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RENATA LOPES ARAUJO
AVALIAÇÃO DO USO DE L-TIROXINA
PARA O CONTROLE DO SOBREPESO
DURANTE A RESTRIÇÃO ALIMENTAR EM
RATOS
TESE SUBMETIDA AO INSTITUTO DE BIOFÍSICA CARLOS CHAGAS FILHO
DA UNIVERSIDADE FERDERAL DO RIO DE JANEIRO PARA OBTENÇÃO
DO GRAU DE MESTRE EM CIÊNCIAS BIOLÓGICAS (FISIOLOGIA)
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
Universidade Federal do Rio de Janeiro
2005
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ii
Este trabalho foi realizado no Laboratório de Fisiologia Endócrina do
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho da Universidade Federal do Rio de
Janeiro sob a orientação da professora Denise Pires de Carvalho, com apoio
financeiro concedido pela Fundação Carlos Chagas Filho de Amparo à Pesquisa
do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ), Coordenação de Aperfeiçoamento de
Pessoal de Nível Superior (CAPES), Programa de Apoio a Núcleos de
Excelência (PRONEX-MCT).
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iii
FICHA CATALOGRÁFICA
Araujo, Renata Lopes
Avaliação do uso de L-tiroxina para o controle do sobrepeso durante a
restrição alimentar em ratos.
Rio de Janeiro, UFRJ, 2005.
xi: 65
Orientadora: Denise Pires de Carvalho
Tese de Mestrado para obtenção do Grau de Mestre em Ciências Biológicas
(Fisiologia)
Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho
1- Restrição alimentar
2- Hormônios tireoideanos
3- Leptina
4- Desiodase tipo 1
iv
Dedico este trabalho aos grandes
contribuidores da minha história de
vida: “Serjão e Silvinha” (meus pais).
v
AGRADECIMENTOS
À minha orientadora, Denise Pires de Carvalho, que procurou despertar
meus “poderes interiores”, não entregando de maneira fácil, as respostas que
procurava. Soube me estimular com sua maravilhosa capacidade de ensinar.
Obrigada pelas palavras sábias e amigas.
À professora Doris Rosenthal, por ser o maior exemplo de amor e
dedicação à ciência, inspirando-me a prosseguir na vida científica.
Às professoras Tânia Ortiga e Vânia Costa, que me apresentaram à
fisiologia endócrina durante a graduação e me estimularam a entrar no
laboratório.
À professora Tamar Frankenfeld, que me incentivou a lecionar
presenteando-me com suas turmas de graduação.
À professora Patrícia Rocco, que colaborou com esta tese, revisando-a
com muita competência.
Às amigas Natália Lourival e Raquel Campos, que se empenharam com
muita competência para a concretização deste trabalho.
Às grandes companheiras de trabalho Michelle Marassi e Renata
Grozovsky, que me ajudaram demais na fase final. Foram muitas
“madrugadas” de radioimunoensaios, desiodases e extrações de RNA.
Aos demais amigos de laboratório que de maneira individual
contribuíram para a realização deste estudo: Alba Cenélia, Andrea Freitas,
Camilla Brito, Débora Galvão, Elaine Cristina, Flávia Nóbrega, Glória
Ginabreda, Lívia de Lima, Luciene Cardoso, Márcia Figueiredo, Nathércia
vi
Percegoni, Rodrigo Fortunato, Sabrina Coelho, Thiago Pantaleão, Valmara
Pereira.
Aos meus amigos e técnicos do laboratório, Advaldo Nunes, Norma de
Araújo e Wagner Nunes, por todo o apoio técnico de excelente qualidade e
pelo constante carinho em nosso convívio. Waguity, seus toques artísticos são
sempre especiais, muito obrigada.
Aos meus queridíssimos pais e irmãos que me acompanharam nesta
etapa de vida, sempre com muito amor. Mãe, obrigada pela constante
preocupação com a minha alimentação! Fê, sua ajuda foi espetacular. Valeu
maninha!
Aos meus familiares, familiares de coração (do meu namorado) e
amigos que souberam compreender minha ausência em muitos momentos dos
finais de semana e até dos eventos sociais.
Ao amor da minha vida não teria palavras para agradecer todo o
companheirismo. Quantas foram às vezes que fomos alimentar os ratinhos nos
finais de semana? E todas as economias feitas para me acompanhar nos
congressos? Sem falar de quanto teve que me ouvir falar por horas e horas da
tese! Obrigada por estar sempre ao meu lado e apoiar o meu trabalho. Lipe, te
amo.
E, principalmente, a DEUS, que me permitiu realizar com satisfação este
trabalho.
vii
LISTA DE ABREVIATURAS
ACTH – adrenocorticotropic hormone (hormônio adrenocorticotrófico)
AgRP – agouti-related peptide (peptídeo relacionado à proteína agouti)
AMPc – adenosina monofosfato cíclico
ATP – adenosina trifosfato
BAT – brown adipose tissue (tecido adiposo marrom)
CAR – constitutive androstane receptor (receptor constitutivo de androstano)
CRH – corticotropin-releasing hormone (hormônio liberador de corticotrofina)
D1 – desiodase tipo 1
D2 – desiodase tipo 2
D3 – desiodase tipo 3
GH – growth hormone (hormônio do crescimento)
IMC – índice de massa corporal
Ob-R – ob receptor (receptor de leptina)
Ob-Rb - ob receptor isoform b (isoforma longa do receptor de leptina)
MCH – melanin-concentrating hormone (hormônio concentrador de melanina)
MCR – melanocortin receptor (receptor de melanocortina)
α-MSH – α- melanocyte-stimulating hormone (hormônio estimulador de α-
melanócitos ou melanocortina)
NPY – neuropeptídeo Y
POMC - proopimelanocortina
RNAm – ribonucleic acid mesanger (ácido ribonucléico mensageiro)
rT3 – 3, 3,’ 5’triiodotironina
STAT – signal transducers and activators of transcription (sinal ativador de
transcrição e tradução)
SNC – sistema nervoso central
SULTs - sulfotransferases
TMB – taxa metabólica basal
TRH – thyrotropin releasing hormone (hormônio liberador de tireotrofina)
viii
TSH – thyroid stimulating hormone (hormônio estimulador da tireóide ou
tireotrofina)
TSH-R – receptor de TSH
T
3
– 3, 5, 3’ triiodotironina
T
4
– 3, 5, 3’, 5 tetraiodotironina ou tiroxina
TR – thyroid hormone receptor (receptor de hormônio tireoideano)
UGTs – uridinas difosfato-glicuronosiltransferases
ix
RESUMO
A obesidade é considerada uma epidemia mundial. O risco aumentado
de morbidade e mortalidade associado à obesidade tem sido alvo de muitos
estudos. A restrição alimentar determina perda de peso corporal e reverte o
quadro de obesidade. Todavia, durante o processo de emagrecimento,
mecanismos homeostáticos operam para resistir à perda de peso. A redução na
taxa metabólica basal, determinada, em parte, pela redução dos hormônios
tireoideanos, contribui para essa resistência. O objetivo desse estudo foi avaliar
o uso de L-tiroxina (T4, 1,0 e 5,0 µg/100 g p.c.) para o controle do sobrepeso
durante a restrição alimentar (60% da ad libitum) em ratos. Para tal avaliou-se
peso corporal, gordura retroperitoneal, concentração sérica de T3, T4 e leptina e
atividade enzimática da desiodade tipo 1 (D1). Ratos Wistar que desenvolvem,
espontaneamente, obesidade com a idade foram separados em dois grupos, por
idade, sendo classificados como controle (3 meses) e sobrepeso (6 meses). A
restrição alimentar foi eficaz em conduzir à perda de peso e de gordura
corporais, porém o T4 não foi capaz de potencializar o efeito da restrição
durante a perda de peso corporal. Apenas a dose de 5,0 µg de T4 determinou
significativa redução de gordura retroperitoneal. Durante a restrição, houve
significativa redução da atividade da D1 e o T4 exógeno reverteu a atividade
desta enzima. Esses resultados sugerem que a resistência à perda de peso,
mesmo após a administração de T4, pode ser determinada pela mudança na
metabolização periférica dos hormônios tireoideanos.
x
ABSTRACT
Obesity is considered a world-wide epidemia. The increased risk of
morbidity and mortality associated with obesity has been described by several
studies. Food restriction determines loss of weight and overcomes the obesity
disorders. However, during caloric restriction weight loss resistance occurs
probably due to homeostatic mechanisms that operate to resist further loss of
weight. The reduction in basal metabolic rate, in part determined by a decrease
in thyroid hormones levels, contributes to this resistance. Wistar rats, which
progressively develop obesity with ageing, were used and separated into two
groups: control (3 months) and overweight (6 months). The aim of this study
was analyze the effects of T4 administration (1.0 and 5.0 µg/100 g b.w.) in
overweight rats submitted to food restriction (60% of food intake). So, we
evaluated body weight, retroperitoneal fat, serum levels of T3, T4 and leptin
and the activity of hepatic type 1 deiodinase (D1). Food restriction leads to
significantly reduced body weight and retroperitoneal fat, however T4
administration did not potentiate the effects of food restriction. Only 5.0 µg of
T4 determined significant reduction in retroperitoneal fat. During food
restriction, there was a significant reduction in hepatic D1 activity and T4
normalized the activity of this enzyme. Our results suggest that serum T4
normalization during food restriction is not sufficient to promote further weight
loss, probably due to changes in the peripheral metabolism of thyroid
hormones.
xi
SUMÁRIO
Lista de abreviaturas vii
Resumo ix
Abstract x
Sumário xi
INTRODUÇÃO 1
I. Obesidade: epidemiologia, diagnóstico, métodos e fundamentos 1
Índice de massa corporal 2
II. Balanço energético 4
Termogênese obrigatória 6
Termogênese facultativa 6
III. Fatores envolvidos na gênese da obesidade 7
Fatores ambientais 7
Fatores genéticos 8
IV. Repercussões endócrinas da obesidade 9
IV.1 Hormônios tireoideanos 10
Desiodase tipo 1 13
Desiodase tipo 2 16
Desiodase tipo 3 17
IV.2 Leptina 18
Os genes ob e db 19
Regulação da síntese 21
O papel da leptina na homeostase energética 22
OBJETIVOS 27
METODOLOGIA 28
I. Tratamento dos animais 28
I.1 Restrição alimentar 28
I.2 Controle do peso corporal 29
I.3 Administração de T4 29
I.4 Coleta de sangue 30
II. Sacrifício dos animais 31
III. Análises 32
III.1 Radioimunoensaios 32
T3 e T4 32
Leptina 32
III.2 Atividade da enzima iodotironina desiodase tipo 1 (D1) 33
Processamento dos tecidos 33
xii
Purificação do rT3 –
125
I 33
Ensaio da atividade de D1 34
IV. Análise estatística 35
RESULTADOS 36
I. Peso corporal e de gordura retroperitoneal 36
II. Concentrações séricas hormonais 42
III. Atividade da enzima D1 no fígado 48
DISCUSSÃO 50
REFERÊNCIAS 60
1
INTRODUÇÃO
A obesidade é provavelmente uma das enfermidades metabólicas mais
antigas que se conhece. Pinturas e estátuas em pedra com mais de 20 mil anos já
representavam figuras de mulheres obesas. As mesmas evidências foram vistas
em múmias egípcias, pinturas e porcelanas chinesas da era pré-cristianismo, em
esculturas gregas e romanas e, mais recentemente, em vasos dos maias, astecas
e incas na América pré-colombiana (Repetto, 1998).
Ainda no século XXI, os mecanismos moleculares envolvidos na gênese
do excesso de peso são obscuros e desencadeiam grande interesse na busca de
soluções para um problema de abrangência mundial.
I - OBESIDADE: EPIDEMIOLOGIA, DIAGÓSTICO, MÉTODOS
E FUNDAMENTOS
A prevalência da obesidade aumentou consideravelmente nos últimos
anos nos países industrializados. Dados da National Health and Nutrition
Examination Survey indicam que, aproximadamente, 20% das crianças
americanas e 1/3 (58 milhões) dos americanos adultos são obesos. Na
Inglaterra, a proporção de obesos duplicou entre 1980 e 1990. No Brasil, o
percentual de indivíduos obesos aumentou de 4,7% para 6,9% em homens e de
12% para 12,5% em mulheres (Villares, 1998).
A obesidade inexoravelmente aumenta o risco de mortalidade, pois se
associa à alta prevalência de doenças cardiovasculares (coronariopatias,
hipertensão arterial, trombose venosa), alterações metabólicas (diabetes,
dislipidemias), afecções pulmonares, renais, biliares e, a certos tipos de
neoplasias. Essas evidências tornam a obesidade um enorme problema de
Saúde Pública, cujos custos apresentam progressão assustadora (Villares, 1998).
No Brasil, as poucas análises existentes não nos permitem realizar um
cálculo de custos fidedignos. No entanto, podemos afirmar que o custo é alto e
tende a aumentar, à semelhança do resto do mundo (Monteiro CA, 1998).
2
Define-se obesidade como excesso de gordura corporal relacionado à
massa magra. A obesidade coincide com o aumento do peso, embora esta
condição possa eventualmente não estar presente. De modo inverso, nem todo
aumento de peso está relacionado à obesidade (Monteiro CA, 1998).
Em 1983, o National Center for Health Statistical (NCHS) distinguiu excesso
de peso de obesidade, esclarecendo que o primeiro refere-se a um excesso de
peso para a altura, enquanto obesidade é um excesso de massa gordurosa
relacionada à massa magra. Excesso de peso, assim, não significa excesso de
gordura, ainda que muitas vezes se tenha utilizado esse termo neste sentido
(Monteiro JC, 1998).
Diagnosticar e avaliar a obesidade significa conhecer a composição
corporal. Os métodos mais utilizados são as aferições do peso corporal e,
especialmente, o Índice de Massa Corporal (IMC). Também é importante
caracterizar a distribuição da gordura, já que em igual grau de obesidade o risco
metabólico é maior se a gordura localiza-se na região central e/ou superior do
corpo. Para avaliar a distribuição da gordura, são úteis as medidas: relação
cintura/quadril e perímetro do quadril (Monteiro JC, 1998), além de técnicas
mais recentes como a tomografia computadorizada de abdômen.
Índice de Massa Corporal (IMC):
Caracteriza-se pelo uso prático, simples, reprodutível, com valor
diagnóstico e prognóstico. Atualmente, é um dos meios diagnósticos mais
utilizados, todavia, o IMC pode se encontrar elevado na ausência de obesidade,
em atletas com importante desenvolvimento muscular, ou em pacientes com
edema, etc.
É calculado dividindo-se o peso, expresso em quilogramas, pela altura,
expressa em metros, elevada ao quadrado:
IMC = Peso (Kg)
Altura
2
(m)
3
Costuma-se classificar a obesidade em classes, determinadas pelo valor
do IMC. Segundo a Organização Mundial de Saúde (OMS), o sobrepeso e a
obesidade são classificados conforme os valores demonstrados na tabela 1.
Classificação IMC (kg/m
2
)
Baixo peso < 18,5
Peso normal 18,5 – 24,9
Excesso de peso ≥ 25,0
- sobrepeso 25,0 – 29,9
- obeso classe I 30,0 – 34,9
- obeso classe II 35,0 – 39,9
- obeso classe III ≥ 40,0
Tabela 1 – Classificação do IMC pela OMS/98 (Adaptado de Monteiro JC, 1998).
O IMC tem sido utilizado para avaliar o risco de morbi-mortalidade
derivado da obesidade. Esse risco pode ser ainda maior se o excesso de peso
coexiste com algumas das seguintes situações ou fatores de risco:
Relação cintura/quadril ou perímetro da cintura elevados;
Diabetes mellitus ou resistência à insulina;
Hipertensão arterial;
Hiperlipidemia ou dislipidemia;
Hipertrofia ventricular esquerda;
Apnéia do sono ou elevação do PCO
2
;
Hisurtismo ou elevada relação entre o hormônio luteinizante e folículo
estimulante;
Tabagismo.
A obesidade em humanos e roedores é usualmente associada com a
distribuição de gordura corporal. O predomínio de tecido adiposo na região
abdominal é um fator de risco à saúde que se correlaciona diretamente com o
surgimento de anormalidades metabólicas (Monteiro JC, 1998).
4
Em humanos, utilizam-se os valores numéricos das medidas da relação
cintura/quadril (valores superiores a 1,0 para os homens e 0,85 para as
mulheres) ou apenas o perímetro da cintura (valores superiores a 102 cm para
os homens e 88 cm para as mulheres) como indicadores de risco. O aumento da
reserva lipídica estocado sob a forma de triglicerídeos na região intra-
abdominal (retroperitoneal) é comumente associado a um conjunto de doenças
metabólicas, como diabetes tipo 2, hipertensão arterial, dislipidemias e doenças
cardiovasculares. Esta síndrome tem sido denominada “síndrome X”,
“síndrome metabólica” ou “síndrome de resistência à insulina” (Reaven, 1994).
Os componentes dessa síndrome são caracterizados por hiperinsulinemia e
diferentes intensidades teciduais de resistência à insulina, que explicam a
relação entre várias anormalidades e a obesidade (Reaven, 1994).
Similarmente ao observado em humanos, constatou-se que nos ratos da
linhagem Wistar, o acúmulo excessivo de tecido adiposo também está associado
à presença de alterações metabólicas como à resistência à insulina e à leptina
(Carvalheira e cols., 2001).
Nos ratos machos, a gordura corporal pode ser estocada em quatro regiões
(epididimal, mesentérico, subcutâneo e retroperitoneal) que apresentam
composição e celularidade diferentes. O aumento da reserva adiposa é
modulado por essa diferença regional. Recentemente, foi demonstrado que a
prole lactente de ratas tratadas com leptina, durante os três últimos dias de
lactação, apresenta o dobro de tecido retroperitoneal comparado aos outros
tecidos adiposos (Lins e cols., 2005).
II- BALANÇO ENERGÉTICO
A sobrevivência dos inúmeros organismos é dependente da capacidade
de procurar, usar e conservar energia eficientemente. Humanos e outros
mamíferos possuem complexos mecanismos desenvolvidos para manter
constante o suporte energético necessário ao funcionamento celular.
5
A cada refeição, consumimos calorias (energia) a mais do que seriam
requeridas para o uso imediato de nossas necessidades metabólicas. O excesso
ingerido é estocado, principalmente como gordura, para uso posterior, em
situações de restrição ou privação de alimentos. A capacidade quase que
ilimitada dos estoques de gordura e as eficientes respostas neuroendócrinas e
metabólicas nos resguardam da depleção total dos estoques energéticos durante
o jejum. Desse modo, é concebível que a atual epidemia da obesidade seja o
resultado conjunto de uma ingestão alimentar exagerada associada à alta
eficiência energética (Ahima, 2000).
Os mecanismos fisiopatológicos que levam ao aumento de peso e
estoque excessivo de massa gordurosa são parcialmente identificados. Sabe-se
que a obesidade resulta do desequilíbrio crônico entre a ingestão alimentar e o
gasto energético, conduzindo a um balanço energético positivo.
A balança energética é mantida segundo os princípios da termodinâmica.
A reserva energética proveniente da ingestão alimentar (aporte energético) deve
ser igual ao gasto energético.
BALANÇO EQUILIBRADO → APORTE ENERGÉTICO = GASTO ENERGÉTICO
A energia dispendida diariamente relaciona-se com as termogêneses
obrigatória (taxa metabólica basal) e facultativa (efeito térmico do alimento,
exposição ao frio, atividade física) (Ravussin & Walder, 1998).
Em todos os animais, pode haver liberação de calor quando há
transformação da energia em seus vários estados. A energia química, por
exemplo, contida nos substratos energéticos (alimentos) é liberada lentamente
durante a oxidação de açúcares e gorduras, sendo armazenada
temporariamente na forma de ATP. A partir de então, através de hidrólise do
ATP ocorre um novo processo de transformação energética resultando em
trabalho biológico (transporte de íons, síntese de proteínas, contração muscular,
etc), neste caso uma parte de energia é liberada na forma de calor. Essa aparente
ineficiência termodinâmica, no entanto, desempenha importante papel no
6
controle da temperatura corporal dos organismos (homeotermia), otimizando o
funcionamento das células, dos tecidos e sistemas (Bianco, 2000).
Termogênese obrigatória (Taxa Metabólica Basal -TMB):
A taxa metabólica basal (TMB) é definida como o somatório de todo o
calor produzido no organismo em repouso, sendo, portanto, a energia gasta por
um indivíduo em repouso no leito, pela manhã, em estado de jejum sob
condições ambientais confortáveis. A TMB corresponde à manutenção dos
sistemas integrados e da temperatura homeotérmica em repouso, contribuindo
com aproximadamente 60% do gasto energético diário em um indivíduo de 70
Kg (Ravussin & Walder, 1998).
Termogênese facultativa:
Define-se termogênese facultativa como todo o calor produzido além da
TMB, como resultado do aumento do turnover de ATP.
Pode ser dividida em termogênese derivada de tremor e não derivada de
tremor. A termogênese facultativa tem intensidade variável, pois é dependente
da magnitude do estímulo desencadeador. Pode ser induzida por processos
involuntários, tais como: o tremor muscular (tiritação) associado à exposição ao
frio e à digestão após uma dieta hipercalórica ou ainda ser derivada de
processos voluntários, tais como: a contração muscular durante atividades
diárias mínimas ou à prática de esportes (Bianco, 2000).
O efeito térmico do alimento como forma de termogênese contribui para
aproximadamente 5%-15% dos gastos energéticos diários. Muitos fatores
influenciam o efeito térmico do alimento: o tamanho da refeição e sua
composição, a palatabilidade do alimento, a hora da refeição, bem como a
constituição genética do indivíduo, idade, forma física e sensibilidade à
insulina. Estas influências, e ainda os aspectos técnicos, como a posição do
indivíduo e a duração da refeição, tornaram o efeito térmico do alimento o
componente mais difícil de ser medido e o menos reprodutível (Ravussin &
Walder, 1998).
7
A atividade física é o componente mais variável do gasto diário de
energia, contribuindo de forma importante para a redução de peso corporal em
pessoas muito ativas. No entanto, adultos sedentários exibem uma faixa de
atividade física que representa somente 20%-30% do gasto energético total. A
atividade física reduzida como causa da obesidade é hipótese óbvia e atraente.
A energia gasta durante uma atividade física é bem variável e o aumento
secular da obesidade é paralelo ao estilo de vida sedentário (Ravussin &
Walder, 1998).
III- FATORES ENVOLVIDOS NA GÊNESE DA OBESIDADE
Embora os excessos alimentares e o sedentarismo (fatores ambientais)
estejam envolvidos no aumento global da prevalência da obesidade, há muitas
evidências de que a genética contribua substancialmente para a regulação do
peso corporal. Acredita-se que a dieta ocidental e o estilo de vida sedentário
favoreçam o desenvolvimento da obesidade nos indivíduos geneticamente
predispostos (Isomaa e cols., 2001). A obesidade não é uma doença singular, e
sim um grupo heterogêneo de condições com múltiplas causas que, em última
análise, refletem no fenótipo obeso (Jebb, 1999).
A rede de vias neuroquímicas hipotalâmicas que controla a ingestão
alimentar e o gasto energético está por trás da base genética da obesidade (Jebb,
1999), que ainda não esta bem esclarecida.
Fatores ambientais:
O início da manutenção de um balanço energético positivo relativo às
necessidades do organismo pode ser conseqüência tanto do aumento na
ingestão calórica, como da redução no gasto calórico total, ou dos dois fatores
combinados (Pereira e cols., 1999).
O processo de modernização e a transição econômica que se tem
observado na maioria dos países têm promovido alterações na industrialização
da produção alimentícia e contribuindo para o consumo de dietas ricas em
lipídeos e conseqüentemente, hipercalóricas (Pereira e cols., 1999).
8
Em animais, a alimentação hiperlipídica é um componente importante na
etiologia da obesidade, já que as dietas ricas em lipídeos comprovadamente
levaram ao excesso de gordura corporal em macacos, cães, suínos, esquilos,
hamsters e ratos (Willet, 1998).
Além das mudanças na composição da dieta, atualmente, há maior
disponibilidade de alimentos prontos para o consumo, enquanto a demanda
energética da vida moderna tem diminuído drasticamente através do uso de
transportes motorizados e equipamentos mecanizados (Pereira e cols., 1999).
Desse modo, o sedentarismo e os hábitos nutricionais parecem
representar o principal fator de risco no desenvolvimento da obesidade
mundial (Pereira e cols., 1999).
Fatores genéticos:
As formas monogênicas de obesidade humana são exceção. Os artigos de
atualização anual do mapa genético da obesidade de Pérusse e cols., 1996 e
Chagnon, Pérusse e Bouchard, 1998, descreveram que este fenótipo faz parte de
24 doenças com transmissão mendeliana. Nove entre essas são autossômicas
dominantes, 10 autossômicas recessivas e 5 ligadas ao cromossomo X. Essas
doenças são geralmente graves, iniciando-se na infância, associadas a má
formações, doenças endócrinas e neuropsiquiátricas (Villares, 1998).
As crianças de pais obesos apresentam risco de se tornarem obesas
quando comparadas às crianças cujos pais apresentam peso normal. Se os dois
pais são obesos, a criança tem 80% de risco de se tornar obesa. Se o pai ou a mãe
é obeso o risco é de 40%. Em uma família em que os pais não são obesos o risco
é de 10% (Villares, 1998).
A base genética da obesidade é complexa. Na maior parte dos casos, a
obesidade humana não segue a herança mendeliana. Provavelmente, ocorre a
interação de vários genes de susceptibilidade (herança poligênica); cada gene,
individualmente, apresenta pouco efeito na variância do peso corporal, mas a
contribuição cumulativa de vários genes de susceptibilidade torna-se
significativa quando ocorre a interação com os fatores ambientais, em particular
9
em relação à ingestão alimentar e ao exercício físico, destarte predispondo à
expressão do fenótipo obesidade (Villares, 1998).
O estudo da obesidade em humanos, provavelmente, responderia muitas
dúvidas correntes neste tópico. No entanto, as pesquisas com humanos têm
óbvias limitações éticas e financeiras. Além disto, animais de laboratório podem
ser mantidos em condições rigidamente controladas consumindo dieta
manipulada e mantidos livres de patógenos e germes. O fato de animais de
laboratório também se tornarem obesos espontaneamente, se alimentando de
ração comercial abriu novas áreas para pesquisa na área da obesidade (Pereira e
cols., 1999).
Estudos sobre as causas e tratamentos da obesidade têm sido
desenvolvidos em animais que apresentam esta característica através de lesão
neural, alterações endócrinas, alimentares e genéticas (Pereira e cols., 1999).
A pesquisa genética, na obesidade, está apenas começando; mais de 21
genes ou regiões candidatas são suspeitos de contribuir com o fenótipo. Nos
roedores existem numerosos modelos de obesidade mono e poligênica.
Alguns genes (agouti, ob, db, fat, tubby) que desenvolvem a obesidade
monogênica foram clonados em camundongos e em modelos poligênicos,
recentemente, foram identificadas várias regiões genéticas que possibilitaram
gerar camundongos caracterizados por um grande painel de fenótipos ligados à
obesidade (Villares, 1998). Essas formas de obesidade multifatorial demonstram
o impacto do meio ambiente alimentar e suas interações com o genótipo. Deste
modo, elas ilustram modelos interessantes para as obesidades humanas
(Villares, 1998).
IV- REPERCUSSÕES ENDÓCRINAS DA OBESIDADE
O sobrepeso (IMC ≥ 25 Kg/m
2
) e a obesidade (IMC > 30 Kg/m
2
)
caracterizam-se pela presença de várias anormalidades no sistema endócrino.
Essas modificações podem ser importantes para a patogênese do excesso
ponderal ou ser apenas secundárias à crescente elevação do conteúdo e
10
distribuição da massa adiposa. Portanto, no último caso, as alterações
endócrinas secundárias seriam, potencialmente, reversíveis após a redução de
peso (Medeiros, 1998). No entanto, a redução de peso em indivíduos obesos não
é tão fácil.
Um significativo e desencorajante fator para os que tentam perder peso é
a existência de mecanismos homeostáticos que operam na resistência à perda de
peso corporal (Spiegelman & Flier, 2001). A maior barreira homeostática é a
redução da TMB durante períodos de reduzida ingestão calórica. Os hormônios
tireoideanos T3 (triiodotironina) e T4 (tiroxina) são os principais reguladores da
taxa metabólica basal. As concentrações séricas desses hormônios apresentam
correlação direta com o gasto energético, diminuindo significativamente
durante o jejum (LiVolsi, 1989). Todavia, os mecanismos que regulam a função
tireoideana e os níveis séricos de hormônios tireoideanos durante a perda de
peso ainda não são bem compreendidos.
IV.1- HORMÔNIOS TIREOIDEANOS:
Os hormônios T3 e T4 desempenham papel crítico na diferenciação, no
crescimento e no metabolismo celulares. Seus principais efeitos estão
vinculados à regulação do consumo de oxigênio e da taxa metabólica, por isso
são fundamentais para o funcionamento normal de quase todos os tecidos (Yen,
2001). De acordo com Bianco (2000), os hormônios tireoideanos são os
mediadores da homeotermia, pois um dos seus principais efeitos biológicos é a
aceleração do metabolismo energético e do turnover de ATP com resultante
consumo de energia e produção de calor. Mamíferos com hipotireoidismo,
incluindo o ser humano, podem apresentar hipotermia e intolerância ao frio,
perdendo parte da capacidade de adaptação ao meio ambiente (Bianco, 2000).
A redução da ingestão calórica (dietas hipocalóricas e/ou jejum) leva ao
decréscimo de T3 e T4 séricos com simultânea elevação do T3 reverso (rT3), um
derivado metabólico inativo. Esse fenômeno também é observado em pacientes
com obesidade mórbida após terem sido submetidos a gastroplastia redutora
11
(Medeiros, 1998). Admite-se que não só a diminuta entrada de nutrientes, como
também a seletiva queda na ingestão de carboidratos sejam determinantes para
a diminuição das concentrações de T3 e T4 circulantes (Medeiros, 1998).
A síntese dos hormônios tireoideanos é realizada pela glândula tireóide
que se localiza abaixo da cartilagem cricóide e é composta por dois lobos unidos
por um istmo, estando aderida às regiões anterior e lateral da laringe e da
traquéia (Larsen e cols., 1998). O iodo é essencial para a biossíntese hormonal,
sendo necessário que esteja disponível em concentrações adequadas para que
quantidades normais de hormônios sejam sintetizadas pelas unidades morfo-
funcionais, os folículos (Larsen e cols., 1998).
A tireóide, assim como outras glândulas do sistema endócrino, está sob a
regulação do eixo hipotálamo-adenohipófise. A função de todo este complexo é
regulada por um modelo básico de retroalimentação negativa envolvendo o
hormônio liberador de tireotrofina (TRH) produzido pelo hipotálamo, o
hormônio tireotrófico (TSH) produzido pela hipófise e os hormônios
tireoideanos (T3 e T4) (Larsen e cols., 1998).
O principal regulador da função tireoideana é o TSH. Células da
adenohipófise denominadas tireotrofos são as responsáveis pela síntese e
secreção de TSH. O TSH é uma glicoproteína e possui duas cadeias peptídicas,
alfa e beta. Para que o TSH possa influenciar a função tireoideana, é necessário
que as células foliculares expressem o receptor para este hormônio. O receptor
do TSH pertence à superfamília dos receptores acoplados à proteína G: Gs e Gq
(Raspe & Dumont, 1992). Assim, quando o TSH liga-se ao seu receptor na
membrana das células foliculares, ocorre ativação da adenilato ciclase e, quando
em altas concentrações, também há ativação da fosfolipase C (Dumont &
Vassart, 2001). Como conseqüência, ocorre uma série de modificações no
metabolismo da célula folicular, que leva ao estímulo da produção hormonal e
também ao crescimento da glândula (Larsen e cols., 1998)
Existem três hormônios de grande importância no controle da síntese e
secreção do TSH: o T3, que têm ação inibitória, o TRH, que apresenta efeito
estimulatório, e a somatostatina, que tem ação inibitória.
12
O TRH é sintetizado como um precursor, o pré-pró-TRH. Após o
processamento, há formação do tripeptídeo modificado, o TRH. Quando o TRH
liga-se ao seu receptor nos tireotrofos adenohipofisários ocorre estímulo da
síntese de ambas subunidades do TSH, assim como do seu processamento pós-
traducional (Larsen e cols., 1998). O jejum e as dietas hipocalóricas determinam
seletiva diminuição na produção de TRH no núcleo paraventricular que, por
sua vez, resulta na diminuição da síntese de TSH. Acredita-se que a aguda
redução de leptina, durante situações de privação energética, seja a responsável
pela diminuição da síntese de TRH no núcleo paraventricular (Krotkiewski,
2002).
Apesar do TRH agir em balanço com reguladores hipotalâmicos
inibitórios, como a somatostatina e a dopamina, os hormônios tireoideanos
exercem o controle mais importante do feedback negativo, isto é, são capazes de
inibir a secreção de TSH, agindo diretamente nos tireotrofos (Scanlon, 2001).
O principal produto secretado pela tireóide é o T4, no entanto, o T3 é o
principal hormônio metabolicamente ativo. Sendo assim, o T4 sofre alterações
metabólicas nos tecidos periféricos, gerando T3 na periferia. As enzimas
responsáveis por essas alterações são denominadas iodotironinas desiodases,
pois catalisam reações de retirada de um iodo por vez das iodotironinas. A
família dessas selenoproteínas compreende três subtipos que são as desiodases
tipos 1, 2 e 3 (D1, D2 e D3) (Bianco e cols., 2002).
A conversão do T4 a T3 é catalisada pelas enzimas D1 e D2 através da
desiodação do anel externo (5’-desiodação). As reações de inativação do T3 e do
T4 são catalisadas pelas enzimas D1 e D3 através da desiodação do anel interno
(5-desiodação), como demonstrado no esquema da figura 1 (Bianco e cols.,
2002). Portanto, a D1 é a única selenodesiodase que funciona como iodotironina
desiodase do anel externo e interno, enquanto a D2 apresenta atividade
exclusivamente de desiodação externa e a D3 exclusivamente interna (Bianco e
cols., 2002).
H
13
CH
2
- CH - COOH
NH
2
3’
5’
5
3
O
HO
I
I
I
I
3,5,3`,5` - tetraiodotironina (tiroxina, T4)
CH
2
- CH - COOH
NH
2
5’
O
HO
I
I
I
CH
2
-CH -COOH
NH
2
5
O
HO
I
I
I
CH
2
- CH - COOH
NH
2
5’
5
O
HO
II
3,3`,5` - triiodotironina (T3 reverso)3,5,3` - triiodotironina (T3)
3,3` - diiodotironina
Ativação (D1), D2 Inativação(D1), D3
D1, D2Inativação (D1), D3
Figura 1 – Esquema representativo das reações de ativação e inativação do T4
pelas desiodases
tipos 1 (D1), 2 (D2) e 3 (D3) (Adaptado de Bianco e cols., 2002).
Desiodase tipo 1 (D1)
Foi a primeira isoenzima reconhecida através de ensaios bioquímicos de
conversão de T4 em T3 e também foi a primeira a ser clonada. Desse modo, há
mais conhecimentos bioquímicos sobre a D1 do que sobre as outras enzimas
(Bianco e cols., 2002).
A D1 é expressa em diversos tecidos. Em ratos, está presente no fígado,
rim, SNC, hipófise, tireóide, intestino e placenta. Em humanos, não há atividade
no SNC, mas seu RNAm está presente no fígado, rim, hipófise e tireóide
(Bianco e cols., 2002).
A maior parte do T3 plasmático é proveniente da atividade da D1. A
provável localização, da D1, na membrana plasmática facilita o acesso do T4
circulante à enzima, assim como a entrada, no plasma, do T3 produzido a partir
do T4 (Bianco e cols., 2002).
A síntese da D1 pode ser influenciada por substâncias, agentes ou
condições. Os mais potentes reguladores são os hormônios tireoideanos que
induzem o aumento da sua atividade, estimulando a transcrição gênica.
14
Entretanto, a expressão da D1 também sofre influências nutricionais. Em
situações de privação de energia como ocorrem no jejum e na restrição
alimentar (dietas hipocalóricas) observa-se diminuição do T3 circulante relativo
ao T4 e aumento do rT3. Essas alterações podem ser interpretadas como
decorrentes de modificações na conversão extra-tireoideana de T4 em T3 pela
D1 (Bianco e cols., 2002).
Os mecanismos envolvidos na diminuição da conversão de T4 em T3
durante as situações de privação de energia, podem estar vinculados à menor
produção hepática da D1, pois sua síntese é dependente da ingestão mínima de
carboidratos (aproximadamente 400 Kcal/dia) (Medeiros, 1998). Há ainda a
possibilidade de a D1 catalisar, preferencialmente, a desiodação do anel interno,
diminuindo a formação do hormônio ativo (T3) e aumentando a formação do
inativo (rT3) (Maglich e cols., 2004).
A metabolização periférica dos hormônios tireoideanos envolve
inúmeras outras reações além das desiodações, conforme demonstrado pela
figura 2.
HO
I
I
CO
2
H
NH
2
O
I
O
O
I
I
OH
HO
HO
HO
2
C
CO
2
H
NH
2
O
I
I
HO
I
I
CO
2
H
NH
2
O
I
I
O
I
I
CO
2
H
NH
2
O
I
I
HO
3
S
O
I
I
CO
2
H
NH
2
O
I
HO
3
S
Glicuronase (UGT)
T
4
D1
Sulfotransferase (SULT)
Anel interno
Anel externo
T
4
G
T
4
S
T
3
rT
3
S
Figura 2 – Esquema representativo do metabolismo periférico dos hormônios tireoideanos. T4–
tiroxina e T3– triiodotironina. T4G– tiroxina glicuronada, T4S– tiroxina sulfatada, D1– desiodase
tipo 1, rT3S- triiodotironina reversa sulfatada (Adaptado de Maglich e cols., 2004).
15
O T4 pode ser o substrato das reações enzimáticas de conjugação fase II
que incluem a glicuronação pelas uridinas difosfato-glicuronosiltransferases
(UGTs) e a sulfatação pelas sulfotransferases (SULTs).
As UGTs representam uma família (UGT1A e UGT2B) de isoenzimas de
membrana localizadas no retículo endoplasmático de tecidos hepáticos e extra-
hepáticos. A glicuronação dos hormônios tireoideanos torna-os mais
hidrofílicos e, portanto, excretados mais rapidamente através da excreção biliar.
A glicuronação dos hormônios tireoideanos determina redução dos níveis de T3
e T4 circulantes (Findlay e cols., 2000).
A sulfatação é uma reação de desintoxicação que aumenta a solubilidade
em água de vários compostos (endógenos e exógenos) lipofílicos, facilitando a
excreção biliar e/ou urinária. Entretanto, o principal efeito da sulfatação sobre
os hormônios tireoideanos é facilitar sua degradação pela D1 (Kester e cols.,
1999).
Quando o T4 é sulfatado, a desiodação do anel externo (formação de T3)
pela D1 torna-se indetectável, enquanto a atividade de desiodação interna
(formação de rT3) aumenta mais de 130 vezes (Maglich e cols., 2004).
Pode-se concluir que o efeito da metabolização periférica hepática dos
hormônios tireoideanos é a produção de metabólitos hormonais menos ativos
ou mais rapidamente excretados (Mol &Visser, 1985). Todavia, a contribuição
do metabolismo conjugativo de sulfatação e glicuronação sobre a regulação dos
hormônios tireoideanos ainda é pouco conhecida. Postula-se o envolvimento do
receptor constitutivo de androstano (CAR
, também nomeado NR1I3 ou NR1I4)
(Shiraki e cols., 2003).
O CAR é um receptor órfão nuclear expresso principalmente no fígado,
que desempenha importante papel protetor no organismo em resposta ao uso
de drogas e moléculas tóxicas (Shiraki e cols., 2003). Maglich e cols., em 2004,
afirmaram que este receptor também pode ter efeitos sobre o estresse
metabólico e nutricional. Eles demonstraram que durante a restrição alimentar
o receptor CAR altera o metabolismo dos hormônios tireoideanos. Esse receptor
parece estar envolvido na modulação da expressão dos genes Sult e Ugt das
16
enzimas sulfotransferases e glicuronases, respectivamente (Maglich e cols.,
2004). Camundongos sem o receptor CAR (Car
-/-
) submetidos à restrição
calórica não apresentaram: a) aumento na expressão dos genes Sult e Ugt, b)
reduções significativas nas concentrações séricas de T3 e T4 e c) resistência à
perda de peso, contrariamente ao observado nos animais selvagens. Esses
dados sugerem que a privação de energia determinada pela redução (dieta) ou
ausência (jejum) de ingestão alimentar (calorias/energia) é um sinal
reconhecido pelo organismo como estresse. Assim, o receptor CAR protege o
organismo modulando o metabolismo dos hormônios tireoideanos (Maglich e
cols., 2004).
O CAR aumenta a expressão dos genes Sult e Ugt e, conseqüentemente
das respectivas enzimas sulfotransferase e glicuronase, determinando rápida
eliminação pelas excreções biliar e urinária e inativação pela atividade D1 das
formas ativas dos hormônios tireoideanos. A redução nas concentrações
circulantes de T3 e T4 (metabólitos ativos) leva a menor mobilização de energia
pelo organismo, dificultando a redução de peso corporal em situações desejadas
como o sobrepeso e a obesidade.
Todavia, os dados de Maglich e cols., em 2004, também demonstraram
que reduções de T3 e T4 circulantes são ainda desencadeadas por outros
mecanismos independentes de CAR, já que os camundongos knockout para CAR
apresentaram uma redução, embora não significativa, nas concentrações séricas
desses hormônios.
Desiodase tipo 2 (D2)
A principal contribuição da D2 sobre o metabolismo hormonal extra-
tireoideano é regular os níveis intracelulares do T3 em tecidos criticamente
dependentes deste. No SNC, no tecido adiposo marrom e na adenohipófise, a
atividade dessa enzima está aumentada durante o hipotireoidismo e a
deficiência de iodo. Este aumento da conversão local de T4 para T3 pode ser
visto como um mecanismo adaptativo em resposta à queda dos níveis
circulantes dos hormônios tireoideanos (Bianco e cols., 2002).
17
Desiodase tipo 3 (D3)
A D3, assim como a D1, protege os tecidos dos excessos de hormônios
tireoideanos, removendo o átomo de iodo do anel interno da iodotironina
(Bianco e cols., 2002).
Depois de ser perifericamente gerado pelas iodotironinas desiodases, o
T3 pode exercer seus efeitos que são mediados por diferentes subtipos de
receptores nucleares (TR), os TRα e TRβ. Os TR são expressos, praticamente, em
todos os tecidos periféricos, como por exemplo, no osso, coração, tecido adiposo
e fígado. Além do papel exercido sobre o metabolismo energético, o T3 também
pode regular importantes funções tecido-específicas (Yen, 2001).
Os hormônios tireoideanos mostram-se necessários ao desenvolvimento
e funcionamento dos tecidos adiposos marrom (BAT) e branco. No entanto, os
mecanismos pelos quais são capazes de induzir a diferenciação tecidual ainda
não estão esclarecidos, mas parece envolver a regulação transcripcional de
importantes genes-alvo (Yen, 2001). No tecido adiposo branco, T3 induz a
atividade de enzimas lipogênicas como acetil CoA carboxilase, a enzima málica,
glicose-6-fosfato-desidrogenase, ácido graxo sintase e spot 14. Todavia, a
expressão desses genes pode ser modulada por outros fatores como dieta
hiperglicídica, insulina e AMPc. Adicionalmente, o T3 também regula a lipólise
de maneira coordenada com a lipogênese (Yen, 2001).
A gordura marrom também é alvo dos hormônios tireoideanos. Este
tecido apresenta grande número de receptores de T3 que se encontram 70%
ocupados à temperatura ambiente e quase 100% ocupados durante exposição
do animal ao frio. Na verdade, o BAT dispõe de um mecanismo próprio
gerador de T3, graças à atividade local da enzima D2. A atividade dessa enzima
e a concentração de T3 aumentam durante atividade simpática do tecido
adiposo marrom, que está fortemente relacionado à termogênese facultativa em
roedores (Bianco, 2000).
Humanos têm pouca gordura marrom. O principal sítio de termogênese
facultativa do organismo humano parece ser o músculo esquelético. A
18
termogênese facultativa pode ser desencadeada pela exposição ao frio ou pela
dieta hipercalórica (Bianco, 2000).
Tendo em vista os efeitos fisiológicos dos hormônios da tireóide sobre o
metabolismo energético, observa-se atualmente, o uso indiscriminado de
fármacos contendo esses hormônios com a finalidade de emagrecer. A
administração de doses variáveis de L-T3 ou L-T4 a pacientes obesos em
restrição calórica leva à elevação de T3 sérico e aumento do ritmo metabólico,
mas, conseqüentemente, determina aumento do catabolismo com redução de
peso corporal devido, em parte, à perda de massa muscular (Medeiros, 1998;
Krotkiewski, 2002).
Freqüentemente, encontram-se sérias alterações da função tireoideana
em obesos, interpretadas como decorrentes da administração iatrogênica de T3
em doses abusivas (Medeiros, 1998).
A maioria dos casos de obesidade apresenta etiologia multifatorial, fator
que a torna uma desordem metabólica de complexo entendimento e de difícil
tratamento. O perfeito conhecimento das inúmeras vias intracelulares que
regulam o metabolismo energético e a ingestão alimentar é fundamental para
que novas drogas possam ser desenvolvidas.
IV.2- LEPTINA:
Indícios da existência de um sistema fisiológico responsável pela
regulação homeostática do peso corporal foram acumulados durante quatro
décadas.
A descoberta da Leptina em 1994 pelo grupo do doutor Friedman
representou importante marco para o entendimento molecular do controle da
ingestão alimentar (Ahima e cols., 2000).
Hoje, após a clonagem dos genes da leptina e de seu receptor, busca-se
compreender os mecanismos interativos envolvidos na regulação
neuroendócrina da ingestão e do gasto energético (Maffei e cols., 1995).
19
Os genes ob e db
A leptina é o produto do gene ob expresso, principalmente, mas não
exclusivamente, no tecido adiposo branco. A síntese de leptina por outros
tecidos, não-adiposos, é observada na placenta, na mucosa fúndica estomacal,
no músculo esquelético e no epitélio mamário (Masuzaki e cols., 1997).
O gene ob codifica um RNAm de 4.5 Kb que origina uma proteína com
167 aminoácidos. Na corrente sangüínea, a leptina circula como uma proteína
não glicosilada de 16 kDa com 146 aminoácidos. Há forte correlação positiva
entre os níveis de RNAm para leptina no tecido adiposo e suas concentrações
séricas (Considini e cols., 1996). Análises estruturais indicam semelhanças entre
a leptina e as citocinas e revelam a presença de uma ligação dissulfídica em sua
estrutura de cadeia interna que se mostra necessária para sua atividade
biológica (Ahima & Flier, 2000).
Mutações no gene ob levam à deficiência de leptina. Camundongos ob/ob
apresentam hiperfagia, hipotermia, obesidade mórbida, e ainda, inúmeras
anormalidades metabólicas e neuroendócrinas. Em humanos, o quadro de
deficiência de leptina é caracterizado por hiperfagia, obesidade mórbida e
hipogonadismo hipotalâmico. E, diferentemente, dos camundongos ob/ob que
apresentam hiperinsulinemia, hiperglicemia, hipercortisolismo e hipotermia,
essas disfunções ainda não foram observadas em humanos leptino-deficientes
(Montague e cols., 1997). Ainda são desconhecidas as razões que levam a essas
diferenças entre as espécies, mas elas sugerem que existam substanciais
divergências nas ações fisiológicas da leptina entre humanos e roedores
(Ahima, 2000)
Os efeitos da leptina são evidenciados através de sua interação com o seu
receptor (Ob-R) codificado pelo gene db. O receptor da leptina pertence à
família de receptores de citocinas classe 1. O gene db pode codificar 6 isoformas
de receptor (Ob-Ra, b, c, d, e, f) (Bjorbaek e cols., 1997). Todas as isoformas
possuem o mesmo domínio extracelular amino-terminal de ligação ao
hormônio. Porém, apenas a isoforma Ob-Re não apresenta domínio
20
transmembrana, sendo que todas as isoformas apresentam diferentes domínios
intracelulares (Ahima & Flier, 2000).
A isoforma Ob-Rb, conhecida como isoforma longa é a única que contém
regiões intracelulares que requerem ativação da via de sinalização Janus-Kinase
(Jak) e do sinal ativador de transcrição e tradução (STAT). Essa via é conhecida
como via Jak-STAT. As isoformas curtas são capazes de ativar a via Jak, mas
incapazes de ativar o STAT, inviabilizando a ação da leptina sobre a ingestão
alimentar (Ahima & Flier, 2000).
A leptina se liga com alta afinidade ao homodímero Ob–R,
desencadeando a ativação da JAK2. Alterações nessa via de sinalização, como
atenuação da fosforilação do STAT-3 ou diminuição da expressão do receptor
inviabilizam a ação da leptina conforme demonstrado em ratos Wistar idosos
(Galaz e cols., 2002). Em outro estudo também utilizando ratos Wistar idosos,
um modelo clássico de resistência periférica à insulina e central à leptina,
encontrou-se inibição da atividade Jak por um membro da família de
supressores da sinalização de citocinas (SOCS-3) (Peralta e cols., 2002). No
hipotálamo, a leptina aumenta os níveis de RNAm do SOCS-3, sugerindo ser
este um mediador da resistência leptínica (Peralta e cols., 2002).
Ob-Rb está presente em regiões hipotalâmicas, co-localizado com o fator
de transcrição STAT3 e com os neuropeptídios importantes para a ação
leptínica, como o neuropeptídio Y (NPY) e a proopiomelanocortina (POMC)
(Hakansson e cols., 1998). Em contraste, as isoformas curtas (Ob-Ra, c, d, e, f)
são expressas no plexo coróide, no endotélio vascular, e em tecidos periféricos
como os rins, o fígado, os pulmões e as gônadas (Elmquist e cols., 1998). O
efeito da leptina sobre o metabolismo energético parece ser mediado apenas
pela isoforma longa, enquanto que as isoformas curtas parecem ser
responsáveis pelo transporte da leptina até o local de ação hormonal e por ações
periféricas (Ahima e cols., 2000).
Mutações no gene db causam, em camundongos, insensibilidade a
leptina, hiperfagia, obesidade mórbida, anormalidades metabólicas e
neuroendócrinas, incluindo hipercortisolismo e hipogonadismo hipotalâmico
21
(Halaas e cols., 1995). Em humanos, as mutações no Ob-R são extremamente
raras e assim como as mutações no gene ob causam hiperfagia, surgimento
precoce da obesidade e hipogonadismo hipotalâmico. Além dessas alterações
ainda há comprometimento nas secreções de TSH e hormônio do crescimento
(GH). Diferente do camundongo db/db, a mutação db em humanos não está
associada com hiperglicemia, hipercortisolismo e hipotermia (Clement e cols.,
1998).
Regulação da síntese
A síntese da leptina é influenciada pelo status energético proveniente do
tecido adiposo. O tamanho do adipócito é um importante determinante da
síntese, pois quanto maior é o tamanho da célula, maior é o conteúdo de leptina
como observado em um mesmo indivíduo com diferentes tamanhos de
adipócitos (Hamilton e cols., 1995). A correlação entre os níveis sangüíneos de
leptina e o conteúdo corporal de tecido adiposo é direta.
Em ratos, observa-se o aumento da concentração sérica de leptina após
uma refeição e em humanos, após alguns dias de superingestão alimentar. No
entanto, em ambas espécies a concentração de leptina decai algumas horas após
o início do jejum (Saladin e cols., 1995). As alterações na expressão da leptina
em resposta ao jejum e à ingestão não correspondem proporcionalmente às
alterações de peso ou de gordura corporais, sugerindo que a leptina funcione
como indicador do estoques energéticos assim como mediador do balanço
energético (Ahima e cols., 2000).
O efeito dos nutrientes sobre a regulação da leptina parece ser mediado,
em parte, pela insulina. Em humanos, observa-se forte correlação entre o
aumento da expressão de leptina e o pico de secreção de insulina durante os
ciclos alimentares. Em cultura de células adiposas, a insulina estimula
diretamente a síntese de leptina (Kolaczynski e cols., 1996). Durante o jejum a
queda nos níveis de insulina é seguida do declínio nos níveis de leptina (Boden
e cols., 1996).
22
A expressão da leptina é regulada por vários fatores mostrados na tabela
2, dentre eles destacam-se os hormônios tireoideanos. Em roedores, a
administração desses leva à diminuição dos níveis de leptina. Todavia, em
humanos ainda não há consenso sobre a relação entre a leptina e os hormônios
tireoideanos (Escobar-Morreale e cols., 1997).
Local Aumenta Diminui
Tecido Hiperfagia Jejum
Adiposo Obesidade Testosterona
Insulina Agonistas β-adrenérgicos
Glicocorticóides Hormns. Tireoideanos (?)
Infecção aguda Frio
Citocinas
Placenta
Insulina Fumo
Glicocorticóides Baixo peso ao nascer
Hipoxia
Músculo
Esquelético
(rato) Glicose
Lipídeos
Estômago
(rato) Ingestão
Colecistocinina
Tabela 2 – Regulação tecido-específica da expressão da leptina (Adaptado de Ahima, 2000).
O papel da leptina na homeostase energética
A classificação da leptina como fator anti-obesidade é baseada na sua
capacidade de inibir a ingestão alimentar, diminuir o peso corporal e a
adiposidade.
Baseando-se em dados anatômicos e funcionais, a leptina parece exercer
seus efeitos sobre o metabolismo energético atuando, principalmente no
cérebro. Lesões hipotalâmicas ventrobasais desencadeiam anormalidades no
balanço energético que se assemelham àquelas descritas nas mutações de
camundongos ob/ob e db/db. Injeções intravenosas de leptina ativam neurônios
hipotalâmicos localizados nos núcleos arqueado, ventromedial, dorsomedial e
nos circuitos neuronais do tronco cerebral que regulam o comportamento
alimentar e o balanço energético (Ahima e cols., 2000).
23
Os neuropeptídeos hipotalâmicos envolvidos na ação da leptina podem
ser classificados em dois grupos como peptídeos orexígenos que são inibidos
pela leptina e apresentam aumento em seus RNAm em resposta à deficiência de
leptina e como peptídeos anorexígenos que são estimulados pela leptina e
tendem a diminuir em resposta a sua deficiência (Sawchenko, 1998).
Classificados como orexígenos incluem o neuropeptídeo Y (NPY), o peptídeo
relacionado à proteína agouti (AgRP), o hormônio concentrador de melanina
(MCH) e a orexina. Os anorexígenos incluem o hormônio estimulante de α-
melanócitos (α-MSH), o transcrito regulado por cocaína e anfetamina (CART) e
o hormônio liberador de corticotrofina (CRH) (Ahima & Flier, 2000).
Os efeitos da leptina se dão através de sua interação com o receptor de
isoforma longa expresso no núcleo hipotalâmico arqueado. No núcleo arqueado
lateral são co-expressos os neuropeptídeos anorexígenos proopiomelanocortina
(POMC, precursor do α-MSH) e CART e no núcleo arqueado medial os
orexígenos NPY e AgRP. Os neurônios-alvo da leptina posicionam-se próximos
à eminência média. Através das junções comunicantes presentes nos capilares
da eminência, a leptina pode alcançar outros núcleos hipotalâmicos como o
ventrobasal, e ainda, ser transportada pelo líquido cerebroespinhal (Ahima,
2000). A figura 3 demonstra a interação neuroendócrina da leptina.
24
Tecido
Adiposo
Sistema Nervoso
Simpático
Tecido
Adiposo
Apetite
Hipotálamo
Núcleo Arqueado Núcleo Lateral
Neurônios Hipofisiotróficos
NPY
AGRP
POMC (αMSH)
CART
Sistema
Porta
TRH
SS
GHRH
Leptina
ObRb
JEJUM
OU
RESTRIÇÃO
ALIMENTAR
Hipófise
MCH
(? Orexina)
T4/T3
Cortisol
Esteróides
sexuais
Crescimento
( CRH)
GH
LH/FSH
TSH
ACTH
Tireóide
GônodasAdrenal
Tecidos
alvo
Figura 3 – Esquema representativo da fisiologia neuroendócrina da leptina durante a privação
de energia. ObRb–isoforma longa do receptor de leptina, NPY–neuropeptídeo Y, AGRP–
peptídeo relacionado à proteína agouti, POMC–proopiomelanocortina, α-MSH–melanocortina,
CART–transcrito regulado por cocaína e anfetamina, GHRH–hormônio liberador de hormônio
do crescimento, CRH–hormônio liberador de corticotrofina, SS-somatostatina, TRH–hormônio
liberador de tireotrofina, MCH–hormônio concentrador de melanina, ACTH–hormônio
adenocorticotrófico, TSH–tireotrofina, T4–tiroxina, T3-triiodotironina, LH–hormônio
luteinizante, FSH–hormônio folículo estimulante, GH-hormônio do crescimento (Adaptado de
Ahima, 2000).
A POMC é um pró-hormônio que sob a ação de pró-hormônio
convertases, origina os peptídeos bioativos: corticotrofina (ACTH), as
melanocortinas – MSH (α, β, γ) e a β-endorfina (Pritchard e cols., 2002).
Os peptídeos derivados da POMC agem através da ligação com os
receptores de melanocortinas (MC1R a MC5R), os quais pertencem ao grupo
dos receptores ligados à proteína G, com 7 alças transmembranas, que
estimulam a adenilato-ciclase. Eles se encontram amplamente distribuídos em
tecidos periféricos e no SNC (Catania e cols., 2000).
Os receptores MC3R e MC4R, estão envolvidos na regulação do peso
corporal: o MC3R modula o gasto energético e o MC4R, a ingestão alimentar. O
MC3R é expresso principalmente no SNC, mas também na placenta, intestino,
timo e adipócitos (Van Der kraan e cols., 1998). O MC4R é densamente
25
encontrado no hipotálamo e a ativação desse receptor pelo α-MSH reduz a
ingestão alimentar (Cone, 1999).
Camundongos homozigotos para mutação no MC4R apresentam
obesidade, com início na maturidade, associada a hiperfagia e aumento do
crescimento linear, sem alterações da função adrenal nem da capacidade
reprodutiva. Os heterozigotos apresentam peso corporal intermediário entre o
peso dos homozigotos e aquele dos camundongos selvagens, sendo o sexo
feminino mais afetado que o masculino (Huszar e cols., 1997). Este fenótipo é
semelhante ao observado na obesidade humana, razão que motivou a procura
de mutações do MC4R (O’ Rahilly, 2002).
O MC4R também parece exercer papel sobre a regulação do
comportamento alimentar. Branson e cols., em 2003, examinaram o gene MC4R
em 469 adultos com obesidade grave e identificaram mutações ou
polimorfismos em 5,1% deles. A prevalência do transtorno de compulsão
alimentar periódica foi de 26,4% na população estudada. Todos os indivíduos
portadores de mutações MC4R apresentaram transtorno de compulsão
alimentar periódica, enquanto apenas 14,2% dos indivíduos-controle obesos, e
nenhum dos indivíduos com peso normal, apresentaram o distúrbio alimentar
(Branson e cols., 2003).
Apesar da mutação MC4R representar a forma monogênica de obesidade
mais prevalente, as etiologias das formas mais comuns, poligênicas, ainda não
foram definidas. Os conhecimentos adquiridos a partir dessa mutação têm
levado ao desenvolvimento de drogas melanocortina-símiles, que podem ser
úteis para outras formas de obesidade. Camundongos knockout para o gene
POMC (chubby mice), tratados com um agonista sintético do α-MSH
denominado MCT II, perderam peso rapidamente em virtude da redução da
ingestão alimentar e do aumento da lipólise, o mesmo ocorrendo em
camundongos leptino-deficientes (ob/ob) (Stepherson,1999; Forbes e cols.,
2001). Em humanos com peso normal, a administração intranasal de
MSH/ACTH por 6 semanas, 2 vezes ao dia, foi capaz de reduzir o peso e a
gordura corporais (Fehm e cols., 2001).
26
O efeito da leptina sobre o controle alimentar é provavelmente mediado
pela via da melanocortina. Durante o jejum a redução sérica de leptina
inviabiliza a ação do α-MSH, porém a administração de MCT II impede a
supressão da expressão do gene do pró-TRH quando administrado intra-
cerebroventricularmente (300 mg de 6 em 6 h durante 3 dias de jejum) e
também aumenta os níveis de T4 livre circulantes (Krotkiewski, 2002).
Sob certas condições, a regulação do eixo tireoideano através do
mecanismo de feedback pode ser desfeita. Durante a restrição alimentar há
redução das concentrações séricas de T3 e T4, diminuição ou concentrações
normais de TSH e redução na expressão de TRH. Este quadro parece ser
mediado pela redução sérica de leptina que suprime a regulação do eixo através
da reduzida expressão do RNAm do TRH no núcleo paraventricular. Esse efeito
da leptina parece ser mediado indiretamente pelos neurônios do núcleo
arqueado que expressam POMC e NPY e diretamente através dos receptores
Ob-R colocalizados com os neurônios paraventriculares que expressam TRH e
ainda, regulando a atividade da região promotora do gene do TRH (Ahima,
2000).
Ortiga e cols., em 2002, demonstraram que a leptina exerce efeito
estimulatório sobre o eixo tireoideano durante condições fisiológicas. Todavia,
ainda é desconhecida a influência da leptina sobre o eixo TRH-TSH-tireóide no
sobrepeso. Em pacientes obesos, sem restrições alimentares, sabe-se que a
concentração de leptina no fluido espinhal correlaciona-se positivamente com a
concentração sérica de T4. E que ao serem submetidos a dietas hipocalóricas
apresentam subseqüentemente diminuição da concentração de leptina no fluido
espinhal que se correlaciona à diminuição nas concentrações séricas dos
hormônios tireoideanos (Krotkiewski, 2002).
Uma vez que os efeitos da dieta sobre a estabilização na taxa de redução
de peso corporal são determinados, pelo menos em parte, pela diminuição
sérica dos hormônios tireoideanos, neste trabalho, administrou-se T4 com o
propósito de avaliar sua eficácia no tratamento do sobrepeso.
27
OBJETIVOS
Neste estudo objetivamos avaliar os efeitos da restrição alimentar
associada ou não à reposição de diferentes doses de T4 em ratos de 3 (peso
normal) e 6 (sobrepeso) meses, observando os seguintes aspectos:
• redução do peso corporal;
• conteúdo de gordura retroperitoneal;
• concentrações séricas de T3, T4 e leptina;
• atividade da D1 no fígado;
28
METODOLOGIA
I -TRATAMENTO DOS ANIMAIS
Foram utilizados ratos da linhagem Wistar, machos com 3 e 6 meses de
idade, mantidos em gaiolas individualizadas sob condições de temperatura
(23ºC) e ciclo claro/escuro (12 h) controladas. Todos os animais tiveram água e
ração oferecidos ad libitum até o momento de se iniciar a restrição alimentar.
I.1 RESTRIÇÃO ALIMENTAR
Os animais foram separados por idade, em dois grupos e classificados
como controle aos 3 meses de idade e sobrepeso aos 6 meses, de acordo com o
peso corporal. Na literatura, o rato Wistar é classificado como obeso aos 12
meses de idade (peso = 419,9 ± 9,8 g) (Seraphim, e cols., 2001). Neste estudo, os
animais apresentam os seguintes pesos corporais: grupo controle (peso = 191,8
± 7,0 g) e grupo com sobrepeso (peso = 421,5 ± 7,4 g).
Com o intuito de estabelecer a ingestão diária de cada animal, a ração
ingerida foi controlada durante 1 semana. Para tanto, os animais foram
alocados em gaiolas individualizadas. Cada animal teve acesso a 100 gramas de
ração por 24 horas. No mesmo horário em que a ração foi oferecida, pesou-se o
que restou em cada gaiola, conhecido como Resto-Ingestão (RI). Ao final de 1
semana foi realizado o cálculo da ingestão diária média.
A ingestão entre os grupos foi diferente e o cálculo para a restrição
baseou-se nos valores médios encontrados. O grupo controle ingeriu 21,9 ± 1,2 g
e o grupo com sobrepeso ingeriu 17,0 ± 0,7 g. De acordo com dados da literatura
(Salih e cols., 1993; Gazdag e cols., 1999; Davidson e cols., 2002) foi estabelecido
o valor de 60% da ingestão média para ser oferecido aos animais em restrição
alimentar.
Aleatoriamente, a metade de cada grupo foi selecionada para receber a
restrição alimentar. Diariamente às 12:00 h foi colocada a quantidade de ração
29
previamente determinada para cada animal em restrição. Os animais controle
receberam ração ad libitum.
Este procedimento foi realizado até o dia do sacrifício.
I.2 CONTROLE DO PESO CORPORAL
Durante todo o experimento o peso corporal dos animais foi aferido
utilizando-se balança digital (Precision) com variação de duas casas decimais.
A primeira fase experimental consistiu no controle da ração oferecida e
do peso corporal. Este foi realizado a cada 2 dias como medida de controle da
perda de peso. Após, aproximadamente, 15 dias, os animais em restrição
alimentar apresentaram diminuições na taxa de perda de peso e, neste
momento, foi iniciada a segunda fase experimental, na qual além da restrição
alimentar, foi administrado ou não o hormônio tireoideano tiroxina (T4).
I.3 ADMINISTRAÇÃO DE T4
Diante da estabilização da perda de peso corporal, foi administrado T4
por via subcutânea (s.c.), diariamente no mesmo horário da oferta de ração
(12:00 h) durante 15 dias. Novamente, o critério de seleção aleatória foi utilizado
para separar os animais que receberam o T4. As doses administradas foram de
1,0 e 5,0 µg/100 g de peso corporal (p.c.). A dose de 1,0 µg/100 g p.c.
corresponde à dose de reposição hormonal capaz de normalizar o nível sérico
de T4 em animais hipotireóideos (Grozovsky, 2002; Ferreira e cols., 2005). A
administração de 5,0 µg/100 g p.c. ocasiona aumento no nível sérico de T4
circulante (Oppenheimer e cols., 1991).
Os animais que não foram tratados com T4 receberam 100 µL de solução
salina.
30
Figura 4 - Quadro representativo dos grupos experimentais.
I.4 COLETA DE SANGUE
Em dois momentos do experimento foram coletadas as amostras de
sangue.
1º coleta
: aconteceu, aproximadamente, quando os animais estavam em
restrição alimentar por 2 semanas e sem o uso do T4. O procedimento foi
realizado com os animais previamente anestesiados usando uma mistura de
cetamina (5,0 mg/100 g de peso corporal) e xilasina (0,5 mg/100 g de peso
corporal), por via intraperitoneal. Foram retirados 3 mL de sangue da jugular
de cada animal.
2ª coleta
: no dia do sacrifício, quando os animais já estavam em restrição
alimentar por, aproximadamente, 4 semanas e recebendo ou não T4 durante 15
dias. Os animais foram sacrificados por decapitação e o sangue coletado.
Para a obtenção do soro foi realizada a centrifugação (3000 rpm 15
minutos 4ºC) do sangue em tubos individualizados com a retirada do
sobrenadante (soro). As amostras de soro foram aliquotadas em 2 tubos e
armazenadas à - 80ºC até o momento das análises.
Animais de 3 meses (Grupo Controle):
Controle - (C)
C + T
4
1,0 µg - (CT1)
C + T
4
5,0 µg - (CT5)
Restrição - (R)
R + T
4
1,0 µg - (RT1)
R + T
4
5,0 µg - (RT5)
Animais de 6 meses (Grupo Sobrepeso):
Sobrepeso - (S)
S + T
4
1,0 µg - (ST1)
S + T
4
5,0 µg - (ST5)
Sobrepeso Restrição - (SR)
SR + T
4
1,0 µg - (SRT1)
SR + T
4
5,0 µg - (SRT5)
Animais de 3 meses (Grupo Controle):
Controle - (C)
C + T
4
1,0 µg - (CT1)
C + T
4
5,0 µg - (CT5)
Restrição - (R)
R + T
4
1,0 µg - (RT1)
R + T
4
5,0 µg - (RT5)
Animais de 6 meses (Grupo Sobrepeso):
Sobrepeso - (S)
S + T
4
1,0 µg - (ST1)
S + T
4
5,0 µg - (ST5)
Sobrepeso Restrição - (SR)
SR + T
4
1,0 µg - (SRT1)
SR + T
4
5,0 µg - (SRT5)
31
II SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS
A data do sacrifício foi determinada pelo controle do peso corporal.
Como os animais prosseguiam em restrição alimentar perdendo peso sem a
administração de T4 por aproximadamente 15 dias, foi mantido o mesmo
período para o tratamento com o T4 e marcada a data do sacrifício.
O sangue foi coletado para avaliação das concentrações séricas T3, T4 e
leptina determinadas por radioimunoensaios (RIE) específicos.
O fígado foi excisado e armazenado a –80
o
C para posterior dosagem da
atividade da enzima D1.
A gordura retroperitoneal total foi retirada, pesada e relacionada com o
peso corporal do animal no dia do sacrifício.
Figura 5 - Esquema representativo da metodologia experimental.
da
da
Controle
Controle
ingestão
ingestão
1 semana
Sangue Sacrifício
Sacrifício
Restrição
Restrição
Alimentar 60%
Alimentar 60%
T4 ou salina
Fígado
Desiodase (D1)
Sangue
RIE (T3,T4 e leptina)
Gordura retroperitoneal
Pesar e relacionar
ao peso corporal
15 dias 15 dias
da
da
Controle
Controle
ingestão
ingestão
1 semana
Sangue Sacrifício
Sacrifício
Restrição
Restrição
Alimentar 60%
Alimentar 60%
T4 ou salina
Fígado
Desiodase (D1)
Sangue
RIE (T3,T4 e leptina)
Gordura retroperitoneal
Pesar e relacionar
ao peso corporal
15 dias 15 dias
da
da
Controle
Controle
ingestão
ingestão
da
da
Controle
Controle
ingestão
ingestão
1 semana
Sangue Sacrifício
Sacrifício
Restrição
Restrição
Alimentar 60%
Alimentar 60%
T4 ou salina
Fígado
Desiodase (D1)
Sangue
RIE (T3,T4 e leptina)
Gordura retroperitoneal
Pesar e relacionar
ao peso corporal
15 dias 15 dias
32
III ANÁLISES
III.1 RADIOIMUNOENSAIO (RIE)
T3 e T4
As concentrações séricas de T3 e T4 foram determinadas através de Kit
comercial para RIE de T3 (DLS – 3100 Active
, TX, EUA) e T4 (DLS – 3200,
Active
, TX EUA) totais, contendo anticorpos específicos aderidos à parede dos
tubos de polipropileno e com T3 e T4 ligados ao radiotraçador (
125
I) com
atividade específica de 5 µCi (185 KBq). As curvas padrão foram realizadas com
T3 e T4 em soro de rato livre de iodotironinas (soro zero) nas concentrações de
(25 a 1000 ng/dL) e (1 a 50 µg/dL), respectivamente. Todo o procedimento foi
realizado seguindo-se as recomendações do fornecedor.
Leptina
As dosagens de leptina sérica foram feitas por RIE específico,
empregando um kit fornecido pela Linco Research, Inc. (Rat Leptin RIA Kit – RL-
83K) que é constituído por reagentes prontos para o uso: tampão de amostra,
leptina murina purificada em concentrações de 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 e 50 ng/mL
para a curva padrão, anticorpo anti-leptina murina (1º anticorpo), leptina
purificada por HPLC e marcada com
125
I , atividade específica de 135 µCi/µg e
anticorpo anti-IgG (2º anticorpo). Para a realização do RIE utilizamos o
protocolo fornecido pelo fabricante.
A contagem da radioatividade dos RIEs foi realizada em um cintilador
de fase sólida (1470 Wallac Wizard
TM
automatic gamma counter). Os resultados
foram expressos em ng/mL para a leptina, em ng/dL para o T3 e em µg/dL
para o T4.
33
III.2 ATIVIDADE DA ENZIMA IODOTIRONINA DESIODASE
TIPO 1 (D1)
Para se estudar a atividade da enzima D1 foram utilizadas as técnicas
desenvolvidas por Berry e colaboradores (1991) que foram padronizadas no
decorrer desta tese em nosso laboratório. Foram seguidas as etapas descritas
abaixo:
Processamento dos tecidos
As amostras de fígado foram pesadas em balança digital (Precision
advanced) (25 mg do tecido/mL de tampão) e homogeneizadas em tampão
sucrose-DTT (0,25 M sucrose e 10 mM DTT). Os tecidos foram homogeneizados
no Ultra-turrax T25 (Ika-Labortechnik). Os homogenatos foram armazenados em
tubos e congelados a - 80°C até o dia do ensaio. Alíquotas de 20 µL foram
guardadas separadamente, a - 20°C para dosagem de proteínas.
Purificação do rT3-
125
I
Antes da dosagem da atividade da D1 foi necessário purificar o traçador
radioativo em virtude do decaimento radioativo e da desiodação das
iodotironinas marcadas, mesmo na ausência da enzima. Esta etapa garantiu que
todo o iodo radioativo presente após a reação de desiodação advinha da ação
enzimática. Para isso, foi utilizada uma coluna de Sephadex L20 (Amersham
Biosciences) (4 mL de H
2
O/g de gel seco) para obter somente o rT3 radioativo
presente na solução (Perkinelmer Life and Analytical Sciences). Uma alíquota de 70
µL da iodotironina marcada foi diluída em 12 mL de H
2
O destilada e aplicada à
coluna. Desprezou-se o eluato, pois o rT3 radioativo, o composto de interesse,
fica retido na trama da coluna. Após esta etapa, a coluna foi lavada com 6 mL
de H
2
O destilada, e posteriormente, foram adicionados 500 µL de etanol 70%
por nove vezes. O eluato de etanol 70% contendo a iodotironina foi colhido em
nove tubos de vidro, de onde 5 µL foram retirados para contagem da
radioatividade no contador automático (1470 Wallac Wizard
TM
automatic gamma
counter), com o intuito de determinar a quantidade de rT3 radioativo presente
34
em cada tubo. Os três tubos com mais de 5.000 cpm/5 µL foram guardados na
geladeira ao abrigo da luz para o ensaio.
Ensaio de atividade da D1
Para dosar a atividade da D1 foram adicionadas as substâncias descritas abaixo
de acordo com a ordem enumerada:
1) tampão PE (100 Mm fosfato de sódio, 1 mM EDTA, pH 6,9) calculado para
obter um volume total de reação de 300 µL;
2) 30 µL de dithiotreitol (DTT) 10 mM (que é um cofator da enzima);
3) 30 µL de rT3 frio 1 µM;
4) o homogenato tecidual (volume calculado para obter 30 µg de proteína por
fígado).
Os homogenatos foram tratados com 2,5 N NaOH durante 30 minutos
antes de dosarmos as concentrações de proteína, que foram realizadas pelo
método de Bradford (1976), usando-se albumina bovina sérica (BSA – Sigma,
MO, EUA).
A adição de 50 µL do rT3-
125
I em todos os tubos dá início à reação.
Durante uma hora os tubos foram incubados a 37°C.
Decorrido o tempo de
incubação, a reação foi interrompida colocando os tubos no gelo. Em seguida,
com os tubos no gelo foram adicionados 200 µL de soro fetal bovino (Cultilab,
BR) e 100 µL de ácido tri-cloro acético (TCA) 50% para a precipitação das
proteínas. Os tubos foram agitados vigorosamente no vortex durante 2 minutos
e centrifugados (10.000 rpm por 3 minutos). 360 µL do sobrenadante foram
transferidos para tubos de contagem para medir a radioatividade no aparelho
Wizard. A atividade da enzima foi expressa em pmoles de rT3. min
-1
. mg
-1
.
35
IV ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os experimentos foram realizados pelo menos 3 vezes, sendo todos os
dados expressos como média ± erro padrão da média. Em cada grupo
experimental havia, no mínimo, 1 animal correspondente a cada tratamento
realizado. A análise estatística empregada na comparação dos resultados
apresentados foi realizada com a utilização do programa de análises estatísticas
Graphpad Prism (versão 4, Graphpad Software, Inc., San Diego, USA).
O peso corporal, a gordura retroperitoneal, as concentrações séricas de
T3, T4 e leptina e a atividade da desiodase foram analisados por variância
univariada paramétrica, seguida de teste de comparação múltipla de Newman-
Keuls. As diferenças foram consideradas significativas quando P< 0,05.
36
RESULTADOS
I - PESO CORPORAL E DE GORDURA RETROPERITONEAL
Nossos dados demonstram que aos 6 meses de idade, os ratos Wistar, são
significativamente mais pesados (421,5 ± 7,4 g) que aos 3 meses (191,8 ± 7,0 g).
Essa diferença de peso corporal foi mantida significativa, do início ao fim do
experimento, fato este que poderia ser determinado apenas pela diferença de
idade existente entre os animais (Figura 6 - A). Porém, no dia do sacrifício
detectou-se significativamente mais gordura retroperitoneal nos animais de 6
meses (sobrepeso) do que nos animais de 3 meses (controle) (Figura 6 - B).
CS
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Gordura retroperitoneal
(g/100g de peso corporal)
*
B)
CS C S
100
200
300
400
500
600
Peso corporal (g)
* *
A)
Início Fim
CS
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Gordura retroperitoneal
(g/100g de peso corporal)
**
B)
CS C S
100
200
300
400
500
600
Peso corporal (g)
** **
A)
Início Fim
37
De acordo com os dados da figura 7 demonstramos que a restrição
alimentar utilizada neste estudo foi eficaz em reduzir significativamente o peso
corporal de ambos os grupos experimentais.
Figura 7 - Peso corporal após 30 dias de restrição alimentar. Comparação entre
o grupo de 3 meses controle (C) e em restrição (R) e o grupo de 6 meses
sobrepeso (S) e sobrepeso em restrição (SR). Os resultados estão expressos como
média ± erro padrão. Os asteriscos indicam resultados estatisticamente
significativos. Nível de significância P<0,05.
CR SSR
100
200
300
400
500
600
Peso corporal (g)
*
*
CR SSR
100
200
300
400
500
600
Peso corporal (g)
**
**
38
Conforme anteriormente apresentado, os animais de ambos os grupos
(controle/sobrepeso), perderam peso após a restrição alimentar. Todavia, ao
final da segunda semana de restrição começaram a reduzir a taxa de perda de
peso. Neste momento, iniciou-se a administração de T4 (Figura 8). Através da
curva de acompanhamento de peso corporal relativo ao peso inicial do grupo
controle (Figura 8 - A), evidenciou-se que aos 3 meses de idade, os ratos estão
em plena fase de crescimento. Desse modo, ao serem submetidos à restrição
alimentar, apresentaram comprometimento no desenvolvimento corporal,
perdendo peso corporal e deixando de crescer. Já no grupo com sobrepeso
(Figura 8 - B), observou-se que aos 6 meses de idade, os ratos da linhagem
Wistar, não estão em fase de crescimento, apresentando apenas ganho de peso
relativo ao acúmulo de tecido adiposo. Evidenciou-se tanto no grupo controle
(Figura 8 - C) como no sobrepeso (Figura 8 - D) significativa perda de peso
corporal após 30 dias de restrição alimentar. Observou-se ainda, que a
administração de T4, nas duas doses (1,0 e 5,0 µg/100 g de p.c.), por 15 dias foi
ineficaz para potencializar o emagrecimento nos dois grupos, pois os animais
em restrição alimentar que receberam T4 exógeno não apresentaram redução de
peso significativamente maior que os animais não tratados.
39
Controle (C) / Sobrepeso (S)
T
4
(1 µg/100 g p.c.) – CT1 / ST1
Restrição (R) / Sobrepeso em restrição (SR)
T
4
(1 µg/100 g p.c.) – RT1 / SRT1
T
4
(5 µg/100 g p.c.) – CT5 / ST5
T
4
(5 µg/100 g p.c.) – RT5 / SRT5
Controle (C) / Sobrepeso (S)
T
4
(1 µg/100 g p.c.) – CT1 / ST1
Restrição (R) / Sobrepeso em restrição (SR)
T
4
(1 µg/100 g p.c.) – RT1 / SRT1
T
4
(5 µg/100 g p.c.) – CT5 / ST5
T
4
(5 µg/100 g p.c.) – RT5 / SRT5
0 10 20 30
0.5
1.0
1.5
2.0
dias
Peso corporal (relativo ao inicial)
T4
A)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
a
bb
a
b
a
C)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
aaa
bbb
D)
B)
0 10 20 30
0.5
1.0
1.5
2.0
dias
T4
GRUPO CONTROLE GRUPO SOBREPESO
Peso corporal (relativo ao inicial)
0 10 20 30
0.5
1.0
1.5
2.0
dias
Peso corporal (relativo ao inicial)Peso corporal (relativo ao inicial)
T4
A)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
a
bb
a
b
a
C)
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
aaa
bbb
D)
B)
0 10 20 30
0.5
1.0
1.5
2.0
dias
T4
GRUPO CONTROLE GRUPO SOBREPESO
Peso corporal (relativo ao inicial)Peso corporal (relativo ao inicial)
40
A ocorrência de distúrbios metabólicos na obesidade não depende
apenas do excesso de peso corporal, mas sim da distribuição do excesso de
gordura corporal. Desse modo avaliou-se a relação entre a redução de peso e a
de gordura retroperitoneal, bem como se observou o efeito do tratamento ou
não com T4 sobre este tecido adiposo branco (Figura 9). A restrição alimentar
causou significativa redução de gordura retroperitoneal nos dois grupos
estudados (Figura 9 - A). A administração de T4 (Figura 9 – B e C), na dose de
1,0 µg/100 g p.c., não alterou o conteúdo de gordura retroperitoneal nos
animais alimentados ad libitum (CT1 e ST1), nem nos animais em restrição (RT1
e SRT1) que tiveram redução semelhante aos animais em restrição sem T4 (R e
SR), demonstrando que a dieta foi o único fator determinante para a redução de
gordura retroperitoneal. Todavia, a administração de T4 na dose de 5,0 µg/100
g p.c., determinou significativa redução de gordura retroperitoneal, nos animais
alimentados ad libitum (CT5 e ST5) e nos animais em restrição (RT5 e SRT5), que
perderam ainda mais gordura que os outros animais em restrição, sugerindo
que a dose de 5,0 µg de T4 exerceu efeito lipolítico sobre a gordura
retroperitoneal.
41
C
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Gordura retroperitoneal
(g/100g de peso corporal)
a
A)
S
b
R
c
SR
c
C
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
Gordura retroperitoneal
(g/100g de peso corporal)
Gordura retroperitoneal
(g/100g de peso corporal)
a
A)
S
b
S
b
R
c
R
c
SR
c
SR
c
Gordura retroperitoneal (g / 100 g de peso corporal)
Gordura retroperitoneal (g / 100 g de peso corporal)
B)
C)
C
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
a
CT1
a
CT5
b
S
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
a
ST1
a
ST5
b
R
a
RT1
a
RT5
b
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
SR
a
SRT1
a
SRT5
b
Gordura retroperitoneal (g / 100 g de peso corporal)
Gordura retroperitoneal (g / 100 g de peso corporal)
B)
C)
C
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
a
CT1
a
CT5
b
S
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
a
ST1
a
ST5
b
R
a
RT1
a
RT5
b
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
SR
a
SRT1
a
SRT5
b
42
II – CONCENTRAÇÕES SÉRICAS HORMONAIS
A restrição alimentar, nos dois grupos (controle/sobrepeso) estudados,
determinou significativa redução na concentração plasmática de T4 (Figura 10 –
A). A concentração sérica, reduzida, de T4 determinada pela restrição, nos
animais do grupo controle em restrição (R), não diferiu da concentração sérica,
fisiológica, de T4 dos animais com sobrepeso (S).
A administração de T4 na dose de 1,0 µg/100 g p.c., no grupo controle
(Figura 10 - B), restaurou a concentração sérica de T4 dos animais submetidos à
restrição alimentar (RT1), e nos animais alimentados ad libitum (CT1), causou
aumento significativo do T4 sérico, em relação aos controles não tratados (C). A
administração de 5,0 µg/100 g p.c. determinou aumento significativo do T4
sérico nos animais alimentados ad libitum (CT5), conforme esperado, e também
nos animais em restrição alimentar (RT5), confirmando que a dose de 5,0
µg/100 g p.c pode ser considerada suprafisiológica, mesmo para os animais em
restrição.
No grupo com sobrepeso (Figura 10 - C), observou-se que a
administração de T4, nas duas doses (1,0 e 5,0 µg/100 g p.c.), causou aumento
significativo do T4 sérico em todos os animais, submetidos ou não à restrição
alimentar. Evidenciou-se que a administração da menor dose de T4, causou
aumento significativo de T4 sérico nos animais SRT1, em relação aos animais
ST1 e a maior dose, causou aumento semelhante entre ST5 e SRT5.
43
B)
0
5
10
15
T4 sérico (µg / dL)
C
a
R
b
CT1
c
RT1
a
CT5
d
RT5
c
0
5
10
15
C)
T4 sérico (µg / dL)
S
a
SR
b
ST1
c
SRT1
d
ST5
e
SRT5
e
B)
0
5
10
15
T4 sérico (µg / dL)
C
a
R
b
CT1
c
RT1
a
CT5
d
RT5
c
B)
0
5
10
15
T4 sérico (µg / dL)
C
a
R
b
CT1
c
RT1
a
CT5
d
RT5
c
0
5
10
15
T4 sérico (µg / dL)
C
a
C
a
R
b
R
b
R
b
CT1
c
CT1
c
RT1
a
RT1
a
CT5
d
CT5
d
RT5
c
RT5
c
0
5
10
15
C)
T4 sérico (µg / dL)
S
a
SR
b
ST1
c
SRT1
d
ST5
e
SRT5
e
0
5
10
15
C)
T4 sérico (µg / dL)
S
a
S
a
SR
b
SR
b
ST1
c
ST1
c
SRT1
d
SRT1
d
ST5
e
ST5
e
SRT5
e
SRT5
e
T4 sérico (µg / dL)
0
5
10
C
a
SR
c
S
b
R
b
A)
T4 sérico (µg / dL)
0
5
10
C
a
SR
c
S
b
R
b
A)
44
Ao avaliar o T3 sérico, observou-se que a restrição alimentar, no grupo
controle, determinou significativa redução na concentração plasmática de T3,
enquanto que no grupo com sobrepeso não houve alteração de T3 sérico após a
restrição (Figura 11 – A). Ao analisar o T3 sérico depois dos 15 dias da
administração de T4, observou-se, no grupo controle (Figura 11 – B), que os
animais alimentados ad libitum apresentaram aumento significativo do T3
sérico, de forma dose-dependente, isto é, a maior dose de T4 (5,0 µg/100 g p.c.)
determinou maior aumento de T3 sérico do que a menor dose (1,0 µg/100 g
p.c.). Os animais submetidos à restrição alimentar, apresentaram aumento
significativo do T3 sérico, porém sem aumento dose-dependente, pois os
animais RT1 e RT5 apresentaram concentrações séricas de T3 semelhantes. Já no
grupo com sobrepeso (Figura 11 – C), apenas a dose de 5,0 µg de T4, nos
animais alimentados ad libitum, acarretou aumento significativo do T3 sérico.
Em todos os outros animais, independentemente, do tratamento alimentar, não
houve alteração do T3 sérico após a administração do T4.
45
0
50
100
T3 sérico (ng / dL)
C
a
S
a
SR
a
R
b
A)
0
50
100
T3 sérico (ng / dL)
C
a
S
a
SR
a
R
b
A)
SST1ST5
0
50
100
150
200
SR
aaa
SRT1
a
SRT5
a
b
T3 sérico (ng / dL)
C)
CCT1CT5
0
50
100
150
200
a
R
b
RT5
a
RT1
a
d
c
T3 sérico (ng / dL)
B)
SST1ST5
0
50
100
150
200
0
50
100
150
200
SR
aaa
SRT1
a
SRT5
a
b
T3 sérico (ng / dL)
C)
CCT1CT5
0
50
100
150
200
0
50
100
150
200
a
R
b
RT5
a
RT1
a
d
c
T3 sérico (ng / dL)
B)
46
A concentração sérica de leptina mostrou-se, significativamente
aumentada, no grupo com sobrepeso, em relação ao grupo controle. A restrição
alimentar, por sua vez, determinou significativa redução de leptina sérica nos
dois grupos (Figura 12 - A).
A diminuição de leptina sérica determinada pela restrição alimentar
induz alterações neuro-fisiológicas, como por exemplo, a modulação do eixo
hipotálamo-hipófise-tireóide. Todavia, ainda são controversos os efeitos
regulatórios entre leptina e hormônios tireoideanos. Por isso, neste trabalho que
reúne a restrição alimentar e a administração de T4, analisou-se a interação
desses dois componentes com a leptina sérica. No grupo controle (Figura 12 -
B), observou-se que a menor dose de T4, nos animais CT1, aumentou
significativamente a concentração de leptina, enquanto a maior dose de T4, nos
animais CT5, não alterou a concentração de leptina. Quando foram reunidos os
efeitos da restrição alimentar e da administração de T4, detectou-se tendência a
diminuir a leptina sérica nos animais RT1 e RT5, que apresentaram
concentrações séricas de leptina abaixo do limite de detecção do teste, em
relação aos animais R. No grupo sobrepeso (Figura 12 - C) observou-se, nos
animais alimentados ad libitum e tratados com a menor dose de T4 (ST1),
tendência a reduzir a leptina sérica e nos animais tratados com a maior dose de
T4 (ST5), significativa redução de leptina sérica. Similarmente ao grupo
controle, no grupo com sobrepeso, também foi observado que a restrição
alimentar associada à administração de T4 determinaram uma tendência a
diminuir a leptina sérica nos animais SRT1 e SRT5, em relação aos animais SR.
47
CRSSR
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Leptina (ng / mL)
A)
a
b
c
b
CRSSR
0
1
2
3
4
5
6
7
8
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Leptina (ng / mL)
A)
a
b
c
b
CCT1CT5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Leptina (ng / mL)
SST1ST5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Leptina (ng / mL)
B) C)
RRT1RT5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Leptina (ng / mL)
SR SRT1 SRT5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Leptina (ng / mL)
a
b
a
a
a
b
CCT1CT5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Leptina (ng / mL)
SST1ST5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
Leptina (ng / mL)
B) C)
RRT1RT5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Leptina (ng / mL)
SR SRT1 SRT5
0.0
0.5
1.0
1.5
2.0
2.5
3.0
3.5
4.0
Leptina (ng / mL)
a
b
a
a
a
b
48
III - ATIVIDADE DA ENZIMA D1 NO FÍGADO
Nos dois grupos (controle/sobrepeso) estudados, a restrição alimentar
determinou significativa redução na atividade da D1 (Figura 13). A
administração das duas doses (1,0 e 5,0 µg/100 g p.c.) de T4, estimulou a
atividade da D1, nos animais alimentados ad libitum (Figura 14 - A e B – gráficos
superiores). Analisando a atividade da D1, após a interação dos efeitos da dieta
(inibitório) e do T4 (estimulatório), evidenciou-se, nos dois grupos
(controle/sobrepeso), que o efeito da restrição alimentar é suprimido pelo T4
exógeno, isto é, houve significativo aumento na atividade dessa enzima, nos
animais RT1 e RT5; SRT1 e SRT5, em relação aos animais R e SR,
respectivamente (Figura 14 - A e B – gráficos inferiores).
Figura 13 - Efeito da restrição alimentar sobre a atividade da enzima D1
hepática, no grupo de 3 meses controle (C) e em restrição (R) e no grupo de 6
meses com sobrepeso (S) e sobrepeso em restrição (SR).
250
0
50
100
150
200
C
a
SR
b
R
b
S
a
Atividade D1 (rT3.min
-1
.mg
-1
)
250
0
50
100
150
200
250
0
50
100
150
200
C
a
SR
b
R
b
S
a
Atividade D1 (rT3.min
-1
.mg
-1
)
49
Figura 14 - Efeito da administração de T4 e da restrição alimentar sobre a
atividade da D1 hepática. A) Grupo controle (controle (C), controle com T4 na
dose de 1,0 µg/100 g de p.c. (CT1), controle com T4 na dose de 5,0 µg/100 g de
p.c. (CT5), restrição (R), restrição com T4 na dose de 1,0 µg/100 g de p.c. (RT1),
restrição com T4 na dose de 5,0 µg/100 g de p.c. (RT5)). B) Grupo com
sobrepeso (sobrepeso (S), sobrepeso com T4 na dose de 1,0 µg/100 g de p.c.
(ST1), sobrepeso com T4 na dose de 5,0 µg/100 g de p.c. (ST5), sobrepeso em
restrição (SR), sobrepeso em restrição com T4 na dose de 1,0 µg/100 g de p.c.
(SRT1), sobrepeso em restrição com T4 na dose de 5,0 µg/100 g de p.c. (SRT5)).
Os resultados foram expressos como média ± erro padrão. As diferentes letras
indicam resultados estatisticamente significativos. Nível de significância P<0,05.
A)
0
50
100
150
200
250
C
a
CT 1
a
CT 5
b
Atividade enzimática D1 (rT3.min
-1
.mg
-1
)
0
50
100
150
200
250
R
b
a
RT1
c
RT5C
a
B)
0
50
100
150
200
250
ST 1
b
ST 5
b
S
a
100
150
200
250
0
50
S
a
SR
b
c
SRT1
c
SRT5
Atividade enzimática D1 (rT3.min
-1
.mg
-1
)
A)
0
50
100
150
200
250
C
a
CT 1
a
CT 5
b
Atividade enzimática D1 (rT3.min
-1
.mg
-1
)
0
50
100
150
200
250
R
b
a
RT1
c
RT5C
a
A)
0
50
100
150
200
250
0
50
100
150
200
250
C
a
CT 1
a
CT 5
b
Atividade enzimática D1 (rT3.min
-1
.mg
-1
)
0
50
100
150
200
250
0
50
100
150
200
250
R
b
a
RT1
c
RT5C
a
B)
0
50
100
150
200
250
ST 1
b
ST 5
b
S
a
100
150
200
250
0
50
S
a
SR
b
c
SRT1
c
SRT5
Atividade enzimática D1 (rT3.min
-1
.mg
-1
)
B)
0
50
100
150
200
250
0
50
100
150
200
250
ST 1
b
ST 5
b
S
a
100
150
200
250
0
50
100
150
200
250
0
50
S
a
SR
b
c
SRT1
c
SRT5
Atividade enzimática D1 (rT3.min
-1
.mg
-1
)
50
DISCUSSÃO
É sabido que a redução da quantidade de massa corporal, em especial de
gordura, melhora a qualidade de vida e diminui a morbi-mortalidade de
indivíduos com sobrepeso (Salih e cols., 1993; Gazdag e cols., 1999; Davidson e
cols., 2002). Para conseguir essa diminuição da massa gordurosa é necessário
um balanço energético negativo, condição na qual o gasto supera o consumo de
energia, pois os estoques energéticos do organismo são consumidos para
sustentar os processos metabólicos, levando à perda de peso.
Muitos tratamentos para a obesidade utilizam a restrição da ingestão
energética, uma das formas de alcançar o déficit energético, com o propósito de
reduzir o peso corporal (Salih e cols., 1993; Gazdag e cols., 1999; Davidson e
cols., 2002).
Todavia, indivíduos submetidos a dietas hipocalóricas sofrem mudanças
metabólicas adaptativas em resposta à limitação do consumo energético para
permitir o prolongamento da vida. À medida que o consumo alimentar é
restrito, o gasto energético diminui, levando à redução da perda de peso
corporal com o tempo (Francischi e cols., 2000).
A redução na TMB é um dos mais constantes resultados observados
durante experimentos com déficit energético. Mecanismos fisiológicos como a
diminuição da atividade do sistema nervoso simpático, mudanças no
metabolismo periférico dos hormônios tireoideanos e na secreção de insulina
operam na diminuição da atividade metabólica (Francischi e cols., 2000).
Na última década, em virtude do aumento de casos de sobrepeso e
obesidade, um dos campos de maior interesse da pesquisa consiste em
encontrar um tratamento que previna ou mesmo que diminua os efeitos
fisiológicos que dificultam o emagrecimento de sujeitos com excesso de peso
corporal. Desse modo, os análogos dos hormônios tireoideanos têm sido
exaustivamente utilizados, para impedir a redução da TMB determinada pelas
dietas restritivas de emagrecimento. Todavia, ainda não existe um consenso
acerca da eficácia desses hormônios em induzirem a perda de peso corporal.
51
Nosso interesse, primeiramente, foi verificar as reduções de peso
corporal e de gordura retroperitoneal em ratos com sobrepeso submetidos à
restrição alimentar. Para tanto, desenvolvemos um modelo experimental que
nos possibilitou evidenciar os efeitos da restrição a 60% da ingestão ad libitum,
durante 30 dias, em animais com sobrepeso, comparando-os a animais de peso
normal (controle). Comprovamos que a restrição alimentar foi eficaz em
determinar as reduções de peso corporal e de gordura retroperitoneal nos dois
grupos experimentais estudados. De acordo com a literatura (Gazdag e cols.,
1999; Seraphim e cols., 2001; Davidson e cols., 2002; Peralta e cols., 2002), a
redução na ingestão calórica, de forma moderada (20-40%), é suficiente para
reduzir o peso e o conteúdo de gordura corporais, determinando, por
conseqüência melhora metabólica.
Assim, partimos para o propósito do estudo, associando à restrição
alimentar a administração do T4, a fim de verificarmos o efeito desse
tratamento conjunto sobre as reduções de peso e gordura retroperitoneal.
Escolhemos duas doses de T4 para serem avaliadas; uma de 1,0 µg/100 g de p.c.
que é utilizada para restaurar o eutireoidismo em animais hipotireóideos, e por
isso considerada uma dose fisiológica (Grozovsky, 2002; Ferreira e cols., 2005) e
outra cinco vezes maior (5,0 µg/100 g de p.c.), sendo considerada uma dosagem
suprafisiológica. Os hormônios tireoideanos alteram o balanço energético
através de muitos mecanismos (Silva, 1995). Esses hormônios estimulam a taxa
metabólica basal, acelerando vias metabólicas de síntese e degradação que, por
sua vez, aumentam o requerimento energético (Al-Adsani e cols., 1997). Em
estudos com animais (Oppenheimer e cols., 1991) e humanos (Al-Adsani e cols.,
1997) nos quais há administração de doses suprafisiológicas de hormônio
tireoideano, observa-se aumento da ingestão alimentar que, todavia é
insuficiente para satisfazer a aumentada demanda energética, determinando
redução de peso corporal relacionada à perda de massas magra (músculo) e
gorda (tecido adiposo).
Ao avaliarmos o efeito do tratamento conjunto (dieta/T4) sobre a
redução de peso corporal verificamos que nos dois grupos (controle/sobrepeso)
52
a redução de peso foi exclusivamente causada pela restrição alimentar.
Nenhuma das doses de T4 utilizadas foram capazes de aumentar a redução de
peso determinada pela restrição alimentar. A maioria dos estudos que associam
o efeito de emagrecimento aos hormônios tireoideanos utilizam doses
suprafisiológicas que, por sua vez, desencadeiam efeitos colaterais não
desejáveis (Oppenheimer e cols., 1991; Krotkiewski, 2002). Nossos resultados,
em ratos, sugerem que para haver aumento na redução de peso corporal
durante a restrição alimentar, induzida pelos hormônios tireoideanos, estes
devem ser utilizados em altíssimas doses, pois mesmo a dose suprafisiológica
de 5,0 µg não foi eficaz.
Mas, por outro lado, ao avaliarmos o efeito do T4 sobre a redução de
gordura retroperitoneal evidenciamos que a dose de 5,0 µg teve efeito lipolítico
sobre o tecido adiposo retroperitoneal em todos os animais tratados com essa
dose, independentemente da restrição alimentar, já que os animais alimentados
ad libitum tiveram redução de gordura retroperitoneal. A dose de 1,0 µg de T4
não causou qualquer alteração no tecido retroperitoneal dos animais tratados.
A princípio, o fato dos animais tratados com 5,0 µg de T4, apresentarem
redução de gordura retroperitoneal sem redução de peso corporal, ainda é
inexplicável. Entretanto, como a gordura retroperitoneal corresponde, em
média, a 2% do peso corporal total, a perda exclusiva desse tecido pode não
resultar em perda significativa do peso corporal. Além disso, sabemos que os
efeitos do T4 devem ser analisados de forma global, relacionando o peso
corporal e a composição corporal, já que os hormônios tireoideanos podem
exercer seus efeitos em praticamente todos os tecidos corporais (Yen, 2001). No
próprio tecido adiposo branco, os hormônios tireoideanos podem ter efeitos
lipolíticos e lipogênicos (Yen, 2001), assim uma hipótese levantada neste
trabalho seria a ocorrência de modulações tecido-específicas exercidas pelos
hormônios tireoideanos que determinariam em alguns órgãos ou
compartimentos o estímulo das vias de síntese e em outros as vias de
degradação.Logo, é possível haver redução de tecido adiposo retroperitoneal
sem, no entanto, haver redução de peso corporal.
53
Com o intuito de obtermos maiores informações acerca da relação
existente entre os efeitos da administração de T4 e o tecido adiposo, analisamos
a concentração sérica de leptina que é um hormônio notadamente
correlacionado à adiposidade corporal, sob condições normais de ingestão
alimentar (Considine, 2001; Lins e cols., 2005). Como esperado, nossos
resultados confirmaram do que os animais do grupo com sobrepeso apresentam
significativamente mais leptina sérica que os animais do grupo controle. Esse
aumento é resultante da liberação aumentada de leptina proveniente dos
adipócitos aumentados em número e tamanho (Reidy e cols., 2000; Considine,
2001).
Ao avaliarmos os efeitos das diferentes doses de T4 (1,0 e 5,0 µg)
administradas nos animais alimentados ad libitum, observamos alterações nas
concentrações séricas de leptina promovidas pelo T4 exógeno. No grupo
controle a dose de 1,0 µg (CT1) determinou aumento significativo de leptina
enquanto a maior dose de 5,0 µg (CT5) manteve a concentração de leptina igual
a do animal controle que não recebeu T4. Esses resultados poderiam nos sugerir
que não há correlação entre a concentração sérica de leptina e a gordura
retroperitoneal, pois apesar de não ter ocorrido alteração no conteúdo deste
tecido adiposo, nos animais CT1, houve aumento significativo de leptina, e nos
animais CT5 houve significativa redução de gordura retroperitoneal sem
redução de leptina sérica. No entanto, no grupo com sobrepeso observamos que
a dose de 1,0 µg de T4 determinou uma queda, porém não significativa, de
leptina e a maior dose de T4 (5,0 µg) reduziu significativamente a concentração
sérica de leptina, de acordo com a significativa redução de gordura
retroperitoneal. Os resultados encontrados, no grupo com sobrepeso,
confirmam que a administração de hormônios tireoideanos em roedores (Reidy
e cols., 2000) diminuiu os níveis séricos de leptina, sendo inclusive coerente ao
apresentarem uma redução dose-dependente. Como alguns resultados
encontrados na revisão de literatura sobre a relação leptina/hormônio
tireoideano (Ahima & Flier, 2000) ainda são controversos podemos sustentar a
hipótese de que, no grupo controle, a administração de T4 determinou aumento
54
sérico de leptina por ser capaz de modular de forma tecido-específica as vias
metabólicas relacionadas aos lipídeos. Em um estudo (Oppenheimer e cols.,
1991), realizado com ratos tratados com diferentes doses de T3, houve relação
funcional do hormônio tireoideano em induzir lipogênese e lipólise
concomitantemente. Após a administração de T3 houve aumento do turnover
lipídico. Os autores sugerem que para manter a demanda energética aumentada
induzida pelo T3, há aumento da síntese de ácidos graxos que por sua vez
também estão sendo liberados a partir da degradação dos estoques de
triglicerídeos que estão sendo requisitados para suprir o aumento no consumo
de oxigênio determinado pelo quadro instalado de hipermetabolismo.
Outro importante regulador da concentração sérica de leptina é a
ingestão alimentar. Sob condições de privação energética como acontece na
restrição alimentar há significativa redução de leptina, sendo que nossos dados
corroboram os achados da literatura (Ahima & Flier, 2000; Reidy e cols., 2000;
Considine, 2001). Apesar da adiposidade ser o principal sinalizador da
concentração sérica de leptina, esta pode ser alterada, durante a restrição
alimentar, mesmo que não haja significativa mudança no conteúdo de tecido
adiposo (Considine, 2001). Em nossos resultados observamos esse
acontecimento nos animais do grupo controle que apresentavam
significativamente menos gordura retroperitoneal que os animais com
sobrepeso e ao serem submetidos à restrição alimentar apresentaram redução
na leptina sérica semelhante ao grupo com sobrepeso, demonstrando que,
proporcionalmente a redução de tecido adiposo não foi o único fator
determinante para a redução significativa de leptina no grupo controle.
Alguns estudos demonstram que após 24 horas de jejum há redução
sérica de leptina com restauração dos níveis 4 a 5 horas depois da
realimentação, indicando que a glicemia ou a insulinemia exercem importante
efeito estimulatório sobre a produção de leptina (Reidy e cols., 2000; Considine,
2001).
A restrição alimentar leva à redução de leptina sérica que, por sua vez,
altera o eixo hipotálamo-hipófise-tireóide, reduzindo a síntese hipotalâmica de
55
TRH (Krotkiewski, 2002). Este parece ser um dos mecanismos envolvidos na
supressão do eixo tireoideano, determinando diminuição sérica de T3 e T4,
durante as restrições alimentares (Ahima & Flier, 2000). Resolvemos então
avaliar o efeito da restrição alimentar à 60% associada à administração de T4
sobre a concentração sérica de leptina.
Ao avaliarmos as diferentes doses de T4 administradas nos animais
controle e com sobrepeso, submetidos à restrição alimentar, observamos que
nesses dois grupos houve diferença na concentração sérica de leptina após a
administração de T4. A restrição, conforme já mencionado, determinou
significativa redução de leptina, mas a restrição com a administração de T4, nas
duas doses, reduziu a leptina a níveis indetectáveis pelo teste utilizado,
sugerindo que o T4 potencializa o efeito da restrição alimentar em diminuir a
leptina sérica, ou seja, a resposta da leptina sérica ao T4 depende do estado
nutricional do animal. Talvez a ação diferencial do T4 seja devido à mudanças
na proporção de tecido adiposo ou à insulinemia que pode estar menor nos
animais em restrição alimentar.
Os hormônios tireoideanos T3 e T4 são os principais reguladores da taxa
metabólica basal. As concentrações séricas desses hormônios apresentam
correlação direta com o gasto energético, diminuindo significativamente
durante situações de privação energética, como a restrição alimentar (LiVolsi,
1989). Os resultados obtidos em nossos experimentos corroboram os dados da
literatura (Ahima & Flier, 2000; Reidy e cols., 2000; Krotkiewski, 2002).
Observamos que o nível sérico de T4, no grupo com sobrepeso, é
significativamente menor que o nível sérico do grupo controle, estando ambos
sob condições normais de alimentação. Ao serem submetidos à restrição
alimentar, os dois grupos, reduziram significativamente o T4 sérico.
Em relação à concentração sérica de T3, observamos que durante a
restrição alimentar, somente no grupo controle, houve significativa redução
desse hormônio, sem nenhuma alteração no grupo com sobrepeso.
A menor concentração sérica de T4, observada no grupo com sobrepeso
em relação ao grupo controle e a não alteração da concentração sérica de T3,
56
observada no grupo com sobrepeso ao ser submetido à restrição alimentar
podem ser fisiologicamente justificadas por dois fatores existentes no grupo
com sobrepeso que contribuem para o perfil hormonal: o excesso de
adiposidade e a idade mais avançada desses animais que chegam ao final do
experimento com 7 meses de idade, em relação ao grupo controle (4 meses ao
final do experimento). De acordo com a literatura (Krotkiewski, 2002), o perfil
hormonal de sujeitos obesos é consistente com alteração da função tireoideana e
o envelhecimento (Moreira e cols., 2005) determina diminuição na concentração
sérica dos hormônios tireoideanos. Na literatura (Seraphim e cols., 2001; Peralta
e cols., 2002) o rato Wistar é utilizado como modelo de obesidade e
envelhecimento a partir dos 12 meses; apesar dos animais do grupo com
sobrepeso ainda não serem considerados obesos nem velhos, nossos dados
sugerem que aos 7 meses de idade já apresentam evidências desses estereótipos.
Fortalecendo ainda essa hipótese, temos outro dado do nosso modelo
experimental, o valor da ingestão alimentar dos animais com sobrepeso, que
pode ser utilizado. Apesar do sobrepeso ser caracterizado pelo acúmulo
excessivo de gordura corporal, proveniente, em parte, da hiperfagia, os animais
com sobrepeso não apresentaram ingestão alimentar maior que o grupo
controle. Durante o período experimental de controle da ingestão, detectamos
que o consumo de ração dos animais com sobrepeso foi significativamente
menor que dos animais controle. O estudo de Forciea e cols. (1981), demonstra
que a ingestão alimentar de roedores, declina consideravelmente, com o
avançar da idade.
Ao avaliarmos a concentração sérica de T4, 15 dias após a administração
das duas doses (1,0 e 5,0 µg/100 g p.c.), encontramos, conforme esperado,
aumento significativo do nível sérico de T4 de forma dose-dependente, isto é, a
maior dose (5,0 µg) causou maior aumento do T4 que a menor dose (1,0 µg).
Isso aconteceu nos dois grupos estudados (controle/sobrepeso) sob as
condições de restrição alimentar ou não.
Interessantemente, observamos que a restrição alimentar no grupo
controle (R) determinou redução no T4 sérico semelhante à redução fisiológica
57
observada no grupo com sobrepeso ad libitum (S). Ao administrarmos a dose de
1,0 µg/100 g p.c. correspondente à dose de reposição hormonal capaz de
normalizar os níveis séricos de T4 em animais hipotireóideos (Grozovsky, 2002;
Ferreira e cols., 2005), evidenciamos que houve restauração do perfil hormonal
à níveis séricos de T4 iguais a do grupo controle. Esse resultado nos sugere que
a restrição alimentar assim como o sobrepeso/ “envelhecimento” mimetizam
uma situação de hipotireoidismo na qual reposição hormonal com a dose de 1,0
µg/100 g reverte este quadro.
Após termos nos certificado que a administração de T4 por 15 dias
realmente foi eficaz, determinando aumento significativo do T4 sérico,
avaliamos a concentração sérica de T3, esperando encontrar correlação direta
entre as concentrações séricas de T4 e T3, tendo em vista que o T4 é convertido
à T3. Nos animais alimentados ad libitum observamos, no grupo controle,
aumento sérico de T3, conforme esperado, e no grupo com sobrepeso apenas
nos animais que receberam a maior dose de T4 (5,0 µg/100 g p.c.).
Demonstrando que pode haver uma diminuição na metabolização periférica do
T4 neste grupo que apenas foi sensibilizado com a maior dose. Nos animais
submetidos à restrição alimentar, tanto no grupo controle como no grupo com
sobrepeso, não encontramos a correlação esperada entre o aumento sérico de
T4, determinado pela administração, e o aumento sérico de T3. No grupo
controle, as duas doses de T4 administradas apenas restauraram a concentração
sérica de T3, diminuída pela restrição alimentar, aos níveis séricos do controle
ad libitum. No grupo com sobrepeso, não observamos nenhuma alteração
determinada pelo T4 exógeno, pois todos os animais em restrição com ou sem
T4, apresentaram a mesma concentração sérica de T3. É sabido que o T3 é o
hormônio metabolicamente ativo, exercendo seus efeitos após interagir com seu
receptor nuclear. Tendo em vista que a restrição alimentar determina redução
na concentração sérica dos hormônios tireoideanos, resolvemos administrar o
T4 para ser convertido perifericamente à T3. Nossos dados demonstraram que
essa metabolização periférica, durante a restrição, pode estar alterada.
58
A atividade da D1, enzima responsável pela conversão periférica de T4 à
T3, é modulada negativamente pela dieta (Bianco e cols., 2002). Durante a
restrição alimentar há diminuição de sua atividade, conforme observado em
nosso trabalho.
O T4, por sua vez é um dos maiores reguladores da atividade da D1,
exercendo sobre ela efeito estimulatório (Bianco e cols., 2002). Neste trabalho,
utilizamos um modelo experimental no qual reunimos a restrição alimentar e a
administração de T4. Por isso, resolvemos analisar os seus efeitos interativos
desses moduladores de ações antagônicas, sobre a atividade da D1.
Sabe-se que a enzima D1 pode catalisar tanto a reação de ativação como a
de inativação do T4, formando T3 e rT3, respectivamente. Durante a restrição
alimentar a D1 aumenta preferencialmente a desiodação do anel interno,
formando o metabólito inativo rT3 (Bianco e cols., 2002). Recentemente, foi
esclarecido que esse fato se dá, pelo menos em parte, pela indução da reação de
sulfatação do T4 cuja enzima responsável é induzida pelo receptor CAR
(Maglich e cols., 2004). Esse receptor é principalmente expresso no fígado e seu
principal papel está relacionado à defesa de xenobióticos, que é a resposta
metabólica do organismo contra moléculas e drogas tóxicas.
A partir dos resultados obtidos e descritos nesta tese, podemos sugerir
que a redução sérica dos hormônios tireoideanos observada durante a privação
energética em ratos, possa ser mediada por pelo menos dois distintos
mecanismos: central (leptina/TRH) conforme mencionado anteriormente
(Krotkiewski, 2002) e principalmente periférico (alteração da atividade da D1).
Porém, o que nos permite afirmar que as reduções encontradas nas
concentrações séricas dos hormônios tireoideanos sejam principalmente
relacionadas ao metabolismo periférico? Ao analisarmos o efeito da
administração das duas doses de T4 sobre o emagrecimento não encontramos
resultados satisfatórios, pois evidenciamos que este foi determinado apenas
pela restrição alimentar. Avaliando o efeito da administração de T4 sobre a
atividade da D1 confirmamos que os hormônios tireoideanos são potentes
estimuladores de sua atividade (Bianco e cols., 2002), pois foram capazes de
59
aumentar significativamente a atividade da D1 nos animais alimentados ad
libitum. Ineditamente demonstramos que, nos animais que fizeram restrição
alimentar, o T4 exógeno foi capaz de anular o efeito inibitório da restrição
alimentar sobre a atividade da D1 em todos os animais. Assim, concluímos que
ao administrarmos o T4, durante a restrição, poderíamos ter revertido o quadro
de redução de perda de peso corporal causado em parte, pela queda nas
concentrações séricas dos hormônios tireoideanos se o problema fosse
dependente de um mecanismo central, isto é, determinado pela diminuição de
TRH em conseqüência da redução de leptina. Porém, conforme mencionado,
anteriormente, a diminuição de TRH leva à redução de TSH e assim de T3 e T4;
ao administrarmos o T4 este seria convertido em T3 pela D1 e o animal
continuaria perdendo peso. Mas, como há mudança na atividade da D1
(mecanismo periférico) determinada provavelmente pela sulfatação do T4
durante a restrição alimentar, o T4 administrado que até é capaz de aumentar a
atividade da D1 hepática, é desiodado no anel interno, formando rT3 um
metabólito inativo e, portanto sem efeito celular. Vale ressaltar que o próprio T3
pode ser sulfatado e assim inativado, provavelmente explicando porque a
administração de altas doses de T3 também não causa perda significativa de
peso em ratos (Yamada e cols., 2004).
Através desse estudo podemos afirmar que o uso do T4 como estratégia
de emagrecimento utilizada durante as dietas restritivas deve ser eliminado,
pelo menos, em modelos de roedores.
60
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