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TESE DE DOUTORADO
Alessandra Duarte Clarizia
AVALIAÇÃO DO POLIMORFISMO DA
METILENOTETRAIDROFOLATO
REDUTASE (MTHFR) EM
AMOSTRAS DE CÂNCER
COLORRETAL E CÂNCER DE MAMA
Orientador
Sérgio D.J. Pena
Co-orientadora
Helenice Gobbi
Instituto de Ciências Biológicas
Universidade Federal de Minas Gerais
2006
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Alessandra Duarte Clarizia
AVALIAÇÃO DO POLIMORFISMO DA
METILENOTETRAIDROFOLATO
REDUTASE (MTHFR) EM
AMOSTRAS DE CÂNCER
COLORRETAL E CÂNCER DE MAMA
Tese de doutorado apresentada
ao Programa de Pós-Graduação
em Ciências Biológicas:
Farmacologia Bioquímica e
Molecular, como requisito parcial
para obtenção do grau de Doutor
em Ciências.
Orientador: Sérgio D.J. Pena
Co-orientadora: Helenice Gobbi
Suporte financeiro: CNPq e
FAPEMIG
Departamento de Bioquímica e Imunologia
Instituto de Ciências Biológicas
Universidade Federal de Minas Gerais
2006
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“Renda-se, como eu me rendi.
Mergulhe no que você não
conhece como eu mergulhei.
Não se preocupe em entender,
viver ultrapassa qualquer
entendimento.”
Clarice Lispector
“A falsa ciência gera ateus; a verdadeira
ciência leva os homens a se curvar
diante de Deus."
Voltaire
À Deus,
Aos meus pais, Angelo e Miriam, e minhas irmãs Viviane
e Cristiana, pelo amor, carinho e compreensão,
dispensados a mim durante essa trajetória. A união, a fé,
e a perseverança da minha família trouxeram-me a paz e
a força necessárias, para enfrentar um grande obstáculo,
e poder finalizar mais uma etapa da minha formação.
A todos os pacientes que participaram deste estudo.
Compreendo a dor ao receber o diagnóstico, o sofrimento
e a trajetória complexa do tratamento, sustentados por
uma grande força e esperança. Espero que esse trabalho
traga, mesmo que indiretamente, uma contribuição para
as pesquisas em câncer. E que ajude futuramente, a
responder a pergunta mais freqüente que ouvi desses
pacientes: ”Essa pesquisa é para a cura do câncer?”
AGRADECIMENTOS
Gostaria de agradecer a todos, que de maneiras diferentes, contribuíram para este trabalho:
Ao Orientador Dr. Sérgio Danilo Junho Pena. Por me ensinar a ter um pensamento crítico e
como usufruí-lo e pelos cuidados prestados a mim, em momentos difíceis. Por comprovar a
cada dia, que a ciência básica é o suporte de toda medicina clínica. Sinto-me privilegiada e
muito honrada, por ter tido a preciosa oportunidade de estar sob sua orientação, pois a sua
dedicação ao trabalho, sabedoria e amor pela ciência são admiráveis.
À minha co-orientadora Dra. Helenice Gobbi, pelo aprendizado valioso, amizade e paciência.
Pelo exemplo de dedicação, competência e paixão pelo seu trabalho. Pela ética, honestidade e
simplicidade, com as quais expõe suas idéias e ensinamentos. Agradeço a disponibilidade de
seu laboratório na Faculdade de Medicina, sempre de portas abertas para mim.
À Dra. Cristina Guatimosim Fonseca, minha grande amiga, pelo apoio incomensurável durante
essa trajetória. Pelo exemplo de profissional dedicada à ciência, e que faz aquilo que realmente
gosta. Pela valiosa força que me impulsionou durante esses últimos anos. Pela imensa
generosidade em me escutar, em dar opiniões, e permitir a utilização dos computadores de seu
laboratório para redigir esse trabalho. Gratidão eterna.
Aos Professores do Departamento de Bioquímica e LGB, Glória Franco, Carlos Renato
Machado, Andréia Macedo e Vânia Prado pelas sugestões, críticas e ensinamentos, e
amizade.
Ao Prof. Marcus Vinícius Gomez e Prof. Luiz Armando de Marco pela confiança e amizade.
À Dra. Wolfanga Lentz Boson pela consideração, carinho e grande amizade.
Ao Prof. Marco Antônio Máximo Prado, Marcão, pela longa convivência, orientação e amizade
que se iniciou desde o 2° período da graduação, passando pelo mestrado, até os dias de hoje.
Obrigada pelo apoio e conselhos. Esses foram fundamentais para a minha trajetória.
Ao Prof. Washington Amorim e Dr. Leandro Ramirez, pelos ensinamentos durante meu estágio
no Ambulatório de Mastologia do Hospital das Clínicas/UFMG. Ao Dr. Henrique Vítor Leite,
coordenador do Ambulatório Carlos Chagas.
Ao Prof. Geraldo Brasileiro Filho pelo exemplo de profisionalismo e colaboração em nosso
projeto “Oncogenômica e oncogenética do câncer de mama”.
Ao Dr. Benedito Rossi e Dr. José Cláudio C. Rocha do Hospital A.C. Camargo (São Paulo);
Dra. Anamaria A. Camargo, Dra. Otávia Caballero e Dr. Andrew Simpson do Instituto Ludwig de
pesquisa sobre o câncer (São Paulo), pelas amostras de câncer colorretal utilizadas neste
trabalho.
Ao Prof. Paulo Roberto Agrizzi Nacaratti pela imensa ajuda em estatística e disposição para
rever, com paciência, todos os cálculos. Por me ensinar com linguagem fácil a bioestatística,
que para mim era extremamente complicada.
À Prof. Maria Alice Duarte Matos pela inestimável ajuda na correção do português da minha
tese.
À Prof. Renata Freitas (UFOP) pelo especial interesse em meu trabalho.
À Dra. Andréia Leopoldino pelos primeiros ensinamentos da prática de biologia molecular, pela
paciência e amizade, que mesmo distante, está sempre presente.
Ao Dr. Charles Anacleto, pelo seu espirituoso jeito acolhedor e pela paciência peculiar de me
ensinar desde dicas em biologia molecular, até lições de vida. Pelas conversas divertidas,
amizade e sinceridade.
À Dra. Cláudia Benedetto pela agradável convivência e grande amizade, pelas sugestões e
críticas. Exemplo de grande profissional de peculiar ética e senso de justiça.
À Dra. Patrícia Pellegrino, pelo exemplo de força em vários momentos difíceis que passamos
juntas. Pela amizade e carinho de sempre. Pela exemplar inteligência e disponibilidade em
ajudar.
Ao grupo de “Humanos” pela união em momentos difíceis e ajuda mútua. Vocês
proporcionaram uma trajetória mais leve: Vanessa pela perseverança, Simone Santos pela
tranqüilidade e caráter, Luciana Bastos pela dedicação, Fernanda (Danda) pela técnica,
Fernanda pela honestidade, Rodrigo pelo carinho e atenção, Lucas pela inteligência e Rogério
pela seriedade.
Ao Helder e Carlos Gustavo pelas conversas cômicas e desabafos. Exemplos de pessoas
leves e agradáveis. Pela imensa ajuda dentro e fora do laboratório.
Às doutoras Flávia Parra e Juliana Pimenta, pela grande consideração e carinho. Pelos
momentos de desabafos. Pelas nossas divertidas conversas e conselhos.
Aos doutores Luiz Augusto Pinto e Analina Furtado pelos ensinamentos valiosos.
Ao Allyson Rivelli pela ajuda no LGB e Faculdade de Medicina para o desenvolvimento deste
trabalho.
Aos colegas do Laboratório de Genética e Bioquímica: Alessandra Campos, Alice, Antônio
Henriques, Bruno Chamber, Carlos Eduardo, Carol, Débora Lopes, Débora Naves, Francisco
Lobo, Francisco Prosdocimi, João Pedro, Jorge, Luciana Werneck, Marina Mourão, Marianne
Antunes, Marcela, Michel, Mateus Rajão, Michelle, Pedro, Simone Pires.
À Neuza Antunes, minha querida Neuzinha, pelo grande profissionalismo, confiança,
generosidade, amizade, carinho e por nossas conversas “papo cabeça”.
À Miriam Rodrigues e Kátia Barroso pela inestimável ajuda técnica e profissional. Além de todo
carinho.
Ao Rafael Coelho pela preciosa ajuda técnica.
À direção e aos funcionários do laboratório GENE, Núcleo de Genética Médica/MG, por me
receberem de portas e abraços abertos, sempre que precisei (em atenção à Gabrielle).
Ao Fernando Biava pelo apoio e compreensão durante esses anos.
Às amigas e colegas de profissão, Dra. Lavínia Borges, Dra. Simone Vieira, Dra. Patrícia
Bittencourt e à amiga Dalva, pela grande força durante essa jornada.
Aos colegas do Laboratório de Patologia Mamária da Faculdade de Medicina e alunos da Prof.
Cristina Guatimosim.
À Pós-graduação em Farmacologia Bioquímica e Molecular e ao Departamento de Bioquímica
do IBC/UFMG.
À secretária Sônia Mara, pelo auxílio prestativo durante todos esses anos.
À minha família.
Ao Criador.
i
Pág.
ÍNDICE GERAL i
ÍNDICE DE FIGURAS iv
ÍNDICE DE TABELAS v
LISTA DE ABREVIATURAS vi
RESUMO vii
ABSTRACT viii
INTRODUÇÃO 1
1. Câncer colorretal e câncer de mama 2
1.1 Incidência e fatores de risco 2
2. O câncer é uma doença genômica 4
2.1 Fatores genéticos e epigenéticos 5
2.1.1 Metilação aberrante de DNA em câncer 8
2.1.2 Hipometilação e câncer 10
2.2 Instabilidade de Microssatélites 12
3. Metilenotetraidrofolato redutase (MTHFR) 14
3.1 Freqüências dos genótipos da MTHFR nas populações 18
3.2 MTHFR e câncer colorretal 20
3.3 MTHFR e câncer de mama 21
3.3.1 Álcool, folato, tabagismo e câncer de mama 23
OBJETIVOS 27
Geral 28
Específico 28
MATERIAIS E MÉTODOS 30
1. Amostras utilizadas neste estudo 31
1.1 Amostras de Câncer Colorretal 31
1.2 Amostras controle para estudo do CCR 32
1.3 Extração de DNA das amostras de CCR 32
1.4 Amostras de Câncer de Mama 34
1.4.1 Seleção de casos 34
1.4.1.1 Extração de DNA das amostras de CM
fixadas em formol e incluídas em parafina 37
1.4.1.2 Extração de DNA das amostras provenientes
de células da mucosa bucal (swab bucal) 39
ii
1.4.2 Seleção de amostras controle 40
2. Genotipagem do polimorfismo da MTHFR por PCR-RFLP 41
2.1 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR) 41
2.2 RFLP para Hinf I 42
3. Análise do padrão de metilação e instabilidade de
microssatélites nas amostras de câncer colorretal 43
4.Análise da ancestralidade genômica em amostras
de câncer colorretal 40
4.1 Segregação genômica 44
5. Análise Estatística 44
RESULTADOS 46
1. Estudo do câncer colorretal 47
2. Estudo do câncer de mama 61
DISCUSSÂO 70
1. Estudo do câncer colorretal 71
1.1 Polimorfismo C677T da MTHFR e CCR 71
1.2 MTHFR, CCR e características clínico-patológicas 76
1.3 MTHFR, CCR e mecanismos patogenéticos 78
1.3.1 MTHFR, CCR e Hipermetilação da região
promotora de genes 78
1.3.2 MTHFR, CCR e Instabilidade de
Microssatélites 80
2. Estudo do câncer de mama 86
2.1 Polimorfismo da MTHFR e Câncer de Mama 86
2.2 Polimorfismo da MTHFR, Câncer de Mama
e Status Hormonal 88
2.3 Polimorfismo da MTHFR, Câncer de Mama
e Idade 88
iii
2.4 Polimorfismo da MTHFR, CM e consumo de
Álcool e Cigarro 90
CONCLUSÃO 96
ANEXOS 98
1.1 Aprovação do estudo pelo Comitê de Ética em Pesquisa
do Hospital do Câncer/ São Paulo 99
1.2 Aprovação do estudo pelo Comitê de Ética em Pesquisa
do Hospital das Clínicas da UFMG 100
1.3 Consentimento Informado e Esclarecido utilizado no
estudo de câncer de mama 101
1.4 Estadiamento de Dukes.para CCR 102
1.5 Estadiamento Clínico do Câncer de Mama baseado
no sistema TNM 103
1.6 Gramas de álcool em algumas bebidas comuns 104
ARTIGO 105
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 114
iv
ÍNDICE DE FIGURAS
N° Pág.
1 Esquema do metabolismo de um-carbono ou
metabolismo do folato 17
4.1 Gel de poliacrilamida corado pela prata com
os genótipos da MTIFH 48
4.2 Amostras de tumor colorretal microssatélite instáveis
e o genótipo do polimorfismo da MTHFR 54
4.3 Análise dos tamanhos dos fragmentos de
inserção-deleção (indels) em uma amostra de CCR,
utilizando o programa Genetic Profiler (versão 2.2) 56-59
4.4 Proporções de indivíduos europeus, africanos,
ameríndeos e a presença ou ausência
de Instabilidade de Microssatélites 60
4.4 Representação gráfica da idade (em anos) da
ocorrência da menarca, da idade das mulheres
no momento do diagnóstico de CM e da idade
da ocorrência da menopausa 63
4.5 Histograma tridimensional mostrando a estratificação
das pacientes com CM, de acordo com estadiamento
da doença, e genótipos da MTIHF C677T 68
4.6 Distribuição das pacientes com CM de acordo com
estadiamento da doença e a presença ou não de
etilismo e/ou tabagismo 69
5.1 Distribuição das freqüências genotípicas 677TT e
677CC+CT da MTHFR em alguns países do mundo 85
v
ÍNDICE DE TABELAS
N° Pág
3.1 Dados clínicos (sexo, idade e estadiamento TNM)
de 98 dos 106 pacientes portadores de CCR dos quais
se obtiveram as amostras de DNA utilizadas neste
trabalho 33
4.1 Frequência do genótipo do polimorfismo da MTIFH
C677T em pacientes com e sem câncer colorretal 49
4.2 A relação entre o polimorfismo da MTIFH C677T
e o sexo, a idade e o estadiamento por Dukes dos
pacientes com câncer colorretal 51
4.3 Os polimorfismos da MTHFR C677T e metilação
do DNA de cinco genes associados ao CCR
(DAPK, MGMT, hMLH1, p16
INK4a
e p14
ARF
) 53
4.4 Associação entre o polimorfismo da MTHFR
C677T e instabilidade de microssatélite no CCR 55
4.5 Frequência do genótipo do polimorfismo
da MTIFH C677T em pacientes com e
sem câncer de mama 62
4.6 Relação entre mulheres com câncer de mama
na pré- e pós-menopausa, idade superior e
inferior a 70 anos e o polimorfismo C677T da MTIFH 65
4.7 Relação entre o consumo de álcool e tabagismo
em mulheres com câncer de mama e o
polimorfismo C677T 66
vi
LISTA DE ABREVIATURAS
5-10 TIF – 5-10 metileno tetraidrofolato
5-TIF – 5- metiltetraidrofolato
CCR – câncer colorretal humano
CM – câncer de mama humano
CpG – citosina que precede guanosina
DNA – ácido desoxiribonucléico
DNMT - DNA metiltransferase
Hinf I – enzima de restrição Hinf I
INCA –Instituto Nacional do Câncer
Indels - locos polimórficos bialélicos de inserção-deleção
MMR – sistema de reparo de DNA por erro de pareamento
MTHFR – metilenotetraidrofolato redutase
MSI – instabilidade de microssatélites
MSI-H – alto nível de instabilidade
MSI-L – baixo nível de instabilidade
MSS – estabilidade de microssatélites
PCR – reação em cadeia da polimerase
RFLP – polimorfismo de comprimento de fragmento de restrição
RNA – ácido ribonucléico
r.p.m. – rotações por minuto
SAH - adenosilhomocisteína sulfato
SAM – adenosilmetionina sulfato
TNM – tumor, nódulo linfático, metástase
vii
RESUMO
Estudos epidemiológicos sugerem que o polimorfismo da metilenotetraidrofolato
redutase (MTHFR), C677T, pode modificar o risco de câncer colorretal (CCR) e
câncer de mama (CM). O polimorfismo C677T está associado à expressão de uma
enzima termolábil de baixa atividade, e afeta diretamente o nível de folato, crucial
para evitar o estado de hipometilação genômica. Considerando que as
anormalidades de metilação são importantes na patogênese do CCR e CM, este
trabalho avaliou em amostras de CCR, a relação entre o polimorfismo C677T da
MTHFR, hipermetilação da região promotora de cinco genes (DAPK, MGMT,
hMLH1, p16
INK4a
and p14
ARF
) e instabilidade de microssatélites (MSI). Nos casos
de CM, os genótipos do polimorfismo C677T foram analisados com relação aos
parâmetros clínicos das pacientes, e o estadiamento da doença. A genotipagem do
polimorfismo C677T foi realizada através da técnica PCR-RFLP. Não foi
encontrada associação entre genótipo 677TT e CCR. Não houve diferença das
freqüências genotípicas da C677T, em relação à presença ou ausência de
hipermetilação de um ou mais locos analisados. Por outro lado, houve uma forte
associação entre o genótipo TT e a presença de MSI. Essa associação parece ser
independente do status de metilação do promotor do gene hMLH1, ou da
ancestralidade genômica dos pacientes (genotipados através da análise de indels).
Em relação ao CM, não foi encontrada associação estatística entre genótipo TT e
CM. Não houve diferença estatística das freqüências genotípicas da C677T com
relação ao tabagismo, à idade e status hormonal (pré ou pós-menopausa), no
momento do diagnóstico. No entanto, foi encontrada uma forte associação
estatística entre o genótipo TT e pacientes com CM etilistas e pacientes
diagnosticadas no estadio IIIA. Nossos resultados sugerem que os efeitos
deletérios advindos da baixa atividade da MTHFR, associados à potente ação
antagonista do folato, induzida pelo álcool, podem aumentar o risco para CM.
Apesar de encontrarmos associação entre estadio avançado da doença e genótipo
TT, o estadiamento neste estudo pode estar ligado à temporalidade do
diagnóstico, não refletindo a agressividade tumoral. Estudos adicionais focados na
relação do álcool, estadiamento para CM e polimorfismo da MTHFR devem ser
realizados. O uso preventivo de folato, para pacientes etilistas portadoras do
genótipo TT, deve ser considerado, com o objetivo de reverter os efeitos do
genótipo 677TT no CM.
viii
ABSTRACT
Epidemiologic studies suggest that the methylenetetrahydrofolate reductase
(MTHFR) C677T polymorphism may modify the risk of both colorectal cancer
(CRC) and breast cancer (BC). The C677T polymorphism is associated with the
expression of a thermolabile enzyme with decreased activity that influences the
levels of methyl-donor molecules. Considering that methylation abnormalities
appear to be important in the pathogenesis of CRC, we have examined the
relationship between the genotype at the MTHFR C677T polymorphism,
hypermethylation of the promoter region of five genes (DAPK, MGMT, hMLH1,
p16
INK4a
and p14
ARF
) and microsatellite instability (MSI) in 106 patients with CCR. In
195 BC cases, the genotype C677T was correlated with clinical parameters of the
patients and stage of disease. The MTHFR C677T polymorphism was assessed by
using polymerase chain reaction-restriction fragment length polymorphism (PCR-
RFLP). The analysis of MTHFR 677 TT genotype between cases and controls did
not reveal any statistically significant difference. We did not show statistically
significant differences in the genotypic frequencies of the MTHFR C677T
polymorphism with or without hypermethylation of one or multiple loci. However,
our study found a significant excess of 677TT individuals among patients with CRC
with MSI. This strong association appears to be independent of the methylation
status of hMLH1 or of the biogeographical genomic ancestry of the patients (typed
utilizing indels). An explanation for this mechanism between MSI, 677TT genotype
and CCR is not clear. We did not find statistical difference in the frequency of 677
TT genotype between controls and BC cases. In BC patients, no frequency
differences of 677 TT genotype were observed among smoking habit, age, and
menopausal status at the initial diagnosis. However, a strong statistical association
was found between TT genotype and BC alcohol drinkers and BC stage IIIA. Our
results suggest that the low activity of the MTHFR, and the powerful folate
antagonistic action of alcohol, could increase the risk for BC. Besides the
association between severity of disease and TT genotype, in this study, BC stage is
linked to temporality of diagnosis and does not reflect tumor aggressiveness.
Additional studies should be carried out to clarify the relationship among alcohol
drinking, stage, and. MTHFR C677T polymorphism. The preventive use of folate for
BC drinkers, bearing 677 TT genotype, may be considered to reverse the effect of
genotype 677TT.
1
1.INTRODUÇÃO
2
1. CÂNCER COLORRETAL E CÂNCER DE MAMA
1.1 Incidência e Fatores de Risco
O câncer colorretal humano (CCR) é um dos tumores mais freqüentes, e
de alta incidência em todo o mundo. A cada ano são diagnosticados mais de
100.000 casos nos Estados Unidos (Jemal et a., 2004). As Estimativas de
Incidência de Câncer no Brasil para 2006, publicadas pelo Instituto Nacional do
Câncer (INCA), apontam o câncer colorretal como o 5º tumor maligno mais
freqüente entre homens (com 11.390 casos novos), e o 4º entre as mulheres
(13.970 casos novos). A maior incidência de casos é de câncer esporádico e
ocorre na faixa etária entre 50 e 70 anos, mas as possibilidades de seu
desenvolvimento aumentam a partir dos 40 anos. A maior concentração dos de
CCR ocorre nas regiões Sul e Sudeste do Brasil (Brasil, 2006).
Os fatores ambientais e hereditários que contribuem para o
aparecimento da doença são: presença de pólipos adenomatosos (incluindo
polipose familar adenomatosa), excesso de peso, tabagismo, alta ingestão de
álcool e dieta pobre em vegetais e rica em alimentos de origem animal,
particularmente a carne (Sharp & Little, 2004).
O câncer de mama (CM) é muito freqüente e constitui um grave
problema de saúde pública. É, provavelmente, o câncer mais temido pelas
mulheres, devido à possível mutilação pelo tratamento, afetando a sexualidade
e a imagem pessoal. O CM esporádico é relativamente raro antes dos 35 anos
de idade, mas, acima desta faixa etária, sua incidência cresce rápida e
progressivamente. Estima-se que a incidência mundial do câncer de mama é
3
de 1 milhão de casos por ano, sendo que mais da metade deles se concentra
nos Estados Unidos e Europa (Dumitrescu & Cotarla, 2005). As estatísticas
indicam aumento de sua freqüência nos países em desenvolvimento, sobretudo
nos ocidentais. De acordo com a Estimativa de Incidência de Câncer no Brasil
para 2006, o câncer de mama será o segundo de maior incidência, com 48.930
casos, e a primeira causa de morte entre as mulheres (Brasil, 2006). Apesar de
a incidência estar aumentando com o tempo, felizmente, nos últimos 10-15
anos, a mortalidade declinou em 2,3% por ano, devido a múltiplos fatores,
incluindo avanços na triagem do câncer e novos regimes de tratamento
(Stewart et al., 2004).
Alguns fatores de risco para o desenvolvimento estão bem estabelecidos
e incluem: idade (aumento em 100 vezes na incidência após 45 anos) (Hulka &
Moorman, 2001), localização geográfica (o país com a maior incidência
atualmente é a Holanda), status sócio econômico (maior número de casos em
classe alta), eventos reprodutivos (menarca, menopausa, gravidez e
amamentação), hormônios exógenos (terapia de reposição hormonal), estilo de
vida (atividade física, consumo de álcool, tipo de alimentação, obesidade),
densidade mamográfica; história pregressa de doença benigna da mama,
fatores ambientais (exposição à irradiação ionizante) e história familiar positiva
(Dumitrescu & Cotarla, 2005).
Apesar dos avanços tecnológicos e terapêuticos que visam a melhorar o
prognóstico e a sobrevida dos pacientes com ambos os tumores, a detecção
precoce ainda é falha. Estima-se que 50% dos casos são diagnosticados em
estádios avançados (Ministério da Saúde. Estimativa 2005: Incidência de
4
Câncer no Brasil). Neste contexto, a busca pela melhoria de estratégias
preventivas e/ou diagnósticas são necessárias para avaliar os pacientes. No
CM a mastectomia é curativa para as pacientes com lesão in situ (carcinoma in
situ), e no CCR, a detecção precoce diminui significativamente a taxa de
mortalidade por essa doença. Por isso, torna-se urgente a busca de
marcadores moleculares de valor diagnóstico e prognóstico, relacionados a
tumorigênese. Recentemente, vários marcadores moleculares tumorais estão
sendo descobertos e, futuramente, poderão ser ferramentas de detecção
precoce ou que permitirão predizer o risco de desenvolvimento tumoral. Assim
será viável diferenciar os pacientes com alto risco de metástases daqueles com
lesão in situ, e determinar a conduta terapêutica mais adequada (Going &
Gusterson, 1999).
2. O CÂNCER É UMA DOENÇA GENÔMICA
Atualmente, sabe-se que o câncer é uma doença eminentemente
genômica (e conseqüentemente genética) e emerge da expansão territorial de
um clone que, através de mutações somáticas cumulativas (herdadas ou
adquiridas ao longo da vida), adquire vantagens adaptativas crescentes e
progressivas (Weinberg, 1996). Durante a tumorigênese, uma célula normal
adquire a habilidade de esquivar-se dos mecanismos reguladores que
controlam o crescimento celular, a morte celular programada ou apoptose, a
angiogênese e a invasão do tecido adjacente e à distância, dando origem às
metástases (Weinberg, 1996; Hanahan & Weinberg, 2000).
5
A perda precoce da capacidade de controle na replicação celular pode
ser causada por alterações genéticas e epigenéticas, que são perpetuadas
com a progressão do tumor. Essas alterações interferem no funcionamento do
complexo e eficiente sistema de monitoramento (caretaker) do DNA que
envolve genes e enzimas de reparo de DNA, genes supressores de tumor e
oncogenes, gerando uma instabilidade genômica que modifica drasticamente a
maquinaria celular (Klausner, 2002). Como conseqüência do mau
funcionamento desse sistema de vigília genômico, as células adquirem a
capacidade de apresentar insensibilidade aos sinais de anti-crescimento, auto-
suficiência da produção dos sinais mitogênicos de crescimento, resistência à
apoptose e indução da angiogênese (Hanahan & Weinberg, 2000). Assim,
ocorre uma rápida e desordenada expansão clonal, originando tumores
agressivos, invadindo o tecido primário local e adjacente, e que, através de
metástases, são capazes de modificar a homeostasia de outros órgãos e
tecidos (Lengauer, 1998; Keith & Loeb, 2000).
.
2.1 Fatores Genéticos e Epigenéticos
Os estudos atuais sugerem que o desenvolvimento do tumor mamário
de baixo grau segue etapas seqüenciais distintas, iniciando-se como
proliferações ductais (hiperplasias com ou sem atipias), e gradualmente o
tumor progride para carcinoma in situ, carcinoma invasor e carcinoma
metastático. O surgimento do CCR segue a seqüência (“multi-step”) de
adenoma para carcinoma. Ambos os modelos de desenvolvimento da
carcinogênese mamária e colorretal estão diretamente relacionados ao
6
acúmulo de modificações genéticas e epigenéticas (Szyf et al., 2004a). A
progressão tumoral do CM para o tipo invasor e o tipo metastático
provavelmente resulta do acúmulo no carcinoma in situ de vários eventos
genéticos e epigenéticos (Lacroix et al., 2004).
Há anos atrás, o fator genético era considerado como o fator causal da
carcinogênese, pois explica a característica irreversível dos tumores. É
indiscutível que a presença de alterações genéticas (mutações em genes,
rearranjos, deleções, duplicações, inserções, erro de pareamento de bases e
recombinação) que acometem o DNA das células é evento marcante para o
início, desenvolvimento e manutenção do câncer (Sugimura & Ushijima, 2000;
Feinberg, 2004). O câncer colorretal hereditário (polipose adenomatosa
familiar) é uma causa rara de CCR, ocorrendo em menos de 1% de todos os
casos. É uma doença autossômica dominante, causada por mutações
germinativas no gene APC (“adenomatous polyposis coli”). Aproximadamente
de 5 a 10% de todos os casos de câncer de mama e ovário são hereditários
(Offit, 2000), a herança é do tipo autossômica dominante e os portadores de
mutação dos genes supressores de tumor BRCA1 ou BRCA2 apresentam
penetrância, aos 70 anos, de 70-85% para carcinoma de mama e, de 20-60%,
para carcinoma de ovário (Ford et al., 1994).
Porém, em decorrência das evidências de que algumas alterações são
reversíveis, sendo estas características singulares dos fenômenos
epigenéticos, os estudos voltados para o modelo epigenético ajudaram a
compreender o quebra-cabeça do paradigma da biologia do câncer. O modelo
epigenético de câncer não contradiz o modelo genético, ambos se
7
complementam. Na verdade, um pode predispor ao outro na indução da
carcinogênese (Verma & Srivastava, 2002).
Alterações epigenéticas são modificações do genoma transmitidas
durante a divisão celular, que não envolvem mudança na sequência de DNA
(Esteller, 2003; Feinberg, 2004), apresentam um caráter hereditário e são
capazes de modificar a expressão gênica (Jones & Laird, 1999). As
características singulares das alterações epigenéticas que as diferenciam das
alterações genéticas incluem: (1) sua potencial reversibilidade; (2) efeito de
posição – isto é, promove efeitos nos genes à distância, porém, quanto maior a
distância entre o ponto de alteração epigenética e o gene alvo, menor será o
poder de alteração deste, podendo até mesmo inexistir; (3) alta freqüência de
alterações, infinitamente maior do que aquelas presentes em mutações e (4)
pode ser modificada pelo ambiente (Feinberg, 2004). Geralmente as
modificações epigenéticas não estão associadas ao câncer familiar em
contraposição ao modelo genético.
Notadamente, um dos principais fenômenos epigenéticos, a metilação
de DNA, tem sido reconhecida como uma das principais modificações
presentes em neoplasias (Sugimura & Ushijima, 2000). A hipometilação do
genoma
e a hipermetilação (restrita às áreas localizadas dentro da região
promotora de genes, as ilhas de CpG) são cruciais para a manutenção da
integridade celular. Os eventos de hipometilação ou hipermetilação de genes
podem ocorrer simultaneamente, sem necessariamente estabelecer uma
relação de causa e efeito. Além disso, esses fenômenos podem promover o
crescimento celular desordenado em determinado tecido e, em outro, diminuir o
risco de câncer, não existindo uma regra rígida. O que exemplifica bem essa
8
informação foram experimentos em que se utilizaram ratos, nos quais
evidenciou-se que a redução da atividade da DNA metiltransferase (DNMT)
leva a hipometilação e instabilidade cromossômica, aumentando a incidência
de linfomas e reduzindo tumores intestinais em ratos (Laird et al., 1995; Gaudet
et al., 2003). Um equilíbrio entre esses eventos é relevante para garantir, pelo
menos em parte, um status epigenético desfavorável para a formação e
progressão tumoral.
2.1.1 Metilação aberrante de DNA em Câncer
Em humanos, a metilação de DNA envolve, predominantemente, a
adição covalente de um grupo metil (CH
3
) à posição 5’ da citosina que precede
uma guanosina na seqüência de DNA (dinucleotídeo CpG). A distribuição dos
grupamentos CpG no genoma é assimétrica, e localizam-se principalmente
reunidos (“ilhas CpG”) nas regiões de promotores de genes (Robertson &
Wolffe, 2000). Pelo menos metade dos genes, em nosso genoma, possui
regiões ricas de ilhas CpG nos promotores. Na imensidão do genoma humano,
cerca de 80% dos nucleotídeos CpG, que não pertencem às ilhas CpG,
encontram-se fortemente metilados (Herman & Baylin, 2003). Em contraste, os
dinucleotídeos presentes nas ilhas CpG, especialmente aqueles associados
aos promotores, geralmente se encontram não-metilados (Robertson & Wolffe,
2000). A metilação que ocorre nas ilhas CpG localizadas em promotores
silencia a expressão gênica e é considerado um evento celular normal que
regula a expressão gênica.
9
A hipermetilação é parte de um processo que afeta vários genes
simultaneamente, alguns dos quais podem ser cruciais para a formação de
uma neoplasia e/ou progressão tumoral. Essa alteração é evento
freqüentemente observado em casos de câncer esporádicos (Esteller et al.,
2001).
A inativação gênica por metilação pode produzir seletivamente a perda
da função de um gene supressor tumoral (De Bustros et al., 1988). Na verdade,
já foi identificada a presença de hipermetilação da região promotora de 66
diferentes genes, todos eles envolvidos com o desenvolvimento tumoral (Issa
et al., 1994). Dentre esses, destacam-se o gene supressor de tumor BRCA1,
os genes envolvidos no ciclo celular p16
INK4a
, p 14
ARF
(Baylin et al., 1998; Issa
et al., 1994), os genes com provável função supressora tumoral CDH1
(caderina-E), ESR1 e ESR2 (receptor de estrógeno) (Issa et al., 1994; Parrela
et al., 2004), os genes envolvidos no reparo de DNA, hMLH1 (homólogo
humano do MutL bacteriano) e MGMT (O
6
-metilguanina-DNA metiltransferase)
e o gene associado a apoptose ligado a proteína quinase, DAPK. A metilação
aberrante - em conjunto ou isoladamente - desses genes está freqüentemente
associada à patogênese do CCR e também do CM. Por exemplo, 58% dos
CCR apresentaram hipermetilação em pelo menos uma região promotora dos
genes DAPK, MGMT, hMLH1, p16
INK4a
e p14
ARF
(Anacleto et al., 2005 a e b).
Já foram descritos mais de 35 genes com hipermetilação da região promotora
associados ao CM. No CM a hipermetilação de alguns genes acontece
precocemente, antes do desenvolvimento de metástases (Lacroix et al., 2004)
10
2.1.2 Hipometilação e Câncer
Várias linhas de evidência indicam que, quando ilhas CpG são
metiladas, o genoma das células cancerosas torna-se hipometilado. Uma célula
maligna contém entre 20 a 60% a menos de 5-metilcitosina do que uma célula
normal. As regiões no genoma que freqüentemente se encontram
hipometiladas incluem os exons, os introns e as seqüências de DNA
repetitivas. A hipometilação genômica contribui para a carcinogênese por meio
de três possíveis mecanismos: (1) instabilidade cromossômica, (2) reativação
de elementos transponíveis, (3) perda do imprinting (Liu et al., 2003; Szyf et al.,
2004; Esteller 2005). O DNA não-metilado favorece recombinação mitótica
levando à perda da heterozigose à promoção de rearranjos, detectáveis em
cariótipos. Além disso, a demetilação em seqüências centroméricas é comum
no câncer humano e deve ter um papel importante na aneuploidia (Esteller,
2003). A perda da metilação poderia ativar a expressão de protoncogenes
quiescentes, ativando uma cascata de eventos que culminaria com a
transformação maligna (Goelz et al., 1985).
As principais fontes alimentares doadoras de grupamentos metila são os
folatos, a metionina e a vitamina B12. Uma dieta pobre nestes nutrientes induz
a ocorrência de hipometilação genômica em humanos e em ratos. Esses
animais, quando submetidos a dieta pobre nestes nutrientes, desenvolveram
câncer hepático, câncer de pulmão e CCR (Pogribny, 1997). Em humanos, a
hipometilação está associada a vários cânceres, incluindo CCR (Pufulete et al.,
2003), mama (Szyf et al., 2004) e ovário (Cheng et al., 1997), e tumor de Wilms
(Ehrlich et al., 2002). Não se sabe precisamente qual é o nível de deficiência de
11
folato que é capaz de promover hipometilação ou instabilidade genômica.
Experimentos in vitro, em que se utilizaram cultura de células humanas,
mostraram que níveis de ácido fólico superiores a 180 nmol/L e 120 nmol/L
minimizam quebra de DNA e incorporação errônea de uracila, respectivamente
(Fenech, 2003). Em humanos, indivíduos com nível de folato sérico entre 8 a
35 nmol/L estão relacionados à instabilidade genômica (Kimura et al., 2004).
Em conjunto, níveis de vitamina B12 maiores que 300 pmol/L, folato plasmático
maiores que 34 nmol/L e homocisteína plasmática menores que 7,5 Pmol/L
podem reduzir a hipometilação de DNA em humanos. Essas concentrações
são alcançadas quando há ingestão diária de pelo menos 400Pg/dia de ácido
fólico e 2Pg/dia de vitamina B12 (Fenech, 2003).
É amplamente aceito que a hipometilação no câncer não é um evento
restrito apenas ao tecido tumoral. A presença de hipometilação foi observada
tanto nas células do tumor colorretal, quanto na mucosa colônica não-afetada
do mesmo paciente (Feinberg et al., 1983, Goelz et al., 1985, Cravo et al.,
1994). Isso reforça a teoria de que a hipometilação é um evento precoce e
consistente na carcinogênese.
Uma metilação eficiente do genoma depende da adequada
disponibilidade dos substratos doadores do grupamento metila.
Bioquimicamente, a manutenção desses substratos é realizada através do
funcionamento eficaz do metabolismo de um-carbono ou metabolismo do
folato. Teoricamente, se esse metabolismo for ineficiente, a hipometilação
poderá ocorrer, contribuindo para a progressão da carcinogênese. Devido a
isso, é crescente o número de trabalhos que estudam a fundo a relação entre
12
as enzimas pertencentes ao metabolismo do folato, a hipometilação e o CCR e
CM.
2.2 Instabilidade de Microssatélites
A instabilidade de microssatélites (MSI) representa um dos mecanismos
moleculares de instabilidade genômica. Os microssatélites são repetições em
tandem de seqüências de DNA (mono, di, tri, tetra e pentanucleotídeos) que
estão espalhados em todo genoma. Por causa da sua natureza repetitiva,
essas seqüências estão sempre sujeitas a alterações freqüentes no número de
repetições, originando a instabilidade de microssatélites (MSI). A MSI é definida
como uma alteração no tamanho do microssatélite causado por deleção ou
inserção de nucleotídeos no DNA do tumor quando comparado com o tecido
normal (Boland et al., 1998). Esse fenômeno é causado por falha do sistema de
reparo por erro de pareamento (MMR, do inglês mismatch repair) que ocorre
durante a replicação de DNA. Mutações germinativas nos genes que estão
envolvidos no reparo de DNA, como MLH1, MSH2 ou MSH6, diminuem a
eficiência do MMR, e culminam em taxas de mutações em microssatélites 100
vezes maiores do que aquelas observadas em células normais (Thomas et al.,
1996).
Um critério mínimo para determinação da MSI no CCR foi desenvolvido
pelo National Cancer Institute (NCI, Bethesda Consensus Panel), o qual
determina a inclusão da avaliação de dois microssatélites com repetições
mononucleotídeos (BAT-25 e BAT-26) e três microssatélites com repetições
dinucleotídeos (D2S123, D5S346 e D17S250). Os cânceres são subdivididos
13
em 3 grupos: microssatélites estáveis (MSS), baixa MSI (MSI-L; menos de 30-
40% de MSI nos locos investigados) e alta MSI (MSI-H; mais de 30-40% de
MSI nos locos investigados) (Boland et al., 1998). Parece que a incidência de
tumores com MSI varia de acordo com o grupo étnico estudado. A proporção
de casos de CCR com MSI em indivíduos com descendência africana (45%) é
superior à proporção observada em indivíduos de origem européia (20%)
(Ashktorab et al., 2003).
Dois mecanismos patogênicos foram propostos para o desenvolvimento
dos CCRs (Lengauer et al., 1997). O primeiro, denominado “clássico”,
representa 85% dos casos, apresenta estabilidade de microssatélites e
depende de eventos mutacionais cumulativos (germinativos ou somáticos) em
genes supressores de tumor e oncogenes, e freqüentemente envolve deleções
cromossômicas, aneuploidias, perda alélica, amplificações e translocações
(Cottrell et al., 1992).
O segundo mecanismo, chamado “mutador”, representa os 15 % dos
CCRs remanescentes. Esses tumores apresentam alta freqüência de MSI e,
portanto, estão relacionados a mutações (germinativas ou somáticas) dos
genes relacionados à maquinaria do sistema de reparo de DNA. Notadamente,
os tumores “mutadores” apresentam um fenótipo específico (fenótipo mutador),
que inclui a localização preferencial na região proximal do cólon direito, do tipo
mucinoso, histologicamente pouco diferenciados e com infiltração linfocitária
marcante. Esses tumores apresentam melhor prognóstico e são resistentes à
quimioterapia adjuvante com 5-fluorouracil (Thibodeau et al., 1993; Ribic et al.,
2003; Lynch et al., 2003). Além disso, a instabilidade de microssatélites neste
mecanismo, freqüentemente resulta da inativação do gene hMLH1 causado por
14
hipermetilação de sua região promotora (Herman & Baylin, 2000). Estudos
recentes têm mostrado que no câncer colorretal esporádico, a perda da função
de outros diferentes genes envolvidos no reparo de DNA ocorre devido à
metilação aberrante de seus promotores. Isso reforça a estreita relação entre
MSI e hipermetilação na patogênese do CCR.
A informação sobre MSI e CM é confusa e inconsistente. As incidências
variam entre 0 a 30%. Entretanto, provavelmente menos de 10% dos tumores
são MSI-H. O papel exato da mutação dos genes de reparo (MMR) no
desenvolvimento e prognóstico do CM requer melhores investigações (Schmitt
et al., 1999; Lawes et al., 2002)
3. METILENOTETRAIDROFOLATO REDUTASE (MTHFR)
Um dos possíveis fatores de risco recentemente proposto para o CCR e
CM é o polimorfismo C677T da MTHFR (revisto por Sharp & Little, 2004,
Gershoni-Baruch et al., 2000). Essa ligação é bastante interessante, pois
fenômenos epigenéticos, como hipermetilação da região promotora de genes e
hipometilação genômica, são comuns em ambos os tipos de câncer. A MTHFR
apresenta um papel central no complexo metabolismo de um-carbono - ou
metabolismo do folato - e determina o equilíbrio entre as várias formas de
folato, essenciais para metilação e síntese de DNA.
O gene autossômico humano da MTHFR está localizado no
cromossomo 1p36.3 e codifica uma flavoproteína de 656 aminoácidos. A
MTHFR catalisa a conversão de 5-10-metilenotetraidrofolato (5-10 TIF) em 5-
15
metiltetraidrofolato (5-TIF, principal forma de folato plasmático circulante) que é
um doador de grupamentos de carbono para a síntese de novo de metionina
(Yamada et al., 2001; Kawakami et al., 2003). A metionina é a precursora para
síntese de adenosilmetionina sulfato (SAM), um importante doador de
grupamentos metila para metilação do DNA (Yamada et al., 2001, Kawakami et
al., 2003). A enzima MTHFR tem um papel crucial no metabolismo do folato,
importante para a manutenção da biossíntese de DNA e/ou RNA e metilação
de DNA genômico (figura 1). É amplamente aceito que na ausência desses
eventos, instala-se uma instabilidade genômica, que pode ser crítica para
transformação oncogênica de células humanas, favorecendo uma possível
ligação entre a enzima MTHFR e a carcinogênese. Atualmente, tem sido
investigada a contribuição de outras enzimas (timidilato sintetase e metionina
sintetase) que pertencem ao ciclo do folato, isoladamente ou em associação ao
polimorfismo da MTHFR, na gênese do câncer (Ulvik et al., 2004; Etienne et al.,
2003; Ricciardiello et al., 2005).
O polimorfismo mais importante do gene da MTHFR encontra-se na
posição 677 (exon 4, códon 222) e altera um aminoácido altamente conservado
no domínio catalítico N-terminal (C677T/Ala222Val). O camundongo com
inativação do gene da MTHFR (MTHFR-knockout) apresenta morte com
apenas alguns dias de vida (Chen et al., 2001). O polimorfismo C677T se
localiza na base do sítio de ligação do co-fator flavina adenina dinicleotídeo
(FAD), e assim diminui a afinidade de ligação do FAD à MTHFR e aumenta a
taxa de dissociação do FAD à enzima (Guenther et al., 1999). Devido a isso, os
indivíduos portadores do genótipo 677TT e 677CT estão associados à
expressão de uma aloenzima termolábil com 30% e 60% de atividade
16
enzimática, quando comparados com genótipo 677CC (Frosst et al., 1995). Um
outro polimorfismo, A1298C (glutamina para alanina, exon 7, codon 1298), é
menos importante do ponto de vista bioquímico, pois altera menos a atividade
enzimática da MTHFR (Weisberg et al., 1998). Os dois polimorfismos se
encontram em desequilíbrio de ligação (C677T e A1298C) na população geral
(Stegmann et al., 1999). Outros polimorfismos no gene da MTHFR têm sido
reportados nas posições 1059, 1289, 1317 e 1793, entretanto são bem menos
comuns do que o C677T e o A1298C, e a importância funcional de todos eles
ainda não foi esclarecida. A homozigose do alelo 677 T está associada com
níveis plasmáticos elevados de homocisteína, baixos níveis de folato sérico
(Kluijtmans et al., 1998) e hipometilação genômica (Stern et al., 2000). Esses
eventos em conjunto aumentam o risco para uma série de manifestações
clínicas, como doenças cardiovasculares, retardo de desenvolvimento e
defeitos de formação do tubo neural em fetos, complicações gestacionais,
desordens psiquiátricas e câncer (para revisão Sharp & Little, 2004). Os tipos
de câncer mais estudados incluem o cancer gástrico (Shen et al., 2001), o
câncer esofágico (Song et al., 2001), o CCR (van Rijnsoever et al., 2002;
Heijmans et al., 2003) e adenoma colorretal (Pufulete et al., 2003), o CM
(Gershoni-Barush et al., 2000; Semenza et al., 2003), o câncer de colo de útero
(Piyathilake et al., 2000; Goodman et al., 2001 Gerhard et al. 2003; Kang et al.,
2005) e as leucemias (Skibola et al., 1999).
17
17
Folato
Diidrofolato
TIF
5-10 MTIFR
5 metil TIF
10 formil TIF
Síntese de DNA
Síntese de DNA
Síntese de
Pirimidinas
Síntese de
Purinas
Deoxiuridilato
(dUMP)
Deoxitimidilato
(dTMP)
Dieta
Metionina
Homocisteína
Cistationina
SAH
SAM
DNMTs
Metilação de DNA
Metilação de outras
moléculas bioativas
como histonas,
Lipídeos e RNA
DIFR
MTIFR
TS
Figura 1: Esquema do metabolismo de um-carbono ou metabolismo do folato. SAM= adenosil-metionina sulfato;
SAH=adenosilhomocisteína sulfato; TS= timidilato sintetase; DIFR= dihidrofolato redutase; TIF= tetraidrofolato;
MTIFR= metilenotetraidrofolato redutase; MS= metionina sintetase; B12= vitamina B12; B6= vitamina B6;
DNMTs= DNA metiltransferases; CBS= cistationa beta sintetase; CH
3
= grupamento metila; CpG= citosina que
precede guanosina. * Alvo para metotrexato; ** Alvo para 5-fluoracil. Adaptado de Lamprecht & Lipkin, 2003.
(Nature Reviews – Cancer)
*
**
Folato
Diidrofolato
TIF
5-10 MTIFR
5 metil TIF
10 formil TIF
Síntese de DNA
Síntese de DNA
Síntese de
Pirimidinas
Síntese de
Purinas
Deoxiuridilato
(dUMP)
Deoxitimidilato
(dTMP)
Dieta
Metionina
Homocisteína
Cistationina
SAH
SAM
DNMTs
Metilação de DNA
Metilação de outras
moléculas bioativas
como histonas,
Lipídeos e RNA
DIFR
MTIFR
TS
Figura 1: Esquema do metabolismo de um-carbono ou metabolismo do folato. SAM= adenosil-metionina sulfato;
SAH=adenosilhomocisteína sulfato; TS= timidilato sintetase; DIFR= dihidrofolato redutase; TIF= tetraidrofolato;
MTIFR= metilenotetraidrofolato redutase; MS= metionina sintetase; B12= vitamina B12; B6= vitamina B6;
DNMTs= DNA metiltransferases; CBS= cistationa beta sintetase; CH
3
= grupamento metila; CpG= citosina que
precede guanosina. * Alvo para metotrexato; ** Alvo para 5-fluoracil. Adaptado de Lamprecht & Lipkin, 2003.
(Nature Reviews – Cancer)
*
**
18
3.1 Freqüências dos genótipos da MTHFR nas populações
Existe uma variação étnica e geográfica na distribuição da freqüência do
alelo 677T no mundo todo. Um estudo recente (Wilcken et al., 2006) avaliou a
freqüência do alelo T em 7.000 recém-nascidos, em 16 áreas em todo mundo.
Na Europa, a prevalência do genótipo 677TT aumenta nitidamente quando se
caminha em direção ao sul do continente, partindo de valores menores no norte
(4-7% na Finlândia, Helsink, Nordeste da Holanda e Rússia), para valores
intermediários na França e Hungria (8-10%) até valores altos no sudeste (12-
15% na Espanha e norte da Itália) com o pico no sudeste da Itália (20-26% na
região da Campanha e Sicília). O mesmo se observa na América do Norte,
onde a freqüência de homozigotos TT aumenta do oeste do Canadá para a
região sul dos Estados Unidos, com um pico no México (32% - 677TT). A
variação étnica do genótipo 677TT é aparente entre os grupos, sendo maior
nos indivíduos de origem hispânica (17%), intermediária entre os indivíduos de
origem européia (10-15%) e extremamente baixa nos indivíduos
afrodescendentes americanos (2,7%). O trabalho de Wilcken et al. (2006) não
avaliou nenhuma população de origem africana, porém essa baixa
porcentagem do genótipo 677TT também foi reportada em três estudos
realizados com indivíduos da região do sub-Sahara africano, África do Sul e
Zimbábue e cinco estudos que avaliaram negros norte-americanos. Em 234
indivíduos provenientes da África Central, Gâmbia, Kênia e Madagascar,
nenhum apresentou o genótipo 677TT (Schneider et al., 1998). Baseando-se
nesses estudos, a freqüência do alelo T parece ser diferente entre os grupos
étnicos de origem européia e africana.
19
Trabalho recente não demonstrou nenhuma diferença na freqüência do
polimorfismo 677TT com relação à estratificação por sexo (Anderson et al.,
2005). No entanto, esse genótipo foi associado à alta mortalidade em
populações idosas (Shannon et al., 2002).
A população brasileira é muito heterogênea devido ao tipo de
colonização. O Brasil acolheu imigrantes oriundos de três continentes
principais: europeus (representados pelos portugueses - colonizadores),
africanos (na figura dos escravos) e ameríndios. Após cinco séculos de mistura
étnica entre esses três grupos, torna-se inviável correlacionar cor da pele à
ancestralidade em nosso país (Parra et al., 2003).
No Brasil, apenas um estudo mostrou a distribuição genotípica 677TT da
MTHFR, maior entre os caucasianos (10,3%) e extremamente menor em
negros (1,45%) e ameríndios (tribo Parakanã) (1,2%) (Arruda et al., 1998).
Apesar de a porcentagem dos genótipos TT ser equivalente à dos valores
encontrados em outro estudo (Wilcken et al., 2006), os indivíduos dos grupos
“caucasiano” e “negros” foram selecionados através da aparência, cor da pele
e entrevista sobre a origem ancestral, o que pode invalidar o estudo.
A busca por ferramentas moleculares com o objetivo de estratificar
etnicamente os indivíduos de acordo com sua ancestralidade genômica, e não
através da cor da pele, é de extrema importância. O controle genômico deve
ser realizado em todos os estudos (principalmente os do tipo caso-controle),
que utilizam populações que apresentam elevado grau de mistura gênica,
como a do Brasil. Recentemente, Bastos-Rodrigues et al. (2006)
desenvolveram uma seleção de 40 locos polimórficos bialélicos de inserção-
deleção (indels), os quais são altamente informativos para sugerir a
20
ancestralidade de um indivíduo. Os indels apresentam características ideais
para serem marcadores de controle genômico: estão espalhados em
praticamente todos os cromossomos, possuem baixíssima taxa de mutação,
possuem neutralidade seletiva e apresentam freqüência alélica entre 0,4-0,5. A
utilização desta ferramenta pode ser útil para esclarecer se determinada
associação entre dois fatores ocorreu devido à mera estratificação étnica ou
não, validando os resultados dos estudos do tipo caso-controle.
3.2 MTHFR e Câncer Colorretal
A hipótese de uma associação direta entre o genótipo 677TT e o CCR é
ainda controversa, pois se sabe que fatores ambientais são igualmente
significantes para o risco de CCR. É notável que a concentração de folato
sérico - e também da cobalamina -, é uma condição importante, e várias linhas
de evidência reforçam a relevância da interação gene-nutriente para o risco do
CCR (Friso et al., 2002). O álcool tem sido considerado também um importante
fator de risco para o CCR, porque age como um antagonista do folato (revisto
por Le Marchand, 2005).
Indivíduos carreadores do genótipo 677TT têm baixos níveis de folato
sérico e de vitamina B12 (diretamente relacionados com hipometilação
genômica), e hiperhomocisteinemia, ambos fatores de risco para o
desenvolvimento de CCR (Pufulete et al., 2003, Ma et al., 1997 e 1999).
Paradoxalmente, os trabalhos mais recentes indicam uma associação inversa
entre o genótipo TT e o risco de CCR (Chen et al., 1999; Ma et al., 1997; Toffoli
et al., 2003). No entanto, esse “efeito protetor” desaparece, especialmente se
21
os níveis de folato plasmático forem inadequados (Kono et al., 2005; Eaton et
al., 2005) ou mesmo se a ingestão de álcool for baixa (Le Marchand et al.,
2005). Uma provável explicação para a relação inversa entre o genótipo TT e o
CCR seria que a baixa atividade da MTHFR aumenta a disponibilidade do
substrato 5-10 TIF, favorecendo a síntese e o reparo de DNA, resultando em
diminuição da incorporação errônea de uracila. Por outro lado, a baixa
atividade enzimática leva à depleção dos níveis de 5-TIF, a forma de folato
essencial para metilação de DNA, favorecendo outro caminho para a gênese
do câncer: a hipometilação genômica. Porém, a hipometilação não ocorrerá se
os níveis plasmáticos de folato (fonte exógena) forem adequados, pois ocorrerá
um aumento dos grupamentos metila para a manutenção da estabilidade
genômica. Esse efeito é tão forte que mesmo altos níveis de homocisteína
plasmática parecem não influenciar no risco de CCR. Indivíduos portadores do
genótipo 677TT com hiperhomocisteinemia e níveis de folato sérico adequados
apresentam uma menor prevalência de CCR (Rosenberg et al., 2002).
3.3 MTHFR e Câncer de Mama
Poucos estudos investigaram a influência do polimorfismo da MTHFR
em câncer de mama. A prevalência do alelo T foi significativamente maior em
mulheres judias com câncer de mama bilateral ou cânceres de mama e ovário
simultâneos (Gershoni-Baruch et al., 2000). Semenza et al. (2003), Ergul et al.
(2003) e Campbell et al. (2002) relataram que a homozigose do alelo T
aumenta o risco de câncer de mama em mulheres na pré-menopausa, mas não
na pós-menopausa, provenientes da população americana, turca e inglesa,
22
respectivamente. Em contraste, alguns estudos não encontraram associação
entre o genótipo TT e o câncer de mama (Kalemi et al., 2005; Beilby et al.,
2004; Langsenlehner et al., 2003).
Um único trabalho propõe que o genótipo 677 TT está associado com a
baixa sobrevida em mulheres com câncer de mama em estádio avançado, que
realizaram quimioterapia adjuvante (Shrubsole et al., 2005). Trabalhos
mostraram que pacientes portadoras do polimorfismo 677 TT apresentam
grande toxicidade ao metotrexato e resposta clínica aumentada à quimioterapia
com 5-fluorouracil. Estas drogas exercem sua atividade antineoplásica através
da inibição do metabolismo do folato. O 5-fluorouracil apresenta vários
mecanismos citotóxicos. Dois metabólitos do 5-fluorouracil, 5-fluoro-2-
deoxiurina-5-trifosfato e 5-fluoridina-5-trifosfato podem incorporar no DNA e
RNA, respectivamente, causando uma instabilidade do DNA e interferindo no
processamento do RNA. Outro metabólito, 5-fluoro-2-deoxiuridina-5-
monofosfato, pode formar um complexo terciário com a timidilato sintetase e
com a 5-10 TIF. A formação desse complexo inibe a atividade da timidilato
sintetase e, conseqüentemente, diminui os níveis intracelulares de timidilato,
suprimindo a síntese de DNA (Kim et al., 2005). O metotrexato inibe a
diidrofolato redutase (DIFH), e o acúmulo de diidrofolato pode inibir a timidilato
sintetase e enzimas envolvidas na biossíntese de purinas. Ambos os fármacos
participam do clássico esquema de quimioterapia para a doença metastática
(Ciclofosfamida, Metotrexato e 5-fluorouracil) (Toffoli et al., 2003).
23
3.3.1 Álcool, folato, tabagismo e Câncer de Mama
A maioria dos estudos tem demonstrado que o risco de câncer conferido
pelo polimorfismo C677T é alterado pelo consumo de álcool, tabagismo e dieta
pobre em folato, notáveis fatores ambientais modificáveis.
Estudos epidemiológicos mostraram que o álcool é considerado um fator
de risco relevante para o desenvolvimento de CM. Estima-se que 4% de todos
os novos casos de CM são primariamente devidos ao uso de álcool (Pöschl &
Seitz, 2004). O risco para a doença aumenta proporcionalmente à quantidade
de álcool ingerida: o consumo crônico de 10-12g de álcool por dia (uma
dose/dia) aumenta o risco em 9%, e pode-se chegar a um risco de até 41%, se
forem consumidos entre 2-5 doses diárias (Dumitrescu & Shields, 2005). O
risco aumentado para o CM independe do tipo de bebiba alcoólica consumida
(Singletary & Gapstur, 2001).
De acordo com os critérios da Organização Mundial de Saúde (OMS), os
indivíduos que consomem três ou mais doses por dia, ou mais de cinco doses
em uma ocasião pelo menos uma vez na semana, são considerados alcoolistas
pesados. Uma dose padrão (do inglês drink) corresponde a uma lata de
cerveja, ou a um cálice de vinho, ou uma dose de uísque ou cachaça (OMS,
2004). A maioria dos estudos prefere calcular a quantidade consumida de
álcool em gramas por dia (g/dia). Apesar de não haver um consenso bem
definido, nota-se que a maioria dos trabalhos padronizou a ingestão de álcool
em leve (menos que 10 g/dia), moderada (10 a 30g/dia) e pesada (maior que
30g/dia).
24
O consumo de álcool estimula a carcinogênese mamária através de
diferentes mecanismos, como estresse oxidativo, mutagênese através do
acetoaldeído (metabólito do etanol), alteração da resposta e do metabolismo do
estrógeno, e redução do ácido fólico (Dumitrescu & Shields, 2005).
O álcool é considerado um antagonista do folato. Ele diminui a
biodisponibilidade do folato plasmático por dificultar sua absorção intestinal e
por aumentar sua excreção urinária. O álcool é capaz de clivar a molécula de
folato, como demonstrado in vitro e em animais, mas não em humanos (Mason
& Choi, 2005). Praticamente todos os folatos encontrados na dieta possuem
uma cauda de ácido glutâmico. A desconjugação do folato poliglutâmico para a
forma monoglutâmica, pela poliglutamil hidroxilase (enzima presente nas
criptas dos enterócitos), é fundamental para essa forma ser transportada
através da membrana luminal do enterócito. O álcool inibe a atividade
enzimática de desconjugação e também inibe a atividade de proteínas
responsáveis pelo transporte transmembrana do folato, prejudicando a
absorção deste. Tanto o consumo de álcool agudo (4 horas), quanto o crônico
(12 semanas), são capazes de diminuir os níveis de folato plasmático por
inibirem a sua reabsorção tubular renal (Mason & Choi, 2005). Não existe até o
momento na literatura indexada, uma correlação linear de qual seria a
quantidade de álcool ingerida que interfere com o nível de folato sérico.
Especula-se que o consumo moderado de álcool (maior que 15g/dia) é
suficiente para reduzir os níveis de folato plasmático, principalmente quando a
ingestão exógena de ácido fólico for deficiente (Chiuve et al., 2005). Porém,
esses etilistas moderados podem ter os níveis de folato plasmáticos
normalizados com uma suplementação adequada de ácido fólico (Cravo,
25
2005). Essa reversibilidade não foi observada em indivíduos etilistas pesados,
que consomem mais que 50g/dia de álcool (Chiuve et al., 2005).
O álcool pode causar efeitos adversos no metabolismo de um-carbono. O
acetoaldeído é um potente inibidor da metionina sintetase (MS). A inibição
desta enzima eleva a homocisteína plasmática em 40% e também aumenta os
níveis de adenosilhomocisteína sulfato (SAH). Particularmente, o SAH é um
potente inibidor das DNMTs e já foi demonstrada a sua relação com
hipometilação em alguns tecidos (Mason & Choi, 2005). O uso moderado de
álcool diminui os níveis séricos de vitamina B12, que é co-fator da MS para
remetilação da homocisteína em metionina, o que contribui para manter os
níveis de homocisteína altos (de la Vega et al., 2001; Giovannucci, 2004).
A investigação entre o genótipo 677TT da MTHFR e o uso de álcool é
interessante, porque as variações no ciclo do folato induzidas pelo álcool e pela
baixa atividade da MTHFR podem ter efeitos cumulativos para o risco de
câncer de mama. No entanto, Le Marchand (2004) mostrou que o consumo de
álcool está associado ao aumento do risco de CM em portadoras do genótipo
677CC, usuárias de terapia de reposição hormonal (TRH). Mulheres saudáveis
portadoras do genótipo TT, que consomem quantidades moderadas de álcool e
baixo consumo de ácido fólico, apresentam hiperhomocisteinemia (Chiuve et
al., 2005, Cravo, 2005).
O consumo adequado de folato deve ter um papel preventivo para o CM
em mulheres que consomem álcool (Zintaras, 2006), à semelhança do que foi
observado para o CCR. O efeito do genótipo 677TT no risco de CM é mais
pronunciado quando essas mulheres apresentam níveis de folato inadequados
(Chen et al., 2003).
26
Diferentemente do álcool, o tabagismo tem um importante papel na
carcinogênese mamária, mas não é considerado fator de risco primário. Além
dos agentes carcinogênicos na fumaça do cigarro, tem sido demonstrado que o
tabagismo eleva os níveis de homocisteína plasmática e diminui os níveis de
vitaminas do grupo B, como B6, B12 e folatos, quando comparados aos níveis
encontrados nos não-fumantes (Piyathilake et al., 1994, O’Callaghan et al.,
2002). Até o momento, não encontramos nenhum trabalho na literatura
indexada que explorou o polimorfismo C677T e sua relação com tabagismo e
CM.
27
2. OBJETIVOS
28
Considerando que o polimorfismo da MTHFR C677T poderia contribuir
para o risco de câncer colorretal e de mama, somando-se aos resultados
controversos da literatura em demonstrar esta associação, à relevância do
assunto e à originalidade do nosso projeto, definimos os seguintes objetivos:
(1) Geral: Avaliação do polimorfismo da MTHFR C677T em
amostras de câncer colorretal e de mama.
(2) Específicos:
(2.1) Câncer Colorretal
Estudar a freqüência deste polimorfismo nas amostras de tumor
primário colorretal esporádico e em pacientes sem câncer (estudo
caso-controle);
Avaliar nas amostras de CCR se há associação entre o polimorfismo
C677T e (1) parâmetros clínicos: sexo, idade e estadiamento por
Dukes; (2) parâmetros moleculares: instabilidade de microssatélites e
hipermetilação da região promotora de genes relacionados ao CCR;
Excluir a estratificação étnica dos pacientes com CCR através da
análise da ancestralidade genômica.
(2.2) Câncer de Mama
Estudar a freqüência do polimorfismo C677T nas amostras de
pacientes com CM esporádico e em pacientes sem câncer (estudo
caso-controle);
29
Avaliar nas amostras de pacientes com CM se há associação entre o
polimorfismo C677T e (1) parâmetros clínicos: idade e status
hormonal no momento do diagnóstico, estadiamento da doença; (2)
hábitos de vida modificáveis: tabagismo e etilismo.
30
3. MATERIAIS E MÉTODOS
31
1. AMOSTRAS UTILIZADAS NESTE ESTUDO
1.1 Amostras de Câncer Colorretal
Foram utilizados DNAs provenientes de amostras de tumor primário de
cólon e tecidos normais (sem processo neoplásico detectado) obtidos de
pacientes submetidos a cirurgia (radical ou paliativa) no Hospital do Câncer
A.C. Camargo, de São Paulo, gentilmente cedidas pelos doutores Anamaria A.
Camargo, José Cláudio C. Rocha, Otávia Caballero, Benedito Mauro Rossi e
Ademar Lopes. Este projeto obteve a aprovação do Comitê de Ética em
Pesquisa em Humanos da mesma Instituição (ver termo de aprovação em
Anexos, 1.1). Foram utilizadas 106 amostras de tumor colorretal. Em alguns
casos, foram utilizadas também amostras de tecido normal (n=32), retiradas
próximo ao tumor, no órgão afetado do mesmo paciente. Enviou-se esse
material para pesquisa no Instituto Ludwig de Pesquisas para o Câncer (São
Paulo), onde permaneceu em nitrogênio líquido até o isolamento das amostras
de DNA.
Na Tabela 3.1, estão descritos alguns dados clínicos de 98 pacientes
dos quais se obtiveram as amostras de tumores colorretais utilizados neste
trabalho. Em dezesseis casos (oito deles mostrados na Tab. 3.1), os dados
clínicos não estavam disponíveis. Foram coletados, ainda, dados referentes à
localização do tumor (proximal ou distal), características histopatológicas,
estadiamento por Dukes (ver Anexos, 1.4) e recorrência de 91 pacientes.
32
1.2 Amostras controle para estudo do CCR
Amostras de DNA de cento e cinqüenta indivíduos saudáveis,
provenientes da região Sudeste do Brasil, foram gentilmente cedidas pelo
Laboratório de Genética e Bioquímica da UFMG. Foi utilizado um protocolo de
extração de DNA proveniente de sangue periférico já padronizado naquele
laboratório (Freitas et al., 2002).
1.3 Extração de DNA das amostras de CCR
Os fragmentos (10-30 mg) de tumor foram microdissecados pelo Dr.
Fernando A. Soares, para se obter um percentual estimado de
aproximadamente 80% de tecido tumoral, e estocados em nitrogênio líquido.
Amostras de tecido normal adjacente também foram coletadas e estocadas nas
mesmas condições.
Para a extração do DNA, foi utilizado o protocolo modificado de extração
de DNA por fenol-clorofórmio (Freitas
et al., 2002). Os tecidos foram macerados
em nitrogênio líquido até a pulverização. A este pó foram adicionados 4 ml de
tampão TE 2:1 (Tris-HCl 2 mM, pH 8.0 e EDTA 1 mM, pH 8.0) contendo RNAse
A (10 mg/ml). A suspensão foi incubada a 37
o
C por 1 hora. Foram
adicionados 100 ug/ml de proteinase K e SDS a 0,5%. Seguiu-se nova
incubação a 37
o
C por 12 a 16 horas. Foram adicionados 3ml de fenol saturado
(Tris-HCl 0.1M, pH7.0), e a solução foi homogeneizada, suavemente, por
inversão, durante 10 minutos. Seguiu-se uma centrifugação a 14.000 r.p.m.,
por 10 minutos, à temperatura ambiente. A fase aquosa foi removida, e o
33
Tabela 3.1 – Dados clínicos (sexo, idade e estadiamento TNM) de 98 dos
106 pacientes portadores de CCR dos quais se obtiveram as amostras de
DNA utilizadas neste trabalho. Estão listados: os códigos das amostras, a
presença ou não de tecido normal (sim = preto ou não = branco), sexo (M =
Masculino ou F = Feminino) e a classificação do tumor pelo sistema TNM
(Tumor, Nódulo e Metástase). Os dados, quando não-disponíveis, estão
indicados por (?). (Adaptação da tese de doutorado do Dr. Charles Anacleto)
N
AMOSTRA
Normal
Sexo
Idade
T
N
M
N
AMOSTRA
Normal
Sexo
Idade
T
N
M
1
COT118
X F 67 4 1 1
50
COT216 M 54 3 0 1
2
COT131
X ? ? ? ? ?
51
COT217 ? ? ? ? ?
3
COT139 M 33 4 2 0
52
COT218 M 68 3 2 0
4
COT141
X F 53 2 1 0
53
COT219 ? ? ? ? ?
5
COT148
X M 64 3 1 0
54
COT54
X F 66 4 0 0
6
COT150 F 56 3 1 1
55
COT66
X M 56 4 1 1
7
COT153 M 74 3 0 0
56
COT68 M 70 4 0 0
8
COT154
X M 56 3 0 0
57
COT89
X M 92 2 0 0
9
COT158
X F 46 4 0 0
58
COT97
X F 55 3 2 0
10
COT161 M 50 2 0 0
59
CT1057 F 74 3 1 0
11
COT162
X M 81 3 1 0
60
CT1069 F 51 3 0 0
12
COT163 M 79 3 0 0
61
CT1077 ? ? ? ? ?
13
COT164 F 63 1 0 0
62
CT1097 F 61 3 1 1
14
COT165 M 74 3 0 0
63
CT1136 M 48 1 0 0
15
COT166 M 71 3 0 0
64
CT1141
X M 59 3 0 1
16
COT168 M 76 4 0 0
65
CT1142
X ? ? ? ? ?
17
COT169
X F 57 4 0 1
66
CT1158 M 74 4 2 1
18
COT170 M 60 3 0 1
67
CT1159
X M 51 3 1 1
19
COT174
X F 48 4 0 0
68
CT1169
X F 76 3 0 0
20
COT175
X F 75 2 0 0
69
CT1179
X F 85 4 0 0
21
COT176
X F 70 4 1 0
70
CT1268 ? ? ? ? ?
22
COT177
X F 76 4 0 0
71
CT1271 M 51 4 0 0
23
COT178 M 74 3 0 0
72
CT1288 ? ? ? ? ?
24
COT179 F 36 3 0 0
73
CT1318 F 74 3 0 0
25
COT180
X F 70 2 0 0
74
CT1368 F 64 3 1 0
26
COT181 M 69 4 1 0
75
CT1383 ? ? ? ? ?
27
COT182 M 79 3 0 0
76
CT1405 F 64 3 0 0
28
COT183 M 64 4 0 0
77
CT1406
X F 84 2 0 0
29
COT184 M 62 2 0 0
78
CT1435 F 66 3 1 1
30
COT185 M 56 2 0 0
79
CT150
X ? ? ? ? ?
31
COT186 F 36 4 2 1
80
CT1515 M 74 3 0 0
32
COT187 M 61 4 1 0
81
CT1545 M 70 3 2 0
33
COT188 F 75 3 0 0
82
CT1561 M 86 2 0 0
34
COT189 M 46 4 0 0
83
CT371
X M 32 2 0 0
35
COT190 F 71 3 0 0
84
CT421
X F 51 2 0 0
36
COT191 F 51 3 0 1
85
CT427
X M 52 3 0 0
37
COT192 M 57 3 1 0
86
CT460 F 34 3 1 0
38
COT193 F 47 3 1 0
87
CT479
X M 81 4 0 0
39
COT194 F 61 4 2 1
88
CT524 F 83 2 1 0
40
COT195 F 56 4 2 1
89
CT545 F 66 4 2 1
41
COT197 ? ? ? ? ?
90
CT591
X ? ? ? ? ?
42
COT201 F 70 ? ? ?
91
CT639
X ? ? ? ? ?
43
COT203 M 49 3 0 0
92
CT833 M 64 4 2 1
44
COT204 F 69 3 0 0
93
CT843 F 63 4 1 0
45
COT206 F 38 2 0 0
94
CT852 F 85 2 0 0
46
COT207 F 73 2 0 0
95
CT860 F 66 4 1 0
47
COT208 F 51 3 0 1
96
CT862 F 68 3 2 1
48
COT210 F 73 3 0 0
97
CT872 F 48 4 1 0
49
COT213 F 49 3 0 0
98
CT908 F 68 3 0 0
34
tratamento com fenol, repetido por duas vezes. Após esse tratamento, foram
adicionados à fase aquosa 3 ml de clorofórmio/álcool isoamílico (24:1),
seguindo-se 10 minutos de homogeneização, por suave inversão. O DNA foi
precipitado com dois volumes de etanol absoluto, seguindo-se de agitação leve
e incubação por 12 a 16 horas a -20
o
C, e, em seguida, uma centrifugação a
14.000 r.p.m., por 20 minutos. O sobrenadante foi descartado, e o sedimento,
lavado duas vezes com etanol 70% e deixado à temperatura ambiente até
secar. O DNA foi solubilizado em TE 10:1 (Tris-HCl 10 mM, pH7.0, EDTA 1mM,
pH7.0) e estocado a 4
o
C para uso posterior. A concentração média de DNA
utilizada para a realização da PCR (Reação em Cadeia da Polimerase) foi de,
aproximadamente, 10 a 20 ng/mL.
1.4 Amostras de Câncer de Mama
1.4.1 Seleção de casos
Foi realizada uma revisão nos arquivos do Laboratório de Patologia
Mamária da Faculdade de Medicina da UFMG, selecionando-se os casos de
pacientes com diagnóstico de câncer de mama, operados no Hospital das
Clínicas da UFMG, e com seguimento clínico no Ambulatório de Mastologia do
Hospital das Clínicas/UFMG, entre 2002 e 2004. As pacientes que se
enquadraram dentre os critérios de inclusão, e não apresentaram nenhum
parâmetro de exclusão, foram selecionadas. Os critérios de inclusão foram:
diagnóstico de câncer de mama confirmado por exame anatomo-patológico,
apresentar material proveniente do espécime cirúrgico de mama (tumor
35
primário/tecido normal), fixado em formol e conservado em parafina e ter
seguimento clínico no Ambulatório de Mastologia do Hospital das
Clínicas/UFMG.
Cento e oitenta e nove casos foram selecionados, e os prontuários
médicos dessas pacientes, arquivados no Setor de Arquivos Médicos do
Hospital das Clínicas da UFMG, foram analisados, em busca de informações
clínicas.
Os dados clínicos analisados foram: idade no momento do diagnóstico,
paridade, tempo de lactação, status hormonal (pré-menopausa ou menopausa),
índice de massa corporal (IMC), tabagismo, etilismo, estadiamento TNM para
CM (tumor/nódulo/metástase, ver Anexos, 1.5), história de recidiva de CM,
história familiar e história pregressa para outras doenças. Os dados do tumor
incluindo o tipo histológico e pesquisa imuno-histoquímica de receptores de
estrógeno e progesterona e a pesquisa para proteína HER-2/neu e p53 foram
obtidos dos laudos do exame anátomo-patológico arquivados no Laboratório de
Patologia Mamária da Faculdade de Medicina da UFMG. Nem todos os
prontuários eram informativos para a totalidade dos dados clínicos. Todos os
dados foram compilados em uma planilha, para arquivo e análise estatística.
Somente alguns dados, como idade no momento do diagnóstico, status
hormonal, etilismo, tabagismo, e estadiamento da doença, foram
estatisticamente analisados. Foi utilizada a fórmula [idade da menopausa ou
idade atual – (idade da menarca+número de gestações completas)] para a
estimativa média dos anos de exposição ao estrógeno durante a vida
reprodutiva. As condições que definiram as pacientes como tabagistas ou
etilistas são as seguintes:
36
“tabagistas” eram pacientes que fumavam pelo menos um cigarro ao
dia (cigarro de tabaco comercial), independentemente do tempo de
uso, e as “não-tabagistas” incluíram as mulheres que nunca fumaram
até o momento do diagnóstico do CM. No grupo da tabagistas, foi
obtido o número de cigarros fumados por dia e o tempo de uso do
cigarro em meses.
“etilistas” eram pacientes que consumiam pelo menos 1 dose (10
gramas de álcool) de qualquer bebida alcoólica com freqüência diária
ou superior a 3 dias da semana (World Health Organization,
Organização Mundial de Saúde, OMS, 2004), as “não-etilistas”
incluíram aquelas que nunca consumiram álcool ou consumiam
eventualmente (“socialmente”) geralmente no fim de semana, sem
apresentar repercurssões sistêmicas da bebida. Para as pacientes
do grupo “etilistas”, foi calculada a quantidade de álcool consumido
por dia, em gramas (para a fórmula, ver Anexos 1.6).
Quarenta e quatro amostras foram excluídas do estudo pela não-
obtenção de DNA suficiente para a realização do PCR, resultando 145 casos.
A casuística incluiu ainda 50 pacientes diagnosticadas com câncer de
mama em acompanhamento clínico no Ambulatório de Mastologia do Hospital
das Clínicas/UFMG, durante período compreendido entre janeiro e abril/2005.
Após concordância espontânea e assinatura do consentimento informado e
esclarecido (ver em Anexos, 1.3), as pacientes foram entrevistadas, e seus
prontuários foram revisados, para coleta dos dados supracitados. Em seguida,
foi coletada amostra de swab bucal para extração de DNA e estudo molecular.
37
Esse estudo obteve aprovação do Comitê de Ética em Pesquisa da
UFMG como parte do projeto “Oncogenômica e Oncogenética do câncer de
mama” (ver em Anexos, 1.2).
1.4.1.1 Extração de DNA das amostras fixadas em formol e
incluídas em parafina
As amostras de tecido para a extração de DNA foram obtidas a partir de
blocos de parafina arquivados no Laboratório de Patologia Mamária da
Faculdade de Medicina da UFMG. A área da amostra foi selecionada, após a
revisão por microscopia ótica dos cortes histológicos (corados pelo método
hematoxilina-eosina) correspondentes aos blocos, para se evitar a coleta de
área de gordura ou necrose. Tanto áreas de tumor primário quanto de tecido
normal foram selecionadas para extração de DNA.
Para a extração de DNA de tecidos fixados em formol e emblocados em
parafina, foi utilizado o método descrito por Coombs et al. (1999), com algumas
modificações, as quais se descrevem a seguir. Inicialmente, alguns testes
foram realizados utilizando esse protocolo, visando observar se haveria
diferença na obtenção do DNA das amostras obtidas por microtomia (cortes de
20 PM), e acondicionadas em lâminas, e as amostras retiradas em pequena
quantidade (aproximadamente uma fatia de 0,5 x 0,5 cm) de forma manual,
diretamente dos blocos de parafina com lâmina de bisturi estéril. Como não
houve diferença entre as duas estratégias, optou-se pela retirada do tecido
emblocado utilizando-se a lâmina bisturi estéril e individual para cada amostra.
38
Cuidadosamente, o excesso de parafina foi retirado de forma a preservar
somente o tumor primário e/ou tecido normal.
Cada amostra foi acondicionada em tubos estéreis de 1,5 ml e em que
se adicionaram 100 PL de Tween-20 a 0,5%, os quais foram agitados
levemente, e deixados por 10 minutos, a 90°C, no termociclador (PTC-100, MJ
Research Inc., Watertrown, MS, EUA). Em seguida, foram resfriados a 55°C,
retirados do termociclador e mantidos na mesma temperatura, em banho-
maria, por 20 minutos. Durante esse período, as amostras eram maceradas de
5 em 5 minutos, com o auxílio de uma ponteira estéril, e posteriormente,
homogeneizadas. A seguir, foram adicionados a essa solução 2 Pl de
proteinase K (10mg/ml – concentração final 200Pg/ml), e a digestão foi mantida
por um período de tempo total de 3 horas, a 55°C, com agitação das amostras
de hora em hora. Após 2 horas de digestão, foi adicionado mais 1 Pl de
proteinase K (10mg/ml). As amostras foram retiradas do banho-maria e,
imediatamente, adicionou-se 100 Pl de Chelex 100 (Biorad) a 5% TRIS EDTA
pH 9,0. Essa solução era mantida em agitação constante, para homogeneizar
os grânulos da resina na solução antes desta ser pipetada. Os tubos foram
agitados levemente e transferidos para o termociclador, onde se mantiveram a
99°C, por 10 minutos. Após, as amostras foram centrifugadas em temperatura
ambiente a 14.000 r.p.m., por 15 minutos, e imediatamente colocadas no gelo,
por 20 minutos. A parafina solidificada era afastada, e a amostra era transferida
para tubos novos e centrifugada a 14.000 r.p.m., por 5 minutos.
Posteriormente, foi aquecida em banho-maria a 45°C, por 10 minutos, e
adicionados 100 Pl de clorofórmio. Após leve agitação e centrifugação sob as
mesmas condições, o sobrenadante foi removido e estocado a 4°C. A
39
quantidade de DNA das amostras foi estimada utilizando-se gel de agarose a
1% comparando-se com o padrão de dosagem de DNA gênomico de esperma
de salmão. A média da quantidade de DNA obtida por esse método foi entre 80
a 100ng/Pl por amostra. Dentre 189 amostras extraídas, obtivemos quantidade
suficiente para realização da PCR em 145 amostras (77%), sendo que as 44
amostras remanescentes foram excluídas do estudo. Todas as amostras foram
diluídas em água bidestilada estéril para a concentração média de 10ng/PL,
para a realização da PCR.
1.4.1.2 Extração de DNA das amostras provenientes de
células da mucosa bucal (swab bucal)
As células da mucosa bucal foram colhidas com o auxílio de uma
pequenina escova do tipo cytobrush, rodando-se a escova de encontro com a
mucosa bucal da bochecha, por 30 segundos. Posteriormente, a escova era
levemente agitada em uma solução de etanol 90%, com o objetivo de
desprender as células. A seguir, os tubos eram identificados e mantidos a 4°C.
A extração de DNA era realizada em até três dias após a coleta, utilizando-se o
protocolo descrito por Miller et al (1988), com as modificações expressas a
seguir:
Os tubos com as amostras eram centrifugados em temperatura ambiente
por 5 minutos, a 14.000 r.p.m.. Após desprezar o sobrenadante, foram
adicionados 200 Pl de solução High TE (Tris-HCl 100mM pH 8, EDTA 40mM),
agitados com auxílio de um agitador tipo vortex, e em seguida adicionados 270
Pl de solução de Madisen (Tris-HCl 100mM pH 8, EDTA 40mM, NaCl 1M, SDS
40
0,2%) pré-aquecida a 55°C e 10 Pl de proteinase K (20mg/ml). Após incubação
em banho-maria a 55°C, por 1 hora, foram adicionados às amostras 120 Pl de
NaCl 6M, as quais foram acondicionadas no gelo, por 10 minutos. Em seguida,
os tubos foram centrifugados sob refrigeração (4°C) a 14.000 r.p.m., por 20
minutos. O sobrenadante era aspirado com auxílio de uma pipeta e colocado
em novos tubos. Em seguida, adicionou-se, ao sobrenadante, 600 Pl de
isopropanol 90% gelado e 5 Pl de LPA a 0,25%, para precipitação do DNA.
Essa solução era delicadamente invertida, e centrifugada sob as mesmas
condições anteriores, por 10 minutos. O pellet (precipitado) era lavado com 250
Pl de etanol 80%, e novamente centrifugado por 5 minutos. Após desprezar o
sobrenadante, o pellet remanescente foi ressuspendido em 100 Pl de água
deionizada estéril e armazenado em refrigeração a 4°C. O DNA foi dosado sob
as mesmas condições descritas anteriormente (ver item 1.4.1.1), com obtenção
média da concentração de DNA de 100ng/Pl. Em todas as 50 amostras (100%),
obtivemos DNA suficiente para o estudo molecular. As amostras foram diluídas
com água deionizada estéril, para a concentração aproximada de 10ng/PL para
realização do estudo molecular.
1.4.2 Seleção de amostras controle
Amostras de DNA de sangue periférico de 150 mulheres e homens
adultos e sem história pregressa ou atual de neoplasias, foram gentilmente
cedidas pelo Laboratório de Genética e Bioquímica (ICB/UFMG). Foi utilizado
um protocolo de extração já padronizado naquele laboratório (Freitas et al.,
2002).
41
2. GENOTIPAGEM DO POLIMORFISMO DA MTHFR POR PCR-RFLP
(Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de Restrição –
Reação em Cadeia da Polimerase)
O DNA eluído das amostras de CCR e CM, foi amplificado pela PCR
com iniciadores específicos e submetidos à digestão pela enzima de restrição
Hinf I, conforme protocolo descrito previamente (Frosst et al.1995), com as
modificações descritas a seguir:
2.1 Reação em Cadeia da Polimerase (PCR)
Em uma reação com o total de 12 Pl contendo aproximadamente 10 a
30ng de DNA, 1,3Pl de tampão 10X PCR (10mM Tris-HCl pH 8.3, 75mM KCl,
3.5mM MgCl
2
), 200 PM dNTP, 2Pl (10 PM) de cada iniciador (Foward: 5’ – TGA
AGG AGA AGG TGT CTG CGG GA – 3’; Reverse: 5’ – AGG ACG CTG CGG
TGA GAG TG -3’) e 0,13 unidades de Taq Platinum DNA polimerase
(Invitrogen) foram amplificados em termociclador (PTC-100, MJ Research Inc.,
Watertrown, MS, EUA), sob as seguintes condições: desnaturação a 95°C, por
4 minutos, seguidos de 40 ciclos, sendo: 1 minuto a 95°C, 1 minuto a 55°C e 1
minuto a 72°C. Imediatamente ao fim dos ciclos, seguiu-se uma extensão final
a 72°C, por 5 minutos. O fragmento de DNA amplificado (198 pb) foi analisado
por meio de corrida eletroforética em gel de poliacrilamida a 6%, em tampão
TBE 1X, 8V/cm, e corado pela prata (Santos et al., 1993).
42
2.2 Polimorfismo de Comprimento de Fragmento de Restrição
(RFLP) para Hinf I
Oito microlitros do produto de PCR foram digeridos com 0,6 unidades de
Hinf I (Promega Corporation Madison, WI), em 15Pl volume final de reação (1,3
Pl de tampão Promega e 5,1Pl de H
2
O) a 37°C, por 24 horas, seguido de
inativação enzimática a 65°C, por 20 minutos. Aproximadamente, 4Pl de cada
produto de digestão foram utilizados na eletroforese em gel de poliacrilamida
6% visualizado pela prata, sob as mesmas condições anteriormente descritas.
Essa técnica utiliza-se da estratégia de que a presença do alelo T cria um sítio
de restrição para a enzima Hinf I. O homozigoto para o alelo C, heterozigoto e
homozigoto para o alelo T produzem, respectivamente, fragmentos de 198 pb;
198, 175 e 23 pb; e 175 e 23 pb.
Em todos os experimentos, foram adicionadas três amostras de DNA
controle para cada genótipo (genótipo previamente conhecido para homozigoto
para alelo C, heterozigoto, e homozigoto para o alelo T) para comparação dos
resultados. Em uma amostra foi utilizada água deionizada estéril ao invés do
DNA, para verificar se houve contaminação do experimento (controle branco).
A leitura dos resultados de genotipagem foi realizada também por outro
pesquisador, para garantir a qualidade dos genótipos.
43
3. ANÁLISE DO PADRÃO DE METILAÇÃO E INSTABILIDADE DE
MICROSSATÉLITES NAS AMOSTRAS DE CÂNCER COLORRETAL
O estudo do polimorfismo da MTHFR nas amostras de câncer colorretal
compreende a continuação de uma linha de pesquisa do Laboratório de
Genética e Bioquímica do ICB/UFMG, conduzida anteriormente pelos alunos
de Doutorado Andréia Machado Leopoldino e Charles Anacleto, os quais foram
responsáveis pela análise da instabilidade de microssatélites (BAT-26 e
Sistema de Bethesda – A.L.F. 10) e pela análise do padrão de metilação do
promotor dos genes p16
INK4a
, p14
ARF
, hMLH-1, MGMT, e DAPK,
respectivamente. Para maiores detalhes sobre os microssatélites, os
iniciadores e as técnicas que foram utilizados, ver Anacleto et al. (2005
a).
4. ANÁLISE DA ANCESTRALIDADE GENÔMICA EM AMOSTRAS DE
CÂNCER COLORRETAL
As 106 amostras de CCR foram submetidas à análise de ancestralidade
genômica biogeográfica. Individualmente, cada amostra foi genotipada
utilizando-se 40 locos polimórficos bialélicos de inserção-deleção (indels). Para
amplificação do fragmento por PCR, foram utilizados quatro sistemas de
reações em multiplex, cada um contendo de 10 a 12 pares de iniciadores,
conforme descrito por Bastos-Rodrigues et al (2006). Os fragmentos
(amplicons) foram mensurados utilizando-se o seqüenciador de DNA
Megabace 1000 (Amersham), e analisados, utilizando-se os programas Genetic
44
Profiler
µ
(versão 2.2) (ver Figura 4.3 em Resultados) e Fragment Profiler
µ
(versão 1.2, Amersham).
4.1 Segregação genômica
Foi utilizado o programa Structure
µ
(versão 2.1) com o objetivo de
alocar cada paciente nas populações com ancestralidade ameríndia, européia
ou africana. Esse programa utiliza como base a freqüência alélica de cada loco
analisado em cada paciente, e os agrupa comparando com a freqüência alélica
dos indivíduos que pertencem aos grupos ancestrais (ameríndios, europeus e
africanos). Os indivíduos representantes dos grupos ancestrais (n=225) tinham
informações a priori de sua população de origem e da freqüência alélica para
cada loco. O programa CLUMP
µ
foi utilizado para investigar as diferenças na
freqüência alélica dos indels entre as amostras de CCR com instabilidade de
microssatélites e sem instabilidade de microssatélites.
5. ANÁLISE ESTATÍSTICA
Os resultados foram analisados conforme se explica a seguir:
O equilíbrio de Hardy-Weinberg foi testado por meio do método
exato de Guo e Thompson (1992).
Para a comparação entre as freqüências dos polimorfismos da
MTHFR C677T do grupo controle e as variáveis clínicas e
45
moleculares das amostras CCR e CM, foi utilizado o programa Epi
Info
µ
(versão 6.0). Os testes utilizados foram o teste exato de
Fisher ou o teste qui quadrado (F
2
).
O programa CLUMP
µ
, utilizado em estudos genéticos do tipo
caso-controle, foi empregado para investigar: (1) as diferenças na
freqüência alélica dos indels entre as amostras de CCR com
instabilidade de microssatélites e sem instabilidade de
microssatélites; (2) a associação entre o estadiamento das
pacientes com CM e o genótipo 677TT.
A análise por regressão logística, nas amostras de CM, foi
realizada utilizando-se a página de análises estatísticas online da
Universidade de Vassar, acesso em:
(http://faculty.vassar.edu/lowry/VassarStats.html).
O nível de significância adotado inicialmente para todas as
análises foi de p< 0,05. A correção por Bonferroni foi realizada
para ajustamento de múltiplas comparações.
46
4. RESULTADOS
47
1. ESTUDO DO CÂNCER COLORRETAL
A genotipagem do polimorfismo C677T foi realizada para cada uma das
106 amostras de CCR (casos), em 32 amostras de tecido normal retirado do
cólon adjacente à lesão e em 150 pacientes sem câncer (controle), utilizando-
se a técnica PCR-RFLP (Frosst et al., 1995). Os genótipos da MTHFR C677T
foram idênticos entre as amostras de tecido tumoral e não-tumoral
provenientes do mesmo paciente. A Figura 4.1 mostra um gel de poliacrilamida
6% corado pela prata, mostrando o fragmento de DNA (198 pb) antes e após
RFLP, para cada genótipo da MTHFR.
Os resultados da genotipagem para o estudo dos CCR e CM foram
segregados em dois grupos 677CC+CT e 677TT, pelos seguintes motivos: (1)
O genótipo CC+CT está associado a uma atividade enzimática eficiente da
MTHFR, contrastando com a atividade dos portadores do genótipo TT; (2)
Diminuir o grau de liberdade e aumentar o poder do teste estatístico.
A Tabela 4.1 mostra pequena diferença entre a freqüência do genótipo
TT no grupo de pacientes com câncer (14%) e de pacientes sem câncer (9%),
mas não revelou nenhuma diferença estatística (p=0,17). Em todas as
amostras, a distribuição do polimorfismo C677T encontrou-se sob equilíbrio de
Hardy-Weinberg.
48
Figura 4.1: Gel de poliacrilamida corado pela prata com os genótipos da
MTHFR. As canaletas do gel estão numeradas em ordem crescente. As
bandas marcadas em asterisco (*) representam as amostras amplificadas pela
técnica de PCR antes do RFLP. As bandas ao lado direito de cada banda
asterisco (*) representam as mesmas amostras após digestão pela enzima
HinfI. CC= homozigoto para o alelo C; CT= heterozigoto; TT= homozigoto para
o alelo T. As setas indicam o peso molecular, em pares de base, de cada
banda. A banda correspondendo a 23 pb não está representada neste gel.
198pb
175 pb
*
**
CC
TT
CT
198pb
175 pb
*
**
CC
TT
CT
1 2 3 4 5 6
49
Tabela 4.1: Freqüência do genótipo do polimorfismo da MTHFR C677T em
pacientes com e sem câncer colorretal.
CC+CT(%) TT(%) OR CI valor p
Controles 137 (91) 13 (9)
Casos 91 (86) 15 (14) 1.74 0,47-4,1 0,17
#
OR = Odds Ratio; CI = 95% de intervalo de confiança para Odds Ratio.
Odds Ratio= razão da probabilidade de ocorrência.
#
valor de p para qui quadrado (F
2
)
Estatisticamente significativo se p<0,05
50
As características clínico-patológicas de 91 pacientes com CCR foram
obtidas, incluindo idade e sexo do paciente, localização do tumor (proximal ou
distal) e características histopatológicas (ambos não avaliados neste estudo),
estadiamento por Dukes (ver Anexos, 1.4) e recorrência.
Algumas informações clínico-patológicas e os dados dos grupos
677CC+CT e 677TT estão mostrados na Tabela 4.2. Não foi observada
diferença entre os sexos e a freqüência do genótipo TT (p=0,82). Com relação
à idade, observa-se uma tendência do aumento da freqüência do genótipo TT
(19%) em pacientes com idade superior ou igual a 70 anos em comparação ao
outro grupo (9%). Nenhuma associação estatísticamente significativa foi
encontrada entre idade e genótipo 677TT (p=0,2).
A freqüência dos genótipos 677CC+CT e TT foi semelhante entre os
estadiamentos de Dukes A, B ou C (p=0,1), não havendo correlação linear
entre os genótipos da MTHFR (CC, CT e TT) e o maior estadiamento da
doença (Tabela 4.2). Além disso, não encontramos nenhuma associação entre
os grupos 677CC+CT/677TT e os pacientes que apresentaram recorrência até
3 anos do diagnóstico (dado não-mostrado).
51
Tabela 4.2: A relação entre o polimorfismo da MTHFR C677T e o sexo, a idade
e o estadiamento por Dukes dos pacientes com câncer colorretal.
CC+CT(%) TT(%) OR CI valor p
Homens (n=41) 36 (88) 5 (12)
Mulheres (n=50) 43 (86) 7 (14) 1,17 0,30-4,72 0,8
#
Idade >70 (n=36) 29 (81) 7 (19)
Idade < 70 (n=55) 50 (91) 5 (9) 2,41 0,61-9,82 0,2*
Dukes A (n=15) 13 (87) 2 (13) 1,00
Dukes B (n=38) 32 (84) 6 (16) 1,22 0,18-10,10 0,99*
Dukes C (n=37) 32 (86) 5 (14) 1,02 0,14-8,74 0,99*
OR = Odds Ratio; CI = 95% de intervalo de confiança para Odds Ratio.
Odds Ratio= razão da probabilidade de ocorrência.
#
valor de p para qui quadrado (F
2
)
* valor de p para Teste Exato de Fisher
Estatisticamente significativo se p<0,05
52
Investigou-se a associação entre o polimorfismo da MTHFR e
hipermetilação da região promotora de 5 genes associados ao CCR (DAPK,
MGMT, hMLH1, p16
INK4a
e p14
ARF
) nas 106 amostras. A freqüência dos
polimorfismos 677CC+CT e 677TT para cada loco hipermetilado individual ou
com presença de locos de hipermetilação simultâneos está sumarizada na
Tabela 4.3. Nenhuma diferença estatística foi encontrada nessas análises.
Quatorze de 106 tumores CCR (13,3%) exibiram instabilidade de
microssatélite (MSI+), sendo que 11 amostras exibiram MSI de alto grau (mais
de três marcadores instáveis) (ver Figura 4.2). Cinqüenta por cento dos
pacientes com MSI+ apresentaram o genótipo TT (7/14), em contraste com
apenas 9% do grupo sem instabilidade de microssatélites (MSI-; Tabela 4.4).
Esta diferença foi altamente significativa (p=0,00057), indicando uma forte
associação entre os tumores MSI+ e o genótipo TT (odds ratio: 10,4; intervalo
de confiança: 2,5-45,4).
Com o objetivo de esclarecer se essa associação ocorreu por mera
estratificação étnica dos indivíduos com CCR, esses foram individualmente
genotipados utilizando-se 40 locos polimórficos bialélicos de inserção-deleção
(indels) (Figuras 4.3 A, B, C e D). Para o grupo MSI+, as proporções de
indivíduos europeus, africanos e ameríndios foram, respectivamente, 0,851,
0,0935 e 0,055 e para o grupo MSI- foram 0,868, 0,115 e 0,017,
respectivamente. As diferenças entre as proporções de ancestralidade
genômica entre esses dois grupos não foram significativas (Figura 4.4).
53
Tabela 4.3: Os polimorfismos da MTHFR C677T e metilação do DNA de cinco
genes associados ao CCR (DAPK, MGMT, hMLH1, p16
INK4a
e p14
ARF
).
CC+CT TT OR CI valor p
Sem metil. 41 8 1
HMLH metil. 15 4 1,37 0,29-6,12 0,72*
DAPK metil. 20 1 0,26 0,01-2,30 0,26*
p16
INK4a
metil. 14 3 1,10 0,20-5,57 1*
p14
ARF
metil. 10 4 2,05 0,41-9,87 0,43*
MGMT metil. 25 5 1,02 0,26-4,00 1*
>3 locos metil. (10) 7 3 2,20 0,36-12,84 0,37*
>2 locos metil. (26) 21 5 1,22 0,30-4,85 0,75*
>1 loco metil. (57) 50 7 0,72 0,72-2,42 0,55
#
metil.= metilado; OR = Odds Ratio; CI = 95% de intervalo de confiança para
Odds Ratio.
Odds Ratio= razão da probabilidade de ocorrência.
#
valor de p para qui quadrado (F
2
)
* valor de p para Teste Exato de Fisher
Estatisticamente significativo se p<0,05.
54
Figura 4.2: Amostras de tumor colorretal microssatélite instáveis e o genótipo do polimorfismo da MTIFH. E.I. =
estrutura interna (número de repetições dos microssatélites); M.S. = nome do loco. G.N.T= genótipo da MTIHR
C677T. Os positivos e negativos estão marcados em preto e branco, respectivamente. Os genótipos do polimorfismo
677 da MTIFH estão marcados em cinza
.
EI M.S./G.N.T. TC852 COT187 COT131 COT174 COT176 COT162 TC524 TC1057 COT190 COT177 TC1318 TC843 COT161 TC860
poli A BAT26
(TAGA)
8
D16S2622
(AAGG)
10
D1S1612
(AAT)
12
D2S1353
(GATA)
11
D22S685
(GATA)
13
D11S1392
(GATA)
12
D3S2398
(GRTA)
10
D5S2501
(GATA)
10
D15S657
677 TT
677 CT
677 CC
55
Tabela 4.4: Associação entre o polimorfismo da MTHFR C677T e instabilidade
de microssatélite nas amostras de CCR.
CC + CT(%) TT (%) OR CI valor p
MSI- (91) 83 (91) 8 (9)
MSI+ (14) 7 (50) 7 (50) 10,4 2,5-45,4 0,00057*
OR = Odds Ratio; CI = 95% de intervalo de confiança para Odds Ratio.
Odds Ratio= razão da probabilidade de ocorrência.
MSI-= ausência de instabilidade de microssatélites
MSI+= presença de instabilidade de microssatélites
* valor de p para Teste Exato de Fisher
Estatisticamente significativo se p<0,05.
56
Figura 4.3 A: Análise dos tamanhos dos fragmentos dos locos de inserção-
deleção (indels) em uma amostra de CCR, utilizando o programa Fragment
Profiler (versão 2.2). A= análise de 10 locos.
A
57
Figura 4.3 B: Análise dos tamanhos dos fragmentos dos locos de inserção-
deleção (indels) em uma amostra de CCR, utilizando o programa Fragment
Profiler (versão2.2). B= análise de 12 locos.
B
58
Figura 4.3 C: Análise dos tamanhos dos fragmentos dos locos de inserção-
deleção (indels) em uma amostra de CCR, utilizando o programa Fragment
Profiler (versão 2.2). C= análise de 10 locos.
C
59
Figura 4.3 D: Análise dos tamanhos dos fragmentos dos locos de inserção-
deleção (indels) em uma amostra de CCR, utilizando o programa Fragment
Profiler (versão 2.2). D= análise de 8 locos.
D
60
Figura 4.4: Proporções de indivíduos europeus (EU), africanos (AF),
ameríndios (AM) e a presença (MSI+) ou ausência (MSI-) de Instabilidade de
Microssatélites (MSI).
0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1
EU/MSI+ EU/MSI- AF/MSI+ AF/MSI- AM/MSI+ AM/MSI-
Proporções de indivíduos
Grupos Ancestrais/MSI
61
2. ESTUDO DO CÂNCER DE MAMA
A genotipagem da MTHFR C677T foi obtida com sucesso em todas 145
amostras de tecido conservado em parafina e nas 50 amostras de swab bucal.
Não foi observada diferença estatisticamente significativa na freqüência
dos genótipos 677 CC+CT e TT entre os grupos caso e controle (p=0,61),
demonstrando ausência de associação entre o polimorfismo C677T e o risco de
câncer de mama (Tabela 4.5). A distribuição do polimorfismo C677T encontrou-
se sob equilíbrio de Hardy-Weinberg em todas as amostras.
A idade das pacientes com CM no momento do diagnóstico variou de 29
a 94 anos (mediana=53 anos; ver Figura 4.4). A mediana para a idade da
ocorrência da menarca e menopausa foi 12,9 e 48,7 anos, respectivamente.
Para cada paciente, foi estimada a exposição aos hormônios sexuais femininos
durante a vida reprodutiva. A estimativa média de anos de exposição ao
estrógeno, durante a vida reprodutiva, das mulheres com CM foi de 22 anos
(dado ausente na Tabela). Com relação à paridade, 20% das pacientes eram
nulíparas, e as demais tiveram, pelo menos, um filho. Aproximadamente um
terço (33%) de todas as pacientes tiveram, pelo menos, um episódio de aborto.
Com relação aos tipos histológicos das amostras de CM deste estudo, a
maioria era do tipo histológico ductal invasor (77%). O restante das amostras
era do tipo ductal in situ, lobular invasor e in situ (considerado hoje “neoplasia”)
e medular.
As pacientes com CM foram separadas em dois grupos: pré- e pós-
menopausa para o estudo da associação entre o status hormonal e o
polimorfismo
62
Tabela 4.5: Freqüência do genótipo do polimorfismo da MTHFR C677T em
pacientes com e sem câncer de mama.
CC+CT(%) TT(%) OR CI valor p
Controles 137 (91) 13 (9)
Casos 181 (93) 14 (7) 1,26 0,35-1,91 0,61
#
OR = Odds Ratio; CI = 95% de intervalo de confiança para Odds Ratio.
Odds Ratio= razão da probabilidade de ocorrência.
#
valor de p para qui quadrado (F
2
).
Estatisticamente significativo se p0,0125 (correção de Bonferroni para
múltiplas comparações)
63
Figura 4.4: Representação gráfica da idade (em anos) da ocorrência da
menarca, da idade das mulheres no momento do diagnóstico de CM e da idade
da ocorrência da menopausa. O gráfico mostra a mediana da idade para a
ocorrência desses eventos.
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
Menar
c
a
M
e
nopausa
1ºquartil
Mínimo
Mediana
Máxim o
3ºquartil
Idade (anos
)
64
da MTHFR C677T. As mulheres que apresentavam ciclos menstruais, e
aquelas que não menstruavam há mais de um ano, foram alocadas no grupo
“pré-menopausa” e “pós-menopausa”, respectivamente. Nenhuma paciente do
grupo pós-menopausa estava recebendo terapia de reposição hormonal.
Houve um equilíbrio entre o número de mulheres com CM na pré- ou pós-
menopausa (Tabela 4.6). Observa-se, ainda, uma distribuição homogênea
entre as pacientes destes grupos e os genótipos CC+CT e TT. Não foi
observada nenhuma associação estatística entre o polimorfismo 677 TT e o
status hormonal (p=0,94).
As pacientes foram segregadas arbitrariamente em dois subgrupos
etários, maior de 70 anos (> 70 anos) e menor que 70 anos (< 70 anos), uma
vez que o polimorfismo 677 TT e a idade avançada são condições que podem
estar associados ao CM (Tabela 4.6). A distribuição da freqüência dos
polimorfismos CC+CT e TT foi semelhante entre os dois grupos. Não houve
diferença estatística significativa entre o polimorfismo 677 TT e a idade
avançada (p=0,72).
O consumo de cigarro e álcool foi investigado, dentre os hábitos de vida
das mulheres com CM. A média de cigarros fumados, por dia, pelas pacientes
tabagistas foi de 16 10, e a média dos anos de tabagismo foi de 21 14.
Com relação ao consumo de álcool, a média de consumo de álcool em gramas,
por dia, foi de 26,5 14.5. A maioria das pacientes etilistas (21/26; 81%)
consumia bebidas alcoólicas com freqüência diária. O consumo médio de
álcool pelas pacientes portadoras do genótipo 677TT foi de 24g/dia. A Tabela
4.7 mostra a freqüência das pacientes com CM nos grupos 677 CC+CT e TT,
de acordo com o consumo, ou não, de cigarro ou álcool.
65
Tabela 4.6: Relação entre mulheres com câncer de mama na pré- e pós-
menopausa, idade superior e inferior a 70 anos e o polimorfismo C677T da
MTHFR.
CC+CT(%) TT(%) OR CI valor p
Pré-Menopausa 81 (49) 7 (50)
Pós-Menopausa 84 (51) 7 (50) 0,96 0,29-3,23 0,94
#
<70 anos 145 (93) 11 (7)
>70 anos 31 (91) 3 (9) 1,28 0,26-5,37 0,72
#
OR = Odds Ratio; CI = 95% de intervalo de confiança para Odds Ratio.
Odds Ratio= razão da probabilidade de ocorrência.
#
valor de p para Teste Exato de Fisher
Estatisticamente significativo se p0,0125 (correção de Bonferroni para
múltiplas comparações).
66
Tabela 4.7: Relação entre o consumo de álcool e o tabagismo em mulheres
com câncer de mama e o polimorfismo C677T.
CC+CT(%) TT(%) OR CI valor p
Tabagismo
Sim 35 (85) 6 (15)
Não 136 (95) 7 (5) 0,3 0,08-1,09 0,043
#
Etilismo
Sim 20 (77) 6 (23)
Não 132 (95) 7 (5) 0,18 0,05-0,67 0,007
# *
OR = Odds Ratio; CI = 95% de intervalo de confiança para Odds Ratio.
Odds Ratio= razão da probabilidade de ocorrência.
#
valor de p para Teste Exato de Fisher
* estatisticamente significativo se p0,0125 (correção de Bonferroni para
análise de múltiplas variáveis)
67
Apesar de os dados mostrarem um número três vezes maior na
freqüência do genótipo TT nas tabagistas (15%) em comparação às não-
tabagistas (5%), essa diferença não foi estatisticamente significativa (p=0.043;
valor de p após correção de Bonferroni para múltiplas comparações, p>0,0125).
As pacientes etilistas portadoras de CM apresentaram um expressivo aumento
da freqüência do genótipo TT, 4,6 vezes maior do que a freqüência encontrada
nas pacientes etilistas do grupo CC+CT. Esses resultados indicam uma forte
associação entre pacientes com CM que consomem álcool e o polimorfismo
677 TT (p=0,007).
A análise da associação entre estadiamento do câncer de mama (ver em
Anexos, 1.5) e os grupos 677 CC+CT e TT foi estatisticamente significativa (qui
quadrado= 17,8; p=0,0077; Figura 4.5). Metade das pacientes do grupo CC+CT
encontravam-se no estadiamento II, no momento do diagnóstico (Figura 4.5). A
maioria das pacientes (65%) portadoras do genótipo TT encontrava-se no
estadiamento III, com maior proporção de pacientes no estadiamento IIIA em
relação ao estadiamento IIIB. Observou-se uma diferença importante entre as
freqüências observadas no estadiamento IIIA para os genótipos CC+CT (12%)
e TT (47%) (Figura 4.5). Essa diferença foi estatisticamente significativa
(p=0,0083), sugerindo associação entre estadiamento IIIA e genótipo 677TT
(Tabela 4.8). Dentre as pacientes diagnosticadas no estadiamento IIIA e
portadoras de genótipo TT, apenas duas eram alcoolistas.
Investigou-se se haveria associação entre o uso de cigarro e álcool,
pelas pacientes com CM, e o estadiamento da doença. Através da análise dos
dados por regressão logística, não se observou correlação entre etilismo ou
tabagismo com a severidade da doença (Figura 4.6).
68
Figura 4.5: Histograma tridimensional mostrando a estratificação das pacientes
com CM, de acordo com estadiamento da doença, e genótipos da MTIHF
C677T. A legenda indica os estadiamentos para CM, de acordo com as cores.
Foi utilizado o programa CLUMP
®
(10.000 simulações) e Epi Info
®
para os
cálculos estatísticos para qui quadrado e teste de Fisher, respectivamente.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
CC+CT TT
Estadio IV
Estadio IIIB
Estadio IIIA
Estadio IIB
Estadio IIA
Estadio I
Estadio 0
Porcentagem de pacientes com CM
p= 0,0077*#
**
**
n=136 n=15
*valor de p para qui quadrado,
** valor de p para Teste Exato de Fisher
#estatisticamente significativo se p>0,0083 (correção de Bonferroni para análise
de múltiplas variáveis)
p=0,0083**#
69
Figura 4.6: Distribuição das pacientes com CM de acordo com estadiamento
da doença e a presença, ou não, de etilismo e/ou tabagismo. A legenda indica
os estadiamentos para CM, de acordo com as cores. *valor de p para qui
quadrado calculado por regressão logística.
0%
10%
20%
30%
40%
50%
60%
70%
80%
90%
100%
álcool sim álcool não tabagismo
sim
tabagismo
não
Estadio IV
Estadio IIIB
Estadio IIIA
Estadio IIB
Estadio IIA
Estadio I
Estadio 0
p<0,1513 p<0,11
Porcentagem de pacientes com CM
*
*
70
5. DISCUSSÃO
71
1. ESTUDO DO CÂNCER COLORRETAL
1.1 POLIMORFISMO C677T DA MTHFR E CCR
Em nosso estudo, não foi observada associação entre o polimorfismo
C677T da MTHFR e CCR. A literatura é controversa sobre a correlação entre
os genótipos da MTHFR e câncer. O polimorfismo da MTHFR modula o risco
de vários tipos de câncer, de uma maneira sítio-específica. O polimorfismo
C677T parece aumentar o risco de câncer de endométrio, colo de útero,
esôfago, estômago, bexiga e CM. Em contraste, o polimorfismo parece diminuir
o risco para CCR, adenoma colorretal, carcinoma hepatocelular, leucemia
linfocítica aguda em adultos e crianças, leucemias, linfomas, displasia e câncer
de colo de útero (Sharp & Little, 2004). Essa discrepância pode ser explicada
pela diferença no nível de expressão da MTHFR, específico para cada tecido.
Além disso, a necessidade de folato e a suscetibilidade à deficiência de folato
são diferentes para cada tecido. A maioria dos estudos tem demonstrado que o
risco de câncer, associado ao polimorfismo C677T, pode ser modificado por
consumo de álcool, tabagismo e níveis de folato inadequados (Kim, 2005).
Uma associação direta entre CCR e genótipo TT foi relatada em indivíduos
com CCR, tabagistas, portadores de baixos níveis de folato plasmático (Ryan
et al., 2001) e também em pacientes com alto consumo de álcool (Chen et al.,
1996). Por outro lado, outros estudos observaram um efeito protetor do
genótipo 677TT em CCR (Chen et al., 1999; Ma et al., 1997; Toffoli et al.,
2003), quando os indivíduos apresentavam níveis adequados de folato (Eaton
72
et al., 2005) e baixos níveis de ingestão de bebidas alcóolicas (Le Marchand et
al., 2005).
Os resultados conflitantes da literatura sobre a correlação do
polimorfismo da MTHFR com o câncer podem ser devidos à importância da
interação gene-ambiente na tumorigênese do CCR. Há evidências de que os
fatores dietéticos (particularmente dietas pobres em folato e cobalamina, e alto
consumo de álcool), associados ao polimorfismo 677 TT, aumentam o risco
para CCR. Estudos mais recentes especulam que os indivíduos que
apresentam níveis de folato séricos adequados adquirem uma insensibilidade
aos efeitos promovidos pelo genótipo TT (tais como hiperhomocisteinemia e
hipometilação genômica), o que diminui o risco para o CCR (Chen et al., 1996,
Ma et al, 1997; Rosenberg et al, 2002). No presente trabalho, os níveis de
folato sérico, de cobalamina ou de homocisteína dos pacientes portadores de
CCR não foram dosados, o que impediu a análise dessas variáveis.
Uma vez que a interação gene-ambiente é relevante, e os níveis de
folato adequados parecem compensar os efeitos oriundos da menor atividade
da MTHFR, em indivíduos portadores do genótipo TT, tem sido amplamente
questionada a necessidade de suplementação de ácido fólico para esses
indivíduos, e para a população geral.
O folato foi isolado do espinafre, pela primeira vez, em 1941 e, nesta
época, os primeiros estudos eram focados para a “cura da anemia”. À medida
que os estudos sobre o metabolismo do folato avançavam, foi notado que a
administração de folato aumentava o crescimento de tumores já existentes e,
por isso, as drogas anti-folato (por exemplo, o metotrexato) tornaram-se
potenciais ferramentas quimoterápicas para o câncer (Ulrich & Potter, 2006).
73
Atualmente, parece existir uma linha tênue entre o efeito benéfico e o efeito
prejudicial da suplementação com ácido fólico, ainda bastante inconsistente
com relação ao câncer. Alguns estudos relatam que a dose e o tempo de
suplementação são críticos para a ocorrência desses efeitos. O folato tem um
papel duplo na carcinogênese, tanto em animais quanto em humanos: está
envolvido na prevenção do aparecimento de lesões neoplásicas e na
progressão de lesões pré-malignas já existentes (Ulrich & Potter, 2006). Os
estudos epidemiológicos sugerem que altas doses de suplementação (>1000
Pg/dia, recomendação diária de ácido fólico = 400 Pg/dia), por tempo
prolongado, reduzem o risco para CCR, CM, e outros cânceres, como o de
pâncreas, esôfago e colo de útero (Ulrich & Potter, 2006). Em contrapartida, os
ensaios clínicos randomizados relatam que doses baixas de ácido fólico (400
Pg/dia) também promovem um efeito protetor, mas ressaltam que, se houver
um pequeno foco pré-maligno, pode ocorrer rápida progressão das células
neoplásicas. Especula-se que a discrepância entre os resultados dos estudos
observacionais e clínicos resulta das diferenças moleculares entre os
indivíduos e as populações estudadas. A ocorrência de fenômenos
epigenéticos e genéticos, assim como os polimorfismos das enzimas
relacionadas ao metabolismo do folato, podem levar a diferenças entre
indivíduos, inclusive com relação ao comportamento biológico do tumor, em
resposta ao ácido fólico. É bem aceito que, dentre vários fenômenos, a
hipometilação genômica é considerada um evento importante na tumorigênese
(Goelz et al., 1985). Já foi demonstrado que o genótipo 677TT da MTHFR leva
a hipometilação genômica de leucócitos (Stern et al., 2000) e de tecidos
normais (Paz et al., 2002). A suplementação diária com ácido fólico (400Pg)
74
pode reverter o estado de hipometilação (Pufulete et al., 2005). Estes autores
observaram um aumento de 31% (p<0,001) e 25% (p=0,09) na metilação
genômica de leucócitos e na mucosa de cólon normal, respectivamente, após
suplementação por 10 semanas.
Mais pesquisas serão necessárias para avaliar a indicação e a
segurança do uso do ácido fólico per se, diante das variações genéticas,
condições dietéticas e marcadores tumorais, de cada indivíduo.
Especificamente com relação aos pacientes portadores do genótipo
677TT, é bem aceito que a suplementação ou dieta rica em ácido fólico deve
ser estimulada em casos de hiperhomocisteinemia. Ainda não é conhecida a
quantidade de folato necessária para compensar o defeito genético. Estima-se
que deve ser necessário um nível de folato plasmático acima de 13,6 nmol/L
para diminuir os níveis de homocisteína (Somekawa et al., 2002). No entanto,
esses indivíduos devem ter acompanhamento clínico e laboratorial para se
evitar excesso de suplementação, pois, hoje em dia, existem alimentos de
grande consumo, tais como farinha e cereais, fortificados com ácido fólico. Os
níveis séricos elevados de ácido fólico podem levar a outros efeitos deletérios,
como declínio da cognição em idosos e da função imune (Ulrich & Potter,
2006).
Em nosso estudo, os resultados de genotipagem da MTHFR foram
semelhantes quando analisamos 32 pares de tecido colorretal normal e tumoral
do mesmo paciente. Sabe-se que a genotipagem do tecido tumoral pode ser
problemática, por causa da perda da heterogosidade (LOH), que é uma
característica comum dos tumores, especialmente no CCR. Isso pode levar a
uma classificação errônea dos genótipos, por isso alguns estudos preferem a
75
utilização do tecido normal ou de sangue periférico. A perda das regiões
cromossômicas 8p, 17p, 18q e 22q são freqüentes em CCR. Em nosso estudo,
não tivemos dificuldade com relação à amplificação do loco da MTHFR por
PCR, ou à genotipagem por RFLP de nossas amostras, realizada em triplicatas
e em dias diferentes. Por mais cuidadosa que seja a microdissecção das
amostras de CCR, existe a chance de contaminação com tecido normal (como
células endoteliais dos vasos, células do estroma e inflamatórias) de
aproximadamente 18%. Isso pôde ter contribuído para as taxas de sucesso de
nossos experimentos. Na ausência de LOH para o loco estudado no tecido
tumoral, o mesmo genótipo era esperado para esses tecidos, uma vez que o
polimorfismo da MTHFR é uma alteração genômica, não-específica das células
tumorais. Por isso, o polimorfismo C677T não deve ser considerado como
marcador tumoral, mas possível marcador preditivo.
Parece ser interessante a genotipagem do polimorfismo da MTHFR e de
outras enzimas cruciais do ciclo do folato (particularmente timidilato sintetase)
anteriormente à quimioterapia adjuvante para tratamento do CCR e CM. É
importante chamar a atenção para a toxicidade e o aumento da resposta
terapêutica por maior quimiosensibilidade, que os pacientes portadores do
genótipo TT apresentam, quando realizam quimioterapia com metotrexato e 5-
fluorouracil, respectivamente, em comparação aos genótipos 677CC/CT
(Shrubsole et al., 2005). Trabalhos recentes demonstraram maior
quimiosensibilidade das células portadoras do genótipo 677TT (Sohn et al.,
2004) e maior resposta terapêutica ao 5-fluorouracil em pacientes com
polimorfismo 677TT com CCR metastático (Cohen et al., 2003). Vários estudos
indicam que o genótipo 677 TT está associado ao risco aumentado de
76
aparecimento de mucosite oral, e principalmente com maior toxicidade hepática
e hematopoiética quando da utilização do metotrexato, o que culmina em
interrupção do tratamento. Uma toxicidade severa de medula óssea foi
observada em mulheres com CM, portadoras do genótipo TT, quando o
esquema quimioterápico utilizava simultaneamente metotrexato e 5-fluorouracil
(Robien et al., 2005; Kim, 2005; Efferth & Volm, 2005). A homozigose do alelo
T parece estar associado à baixa sobrevida em mulheres com CM avançado, e
não modifica a sobrevida de mulheres diagnosticadas em estádio inicial,
quando comparado a pacientes portadores dos outros genótipos com os
mesmos estádios (Efferth & Volm, 2005).
1.2 MTHFR, CCR E CARACTERÍSTICAS CLÍNICO-PATOLÓGICAS
A literatura tem mostrado que o CCR pode progredir através de dois
mecanismos distintos que envolvem diferenças clínicas, fenotípicas e
moleculares.
Um estudo conduzido por Rosen & Shaw (1999) avaliou 915 recém-
nascidos hígidos, e sugeriu que o genótipo TT foi mais freqüente em recém-
nascidos do sexo masculino do que no sexo feminino. Em nosso estudo, não
foi observada diferença na freqüência do genótipo TT com relação à
estratificação por sexo, assim como demonstrado no estudo de Anderson et al.
(2005). Neste estudo, os autores analisaram os resultados de 20 trabalhos
publicados na literatura, referentes a um total de 8.400 indivíduos pesquisados,
77
e não encontraram variação entre a freqüência dos genótipos da MTHFR e o
sexo desses indivíduos.
Shannon e colaboradores (2002) sugerem que o genótipo 677 TT está
associado à alta mortalidade em populações idosas. Esses autores justificam
esse resultado pelo fato de que, tanto o genótipo TT quanto o processo natural
de envelhecimento, favorecem um aumento do nível de homocisteína
plasmática, notável fator de risco para hipometilação genômica. Assim,
teoricamente, à medida que a idade progride, aqueles indivíduos portadores do
genótipo TT devem apresentar maior risco para o aparecimento do CCR,
quando alcançarem uma idade mais avançada. De fato, ao separamos os
pacientes com CCR em dois grupos, o primeiro constituído de indivíduos com
idade superior a 70 anos, e o segundo com indivíduos com menos de 70 anos,
observamos uma maior freqüência do genótipo TT no primeiro grupo (19%) em
comparação ao segundo (9%), mas essa diferença não apresentou
significância estatística. Além disso, parece não haver relação linear entre o
genótipo TT e a severidade (avaliado através do estadiamento por Dukes) e a
recorrência até 3 anos após remissão da doença, em concordância com o
trabalho de Shannon e colaboradores (2002). Consideramos que o
estadiamento da doença está ligado à temporalidade do diagnóstico, não
refletindo a agressividade tumoral.
78
1.3 MTHFR, CCR E MECANISMOS PATOGENÉTICOS
1.3.1 MTHFR, CCR e Hipermetilação da região promotora de genes
Dois mecanismos patogenéticos distintos foram propostos para o CCR.
O mais freqüente (85%), denominado “clássico”, está relacionado à ocorrência
de eventos mutacionais (germinativos e/ou somáticos) aditivos que culminam
em LOH, e, portanto, em instabilidade cromossômica, de importantes regiões
genômicas. O outro, denominado “mutador”, está relacionado à ineficiência do
sistema de reparo (MMR) que ocorre em decorrência de mutações somáticas
e/ou germinativas em genes relacionados ao MMR. A distinção entre os dois
mecanismos é relevante, uma vez que os tumores ditos “mutadores” exibem
características biológicas e clínicas específicas que, em conjunto, são
denominadas fenótipo mutador. Este fenótipo inclui localização preferencial no
cólon direito, histologia indiferenciada, infiltração linfocitária, melhor prognóstico
e maior resistência à quimioterapia com 5-fluorouracil.
Atualmente, sabe-se que a perda da atividade dos genes relacionados
na gênese de ambos os mecanismos (clássico ou mutador) ocorre
preferencialmente por eventos epigenéticos (hipermetilação e hipometilação).
Dentre esses, a hipermetilação da região promotora de genes é evento
marcante das células neoplásicas, especialmente para o CCR. Particularmente,
a hipermetilação da região promotora do gene hMLH1 é o único evento que
reconhecidamente origina MSI e, portanto, está relacionado ao fenótipo
mutador. Em nosso estudo, avaliamos se haveria associação entre a
hipermetilação da região promotora de 5 genes relacionados ao CCR (DAPK,
79
MGMT, hMLH1, p16
INK4a
e p14
ARF
), MSI (dados publicados por Anacleto et al.,
2005) e os genótipos da MTHFR. Poucos trabalhos estudaram esses
parâmetros moleculares com relação aos polimorfismos da MTHFR.
A investigação entre hipermetilação e o genótipo TT da MTHFR é
interessante devido a três pontos principais: (i) o polimorfismo da MTHFR
C677T leva ao desequilíbrio do metabolismo dos grupos metila e, teoricamente,
pode afetar o padrão de metilação; (ii) o genótipo 677TT está associado à
hipometilação de tecidos normais e em tecidos de CCR, CM e câncer de
pulmão (Paz et al., 2002); (iii) os tumores que exibem hipermetilação da região
promotora de genes, freqüentemente, exibem hipometilação genômica por
excesso de consumo de grupamentos metila, o qual ocorre no primeiro evento
(Esteller, 2005). No entanto, nós não encontramos diferenças estatisticamente
significativas entre o genótipo TT e hipermetilação de um ou mais locos
analisados nas amostras de CCR, em concordância com estudo anterior (Paz
et al., 2002). No entanto uma pergunta poderia ser feita: será que o genótipo
TT poderia levar a menor quantidade de locos hipermetilados em nossas
amostras, em comparação aos genótipos CT e CC? Esta pergunta se sustenta
pela hipótese de que o genótipo TT leva à diminuição da formação de SAM,
principal doador de grupamentos metila, fundamental para metilação aberrante
dos promotores dos genes. Das amostras com genótipo 677TT (n=15) e 677
CT+CC (n=91), 47% (n=7) e 55% (n=50) delas apresentaram hipermetilação
em pelo menos um dos locos analisados, sem diferença estatística entre os
grupos (p=0,59; dado não-mostrado). Dois motivos podem contribuir para o
resultado negativo, em resposta à pergunta feita anteriormente: o número
pequeno de indivíduos com genótipo 677TT (n=15), e a inacessibilidade dos
80
níveis de folato plasmático dos pacientes, pois níveis adequados de folato
podem reverter os efeitos da homozigozidase do alelo T. Seria interessante a
realização de estudos com maior casuística em que se investigasse a
associação entre as variantes germinativas que envolvem as enzimas
relacionadas no metabolismo do folato, a metilação aberrante dos promotores
de genes envolvidos na gênese do câncer e os níveis de folato plasmático.
Esses parâmetros, em conjunto, podem afetar o paradigma de metilação de
DNA.
1.3.2 MTHFR, CCR e Instabilidade de Microssatélites
A presença de MSI é característica marcante dos CCR que pertencem
ao fenótipo mutador. Tumores MSI+ são tipicamente diplóides, apresentam
tamanhos maiores, raramente dão origem a metástases, apresentam
estadiamento menos avançado e, por isso, apresentam melhor prognóstico e
sobrevida do que os tumores com instabilidade cromossômica e com
estabilidade de microssatélites (MSS) (Chang et al., 2006). Dois eventos falam
contra a “benignidade” dos tumores CCR/MSI+. O primeiro é a resistência à
quimioterapia e a menor sobrevida dos pacientes MSI+ em tratamento com 5-
fluorouracil (Carethers et al., 1999). O segundo evento é que a MSI em CCR
pode ser um marcador de suscetibilidade herdada ou adquirida para outras
doenças, como câncer gástrico, de útero e ovário, conforme relatado por
recente estudo (Chang et al., 2006). As nossas amostras 677TT/MSI+
totalizaram 7 indivíduos que apresentaram as seguintes características: 6
mulheres, todos os pacientes apresentavam idade superior a 70 anos, 2 casos
81
de invasão linfocitária, estadiamento a partir de T2N0M0 e nenhuma
recorrência da doença. Não tivemos acesso ao tipo de quimioterapia
empregada nesses pacientes. Seria interessante analisar a resposta à
quimioterapia com 5-fluorouracil nos pacientes CCR do grupo 677TT/MSI+. De
forma paradoxal, o genótipo 677TT pode “anular” o efeito conferido pelo
CCR/MSI+, e vice-versa. Os pacientes portadores de tumores MSI+ são
quimioresistentes e, em contraponto, o genótipo TT confere maior
quimiosensibilidade e resposta terapêutica ao 5-fluorouracil.
Em nosso estudo, encontramos uma forte associação estatística entre o
genótipo 677TT e a instabilidade de microssatélites. Esta associação já foi
observada em estudo prévio (Shannon et al., 2002), mas não em outros (Toffoli
et al., 2003; Eaton et al., 2005). Shannon et al. (2002) observaram que os
tumores MSI eram mais comuns entre pacientes com CCR mais idosos (>70
anos), quando comparados com tumores MSS, à semelhança dos nossos
resultados. Em contraponto, Plaschke et al. (2003) não identificaram nenhuma
associação entre os genótipos dos polimorfismos C677T/A1298C e os casos
de CCR com MSI. Dois estudos em CCR são favoráveis a uma associação
inversa entre o genótipo 677TT e MSI (Toffoli et al., 2003 e Eaton et al., 2005)
influenciado por adequados níveis de folato, e preconizam que essa situação
favorece tumores MSS.
Investigamos duas possibilidades que poderiam originar a associação
entre polimorfismo 677TT e MSI+: o excesso do genótipo 677TT nas amostras
MSI+ estaria relacionado à hipermetilação da região promotora do gene
hMLH1? Ou estaria associado à mera estratificação étnica?
82
Para responder à primeira pergunta, separamos as amostras
677TT/MSI+ em dois subgrupos com relação à presença ou ausência de
hipermetilação para o loco hMLH1. Houve um equilíbrio entre as freqüências
das amostras 677TT/MSI+ para ambos subgrupos (p=0,1). Observamos, ainda,
que nem todas as amostras MSI+ apresentavam hipermetilação da região
promotora para o loco analisado. A metilação neste loco, reconhecidamente,
leva à instabilidade de microssatélites, mas nem sempre toda instabilidade de
microssatélites está associada a hipermetilação do gene de reparo hMLH1,
conforme já visto em alguns estudos (Yamashita et al., 2003; Anacleto et al.,
2005b). Nas amostras 677TT/MSI-, não foi observada hipermetilação para o
loco hMLH1.
No Brasil, temos uma população bastante heterogênea, que resulta de
cinco séculos de mistura étnica entre indivíduos. Estes eram oriundos de três
continentes: Europa, na figura dos colonizadores portugueses, África (através
da vinda dos escravos) e América (nativos habitantes do Brasil). Desde a
colonização, esses três grupos se misturaram a tal ponto que, no Brasil, a cor
de pele não reflete a origem ancestral do indivíduo (Parra et al., 2003). As
proporções relativas das três ancestralidades variam consideravelmente em
diferentes regiões brasileiras (Alves-Silva et al., 2000; Carvalho-Silva et al.,
2001). Poucos estudos relatam a freqüência alélica ou genotípica da MTHFR
C677T encontrada no Brasil, segundo dados publicados na literatura indexada
(Franco et al., 1998; Arruda et al., 2002; Couto et al., 2004). No mundo, a
distribuição da freqüência do alello 677T parece variar de acordo com o grupo
étnico e área geográfica. As freqüências alélicas e genotípicas mais baixas são
encontradas em populações pretas de descendência africana, como do Quênia
83
(4.9% / 0%), Gâmbia (6.25% / 0%) e Madagascar (6,7% / 0%) (Schneider et al.,
1998). Nesses grupos africanos, não foi detectado nenhum indivíduo portador
de homogozigose do alelo T (Schneider et al., 1998, Rosenberg et al., 2002).
As maiores freqüências são encontradas em hispânicos, variando entre 41 até
57% para freqüência do alelo T (maior pico observado em mexicanos) e 15,3 a
32% para freqüência genotípica (Schneider et al., 1998; Wilcken et al., 2003).
Na população européia observa-se um aumento progressivo da freqüência do
genótipo TT à medida que se desloca do extremo norte europeu para os países
mediterrâneos. Este fenômeno também é observado na América do Norte,
onde no Canadá encontram-se freqüências do genótipo TT menores do que
aquelas encontradas no sul dos Estados Unidos (Wilcken et al., 2003). O
consumo adequado de ácido fólico parece influenciar na distribuição dos
genótipos da MTHFR, o que justifica a variabilidade na prevalência do genótipo
677TT em diferentes populações. Os indivíduos portadores de homozigose da
MTHFR apresentam uma sobrevida maior, se o consumo de ácido fólico for
adequado (Rosenberg et al., 2002). Isso explicaria o fenômeno observado na
distribuição crescente da freqüência do genótipo 677TT do norte para o sul da
Europa: há um consumo maior de ácido fólico nos países mediterrâneos, em
comparação aos nórdicos. Concebivelmente, a baixa freqüência da MTHFR
677T observada em africanos está relacionada à deficiência de folato, por
desnutrição e má absorção do ácido fólico, condições ainda comuns na África
(Rosenberg et al., 2002). No entanto, a freqüência do genótipo TT em
afrodescendentes moradores nas Américas é superior em relação aos
africanos, mas ainda são freqüências menores do que aquelas encontradas
nos outros grupos étnicos (Botto & Yang, 2000). Uma dieta mais rica em ácido
84
fólico e a mistura étnica poderiam contribuir para o aumento da freqüência do
genótipo 677TT entre afro-descendentes. A figura 5.1 mostra a distribuição da
freqüência dos genótipos 677CC+CT e 677TT em alguns países do mundo.
Considerando que a freqüência do alelo 677T (Botto et al., 2001) e a
incidência da MSI (Ashktorab et al., 2003) em CCR parecem ser
diferentesentre africanos e europeus, investigamos se a associação entre MSI+
e genótipo 677TT poderia ter acontecido devido à estratificação étnica das
amostras de CCR. Utilizamos como ferramenta a análise de 40 locos bialélicos
polimórficos (indels) que, em conjunto, formam uma poderosa ferramenta para
informar a ancestralidade genômica de cada indivíduo (Bastos-Rodrigues et al.,
2006). Escolhemos os indels como marcadores de ancestralidade genômica
porque apresentam algumas vantagens em comparação a outros marcadores,
como, por exemplo, os microssatélites. Os indels formam uma ferramenta
simples, com baixa taxa de mutação e, por isso, reproduzem um histórico
evolutivo mais antigo do que os microssatélites.
A distribuição dos indivíduos com CCR MSI+ e MSI- nas três principais
populações étnicas fundadoras da população brasileira (Ameríndia, Africana e
Européia) foi semelhante entre os grupos MSI+ e MSI-. Esse resultado é
importante porque exclui a estratificação étnica de nossas amostras. Assim,
descartam-se duas possibilidades que poderiam causar um viés em nosso
resultado. A primeira, de encontramos um maior número de indivíduos de
ancestralidade européia no grupo MSI+ do que o número observado no grupo
MSI- e, a segunda, de existir um número de indivíduos de ancestralidade
africana no grupo MSI-, superior ao número encontrado no grupo MSI+.
85
A maioria dos pacientes do grupo CCR e do grupo controle
apresentaram ancestralidade européia (85%). Os indivíduos pesquisados em
nosso estudo são representativos da distribuição dos grupos ancestrais, na
Região Sudeste do Brasil. Um estudo populacional, utilizando os mesmos
marcadores, revelou que 88% dos indivíduos da região sudeste brasileira
pertencem à ancestralidade européia (Bastos-Rodrigues et al. - manuscrito em
preparação). Assim, exclui-se a possibilidade de não-aleatoriedade ou de
seletividade de nossas amostras.
86
32%
68%
32%
68%
677 TT
677 CC+CT
32%
68%
12%
88%
12%
88%
12%
88%
12%
88%
11%
89%
11%
89%
5%
95%
26%
74%
6%
94%
1%
99%
0%
100
%
20%
80%
8%
92%
13%
87%
9%
91%
4%
96%
7%
93%
1%
99%
0%
100
%
14%
86%
7%
93%
0%
100
%
2%
98%
15%
85%
0%
100
%
13%
87%
2%
98%
Figura 5.1: Distribuição das freqüências genotípicas 677TT e 677CC+CT da MTIFR em alguns
países do mundo. Adaptado de: Arruda et al., 1998; Schineider et al., 1998; Botto & Yang,
2000; Adjalla et al., 2003; Rajkovic et al., 2003, Wilcken et al., 2003
86
2. ESTUDO DO CÂNCER DE MAMA
2.1 POLIMORFISMO DA MTHFR E CÂNCER DE MAMA
Os poucos estudos que investigaram a associação entre CM e o
polimorfismo da MTHFR C677T forneceram resultados controversos ou
inconclusivos, até o momento. Vários fatores contribuíram para a variabilidade
dos resultados: pequeno número de casos e controles, diferentes populações e
agrupamento diferente de genótipos da MTHFR 677 para análise estatística
(por exemplo, CC x CT/TT ou CC/CT x TT).
Em nosso estudo, não foi encontrada associação estatisticamente
significativa entre o polimorfismo C677T e o risco para CM. Recente meta-
análise sobre o tema (Zintaras, 2006) agrupou e analisou os dados de 33
artigos indexados e não encontrou relação entre o polimorfismo C677T e CM.
Dentre esses, apenas três trabalhos (Ergul et al., 2003; Deligezer et al., 2005;
Chen et al., 2005) mostraram associação entre o genótipo 677TT e CM.
Zintaras (2006) estratificou os dados de acordo com três categorias principais:
(i) grupo étnico (descendência européia, africana, leste asiático e “outros” que
incluíram as etnias turcas, havaianas, judias e árabes), (ii) época do
diagnóstico do CM na pré- e (iii) pós menopausa. Não foi encontrada diferença
estatística entre o polimorfismo C677T e mulheres com CM de diferentes
grupos étnicos ou mulheres diagnosticadas com CM na pós-menopausa. No
entanto, essa meta-análise (Zintaras, 2006) e outro estudo (Semenza et al.,
2003) relataram que o polimorfismo C677T é um fator de risco para CM em
mulheres na pré-menopausa, contrariamente aos resultados encontrados em
nosso trabalho, no qual não encontramos associação entre mulheres na pré-
87
menopausa com diagnóstico de CM e o genótipo 677TT. Os efeitos
decorrentes da inadequada atividade da MTHFR podem-se somar aos efeitos
do estrógeno no epitélio mamário. Casos de CM diagnosticados em mulheres
com ciclos ovulatórios (ou seja, na pré-menopausa) apresentam mecanismo
patogenético diferente dos casos com diagnóstico na pós-menopausa. Os
hormônios ovarianos (notadamente o estrógeno) afetam a cinética das células
tronco do epitélio mamário, induzindo sua diferenciação e replicação. A longa
ou superexposição aos hormônios pode ser um ponto de partida para a
carcinogênese mamária (Henderson et al., 1988). Células com alta atividade
mitótica são susceptíveis a alterações na síntese, reparo e metilação de DNA.
Uma vez que a MTHFR tem um papel relevante na manutenção destas etapas
moleculares, sua inadequada atividade pode ter um sinergismo juntamente
com os hormônios ovarianos na patogênese do câncer de mama. No entanto, a
avaliação dietética do consumo de folato é importante para validar esse tipo de
associação. Devido a isso, as conclusões dos trabalhos que avaliam a relação
entre a expansão estrogênica e a atividade da MTHFR no parênquima mamário
devem ser interpretadas com cautela (Semenza et al., 2003; Zintaras, 2006),
pela falta de dados referentes a fatores modificadores do ciclo do folato, como
a dieta.
88
2.2 POLIMORFISMO DA MTHFR, CÂNCER DE MAMA E STATUS
HORMONAL
Estudos sugerem que as pacientes portadoras do genótipo TT na pós-
menopausa são boas candidatas a utilizarem terapia de reposição hormonal
(TRH) (Somekawa et al., 2002). Recente trabalho (Le Marchand et al., 2004)
mostrou uma associação inversa entre o genótipo 677TT e CM em mulheres na
pós-menopausa em TRH. De maneira similar, também não encontramos
associação entre genótipo TT e status hormonal, porém, nossas pacientes não
estavam em TRH. Na pós-menopausa, o epitélio mamário apresenta uma
diminuição notória das taxas de divisão celular, no entanto ocorre um aumento
significativo dos níveis de homocisteína plasmática (Hak et al., 2000).
Teoricamente, os estrógenos exógenos aumentam a proliferação epitelial na
mama e, ao mesmo tempo, diminuem os níveis de homocisteína plasmática,
mas por um mecanismo que parece ser independente dos níveis de folato ou
do genótipo da MTHFR (Somekawa et al., 2002, Madsen et al., 2002). Ainda
permanece sem resposta o mecanismo pelo qual o genótipo TT favoreceria um
efeito protetor para o risco de CM, nas mulheres pós-menopausa em TRH.
2.3 POLIMORFISMO DA MTHFR, CÂNCER DE MAMA E IDADE
O aumento da idade, a pós-menopausa e o genótipo 677TT elevam os
níveis de homocisteína plasmática, e, além disso, já foi demonstrado que a
homozigosidade do alelo T da MTHFR 677 está relacionada à maior
mortalidade em idosos com CCR (Shannon et al., 2002). Devido a isso,
estratificamos as pacientes com CM em dois grupos, o primeiro constituídos de
pacientes com idade maior que 70 anos e o segundo, constituído de pacientes
89
com idade menor que 70 anos. Não houve diferença na freqüência do genótipo
677TT em relação à iadade. O que pode ter influenciado os resultados de
nosso trabalho é o número reduzido de mulheres acima de 70 anos com CM,
aproximadamente 18% da casuística, diferentemente do número de pacientes
com idade acima de 70 anos no estudo CCR (Shannon et al., 2002), que
representaram 52%. Em nosso trabalho, não pudemos avaliar o impacto do
genótipo TT sobre a mortalidade, pois todas as pacientes estavam vivas e em
acompanhamento clínico no ambulatório de mastologia do Hospital das
Clínicas (UFMG), por ocasião do estudo. A homozigosidade do alelo T parece
estar associada à baixa sobrevida em mulheres com CM avançado, e não
modifica a sobrevida de mulheres diagnosticadas em estágio inicial, quando
comparada a pacientes portadores dos outros genótipos da MTHFR com os
mesmos estádios (Shrubsole et al., 2005). Não tivemos acesso ao tipo de
quimioterapia que as pacientes utilizaram para o tratamento do CM. Parece
que as pacientes com CM e genótipo 677TT podem apresentar baixa sobrevida
por apresentarem exacerbação dos efeitos tóxicos da quimioterapia adjuvante.
Uma toxicidade severa de medula óssea foi observada em mulheres com CM
portadoras do genótipo TT, quando no esquema quimioterápico, utilizava-se
simultaneamente metotrexato e 5-fluoracil (Robien et al., 2005; Kim, 2005;
Efferth & Volm, 2005). Dentre seis pacientes que apresentaram toxicidade
severa ao primeiro ciclo com CMF (ciclofosfamida, metotrexato e 5-fluoracil),
cinco eram portadoras do genótipo 677TT. Tratamentos com drogas
antimetabólicas, como o metotrexato, podem elevar os níveis de
homocisteinemia plasmática, o que contribui para a toxicidade (Toffoli et al.,
2000). Neste sentido, o genótipo da MTHFR C677T e os níveis de
90
homocisteína são fatores preditores de toxicidade quando se utilizam drogas
antifolato, como metotrexato e 5-fluoracil. A administração de folato, vitamina
B6 e B12 é barata, não-tóxica e pode proteger as pacientes portadoras do
genótipo TT de efeitos colaterais severos e até mesmo letais da quimioterapia
com CMF.
2.4 POLIMORFISMO DA MTHFR, CÂNCER DE MAMA E CONSUMO
DE ÁLCOOL E CIGARRO
Atualmente, as pesquisas têm dado muita atenção para os fatores de
risco modificáveis associados ao câncer. O efeito cumulativo de nove fatores
de risco modificáveis é responsável por mais de um terço das mortes por
câncer (Danaei et al., 2005). A busca por medidas de saúde pública e
intervenções clínicas têm sido o foco de vários estudos porque vários tipos de
câncer, incluindo CM e CCR, podem ser prevenidos por mudanças nos hábitos
de vida. Dentre os fatores de risco modificáveis, destacam-se o tabagismo e o
consumo de álcool, além do baixo consumo de frutas e vegetais.
Um dos exemplos mais ilustrativos da interação gene-ambiente na
carcinogênese constitui-se da relação do polimorfismo da MTHFR 677 e dos
fatores de risco modificáveis. A associação do polimorfismo 677 e CM tem sido
inconsistente, porque os fatores ambientais apresentam um potente efeito
modificador no risco para CM. Isoladamente, o tabagismo deve ter um
importante papel na carcinogênese mamária, mas não é considerado fator de
risco primário. Cui et al. (2006) mostraram que o risco para CM está associado
com a duração, a intensidade e a exposição cumulativa ao consumo de cigarro.
Os fumantes estão expostos a vários agentes carcinogênicos bem conhecidos,
91
presentes na fumaça do cigarro, como, por exemplo, o benzopireno, um
hidrocarbono aromático policíclico. A forma ativa do benzopireno, benzopireno-
diol-epóxido, está relacionada a maior dano ao DNA de pacientes com CM, por
alterações no sistema de reparo, podendo contribuir para o risco de CM (Shi et
al., 2004). Além disso, estudos epidemiológicos têm demonstrado que os
fumantes apresentam um nível maior de homocisteína plasmática e baixos
níveis séricos de vitaminas do grupo B, como B6, B12 e folatos, quando
comparados aos não-fumantes (Piyathilake et al., 1994, O’Callaghan et al.,
2002). Portanto, os efeitos deletérios do cigarro podem se somar aos efeitos
promovidos pela baixa atividade da MTHFR. Por isso, investigamos se as
pacientes com CM, tabagistas, apresentariam maior freqüência do genótipo
677TT, em comparação às não-tabagistas. Encontramos um valor marginal
(p=0,043), estatisticamente não significativo, entre pacientes portadoras do
genótipo 677TT tabagistas, e. não-tabagistas. Até o momento, na literatura
indexada, nenhum trabalho exibiu uma casuística adequada para a avaliação
entre CM, tabagismo e polimorfismo da MTHFR C677T. Dois trabalhos
relataram associação significativa entre tabagismo e o polimorfismo C677T da
MTHFR em câncer de bexiga (Lin et al., 2004) e em mulheres com câncer de
pulmão (Shi et al., 2005). O tabagismo é um fator de risco primário para o risco
de câncer de pulmão e bexiga, e é considerado um fator secundário em outros
tipos de câncer, como o colorretal e o de mama. Esta observação pode
contribuir para um viés na análise dos resultados relatados pelos estudos
anteriormente citados.
Com relação ao consumo de álcool, observamos freqüência maior do
genótipo 677TT em mulheres com CM, etilistas, que foi estatisticamente
92
diferente das não-etilistas (p=0,007; CI=0,05-0,67). Esse resultado indica uma
forte associação entre pacientes com CM que consomem álcool e o
polimorfismo 677TT. Esse resultado é interessante, porque o álcool interfere
em variáveis importantes para o metabolismo do folato. O álcool é um
“antagonista do folato”, e seu uso moderado (2-3 doses/dia) diminui os níveis
séricos de vitamina B12 e folatos, e aumenta os níveis de homocisteína (de la
Vega et al., 2001; Giovannucci, 2004; Chiuve et al., 2005). Além disso, os
indivíduos portadores do genótipo 677TT são especialmente sensíveis aos
efeitos carcinogênicos do álcool (Bailey et al., 2003), e podem ser intolerantes
ao uso de bebidas alcoólicas (Semenza et al., 2003). Nossos resultados são
diferentes dos relatados por Le Marchand (2004), que relatou que o consumo
de álcool está associado ao aumento do risco de CM em portadoras do
genótipo 677CC, usuárias de TRH. Trabalho anterior relatou que as pacientes
com CM portadoras dos genótipos 677CC e CT estão associadas a um risco
menor para a doença quando os níveis de folato são adequados (Beilby et al.,
2004). De fato, o consumo adequado de folato deve ter um papel preventivo
para o CM, em mulheres que consomem álcool (Zintaras, 2006). A maioria dos
trabalhos observou que há um risco elevado de CM em mulheres com genótipo
677TT que apresentam um baixo consumo de folato (Chen te al., 2003),
semelhante ao relatado para o CCR. Indivíduos etilistas portadores do genótipo
677TT apresentam um risco maior para CCR, que pode ser revertido através
de alto consumo de folato (Weisberg et al., 2003). Há poucos trabalhos que
relataram o álcool como modificador do risco para CM em portadores do
genótipo 677TT. Na maioria dos trabalhos, observou-se que há um risco
elevado de CM em mulheres com genótipo 677TT que apresentam um baixo
93
consumo de folato (Chen te al., 2003). Estima-se que o consumo moderado de
álcool (>15g/dia) é suficiente para aumentar os níveis de homocisteína em
mulheres saudáveis (Chiuve et al., 2005), e que os níveis de folato plasmático
acompanham inversamente aos níveis de homocisteína. Neste estudo, as
pacientes etilistas consomem de 12 a 41g/dia de álcool. A média de álcool
consumida pelas pacientes portadoras do genótipo TT foi de 24g/dia.
Teoricamente, a ingestão dessa quantidade de álcool poderia modificar os
níveis de homocisteína e folato plasmático, sendo intensificados pelos efeitos
deletérios advindos da baixa atividade da MTHFR. Isso justificaria a maior
proporção de pacientes com CM alocadas no grupo das etilistas portadoras do
genótipo TT. No entanto, não podemos afirmar tal mecanismo, porque não
temos acesso aos níveis de homocisteína ou folato plasmáticos e nem
informações sobre a dieta dessas pacientes. O uso preventivo de folato para
pacientes etilistas portadoras do genótipo TT, deve ser considerado, com o
objetivo de reverter os efeitos do genótipo 677TT no CM.
Com o intuito de determinar se a gravidade do CM e o genótipo 677TT
da MTHFR estariam relacionados, separamos as pacientes de acordo com o
estadiamento TNM e os genótipos 677CC+CT e TT. Foi encontrada uma forte
associação estatística, entre estadiamento para CM e genótipo TT (p=0,0077).
Observamos um significativo acúmulo de pacientes portadoras do genótipo
677TT encontradas no estadiamento IIIA (p=0,0083). Esse resultado foi
diferente do reportado pelo estudo de Srubsole et al., (2005), no qual não
encontrou diferença significativa entre estadiamento para CM e genótipos da
MTHFR. Outro estudo conduzido por Langsenlehner et al., (2003), o qual
analisou variáveis como, tamanho do tumor maior que 2 cm, grau histológico
94
superior a 2, e metástases em linfonodos, também não encontrou associação
estatística entre essas características e os genótipos da MTHFR. Ambos os
trabalhos utilizaram um número maior de pacientes, e a proporção de pacientes
portadoras do genótipo TT foi superior à nossa casuística.
Não podemos afirmar que existe uma relação de causalidade entre
genótipo TT e estadiamento IIIA para CM. O estadiamento, neste estudo, está
ligado apenas à temporalidade do diagnóstico, não refletindo o nível de
agressividade tumoral. Temos que considerar que as pacientes do nosso
estudo são pertencentes às classes sociais média e baixa. Sabe-se que o
acesso dessas pacientes ao setor primário de saúde (posto de saúde) e ao
secundário (ambulatórios de especialidade) é difícil, o que pode postergar o
diagnóstico da doença. Ao mesmo tempo, não podemos deixar de discorrer
que o tumor de mama classificado em estádio III, apresenta maior atividade
celular em relação aos estádios I e II. A diferença marcante entre estadiamento
IIIA e os demais estádios se refere à invasão de células cancerosas em
linfonodos axilares (N2, linfonodos axilares fixos). Não sabemos qual é o
processo que poderia contribuir para a metástase das células do CM que
expressam a MTHFR com baixa atividade. No entanto, os efeitos da inatividade
da MTHFR podem se somar às inúmeras alterações celulares que controlam o
crescimento celular e a invasão do tecido adjacente e à distância. No entanto,
uma pergunta poderia ser feita: será que essa associação ocorreu por maior
quantidade de pacientes etilistas encontradas no estadiamento IIIA? Somente
duas pacientes, com estádio IIIA e portadoras do genótipo TT, eram etilistas.
Com o intuito de averiguar se o consumo de álcool e de cigarro poderia estar
correlacionado ao estadiamento mais avançado, essas variáveis foram
95
analisadas através de regressão logística. Nesta análise não foi encontrada
nenhuma associação, sugerindo que, em nosso estudo, esses fatores de risco
modificáveis não se correlacionam com a estadiamento avançado. Estudos
adicionais focados na relação do álcool, estadiamento para CM e polimorfismo
da MTHFR devem ser realizados.
96
6. CONCLUSÃO
97
Este traballho avaliou o polimorfismo da MTHFR C677T em dois tipos de
câncer, CCR e CM. Nas amostras de CCR avaliou-se a relação entre o
genótipo 677TT, e parâmetros clínicos e moleculares. Nas amostras de CM,
avaliou-se a relação entre o genótipo 677TT e parâmetros clínico-patológicos.
A partir da análise e discussão dos resultados encontrados neste trabalho,
podemos concluir:
9 Não encontramos associação estatisticamente significativa entre o
polimorfismo C677T e o risco para CCR e CM.
9 Nas amostras de CCR, não encontramos associação
estatisticamente significativa entre o genótipo 677TT e parâmetros
clínicos e/ou hipermetilação da região promotora de 5 genes
associados ao CCR (DAPK, MGMT, hMLH1, p16
INK4a
e p14
ARF
). No
entanto, foi observada uma forte associação estatística entre os
tumores MSI+, e o genótipo 677TT.
9 Nas amostras de CM, foi encontrada associação estatisticamente
significativa, entre o genótipo 677TT e pacientes etilistas, e entre
pacientes diagnosticadas em estádio IIIA.
98
7. ANEXOS
99
1.1
Aprova
ç
ão do estudo pelo Comitê de
É
tica em
Pesquisa do Hospital do Câncer/ São Paulo
100
1.2 Aprova
ç
ão do estudo pelo Comitê de
É
tica em
Pesquisa do Hospital das Clínicas da UFMG
101
CONSENTIMENTO INFORMADO E ESCLARECIDO
Estudo Epigenético do Câncer de Mama/UFMG
Faculdade de Medicina UFMG/Instituto de Ciências Biológicas UFMG
Nome:________________________________________Nºpront:___________
End:_____________________________________Biópsia HC:( )sim( )não Nº________
Telefone:________________________Cor:_________EstCivil:_______ G P A
Idade:________Idade no diagnóstico:__________ Pré menop: ( ) sim( ) não
Quimio: ( ) sim ( ) não ________________ Radio: ( ) sim ( )não_____________
Dieta:____________________________________________________________________
A.P:___________E___P____cerb-2____p53____Tipo histológico________
Tabagismo:_________________ Álcool:________________HP:____________________
IMC:_______________________ HF:________________________________________
Metástase: ( ) sim( ) não Esvaziamento axilar: ( ) sim( ) não Recidiva: ( ) sim( ) não
Médico responsável:_____________________ SUS / Convênio T N M
Você está sendo convidada a participar de um estudo que irá enriquecer a pesquisa sobre
câncer de mama. A sua participação é VOLUNTÁRIA. Não há interesse financeiro neste
estudo. Este estudo tem autorização do comitê de Ética do Hospital das Clínicas/UFMG.
Iremos estudar se existe ou não alguma alteração em seu DNA que predispõe ao câncer de
mama, e ainda associar aos seus fatores pessoais que estão listados acima com os resultados
encontrados. Como qualquer estudo de laboratório, os resultados podem demorar alguns
anos para serem analisados.
Será coletado uma amostra da sua mucosa bucal (chamamos swab bucal) através da
raspagem da parte interna da boca com uma escovinha. Em casos especiais será coletado
uma pequena amostra de sangue. O material utilizado é totalmente descartável e individual.
Todos os dados coletados serão SIGILOSOS, somente os médicos e as pessoas que estarão
envolvidos saberão dos seus dados, e não serão fornecidos em nenhuma hipótese a outras
pessoas. Esses dados utilizados para publicação em revistas científicas/médicas.Em caso de
necessidade ou dúvida, retorne ao Ambulatório de Mastologia ou ligue para 3499-2628 e
procure pela Dra. Alessandra Clarizia.
Declaro que li e entendi e ainda foi-me explicado claramente sobre a pesquisa que estarei
participando para contribuir com o estudo sobre câncer de mama. Declaro que entendi que
essa pesquisa não apresenta fins lucrativos e que minha participação é voluntária.
_______________________, _____/_____/_____
__________________________________ _____________________________
Paciente Médico (a)
__________________________________
Testemunha
1.3 Consentimento Informado e esclarecido utilizado no
estudo de câncer de mama
102
1.4 Estadiamento de Dukes.
O estadiamento de Dukes utiliza como critério de base o sistema TNM (Tumor,
Nódulo, Metástase). T= tamanho do tumor; Tis= acometimento da mucosa; T1=
acometimento da mucosa e submucosa; T2= acometimento da muscular
própria; T3= acometimento da serosa; T4= acometimento de toda a espessura
da parede incluindo tecidos ou órgãos adjacentes. N= linfonodos com células
tumorais; N0= nenhum linfonodo acometido; N1= acometimento de 1 a 3
linfonodos; N2/N3= acometimento de mais de 4 linfonodos. M= metástase a
distância; M0= ausência de metástase a distância, M1= presença de metástase
a distância.
AJCC= American Joint Committee on Cancer.
Adaptado de: AJCC/Câncer Staging Manual, 6º edição, 2002.
ESTADIO TUMOR PRIM
Á
RIO
L
INFONODOS REGIONAIS MET
Á
STASE A DIST
Â
NCIA DUKES
AJCC
Estadio 0
Tis N0 M0
Estadio I
T1 N0 M0 A
T2 N0 M0 A
Estadio II
AT3 N0 M0 B
BT4 N0 M0 B
Estadio III
A T1-T2 N1 M0 C
B T3-T4 N2 M0 C
C Qualquer T N3 M0 C
Estadio IV
Qualquer T Qualquer N M1 C
103
1.5 Estadiamento Clínico do Câncer de Mama baseado no sistema TNM.
T= tamanho do tumor; TX= tumor primário não pode ser avaliado; Tis=
carcinoma in situ; T0= não há evidência de tumor primário T1= tumor igual ou
maior que 2 cm em seu maior diâmetro; T2= tumor maior que 2 cm ou igual a 5
cm em seu maior diâmetro; T3= tumor maior que 5 cm; T4= tumor de qualquer
tamanho com extensão direta para parede torácica ou pele. N= linfonodos com
células tumorais; NX= linfonodos regionais não podem ser avaliados; N0=
ausência de metástases em linfonodos axilares; N1= metástases em linfonodos
axilares homolaterais móveis; N2= metástases em linfonodos axilares fixos;
N3= metástases em linfonodos da cadeia mamária interna, e/ou infraclavicular,
e/ou supraclavicular. M= metástase à distância; MX= metástase à distância não
pode ser avaliada; M0= ausência de metástase à distância, M1= presença de
metástase à distância.
AJCC= American Joint Committee on Cancer.
Adaptado de: AJCC/Câncer Staging Manual, 6º edição, 2002
ESTADIO
T
UMOR PRIM
Á
RIO
L
INFONODOS REGIONAIS MET
Á
STASE A DIST
Â
NCIA
AJCC
Estadio 0
Tis N0 M0
Estadio I
T1 N0 M0
Estadio II
AT0N1M0
T1 N1 M0
T2 N0 M0
BT2N1M0
T3 N0 M0
Estadio III
AT0N2M0
T1 N2 M0
T2 N2 M0
T3 N1 M0
T3 N2 M0
BT4N0M0
T4 N1 M0
T4 N2 M0
C Qualquer T N3 M0
Estadio IV
Qualquer T Qualquer N M1
104
1.6 GRAMAS DE ÁLCOOL EM ALGUMAS BEBIDAS COMUNS
Nome Quantidade (mL) % álcool v/v média de gramas de álcool
Cerveja 350 4 a 6 13
Vinho branco/tinto 100 13 a 15 10
Gim, Rum, Vodka 45 35-45 16
Aguardente 45 30 a 38 12
Uísque 45 40 a 45 16
Licores 30 20 a 40
7
Fórmula para cálculo de gramas de álcool:
volume (mL) x concentração v/v x 0,789
Fonte:
http://www.alcohol.org.nz/WhatsInAStandardDrink.aspx
http://www.fcf.usp.br/LAT/i_alcool.php
105
8. ARTIGO
114
9.REFERÊNCIAS
BIBLIOGRÁFICAS
115
AJCC cancer staging manual.- 6th ed. Greene Frederick, Page David, Fleming
Irving, Fritz April, Balch Charles, Haller Daniel, Morrow Monica. Springer-
Verlag, New York, 2002.
Alves-Silva J, da Silva Santos M, Guimaraes PE, Ferreira AC, Bandelt HJ,
Pena SD, Prado VF. The ancestry of Brazilian mtDNA lineages. Am J Hum
Genet., 67(2):444-61, 2000.
Anacleto C, Rossi B, Lopes A, Soares FA, Rocha JCC, Caballero O, Camargo
AA, Simpson AJG, Pena SDJ. Development and application of a multiplex
PCR procedure for the detection of DNA methylation in colorectal cancer.
Oncology Reports, 13:325-328, 2005a.
Anacleto C, Leopoldino AM, Rossi B, Soares FA, Lopes A, Rocha JC, Caballero
O, Camargo AA, Simpson AJ, Pena SD. Colorectal cancer "methylator
phenotype": fact or artifact? Neoplasia,. 7(4): 331-5, 2005b.
Anderson CA, Jorgensen AL, Deeb S, McLerran D, Beresford SA, Motulsky AG.
Equal proportion of adult male and female homozygous for the 677C --> T
mutation in the methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism. Am J
Med Genet ; 134(1): 97-9, 2005.
Arruda VR, Siqueira LH, Goncalves MS, von Zuben PM, Soares MC, Menezes
R, Annichino-Bizzacchi JM, Costa FF. Prevalence of the mutation C677 -->
T in the methylene tetrahydrofolate reductase gene among distinct ethnic
groups in Brazil. Am J Med Genet., 78(4):332-5, 1998.
Bastos-Rodrigues L, Pimenta JR, Pena SDJ
The genetic structure of human
populations studied through short insertion-deletion polymorphisms. Annals
of Human Genetics, 70:1-8, 2006.
Baylin SB, Herman JG, Graff JR, Vertino PM, Issa JP. Alterations in DNA
methylation: a fundamental aspect of neoplasia. Adv. Cancer Res., 72:141-
96, 1998.
Beilby J, Ingram D, Hahnel R, Rossi E. Reduced breast cancer risk with
increasing serum folate in a case-control study of the C677T genotype of the
metilenetetrahydrofolate reductase gene. Eur.J. Câncer, 40: 1250-54, 2004.
Brasil. Ministério da Saúde. Secretaria de Atenção à Saúde. Instituto Nacional
de Câncer. Coordenação de Prevenção e Vigilância. Estimativa 2005:
Incidência de Câncer no Brasil. Rio de Janeiro: INCA, p94, 2004.
Brasil. Estimativas de Incidência de Câncer no Brasil para 2006. INCA, 2006:
www.inca.gov.br/estimativas/2006.
Boland CR, Thibodeau SN, Hamilton SR, Sidransky D, Eshleman JR, Burt RW,
Meltzer SJ, Rodriguez-Bigas MA, Fodde R, Ranzani GN, Srivastava S. A
National Cancer Institute Workshop on Microsatellite Instability for cancer
detection and familial predisposition: development of international criteria for
116
the determination of microsatellite instability in colorectal cancer. Cancer
Res., 58, 5248-57, 1998.
Campbell IG, Baxter SW, Eccles DM, Choong DY. Methylenetetrahydrofolate
reductase polymorphism and susceptibility to breast cancer. Breast Cancer
Res., 4: R 4, 2002.
Carethers JM, Chauhan DP, Fink D, et al. Mismatch repair proficiency and in
vitro response to 5-fluoracil. Gastroenterology; 117: 123-131, 1999.
Carvalho-Silva DR, Santos FR, Rocha J, Pena SD. The phylogeography of
Brazilian Y-chromosome lineages. Am. J. Hum. Genet., 68(1):281-6, 2001.
Chang EY, Dorsey PB, Johnson N, Lee R, Walts D, Johnson W, Anadiotis G,
Kiser K, Frankhouse J. A prospective analysis of microsatellite instability as
a molecular marker in colorectal cancer. The American Journal of Surgery,
191: 646-651, 2006.
Chen Z, Karaplis AC, Ackerman SL, Pogribny IP, Melnyk S, Lussier-Cacan S,
Chen MF, Pai A, John SW, Smith RS, Bottiglieri T, Bagley P, Selhub J,
Rudnicki MA, James SJ, Rozen R. Mice deficient in
methylenetetrahydrofolate reductase exhibit hyperhomocysteinemia and
decreased methylation capacity, with neuropathology and aortic lipid
deposition. Hum. Mol. Genet., 10(5): 433-43, 2001.
Cheng P, Schmutte C, Cofer KF, Felix JC, Yu MC, Dubeau L. Alterations in
DNA methylation are early, but not initial, events in ovarian tumorigenesis.
Br. J. Cancer, 75(3):396-402, 1997.
Chiuve SE, Giovannucci EL, Hankinson SE et al. Alcohol intake and
methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism modify the relation of
folate intake to plasma homocysteine. Am. J. Clin. Nutr., 82: 155-62, 2005.
Coombs NJ, Gough AC, Primrose JN. Optimisation of DNA and RNA extraction
from archival formalin-fixed tissue. Nucleic Acids Res., 15;27(16): e12, 1999.
Cottrell S, Bicknell D, Kaklamanis L, Bodmer WF. Molecular analysis of APC
mutations in familial adenomatous polyposis and sporadic colon carcinomas.
Lancet, 340(8820):626-30, 1992.
Couto FD, Adorno EV, Menezes JF, Neto JPM, Rêgo MAV, Reis MG,
Gonçalves MS. C677T polymorphism of the MTHFR gene and variant
hemoglobin: a study in newborns from Salvador, Bahia, Brazil. Cad. Saúde
Pública, 20(2):529-33, 2004.
Cravo M, Fidalgo P, Pereira AD, Gouveia-Oliveira A, Chaves P, Selhub J,
Mason JB, Mira FC, Leitao CN. DNA methylation as an intermediate
biomarker in colorectal cancer: modulation by folic acid supplementation.
Eur. J. Cancer Prev., 3(6): 473-9, 1994.
117
Cravo M. Alcohol, methylenetetrahydrofolate 677C->T genotype, and low folate
intake:concurrent causes for hyperhomocysteinemia. Am. J. Clin. Nutr.,
82(1):3-4, 2005.
Danaei G, Vander Hoorn S, Lopez AD, Murray CJ, Ezzati M. Causes of cancer
in the world: comparative risk assessment of nine behavioural and
environmental risk factors. Lancet, 366(9499):1784-93, 2005.
De Bustros A, Nelkin BD, Silverman A, Ehrlich G, Poiesz B, Baylin SB. The
short arm of chromosome 11 is a "hot spot" for hypermethylation in human
neoplasia. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A, 85(15):5693-7, 1988.
de la Vega MJ, Santolaria F, Gonzalez-Reimers E, Alemán MR, Milena A,
Martinez-Riera A, Gonzalez-Garcia C. High prevalence of
hiperhomocisteinemia in chronic alcoholism: the importance of the
thermolabile form of the enzyme methylenetetrahydrofolate reductase
(MTHFR). Alcohol, 25: 59-67, 2001.
Dumitrescu RG, Shields PG. The etiology of alcohol-induced breast cancer.
Alcohol, 35:213-25, 2005.
Dumitrescu RG, Cotarla I. Understanding breast cancer risk -- where do we
stand in 2005? J. Cell Mol. Med., 9(1):208-21, 2005.
Eaton AM, Sandler R, Carethers JM, Millikan RC, Galanko J, Keku TO. 5,10-
methylenetetrahydrofolate reductase 677 and 1298 polymorphisms, folate
intake, and microsatellite instability in colon cancer. Cancer Epidemiol.
Biomarkers Prev., (8):2023-9, 2005.
Efferth T, Volm M. Pharmacogenetics for individualized cancer chemotherapy.
Pharmacol. Ther., 107(2):155-76, 2005
Ehrlich M, Jiang G, Fiala E, Dome JS, Yu MC, Long TI, Youn B, Sohn OS,
Widschwendter M, Tomlinson GE, Chintagumpala M, Champagne M,
Parham D, Liang G, Malik K, Laird PW. Hypomethylation and
hypermethylation of DNA in Wilms tumors. Oncogene, 21(43):6694-702,
2002.
Ergul E, Sazci A, Canturk NZ. Polymorphisms in the MTHFR gene are
associated with breast cancer. Tum. Biol., 24: 286-90, 2003.
Esteller. M; Corn, PG, Baylin, SB; Herman, JG. A gene hypermethylation profile
of human cancer. Cancer Res., 61: 3225-3229, 2001.
Esteller M. Cancer epigenetics: DNA methylation and chromatin alterations in
human cancer. Adv .Exp. Med. Biol., 532:39-49, 2003.
Esteller M. Aberrant DNA methylation as a cancer-inducing mechanism. Annu.
Rev. Pharmacol. Toxicol.;45: 629-56, 2005.
118
Feinberg, A. P., Volgestein, B. Hipomethylation of ras oncogenes in primary
human cancers. Biochem. Biophys. Res. Commun.,111:47-54, 1983.
Feinberg AP. The epigenetics of cancer etiology. Semin. Cancer Biol.,
14(6):427-32, 2004.
Fenech M. Nutritional treatment of genome instability: a paradigm shift in
disease prevention and in the setting of recommended dietary allowances.
Nutr. Res. Reviews, 16:109-122, 2003.
Ford D, Easton DF, Bishop DT, Narod SA, Goldgar DE. Risks of cancer in
BRCA1-mutation carriers. Breast Cancer Linkage Consortium. Lancet,
343(8899):692-5, 1994.
Freitas RN, Brasileiro-Filho G, Silva ME, Pena SD. Bracken fern-induced
malignant tumors in rats: absence of mutations in p53, H-ras and K-ras and
no microsatellite instability. Mutat. Res., 499: 189-196, 2002.
Frosst P, Blom HJ, Milos R, Goyette P, Sheppard CA, Matthews RG, Boers GJ,
den Heijer M, Kluijtmans LA, van den Heuvel LP, et al. A candidate genetic
risk factor for vascular disease: a common mutation in
methylenetetrahydrofolate reductase. Nat. Genet., 10(1): 111-3, 1995.
Gaudet F, Hodgson JG, Eden A, Jackson-Grusby L, Dausman J, Gray JW,
Leonhardt H, Jaenisch R. Induction of tumors in mice by genomic
hypomethylation. Science, 300(5618):489-92, 2003.
Gerhard DS, Nguyen LT, Zhang ZY, Borecki IB, Coleman BI, Rader JS. A
relationship between methylenetetrahydrofolate reductase variants and the
development of invasive cervical cancer. Gynecol. Oncol., 90(3): 560-5,
2003.
Gershoni-Baruch R, Dagan E, Israeli D, Kasinetz L, Kadouri E, Friedman E.
Association of the C677T polymorphism in the MTHFR gene with breast
and/or ovarian cancer risk in Jewish women. Eur. J. Cancer, 6(18): 2313-6,
2000.
Giovannucci E. Alcohol, one –carbon metabolism, and colorectal cancer: recent
insights from molecular studies. J. Nutr., 134:2475S-81S, 2004.
Goelz, SE; Vogestein, B; Hamilton, SR, Feinberg, AP. Hypomethylation of DNA
from benign and malignant human colon neoplasms. Science, 228; 187-90,
1985.
Going, JJ; Gusterson, BA. Molecular Pathology and future developments. Eur.
J. Cancer, 35: 1895-1904, 1999.
Goodman MT, McDuffie K, Hernandez B, Wilkens LR, Bertram CC, Killeen J, Le
Marchand L, Selhub J, Murphy S, Donlon TA. Association of
methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism C677T and dietary
119
folate with the risk of cervical dysplasia. Cancer Epidemiol. Biomarkers
Prev., 10(12): 1275-80, 2001.
Guenther BD, Sheppard CA, Tran P, Rozen R, Matthews RG, Ludwig ML. The
tructure and properties of methylenetetrahydrofolate reductase from
Escherichia coli suggest how folate ameliorates human
hyperhomocysteinemia. Nat. Struct. Biol., 4:359-65, 1999.
Guo SW, EA Thompson. Performing the exact test of Hardy-Weinberg
proportions for multiple alleles. Biometrics, 48: 361-372, 1992.
Hak EA, Polderman KH, Westendorp ICD, Jackobs C, Hofman A, Witteman
JCM, Stehouwer CDA. Increased plasma homocysteine after menopause.
Atherosclerosis, 149: 163-68, 2000.
Heijmans BT, Boer JM, Suchiman HE, Cornelisse CJ, Westendorp RG,
Kromhout D, Feskens EJ, Slagboom PE. A common variant of the
methylenetetrahydrofolate reductase gene (1p36) is associated with an
ncreased risk of cancer. Cancer Res., 63(6):1249-53, 2003.
Henderson BE, Ross R, Bernstein L. Estrogens as a cause of human cancer:
the Richard and Hinda Rosenthal Foundation award lecture. Cancer Res.,
48: 246-53, 1988.
Herman JG, Baylin SB. Promoter-region hypermethylation and gene silencing in
human cancer. Curr. Top. Microbiol. Immunol., 249:35-54, 2000.
Herman JG, Baylin SB. Gene silencing in cancer in association with promoter
hypermethylation. N Engl J Med 349, 2042-2054, 2003.
Hulka BS, Moorman PG. Breast cancer: hormones and other risk factors.
Maturitas, 38(1):103-13, 2001.
Issa JP, Ottaviano YL, Celano P, Hamilton SR, Davidson NE, Baylin SB.
Methylation of the oestrogen receptor CpG island links ageing and neoplasia
in human colon. Nat. Genet., 4:536-40, 1994.
Jemal A, Tiwari RC, Murray T, Ghafoor A, Samuels A, Ward E, Feuer EJ, Thun
MJ, and American Cancer Society. Cancer statistics 2004. CA Cancer J.
Clin., 54: 8-29, 2004.
Jones PA, Laird PW. Cancer epigenetics comes of age. Nat. Genet., 2:163-7,
1999.
Kalemi TG, Lambropoulos AF, Gueorguiev M, Chrisafi, Papazisis KT, Kotsis A.
The association of p53 mutations and p53 codon 72, Her 2 codon 655 and
MTHFR C677T polymorphisms with breast cancer in Northern Greece.
Cancer Lett., 222: 57-65, 2005.
120
Kang S, Kim JW, Kang GH, Park NH, Song YS, Kang SB, Lee HP.
Polymorphism in folate- and methionine-metabolizing enzyme and aberrant
CpG island hypermethylation in uterine cervical cancer. Gynecol. Oncol.,
96(1): 173-80, 2005.
Kawakami K, Ruszkiewicz A, Bennett G, Moore J, Watanabe G, Iacopetta B.
The folate pool in colorectal cancers is associated with DNA
hypermethylation and with a polymorphism in methylenetetrahydrofolate
reductase. Clin. Cancer Res., 9(16 Pt 1): 5860-5, 2003.
Kim, YI. 5-10 methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms and
pharmacogenetics: a new role of single nucleotide polymorphisms in folate
metabolic pathway in human health and disease. Nutr. Rev., 63(11): 398-407,
2005.
Kimura M, Umegaki K, Higuchi M, Thomas P, Fenech M.
Methylenetetrahydrofolate reductase C677T polymorphism, folic acid and
riboflavin are important determinants of genome stability in cultured human
lymphocytes. J Nutr., 134(1):48-56, 2004.
Kluijtmans LA, den Heijer M, Reitsma PH, Heil SG, Blom HJ, Rosendaal FR.
Thermolabile methylenetetrahydrofolate reductase and factor V Leiden in
the risk of deep-vein thrombosis. Thromb. Haemost., 79(2):254-8, 1998.
Kono S, Chen K. Genetic polymorphisms of methylenetetrahydrofolate
reductase and colorectal cancer and adenoma. Cancer Sci., 96(9):535-42,
2005.
Lacroix M, Toillon RA, Leclercq. Stable “portrait” of breast tumors during
progression: data from biology, pathology and genetics. Endocrine-related
cancer, 11: 497-522, 2004.
Laird PW, Jackson-Grusby L, Fazeli A, Dickinson SL, Jung WE, Li E, Weinberg
RA, Jaenisch R. Suppression of intestinal neoplasia by DNA
hypomethylation. Cell, 81(2):197-205, 1995.
Lamprecht SA, Lipkin M. Chemoprevention of colon cancer by calcium, vitamin
D and folate: molecular mechanisms. Nature Rev. Cancer, 3: 601-14, 2003.
Langsenlehner U, Kripp P, Renner W, Yasdani-Biuki B, Wolf G, Wascher TC,
Paulweber B, Weitzer W, Samonigg H. The common 677C>T gene
polymorphism of ethylenetetrahydrofolate reductase gene is not associated
with brest cancer risk. Breast Cancer Res. Treat., 81: 169-72, 2003.
Lawes DA, SenGupta S, Boulos PB. The clinical importance and prognostic
implications of microsatellite instability in sporadic cancer. Eur. J. Surg.
Oncol., 3:201-12, 2003.
121
Le Marchand L, Wilkens LR, Kolonel LN, Henderson BE. The MTHFR C677T
polymorphism and colorectal cancer: the multiethnic cohort study. Cancer
Epidemiol. Biomarkers Prev., 14(5): 1198-203, 2005.
Lengauer, C., Kinzler, K.W. and Vogelstein, B. DNA methylation and genetic
instability in colorectal cancer cells. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 94:2545-
50, 1997.
Lin J, Spitz M, Wang Y, Schabath MB, Gorlov IP, Hernandez LM, Pillow P,
Grossman HB, Wu X. Polymorphisms of folate metabolic genes and
susceptibility to bladder cancer: a case-control study. Carcinogenesis, 25
(9): 1639-47, 2004.
Liu L, Wylie RC, Andrews LG, Tollefsbol TO. Aging, cancer and nutrition: the
DNA methylation connection. Mech. Ageing Dev., 124(10-12): 989-98, 2003.
Lynch HT, de la Chapelle A. Hereditary colorectal cancer. N. Engl. J. Med.,
348(10):919-32, 2003.
Ma J, Stampfer MJ, Giovannucci E, Artigas C, Hunter DJ, Fuchs C, Willett WC,
Selhub J, Hennekens CH, Rozen R. Methylenetetrahydrofolate reductase
polymorphism, dietary interactions, and risk of colorectal cancer. Cancer
Res., 57(6):1098-102, 1997.
Ma J, Stampfer MJ, Christensen B, Giovannucci E, Hunter DJ, Chen J, Willett
WC, Selhub J, Hennekens CH, Gravel R, Rozen R. A polymorphism of the
methionine synthase gene: association with plasma folate, vitamin B12,
homocyst(e)ine, and colorectal cancer risk. Cancer Epidemiol. Biomarkers
Prev., 8(9): 825-9, 1999.
Madsen JS, Kristensen SR, Klitgaard NA, Bladbjerg EM, Abrahamsen B,
Stilgren L, Jespersen J. Effect of long-term hormone replacement therapy on
plasma homocysteine in post menopausal women: A randomized controlled
study. Am. J. Obstet. Gynecol., 187(1): 33-39, 2002.
Mason JB, Choi SW. Effects of alcohol on folate metabolism: implications for
carcinogenesis. Alcohol, 35(3):235-41, 2005.
Miller SA, Dykes DD, Poleski HF. A simple salting out procedure for extracting
DNA from human cells. Nucleic Acids Res.,16: 1215, 1988.
O'Callaghan P, Meleady R, Fitzgerald T, Graham I. Smoking and plasma
homocysteine. Eur. Heart J., 23(20):1580-6, 2002.
Offit K. Are BRCA1- and BRCA2-associated breast cancers different? J. Clin.
Oncol.,18(21 Suppl):104S-6S, 2000.
Parra FC, Amado RC, Lambertucci JR, Rocha J, Antunes CM, Pena SD. Color
and genomic ancestry in Brazilians. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 100(1):
177-82, 2003.
122
Parrela P, Poeta ML, Gallo AP, Prencipe M, Scintu M, Apicella A, Rossiello R,
Liguoro G, Seripa D, Gravina C, Rabiti C, Rinaldi M, Nicol T, Tommasi S,
Paradiso A, Schitulli F, Altomare V, Fazio VM. Nonrandom distribution of
aberrant promoter methylation of cancer-related genes in sporadic breast
tumors. Clin. Cancer Res., 10:5349-54, 2004.
Paz MF, Avila S, Fraga MF, Pollan M, Capella G, Peinado MA, Sanchez-
Cespedes M, Herman J G, Esteller M. Germ-line variants in methyl group
metabolism genes and susceptibility to DNA methylation in normal tissues
and human primary tumors. Cancer Res., 62: 4519-24, 2002.
Plaschke J, Schwanebeck U, Pistorius S, Saeger HD, Schackert HK.
Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms and risk of sporadic
and hereditary colorectal cancer with or without microsatellite instability.
Cancer Lett., 191(2): 179-85, 2003.
Piyathilake CJ, Macaluso M, Hine RJ, Richards, EW, Krumdieck CL. Local and
systemic effects of cigarette smoking on folate and vitamin B12. Am. J. Clin.
Nutr., 60: 559-66, 1994.
Piyathilake CJ, Macaluso M, Johanning GL, Whiteside M, Heimburger DC,
Giuliano A. Methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) polymorphism
increases the risk of cervical intraepithelial neoplasia. Anticancer Res.,
20(3A): 1751-7, 2000.
Pogribny, I. P., Miller, B. J., and James, S. J. Alterations in hepatic p53 gene
methylation patterns during tumor progression with folate/methyl deficiency in
the rat. Cancer Lett., 115:31-8, 1997.
Poschl G, Seitz HK. Alcohol and cancer. Alcohol Alcohol., 39(3):155-65, 2004.
Pufulete M, Al-Ghnaniem R, Leather AJ, Appleby P, Gout S, Terry C, Emery
PW, Sanders TA. Folate status, genomic DNA hypomethylation, and risk of
colorectal adenoma and cancer: a case control study. Gastroenterology,
124(5): 1240-8, 2003.
Ribic CM, Sargent DJ, Moore MJ, Thibodeau SN, French AJ, Goldberg RM,
Hamilton SR, Laurent-Puig P, Gryfe R, Shepherd LE, Tu D, Redston M,
Gallinger S. Tumor microsatellite-instability status as a predictor of benefit
from fluorouracil-based adjuvant chemotherapy for colon cancer. N. Engl. J.
Med., 348:919-32, 2003.
Robertson KD, Wolffe AP. DNA methylation in health and disease. Nat. Rev.
Genet., 1(1): 11-9, 2000.
Robertson KD. DNA methylation, methyltransferases, and cancer. Oncogene,
20: 3139-55, 2001.
123
Robien K, Ulrich CM. 5,10-Methylenetetrahydrofolate reductase polymorphisms
and leukemia risk: a HuGE minireview. Am. J. Epidemiol., 157(7):571-82,
2003.
Robien K, Boynton A, Ulrich CM. Pharmacogenetics of folate-related drug
targets in cancer treatment. Pharmacogenomics. 2005 Oct;6(7):673-89.
Rosenberg N, Murata M, Ikeda Y, Opare-Sem O, Zivelin A, Geffen E, Seligsohn
U. The frequent 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase C677T
polymorphism is associated with a common haplotype in whites, Japanese,
and Africans. Am. J. Hum. Genet., 70(3): 758-62, 2002.
Rozen R, Shaw G. Decreased proportion of female newborn infants
homozygous for the 677 CT mutation in the methylenetetrahydrofolate
reductase. Am. J. Hum. Genet., 83: 142-43, 2002.
Santos FR, Pena SD, Epplen JT. Genetic and population study of a Y-linked
tetranucleotide repeat DNA polymorphism with a simple non-isotopic
technique. Human Genet., 90(6): 655-56, 1993.
Schmitt FC, Soares R, Gobbi H, Milanezzi F, Santos-Silva F, Cirnes L, Costa C,
Seruca R. Microsatellite instability in medullary breast carcinomas. Int. J.
Cancer, 82 (5): 644-47, 1999.
Shannon B, Gnanasampanthan S, Beilby J, Iacopetta B. A polymorphism in the
methylenetetrahydrofolate reductase gene predisposes to colorectal cancers
with microsatellite instability. Gut, 50(4): 520-4, 2002.
Schneider JA, Rees DC, Liu YT, Clegg JB. Worldwide distribution of a common
methylenetetrahydrofolate reductase mutation. Am. J. Hum. Genet.,
62(5):1258-60, 1998.
Semenza JC, Delfino RJ, Ziogas A, Anton-Culver H. Breast cancer risk and
methylenetetrahydrofolate reductase polymorphism. Breast Cancer Res.
Treat., 77(3): 217-23, 2003.
Sharp L, Little J. Polymorphisms in genes involved in folate metabolism and
colorectal neoplasia: a HuGE review. Am. J. Epidemiol.;159(5): 423-43,
2004.
Shen H, Xu Y, Zheng Y, Qian Y, Yu R, Qin Y, Wang X, Spitz MR, Wei Q.
Polymorphisms of 5,10-methylenetetrahydrofolate reductase and risk of
gastric cancer in a Chinese population: a case-control study. Int. J. Cancer.,
95(5): 332-6, 2001.
Shi Q, Wang LE, Bondy ML, Brewster A, Singletary SE, Wei Q. Reduced DNA
repair of benzo[a]pyrene diol epoxide-induced adducts and common XPD
124
polymorphisms in breast cancer patients. Carcinogenesis, 25(9):1695-700,
2004.
Shi Q, Zhang Z, Li G, Pillow P, Hernandez LM, Spitz M, Wei Q. Sex differences
in risk of lung cancer associated with methylenetetrahydrofolate reductase
polymorphims. Cancer Epidemiol. Biomarkers Prev., 14(6): 1477-84, 2005.
Shrubsole MJ, Shu XO, Ruan ZX, Cai Q, Cai H, Niu Q Gao YT, Zheng W.
MTHFR genotypes and breast cancer survival after surgery and
chemotherapy: a report from the Shanghai Breast Cancer Study. Breast
Cancer Res. Treat., 91: 73-79, 2005.
Singletary KW, Gapstur SM. Alcohol and breast cancer: review of epidemiologic
and experimental evidence and potential mechanisms. JAMA, 286(17):2143-
51, 2001.
Skibola CF, Smith MT, Kane E, Roman E, Rollinson S, Cartwright RA, Morgan
G. Polymorphisms in the methylenetetrahydrofolate reductase gene are
associated with susceptibility to acute leukemia in adults. Proc. Natl. Acad.
Sci. U S A., 96(22): 12810-5, 1999.
Somekawa Y, Kobayashi K, Tomura S, Aso T, Hamagushi H. Effects of
hormone replacement therapy and methylenetetrahydrofolate reductase
polymorphism on plasma folate and homocysteine levels in postmenopausal
Japonese women. Fertil Steril., 77:481-85, 2002.
Song C, Xing D, Tan W, Wei Q, Lin D. Methylenetetrahydrofolate reductase
polymorphisms increase risk of esophageal squamous cell carcinoma in a
Chinese population. Cancer Res., 61(8):3272-5, 2001.
Stern LL, Mason JB, Selhub J, Choi SW. Genomic DNA hypomethylation, a
characteristic of most cancers, is present in peripheral leukocytes of
individuals who are homozygous for the C677T polymorphism in the
methylenetetrahydrofolate reductase gene. Cancer Epidemiol. Biomarkers
Prev., 9(8):849-53, 2000.
Stewart SL, King JB, Thompson TD, Friedman C, Wingo PA. Cancer mortality
surveillance--United States, 1990-2000. MMWR Surveill. Summ., 53(3):1-
108, 2004.
Sugimura T, Ushijima T. Genetic and epigenetic alterations in carcinogenesis.
Mutat. Res., 462(2-3):235-46, 2000.
Szyf M, Pakneshan P, Rabbani SA. DNA demethylation and cancer: therapeutic
implications. Cancer Lett., 211(2): 133-43, 2004.
125
Tavassoli F.A., Devilee P (Eds.). World Health Organization Classification of
Tumors. Pathology and Genetics of Tumor of the Breast and Female Genital
Organs. IARC Press: Lyon, 2003.
Thibodeau SN, Bren G, Schaid D. Microsatellite instability in cancer of the
proximal colon. Science, 260: 816-9, 1993.
Thomas DC, Umar A, Kunkel TA. Microsatellite instability and mismatch repair
defects in cancer. Mutat. Res., 350(1):201-5, 1996.
Toffoli G, Veronesi A, Boiocchi M, Crivellari D. MTHFR gene polymorphism and
severe toxicity during adjuvant treatment of early breast cancer with
ciclofosphamide, methotrexate, and fluorouracil. Ann. Oncol., 11:373-75,
2000.
Toffoli G, Gafa R, Russo A, Lanza G, Dolcetti R, Sartor F, Libra M, Viel A,
Boiocchi M. Methylenetetrahydrofolate reductase 677 C-->T polymorphism
and risk of proximal colon cancer in north Italy. Clin. Cancer Res., 9(2): 743-
8, 2003.
van Rijnsoever M, Grieu F, Elsaleh H, Joseph D, Iacopetta B. Characterisation
of colorectal cancers showing hypermethylation at multiple CpG islands.
Gut, 51(6):797-802, 2002.
Verma M, Srivastava S. Epigenetics in cancer: implications for early detection
and prevention. Lancet Oncol., 3(12): 755-63, 2002.
Weinberg RA. The molecular basis of carcinogenesis: understanding the cell
cycle clock. Cytokines Mol. Ther., 2(2):105-10, 1996.
Weisberg I, Tran P, Christensen B, Sibani S, Rozen R. A second genetic
polymorphism in methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR) associated
with decreased enzyme activity. Mol. Genet. Metab., 64(3): 169-72, 1998.
Wilcken B, Bamforth F, Li Z, Zhu H, Ritvanen A, Renlund M, Stoll C, Alembik Y,
Dott B, Czeizel AE, Gelman-Kohan Z, Scarano G, Bianca S, Ettore G,
Tenconi R, Bellato S, Scala I, Mutchinick OM, Lopez MA, de Walle H,
Hofstra R, Joutchenko L, Kavteladze L, Bermejo E, Martinez-Frias ML,
Gallagher M, Erickson JD, Vollset SE, Mastroiacovo P, Andria G, Botto LD.
Geographical and ethnic variation of the 677C>T allele of 5,10
methylenetetrahydrofolate reductase (MTHFR): findings from over 7000
newborns from 16 areas world wide. J. Med. Genet., 40(8):619-25, 2003.
World Health Organization. Global Status Report on alcohol 2004. Geneva:
Department of Mental Health and Substance Abuse, 2004.
Yamada K, Chen Z, Rozen R, Matthews RG. Effects of common polymorphisms
on the properties of recombinant human methylenetetrahydrofolate
reductase. Proc. Natl. Acad. Sci. U S A., 98(26): 14853-8, 2001.
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