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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CAMPUS DE BOTUCATU
AVALIAÇÃO DE PRODUTOS COMERCIAIS DE FUNGOS
ENTOMOPATOGÊNICOS NO CONTROLE DO PSILÍDEO-DE-
CONCHA Glycaspis brimblecombei (HEMIPTERA: PSYLLIDAE)
MÁRIO HENRIQUE FERREIRA DO AMARAL DAL POGETTO
Dissertação apresentada à Faculdade de
Ciências Agronômicas da UNESP – Câmpus de
Botucatu, para obtenção do título de Mestre em
Agronomia (Proteção de Plantas).
BOTUCATU
Fevereiro – 2009
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UNIVERSIDADE ESTADUAL PAULISTA “JÚLIO DE MESQUITA FILHO”
FACULDADE DE CIÊNCIAS AGRONÔMICAS
CAMPUS DE BOTUCATU
AVALIAÇÃO DE PRODUTOS COMERCIAIS DE FUNGOS
ENTOMOPATOGÊNICOS NO CONTROLE DO PSILÍDEO-DE-
CONCHA Glycaspis brimblecombei (HEMIPTERA: PSYLLIDAE)
MÁRIO HENRIQUE FERREIRA DO AMARAL DAL POGETTO
Orientador: Prof. Dr. Carlos Frederico Wilcken
Dissertação apresentada à Faculdade de
Ciências Agronômicas da UNESP – Câmpus de
Botucatu, para obtenção do título de Mestre em
Agronomia (Proteção de Plantas).
BOTUCATU
Fevereiro – 2009
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IV
AGRADECIMENTOS
À Deus, pois não há como superar os desafios que a vida nos apresenta sem
contar com sua presença entre nós.
A minha mulher, companheira e amiga Maíra Rodrigues Baldin, pela paciência
e dedicação, e por tornar minha vida mais cativante, sendo motivo de meus esforços
para a superação de qualquer desafio.
Aos meus pais, que sempre apoiaram minhas decisões e contribuiram com
todas as minhas realizações.
Ao meu orientador e amigo Prof. Dr. Carlos Frederico Wilcken, pela amizade e
pelos ensinamentos transmitidos, ao qual atribuo todo o conhecimento adquirido nestes
anos de convivência.
Aos amigos, Rafael de Souza Christovam, Evandro Pereira Prado, Hélio de
Oliveira Aguiar Júnior, Pedro José Ferreira Filho, Alexandre Coutinho Vianna Lima,
Daniel Dias Rosa e Marco Antônio Basseto pelo companheirismo e ajuda na execução
deste trabalho.
Aos docentes, funcionários e estagiários do Departamento de Produção Vegetal
– Defesa Fitossanitária pela amizade e colaboração.
Ao Conselho Nacional de Pesquisa e Desenvolvimento/CNPq, pela concessão
da bolsa de mestrado.
A todos, que de alguma forma, contribuíram para a realização deste trabalho.
V
ÍNDICE
RESUMO ..............................................................................................................................1
SUMMARY ..........................................................................................................................3
1 INTRODUÇÃO..................................................................................................................5
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...........................................................................................8
2.1 Aspectos taxonômicos, morfologia externa e bioecologia de Glycaspis
brimblecombei ....................................................................................................................8
2.2 Danos provocados por Glycaspis brimblecombei ......................................................10
2.3 Métodos de controle de Glycaspis brimblecombei.....................................................11
2.3.1 Controle químico..................................................................................................11
2.3.2 Controle cultural...................................................................................................12
2.3.3 Controle biológico................................................................................................13
2.3.3.1 Predadores e parasitóides ...............................................................................13
2.3.3.2 Fungos entomopatogênicos ............................................................................14
2.4 Utilização de fungos entomopatogênicos no controle de pragas................................15
2.4.1 Beauveria bassiana ..............................................................................................15
2.4.2 Metarhizium anisopliae ........................................................................................17
2.4.3 Lecanicillium longisporum...................................................................................18
3 MATERIAL E MÉTODOS..............................................................................................20
3.1 Criação de Glycaspis brimblecombei em laboratório.................................................20
3.2 Micoinseticidas utilizados ..........................................................................................21
3.3 Patogenicidade dos inseticidas biológicos às ninfas de Glycaspis brimblecombei em
laboratório.........................................................................................................................22
3.3.1 Deposição de conídios..........................................................................................25
3.3.2 Análise dos dados.................................................................................................26
3.4 Eficiência dos inseticidas biológicos no controle de ninfas de Glycaspis
brimblecombei em condições de semicampo ...................................................................26
3.4.1 Deposição de conídios..........................................................................................29
3.4.2 Análise dos dados.................................................................................................29
3.5 Desenvolvimento dos fungos entomopatogênicos sobre ninfas de Glycaspis
brimblecombei..................................................................................................................30
VI
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO .....................................................................................31
4.1 Patogenicidade dos inseticidas biológicos às ninfas de Glycaspis brimblecombei em
laboratório.........................................................................................................................31
4.1.1 Deposição de conídios..........................................................................................45
4.2 Eficiência dos inseticidas biológicos sobre as ninfas de Glycaspis brimblecombei em
condições de semicampo ..................................................................................................49
4.3 Desenvolvimento dos fungos entomopatogênicos sobre ninfas de Glycaspis
brimblecombei ..................................................................................................................57
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS ...........................................................................................70
6 CONCLUSÕES................................................................................................................72
7 REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS .............................................................................73
1
RESUMO
Este trabalho teve como objetivo avaliar o potencial de controle de
alguns produtos comerciais de fungos entomopatogênicos disponíveis no mercado, bem como
o desenvolvimento dos fungos Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae e Lecanicillium
longisporum sobre ninfas de Glycaspis brimblecombei (Hemiptera: Psyllidae). Para tanto,
foram realizados ensaios em laboratório com pulverização de suspensões fúngicas de 1 x 10
4
,
1 x 10
5
, 1 x 10
6
, 1 x 10
7
e 1 x 10
8
conídios/mL dos bioinseticidas Boveril WP, Toyobo e
Mycotrol (B. bassiana), Metarril WP e Toyobo (M. anisopliae) e Vertirril WP (L.
longisporum) nas ninfas do inseto. Nos bioensaios de semicampo estes produtos foram
aplicados na forma pulverizada e polvilhada sobre mudas infestadas por ninfas de G.
brimblecombei. As avaliações para o bioensaio de laboratório foram realizadas aos um, três,
cinco e sete dias após a pulverização, enquanto no ensaio de semicampo as avaliações foram
realizadas apenas sete dias após a aplicação dos produtos. O desenvolvimento dos fungos
sobre os insetos foi avaliado mediante a observação dos insetos em microscópio óptico a 0, 24,
48, 72 e 148 horas após a aplicação dos fungos. No bioensaio de laboratório os produtos que
apresentaram as maiores mortalidades na maior concentração foram L. longisporum (Vertirril
WP), B. bassiana (Mycotrol e Boveril WP) e M. anisopliae (Metarril WP), com mortalidades
acima de 70%. As maiores porcentagens de mortalidade confirmada foram observadas para os
tratamentos com maior porcentual de mortalidade total, destacando-se o produto Mycotrol que
2
obteve 70% dos indivíduos esporulados nas concentrações de 1 x 10
6
, 1 x 10
7
e 1 x 10
8
conídios/mL. Em semicampo os produtos M. anisopliae (Metarril WP) aplicado em
pulverização e M. anisopliae e B. bassiana (Toyobo) aplicados em polvilhamento
apresentaram eficiência em torno de 70%. Na avaliação do ciclo biológico dos fungos sobre as
ninfas de G. brimblecombei, todos os fungos apresentaram conidiogênese, finalizando seu
ciclo sobre o hospedeiro 144 horas após a contaminação.
Palavras-chave: Glycaspis brimblecombei, Eucalyptus, Beauveria bassiana, Metarhizium
anisopliae, Lecanicillium longisporum, controle biológico, bioinseticidas.
3
EVALUATION OF COMMERCIAL PRODUCTS OF ENTOMOPATHOGENIC
FUNGI ON REDGUM LERP PSYLLID Glycaspis brimblecombei (HEMIPTERA:
PSYLLIDAE) CONTROL. 2009. 90p. Dissertation (Master Degree in Agronomy – Plant
Protection) – Faculty of Agronomic Sciences – São Paulo State University (UNESP)
Author: MÁRIO HENRIQUE FERREIRA DO AMARAL DAL POGETTO
Adviser: CARLOS FREDERICO WILCKEN
SUMMARY
This study aimed to evaluate the potential control of some commercial
entomopathogenic fungi products available in the market and the development of Beauveria
bassiana, Metarhizium anisopliae and Lecanicillium longisporum on nymphs of Glycaspis
brimblecombei. The insecticides Boveril WP, Toyobo and Mycotrol (B. bassiana), Metarril
and Toyobo WP (M. anisopliae) and Vertirril WP (L. longisporum) were tested in laboratory
spraying fungal suspensions with 1 x 10
4
, 1 x 10
5
, 1 x 10
6
, 1 x 10
7
and 1 x 10
8
conidia/mL on
insect nymphs. In the semi field bioassays, these products were used in dust and sprayed forms
on plants infested by nymphs of G. brimblecombei. The evaluations in laboratory bioassay
were made at one, tree, five and seven days after spraying, and semi field test the assessments
were carried out seven days after products application. The fungi development on insects was
evaluated by observing of nymphs in optical microscope at 0, 24, 48, 72 and 148 hours after
application. In laboratory bioassay the bioinsecticides had highest mortality in highest
concentration were L. longisporum (Vertirril WP), B. bassiana (Mycotrol and Boveril WP)
and M. anisopliae (Metarril WP), with mortality rates above 70%. The highest percentages of
confirmed mortality were obtained in most effective treatments, especially to Mycotrol which
obtained 70% of individuals sporulated at concentrations of 1 x 10
6
, 1 x 10
7
and 1 x 10
8
conidia/mL. In semi field bioassay, M. anisopliae (Metarril WP) applied in spraying and M.
anisopliae and B. bassiana (Toyobo) applied in dusting obtained efficiency around 70%. In
4
assessment of the fungi biological cycle on nymphs of G. brimblecombei, all fungi showed
conidiogenesis 144 hours after the contamination, concluding their cycle on the host.
KEYWORDS: Glycaspis brimblecombei, Eucalyptus, Beauveria bassiana, Metarhizium
anisopliae, Lecanicillium longisporum, biological control, bioinsecticide.
5
1 INTRODUÇÃO
Atualmente o Brasil detém uma das maiores áreas de reflorestamentos
do mundo, com aproximadamente seis milhões de hectares, com plantios constituídos
basicamente pelos gêneros de Pinus e Eucalyptus (ABRAF, 2008). Este crescimento é devido,
sobretudo, a crescente demanda de madeira, como fonte energia e para a produção de celulose.
Neste contexto, o eucalipto desponta como gênero promissor dentre os plantios comerciais de
espécies florestais atribuído, principalmente, ao seu reduzido tempo de crescimento e
qualidade da matéria-prima.
Entretanto, pela homogeneidade e extensão da área plantada, a cultura
propicia diversos fatores limitantes ao seu desenvolvimento, como o estabelecimento de
espécies de insetos-praga nativos, como lagartas e formigas cortadeiras (SANTOS, 1986).
Relativamente, além dos problemas com pragas nativas, as introduções
de pragas exóticas também proporcionam sérios riscos à cultura, tendo como exemplo a broca-
do-eucalipto Phoracantha semipunctata (Coleoptera: Cerambycidae) e os besouros
desfolhadores Gonipterus scutellatus e G. gibberus (Coleoptera: Curculionidae). Entretanto,
os danos apresentados são considerados reduzidos, devido a fatores como ocorrência de
inimigos naturais que provavelmente foram introduzidos junto com a praga ou porque as
espécies de eucalipto encontradas no país não eram suscetíveis às pragas, evitando o aumento
de suas populações (WILCKEN et al., 2003).
6
Contudo, este quadro foi alterado devido a recente introdução do
psilídeo-de-concha Glycaspis brimblecombei Moore (Hemiptera: Psyllidae), encontrado pela
primeira vez no município de Mogi-Guaçu, SP, oferecendo grande potencial de destruição aos
povoamentos de eucalipto, como verificado nos Estados Unidos e México (WILCKEN et al.,
2003; DAHLSTEN et al, 2003).
Atualmente, a principal forma de controle desta praga é através de seu
parasitóide específico Psyllaephagus bliteus Riek (Hymenoptera: Encyrtidae), com criação
deste inseto em laboratório e realização de liberações nas áreas atacadas. Porém, em algumas
regiões do país, este agente de controle não tem conseguido se estabelecer, como nos estados
de Minas Gerais, Mato Grosso do Sul e Mato Grosso, aparentemente por falta de adaptação do
inseto às condições locais (WILCKEN, 2008)
1
.
Nesse contexto, a busca por medidas alternativas de controle que
mantenham o propósito de menor impacto ao meio ambiente torna-se imperiosa, abrindo
oportunidades para pesquisas e uso de outras táticas de controle biológico.
Os trabalhos com controle microbiano relacionado a esta praga são
escassos, necessitando estudos mais aprofundados sobre a eficiência de microrganismos
entomopatogênicos para seu controle, sendo de extrema relevância pesquisas com patógenos
que já sejam comercializados, o que pode proporcionar resultados práticos e de pronto uso.
Neste caso, os fungos consistem, atualmente, em uma das mais importantes ferramentas do
manejo de pragas na agricultura por serem frequentemente encontrados atacando insetos
(SILVA, 2001).
Os micoinseticidas podem ser empregados de diversas formas em
programas de controle de pragas, através de liberações de insetos infectados, utilização de
iscas atrativas inoculadas ou de forma inundativa, através de pulverizações. Segundo Wright
(1993) micoinseticidas aplicados em pulverização podem apresentar eficiência semelhante ou
pouco inferior aos inseticidas químicos.
Neste sentido, devido à grande extensão da área plantada com
eucalipto no país, os surtos de pragas são cada vez mais freqüentes e, consequentemente,
1
WILCKEN, C.F. Comunicação pessoal, 2008.
7
torna-se imprescindível o registro de produtos específicos que reduzam tais problemas.
Entretanto, as pressões ambientalistas para o uso cada vez mais restrito de produtos químicos
viabilizam ainda mais a utilização de bioinseticidas, que, além de possuírem especificidade de
controle, não exercem danos ao meio ambiente. No Brasil, foi aprovada a Portaria 226 de
22/04/2005 de registro de inseticidas à base de Beauveria bassiana para uso em caráter
emergencial no controle de Gonipterus scutellatus na cultura do eucalipto (MINISTÉRIO DA
AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2005).
Nesse contexto, o objetivo deste trabalho foi avaliar o potencial de
controle que algumas formulações comerciais de Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae
e Lecanicillium longisporum podem oferecer no controle do psilídeo-de-concha em bioensaios
de laboratório e semicampo.
8
2 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
2.1 Aspectos taxonômicos, morfologia externa e bioecologia de Glycaspis
brimblecombei
O psilídeo-de-concha, Glycaspis brimblecombei Moore pertence à
ordem Hemiptera, subordem Sternorrhyncha e família Psyllidae. São insetos de corpo pequeno
com aproximadamente 2 mm de comprimento, semelhantes a pequenas cigarrinhas, com
pernas posteriores saltatórias e antenas bem desenvolvidas. O gênero Glycaspis possui 127
espécies e a maioria delas alimenta-se de seiva do floema das plantas de eucalipto (HALBERT
et al., 2001), sendo G. brimblecombei um inseto fitófago succívoro exclusivo de eucalipto
(WILCKEN et al., 2003).
As ninfas de G. brimblecombei apresentam cinco ínstares e são
achatadas dorsoventralmente, sua cor varia desde amarelo nos três primeiros ínstares a
amarelo – alaranjado ao verde nos dois últimos ínstares e as tecas alares apresentam coloração
escura (CIBRIAN – TOVAR et al., s.d.). A principal característica das ninfas deste inseto é
presença de pequenos cones brancos na superfície das folhas que são formados pela excreção
do inseto (HALBERT et al, 2001), sendo feitas basicamente de ceras e açúcares, além de
abrigarem as ninfas até a fase adulta (SANCHEZ, 2003).
9
Esta concha também serve de proteção contra predadores e perda de
água pelas ninfas, motivado pelo formato achatado do corpo do inseto que facilita o processo
de desidratação (HODKINSON, 1974). A construção da concha é realizada pelo acúmulo de
excrementos do inseto em alguns pontos, formando inicialmente arcos, os quais são
posteriormente preenchidos até adquirirem o formato cônico (FAVARO, 2006a).
Os adultos de G. brimblecombei se diferenciam das demais espécies de
psilídeo por apresentarem projeções que saem da parte anterior da cabeça, chamadas de cones
genais providas de um tufo de cerdas no ápice (DAHLSTEN et al., 2003; FAVARO, 2006a).
Sua reprodução se dá de forma sexuada, sendo as fêmeas de coloração verde a vermelho e os
machos com coloração variando do verde ao café, podendo adquirir, também, tonalidades
vermelhas, As antenas são filiformes com 10 segmentos e a parte terminal do abdome é
arredondada e possui uma protuberância por onde são colocados os ovos. Os machos possuem
uma estrutura na parte superior de seu abdome chamada “fórceps” que servem para imobilizar
a fêmea na hora da cópula, além de apresentarem menor tamanho que as fêmeas (CIBRIAN –
TOVAR et al., s.d.).
As fêmeas ovipositam em folhas abertas e os ovos são dispostos em
linha, individualizados ou agrupados. Os ovos possuem coloração alaranjada e são fixados na
superfície do limbo foliar por um pedúnculo (CIBRIAN – TOVAR et al., s.d.).
Firmino (2004) estudou a biologia de G. brimblecombei sob diferentes
temperaturas em diferentes espécies de eucalipto e constatou que as temperaturas de 22°C e
26°C oferecem condições favoráveis ao seu desenvolvimento e que as temperaturas de 18°C e
30°C são limitantes. Neste mesmo estudo, Firmino (2004) criando ninfas de G. brimblecombei
em folhas de E. camaldulensis com temperatura de 26°C e fotofase de 12 horas verificou que a
duração média do estágio ninfal foi de 14,2 dias. Os adultos criados nas mesmas condições
obtiveram longevidade de 8,4 dias, enquanto que o período embrionário teve duração média de
7,9 dias. O ciclo total, observado da eclosão das ninfas até a morte dos adultos, obteve duração
média de 22,7 dias. No mesmo trabalho foi observado também que as espécies mais favoráveis
ao desenvolvimento de G. brimblecombei foram E. camaldulensis, E. urophylla, E. grandis, E.
tereticornis e o híbrido E. grandis e E. urophylla, sendo o E. camaldulensis a mais adequada.
A época de ocorrência desta praga está associada aos índices
pluviométricos, sendo sua população maior nos meses mais secos, com significativa redução
10
nos meses mais chuvosos do ano (RAMIREZ et al., 2002). Entretanto, no Brasil, Ferreira
Filho et al. (2008), estudando a flutuação populacional desta praga em função da precipitação
pluviométrica e temperatura, concluiu que a população de G. brimblecombei possui correlação
inversamente proporcional com a temperatura, atingindo picos maiores de infestação nos
meses de inverno.
2.2 Danos provocados por Glycaspis brimblecombei
Os principais danos causados por espécies de psilídeos em culturas
agrícolas são caracterizados pelo murchamento e enrolamento do limbo foliar, com secamento
e queda das folhas, devido ao hábito sugador da praga. A fumagina, fungo saprófita que se
alimenta dos excrementos açucarados do inseto, se estabelece principalmente nas conchas
construídas pelas ninfas de G. brimblecombei e no “honeydew” que escorre pelas folhas
quando ocorrem altas infestações da praga formando uma camada escura sobre as folhas das
plantas diminuindo sua taxa fotossintética (GALLO et al., 2002; DREISTADT &
DAHLSTEN, 2001).
Como já foi constatado por Dahlsten et al. (2003) e Wilcken et al.
(2003), o psilídeo-de-concha causa danos consideráveis aos plantios de eucalipto,
principalmente nas espécies de E. camaldulensis e E. tereticornis, admitidas como altamente
suscetíveis (FERREIRA FILHO et al., 2004).
Os psilídeos do gênero Glycaspis se caracterizam por causar
descoloração das folhas, redução da área fotossintética das plantas, redução no crescimento e
seca dos ponteiros (CARNE & TAYLOR, 1984). Nesse sentido, altas infestações podem
ocasionar queda de folhas, redução no crescimento e a morte da planta (RAMIREZ, 2003).
Gill (1998) constatou que ataques severos de G. brimblecombei podem
ocasionar perdas de grande proporção, com 15% de mortalidade de plantas no primeiro ano e
até 40% no segundo ano, caso não sejam adotadas medidas de controle.
No Brasil os problemas com esta praga vêm se agravando, sobretudo
pela sua alta capacidade de dispersão e pelas grandes extensões das áreas plantadas com
11
eucalipto no país, compreendidas entre o Rio Grande do Sul e o Amapá e entre Mato Grosso
do Sul e Espírito Santo (WILCKEN et al., 2003).
2.3 Métodos de controle de Glycaspis brimblecombei
2.3.1 Controle químico
São poucos os trabalhos sobre o controle químico desta praga. Na
Austrália, país de origem deste inseto, não há a necessidade de controle da grande maioria das
espécies de psilídeos, pois se encontram em equilíbrio com inimigos naturais e apenas as
espécies do gênero Cardiaspina são consideradas pragas, porém secundárias (PHILLIPS,
1992).
Nos Estados Unidos e México, onde ocorrem infestações significativas
desta praga o controle químico é pouco usado, devido ao caráter paisagístico dos plantios de
eucalipto e, principalmente, por se situarem em áreas urbanas. Além disso, pela característica
das ninfas deste inseto em formar conchas para sua proteção, os inseticidas de contato se
tornam menos adequados, pois teriam ação maior sobre adultos, eventualmente sobre ovos ou
ninfas que estiverem fora da concha, tendo sua eficiência significativamente diminuída
(GARRISON, 1998).
Existem vários inseticidas de ação sistêmica efetivos no controle do
psilídeo-de-concha (DREISTADT et al., 2001), porém, sua aplicação não é sustentável sendo
considerada apenas como medida de controle em curto prazo e de pequena escala das
populações da praga.
Dahlsten et al. (2003) recomendam o uso de inseticidas sistêmicos
como imidacloprid, aplicado de preferência no solo sob a copa das árvores, uma vez ao ano
antes das chuvas para facilitar a absorção pelas raízes.
A eficiência destes inseticidas no controle de G. brimblecombei foi
estudada por Young (2002) que realizou micro injeções de imidacloprid, metil-oxidemeton e
uma mistura de ambos, em árvores de E. camaldulensis com aproximadamente 20 anos de
idade sob ataque severo da praga. Após 15 meses, as menores populações da praga foram
12
obtidas com os tratamentos imidacloprid e sua mistura com metil-oxidemeton. Contudo, a
variação na população das ninfas foi muito alta, não permitindo detectar diferenças
significativas entre os tratamentos.
No Brasil, em plantio comercial do híbrido de eucalipto E. urophylla x
E. grandis (urograndis) naturalmente infestado por G. brimblecombei, Dal Pogetto et al.
(2008a) realizaram a aplicação aérea de imidacloprid em forma pulverizada obtendo eficiência
de 63% no controle da praga, diferindo significativamente da testemunha. Anteriormente,
Ferreira Filho et al. (2004), através da pulverização deste mesmo ingrediente ativo, obteve
eficiência de controle superior a 80%.
2.3.2 Controle cultural
É necessário adotar práticas de manejo adequadas das árvores
infestadas por G. brimblecombei estressadas pela desfolha causada pelos psilídeos, visto que
em experiências anteriores com insetos sugadores, a irrigação excessiva e adubação
nitrogenada aumentaram o alimento disponível e também sua qualidade, tornando as árvores
mais atrativas ao inseto (HODDLE et al., 2003).
Garrison (1998) e Dahlsten et al. (2003) desaconselham a adubação de
árvores infestadas por G. brimblecombei, pois o nitrogênio aumenta a reprodução e
sobrevivência do psilídeo.
Dal Pogetto et al. (2006), estudando a biologia de G. brimblecombei
em mudas de E. camaldulensis adubadas com diferentes níveis de nitrogênio e potássio,
observaram que insetos nutrindo-se de plantas submetidas a altas doses de nitrogênio, o
período ninfal do inseto diminuiu e a longevidade dos adultos aumentou, resultando em
insetos com maior potencial reprodutivo. A maior longevidade dos adultos proporcionou
maior tempo para acasalamento, acarretando em aumento do número de posturas.
Outros tratos culturais também são recomendados, como podas de
ramos infestados ou até mesmo o abate de árvores extremamente atacadas, como é realizado
no México (DIÁRIO OFICIAL DE LA FEDERACIÓN, 2002). Porém, estas medidas são
economicamente inviáveis para aplicação nas plantações extensivas de eucalipto no Brasil.
13
2.3.3 Controle biológico
2.3.3.1 Predadores e parasitóides
Na Austrália são relatados diversos predadores generalistas que
desempenham papel fundamental na regulação da população de G. brimblecombei, como
larvas da mosca sirfídea (Diptera: Syrphidae), larvas do bicho-lixeiro (Neuroptera:
Chrysopidae) e as joaninhas (Coleoptera: Coccinelidae) (WILCKEN et al., 2003).
No Brasil foram encontradas algumas espécies destes predadores
generalistas como larvas de crisopídeos, sirfídeos e de coccinelídeos (Cycloneda sanguinea)
(WILCKEN et al., 2003). Porém, estes insetos são considerados pouco eficientes, pois eles
não são adaptados a perfurarem ou removerem a concha que protege as ninfas de G.
brimblecombei (DAHLSTEN et al., 2003).
Nos Estados Unidos foi realizada a importação de oito espécies de
parasitóides da Austrália para o controle do psilídeo-de-concha, obtendo êxito apenas a
espécie Psyllaephagus bliteus (Hymenoptera: Encyrtidae), a qual se estabeleceu no campo e
tem controlado a praga com resultados satisfatórios na Califórnia e México (PAINE et al.,
2000).
No Brasil este parasitóide foi detectado praticamente logo após a
introdução da praga (BERTI FILHO et al., 2003), e se caracteriza por ser o seu inimigo natural
específico e altamente dependente da população da praga. A principal característica deste
parasitóide baseia-se na sua capacidade de perfurar a concha e depositar seu ovo no interior do
abdome da ninfa, causando sua morte ainda na fase jovem.
A efetividade e especificidade deste parasitóide motivaram a criação
de programas de controle biológico clássico do psilídeo-de-concha, como vêm sendo feito nos
EUA, México, Chile (CHAUZAT et al., 2002; DAHLSTEN et al., 1998; PAINE et al., 2000) e
Brasil.
Foi observado também que há forte sincronismo da população deste parasitóide
com a população da praga no campo, atingindo correlações entre 76% (LIMA et al., 2005) e
86,1% (DAL POGETTO et al., 2005), além da alta taxa de parasitismo que, em alguns casos,
pode chegar a 80% (IÑIGUEZ-HERRERA, 2001).
14
No Brasil, o parasitóide P. bliteus é criado no Laboratório de Controle
Biológico de Pragas Florestais da FCA/UNESP – Campus de Botucatu e no Laboratório de
Quarentena “Costa Lima” da EMBRAPA – Meio Ambiente – Jaguariúna para o controle
biológico de G. brimblecombei, realizado com liberações inoculativas deste parasitóide em
áreas de plantios comerciais de eucalipto.
2.3.3.2 Fungos entomopatogênicos
Resultados sobre controle microbiano do psilídeo-de-concha são
escassos na literatura, necessitando estudos mais aprofundados sobre a eficiência de
microrganismos entomopatogênicos em seu controle, sobretudo pelo grande potencial de dano
que esta praga causa e a extensão dos plantios com eucalipto no Brasil. Nesse sentido,
pesquisas com patógenos que já sejam comercializados são de extrema relevância, pois
poderão gerar resultados práticos e de pronto uso.
Em testes realizados em laboratório com mudas de E. camaldulensis
infestadas com ninfas de G. brimblecombei, a aplicação de forma tanto pulverizada quanto
polvilhada do fungo Beauveria bassiana apresentaram alta eficiência no controle da praga
(WILCKEN et al., 2007; DAL POGETTO et al., 2008).
Ainda em laboratório, Favaro (2006a) pulverizando suspensões
fúngicas de isolados de Lecanicillium lecanii e B. bassiana em mudas de E. camaldulensis
infestadas com ninfas de 5° ínstar de G. brimblecombei, obteve mortalidade de 80% e 81%
para cada isolado, respectivamente.
Favaro et al, (2006b) em testes de campo, avaliou a eficiência de B.
bassiana e L. lecanii aplicados via pulverização de suspensão conidial em plantas de E.
camaldulensis infestadas com G. brimblecombei, obtendo redução de cerca de 90% da
população com ambas espécies de fungos.
Em contrapartida, testes realizados com aplicação aérea de B. bassiana
em plantio do híbrido de eucalipto E. urophylla e E. grandis (urograndis) Dal Pogetto et al.
(2008a) obteve eficiência em torno de 50% no controle de G. brimblecombei. Porém, a baixa
eficiência obtida pode ter sido ocasionada pelas condições ambientais e do local, visto que o
15
ensaio foi conduzido no centro-oeste do estado de Minas Gerais nos meses mais secos do ano
que é a principal época de ocorrência do psilídeo.
2.4 Utilização de fungos entomopatogênicos no controle de pragas
O controle microbiano de pragas consiste, atualmente, em uma das
mais importantes ferramentas do manejo de pragas na agricultura, destacando-se
principalmente os fungos por serem frequentemente encontrados atacando insetos (SILVA,
2001).
Atualmente são conhecidas aproximadamente 750 espécies e 85
gêneros de fungos considerados importantes como reguladores biológicos (PUTZKE &
PUTZKE, 1998).
Os fungos são patógenos com amplo espectro de ação, podendo atacar
insetos nos mais diferentes habitats, causando epizootias. Alguns são virulentos e a grande
maioria é especializada na penetração via tegumento do hospedeiro, podendo atuar também
por outras vias (ALVES, 1998).
2.4.1 Beauveria bassiana
É a espécie de fungo mais freqüentemente encontrada sobre insetos e
em amostras de solo, onde pode subsistir por longo tempo em saprogênese. Em condições de
laboratório pode colonizar um grande número de insetos e em campo pode ocorrer de forma
enzoótica e epizoótica em coleópteros, lepidópteros, hemípteros, entre outros (ALVES, 1998).
A produção de esporos ou conídios por hifomicetos
entomopatogênicos são geralmente responsáveis pela dispersão da doença e infecção de
hospedeiros no ambiente. A adesão do conídio, seguido pela sua germinação, é a primeira
etapa para o estabelecimento de infecções de insetos terrestres pela maioria dos fungos
entomopatogênicos, incluindo B. bassiana (TALAEI – HASSANLOUI et al., 2007).
16
Entretanto, demais fatores estão relacionados à germinação e
crescimento de B. bassiana, como exigências nutricionais a partir de fontes de carbono,
nitrogênio, glucose e quitina, indispensáveis para o crescimento e formação das estruturas de
penetração do fungo (SMITH & GRULA, 1981; ALVES, 1998).
A fase de penetração do fungo ocorre normalmente pelo tegumento, a
partir da germinação, por ação mecânica e efeitos enzimáticos, com duração entre 12 e 18
horas. Após 72 horas da inoculação, o inseto apresenta-se colonizado com uma grande
quantidade de conidióforos e conídios. Entretanto, para aumentar a capacidade de
disseminação dos propágulos, são necessárias algumas condições favoráveis, destacando-se a
temperatura, umidade relativa e radiação solar (ALVES, 1998).
Sósa-Gomez & Alves (2000) relataram que a conidiogênese de B.
bassiana ocorreu em diferentes hospedeiros com umidade relativa entre 75% e 100%. Outra
importante condição para infecção é a idade dos insetos, pois nem todos os estágios de
desenvolvimento são igualmente suscetíveis à infecção. O estágio de pupa, geralmente é o que
oferece maior resistência, enquanto adultos podem ser mais vulneráveis (BUTT & GOETTEL,
2000), além da variação da infecção inclusive com insetos adultos de sexos diferentes ou
formas, como afídeos alados e ápteros (OGER & LATTEUR, 1985).
Este fungo se tornou conhecido internacionalmente através do produto
Boverin, formulado e amplamente utilizado pela ex-União Soviética em 1970 para o controle
do besouro-do-colorado, Leptinotarsa decemlineata (IGNOFFO et al., 1975).
Nos Estados Unidos várias formulações de fungos entomopatogênicos
têm sido testadas com sucesso no controle do bicudo-do-algodoeiro, Anthonomus grandis,
tanto em laboratório (WRIGHT & CHANDLER, 1991) quanto no campo (FRANK &
SLOSSER, 1990; WRIGHT & CHANDLER, 1992). No Brasil o potencial de B. bassiana para
o controle de A. grandis já foi demonstrado por Coutinho & Cavalcanti (1988) e Coutinho &
Oliveira (1991).
A aplicação inundativa de B. bassiana através de formulações na
cultura do milho mostrou-se eficiente em longo prazo, interferindo na reinfestação de larvas de
Ostrinia nubilallis (ANDERSON & LEWIS, 1991), além de apresentar níveis de seletividade
a outros organismos benéficos (GOETTEL et al., 1990).
17
Este fungo também tem sido amplamente estudado para o controle do
cupim de montículo, apresentando alta eficiência e se tornando uma alternativa ecológica e
econômica no controle desta praga (ALVES, 1998).
Para a cultura do eucalipto, a Portaria 226 de 22/04/2005 do MAPA
autorizou o uso dos inseticidas à base de Beauveria bassiana para controle em caráter
emergencial gorgulho-do-eucalipto, Gonipterus scutellatus (MINISTÉRIO DA
AGRICULTURA PECUÁRIA E ABASTECIMENTO, 2005).
Atualmente a produção de micoinseticidas a base de B. bassiana é
realizada no mundo inteiro e utilizada para o controle de diversas pragas. Na França, uma das
formulações comerciais deste fungo recebe o nome de Naturalis, enquanto nos Estados Unidos
um dos produtos mais conhecidos é o Mycotrol (GLARE, 2004).
No Brasil existem diversas empresas que produzem e comercializam
estes produtos em diferentes tipos de formulações como Boveril, Boveriol, Toyobo, entre
outras, em forma líquida (oleosa), pó (arroz triturado + fungo), conídios puros e arroz inteiro
(GALLO et al., 2002).
2.4.2 Metarhizium anisopliae
M. anisopliae constitui outra espécie de fungo muito pesquisada e
amplamente utilizado no controle de pragas, atacando naturalmente mais de 300 espécies de
insetos, que se tornam mumificados, com o cadáver podendo apresentar colorações entre o
verde claro e escuro, acinzentados ou esbranquiçados (ALVES, 1998).
Na fase parasitária, a infecção por M. anisopliae se inicia a partir da
adesão, germinação do esporo e formação de estruturas de penetração denominadas
apressórios e grampo de penetração (FERRON, 1978). Essas estruturas facilitam a penetração
do fungo no hospedeiro através de processos mecânicos e enzimáticos.
A etapa compreendida entre a germinação do conídio e a penetração
no tegumento do inseto tem duração entre dois a três dias. A colonização varia de dois a
quatro dias e a esporulação ocorre em mais dois ou três dias, dependendo das condições de
temperatura e umidade do ambiente. O ciclo total da doença pode variar entre oito a dez dias.
18
O cadáver do inseto apresenta crescimento micelial branco sobre o corpo, seguido por
esporulação de cor verde (ALVES, 1998). Esta exteriorização de hifas e formação dos
conídios e conidióforos, juntamente com a disseminação destas estruturas reinicia o ciclo do
patógeno (ZACHARUK, 1970; LIMA & TIGANO, 1989).
No Brasil este fungo assume grande importância por ter sido
empregado em um projeto de controle biológico de bastante sucesso, com a aplicação deste
patógeno em condições de campo para o controle da cigarrinha da cana-de-açúcar, Mahanarva
posticata e M. fimbriolata (Hemiptera: Cercopidae) (FERRON, 1981; ALVES, 1998; FARIA
& MAGALHÃES, 2001). Esta espécie infecta outros insetos pragas como Deois flavopicta e
Zulia entreriana (Hemiptera: Cercopidae) (ALVES, 1998), Glossina ssp. (Diptera:
Glossinidae) (KAYA & MUNYINYI, 1995), Frankliniella occidentalis (Thysanoptera:
Thripidae) (LOPES et al., 2000), Coptotermes acinaciformes (Isoptera: Rhinotermitidae)
(MILNER et al., 1998), carrapatos (Boophilus microplus) (CORREIA et al., 1998), entre
outros.
A produção em escala comercial deste fungo ocorre em boa parte do
mundo, com destaque para o Brasil, cuja produção comercial se iniciou na década de 70 para
atender as usinas de cana-de-açúcar, visando o controle de cigarrinhas (ALVES, 1986;
ZIMMERMANN, 1993).
Atualmente, existem no mercado diversas marcas de micoinseticidas a
base de M. anisopliae, como Metarril, Biotec, Toyobo, Metabiol, Metaquino (Brasil),
Metarhizium Schweizer (Suiça), Meta-Sin (México), Bio 1020 (Alemanha), BioGreen
(Austrália), Bio-Pat e Bio-Blast (Estados Unidos), comercializados nas mesmas formas
descritas no item anterior.
2.4.3 Lecanicillium longisporum
A espécie denominada Verticillium lecanii foi reclassificada
primariamente em Lecanicillium lecanii e posteriormente subdividida em três espécies, como
L. lecanii, L. longisporum e L. muscarium (HUMBER & HANSEN, 2005).
19
Lecanicillium é um dos gêneros anamorfos de Cordyceps (SAMSOM
et al, 1988). Os conídios apresentam-se em massas globosas sobre as fiálides de disposição
verticilada, condição que levou a separação do gênero original Verticillium, que incluía fito e
entomopatógenos (MOLINA, 2007).
Os sintomas da infecção causada por Lecanicillium em insetos é
caracterizado pelo aparecimento de um halo branco em volta do hospedeiro, que é associado a
característica do condióforo (ALVES, 1998).
Lecanicillium longisporum (=Verticillium lecanii) é considerado um
dos principais agentes fúngicos no controle microbiano de pragas (LECUONA & RIBA,
1991). Além de sua importância no controle de insetos homópteros, como afídeos, coccídeos e
aleirodídeos (KHALIL & TABORSKY, 1982; GRAJEK, 1994), podem causar doença em
algumas espécies de ácaros, ser hiperparasito de fungos fitopatogênicos, como vários tipos de
ferrugens (CASTALDI & NICOLE, 1993). A espécie L. lecanii, também possui igual
importância no controle destas pragas (HALL, 1981a).
O ciclo deste gênero de fungo é variável de acordo com as condições
ambientais e das características intrínsecas de cada hospedeiro. Em Orthezia praelonga
(Hemiptera: Ortheziidae) o ciclo total de L. longsiporum, da inoculação do fungo à
conidiogênese ocorreu em torno de dois dias. No ácaro Brevipalpus phoenicis (Acari:
Tenuipalpidae), o patógeno L. muscarium completou seu ciclo em aproximadamente 3 dias,
enquanto que L. lecanii este processo precisou de sete dias (MOLINA, 2007).
Existem atualmente diversas marcas comerciais de bioinseticidas
formulados com patógenos do gênero Lecanicillium. Na Europa o fungo L. lecanii vêm sendo
bastante utilizado sobre cultivos em casa de vegetação para o controle de hemípteros, na
formulações comerciais Vertalec e Mycotal (HALL, 1981b).
No Brasil a formulação de L. lecanii é comercializada através da
marca Vertinat e a espécie L. longisporum através da marca comercial Vertirril WP
(MICHEREFF FILHO et al., 2007). O produto Vertirril WP é amplamente utilizado para o
controle de cochonilhas e outros insetos sugadores nos pomares de citros do estado de São
Paulo, o qual vem apresentando resultados satisfatórios (MOLINA, 2007).
20
3 MATERIAL E MÉTODOS
3.1 Criação de Glycaspis brimblecombei em laboratório
Todos os insetos utilizados no ensaio foram provenientes da criação
estoque de psilídeo-de-concha do Laboratório de Controle Biológico de Pragas Florestais da
FCA/UNESP – Campus de Botucatu.
A criação de G. brimblecombei foi conduzida em sala climatizada com
temperatura de 26 ± 2 °C, umidade relativa de 60 ± 10% e fotofase de 13 horas, consideradas
estas as condições ideais para o desenvolvimento do inseto (FIRMINO, 2004), em gaiolas de
criação confeccionadas em madeira revestidas com tecido tipo “voil”, com dimensão de 80 x
40 x 44 cm.
No interior de cada gaiola foi colocada uma bandeja plástica para
colocação dos tubetes contendo mudas de E. camaldulensis com aproximadamente 50 cm de
altura. Em cada gaiola foram colocadas de 10 a 12 mudas, dependendo da quantidade de
folhas de cada uma (Figura 1).
As gaiolas foram acomodadas em prateleiras de metal com capacidade
para quatro unidades, com uma divisória horizontal no centro. Cada prateleira foi provida de
duas lâmpadas fluorescentes de luz branca e uma lâmpada fluorescente de luz de planta
(plantlight), ambas de 15 W.
21
No interior das gaiolas foram liberados entre 60 e 80 insetos adultos do
psilídeo-de-concha, provenientes da própria criação, a partir de outras gaiolas com criação já
estabelecida ou de espécimes coletados no campo, para evitar problemas de consanguinidade.
A
B
C
D
Figura 1. Vista geral da gaiola (A), colocação da muda de eucalipto na bandeja (B), disposição
das gaiolas nas prateleiras da sala de criação (C) e manejo dos insetos adultos no interior das
gaiolas (D).
3.2 Micoinseticidas utilizados
Para a realização dos ensaios foram utilizados produtos biológicos
comerciais à base de fungos entomopatogênicos, disponíveis no mercado nacional e importado
(Tabela 1).
22
Tabela 1. Inseticidas à base de fungos entomopatogênicos utilizados nos bioensaios de
controle de Glycaspis brimblecombei (Hemiptera: Psyllidae).
Patógeno
Marca
comercial
Concentração Preparação Fabricante
Boveril
5,0 x 10
8
conídios/g
Arroz moído
Itaforte Indústrial de
BioProdutos
Agro-Florestais Ltd.
s/n
2,0 x 10
10
conídios/g
Arroz inteiro Toyobo do Brasil Ltd.
Beauveria
bassiana
Mycotrol
2,2 x 10
13
conídios/L
Suspensão
oleosa
Mycotech, EUA.
Metarril
5,0 x 10
8
conídios/g
Arroz moído
Itaforte Indústrial de
BioProdutos
Agro-Florestais Ltd.
Metarhizium
anisopliae
s/n
4,0 x 10
9
conídios/g
Arroz inteiro Toyobo do Brasil Ltd.
Lecanicillium
longisporum
Vertirril
5,0 x 10
8
conídios/g
Arroz moído
Itaforte Indústrial de
BioProdutos
Agro-Florestais Ltd.
s/n: sem nome comercial.
3.3 Patogenicidade dos inseticidas biológicos às ninfas de Glycaspis brimblecombei
em laboratório
A escolha de ninfas de G. brimblecombei para utilização nos
bioensaios ao invés de insetos adultos foi motivada pela facilidade de manuseio e pela
importância dos danos causados na cultura, sendo superiores aos provocados pelos insetos
adultos. Optou-se também, neste caso, pela retirada da concha protetora do inseto,
proporcionando a máxima exposição aos produtos. Em contrapartida, para os ensaios de
23
semicampo as conchas foram mantidas, mantendo a condição natural para verificar a
eficiência dos bioinseticidas nas ninfas protegidas.
Folhas infestadas com ninfas do psilídeo-de-concha foram destacadas
das mudas de eucalipto da criação e levadas ao microscópio estereoscópico para retirada das
conchas e eliminação de ninfas excedentes, mantendo-se ninfas de terceiro e quarto ínstar.
Devido ao tipo de aparelho bucal das ninfas, que é muito delicado, optou-se por retirar o
número de ninfas excedentes para diminuir o estresse e a possibilidade de morte dos insetos
por conseqüência da transferência para outras folhas.
Posteriormente, estas folhas foram acondicionadas em placas de petri
com 90 mm de diâmetro nas quais foi vertida solução contendo gel hidrorretentor
(condicionador de solo, marca comercial Hidroplan) na concentração de 5g de produto/L de
água, para manter as condições de turgidez da folha durante o período de avaliações. Dessa
forma evitou-se a necessidade de transferência das ninfas para folhas novas e a possível morte
das mesmas pelo manuseio. Esta técnica foi previamente testada, comprovando não causar
efeito negativo sobre o desenvolvimento das ninfas do psilídeo-de-concha (Figura 2).
Para o estabelecimento correto das concentrações dos bioinseticidas,
foram realizadas diluições dos produtos em água esterilizada e a inoculação em placas de petri
de 90 mm de diâmetro com meio de cultura BDA (batata-dextrose-ágar), com as suspensões
espalhadas sobre o meio de cultura com o auxilio de uma alça de vidro. Foram inoculadas três
concentrações das suspensões fúngicas em dez placas para cada diluição, sendo tampadas e
lacradas com filme de PVC e incubadas em BOD (temperatura de 26 ± 1 °C, fotofase de 12
horas). Após 24 horas foi realizada a contagem das unidades formadoras de colônia de cada
produto das três diluições.
24
Figura 2. Detalhe da placa de petri com solução hidrorretentora e folhas de eucalipto com
ninfas de Glycaspis brimblecombei.
Este experimento foi composto por 31 tratamentos, distribuídos no
esquema fatorial 6 x 5 + 1 (6 produtos, 5 concentrações e testemunha), com 4 repetições.
Cada repetição foi composta por uma placa de petri com 30 ninfas cada, totalizando 120 ninfas
por tratamento. Os micoinseticidas foram pulverizados sobre as placas de petri contendo as
folhas infestadas com a praga em torre de Potter, com pressão de 15lb/pol
2
(Figura 3). Foram
aplicadas as concentrações de 1,0 x 10
4
, 1,0 x 10
5
, 1,0 x 10
6
, 1,0 x 10
7
e 1,0 x 10
8
conídios/ml
de calda mais espalhante adesivo Tween 20 a 0,02%.
Após a pulverização dos produtos, as placas foram transferidas para
bandejas plásticas e acondicionadas em câmara climatizada tipo BOD (temperatura de 26 ± 1
°C, umidade relativa de 70 ± 10% e fotofase de 12 horas).
Foi avaliada a mortalidade de ninfas para a determinação da CL
50
(concentração letal para mortalidade de 50% da população), TL
50
(tempo letal para
mortalidade de 50% da população) e a eficiência de controle (%) da praga.
As avaliações foram realizadas com um, três, cinco e sete dias após a
aplicação dos produtos, contabilizando-se o número de insetos mortos. Todos os insetos
25
mortos foram transferidos para câmara úmida (placa de petri forrada com papel filtro
umedecido) para observar a esporulação dos fungos e quantificar a mortalidade confirmada.
Figura 3. Torre de Potter adaptada para aplicação dos bioinseticidas.
3.3.1 Deposição de conídios
Antes de cada pulverização foram colocadas sobre a arena da Torre de
Potter quatro lâminas de vidro (25 mm x 75 mm) entre as placas contendo os insetos, para a
contagem dos conídios depositados. Após cada pulverização e secagem, as lâminas foram
preparadas com adição de uma gota de lacto glicerol e de lamínula para observação em
microscópio óptico com aumento de 400x. A contagem do número de conídios foi realizada
através da observação de cinco campos (0,3318 mm
2
) aleatórios em cada lâmina (SHI &
FENG, 2006), perfazendo 20 avaliações em 31 tratamentos distribuídos no esquema fatorial
idêntico ao descrito no item 3.3. Os resultados obtidos foram expressos em número médio de
conídios/mm
2
.
26
3.3.2 Análise dos dados
Os dados de mortalidade foram submetidos à análise de variância
fatorial e as médias comparadas entre si pelo Teste de Tukey (p<0,05), com o auxílio do
software SISVAR 4.6. A CL
50
e TL
50
foram calculados pela análise de Probit (FINNEY,
1964), com o auxílio do software STATPLUS 2007 4.8.0.0.
A deposição dos conídios foi analisada graficamente, através das
possíveis correlações do número médio de conídios/mm
2
com a mortalidade das ninfas.
3.4 Eficiência dos inseticidas biológicos no controle de ninfas de Glycaspis
brimblecombei em condições de semicampo
Os produtos foram aplicados de forma pulverizada e polvilhada nas
mudas de E. camaldulensis infestadas com ninfas do psilídeo-de-concha, provenientes da
criação estoque de G. brimblecombei. O produto Mycotrol, por sua natureza líquida, foi
somente pulverizado. Foram utilizadas duas dosagens de cada produto, objetivando englobar a
recomendação do fabricante de cada produto para o controle de outras pragas em outras
culturas.
Os tratamentos (Tabela 2) foram distribuídos no esquema fatorial 2 x 2
x 5 + 3 (2 formas de aplicação, 2 concentrações e 5 produtos, mais 2 concentrações do produto
Mycotrol aplicado de forma apenas pulverizada e testemunha), com três repetições. Cada
repetição foi formada por uma muda de eucalipto infestada pela praga.
Na calda de pulverização foi adicionado espalhante adesivo Tween 20
(0,02%) e no polvilhamento foi utilizado talco industrial como veículo inerte (Chenco – talco
neutro), misturado com os entomopatógenos.
27
Tabela 2. Descrição dos tratamentos bioinseticidas, com dosagem, forma de aplicação, volume
de calda e quantidade de talco/ha.
Patógeno
Marca
comercial
Dosagem
Volume de
calda/ha
(pulverização)
Quantidade de
talco/ha
2
(polvilhamento)
Boveril WP 4,0 kg/ha 200 L 6,0 kg
8,0 kg/ha 200 L 2,0 kg
(Toyobo)
1
0,2 kg/ha 200 L 9,8 kg
0,4 kg/ha 200 L 9,6 kg
Mycotrol 0,5 L/ha 200 L -
B. bassiana
1,0 L/ha 200 L -
Metarril WP 4,0 kg/ha 200 L 6,0 kg
8,0 kg/ha 200 L 2,0 kg
(Toyobo)
1
0,5 kg/ha 200 L 9,5 kg
M. anisopliae
1,0 kg/ha 200 L 9,0 kg
Vertirril WP 4,0 kg/ha 200 L 6,0 kg
L. lecanii
8,0 kg/ha 200 L 2,0 kg
1
- Não possui marca comercial.
2
- Volume de talco somado à quantidade de produto equivale a 10 kg de mistura/ha.
A aplicação pulverizada foi realizada no Laboratório de Tecnologia de
Aplicação de Defensivos da FCA/UNESP – Campus de Botucatu, em simulador de
pulverizador de barras dotado de pontas de pulverização de jato cônico vazio JA-2 (Figura 4).
O polvilhamento foi simulado através do pulverizador/atomizador costal motorizado da marca
Jacto S.A. com ventilador de 7000 rpm e vazão de 12,6 m
3
de ar. Para tanto, o equipamento foi
fixado no solo e as mudas colocadas na frente do canhão atomizador, suportadas por uma
bandeja plástica vazada para encaixe dos tubetes (Figura 5). O cálculo para determinar a
quantidade de mistura (produto + talco) a ser aplicada foi baseado na quantidade de mistura
por planta, considerando-se espaçamento de 3 x 2 m, muito utilizado em plantios de eucalipto.
28
A quantidade de mistura calculada foi colocada em copos descartáveis e despejada rente a
boca do atomizador, no início do turbilhão de ar.
Figura 4. Pulverização das mudas de eucalipto em simulador de pulverizador de barras.
Figura 5. Polvilhamento das mudas de eucalipto com pulverizador/atomizador costal
motorizado.
29
Após a aplicação dos produtos, as mudas foram acondicionadas em
casa de vegetação providas de sombrite e janela telada, em condições ambiente, cujas
variáveis climáticas foram registradas através de sensor eletrônico.
As avaliações foram realizadas sete dias após a aplicação dos produtos,
contabilizando-se o número ninfas de G. brimblecombei vivas por planta, avaliando-se a muda
inteira.
3.4.1 Deposição de conídios
Neste ensaio a deposição de conídios foi quantificada para ambas as
formas de aplicação dos bioinseticidas, conforme metodologia descrita no item 3.3.1,
colocando-se as lâminas nos espaços entre as mudas, de forma que não houvesse sobreposição
pelas folhas das plantas.
3.4.2 Análise dos dados
A densidade de declínio da população de ninfas de G. brimblecombei
(D), foi submetida à análise de variância fatorial, sendo todas as médias comparadas pelo
Teste de Tukey (p<0,05). A densidade de declínio da população foi obtida pela fórmula de
(SHI & FENG, 2006):
D (%) = [(d
i
– d
f
)/ d
i
] x 100
onde d
i
e d
f
são as densidades (n°
de ninfas/folha) inicial (antes da pulverização) e final de
ninfas do psilídeo-de-concha.
A eficiência dos bioinseticidas foi obtida através da correção do
número de ninfas vivas nos tratamentos em relação ao tratamento testemunha (HENDERSON
& TILTON, 1955).
Como foram utilizadas dosagens comerciais dos produtos, a deposição
dos conídios foi representada graficamente.
30
3.5 Desenvolvimento dos fungos entomopatogênicos sobre ninfas de Glycaspis
brimblecombei
Conforme metodologia descrita no item 3.3, foram separadas 300
ninfas de G. brimblecombei entre terceiro e quarto ínstares em 30 placas de petri de 90 mm de
diâmetro, e pulverizadas em torre de Potter com suspensões conidiais dos seis bioinseticidas,
na concentração de 1,0 x 10
8
conidios/mL, mais adição de Tween 20 (0,02%). Cada
tratamento teve cinco repetições, sendo cada repetição formada por uma placa de petri. Após a
pulverização todas as placas foram acondicionadas em BOD (temperatura de 26 ± 1 °C,
umidade relativa de 70 ± 10% e fotofase de 12 horas).
Ao decorrer os intervalos de 0, 24, 48, 72 e 144 horas da pulverização
dos conídios, uma placa de petri com 10 ninfas de cada tratamento foi levada ao freezer por
aproximadamente 30 minutos para promover a morte dos insetos. Optou-se por colocar a placa
inteira no freezer para evitar o contato com os insetos e danos às estruturas dos fungos.
Os insetos mortos foram cuidadosamente retirados das folhas nas
placas de petri e colocados em lâminas de vidro (25 mm x 75 mm), com adição de lacto
glicerol e lamínula para observação das etapas de crescimento dos fungos nas ninfas (Figura
6). As observações foram realizadas em microscópio ótico com aumento de 400x.
Figura 6. Lâmina com ninfas de Glycaspis brimblecombei tratadas com lactoglicerol (direita) e
detalhe das ninfas de Glycaspis brimblecombei (esquerda).
31
4 RESULTADOS E DISCUSSÃO
4.1 Patogenicidade dos inseticidas biológicos às ninfas de Glycaspis brimblecombei
em laboratório
Todos os produtos testados apresentaram-se patogênicos às ninfas de
G. brimblecombei. Na maior concentração utilizada, 1 x 10
8
conídios/mL, todos os produtos
apresentaram mortalidade corrigida (ABBOTT, 1925) superior a 50% no último dia de
avaliação. Englobando todos os produtos e concentrações, a mortalidade variou de 7,14% à
100% de insetos mortos no sétimo dia de avaliação (Figura 7).
Na maior concentração, as maiores mortalidades corrigidas foram
obtidas com os produtos B. bassiana (Mycotrol), com 96,94%, M. anisopliae (Metarril WP) e
L. lecanii (Vertirril WP), com 100% de mortalidade dos insetos. Os menores valores de
mortalidade foram obtidos por B. bassiana (Toyobo) e M. anisopliae (Toyobo), com 54,08% e
61,22%, respectivamente, na última avaliação (Figura 7). Entretanto, apenas o tratamento B.
bassiana (Toyobo) diferiu estatisticamente dos demais quando comparado o número médio de
ninfas mortas por repetição (Tabela 3).
Ambos os produtos a base de M. anisopliae apresentaram mortalidade
satisfatória dos insetos, sendo superior a 60%, diferindo significativamente entre si apenas na
terceira avaliação, com 28,8 insetos mortos/repetição de M. anisopliae (Metarril WP) contra
11,0 insetos mortos por M. anisopliae (Toyobo) (Tabela 3).
32
Tabela 3. Número médio de ninfas de Glycaspis brimblecombei mortas pela aplicação dos bioinseticidas em função das diferentes
concentrações, em cada período de avaliação (temperatura: 26 ± 1 °C, UR: 70 ± 10% e fotofase: 12 h).
1 DAP 3 DAP
Patógeno
Produtos
1 x 10
4
1 x 10
5
1 x 10
6
1 x 10
7
1 x 10
8
1 x 10
4
1 x 10
5
1 x 10
6
1 x 10
7
1 x 10
8
Boveril 1,8 a
1
A
2
2,0 aA 1,5 aA 1,3 aA 5,0 abA 4,3 aA 4,3 aA 6,5 aAB 5,5 aAB 13,3 abB
Toyobo 3,0 aA 4,0 aA 3,5 aA 6,5 abA 5,8 abA 8,3 abA 7,8 aA 9,3 aA 9,0 abA 12,3 abA
B.bassiana
Mycotrol 1,5 aA 3,0 aAB 5,8 aAB 4,0 aAB 7,5 abB 6,5 abA 8,5 aA 12,3 aAB 18,0 bcB 21,0 bcB
Metarril 3,5 aAB 3,0 aAB 1,0 aA 7,0 abBC 10,3 bC 5,5 abA 3,8 aA 5,5 aA 18,3 bcB 28,8 cC
M.anisopliae
Toyobo 4,3 aA 3,5 aA 5,5 aA 3,3 aA 5,5 abA 7,3 abA 8,3 aA 10,0 aA 8,8 abA 11,0 aA
L. longisporum
Vertirril
4,3 aA 4,3 aA 4,0 aA 10,3 bAB 5,8 abB 14,8 bAB 13,0aAB 9,5 aA 18,8 cB 21,0 cB
Testemunha
2,0 a 2,0 a 2,0 a 2,0 a 2,0 a 4,3 a 4,3 a 4,3 a 4,3 a 4,3 a
CV (%):
32,40 22,21
DMS prod.:
5,78 9,57
DMS conc.:
5,34 8,84
5 DAP 7 DAP
1 x 10
4
1 x 10
5
1 x 10
6
1 x 10
7
1 x 10
8
1 x 10
4
1 x 10
5
1 x 10
6
1 x 10
7
1 x 10
8
Boveril 6,0 aA 5,8 aA 11,5abAB
11,5abcAB 20,5bcdB 7,3 abA 9,3 abA 15,8bcAB
18,5 bcB 23,3 bcB
Toyobo 9,8 abA 9,0 aA 10,8 abA 9,8 abA 13,5 abA 10,3abAB
9,8 abA 11,3abAB
10,0abAB
18,8 bB
B.bassiana
Mycotrol 11,5 abA 10,5abA
20,0 bAB 23,0 dB 24,5 cdB 16,5 bcA 18,8bcA 24,0 cAB 27,8 cB 29,3 cB
Metarril 7,5 aA 6,5 aA 8,3 aA 21,3 cdB 29,8 dB 10,3 abA 12,0abA 11,0 abA 23,3 cB 30,0 cB
M.anisopliae
Toyobo 9,3 abA 10,8abA
20,8 abB 17,8bcdAB
18,5bcAB
9,5 abA 11,3abA 21,5 cB 18,3bcAB
20,5 bcB
L. longisporum
Vertirril
18,5 bA 19,5 bA 19,5 bA 25,5 dA 26,8 cdA 22,8 cA 24,3 cA 21,5 cA 27,8 cA 30,0 cA
Testemunha
5,0 a 5,0 a 5,0 a 5,0 a 5,0 a 5,5 a 5,5 a 5,5 a 5,5 a 5,5 a
CV (%):
35,10 27,66
DMS prod.:
10,29 9,60
DMS conc.:
9,50 8,87
1,2
- Letras minúsculas iguais na mesma coluna e maiúscula na mesma linha não diferem significativamente pelo Teste de Tukey (p<0,05).
33
Na primeira e nas duas últimas avaliações não foi observada diferença
entre estes produtos. Gassen (2006), avaliando a patogenicidade de B. bassiana, M. anisopliae
e L. lecanii em insetos adultos do psilídeo-da-goiabeira Triozoida sp., obteve 44% de
mortalidade na concentrações de 5 x 10
7
para o fungo M. anisopliae. Para o fungo L. lecanii,
os valores de mortalidade superaram 80%, sendo considerado o fungo mais virulento,
corroborando com os resultados obtidos neste estudo, onde L. longsiporum foi considerado
altamente eficiente na mortalidade de G. brimblecombei. Já para os produtos à base de B.
bassiana, os resultados para as marcas Boveril WP e Toyobo apresentaram mortalidades
semelhantes aos obtidos por Gassen (2006), exceto para o produto Mycotrol, cujos valores de
mortalidade superaram os 90% nas duas maiores concentrações na última avaliação.
A alta virulência dos produtos analisados pode estar relacionada ao
grau de exposição das ninfas, por serem menos esclerotizadas do que insetos adultos e se
movimentarem menos. A ecdise também pode colaborar com o aumento da suscetibilidade
dos espécimes aos entomopatógenos, através da queda do número de oenócitos, debilitando
seu sistema imunológico de defesa (HEMING, 2003).
As qualidades intrínsecas de cada patógeno, como procedência do
isolado, hospedeiro original ou local de coleta, também são fatores que podem influenciar na
virulência, positiva ou negativamente. A variação na mortalidade dos insetos por fungos de
mesma espécie, mas de diferentes procedências, podem estar ligados à virulência, que é
determinada pela produção de compostos secundários que influenciam a capacidade do
patógeno em causar doença (PADULLA, 2007). Em bioensaios de seleção de isolados, a
variação de patogenicidade tem sido observada com frequência e pode estar associada a
fatores como baixa virulência, especificidade e tolerância do hospedeiro, juntamente com a
variabilidade genética de cada isolado.
Neste caso, alguns produtos podem ter apresentado resultados de
mortalidade satisfatórios, mas apenas em laboratório, cujas condições de temperatura,
fotoperíodo e umidade são propicias ao desenvolvimento dos patógenos (ALVES, 1998). Em
muitas situações, os resultados obtidos em laboratório não são confirmados em condições de
campo.
34
MORTALIDADE CORRIGIDA (%)
Figura 7. Mortalidade acumulada corrigida de ninfas de Glycaspis brimblecombei
pulverizadas com diferentes concentrações de formulações comerciais de fungos
entomopatogênicos (temperatura: 26 ± 1 °C, UR: 70 ± 10% e fotofase: 12 h). (Obs.: dat = dias
após o tratamento) (ABBOTT, 1925).
35
Favaro (2006a), testando o efeito de um isolado de B. bassiana e dois
isolados de L. lecanii sobre ninfas de 5° instar de G. brimblecombei em mudas de E.
camaldulensis, obteve valores de mortalidade total de 81% para B. bassiana, 80% e 66% para
os dois isolados de L. lecanii (isolados CG904 e CG902, respectivamente) no décimo dia de
avaliação, com a concentração de 1,5 x 10
7
conídios/mL. Esta alta mortalidade apresentada
pelo fungo B. bassiana pode indicar maior especificidade deste patógeno ao psilídeo-de-
concha, pois foi isolado de cadáver de G. brimblecombei. Comparativamente aos resultados
obtidos neste trabalho, o produto à base de B. bassiana que apresentou maior virulência foi o
Mycotrol, cujo patógeno foi obtido em mosca-branca Bemisia tabaci, ou seja, também um
hemíptero como G. brimblecombei. Os demais produtos a base de B. bassiana (Boveril WP e
Toyobo) utilizados foram provenientes de cadáveres de coleópteros, podendo esta ser uma das
justificativas pelo menor desempenho em relação ao produto Mycotrol. Tantos os isolados de
L. lecanii usados por Favaro (2006) quanto o isolado de L. longisporum usado neste estudo
foram provenientes de hemípteros.
Puterka et al. (1994) testaram dois isolados de B. bassiana e um
isolado de L. lecanii para o controle do psilídeo-da-pêra Cacopsylla piricola, na concentração
de 1 x 10
7
conidios/mL aplicados sobre ninfas de terceiro ínstar. Nas avaliações de três, cinco
e sete dias após a aplicação dos patógenos, os percentuais de mortalidade foram 40,6%, 85,6%
e 92,5% para o isolado de B. bassiana 2430, de 57,4%, 93,8% e 96,0% para o isolado de B.
bassiana 2860. Para o isolado de L. lecanii as mortalidades foram de 17%, 81,1% e 98,6%
para o 3°, 4° e 5° dia após a aplicação do fungo, mostrando-se mais virulento do que o fungo
L. longisporum usado neste estudo, que obteve resultados semelhantes, porém na concentração
de 10
8
conídios/ml.
Leite et al. (2005) observaram que mortalidade acumulada de ninfas de
terceiro ínstar do pulgão gigante-do-pinus Cinara atlantica, por 21 isolados de L.lecanii
variou entre 22,92% e 72,22%, na concentração de 1 x 10
7
conídios/ml em condições de
laboratório, após 15 dias de avaliação. Nesta mesma concentração, os resultados obtidos pelo
produto Vertirril WP sobre ninfas entre terceiro e quarto ínstar de G. brimblecombei foram de
90,82% de mortalidade corrigida e 92,50% de mortalidade total.
A suscetibilidade de alguns hemípteros-praga de cereais ao fungo L.
lecanii foi avaliada por Feng et al. (1990), demonstrando que Diuraphis noxia,
36
Metopolophium dirhodum, Rhopalosiphum maidis, Schizaphis graminum, Sitobion avenae e
R. padi apresentaram índices de mortalidade de 85%, 80%, 86%, 62%, 100% e 70%,
respectivamente.
Com relação ao fungo M. anisopliae, Carswell et al. (1998) obtiveram
100% de mortalidade para Musca domestica e Bactrocera tryoni, nove dias após a inoculação.
Na concentração de 1 x 10
7
conídios/mL, de 10 isolados de M. anisopliae, 5 apresentaram
mortalidade de ninfas de B. tabaci em folhas de feijão entre 73% e 97% (HERRERA et al.,
1999). Freitas et al. (2001) avaliando a patogenicidade deste mesmo fungo no controle de B.
tabaci, obteve mortalidade de 72,6% das ninfas tratadas.
Pela análise de Probit (FINNEY, 1964) não foi verificada diferença
significativa entre as CL
50
, pela sobreposição dos intervalos de confiança (Tabela 4).
Paralelamente, os produtos que proporcionaram valores de mortalidade mais altos mesmo nas
menores concentrações testadas, obtiveram CL
50
calculada abaixo das concentrações
utilizadas. Destaca-se L. longisporum (Vertirril WP), cuja CL
50
foi calculada em 150
conídios/mL e B. bassiana (Mycotrol), com 9,67 x 10
3
conídios/mL (Tabela 4). Estes
resultados foram motivados pela alta virulência destes dois produtos às ninfas de G.
brimblecombei, que no caso de L longisporum (Vertirril WP), apresentou mortalidade total de
75,83% na menor concentração na avaliação de 7 dias (Figura 8).
Tabela 4. CL
50
, intervalo de confiança (95%) e valores do teste qui-quadrado para as
formulações comerciais de fungos entomopatogênicos utilizados no controle de ninfas de
Glycaspis brimblecombei (temperatura: 26 ± 1 °C, UR: 70 ± 10% e fotofase: 12 h)
Patógeno (produto) CL
50
(con./ml) Log.CL
50
I.C. (95%) x
2
p-valor
B. bassiana (Boveril WP) 11,2 x 10
5
6,05 (5,76; 6,34) 1,09 0,7802
B. bassiana (Toyobo) 53,1 x 10
5
7,73 (3,86; 11,59) 8,17* 0,0425
B. bassiana (Mycotrol) 0,10 x 10
5
3,99 (3,49; 4,34) 1,10 0,7776
M. anisopliae (Metarril WP) 3,03 x 10
5
5,48 (3,97; 6,99) 19,44*
0,0002
M. anisopliae (Toyobo) 3,82 x 10
5
5,58 (3,84; 7,32) 8,78* 0,0323
L. longisporum (Vertirril WP) 0,0015 x 10
5
2,18 (-8,98; 8,33) 3,89 0,2733
* x
2
significativo (p<0,05)
37
MORTALIDADE (%)
LOG DA CONCENTRAÇÂO
Figura 8. Mortalidade de ninfas de Glycaspis brimblecombei pulverizadas com diferentes
concentrações de formulações comerciais de fungos entomopatogênicos (temperatura: 26 ± 1
°C, UR: 70 ± 10% e fotofase: 12 h).
38
Nesse contexto, sabe-se que suscetibilidade da grande maioria dos
insetos a patógenos é dependente da dosagem de esporos, sendo presumida a existência de um
limiar mínimo necessário de propágulos infectivos para provocar doença no hospedeiro.
Entretanto, a natureza desta relação não é bem definida para algumas situações (NAVON &
ASCHER, 2000). Goettel et al. (1993) observaram correlação negativa entre dosagem e
mortalidade para concentrações maiores que 1 x 10
4
ascósporos de Ascosphaera aggregata
sobre larvas de Megachile rotundata (Hymenoptera: Megachilidae).
De fato, todos os produtos testados não apresentaram diferença
significativa entre si e nem com a testemunha com relação ao número médio de ninfas mortas,
nas duas primeiras avaliações nas concentrações de 1 x 10
4
, 1 x 10
5
e 1 x 10
6
conidios/mL.
Quando comparadas concentrações de um mesmo produto, foi
observado que o bioinseticida Vertirril WP (L. longisporum) não apresentou diferença entre
suas próprias concentrações com relação ao número de ninfas mortas na última avaliação,
variando de 22,8 a 30,0 ninfas mortas.
Os produtos que apresentaram as melhores eficiências no controle de
ninfas de G. brimblecombei, B. bassiana (Mycotrol), M. anisopliae (Metarril WP) e L.
longisporum (Vertirril WP), também apresentaram um pico de mortalidade aos 3 dias após a
pulverização (Figura 9), principalmente na concentração de 1 x 10
8
conídios/mL, cujas médias
do número de ninfas mortas foram significativamente diferentes quando comparadas a dos
demais produtos (Tabela 3).
Esta rápida mortalidade das ninfas pode estar atrelada a alta
concentração do patógeno, bem como pela suscetibilidade do hospedeiro (FARGUES &
RODRIGUES-RUEDA, 1980). Cassiano et al. (2008), analisando a adesão de conídios e as
possíveis correlações entre o tempo e a concentração de esporos de M. anisopliae em
cascudinho, Alphitobius diaperinus (Coleoptera: Tenebrionidae), observou alta correlação
entre estes fatores e, consequentemente, maior mortalidade em menor tempo.
De fato, o tratamento B. bassiana (Mycotrol) apresentou pico de
mortalidade aos 3 dias após a pulverização, na concentração de 1 x 10
8
e 1 x 10
7
conídios/mL,
de 45% e 46,67%, enquanto que na concentração de 1 x 10
6
a maior mortalidade foi aos 5 dias
após a pulverização (25,83%) e na concentração de 1 x 10
5
conídios/mL o maior valor foi aos
7 dias após a pulverização (27,50%) (Figura 9).
39
MORTALIDADE DIÁRIA (%)
Figura 9. Mortalidade diária de ninfas de Glycaspis brimblecombei pulverizadas com
diferentes concentrações de formulações comerciais de fungos entomopatogênicos.
(temperatura: 26 ± 1 °C, UR: 70 ± 10% e fotofase: 12 h) (Obs.: dat = dias após o tratamento).
40
Pela análise dos valores de TL
50
(Tabela 5) foi possível observar o
comportamento dos patógenos com relação ao tempo necessário para matar 50% da
população. De maneira geral, o TL
50
foi diminuindo com o aumento da concentração, sendo
menor para o produto M. anisopliae (Metarril) (1,37), na maior concentração. Neste caso, os
valores de mortalidade final não significaram maiores mortalidades em menos tempo, pois L.
longisporum (Vertirril WP) apresentou mortalidade total igual a M. anisopliae, porém com
tempo TL
50
de 2,39 dias, sendo ambos os produtos com melhor desempenho. O maior TL
50
encontrado foi para o bioinseticida B. bassiana (Toyobo), de 13,91 dias.
Os tempos letais mais lentos podem ser explicados ou pelo modo de
aplicação dos produtos ou por reações específicas dos fungos no processo de penetração,
colonização, ação de toxina e mecanismo de defesa dos insetos (BATISTA FILHO et al.,
1995).
41
Tabela 5. TL
50
, intervalo de confiança e valores do teste qui-quadrado para as formulações
comerciais e concentrações de fungos entomopatogênicos aplicados nas ninfas de Glycaspis
brimblecombei (temperatura: 26 ± 1 °C, UR: 70 ± 10% e fotofase: 12 h).
B. bassiana
(Boveril WP)
TL
50
IC Equação χ
2
p-valor
1,0 x 10
4
11,90 (10,78; 13,02) p = 3,4459 + 0,1306.logx 0,00 0,9987
1,0 x 10
5
10,23 (9,30; 11,16) p = 3,3860 + 0,1578.logx 1,24 0,5382
1,0 x 10
6
6,45 (5,88; 7,02) p = 3,3344 + 0,2581.logx 0,31 0,8556
1,0 x 10
7
5,99 (5,53; 6,44) p = 3,0668 + 0,3229.logx 3,10 0,2123
1,0 x 10
8
3,85 (3,41; 4,30) p = 3,8953 + 0,2871.logx 0,71 0,7008
B. bassiana
(Toyobo)
TL
50
IC Equação χ
2
p-valor
1,0 x 10
4
9,38 (8,35; 10,41) p = 3,8464 + 0,1230.logx 1,19 0,5526
1,0 x 10
5
10,83 (9,55; 12,11) p = 3,9277 + 0,0990.logx 0,27 0,8738
1,0 x 10
6
8,60 (7,58; 9,62) p = 3,9302 + 0,1244.logx 1,28 0,5269
1,0 x 10
7
13,91 (11,61; 16,21) p = 4,2340 + 0,0551.logx 0,12 0,9401
1,0 x 10
8
5,23 (4,53; 5,94) p = 4,0568 + 0,1802.logx 1,23 0,5418
B. bassiana
(Mycotrol)
TL
50
IC Equação χ
2
p-valor
1,0 x 10
4
6,30 (5,76; 6,84) p = 3,2994 + 0,2700.logx 0,64 0,7262
1,0 x 10
5
5,93 (5,42; 6,45) p = 3,5438 + 0,2454.logx 4,16 0,1249
1,0 x 10
6
3,84 (3,40; 4,27) p = 3,8848 + 0,2907.logx 2,49 0,2879
1,0 x 10
7
3,08 (2,77; 3,40) p = 3,7497 + 0,4054.logx 0,34 0,8435
1,0 x 10
8
2,34 (1,98; 2,70) p = 4,0481 + 0,4069.logx 0,67 0,7141
M. anisopliae
(Metarril WP)
TL
50
IC Equação χ
2
p-valor
1,0 x 10
4
10,17 (9,18; 11,16) p = 3,6917 + 0,1287.logx 0,90 0,6360
1,0 x 10
5
8,82 (8,12; 9,53) p = 3,4124 + 0,1800.logx 6,90* 0,0318
1,0 x 10
6
8,28 (7,56; 9,01) p = 3,3316 + 0,2014.logx 0,24 0,8874
1,0 x 10
7
3,03 (2,49; 3,57) p = 4,2891 + 0,2345.logx 0,55 0,7594
1,0 x 10
8
1,37 (0,95; 1,80) p = 4,1729 + 0,6024.logx 0,01 0,9954
M. anisopliae
(Toyobo)
TL
50
IC Equação x
2
p-valor
1,0 x 10
4
11,14 (9,82; 12,47) p = 3,9355 + 0,0955.logx 0,18 0,9132
1,0 x 10
5
8,55 (7,59; 9,50) p = 3,8675 + 0,1325.logx 0,46 0,7930
1,0 x 10
6
4,23 (3,76; 4,71) p = 3,8668 + 0,2677.logx 5,56 0,0621
1,0 x 10
7
5,18 (4,68; 5,68) p = 3,6767 + 0,2554.logx 2,71 0,2582
1,0 x 10
8
4,47 (3,94; 5,01) p = 3,9406 + 0,2368.logx 1,75 0,4160
L. longisporum
(Vertirril WP)
TL
50
IC Equação x
2
p-valor
1,0 x 10
4
3,99 (3,52; 4,46) p = 3,9166 + 0,2716.logx 0,33 0,8497
1,0 x 10
5
3,94 (3,53; 4,34) p = 3,7596 + 0,3152.logx 0,83 0,6595
1,0 x 10
6
4,51 (4,07; 4,94) p = 3,6796 + 0,2930.logx 3,89 0,1433
1,0 x 10
7
2,11 (1,72; 2,51) p = 4,3190 + 0,3221.logx 1,30 0,5216
1,0 x 10
8
2,39 (2,14; 2,65) p = 3,6291 + 0,5732.logx 0,68 0,7122
* x
2
significativo (p<0,05)
42
De acordo com os resultados de Favaro (2006a), o TL
50
dos isolados
de B. bassiana BF01 e de L. lecanii CG904 e CG902, foram de 4,86, 6,52 e 7,03 dias,
respectivamente, para ninfas de G. brimblecombei, utilizando concentração de 1,5 x 10
7
conidios/mL.
Gassen (2006) obteve, para as concentrações de 1 x10
7
e 1 x 10
8
conidios/mL, valores de TL
50
de 2,67 e 2,94 para B. bassiana, 1,74 e 1,88 para M. anisopliae e
2,94 e 2,84 para L. lecanii, respectivamente para Triozoida sp.
Kim et al. (2003), ao avaliar a patogenicidade dos fungos L. lecanii, B.
bassiana e Paecilomyces spp., demonstraram que L. lecanii foi o mais patogênico contra Aphis
gossypii, tendo apresentado 100% de mortalidade e TL
50
de 2,7 dias. Askary et al. (1998)
avaliaram a capacidade de infecção de dois isolados de L. lecanii e o produto comercial
Vertalec, para o pulgão M. euphorbiae. O TL
50
foi de 5 dias para o produto e para o isolado
198499, e de 9 dias para o isolado 216596, indicando maior eficiência do produto Vertalec e
do isolado 198499, com mortalidade de 76% e 94%, respectivamente. Hall & Burges (1979)
obtiveram sucesso no controle de M. persicae, em casa de vegetação com o fungo L. lecanii,
cujo TL
50
foi de 3,3 dias.
Loureiro e Monteiro (2004) observaram decréscimo dos tempos letais
para operárias de Atta sexdens sexdens conforme o aumento da concentração de conídios nas
suspensões de B. bassiana, M. anisopliae e P. farinosus. Os tempos letais para os três fungos
em questão foram 2,16, 2,50 e 1,48 dias, porém, em concentração de 10
9
conidios/mL.
43
Todos os bioinseticidas utilizados resultaram em cadáveres com
extrusão das estruturas dos fungos, comprovando a capacidade do patógeno em completar seu
ciclo no interior do hospedeiro (TAKADA, 2002). Foi observado que o desenvolvimento do
fungo foi crescente em resposta ao aumento das concentrações para todos os tratamentos
(Figura 10). Este fenômeno foi reportado por Wenzel (2005) através da aplicação de diferentes
concentrações de L. lecanii em Tetranychus urticae e por Neves & Hirose (2005) em
Hypothenemus hampei.
Além das características intrínsecas de cada fungo, esta relação
positiva entre a conidiogênese e a concentração pode ser explicada considerando-se que
quanto maior a quantidade, maior número de conídios tem possibilidade de germinar, penetrar
e colonizar o hospedeiro, dificultando a proliferação de outros microrganismos competidores
que poderiam interferir no processo de esporulação (NEVES & HIROSE, 2005).
Nesse sentido, as menores concentrações dos produtos utilizados neste
trabalho resultaram insetos com a presença de outros agentes colonizadores, sendo observado,
pela aparência de alguns dos insetos mortos que não esporularam, a provável ocorrência de
septicemia, onde se presume que seja o desenvolvimento de bactérias. Alguns insetos mortos
apresentaram infecção por alguns fungos oportunistas como Aspergillus spp., Paecylomices e
Penicillium spp.
Dos produtos utilizados neste trabalho que apresentaram melhor
desempenho, o bioinseticida Mycotrol foi o que apresentou a maior porcentagem de insetos
colonizados, nas três maiores concentrações (74,17%, 25,0% e 88,3%), seguido pelo
tratamento L. longisporum (Vertirril WP) (83,3%) na maior concentração. Estes resultados são
bastante interessantes, pois indicam a capacidade do patógeno em se disseminar e infectar
outros organismos, podendo desencadear processos epizoóticos através da transmissão
horizontal.
Salienta-se, também, que no caso de produtos que apresentaram
menores taxas de mortalidade total, como no caso de B. bassiana (Boveril WP), apresentou,
por conseguinte, taxa satisfatória de insetos esporulados na maior concentração (77,5%). Em
contrapartida, o tratamento M. anisopliae (Metarril WP), que apresentou alta performance na
mortalidade de ninfas de G. brimblecombei, não obteve o mesmo desempenho quanto ao
desenvolvimento do patógeno no hospedeiro.
44
MORTALIDADE CONFIRMADA (%)
Figura 10. Mortalidade confirmada acumulada de ninfas de Glycaspis brimblecombei
pulverizadas com diferentes concentrações de formulações comerciais de fungos
entomopatogênicos. (temperatura: 26 ± 1 °C, UR: 70 ± 10% e fotofase: 12 h).
45
Figura 11. Ninfas de Glycaspis brimblecombei infectadas por B. bassiana (A), L. longisporum
(B) e M. anisopliae (C). Ninfas sadias (D).
4.1.1 Deposição de conídios
A análise de deposição de conídios, geralmente expressa em
conídios/mm
2
, pode ser utilizada como método auxiliar na padronização e determinação de
isolados ou formulações comerciais de fungos entomopatogênicos (SHI et al., 2008).
O número de conídios depositados nas lâminas de vidro em
decorrência da pulverização das formulações comerciais de fungos entomopatogênicos
aumentou com o incremento da concentração das suspensões (Figura 12).
46
DEPOSIÇÃO DE CONÍDIOS/mm
2
Figura 12. Valores médios da deposição de conídios/mm
2
dos fungos entomopatogênicos em
função da aplicação de diferentes concentrações dos bioinseticidas.
A variação entre os valores das menores para as maiores concentrações
foi de no mínimo 12,66 conídios/mm
2
para os tratamentos B. bassiana (Boveril WP e Toyobo)
e, no máximo, de 1345 conídios/mm
2
para o tratamento M. anisopliae (Metarril WP). Os
dados obtidos corroboram com os obtidos por Shi et al. (2008) que, utilizando concentrações
de 1 x 10
6
, 1 x 10
7
e 1 x 10
8
conídios/ml de B. bassiana e M. anisopliae, chegaram em
deposições mínimas de 29 e máxima de 1946 conídios/mm
2
para B. bassiana e mínima de 21 e
máxima de 1626 conídios/mm
2
para M. anisopliae.
A relação entre o número de conídios depositados e mortalidade foi
mais forte para os produtos que apresentaram incremento da mortalidade em resposta a
concentração, como Boveril WP e Metarril WP. Os bioinseticidas que apresentaram
mortalidade pouco dependente da concentração também mostraram menor dependência com
relação ao némro de conídios depositados (Figura 13).
47
Tais resultados reforçam a eficiência efetiva dos bioinseticidas,
principalmente quanto à formulação, pois as diferenças na deposição dos conídios, neste caso,
podem ser atribuídas às diferentes preparações utilizadas.
Considerando-se apenas a concentração de 1 x 10
8
conídios/mL, os
produtos preparados em arroz inteiro apresentaram menor deposição de conídios em relação às
outras preparações. Contudo, durante o preparo das suspensões, foi realizada agitação
constante, até a soltura de toda a massa de esporos dos grãos de arroz. A agregação de
conídios em massas foi observada com frequência durante a contagem de esporos nas lâminas,
mesmo com a padronização da agitação das suspensões, que foram realizadas por 30 segundos
em tubos de ensaio antes da pulverização.
Nesse sentido, pelo aspecto visual das formulações, os produtos à base
de M. anisopliae e L. longisporum apresentaram-se de forma aparentemente mais solta, o que
pode ter colaborado para a homogeneização das suspensões fúngicas.
48
MORTALIDADE CORRIGIDA (%)
DEPOSIÇÃO DE CONÍDIOS/mm
2
Figura 13. Relação entre a deposição de conídios/mm
2
dos diferentes fungos
entomopatogênicos e a mortalidade corrigida de ninfas de Glycaspis brimblecombei.
49
4.2 Eficiência dos inseticidas biológicos sobre as ninfas de Glycaspis
brimblecombei em condições de semicampo
Comparativamente aos ensaios realizados no laboratório, a
mortalidade dos insetos mostrou-se inferior no teste de semicampo. Pela análise do declínio da
população das ninfas de G. brimblecombei no tratamento testemunha e em comparação deste
com os demais tratamentos, observou-se baixa ação de alguns bioinseticidas, como B.
bassiana (Boveril WP), M. anisopliae (Toyobo) nas formas de aplicação pulverizada e
polvilhada. A pulverização do produto Mycotrol também apresentou valores baixos de
mortalidade, com 36,5% e 34,3% para as dosagens de 0,5 e 1,0 L do produto comercial/ha
(Tabela 6). Nos ensaios de laboratório este produto apresentou, nas concentrações de 1 x 10
7
e
1 x 10
8
conídios/mL, mortalidade de ninfas superior a 80%.
Entretanto, a situação inversa também foi observada, visto que
produtos com resultados inferiores no laboratório apresentaram taxas de controle satisfatórias
na condição de semicampo. Nesse sentido, em condições praticamente opostas às do
laboratório, o tratamento B. bassiana (Toyobo) teve declínio de aproximadamente 70% da
população para ambas as dosagens na aplicação polvilhada. Os tratamentos M. anisopliae
(Toyobo) e L. longisporum (Vertirril WP) responderam por 66,2% e 76,5% do declínio da
população da praga, também na forma polvilhada.
O bom desempenho de alguns produtos aplicados na forma polvilhada
pode ser atribuído às condições da própria forma de aplicação, que diferentemente da
aplicação pulverizada, o conídio não entra em contato com água, evitando o inicio do processo
germinativo. Dessa maneira, os conídios só irão germinar em condições ideais de umidade e
temperatura, e se houver condições ideais específicas entre o patógeno e hospedeiro, podendo
manter, de certa forma, a capacidade infectiva do conídio por mais tempo.
50
Tabela 6. Valores médios (%) da densidade de declínio (D) da população de Glycaspis
brimblecombei em função da aplicação dos bioinseticidas.
Polvilhamento
Pulverização
Tratamentos Dosagens
(kg/ha)
Maior Menor
Maior Menor
B. bassiana (Boveril WP)
36,3 ab
1
A
2
α
3
(8,0)
33,4 ab A α
(4,0)
30,8 ab A α
(8,0)
21,6 a A α
(4,0)
B. bassiana (Toyobo)
68,4 c B α
(0,4)
72,9 c B α
(0,2)
41,0 ab A α
(0,4)
34,0 ab A α
(0,2)
B. bassiana (Mycotrol)
- -
34,3 ab α
(1,0 L/ha)
36,5 ab α
(0,5 L/ha)
M. anisopliae (Metarril WP)
53,3 bc A α
(8,0)
46,5 bc A α
(4,0)
53,4 b A α
(8,0)
70,9 c B β
(4,0)
M. anisopliae (Toyobo)
66,2 bc B α
(1,0)
47,1 bc A α
(0,5)
23,0 ab A α
(1,0)
62,8 bc A β
(0,5)
L. longisporum (Vertirril WP)
76,5 c B β
(8,0)
45,1 abc A α
(4,0)
47,5 b A α
(8,0)
38,3 abc A α
(4,0)
Teste 14,33 a
14,33 a
CV (%): 58,36
DMS produtos x aplicação: 31,64 32,74
DMS polvilhado x pulverizado: 21,69
DMS dosagens: 21,69
1
Letras minúsculas comparam os produtos em cada coluna
2
Letras maiúsculas comparam o polvilhamento e a pulverização
3
Letras gregas comparam as doses dentro de cada forma de aplicação
Ambos bioinseticidas à base de M. anisopliae mostraram-se eficientes
no controle das ninfas de G. brimblecombei, nas duas formas de aplicação para M. anisopliae
(Toyobo) e na forma pulverizada para Metarril WP. O tratamento M. anisopliae (Toyobo)
apresentou, quando pulverizado, eficiência superior na menor dose (61,72%), com 62,8% de
declínio da população.
O produto Metarril, quando testado em condições de campo para a
cigarrinha das pastagens M. fimbriolata atingiu 65% de mortalidade corrigida dos insetos
51
(MACEDO et al., 2003). Para o controle de M. posticata, o produto Metarril WP, na dose de 4
kg/ha, apresentou mortalidade de 80% (LOPES et al., 2002).
Segundo Alves (1998) a espuma formada por estas espécies de
cigarrinhas, a partir da excreção, forma um microclima favorável ao desenvolvimento de
fungos entomopatogênicos. Além das próprias características do honeydew, ricos em açúcares
e compostos nitrogenados, que são algumas das exigências nutricionais preferidas por alguns
fungos entomopatogênicos, incluindo os hifomicetos, que podem inclusive ter a capacidade de
germinação de esporos aumentada quando em contato com estas substâncias. Analogamente,
pelas características da concha produzida pelas ninfas de G. brimblecombei, que são ricas em
açúcares e carboidratos (SANCHES, 2003; WHITE, 1972) e pelos resultados obtidos por Dal
Pogetto et al. (2008a), esperava-se encontrar estas conchas colonizadas pelos fungos.
Ainda com relação ao ensaio de Dal Pogetto et al. (2008a), este foi
conduzido em mudas de eucalipto acondicionadas em laboratório, em condições muito mais
próximas do ideal para o desenvolvimento dos fungos do que nas condições de semicampo
deste trabalho, cuja temperatura média oscilou entre 26,0 °C à 31,0 °C e a umidade relativa,
bem mais crítica, entre 36% à 58,4% (Figura 14).
52
DIAS APÓS A APLICAÇÃO DOS BIOINSETICIDAS
Figura 14. Umidade relativa (%) e temperatura (°C) medidas na casa de vegetação durante o
período entre a aplicação dos bioinseticidas e a avaliação de mortalidade nas ninfas de
Glycaspis brimblecombei.
A eficiência de grande parte dos bioinseticidas não ultrapassou 60%
nas condições de semicampo (Figura 15). Entretanto, são inúmeros os fatores bióticos e
abióticos que podem comprometer a eficácia destas formulações, principalmente em
condições de campo e semi-campo (UGINE et al., 2007).
Condições ambientais desfavoráveis, incluindo baixa umidade, altas
temperaturas, chuvas e radiação solar são frequentemente citados como os principais entraves
ao sucesso do controle biológico com agentes microbianos (INGLIS et al., 2002; HAJEK,
1997; GLARE & MILNER, 1991; GOETTEL et al., 2000).
Yeo et al. (2003) observou que o produto Mycotrol (B. bassiana) e o
isolado HRI 172 (L. lecanii) apresentaram maior taxa de germinação e maior eficiência no
controle de Aphis fabae e Mizus persicae em temperaturas de 23 °C.
Estudos recentes indicam que até mesmo a temperatura do corpo do
inseto pode afetar a eficácia destes agentes de controle, exigindo critérios mais precisos para a
53
seleção de isolados, visando aqueles com maior tolerância a altas temperaturas (INGLIS et al.,
1996; THOMAS & JENKINS, 1997).
Para a adoção de programas de controle microbiano de pragas, a
tolerância dos patógenos às condições ambientais adversas é uma característica desejável,
devendo comprometer o mínimo possível a eficiência. Especificamente para o psilídeo-de-
concha, que ocorre em plantios extensivos em regiões com grande variação de temperatura e
umidade, é importante se ter entomopatógenos adaptados a condições mais secas, como ocorre
no centro-oeste do estado de Minas Gerais e Mato Grosso do Sul.
Os fatores bióticos também exercem influência direta sobre a eficácia
dos agentes de controle, como as interações tróficas entre a planta hospedeira, a praga e
fungos entomopatogênicos. Alguns entomologistas e estudiosos de patologia de insetos têm
reportado o seqüestro, por parte de alguns insetos, de compostos fitoquímicos com
características antimicóticas, conferindo-lhes resistência à infecção por fungos (GOULD &
MASSEY, 1984; RAMOSKA & TODD, 1985; POPRAWSKI & JONES, 2000).
Insetos mantidos em dietas artificiais apresentam maior suscetibilidade
á infecções por fungos do que insetos mantidos em dieta natural (BOUCIAS et al., 1984;
GOETTEL et al., 1993), assim como insetos criados em laboratório também são mais
suscetíveis do que insetos coletados no campo (BELL & HAMALLE, 1971).
54
Figura 15. Eficiência da pulverização e do polvilhamento dos bioinseticidas aplicados em diferentes dosagens no controle de ninfas
de Glycaspis brimblecombei em condições de semicampo.
55
Muitos fungos entomopatogênicos entram na hemocele do inseto pela
penetração na cutícula do hospedeiro através da combinação de força mecânica e enzimas
hidrolíticas (GOETTEL et al., 1989; ST. LEGER et al., 1989). No entanto, o tempo letal e a
eficiência são diretamente influenciados pelo número de propágulos infectivos depositados na
cutícula do inseto (NAVON & ASCHER, 2000).
A deposição dos conídios variou amplamente entre as formas de
aplicação pulverizada e polvilhada, sendo muito superior nos tratamentos pulverizados cujas
formulações dos produtos foram em pó (Boveril WP, Metarril WP e Vertirril WP). Entretanto,
estes mesmos produtos obtiveram deposição aproximadamente dez vezes menor quando
aplicados de forma polvilhada.
Apesar da deposição de conídios inferior, os tratamentos B. bassiana e
M. anisopliae (Toyobo) apresentaram eficiência de 72,14% e 68,28% (Figura 15) quando
aplicados na forma polvilhada, sugerindo que mesmo com baixa deposição, o número de
conídios depositados foi suficiente para causar infecção (Figura 16).
Em aplicações pulverizadas do produto BotaniGard 22 WP (B.
bassiana) para controle do tripes Frankliniella occidentalis em folhas de feijão Phaseolus
vulgaris e Impatiens wallerana, Ugine et al. (2007) obteve deposição de conídios que
variaram de 4 a 3184 conídios/mm
2
, utilizando dosagens entre 0,002 a 6,63 mg de pó do
produto comercial/ml. Neste trabalho os autores quantificaram que o número médio de
conídios encontrados por inseto variou de 1 a 82,9 e que a CL
50
(dose de conídios/inseto)
variou de 34,5 para os insetos mantidos em folhas de Phaseolus vulgaris e 26,8 para Impatiens
wallerana.
Pu et al. (2005) aplicaram concentrações de 1,5 x 10
13
e 3 x 10
13
conídios/ha de B. bassiana com três tipos de pulverizadores para controle da cigarrinha
Empoasca vitti em plantas de chá, em duas épocas do ano. A deposição de conídios variou de
594 a 1710 conídios/mm
2
. Já a eficiência não diferiu significativamente entre as doses e
formas de aplicação testadas, nem entre as épocas de aplicação na avaliação de 5 dias. Os
valores de eficiência variaram de 62,9% a 94,4%, sendo que o maior valor foi para a menor
dosagem.
56
Figura 16. Deposição de conídios/mm
2
em função da pulverização e do polvilhamento dos bioinseticidas aplicados em diferentes
dosagens no controle de ninfas de Glycaspis brimblecombei em condições de semicampo.
57
4.3 Desenvolvimento dos fungos entomopatogênicos sobre ninfas de Glycaspis
brimblecombei
A primeira etapa do ciclo infectivo de boa parte dos fungos
entomopatogênicos, neste caso, B. bassiana, M. anisopliae e L. longisporum consiste na
adesão dos esporos ao tegumento do inseto visando à preparação do local para a fase de
penetração (ALVES, 1998).
Os conídios destas espécies de fungo são providos de uma mucilagem
que os envolvem (SAMSONS et al., 1988) e que podem auxiliar no processo de adesão.
Segundo Boucias et al. (1988) o processo de adesão dos fungos pode estar relacionado à
camada de microbastonetes, denominada rodlets, de natureza lipoproteica que envolvem os
conídios. A atuação de forças eletrostáticas também ocorre neste processo, e estas forças
podem variar com a espécie de fungo (ALVES, 1998).
O sitio de adesão na cutícula do inseto também pode influenciar o
processo de penetração pelos propágulos infectivos dos fungos (NAVON & ASCHER, 2000),
como as membranas intersegmentais e as áreas abaixo dos élitros em Coleoptera. As cavidades
bucais e anais também podem ser locais preferenciais para o inicio da doença (WRAIGHT et
al., 1990; BUTT et al., 1995; SCHABEL, 1976).
Boucias et al. (1988) reportaram que os conídios tendem a penetrar
locais da cutícula dos insetos onde existe a predominância de setas do próprio tegumento, que
por ser uma região de maior hidrofobicidade, pode facilitar a adesão dos conídios que também
são hidrofóbicos.
Na análise dos corpos das ninfas de G. brimblecombei em
microscópio óptico, foi possível a observação dos conídios dos três tipos de fungos logo após
a aplicação das suspensões conidiais (Figuras 17, 18, 19 e 20).
58
Figura 17. Aspecto geral da ninfa de Glycaspis brimblecombei (A) e detalhe da perna,
observados em microscópio óptico (100x e 400x, respectivamente).
Figura 18. Conídios de B. bassiana sobre o tegumento da ninfa de Glycaspis brimblecombei (0
hora).
59
Figura 19. Conídios de M. anisopliae sobre o tegumento da ninfa de Glycaspis brimblecombei.
(0 hora).
Figura 20. Conídios de L. longisporum sobre o tegumento da ninfa de Glycaspis
brimblecombei. (0 hora).
60
Alguns trabalhos indicam que a adesão dos esporos é variável em
função da espécie de fungo e hospedeiro. Boucias & Pendland (1991) relataram que esporos
de M. anisopliae, Nomuraea rileyi e B. bassiana ficaram firmemente aderidos á cutícula de
formigas dez minutos após a contaminação pelos fungos. Vey et al. (1982) demonstrou forte
correlação entre falhas na adesão de conídios de M. anisopliae e a baixa mortalidade de
Oryctes rhinoceros (Coleoptera: Scarabaeidae) Altre (1999) observou decréscimo do número
de esporos de P. fumosoroseus/mm
2
de cutícula de Plutella xylostella (Lepidoptera:
Plutellidae), sugerindo que o inseto os retira através do caminhamento.
No exame das ninfas tratadas com as três espécies de fungos
entomopatogênicos foi observada a germinação dos esporos (Figuras 21, 22 e 23). A partir do
processo de adesão e, encontrando condições ambientais favoráveis, os conídios podem iniciar
o processo de germinação. O contato entre o patógeno e a cutícula do inseto pode desencadear
vários processos, como o simples fato de não germinar, produzir tubo germinativo que não
penetra o inseto, produzir conidióforos que produzem conídios secundários ou endurecimento
de suas paredes para formação de estruturas de resistência (ALVES, 1998).
Além das condições ambientais, o processo germinativo e de
crescimento do tubo germinativo é dependente de algumas fontes nutritivas não complexas,
como fontes de carbono e nitrogênio (SMITH & GRULLA, 1981). A germinação sozinha não
é necessariamente responsável pela infecção. Segundo Bidochka et al. (2000), a cutícula do
hospedeiro é a barreira mais complexa a ser superada pelo fungo, e isto só acontece através de
processos químicos e das condições do microambiente da superfície da cutícula, que
geralmente são mais favoráveis onde há a formação de pequenas depressões, que são capazes
de acumular altos níveis de umidade. Os processos químicos da germinação envolvem a
produção de enzimas proteolíticas e quitinolíticas, que auxiliam a transposição do tegumento
do inseto, acelerando o tempo de penetração e infecção pelo fungo (CHARNLEY & ST.
LEGER, 1991).
Os tipos de germinação dos conídios também podem influenciar na
virulência dos fungos. Talaei-Hassanloui et al. (2006) observou correlação positiva entre a
unipolaridade de germinação de conídios de B. bassiana e seu grau de infectividade. Altre
(1999) reportou que a correlação entre a infectividade e a velocidade de germinação e tamanho
dos esporos de P. fumosoroseus foi altamente significativa.
61
Figura 21. Germinação dos conídios de B. bassiana em ninfa de Glycaspis brimblecombei (24
horas após a inoculação).
Figura 22. Germinação dos conídios de M. anisopliae em ninfa de Glycaspis brimblecombei
(24 horas após a inoculação).
62
Figura 22. Germinação dos conídios de L. longisporum em ninfa de Glycaspis brimblecombei
(24 horas após a inoculação).
Figura 23. Penetração de B. bassiana em ninfa de Glycaspis brimblecombei (48 horas após a
inoculação).
63
Figura 24. M. anisopliae ainda em processo de geminação sobre ninfa de Glycaspis
brimblecombei (48 horas após a inoculação).
Figura 25. Penetração e inicio da colonização de L. longisporum em ninfa de Glycaspis
brimblecombei (48 horas após a inoculação).
64
A 3º etapa do processo infectivo, que se caracteriza pela penetração
dos fungos no corpo do inseto, foi observada nos ensaios realizados com as três espécies de
fungos testadas nas ninfas do psilídeo-de-concha (Figura 25). Segundo Alves (1998), o
processo de penetração envolve dois processos, o mecânico, através da pressão exercida pela
hifa terminal no tegumento do inseto, e o químico, resultante da elaboração de enzimas que
auxiliam a penetração mecânica do fungo. As Figuras 23 e 25 apresentam conídios dos fungos
B. bassiana e L. longisporum em fase de germinação e penetração, sendo que L. longisporum
já apresenta a fase de colonização, 48 horas após a inoculação. Molina (2007) analisando o
ciclo infectivo de L. longisporum na cochonilha Orthezia praelonga, também relatou que a
colonização do inseto ocorreu 48 horas após sua contaminação, sendo uma característica deste
fungo a sobreposição de fases.
Padulla (2007) analisando o ciclo infectivo de B. bassiana em ninfas
de Diaphorina citri através de microscopia eletrônica de varredura observou que a penetração
do fungo no tegumento do inseto também ocorreu às 48 horas. No entanto, foram encontrados
conídios em processo de germinação até nas avaliações de 72 horas após a contaminação do
inseto.
No caso do fungo M. anisopliae, todas as ninfas observadas
apresentaram conídios no máximo ainda desenvolvendo ou engrossando o tubo germinativo,
tanto para as imagens feitas às 24 horas, quanto para as feitas 48 horas após a germinação.
Melo et al. (2007), ao estudarem o ciclo de M. anisopliae e B. bassiana na pulga
Ctenocephalides felis felis, através da análise em microscopia eletrônica de varredura, relatou
que não foi possível a observação do apressório e do grampo de penetração do fungo M.
anisopliae, no entanto, o fato do fungo desenvolver-se até a formação da colônia sugere que
todas as etapas tenham sido realizadas. Estes autores também observaram o engrossamento e
as ramificações das hifas de M. anisopliae após 24 horas. Outra hipótese, é que essa atividade
tenha ocorrido sob o conídio (PADULLA, 2007).
Todas as ninfas observadas no intervalo de 0 a 48 horas estavam vivas,
porém as inoculadas pelos fungos B. bassiana e L. longisporum com os movimentos mais
lentos quando tocadas com pincel.
65
Na avaliação de 72 horas os tratamentos B. bassiana e M. anisopliae
apresentaram mortalidade de 100%. Enquanto as ninfas tratadas com L. longisporum
apresentaram mortalidade próxima a 70%.
O fungo B. bassiana apresentou duas fases de desenvolvimento na
avaliação de 72 horas, com extrusão micelial e formação de conidióforos e conídios sobre as
ninfas de G. brimblecombei (Figuras 26 e 27). Padulla et al. (2005) relatou que a
conidiogênese de B. bassiana não ocorre sobre ninfas de D. citri, apenas em insetos adultos.
Subandiyah et al. (2000) observou comportamento semelhante dos fungos Hirsutella
citriformis e P. fumosoroseus em ninfas do mesmo inseto.
Os fungos M. anisopliae e L. longisporum apresentaram apenas a
formação de conidióforos no intervalo de 72 horas (Figuras 28 e 29). Na pulga C. felis felis
Melo et al. (2007) observaram que a conidiogênese dos fungos M. anisopliae e B. bassiana
ocorreu 96 horas após a aplicação dos fungos.
Figura 26. Extrusão do micélio de B. bassiana na região da abertura anal da ninfa de Glycaspis
brimblecombei (72 horas após a inoculação).
66
Figura 27. Formação do conidióforo e conídios de B. bassiana em ninfa de Glycaspis
brimblecombei (72 horas após a inoculação).
Figura 28. Formação de conidióforos de M. anisopliae em ninfa de G. brimblecombei (72
horas após a inoculação).
67
Figura 29. Formação de fiálides de L. longisporum em ninfa de Glycaspis brimblecombei (72
horas após a inoculação).
Por fim, nas avaliações de 144 horas foi possível observar todas as
estruturas reprodutivas das três espécies de fungo, indicando que estes completaram seu ciclo
nas ninfas de G. brimblecombei.
Estes dados são interessantes do ponto de vista da transmissão
horizontal, pois a formação de estruturas reprodutivas como os conídios ou conidióforos
favorecem a dispersão do patógeno e a possibilidade do estabelecimento de epizootias.
Foi observada a conidiogênese de B. bassiana sobre as ninfas de G.
brimblecombei (Figura 30). Para M. anisopliae e L. longisporum foram verificadas a formação
da fiálide e conidiogênese nas ninfas do psilídeo-de-concha (Figuras 31, 32 e 33).
É interessante salientar que, pelo corante utilizado para marcação das
estruturas dos fungos (lacto glicerol), as imagens da avaliação de 144 horas ficaram tomadas
pela cor azul (Figuras 31, 32 e 33), indicando que os corpos das ninfas ficaram tomadas pelas
estruturas dos fungos.
68
Figura 30. Formação do conidióforo e conídios de B. bassiana em ninfa de Glycaspis
brimblecombei (144 horas após a inoculação).
Figura 31. Formação da fiálide de M. anisopliae na antena da ninfa de Glycaspis
brimblecombei (144 horas após a inoculação).
69
Figura 32. Formação de conidióforo e conídios de M. anisopliae em ninfa de Glycaspis
brimblecombei (144 horas após a inoculação).
Figura 33. Formação de conidióforo e conídios de L. longisporum em ninfa de Glycaspis
brimblecombei (144 horas após a inoculação).
70
5 CONSIDERAÇÕES FINAIS
Pelo aumento significativo dos danos causados por Glycaspis
brimblecombei em plantios comerciais de eucalipto, observado desde sua introdução em 2003
até os dias atuais, sugere-se que este inseto ainda possa estar em processo de adaptação às
condições ambientais brasileiras. A principal tática de controle do psilídeo-de-concha é o
controle biológico com o parasitóide exótico Psyllaephagus bliteus (Hymenoptera:
Encyrtidae). O parasitóide tem mantido baixas a população da praga nos estados do Sul e parte
da região sudeste, principalmente em São Paulo e Espírito Santo. Entretanto, nos estados da
região central do Brasil, como Minas Gerais, Mato Grosso do Sul e Mato Grosso, a praga
continua causando danos expressivos, causando mortalidade de 30 a 40 % de árvores em
espécies e clones de eucalipto suscetíveis. Aparentemente, o parasitóide não tem se adaptado
nessa região, principalmente no período mais propício da praga, nos meses mais secos
(WILCKEN, comunicação pessoal).
Paralelamente, nos últimos anos a área plantada com eucalipto no país
tem crescido em proporções significativas, motivado pela demanda mundial de produtos
madereiros, inclusive fontes de energia renovável, culminado na homogeneização destas áreas
e que, como conseqüências, podem acarretar o aparecimento de novas espécies de pragas ou
aumentar consideravelmente as populações dos insetos que já são danosos, porém, em menor
proporção.
71
Contrariamente a este cenário, o apelo de órgãos ambientais nos
últimos anos pelo uso cada vez mais restrito de agroquímicos tem aumentado
consideravelmente, sustentado por um uso mais racional e declinante desses produtos.
Diante deste contexto, medidas de controle que causam pouco ou
nenhum impacto ao meio ambiente ganham cada vez mais destaque e o controle microbiano
vêm despontando, ao longo dos últimos anos, como tática promissora.
Particularmente aos resultados do presente estudo, servem apenas
como alicerce inicial para o balizamento do desenvolvimento de novas pesquisas,
principalmente em condições de campo, pois os plantios de eucalipto, juntamente com o
psilídeo-de-concha, estão presentes em praticamente todos os estados do país, o que demanda
resultados pontuais para cada região.
O trabalho em conjunto com instituições que detenham bancos de
patógenos também pode ser um caminho interessante, pois os produtos estudados nesta
pesquisa representam uma quantia ínfima da grande variedade de isolados e outras tantas
formulações comerciais de fungos entomopatogênicos disponíveis no mercado.
O manejo de pragas com entomopatógenos na área florestal já
vivenciou experiências promissoras no Brasil, com bons resultados obtidos no controle do
gorgulho-do-eucalipto Gonipterus scutellatus (Coleoptera: Curculionidae), que juntamente
com a aplicação polvilhada do fungo Beauveria bassiana e com o parasitóide de ovos
específico desta praga Anaphes nitens (Hymenoptera: Mymaridae), conseguiram reduzir e
manter a população dessa praga a níveis muito baixos.
Analogamente, o controle de G. brimblecombei com entomopatógenos,
associados ao seu parasitóide específico Psyllaephagus bliteus, que é a principal forma de
controle desta praga atualmente, devem ser estudados mais aprofundadamente. Iniciando,
principalmente, com estudos sobre a compatibilidade entre estes dois agentes de controle e
regionais para a seleção dos melhores isolados. A associação de diferentes agentes de controle
é um dos objetivos do manejo integrado de pragas e, provavelmente, será o caminho a ser
trilhado para o sucesso do controle efetivo do psilídeo-de-concha do eucalipto.
72
6 CONCLUSÕES
• Os produtos comerciais dos fungos entomopatogênicos Beauveria bassiana,
Metarhizium anisopliae e Lecanicillium longisporum, nas condições de laboratório,
foram patogênicos às ninfas de Glycaspis brimblecombei (Hemiptera: Psyllidae).
• Nas condições de semicampo, os produtos a base de Beauveria bassiana e
Metarhizium anisopliae da empresa Toyobo aplicados na forma polvilhada e
Metarhizium anisopliae (Metarril WP) aplicado na forma pulverizada foram
considerados eficientes no controle das ninfas de G. brimblecombei.
• Os fungos Beauveria bassiana, Metarhizium anisopliae e Lecanicillium
longisporum foram capazes de completar seu ciclo biológico nas ninfas de G.
brimblecombei nas condições de laboratório.
73
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