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AVALIAÇÃO DO PERFIL DE METILAÇÃO DA
REGIÃO PROMOTORA DE GENES EM
OSTEOSSARCOMA
VIVIANE SONAGLIO
Dissertação apresentada à Fundação Antônio
Prudente para obtenção do título de Mestre em
Ciências
Área de Concentração: Oncologia
Orientador: Dr. André Luiz Vettore de Oliveira
Co-Orientador: Profa. Dra. Beatriz de Camargo
São Paulo
2008
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FICHA CATALOGRÁFICA
Preparada pela Biblioteca da Fundação Antônio Prudente
Sonaglio, Viviane
Avaliação do perfil de metilação da região promotora de genes
em osteossarcoma / Viviane Sonaglio – São Paulo, 2008.
79p.
Dissertação (Mestrado)-Fundação Antônio Prudente.
Curso de Pós-Graduação em Ciências - Área de concentração:
Oncologia.
Orientador: André Luiz Vettore de Oliveira
Descritores: 1. OSTEOSSARCOMA. 2. NEOPLASIAS ÓSSEAS.
3. METILAÇÃO. 4. GENES. 5. SOBREVIDA. 6. CRIANÇA. 7.
ADOLESCENTE.
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DEDICATÓRIA
Dedico esta dissertação a todos os pacientes
que, através de coragem e dedicação, me
ensinam o verdadeiro sentido da palavra vida.
AGRADECIMENTOS ESPECIAIS
Agradeço aos meus amados pais, Adair e Maria Inez, por todo amor,
incentivo e dedicação em todos os momentos da minha vida. Agradeço por
todos os esforços e abdicações realizados em suas vidas para permitirem
que eu realizasse os meus sonhos.
Agradeço meu querido companheiro, Júnior, pelo amor, estímulo e
compreensão nas fases difíceis e por acreditar em mim em todos os
momentos.
Agradeço minha irmã Carol, meu cunhado César e meu sobrinho Pepe por
facilitarem muito a minha vida em momentos difíceis.
Agradeço meus sogros, Nilton e Maria Esperança pelo apoio e estimulo.
Agradeço ao verdadeiro sentido da minha vida - minha ‘’ filhinha’’ Ana Lú.
AGRADECIMENTOS
Ao meu orientador Dr. André Vettore, por todos os ensinamentos e pela
orientação neste trabalho. Agradeço pelas vezes que colocou seu avental e
foi para a bancada me ajudar a ‘’pulverizar osso’’. Agradeço pela paciência e
pela compreensão, pois diante de tantas surpresas durante a realização
deste trabalho, sempre acreditou que iríamos terminar e que tudo daria
certo.
A minha co-orientadora Profª Dra. Beatriz de Camargo, que sempre foi um
exemplo profissional de competência e sucesso. Agradeço pela contribuição
e pelos ensinamentos na minha vida profissional como oncologista pediátrica
e por ter me incentivado a entrar no mundo da biologia molecular e assim
concluir este trabalho.
A Dra. Silvia Toledo, pesquisadora do IOP, pela imprescindível colaboração
neste trabalho, tanto pelas amostras compartilhadas, como por sempre
mostrar-se prestativa para discutirmos qualquer dúvida relacionada ao nosso
trabalho. Não posso deixar de agradecer os ensinamentos na área da
genética básica há 12 anos atrás.
Ao Dr. André Lopes Carvalho por ter disponibilizado parte de seu tempo
para discutirmos os resultados e pela análise estatística deste trabalho.
A Dra. Cecília Maria Lima da Costa, minha amiga e chefe do departamento
de Oncologia Pediátrica do Hospital AC Camargo, pela a amizade e por
todas as oportunidades que tem me oferecido e por sempre acreditar em
mim. Agradeço muito pelo apoio e estimulo para a conclusão deste trabalho.
A Andréa Kurashima pela grande ajuda no entendimento do programa
estatístico SPSS e pelo apoio indispensável na conclusão deste trabalho.
Aos meus queridos amigos do Departamento de Pediatria Roberta,
Gustavo e Luiz Fernando Lopes, pela compreensão, estimulo e por terem
permitido que eu me ausentasse para que eu concluísse este trabalho
As pessoas que conheci no laboratório e que hoje eu considero grandes
amigas Val, Clau e Roberta. Principalmente por terem tornado estes
momentos vividos no laboratório muito prazerosos e pela amizade que
levarei para sempre.
Ao grande amigo e parceiro de profissão Luis Henrique Sakamoto pelo
exemplo de amigo e profissional que sempre foi para mim, por tudo que me
ensinou e pela parceria na residência medica e no laboratório.
A Carolzinha, minha grande amiga, pelo exemplo de persistência e
brilhantismo em tudo que se dispõe a fazer, pela imprescindível ajuda na
biologia molecular e em toda realização deste trabalho. Agradeço pela
amizade que com certeza levaremos para sempre.
Ao Departamento de Anatomia-Patologica, em nome de Dr. Fernando
Soares e Dra. Isabela Werneck por terem fornecido as amostras de tecido
tumoral para a realização deste trabalho.
Ao Serviço de Arquivo Medico e Estatístico (SAME), principalmente a Sra.
Irde Contesini e principalmente ao Luis pela ajuda na coleta dos dados no
prontuário e por sempre entender minha falta de tempo.
As queridas amigas da Biblioteca, Sra. Suely pela competência e
profissionalismo na revisão das referencias bibliográficas e formatação deste
trabalho, Fran e Rose pela importante e sempre disponível ajuda pela busca
aos inúmeros artigos e pelo carinho durante todo este tempo.
Ao Dr. Jose Andrés Yunes e Dra. Maria Tereza, por disponibilizar seus
preciosos tempos à leitura dos relatórios e pelas indispensáveis sugestões,
durante a qualificação deste trabalho.
A Pós-Graduação da Fundação Antonio Prudente, principalmente ao Dr. Luis
Fernando Lima Reis, a Ana Maria Kuninari e a Luciana Pitombeira pela
ajuda e compreensão desde o inicio deste trabalho e principalmente pela
compreensão nas inúmeras surpresas durante a realização e finalização
desta tese.
A minha banca julgadora pela avaliação desta dissertação.
A todas as dificuldades enfrentadas, por terem me estimulado cada vez mais
a desejar concluir este trabalho.
A Deus por tudo que tem me proporcionado, tanto na vida profissional como
na vida pessoal e principalmente pela maior e melhor ‘’surpresa’’ durante a
realização deste estudo – Ana Luiza.
RESUMO
Sonaglio V. Avaliação do perfil de metilação da região promotora de
genes em osteossarcoma. São Paulo; 2008. [Dissertação de Mestrado-
Fundação Antônio Prudente].
O osteossarcoma é o mais comum tumor ósseo maligno da infância e
adolescência, correspondendo a aproximadamente 5% dos tumores nesta
faixa etária. Acomete principalmente a metáfise dos ossos longos. O pico de
incidência é a segunda década de vida. Aproximadamente 20% dos
pacientes apresentam metástase ao diagnóstico, sendo o pulmão o sítio
mais freqüente, seguido por metástases ósseas. Vários fatores prognósticos
tem sido propostos como ressecabilidade do tumor primário, presença de
metástases e grau de necrose induzido pelo tratamento pré-operatório.
Apesar de todos os avanços obtidos com os métodos diagnósticos, no
campo da quimioterapia e das técnicas cirúrgicas a sobrevida global em 5
anos do ostessarcoma para pacientes não metastaticos permanece em torno
de 70% e para pacientes metastáticos a sobrevida é aproximadamente 20-
30%. Desta forma, os estudos hoje tem se voltado para um maior
entendimento sobre a biologia do osteossarcoma. A metilação é um
mecanismo epigenético e está implicado no silenciamento de diversos genes
supressores de tumor. O objetivo deste estudo foi determinar o perfil de
hipermetilação da região promotora de 18 genes supressores de tumor
(AIM1, APC, CALCA, CCNA1, CDH1, CDKN2A, DAPK, ESR1, GSTP1,
HIC1, MLH1, p14
ARF
, RARβ, RASSF1A, RB1, SOCS1, THBS1 e SFRP1) em
amostras de osteossarcoma sem tratamento quimioterápico prévio, atraves
da técnica PCR quantitativa específica para metilação (QMSP) e verificar se
existia alguma correlação entre os dados moleculares gerados e aspectos
clinico-patológicos dos pacientes.
Sete genes apresentaram-sehipermetilados em pelo menos 30% das
amostras analisadas: AIM1, CALCA, CDH1, ESR1, HIC1, p14
ARF
e SFRP. A
análise dos genes AIM1, CALCA, HIC1 e SFRP não apresentaram correlação
entre a presença de metilação e variáveis clínicas analisadas. Entretanto, a
hipermetilação do gene CDH1 apresentou uma associação significativa com
a idade ao diagnóstico maior que 12 anos (p= 0,03). A hipermetilação da
região promotora do gene p14
ARF
apresentou associação estatisticamente
significativa com ausência de metástases ao diagnóstico (p=0,04). A
hipermetilação do gene ESR1 associou-se com uma pior sobrevida global
dos pacientes analisados (p=0,058).
SUMMARY
Sonaglio V. [Gene promoter hypermethylation pattern in osteosarcoma]
São Paulo; 2008. [Dissertação de Mestrado-Fundação Antônio Prudente].
Osteosarcoma is the most common type of malignant bone cancer in childhood
and adolescence, representing approximately 5% of tumors in this age group. It
affects mainly the metaphysis of long bones. The incidence peak is in the
second decade of life. Approximately 20% of patients have metastatic disease at
diagnosis, being the lung the most frequent site, followed by bone metastases.
Several prognostic factors have been proposed as primary tumor, presence of
metastases and degree of necrosis by the pre-operative treatment. Despite all
the advances obtained in the diagnostic methods, chemotherapy and surgical
methods field, the 5 years overall survival for non metastatic patients remains
around 70% and for metastatic patients the survival is approximately 20-30%.
Thus, the studies nowadays have turned to a greater understanding of the
biology of osteosarcoma. Methylation is an epigenetic mechanism and is
involved in silencing of several tumor suppressor genes. The objective of this
study aimed to determine the promoter region hypermethylation profile of 18
tumor suppressor genes (AIM1, APC, CALCA, CCNA1, CDH1, CDKN2A, DAPK,
ESR1, GSTP1, HIC1, MLH1, p14
ARF
, RARβ, RASSF1A, RB1, SOCS1, THBS1 e
SFRP1) in osteosarcoma samples without previous chemotherapy treatment,
through the quantitative methylation-specific PCR technique (QMSP). Seven
genes showed hypermethylation in at least 30% of the samples analysed: AIM1,
CALCA, CDH1, ESR1, HIC1, p14
ARF
and SFRP. The analysis of AIM1, CALCA,
HIC1 and SFRP showed no correlation between the presence of methylation
and clinical variables analysed. However, hypermethylation of CDH1 showed a
significant association with age at diagnosis higher than 12 years old (p= 0,03).
Hypermethylation of p14
ARF
promoter region showed statistically significant
association with the diagnosis of metastases (p=0,04). ESR1 hypermethylation
was associated with a worse overall survival in the patients tested (p=0,058).
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Sítios anatômicos mais freqüentes (percentuais
aproximados) de osteossarcoma.
2
Figura 2 Exames de imagem de um paciente com osteossarcoma. 8
Figura 3 Metilação da citosina. 16
Figura 4 Propagação do modelo de metilação. DNMT3A/B catalisam
reação de metilação em sítios não metilados previamente.
16
Figura 5 Estrutura da cromatina ativa e inativa. 19
Figura 6 Distribuição dos dinucleotideos CpG no genoma humano e
diferenças do perfil de metilação entre células normais e
neoplásicas.
21
Figura 7 Sobrevida Global em 5 anos do grupo de 34 pacientes
incluídos no estudo.
41
Figura 8 Sobrevida Global em 5 anos em relação à presença de
metástase ao diagnostico.
41
Figura 9 Sobrevida global em 5 anos em relação à recidiva tumoral
após o tratamento quimioterápico de primeira linha.
42
Figura 10 Sobrevida global em 5 anos em relação ao grau de Necrose
– (Huvos).
42
Figura 11 Sobrevida global em 5 anos em relação ao sitio primário. 43
Figura 12 Sobrevida global em 5 anos em relação ao tipo histológico. 43
Figura 13 Sobrevida global em 5 anos em relação ao sexo. 44
Figura 14 Sobrevida global em 5 anos em relação a idade. 44
Figura 15 Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio com
fragmentos de 283pb amplificados do gene BRCA1.
45
Figura 16 Sobrevida global – Gene CDH1: metilado x não-metilado. 56
Figura 17 Sobrevida global – Gene CALCA: metilado x não-metilado. 56
Figura 18 Sobrevida global – Gene SFRP1: metilado x não-metilado. 57
Figura 19 Sobrevida global – Gene HIC1: metilado x não-metilado. 57
Figura 20 Sobrevida global – Gene p14: metilado x não-metilado. 57
Figura 21 Sobrevida global – Gene AIM1: metilado x não-metilado. 58
Figura 22 Sobrevida global – Gene ESR1: metilado x não-metilado. 58
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 Seqüência dos primers direto e reverso para amplificação do
fragmento de 283pb do gene BRCA1 – exon 11.
28
Tabela 2 Características clínicas e histológicas dos pacientes
incluídos no estudo.
40
Tabela 3
A
nálise comparativa entre a população total de 60 casos de
osteossarcoma e a população selecionada de 34 casos
48
Tabela 4 Análise comparativa entre a população total de 34 casos de
osteossarcoma incluída no estudo e a população de 26
casos excl uídos por inviabilidade das amostras.
50
Tabela 5 Freqüência de hipermetilação dos 18 genes avaliados nas
13 amostras de osteossarcoma incluídas no estudo piloto.
52
Tabela 6 Freqüência de hipermetilação dos 7 genes avaliados nas 34
amostras de osteossarcoma.
53
Tabela 7 Associação entre hipermetilação do gene CDH1 e variáveis
clínico-patológicas
54
Tabela 8 Associação entre hipermetilação do gene CALCA e variáveis
clínico-patológicas.
55
Tabela 9 Associação entre hipermetilação do gene SFRP1 e variáveis
clínico-patológicas.
55
Tabela 10 Associação entre hipermetilação do gene HIC1 e variáveis
clínico-patológicas.
56
Tabela11 Associação entre hipermetilação do gene p14 e variáveis
clínico-patológicas.
56
Tabela 12 Associação entre hipermetilação do gene AIM1 e variáveis
clínico-patologicas.
57
Tabela 13 Associação entre hipermetilação do gene ESR1 e variáveis
clínico-patológicas.
57
LISTA DE ABREVIAÇÕES
ACTB Homo sapiens actin, beta
AIM1 Homo sapiens absent in melanoma 1
APC Homo sapiens adenomatosis polyposis coli
CALCA Homo sapiens calcitonin/calcitonin-related polypeptide
CCNA1 Homo sapiens cyclin A1
CCND2 Homo sapiens cyclin D2
CDH1 Homo sapiens cadherin 1, type 1, E-cadherin (epithelial)
CDKN2A Homo sapiens cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (variante de
splicing)
Ct Cycle Threshold
DAPK Homo sapiens death-associated protein kinase 1
DNA Desoxyribonucleic Acid
ESR1 Homo sapiens estrogen receptor 1
GSTP1 Homo sapiens glutathione S-transferase pi
HIC1 Homo sapiens hypermethylated in cancer 1
M Molar
mm Milímetro
Mm Milimolar
mm
3-
Milímetros cúbicos
MBP Methyl CpG binding protein
MeCP Methyl-core binding protein
MgCl
2-
Cloreto de Magnésio
MLH1 Homo sapiens mutL homolog 1, colon cancer, nonpolyposis
type 2
p14
ARF
Homo sapiens cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (variante de
splicing)
P16 Homo sapiens cyclin-dependent kinase inhibitor 2A (variante de
splicing)
PCR Polymerase Chain Reaction
RARB Homo sapiens retinoic acid receptor, beta
RASSF1A Homo sapiens Ras association (RalGDS/AF-6) domain family 1
RB1 Homo sapiens retinoblastoma 1
SFRP1 Homo sapiens secreted frizzled-related protein 1
SOCS1 Homo sapiens suppressor of cytokine signaling 1
THBS1 Homo sapiens thrombospondin 1
μg Micrograma
μL Microlitro
μM Micromolar
ÍNDICE
1 INTRODUÇÃO 1
1.1 Osteossarcoma 1
1.2 Genética e Osteossarcoma 12
1.3 Metilação de Dna 15
1.4 Metilação do Dna e Câncer 19
1.5 Metilação e Osteossarcoma 21
2 OBJETIVOS 25
2.1 Objetivos Gerais 25
2.2 Objetivos Específicos 25
3 MATERIAIS E MÉTODOS 26
3.1 Casuística 26
3.2 Extração de DNA 27
3.3 Tratamento com Bissulfito de Sódio 29
3.4 PCR quantitativa específica para metilação (QMSP) 30
3.5 Metilação in Vitro de DNA de Linfócitos 35
3.6 Escolha dos Genes 35
3.7 Análise Estatística 37
4 RESULTADOS 38
4.1 Caracterização da Casuística 38
4.2 Extração, Quantificação e Avaliação das Amostras de DNA 45
4.3 Analises de Hipermetilação em Osteossarcoma 49
4.3.1 Estudo Piloto 49
4.3.2 Análise Total 53
4.4 Correlação entre Hipermetilaçao e Características Clínico-Patológicas 53
5 DISCUSSÃO 61
6 CONCLUSÕES 72
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS 73
ANEXO
Anexo 1 Quadro de nível de metilação das 34 amostras.
1
1 INTRODUÇÃO
1.1 OSTEOSSARCOMA
Osteossarcoma ou sarcoma osteogênico é o tumor primário ósseo
derivado do mesênquima ósseo primitivo e caracteriza-se histologicamente
pela produção de matriz osteóide ou osso imaturo pelas células ósseas
mesenquimais malignas (DORFMAN e CZERNIAK 1995). O termo
osteossarcoma foi usado pela primeira vez em 1805 pelo cirurgião francês
Alexis Boyer (1757-1833) (HAM et al. 1998).
Em geral, tumores ósseos são raros, correspondem a 6% de todos os
cânceres na faixa etária pediátrica, destes o osteossarcoma é o mais
freqüente, seguido pelo Sarcoma de Ewing (GURNEY et al. 1999).
Segundo dados do programa de registro populacional de câncer dos
Estados Unidos, (SEER – Surveillance Epidemiology and End Results) a
incidência do osteossarcoma é de 400 casos novos / ano (8,7 casos / milhão
de pacientes abaixo dos 20 anos) (GURNEY et al. 1999).
O osteossarcoma apresenta distribuição etária bimodal, com um
primeiro pico de incidência na segunda década de vida, durante o estirão de
crescimento e um segundo pico em indivíduos idosos. Em crianças abaixo
de 5 anos correspondem a 0,5% de todas as neoplasias, comparado com
5% para crianças entre 5 e 9 anos, 11% para aquelas entre 10 e 14 anos e
8% para aquelas entre 15 e 19 anos (GURNEY et al. 1999). Estudos
2
demonstram uma incidência maior deste tumor em meninos do que em
meninas e indivíduos da raça negra apresentam uma freqüência maior de
acometimento do que indivíduos caucasianos (LINK et al. 2006).
Embora o osteossarcoma possa ocorrer em qualquer osso, é mais
comum o acometimento na região metafisária dos ossos longos. O sitio
primário mais comum é a região da articulação do joelho, sendo que 60%
dos casos originam-se nesta região anatômica. O fêmur distal (42%) e a tíbia
proximal (19%) são as áreas mais freqüentemente acometidas, seguidas por
úmero proximal (10%) e fêmur proximal (4%) (LINK et al. 2006). O esqueleto
axial pode também ser acometido (< 10% dos casos no grupo pediátrico)
ocorrendo mais comumente na pélvis. A mandíbula está acometida em
menos de 7% dos casos de osteossarcoma (Figura1) (MARINA et al. 2004).
4%
10%
7%
10%
60%
Legenda: articulação do joelho (60%), úmero proximal (10%), fêmur proximal (4%), pélvis
(10%) e mandíbula (7%).
Figura 1 - Sítios anatômicos mais freqüentes (percentuais aproximados) de
osteossarcoma.
3
A etiologia do osteossarcoma permanece obscura. O pico de
incidência do osteossarcoma coincide com a puberdade, um período de
rápido crescimento ósseo, sugerindo uma correlação entre o estirão de
crescimento observado nesta fase e a evolução do osteossarcoma
(GELBERG et al. 1997). HAM et al. (1998) sugerem que o desenvolvimento
do osteossarcoma esteja relacionado com o aumento dos níveis do
hormônio de crescimento e IGF-1, ambos encontram-se aumentados
durante a fase do estirão de crescimento. Segundo este autor, o rápido
crescimento ósseo observado nesta fase torna os precursores osteogênicos
susceptíveis a fatores oncogênicos, favorecendo erros mitóticos, rearranjos
cromossômicos e transformação neoplásica.
De acordo com esta teoria, a maior incidência deste tumor em
meninos pode ser explicada pelo maior crescimento ósseo observado neste
sexo. O pico de incidência de osteossarcoma mais precoce observado em
meninas (12,5 anos) quando comparado aos meninos (15 anos) também
suporta esta teoria, pois as meninas apresentam o desenvolvimento e
maturação do esqueleto mais precoce que os meninos (GELBERG et al.
1997). Porém, este fato ainda é controverso na literatura.
Alguns agentes químicos estão relacionados com o desenvolvimento
do osteossarcoma. Alguns estudos realizados com animais sugerem que
óxido de berílio atua como um fator iniciador do processo neoplásico
(HOAGLAND et al. 1950). Em seres humanos os compostos químicos que
se relacionam com um maior risco para o desenvolvimento de
osteossarcoma são alguns agentes quimioterápicos, como ciclofosfamida,
4
ifosfamida, cisplatina, carboplatina e dacarbazida, entre outros. Este efeito
dos agentes antineoplásicos ocorre independente do efeito sinérgico da
radioterapia e do tipo tumoral prévio (FERRIS et al. 2005).
A radiação ionizante é um dos fatores de risco mais bem estudados
para osteossarcoma. A radiação ionizante esta relacionada com 3% dos
casos. O risco para o desenvolvimento de um sarcoma ósseo esta
diretamente relacionada com a dose total de radiação administrada ao
paciente. O período de latência entre a radiação e o desenvolvimento do
tumor varia de 4 a 40 anos (FERRIS et al. 2005).
Algumas síndromes genéticas apresentam uma maior incidência para
o desenvolvimento de osteossarcoma.
Aparentemente, existe um mecanismo comum na tumorigênese de
retinoblastoma e osteossarcoma, o qual envolve uma mutação do gene RB1
(FRIEND et al. 1987; SANDBERG et al. 2003). Pacientes com diagnóstico
de retinoblastoma hereditário apresentam mutação do gene supressor de
tumor RB1 localizado no braço longo do cromossomo 13q14.3 das células
germinais o que implica em um maior risco para o desenvolvimento de
segundos tumores, sendo que o osteossarcoma representa mais de 50%
deste grupo. Pacientes que recebem radioterapia externa em órbita para o
tratamento de retinoblastoma apresentam um risco 2000 vezes maior de
evoluírem com osteossarcoma na área irradiada do que o esperado na
população geral, assim como um risco de 500 vezes maior de evoluírem
com osteossarcoma em extremidades (áreas não irradiadas) (FERRIS et al.
2005).
5
Outra síndrome genética associada com maior freqüência de
desenvolvimento de osteossarcoma é a síndrome de Li-Fraumeni,
caracterizada pela elevada freqüência de tumores em idade precoce, dentre
estes o osteossarcoma. O gene implicado no desenvolvimento desta
síndrome é o gene TP53 um gene supressor tumoral localizado no braço
curto do cromossomo 17p13.1. Estudos de screening envolvendo crianças
com osteossarcoma revelam que 3-4% apresentam mutação germinativa no
gene TP53 (TOGUSHIDA et al. 1992; MCINTYRE et al. 1994). Diversas
alterações no gene TP53 foram observadas em amostras de osteossarcoma,
tais como, mutações pontuais, rearranjos cromossômicos e perdas alélicas
(TOGUSHIDA et al. 1992).
Outras síndromes genéticas associadas são síndrome de Rothmund-
Thomson e Síndrome de Bloom. Estas síndromes caracterizam-se pela falha
dos mecanismos de reparo de DNA, com maior predisposição para
desenvolvimento de neoplasias (FERRIS et al. 2005).
Patologias pré-existentes também apresentam um risco maior para o
desenvolvimento destes tumores ósseos. Doença de Paget ou osteíte
deformante predispõem ao desenvolvimento de osteossarcoma em
indivíduos idosos, sendo que aproximadamente 1-2% dos pacientes
desenvolverão osteossarcoma. Outras patologias como displasia fibrosa,
exostoses múltiplas, osteomielite crônica e cistos ósseos aneurismáticos
apresentam um risco maior para o desenvolvimento de osteossarcomas
(FUCHS et al. 2001).
6
Apesar de inúmeros estudos tentarem explicar a etiologia do
osteossarcoma, como em todas as neoplasias, as evidências científicas
sugerem que ocorra uma interação entre vários fatores endógenos e
exógenos, porém muitos destes fatores e suas interações ainda são
desconhecidos.
Os achados clínicos do osteossarcoma são inespecíficos e dependem
da localização do tumor. A dor é o sintoma mais comum. Geralmente o
paciente refere dor intensa com duração de semanas a meses. Pode-se
encontrar associado ao sintoma álgico, sinais flogísticos como edema,
aumento da temperatura e hiperemia, com importante aumento da
vascularização local. O paciente pode apresentar limitação funcional da
articulação acometida ou dificuldade de deambulação. Sintomas
constitucionais, como perda ponderal e febre são menos comuns, sendo
encontrados mais comumente em pacientes com doença disseminada
(DORFMAN e CZERNIAK 1995).
Aproximadamente 15-20% dos pacientes apresentam metástases ao
diagnóstico (MEYERS et al. 1997). A maioria das lesões metastáticas é
encontrada em pulmão, correspondendo a 90% dos casos.
Aproximadamente 10% dos pacientes apresentam metástases ósseas, com
ou sem metástases pulmonares concomitantes.
Os exames laboratoriais também são inespecíficos. Aumento dos
níveis séricos de fosfatase alcalina e desidrogenase láctica é encontrado em
40% e 30% dos pacientes com diagnóstico de osteossarcoma,
7
respectivamente. Entretanto, não há um consenso na literatura sobre a
correlação destes marcadores com extensão da doença (LINK et al. 2006).
Os exames de imagem são extremamente úteis na avaliação dos pacientes
com suspeita de tumores ósseos. O raio-X simples revela a localização e o
padrão destrutivo do trabeculado ósseo normal, com acometimento do
espaço medular e do córtex e, muito freqüentemente com invasão de tecidos
adjacentes e conseqüente calcificação (DORFMAN e CZERNIAK 1995).
Radiograficamente, o osteossarcoma pode apresentar-se como imagem
esclerótica em 45% dos casos, lítica em 30% ou misto (esclerótico-lítico) em
25% dos casos. O crescimento do tumor pode levar a uma intensa reação
periosteal com levantamento do periósteo e remodelamento do córtex,
imagem conhecida como triângulo de Codman (LINK et al. 2006) (Figura 2).
Os sinais radiológicos são sugestivos, porem não patognomônicos de
osteossarcoma. Outros exames radiológicos de extrema importância para
avaliação inicial e planejamento cirúrgico são a tomografia computadorizada
e a ressonância nuclear magnética. A tomografia computadorizada é
utilizada para avaliação da extensão local do tumor e avaliação de
metástases pulmonares. A ressonância nuclear magnética tem superado a
tomografia computadorizada na avaliação da extensão intraóssea tumoral e
sua relação com estruturas vizinhas, como músculos, gordura, articulações e
feixe vásculo-nervoso, determinantes para o planejamento cirúrgico. A
cintilografia óssea com tecnésio- 99 também é utilizada na avaliação inicial
do tumor para avaliar a extensão intraóssea do tumor primário e presença de
“skip-metastase” e/ou metástases ósseas a distância (MARINA et al. 2004).
8
Legenda: A – Raio X mostrando osteossarcoma de fêmur distal evidenciando o Triângulo
de Codman (seta amarela). B – Ressonância Nuclear Magnética de um osteossarcoma de
fêmur distal (visão sagital) mostrando comprometimento da medula óssea com destruição
da cortical e invasão de tecidos adjacentes
Fonte: TAN et al. (2006)
Figura 2 - Exames de imagem de um paciente com osteosarcoma.
A história clínica e as avaliações laboratoriais e radiológicas são de
extrema importância para o diagnóstico de osteossarcoma, porém a biópsia
para a confirmação patológica é mandatória (MARINA et al. 2004).
De acordo com a Organização Mundial de Saúde (OMS) o
osteossarcoma pode ser classificado em osteossarcoma convencional
(osteoblástico, condroblástico e fibroblástico), telangiectásico, parosteal,
periosteal, pequenas células e multifocal (RAYMOND et al. 2002). Esta
classificação é baseada no tipo de matriz predominante encontrada no tumor
(TAN et al. 2006). O osteossarcoma convencional é o mais freqüente na
faixa etária pediátrica. Destes, 50% são osteoblásticos, 25% condroblásticos
e 25% fibroblásticos. Estes tumores são caracterizados por apresentarem
9
alto grau de malignidade. Alguns estudos que avaliam os fatores
prognósticos em osteossarcoma não referem o subtipo histológico como um
fator estatisticamente significante (FORD et al. 2004; TAN et al. 2006).
Outros estudos sugerem que o subtipo condroblástico apresenta-se menos
responsivo a quimioterapia (LINK et al. 2006).
Embora não haja um consenso, algumas características clínicas dos
pacientes com diagnóstico de osteossarcoma são sugeridas como fatores
prognósticos. Segundo BACCI et al. (2006), pacientes com idade abaixo de
14 anos ao diagnóstico apresentam um pior prognóstico. Entretanto, no
estudo de PETRILLI et al. (2006) a idade não foi identificada como fator
prognóstico significativo. Tumores localizados em extremidades quando
comparados com tumores localizados em esqueleto axial apresentam um
melhor prognóstico (BIELACK et al. 2002). Em relação ao tamanho tumoral
os estudos apresentam resultados discrepantes. BIELING et al. (1996)
mostraram através de uma análise multivariada que tumores maiores de
150cm
3
apresentaram pior sobrevida, enquanto que PETRILLI et al. (2006)
mostraram que tumores maiores que 12cm apresentavam pior prognóstico.
A presença de metástases ao diagnóstico e o grau de necrose
induzido pela quimioterapia pré-operatória são os fatores prognósticos mais
significativos. Pacientes que apresentam metástases ao diagnóstico
apresentam sobrevida muito inferior quando comparados com pacientes não
metástaticos ao diagnóstico (LINK et al. 2006). Pacientes que apresentam
mais que 90% de necrose após a quimioterapia pré-operatória (HUVOS III –
10
IV) apresentam sobrevida significantemente melhor do que pacientes com
grau de necrose menor que 90% (HUVOS I – II) (CLARK et al. 2007).
O tratamento dos pacientes com osteossarcoma passou por muitas
transformações nas últimas décadas. Hoje baseia-se em quimioterapia
neoadjuvante, ressecção cirúrgica e quimioterapia adjuvante.
Até a década de 70 o tratamento do osteossarcoma baseava-se na
ressecção cirúrgica do tumor primário e ou radioterapia. A sobrevida global
em dois anos era de 15 – 20%. Oitenta a 90% dos pacientes apresentavam
recaída local ou pulmonar, fazendo entender que estes pacientes já
apresentavam micrometástases ao diagnóstico (MARINA et al. 2004). No
início da década de 70 alguns estudos mostraram uma maior sobrevida
global em 2 anos para aqueles pacientes que recebiam quimioterapia
adjuvante (50%) quando comparados com pacientes submetidos apenas ao
controle cirúrgico (15-20%) (HAM et al. 1998). No fim da década de 70 e
início da década de 80, ROSEN et al. (1976) introduziram o conceito de
quimioterapia neoadjuvante ou pré-operatória. A quimioterapia sistêmica pré-
operatória propiciou um aumento do número de cirurgias conservadoras,
facilitando a técnica cirúrgica e também a avaliação do grau de resposta à
quimioterapia, avaliando assim a sua eficácia. Observou-se uma forte
correlação entre o grau de necrose (HUVOS) e a sobrevida livre de recaída.
Pacientes que apresentavam mais do que 90% de necrose (HUVOS III e IV)
apresentavam uma sobrevida mais alta quando comparados com pacientes
que apresentavam menos que 90% de necrose, isto é HUVOS I e II (ROSEN
et al. 1976). Hoje em dia, com os esquemas atuais de quimioterapia
11
sistêmica, avanços nas técnicas cirúrgicas e melhora nos métodos
diagnósticos de imagem, com maior sensibilidade para detecção das lesões
metástaticas, os pacientes com tumores de extremidades, não metastáticas
ao diagnóstico, apresentam uma sobrevida livre de eventos em 5 anos de
50% enquanto que esta taxa é de 15% para os pacientes metastáticos. Já a
sobrevida global em 5 anos para pacientes não metastáticos encontra-se em
torno de 70%, enquanto para pacientes metastáticos está em torno de 30%
(BIELACK et al. 2002).
A necessidade de quimioterapia neoadjuvante e adjuvante já é bem
estabelecida nos diferentes estudos, porém diferentes esquemas
quimioterápicos são utilizados por diferentes instituições entretanto, a
maioria dos esquemas atuais baseia-se em altas doses de metotrexate,
doxorrubicina e ou derivados de platina (BIELACK et al. 2008).
No Brasil também vivenciamos um progresso importante no
diagnóstico e tratamento do osteossarcoma. Em 1980, iniciou-se um
trabalho cooperativo com investigadores de diversos serviços hoje chamado
Grupo Brasileiro para o Tratamento de Osteossarcoma cujos objetivos são
obter informações detalhadas das características clínico-epidemiologicas da
nossa população e o desenvolvimento de estratégias terapêuticas
considerando as características populacionais. Nestes 25 anos de
experiência houve uma melhora significativa na sobrevida global. Anterior à
década de 80 a sobrevida encontrava-se em torno de 10%. O primeiro
estudo iniciado em 1982, resultou em uma sobrevida livre de eventos em 3
anos (EFS) de 44,1%. O segundo estudo conduzido entre 1987 – 1990
12
mostrou ESF em 3 anos de 65%, identificando tamanho do tumor primário,
grau de necrose e tipo de cirurgia com fatores prognósticos relevantes
(PETRILLI et al. 1991). O terceiro estudo iniciado em 1991 conduzido até
1996 e o quarto estudo conduzido de 1996 - 1999 resultaram em uma
sobrevida global e livre de eventos de 60% e 45,5% em cinco anos,
respectivamente (PETRILLI et al. 2006). Além disso, neste período, os
avanços nas técnicas de cirúrgicas proporcionaram um aumento na taxa de
cirurgia conservadora de membro de 59% para 70% (PETRILLI et al. 2006).
Apesar de todos os avanços obtidos com os métodos diagnósticos, no
campo da quimioterapia e das técnicas cirúrgicas, a sobrevida global em 5
anos do ostessarcoma para pacientes não metastáticos permanece em torno
de 70% e para pacientes metastáticos a sobrevida é de aproximadamente
20-30%.
Desta forma, os estudos hoje têm se voltado para um maior
entendimento sobre a biologia do osteossarcoma.
1.2 GENÉTICA E OSTEOSSARCOMA
O desenvolvimento do osteossarcoma não tem sido relacionado com
alterações genéticas características, todavia múltiplas e complexas
alterações moleculares, com inúmeras alterações cromossômicas,
inativação de genes supressores de tumor e amplificação de oncogenes tem
sido descritas (GORLICK et al. 2003).
13
Estudos de citogenética clássica têm demonstrado que estes tumores
apresentam um cariótipo complexo, caracterizado por alto grau de
anormalidades cromossômicas,, sejam estruturais ou numéricas. BATANIAN
et al. (2002) avaliaram por citogenetica clássica e hibridização genômica
comparativa (CGH) 4 casos de osteossarcoma em crianças entre 3 e 13
anos. As anormalidades numéricas comumente encontradas incluem ganho
do cromossomo 1, perda dos cromossomos 9, 10, 17, 19 e 22. Outras
alterações numéricas descritas foram as monossomias do cromossomo 6, 8,
10, 16, 18 e 19, além da trissomia dos cromossomos 20 e 22. As alterações
estruturais encontradas incluem rearranjos da região 1p11-13, 1q11, 4q27-
33, 6p23-25, 6q16-25, 7p13-22, 7q11-36, 11p10-15, 11q23, 12p12, 17p11-
13, 21p11 e 21q11-22. ZIELENSKA et al. (2001) analisaram 18 amostras de
osteossarcoma por CGH e detectaram o ganho da região 1p35-p36 e do
cromossomo 19 como as alterações mais freqüentes encontradas. DOS
SANTOS-AGUIAR et al. (2007) analisaram 41 amostras de pacientes com
osteossarcoma por CGH e identificou em 26 amostras perda do
cromossomo 21, mais especificamente perda da região 21q11.2-21.
MARINA et al. (2004) descreveram outras anormalidades estruturais
encontradas em osteossarcoma, as quais incluem ganho do cromossomo 1
e perda dos cromossomos 9, 10, 13 e 17, além da perda parcial ou completa
do braço longo do cromossomo 6. Entre as anormalidades estruturais
descritas encontram-se os rearranjos dos cromossomos 11, 19 e 20.
Os genes supressores de tumor TP53 e RB1 são genes sabidamente
envolvidos na gênese do osteossarcoma. Entretanto, a perda de
14
heterozigose tem sido detectada em outros loci (3q, 13q, 17p, 18q),
sugerindo a participação de outros genes supressores de tumor na
patogênese do osteossarcoma (GORLICK et al. 2003).
Estudos de expressão gênica identificaram vários genes
diferencialmente expressos em osteossarcoma. WOLF et al. (2000)
analisaram o perfil de expressão gênica em três linhagens de
osteossarcoma comparadas com linhagens de osteoblastos normais
(doadores de medula óssea) através da técnica de cDNA microarray e
encontraram quatro genes diferencialmente expressos . São eles HSP90b,
PABPLI, FNI e THBS1. MINTZ et al. (2005) analisaram 30 amostras de
osteossarcoma (15 amostras de paciente HUVOS I e II e 15 amostras de
pacientes HUVOS III e IV) e identificaram a hiperexpressão dos genes
PLA2G2A, TGFB1, anexina2 e SMAD nas amostras de pacientes HUVOS I
e II, sugerindo serem estes genes relacionados com quimiorresistência em
osteossarcomas.
DALLA-TORRE et al. (2006) identificaram, através de experimentos
de cDNA array, três genes diferenciamente expressos em 76 amostras de
osteossarcoma obtidas no Instituto de Oncologia Pediátrica (IOP-GRAACC).
De acordo com este estudo, a hiperexpressão do gene THBS3
correlacionou-se com metástase ao diagnóstico (p=0.058) e com pior
sobrevida livre de recaída (p=0,003). O gene SPARC foi encontrado
hiperexpresso em 96% das amostras de osteossarcoma e apresentou
correlação com pior sobrevida livre de eventos (p=0,07). O gene SPPI
estava hiperexpresso em 89% das amostras de osteossarcoma e
15
apresentou correlação com melhor sobrevida global (p=0,001), sobrevida
livre de eventos (p=0,02) e sobrevida livre de recaídas (p=0,005).
O aumento da expressão de EGFR-2 também foi descrito em
amostras de osteossarcoma (SANDBERG et al. 2003).
Estas anormalidades são extremamente diversas e variáveis,
confirmando o complexo perfil de alterações cromossômicas presentes em
osteossarcoma, o que dificulta a identificação de alterações especifica neste
grupo de pacientes.
1.3 METILAÇÃO DE DNA
A metilação do DNA é a mais freqüente modificação química
encontrada no genoma dos eucariotos. É considerada uma alteração
epigenética, pois embora modifique a constituição química do DNA, ela não
altera diretamente a seqüência de nucleotídeos (SULEWSKA et al. 2007).
A metilação envolve a ligação covalente de um radical metil (CH
3
) à
base nitrogenada citosina que precede uma guanina na seqüência do DNA
(dinucleotideo CpG), originando assim a 5-metil-citosina. Esta reação utiliza
S-adenosil-metionina como doador do radical metil e é catalisada por
enzimas chamadas DNA metiltransferase (DNMTs) (Figura 3).
16
METILAÇÃO DA CITOSINA
Legenda: A enzima DNA metiltransferase (DNMT) catalisa a metilação na posição 5 da
citosina, utilizando S-adenosilmetionina como doador do grupo metil.
Fonte: Modificada de HERMAN e
BAYLIN (2003).
Figura 3 - Metilação da citosina:
A família de DNMTs inclui DNMT1, DNMT3a e DNMT3b. A enzima
DNMT1 é responsável pela manutenção do padrão de metilação da célula
mãe à célula filha e catalisa 97-99,9% das reações de metilação durante a
mitose. As enzimas DNMT3a e DNMT3b são responsáveis pela adição de
novos radicais metil ao DNA recém-sintetizado, processo conhecido como
metilação de novo, com importância reconhecida nos processos iniciais do
desenvolvimento embrionário (SULEWSKA et al. 2007) (Figura 4).
Replicação
Manutenção
DNMT1
fita DNA mãe
fIta DNA filha
Legenda: DNMT3A/B catalisam reação de metilação em sítios não metilados previamente.
Após cada replicação a manutenção do padrão de metilação às células filhas deve-se a
enzima DNMT1.
Fonte: Adaptada de GRONBAEK et al. (2007).
Figura 4 - Propagação do modelo de metilação.
17
O dinucleotídeo CpG está presente em apenas 5-10% do genoma e
encontra-se distribuído irregularmente. Estes dinucleotídeos CpG têm sido
progressivamente eliminados do genoma provavelmente devido à
instabilidade da metil-citosina, pois as citosinas metiladas apresentam uma
maior propensão a se transformarem em timina através da deaminação
hidrolitíca (SINGAL et al. 1999).
Algumas regiões do genoma humano apresentam freqüência
aumentada destes nucleotídeos CG, as chamadas ”ilhas CpG”. Estas
regiões estão localizadas na região promotora dos genes e representam
aproximadamente 1 a 2% do genoma, com aproximadamente 0,5 kb de
extensão e um conteúdo de citosinas e guaninas maior que 50%.
Aproximadamente 50 a 60% dos genes possuem ilhas de CpG em suas
regiões promotoras. Aproximadamente 80% dos dinucleotídeos CpG, os
quais não estão associados com as ilhas CpG, encontram-se metilados . Em
contraste, os dinucleotídeos localizados nas ilhas CpG encontram-se não
metilados (HERMAN e BAYLIN 2003; GRONBAEK et al. 2007).
O papel da metilação do DNA é a regulação diferencial da expressão
gênica (SINGAL et al. 1999).
A metilação é um mecanismo fisiológico e tem um importante papel
no desenvolvimento com a repressão transcricional de determinados genes,
no imprinting genômico, na inativação de um cromossomo X nas mulheres e
na proteção contra seqüências virais (LAIRD 2003; ROBERTSON 2005). O
imprinting genômico determina que apenas um alelo do gene seja expresso
18
em tecidos normais, ou seja, para alguns genes o alelo paterno será
expresso e para outros será o alelo materno (HERMAN e BAYLIN 2003).
Alguns possíveis mecanismos têm sido propostos para explicar a
repressão transcricional pela metilação do DNA (SINGAL et al. 1999).
O primeiro mecanismo envolve a interferência direta da ligação dos
fatores de transcrição na região promotora. Alguns fatores de transcrição
reconhecem seqüências que contêm os dinucleotídeos CpG e quando a
citosina encontra-se metilada há inibição da ligação dos fatores de
transcrição. Porém alguns fatores de transcrição são insensíveis à metilação
(SINGAL et al. 1999).
Outro potencial mecanismo para o silenciamento gênico induzido pela
metilação é a ligação de proteínas especificas repressoras transcricionais à
seqüência de DNA metilado. Estas proteínas, MeCP-1 e MeCP2 (methyl
cytosine binding proteins 1 / 2) ligam-se a seqüência de DNA metilado.
MeCP-2 é mais abundante que MeCP-1 (SINGAL et al. 1999). Estas
proteínas apresentam um domínio de repressão transcricional que forma um
complexo com moléculas co-repressoras (mSin3A) e proteínas histona-
deacetilase (ESTELLER 2007). Quando este complexo se liga ao DNA
metilado ocorre uma alteração na estrutura da cromatina, fazendo com que
ela se torne mais condensada, dificultando o acesso dos fatores de
transcrição (Figura 5). Assim ocorre o silenciamento gênico (STIRZAKER et
al. 2003).
19
Eucromatina
Heterocromatina
Legenda: Cromatina ativa transcripcionalmente (eucromatina) é caracterizada por citosinas
não metiladas e histonas acetiladas. Cromatina inativa (heterocromatina) é caracterizada
por metilação dos resíduos de citosina, com ligação das proteínas de ligação às
metilcitosinas (MBD: MeCP-1 e MeCP-2) e das histonas desacetilases (HDAC). Assim a
cromatina torna-se mais condensada e inacessível aos fatores de transcrição.
Fonte: Adaptada de GRONBAEK et al. (2007).
Figura 5 - Estrutura da cromatina ativa e inativa.
1.4 METILAÇÃO DO DNA E CÂNCER
Diferentes alterações no perfil de metilação do DNA podem estar
relacionadas com a carcinogênese. Em geral, as células neoplásicas são
caracterizadas por apresentarem hipometilação em áreas normalmente
metiladas e hipermetilação nas ilhas CpG, normalmente não metiladas em
células normais (GRONBAEK et al. 2007) (Figura 6).
A perda de metilação do DNA pode levar a expressão de regiões
normalmente silenciadas do genoma, sendo um achado comum na
tumorigênese. A hipometilação pode levar à perda do imprinting de um dos
alelos à transcrição de seqüências virais inseridas no DNA ou à expressão
de microRNA oncogênicos. Além disso, a hipometilação do DNA facilita o
surgimento de regiões genômicas instáveis, aumentando o potencial
20
oncogênico (GRONBAEK et al. 2007). Na síndrome hereditária de Bekwith-
Wiedemann há a perda do imprinting de IGF2 com aumento do risco de
desenvolvimento de algumas neoplasias (ESTELLER 2008).
Em adição às mutações pontuais e deleções gênicas, a
hipermetilação da região promotora dos genes supressores de tumor
apresenta como conseqüência a repressão transcricional com inativação
destes genes. Estes genes que apresentam hipermetilação da região
promotora estão envolvidos com ciclo celular, reparo de DNA, metabolismo
de carcinógenos, interação célula-célula, apoptose e angiogênese
(ESTELLER 2000, 2008).
Eventos genéticos e epigenéticos podem levar à inativação de genes
supressores de tumor. Em concordância com a hipótese de Knudson, para
que ocorra a inativação do gene supressor de tumor ambos os alelos devem
ser inativados (modelo dos dois eventos). Isso pode ocorrer por
hipermetilação de ambos ou por uma combinação de deleção e
hipermetilação. Em cânceres hereditários os eventos epigenéticos
funcionam como o segundo evento para inativação de genes supressores de
tumor, porém em cânceres esporádicos, a hipermetilaçao de ambas as
cópias não é infreqüente (HERMAN e BAYLIN 2003). O gene do
Retinoblastoma (Rb) foi o primeiro gene supressor de tumor no qual a
hipermetilação da região promotora foi detectada (GRONBAEK et al. 2007).
Outros genes supressores de tumor inativados por hipermetilação da região
promotora são VHL, MLH1, p16, BRCA1, entre outros.
21
Legenda: Na figura A observamos o padrão de metilação em células normais. A região
promotora do gene apresenta os dinucleotideos CpG não metilados. Os dinucleotídeos CpG
localizados fora da região promotora encontram-se metilados. Assim a transcrição do gene
ocorre normalmente. Na figura B observamos que os dinucleotídeos da região promotora
encontram-se hipermetilados o que causa a inibição da transcrição gênica.
Fonte: Adaptada de BAYLIN (2005).
Figura 6 - Distribuição dos dinucleotideos CpG no genoma humano e
diferenças do perfil de metilação entre células normais e neoplásicas.
1.5 METILAÇÃO E OSTEOSSARCOMA
Existem poucos estudos avaliando o padrão de metilação de
neoplasias pediátricas. RATHI et al. (2003) demonstraram que o gene
supressor de tumor HIC1 encontra-se metilado em 36-80% das amostras de
meduloblastoma, retinoblastoma, rabdomiossarcoma, tumor de células
germinativas e neuroblastomas. Em um outro estudo, WONG et al. (2004)
encontraram o gene RASSF1A metilado em 67% das 24 amostras de
tumores pediátricos avaliadas, incluindo neuroblastoma, carcinoma de
tireóide, hepatocarcinoma, pancreatoblastoma, carcinoma adrenocortical,
tumor de Wilms, Linfoma de Burkitt e Linfoma de células T. Outros genes
descritos como metilados em tumores pediátricos são CASP8, TP53,
22
CDKN2A, CDKN2B, p14
ARF
, RB1, CDH-1, porém todos com grande variação
entre os estudos. Talvez devido ao pequeno número de amostras analisadas,
nenhum dos estudos obteve sucesso em estabelecer uma correlação válida
entre o perfil de metilação e fatores prognóstico.
Poucos estudos até o momento avaliaram o padrão de metilação em
osteossarcoma. TSUCHIYA et al. (2000) estudaram o perfil de metilação dos
genes CDKN2A, p14
ARF
, CDKN2B e TP53 e diversas alterações (deleções,
mutações pontuais) em 30 pacientes com diagnóstico de osteossarcoma e
idade entre 6-55 anos. O gene CDKN2A mostrou-se alterado em 19% das
amostras e destes, 40% correspondiam a metilação. O gene CDKN2B
mostrou-se alterado em 14% das amostras e destes a metilação
correspondia a 20%. Já o gene p14
ARF
mostrou-se alterado em 9% das
amostras, porém em nenhuma delas foi confirmada a metilação. BENASSI et
al. (2001) estudaram 35 amostras de osteossarcoma e avaliaram os genes
CDKN2A e p14
ARF
. Em 60% das amostras o gene CDKN2A não foi expresso
e em 57% ele encontrava-se metilado. LIM et al. (2003) estudaram o perfil de
metilação do gene RASSF1A em 10 amostras de osteossarcoma primário e 6
linhagens de osteossarcoma. O gene RASSF1A estava metilado em 40% dos
tumores primários e 83% das linhagens. Após 4 dias de tratamento com 5-
aza-2-deoxicitidina, o gene RASSF1A passou a ser expresso em todas as
linhagens celulares, indicando que a metilação seria o mecanismo
responsável pelo silenciamento deste gene. PATIÑO-GARCÍA et al. (2002)
avaliaram 41 amostras de osteossarcoma, encontrando os genes CDKN2A e
RB1 metilados em 12% e em 14% delas, respectivamente.
23
HOU et al. (2006) estudaram o perfil de metilação em 5 genes
(CDKN2A, RASSF1A, DAPK, MGMT, TIMP3) em 30 amostras de
osteossarcoma e seus correspondentes normais através de PCR quantitativa
específica para metilação (Q-MSP) em pacientes com idade variável entre 4
e 51 anos. Os resultados indicam que os genes RASSF1A, TIMP3, MGMT e
DAPK apresentaram diferença significativa de hipermetilação nas amostras
tumorais quando comparados com o controle normal. Em adição, os
resultados mostram que houve uma diferença significativa no nível de
metilação do DNA entre os pacientes metastáticos e não metastáticos (p
<0,01).
O delineamento adequado do curso da doença, sua detecção precoce e
a identificação de parâmetros que pudessem auxiliar na identificação de
tumores metastáticos poderiam contribuir com o aumento da sobrevida dos
pacientes, além de melhora da qualidade de vida. Além disso, fatores
prognósticos sensíveis poderiam oferecer mais subsídios para a adequação
das estratégias terapêuticas. A hipermetilação de promotores gênicos tem
sido considerada um potencial marcador molecular para diagnóstico e
prognóstico em vários tumores, como por exemplo, pulmão, mama e cólon
(NUOVO et al.1999; ESTELLER et al. 1999, 2000; BAYLIN et al. 2001; VAN
RIJINSOEVER et al. 2002).
Entretanto, existem poucos estudos avaliando o
perfil de metilação em osteossarcomas e, talvez devido a pequena casuística
avaliada, nenhum destes estudos conseguiu estabelecer uma correlação
entre a hipermetilação e aspectos clinico-patológicos da doença.
24
Considerando a metilação como um importante mecanismo epigenético
para o silenciamento de genes supressores de tumor, a avaliação do perfil de
metilação de genes envolvidos com a tumorigênese do osteossarcoma pode
ser útil como fator prognóstico, permitindo modificações na abordagem
terapêutica e, com isso, melhorar as taxas de cura.
25
2 OBJETIVOS
2.1 OBJETIVO GERAL
O presente trabalho visou estabelecer a freqüência de hipermetilação
da região promotora de genes supressores de tumor em amostras de tumor
fresco e congelado (biópsias) de pacientes pediátricos com diagnóstico de
osteossarcoma, sem tratamento quimioterápico prévio, provenientes do
Banco de Tumores do Hospital A.C. Camargo e do Instituto de Oncologia
Pediátrica – UNIFESP e avaliar se o perfil de hipermetilação pode funcionar
como um marcador molecular útil neste tipo tumoral.
2.2 OBJETIVOS ESPECÍFICOS
1 Determinar o perfil de hipermetilação da região promotora de 18
genes supressores de tumor (AIM1, APC, CALCA, CCNA1, CDH1,
CDKN2A, DAPK, ESR1, GSTP1, HIC1, MLH1, p14
ARF
, RARβ,
RASSF1A, RB1, SOCS1, THBS1 e SFRP1) em amostras de
osteossarcoma sem tratamento quimioterápico prévio.
2 Verificar se existe correlação entre o perfil de hipermetilação e fatores
clínicos e histopatológicos, principalmente aqueles relacionados ao
prognóstico, como a presença de metástases e grau de necrose
induzido pela quimioterapia.
26
3 MATERIAIS E MÉTODOS
3.1 CASUÍSTICA
Foram selecionadas amostras de tecido tumoral ósseo fresco e
congelado provenientes de biópsias realizadas no momento do diagnóstico.
Estas amostras pertenciam ao Banco de Tumores do Hospital AC Camargo,
sob coordenação do Dr. Fernando Soares e do Banco de Tumores do
Instituto de Oncologia Pediátrica – UNIFESP, sob coordenação da Dra.
Silvia Toledo.
As amostras foram revisadas por um patologista para que houvesse
confirmação do diagnóstico de osteossarcoma através da confecção de uma
lâmina corada por hematoxilina-eosina proveniente da amostra obtida no
banco de tumores.
Os dados clínicos dos pacientes foram extraídos dos prontuários
arquivados no Serviço de Arquivo Médico (SAME) do serviço de origem.
Foram abordados os seguintes critérios: data de nascimento, sexo, idade ao
diagnóstico, data do diagnóstico, sítio primário do tumor, tipo histológico
(biopsia pré operatória e peça cirúrgica), presença de metástases ao
diagnóstico, grau de necrose induzido pela quimioterapia pré-operatória
(Grau de HUVOS), recaída, status do paciente, data do último follow-up.
O projeto foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa (CEP) da
Universidade Federal de São Paulo (UNIFESP) em 17/02/05 e pelo Comitê
27
de Ética em Pesquisa (CEP) Fundação Antonio Prudente em 28/03/06 -
SISNEP número 1336.0.022.174-06
3.2 EXTRAÇÃO DE DNA
As amostras de tumor fresco com aproximadamente 1 cm
3
foram
pulverizadas em nitrogênio líquido para em seguida ser realizada extração
de DNA utilizando-se o Reagente TRIZOL (Invitrogen
®
) conforme protocolo
fornecido pelo fabricante. Ao tecido pulverizado foi adicionado 1mL de
TRIZOL. Após centrifugação (10 minutos a 12.000 rpm a 4
o
C) a fase
aquosa foi removida e o RNA presente nela foi precipitado através da adição
de etanol e armazenado a -70ºC. À fase orgânica foram adicionados 500μL
de tampão de extração (tiocianato de guanidina 4M, citrato de sódio 50mM e
TRIS 1M pH 8,0 para cada 1 ml de TRIZOL utilizado no início da extração.
As amostras foram homogeneizadas e incubadas por 20 minutos a
temperatura ambiente, homogeneizando-as a cada 5 minutos. Em seguida
foram centrifugadas por 15 minutos à 4ºC 12.000 rpm. O sobrenadante
(contendo o DNA) foi transferido para um novo tubo ao qual foi adicionado
1μL de glicogênio (20mg/mL) e 1 volume de isopropanol. As amostras foram
então deixadas a temperatura ambiente por 10 minutos e em seguida,
centrifugadas por 10 minutos a 12.000 rpm a 4ºC. O sobrenadante foi
descartado cuidadosamente e foi adicionado 1mL de etanol 70% gelado,
misturando-se por inversão e centrifugando-as novamente por 10 minutos a
12.000 rpm a 4ºC. O sobrenadante foi novamente descartado e todas as
28
amostras foram secas a temperatura ambiente para em seguida, o DNA
contido nos tubos ser ressuspendido em 50μL água.
As amostras oriundas do Banco de Tumores do Instituto de Oncologia
Pediátrica – UNIFESP foram processadas pelo grupo da Dra. Silvia Toledo e
uma alíquota do DNA nos foi enviada
As amostras de foram quantificadas por espectrofotometria utilizando-
se o equipamento Nanodrop.
Para verificar a qualidade e integridade do DNA foi realizada PCR
utilizando-se primers para a amplificação de um fragmento de 283pb do
gene BRCA1 - éxon 11 (Tabela1)
Tabela 1- Seqüência dos primers direto e reverso para amplificação do
fragmento de 283pb do gene BRCA1 – exon 11.
Primer Seqüência
Direto
5'-GAGAGGCATCCAGAAAAGTATCAG-3'
Reverso
5'-CACACAGGGGATCAGCATTC-3'
Essa reação foi realizada sob as seguintes condições: 1 mM de
MgCl
2
, 0,2mM de dNTPs, 0,2μM de cada primer, 1X tampão de PCR, 1,0U
de Taq DNA Polymerase (Invitrogen) e 100ng de DNA em um volume final
de reação de 25µl. O programa de PCR utilizado foi: 95
o
C por 5 minutos; 35
ciclos de 95
o
C por 30 segundos, 61°C por 45 segundos e 72
o
C por 45
segundos; e um passo final a 72
o
C por 7 minutos. Para a visualização dos
produtos amplificados as amostras foram resolvidas através de eletroforese
em gel de agarose a 1% corado com brometo de etídio.
29
3.3 TRATAMENTO COM BISSULFITO DE SÓDIO
O tratamento do DNA com bissulfito de sódio resulta na conversão
das citosinas não metiladas em uracilas, não alterando as citosinas
metiladas. As uracilas são convertidas em timinas durante a reação de
amplificação. O DNA de cada uma das amostras foi submetidos ao
tratamento com bissulfito de sódio conforme descrito por Jerônimo et al.
(2004). Basicamente, numa primeira etapa foi realizada a denaturação do
DNA, utilizando 2 μg do DNA, 1μL de Hering Sperm DNA 1 ug/ml
(Invitrogen) e 2μL de NaOH 3M para um volume final de 20 μL. As amostras
foram então incubadas em banho-maria a 50ºC por 20 minutos. Em seguida
foram adicionados às amostras 500µL de solução de bissulfito de sódio
(bissulfito de sódio 2,5M, hidroquinona 125mM e NaOH 350 mM). As
amostras então foram incubadas no escuro a 70ºC por 3 horas. O DNA foi
purificado com a utilização do kit Wizard DNA clean-up system (PROMEGA)
e, posteriormente, lavado com 4 mL de isopropanol 80%, seguida pela
centrifugação das amostras por 3 minutos a 13000 rpm. O DNA tratado foi
então eluído em 45µL de água mili-Q a 80ºC. A dessulfonação do DNA foi
feita através da adição de 5µL de NaOH 3M e incubação por 10 minutos a
temperatura ambiente. A precipitação do DNA, foi realizada com a adição de
75μL de acetato de amônia 5M, 300μL de etanol 100% gelado e 1μL de
glicogênio (20mg/mL) e incubação overnight a -20ºC. Após centrifugação (30
min., 12000rpm, 4°C) e descarte do sobrenadante, foram adicionados 500µL
de álcool 70% gelado e repetidos os passos de centrifugação e descarte do
30
sobrenadante. Os pellets foram deixados à temperatura ambiente para sua
secagem, ressuspensos em 110µL de água e armazenados a -70º C.
3.4 PCR QUANTITATIVA ESPECÍFICA PARA METILAÇÃO
(QMSP)
O DNA extraído foi submetido a tratamento com bissulfito de sódio e
posteriormente à MSP quantitativa (QMSP - methylation specific PCR –
polimerase chain reaction - MethyLight) conforme descrição de EADS et al.
(2000). A QMSP é uma abordagem quantitativa baseada na PCR em tempo-
real. Nessa abordagem são utilizados um par de primers e uma sonda
específica marcada com 2 fluoróforos: um reporter (6-carboxi-fluoresceina –
FAM) na extremidade 5’ e um quencher (6-carboxi-tetrametil-rodamina –
TAMRA) na extremidade 3’. O reporter, quando excitado por um laser, emite
fluorescência, a qual é captada pelo quencher devido à proximidade entre
ambos. Durante a reação de PCR, a atividade de exonuclease da Taq DNA
Polimerase hidrolisa a sonda, separando o reporter do quencher, e a
fluorescência emitida pode, então, ser captada pelo aparelho. Portanto, o
nível de fluorescência detectado pelo aparelho é proporcional à quantidade
de produto amplificado formado durante a reação. A quantidade inicial de
amostra pode ser inferida tendo como base o C
T
, o qual representa o ciclo
da PCR em que a quantidade de florescência produzida na reação atinge um
limite pré-estabelecido. Para que as amostras possam ser quantificadas
baseadas no C
T
é necessária a construção de uma curva padrão, construída
31
a partir da diluição seriada de uma mesma amostra de DNA, na qual o C
T
diminui linearmente de acordo com o aumento da quantidade de DNA. Os
dados referentes à quantificação da amostra amplificada são calculados pelo
próprio aparelho de PCR em tempo-real (BUSTIN 2000; EADS et al. 2000).
Como referência interna das reações foi utilizada a amplificação do gene
ACTB, cujos iniciadores e sondas foram desenhados em região livre de
nucleotídeos CG, por isso, a amplificação do gene referência ocorre
independentemente da presença ou ausência de metilação. Por outro lado, a
amplificação dos genes-alvo depende da presença de metilação em seus
promotores, pois os primers e sondas contemplam em suas seqüências a
presença do dinucleotídeo CG (JERONIMO et al. 2001; HARDEN et al.
2003; JERONIMO et al. 2004b).
As reações de amplificação para o gene ACTB e para os genes alvo
(AIM1, APC, CALCA, CCNA1, CDH1, DAPK, ESR1, GSTP1, HIC1, p14
ARF
CDKN2A, RARB, RASSF1A, RB1, SOCS1, THBS1, SFRP1, MLH1 ) foram
realizadas em um volume total de 20μL contendo tampão Home Made 1X
(sulfato de amônio 16,6mM, Tris-HCl pH 8,8 67mM, cloreto de magnésio
6,7mM, β-mercaptoetanol 10mM, DMSO 0,1%), 200µM de dNTP, 1,2µM de
cada um dos primers, 200nM de sonda, 0,75 unidade de Platinum Taq DNA
Polimerase (Invitrogen) e 3µL de DNA tratado com bissulfito de sódio. As
condições de amplificação foram: uma etapa inicial de denaturação a 95
o
C
durante 2 minutos, seguida de 45 ciclos de 95
o
C por 15 segundos e 60
o
C
por 1 minuto. Todas as reações foram preparadas em placas de 96 wells e
todas as amostras foram analisadas em triplicatas no aparelho 7500 Real
32
Time PCR System (Applied Biosystems). Para o gene CDKN2A a
concentração de cloreto de magnésio no tampão Home Made 1X foi de
2,5mM.
Os primers e sondas utilizados neste estudo estão apresentados no
Quadro 1.
Além das amostras, para cada reação foi construída uma curva
padrão a partir da diluição seriada de uma mesma amostra de DNA. Nesse
estudo, foi utilizado DNA de linfócitos metilados in vitro, através da ação da
enzima Methylase – SssI (New England Biolobs) conforme instruções do
fabricante, e submetido ao tratamento com bissulfito de sódio. Para a
construção das curvas foram utilizados 6 pontos de diluição cujas
concentrações foram 30ng; 3ng; 0,3ng; 0,03ng; 0,003ng e 0,0003ng.
Antes da realização das reações de QMSP foram verificadas as
eficiências de amplificação de todos os conjuntos de iniciadores e sondas.
Para tanto, foram construídas curvas padrão para cada um dos genes,
incluindo o gene referência. Essas curvas foram construídas a partir de uma
diluição seriada (como descrita acima) de uma mesma amostra de DNA de
linfócitos metilados in vitro. Após a amplificação a eficiência foi calculada
através da fórmula: E = 10
(-1/slope)
– 1, onde E é a eficiência e slope é a
inclinação da reta formada pelos pontos da curva padrão, este valor é
fornecido pelo próprio aparelho de PCR em tempo-real.
Só foram consideradas as amostras onde foi possível detectar
amplificação em pelo menos duas das triplicatas. A ausência de amplificação
ou amplificação de apenas uma das triplicatas indicava amostras não
33
metiladas. Para os cálculos foram utilizadas as médias dos valores das
triplicatas. As amostras foram consideradas metiladas quando o nível de
metilação foi superior a 0,1 %.
O cálculo do nível de metilação foi realizado com base na
quantificação das amostras determinada pela curva padrão. Para esse
cálculo foi obtida a razão entre a quantidade de amostra amplificada para o
gene alvo e para o gene ACTB que em seguida foi multiplicada por 100
(quantidade do gene alvo/quantidade do gene ACTB X 100), gerando dados
percentuais (HARDEN et al. 2003; JERONIMO et al. 2004a).
34
Quadro 1 - Seqüência de primers e sondas
Gene Forward 5´-3´ Probe 6FAM 5´-3´TAMRA Reverse 5´-3´ Reference
ACTB
TGGTGATGGAGGAGGTTTAGTAAGT ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA AACCAATAAAACCTACTCCTCCCTTAA Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8
AIM1
CGCGGGTATTGGATGTTAGT GGGAGCGTTGCGGATTATTCGTAG CCGACCCACCTATACGAAAA
Carvalho et al. ( 2008) Clin Cancer Res 14: 97-
107
APC
GAACCAAAACGCTCCCCAT CCCGTCGAAAACCCGCCGATTA TTATATGTCGGTTACGTGCGTTTATAT Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8
CALCA
GTTTTGGAAGTATGAGGGTGACG ATTCCGCCAATACACAACAACCAATAAACG TTCCCGCCGCTATAAATCG Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8
CCNA1
TCGCGGCGAGTTTATTCG CGTTATGGCGATGCGGTTTCGG CCGACCGCGACAAACG
Carvalho et al. ( 2008) Clin Cancer Res 14: 97-
107
CDH1
AATTTTAGGTTAGAGGGTTATCGCGT CGCCCACCCGACCTCGCAT TCCCCAAAACGAAACTAACGAC Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–9
CDKN2A
TTATTAGAGGGTGGGGCGGATCGC AGTAGTATGGAGTCGGCGGCGGG GACCCCGAACCGCGACCGTAA
Harden et al. (2003) Clinical Cancer Res 9:1370-
1375
DAPK
GGATAGTCGGATCGAGTTAACGTC TTCGGTAATTCGTAGCGGTAGGGTTTGG CCCTCCCAAACGCCGA
Harden et al. (2003) Clinical Cancer Res 9:1370-
1375
ESR1
GGCGTTCGTTTTGGGATTG CGATAAAACCGAACGACCCGACGA GCCGACACGCGAACTCTAA Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8
GSTP1
AGTTGCGCGGCGATTTC CGGTCGACGTTCGGGGTGTAGCG GCCCCAATACTAAATCACGACG
Jeronimo et al. (2001) J Nat Cancer Inst 93:1747-
1752
HIC1
GTTAGGCGGTTAGGGCGTC CAACATCGTCTACCCAACACACTCTCCTACG CCGAACGCCTCCATCGTAT Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8
MLH1
CGTTATATATCGTTCGTAGTATTCGTGTTT CGCGACGTCAAACGCCACTACG CTATCGCCGCCTCATCGT Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8
P14
ARF
ACGGGCGTTTTCGGTAGTT CGACTCTAAACCCTACGCACGCGAAA CCGAACCTCCAAAATCTCGA Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8
RARB
GGGATTAGAATTTTTTATGCGAGTTGT TGTCGAGAACGCGAGCGATTCG TACCCCGACGATACCCAAAC
Hoque et al. (2005) J Clin Endocrinol Metab
90:4011-18
RASSF1A
GCGTTGAAGTCGGGGTTC ACAAACGCGAACCGAACGAAACCA CCCGTACTTCGCTAACTTTAAACG Lehmann et al. (2002) Am J Pathol 160:605-612
RB1
TTAGTTCGCGTATCGATTAGCG TCACGTCCGCGAAACTCCCGA ACTAAACGCCGCGTCCAA Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8
SFRP1
GAATTCGTTCGCGAGGGA CCGTCACCGACGCGAAAACCAAT AAACGAACCGCACTCGTTACC
Weisenberger et al. (2006) Nature Genet
38(7):787-94
SOCS1
GCGTCGAGTTCGTGGGTATTT ACAATTCCGCTAACGACTATCGCGCA CCGAAACCATCTTCACGCTAA Müller et al. (2003) Cancer Res 7641-7645
THBS1
CGACGCACCAACCTACCG ACGCCGCGCTCACCTCCCT GTTTTGAGTTGGTTTTACGTTCGTT Eads et al. (2001) Cancer Res 61:3410–8
35
3.5 METILAÇÃO IN VITRO DE DNA DE LINFÓCITOS
Para a construção das curvas padrão utilizada na reação de
methylation-specific PCR quantitativa (QMSP) foi utilizado DNA de linfócitos
metilados in vitro. Após extração de linfócitos de sangue periférico de
indivíduos saudáveis, adicionou-se 20µg de DNA de linfócitos a 0,032mM de
S-adenosilmetionina (SAM) e 25 unidades da enzima SssI CpG Methylase
(New England Biolabs). O volume final da reação foi de 250µL. A reação foi
incubada por 4 horas a 37°C. Em seguida, adicionou-se 0,064mM de
S-adenosilmetionina e 12,5 unidades de SssI CpG Methylase e novamente
as amostras foram incubadas por 4 horas a 37°C. Após esta fase foi
realizada a extração do DNA através da adição de 250µL de fenol-clorofórmio
e em seguida a precipitação através da adição de 625 µL de etanol 100%. O
pellet de DNA foi dissolvido em 15µL de água e estocado a -70°C.
O DNA de linfócitos metilado foi submetido ao tratamento com
bissulfito de sódio conforme descrição anterior e então utilizado na
construção das curvas padrão.
3.6 ESCOLHA DOS GENES
Todos os genes selecionados para estes estudo já foram descritos
descritos como hipermetilados em outros tipos de neoplasias humanas.
Os genes RASSF1A e DAPK estão envolvidos com apoptose,
enquanto CDKN2A, p14
ARF
, RB1, CCNA1 e SOCS com controle do ciclo
36
celular. Alguns genes estão envolvidos com regulação da transcrição gênica
como AIM1 e HIC1 ou com o reparo de DNA (MLH1). Os genes CALCA,
ESR1 e RARβ estão envolvidos com sinalização célula-célula. O gene
GSTP1 esta envolvido com o processo de detoxificação e mediação de
resposta inflamatória. O gene THBS1 está relacionado com invasão e
capacidade de metástase em alguns tumores, enquanto que o gene SFRP1
está relacionado com diferenciação celular e o CDH1 com adesão celular. O
gene APC é um gene supressor tumoral.
Os genes RASSF1A, HIC1, DAPK, CDKN2A, p14
ARF
e RB1 já haviam
sido descritos como hipermetilados em amostras de osteossarcoma,
entretanto, há uma grande variação no tamanho das casuísticas destes
estudos e na freqüência de metilação encontrada, por isso, estes genes
foram incluídos e avaliados neste estudo.
O estudo publicado por WOLF et al. (2000) utilizando cDNA
microarray para avaliar a expressão gênica em linhagens de osteossarcoma
demonstrou que o gene THBS1 encontrava-se hipoexpresso em todas
amostras avaliadas. O gene THBS1 já foi descrito como freqüentemente
metilado em outros tumores (ESTELLER 2003), mas ainda não foi avaliado
em osteossarcoma, por isso ele foi incluído neste estudo
Os genes MLH1, CALCA, AIM, SFRP1, ESR1, CCNA1, APC, RARβ,
GSTP1, SOCS-1 e CDH1 já foram descritos como estando freqüentemente
metilados em diversas neoplasias, como tumores do sistema nervoso
central, linfomas, mama, cólon, pulmão, próstata, fígado e rim (ESTELLER
37
2003). Estes genes, ainda não foram avaliados em osteossarcoma e, por
isso, também foram incluídos neste estudo.
3.7 ANÁLISE ESTATÍSTICA
Para as análises estatísticas foi utilizado o programa estatístico SPSS
13.0 for Windows.
Para comparação dos dados clínicos e freqüências de metilação, para
cada gene entre os pacientes tratados nas duas instituições, foram utilizados
os testes de Qui-quadrado e exato de Fischer. Todas as características
clinicas analisadas foram transformadas em variáveis categóricas. As
características clínicas analisadas incluem: idade (< ou > 12 anos), sitio
primário (fêmur ou outros), tipo histológico (osteoblástico ou outros), grau de
HUVOS (bons respondedores (III e IV) ou pobres respondedores (I e II))
A avaliação da correlação entre a presença de hipermetilação para
cada gene e as variáveis clínicas foi realizada utilizando-se todo o grupo de
pacientes e aplicando-se os testes estatísticos de qui-quadrado e exato de
Fischer.
A sobrevida global de todo o grupo foi avaliada pelo método de
Kaplan-Meier e comparada atraves do log-rank
A significância estatística foi determinada para um valor de p<0,05.
38
4 RESULTADOS
4.1 CARACTERIZAÇÃO DA CASUÍSTICA
Inicialmente foram incluídas no estudo 60 amostras de tumor ósseo
fresco e congelado (biópsias) colhidas no momento do diagnóstico, sendo 50
eram provenientes do Instituto de Oncologia Pediátrica – UNIFESP e 10
amostras foram obtidas junto ao Banco de Tumores do Hospital A.C.
Camargo. Destas 60 amostras, foi possível recuperar DNA de qualidade
satisfatória de 34 casos (24 provenientes do IOP e 10 provenientes do
Hospital A.C. Camargo), e estes prosseguiram no estudo.
A idade dos pacientes avaliados variou de 7 a 29 anos, com média de
14 anos. Dezoito pacientes eram do sexo feminino (52,9%). O local primário
mais freqüentemente acometido foi o fêmur (52,9%), seguido por tíbia
(26,5%), úmero (8,8%) e fíbula (5,9%). 29,4 % dos pacientes eram
metastáticos ao diagnóstico. O tipo histológico mais comum foi osteoblástico
(61,8%), seguido por condroblástico (17,6%) e telangiectásico (5,9%). Em
relação ao grau de necrose (Grau de HUVOS), avaliado na peça cirúrgica
após quimioterapia neoadjuvante, 29,4% dos pacientes foi classificados como
HUVOS I (menos que 50% de necrose tumoral), 29,4% eram HUVOS II (51%
- 90% de necrose), 20,6% eram HUVOS III (90-99% de necrose) e 20,6%
eram HUVOS IV (100% de necrose). 52,9 % dos pacientes apresentaram
recidiva da doença, sendo que 33% dos pacientes apresentaram recidiva
39
local e pulmonar combinadas, 16% só recidiva local isolada, 40% recidiva
pulmonar isolada e 11% recaída óssea em local diferente do sítio primário
(dados não mostrados). 67,6% dos pacientes estavam vivos no último follow-
up (Tabela 2).
A sobrevida global em 5 anos para o grupo foi de 64% (Figura 7).
Pacientes metastáticos ao diagnóstico apresentaram uma sobrevida global
em 5 anos de 16%, os pacientes não metastáticos apresentaram uma
sobrevida global em 5 anos de 86% (p=0,001) (Figura 8) .Os pacientes que
apresentaram recidiva do tumor após o tratamento qumioterápico de primeira
linha apresentaram uma sobrevida global em 5 anos de 40%, já os pacientes
que não apresentaram recidiva apresentaram uma sobrevida em 5 anos de
aproximadamente 90% (p= 0,024) (Figura 9) Os pacientes que foram
classificados como grau de HUVOS I apresentaram sobrevida global em 5
anos de 40%, para os grupos II , III e IV foram 77%, 64% e 100%
respectivamente (p=0,032) ( Figura 10).
Sítio primário (p=0,054), tipo histológico (p=0,06), sexo (p=0,184) e
idade (p=0,648) não foram variáveis que apresentaram impacto estatístico na
sobrevida (Figuras 11, 12, 13 e 14 respectivamente).
40
Tabela 2 - Características clínicas e histológicas dos pacientes incluídos no
estudo.
Variável Categoria N %
Sexo
feminino
masculino
18
16
52,9
47,1
Idade
média
mediana
13,5
14
Sítio Primário
fêmur
tíbia
fíbula
úmero
outros
18
9
2
3
2
52,9
26,5
5,9
8,8
5,9
Metástase
sim
não
10
24
29,4
70,6
Tipo Histológico
osteoblastico
condroblástico
telangiectásico
não avaliado
21
6
2
5
61,8
17,6
5,9
14,7
HUVOS
I
II
III
IV
10
10
7
7
29,4
29,4
20,6
20,6
Recidiva
sim
não
18
16
52,9
47,1
Status
vivo 23 67,6
óbito 11
32,4
41
1501209060300
meses
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Sobrevida
SG 5 anos = 64%
Figura 7 - Sobrevida Global em 5 anos do grupo de 34 pacientes incluídos
no estudo.
1501209060300
meses
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
SG 5anos = 86%
Sobrevida
SG 5anos= 16%
p=0
METASTASES
SIM
NAO
,001
Figura 8 - Sobrevida Global em 5 anos em relação à presença de metástase
ao diagnostico (não metastático = 86% x metastático = 16%).
42
1501209060300
meses
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Sobrevida
SG 5anos= 90%
SG 5anos= 40%
p= 0,024
RECIDIVA
SIM
NAO
Figura 9 - Sobrevida global em 5 anos em relação à recidiva tumoral após o
tratamento quimioterápico de primeira linha (sem recidiva = 90% x com
recidiva = 40%)
1501209060300
meses
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
S
o
b
rev
id
a
SG =40%
SG = 64%
SG = 100%
SG =77%
p=0,032
HUVOS
IV
III
II
I
Figura 10 - Sobrevida global em 5 anos em relação ao grau de Necrose –
(Huvos) ( I = 40% , II = 77%, III = 64% e IV = 100%).
43
1501209060300
meses
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Sobrevida
SG 5anos= 85%
SG5 anos= 38%
p=0,054
SITIO PRIMARIO
NAO FEMUR
FEMUR
Figura 11 - Sobrevida global em 5 anos em relação ao sitio primário (fêmur =
85% x outros sítios = 38%)
1501209060300
meses
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Sobrevida
SG 5anos= 35%
p= 0,06
SG 5anos= 75%
TIPO HISTOLOGICO
OUTROS
OSTEOBLASTICO
Figura 12 - Sobrevida global em 5 anos em relação ao tipo Histológico
(osteoblástico = 75% x outros = 35%).
44
1501209060300
meses
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Sobrevida
SG 5anos=56%
SG 5anos= 75%
p= 0,184
SEXO
MASCULINO
FEMININO
Figura 13 - Sobrevida global em 5 anos em relação ao sexo (feminino = 56%
x masculino = 75%)
1501209060300
meses
1,0
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
Sobrevida
SG 5anos= 70%
p=0,648
SG 5anos=60%
Figura 14 - Sobrevida global em 5 anos em relação a idade (> 12 anos =
70% x < 12 anos= 60%)
45
4.2 EXTRAÇÃO, QUANTIFICAÇÃO E AVALIAÇÃO DAS
AMOSTRAS DE DNA
As 50 amostras oriundas do Banco de Tumores do Instituto de
Oncologia Pediátrica (IOP) foram extraídas por aquele grupo, enquanto que
as 10 amostras do Banco de Tumores do Hospital A.C. Camargo foram
extraídas no âmbito deste estudo.
Das amostras do Banco de Tumores do Hospital A.C. Camargo
obtivemos entre 1µg e 25 µg de DNA. Das amostras provenientes do IOP, 17
amostras apresentaram mais de 2 μg de DNA, 4 amostras apresentaram
entre 1-2μg e 29 amostras apresentaram quantificação inferior a 1μg de DNA
(Quadro 2).
A integridade dos DNAs de todas as amostras foi avaliada através da
amplificação de um fragmento de 283pb do gene BRCA-1 (exón 11) (Figura
15)
1 2 3 C+ C-
100pb
283
pb
Legenda: Canaletas 1, 2, 3 com amostras tumorais. C+ : controle positivo (DNA genômico
de linhagem celular). C - controle negativo (ausência de DNA).
Figura 15 - Gel de agarose 1% corado com brometo de etídio com
fragmentos de 283pb amplificados do gene BRCA1.
46
Todas as amostras provenientes do Banco de Tumores do Hospital
A.C. Camargo apresentaram amplificação, atestando a integridade do DNA
extraído. Das amostras provenientes do Banco de tumores do IOP apenas
48% das amostras amplificaram e puderam prosseguir no estudo (Quadro 2).
Quadro 2 - Quantidade de DNA obtida de cada amostra incluída no estudo e
avaliação de sua qualidade através da amplificação de um fragmento de
283pb do gene BRCA1.
Amostras Procedência Quantificação Amplificação
1
HAC 6,0µg Sim
2
HAC 25,0µg Sim
3
HAC 14,0µg Sim
4
HAC 10,0µg Sim
5
HAC 15,0µg Sim
6
HAC 11,0µg Sim
7
HAC 5,0µg Sim
8
HAC 5,0µg Sim
9
HAC 1,0µg Sim
10
HAC 1,0µg Sim
11
IOP 1,2µg Sim
12
IOP 1,3µg Sim
13
IOP 0,6µg Não
14
IOP 0,1µg Sim
15
IOP 0,3µg Não
16
IOP 0,5µg Não
17
IOP 0,5µg Não
18
IOP 0,8µg Não
19
IOP 0,5µg Não
20
IOP 1,2µg Sim
21
IOP 1,2µg Sim
22
IOP 0,4µg Não
23
IOP 0,1µg Não
24
IOP 0,4µg Não
25
IOP 2,6µg Sim
26
IOP 2,0µg Sim
27
IOP 3,6µg Sim
28
IOP 0,4µg Não
29
IOP 1,5µg Sim
30
IOP 1,2µg Sim
31
IOP 1,7µg Sim
32
IOP 2,0µg Não
33
IOP 1,6µg Sim
34
IOP 0,3µg Não
35
IOP 0,7µg Não
36
IOP 0,6µg Não
37
IOP 0,5µg Não
47
Cont/ Quadro 2
38
IOP 0,6µg Não
39
IOP 1,5µg Sim
40
IOP 0,1µg Não
41
IOP 0,2µg Não
42
IOP 0,2µg Não
43
IOP 2,3µg Não
44
IOP 0,8µg Sim
45
IOP 0,5µg Não
46
IOP 3,0µg Sim
47
IOP 0,7µg Sim
48
IOP 1,9µg Sim
49
IOP 0,5µg Não
50
IOP 0,8µg Sim
51
IOP 0,7µg Sim
52
IOP 3,6µg Sim
53
IOP 0,7µg Não
54
IOP 1,0µg Sim
55
IOP 0,5µg Não
56
IOP 0,6µg Não
57
IOP 2,0µg Sim
58
IOP 0,8 µg Não
59
IOP 0,6 µg Sim
60
IOP 2,5 µg Sim
HAC – Hospital A. C. Camargo, IOP – Instituto de Oncologia Pediátrica /UNIFESP-GRAACC
Para se detectar eventuais vieses de seleção de amostra, a
população total inicial de 60 casos de osteossarcoma foi comparada com a
população selecionada de 34 casos. Esta análise demonstrou que, a
populaçao selecionada não difere estatisticamente da população total do
estudo quando consideradas as variáveis categóricas (sexo, sítio, tipo
histológico, presença de metástases ao diagnóstico, grau de necrose –
HUVOS e recidiva) e não-categóricas (idade) (Tabela 3). A sobrevida global
nos dois grupos também não apresentou diferença estatisticamente
significativa (população total (n=60) =74% x população selecionada (n=34)
=64,5% p=0,184).
48
Tabela 3 - Análise comparativa entre a população total de 60 casos de
osteossarcoma e a população selecionada de 34 casos .
Características
População
total
n=60
Amostras
do estudo
n=34
p*
idade
< 12 anos
> 12 anos
20
40
14
20
0,294
sexo
feminino
masculino
30
30
18
16
0, 477
sítio
fêmur
outros
35
25
18
16
0,385
tipo histológico
osteoblastico
outros
38
16
21
8
0,527
metástase
não
sim
43
17
24
10
0,546
Huvos
I e II
III e IV
Não avaliados
34
19
7
20
14
0
0,391
recidiva
não
sim
32
28
16
18
0,570
TOTAL 60 34
*log-rank
49
4.3 ANALISES DE HIPERMETILAÇÃO EM OSTEOSSARCOMA
4.3.1 Estudo Piloto
Devido ao pequeno número de amostras que conseguimos incluir no
estudo e à escassez de DNA obtido destas amostras optamos por realizar
um estudo piloto, cujo desenho consistiu em determinar o perfil de metilação
dos 18 genes selecionados em 13 amostras de osteossarcoma através da
reação de QMSP. Estas amostras foram selecionadas de acordo a
quantidade de DNA disponível, sendo analisadas nesta fase aquelas em que
foram obtidos pelo menos 6μg de DNA.
Para se detectar eventuais vieses de seleção de amostra, a
população total de 34 casos de osteossarcoma foi comparada com a
população selecionada de 13 casos analisados no estudo piloto. Esta
análise demonstrou que, a população total não parece diferir
estatisticamente da sub-população analisada no estudo piloto quando
consideradas as variáveis categóricas (sexo, sítio, tipo histológico, presença
de metástases ao diagnóstico, grau de necrose – HUVOS e recidiva) e não-
categóricas (idade) (Tabela 4). A sobrevida global nos dois grupos também
não apresentou diferença estatisticamente significativa (população total
(n=34) =64,5% x população selecionada para piloto (n=13) =80,0%
p=0,293).
50
Tabela 4 - Analise comparativa entre a população total de 34 casos de
osteossarcoma incluída no estudo e a população selecionada de 13 casos
analisados no estudo piloto
Características
População
total
n=34
Estudo
piloto
n=13
p*
idade
< 12 anos
> 12 anos
14
20
4
9
0,379
sexo
feminino
masculino
18
16
6
7
0, 464
sítio
fêmur
outros
18
16
7
6
0,608
tipo histológico
osteoblastico
outros
21
8
10
3
0,538
metástase
não
sim
24
10
11
2
0,277
Huvos
I e II
III e IV
Não avaliados
20
14
8
5
0,568
recidiva
não
sim
16
18
7
6
0,464
TOTAL 34 13
*log-rank
51
O estudo piloto permitiu a classificação dos 18 genes avaliados em 3
grupos: No grupo 1, genes freqüentemente hipermetilados (com freqüência
de hipermetilação superior a 30%), foram classificados o HIC1 (92,0%),
CDH1 (76%), CALCA (76%), SFRP1 (61,5%), p14
ARF
(61,5%), ESR1 (30,7%)
e AIM1 (30,7%). No grupo 2, genes com baixa freqüência de hipermetilação
(até 29%) encontram-se os genes APC (23,0%), SOCS1 (23,0%),
MLH1(23%), RARβ (15,3%) e RASSF1A (7,6%). No grupo 3 estão os genes
CDKN2A, CCNA1, GSTP1, THBS1, RB1 e DAPK que não apresentaram
hipermetilação nas amostras de osteossarcoma avaliadas (Tabela 4).
Após análise dos resultados do estudo piloto, foram selecionados os 7
genes que estavam hipermetilados em pelo menos 30% das amostras
analisadas (AIM1, CALCA, CDH1, ESR1, HIC1, p14
ARF
e SFRP1) para
prosseguir no estudo e serem avaliados nas demais 21 amostras de
osteossarcoma incluídas no estudo.
52
Tabela 5 - Freqüência de hipermetilação dos 18 genes avaliados nas 13
amostras de osteossarcoma incluídas no estudo piloto.
Genes
Estudo piloto
n
(
%
)
HIC1
12 (92,0%)
CDH1
10 (76,0%)
CALCA
10 (76,0%)
SFRP1
8 (61,5%)
p14
ARF
8 (61,5%)
AIM1
4 (30,7%)
ESR1
4 (30,7%)
MLH1
3 (23,0%)
APC
3 (23,0%)
SOCS
3 (23,0%)
RARβ
2 (15,3%)
RASSF1A
1 (7,6%)
CDKN2A
0 (0,0%)
CCNA1
0 (0,0%)
GSTP1
0 (0,0%)
RB1
0 (0,0%)
DAPK
0 (0,0%)
THBS1
0 (0,0%)
53
4.3.2 Análise Total
Analisando as 34 amostras em conjunto, as freqüências de
hipermetilação dos 7 genes selecionados foram: CALCA (79,4%), SFRP1
(76,5%), HIC1 (76,5%), CDH1 (61,8%), AIM1 (38,2%), p14
ARF
(23,5%), e
ESR1 (14,7%) (Tabela 5)
Tabela 6 - Freqüência de hipermetilação dos 7 genes avaliados nas 34
amostras de osteossarcoma.
Genes
Analise Total
n
(
%
)
CALCA
27 (79,4%)
HIC1
26 (76,5%)
SFRP1
26 (76,5%)
CDH1
21 (61,8%)
AIM1
13 (38,2%)
p14
ARF
8 (23,5%)
ESR1
5 (14,7%)
4.4 CORRELAÇÃO ENTRE HIPERMETILAÇAO E CARACTERÍSTICAS
CLÍNICO-PATOLÓGICAS
O perfil de hipermetilação obtido para os 7 genes foi correlacionados
com as características clinico-patologicas dos 34 pacientes incluídos no
estudo.
A hipermetilação do gene CDH1 apresentou uma associação
significativa com a idade ao diagnóstico maior que 12 anos (p= 0,03) (Tabela
54
6). O gene p14
ARF
quando hipermetilado apresentou associação significativa
com a ausência de metástases (p=0,04) (Tabela 12).
Não foi possível detectar nenhuma outra associação significativa entre
o perfil de hipermetilação dos demais genes avaliados e as características
clínico-patológicas estudadas como sexo, sítio primário, tipo histológico,
presença de metástase ao diagnóstico, grau de HUVOS e recidiva (Tabelas
6, 7, 8, 9, 10, 11,12).
Tabela 7 - Associação entre hipermetilação do gene CDH1 e variáveis
clinico-patologicas.
Caracteristicas Não Metilado Metilado p*
idade < 12 anos
> 12 anos
12
9
2
11
0,03
sexo feminino
masculino
13
8
5
8
0,28
sitio fêmur
outros
13
5
5
8
0,29
tipo histológico osteoblastico
outros
14
4
7
4
0,43
metastase não
sim
17
4
7
6
0,13
Huvos I e II
III e IV
12
9
8
5
***
recidiva não
sim
10
11
6
7
***
*log-rank
55
Tabela 8 - Associação entre hipermetilacao do gene CALCA e variaveis
clinico-patologicas.
Caracteristicas Não Metilado Metilado p*
idade < 12 anos
> 12 anos
11
16
3
4
***
sexo feminino
masculino
11
20
5
4
0,2
sitio fêmur
outros
16
11
2
5
0,2
tipo histológico osteoblastico
outros
17
7
4
1
***
metastase não
sim
20
7
4
3
0,3
Huvos I e II
III e IV
17
10
3
4
0,4
recidiva não
sim
13
14
4
3
***
*log-rank
Tabela 9 - Associação entre hipermetilacao do gene SFRP1 e variaveis
clinico-patologicas.
Caracteristicas Não Metilado Metilado p*
idade < 12 anos
> 12 anos
11
15
3
5
***
sexo feminino
masculino
12
14
6
2
0,2
sitio fêmur
outros
16
10
2
6
0,1
tipo histológico osteoblastico
outros
17
6
4
2
***
metastase não
sim
20
6
4
4
0,1
Huvos I e II
III e IV
14
12
6
2
0,4
recidiva não
sim
14
12
2
6
0,2
*log-rank
56
Tabela 10 - Associação entre hipermetilacao do gene HIC1 e variaveis
clinico-patologicas.
Caracteristicas Não Metilado Metilado p*
idade < 12 anos
> 12 anos
12
14
2
6
0,42
sexo feminino
masculino
16
10
2
6
0,08
sitio fêmur
outros
15
11
3
5
0,27
tipo histológico osteoblastico
outros
14
4
7
4
0,43
metastase não
sim
20
6
4
4
0,19
Huvos I e II
III e IV
16
10
4
4
0,42
recidiva não
sim
13
13
3
5
0,69
*log-rank
Tabela 11 - Associação entre hipermetilacao do gene p14 e variaveis clinico-
patologicas.
Caracteristicas Não Metilado Metilado p*
idade
< 12 anos
> 12 anos
5
3
9
17
0,2
sexo
feminino
masculino
4
4
14
12
***
sitio
fêmur
outros
6
2
12
14
0,2
tipo histológico
osteoblastico
outros
6
1
15
7
0,6
metastase
não
sim
16
10
8
0
0,04
Huvos
I e II
III e IV
4
4
16
10
0,6
recidiva
não
sim
5
3
9
17
0,4
*log-rank
57
Tabela 12 - Associação entre hipermetilacao do gene AIM1 e variaveis
clinico-patologicas.
Caracteristicas Não Metilado Metilado p*
idade
< 12 anos
> 12 anos
7
6
7
14
0,2
sexo
feminino
masculino
7
6
11
10
***
sitio
fêmur
outros
8
5
10
11
0,4
tipo histológico
osteoblastico
outros
10
2
11
6
0,4
metastase
não
sim
10
3
14
7
0,7
Huvos
I e II
III e IV
7
6
13
8
0,7
recidiva
não
sim
7
6
9
12
0,7
*log-rank
Tabela 13: Associação entre hipermetilacao do gene ESR1 e variaveis
clinico-patologicas.
Caracteristicas Não Metilado Metilado p*
idade
< 12 anos
> 12 anos
3
2
11
18
0,6
sexo
feminino
masculino
2
3
16
13
0,6
sitio
fêmur
outros
1
4
17
12
0,1
tipo histológico
osteoblastico
outros
3
2
18
6
0,59
metastase
não
sim
4
1
20
1
***
Huvos
I e II
III e IV
4
1
16
13
0,37
recidiva
não
sim
2
3
14
15
***
*log-rank
58
A análise das sobrevidas globais em 5 anos realizadas pelo método de
Kaplan-Meier e comparadas pelo teste de log-rank não identificou nenhuma
associação significativa com o perfil de hipermetilação dos 7 genes
investigados (Figuras 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22). Entretanto, embora a
diferença na sobrevida global entre os paciente com e sem hipermetilação do
gene ESR1 não seja significativa (p=0,058), os pacientes com ESR1 metilado
parecem ter um pior prognóstico quando comparados com os portadores de
osteossarcoma com ESR1 não-metilado (Figura 22)
1501209060300
meses
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Sobrevida
SG 5anos67%
SG 5anos= 58%
CDH1
não-metilado
metilado
Figura 16 - Sobrevida global – Gene CDH1: metilado 67% x não-metilado
58% (p=0,942).
1501209060300
meses
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
SG 5anos=69%
Sobrevida
SG 5anos=57%
CALCA
não-metilado
metilado
Figura 17 - Sobrevida global – Gene CALCA: metilado 69% x não-metilado
57% (p=0,966)
59
1501209060300
meses
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Sobrevida
SG 5anos 57%
SG 5anos=67%
F
SFRP1
não-metilado
metilado
Figura 18 - Sobrevida global – Gene SFRP1: metilado 67% não-metilado
57% ( p=0,860)
1501209060300
meses
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Sobrevida
SG 5anos=49%
SG 5anos=67%
HIC1
não-metilado
metilado
Figura 19 - Sobrevida global – Gene HIC1: metilado 67% x não-metilado
49% ( p=0,712)
1501209060300
meses
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
SG 5anos=87%
Sobrevida
p14
não-metilado
metilado
SG 5anos=54%
Figura 20 - Sobrevida global – Gene p14: metilado 87% x não-metilado 54%
( p=0,390)
60
1501209060300
meses
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Sobrevida
SG 5anos=70%
SG 5anos=60%
AIM1
não-metilado
metilado
Figura 21 - Sobrevida global – Gene AIM1: metilado 70% x não-metilado
60% ( p=0,391)
1501209060300
meses
1.0
0.8
0.6
0.4
0.2
0.0
Sobrevida
SG 5anos=60%
SG 5anos=30%
ESR1
não-metilado
metilado
Figura 22 - Sobrevida global – Gene ESR1: metilado 60% x não-metilado
30% ( p=0,058)
61
5 DISCUSSÃO
Neste estudo foi analisado o perfil de metilação de 18 genes em
amostras de osteossarcoma sem tratamento quimioterápico prévio, sendo
este o maior número de genes avaliados em osteossarcoma até o momento
até o momento.
Apesar do osteossarcoma ser o mais freqüente tumor ósseo em
crianças e adolescentes, os tumores ósseos são raros e correspondem a
0,2% de todos os cânceres o que dificulta a obtenção de amostras de tecido
tumoral fresco e congelado pré-tratamento quimioterápico.
Mesmo com uma casuística de 34 pacientes, o perfil de pacientes
descritos neste estudo não difere do observado em outros estudos
publicados. Em nosso estudo a idade média dos pacientes foi de 13,5 anos o
que coincide com o período de maior incidência deste tipo tumoral (2ª década
de vida). Não houve diferença de acometimento entre os sexos. A grande
maioria dos pacientes apresentava comprometimento de ossos longos,
especialmente fêmur e tíbia. O tipo histológico mais freqüente foi o
osteoblástico. Em nosso estudo 29,4% dos pacientes eram metastáticos ao
diagnóstico e 52,9% dos paciente apresentaram recidiva da doença após
tratamento quimioterápico de primeira linha. A sobrevida global em 5 anos
para todo o grupo foi de 64%. Conforme esperado, as variáveis clinico-
patologicas que apresentaram impacto estatisticamente significativos na
sobrevida foram a presença de metátases, recidiva tumoral após tratamento
62
primário e grau de necrose. Idade, sexo, tipo histológico e sitio tumoral
primário não apresentaram impacto na sobrevida.
Em um estudo realizado pelo grupo italiano, o qual reuniu 300
pacientes com diagnóstico de osteossarcoma de extremidades não
metastático tratados no Instituto Rizzoli entre setembro de 1986 e dezembro
de 1992, mostrou que 56% dos pacientes eram do sexo masculino e 44% do
sexo feminino, a idade média foi de 15 anos (mediana de 15,9 anos), o sítio
primário mais freqüentemente acometido foi fêmur (52%) seguido por tíbia
(30%), úmero (11%) e fíbula (5%) e o diagnóstico do subtipo osteoblástico foi
feito em 65% dos pacientes. Em relação o grau de necrose (grau de HUVOS)
68% dos pacientes foram classificados como bons respondedores (HUVOS
III e IV) enquanto 32% dos pacientes foram classificados como pobres
respondedores (HUVOS I e II). As variáveis clínicas que influenciaram a
sobrevida livre de eventos em 8 anos foram idade (< 12 anos 48% x 12 anos
63%, p=0,04), nível de DHL (alto = 51% x baixo ou normal = 63%, p=0,04),
resposta histológica (HUVOS III e IV 63% x HUVOS I e II 52%, p=0,01) e
tamanho tumoral ( < 150mL 68% x > 150mL 53%, p=0,002) (FERRARI et al.
2001).
O grupo cooperativo europeu de estudos de tumores ósseos (COSS)
analisou 1.702 pacientes entre 1980 e 1998. A idade média foi de 15 anos,
59% dos pacientes eram do sexo masculino e 41% do sexo feminino, o sítio
primário mais freqüente foi fêmur (49,7%), seguido por tíbia (26,4%) e úmero
(10%) e o tipo histológico mais freqüente foi osteoblástico. Metástase foi
encontrada em 12,4% dos pacientes e destes o pulmão foi o sítio metastático
63
mais freqüente (86%). Em relação o grau de necrose (grau de HUVOS),
55,6% dos pacientes apresentou boa resposta ao tratamento quimioterápico
neoadjuvante. De todos os pacientes do estudo, 32% apresentaram recidiva
local ou a distancia (BIELACK et al. 2002). A sobrevida global em 5 anos foi
de 65% e os fatores que apresentaram impacto na sobrevida foram sítio
primário em extremidades quando comparados com tumores localizados em
esqueleto axial (54% x 19% p=0,0001), presença de metástases ao
diagnóstico (15% x 58%, p=<0,0001) e resposta histológica ao tratamento
quimioterápico neoadjuvante (38% x 67% , p=0,0001) (BIELACK et al. 2002).
O Grupo Brasileiro para Tratamento de Osteossarcoma (BOTG)
avaliou 225 pacientes entre 1991 e 1999 (Estudo III -1991 a 1996 e Estudo
IV-1996 a 1999). A média de idade dos pacientes foi de 14 anos e 56% eram
do sexo masculino. Os sítios primários mais freqüentes foram fêmur (56%),
tíbia (29,8%), úmero (9,3%) e fíbula (2,7%). Aproximadamente 21% dos
pacientes eram metastáticos ao diagnóstico e o pulmão foi o sítio mais
freqüente de metástase (78%). De todo o grupo, 70,6% dos pacientes
apresentou pobre resposta ao tratamento quimioterápico neoadjuvante e 44%
dos pacientes apresentaram recidiva tumoral. A sobrevida global em 5 anos
para todo o grupo foi de 50%. A variáveis clinicas que tiveram impacto
significativo na sobrevida global em 5 anos foram presença de metástases ao
diagnóstico (60% x 12%, p=0,001), grau de resposta histológica ( I=44%,
II=48%, III=77% e IV=68%, p=0,005). Outras variáveis que apresentaram
impacto na sobrevida foram tipo de cirurgia realizada e tamanho tumoral
64
(PETRILLI et al. 2006), porém estas variáveis não foram avaliadas no
presente estudo.
Deste modo, podemos inferir que a casuística analisada neste estudo
apresenta características clínico-patológicas semelhantes aos de outros
estudos publicados por importantes grupos envolvidos no tratamento de
osteossarcoma na faixa etária pediátrica. Ou seja, apesar do pequeno
tamanho da casuística analisada (n = 34), os achados deste estudo devem
ser confiáveis, pois os casos incluídos neste estudo representam uma fiel
amostragem dos portadores desta neoplasia.
Como já citado anteriormente, a raridade dos tumores ósseos dificulta
a obtenção de amostras de tecido tumoral fresco e congelado pré-tratamento
quimioterápico. Além desta dificuldade de obtenção de material, a extração
de DNA a partir deste tipo de tecido também é um fator limitante neste tipo de
estudo.
A casuística inicial deste estudo era de 60 amostras, um número
expressivo, principalmente quando levamos em consideração os demais
estudos encontrados na literatura referentes à análise de hipermetilação em
osteossarcoma. Porém de apenas 56% das amostras (34 amostras) se
conseguiu obter DNA de boa qualidade (quantificação adequado e
amplificação do fragmento do gene BRCA1 de 283pb) e foram estas as
amostras analisadas no estudo. Com isso, a casuística analisada foi
semelhante a de outros estudo de hipermetilação em osteossarcoma.
Análises estatísticas mostraram não haver diferenças significantes entre a
65
casuística inicial (n = 60) e aquela efetivamente analisada (n = 34) no tocante
à variáveis categóricas e não-categóricas.
Devido a escassez de material, optou-se por realizar inicialmente um
estudo piloto onde se analisou o perfil de metilação dos 18 genes em um
subgrupo de amostras (n = 13) das quais tinha-se obtido uma quantidade
razoável de DNA (pelo menos 6g). Uma análise comparativa demonstrou
que as características clínico-patológicas deste subgrupo de pacientes(n=13)
excluídos não deferiam do grupo total de amostras analisadas , portanto,
nenhum viés foi introduzido por esta abordagem adotada. Através deste
estudo foram selecionados os 7 genes mais frequentemente metilados para
serem analisados no restante da casuística (n = 21).
A grande maioria dos estudos que tentam correlacionar o perfil de
metilação em amostras de osteossarcoma com os aspectos cínicos da
doença utilizaram a técnica de MSP-convencional. Esta é uma técnica que
permite apenas a análise qualitativa do perfil de metilação e apresenta um
certo grau de subjetividade na interpretção dos dados. Em nosso estudo
utilizamos um método quantitativo (QMSP) na análise do perfil de metilação
em osteossarcoma, que apresenta maior sensibilidade e acurácia para a
análise do perfil de metilação, pois permite a detecção de um alelo metilado
em meio a 10.000 alelos não metilados e também observamos uma redução
da subjetividade na análise dos resultados, pois apenas as amostras que
apresentarem uma curva de amplificação são consideradas positivas (EADS
et al. 2000).
66
Este estudo avaliou o perfil de metilação de 18 genes em amostras de
osteossarcoma e identificou os genes CALCA SFRP1, HIC1, CDH1, AIM1,
p14
ARF,
ESR1 como sendo os genes mais freqüentemente metilados (pelo
menos 30%) nesta neoplasia. Dos 18 genes incluídos neste estudo, 12 jamais
haviam sido avaliados em osteossarcoma (AIM1, APC, CALCA, CCNA1,
CDH1, ESR1, GSTP1, MLH1, THBS1, RARβ, SOCS1 e SFRP1). Por outro
lado, existem relatos na literatura sobre o perfil de hipermetilação dos genes
CDKN2A, DAPK, HIC1, RASSF1A, p14
ARF
e RB1, em amostras de
osteossarcoma.
O CDKN2A, localizado no lócus 9p21, é um gene supressor de tumor
que induz a parada do ciclo celular em G1 pela inibição da fosforilação da
proteína RB1 (BADAL et al. 2007). BENASSI et al. (2001) analisaram 21
amostras de osteossarcoma através de MSP convencional e encontraram
metilação de CDKN2A em 57% das amostras. Por outro lado, HARADA et al.
(2002), analisando 11 casos de osteossarcoma, encontraram o gene
CDKN2A metilado em apenas 9% das amostras. Os nossos dados são
concordantes com os de Harada e colaboradores, pois, em nenhuma das 34
amostras de osteossarcoma avaliadas, foi detectada a metilação deste gene.
OH et al. (2006) que, analisando o perfil de hipermetilação da região
promotora do gene p14
ARF
em 32 amostras de osteossarcoma através da
técnica de MSP convencional, demonstraram que a metilação deste gene
estava presente em 47% das amostras e este fato correlacionou-se com
uma pior sobrevida dos pacientes (não metilado SG 79% x metilado SG
31%, p=0,03). Os resultados do nosso estudo diferem deste, pois o gene
67
p14
ARF
se mostrou hipermetilado em 23,5% das amostras avaliadas e foi
possível encontrar uma correlação estatisticamente significativa entre o nível
de metilação deste gene e a ausência de metástases ao diagnóstico
(p=0,04). Ou seja, a hipermetilação deste gene parece estar correlacionada
com um melhor prognóstico para os pacientes de osteossarcoma.
Existemrelatos na literatura de estudos com outros tipos tumorais que
também identificaram a hipermetilação de p14
ARF
como fator de bom
prognóstico. Por exemplo, SAILARSREE et al. (2008) analisaram 116
amostras de pacientes com carcinoma oral e concluíram que a metilação do
gene p14
ARF
relaciona-se com a baixa taxa de recorrência local e melhor
prognóstico quando comparados com pacientes que não apresentavam
hipermetilação deste gene.
Ao proteína codificada pelo gene RASSF1A, localizado no lócus
3p21.3, induz a parada do ciclo celular através da interação com a proteína
de reparo XPA e inibição do acúmulo de ciclina D1. LIM et al. (2003)
analisaram 10 casos de osteossarcoma e encontraram metilação do gene
RASSF1A em 80% das amostras, enquanto que, HOU et al. (2006),
analisando 30 casos desta neoplasia óssea, detectaram metilação deste
mesmo gene em apenas 14% das amostras. Os nossos dados são similares
aos descritos por este segundo grupo, pois em nosso estudo piloto o gene
RASSF1A apresentou-se metilado em 7% das amostras analisadas.
No estudo realizado por PATIÑO-GARCÍA et al. (2002) foram
analisadas 27 amostras de ostessarcoma e o gene RB1 mostrou-se metilado
em 14% das amostras. GUERRERO et al. (2004) analisaram as alterações
68
moleculares encontradas em diversos genes implicados na gênese do
osteossarcoma em 29 amostras de tecido tumoral ósseo, sendo que, em
nenhuma das amostras o gene RB1 apresentou-se metilado. Os nossos
resultados demonstraram que o gene RB1 também não estava metilado em
nenhuma das amostras analisadas. Já e bem definido na literatura a
importância do gene RB1 na tumorigênese do osteossarcoma, porém os
dados de hipermetilção sugerem que este não deva ser o mecanismo
responsável pelo silenciamento deste gene nesta neoplasia.
O gene HIC1 é um gene supressor de tumor e esta localizado no
locus 17p13.3. RATHI et al. (2004) analisaram o perfil de metilação deste
gene HIC1 em 157 casos de tumores pediátricos e encontraram
hipermetilação em 17% dos casos de osteossarcoma avaliados (2 casos em
12 amostras). Em nosso estudo o gene HIC1 foi encontrado metilado em
76,5% das amostras tumorais, possivelmente isto pode ser explicado pela
maior sensibilidade da técnica utilizada em nosso estudo (QMSP) pois no
estudo referido a técnica utilizada foi MSP convencional. Além disso, os
autores não descrevem quais nucleotídeos CG foram analisados, por isso
não se pode ter certeza que a mesma região foi analizada em ambos os
estudos.
HOU et al. (2006) analisaram o perfil de metilação de 5 genes de 30
amostras de osteossarcoma e margens cirúrgicas através de QMSP. Os
genes RASSF1A, TIMP3, MGMT, DAPK e CDKN2A foram encontrados
diferencialmente metilados em tecidos tumorais quando comparados com
tecidos normais (margens cirúrgicas). Estes autores não fizeram uma análise
69
individual da metilação de cada gene, mas agruparam as amostras em
metiladas e não-metiladas. Desta forma conseguiram demonstrar uma
diferença estatisticamente significativa entre a presença de DNA metilado e
a presença de metastases (p<0,01).
Dentre os genes que apresentaram uma porcentagem significativa de
metilação nas amostras avaliadas no nosso estudo estão os genes CALCA,
SFRP1, CDH1 e o AIM1. Entretanto, não houve correlação significativa entre
a hipermetilação destes genes e as variáveis clinico-patológicas analisadas.
O gene CALCA que codifica uma proteína chamada calcitonina, cuja
função é a redução dos níveis séricos de cálcio, efeito oposto ao do
hormônio da paratireóide. Este gene encontrou-se metilado em 79,4% das
amostras, porém não houve nenhuma correlação significativa com as
variáveis analisadas.
Outro gene com alta freqüência de hipermetilação (76,5%) foi o
SFRP1, que atua como antagonista da via Wnt (BHAT et al. 2007). Alguns
estudos descrevem este gene como hipermetilado em câncer gástrico e
intestinal (SUZUKI et al. 2000).
O gene CDH1 codifica a proteína de adesão celular E-caderina. A
redução da expressão deste gene esta relacionado com a perda de adesão
celular, com conseqüente invasão celular e metástases. Em nosso estudo
este gene foi encontrado como hipermetilado em 61,8% das amostras.
O gene AIM1 (hipermetilados em 38,2% das amostras avaliadas)
apresenta função supressora de tumor e relaciona-se com o citoesqueleto
celular.
70
O gene ESR1, localizado no locus 6q25. 1, codifica o receptor de
estrógeno 1, uma proteína com seis domínios funcionais, com duas regiões
com atividade transcripcional. Este receptor pode iniciar ou intensificar a
transcrição de genes responsivos ao estímulo estrogênico.
O estrógeno tem papel multifuncional, influenciando o crescimento,
diferenciação e função de diversos tecidos. No tecido ósseo, o estrógeno
tem importante papel na regulação do crescimento ósseo durante a
puberdade e remodelamento ósseo no individuo adulto (STOSSI et al. 2004).
Alguns autores têm sugerido que o efeito estrogênico mediado pelo ESR1
está envolvido com a mineralizaçao óssea e a deleçao homozigótica deste
gene esta associada com severa osteoporose e aumento do turn-over ósseo
(LIMA et al. 2004). Além disto, vários estudos tem demonstrado a presença
destes receptores em osteoblastos e osteoclastos, porém com atividades
distintas (BORD et al. 2001).
Um achado relevante em nosso estudo foi a associação do nível de
metilaçao do gene receptor de estrógeno 1 (ESR1) com o prognóstico dos
pacientes. Este gene encontrou-se metilado em 14,7% das amostras
analisadas e podemos observar que quando ESR1 encontrava-se metilado a
sobrevida global em 5 anos é pior (não-metilado 60% x metilado 30%, p=
0,058). Apesar desta diferença não ser estatisticamente significativa, as
curvas de sobrevida mostram uma clara tendência de separação dos dois
grupos e, por isso acreditamos que a falta de significância se deva ao
reduzido tamanho da casuística
71
CASAS-GANEM et al. (2005) analisaram 110 pacientes com
diagnóstico de osteossarcoma e concluíram que aqueles que expressavam
receptor de estrógeno 1 (ESR1) apresentavam doença localizada e melhor
sobrevida. Em adição, concluíram neste estudo que altos níveis de ESR1
inibiam proliferação celular.
Já foi demonstrado que a hipermetilacao deste gene pode ser um
importante mecanismo de repressão transcricional e silenciamento gênico
(Issa et al., 1994). Portanto, os nossos resultados concordam com os
achados de Casas-Ganem e colaboradores, pois, os pacientes em que
ESR1 não esta metilado, devem expressar este receptor e, assim como
reportado por aqueles autores, apresentam um melhor prognóstico.
Nossos dados sugerem que o receptor de estrógeno 1 (ESR1) pode
ser utilizado como um marcador prognóstico para o osteossarcoma. Pode-se
imaginar que testes pré-operatórios possam ser realizados e, quando este
gene estiver hipermetilado, a terapêutica deverá ser intensificada para que
sejam alcançadas maiores taxas de cura, com melhora da sobrevida.
Entretanto, a avaliação de um número maior de casos é imprescindível para
uma melhor elucidação e confirmação destes achados. Entretanto, a
avaliação de um número maior de casos torna-se necessária para uma
melhor elucidação e confirmação deste achado.
72
6 CONCLUSÕES
1 Os genes mais frequentemente metilados em osteossarcoma são
CALCA (79%), SFRP1 (76%), HIC1 (76%), CDH1 (61%), AIM1 (38%),
MLH1 (26%), p14
ARF
(23%) THBS1 (14%) e ESR1 (14%).
2 A hipermetilação do gene CDH1 apresentou uma associação
significativa com a idade ao diagnóstico maior que 12 anos (p= 0,03)
3 A hipermetilação da região promotora do gene p14
ARF
apresentou
associação estatisticamente significativa com ausência de metástases
ao diagnóstico (p=0,04).
4 A hipermetilação do gene ESR1 realcionou-se com uma pior
sobrevida global dos pacientes analisados (p=0,058).
73
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osteossarcoma. Cancer Genet Cytogenet 2001; 130:14-21.
ANEXO
Anexo 1 - Quadro de nível de metilação das 34 amostras.
cdh1 thbs1 calca mlh1 sfrp1 hic1 p14 Aim esr1
1 0,000 0,000 5,726 2,809 0,000 24,398 0,000 0,000 0,000
2 0,000 0,000 0,000 0,000 0,000 44,441 0,000 6,267 0,000
3 4,776 0,000 4,417 0,174 2,396 100,000 0,000 0,000 0,000
4 0,050 0,000 2,426 0,048 0,000 100,000 0,000 0,000 0,000
5 0,103 0,000 0,000 0,000 1,564 53,471 0,477 7,487 0,047
6 1,003 0,001 100,000 0,000 3,792 100,000 1,739 0,000 0,000
7 0,000 0,000 0,813 0,000 2,279 0,000 0,000 0,000 0,000
8 1,049 0,029 15,209 0,000 1,860 31,460 7,893 0,081 0,000
9 0,000 0,000 0,000 0,000 16,318 1,945 0,000 5,296 0,000
10 0,642 0,024 0,000 0,000 4,703 0,000 1,107 6,695 0,010
11 0,000 0,000 100,000 0,000 58,287 0,000 0,000 30,340 0,000
12 0,401 0,000 63,761 3,379 2,164 11,358 0,000 28,458 0,000
13 0,000 0,000 38,468 5,908 100,000 0,000 0,000 0,000 100,000
14 0,000 0,000 3,910 0,000 1,978 0,000 0,000 12,518 0,000
15 0,780 1,596 13,946 0,000 1,226 0,810 0,054 0,284 0,000
16 35,165 0,142 8,022 0,000 19,503 59,004 0,000 26,164 0,000
17 0,228 0,112 20,932 0,000 0,513 63,104 0,054 0,068 0,000
18 3,867 0,001 30,905 0,000 0,000 100,000 0,280 12,27 0,000
19 0,000 0,000 52,368 0,000 100,000 0,000 0,000 0,000 0,000
20 0,000 0,000 2,161 0,000 0,012 1,269 0,000 0,000 0,000
21 0,000 0,000 29,724 0,000 5,165 18,795 0,000 0,231 0,000
22 33,533 0,000 14,332 0,646 1,838 64,504 0,000 0,000 0,000
23 3,019 0,897 11,686 0,001 3,921 44,791 0,055 0,000 0,686
24 1,048 0,000 0,580 0,000 0,000 42,254 0,138 0,000 0,000
25 0,000 0,023 4,182 0,000 0,676 83,710 0,000 0,003 43,12
26 0,375 0,000 0,490 0,000 10,661 0,000 0,000 41,44 0,000
27 1,687 0,094 4,049 0,000 0,048 49,811 0,000 0,000 0,000
28 2,458 0,040 0,774 0,000 0,466 1,350 0,000 0,012 0,000
29 0,232 0,007 2,877 0,000 5,670 26,340 0,393 0,000 0,039
30 0,865 0,002 0,757 34,735 0,763 85,527 0,584 0,000 100,0
31 1,377 0,000 100,000 0,119 4,421 100,000 0,000 100,0 0,058
32 0,000 0,000 83,053 16,179 100,000 0,000 0,000 0,000 0,000
33 0,616 0,000 26,329 0,140 20,752 100,000 0,000 0,000 100,0
34 0,231 0,519 2,901 0,000 0,060 84,211 0,003 0,000 0,003
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