-55, 2000.
90
PHUTELA, U.; DHUNA, V.; SANDHU, S.; CHADHA, B.S. Pectinase and
polygalacturonase production by a thermophilic Aspergillus fumigatus isolated from
decomposting orange peels. Brazilian Journal of Microbiology, v.36, p.63-69,
2005.
PIETRO, A.D.; RONCERO, M.I.G. Endopolygalacturonase from Fusarium oxysporum
f. sp. lycopersici: purification, characterization, and production during infection of
tomato plants. Biochemistry and Cell Biology, V.86, p.1324-1330, 1996.
PILNIK, W.; ROMBOUTS, F.M. Pectic enzymes. In: BIRCH, G.C.;BLAKEBROUGH,
N.; PARKER, K.J. (Ed.). Enzymes and food processing. London: Applied Science
Publishers, p.105-128, 1981.
PILNIK, W.; VORAGEN, A.G.J. In: Hulme, A.C. (ed). The Biochemistry of Fruits
and their Products. Academic Press, London and New York, p. 53-87, 1970.
PUCHART, V.; KATAPODIS, P.; BIELY, P.; KREMNICKÝ, L.; CHRISTAKOPOULOS,
P.; VRSANSKÁ, M.; KEKOS, D.; MACRIS, B.J.; BHAT, M.K. Production of xylanases,
mannanases, and pectinases by the thermophilic fungus Thermomyces lanuginosus.
Enzyme and Microbial Technology, v.24, p.355-361, 1999.
RABALHO A.A. Isolamento de linhagens microbianas termofílicas amilolíticas,
produção, caracterização e aplicação das amilases na hidrólise do amido de
mandioca. 2002. 172 f. Dissertação (Mestrado em Ciência de Alimentos) - Instituto
de Biociências, Letras e Ciências Exatas. Universidade Estadual Paulista, São José
do Rio Preto.
91
REXOVA-BENKOVA, L.; MARKOVIC, O. Pectic enzymes. Advances in
Carbohydrate Chemistry & Biochemistry, v.33, p.323-385, 1976.
RIDLEY, B.L.; O’NEILL, M.A.; MOHNEN, D. Pectins: structure, biosynthesis,and
oligogalacturonide-related signaling. Phytochemistry, v.57, p.929-967, 2001.
RIOU, C.; FREYSSINET, G.; FEVRE, M. Purification and characterization of
extracelular pectinolytic enzymes produced by Sclerotinia sclerotiorum. Applied and
Environmental Microbiology, v.58, No.2, p.578-583, 1992.
ROMBOULTS, F.M.; THIBAULT, J.F. Carbohydrate Research, v.154 p.177-187,
1986.
SAITO, K.; TAKAKUWA, N.; ODA, Y. Purification of the extracellular pectinolytic
enzyme from the fungus Rhizopus oryzae NBRC 4707. Microbiological Research,
v.159, p.83-86, 2004.
SAKAI, T.; SAKAMOTO, T.; HALLAERT, J.; VANDAMME, E. Pectin, pectinase and
protopectinase: production, properties and applications. Advances Applied
Microbiology, v.39, p.213-294, 1993.
SAMBROOK, J.; RUSSELL, D.W. Molecular Cloning: A laboratory manual. 3. ed.
NY: Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2001.
SANTOS, M.M.; ROSA, A.S.; DALBOIT, S.; MITCHELL, D.A.; KRIGER, N. Thermal
denaturation: is solid-state fermentation really a good technology for the production of
enzymes? Bioresource Biotechnology, v.93, p.261-268, 2004.
92
SARABOJI, K.; GROMIHA, M.M.; PONNUSWAMY, M.N. Importance of main-chain
hydrophobic free energy to the stability of thermophilic proteins. International
Journal of Biological Macromolecules, v.35, p.211-220, 2005.
SATO, M.; KAJI, A. Action pattern of pectate lyase from Streptomyces nitrosporeus.
Agricultural Biological Chemistry, v.41, p.2199-2203, 1977.
SCHNITZHOFER, W.; WEBER, H.-J.; VRSANSKÁ, M.; BIELY, P.; CAVACO-PAULO,
A.; GUEBITZ, G.M. Purification and mechanistic characterization of two
polygalacturonases from Sclerotium rolfsii. Enzyme and Microbial Technology,
v.40, p.1739-1747, 2007.
SCHUSTER, E.; DUNN-COLEMAN, N.; FRISVAD, J.C.; DIJCK, P.W.M. On the
safety of Aspergillus niger – a review. Applied Microbiology and Biotechnology,
v.59, p.426-435, 2002.
SILVA, D.; MARTINS, E.S.; LEITE, R.S.R.; DA SILVA, R.; FERREIRA, V.; GOMES,
E. Purification and characterization of an exo-polygalacturonase produced by
Penicillium viridicatum RFC3 in solid-state fermentation. Process Biochemistry,
v.42, p.1237-1243, 2007.
SINGH, S.; PILLAY, B.; PRIOR, B.A. Thermal stability of β-xylanases produced by
Thermomyces lanuginosus strains. Enzyme and Microbial Technology, v.26,
p.502-508, 2000.
SOCCOL, R.S.; VANDENBERGHE, L.P.S. Overview of applied solid-state
fermentation in Brazil. Biochemical Engineering Journal, v.13, p.205-218, 2003.
93
SOLIS, S.; FLORES, M.E.; HUITRON, C. Isolation of endopolygalacturonase
hyperproducing mutants of Aspergillus sp CH-Y-1043. Biotechnology Letters, v.12,
p.751-756, 1990.
SOUZA, H.Q.; OLIVEIRA, L.A.; ANDRADE, J.S. Seleção de basidiomycetes da
Amazônia para produção de enzimas de interesse biotecnológico. Ciência e
Tecnologia de Alimentos, v.28, p.116-124, 2008.
UENOJO, M.; PASTORE, G.M. Pectinases: aplicações industriais e perpectivas.
Química Nova [online], v.30, No.2, p.388-394, 2007.
VIDAL, S.; SALMON, J.M.; WILLIAMS, P.; PELLERIN, P. Penicillium daleae, a soil
fungus able to degrade rhamnogalacturan II, a complex pectic polysaccharide.
Enzyme and Microbial Technology, v.24, p.283-290, 1999.
VIEILLE, C.; ZEIKUS, J.G. Hyperthermophilic enzymes: sources, uses and molecular
mechanisms for thermostability. Microbiology and Molecular Biology Reviews,
v.65, p.1-43, 2001.
VIEILLE, C.; ZEIKUS, J.G. Thermozymes: identifying molecular determinants of
protein structural and functional stability. TIBTECH, v.14, p.183-190, 1996.
VIESTURS, U.F.; ASPITE, A.F.; LAUKEVIES, J.J.; OSE, V.P.; BEKERS, M.J. Solid-
state fermentation of wheat straw with Chaeromium cellulolyticum and Trichoderma
lignorum. Biotechnology and Bioengineering Symposium, v.11, p.359-369, 1981.
94
XAVIER-SANTOS, S.; CARVALHO, C.C.; BONFÁ, M.; SILVA, R.; CAPELARI, M.;
GOMES, E. Screening for pectinolytic activity of wood-rotting basidiomycetes and
characterization of the enzymes. Folia Microbiology, v.49, p.46-52, 2004.
YANO, J.K.; POULOS, T. New understandings of thermostable and peizostable
enzymes. Current Opinion in Biotechnology, v.14, p.360-365, 2003.
WILLATS, W.G.T.; KNOX, J.P.; MIKKELSEN, J.D. Pectin: new insights into an old
polymer are starting to gel. Trends in Food Science & Technology, v.17, p.97-104,
2006.
Livros Grátis
( http://www.livrosgratis.com.br )
Milhares de Livros para Download:
Baixar livros de Administração
Baixar livros de Agronomia
Baixar livros de Arquitetura
Baixar livros de Artes
Baixar livros de Astronomia
Baixar livros de Biologia Geral
Baixar livros de Ciência da Computação
Baixar livros de Ciência da Informação
Baixar livros de Ciência Política
Baixar livros de Ciências da Saúde
Baixar livros de Comunicação
Baixar livros do Conselho Nacional de Educação - CNE
Baixar livros de Defesa civil
Baixar livros de Direito
Baixar livros de Direitos humanos
Baixar livros de Economia
Baixar livros de Economia Doméstica
Baixar livros de Educação
Baixar livros de Educação - Trânsito
Baixar livros de Educação Física
Baixar livros de Engenharia Aeroespacial
Baixar livros de Farmácia
Baixar livros de Filosofia
Baixar livros de Física
Baixar livros de Geociências
Baixar livros de Geografia
Baixar livros de História
Baixar livros de Línguas
Baixar livros de Literatura
Baixar livros de Literatura de Cordel
Baixar livros de Literatura Infantil
Baixar livros de Matemática
Baixar livros de Medicina
Baixar livros de Medicina Veterinária
Baixar livros de Meio Ambiente
Baixar livros de Meteorologia
Baixar Monografias e TCC
Baixar livros Multidisciplinar
Baixar livros de Música
Baixar livros de Psicologia
Baixar livros de Química
Baixar livros de Saúde Coletiva
Baixar livros de Serviço Social
Baixar livros de Sociologia
Baixar livros de Teologia
Baixar livros de Trabalho
Baixar livros de Turismo
