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Universidade do Vale do Paraíba
Instituto de Pesquisa e Desenvolvimento
Elisa Celeste Dreux
“Avaliação do efeito antiinflamatório do extrato hidroalcoólico de
Vernonia scorpioides (Lam) Persoons em inflamação aguda”.
“Antiinflamatory effects of hidroalcoholics extract of Vernonia scorpioides (Lam)
Persoons in acute inflammation”.
São José dos Campos, SP
2005
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Elisa Celeste Dreux
“Avaliação do efeito antiinflamatório do extrato hidroalcoólico de
Vernonia scorpioides (Lam) Persoons em inflamação aguda”.
“Antiinflamatory effects of hidroalcoholics extract of Vernonia scorpioides (Lam)
Persoons in acute inflammation”.
Dissertação de Mestrado apresentada ao programa
de Pós Graduação em Ciências Biológicas, como
complementação dos créditos necessários para
obtenção do título de Mestre em Ciências
Biológicas.
Orientador: Prof. Dr. José Carlos Cogo.
Co-orientador: Prof Dr Rodrigo A. Martins
São José dos Campos, SP
2005
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... Aos meus pais Denis e Arlete que através de exemplos de integridade, sabedoria, amor e
compreensão me apoiaram e incentivaram em todos os momentos de minha vida.
... Ao Beto e minha filha Priscille por tudo que representam em
minha vida e pela compreensão nos momentos difíceis e de
ausência.
... ofereço este trabalho.
... ao Professor José Carlos Cogo
pela orientação, pelo seu profissionalismo e seriedade na pesquisa,
pelo respeito e credibilidade na minha pessoa, me incentivando e
ajudando-me nos momentos necessários.
... A amiga Ana Maria Barbosa por me ensinar algumas
técnicas na realização desta pesquisa e pelo companhei-
rismo indispensável em todos os momentos necessários.
... meu reconhecimento e consideração.
Agradecimentos
- Ao Prof Dr Wellington Ribeiro pelos conselhos, trocas de idéias e incentivos na
realização desta pesquisa, permitindo o livre acesso ao laboratório de fisiologia e
farmacodinâmica;
- Ao Prof Dr Rodrigo A. Martins pela co-orientação durante a realização desta
pesquisa;
- Ao Prof Mestre Luiz Eduardo Cardozo que orientou sobre a produção do extrato.
- Ao Prof Dr Milton Beltrame por auxiliar na elaboração do extrato utilizado na
pesquisa, permitindo a utilização do Laboratório de química e os equipamentos
necessários;
- As técnicas Carolina e Érica do laboratório de química orgânica que me apoiaram e
auxiliaram para que o extrato ficasse pronto em tempo hábil, me ensinando a
manipular os aparelhos e me auxiliando nos momentos difíceis;
- Á Rebeca da Biblioteca do IP&D que viabilizou grande parte dos pedidos de
inúmeros “papers” e teses para a realização desta pesquisa;
- Ao Prof Dr Stephen Hyslop pela liofilização do extrato no laboratório do
Departamento FCM - Unicamp;
- Á Carol do Laboratório de Histologia da Odontologia (Univap) pela oportunidade
de confeccionar as lâminas histológicas e o ensinamento das técnicas pertinentes
para a realização das mesmas;
- Á Fernanda por me auxiliar na confecção das lâminas histológicas;
- A amiga e Mestre Tatiana V. Mendes pelo incentivo nos momentos difíceis e o
contato com o laboratório da odontologia para a confecção das lâminas histológicas;
- À Tatiana, Carli, Andréia Delu; Roberta, Catarina pelo companherismo constante
no laboratório de Fisiologia e Farmacodinâmica durante a realização dos
experimentos;
- Ao amigo e Mestre Luiz Prudêncio e Silvana pelo apoio, amizade e lucidez que me
ofereceram nas várias etapas desta pesquisa;
- Ao Amigo e Mestre Antonio Carlos Prianti, pela presença, orientação, incentivo e
amizade dispensada durante toda a pesquisa;
- Ao Giordano, pela importante ajuda na leitura das lâminas me auxiliando na
diferenciação das células mononucleares;
- Ao André Luiz de Toledo, pela ajuda e o empenho na finalização da dissertação me
auxiliando nos recursos gráficos e técnicas apropriadas de computação;
- A Rosangela Regis Cavalcanti Taranger, pela revisão final da dissertação e a
delicadeza em me orientar nos erros e na finalização da dissertação;
- Aos meus amigos e vizinhos Naiara e Davis pelo apoio e empenho na parte gráfica
e recursos do computador;
- Á todos professores, amigos e funcionários do IP&D que me ajudaram nos
momentos em que necessitei de apoio e orientação.
“Que se permita a
todas as coisas
fazerem o que elas
naturalmente fazem, de
modo que a sua natureza
fique satisfeita”
Chuang- Tse
RESUMO
A espécie vegetal Vernonia scorpioides (Lam) Persoons (Asteraceae) (Piracá), é
utilizada popularmente no Vale do Paraíba (SP) como agente antiiflamatório na forma de
extratos fluidos preparados empiricamente com álcool e folhas do vegetal no tratamento de
processo edematogênicos. Com o objetivo de investigar a atividade antiinflamatória de
Vernonia scorpioides em inflamação aguda, foi preparado o extrato hidroalcoólico de
folhas e flores da espécie vegetal, realizando-se os seguintes testes: - Edema de pata em
ratos induzido por carragenina e histamina; - Peritonite em camundongos induzido por
carragenina; - Análise histológica do músculo plantar dos ratos após 4 horas da indução do
edema de pata por carragenina.
No teste de edema de pata em ratos por carragenina (1mg/pata), determinou-se as curvas
doses respostas do extrato de Vernonia scorpioides para as doses de 0,45, 0,67 e 1g/Kg,
comparados ao diclofenaco sódico (10 mg/Kg) (i.p), adotando-se os tratamentos de 30
minutos antes, tratamento imediato e tratamento 30 minutos após a indução do edema. No
teste de edema de pata em ratos induzido por histamina (50µg/pata), foi utilizada a dose
única de 0,45g/Kg (i.p) comparado ao Fernegan (cloridrato de prometazina) (4mg/Kg)
adotando-se os tratamentos de 15 minutos antes; tratamento imediato e tratamento 15
minutos após a indução do edema. No modelo de peritonite em camundongos induzida por
carragenina (600µg/cavidade), utilizou-se as doses de 0,45, 0,67 e 1g/Kg do extrato
comparados ao diclofenaco sódico (10 mg/Kg) (v.o); 30 minutos após a indução de
peritonite. O extrato inibiu o edema por carragenina e histamina em todos os tratamentos
realizados com resposta diferenciada das doses adotadas. No edema de pata induzido por
carragenina o tratamento realizado 30 minutos antes, a melhor dose foi de 1 g/Kg que
reduziu o edema em 32%, 51%,45% e 42% após 1, 2, 3 e 4 horas respectivamente; para o
tratamento imediato, todas as doses inibiram o edema sem apresentar diferença significativa
entre elas, mas de forma superior ao diclofenaco; no tratamento 30 minutos após a melhor
dose foi a de 0,45g/kg que reduziu o edema em 30%, 60% 55% e 60 % respectivamente
após 1, 2, 3 e 4 horas respectivamente. Em edema de pata induzido por histamina o melhor
resultado foi o realizado 15 minutos após onde o extrato apresentou ação semelhante ao
fernegam, reduzindo o edema em 30%, 60%, 55% e 40 % após 0,5, 1, 1,5 e 2 horas
respectivamente; nos demais tratamentos, o extrato inibiu o edema mas não foi mais
eficiente que o fernegan. Em peritonite induzida por carragenina a melhor dose foi a de
1g/kg em relação a contagem total e diferencial com resultados semelhantes ao diclofenaco.
A análise histológica do músculo plantar dos ratos realizada 4 horas após a indução do
edema por carragenina confirmou a diminuição do edema e do infiltrado leucocitário em
todas a doses utilizadas.Baseados nos resultados obtidos podemos concluir que o extrato de
Vernonia scorpioides possui ação antiiflamatória nos modelos de inflamação aguda
testados.
Palavras chave: Extrato, Vernonia scorpioides , Edema de pata, peritonite, inflamação.
Abstract
Ethanolic extracts and the leaves of Vernonia scorpioides (Lam) Persons
(Compositae), a plant commonly known in Brazil as piracá, are widely used to treat
inflammation and edema. In this work, we examined the antiinflammatory activity of a
lyophilized ethanolic extract of the leaves and flowers of V. scorpioides on rat paw edema
induced by carrageenan (1 mg/paw) and histamine (50 µg/paw), and on peritonitis induced
by carrageenan. The histological alterations in paws injected with carrageenan were also
assessed. Administration of three doses of this extract (0.45, 0.67 and 1 g/kg) 30 min before
the agonists markedly reduced the subsequent edema, although this inhibition was not as
effective as that seen with sodium diclofenac (10 mg/kg); an extract dose of 1 g/kg had an
effect similar to that of diclofenac, and reduced the edema by 31%, 51%, 45% and 48%
after 1, 2, 3 and 4 h, respectively. Inhibition of edema was also seen when the extract was
give 30 min after the agonists, with the most effective dose being 0.45 g/kg, which reduced
the edema by 48%, 44%, 50% and 60% after 1, 2, 3, and 4 h, respectively; the other doses
produced effects similar to that of diclofenac. When given immediately after the agonists,
all doses of the extract also inhibited the edema to an extent similar to that seen with
diclofenac. A single dose of extract (0,45 mg/kg) also inhibited the edema induced by
histamine when given 15 min before, 15 min after or immediately after the agonist. The
greatest inhibition was seen when the extract was given 15 min after the agonist, with
reductions of 30%, 60%, 55% and 40% after 0.5, 1.0, 1.5 and 2 h, respectively; these
decreases were similar to that seen with promethazine (4 mg/kg). In carrageenan (600
µg/cavity)-induced peritonitis, the same doses of extract as used for paw edema reduced the
leucocyte migration when given 30 min after the agonist. The most effective dose of extract
was 1 g/kg, with reductions of 39%, 29%, 18% and 43% after 1 ,2, 3 and 4 h, respectively,
which was similar to that seen with diclofenac (1 g/kg). The most effective doses against
neutrophil migration were 0.45 g/kg and 1 g/kg (27% inhibition at all time intervals),
whereas the most effective doses against mononuclear migration were 0.67 and 1 g/kg, both
of which were similar to diclofenac. Histological analysis of the effects of the extract 4 h
after the induction of edema with carrageenan showed a reduction in the amount of edema
and a decrease in leucocyte infiltration compared to mice receiving carrageenan alone.
Together, these results indicate that the ethanolic extract of V. scorpioides has an
antiinflammatory action in experimental models of acute inflammation.
Key words: Ethanolic extract, inflammation, peritonitis, rat paw edema, Vernonia
scorpioides.
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Vernonia scorpioides (Lam) Persons. (A) aspecto geral do hábito
vegetativo; (B) receptáculo floral; (C) Detalhes do botão floral; (D) semente.
04
Figura 2: Fotografia da espécie Vernonia scorpioides (Lam) Persons, detalhe das
folhas adultas e do botão floral.
06
Figura 3: Seqüência dos eventos leucocitários na inflamação. 11
Figura 4: Geração de metabólitos do ácido aracdônico e seus papéis na inflamação 14
Figura 5: Fotografia do pletismógrafo. 21
Figura 6: Fotografia ilustrando a realização da medição do volume da pata de ratos
através do uso do pletismógrafo
22
Figura 7: Aumento do volume da pata em função do tempo (horas) em ratos
inoculados com carragenina (1000 µg/pata). Os animais foram tratados 30
minutos antes (i.p) após a aplicação do estímulo.
29
Figura 8: Aumento do volume da pata em função do tempo (horas) em ratos
inoculados com carragenina (1000 µg/pata). Os animais foram tratados (i.p)
30 minutos após a aplicação do estímulo.
31
Figura 9: Aumento do volume da pata em função do tempo (horas) em ratos
inoculados com carragenina (1000 µg/pata). Os animais foram tratados
imediatamente (i.p) após a aplicação do estímulo.
32
Figura 10: Aumento do volume da pata em função do tempo (minutos) em ratos
inoculados com Histamina. Os animais foram tratados 15 minutos antes da
aplicação do estímulo.
34
Figura 11: Aumento do volume da pata em função do tempo (minutos ) em ratos
inoculados com histamina. Os animais foram tratados imediatamente após a
aplicação do estímulo.
35
Figura 12: Aumento do volume da pata em função do tempo (minutos ) em ratos
inoculados com histamina. Os animais foram tratados 15 minutos após da
aplicação do estímulo.
36
Figura 13: Efeito da administração oral do extrato de V. scorpioides nas doses de 0,45
g/Kg; 0,67g/Kg e 1 g/Kg sobre o processo inflamatório em modelo
experimental de Peritonite em camundongos induzido por carragenina
comparados aos grupos controle (salina e carragenina e tratamento com
diclofenaco sódico ), observando o nº de Leucócitos Totais migrantes para a
cavidade peritonial durante o intervalo de tempo de 1,2,3 e 4 horas após a
indução da inflamação.
39
Figura 14: Efeito da administração oral do extrato de V. scorpioides nas doses de 0,45
g/Kg; 0,67g/Kg e 1 g/Kg sobre o processo inflamatório em modelo
experimental de Peritonite em camundongos induzido por carragenina
comparados ao grupos controle (salina e carragenina e tratamento com
diclofenaco sódico , observando o nº de Neutrófilos migrantes para a
cavidade peritonial durante o intervalo de tempo de 1,2,3 e 4 horas após a
indução da inflamação.
40
Figura 15: Efeito da administração oral do extrato de V. scorpioides nas doses de 0,45
g/Kg; 0,67g/Kg e 1 g/Kg sobre o processo inflamatório em modelo
experimental de Peritonite em camundongos induzido por carragenina
comparados ao grupos controle (salina e carragenina e tratamento com
diclofenaco sódico), observando o nº de células mononucleares migrantes
para a cavidade peritonial durante o intervalo de tempo de 1,2,3 e 4 horas
após a indução da inflamação.
41
Figura 16: Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo controle salina A:
Aumento de 100x. B: aumento de 400x.
44
Figura 17: Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo carragenina. A:
Aumento de 100x. B: Aumento de 400x.
45
Figura 18: Fotomicrografia do grupo diclofenaco sódico.A: Aumento de 100x. B:
Aumento de 400x.
46
Figura 19: Fotomicrografia da lâmina histológica do grupo tratado com a dose de
0,45g/kg do extrato de V. scorpioides. A: Aumento de 100x. B: Aumento
de 400x.
47
Figura 20: Fotomicrografia da lâmina histológica do grupo tratado com a dose de
0,67g/kg do extrato de V. scorpioides A: Aumento de 100x. .B:Aumento
de 400x.
48
Figura 21: Fotomicrografia da lâmina histológica do grupo tratado com a dose de
1,0g/kg do extrato de V. scorpioides. A: Aumento de 100x.B:
Aumento de 400x.
49
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Porcentagem de inibição nº de Leucócitos Totais migrantes para a
cavidade peritonial comparados com o grupo carragenina e os tratamentos
por diclofenaco sódico e o extrato.
42
Tabela 2: Porcentagem de inibição nº de neutrófilos migrantes para a cavidade
peritonial comparados com o grupo carragenina e os tratamentos por
diclofenaco sódico e o extrato.
42
Tabela 3: Porcentagem de inibição nº de neutrófilos migrantes para a cavidade
peritonial comparados com o grupo carragenina e os tratamentos por
diclofenaco sódico e o extrato.
42
SUMÁRIO
1-Introdução 01
1.1 – Fitoterapia
01
1.2 - A Família Asteraceae 02
1.3 - Considerações Gerais sobre Vernonia scorpioides 03
1.4 - Aspectos vasculares e celulares da reação inflamatória aguda 09
1.4.1 - O processo inflamatório. 09
1.4.2 - Os mediadores da inflamação 12
1.4.3 – Inflamação experimental 16
2 – Objetivos 17
3 - Material e métodos 18
3.1 – Aprovação pelo comitê de ética 18
3.2 – Animais 18
3.3 – Protocolo de eutanásia 18
3.4 – Obtenção do extrato 19
3.4.1 – Coleta do material vegetal 19
3.4.2 – O processo extrativo 19
3.5 – Avaliação farmacológica – via intraperitonial 20
3.5.1 – Edema de pata induzido pela carragenina 20
3.5.2 – Edema de pata induzido pela histamina 24
3.6 – Análise histológica 25
3.7 – Avaliação farmacológica – via oral 25
3.7.1 - Peritonite 25
4 - Resultados 28
4.1 – Avaliação farmacológica – via intraperitonial 28
4.1.1 – Edema de pata induzido pela carragenina 28
4.1.2 – Edema de pata induzido pela histamina 33
4.2 – Peritonite induzida pela carragenina 37
4.2.1 – Resultados da migração celular 37
4.3 – Estudo histológico 43
5 - Discussão 50
6 – Conclusão 56
Referências Bibliográficas 57
Anexos 66
1
1. INTRODUÇÃO
1.1 Fitoterapia
A fitoterapia constitui uma forma de terapia medicinal que cresceu notadamente
nestes últimos anos, ao ponto que atualmente o mercado mundial de fitoterápicos gira em
torno de aproximadamente 22 milhões de dólares. O Brasil não se destaca no mercado
mundial de fitoterápicos apesar de possuir uma extensa e diversificada flora (detendo
aproximadamente um terço da flora mundial) ficando inclusive atrás de países menos
desenvolvidos tecnologicamente. No entanto, no Brasil desenvolve-se um grande número
de pesquisas que têm contribuído significativamente para o desenvolvimento da química de
produtos naturais de plantas (YUNES et al., 2001).
Existem muitos setores da sociedade que desenvolvem programas de assistência
fitoterápica baseados nas práticas e saberes populares, tradicionalmente transmitidos, sobre
o uso de plantas. Muitos desses programas, assentados em bases não científicas, contribuem
para agravar o problema social do uso indiscriminado de medicamento. Apesar de se
reconhecer a legitimidade do conhecimento tradicional, uma planta para ser usada em
qualquer atividade ou programa de fitoterapia deve ser cientificamente validada
(ABULQUERQUE et al., 2004).
Carline (1983) propõe que o estudo farmacológico de extratos de plantas brasileiras
conste de três etapas. Primeiramente, os testes farmacológicos devem ser realizados ao
acaso, preferencialmente com vegetais utilizados na medicina popular; comprovando sua
atividade, parte-se para o fracionamento do extrato bruto e para testes farmacológicos das
respectivas frações; a seguir, realiza-se estudo farmacológico detalhado de substâncias
ativas, eventualmente obtidas em estado puro.
Segundo Bachi (1988), Davino (1989), o extrato bruto com ação farmacológica
comprovada e baixa toxicidade podem ser utilizados na terapêutica com vantagens sobre
substâncias puras dele isoladas. A atividade terapêutica do extrato bruto deve-se muitas
vezes, a um conjunto de substâncias com ação sinérgica que contribui para a obtenção de
melhores resultados do que com os compostos isolados.
2
Do ponto de vista de saúde pública é de extrema importância que haja uma avaliação
farmacológica de plantas e preparações utilizadas pela população com propriedades
medicinais.
Há no Brasil, inúmeras famílias botânicas bem representadas em número de táxon e
estudadas entre as quais destacam-se a família dos Compositae (Asteracae) devido ao seu
grande uso popular e grande variedades de espécies freqüentemente citadas em
levantamentos etnobotânicos, podendo citar como exemplos a “Camomila” (Matricaria
chamomila L.), a “Carqueja” (Baccharis trimera Less.), “ erva doce” (Stevia rebaudiana
Ber), “Guaco” (Mikania glomerata) entre outras (MENDES, 2001).
No Vale do Paraíba destaca-se a espécie vegetal “Piracá”, Vernonia sp; que
apresenta ampla distribuição entre a vegetação nativa nos quintais das residências, sendo
utilizada popularmente na forma de infusões para tratamento de edemas e traumatismos.
1.2 A Família Asteraceae
A espécie Vernonia scorpioides (Lam) Persons pertence a família das Compositae
(Asteraceae), que reúne cerca de 1.100 gêneros (180 no Brasil) com aproximadamente
2.500 espécies, de ampla distribuição, sendo a família com maior número de espécies entre
as dicotiledôneas, com inúmeras propriedades farmacológicas devido a grande variedades
de metabólicos secundários por elas produzido (CUNHA, 1989).
Os constituintes químicos mais encontrados entre as espécies desta família são os
terpenos, flavonóides e poliacetilenos, enquanto que as lactônas sesquiterpênicas constitui o
componente químico que desencadeia grande parte da atividade farmacológica dessas
plantas ( DAVINO, 1989; FREIRE, 1996; LOPES, 1991).
Entre as atividades biológicas atribuídas as espécies desta família cita-se a ação
citotóxica tumoral, antibiótica, inibidora de penetração de cercarias de Schitossoma
mansoni, atividade desistimulante de apetite de insetos, alergênica, ação tóxica nos
vertebrados, alelopática ,fungicida, antielmíntica, atividade antiinflamatória
(DAVINO,1989), moluscida (LOPES, 1991).
Entre as 13 tribos que compõem a família Asteraceae, destaca-se a tribo Vernoniae,
uma das mais numerosas, com cerca de 70 gêneros e aproximadamente 1500 espécies. A
3
tribo Vernoniae tem uma distribuição pan tropical, ocorrendo na América, África, Ásia e
Austrália. Reconhece-se dois centros de dispersão do gênero, um no sudeste do Brasil e
outro na África. A tribo presente no Brasil contém 40 gêneros e entre eles o gênero
Vernonia (CUNHA, 1989).
O gênero Vernonia contém cerca de 1000 espécies encontradas nos trópicos do
velho e novo mundo. No Brasil é bastante disseminado, ocorrendo pelo menos 200
espécies, cujo porte pode ser herbáceo, arbustivo e aéreo (HARBONE, 1977).
A variação do aspecto morfológico e vegetativo de suas espécies é extensa; os
caracteres florais são relativamente uniformes (KELEY, 1979).
1.3 Considerações gerais sobre Vernonia scorpioides
Vernonia scorpioides conhecida em algumas regiões do Brasil por Erva-de Preá,
Erva de São Simão, Capichingui-de-bicho, Enxuga, Piracá encontra-se distribuída
geograficamente pelos continentes: Europeu, Asiático, Africano e Americano, e foi
espalhada pela ação do homem. É cultivada em vários países tropicais e alguns
subtropicais.
É uma espécie perene, subarbustiva, bastante ramificada, caule lanuginoso-
pubescente, medindo entre 1 e 2 metros de altura, com reprodução por sementes e por
estaquia. As folhas são alternadas, membranáceas, glabas na face superior e cerício-pilosa
na inferior, pecioladas medindo 6-12 centímetros de comprimento e 3-6 cm de largura. As
inflorecências são terminais, em cimeiras escorpiódes de capítulos sésseis. As flores são
violáceas em números de 20 a 30 por capítulo (LORENZI, 1982) (Figura 1).
A espécie Vernonia scorpioides apresenta a seguinte classificação botânica:
Divisão: Angiospermae
Classe: Dicotyledonea
Sub classe: Asteridae
Ordem: Asterales
Família: Composite Giseke (Asteraceae)
Sub família: Asteróide
Gênero: Vernonia
Espécie: Vernonia scorpioides
4
Figura 1: Esquema Vernonia scorpioides (Lam) Persons. (A) Aspecto geral do hábito vegetativo;
(B) receptáculo floral; (C) Detalhes do botão floral; (D) Semente (Fonte: CABRERA, 1980).
5
No que se refere à anatomia, Carvalho et al., 1884 descreveram a presença de
células de transferência do tipo a em V. scorpioides, ou seja, células companheiras,
altamente especializadas, apresentando projeções parietais, citoplasma denso e numerosas
mitocôndrias caracterizadas por suas cristas abundantes e conspícuas, agrupadas
densamente.
Vernonia scorpioides (Lam) Persons, foi descrita pela primeira vez como Conyza
scorpioides Cass. Essa espécie possui diversas sinonímias, entre elas:
* Chrycossoma reponda Well
* Lepidoploa scorpioides Cass
* Cacalia scorpioides O Huntze
* Vernonia centrioflora Link
* Vernonia flavescens Less
É uma erva comum da vegetação secundária da encosta Atlântica e da Floresta
Latifoliada do alto do Uruguai, no extremo oeste Catarinense, apresentando, portanto área
de dispersão a América Central, desde a Nicarágua até o nordeste da Argentina
(CABRERA, 1980).
No Brasil, apresenta extensa distribuição geográfica, sendo encontrada desde o
Ceará até o Rio Grande do sul, como também no Centro-oeste (MS e MT) (CORREA,
1984).
É uma planta que exige plena luz suportando bem o sol intenso do verão, preferindo
solos argilo-arenosos, não necessariamente férteis, mas drenados (espécie seletiva
higrófita), nestas condições costuma florescer de junho a outubro (CABRERA, 1980). No
entanto, quando encontrada em áreas sombrias e úmidas (planície litorânea) floresce nos
meses de setembro a fevereiro (CORREA, 1984).
A espécie é de fácil cultivo sendo que as partes do vegetal empregadas em medicina
popular são preferencialmente as folhas (Figura 2).
6
Figura 2: Fotografia da espécie Vernonia scorpioides (Lam) Persons, detalhes das folhas adultas e
do botão floral (Dreux, 2004, Bairro dos Freitas - SJC – SP)
Na terapêutica popular e em levantamentos etnobotânicos encontram-se algumas
indicações do uso de V. scorpioides como por exemplo, infecções do estômago (úlceras)
(chás), edemas provocados por traumatismos e agentes infecciosos (Infusão), efeito
sedativo (chás), cura de hemorróidas e leucorrérias (banho das partes afetadas), cura de
desinterias (chás).
Na literatura podemos encontrar estudos farmacológicos realizados com
V. scorpioides onde:
Lopes (1991) verificou a ação desestimulante de apetite em insetos (antifeedant)
contra Locrusta migratória (defesa da planta contra atividade predadora de insetos
herbívoros).
Freire et al., (1996) verificou a existência de propriedades antifúngicas dos extratos
obtidos de folhas e caules de V. scorpioides para Penicilium citrinus. O desenvolvimento
de hifas no meio da cultura, testado na presença dos extratos hexânico e clorofórmicos
7
mostraram-se insipientes, além de formar halos de inibição significativos. Os extratos de
folhas frescas também apresentaram efeitos semelhantes, embora de menor intensidade,
obtendo halos de inibição para Aspergillus alutaceos. Os autores relacionaram a atividade
observada a provável produção de lactonas sesquiterpênicas indicadas pela observação de
sinais característicos do estiramento de carbanilas lactânicas ativas com obsorção entre
1750 nm e 1770 nm no espectro de infravermelho.
Leite et al., (2002) investigaram a atividade de cicatrização a partir do extrato
etanólico de folhas de V. scorpioides comprovando que o tratamento não acelera o tempo
de fechamento do ferimento mais contribui para o processo de regeneração e organização
do novo tecido.
Alguns autores também realizaram estudos referentes a composição fitoquímica de
V. scorpioides como:
Drew et al., (1980) isolaram e identificaram das partes aéreas desta planta um novo
germacranolídeo que foi denominado escorpioidina.
Warning et al., (1987) isolaram e identificaram em partes aéreas de V. scorpioides
um novo tipo de lactona sesquiterpênica denominada escorpiolídeo.
Gomes et al., (1987) descreveram a estrutura em raio-X de 6 - deoximikanokryptin,
um novo guaianolide de V. scorpioides (Lam) Pers.
Andreucci (2002) verificou e descreveu a presença dos princípios ativos presentes
no extrato hidroalcólico de V. scorpioides tais como: alcalóides, flavonóides, taninos,
saponinas e óleo essencial através da análise química qualitativa do extrato de
V. scorpioides.
Freire (2000) isolou e quantificou pela primeira vez um triterpeno, o acetato de
lupeol através de métodos fitoquímicos clássicos. O método de detecção foi estabelecido a
partir de anticorpos antiacetato de lupeol (anti-L Ac). Foram realizados ensaios de Elisa de
captura, segundo a metodologia clássica para a quantificação de haptenos. A maior
concentração de acetato de lupeol foi encontrada nas raízes na casa de vegetação, e na parte
aérea (principalmente no caule) das plantas silvestres, sugerindo existir uma relação entre a
idade das plantas analisadas e o sítio de produção desta susbstância.
Mendes (2001) isolou compostos terpenoidais a partir da fração clorofórmica, de V.
scorpioides por cromatografia em camada delgada preparativa e identificada por
8
espectroscopia de RMN de
1
H e de
13
C. O lupeol e seus derivados lupenona e acetil lupeol
revelaram ter atividade sobre a produção de anticorpos em especial os das classes IgM e
IgG2a. O acetil lupeol apresentou atividade antitumoral, enquanto que o lupeol foi
ineficiente. Já o acetil lupeol inibiu a rejeição aguda a transplantes alogênicos de pele em
camundongos. Os ensaios microbiológicos realizados com o extrato bruto metanólico de V.
scorpioides não inibiu o crescimento dos microrganismos testados; o extrato metanólico
bruto como a fração clorofórmica de V. scorpioides induziu inibição do número de células
secretoras de anticorpos IgM em animais imunizados com antígenos T dependente.
Embora V. scorpioides seja potencialmente importante por suas propriedades
medicinais, permanece pouco estudada quanto a sua padronização no sentido de
proporcionar o controle de qualidade na produção de fitoterápicos. Suas atividades
biológicas e farmacológicas também necessitam ser estudadas com maior profundidade
pois praticamente não existem.
9
1.4 Aspectos Vasculares e Celulares da reação inflamatória aguda:
1.4.1 O Processo inflamatório
A inflamação é uma resposta do organismo a um trauma, cuja característica
fundamental é a de se manifestar de maneira esteriotipada, independente da natureza do
agente lesivo; caracterizando-se por alterações morfofuncionais da microcirculação na área
lesada envolvendo células, tecidos, vasos sanguíneo, e linfáticos. As alterações
estereotipadas podem ser determinadas pela intensidade ou persistência da injúria,
característica do órgão ou tecido atingido e pela capacidade de reação do organismo
(PEGORARO, 1994).
Desde Celsus (contemporâneo de Cristo) que se caracteriza a inflamação por quatro
sinais cardinais “rubor, calor, tumor e dor”. Virchow, no século XIX, acrescentou um
quinto sinal a perda da função (MONTENEGRO et al., 1999).
Desta forma, a inflamação é um processo multimediado e seus sinais e sintomas
podem ser definidos como a expressão dos efeitos da mobilização endógena de mediadores
que atuam localmente (DI ROSA et al., 1971).
A resposta inflamatória ocorre no tecido conjuntivo vascularizado, inclusive no
plasma, nas células circulantes, nos vasos sanguíneos e nos componentes extravasculares
do tecido conjuntivo (COTRAN et al., 1996).
Uma resposta inflamatória, entretanto pode ser transitória ou aguda, com predomínio
de alterações vasculares exudativas, e se o estímulo lesivo original ou modificado
permanecer por períodos relativamente longos, pode modificar-se e adquirir caráter
persistente ou crônico, com grande proliferação celular, que não raramente levará a lesão
funcional do órgão afetado (GARCIA & LEME, 1979).
Na primeira fase da reação inflamatória, a fase aguda, ocorrem fenômenos
vasculares e celulares; as principais mudanças observadas envolvem praticamente três
processos sumariamente caracterizados pelas seguintes fases (ALBERTINE, 2001):
10
1) Mudança de calibre e fluxo na microcirculação levando a vasodilatação das
arteríolas;
2) Aumento da permeabilidade vascular das vênulas em conseqüência da abertura das
junções entre as células levando a formação de exudato rico em proteínas e edema
local;
3) Migração de leucócitos do sangue circulante para o local da lesão.
As alterações que ocorrem nas arteríolas a contração das células endoteliais das
vênulas e as respostas celulares são causadas por substâncias liberadas no local da
inflamação, conhecidos como mediadores inflamatórios. Estes mediadores podem atuar
isoladamente, associadamente ou em seqüência podendo amplificar a resposta inflamatória
influenciando na sua resolução (YOSHIKAI, 2001).
Os mediadores podem ter origem no plasma, células e tecidos agredidos. Entre os
principais mediadores destacam-se: histamina, cininas plasmáticas, serotonina,
prostaglandinas, elementos formados durante a ativação do sistema complemento, proteases
neutras, proteínas catiônicas de origem lisossomal, produtos decorrentes da degradação de
fibrina (PDF), fatores reativos de linfócitos, citocinas, entre outros (LANSEN et al., 1983).
A reação inflamatória é caracterizada pelo acúmulo local de leucócitos
polimorfonucleares no tecido lesado que migram de vasos adjacentes. Os mecanismos de
acúmulo no local da lesão são complexos e dependem de uma seqüência de eventos que
compreendem a marginação, adesão, migração em direção ao estímulo quimiotático,
fagocitose e degradação intracelular, ocorrendo também a liberação extracelular de
produtos de leucócitos (COTRAN et al., 1989) (Figura 3).
11
Figura 3: Seqüência de eventos leucocitários na inflamação (COTRAN, et al., 2000).
Na inflamação existe um aumento da permeabilidade capilar devido a ação dos
mediadores que se formam no local induzindo a contração dos endotélios e pericitos,
separando as junções intracelulares e permitindo a passagem sucessiva de líquido,
macromoléculas e eventualmente de células do sangue para o interstício. (MONTENEGRO
et al., 1999).
O líquido rico em macromoléculas e células que se acumula nos intertíscio da área
constitui o exsudato, que é um fluido extravascular de origem inflamatória contendo altas
concentrações de proteínas e muitos detritos celulares (SIQUEIRA & DANTAS, 2000).
O exudato inflamatório é importante na contenção e limitação da agressão, trazendo
para o interstício anticorpos, complemento e outras macromoléculas envolvidas na inibição
e destruição de agressores, assim como na modulação da própria resposta inflamatória
( MONTENEGRO et al., 1999).
O exudato deforma e comprime os vasos, sobrecarregando a circulação linfática, que
perde a eficiência de drenagem agravando a retenção de água no interstício. Todo este
processo, portanto, contribui para a formação do edema inflamatório (BRASILEIRO,
1998).
12
As células, principalmente neutrófilos são as primeiras a atingirem o sítio da lesão e
migram pelo processo de quimiotactismo se acumulando no sítio da lesão seguido por
leucócitos mononucleares, em períodos mais tardios. Muitos são dotados de propriedades
fagocíticas, englobando material particulado ou microorganismos do seu citoplasma
(GARCIA & LEME, 1979).
Estudos histológicos demonstraram casos de inflamação exudativa aguda com
predomínio de infiltração neutrolítica, seguida de fase crônica caracterizada por
proliferação fibroblastica, formação de vasos sanguíneos e infiltração de mononucleares
(SILVA, 1986; GARCIA & LEME, 1979).
1.4.2 Mediadores da inflamação:
Em termos simples, um mediador pode ser considerado como um mensageiro
químico que tem ação nos vasos sanguíneos e/ou células e contribuem para a resposta
inflamatória. (LANSEN et al., 1983).
Tais substâncias modulam uma série de eventos locais, sendo os principais
vasodilatação, aumento da permeabilidade vascular, opsonização, quimiotaxia para células
inflamatórias, destruição tecidual e dor, como também febre e mal estar. Os mediadores
químicos da inflamação podem ser de origem plasmática ou tecidual (SIQUEIRA &
DANTAS , 2000).
Plasmática:
- Sistema das cininas (Substrato plamático).
- Sistema complemento ( C3a; C5a; C5b – C9) (Proteínas plasmáticas via
fígado, macrófagos).
- Sistema de coagulação (leucócitos).
- Sistema fibrinolítico.
Tecidual:
- Aminas vasoativas: histamina e serotonina (mastócitos e plaquetas).
- Derivados do ácido aracdônico (A.A.) (fosfolipídeos da membrana).
- Enzimas lisossomais (neutrófilos e mastócitos).
- Metaloproteinases de matriz.
13
- Radicais livres derivados do oxigênio (leucócitos).
- Fator ativador de plaquetas (PAF) (leucócitos e mastócitos).
- Citocinas (macrófagos e linfócitos ativados).
- Óxido nítrico (macrófagos e endotélio).
- Fatores do crescimento.
As aminas vasoativas, histamina e serotonina, liberadas dos mastócitos e das
plaquetas podem ser identificadas no início da inflamação aguda. A histamina é o primeiro
mediador a atuar; gerando o aumento da permeabilidade vascular e uma contração do
endotélio venular com alargamento de junções celulares interendoteliais. A serotonina
apresenta ações semelhantes ás da histamina, correspondendo a um segundo mediador pré
formado (COTRAN et al. 1996).
As prostaglandinas originadas da conversão do ácido aracdônico também agem
como importantes substâncias vasodilatadoras. No homem, o ácido aracdônico é o mais
abundante precursor de prostaglandinas, como também prostaciclina, tromboxanos ou
leucotrienos. A liberação do ácido aracdônico ocorre como conseqüência da estimulação
específica de receptores da superfície celular e da subseqüente ativação de fosfolipases do
tipo A
2
. Vários tipos de células liberam ácido aracdônico em resposta a diferentes estímulos
tais como a bradicinina, angiotensina II, vasopressina, trombina, colágeno, adrenalina,
ADP, peptídios quimiotáticos, IgE – Ag, concanavalina A e histamina (CARVALHO,
1990).
Duas grandes rotas do metabolismo do Ácido aracdônico em células de mamíferos
correspondem a via da ciclooxigenase e a via da lipoxigenase. Prostanóides incluindo
prostaglandinas e tromboxano A
2
são produzidos por fosfalipases A
2
e ciclooxigenase e
leucotrienos são produzidos por 5- lipoxigenase (YOSHIKAI, 2001) (Figura 4).
14
Figura 4: Geração de metabólitos do ácido aracdônico e seus papéis na inflamação. (COTRAN,
et al. 2000).
15
As prostaglandinas podem participar de reações alérgicas, como o mais abundante
produto produzido por reação imunológica de mastócitos em pulmão, como a PGD
2
. Efeito
biológico de prostaglandinas produzido durante a reação de mastócitos em tecidos incluem
modulação da musculatura lisa e contração, permeabilidade vascular, sensação de prurido e
dor e agregação plaquetária (WHITE, 1999).
A via da ciclooxigenase conduz a geração de prostaglandinas que incluem PGE
2,
PGD
2,
PGF
2α
, PGI
2
(Prostaciclina e tromboxano (Tx A
2
), todos derivados da ação de
enzimas específicas (COTRAN et al., 1996).
Na via da lipooxigenase a 5-lipooxigenase é a enzima predominante dos neutrófilos.
O principal produto, a HETE, que é quimiotática para neutrófilos é convertida em uma série
de compostos conhecidos como leucotrienos (COTRAN et al., 2000). Dentre os
leucotrienos mais importantes está o LTB, que causa aderência de neutrófilos ao endotélio
das vênulas pós-capilares, sendo também um potente quimiotático para neutrófilos
(CORREA, 2001). O LTC
4
LTD
4,
LTDC
4,
causam vasoconstrição, broncoespasmo e
aumento da permeabilidade vascular (SIQUEIRA & DANTAS, 2000).
Recentemente descobriu-se que o óxido nítrico (NO) pode ser sintetizado por células
do organismo com células endoteliais, macrófagos e por neurônios específicos podendo
desempenhar funções distintas em muitos tecidos. O NO é uma molécula instável capaz de
permear rapidamente membranas biológicas e interagir com a enzima guanilato ciclase
solúvel presente em células vizinhas. Assim, o NO sintetizado nas células endoteliais
difunde-se rapidamente para fora das células de origem para as células musculares lisas
subjacentes, provocando relaxamento e, conseqüentemente vasodilatação e para as
plaquetas do lúmen do vaso, inibindo a adesão e agregação destas (PALMER et al., 1987;
IGNARO, 1989). Além de promover o relaxamento da musculatura lisa, o NO desempenha
outros papéis importantes na inflamação. Reduz a agregação e adesão plaquetária, é
citotóxico para determinados micróbios e células tumorais, e sua produção descontrolada
por macrófagos ativados no choque séptico pode levar a uma vasodilatação periférica
maciça e a choque (COTRAN et al. 2000). Células endoteliais produzem e liberam NO,
após a estimulação por citocinas como MCP-1;IL-6; M-CSF, ICAM – 1 e VCAM – 1
(TEDGUI & MALLAT, 2001).
16
As citocinas podem ser definidas como uma família de peptídeos sintetizados por
monócitos e linfócitos, destacando-se a interleucina 1(IL-1) e o fator de necrose tumoral
(TNF) que participam da resposta inflamatória (MONTENEGRO, 1999). Citocinas são
liberadas também por fagócitos ativados em inflamação aguda. TNF-α é um indutor de
inflamação aguda local causada por bactérias infecciosas ou lipopolisacarídeos. Interleucina
1 e 6 e TNF- α possuem papel importante não somente na indução da inflamação local
mas também na indução da febre que favorece um efeito defensivo contra o agressor por
vários dias (YOSHIKAI, 2001).
1.4.3 – Inflamação experimental:
O estudo da reação inflamatória e o desenvolvimento de novas terapias e drogas
sempre dependeram de modelos animais apropriados (ALBERTINE, 2001).
Do ponto de vista laboratorial existem diversos métodos experimentais empregados
na investigação do processo inflamatório. Estes métodos são bastante variáveis e analisam
alguns aspectos do processo inflamatório (GARCIA & LEME, 1979). Exemplos:
- os fenômenos vasculares precoces: dilatação, alterações do fluxo, dinâmica circulatória;
- as alterações da permeabilidade vascular;
- o desenvolvimento de edemas;
- a pesquisa de fatores quimiotáticos e seu mecanismo;
- os processo fagocitários;
- a análise química e farmacológica de exsudatos inflamatórios e perfusatos de áreas
inflamadas, para detecção de substâncias ativas (mediadores e enzimas).
- as alterações no sistema linfático: composição e fluxo da linfa;
- os fenômenos dolorosos, sua produção e mecanismos;
- as alterações morfológicas globais, a natureza das células presentes, a extensão do
infiltrado celular, a lesão final;
- os processos cicatriciais.
17
2 OBJETIVO
Objetivo geral:
- Investigar o efeito antiiflamatório do extrato hidroalcóolico liofilizado de flores e folhas
de Vernonia scorpioides (Piracá) no processo inflamatório agudo, utilizando-se para isto, os
modelos de edema de pata em ratos e peritonite em camundongos.
Objetivos específicos:
- Verificar o efeito inibitório do extrato hidroalcoólico de V. scorpioides em edema de pata
induzido por carragenina e histamina.
- Verificar a migração leucocitária após a administração do extrato de V. scorpioides.
- Realizar a análise histológica do músculo plantar dos ratos em relação ao tratamento
realizado por diclofenaco sódico e doses do extrato de 0,45g/Kg; 0,67g/Kg e 1,0 g/Kg 4
horas após a indução do edema por carragenina.
- Verificar o melhor tratamento adotado em relação ao extrato hidroalcoólico de V.
scorpioides para edema de pata induzido por carragenina e histamina.
18
3. MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Aprovação pelo Comitê de Ética
Neste trabalho foram aplicados os princípios éticos da experimentação animal de
acordo com a COBEA (Colégio Brasileiro de Experimentação animal) tendo sido aprovado
pelo Comitê de Ética em Pesquisa da Univap seguindo as normas para Prática Didático
Científica da Vivissecação de animais. Protocolo L017/2004/CEP (Anexo A).
3.2 Animais
Foram utilizados ratos da linhagem Wistar, machos adultos, pesando entre 150 e
200g, e camundongos machos, pesando entre 15 e 25g, acondicionados em gaiolas de
polietileno convencionais (n = 6) em condições de temperatura controlada (22ºC á 28ºC),
ciclo de luz controlado (período de luz 6:00 ás 18:00 h) e recebendo água e ração ad
libitum.
3.3 Protocolo de Eutanásia
Os animais foram anestesiados com 0,05 mL de cloridrato de Xilazina mais 0,05 mL
cloridrato de Ketamina (10mg/Kg) injetados intraperitonialmente.
Os animais ainda sob o efeito do anestésico foram sacrificados em câmara fechada
com Halotano .
19
3.4 Obtenção do extrato
3.4.1 Coleta do Material Vegetal
A espécie vegetal Vernonia scorpioides foi cultivada durante um período de 2 anos
em um sítio particular localizado no Bairro dos Freitas no município de São José dos
Campos onde foi realizada a coleta do material vegetal (folhas e flores) no período de
intensa floração, em junho de 2003. A identificação botânica já havia sido realizada em
1996, no Instituto de Botânica pela Prof Drª Silvia Chiléia especialista na família
Asteraceae (Anexo B).
3.4.2 O Processo extrativo
As folhas e flores de V. scorpioides foram secas á temperatura ambiente durante 10
dias, posteriormente foram colocadas numa estufa de lâmpadas de 100 watts por mais um
período de 10 dias, terminando-se a desidratação total do material numa estufa com
temperatura controlada á 40º C por mais 3 dias. Após a dissecação total, o material foi
moído em moinho elétrico de facas. O pó obtido foi pesado e acondicionado em frasco
âmbar e mantido á temperatura ambiente por aproximadamente uma semana.
O extrato fluido foi preparado em percolador de aço inoxidável com capacidade para
5000 mL segundo o processo da Farmacopéia Brasileira 1959, utilizando-se 650g da droga
pulverizada, 3000 mL de álcool etílico 70%. A mistura permaneceu no percolador durante
o período de seis dias onde foi feita a primeira extração. Adicionou-se ao resíduo a mesma
quantidade de álcool etílico 70% (3000 mL) e a mistura foi agitada por mais três dias. Este
processo foi repetido por mais uma vez totalizando três extrações (ANDREUCCI, 2002;
MENDES, 2001).
O extrato líquido obtido foi concentrado com o auxílio de um rotoevaporador,
obtendo-se 138g de extrato concentrado (rendimento de 21%). O extrato foi liofilizado no
Laboratório do DR Stephem Hyslop – FCM – Unicamp.
20
3.5 Avaliação Farmacológica – via intraperitonial
3.5.1 Edema de pata induzido pela carragenina
Avaliação do processo inflamatório
O processo inflamatório agudo foi induzido pela administração de carragenina
(1000µg/0,1 mL/ pata) no tecido subcutâneo do coxim plantar direito dos animais, sendo o
edema medido através de plestimógrafo (UGO BASILLE 7140) Plethysmometer, ornano
IMBIBENTE BBC 97 com precisão de duas casas decimais.
O Método utilizado para avaliação do edema inflamatório foi o método da
pletismografia de VAN ARMAN et al., (1965). (Figura 5 e 6). A primeira medida do
volume da pata foi feita imediatamente antes da injeção do agente irritante e as demais
foram feitas de uma em uma hora no período de 4 horas. Nesse método a diferença de
volume da pata medido por imersão de líquido reflete o edema acumulado.
O aumento do volume das patas foi calculado pela diferença entre o volume inicial
da pata (antes da injeção do agente inflamatório) e o volume a cada hora, durante um
período de 4 horas como pode ser observado na figura 6. Os resultados foram expressos
como aumento do volume de pata (mL).
Tratamento dos animais
Nos experimentos para se obter a curva dose resposta do extrato de V. scorpioides
foram utilizadas três concentrações das doses do extrato (0,45g/Kg; 0,67g/Kg e 1,0 g/Kg)
que foram diluídas em 0,3 mL de água deionizada .A determinação das doses foram
baseadas no estudo da toxicidade aguda segundo MONTEIRO, (1996); GAD &
CHENGELIS, 1998).
O diclofenaco sódico foi utilizado em todos os tratamentos com o objetivo de
comparar o efeito antiinflamatório produzido com o extrato vegetal.
21
Figura 5: Fotografia Pletismógrafo (Univap 2005).
22
Figura 6: Fotografia ilustrando a realização da medição do volume da pata em ratos através do
plestismógrafo
(Univap, 2005).
23
Foram realizados os seguintes protocolos:
Protocolo 1:
Tratamento com o diclofenaco e o extrato 30 minutos antes da indução do edema por
carragenina.
Protocolo 2:
Tratamento com o diclofenaco e o extrato imediatamente com a indução do edema por
carragenina.
Protocolo 3:
Tratamento com o diclofenaco e o extrato 30 minutos após a indução do edema por
carragenina.
Todos os protocolos foram compostos por 30 animais, divididos em 5 grupos (n = 6).
Grupo 1: Carragenina (1000µg/pata) - controle
Grupo 2: Carragenina (1000µg/pata) + Tratamento com diclofenaco sódico
(10 mg/Kg)(i.p).
Grupo 3: Carragenina (1000µg/pata) + Tratamento com o extrato de
V. scorpioides na dose de 0,45g/Kg (i.p).
Grupo 4: Carragenina (1000µg/pata) + Tratamento com o extrato de
V. scorpioides na dose de 0,67g/Kg (i.p).
Grupo 5: Carragenina (1000µg/pata) + Tratamento com o extrato de
V. scorpioides na dose de 1g/Kg (i.p).
24
3.5.2 – Edema de pata induzido por histamina
Avaliação do processo inflamatório
O processo inflamatório agudo foi induzido por administração de histamina na dose
de 50µg/0,1 mL/ pata (CARVALHO et al, 1999) no tecido subcutâneo do coxim plantar
direito dos ratos, sendo o edema medido através de plestimógrafo.
Tratamento dos animais
Após a indução do edema por histamina os ratos foram tratados por via
intraperitonial (i.p) com a dose única de extrato de 0,45g/Kg diluído em 0,3 mL de água
deionizada. Os animais em todos os experimentos foram tratados com Fernegam
(Cloridrato de prometazina) na dose de 4 mg/Kg (COELHO et al., 2004).
Foram realizados os seguintes Protocolos:
Protocolo 4:
Tratamento com Fernegan e Extrato 15 minutos antes da indução do edema por histamina.
Protocolo 5:
Tratamento com Fernegam e o extrato imediatamente após a indução do edema por
histamina.
Protocolo 6:
Tratamento com Fernegan e o Extrato 15 minutos depois da indução do edema por
histamina.
25
Todos os protocolos foram compostos por 18 animais divididos em 3 grupos (n = 6).
Grupo 1: Histamina (50µg/pata) – controle
Grupo 2: Histamina (50µg/pata) + Cloridrato de prometazina (4mg/Kg) (i.p)
Grupo 3: Histamina (50µg/pata) + tratamento com extrato de V. scorpioides na
dose de 0,45 g/Kg (i.p).
3.6 Análise histológica
A análise histológica foi realizada para se confirmar o efeito antiiflamatório do
extrato de V. scorpioides.
Ao término da 4ª hora do experimento de edema de pata induzido por carragenina o
músculo plantar foi retirado para análise histológica e fixado em formol 10 % por um
período de 7 dias.
Após este período a peça foi desidratada em etanol com porcentagens crescentes
(50%, 70%, 80%, 90%) por períodos de 1 hora e finalmente em álcool 100% durante 8
horas. A peça desidratada foi diafanizada em xilol por 4 horas, permanecendo em parafina
ou paraplast por 4 horas na estufa á 58ºC para então ser emblocada para a realização dos
cortes histológicos. As peças foram coradas com eosina e hematoxilina e analisadas em
microscópico óptico Karl Zeiss e fotografadas com câmara Olimpus BB12 acoplada ao
microscópio CX41.
3.7 – Avaliação Farmacológica – via oral
3.7.1- Peritonite
Indução da peritonite
Os camundongos receberam 600 µg/cavidade carragenina suspensa em 0,1 mL
solução fisiológica estéril através de injeção intraperitonial para a indução da peritonite e
foram tratados por via oral com o extrato de V. scorpioides através de gavagem com as três
26
doses utilizadas no experimento com edema de pata por carragenina (0,45g/Kg; 0,67g/Kg
1,0g/Kg) 30 minutos após a aplicação do agente flocógeno (CARVALHO et al., 1999) e
comparados com tratamento com diclofenaco sódico (10 mg /Kg) e o grupo salina.
Foi realizado o seguinte protocolo:
Protocolo 7
Grupo 1: Salina estéril (0,1mL/cavidade) (i.p)
Grupo 2: Carragenina (600µg/cavidade) (i.p) - controle
Grupo 3: Carragenina (600µg/cavidade) (i.p) + Tratamento com diclofenaco
sódico (10 mg/Kg) (v.o).
Grupo 4: Carragenina (600µg/cavidade) (i.p) + Tratamento com o extrato de
V. scorpioides na dose de 0,45g/Kg (v.o).
Grupo 5: Carragenina (600µg/cavidade) (i.p) + Tratamento com o extrato de
V. scorpioides na dose de 0,67g/Kg (v.o).
Grupo 6: Carragenina (600µg/cavidade) (i.p) + Tratamento com o extrato de
V. scorpioides na dose de 1g/Kg (v.o).
Os animais foram sacrificados 1, 2, 3 e 4 h após a indução da peritonite em câmara
fechada utilizando-se Halotano. Em seguida suas cavidades peritoniais foram lavadas com
1mL de solução contendo PBS (dissolvido em 9 partes de água destilada) e 10 µl de
heparina. O volume do interior da cavidade foi coletado com pipeta automática e em
seguida foram feitas as contagens de leucócitos totais e contagem diferencial.
Contagem total de leucócitos
Para a contagem do número total de células presentes no lavado peritonial utilizou-
se 20µl do lavado que foram diluídos em líquido de Tukey (380 µl). Para a contagem foi
utilizada a câmara de Neubauer com auxílio de microscópio óptico Karl Zeiss sob aumento
de 40x. Os resultados foram expressos como número total de leucócitos por cavidade.
27
Contagem diferencial de leucócitos
Para a contagem diferencial de leucócitos, alíquotas de 100µl da suspensão celular
foram utilizadas para o preparo do citoesfregaço em citocentrífuga (FANAEM – Citospim).
A coloração foi realizada pelo método de Instant – Prov e a contagem diferencial das
células foi realizada com auxílio de um microscópio óptico (Karl Zeis) com objetiva de
imersão em óleo sob aumento de 100x. As populações celulares avaliadas foram de células
mononucleares e neutrófilos.
Análise estatística
Os dados foram analisados estatisticamente pelo teste de variância a 5% de
probabilidade (ANOVA) e quando da necessidade de outro teste para determinação da
diferença encontrada foi utilizado o teste de Tukey, também com 5% de probabilidade. Os
resultados estão expressos na forma de gráficos, que foram escolhidos de acordo com a
melhor representação para cada tipo de experimento.
28
4. RESULTADO
4.1 Avaliação farmacológica – via intraperitonial
4.1.1 Edema de pata induzido pela carragenina
A administração de carragenina (0,1mL a 1%) no interior das patas dos ratos causou
aumento progressivo do volume das patas que foi mensurado uma hora após a aplicação do
agente irritante, apresentando pico máximo na 3ª hora e a redução do volume a partir deste
momento em todos os tratamentos realizados.
No experimento de edema de pata induzido por carragenina determinou-se as curvas
dose resposta do extrato hidroalcoólico de V. scorpioides quando administrado
intraperitonialmente avaliando-se uma possível relação entre a dose administrada e o
aparecimento de um efeito antiiflamatório.
No tratamento realizado 30 minutos antes da indução do edema por carragenina
todas as doses do extrato diminuíram o edema em relação ao grupo controle. O diclofenaco
sódico diminuiu o edema na proporção de 31%, 51%,54%, 40% respectivamente na 1ª, 2ª,
3ª e 4ª hora e a melhor dose do extrato para este tratamento foi a de 1 g/Kg, com ação
semelhante ao diclofenaco sódico, na proporção de 31%, 51%, 45% e 48% respectivamente
na 1ª, 2ª, 3ª e 4ª hora. (Figura 7)
29
0 1 2 3 4 5
0
1
2
3
Carragenina 1000 µg/Kg (n=6)
Di cl ofenaco 10 mg/Kg (n=6)
Extrato 0,45g/Kg ( n=6)
Extrato 0,67g/Kg ( n=6)
Extrato 1,0g/Kg ( n=6)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Tempo (Horas)
Volume podal (mL)
Figura 7: Aumento do volume da pata em função do tempo (horas) em ratos inoculados com carragenina
(1000 µg/pata). Os animais foram tratados 30 minutos antes (i.p.) com o extrato e diclofenaco, após a
aplicação do estímulo (n = 6). Os valores estão representados como média +
DP para *P< 0,05, ** P< 0,01,
em relação ao controle.
30
A figura 8 representa o tratamento realizado imediatamente a indução do edema por
carragenina. Observamos a evolução do edema de pata induzido pela carragenina e
diminuição do edema quando tratados com diclofenaco e três doses do extrato. Nota-se que
na primeira hora para a dose 0,45g/Kg do extrato, um efeito similar ao diclofenaco e nas
demais horas com a mesma dose do extrato houve uma redução significativa do edema em
44% (2ª hora); 50 % (3ª hora) e 60 % na 4ª hora, comparado ao grupo controle.
As outras duas doses utilizadas (0,67g/Kg e 1g/Kg) também provocaram redução do
edema em relação ao grupo controle, com efeito similar ao diclofenaco.
No tratamento realizado 30 minutos após a indução do edema por carragenina todas
as doses diminuíram o edema de pata em relação ao grupo controle e ao tratamento
realizado com o diclofenaco sódico. Nota-se que na 1ª hora o extrato, na dose de 1g/Kg tem
um efeito similar ao diclofenaco sódico, apresentando posteriormente nas demais horas
uma significativa redução do edema em relação ao grupo controle na proporção de 64%,
72% e 40% respectivamente para a 2ª, 3ª e 4ª hora.
A dose 0,45 g/Kg reduziu o edema em 64%, 59%, 63%, 55% na 1ª, 2ª, 3ª e 4ª hora,
respectivamente. As doses utilizadas neste tratamento reduziram o edema numa proporção
semelhante, não havendo uma diferença estatística significativa entre elas (Figura 9).
Para analisar a porcentagem de inibição do extrato em todos os experimentos de
edema de pata utilizou-se como método a área da curva (expresso em porcentagem).
31
0 1 2 3 4 5
0
1
2
Car r agenina 1000
µ
g/Pata (n=6
)
Di clofenaco 10 mg/Kg ( n=6)
Extr ato 0,45g/kg ( n=6)
Extrato 0,67g/Kg ( n=6)
Extrato 1,0g/Kg ( n=6)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Tempo (Horas)
Volume podal (mL)
Figura 8: Aumento do volume da pata em função do tempo (horas) em ratos inoculados com carragenina
(1000 µg/pata). Os animais foram tratados (ip) imediatamente a aplicação do estímulo com o extrato e o
diclofenaco n=6). Os valores estão representados como média +
DP *P< 0,05, em relação ao controle.
.
32
0 1 2 3 4 5
0
1
2
Car r ageni na 1000
µ
g/Kg ( n=6)
Di cl ofenaco 10 mg/Kg ( n=6)
Extr ato 0,45g/Kg ( n=6)
Extr ato 0,67g/Kg ( n=6)
Extr ato 1,0 g/Kg (n=6)
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
*
Tempo (horas)
Volume podal (mL)
Figura 9: Aumento do volume da pata em função do tempo (horas) em ratos inoculados com carragenina
(1000 µg/pata). Os animais foram tratados 30 minutos após (ip) a aplicação do estímulo pelo extrato e
diclofenaco (n=6). Os valores estão representados como média +
DP *P< 0,05, ** P< 0,01, ***P< 0,001 em
relação ao controle.
33
4.1.2 Edema de pata induzido pela histamina
O edema de pata provocado por histamina obteve seu pico máximo aos 60 minutos,
onde o edema foi mensurado de 30 em 30 minutos após a aplicação do agente irritante. O
volume da pata voltou ao nível normal após 120 minutos.
Neste experimento o edema foi mensurado até o 180 minutos onde foram realizados
os seguintes tratamentos: 15 minutos antes, imediatamente e 15 minutos depois da indução
do edema pelo extrato e fernegam, devido ao fato do pico máximo do edema provocado
pela histamina ocorrer aos 60 minutos.
No tratamento realizado 15 minutos antes da indução do edema por histamina
observamos que a dose de 0,45g/Kg do extrato diminuiu o edema aos 30 minutos em 9,6%;
60 minutos em 32%; 90 minutos em 32% e 120 minutos em 15% . O grupo tratado pelo
fernegam diminuiu o edema aos 30 minutos em 41%, aos 60 minutos em 55%, 90 minutos
em 62% e 120 minutos em 60 % apresentando melhor resultado comparado á dose do
extrato utilizado. (Figura 10)
No tratamento realizado imediatamente após a indução do edema por histamina
observamos que o extrato na dose de 0,45g/Kg teve ação similar ao fernegam (Cloridato de
Prometazina), reduzindo em ambos tratamentos aos 30 minutos em 30%, aos 60 minutos
60% aos 90 minutos 35% e 120 minutos 40 %. Não houve diferença significante após os 90
minutos entre grupo controle, extrato e Fernegam. (Figura 11)
A figura 12 representa o tratamento com Fernegam e extrato realizado 15 minutos
após da indução do edema por histamina.
Para este tratamento o fernegam e o extrato diminuíram o edema aos 30 minutos,
numa proporção menor que aos 60 minutos onde o extrato e o fernegam diminuíram o
edema na proporção de 21%, apresentando portanto uma curva semelhante nos demais
intervalos como pode ser observado na figura 12.
34
0 30 60 90 120 150 180
0.0
0.1
0.2
0.3
0.4
Hi stamina 50µg/pata ( n=6)
Fer negan 4mg/pata ( n=6)
Extrato 0,45 g/Kg ( n=6)
*
*
*
*
*
*
Tempo (Minutos)
Volume podal (mL)
Figura 10: Aumento do volume da pata em função do tempo (minutos) em ratos inoculados com histamina.
Os animais foram tratados com Fernegam e extrato 15 minutos antes da aplicação do estímulo. Os valores
estão representados como média +
para animais * P < 0,05, ** P < 0,01 em relação ao grupo controle.
35
0 30 60 90 120 150 180
0.00
0.25
0.50
0.75
Hi stami na 50
µ
g/pata (n=6)
Fer negam 4mg/Kg ( n=6)
Extr ato 0,45g/Kg (n=6)
*
*
*
Tempo (Minutos)
Volume podal (mL)
Figura 11: Aumento do volume da pata em função do tempo (minutos) em ratos inoculados com Histamina.
Os animais foram tratados com Fernegam e extrato imediatamente com a aplicação do estímulo. Os valores
estão representados como média +
DP para 6 animais *P < 0,05, ** P < 0,01 em relação ao grupo controle
.
36
0 30 60 90 120 150 180
0.00
0.25
0.50
0.75
Hi stami na 50 µg/pata ( n=6)
Fer negan 4mg/Kg ( n=6)
Extr ato 0,45g/Kg (n=6)
*
*
*
*
*
Tempo (Minutos)
Volume podal (mL)
Figura 12: Aumento do volume da pata em função do tempo (minutos) em ratos inoculados com histamina.
Os animais foram tratados com Fernegam e extrato 15 minutos após a aplicação do estímulo. Os valores estão
representados como média +
DP para animais * P < 0,05, ** P < 0,01 em relação ao grupo controle.
37
4.2 Peritonite induzida pela carragenina
Através do uso do estímulo carragenina é possível produzir uma resposta
inflamatória aguda na cavidade peritonial com predominância de um grande número de
células polimorfonucleares presentes no exsudato.
Os resultados mostram a migração de leucócitos Totais e Diferenciais durante a 1ª,
2ª,3ª e 4ª horas, revelando a quantidade de células que migraram para o local inflamado nas
respectivas horas (Figura 13, 14 e 15).
Para calcular os valores adequados e realizar a confecção dos gráficos, na contagem
total e diferencial, utilizamos as seguintes fórmulas (CORREA, 2001) (obtidas pela
fundação Oswaldo Cruz):
Contagem Total
Valor da contagem x 2,5 x 40 x 1000 (Resultado desta multiplicação corresponde ao valor
real). Onde:
2,5 é o valor de correção da câmara de Newbawer
40 e o valor da diluição (Líquido de Turkey)
1000 é o fator da lavagem da cavidade.
Contagem diferencial
Valor da contagem total ________ 100%
X (Valor real) ________ nº diferencial %
4.2.1 Resultados da migração celular
Contagem Total
Na Figura 13 estão expressos o resultados do experimento, podendo observar a ação
antiinflamatória do diclofenaco sódico e do extrato de V. scorpioides sobre o processo de
migração leucocitária em camundongos (contagem total).
A contagem do número total de leucócitos que migraram para a cavidade peritonial
foi feita durante o intervalo de tempo de uma hora em todos os grupos onde foi aberta a
38
cavidade peritonial dos animais durante a 1ª, 2ª, 3ª e 4ª horas após a indução de peritonite
por carragenina e os resultados podem ser observados na figura 13.
Contagem diferencial
Na contagem diferencial de células determinou-se o número de neutrófilos e células
mononucleares que migraram durante a 1ª, 2ª, 3ª e 4ª hora após a indução de peritonite por
carragenina. Foram contadas 100 células por lâmina diferenciadas entre neutrófilos e
células mononucleares até atingir o número total. O resultado foi expresso em porcentagem.
Os valores da migração de neutrófilos analisados durante o intervalo de tempo de 1
á 4 horas após a indução de peritonite por carragenina estão expressos em porcentagem
com o mostra a figura 12 . O melhor resultado obtido em relação as doses utilizadas foi
com a dose de 1g/Kg que diminuiu o edema em todos intervalos de tempo observados
(Tabela 2).
A Figura 13 expressa os valores em porcentagem da migração de células
mononucleares analisados durante o intervalo de tempo de 1 á 4 horas após a indução da
peritonite por carragenina. Observamos que a dose de 0,67g/Kg e 1,0 g/Kg inibiram a
migração de células mononucleares. A dose 2 apresentou um efeito significativo em relação
ao grupo carragenina e e a dose 1 (Tabela 3). A dose de 1g/Kg apresentou o melhor
resultado observado na quarta hora com valores semelhantes ao diclofenaco sódico e á dose
2.
Para melhor compreensão dos resultados da migração leucocitária induzida por
carragenina os resultados estão expressos em porcentagem de inibição do número de
leucócitos totais, neutrófilos e células mononucleares migrantes para a cavidade peritonial,
comparados com grupo controle carragenina em relação aos tratamentos realizados pelo
diclofenaco sódico, e as doses do extrato de V. scorpioides durante o intervalo de tempo de
4 horas nas tabelas 1, 2 e 3.
39
A
salina Carrag Diclof Dose 1 Dose 2 Dose 3
0
100
200
1 hora
10
6
Leucócitos totais por
cavidade (mm
3
)
**
B
salina Carrag Diclof Dose 1 Dose 2 Dose 3
0
50
100
150
*
2 horas
10
6
Leucócitos totais por
cavidade (mm
3
)
D
Salina Carrag Diclof Dose 1 Dose 2 Dose 3
0
50
100
150
*
*
4 horas
10
6
Leucócitos totais por
cavidade (mm3)
Figura 13: Efeito da administração oral do extrato de V. scorpioides nas doses de 0,45 g/Kg; 0,67g/Kg e 1
g/Kg sobre o processo inflamatório de peritonite em camundongos induzido por carragenina comparados aos
grupos controle (salina e carragenina e tratamento com diclofenaco sódico ), observando o nº de leucócitos
totais migrantes para a cavidade peritonial durante o intervalo de tempo de 1, 2 ,3 e 4 horas após a indução da
inflamação. Os valores estão representados como média +
DP * P < 0,05, ** P < 0,01 em relação ao grupo
controle.; P < 0,01
diclofenaco x extrato.(A=1; B=2; C=3 e D=4 horas)
C
salina Carrag Diclof Dose 1 Dose 2 Dose 3
0
50
100
150
*
3 horas
10
6
Leucócitos totais por
cavidade (mm
3
)
Carragenina 600µg/pata(n=6)
Diclofenaco 10 mg/Kg (n=6)
Dose1; 045g/Kg (n=6)
Dose2; 0,67g/Kg (n=6)
Dose3
;
1
,
0
g
/K
g
(
n=6
)
40
A
Salina Carrag Diclof Dose 1 Dose 2 Dose 3
0
50
100
150
*
*
1 hora
10
6
Neutrófilos por cavidade
(mm
3
)
B
Salina Carrag Diclof Dose 1 Dose 2 Dose 3
0
50
100
150
*
*
2 horas
10
6
Neutrófilos por cavidade
(mm
3
)
C
Salina Carrag Diclof Dose 1 Dose 2 Dose 3
0
25
50
75
100
*
*
3 horas
10
6
Neutrófilos por cavidade
(mm
3
)
*
D
Salina Carrag Diclof Dose 1Dose 2Dose 3
0
25
50
75
100
*
*
4 horas
10
6
Neutrófilos por cavidade
(mm
3
)
Figura 14: Efeito da administração oral do extrato de V. scorpioides nas doses de 0,45 g/Kg(n=6);
0,67g/Kg(n=6) e 1 g/Kg(n=6) sobre o processo inflamatório de Peritonite em camundongos induzido por
carragenina comparados ao grupos controle (salina e carragenina e tratamento com diclofenaco sódico ,
observando o nº de neutrófilos migrantes para a cavidade peritonial durante o intervalo de tempo de 1, 2, 3 e 4
horas após a indução da inflamação. Os valores estão representados como média +
DP * P < 0,05, ** P < 0,01
em relação ao grupo controle P < 0,01
diclofenaco x extrato.(A=1; B=2; C=3 e D= 4 horas)
Carragenina 600µg/pata(n=6)
Diclofenaco 10mg/Kg (n=6)
Dose 1 = 0,45 g/Kg; (n=6)
Dose 2 = 0,67g/Kg; (n=6)
Dose 3 = 1
,
0
g
/K
g;
(
n=6
)
41
A
Salina Carrag Diclof Dose 1 Dose 2 Dose 3
0
10
20
30
40
1 hora
10
6
Mononucleares por cavidade
(mm
3
)
*
*
*
*
B
Salina Carrag Diclof Dose 1 Dose 2 Dose 3
0
10
20
30
**
*
2 horas
10
6
mononucleares por cavidade
(mm
3
)
*
C
Salina Carrag Diclof Dose 1 Dose 2 Dose 3
0
10
20
30
40
*
**
3 horas
10
6
Mononucleares por
cavidade (mm
3
)
*
D
Salina Carrag Diclof Dose 1 Dose 2 Dose 3
0
10
20
30
40
*
*
*
*
4 horas
10
6
mononucleares por cavidade
(mm
3
)
Figura 15: Efeito da administração oral do extrato de V. scorpioides nas doses de 0,45 g/Kg; 0,67g/Kg e 1
g/Kg sobre o processo inflamatório em modelo experimental de Peritonite em camundongos induzido por
carragenina comparados ao grupos controle (salina e carragenina e tratamento com diclofenaco sódico),
observando o nº de células mononucleares migrantes para a cavidade peritonial durante o intervalo de tempo
de 1,2,3 e 4 horas após a indução da inflamação. Os valores estão representados como média +
DP * P < 0,05,
** P < 0,01 em relação ao grupo controle; P < 0,01
diclofenaco x extrato. (A=1; B=2; C=3 e D= 4 horas)
Carragenina 600µg/pata(n=6)
Diclofenaco 10mg/Kg (n=6)
Dose 1 = 0,45 g/Kg; (n=6)
Dose 2 = 0,67g/Kg; (n=6)
Dose 3 = 1
,
0
g
/K
g;
(
n=6
)
42
Tabela 1: Porcentagem de inibição nº de Leucócitos Totais migrantes para cavidade peritonial comparados
com o grupo carragenina e os tratamentos por diclofenaco sódico e extrato
Tempo
Diclofenaco Extrato 0,45 g/Kg Extrato 0,67 g/Kg Extrato 1,0 g/Kg
1H
Inibiu 21% Não houve inibição Inibiu 4,3% Inibiu 37%
2H
Inibiu 34% Não houve inibição Inibiu 13% Inibiu 21%
3H
Inibiu 20% Não houve inibição Inibiu 2,5% Inibiu 19%
4H
Inibiu 32% Não houve inibição Inibiu 17,5% Inibiu 49%
.
Tabela 2: Porcentagem de inibição nº Neutrófilos migrantes para cavidade peritonial comparados com o
grupo carragenina e os tratamentos por diclofenaco sódico e extrato
Tempo
Diclofenaco Extrato 0,45 g/Kg Extrato 0,67 g/Kg Extrato1,0 g/Kg
1H
Inibiu 5,2% Não houve inibição Não houve inibição Inibiu 26,5%
2H
Inibiu 34% Não houve inibição Não houve inibição Inibiu 20%
3H
Inibiu 11% Não houve inibição Não houve inibição Inibiu 33,%
4H
Inibui 48% Inibiu 7,5% Inibiu 5,5% Inibiu 46,5%
.
Tabela 3: Porcentagem de inibição nº células mononucleares migrantes para cavidade peritonial comparados
com o grupo carragenina e os tratamentos por diclofenaco sódico e extrato
Tempo
Diclofenaco Extrato 0,45 g/Kg Extrato0,67 g/Kg Extrato 1,0 g/Kg
1H
Inibiu 57,% Inibiu 46% Inibiu 74,% Inibiu 56%
2H
Inibiu 22,5% Não houve inibição Inibiu 66,5% Não houve inibição
3H
Inibiu 68,5% Não houve inibição Inibiu 71% Inibiu 22%
4H
Inibiu 66% Não houve inibição Inibiu 67% Inibiu 62%
43
4.3 Estudo Histológico
A figura 16 demonstra as lâminas histológicas da região plantar da pata de ratos, 4
horas após a injeção de salina estéril. Observa-se a ausência de células inflamatórias e
edema tecidual, um capilar sanguíneo com acúmulo de células intravasculares envolvidas
na resposta inflamatória. A figura 17 demonstra as lâminas histológicas do tecido plantar da
pata de ratos após 4 horas da indução do edema de pata por carragenina. Podemos observar
edema tecidual com espaçamento entre as fibras musculares em resposta transitória aguda e
infiltrados celulares precoces com grande número de neutrófilos e outras células
inflamatórias acumulados em área de inflamação aguda.
A figura 18 demonstra as lâminas histológicas do grupo tratado com diclofenaco
sódico. Observa-se a redução do edema tecidual e do infiltrado inflamatório (influxo
leucocitário).
No tratamento realizado com todas as doses do extrato de V. scorpioides, podemos
observar uma diminuição significativa da infiltração leucocitária no tecido plantar da pata
dos ratos (figuras 19, 20 e 21) e redução do edema induzido pela carragenina.
44
Prancha 1
Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo controle salina 4 horas após a realização
do experimento. Observa-se a ausência de células inflamatórias e edema tecidual.
Figura 16: Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo controle salina.
A: Aumento de 100x. B: Aumento de 400x. Univap 2005.
A
B
45
Prancha 2
Fotomicrografia das lâmina histológicas do grupo controle carragenina após 4 horas da
indução do edema. Observa-se o edema tecidual e um grande número de neutrófilos e
outras células inflamatórias.
Figura 17: Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo carragenina . A:
Aumento de 100x. B: aumento de 400x. Univap 2005.
A
B
46
Prancha 3
Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo diclofenaco sódico. Observa-se a
redução do edema tecidual e diminuição do infiltrado leucocitário.
Figura 18: Fotomicrografia do grupo diclofenaco sódico.A: Aumento de 100x.
B: aumento de 400x. Univap 2005.
A
B
47
Prancha 4
Fomicrografia das lâminas histológicas do grupo tratado pela dose de 0,45g/kg do extrato
após a 4ª hora da indução do edema por carragenina. Observa-se a presença de um capilar
sanguíneo com acúmulo de células intravasculares envolvidas na resposta inflamatória.
Figura 19: Fotomicrografia da lâmina histológica do grupo tratado com a dose
de 0,45g/kg do extrato de V. scorpioides. A: Aumento de 100x . B: Aumento de
400x . Univap 2005.
A
B
48
Prancha 5
Fomicrografia das lâminas histológicas do grupo tratado pela dose de 0,67g/kg do extrato
após a 4ª hora da indução do edema por carragenina observa-se redução do edema e do
número de células envolvidas no processo inflamatório
Figura 20: Fotomicrografia da lâmina histológica do grupo tratado com a
dose de 0,67g/kg do extrato de V. scorpioides. A: Aumento de 100x . B:
Aumento de 400x Univap 2005.
A
B
49
Prancha 6
Fotomicrografia das lâminas histológicas do grupo tratado pela dose de 1,0g/kg do extrato
após a 4ª hora da indução do edema por carragenina. Observa-se redução do edema e do
número de células envolvidas no processo inflamatório.
Figura 21: Fotomicrografia da lâmina histológica do grupo tratado com a dose
de 1,0g/kg do extrato de V. scorpioides. Aumento de 100x. B: Aumento de 400x
Univap 2005.
A
B
50
5. DISCUSSÃO
Os resultados do presente estudo demonstraram que o extrato hidroalcoólico de
V. scorpioides inibiu o processo de inflamação aguda nos modelos utilizados de edema de
pata em ratos induzido tanto pela carragenina como por histamina e migração leucocitária
por peritonite em camundongos.
De acordo com dados da literatura, o edema de pata induzido pela carragenina está
associado com três fases distintas de alterações de permeabilidade vascular induzida por
mediadores (SPECTOR, 1962; VAN ARMAN et al., 1965; WILLIS, 1969; DI ROSA et
al., 1971). Durante os 60 minutos (fase inicial) possivelmente ocorre a liberação de
histamina e serotonina. A segunda fase, que se estende até aproximadamente 150 minutos
caracteriza-se pela liberação de bradicinina. Na terceira fase, até os 360 minutos (fase de
edema persistente), ocorre a produção local de prostaglandinas, principalmente PGE
2
(DI
ROSA & WILLOUGHBY, 1971; DI ROSA, 1972; GOETZL E GOLDSTEIN, 1980).
O extrato inibiu o edema de pata induzido pela carragenina em todos os tratamentos
realizados, no entanto, as doses administradas produziram uma resposta diferenciada frente
aos tratamentos adotados. No tratamento realizado 30 minutos antes da indução do edema
por carragenina a melhor dose foi a de 1 g/Kg; no tratamento realizado 30 minutos depois a
melhor dose foi a de 0,45g/Kg e no tratamento imediato todas as doses inibiram o edema,
porém sem diferença significativa entre as três doses; neste tratamento as doses
apresentaram resultado superior ao diclofenaco.
Os resultados obtidos em relação aos tratamentos e as doses adotadas podem estar
relacionados a metabolização dos princípios ativos presentes no extrato hidroalcólico de
V. scorpioides, envolvendo aspectos relacionados a absorção e biodisponibilidade do
fármaco analisado. A administração intraperitonial de fármacos oferece uma grande
superfície de absorção, onde os fármacos entram rapidamente na circulação, em especial
através da veia porta, podendo ocorrer perdas na primeira passagem pelo fígado; o que
poderá influenciar na biodisponibilidade dos princípios ativos atuantes no organismo,
podendo-se deduzir que as doses menores utilizadas no tratamento realizado 30 minutos
antes podem não ter apresentado efeito tão eficaz devido ao fato dos princípios ativos não
51
serem absorvidos tão rapidamente, ou mesmo ter ocorrido perdas de metabolização na
primeira passagem pelo fígado (GOODMAN E GILMAN, 1996).
No tratamento imediato e tratamento realizado 30 minutos após a indução do edema
por carragenina, todas as doses apresentaram efeito antiinflamatório superior ou igual ao
diclofenaco sódico (figura 8 e 9). Este resultado pode estar relacionado á presença de
princípios ativos que possuam uma atividade antiedematosa de forma similar a Arnica
montana (Asteraceae) que apresenta propriedades antiinflamatória testadas em modelos de
inflamação por carragenina (CARVALHO et al., 2001).
A via da ciclooxigenase é inibida por antiinflamatórios não esteróides (AINES)
impedindo a formação de prostaglandinas (BROOKS & DAY, 1991). A droga padrão de
referência para este modelo experimental foi o diclofenaco sódico, um AINE consagrado na
terapêutica cuja ação antiinflamatória e efeito analgésico está relacionada a inibição da
enzima ciclooxigenase e redução da liberação dos derivados do ácido aracdônico com
afinidade para ambas isoformas de ciclooxigenase, COX-1 e COX-2 (BURITOVA et al.,
1995).
O extrato de V. scorpioides também demonstrou efeito inibidor em inflamação em
edema de pata induzido pela histamina em todos os tratamentos realizados com efeito
bastante similar ao Fernegam ( Cloridrato de prometazina).
No tratamento realizado 15 minutos antes da indução do edema por histamina, o
extrato na dose de 0,45g/Kg não foi tão eficaz em reduzir o edema comparado aos
tratamentos realizados 15 minutos depois e tratamento imediato, o que pode novamente
sugerir que a biotransformação dos princípios ativos esteja relacionado a presença de uma
maior quantidade de substâncias disponíveis e suficientes para inibir o edema, produzindo
um efeito protetor antinflamatório, mas dependente da dose utilizada. Nos tratamentos
realizados 15 minutos após e imediatamente a indução do edema por histamina, os
resultados foram semelhantes aos apresentados pelo fernegam.
A histamina sintetizada pelos mastócitos e basófilos é armazenada em grânulos e pode
ser liberada para o meio extracelular como resposta a diversos estímulos como: agravos
físicos como traumatismos, frio e calor; reações imunes que envolvam a ligação de
anticorpos aos mastócitos; fragmentos de complementos denominados anafilatoxinas (C3a
e C5a); proteínas liberadoras de histamina derivadas de leucócitos; neuropeptídeos e
52
citocinas (COTRAN et al., 2000). Segundo Bonamin & Abel, (1999) a histamina também
pode ser liberada para o meio extra celular pelo rompimento acidental da membrana
plasmática provocado por exemplo por estímulos mecânicos ou por alguns medicamentos.
As aminas vasoativas, histamina e serotonina, influenciam a resposta inflamatória
através de vários mecanismos. A histamina através de receptores H
1
e H
2
, interage com o
endotélio, com a musculatura lisa dos vasos integrantes da microcirculação local e também
com as terminações nervosas próximas. O aumento da permeabilidade vascular ocorre á
nível venular e está ligado aos receptores H
1,
desta forma o efeito da histamina sobre os
vasos consiste em aumentar o calibre e a permeabilidade vascular, permitindo a passagem
de plasma para o interstício, o qual está associado ao desenvolvimento do edema
inflamatório (BONAMIN & ABEL, 1999).
A droga padrão de referência para este modelo experimental foi o Cloridrato de
prometazina onde o extrato apresentou uma ação similar ao seu efeito; os efeitos
farmacológicos das drogas antagonistas H
1
podem ser caracterizados da seguinte forma:
inibição da musculatura lisa não vascular por antagonismo competitivo da histamina;
bloqueio total do aumento da permeabilidade vascular prevenindo a formação do edema e
ação anestésica local por bloqueio de receptores H
1
das terminações nervosas presentes no
local inflamado (SPINOSA et al., 1999).
Segundo Maleki, 2001 na segunda fase da inflamação aguda induzida por carragenina
há a acumulação de PMN. Assim para avaliar o possível efeito sobre a inibição e infiltração
dos neutrófilos, foi realizada a migração leucocitária em modelo de peritonite induzidos por
carragenina em camundongos.
O extrato inibiu a migração leucócitária com efeito significativo na dose mais alta
utilizada (1g/Kg) apresentando uma redução do número de neutrófilos e mononucleares em
todos os intervalos de tempo analisados para esta dose, no entanto as demais doses não
foram tão mais eficientes que o diclofenaco sódico que foi utilizado como droga padrão
neste modelo de inflamação.
O efeito do extrato de V.scorpioides na inibição da migração leucócitária pode ser
confirmado através do exame histológico observado em edema de pata induzido pela
carragenina, revelando após a análise histológica acentuada inibição do edema e diminuição
53
da infiltração de neutrófilos no músculo plantar dos ratos em todos tratamentos utilizados
após a quarta hora da indução do edema, comparados ao grupo carragenina.
Segundo Robbins, 1994 os leucócitos aderem ao endotélio nas fases iniciais da
inflamação e atingem o espaço extravascular após a 2ª e 3ª hora da lesão inicial migrando
para o local da lesão.
Os resultados do experimento sobre a migração leucocitária em camundongos
demostram um aumento da migração leucocitária durante a 1ª hora após o estímulo
carragenina no peritônio dos camundongos, com uma diminuição da migração de se inicia
moderadamente na 2ª hora em todos os grupos analisados, observando-se uma tendência a
adaptação fisiológica com diminuição do número de leucócitos a partir a primeira hora do
experimento.
Segundo Martins, 1989 o fluido peritonial dos camundongos é excelente para o estudo
de leucócitos extravasculares devido a fatores como:
- O número de células livres do fluido peritonial é completamente constante em
camundongos não estimulados, ocorrendo uma tendência do sistema se reequilibrar
as medidas normais em manipulação experimental;
- Os camundongos parecem depender mais de fatores celulares que humorais;
- O fluido peritonial do camundongo não estimulado contém poucos neutrófilos, fato
que facilita detectar e medir o influxo de qualquer número de células.
De acordo com Vinegar et al., (1968), a mobilização de neutrófilos
(polimorfonucleares) resultantes da injeção intraperitonial de carragenina aumenta entre a
1ª e 3ª horas, sendo que a mobilização de monócitos (mononucleares) ocorre duas horas
após a presença dos neutrófilos. Este fato pode ser comparado e observado no grupo
controle carragenina; grupo tratado pelo diclofenaco sódico e nas duas doses utilizadas
com o extrato; onde na 4ª hora nota–se um pequeno aumento do número de células
mononucleares como revela a figura 15.
A administração oral do extrato na dose de 1 g/Kg após os 30 minutos da injeção
intraperitonial de carragenina inibiu de forma efetiva a mobilização celular de leucócitos
polimormonucleares (neutrófilos e mononucleares).
A curva da migração de leucócitos em todos os intervalos de tempo até a 4ª hora
analisados revela uma ostensiva diminuição de neutrófilos e mononucleares em todas as
54
doses, inclusive na dose de 0,45 g/Kg que na 1ª hora apresentou um número elevado de
células inflamatórias, sugerindo que a diminuição da resposta inflamatória é dependente da
dose do extrato pois as doses utilizadas apresentaram resultados diferentes para a migração
leucócitária tanto para a contagem total de células como na contagem diferencial das
células.
A redução dos polimorfonucleares, a leucopenia pode refletir algum efeito citotóxico de
antiinflamatórios não esteroidais. Segundo ALE et al, 1988, as drogas antiiflamatórias
atuam sobre a superfície da membrana plasmática dos leucócitos, particularmente dos
monócitos, prejudicando sua capacidade de movimentação e sua capacidade de fagocitose;
fato que pode ser atribuído á uma possível ação do extrato de V. scorpioides.
A ação farmacológica do extrato pode estar relacionada a presença de constituintes
químicos característicos a algumas espécies da família compositae a qual pertence a espécie
estudada como a presença de lactonas sesquiterpênicas, presença de flavonóides e
triterpenóides (MALEKI et al., 2001).
As lactonas sesquiterpênicas compreendem um dos constituintes químicos mais
abundantes e caracteristicos da família Compositae e que possivelmente sejam responsáveis
por desencadear grande parte da atividade farmacológica destas plantas (GIESBRECHT et
al. 1985; DAVINO,1989; LOPES, 1991; FREIRE, 1996).
Cerca de 90% das lactonas mencionadas na literatura científica foram isoladas de
espécies presentes na família Compositae, não existindo família na qual as lactonas
ocorram tão freqüentemente e com tal grau de diversidade (CUNHA, 1989).
Segundo Lopes, (1991) a atividade biológica de alguma lactonas sesquiterpênicas foram
investigadas com resultados positivos para atividade antimicrobiana como inibidora para
fungos e bactérias; no entanto nenhum efeito foi observado com glaucolide B (uma lactona
sesquiterpênica) testada em modelo de edema de pata induzido pela carragenina.
A atividade antiiflamatória de flavonóides foi investigada para a espécie Tanacetum
microphylun D.C (Compositae) apresentando atividade antiinflamatória com ação sobre o
ciclo da Lipoxygenase e síntese de prostaglandina (ABAD et al. 1995) quando testados em
modelo de edema de pata induzidos pela carragenina.
Foi investigado a ação de um outro flavonóide “o ternatin”, isolado de Egletes
viscosa Less (Compositae) em atividade anti-anafilática e antinflamatória concluindo que o
55
ternatin apresentou efeito antiiflamatório e propriedade anti-anafilática nos testes realizados
de alergias e pleurisia induzida por carragenina o que sugere que esta substância pode ser
utilizada como droga antialérgica como o disodium cromoglycate (DSGG) um tipo de
droga utilizada em tratamento de asma brônquica (SOUZA et al. 1992).
Alguns trabalhos sugerem a influência dos flavonóides com mecanismos envolvidos no
processo inflamatório (MALEKI et al., 2001; MANZUNDER et al., 2003). De acordo com
Vane (1971), os flavonóides podem inibir a atividade da enzima ciclooxigenase, o maior
mecanismo de ação comparada a atividade antiiflamatória dos clássicos AINES.
No entanto a ação dos triterpenos, um outro constituinte químico característico da
família Compositae pode também ser responsável pela a ação antinflamatória do extrato de
V. scorpioides onde Freire (2000), isolou e quantificou pela primeira vez um triterpeno, o
acetado de lupeol através de métodos fitoquímicos clássicos nas raízes, caules e folhas de
V. scorpioides podendo esta substância também estar influenciando na resposta
antiiflamatória da espécie estudada pois segundo Singh et al., (1997) existe um grande
número de triterpenos com atividade antiiflamatória fazendo parte da constituição de
drogas não esteroidais.
A atividade de um triterpeno foi avaliada em uma espécie vegetal conhecida como
Crataeva religiosa (Capparidaceae) uma planta que apresentava propriedades
antiiflamatórias onde foi comprovado o efeito antiinflamatório de um triterpeno isolado
desta planta (SINGH et al. 1997).
O presente trabalho abre perpectivas promissoras para o uso do extrato de
V. scorpioides como agente antiiflamatório. A comprovação deste fato e os possíveis
mecanismos de ação dos constituintes químicos requerem novas investigações.
56
6
. CONCLUSÃO
Em vista dos resultados obtidos e dentro das condições em que foi realizada a presente
pesquisa, pode-se concluir que:
1- A administração intraperitonial do extrato hidroalcoóliico V. scorpioides em ratos
apresenta efeito inibitório nos modelos experimentais de inflamação aguda de edema
de pata tanto induzido por Carragenina como por histamina.
2- A administração oral do extrato hidroalcoóliico de V. scorpioides em camundongos
apresenta diminuição da migração leucocitária em modelo de peritonite induzido pela
carragenina, diminuindo o número de neutrófilos e células mononucleares migrantes.
3- A análise histológica confirma a inibição da infiltração leucocitária em edema de pata
induzido pela carragenina no tratamento realizado 30 minutos após a indução do edema e
com todas as doses utilizadas.
4- O melhor tratamento realizado foi o tratamento imediato após a indução do edema por
carragenina e por histamina.
57
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ANEXOS
A – Aprovação pelo Comitê de Ética
B - Classificação da espécie Vernonia scorpióides
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Livros Grátis
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