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UNIVERSIDADE FEDERAL DE CIÊNCIAS DA SAÚDE DE PORTO ALEGRE
RIO GRANDE DO SUL
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM PATOLOGIA
DILMAR FRANCISCO LEONARDI
AVALIAÇÃO DO USO ASSOCIADO DE CÉLULAS-TRONCO E ENGENHARIA
TECIDUAL NA REGENERAÇÃO E NEOVASCULARIZAÇÃO DE LESÃO
CUTÂNEA EM CAMUNDONGOS
Porto Alegre,
2008
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1
DILMAR FRANCISCO LEONARDI
AVALIAÇÃO DO USO ASSOCIADO DE CÉLULAS-TRONCO E ENGENHARIA
TECIDUAL NA REGENERAÇÃO E NEOVASCULARIZAÇÃO DE LESÃO
CUTÂNEA EM CAMUNDONGOS
Tese submetida ao Programa de Pós-Graduação
em Patologia da Universidade Federal de Ciências
da Saúde de Porto Alegre como requisito para
obtenção do grau de Doutor.
Orientador: Prof. Doutor Roberto Correa Chem
Co-Orientador: Prof. Doutora Nance Beyer Nardi
Porto Alegre,
2008
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2
Agradecimentos
Ao Professor Roberto C. Chem, chefe do Serviço de Cirurgia Plástica do
Complexo Hospitalar da Santa Casa de Misericórdia de Porto Alegre e meu
orientador, e à Professora Nance Beyer Nardi, do Departamento de Genética da
Universidade Federal do Rio Grande do Sul, verdadeiros professores e pessoas de
mente privilegiada que acreditam no estudo continuado como forma de
desenvolver novas possibilidades terapêuticas e, acima de tudo, amigos. Agradeço
pela demonstração de confiança e amizade e pelo contínuo estímulo à pesquisa,
pelos ensinamentos que permitiram a confecção desse projeto.
À Professora Marilda, por sua contribuição inestimável no
esclarecimento, disponibilidade e ensinamentos que contribuíram nesse trabalho.
À Doutora Luiza, da Fundação Estadual de Pesquisa do Rio Grande do
Sul, que sempre esteve comigo quando da necessidade de animais, pela sua
exigência ética em relação aos mesmos.
À colega Rosalva Meuer, minha colaboradora direta a qual devo muito e
que sem sua participação não poderia ter alcançado tal finalidade.
Aos funcionários do programa de pós-graduação em patologia desta
Universidade, em particular à Ivonice Oliveira Santos, pessoa de especial trato com
os alunos e que desconhece as palavras de conotações negativas como: não,
nunca, impossível, etc.
Aos alunos e colaboradores diretos e constantes Paloma D da Cruz,
Daniel Oberdoerfer, Marcelo M de Vargas, Gustavo P Filho e Flavia Heinz, que
sempre me incentivaram e são o nosso futuro.
Aos meus pais, Luiz e Diva, cujo seu exemplo de constância e
perseverança sempre procurei seguir.
E, finalmente, a uma pessoa cuja inocência não permite, ainda,
compreender tamanho esforço, mas aceitou a falta da minha presença, Luiza,
minha filha e eterna menininha a quem dedico esse trabalho.
3
LISTA DE ABREVIATURAS
FDA – Administração de drogas e alimentos dos Estados Unidos
ANOVA – Análise de variância
EPCs – Células progenitoras de endotélio
MSCs – Células-tronco mesenquimais
BSE – Encefalite espongiforme bovina
BM – Medula óssea
PECAM-CD31 – Molécula de adesão celular endotélio/plaquetas
GFP – Proteína verde fluorescente
eGFP – Proteína verde fluorescente aumentada
SCTA – Superfície corporal total atingida
4
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO.....................................................................................
2 REVISÃO DA LITERATURA................................................................
2.1 PELE.................................................................................................
2.1.1 Epiderme........................................................................................
2.1.2 Derme............................................................................................
2.2 ENGENHARIA DE TECIDOS............................................................
2.3 CÉLULAS-TRONCO..........................................................................
2.3.1 GFP (Green Fluorescence Protein)................................................
2.4 ANGIOGÊNESE................................................................................
2.4.1 Avaliação da Angiogênese - CD31/PECAM (Platelet endothelia
l
cell adhesion molecule)..........................................................................
2.4.2 Avaliação da densidade vascular – Índice de Chalkley.................
3 OBJETIVOS.........................................................................................
3.1 PRINCIPAL.......................................................................................
3.2 SECUNDÁRIOS ...............................................................................
4 MATERIAL E MÉTODOS.....................................................................
4.1 DELINEAMENTO..............................................................................
4.2 COMITÊ DE ÉTICA...........................................................................
4.3 AMOSTRAGEM................................................................................
4.4 MANUTENÇÃO.................................................................................
4.5 PROCEDIMENTO.............................................................................
4.6 GERAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO DOADORAS...........................
4.7 MATRIZ DE REGENERAÇÃO DÉRMICA........................................
4.8 MODELOS RECEPTORES DO ENXERTO......................................
4.9 SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS.............................................................
4.10 OBTENÇÃO DAS PEÇAS E PREPARO DAS LÂMINAS..............
4.11 MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA – FORMA,
LOCALIZAÇÃO E FREQUÊNCIA DAS CÉLULAS EGFP
+
.....................
4.12 AVALIAÇÃO COM MICROSCOPIA ÓTICA ...................................
4.12.1 Hematoxilina-Eosina – contagem das células no enxerto...........
4.12.2 Imuno-histoquímica – CD31
+
(PECAM).......................................
4.12.2.1 Anticorpo primário ........... .......................................................
4.12.2.2 Anticorpo secundário.................................................................
4.12.3 Quantificação das células endoteliais no enxerto .......................
5 ANÁLISE ESTATÍSTICA......................................................................
6 RESULTADOS.....................................................................................
6.1 INSPEÇÃO........................................................................................
6.2 MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA - CARACTERIZAÇÃO
DAS CÉLULAS EGFP
+
............................................................................
6.2.1 Medula total (Grupo 1) – Intervalo de 4 dias .................................
06
10
10
10
10
12
19
22
24
24
25
27
27
27
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28
28
28
28
29
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32
32
33
33
34
34
34
34
34
35
35
37
38
38
39
39
5
6.2.2 Medula total (Grupo 1) – Intervalo de 8 dias .................................
6.2.3 Mesenquimal (Grupo 2) – Intervalo de 4 dias................................
6.2.4 Mesenquimal (Grupo 2) – Intervalo de 8 dias................................
6.3 MICROSCOPIA ÓTICA....................................................................
6.3.1 Hematoxilina-Eosina – contagem das células no enxerto
(colonização)...........................................................................................
6.3.2 Imunoistoquímica - contagem das células endoteliais no enxerto
– CD31
+
(PECAM)....................................................................................
7 DISCUSSÃO........................................................................................
8 CONCLUSÕES.....................................................................................
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS.....................................................
ANEXO A - Artigo 1 – English.................................................................
ANEXO B - Artigo 1 – Português……………………………….................
ANEXO C – Testes Estatísticos Complementares.................................
40
41
41
44
44
48
53
64
65
71
85
101
6
1 INTRODUÇÃO
A prática médica atual experimenta novas modalidades terapêuticas, pelo
menos em potencialidade, nunca antes imaginadas. Essas recentes tecnologias,
ainda que no seu princípio, apresentam resultados promissores em modelos in vivo
de investigação e podem revolucionar o tratamento convencional de muitas
desordens teciduais. Isso pode alterar, profundamente, protocolos de tratamento
há muito estabelecidos, em particular no transplante de pele e na reparação
tecidual, substituindo-os por inovações com eficácia comprovada.
A tecnologia envolvida entre essas novidades inclui princípios de engenharia
tecidual e terapia celular, entre outros (59). É assim, uma alternativa terapêutica
importante para a cirurgia plástica reparadora.
Na cirurgia plástica reparadora, desde a origem de sua constituição como
arte médica, entre seus objetivos, está a reposição de tecidos perdidos por
diversas causas. Uma variedade de técnicas, como enxertos, retalhos
vascularizados, retalhos livres, retalhos pré-moldados, buscam restituir, do modo
mais natural possível partes do corpo comprometidas. Entre todos os defeitos
cutâneos, o que esgota mais facilmente tais recursos, bem como as fontes
doadoras de tal reposição, são as queimaduras extensas. Isso é especialmente
importante nos serviços que adotam a excisão precoce e cobertura imediata como
regime de tratamento. Nesses protocolos de tratamento, o que se busca é o
fechamento cutâneo mais precoce e funcional possível.
Para se ter uma imagem do seu benefício, basta lembrar que as
queimaduras são lesões freqüentes e que podem atingir toda população, em
qualquer faixa etária, com qualquer segmento sócio-econômico e com morbidade e
mortalidade elevadas.
Somente nos EUA, a cada ano, cerca de 1,4 milhão de pessoas sofre esse
tipo de trauma. Desse grupo, 54.000 necessitam de hospitalização, e 5.000 vão a
óbito (24). Toda essa população é claro, se indicado, pode precisar de considerável
quantidade de pele para a cobertura cutânea dos defeitos originados em tais
danos. Outras situações clínicas, porém, também podem ser contempladas, como
ressecções extensas, feridas crônicas e revisão cirúrgica de seqüelas cicatriciais.
A disponibilidade da cobertura cutânea, em termos de quantidade, será
7
dependente da doação autóloga, homóloga ou de substitutos cutâneos. É claro que
a primeira escolha da substituição da pele é sempre a autóloga, entretanto, caso a
extensão da lesão ultrapasse 30 a 40% de superfície corporal atingida, tal recurso
se esgota. Essa obtenção é dependente do tamanho da própria lesão, pois se
muito extensa, pode ultrapassar os limites de pele normal disponível, para sua
utilização.
Já a obtenção hómologa é dependente de doadores de múltiplos órgãos e
fica restrita à disponibilidade de bancos de tecidos e órgãos; atualmente, em nosso
país, dois principais problemas concorrem para a dificuldade de sua utilização:
ausência de lei específica determinando seu emprego na clínica médica diária e
existência de apenas dois bancos, dentro do território brasileiro que apresentam
qualidade exigida para tal atividade, a saber, nos estados de São Paulo e do Rio
Grande do Sul.
Compreende-se, assim, que a disponibilidade de pele homóloga é
facilmente ultrapassada pela sua vasta necessidade.
É, portanto, razoável pensar na possibilidade da utilização de algum
substituto cutâneo para a cobertura de tais lesões, pois, se tais defeitos cutâneos
não forem cobertos, invariavelmente seguem com dor, perda de calor, perda de
líquidos, infecção e resultam em condições de extensa fibrose, devido à disposição
aberrante do colágeno, como seqüência da cicatrização. Isso pode tornar-se
disfuncional e, até mesmo, desfigurável, o que, em outras palavras, pode ser
envolvido com altas taxas de morbidade, se ocorrer a sobrevivência no caso de
queimaduras extensas. Inversamente, se os defeitos cutâneos extensos forem logo
resolvidos, ocorre alívio da dor, redução dos procedimentos cirúrgicos e de
complicações infecciosas, o que pode ser compreendido como morbidade
atenuada (28).
Além da pele humana autóloga, os substitutos cutâneos com atividade
biológica e a incorporação de células podem, teoricamente, fornecer uma
reposição cutânea funcional, esteticamente aceitável e de modo permanente. Entre
os substitutos cutâneos, o mais utilizado e aceito em todo o mundo é a matriz de
regeneração dérmica (pele artificial - integra®), desenvolvida para utilização em
pacientes queimados e descrita por Yannas e Burke em 1980 (73).
Apesar de suas vantagens terem sido descritas como melhora na
elasticidade, menor morbidade da área doadora, resultados funcionais e estéticos
8
superiores, quando comparado a enxertos convencionais, suas desvantagens
também puderam ser demonstradas. Entre elas, encontra-se o alto custo, quando
confrontado com enxertos homológos de bancos de pele; necessidade de dois
procedimentos; a curva de aprendizado e o tempo longo à espera da neo-
vascularização (30). Modificações no substituto foram o passo seguinte, com
objetivo de buscar melhores taxas de integração (média de 80%), evitar um
segundo procedimento cirúrgico (enxerto de queratinócitos autólogos) e a
incorporação de antibióticos (diminuição da possibilidade de infecção) (51,65).
Além das modificações já mencionadas, teoricamente, poderíamos estimular a
angiogênese (neovascularização), a partir de células-tronco da medula óssea,
buscando reduzir o tempo da vascularização completa do enxerto (3-6 semanas).
Em outras palavras, a associação da engenharia tecidual com a utilização do
substituto dérmico, construído ex vivo, somado à terapia celular, às células-tronco,
e dispostos em um modelo in vivo, poderia fornecer informações importantes em
relação à neovascularização desses enxertos.
A associação de novas tecnologias usando terapia celular (células-tronco) e
estruturas biologicamente ativas resultantes da engenharia tecidual (matriz de
regeneração dérmica - integra®) poderia induzir à diferenciação celular no órgão
alvo - essa é uma hipótese a ser testada. Elas devem, entretanto, fornecer
fundamentalmente evidências que suportem uma prática clínica viável.
Experiência clínica utilizando populações celulares autólogas
indiferenciadas, como as células-tronco, obtidas por aspiração da medula óssea,
associadas com esse tipo de engenharia tecidual para a cobertura de extensos
defeitos cutâneos, não tem sido publicada até o momento.
Os métodos que utilizam a engenharia de tecidos contemplam três cenários:
1) expansão de uma população celular ex vivo antes do transplante ao
hospedeiro;
2) tentativa de criação de um tecido ou órgão ex vivo para o transplante;
3) conjunto de substâncias ou estrutura para ativação in vivo de células-
tronco, no próprio local ou à distância, para a reparação tecidual apropriada (59).
O presente estudo objetiva testar a última possibilidade descrita, isso é, a
utilização de células-tronco provenientes da medula óssea total, e uma fração da
mesma, as células-tronco mesenquimais, associada à utilização de uma matriz
dérmica (scaffold), quando enxertada em um modelo animal, portador de defeito
9
cutâneo de espessura total.
Para essa observação, pretendemos acompanhar o destino das células
doadoras, por marcadores genéticos, entre eles, a fluorescência da GFP (Green
Fluorescence Protein), na área do defeito cutâneo. Adicionalmente, serão
observadas a colonização celular da matriz por técnica de hematoxilina-eosina e a
formação de uma linhagem celular endotelial (neovascularização), por técnica de
imuno-histoquímica (marcador endotelial - PECAM/CD31). Além disso, a densidade
vascular que suportará tal enxerto, será quantificada através do índice de Chalkley
(15, 60).
Os marcadores, GFP e PECAM/CD31, bem como o índice de Chalkley
serão descritos adiante.
O objetivo desse trabalho, portanto, é estudar a angiogênese induzida no
substituto cutâneo (matriz de regeneração dérmica), a partir do implante de células-
tronco da medula óssea, em um defeito cutâneo total (simulando uma queimadura
de III grau), em modelo animal (camundongo), observando a integração do enxerto,
bem como a densidade vascular em relação à linhagem celular enxertada e ao
tempo.
10
2 REVISÃO DA LITERATURA
2.1 PELE
A pele é um órgão complexo que regula interações celulares e moleculares
dirigindo respostas cruciais ao meio ambiente. Constitui-se por um conjunto de
células derivadas de três origens embrionárias distintas, ectoderma (epiderme),
mesoderma (derme), e crista neural (melanócitos) (31). É, então, um órgão
complexo, com uma estrutura conservadora da vida, responsável pela homeostase,
e não simplesmente uma barreira protetora da perda de fluídos e de lesões
mecânicas do meio ambiente. Representa 16% do peso corporal e pode chegar a
uma superfície de até 2m², no adulto. Anatomicamente e funcionalmente apresenta
duas camadas distintas: a epiderme e a derme.
2.1.1 Epiderme
A superficial – epiderme - fornece uma barreira à infecção e à perda de
líquidos. Ela é composta por um epitélio estratificado, com uma elevada renovação
celular, sendo substituído nos seres humanos, em média, a cada 28 dias. Nela,
toda atividade proliferativa esta restrita à camada basal onde residem as células-
tronco ou progenitoras dos queratinócitos.
Os queratinócitos constituem a maioria da população celular da epiderme,
aproximadamente 90%, e são originados do ectoderma. Eles estão dispostos em
uma organização que resulta em um epitélio de células escamosas que produzem
queratina e moléculas solúveis (citoquinas).
Outras células também residem na epiderme, porém em densidade bem
menor, entre elas: melanócitos, células de Langerhans e células epidérmicas T.
2.1.2 Derme
A camada profunda, a derme, oriunda do mesoderma, é responsável pela
elasticidade e pela integridade mecânica e contém os vasos nutrientes que se
dirigem para a epiderme. É constituída de tecido conectivo e fibroblastos que
sintetizam colágeno, fibras elásticas e proteoglicanos. Sua disposição preenche
11
todo o espaço extracelular, o que confere a ela um volume significante em qualquer
tecido, pois sua espessura ultrapassa, em muito, a espessura da epiderme. Entre
suas funções, encontram-se a retenção de água, fornecendo turgor aos tecidos
moles, e de minerais, fornecendo rigidez aos tecidos esqueléticos, e também como
reservatório de fatores do crescimento controlando a proliferação celular (40).
Também estão presentes, na derme, os anexos cutâneos que, em muitas
oportunidades, são os únicos responsáveis pela reepitelização, que só ocorrerá, a
partir dos bordos de uma lesão, se a mesma não ultrapassar poucos centímetros.
Nessa condição, os anexos promovem a reepitelização por meio de populações de
células-tronco, progenitoras de queratinócitos, presentes no folículo piloso;
formando não apenas a epiderme, como também o próprio pelo e sua estrutura
completa (50).
Entre as duas camadas, há uma terceira e bem caracterizada: a membrana
de basamento ou junção dermo-epidérmica. Ela é uma estrutura dinâmica e
uniforme em sua espessura, que estabiliza a epiderme ao tecido conectivo
subjacente. A integralidade, da mesma, está diretamente ligada à velocidade de
reepitelização e estabilização do epitélio (4). A sua visualização só é possível por
meio da microscopia eletrônica.
A figura a seguir demonstra a pele em sua estrutura completa.
Figura 1: A estrutura da pele – Reproduzido de Mitchell e Lynch; 1996 (43).
12
Existe uma interação dinâmica entre as duas camadas, epiderme e derme,
modulando respostadas de vários tipos celulares. Qualquer desequilíbrio nessa
relação pode determinar inúmeros processos patológicos. Em se tratando de sua
substituição, qualquer análogo deve prover funções básicas que ativamente
estimulem a regeneração tecidual e/ou cicatrização.
2.2 ENGENHARIA DE TECIDOS
O termo Engenharia de Tecidos foi oficialmente cunhado no National
Science Foundation Workshop, nos Estados Unidos, em 1988 (6). Engenharia de
tecidos, ou tecidual, é um campo multidisciplinar que envolve princípios de
engenharia (ciência dos materiais, química, química de superfície, física,
matemática e engenharia de computação) e ciências da vida (biologia molecular,
biologia celular, transplantes, genética e cirurgia), cujo objetivo é desenvolver
projetos que permitam crescimento, restauração ou manutenção de sistemas
biológicos existentes. Esses projetos podem basicamente ser resumidos, de
acordo com sua função, em substitutos, condutores (histioconductive) ou indutores
(histioinductive) (35).
Essa associação de ciências oportunizou uma nova era terapêutica;
conseguir-se-ia, por exemplo, estimular o organismo a recrutar determinadas
células para regeneração de defeitos através dos fatores de crescimento. De outra
maneira, em um método mais sofisticado de reconstrução, poder-se-ia obter
células previamente e expandi-las ex vivo, para, na seqüência, incorporá-las em
sistemas biologicamente ativos (scaffold) e utilizá-los, associados, em sistemas in
vivo (70). A figura a seguir pode exemplificar os princípios da engenharia de
tecidos.
13
Engenharia
Genética
Engenharia
de
Tecidos
Biológico
Sub-confluente
Sintético
Confluente
Cultura celular
Expansão celular in vitro
Materiais da
matriz
Fatores
do crescimento
Reconstrução tecidual
por injeção ou
implante
Tecido autólogo,
homólogo ou heterólogo
Figura 2: Possibilidades com engenharia tecidual [reproduzido de The Anatomical
Record 263:372-378, 2001 (70)].
Independentemente dos sistemas acima descritos, todos podem participar,
de forma conjunta ou isolada, na regeneração do tecido perdido. Adicionalmente, é
imperativa a utilização de sistemas in vivo para avaliar sua eficácia, antes de sua
aplicação clínica em seres humanos (3).
De todos os modos de combinação nos sistemas descritos, a utilização de
células-tronco em matrizes (scaffolds) representou um grande progresso com a
14
visualização de sua aplicação clínica (59). Como resultado da observação,
percebeu-se que células isoladamente não podem gerar órgãos, sendo necessária
a matriz, que fornece o elemento fundamental para a organização tri-dimensional e
a diferenciação apropriadas. O que resultou na denominação de scaffold
(andaime).
Essas novidades tecnológicas vêm participando, em graus variados, do
cenário clínico, dependendo de aprovação e liberação para uso em seres humanos
pelo FDA (U.S. Food and Drug Administration) e também do volume de recursos
liberados para a pesquisa.
Muitos recursos econômicos e grupos de pesquisa estiveram dedicados, nas
duas últimas décadas, à confecção de projetos objetivando desenvolver substitutos
cutâneos para cobrir grandes defeitos da pele. Poder-se-ia, portanto, afirmar que
defeitos cutâneos já se beneficiam da engenharia de tecidos ou tecidual. Isso é
particularmente importante nos casos de queimaduras extensas, quando o tecido
cutâneo autólogo remanescente é insuficiente para a cobertura das lesões. Outras
situações clínicas, todavia, também podem ser contempladas, como ressecções
extensas, feridas crônicas e revisão cirúrgica de seqüelas cicatriciais.
Desde o final da década de 70, os médicos envolvidos no tratamento de
portadores de grandes defeitos cutâneos, entre eles as queimaduras, buscaram
seu fechamento o mais precoce possível (28). Uma vez exauridas as fontes
doadoras autóloga e homóloga da pele é razoável pensar na possibilidade da
utilização de algum substituto cutâneo para a cobertura de tais lesões. Entre as
propriedades desses substitutos, é desejável que eles, além de melhorarem as
chances de sobrevivência, forneçam substancialmente uma melhor recuperação
funcional e estética, vindo ao encontro dos objetivos de um tratamento padrão do
paciente queimado: não simples e/ou exclusivamente a sobrevivência do mesmo,
mas isso associado a uma qualidade de vida. Tal resultado se aplica em relação à
pele, percebida não mais como um tecido simples, e, sim, como um órgão
altamente complexo.
Então, o primeiro critério de um substituto cutâneo “ideal” é que suas
estrutura e características de funcionalidade sejam o mais semelhante possível da
pele (4). Desta forma, os substitutos cutâneos que objetivem o fechamento de uma
lesão, além de contemplar, total ou parcialmente, tal anatomia e função, devem
apresentar as seguintes características: não produzir toxidade, não ser
15
carcinogênico, ser esterilizável, possuir estabilidade mecânica, ser absorvível, ser
tecido condutivo e tecido indutivo e ser permeável a nutrientes e seus produtos do
catabolismo. Adicionalmente, se for absorvível, sua taxa de degradação necessita
ser equivalente ao crescimento do novo tecido no local do implante (70).
Entre os substitutos de pele mais utilizados em todo o mundo e em uso na
prática clínica diária, encontra-se a matriz de regeneração dérmica, o integra® (30).
Descrita por Yannas e Burke, em 1980, a matriz dérmica foi originalmente
desenvolvida para a utilização em pacientes com queimaduras extensas,
submetidos à excisão precoce e cobertura imediata das lesões (73).
Pelas características, o integra® trata-se de uma estrutura bilaminar
constituída de colágeno bovino e condroitina-6-sulfato (componente dérmico),
coberta em sua superfície externa com uma lâmina sintética de silicone (polímero
de polisiloxane), na espessura de 100 µm (componente epidérmico), cuja função é
impedir a perda de líquidos (0,5 ml/cm²/h). Fisicamente é uma barreira protetora.
Na sua superfície interna, encontra-se uma estrutura tridimensional, com
uma porosidade variável de 50 ± 20 µm, cujo objetivo é permitir a invasão de
células do hospedeiro, como as células inflamatórias, endoteliais e fibroblastos,
para o interior da mesma; o diâmetro dos poros é crucial para a incorporação de
tais células. Conseqüentemente, a estrutura da matriz dérmica é bio-integrada ao
organismo formando uma “neoderme” vascularizada que suportará um enxerto
epidérmico, que deve ser muito fino (0,003-0,006 polegadas de espessura), em um
intervalo de tempo variável de 3-6 semanas. Essa “neoderme”, resultante da bio-
integração com o leito receptor, é estruturalmente uma derme humana e não um
acúmulo aberrante de colágeno, como se verifica em uma cicatriz patológica (30).
Tal composto e suas características podem ser observados na figura a seguir.
16
Estrutura
tridimensional
da matriz
Figura 3: Substituto cutâneo integra®, observar a estrutura.
Poder-se-ia afirmar que a matriz de regeneração dérmica orienta, pela sua
estrutura tridimensional (scaffold), toda a conformação da reparação alvo. Tal
tecnologia resultante da engenharia tecidual considerou a importância anatômica e
funcional dos substitutos cutâneos quando utilizados em grandes defeitos de pele.
Em 1981, Burke e cols. apresentaram o primeiro estudo clínico com a
utilização da matriz de regeneração dérmica. Os autores trataram dez pacientes de
idade entre 3 e 60 anos (IM:60 anos), com queimaduras de terceiro grau
envolvendo 50% a 95% (média 77%) da superfície corporal total atingida (SCTA),
todos com lesões originadas com fogo e que tiveram uma porção significativa de
cobertura com o substituto cutâneo. O padrão terapêutico empregado foi a excisão
seqüencial, estagiada e completa das lesões, até o décimo dia após a internação.
A seguir, foi realizada a cobertura imediata com enxertos de pele autóloga,
expandida até esgotar as zonas doadoras, enquanto que as demais áreas
receberam o substituto cutâneo, o que representou de 15% a 60% (média: 27,5%)
do corpo coberto com o mesmo. Após a remoção da camada externa de silicone, a
cobertura da matriz dérmica ocorreu em um tempo de 14-46 dias (média: 26 dias).
Apesar dos autores demonstrarem complicações em três pacientes, como, por
exemplo, a formação de hematoma e seroma abaixo da placa do substituto, bem
17
como a separação prematura da camada de silicone, em nenhum dos casos foi
identificado infecção no substituto cutâneo ou em áreas adjacentes (7).
Após sete anos, um estudo multicêntrico prospectivo randomizado
envolvendo 11 centros dedicados a tratamento de queimados foi publicado em
1988 (21). Os pacientes que tinham lesões extensas e ameaçadoras à
sobrevivência foram incluídos em um protocolo de tratamento que envolvia a
excisão completa das lesões e cobertura imediata dentro da primeira semana pós-
lesão. A cobertura de sítios comparáveis, foi realizada com o substituto cutâneo,
integra® (local do estudo), ou com a cobertura convencional do investigador (local
do controle) de forma randomizada. Os materiais dispensados nos sítios de
controle foram enxertos autólogos, homólogos, heterólogos ou curativo sintético.
Os pacientes originalmente envolvidos foram 149, todos com consentimento
informado. Do total, seis foram a óbito, e 37 foram excluídos por alguma razão de
violação do protocolo estabelecido. Para análise final, preencheram os critérios 136
sítios de cobertura em 106 pacientes. Desse grupo, 14 pacientes morreram após a
integração da cobertura cutânea ter sido alcançada e, por conseqüência, foram
excluídos; dez pacientes desistiram do estudo, tendo sido excluídos pela
impossibilidade de seguimento. Dos 82 pacientes restantes, 59 foram
acompanhados, no mínimo, por nove meses, e 26 do grupo por pelo menos um
ano após a cicatrização completa. Como vantagens, os autores declararam que a
matriz dérmica fornecia uma aparência melhor em relação aos enxertos em malha;
quando comparada aos enxertos homólogos, a matriz se integrava favoravelmente
como os mesmos, não acrescentando risco de infecção viral, não sofrendo rejeição
e não precisando ser removida. Como desvantagens, verificaram-se a extrema
fragilidade à infecção e/ou contaminação grosseira e a necessidade de um
segundo procedimento cirúrgico para o enxerto epidérmico. Os autores concluíram
que, em pacientes com extensas lesões cutâneas a matriz dérmica permite o
fechamento precoce equivalente ao homoenxerto. Ao receber o enxerto epidérmico
autólogo, fornece uma cobertura permanente tão boa quanto às técnicas de
enxerto de pele usual e, por utilizar áreas doadoras de pele muito fina, favorece
sua recuperação de forma muito mais rápida, quando comparada à prática comum
de enxertia autóloga (25).
Inúmeros trabalhos foram divulgados a partir dessa experiência, relatando
graus variáveis de sucesso bem como, complicações. Sheridan e cols., em 1994,
18
publicaram a experiência de uma década com o uso do integra®, no
Massachusetts General Hospital and the Boston Unit of Shriners Burn Institute. O
estudo envolveu 121 pacientes, com idade entre 2 e 90 anos (IM = 44 anos), com
queimaduras de extensão entre 1% e 98% (média de SCTA = 55%) e com um
número de 87 pacientes sobreviventes. Desse número, 70 pacientes tiveram
seguimento por 5,45 anos, e seus resultados indicaram uma taxa média de
integração do enxerto de 80%. Adicionalmente, os autores reportaram que, em
93% dos pacientes, a cicatrização hipertrófica era mínima ou mesmo ausente. Na
opinião dos pacientes, as áreas enxertadas com a matriz dérmica (integra®) foram
superiores do ponto de vista estético do que aquelas enxertadas com pele autóloga
isoladamente, embora, em nenhum dos casos, tenha sido idêntica à pele normal
(61).
As vantagens com a sua utilização foram, então, descritas como:
disponibilidade para o uso imediato em quantidades ilimitadas, fechamento
fisiológico do defeito cutâneo, melhora na elasticidade e estética, redução da
morbidade na área doadora de pele, com a recuperação mais rápida e com menor
seqüela, quando comparada a enxertos de pele comumente empregados.
As principais desvantagens do seu uso são: seu alto custo, quando
comparada a enxertos autólogos e/ou homólogos, tempo de espera para a
vascularização relativamente longo (3 a 6 semanas), a necessidade de um enxerto
autólogo, mesmo que bastante fino, e necessidade de dois procedimentos
cirúrgicos.
É, portanto, lógico pensar que alguma modificação nessa matriz dérmica,
com o objetivo de aumentar a taxa de integração (média de 80%), de melhorar sua
vascularização, diminuindo o intervalo de espera da “neoderme” vascularizada, ou
mesmo de abolir o segundo procedimento cirúrgico, seria de caráter prático. Uma
vez que custos hospitalares poderiam ser reduzidos, riscos de complicações
associados com os procedimentos cirúrgicos da mesma forma seriam diminuídos
e, finalmente, o tempo em que o paciente ficaria disponível à bio-integração do seu
enxerto poderia ser abreviado.
Algumas dessas modificações objetivando a cicatrização, já estão em
estudo tanto in vivo como in vitro, como a incorporação de peptídeos na matriz
(22), o uso de queratinócitos autólogos (51) e a utilização simultânea do enxerto
epidérmico e dérrmico (65), sem, contudo, terem sido utilizadas em humanos.
19
Também a cola de fibrina e a terapia com pressão negativa têm sido empregadas
com o objetivo de melhorar a taxa de integração e o tempo de vascularização,
mesmo em lesões complicadas (29).
Então, teoricamente, uma modificação com objetivo de estimular a
vascularização precoce in vivo, angiogênese que pudesse abreviar esse tempo e,
também, ser induzida em termos de densidade poder-se-ia afirmar como benéfica.
2.3 CÉLULAS-TRONCO
Simultaneamente à progressiva experiência clínica com os produtos da
engenharia de tecido, ocorreu um aumento na compreensão da biologia das
células-tronco, de modo que a exploração do seu potencial terapêutico em diversos
campos de tratamento tornou-se uma opção exeqüível. Atualmente, quando se
refere aos métodos terapêuticos modernos, é provável que estejam incluídos todos
esses elementos: engenharia de tecidos, terapia celular ou células-tronco.
O termo célula-tronco tem sido utilizado para descrever um tipo de célula
indiferenciada com capacidade de se manter por um longo período de tempo, bem
como se diferenciar em uma célula especializada e funcional (13). Esse, talvez,
seja o conceito mais simples de células-tronco com o qual, muitos autores
concordam - propriedade de auto-renovação e diferenciação. Além dessa
definição, termina toda a concordância em relação à significação das mesmas (52).
O termo célula-tronco adulta é utilizado para se diferenciar de qualquer
célula multipotente embrionária ou célula primordial germinativa. Elas estão
presentes em todos os organismos, são responsáveis pela manutenção da vida e
mostram-se, envolvidas na reparação de lesão de órgãos e tecidos. Inicialmente
descritas como órgão-restrita, isso é, comprometidas apenas com a reparação no
seu local de derivação, diversas evidências sugerem que células-tronco adulta são,
na realidade, multipotentes e podem se diferenciar em vários tecidos, tanto in vitro,
quanto in vivo, muito além de suas fronteiras. Elas, portanto, são comparáveis às
células embrionárias, sendo essa função denominada de ¨plasticidade celular¨.
Medula óssea, cérebro, músculo esquelético, fígado, pâncreas, gordura,
pele, em todos esses locais, tem sido possível a demonstração da existência de
células-tronco ou progenitoras, com capacidade de se diferenciar em outros tipos
celulares além do seu tecido de origem.
20
Entre todas as células-tronco conhecidas, as células progenitores da medula
óssea têm revelado o mais alto potencial quanto à diferenciação em múltiplas
linhagens, bem como à integração funcional das mesmas em modelos de
hospedeiro (5). Apesar de que presente em todos os tecidos, sua disponibilidade é
limitada especialmente por sua acessibilidade; é no sangue periférico, cordão
umbilical e medula óssea, contudo, que se encontram as fontes mais acessíveis e
que forneceram as maiores informações.
A célula-tronco adulta, portanto, foi definida primeiramente no sistema
hematopoético, e seu potencial é ainda o mais conhecido dentro de todas as
células-tronco. Hoje as células-tronco adultas do sistema hematopoético são,
rotineiramente, isoladas do sangue periférico, cordão umbilical e medula óssea.
O interesse em tais células cresceu de modo significativo quando os
trabalhos de Kocher e cols. e Orlic e cols., ambos em 2001, puderam demonstrar
que, células-tronco derivadas da medula óssea, não somente reconstituíam o
sistema hematopoético, mas também eram capazes de contribuir para a
regeneração do músculo cardíaco após infarto (36, 49).
Também foi demonstrada a sua diferenciação em mioblastos (19), endotélio
(42), fígado, ducto biliar (55), pulmão, intestino (41) ou mesmo em tecido neural
(38). Além disso, também foi descrito que células-tronco hematopoéticas podem se
diferenciar in vitro em células progenitores neurais e miogênicas (33, 62).
Uma perspectiva importante foi a demonstração de que células-tronco,
derivadas da medula óssea, quando utilizadas em um ambiente patológico como
uma ferida crônica, podem participar na modulação da cicatrização. Se verdadeiro,
tal conhecimento teria um impacto no tratamento de feridas.
De Londres, Navsaria e cols., em 2004, publicaram um relato de caso com
uma idéia inovadora. Cobriram uma queimadura de espessura total no escalpo de
um paciente de 26 anos, em uma extensão de 10 x 8 cm, com matriz de
regeneração dérmica, integra®. A inovação foi que, no décimo-segundo dia após o
implante, através de microenxertos, transplantaram folículos pilosos autólogos por
meio do silicone da matriz. Sua base teórica era de que poderiam obter uma
reepitelização a partir de células-tronco localizadas na camada externa da bainha
do folículo. Se fosse possível, conseguiriam uma reepitelização semelhante à de
uma queimadura de espessura parcial; sem a necessidade de um enxerto autólogo
fino. Apesar do tempo necessário e da densidade celular inferior à pele adjacente
21
normal, os autores encontraram uma reepitelização completa (46). Embora o
método do enxerto de folículos pilosos não seja uma novidade, sua associação
com engenharia tecidual objetivando provocar células-tronco, do próprio folículo
piloso, a se diferenciarem em epiderme enfatiza a possibilidade da utilização
dessas ferramentas em situações clínicas de difícil solução. Mais uma vez se
enfatizou o tempo, considerado relativamente longo, necessário para a
neovascularização.
Na Coréia Han e cols., 2005, demonstraram que o emprego de células-
tronco da medula óssea como terapia celular é promotor de cicatrização, capaz de
sintetizar matriz extracelular, incluindo colágeno, fibronectina e laminina (23).
Uma consideração importante é que, nesses estudos, o verdadeiro
mecanismo pelo qual, tais células são recrutadas e se diferenciam não está
devidamente esclarecido, entretanto vários autores concordam que a lesão tecidual
pode ter um papel fundamental. A concentração de células-tronco no local de dano
tecidual está relacionada com a reparação do mesmo, como evidenciou Orlic e
cols., em 2001 (49). Assim, o microambiente pode sinalizar em favor de sua
reparação no recrutamento de tais células, por meio dos fatores de crescimento. A
figura a seguir demonstra o possível papel das células-tronco na reparação
tecidual.
Figura 4: Hipótese de como as células-tronco são recrutadas para o sítio da lesão
Reproduzido de Körbling e Estrov , 2003 (37).
22
Apesar da experiência inicial com a terapia celular, através das células-
tronco, ser pequena as perspectivas são promissoras. Considerando que células-
tronco, por definição, têm propriedade de auto-renovação, plasticidade e
diferenciação, é excitante a possibilidade de testar esses conhecimentos em busca
de uma alternativa terapêutica que possa aliviar a morbidade e mortalidade dos
pacientes portadores de extensas lesões cutâneas. Além disso, a medula óssea é
uma fonte importante de células-tronco, e sua acessibilidade pode ser alcançada
com segurança (5). Uma prova importante, em estudos in vivo, é, porém, a
demonstração de que tais células transplantadas estão no microambiente, isso é
desenvolveram ¨homing¨ no local alvo da reparação. Entre as técnicas publicadas,
para tal seguimento, encontram-se os marcadores transgenéticos, que expressam
fluorescência, sob condições específicas, como a GFP (Green Fluorescence
Protein).
2.3.1 GFP (Proteína verde fluorescente)
A GFP foi descoberta por Shimomura e cols. a partir da luminosidade da
Aequorea Victoria, no inicio da década de 70. Tal proteína demonstrou emitir
fluorescência verde clara, sob luz ultravioleta (63).
Somente três décadas depois, foi possível sua clonagem e a demonstração
de sua utilidade em outros organismos além do original. Essa propriedade de
fluorescência de determinadas proteínas incorporou uma ferramenta importante
como marcador de expressão genética em muitas áreas da biologia (11).
A GFP pode ser detectada nas células vivas e é largamente utilizada em
diversas áreas de pesquisa, como a terapia genética, celular, entre outras. Ela
permitiu acompanhar e revelar vários processos biológicos, sendo um dos
marcadores mais utilizados na pesquisa genética atualmente (71). Essa técnica
também é viável no seguimento de células-tronco enxertadas em seu destino à
diferenciação, como afirmou Verfaillie, em 2004 (68).
Tais características de luminosidade expressa por células GFP
+
, oriundas da
medula óssea, podem ser observadas na figura 5, onde se pode observar sua
localização através da microscopia de fluorescência.
23
Figura 5. Células eGFP
+
(de cor verde) entre as fibras da matriz dérmica (de cor
verde amarelada), na microscopia de fluorescência (aumento de 40x).
2.4 ANGIOGÊNESE
Durante o desenvolvimento embrionário, os vasos sangüíneos são reunidos
em uma rede vascular primitiva, fenômeno denominado de vasculogênese, a partir
de células precursoras endoteliais, os angioblastos. Isso deve ser diferenciado da
formação vascular pós-nascimento, que é denominada de angiogênese ou neo-
vascularização.
A angiogênese é fundamental em processos biológicos como o crescimento
tumoral, fibrose, inflamação e zonas de isquemia. Se por um lado a neo-
vascularização é indesejável (crescimento tumoral, metástases), ela poderá ser
altamente necessária em alguns processos, entre eles, a integração de enxertos.
Se condições apropriadas forem ofertadas, é possível a indução do
crescimento vascular em determinada área, processo conhecido como
¨Vasculogênese Terapêutica¨ (10). Esse é o termo utilizado para se referir ao
aumento da densidade vascular usando terapia celular e tem gerado interesse em
uma variedade de condições clínicas.
Células progenitoras a partir de aspirados da medula óssea, cordão
umbilical ou sangue periférico podem ser reintroduzidas na circulação ou em
tecidos isquêmicos e manter sua habilidade de participar no desenvolvimento de
24
vasos sangüíneos nos locais de isquemia ou lesão vascular. Devido ao número
limitado de células autólogas progenitoras de endotélio (EPCs – Endothelial
progenitor cells) no cordão umbilical e/ou sangue periférico, grande atenção tem
sido direcionada à medula óssea total (74).
Foi demonstrado, adicionalmente, que as células progenitoras endoteliais
pós-nascimento (EPCs) dividem um ascendente comum com o sistema
hematopoético, o hemangioblasto. Também, de igual modo, seus descendentes
dividem os mesmos marcadores, estando armazenados na medula óssea de
organismos adultos (58).
No que se refere à utilização dos substitutos cutâneos em tal situação, sua
integração é vitalmente dependente da circulação sangüínea. Poder-se-ia afirmar
que qualquer estímulo em direção à angiogênese, ou neovascularização, é
altamente desejável, uma vez que o tempo de espera pela irrigação sangüínea
completa ainda é extremamente longo, de aproximadamente quatro semanas (44).
Além disso, a medula óssea possui células precursoras de células
endoteliais, tipo angioblastos, que têm a capacidade de circular, proliferar e se
diferenciar em células endoteliais maduras, como descreveu Rafii, em 2000 (56).
Também deve ser enfatizado que, na prática clínica diária, a medula óssea é
acessada de forma rotineira, com morbidade bastante baixa.
Esse potencial terapêutico poderia, em teoria, ser explorado pela obtenção
de tais células, visando induzir uma neovascularização precoce e consistente. De
igual modo, elas poderiam encontrar condições adequadas (microambiente), para
se diferenciarem em células especializadas de outras linhagens.
O que se busca, em se tratando de lesões de espessura profunda da pele,
na sua substituição, é, sim, uma composição que envolva suas duas camadas.
Entre as qualidades de tal composição, como descrito anteriormente, a estabilidade
é fundamental, bem como, a correta polaridade celular que pode ser obtida com o
uso de estruturas tridimensionais (matriz de regeneração dérmica), como scaffolds
e, é claro, com uma vascularização efetiva.
2.4.1 Avaliação da Angiogênese - CD31/PECAM (Platelet endothelial cell
adhesion molecule)
A formação vascular pós-nascimento pode ser acompanhada, em diversos
25
processos por marcadores de endotélio mais específicos, e, entre eles, o CD31. A
molécula de adesão celular plaqueta-endotelial (PECAM-1/CD31) pertence à
superfamília das imunoglobulinas e são expressas, fracamente, na superfície de
plaquetas circulantes, monócitos, neutrófilos e subpopulações de células T. Ela é,
também, o maior constituinte da junção intercelular das células endoteliais (47).
A partir de sua clonagem (clone MEC 13,3) em 1987, muito tem sido
descrito sobre a estrutura desse receptor celular de adesão e sua função nas
células vasculares. Foi demonstrado que essa molécula está concentrada em altos
níveis nas células endoteliais e implicada na angiogênese (75), sendo também
encontrada nas plaquetas e leucócitos, onde está concentrada nos bordos célula-
célula. Entre suas aplicações testadas encontram-se o baço, pulmão, coração e
timo de camundongos (17).
A expressão do CD31 pode ser observada no exemplo da figura 6, por meio
da técnica de imuno-histoquímica.
Figura 6. Imuno-histoquímica de corte do enxerto, a seta demonstra a expressão
do CD31 (cor marrom), entre as fibras do integra® (Aumento de 200x).
2.4.2 Avaliação da densidade vascular – Índice de Chalkley
26
A contagem da densidade vascular envolve algumas variáveis e, entre elas,
problemas de reprodutibilidade somados à dificuldade de determinar parâmetros
vasculares adotados. Entretanto é a partir de estudos da vascularização no
crescimento tumoral que se desenvolveram métodos de contagem de microvasos
no campo microscópico, como o descrito por Chalkley, 1943 (12) e, posteriormente,
modificado por Salgado e cols., 2007 (60).
Para a cicatrização, órgãos, enxertos, tecidos assim como tumores, todos
necessitam de neovascularização e, portanto tal contagem oferece uma estimativa
do resultado das fases da angiogênese. Essas informações foram padronizadas
em um consenso de metodologia e critérios de avaliação da angiogênese em
tumores sólidos, Vermeulen e cols., 2002 (69). Não há padronização descrita para
a avaliação vascular nos casos de enxertos, entretanto a sobrevivência dos
mesmos, assim como o crescimento tumoral, está diretamente relacionada à
intensidade da vascularização efetiva. Entre as modalidades de avaliação
encontra-se a utilização de marcadores de endotélio CD31 (Pecam). Esses
conhecimentos fundamentaram nossa contagem pelo método de Chalkley
modificado, que será descrito adiante. Um exemplo da lâmina com seus pontos
coincidentes com vasos podem ser observados na figura a seguir.
Figura 7. Demonstração da lâmina graticulada para avaliação da densidade
vascular. Reproduzido de Steinbjorn e cols., 2000 (66).
27
3 OBJETIVOS
3.1 PRINCIPAL
Avaliar a capacidade das células-tronco da medula óssea em promover
neovascularização e reparação tecidual, quando associadas à matriz de
regeneração dérmica no tratamento de defeito cutâneo, de espessura total, em
modelo in vivo .
3.2 SECUNDÁRIOS
Avaliar a cicatrização dos enxertos;
Avaliar a colonização celular dos enxertos;
Avaliar a colonização com células marcadas com eGFP
+
;
Avaliar a densidade vascular dos enxertos que receberam células-tronco
da medula total;
Avaliar a densidade vascular dos enxertos que receberam células-tronco
da fração mesenquimal;
Avaliar as relações das duas populações celulares, quando considerados
a vascularização e o tempo.
28
4 MATERIAL E MÉTODO
4.1 DELINEAMENTO
Estudo experimental pré-clínico.
4.2 COMITÊ DE ÉTICA
O desenvolvimento do trabalho só teve início, após a aprovação e liberação
pelo Comitê de Ética em Pesquisa, do Ministério da Educação – Fundação
Faculdade Federal de Ciências Médicas de Porto Alegre. O documento of.175/06-
CEP, do processo número 054/05 da reunião de 09 de fevereiro de 2006, bem
como o parecer consubstanciado nº137 encontra-se no anexo I.
4.3 AMOSTRAGEM
Foram utilizados 72 camundongos isogênicos, da linhagem C57Bl/6, de
ambos os sexos, com idade média de oito semanas e peso médio igual a 30
gramas. Os animais foram fornecidos pelo biotério da Fundação Estadual de
Produção e Pesquisa em Saúde do Rio Grande do Sul.
4.4 MANUTENÇÃO
A utilização e o manuseio do modelo animal permaneceram dentro dos
critérios que estabelece a lei n° 6.638, de 08 de maio de 1979, bem como foram
observados os princípios éticos na experimentação animal. Inicialmente
acomodados em gaiolas separadas, os animais foram alimentados com ração,
tendo livre acesso à água, durante três dias. Forneceram-se ração e água, de
acordo com o protocolo do Colégio Brasileiro de Experimentação Animal, sob o
seguinte regime: em torno de 5g/dia/animal e 6ml/dia/animal, respectivamente.
Também foram observadas as condições de ambiente, como: temperatura, luz,
ventilação, ruído e qualidade do ar. Dispostas individualmente, as gaiolas
apresentavam dimensão mínima de 60cm², sendo que o material utilizado para a
cama foi a serragem seca.
29
4.5 PROCEDIMENTO
Para a técnica cirúrgica, os animais foram anestesiados com Ketamina
(1,16g/10ml) e Xilasina (2,3g/100ml), associadas e diluídas em soro fisiológico (1ml
de Ketamina + 1ml de Xilasina para 8 ml de soro fisiológico). Utilizou-se 0,1 ml da
solução para cada 10mg/peso do animal (recomendado pelo Institutional Animal
Care and Use Committees – IACUC, USA), via intraperitonial. Após, em condições
de anestesia, os animais foram depilados e uma lesão, no dorso, de 1,5 x 1,5cm
(correspondente a 10% de SCTA), foi produzida através da excisão com lâmina de
bisturi, removendo a pele até a fáscia muscular, sob condições e observância de
técnicas cirúrgicas (figuras 8 e 9). O defeito foi imediatamente recoberto por uma
placa de matriz de regeneração dérmica (Integra®) de 1,5 x 1,5cm, fixada à pele
normal adjacente com sutura contínua, utilizando o fio mononylon 6-0, modelo
descrito por Kremer e cols., em 2000 (39).
A seguir, as células-tronco foram inoculadas abaixo da matriz dérmica, isso
é, entre o defeito cutâneo e a matriz enxertada com a utilização de micropipeta
(figura 10). Todos os animais receberam, de acordo com o protocolo estabelecido,
a mesma densidade celular, ou seja, uma população celular de 1 x 10
6
células/ml e
1ml/animal independentemente se oriundas da medula total ou da fração
mesenquimal. Os controles seguiram idêntico procedimento e receberam, abaixo
da matriz, apenas o veículo das células-tronco (metil-celulose) sem a presença das
mesmas. Nenhum curativo adicional foi utilizado sobre o enxerto.
Logo depois, os animais retornaram para suas gaiolas, as quais eram
devidamente identificadas de acordo com o tipo de tratamento e número dentro do
grupo. Todos os enxertos permaneceram completamente expostos, para
visualização diária dos mesmos em cada animal e durante todo o período.
30
Figura 8. A demarcação da lesão (±2,25cm
2
).
Figura 9. Lesão de espessura total.
31
Figura 10. Transplante de células-tronco com micro-pipeta.
4.6 GERAÇÃO DE CÉLULAS-TRONCO DOADORAS
As células foram provenientes de camundongos C57Bl/6 eGFP
+
(Green
mouse FM131) e que foram gentilmente cedidos pelo Dr M. Okabe, da Osaka
University, Japão. O modelo animal, geneticamente modificado, para o gene
eGFP
+
(Enhanced Green Fluorescent Protein), confere fluorescência na cor verde
às células quando expostas à luz ultravioleta (veja figura 11).
Foram utilizadas duas populações celulares, a saber:
1. Células da medula óssea total
2. Células-tronco mesenquimais, isoladas e cultivadas conforme descrito
por da Silva Meirelles e cols., 2006 (16).
As células foram gentilmente fornecidas pela Dra. Nance Beyer Nardi do
laboratório de imunogenética do Departamento de Genética da Universidade
Federal do Rio Grande do Sul.
32
Figura 11. Modelo animal doador da linhagem C57Bl/6 eGFP
+
quê sob luz
ultravioleta mostra fluorescência observável para emissão de coloração verde.
4.7 MATRIZ DE REGENERAÇÃO DÉRMICA
As peças da matriz de regeneração dérmica, que foram utilizadas como
enxertos, são provenientes de sobras de recortes cirúrgicos utilizados em casos
clínicos e que foram devidamente acondicionadas em álcool isopropílico em
frascos esterilizados. Dessa maneira, não configura conflito de interesses, uma vez
que não houve doação do fabricante.
4.8 MODELOS RECEPTORES DO ENXERTO
Camundongos isogênicos da linhagem C57BL/6 (n=72) foram utilizados e
submetidos à lesão de pele total no dorso, simulando uma queimadura de terceiro
grau, conforme descrito anteriormente. Os animais foram alocados em 8 grupos,
cada um com 6 animais tratados e 3 controles, totalizando uma amostra de 72
animais.
Os grupos 1, 2, 5 e 6 foram submetidos ao transplante com células da
medula total (BM), sendo sacrificados nos dias 4, 8, 12 e 16 respectivamente. Os
grupos de números 3, 4, 7 e 8 foram submetidos ao transplante com células
mesenquimais (MSC), sendo sacrificados nos dias 4, 8, 12 e 16 respectivamente.
O modelo do animal receptor pode ser observado na figura 12.
33
Figura 12. Modelo animal receptor da linhagem C57BL/6.
4.9 SACRIFÍCIO DOS ANIMAIS
Os animais foram manipulados gentilmente, e o sacrifício foi realizado com a
exposição em tenda de monóxido de carbono, pelo período mínimo de cinco
minutos. Todos os animais foram igualmente submetidos ao mesmo padrão de
sacrifício. Após a retirada da peça, os mesmos foram descartados.
4.10 OBTENÇÃO DAS PEÇAS E PREPARO DAS LÂMINAS
Após o sacrifício, um fragmento de 2,25cm² contendo pele normal, transição
pele-enxerto e enxerto, foi removido de cada animal. A metade do fragmento foi
fixada em paraformaldeído 4% tamponado (pH= 7,4), por 16 horas. Em seguida,
consecutivamente, permaneceu por 24 horas, em solução de sacarose 15% e, por
24 horas, em solução de sacarose 30%.
A partir de cada peça, foram confeccionadas dez lâminas, cada uma com
três secções de quatro micrômetros obtidas no criostato. Uma lâmina recebeu
coloração de hematoxilina-eosina para avaliação histológica, e duas outras foram
montadas com glicerina tamponada para contagem das células fluorescentes em
microscópio de epifluorescência. As metades restantes foram guardadas a –20ºC,
34
para posterior realização de técnica de imuno-histoquímica para avaliação da
densidade microvascular.
4.11 MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA – FORMA, LOCALIZAÇÃO E
FREQUÊNCIA DAS CÉLULAS eGFP
+
O número de células eGFP
+
/campo do microscópico foi analisado pela
observação, em média, de dez campos por secção, três secções por amostra, com
aumento de 40 x. A forma das células, e sua localização (preferencialmente no
enxerto ou no leito) também foram observadas.
4.12 AVALIAÇÃO COM MICROSCOPIA ÓTICA
4.12.1 Hematoxilina-Eosina – contagem das células no enxerto
De cada lâmina, foram contados os números de células em três campos
(aumento de 40 x), entre as fibras da matriz de regeneração dérmica, sendo as
médias e desvios padrões (DP) destas três contagens apresentados em formas de
tabelas e, as diferenças com significância em gráfico. As contagens foram cegas
(sem identificação dos animais das quais procediam), sendo os valores em geral,
confirmados por análise independente realizada por um segundo observador.
4.12.2 Imuno-histoquímica – CD31
+
(PECAM)
4.12.2.1 Anticorpo primário
O anticorpo utilizado foi o MEC 13.3/ CD-31 [(Rat Anti-Mouse
CD31(PECAM-1), anticorpo monoclonal para imuno-histoquímica na diluição: 1/50]
que reage com a molécula CD31, também conhecida como PECAM-1 (Platelet
endothelial cell adhesion molecule) cujas características foram descritas
anteriormente.
4.12.2.2 Anticorpo secundário
35
Como anticorpo secundário foi utilizado o Biotin-Conjugated Goat Anti-Rat Ig
specific policlonal Antibody. Sua diluição foi a mesma do primário (1/50), ambos do
mesmo Laboratório, (Lab. BDPharmingenBD Biosciences-www.bdbiosciences.com;
United States).
4.12.3 Quantificação das células endoteliais no enxerto
Para a avaliação da densidade endotelial foi utilizado o índice de Chalkley,
que consiste na utilização de uma lente graticulada com 25 pontos distribuídos
aleatoriamente em uma área determinada (0,196mm²), e aclopada à ocular do foto-
microscópio (OLYMPUS BX40), conforme descrito por da Rocha, em 2006 (15) e
posteriormente por Salgado e cols., em 2007 (60). A lente pode ser acomodada em
qualquer posição, de modo a captar o melhor ângulo visual. A escolha do campo
para avaliação da densidade vascular ocorreu da maneira descrita a seguir.
Em um menor aumento (100x), toda a lâmina foi inspecionada, em todos os
cortes, com objetivo de selecionar uma área com micro vasos presentes (hot-spot).
A seguir, em um aumento de 200x, posiciona-se a lente sobre a lâmina até que o
maior número de vasos, grupo de células endoteliais ou luz de micro vasos sejam
coicidentes. Todos os pontos que coicidiram nos três cortes da lâmina são
considerados, ou seja, em três hot-spots por caso. A média dos três campos
corresponderá ao índice de Chalkley. A modificação na técnica, ocorreu da
seguinte maneira: a imagem com os pontos foi capturada para ser reproduzida em
um filme transparente, em tamanho proporcional às fotografias obtidas, no
microscópio, na ampliação de 200x. Então, o filme foi colocado sobre as imagens
sendo realizada a contagem por um pesquisador independente, cego para a
origem das peças e dos controles, reproduzindo a metodologia descrita por
Salgado e cols., 2007 (60). Um exemplo da distribuição dos pontos pode ser
observado na figura a seguir.
36
Figura 13. Demonstração da distribuição dos pontos.
37
5 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os valores foram expressos como médias, desvio padrão, valores máximo e
mínimo. A comparação das médias foi realizada por análise da variância (ANOVA)
seguida do teste de post-hoc de Duncan. Adicionalmente, os achados foram
confirmados pelos testes robustos (estimativa robusta de erro padrão) de Welch e
Brown-Forsythe. O nível de significância adotado no estudo foi de 5% (p<0,05). Os
dados foram analisados com o programa SPSS (versão 12.0 – SPSS, Chicago, IL,
USA).
Os dados completos e testes adicionais encontram-se no anexo C.
38
6 RESULTADOS
A amostra incluiu 72 animais receptores (camundongo C57BL/6), que foram
acompanhados e divididos em quatro pontos de intervalo: a saber, 4, 8, 12 e 16
dias (n=6), alocados nos seus grupos. Para efeito de demonstração, os grupos
foram denominados da seguinte forma: 0 ou controle (somente o veículo – metil-
celulose); 1 ou tratamento com células da medula total e 2 ou tratamento com
células mesenquimais. Todos os animais sobreviveram dentro de seu grupo de
estudo respectivamente. Os animais receberam a mesma densidade celular com o
mesmo volume (1 X 10
6
cél/ml e 1ml/animal). Foram avaliados com a inspeção,
microscopia de fluorescência para a avaliação da densidade celular das células
eGFP
+
e também, microscopia ótica (Hematoxilina-Eosina e imuno-histoquímica).
6.1 INSPEÇÃO
Todas lesões foram cobertas com o enxerto de matriz dérmica,
imediatamente após a produção da lesão.
Dos 72 animais, em 71 (98,61%) o enxerto se manteve estável. Em um
animal do grupo de 16 dias, houve descolamento da lâmina de silicone e de forma
parcial, não compremetendo a matriz subjacente que, nesse período de estudo,
mostrava-se totalmente integrada. Não se observou hematoma, seroma ou sinais
de infecção em nenhum dos casos. Utilizamos o critério clínico da coloração
(pêssego) para identificar integração completa do enxerto, o que encontramos em
todos os casos (tratados e controles) com 12 dias e principalmente aos 16 dias. A
figura 14 demonstra um exemplo da matriz integrada.
39
Figura 14. Exemplo da integração da matriz identificado pelo aspecto da coloração
em tom pêssego.
6.2 MICROSCOPIA DE FLUORESCÊNCIA - CARACTERIZAÇÃO DAS CÉLULAS
eGFP
+
6.2.1 Medula total (Grupo 1) – Intervalo de 4 dias
Nesse grupo, a densidade celular média encontrada foi de 7,32 ±
1,75/campo. A localização preferencial das células eGFP
+
foi observada entre as
fibras do enxerto e sua forma era variada, mais freqüentemente arredondada ou
ovalada, como pode ser observado na figura 15.
40
Figura 15. Forma arredondada (verde escuro) da célula-tronco eGFP
+
da medula
total identificada e posicionada entre as fibras do enxerto na cor verde
claro (Aumento de 400x).
6.2.2 Medula total (Grupo 1) – Intervalo de 8 dias
Nesse grupo, as células proliferaram e sua localização ocorreu
prioritariamente entre as fibras da matriz (figura 16A), mas algumas células foram
também observadas no tecido adjacente (figura 16B). Em relação a seu formato se
identificou uma forma variada, mais frequentemente arredondada ou ovalada.
Quanto à sua densidade média encontrou-se 24,68 ± 4,09 células/campo.
A B
Figura 16. A. Células eGFP
+
localizadas entre a estrutura da matriz. B.
Células eGFP
+
localizadas no tecido adjacente (leito da lesão) (Aumento de 400x).
41
6.2.3 Mesenquimal (Grupo 2) – Intervalo de 4 dias
Nesse grupo, a localização preferencial de células mesenquimais foi logo
abaixo da matriz, entre as primeiras células do tecido subjacente; não foram
localizadas células no enxerto em si. Em relação a sua configuração observou-se
uma forma bem alongada. A densidade celular média encontrada foi de 2,05 ±
0,97/campo. A figura 17 demonstra essas características.
Matriz MSC
Figura 17. Células eGFP
+
mesenquimais (MSC) encontradas abaixo da matriz
entre as primeiras células do tecido subjacente (Aumento de 400x).
6.2.4 Mesenquimal (Grupo 2) – Intervalo de 8 dias
Nesse grupo, a localização das células mesnquimais eGFP
+
ocorreu na
camada de células subjacente ao enxerto; não foram localizadas células no enxerto
em si ou em camadas mais profundas. Em relação à sua configuração, observou-
se uma forma variada, mas mais frequentemente estrelada, semelhante à das
MSCs in vitro. Quanto a sua densidade celular média encontrada foi de 15,33 ±
3,49 células/campo. A figura 18 demonstra essas características.
42
Figura 18. Forma e localização das MSC eGFP
+
com 8 dias. Observa-se que as
células mesenquimais de cor verde claro apresenta uma forma estrelada,
localizando-se no tecido subjacente (Aumento de 400x).
Nos intervalos de 12 e 16 dias a densidade celular do grupo 1 (da medula
total) foi inexpressiva, algumas células eGFP
+
foram observadas no tecido em
regeneração.
Em relação ao grupo 2, nesses intervalos, o resultado é variável. Em
aproximadamente 50% dos animais, poucas células eGFP
+
foram visíveis. Nos
demais, foram visualizados grupos localizados (“clusters”) de células eGFP
+
,
compactadas em sentido longitudinal ou formando grupos concêntricos. Nos
períodos 12 e 16 dias, em ambos os grupos, não foi possível realizar a sua
quantificação.
A descrição da densidade celular das células eGFP
+
, nos dois grupos e nos
intervalos que foram avaliados pode ser observada na tabela 1.
43
Tabela 1
Descrição da densidade das células eGFP
+
para medula total (grupo 1) e
mesenquimal (grupo 2) (IC=95%).
Grupo N Densidade
cel/média
Desvio
padrão
Erro
padrão
Limite
inferior
Limite
superior
Dia 4
1 4 7,32 1,76 0,88 4,52 10,12
2 6 2,05 0,97 0,40 1,02 3,07
Total 10 4,16 3,0 0,94 2,01 6,30
Dia 8
1 6 24,68 4,09 1,67 20,4 29,0
2 6 15,33 3,5 1,42 11,66 19,0
Total 12 20,00 6,08 1,75 16,14 23,87
A observação das células fluorescentes da medula total, em termos de
densidade celular média, foi muito superior em relação ao grupo das células
mesenquimais. Ficou ainda mais evidente quando se considerou a variável tempo.
Para saber o grau de significância estatística os resultados foram submetidos a
análise de variância, confirmando tal diferença. O que pode ser verificado na tabela
2.
Tabela 2
Resultado da análise da diferença da densidade celular média eGFP
+
dentro do
enxerto conforme o período do estudo (ANOVA).
Causas da
variância
Soma dos
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrados
Médios
F Valor - p
Dia 4
Dia 8
Entre os grupos
Dentro dos grupos
Total
Entre os grupos
Dentro dos grupos
Total
66,78
14,06
80,84
262,26
144,66
406,92
1
8
9
1
10
11
66,78
1,75
262,26
14,46
38,00
18,13
0,000
0,002
A densidade celular das células-tronco eGFP
+
quando identificadas na
estrutura do enxerto, nesse modelo, se mostrou superior e com significância
estatística, quando da sua origem. Em outras palavras as células da medula total
foram identificadas em uma densidade superior nos dois intervalos (p=0,000 e
44
p=0,002 respectivamente). Esses significados foram confirmados por pós-testes de
robustez de Welch e Brown-Forsyte e estão disponíveis no anexo II. A relação dos
grupos, nos períodos de estudo de 4 e 8 dias, quanto à densidade celular das
células eGFP
+
pode ser verificada na figura a seguir.
Densidade média das células
eGFP
+
0
5
10
15
20
25
30
Dia 4 Dia 8
Intervalos do estudo
Densidade celular
média/campo
Grupo 1
Grupo 2
Figura 19. Gráfico demonstrando a densidade média das células eGFP
+
nos
grupos 1 e 2 nos períodos do estudo.
6.3 MICROSCOPIA ÓTICA
6.3.1 Hematoxilina-Eosina – contagem das células no enxerto (colonização)
Nesse estudo, por meio da coloração da Hematoxilina-Eosina, foi possível a
contagem da colonização celular nos dias quatro e oito, para os três grupos, a
saber: controle, medula total e mesenquimal.
De cada lâmina, foram contados os números de células em três campos
(aumento de 400 x), sendo as médias e desvios padrões (DP) das três contagens
apresentados na tabela abaixo. As contagens foram cegas (sem identificação dos
animais das quais procediam), sendo os valores em geral confirmados por análise
independente realizada por um segundo pesquisador.
45
Tabela 3
Colonização celular observada por Hematoxilina-Eosina nas amostras controle,
medula total e células mesenquimais conforme o tempo de avaliação.
Grupo N Média Desvio
padrão
Erro
padrão
Limite
inferior
Limite
superior
Dia 4
Dia 8
0
1
2
Total
0
1
2
Total
6
6
6
18
5
6
5
16
505,83
339,17
545,83
463,61
375,60
528,17
609,60
505,94
111,34
171,62
77,80
150,23
92,37
63,34
56,98
118,00
45,45
70,06
31,76
35,41
41,31
25,86
25,48
29,50
389,00
159,06
464,19
388,90
260,90
461,70
538,84
443,07
622,68
519,27
627,48
538,32
490,30
594,65
680,36
568,81
Observou-se uma colonização celular média maior no grupo das células
mesenquimais nos dois períodos (545,83±77,8 e 609,60±57,0). Para entender a
importância de tal achado, essa diferença foi submetida à análise de variância, que
pode ser observado na tabela a seguir.
Tabela 4
Análise da diferença da colonização média celular nos intervalos do estudo
(ANOVA).
Causas da
variância
Soma dos
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrados
médios
F Valor -
p
Dia 4
Entre os grupos
Dentro dos grupos
Total
144177,78
239516,50
383694,28
2
15
17
72088,88
15967,76
4,51
0,029
Dia 8
Entre os grupos
Dentro dos grupos
Total
141633,70
67191,23
208824,94
2
13
15
70816,85
5168,55
13,70
0,001
Observou-se uma diferença estatisticamente significativa para o grupo 2 ou
de células mesenquimais nos períodos de quatro e oito dias respectivamente
(p=0,029 e p=0,001). Esses resultados foram, também, confirmados por pós-testes
46
de robustez de Welch e Brown-Forsyte e podem ser observados na tabela a seguir.
Tabela 5
A colonização celular superior do grupo 2 confirmado por pós-teste de robustez da
Equivalência das Médias.
Estatística
a
Graus de
liberdade 1
Graus de
liberdade 2
Valor- p
Dia4
TesteWelch
Teste de Brown-Forsyte
3,36
4,51
2
2
9,21
10,84
0,08
0,03
Dia 8
Teste Welch
Teste de Brown-Forsyte
10,85
13,35
2
2
8,15
10,12
0,00
0,00
a
– F distribuição estável.
Quando reunidos os grupos nos períodos de 4 e 8 dias, a relação da
colonização celular em relação ao tempo, confirmou a maior densidade das células
mesenquimais, sendo suas médias sempre superiores aos demais grupos, controle
e da medula total, o que pode ser verificado no gráfico da figura 20.
Densidade celular (células/campo) 200x
Figura 20. A densidade celular média nos grupos de estudo de 4 e 8 dias,
observar o nível mais elevado das células mesenquimais (p=0,00 ANOVA).
47
As figuras 21 e 22 demonstram a colonização celular dos grupos quando
observadas com oito dias de evolução. Deve ser observado a densidade mais
elevada, no grupo das células mesenquimais (p=0,001 - ANOVA).
Figura 21. Colonização celular no enxerto (seta), com 8 dias de evolução
(grupo 0) (aumento de 100x).
Figura 22. Colonização celular no enxerto (seta), com 8 dias de evolução.
(grupo 1) (aumento de 100x).
48
Figura 23. Colonização celular no enxerto (seta), com 8 dias de evolução grupo 2),
superior aos demais grupos (p=0,001 - ANOVA) (aumento de 100x).
6.3.2 Imuno-histoquímica - contagem das células endoteliais no enxerto –
CD31
+
(PECAM)
Em relação à neovascularização foi possível a análise de todos os grupos e
em todos os intervalos do estudo. Na avaliação da densidade endotelial, foi
utilizado o índice de Chalkley. Todos os animais foram submetidos à avaliação da
vascularização independente do tipo de tratamento administrado. As contagens
foram cegas (sem identificação dos animais das quais procediam), sendo os
valores em geral confirmados por análise independente realizada por um segundo
observador. Um exemplo da expressão imuno-histoquímica do CD31 pode ser
observado na figura 24.
49
Figura 24. As setas indicam as células endoteliais com expressão do CD31,
correspondendo à neovascularização,(dentro do enxerto) (aumento de 200x).
O resultado descritivo e completo da densidade vascular média, em relação
ao tratamento, nos diversos intervalos do estudo, bem como o erro padrão e limites
inferior e superior (IC=95%), podem ser analisados na tabela 6.
50
Tabela 6
Densidade vascular média em todos os períodos do estudo para controle (0),
medula total (1) e mesenquimal (2).
N Média Desvio
padrão
Erro
padrão
Limite
inferior
Limite
Superior
Dia 4 0
1
2
Total
6
6
6
18
4,44
4,25
4,86
4,51
0,77
0,63
1,07
0,83
0,31
0,25
0,43
0,19
3,62
3,58
3,73
4,10
5,26
4,91
5,98
4,93
Dia 8 0
1
2
Total
6
6
6
18
3,52
4,61
3,77
3,97
0,65
0,88
0,82
0,88
0,26
0,36
0,33
0,20
2,84
3,68
2,90
3,53
4,21
5,54
4,64
4,41
Dia 12 0
1
2
Total
6
6
6
18
3,25
3,86
3,30
3,47
0,72
0,60
0,84
0,74
0,29
0,24
0,34
0,17
2,48
3,22
2,41
3,10
4,01
4,50
4,19
3,84
Dia 16 0
1
2
Total
6
6
6
18
3,02
3,33
3,91
3,42
0,12
0,40
0,75
0,60
0,05
0,16
0,30
0,14
2,89
2,90
3,12
3,12
3,15
3,76
4,70
3,72
Notou-se uma diferença nos valores da densidade vascular média entre os
grupos quando considerado o tempo, sendo superior para o grupo 1 nos intervalos
de 8 e 12 dias e para o grupo 2 nos intervalos de 4 e 16 dias. Essas variações
foram submetidas à análise estatística para identificar seu significado.
Somente a densidade vascular média superior das células mesenquimais
(grupo 2), no intervalo de 16 dias se mostrou estatisticamente significativo, pela
análise de variância. Tal achado pode ser verificado nas tabelas a seguir.
51
Tabela 7
Densidade vascular média submetida a análise da variância (ANOVA).
Causas da
Variância
Soma dos
quadrados
Graus de
liberdade
Quadrados
médios
F p-valor
Dia 4
Entre os grupos
Dentro dos grupos
Total
1,17
10,76
11,93
2
15
17
0,58
0,71
0,81
ns
Dia 8
Entre os grupos
Dentro dos grupos
Total
3,86
9,48
13,34
2
15
17
1,93
0,63
3,05
ns
Dia 12
Entre os grupos
Dentro dos grupos
Total
1,37
8,08
9,45
2
15
17
0,68
0,53
1,27
ns
Dia 16
Entre os grupos
Dentro dos grupos
Total
2,44
3,73
6,17
2
15
17
1,22
0,24
4,91
0,02
Como se percebeu uma diferença estatisticamente significativa para o grupo
no período de 16 dias no teste acima (p=0,02), isso foi confirmado pelos testes de
robustez (Post Hoc Test). O que pode ser verificado na tabela a seguir.
Tabela 8
Descrevendo os testes de robustez ( Post Hoc Test ) para a diferença superior da
densidade média vascular no Grupo 2 no período de 16 dias.
Estatística
a
Graus de
liberdade 1
Graus de
liberdade 2
Valor - p
Dia 4
Teste de Welch
Teste de Brown-Forsyte
0,68
0,81
2
2
9,61
12,55
ns
ns
Dia 8
Teste de Welch
Teste de Brown-Forsyte
2,77
3,05
2
2
9,81
14,19
ns
ns
Dia 12
Teste de Welch
Teste de Brown-Forsyte
1,44
1,27
2
2
9,82
14,04
ns
ns
Dia 16
Teste de Welch
Teste de Brown-Forsyte
4,94
4,91
2
2
7,40
8,04
0,04
0,04
a
– F distribuição estável
52
Essas diferenças em relação aos grupos, bem como em relação ao tempo,
podem ser também analisadas no gráfico a seguir, que demonstra a densidade
média vascular superior no grupo 2 e no período de 16 dias (p=0,023 – ANOVA).
Figura 25. Notar a densidade média superior do grupo mesenquimal quando
observada no período de 16 dias pós-enxerto (p=0,023).
53
7 DISCUSSÃO
O presente trabalho procurou controlar o maior número de variáveis
possíveis, de modo a esclarecer a participação das células-tronco na reparação
tecidual e na neovascularização. Mesmo que sujeitos às interferências próprias de
sua biologia, ainda assim, os modelos in vivo oferecem uma resposta superior,
mimetizando e predizendo um cenário clínico, quando do entendimento de novos
métodos terapêuticos.
A escolha do modelo - animal (camundongo C57/Bl6 - isogênico) - foi
baseada em aspectos de logística local (linhagem, produção), biologia amplamente
descrita, semelhança entre os doadores versus receptores (população homóloga) e
na revisão da literatura. Entre os mamíferos, o modelo de roedores (camundongo)
é o sistema in vivo mais utilizado em associação com a engenharia tecidual e
terapia celular (scaffold/cell), conforme descreveu Baydlak, 2002 (3).
A área selecionada para a lesão, no modelo, foi na região posterior entre as
orelhas, para dificultar o acesso do próprio animal ao ferimento, ficando, desse
modo, livre de trauma adicional. Também as gaiolas foram modificadas em sua
altura para evitar que os mesmos atritassem seu dorso contra o teto. A lesão foi
marcada previamente, com um modelo em filme de RX, de forma que todas
tivessem as mesmas dimensões, em torno de 2,25 cm², e de espessura total, de
aproximadamente 0,5 mm, o que corresponde a uma superfície corporal atingida
de 10% e está de acordo com o modelo usado por Kremer e cols., em 2000 (39)
Ichioka e cols., em 2005 (26), e Capla e cols., em 2006 (8).
O fenômeno da contração, em direção à cicatrização, foi mínimo e até
imperceptível em alguns animais, o que pode ser explicado devido à cobertura
imediata, com o enxerto da matriz dérmica, conferindo estabilidade nos bordos da
ferida. Nenhum curativo foi adicionado aos enxertos, permitindo sua visualização
direta e também não interferindo na evolução, e, com exceção de um animal, todos
se mantiveram bem. Desse modo, as lesões mantiveram a forma e dimensões
muito próximas da original durante todo o período de estudo e tal observação está
de acordo com a descrição de Walgenbach e cols., 2001 (70). Um exemplo da
evolução dos enxertos com a integração completa (100%), pôde ser verificado na
figura 14.
54
O tamanho da amostra (tratados e controles), o procedimento cirúrgico e os
pontos de intervalos, com algumas modificações foram desenvolvidos com base no
modelo descrito por Badylak e cols., em 2001 (2) e, posteriormente por Capla e
cols., 2006 (8).
Em relação ao transplante, in situ, das células-tronco no estudo de seu
envolvimento na lesão encontra base no trabalho de Ferrari e cols., 1998 (19),
kocher e cols., 2001 (36) e Orlic e cols., 2001 (49) e Edelberg e cols., 2002 (18).
O emprego da matriz de regeneração dérmica para o tratamento das lesões
de pele está bem estabelecido na prática médica, sendo aplicada no manejo de
queimados nos Estados Unidos e para qualquer defeito cutâneo, de espessura
total, na Europa, desde 1995 (30). As peças aqui usadas (± 2,25 cm²/animal ± 10%
de SCTA) são oriundas de sobras de recortes cirúrgicos e foram empregadas
somente após a alta do paciente envolvido e sem qualquer prejuízo para o mesmo.
Um ponto a ser enfatizado é que o uso de tal tratamento não acrescenta
injúria ao animal, permanecendo o ferimento original. Entretanto, e diferentemente
de sua utilização em seres humanos, nesse estudo apenas o primeiro
procedimento, enxerto da matriz, foi alvo de análise, uma vez que, entre os
objetivos, estava o estudo da neovascularização no mesmo. Em praticamente
todos os animais (98,6%) os enxertos se mantiveram bem e, no intervalo de 16
dias, devido à sua coloração (pêssego), identificou-se um quadro de
vascularização completa em todos os animais. Em uma série de casos clínicos
Moiemen e cols., 2001, encontraram resultados similares em relação ao
prognóstico da vascularização completa, sendo a coloração o sinal clínico mais
utilizado na prática clínica (44). Através da inspeção, verificou-se que as lesões nos
animais de 12 dias, e, fundamentalmente, de 16 dias estavam cicatrizadas, ou na
eminência de cura, o que poderia ser explicado por sua extensão pequena (± 10%
de SCTA), pela biologia do animal (rápida recuperação) ou mesmo pelo tratamento
(excisão e cobertura imediata) com nível de contaminação pequeno. Esses
resultados, em relação à cicatrização e à integração dos enxertos estão de acordo
com os achados por Kremer e cols., 2000 (39). O fato dos animais não
apresentarem complicações pode estar associado com o tipo de ferida produzida,
treinamento cirúrgico prévio no modelo animal (projeto piloto) e a escolha da
cobertura.
55
O substituto cutâneo utilizado (classe II – Balasubramani e cols., 2001), o
integra®, é um análogo dérmico que incorpora proteína animal (colágeno bovino)
em teoria, poderia transmitir doenças, como por exemplo, a encefalite
espongiforme (BSE – Bovine spongiforme encephalitis), com o seu correspondente
em seres humanos – Doença de Creutzfeldt-Jacob. Até o momento, nenhum caso
foi relatado (4). Além disso, outra importante desvantagem da matriz de
regeneração dérmica é seu alto custo, o que concorre para limitação em seu uso.
Suas estruturas física e biológica, entretanto, são baseadas no colágeno bovino e
tem um passado longo de utilização, o que gerou dados, informações e
conhecimento nas últimas décadas. Como é um componente acelular e
biodegradável, sua utilização na reparação tecidual está bem caracterizada como
Scaffold, onde as células do hospedeiro e as transplantadas podem migrar e
assumir uma posição adequada - homing. Essa segunda informação de que
células transplantadas da medula óssea podem, sim, colonizar esse
microambiente, não havia sido demonstrado anteriormente e pode ser uma
ferramenta importante na terapia celular, quando associada à engenharia tecidual.
Esse aspecto pôde ser comprovado com o uso de camundongos doadores
transgênicos, através da utilização de células da medula óssea que expressam
eGFP
+
. Um exemplo dessa colonização das células enxertadas entre as fibras da
matriz pode se verificado na figuras 15 e 16.
Como descreveu Robey e Bianco, 2004, a engenharia tecidual encontra
aplicações até mesmo mais importantes para as células-tronco do que sua
utilização in natura, em referência à necessidade da utilização de um scaffold,
quando de sua aplicação clínica (59). As vantagens do emprego de um produto da
engenharia tecidual em associação com a terapia celular foram bem descritas por
esses autores; elas fornecem não somente um molde para o crescimento
organizado de células no local, como também orientam fatores do crescimento na
sua apresentação à célula.
Aos quatro e oito dias, existe clara distinção entre a região do enxerto e o
leito da ferida. Dentro desses intervalos, foi possível quantificar as células eGFP
+
nas duas populações. Já nos intervalos de 12 dias e principalmente aos 16 dias,
intensa proliferação celular levou praticamente a uma incorporação das fibras do
colágeno, da matriz, ao tecido regenerado (remodelamento – biointegração). O
número de células eGFP
+
diminuiu muito nesses dois intervalos de observação,
56
não permitindo sua contagem. Nos animais tratados com células da medula total,
praticamente não se observaram células fluorescentes, enquanto que, nos animais
que receberam as mesenquimais, ainda se observaram agrupamentos de células
eGFP
+
aos 12 dias, mas não aos 16 dias. A descrição das células eGFP
+
dentro
dos períodos de estudo (4 e 8 dias), com erro padrão e seus limites, pode ser
observada na tabela 1. Sua identificação nos períodos de 12 e 16 dias não foi
possível e, estes resultados mostram que o homing das células transplantadas é
transitório. Achados semelhantes têm sido demonstrados em outros sistemas (27),
sendo interpretados como indicativos de mecanismo de ação parácrina das
células-tronco sobre as células do hospedeiro na sua sinalização em direção à
reparação do local-alvo.
Mesmo que tenham sido notadas em maior número nos grupos iniciais,
quatro e oito dias, as células da medula óssea desapareceram mais rapidamente, o
que poderia ser devido ao fato de que seu nicho, após o transplante, ficou
sobretudo no enxerto e, à medida que a matriz sofreu sua degradação (bio-
integração), o nicho deixou de existir. Essa peculiaridade é fundamental na
utilização de células-tronco fora de seu ambiente natural, uma vez que sua
ativação ocorrerá in situ. Sendo assim, o micro ambiente utilizado deve sustentar e
manter o nicho das mesmas, como enfatizou Robey e Bianco, 2004 (59). Em
relação à densidade celular das células da medula total e à sua caracterização, são
verificadas semelhanças com os achados de Han e cols., 2005 (23). Em seu
estudo, in vitro, o autor descreveu não somente a aparência como também sua
capacidade de expansão e sua participação na síntese do colágeno (tipo I e IV),
fibronectina e laminina. Como são todos elementos da matriz extracelular, é do
entedimento que tais células têm, sim, uma participação importante na reparação
tecidual.
Quanto às células mesenquimais, elas localizaram-se preferencialmente, no
leito da lesão. É provável que a intensa proliferação das células do hospedeiro,
somada ao desaparecimento dos sinais de homing produzidos pela lesão tenham
deslocado esta população dos sítios originalmente colonizados, pois, além da
“lesão adequada”, há necessidade, no micro ambiente, de espaço disponível, como
descrito por Conrad e Huss, 2005 (13). Outros autores, Simpson e cols., 2007,
também não conseguiram demonstrar a presença de células mesenquimais, em
matriz de colágeno aplicada no epicárdio após quatro semanas, mesmo que esse
57
fator não tenha sido determinante para que se tivesse encontrado resultados
positivos na área de aplicação (64). Isso poderia explicar a cicatrização encontrada
nos grupos de tratamento com células mesenquimais, ainda que não tenha sido
possível sua demonstração (12 e 16 dias).
Independente do verdadeiro motivo essa diferença foi significativa em
ambos os períodos analisados, quando se encontrou uma densidade celular média
de 7,32 ± 1,75 para o intervalo de 4 dias e 24,68 ± 4,09 para 8 dias, no grupo da
medula total (p=0,000 e p=0,002). Tal achado pode ser verificado nas tabelas 1 e
2.
Na análise, através da microscopia ótica das lâminas coradas com
Hematoxilina-Eosina, observou-se uma diferença em relação à colonização do
enxerto, dependendo da origem da população celular, se da medula total ou se
mesenquimal. Deve ser ressaltado que o grupo do tratamento com as células
mesenquimais, provocou maior colonização em relação aos demais. Essa maior
densidade celular é mais evidenciada no período de quatro dias quando
comparada ao grupo do tratamento com medula total, sugerindo uma sinalização
celular (parácrina), mais pronunciada e/ou mais precoce. Já no período de 8 dias,
ocorreu uma diferença estatisticamente significativa do grupo mesenquimal em
relação ao da medula total (p=0,001). Tal efeito pode ser observado nas tabelas 4
e 5 e na figura 20.
Tais resultados sugerem a participação das células na colonização do
enxerto, acelerando e possivelmente tendo um impacto positivo sobre a
recuperação da lesão. A maior densidade celular encontrada com as células-tronco
em relação aos controles pode ser compreendida como uma ação parácrina,
transdiferenciação ou ambas (38).
Apesar de as células-tronco, até o momento, não possuírem marcadores
específicos, sua demonstração, através da expressão de marcadores genéticos
como a GFP, é aceita em estudos in vivo. E, se adicionalmente, houver expressão
de marcadores de células especializadas no órgão alvo, poderá ser considerado
como prova de sua “plasticidade”; o que encontra correspondência com a
descrição de Verfaillie, 2004 (68).
Torna-se importante enfatizar que, nesse modelo, as células utilizadas do
aspirado da medula óssea não foram submetidas a qualquer expansão ex vivo,
tampouco a lesão recebeu qualquer fator de crescimento como colaborador da
58
regeneração tecidual. Como se tentou mimetizar um cenário clínico de trauma, a
expansão celular representa consumo de tempo e os fatores de crescimento
acrescentariam variáveis de difícil controle, além dos efeitos colaterais (indução de
crescimento tumoral) (6). Assim, a população celular transplantada foi controlada, e
o mesmo regime foi utilizado em todos os casos.
A presença das células eGFP
+
, dentro do enxerto, sugere que a participação
da lesão tecidual na sinalização adequada não deve ser subestimada, o que pode
melhorar de forma significativa a integração do enxerto. Tal sinalização celular
(parácrina) foi demonstrada na presença de lesão em comparação ao transplante
realizado na ausência de injúria por Krause e cols., 2001 (38). Posteriormente, em
modelo de lesão na retina de camundongos, ela também foi encontrada por Grant
e cols., 2002 (21). Desse modo, poder-se-ia afirmar que as células-tronco
“compreendem” o dano tecidual no órgão-alvo. Outro fator interessante é a adesão
das células na estrutura da matriz, em particular as da medula total, o que poderia
ser explicado, pela composição principal da mesma, isso é, a molécula do
colágeno. Tal proteína da matriz extracelular assim como fibronectinas,
proteoglicanos, heparinas entre outras, fornece a superfície de adesão, apresenta
citoquininas para sinalização célula-célula e também pode demonstrar estrutura
similar ao estroma original das células-tronco (67).
Como foi citado anteriormente, a utilização de células progenitoras
diretamente, in situ, na área da lesão encontra respaldo na bibliografia em diversas
áreas, entre elas, a oftamologia (21), cardiologia (49), distrofia muscular (19),
cirurgia plástica reconstrutiva (53) e queimaduras (57). Outros autores, porém,
utilizando diferentes sistemas, questionam essa “plasticidade” celular quando elas
são usadas no local da lesão, entre eles, Castro e cols., 2002 e Moeshead e cols.,
2002 (9, 45).
Com a observação dos resultados obtidos nesse estudo e a revisão de
outros trabalhos publicados nos últimos anos, pode-se assumir que células-tronco
da medula óssea estão, sim, envolvidas na reparação tecidual e na manutenção da
função (72). Em um diferente sistema ao utilizado nesse estudo, outros autores
confirmaram a cicatrização completa, inclusive com a presença de anexos, em três
semanas, a partir do transplante de células da medula óssea (32).
A cobertura precoce de defeitos cutâneos importantes, como as
queimaduras, tem reduzido a mortalidade e também, efetivamente, reduzido a
59
incidência de cicatrização patológica. A utilização de substitutos cutâneos nesse
tratamento oferece, também, uma oportunidade para observação da
neovascularização (angiogênese).
Os estudos iniciais da vascularização dos enxertos de pele indicavam que,
fundamentalmente, ocorria uma conexão precoce e direta entre os vasos do
hospedeiro e os contidos no enxerto (inosculação). Enquanto a vinculação se
desenvolvia, a sobrevivência dos mesmos era dependente do processo de
absorção de fluídos (embebição), demonstrado pelo edema inicial dos mesmos.
(8). O verdadeiro mecanismo ainda não está devidamente esclarecido, porém o
que está confirmado é que a circulação efetiva não está estabelecida antes de 48
horas e pode mesmo iniciar pelo quarto dia após a enxertia, como demonstrou
Ohmori e kurata em 1960, (48), o que foi confirmado por Converse e cols., por
meio de um marcador de endotélio viável (diaphorese) (14). Apesar de não
mencionarem qualquer envolvimento das células tronco, esses trabalhos serviram
como base para determinar, no tempo, o início do período do estudo da
neovascularização dos enxertos, desse estudo (quatro dias). Também deve ser
enfatizado que, no modelo avaliado, o fenômeno da inosculação está afastado, já
que a estrutura enxertada (matriz dérmica) não contém vasos, dependendo,
exclusivamente, da formação vascular a partir do hospedeiro, demonstrando a
participação de outros mecanismos responsáveis pela angiogênese.
Da mesma forma e sem vasos pré-existentes, dois processos biológicos
necessitam da angiongênese para o seu desenvolvimento: cicatrização e o
crescimento tumoral. Há, portanto, uma correlação entre a densidade vascular e a
progressão desses processos, o que é amplamente descrito no caso da
progressão tumoral. O mecanismo do brotamento (sprouting) de neo-vasos pré-
existentes, através de células endoteliais da parede dos vasos, é bem descrito,
entretanto a participação de células precursoras endoteliais, na neovascularização
foi recentemente sugerida (56). Também foi demonstrado que a medula óssea
possui progenitores de células endoteliais (angioblasto) e é facilmente acessada,
sem acrescentar morbidade aos pacientes, o que justifica a sua investigação como
fonte doadora de células envolvidas na neovascularização. Para o
acompanhamento de células-tronco da medula óssea e mesenquimais como
indutoras da neovascularização (angiogênese terapêutica), usaram-se, neste
trabalho, apenas animais modificados (químeras), como doadores. Em outras
60
palavras, o monitoramento do destino celular foi pela expressão da eGFP
+
, o que
possibilitou sua quantificação no local, como descrito e demonstrado
anteriormente.
A utilização da suspensão celular pura da medula óssea encontra
correspondência com o trabalho de Kataoka e cols., 2003 (32), e Ichioka e cols.,
2005 (26).
Em um outro modelo descrito por Kocher e cols., 2001 (36), relatou-se a
importância da utilização dessas células em lesão do miocárdio em casos de
infarto. Seus achados indicaram que ocorreu não somente a redução da deposição
do colágeno, e conseqüentemente da cicatriz, como também o aumento da
neovascularização. Assim como a lesão cutânea de espessura total, o insulto
resultante do infarto do miocárdio é uma cicatriz, ou seja, deposição anormal do
colágeno.
A contribuição da medula óssea na vascularização pós-natal, denominada
de angiogênese ou neovascularização, está bem apresentada por vários autores
(56, 58, 74). Não há questionamento, quanto da sinalização adequada da lesão
(isquemia, lesão celular) e sobre o recrutamento de células progenitoras
endoteliais, para o desenvolvimento da vascularização no local-alvo. O que se
busca é identificar qual a população mínima necessária para tal tarefa. Uma
informação importante é originada nos pacientes portadores de desordens linfo-
hematopoéticas e submetidos a transplante de célula tronco. Após a ablação
medular, em seu tratamento, é utilizada a infusão de dez milhões de células-
tronco/kg de peso. Se tal fórmula é necessária para a utilização em associação
com a engenharia tecidual e/ou reparação de órgão, é uma questão a ser resolvida
(13). O presente trabalho buscou, da forma mais prática, uma população não
fracionada (BM) e uma parte (MSC) de igual densidade celular (1X10
6
cél/ml) para
observar seu efeito pró-angiogênese. Em New York, Edelberg e cols., (2002)
trabalharam com densidade celular superior (1X10
7
) e encontraram resultados
positivos na neovascularização (18). Se, portanto, a densidade celular apropriada
para a indução da neovascularalização é abaixo, igual ou mesmo superior a estas
utilizadas ainda é uma questão a ser esclarecida.
O período mais longo de observação, deste estudo, foi de 16 dias, uma vez
que, a partir desse período, poder-se-ia encontrar vascularização já estabelecida
em todo o enxerto, independente do tratamento, como descreveu Kearney, 2001
61
(34). Isso efetivamente ocorreu, em todos os animais com intervalo de 16 dias de
acompanhamento, quando então se identificou, pela inspeção, a coloração tipo
pêssego, amarelada, o que configura vascularização completa, conforme
descreveram Moiemen e cols., 2001 (44), sendo este o padrão clínico mais
utilizado em seres humanos para o diagnóstico de vascularização completa.
Adicionalmente, através da histologia, verificaram-se a formação de vasos patentes
e a presença de folículos pilosos dentro dos enxertos, demonstrando a cicatrização
de suas lesões, o que encontra concordância com os achados de Ichioka e cols.,
2005 (26). Também deve ser enfatizado que, nesse tipo de animal, a recuperação
das lesões é muito veloz, portanto não se justificaria longos períodos de
acompanhamento.
A porosidade da matriz permitiu a invasão das células transplantadas
(homing), para dentro de sua estrutura, confirmando sua porosidade adequada (20-
50µm), o que possibilita o crescimento vascular para dentro do enxerto. Essa
configuração foi salientada como uma característica necessária em um scaffold, na
utilização em cirurgia reparadora, por Knight e Evans, 2004 (35).
Como citado anteriormente, procurou-se mimetizar um cenário clínico
semelhante ao da prática diária, quando a integração média da matriz (80%) ocorre
após quatro semanas, contudo vale salientar que, em média, 20% da área
enxertada são perdidos. Uma possibilidade nesses pacientes é a deficiência da
neovascularização, que pode ocorrer por várias etiologias. Entre elas, uma
densidade celular de EPCs que pode estar alterada; se for o caso, uma carga
exógena (transplante de EPCs) poderia suprir tal deficiência, induzindo uma
vascularização rápida e efetiva. Há vários autores sugerindo a participação dessas
células na formação vascular pós-nascimento (56, 58). Considerando o modelo
utilizado, a neovasculizarção se originou do leito da lesão e/ou dos tecidos
adjacentes (sprouting), ou do transplante celular (células indiferenciadas). No
presente trabalho, em seguimento ao destino das células, foi possível demonstrar a
expressão do antígeno CD31(PECAM) proveniente das células endoteliais dentro
da estrutura do enxerto. O CD31 é um membro da superfamílias das
Imunoglobulinas e é expresso por células endoteliais, estando envolvido na
biologia celular vascular, como demonstrou Newman, 1997 (47). Isso pode ser
observado na figura 24.
Essa demonstração encontra apoio na bibliografia, confirmando o
62
crescimento vascular pós-natal a partir de células indiferenciadas da medula óssea
e podendo ser, até mesmo, explorado num processo denominado
“Neovascularização Terapêutica” (10). Para observarmos o efeito dessa “terapia
celular” sobre o implante da matriz avascular em lesões de espessura total, foi
utilizado o índice de Chalkley (12), o qual tem sido comumente utilizado em
estudos clínicos como fator prognóstico e orientador de terapias na oncologia. A
leitura da densidade vascular (hot spot) oferece um resultado de determinada área,
mas há forte evidência entre o número de células com expressão do CD31 e os
vasos (20). A contagem foi definida como qualquer célula endotelial (expressão do
CD31), aglomerado celular (cluster), separada dos microvasos adjacentes, luz
vascular e, inclusive eritrócitos que não foram considerados. Somente os pontos
coincidentes com os pontos da lâmina foram considerados, conforme o modelo
utilizado por outros autores (15, 60). Há, contudo, autores que discutem a
interpretação dos achados e os critérios considerados, como, por exemplo,
Axelsson e cols., 1995 (1).
A descrição completa da densidade vascular média bem como, desvio
padrão e limites inferior e superior podem ser observados na tabela 6.
Nesse estudo foi observado que a indução da neovascularização pelas
células-tronco, traduzido pela densidade vascular média, foi superior nos grupos
tratados em relação ao grupo controle, confirmando achados da bibliografia em que
há, sim, participação das mesmas na angiogênese terapêutica. Tal característica é
melhor observada na figura 25.
Quando comparamos as diferenças nos grupos de tratamento, em relação
ao tempo, observou-se uma diferença significativa do grupo 2 (mesenquimal), em
relação ao grupo 1 (medula total), no intervalo de 16 dias (p=0,023 - ANOVA). Tal
significância foi confirmada por pós-teste de robustez (p=0,043 - WELCH e p=0,040
- BROWN-FORSYTHE).
Poder-se-ia afirmar que, neste estudo, as células-tronco mesenquimais
produziram um efeito pró-angiogênese, quando associadas ao tratamento de
defeitos cutâneos, com matriz dérmica, superior em relação às células da medula
total. Adicionalmente, deve ser enfatizado que o resultado superior foi observado
também, quando se analisou a colonização celular, o que pode ser entendido como
uma sinalização celular maior. Essa característica pode ser verificada na figura 20.
Uma vascularização precoce e efetiva do componente dérmico, a partir do
63
tecido receptor, é crucial para melhorar significativamente a integração de enxertos
epidérmicos. Por sua vez, o uso isolado de células na lesão não encontra
resultados substanciosos, em termos de cicatrização final. Assim, poder-se-ia
afirmar que essa associação, matriz e células, parece ser fundamental na biologia
celular das células-tronco, no entanto várias questões permanecem em aberto.;
como por exemplo, a densidade celular, tipo celular, volume administrado, modelo
animal superior e, finalmente, realização de estudos clínicos. Adicionalmente, a
utilização de marcadores específicos que possam afirmar e acompanhar o destino
das células-tronco. Em resposta a tais questões, novas investigações são
necessárias.
Em tempos de engenharia tecidual e terapia com células-tronco, a pesquisa
por fatores, sinais, materiais e modelos ex vivo ou in vivo que atuem para uma
vascularização precoce e efetiva e uma reparação cutânea ideal, ainda desafia a
comunidade científica. Inúmeros tratamentos foram testados, e provavelmente
outras estratégias serão descritas. O uso de um modelo é uma condição inevitável
na tentativa de obter conhecimentos, reproduzir resultados e desenvolver novas
opções terapêuticas. A informação originada em testes de experimentação in vivo,
que afetem a evolução das lesões cutâneas, seria a mais substancial.
Apesar das enormes diferenças entre a biologia do modelo utilizado e os
seres humanos, em relação à pele, ambos possuem os elementos da epiderme,
membrana de basamento e derme. Mesmo assim, não se devem extrapolar esses
achados para organismos superiores, apesar de os resultados serem comparáveis
entre si, o que pode instigar investigações futuras. Nos modelos que empregam
produtos resultantes da engenharia de tecidos, a vascularização é a diferença
entre a integração ou a perda do tratamento. À medida que se inicia a
compreensão das células-tronco, elas tornam-se uma opção importante,
principalmente, se utilizarmos material autólogo para a indução da
neovascularização.
A engenharia tecidual e a terapia celular são novos campos, fascinantes e
progressivos para a pesquisa clínica aplicada cujo objetivo é otimizar e aprimorar
os protocolos de atendimento com novas opções terapêuticas. Torna-se, então,
urgente e necessária uma cooperação entre cientistas das pesquisas básica e
clínica, para que novos projetos possam ser desenvolvidos.
64
8 CONCLUSÕES
As células-tronco migram, proliferam e participam da reparação tecidual e da
neovascularização induzida, quando utilizadas em associação com uma matriz
dérmica no tratamento de defeito cutâneo de modelo in vivo.
As células-tronco podem ser utilizadas em associação com a engenharia
tecidual;
As células-tronco induzem a colonização celular do enxerto, tendo um
impacto positivo na recuperação da lesão no órgão-alvo;
As células-tronco mesenquimais induzem uma colonização superior no
enxerto, em relação, às células da medula total (p=0,001), aos 8 dias;
As células-tronco mesenquimais induzem uma neovascularização
superior no enxerto, em relação, às células da medula total (p=0,023),
aos 16 dias.
65
9 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS
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