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Universidade Federal de Goiás
Instituto de Ciências Biológicas
Mestrado em Ciências Biológicas
(Minter FESURV/UFG)
Avaliação do efeito de tunicamicina na glicosilação, secreção, estabilidade e
atividade da enzima α-amilase produzida por Cryptococcus flavus
Aluno: Manoel Cardoso de Barros
Orientador: Dr. Cirano José Ulhoa
Trabalho de conclusão apresentado à
Universidade Federal de Goiás, como parte
das exigências para obtenção do título de
Mestre em Biologia Molecular e Celular.
Goiânia
2007
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Universidade Federal de Goiás
Instituto de Ciências Biológicas
Mestrado em Ciências Biológicas
(Minter FESURV/UFG)
Avaliação do efeito de tunicamicina na glicosilação, secreção, estabilidade e
atividade da enzima α-amilase produzida por Cryptococcus flavus
Aluno: Manoel Cardoso de Barros
Orientador: Dr. Cirano José Ulhoa
Trabalho de conclusão apresentado à
Universidade Federal de Goiás, como parte
das exigências para obtenção do título de
Mestre em Biologia Molecular e Celular.
Goiânia
2007
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DEDICATÓRIA
Primeiramente a Deus, que me concedeu a vida e ricamente tem
abençoado essa minha trajetória terrena. Possibilitando-me a viver esta etapa tão
importante de minha vida familiar, profissional e acadêmica. Ao senhor Deus, toda
honra, gloria e louvor.
A nossa Senhora Aparecida do qual sou devoto, ela que sempre foi e será
minha intercessora junto ao pai eterno.
Ao meu querido e saudoso pai Valdomiro Cardoso (in memorian) e minha
querida e saudosa mãe Maria Firmina de Barros (in memorian) por ter me
concebido biologicamente a vida, e pelo apoio e preocupação na orientação de
minha formação desde os primórdios de minha existência. Inesquecíveis e
presentes em minha vida.
Ao meu querido, inesquecível e saudoso amigo Ronaldo Lacerda (in
memorian) pelo incentivo nos momentos iniciais desse processo de
aprimoramento no mestrado, inclusive me acompanhando na UFG na ocasião em
que consegui a carta de orientação com o meu estimado orientador.
AGRADECIMENTOS
A minha família: esposa Romilda, filhos Will, sua esposa e minha nora
Franciely, minhas netinhas Ana Beatriz e Maria Luiza, e Bruno Cleyton sua
esposa e minha nora Pauliany, minha neta Lara e o netinho Arthur, pelo
incondicional apoio.
Dedicação, compreensão e estímulo nos momentos de maior turbulência
nesse período de estudo, principalmente nos momentos de minhas ausências
periódicas. Com cada um de vocês quero dividir esta conquista que culmina em
uma maiúscula e tão ímpar vitória. Em nossas vidas.
Ao meu estimado irmão Ademar Cardoso o responsável direto pela minha
formação inicial escolar, pois, foi o meu primeiro professor, ainda na década da
cartilha. Sendo ainda o responsável direto pela minha formação profissional e
acadêmica.
A estimada família, Barreto e sua esposa, minha cunhada, Comadre Ana,
minhas queridas e inesquecíveis sobrinhas, Anielia e Mirella, pelo incondicional
apoio pelas hospedagens contínuas e periódicas, onde sempre me sinto em casa,
com vocês compartilho está vitória.
Ao meu amigo, sempre amigo Prof. Arnaldo Evangelista pela confiança
que depositou em mim quando eu mais necessitei, inclusive foi o responsável
direto pelo meu ingresso profissional na rede particular de ensino de Rio Verde-
Go, pelo estímulo nessa jornada de estudo do mestrado.
Ao casal de compadres o Diácono Messias e minha comadre Abadia,
pela concreta e consolidada amizade, e apoio em todos os momentos de nosso
relacionamento e convivência mútua, pelos sinceros incentivos para o meu
aprimoramento profissional.
AGRADECIMENTOS MUITO ESPECIAIS
Ao Prof. Dr. Cirano Ulhoa, detentor da mais alta expoência de
conhecimento no campo da pesquisa cientifica e tecnológica pela sua ilibada
conduta ética, moral e humana, proporcionou-me o maior dos privilégios ao
conceder-me a carta de orientação.
Obrigado, muitíssimo obrigado, pela orientação sabia, paciente, gradual,
progressiva e pela conduta rigorosa de ensinamento sob a qual enriqueci
substancialmente meus conhecimentos no campo cientifico.
Ao particular amigo Prof.: Roberto Nascimento Silva, pela imensurável
colaboração em cada momento, em cada etapa desta trajetória de estudos,
pesquisas e experimentos.
Muitíssimo obrigado Roberto pelo incondicional apoio técnico, humano e
científico.
Ao Prof. Dr.: Paulo Eustáquio magnífico reitor da Universidade de Rio
Verde - FESURV. Pelo apoio direto e indireto na consolidação desse projeto, pois,
sua gestão administrativa priorizou um dos pontos essenciais que é a qualificação
e o aprimoramento profissional e intelectual do corpo docente, culminando na
parceria da FESURV/UFG possibilitando-me este momento de vitória e de
conquista.
Obrigado!!!
Ao Prof.: Aildo R. de Miranda, pela disponibilidade incondicional do
almoxarifado técnico e dos laboratórios 09 e 10 do Bloco II da FESURV. Para que
possibilitasse execução de experimentos realizados em Rio Verde.
Obrigado Amigo!!!
Aos técnicos Dalton e Carmem Bonini dos Lab. 9 e 10 respectivamente,
pelo suporte e auxílio técnico sempre que foi necessário.
Ao pessoal do Laboratório de Enzimologia do ICB 2 da UFG, mais
conhecido Laboratório do Cirano. De modo muito especial a “Val” que com seu
rigor técnico e científico muito colaborou para que as repetições fossem as
menores possíveis e os resultados os melhores possíveis. Ao Andrei com sua
juventude promissora ao ingresso no campo da Pesquisa Cientifica, pela a ajuda,
sábia e paciente que a mim dispensava sempre que tinha dúvidas. Ao Roberto
que incansável no auxílio aos manuseios dos equipamentos para que os
resultados obtidos registrassem o máximo de exatidão.
Obrigadão mesmo.!!!
Ao professor Araripe e toda sua equipe do laboratório de Biologia
Molecular da UNB pela acolhida e contribuição nos resultados deste meu
trabalho, onde por algumas semanas estive purificando essa sutil enzima amilase.
Obrigado!!!
A Prof.ª Dr.ª Maria Dolores pró-reitora de Pesquisa e Pós-graduação da
FESURV. Pelo apoio e atenção todas as vezes que a procurei.
A cada um dos Professores e Professoras da UFG que ministram as aulas
nos módulos teóricos.
Pela bagagem de conhecimentos que estão sabiamente transmitidos a
mim.
Aos colegas do programa Minter FESURV/UFG pelo companheirismo e a
ajuda recíproca.
A todos que de modo direto ou indireto colaborou comigo para que esse
projeto de aprimoramento pudesse ser consolidado.
Muitíssimo Obrigado!
7
ÍNDICE
LISTA DE FIGURAS .............................................................................................. 9
RESUMO.............................................................................................................. 11
ABSTRACT .......................................................................................................... 12
1.1. Leveduras e o gênero Cryptococcus............................................................. 13
1.2. A estrutura do amido ..................................................................................... 15
1.2.1. Hidrólise Ácida do Amido ........................................................................... 16
1.2.2. Processamento Enzimático do Amido........................................................ 17
1.3. Classificação das amilases ........................................................................... 18
1.3.1. α-Amilases ................................................................................................. 18
1.3.2. β-amilases .................................................................................................. 18
1.3.3. Glucoamilase.............................................................................................. 19
1.3.4. Pululanase.................................................................................................. 19
1.3.5. α-D-Glucosidase ........................................................................................ 20
1.3.6. EXO-(1
4-α-D)glucanase ......................................................................... 20
1.3.7. Isoamilase .................................................................................................. 20
1.3.8. Ciclodextrinases ......................................................................................... 20
1.4. A importância das amilases........................................................................... 21
1.5. Glicosilação de proteínas .............................................................................. 23
2. OBJETIVOS ..................................................................................................... 27
2.1. Objetivos Gerais............................................................................................ 27
2.2. Objetivos Específicos .................................................................................... 27
3. MATERIAIS E MÉTODOS................................................................................ 28
3.1. Levedura utilizada e manutenção.................................................................. 28
3.2. Avaliação do efeito de tunicamicina no crescimento de C. flavus ................. 28
3.3. Cinética de produção da α-amilase produzida por C. flavus em meio líquido28
8
3.4. Avaliação do efeito da tunicamicina na secreção da
α-amilase por C. flavus
em meio líquido.................................................................................................... 29
3.5. Determinação da atividade amilolítica........................................................... 29
3.6. Extração de proteínas intracelular................................................................. 29
3.7. Dosagem de Proteínas.................................................................................. 30
3.8. Determinação da atividade amilolítica em gel de poliacrilamida ................... 30
3.9. Caracterização cinética da α-amilase produzida por C. flavus na ausência e
na presença de tunicamicina................................................................................ 30
3.9.1. Determinação do pH e temperatura ótimos e Termo estabilidade ............. 31
3.9.2. Determinação do K
M
e Vmáx...................................................................... 31
3.9.3. Efeito de íons e detergente aniônico na atividade de α-amilase ................ 31
4. RESULTADOS................................................................................................. 32
4.1. Avaliação do efeito de tunicamicina no crescimento de C. flavus ................. 32
4.2. Cinética de produção da α-amilase produzida por C. flavus em meio líquido
............................................................................................................................. 33
4.3. Avaliação do efeito da tunicamicina na secreção da α-amilase por C. flavus
em meio líquido.................................................................................................... 34
4.4. Caracterização cinética da α-amilase produzida por C. flavus na ausência e
na presença de tunicamicina................................................................................ 36
5. DISCUSSÃO .................................................................................................... 41
6. CONCLUSÕES ................................................................................................ 46
7. BIBLIOGRAFIA ................................................................................................ 47
9
LISTA DE FIGURAS
Figura 1. Polissacarídeos do amido. Estrutura da amilose, amilopectina e
esquema da ligação α-1,6 presente na molécula de
amilopectina.......................................................................................................
16
Figura 2. Classes de enzimas amilolíticas e respectivos mecanismo de
ação....................................................................................................................
21
Figura 3. Síntese do núcleo de oligossacarídeo das glicoproteinas durante o
processo de N-glicosilação................................................................................
24
Figura 4. Estrutura da tunicamicina....................................................................
25
Figura 5. Efeito da tunicamicina no crescimento de C. flavus em meio mínimo
contendo 2% de amido......................................................................................
32
Figura 6. Crescimento celular (A), Consumo de amido (B), proteínas totais
(C) e atividade enzimática (D) de α-amilase produzida por C. flavus crescido
em meio mínimo contendo 2% de amido na ausência () e na presença de
0,5 µg.mL
-1
de tunicamicina ().........................................................................
34
Figura 7. Avaliação do efeito de tunicamicina na atividade específica (A) intra
e extra celular e atividade em gel de poliacrilamida (B) das frações intra e
extra celular de α-amilase produzida por C. flavus em meio líquido.................
35
Figura 8. Determinação do efeito do pH na atividade de α-amilase produzida
por C. flavus em meio líquido mínimo contendo 2% de amido na ausência ()
e na presença de 0,5 µg.mL
-1
de tunicamicina ()............................................
36
Figura 9. Determinação do efeito da temperatura na atividade de α-amilase
10
produzida por C. flavus em meio líquido mínimo contendo 2% de amido na
ausência (
) e na presença de 0,5 µg.mL
-1
de tunicamicina ().......................
37
Figura 10. Determinação do efeito da temperatura na estabilidade de α-
amilase produzida por C. flavus em meio líquido mínimo contendo 2% de
amido na ausência () e na presença de 0,5 µg.mL
-1
de tunicamicina
().......................................................................................................................
38
Figura 11. Efeito da concentração do substrato na velocidade de reação da
α-amilase produzida por C. flavus em meio líquido mínimo contendo 2% de
amido na ausência () e na presença de 0,5 µg.mL
-1
de tunicamicina (). .....
39
Figura 12. Efeito de íons e SDS na atividade da α-amilase produzida por C.
flavus em meio líquido mínimo contendo 2% de amido na ausência e na
presença de 0,5 µg.mL
-1
de tunicamicina.........................................................
40
11
RESUMO
As leveduras são fungos amplamente distribuídos na natureza, podendo
ser encontrados em diferentes habitats. O gênero Cryptococcus inclui
aproximadamente 37 espécies dentre as quais somente o Cryptococcus
neoformans é patogênico. Recentemente uma levedura foi isolada a partir de
frutos do Cerrado Brasileiro e classificada como C. flavus com uma grande
capacidade de produção de α-amilase. As enzimas classificadas dentro do grupo
das amilases têm uma grande aplicação biotecnológica no aproveitamento do
amido como fonte de açúcares fermentáveis. Este trabalho teve como objetivo
analisar o efeito do antibiótico tunicamicina no processo de N-glicosilação,
durante a produção de α-amilase por C. flavus e seus possíveis efeitos na
secreção, atividade e estabilidade desta enzima. A tunicamicina exerceu uma
influência gradativa na inibição do crescimento de C. flavus, onde concentrações
acima de 1
µg.mL
-1
promoveu uma grande inibição no crescimento do fungo.
Durante a cinética de produção de amilase, as células não tratadas com
tunicamicina apresentaram uma taxa de crescimento de aproximadamente 20%
maior em relação as células tratadas com 0,5 µg.mL
-1
deste antibiótico. Entretanto
as células tratadas e não tratadas não apresentaram diferenças significativas
quanto o consumo de amido. A secreção de proteínas de células tratadas com
tunicamicina e com 18 horas de indução foi aproximadamente o dobro quando
comparadas com as células não tratadas. A tunicamicina exerceu um efeito na
atividade enzimática, com redução em aproximadamente 18% em relação ao
controle. Foi detectada uma maior atividade amilolítica intracelular na presença de
tunicamicina em relação ao controle. A caracterização cinética da enzima mostrou
que não houve diferença em termos de pH e temperatura ótima bem como
termoestabilidade. Porém, a enzima teve seu K
m
aumentado em quase duas
vezes e ficou mais sensível á ação dos íons Hg
+2
e Cu
+2
. Os resultados sugerem
que o processo de N-glicosilação pode influenciar a secreção e interferir na
estrutura da α-amilase produzida por C. flavus.
Palavras-chave: Cryptococcus flavus; α-amilase; glicosilação; tunicamicina.
12
ABSTRACT
Yeasts are fungi amply distribute in nature, can be found in different
habitats. The genus Cryptococcus includes 37 species within whom only
Cryptococcus neoformans is pathogenic. Recently one yeast was isolated from
Brazilian Cerrado fruits and classified as C. flavus with a high capacity of α-
amylase production. The enzymes classified within amylases group have a high
biotechnology application in starch improvement as fermentable sugars. This work
had as objective analyze the effect of antibiotic tunicamycin on the N-glicosylation
process during α-amylase production by C. flavus and its possible effects on
secretion, activity and enzyme stability. The tunicamycin exerted gradate influence
in growing inhibition of C. flavus where concentrations above1
µg.mL
-1
promoted a
significant inhibition on fungus growing.
During amylase kinetic production, cells none treated with tunicamycin had a
growth rate approximately 20% higher in relation to treated cells with 0.5 µg.mL
-1
of this antibiotic. However, treated and non treated cells did not show significant
difference while starch consume. The proteins secretion of treated cells with
tunicamycin and with 18 hours of induction was approximately double when
compared with treated cells. The tunicamycin exerted effect in enzymatic activity,
with reduction in 18% approximately in relation to control. It was detected a high
intracellular amylolytic activity in tunicamycin presence in relation control. The
kinetic characterization of enzyme showed that no difference in terms of optimum
pH and temperature and thermostability as well. However, the enzyme had
increasing in its K
m
almost twice and stayed more sensible to Hg
+2
and Cu
+2
ions
action. The results suggest that N-glicosylation process may influence the
secretion and interfere in structure of α-amylase produced by C. flavus.
Key-word: Cryptococcus flavus; α-amylase; glicosylation; tunicamycin.
13
1. INTRODUÇÃO
1.1. Leveduras e o gênero Cryptococcus
As leveduras são fungos que se apresentam predominantemente sob a
forma unicelular, podendo se reproduzir por esporulação, gemulação ou por
fissão. São classificadas de acordo com as características sexuais como
ascomicéticas ou ascoporógenas (esporos resultantes de cariogamia e meiose
em ascos), basidiomicéticas (esporos resultantes de cariogamia e meiose em
basídios) ou como pertencentes aos fungos imperfeitos (Deuteromycetes), e em
categorias menores baseado em características morfológicas, fisiológicas e
genéticas (Walker, 1999).
Estes microrganismos são amplamente distribuídos na natureza, podendo
ser encontrados em diferentes habitats. A maior parte das espécies descritas é
saprófita, mas algumas são parasitas e dependem de um hospedeiro para sua
sobrevivência. As plantas são um excelente nicho para uma grande variedade de
leveduras que normalmente encontram-se associadas aos nutrientes solúveis,
principalmente açúcares dos frutos.
As leveduras têm um grande significado econômico e social na cultura dos
seres humanos, pois vêm sendo utilizadas na produção de bebidas alcoólicas e
pães durante séculos. Certamente estes foram os primeiros produtos
biotecnológicos produzidos pelo homem. Atualmente sua importância é ainda
maior, pois são utilizadas em inúmeros processos fermentativos tanto para
produção de etanol combustível, na produção de alimentos e de diferentes
fármacos usados na prevenção e no tratamento de doenças humanas. Estes
organismos vêm sendo utilizados também como modelo celular para estudar os
processos bioquímicos e metabólicos das células eucarióticas. Entretanto,
encontramos várias espécies de leveduras que são patogênicas, principalmente
14
para os seres humanos. Exemplos incluem Blastomyces dermatidis, Cândida
albicans, Cryptococcus neoformans, Histoplasma capsulatum e Trichosporon
beigelli (Walker, 1999).
Embora os dados da literatura apresentem cerca de 150 espécies de
leveduras sendo capazes de utilizar amido como fonte de carbono, pouco se sabe
sobre enzimas produzidas por estes organismos (Walker, 1999; Moranelli et al,
1987). Dentre as leveduras estudadas, aquelas da espécie Saccharomyces
cerevisae mostraram se as mais eficientes em produzir etanol a partir de açúcares
simples, pois possuem um sistema fermentativo bem desenvolvido, mas não
conseguem degradar o amido, que para ser utilizado como fonte de açucares
fermentáveis, precisa ser hidrolisado previamente por agentes químicos ou
enzimáticos.
Atualmente existe um grande interesse da comunidade cientifica em
melhorar a capacidade amilolítica destas espécies, pela adição de genes de
amilases advindos de outras espécies de levedura ou mesmo de outros
microrganismos (Forgaty & Kelly, 1990; Moraes et al., 1999 Walker, 1999). Esta
estratégia poderá trazer benefícios tais como: simplificação dos estágios que
precedem a fermentação, aumento da eficiência na conversão do amido e
eliminação da etapa de adição de enzimas amilolíticas no processo (Tubb, 1986;
Tubb & Hammond, 1987). Na verdade, o objetivo dos pesquisadores é gerar uma
cepa de levedura amilolítica que tenha capacidade de produzir etanol em um
único processo, enzimas amilolíticas e xaropes entre outros produtos
biotecnológicos através de substratos contendo amido. (Steyn & Pretorius 1990).
Recentemente, Wanderley et al. (2004) do grupo de Enzimologia da UFG
estudou uma levedura isolada a partir de frutos do Cerrado Brasileiro pelo grupo
de Biotecnologia do laboratório de Biologia Molecular/UNB e que foi classificada
como C. flavus. Durante o rastreamento de microorganismos amilolíticos essa
espécie foi a que apresentou maior produção de α-amilase. O gênero
Cryptococcus inclui aproximadamente 37 espécies dentre somente o
Cryptococcus neoformans é patogênico (Abadi e Pirofski, 1999). São leveduras
encapsuladas que possuem como habitat, solo, plantas, frutos e as formas
patogênicas o homem.
15
A α-amilase produzida por C. flavus foi purificada e caracterizada por
Wanderley et al. (2004). Esta enzima foi caracterizada como sendo uma
glicoproteína com massa molecular de 75 kDa, pH ótimo de 5,5 e temperatura
ótima de 50ºC.
1.2. A estrutura do amido
O amido é um polímero de glicose de alta massa molecular, sendo
juntamente com a celulose, um dos polímeros de origem vegetal mais
amplamente disponível na natureza (Beck Ziegler, 1989), considerado como um
dos principais componentes da dieta humana e de outros animais. É a maior
substância de reserva dos vegetais, sendo produzido nas folhas como resultado
da conversão da glicose-6-fosfato, originada durante a fotossíntese, em glicose-1-
fosfato pela ação transferida para as extremidades não redutoras da molécula de
amido pré-existentes pela ação da enzima amido sintase (Lehninger, 1993).
Sua constituição é originária da mistura de dois polímeros estruturalmente
diferentes: amilose e amilopectina (Figura 1). Estes compostos diferem em massa
molecular, solubilidade em água, coloração com iodo e suscetibilidade a hidrólise
enzimática (De Mot, 1990).
O polissacarídeo amilose é uma molécula linear constituída de unidades de
glicose, ligadas entre si, por ligações glicosídicas do tipo
α-1,4 (Figura 1).
Apresenta-se na forma helicoidal e é menos solúvel que a amilopectina
(Cabello, 1999). As cadeias apresentam tamanho médio de 500-1000 unidades
de glicose e constituem cerca de 20 a 30% da molécula de amido (Janse &
Pretorius, 1995).
A amilopectina é uma molécula mais complexa, formada de cadeias curtas
de amilose (α-1,4) contendo ligações glicosídicas do tipo α-1,6 nos pontos de
ramificação (Figura 1). Representa cerca de 70 a 80% da molécula do amido.
Apresenta normalmente um padrão bimodal de distribuição com cadeias curtas
contendo em média de 11 a 15 resíduos de glicose e cadeias mais longas com
40-60 resíduos de D-glicose (Janse & Pretorius, 1995).
16
Figura 1. Polissacarídeos do amido. Estrutura da amilose (a), amilopectina (b), e
(c) esquema da ligação α-1,6 presente na molécula de amilopectina. (Lehninger et
al. 1993).
Ao ser hidrolisado, o amido produz carboidratos de cadeia curta, tais como
dextrinas, maltopentose, maltotetrose, maltose e finalmente glicose (Crueger &
Crueger, 1984). Estes produtos derivados da hidrólise do amido podem ter
diversas aplicações biotecnológicas. Esta hidrólise pode ser ácida ou enzimática.
1.2.1. Hidrólise Ácida do Amido
A hidrólise ácida de interesse industrial resulta na clivagem de ligações
α1
4 e α16 que ligam os resíduos de D-glicose na molécula de amido. O
átomo de oxigênio glicosídico reage com o próton para formar o acetal protonado,
o qual é quebrado para liberar o grupamento 4-hidroxil o 5-hidroxil na parte não
redutora criada pela hidrólise no lado de clivagem do polímero e um íon
oxicarbônico, intermediário na porção redutora correspondente. Este íon reage
17
com a molécula de água para formar o grupamento 1-hidroxil na parte redutora e
um resíduo de glicose no local de clivagem (Cabello,1997).
As ligações α1
4 são mais suceptíveis à hidrólise do que as ligações
α16. As cadeias terminais da parte não redutora do polímero são quebradas
mais rapidamente do que as cadeias internas (Cabello,1999). Quando se utilizam
baixas concentrações de amido, a conversão em glicose é de quase 100%.
Porém em escala industrial, devido a irregularidade da estrutura do amido, esta
conversão não é alcançada. A conversão de 20% de amido, por exemplo, possui
um rendimento de aproximadamente 88% em base seca (Cadmus et al., 1996).
Este fato pode ter como fator pequenas quantidades de cinzas, lipídeos e
proteínas presentes no amido (Macallister, 1979). A ação de microorganismos
durante o processo, causa a formação de ácido lático o qual juntamente com o
dióxido de enxofre adicionado no início do processamento, resulta num redução
do pH, cerca de 4,2, facilitando a formação de hidróximetilfurfural (HMF), produto
que deve ser removido devido a sua toxicidade (Bhat, 1998).
1.2.2. Processamento Enzimático do Amido
A utilização de enzimas na catálise de reações hidrolíticas de material
amiláceo são vantajosas em relação à hidrólise ácida, uma vez que são
realizadas a temperaturas menores e a um pH próximo da neutralidade, sendo
dispensáveis, portanto, reatores de alta pressão e temperatura, extremamente
caros, além do fato da hidrólise ácida introduzir substâncias indesejáveis (Oliveira
et al., 1993). Devido as condições de temperatura e pH a hidrólise enzimática
produz uma quantidade ínfima de produtos colaterais, elevando a concentração
dos produtos desejáveis com menor formação de cor, sabor e aroma
indesejáveis. Isto é importante, pois reduz o custo dos processos de refinação
(Oliveira et al., 1993).
Em alguns casos, as reações enzimáticas podem ser conduzidas em
concentrações maiores do substrato do que na hidrólise ácida. Também a catálise
enzimática é mais específica que a ácida. A seleção apropriada das enzimas a
serem utilizadas na hidrólise do amido, produz uma maior variedade de
sacarídeos do que os obtido através de hidrólise química (Baht, 1998).
18
A Classificação, bem como o modo de ação das principais enzimas
utilizadas no processamento do amido estão descritas a seguir.
1.3. Classificação das amilases
1.3.1. α
αα
α-Amilases
A α-amilase de Bacillus subtilis variedade amyloliquefaciens é uma dos
tipos mais usados (Oliveira et al,1993). Podem ser classificados como sendo
liqueficantes ou sacarificante. Dentre as liqueficantes as mais utilizadas são as do
B. amyloliquefaciens, B. licheniformis, B. strearothermophillus e B. acidocoldrius.
Dentre as sacarificantes as amilases do B. subtilis e fúngica produzem níveis mais
elevados de açúcares redutores do que as liqueficantes (Pretorius & Lambrechts,
1991).
A α-amilase (α-1,4-glucan-4-glucano hidrolase) é uma endohidrolase que
rompe as ligações α,1
4 da molécula do amido ao acaso, dando origem a
oligossacarídeos de baixo peso molecular e provocando rápida liquefação do
amido (Shah & Zeikus, 1992). Os açúcares glicose, maltose, maltotriose,
maltotetrose, maltopentose e maltohexose foram identificados como produtos
finais da ação de α-amilases (Castro, 1992; Chang & Scwartz, 1988).
O mecanismo de ação provavelmente envolve a protonação da ponte
glicosídica pelo íon imidazol da enzima, seguido pelo ataque no carbono
anomérico pelo qual o grupamento carboxil da enzima, resultando em um
intermediário glicosil éster, o qual é então hidrolisado pelo ataque da água no
carbono anomérico da molécula (Macallister, 1979).
1.3.2. β
ββ
β-amilases
A β-amilase (1,4-α-D-glucano malto hidrolase) é uma exohidrolase que
cliva ligações alternadas de α-1,4 da porção não redutora da amilose e
amilopectina para produzir a β-maltose (Bhat, 1998). Esta enzima é incapaz de
contornar as ligações glicosídicas do tipo α-1,6, interrompendo sua atividade nos
pontos de ramificação. O amido solúvel quando hidrolisado por esta enzima
resulta na produção de 69% de maltose e β-dextrinas (Bhat, 1998).
19
O mecanismo de ação da β-amilase envolve a interação do amido com os
grupos imidazol e carboxil da enzima, resultando no glicosil éster intermediário, o
qual é hidrolisado pela adição de água para o grupo carboxil, o qual libera a
maltose na configuração β-anomérica (Macallister, 1979).
1.3.3. Glucoamilase
Esta enzima também é chamada de amiloglucosidase (α-1,4-glcucan-
glucano hidrolase), é uma enzima sacarificante que produz unicamente glicose
através da hidrólise das ligações glicosídicas α-1,4 e α-1,6 removendo unidades
de glicose consecutivamente a partir da extremidade não redutora da cadeia de
amido e de oligossacarídeos deixados pela ação da α-amilases (Oliveira et al.,
1993).
Os principais gêneros produtores de glucoamilase são: Aspergillus e
Rhizopus, sendo o Aspergillus niger o melhor produtor desta enzima (Sauer et al.,
2001). Outras espécies de produtores de glucoamilases são: A. awamori, A.
terreus, A. foetidus, A. oryzae, A. usami e Rhizopus sp. (Reilly, 1985; Frost &
Moss, 1985).
Dados recentes reportam que o isolamento de glucoamilase de A. niger
consiste em isoenzimas, onde somente uma delas é efetiva na hidrólise de
ligações α-1,6, enquanto que a outra é relativamente fraca (Sauer et al., 2001).
1.3.4. Pululanase
As Pullulanases (α-dextrinas 6-glucohidrolase) clivam as ligações do tipo α-
1,6 nos pontos de ramificação do amido e da amilopectina, fazendo a converção
em molécula de amilose, que possuem somente ligações do tipo α-1,4. Também
são capazes de atuar nas ligações α-1,6 da pullulana, que por sua vez, são
separadas por 3 ligações glicosídicas do tipo α-1.4, liberando moléculas de
maltotriose (Saha & Zeikus, 1989).
São industrialmente importantes e geralmente são usadas em combinação
com amilases sacarificantes como a glucoamilase, α-amilases e β-amilases para
a produção de xaropes, onde a pullulanase é adicionada juntamente com a
20
glucoamilase para aumentar o teor de glicose, reduzindo o tempo de reação
(Bhat, 1998).
1.3.5. α
αα
α-D-Glucosidase
Esta enzima ataca ligações α-1,4 terminais do amido e libera D-glicose. A
enzima pode ainda atacar ligações terminais α-1,2 , α-1,4 e α-1,6 de
dissacarídeos e oligossacarídeos liberando α-D-glicose. É uma enzima muito
importante no processo de produção de xarope com alto teor de glicose (Bhat,
1998).
1.3.6. EXO-(1
4-α
αα
α-D)glucanase
Esta enzima libera tipicamente maltoligossacarídeos do amido. Estes
maltoligossacarídeos possui um alto valor comercial e pode ser usado como
suplemento alimentar para crianças, idosos e pacientes clínicos (Bhat, 1998).
1.3.7. Isoamilase
As isoamilases (glicogênio 6-glucano hidrolase) são capazes de hidrolisar
ligações do tipo α-1,6-D de amilopectina, glicogênio, dextrinas ramificantes e
alguns oligossacarídeos. Entretanto, tais enzimas não hidrolisam as ligações do
tipo α-1,6 da pullulana e de β-dextrina-limite. Tal característica é atribuída a sua
baixa atividade às cadeias laterais curtas da molécula de amido (Ara & Ito., 1993).
As isoamilases são usadas pela indústria para a produção de maltose e
glicose a partir de amido em combinação com outras amilases. Estas enzimas
foram descritas primeiramente por Marvo & Kobayashi (1951) em extratos de
leveduras, capazes de degradar o glicogênio. Posteriormente, outras isoamilases
foram caracterizadas como as de Pseudomonas amyloderamosa, Bacilo
amyloliquefaciens, Escherichia coli, Lipomyces kononenkoae (Ara & Ito, 1993).
1.3.8. Ciclodextrinases
A ciclodextrinases são enzimas que hidrolizam o amido formando
estruturas circulares denominadas de cliclodextrinas unidas por ligações
glicosídicas do tipo α-1,4. Estes anéis podem ser constituídos por 6, 7 e 8
21
unidades de glicose, sendo chamadas de α, β e γ-cliclodextrinas respectivamente.
Geralmente são enzimas extracelulares encontradas principalmente em bactérias
do gênero Bacillus (Saha & Zeikus, 1992). Igualmente as α-amilases, as
ciclodextrinases requerem Ca
2+
para uma máxima estabilidade (Bhat, 1998).
Figura 2. Classes de enzimas amilolíticas e respectivos mecanismos de ação
(Pretorius & Lambrechts, 1991).
1.4. A importância das amilases
As amilases têm sido amplamente usadas na produção de maltodextrina,
amidos modificados, e xaropes de glicose ou frutose. Atualmente, estas enzimas
compreendem 30% da produção mundial das enzimas. Além do uso na hidrólise
do amido, as enzimas conversoras de amido são também usadas em outras
aplicações industriais tais como: componente de detergentes para lavanderia e
louças ou como agente anti-envelhecedor na panificação (Cavaco-Paulo,1999).
Veja exemplos de suas principais aplicações:
22
Na aplicação industrial: é importante na indústria do amido de tal maneira
que enzimas são mais utilizadas como catalisadores com aplicações variando
desde a hidrólise de macromoléculas até a produção de frutose. Assim, uma
importante forma de usar o amido é degradar a sua estrutura molecular para se
obter oligossacarídeos de baixo peso molecular até a glicose. Motivo de uso das
amilases mais especificamente a
α-amilase: é uma forma simples e barata de
realizar o primeiro passo de despolarização. Hoje em dia, o uso de enzimas é
preferido ao uso de compostos químicos, devido ao alto rendimento e pelos
inúmeros produtos que podem ser obtidos. Exemplo de produção: xarope de
glicose, xarope de maltose feitos através da isomerização ou por processos de
liquefação, sacarificação (Bhat, 1998).
Panificação: na panificação a α-amilase é adicionada à massa para
degradar o amido danificado da farinha a pequenas dextrinas. Assim, o uso da
enzima permite um atraso no envelhecimento, além de melhorar a textura, volume
e sabor dos produtos de panificação. Vários aditivos são utilizados na produção
de pão, entre estes, enzimas que atuam sobre o amido têm sido sugeridas como
agentes anti-envelhecedores. Exemplos: α-amilase, enzimas ramificadoras e
desramificadoras, amilases maltogênicas, β-amilase e amiloglicosidases. Além de
gerar compostos fermentescíveis e atuar como agente anti-envelhecedor a adição
de α-amilase melhora a retenção da maciez dos produtos (Shah, 1991).
Indústrias de bebidas alcoólicas: na produção de bebidas a matéria
prima é normalmente a cevada, mas o objetivo é hidrolisar a glicose para a
fermentação alcoólica por leveduras (Pretorius & Lambrechts, 1991).
Produção de álcool combustível: o principal entrave na utilização de
amido para produção de álcool combustível é a conversão de amido a açúcares
fermentescíveis. A conversão é feita pela adição de α-amilase bacteriana e
glicoamilase fúngica, que devem ser importadas da Europa, ao amido
solubilizado. Quando comparado ao processo de obtenção de álcool a partir da
sacarose, que apenas necessita da extração do caldo-de-cana, antes da adição
das leveduras, o álcool de amido se torna pouco atraente. Uma forma de baratear
os custos do álcool de amido é produzir as enzimas nacionalmente, já que
atualmente o Brasil importa mais de 10 milhões de dólares só com amilases.
23
Usos gerais: a
α-amilase por ser de maior espectro de uso, além de ser
utilizada para sacarificação ou liquefação do amido, pode ser usada também no
preparo de soluções viscosas de amido usada na urdidura de fibras têxteis,
clarificação de cervejas e sucos, ou no pré-tratamento de ração animal para
melhorar a digestibilidade. Na indústria de jeans como bioestonagem para
remoção da goma (Moraes, 2004).
Outras aplicações que são perspectivas de uso: utilização da enzima
ciclodextrina glicosiltransferase, que formam complexos com uma variedade de
moléculas orgânicas de tamanho adequado, sendo que a formação do complexo
leva a várias vantagens para a molécula aprisionada conferindo proteção contra
degradação oxidativa ou destruição por UV, melhoramento da solubilidade de
substâncias hidrofóbicas em soluções aquosas; estabilização de compostos
voláteis; alteração da reatividade química de soluções químicas para pó e,
melhoramento do aroma e sabor de alimentos; detergentes biodegradáveis, que
utilizam enzimas em detergentes para o uso doméstico, sendo que estas enzimas
são 100% biodegradáveis, e substituem ingredientes que são tóxicos para o meio
ambiente (exemplo: detergente para lavanderia e para louças); uso
biofarmacêutico, que permite que em processos utilizando amilases tem sido
desenvolvido para a produção de tio-açúcares, que apresentam potenciais como
novos agentes terapêuticos, além de se mostrarem importantes para o
desenvolvimento do desenho de drogas baseadas em carboidratos, isto acontece
devido a biotecnologia (Moraes, 2004).
1.5. Glicosilação de proteínas
O processo de glicosilação é uma das maiores modificações que ocorrem
na estrutura da maioria das proteínas secretadas. O processo consiste na adição
de sacarídeos a proteínas ou lipídios (Spiro, 2002). Existem dois diferentes tipos
de glicosilação de proteínas: O-glicosilação, e a N-glicosilação.
A N-glicosilação é importante para o enovelamento de algumas proteínas
de eucariotos e ocorre no retículo endoplasmático. Este processo pode ocorrer
também frequentemente em archaea e raramente em bactérias (Weerapana &
Imperial, 2006).
24
Para a N-ligação dos oligosacarideos, um precursor de 14 açucares é
primeiramente adicionado ao resíduo de asparagina na cadeia polipeptídica da
proteína alvo. A estrutura desse precursor é comum na maioria dos eucariotos e
geralmente contem 3 moléculas glicoses, 9 moleculas de manoses e 2 moleculas
de N-acetilglicosamina (Spiro, 2002).
O processo se inicia com a transferência de gurpamentos N-
acetilglicosamina-fosfato da N-acetilglicosamina-uridina-difosfato para o dolicol-
fosfato. Após, ocorre a transferência de manose da Manose-guanina-difosfato
para o N-acetilglicosamina-dolicol-difosfato. A cadeia de oligosacarídeo formada é
então translocada para o interior do retículo endoplasmático onde ocorrerá a
adição de mais moléculas de manose e de glicose. Esta cadeia de
oligossacarídeo é então ligada através de uma oligosacarideo transfrerase à
asparigina da seqüência consenso Asn-X-Ser/Thr, regenerando o grupo dolicol-
fosfato. Após a ligação, uma vez que a proteína estiver corretamente enovelada,
os resíduos de glicose podem ser removidos da cadeia e a proteína exportada
para o complexo de Golgi onde resíduos de manose poderão ser removidos ou
novas manoses adicionadas (Nelson & Cox, 2003) (Figura 3).
Figura 3. Síntese do núcleo de oligossacarídeo das glicoproteinas durante o
processo de N-glicosilação. Fonte: Nelson e Cox (2003).
25
As funções biológicas das glicoproteínas são bem estabelecidas, porém o
papel que os carboidratos exercem nessas funções é, na maioria dos casos,
ainda desconhecidos e os artigos publicados são contraditórios (Jafari-Aghadam
et al., 2005). A glicosilação por si só não parece ser tão necessário para um
transporte correto das proteínas (Spiro, 2002).
A tunicamicina (Figura 4) é um antibiótico que bloqueia a N-glicosilação de
proteínas pela inibição de transferência de N-acetilglicosamina fosfato para dolicol
fosfato, o primeiro passo na síntese do precursor oligosacarídico (Eriksen et al.,
1998). Este antibiótico tem sido utilizado como uma ferramenta para o estudo do
papel da N-glicosilação na secreção, atividade e estabilidade de glicoproteínas
secretadas por fungos filamentosos (Ulhoa et al., 2001).
Figura 4. Estrutura da tunicamicina. Fonte: Nelson e Cox (2003).
A O-glicosilação, por outro lado, ocorre posteriormente num outro estagio
do processamento das proteínas, podendo-se iniciar no retículo endoplasmático,
mas comumente ocorre no complexo de Golgi (Spiro, 2002). Este processo
consiste na adição de N-acetil-galactosamina os grupos hidroxil de resíduos de
26
serina e treonina, seguido da adição de outros carboidratos como galactose e
ácido siálico. Ao que parece, não existe motivo consenso de aminoácidos para
ocorrer a glicosilação como na N-glicosilação, sendo que todo aminoácido que
apresentar um grupo funcional hidorxil pode estar envolvido no processo (Goto,
2007). A O-glicosilação, parece estar envolvida na secreção e adesão de
proteínas. Entretanto, o processo O-glicosilação em fungos ainda é pouco
conhecido (Goto, 2007).
27
2. OBJETIVOS
2.1. Objetivos Gerais
As enzimas classificadas dentro do grupo das amilases têm uma grande
aplicação biotecnológica no aproveitamento do amido como fonte de açúcares
fermentáveis. As maiores fontes das enzimas amilolíticas usadas na indústria, são
aquelas produzidas por bactérias e alguns fungos filamentosos. Entretanto, pouco
é conhecido sobre a produção destas enzimas por leveduras de diferentes
gêneros. Este trabalho teve como objetivo geral analisar o efeito da tunicamicina
no processo de N-glicosilação de uma
α-amilase produzida por C.flavus bem
como os efeitos desse processo na secreção, atividade e estabilidade da enzima.
2.2. Objetivos Específicos
• Avaliar o efeito de diferentes concentrações de tunicamicina no
crescimento de C. flavus em meio mínimo SD (Synthetic Dextros Minimal
Médium) contendo amido como fonte de carbono.
• Analisar a cinética de produção da α-amilase de C. flavus em meio mínimo
(SD) contendo amido como fonte de carbono e tunicamicina em diferentes
concentrações.
• Caracterizar a α-amiliase produzida na presença de Tunicamicina e
comparar com os resultados obtidos por Wanderley et al. (2004),
analisando os seguintes parâmetros:
Efeito do pH na atividade enzimática;
Efeito da temperatura na atividade e estabilidade enzimática;
Efeito da concentração do substrato (K
M
e Vmax);
Efeito de íons e detergente aniônico SDS na atividade enzimática.
28
3. MATERIAIS E MÉTODOS
3.1. Levedura utilizada e manutenção
O isolado de C. flavus, obtido da Coleção do Laboratório de Biologia
Molecular da Universidade de Brasília (CEL/ICB) foi mantido em placas de Petri,
contendo meio SD, constituído de: 0.67% YNB (Bacto Yeast Nitrogen base
without amino acids), 2% glicose, 2% bacto-ágar e água destilada (qsp), a
temperatura de 28ºC.
3.2. Avaliação do efeito de tunicamicina no crescimento de C. flavus
Colônias isoladas da levedura foram primeiramente inoculadas em 10mL
de meio SD glicose (0.67% YNB e 2% glicose). Após incubação sob agitação
constante (200 rpm) a 28ºC por 24 horas, 1 mL do pré-inóculo foi transferido para
frascos de Erlenmeyer de 500 mL, contendo 100 mL do meio de indução SD
amido (0,67% YNB e 2% amido) na ausência e na presença de tunicamicina (0,1
a 5µg/mL). Os frascos foram incubados sob agitação constante (200 rpm) a 28ºC
por 30 horas. Após este período, amostras foram coletadas e medidas de
crescimento celular (OD 600nm) foram realizados.
3.3. Cinética de produção da α
αα
α-amilase produzida por C. flavus em meio
líquido
A indução ocorreu como descrita acima. Em intervalos de 6 horas amostras
foram coletadas e o crescimento celular (OD 600nm) determinado. Após, as
amostras foram centrifugadas a 10.000 rpm por 10 minutos, o sobrenadante foi
coletado e utilizado para dosagens de proteínas e atividade enzimática e
consumo de amido.
29
3.4. Avaliação do efeito da tunicamicina na secreção da
α-amilase por C.
flavus em meio líquido
Para a avaliação do efeito da tunicamicina na secreção da α-amilase por C.
flavus, concentrações do antibiótico (0,1 a 5µg/ml) foram adicionados ao meio de
indução de acordo com Ulhoa et al. (2001). As condições de indução foram as
mesmas descritas acima. Após a indução por 30hs as amostras foram
centrifugadas a 10.000 rpm por 10 minutos.
3.5. Determinação da atividade amilolítica
A atividade amilolítica foi avaliada pelo método de FUWA (Fuwa, 1954),
utilizando-se amido como substrato. O método se baseia na variação da
intensidade da cor do complexo iodo-amido. A 40µl de tampão acetato de sódio
(50 mmol.L
-1
, pH 5,5), foram adicionados 60µl de sobrenadante de cultura e
100µl de solução de amido (0,5%). A mistura foi incubada a 50ºC por 20 minutos
e a reação interrompida com a adição de 200µl de ácido acético (1,0 mol.L
-1
) e
200µl da solução de iodo/iodeto (1% iodo em etanol absoluto, 10% iodeto de
potássio e água destilada na proporção de 1v:1v:3v). O volume foi completado
para 10 mL com água destilada, homogeneizado e a absorbância determinada a
660nm. A quantidade de amido consumido é calculada de acordo com uma curva
padrão construída com quantidades crescentes de amido solúvel (0 - 0,5mg.ml
-1
).
Uma unidade (U) de atividade amilolítica dextrinizante foi definida como sendo a
quantidade de enzima necessária para hidrolisar 0,1mg de amido por minuto de
reação (Fuwa, 1954).
3.6. Extração de proteínas intracelular
Para a extração do conteúdo protéico intracelular, primeiramente as células
foram centrifugadas a 7.000 rpm por 5 minutos a 4ºC e lavadas com água
destilada uma vez. Após, as células foram suspensas em tampão de extração de
acordo com Rodrigues et al. (2006): Tris-HCl pH 7,8, 20mM; NH
4
SO
4
, 300mM;
MgCl
2
, 10mM; EDTA, 1mM; glicerol, 10% e PMSF, 0,1µM. Após suspensão, as
células foram submetidas a sonicação por 20 minutos a 4ºC com exposições de 5
minutos e intervalos de 5 minutos cada. Restos celulares foram removidos por
centrifugação a 12.000 rpm a 4ºC por 20 minutos. O sobrenadante foi utilizado
30
para as dosagens de proteínas, atividade enzimática e atividade em gel de
poliacrilamida.
3.7. Dosagem de Proteínas
A concentração de proteína nas amostras foi determinada pelo método
Bradford (1976). Para as dosagens foi utilizado 100
µL de amostra e 1mL de
ragente de Bradford. A reação foi realizada a temperatura ambiente por 15
minutos e absorbância determinada a 595nm. O conteúdo protéico foi calculado
utilizando-se uma curva padrão de albumina bovina da Sigma
3.8. Determinação da atividade amilolítica em gel de poliacrilamida
Para determinação de atividade em gel foi utilizado o sistema de
eletroforese (MiniGel-Sigma) em gel de poliacrilamida 12% em condições
desnaturante (SDS-PAGE) conforme descrito por Laemmli (1970). As amostras
de proteína intra e extracelulares, na presença e ausência de tunicamicina, foram
liofilizadas e ressuspendidas em tampão de amostra 1X {Tris-Hcl 0,5M pH 6,8
(50µL), SDS 10%(100µL), glicerol (100µL ), azul de bromofenol (0,05mg) e água
destilada suficiente para 1000µL}, e aplicadas no gel. A corrida foi feita utilizando-
se uma voltagem constante de 80 V, por aproximadamente duas horas. Após
esse período, o gel foi equilibrado com tampão acetato de sódio (50 mmol.L
-1
, pH
5,5) por 30 minutos a temperatura ambiente. Após esse tempo, o gel foi incubado
com uma solução de amido 0,5% previamente preparada em tampão acetato de
sódio (50 mmol.L
-1
, pH 5,5) a 4ºC por aproximadamente 12 horas. Logo após, o
gel foi incubado a 37ºC por 2 horas e coberto com uma solução de iodo-iodeto
para visualização das bandas de degradação do amido (Lacks & Springhorn,
1980).
3.9. Caracterização cinética da α
αα
α-amilase produzida por C. flavus na
ausência e na presença de tunicamicina
Todos os experimentos de caracterização foram realizados utilizando-se do
método de Fuwa para determinação da atividade amilolítica. As amostras
testadas foram obtidas após a indução descrita acima na ausência e na presença
de tunicamicina na concentração de 0,5 µg/ml.
31
3.9.1. Determinação do pH e temperatura ótimos e Termo estabilidade
O efeito do pH na atividade da α-amilase foi determinado incubando-
se a enzima com tampões de mesma força iônica em diferentes valores de
pH. Foram utilizados os seguintes tampões na concentração de 100mmol.L
-1
:
acetato de sódio na faixa de 3,0 a 5,5; fosfato de sódio na faixa de 6,0 a 7,0
e Tris-HCl 7,5 a 8,0. O efeito da temperatura na atividade enzimática foi
determinado incubando a enzima em diferentes temperaturas e no pH ótimo.
As temperaturas testadas foram 30, 25, 40, 45, 50, 55, 60, 65 e 70ºC. O
efeito da temperatura na estabilidade da enzima foi determinado após pré-
incubação da enzima na temperatura de 45ºC por 15, 30, 45 e 60 min, e
posterior determinação da atividade conforme explicado acima.
3.9.2. Determinação do K
M
e Vmáx
As propriedades cinéticas da amilase foram determinadas incubando
a enzima em concentrações crescentes de amido (0-1,0 mg.mL
-1
) .Os
cálculos dos valores das constantes foram feitos através de um programa de
análise de regressão linear Microcal Origin versão 5.0 utilizando o
método de Lineweaver-Burk (Wanderley et al., 2004).
3.9.3. Efeito de íons e detergente aniônico na atividade de α
αα
α-amilase
O efeito de íons na atividade da amilase foi determinado após a pré-
incubação, por 10 min, da enzima com 4 mmol.L
-1
dos seguintes compostos:
Al
2
(SO
4
)
3
, CaCl
2
, CuCl
2
, HgCl
2
, LiSO
4
,
MnCl
2,
ZnSO
4
e SDS(100 mmol.L
-1
).
Após a incubação a determinação da atividade enzimática foi realizada
conforme descrito anteriormente.
32
4. RESULTADOS
4.1. Avaliação do efeito de tunicamicina no crescimento de C. flavus
A influência da tunicamicina em concentrações de 0,1 a 5µg/ml no
crescimento de C. flavus em meio contendo amido foi avaliada e os resultados
apresentados na figura 5.
Figura 5. Efeito da concentração da tunicamicina no crescimento de C. flavus em
meio mínimo contendo 2% de amido. Estes dados representam a média ou desvio
padrão de dois experimentos independentes.
Podemos observar que a tunicamicina exerceu um efeito dose dependente
na inibição do crescimento de C. flavus, onde concentrações acima de 1
µg.mL
-1
promove uma maior inibição no crescimento do fungo. Os desvios mostram que
0
1
2
3
4
5
0 0,1 0,2 0,5 1,0 5,0
Crescimento celular (O.D 660nm)
Concentração de tunicamicina
µ
µµ
µ
g/mL
33
parece não haver uma diferença significativa na inibição do crescimento quando
utilizadas concentrações de tunicamicina até 0,5
µg.mL
-1
.
4.2. Cinética de produção da α
αα
α-amilase produzida por C. flavus em meio
líquido
Os resultados da cinética de produção de α-amilase por C. flavus estão
mostrados na figura 6. Em relação ao crescimento celular podemos observar que
até 12 horas de indução os tratamentos sem tunicamicina e com tunicamicina na
concentração de 0,5 µg.mL
-1
não tiveram diferença significativa. Porém, após
esse período, a indução sem tunicamicina, teve um maior crescimento chegando
a uma taxa de aproximadamente 20% a mais do que o crescimento feito na
presença de tunicamicina (Figura 6A). Esses dados sugerem que o C. flavus leva
um tempo para sentir a ação do antibiótico, provavelmente tempo gasto para
absorção e metabolização da droga.
Frente ao consumo de amido, apresentado na figura 6B, os dois
tratamentos tiveram um consumo bastante semelhante, tendo consumido todo ao
amido do meio com 24hs de indução. Já para a secreção de proteínas, podemos
observar na figura 6C que após 6 horas de indução o tratamento com
tunicamicina leva a uma maior secreção de proteínas no meio de cultura
chegando a um pico de 20,88 µg.mL
-1
, praticamente o dobro daquela sem
tunicamicina. Porém após 24hs os conteúdos de proteínas dos dois tratamentos
são praticamente o mesmo e tendem a diminuir, sugerindo a presença de
proteases no meio.
Durante a cinética de produção, a atividade enzimática expressa em U.mL
-
1
, foi analisada e esta representada na figura 6D. Podemos observar que a
indução na presença de tunicamicina na concentração de 0,5 µg.mL
-1
influencia
na atividade da enzima, diminuindo em aproximadamente 18% em relação ao
controle sem tunicamicina, sugerindo que o processo de glicosilação pode estar
influenciando tanto a secreção quanto a estrutura da α-amilase produzida por C.
flavus.
34
Figura 6. Crescimento celular (A), Consumo de amido (B), proteínas totais (C) e
atividade enzimática (D) de
α-amilase produzida por C. flavus crescido em meio
mínimo contendo 2% de amido na ausência () e na presença de 0,5 µg.mL
-1
de
tunicamicina ().Estes dados representam a média ou desvio padrão de dois
experimentos independentes.
4.3. Avaliação do efeito da tunicamicina na secreção da α-amilase por C.
flavus em meio líquido
Para avaliar se o processo de N-glicosilação influência a secreção da α-
amilase produzida por C. flavus em meio líquido, uma indução por 30 horas na
ausência e na presença de tunicamicina na concentração de 0,5 µg.mL
-1
foi
realizada. Após a indução o sobrenadante foi utilizado com fonte de amilase
extracelular e as células foram maceradas com nitrogênio e tampão de extração
para a obtenção da fração intracelular. Os resultados estão mostrados na figura 7.
A figura 7A mostra que na medida em que se aumenta a concentração de
tunicamicina no meio de cultura, a atividade específica da enzima intracelular
também aumenta, ao passo que a atividade extra diminui proporcionalmente.
Estes dados sugerem uma influência do processo de N-glicosilação na secreção
0 6 12 18 24 30
0
2
4
6
8
10
12
Crescimento celular (O.D. 660nm)
Tempo (horas)
0 6 12 18 24 30
0,0
0,5
1,0
1,5
2,0
2,5
Consumo de amido (mg/mL)
Tempo (horas)
0 6 12 18 24 30
0
5
10
15
20
25
30
35
40
45
50
Proteina total (
µ
µ
µ
µ
g/mL)
Tempo (horas)
0 6 12 18 24 30
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
1,2
1,4
1,6
1,8
2,0
Atividade Enzimática (U.mL
-1
)
Tempo (horas)
A
B
C D
35
da α-amilase produzida por C. flavus. Esses resultados foram confirmados
através de analise da atividade de α-amilase em gel de poliacrilamida, mostrado
na figura 7B. Assim com os experimentos realizados nos itens 8.1, 8.2 e 8.3
podemos concluir que a concentração ideal para estudos de glicosilação em C.
flavus durante a produção de α-amilase é de 0,5
µg.mL
-1
, visto que esta
concentração não influência de forma significativa no crescimento do fungo ao
passo que influência na secreção da enzima.
Figura 7. Avaliação do efeito de tunicamicina na atividade específica (A) intra e
extra celular e atividade em gel de poliacrilamida (B) das frações intra e extra
celular de α-amilase produzida por C. flavus em meio líquido.
0
20
40
60
80
100
120
0 0,1 0,2 0,5
Atividade Específica (UE/mg proteína)
Concentração de Tunicamicina (
µ
µµ
µ
g/mL)
Extra celular
Intra celular
Extra celular
1 2 3 4
Intra
celular
1 2 3 4
A
B
36
4.4. Caracterização cinética da α
αα
α-amilase produzida por C. flavus na
ausência e na presença de tunicamicina
A influência do pH na atividade enzimática é mostrada na figura 8.
Segundo os dados, podemos observar que tanto a enzima produzida na ausência
e na presença de tunicamicina a 0,5
µg.mL
-1
apresentaram uma maior atividade
na faixa de pH entre 5,0 e 6,0, sendo que o pH ótimo ficou em pH 5,5. Apesar
disso, a enzima teoricamente deglicosilada (produzida na presença de
tunicamicina), apresentou uma maior atividade nos pHs testados.
Figura 8. Determinação do efeito do pH na atividade de α-amilase produzida por
C. flavus em meio líquido mínimo contendo 2% de amido na ausência () e na
presença de 0,5 µg.mL
-1
de tunicamicina (). Estes dados representam a média
ou desvio padrão de dois experimentos independentes.
Em relação à ao efeito da temperatura na atividade da enzima, a α-amilase
produzida na ausência e na presença de tunicamicina apresentaram a mesma
temperatura ótima, ou seja, 65ºC. Entretanto, a enzima nativa apresentou uma
2 3 4 5 6 7 8 9
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
110
Atividade Relativa (%)
pH
37
maior atividade relativa no intervalo de 45 a 60ºC. As duas enzimas demonstrarm
uma grande diminuição da atividade relativa à 70ºC (Figura 9).
30 40 50 60 70
0
20
40
60
80
100
Atividade Relativa (%)
Temperatura (ºC)
Figura 9. Determinação do efeito da temperatura na atividade de α-amilase
produzida por C. flavus em meio líquido mínimo contendo 2% de amido na
ausência () e na presença de 0,5 µg.mL
-1
de tunicamicina (). Estes dados
representam a média ou desvio padrão de dois experimentos independentes.
O efeito da temperatura na estabilidade da enzima foi testado pré-
incubando a enzima por 15, 30, 45 e 60 minutos na temperatura de 45ºC e,
posteriormente, realizando o ensaio enzimático nas condições ótimas de
temperatura e pH. Os resultados demonstram não haver influência significativa do
processo de N-glicosilação na termoestabilidade da enzima (Figura 10).
38
0 10 20 30 40 50 60
20
40
60
80
100
Atividade Relativa (%)
Tempo (minutos)
Figura 10. Determinação do efeito da temperatura na estabilidade de α-amilase
produzida por C. flavus em meio líquido mínimo contendo 2% de amido na
ausência () e na presença de 0,5 µg.mL
-1
de tunicamicina (). A temperatura de
incubação foi de 45ºC. Estes dados representam a média ou desvio padrão de
dois experimentos independentes.
A influência da concentração de substrato na velocidade de reação da α-
amilase produzida por C. flavus foi avaliada e está representada na figura 11. Os
resultados demonstram que quando a enzima é produzida na presença de
tunicamicina, a mesma perde a afinidade pelo substrato. Tanto o valor de Km
quanto de Vmáx aumentaram significativamente sendo 0,047 e 0,038
respectivamente para o controle e 0,098 e 0,052 para a deglicosilada. Estes
dados sugerem que houve uma influencia da glicosilação na estrutura da enzima,
provavelmente modificando sua estrutura ao ponto da enzima perder em quase
100% sua afinidade pelo substrato.
39
Figura 11. Efeito da concentração do substrato na velocidade de reação da α-
amilase produzida por C. flavus em meio líquido mínimo contendo 2% de amido
na ausência (
) e na presença de 0,5 µg.mL
-1
de tunicamicina (). Os valores das
constantes Vmáx e Km estão apresentados na tabela. Estes dados representam a
média ou desvio padrão de dois experimentos independentes.
O efeito de íons sobre a atividade de α-amilase foi determinado
adicionando-se ao sistema de reação 4 mmol.L
-1
do íon correspondente e 10
mmol.L
-1
de SDS. Após esse tempo o ensaio de atividade nas condições ótimas
de temperatura e pH foi realizado. Os resultados estão apresentados na figura 12.
Os dados mostram que a enzima deglicosilada parece ser mais sensível a
influencia dos íons testados, principalmente em relação ao cloro e o mercúrio.
Além disso, mesmo na presença de cálcio, um conhecido cofator das α-amilases,
a enzima deglicosilada apresentou uma atividade relativa abaixo da nativa.
Interessante ressaltar que a enzima deglicosilada apresentou uma maior
Grandeza Controle Tunicamicina 0,5 µg.mL
-1
Vmáx (mg.min
-1
) 0,038 ± 0,0071 0,047 ± 0,005
Km (mg.mL
-1
) 0,052 ± 0,019 0,098 ± 0,017
1/V
1/[S]
40
resistência à presença de SDS, um agente desnaturante. Todos esses resultados
corroboram a hipótese de que o processo de N-glicosilação interfere na estrutura
da α-amilase produzida por C. flavus.
0 20 40 60 80 100
Controle
Al
2
(SO
4
)
3
CaCl
2
CuCl
2
HgCl
2
LiSO
4
MnCl
2
ZnSO
4
SDS
Íons testados (4 mmol.L
-1
)
Atividade Relativa (%)
Tunicamicina
Controle
Figura 12. Efeito de íons e SDS na atividade da α-amilase produzida por C. flavus
em meio líquido mínimo contendo 2% de amido na ausência e na presença de 0,5
µg.mL
-1
de tunicamicina. Estes dados representam a média ou desvio padrão de
dois experimentos independentes.
41
5. DISCUSSÃO
A grande aplicação das amilases na biotecnologia industrial tem gerado um
grande número de trabalhos nas mais diversas áreas que vão desde a regulação
da expressão gênica até mudanças estruturais da enzima no intuito de melhorar
as características cinéticas da mesma (Priyadharshini & Gunasekaran, 2007;
Nakamura et al., 2006; Lammle et al., 2006).
Uma grande variedade de microrganismos são capazes de produzir
amilases, principalmente bactérias e fungos (Prieto et al., 1995). Porém, com o
desenvolvimento da produção de etanol a partir de matéria amilácea, existe um
grande interesse no isolamento e/ou construção de leveduras amilolíticas com
rápido crescimento e alta tolerância a etanol (Moraes et al., 1995; Moraes et al.,
1999; Toskoy et al., 2006).
Nesse sentido, recentemente o grupo de Biologia Molecular da
Universidade de Brasília (CEL/ICB) isolou uma levedura com grande potencial de
produção de amilase e a mesma foi identificada como Cryptococcus flavus.
Posteriormente uma amilase produzida por esta levedura foi purificada e
caracterizada por Wanderley et al. (2004).
Este trabalho teve como objetivo analisar o efeito da tunicamicina no
processo de N-glicosilação de uma
α-amilase produzida por C.flavus bem como
os efeitos desse processo na secreção, atividade e estabilidade da enzima.
Primeiramente o efeito desse antibiótico no crescimento de C. flavus, foi
avaliado. A C. flavus se mostrou bastante sensível à presença deste antibiótico no
que diz respeito ao seu crescimento (Figura 5). Em estudos de N-glicosilação em
fungos filamentosos, os mesmos parecem ser mais tolerantes a tunicamicina em
relação ao crescimento. Valores muito maiores foram utilizados em experimentos
de mesma natureza dos que realizados aqui. Eriksen et al. (1998) reporta que
somente concentrações acima de 40µg.mL
-1
foi capaz de influenciar no
crescimento do fungo Aspergillus oryzae durante a produção deα-amilase. Para
42
outros fungos filamentosos valores acima de 30
µg.mL
-1
já influenciam no
crescimento (Ulhoa et al., 2001; Mukherjee et al., 2006).
Estes dados demonstram que não existe um padrão de influência de
tunicamicina sobre os fungos, principalmente no gênero Cryptococcus, visto que
um trabalho publicado por Morosoli et al. (1988), que reporta o efeito da
tunicamicina na secreção de xilanase, não discute se houve influência no
crescimento do fungo quando usados 30 µg.mL
-1
do antibiótico.
Como o fungo se mostrou bastante sensível a presença da droga, os
experimentos foram conduzidos com prévio crescimento do C. flavus em meio
contendo glicose e posteriormente a transferência de 10% desse volume para o
meio de indução propriamente dito contendo então a fonte indutora, que é o
amido, e tunicamicina na concentração de 0,5µg.mL
-1
.
Wanderley et al. (2004) demonstrou que a α-amilase secretada por C.
flavus trata-se de uma glicoproteina com cerca de 50% de massa glicídica, porém
não determinada qual a natureza, ou seja, se é N ou O-glicosilação. Este dado se
mostra interessante visto que grande parte da enzima é de origem glicídica e que
a retirada dessa porção poderia levar a uma grande mudança na estrutura da
enzima. Apesar disso, estudos mais detalhados que comprovam esta
porcentagem de carboidratos ainda não foram realizados.
Essa característica é comum em enzimas amilolíticas produzidas por
leveduras tais como as α-amilases produzidas por Lipomyces kononenkoae,
Schwanniomyces alluvius ATCC 26074 e Candida antarctica CBS 6678, sendo
todas glicoproteínas secretadas no meio de cultura (Prieto, et al., 1995: Moranelli
et al., 1987; Wilson & Ingledew, 1982). Dados da literatura sugerem que a
glicosilação destas amilases e outras proteínas de leveduras é uma etapa
importante nos mecanismos de secreção desses microrganismos (Steyn &
Pretorius, 1995). Além disso, a glicosilação parece ter um importante papel na
manutenção da estrutura e estabilidade das enzimas após a secreção para o
meio de cultura (Kobata, 1992; Weerapana & Imperial, 2006).
Em nossos experimentos existe uma evidência de que o processo de N-
glicosilação influência tanto na secreção quanto em alguns aspectos da estrutura
da enzima. Apesar de o nosso trabalho não ter objetivado o estudo do processo
de O-glicosilação, os dados de literatura, que demonstram a influencia desse
43
processo na estabilidade e secreção de enzimas em fungos, são pouco discutidos
(Goto, 2007).
Muito tem se pesquisado sobre o efeito de tunicamicina na secreção de
diferentes enzimas, na sua maioria, hidrolases (Eriksen et al., 1998; Ulhoa et al.,
2001; Jafari-Aghdama et al., 2005; Mukherjee et al., 2006). Eriksen et al. (1998)
reporta que a presença de tunicamicina não influencia nem na secreção nem na
estabilidade de α-amilase produzida por Aspergillus oryzae. Em nossos
experimentos observamos um acúmulo de amilase intracelular quando na
presença de tunicamicina (Figura 7). Este fato também foi observado por Morosoli
et al. (1988), porém o mesmo relata um retardo no processo de secreção da
enzima deglicosilada em relação à glicosilada. Glicoproteínas de eucariotos tem
sido relacionada com múltiplas funções intracelulares tais como resposta imune,
endereçamento, reconhecimento celular, enovelamento e principalmente
estabilidade da proteína (Weerapana & Imperial, 2006)
A influência do processo de glicosilação na estrutura da α-amilase
produzida por C. flavus foi avaliada através da caracterização cinética da enzima.
Parâmetros de pH e temperatura ótima, termoestabilidade, km e Vmax e efeito de
íons e detergente aniônico foram testados.
As enzimas são moléculas anfóteras que possuem grupamentos ácidos e
básicos. Assim desta forma, valores diferentes de pH podem afetar a estrutura e
estabilidade da enzima (Nelson & Cox, 2003). Mudanças na estrutura da enzima,
como por exemplo, deglicosilação, podem mudar as cargas desses grupamentos
ácidos e básicos, fornecendo uma nova conformação estrutural, mudando o valor
do pH ótimo. Nossos resultados mostram que não houve uma mudança no valor
de pH ótimo sendo de 5,5 (figura 8), o mesmo encontrado por Wanderley et al.
(2004). Porém, a enzima deglicosilada apresentou uma maior estabilidade nos
pHs testados em relação ao controle. Este resultado também foi encontrado por
Ulhoa et al. (2001) e Jafari-Aghdama et al. (2005), onde a enzima nativa e a
deglicosilada, quer seja com o uso de tunicamicina ou por deglicosilação
enzimática respectivamente, não apresentaram diferenças significativas nos
valores de pH ótmo.
Uma das mudanças mais comuns relatadas na literatura e que acontece
em experimentos de deglicosilação são no que se refere a temperatura ótima e/ou
44
termoestabilidade. Ulhoa et al. (2001), relata que a N-acetilglicosaminidase
produzida por T. harzianum na presença de tunicamicina, se mostrou mais
sensível à inativação pelo calor, retendo apenas 18% de atividade após 120 min a
60ºC, ao passo que a enzima nativa 45%. Este comportamento também foi
observado por Jafari-Aghdama et al. (2005), mas como sendo pH dependente.
Nossos resultados mostram que não houve diferença nem na temperatura ótima
nem na termoestabilidade entre a enzima deglicosilada e a nativa (Figuras 9 e
10).
No que se refere aos parâmetros de Km e Vmáx, é comum encontrar na
literatura valores diferentes para a enzima deglicosilada e a nativa, sendo que
esta pode possuir um menor valor de Km, grandeza que mede a afinidade da
enzima pelo substrato (Ulhoa et al., 2001). Entretanto a influencia da
deglicosilação pode não afetar o sítio ativo da enzima e neste caso, valores de
Km e Vmáx não apresentarão diferenças significativas (Ulhoa et al., 2001; Jafari-
Aghdama et al., 2005). Ao que parece, a influência da N-glicosilação na amilase
de C.flavus, ocorre no sítio catalítico, visto que os resultados da figura 11
mostram uma perda significativa de afinidade da enzima deglicosilada pelo
substrato quando comparada com a nativa.
Não foi encontrado na literatura dados sobre o efeito de íons na atividade
de enzimas glicosiladas e deglicosiladas. Entretanto nossos resultados parecem
promissores no que se diz respeito ao estudo da estrutura da enzima
deglicosilada. A figura 12 mostra que a enzima deglicosilada, apresentou uma
maior sensibilidade à influencia de íons como Hg
+2
e Cu
+2
. Ao que parece, a
deglicosilação promove uma maior exposição da enzima à ação desses íons.
Além disso, assim como encontrado por Wanderley et al. (2004), a α-amilase de
C. flavus não é cálcio dependente e que depende do grupamento indol dos
aminoácidos para realizar sua atividade, visto que a enzima também foi
fortemente inibida por Hg
+2
. Fato interessante foi que a enzima deglicosilada
apresentou uma maior resistência à ação do detergente aniônico SDS o que
mostra provavelmente um rearranjo nas cargas globais da enzima quando
deglicosilada.
Outros experimentos, como mutação sítio dirigida para o consenso Asn-X-
Ser/Thr e a deglicosilação enzimática da enzima nativa, terão de ser realizados
45
para demonstrar de forma mais clara a influência do processo de N-glicosilação
na estrutura da α-amilase produzida por C. flavus. Um maior conhecimento deste
processo e se existe O-glicosilação, contribuirá para um maior entendimento da
produção desta enzima e possibilitará uma aplicação industrial para esta α-
amilase.
46
6. CONCLUSÕES
Este trabalho permitiu as seguintes conclusões:
• Doses de tunicamicina acima de 0,5
µg/mL inibem de forma significativa o
crescimento de C. flavus.
• A tunicamicina na dosagem de 0,5µg/mL influencia na secreção de amilase
produzida por C. flavus.
• A α-amilase produzida por C. flavus na presença de 0,5µg/mL de
tunicamicina apresenta uma alteração nos seus parâmetros cinéticos:
• Maior estabilidade em todos os pHs testados
• Não afeta a temperatura ótima e termoestabilidade
• Aumento da velocidade máxima e diminuição da afinidade da enzima pelo
substrato (maior Km).
• Maior sensibilidade à ação de íons Hg
+2
e Cu
+2
e maior resistência à ação
de SDS.
47
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