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UNIVERSIDADE FEDERAL DE ALFENAS
GUSTAVO DE SOUZA PESSÔA
AVALIAÇÃO DE PROCEDIMENTOS PARA CONTAGEM DE
SACCHAROMYCES CEREVISIAE EM SISTEMAS DE ANÁLISE POR
INJEÇÃO EM FLUXO (FIA)
ALFENAS/MG
2008
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GUSTAVO DE SOUZA PESSÔA
AVALIAÇÃO DE PROCEDIMENTOS PARA CONTAGEM DE SACCHAROMYCES
CEREVISIAE EM SISTEMAS DE ANÁLISE POR INJEÇÃO EM FLUXO (FIA)
ALFENAS/MG
2008
Dissertação apresentada à Universidade
Federal de Alfenas, para obtenção do título
de Mestre em Ciências Farmacêuticas,
Área de Concentração: Desenvolvimento e
avaliação microbiológica e físico-química
de fármacos, toxicantes e medicamentos
Orientador: Pedro Orival Luccas
Co-orientador: Antônio Martins de Siqueira
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4
5
Ao meu pai,
Pelo amor e amizade incondicionais a mim oferecido. Por fazer desta arte de
educar, na qual o senhor é mestre, o alicerce de meu caráter. O senhor sempre será
um exemplo de pai e homem.
À minha mãe,
Por me mostrar o sentido do amor, da dedicação e do altruísmo. Por sempre
me fazer sentir seguro e em paz em meu lar. Ainda, por me proporcionar uma vida
feliz como seu filho.
Às minhas irmãs,
Thamara e Amanda, por sempre me deixarem cuidar um pouquinho de vocês
e por cuidarem muito de mim. Pelo apoio e incentivo em todas as etapas da minha
vida.
À Lívia,
Pelo amor, carinho e dedicação. A companheira mais fiel, tanto nos
momentos felizes quanto nos mais difíceis. Você sempre me passou confiança e me
fez acreditar que tudo ao final podia dar certo. Amo-te muito.
A Deus,
Por esta oportunidade sublime de viver.
DEDICO
6
AGRADECIMENTOS
À Universidade,
A Universidade Federal de Alfenas, por ter cedido espaço para que a
realização do trabalho se tornasse possível.
Aos funcionários, aos docentes que fazem dessa instituição um segundo lar
aos alunos.
Meus sinceros agradecimentos a todos da UNIFAL-MG.
Ao pessoal do laboratório,
Assim como o mar eu descreveria o laboratório. Um dia, sereno e tranqüilo.
No outro, revolto e agitado. Um microcosmo que imita a vida fora dele. Se não há
nada mais belo do que esta oportunidade divina de viver, posso dizer o mesmo a
vocês. Foi maravilhoso conviver todo esse tempo com vocês.
Obrigado por tudo!
Aos professores Tonhão, Lucia e Célio,
Sem a colaboração de vocês, possivelmente a realização deste trabalho seria
inconcebível.
Meus sinceros agradecimentos!
Ao Pedro,
Em mais de quatro anos juntos, cada atitude sua me serviu de exemplo e me
trouxe aprendizado. Certamente levarei comigo um pouco de sua determinação,
disposição e boa vontade.
Desejo-lhe que as melhores coisas te aconteçam.
Obrigado por tudo!
7
“A imaginação é mais importante do que o conhecimento, pois o
conhecimento tem limites, ao passo que a imaginação abraça o
mundo todo.”
Albert Einstein
8
RESUMO
A contagem celular é uma técnica empregada para se monitorar a reprodução de
células em meios de cultivo de interesse em ensaios biológicos. Um sistema de
análise por injeção em fluxo foi desenvolvido para a contagem de células como uma
alternativa ao sistema convencional, câmara de Neubauer. O método é baseado na
proporcionalidade entre o sinal de sulfato de bário e das células. Apesar das
diferenças nas propriedades físicas, foi possível estabelecer uma relação entre os
sistemas de fluxo. No sistema FIA para determinação de sulfato, foi obtida a
seguinte equação para curva analítica: S = 0,0087C
sulfato
+ 0,000458. Para o
Saccharomyces cerevisiae a curva analítica obtida foi S = 4,01 x 10
-11
C
S.cerevisiae
+
0,0018 e a relação entre os sistemas foi C
S.cerevisiae
= 2,17 x 10
8
C
Sulfato
+ 0,002258.
Os limites de detecção e quantificação foram, respectivamente, 2,37 x 10
8
células L
-1
e 7,90 x 10
8
células L
-1
. O método foi comparado com os resultados obtidos na
câmara de Neubauer e não existiram diferenças significativas a um nível de
confiança de 95% (teste-t pareado). A determinação com a câmara de Neubauer
apresentou menor precisão que o sistema FIA. Além disso, o método permite a
monitoração do crescimento microbiano. As principais vantagens do sistema FIA
foram a alta freqüência, a seletividade, exatidão e repetibilidade satisfatórias.
Palavras-chave: Análise por injeção em fluxo. Microorganismos - Contagem.
Turbidimetria.
9
ABSTRACT
Cell count is a procedure that has been used in screening of cell reproduction in
different types of inquiry and science areas. A system of flow injection analysis (FIA)
was developed for cell counting how an alternative to conventional system, the
Neubauer Chamber. The method is based on the proportionality between the barium
sulfate and the cell signals. In spite of differences in the physical properties, it was
possible to establish a relationship among the flow systems. In the sulfate FIA
system, it was obtained the following equation for calibration curve: (S 0.0087C
sulfate
+
0.000458). The Saccharomyces cerevisiae calibration curve obtained was: S = 4,01 x
10
-11
C
S.cerevisiae
+ 0.0018 and the relationship between the systems was: C
S.cerevisiae
=
2,17 x 10
8
C
Sulfate
+ 0.002258. The limits of detection and quantification was
respectively equal to 2.37 x 10
8
cells L
-1
and 7.90 x 10
8
cells L
-1
. The method was
compared with results obtained in the Neubauer chamber and there was no
significant difference at confidence level of 95% (paired t-test). The determination
with classical Neubauer chamber presented lower precision than the FIA system.
Besides this, the method has permitted the screening of microbial proliferation. The
main advantages of FIA system were the high analytical frequency, the selectivity,
accuracy and repeatability satisfactory.
Keywords: Flow injection analysis. Microorganisms - Counting. Turbidimetry.
10
Lista de figuras
Figura 1 -
Preparo das amostras................................................................... 34
Figura 2 - Figura 2 - Desenho esquemático da câmara de Neubauer...........
35
Figura 3 -
Módulo do sistema FIA:
A = amostra; C = fluxo carregador
(solução fisiológica); R1 = 0,3% (m/v) EDTA em 0,07 mol L
-1
NaOH; R2 = 5,0 % (m/v) BaCl2. 2H2O em 0,05% (m/v) álcool
polivinílico (PVA) -
para determinação de sulfato; solução
fisiológica - para determinação da concentração celular; D =
detector (espectrofotômetro, λ = 410 nm); W = descarte; L = al
ça
de amostragem (volume = 502 µL). Os valores entre parênteses
representam as taxas de fluxo empregadas no sistema FIA
(mL/min).........................................................................................
38
Figura 4 - Figura 4 -
Procedimento realizado para o ensaio da curva de
crescimento....................................................................................
42
Figura 5 - Desenho esquemático da câmara de Neubauer mostrando um
resultado da contagem de células de
Saccharomyces
cerevisiae.......................................................................................
43
Figura 6 - Curva analítica e
registros de sinais dos padrões de sulfato (2,5,
5,0, 10,0, 15,0, 20,0 e 25,0 mg L
-1
)................................................
44
Figura 7 - Curva analítica e registros de sinais dos padrões de
Saccharomyces cerevisiae (0,0, 1,47 x 10
9
, 2,93 x 10
9
, 4,41 x
10
9
, 5,87 x 10
9
, 7,34 x 10
9
células L
-1
)..........................................
45
Figura 8 - Curva de crescimento de Saccharomyces cerevisiae...................
52
11
Lista de tabelas
Tabela 1 - Concentrações dos interferentes (g/L).........................................
39
Tabela 2 - Estudo de interferentes................................................................
46
Tabela 3 -
Validação do método com relação à linearidade, ao limite de
detecção e limite de quanti
ficação do método
proposto....................................................................................... 47
Tabela 4 - Precisão do método – Repetibilidade...........................................
48
Tabela 5 - Comparação entre o método
proposto e câmara de Neubauer
em amostras simuladas...............................................................
49
Tabela 6 -
Determinação da concentração celular através da Câmara de
Neubauer e do sistema FIA em amostras de probiótico e
fermentos biológicos.....................................................................
50
12
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO....................................................................................
14
1.1 O MICRORGANISMO.........................................................................
15
1.2 ISOLAMENTO DA CULTURA............................................................ 16
1.3 NUTRIÇÃO MICROBIANA................................................................. 17
1.4 CRESCIMENTO MICROBIANO.........................................................
18
1.4.1 Fases de crescimento.........................................................................
18
1.4.2 Efeito das condições ambientais sobre o crescimento.......................
19
1.5 APLICAÇÕES DA CONTAGEM CELULAR........................................
21
1.5 Alimentos............................................................................................
21
1.5.2 Fármacos............................................................................................
23
1.5.3 Ambiental............................................................................................
23
1.5.4 Análises clínicas................................................................................. 24
1.6 MÉTODOS DE CONTAGEM CELULAR............................................ 25
1.6.1 Método do peso seco..........................................................................
26
1.6.2 Método da membrana filtrante............................................................
26
1.6.3 Método do número mais provável.......................................................
27
1.6.4 Método da contagem em placa...........................................................
27
1.6.5 Método de contagem em câmara de Neubauer.................................
28
1.6.6 Métodos automáticos de análise........................................................
28
1.6.7 Citometria de fluxo..............................................................................
29
1.6.8 Sistemas de análise por injeção em fluxo (FIA) .................................
29
1.6.9 Ensaios colorimétricos........................................................................
30
1.6.10
Turbidimetria.......................................................................................
30
1.7 OBJETIVOS........................................................................................
31
1.8 JUSTIFICATIVA..................................................................................
31
2 MATERIAIS E MÉTODOS..................................................................
32
2.1 EQUIPAMENTOS...............................................................................
32
2.2 REAGENTES......................................................................................
33
2.3 PREPARO DAS CULTURAS..............................................................
34
2.4 CONTAGEM EM CÂMARA DE NEUBAUER..................................... 34
13
2.5
CONTAGEM EM SISTEMAS DE ANÁLISE POR INJEÇÃO EM
FLUXO................................................................................................
35
2.5.1 Curva analítica de sulfato de bário.....................................................
36
2.5.2 Curva analítica de Saccharomyces cerevisiae...................................
37
2.5.3 Sistema da análise por injeção em fluxo............................................
37
2.6 FIGURAS DE MÉRITO.......................................................................
38
2.6.1 Seletividade........................................................................................ 38
2.6.2
Linearidade, limite de detecção (LOD) e limite de quantificação
(LOQ)..................................................................................................
39
2.6.3 Repetibilidade.....................................................................................
40
2.6.4 Reprodutibilidade................................................................................
40
2.6.5 Exatidão..............................................................................................
41
2.7 APLICAÇÃO EM PRODUTOS COMERCIAIS....................................
41
2.8
APLICAÇÃO DO MÉTODO PARA MONITORAR A CURVA DE
CRESCIMENTO.................................................................................
41
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO......................................................... 43
3.1 CONTAGEM EM CÂMARA DE NEUBAUER..................................... 43
3.2 ESTUDO DA CORRELAÇÃO ENTRE OS SINAIS.............................
44
3.3 FIGURAS DE MÉRITO.......................................................................
45
3.3.1 Seletividade........................................................................................ 45
3.3.2
Linearidade, limite de detecção (LOD) e limite de quantificação
(LOQ)..................................................................................................
46
3.3.3 Repetibilidade.....................................................................................
47
3.3.4 Reprodutibilidade................................................................................
48
3.3.5 Exatidão..............................................................................................
48
3.4 APLICAÇÃO EM PRODUTOS COMERCIAIS....................................
50
3.5
APLICAÇÃO DO MÉTODO PARA MONITORAR A CURVA DE
CRESCIMENTO................................................................................. 51
4 CONCLUSÕES...................................................................................
53
REFERÊNCIAS BIBLIOGRÁFICAS ................................................ 54
APÊNDICE A - ARTIGO SUBMETIDO A REVISTA ANALYTICAL
BIOCHEMISTRY.
61
14
1 INTRODUÇÃO
A contagem celular é uma técnica empregada para monitorar a reprodução de
células em meios de cultivo de interesse em ensaios biológicos. Esses ensaios
envolvem a monitoração do crescimento microbiano e a concentração de
componentes do meio, o controle da proliferação de células em tecidos vivos e
estudos de cinética celular (MOUTON; VINKS, 2005; FUSSENEGER; BAILEY, 1998;
ABU-ABSI et al., 2003).
A quantificação celular é feita através de contagem direta das células
presentes em uma solução ou meio de cultura, podendo se diferenciar células
viáveis e não viáveis (PARAMESWARAN; HARGREAVE, 2001). A contagem de
células viáveis é importante principalmente nas áreas de microbiologia, incluindo a
saúde pública, tecnologia de alimentos, biotecnologia e indústria farmacêutica
(JEPRAS et al., 1995).
Além disso, a quantificação pode ser realizada através de contagem indireta,
sendo que a concentração celular, nesse caso, é uma função da variação do
consumo ou produção dos constituintes das vias metabólicas de um microrganismo
(LINDBERG et al., 1994). Existem diversos métodos clássicos e instrumentais
utilizados como referência. Dentre esses métodos, pode ser citada a microscopia,
utilizando câmaras de contagem ou hemocitometros, a colorimetria, a turbidimetria e
a citometria de fluxo (MEUWLY et al., 2006; COLLINS; LYNE; GANGE, 1989;
KULSTAD; KULSTAD; LOVELL, 2004; SKLAR et al., 2002).
Entretanto é necessário salientar que mesmo as técnicas automáticas não
estão livres de erros. Muitos artigos propõem diferentes modelos que estimam o
número total de partículas biológicas em amostras de referência. Essas técnicas
podem estar particularmente susceptíveis à interferência do observador. Podem
existir diferenças consideráveis entre o número de partículas previstas e as
estimadas empiricamente quando modelos matemáticos são aplicados (WEST et al.,
1996; SIMIC et al., 1997).
A resolução deste problema é necessária para se obter maior precisão e
melhor avaliação da validade e confiabilidade de qualquer dado obtido com essas
técnicas. Isto pode ser crucial para maior utilização e aceitação das técnicas de
contagem baseadas em esquemas automáticos (SCHMITZ; KORR; HEINSEN,
15
1999).
Com tantas possibilidades, cabe aos laboratórios, de pesquisa e análises
clínicas, utilizar o método que lhes ofereçam mais vantagens, levando em
consideração a relação entre custo, benefícios e a freqüência analítica. É para
atender a essas necessidades que diversos métodos são propostos, ou seja,
diminuir os erros aleatórios ou sistemáticos em atividades experimentais, o tempo de
análise e, consequentemente, o capital investido.
1.1 O MICRORGANISMO
A levedura Saccharomyces cerevisiae é utilizada pelos seres humanos por
milhares de anos. Desde 8.000 anos atrás, o fungo tem sido empregado na
fabricação do vinho, pão, cerveja, dentre outros produtos. Atualmente, é um
importante modelo para diversas áreas da ciência como a bioquímica, a genética e a
biologia molecular (AKADA, 2002).
A transformação genética do fungo foi estabelecida em 1978 (HINNEN;
HICKS; FINK, 1978). Desde então, o fungo é usado como principal microrganismo
eucariótico para análise biológica, assim como para produção de proteína
heteróloga. Um bom exemplo é dado por Juozapaitis e colaboradores (2008). Em
seu trabalho, os autores descrevem a clonagem de genes do vírus da parainfluenza
humana, produção e caracterização de partículas tipo-nucleocapisídeo
recombinantes expressas pelo fungo Saccharomyces cerevisiae. Os dados
apresentados pelos autores foram usados na detecção da imunoglobulina G
específica para HPIV em amostras de soro humano.
O fungo tem sido empregado por muitos anos como um agente bioterapêutico
para tratamento de desordens entéricas, como diarréias. O fungo coloniza o trato
intestinal, onde, com uma função probiótica, combate a bactéria causadora da
diarréia. Além disso, subprodutos do fungo, incluindo enzimas, antioxidantes,
vitaminas e polissacarídeos são de grande interesse para a saúde humana. É
reconhecido que os polissacarídeos da parede celular do fungo podem estimular o
sistema imune, diminuir o colesterol sérico, exibir atividade antitumoral e adsorver
substâncias como micotoxinas (FLEET; BALIA, 2006; DAWSON, 2002).
16
O maior interesse no fungo Saccharomyces cerevisiae é sobre o seu
processo metabólico. Além dos produtos alimentícios obtidos pela fermentação, há
grande entusiasmo na comunidade científica pela pesquisa de fontes alternativas de
energia, incluindo então, os biocombustíveis, no caso o etanol. Comparando este
combustível ao petróleo, podem-se apresentar como principais vantagens a menor
quantidade de produtos gerados no ambiente e por ser um recurso renovável.
Tendo-se em vista a importância do produto, qualquer melhoria na tecnologia da
fermentação, será economicamente atraente, justificando investimentos de pesquisa
e desenvolvimento nas pesquisas sobre fermentação etanólica (BAI; ANDERSON;
YOUNG, 2008).
Sob o ponto de vista bioquímico, a principal via envolvida na fermentação
etanólica é a glicólise, através da qual uma molécula de glicose é metabolizada e
duas moléculas de piruvato são produzidas. Sob condições anaeróbias, o piruvato é
reduzido a etanol com liberação de gás carbônico. Dois ATPs produzidos na
glicólise são usados na biossíntese do fungo. Logo, a produção de etanol é
estritamente ligada com o crescimento celular do fungo (BAI; ANDERSON; YOUNG,
2008).
1.2 ISOLAMENTO DA CULTURA
O isolamento de uma cultura pura de um microrganismo é essencial para
estudar as propriedades de crescimento. Culturas puras são comumente isoladas
pelo espalhamento de células de uma amostra, em um meio apropriado. Uma
colônia isolada pode fornecer uma cultura pura para estudos subseqüentes de
crescimento e propriedades de resistência a drogas. É uma prática adequada inserir
cada colônia em um meio similar para assegurar a ausência de qualquer bactéria
contaminante (PELCZAR JR.; CHAN; KRIEG, 1996a). Há meios que favorecem o
crescimento de determinadas espécies, inibindo o crescimento de outras, ou seja,
meios seletivos. A seletividade pode ser obtida pela adição de antibióticos, por
exemplo, cloranfenicol, ao meio de cultivo, agar extrato de levedura glicosado
(YGC), suprimindo a flora bacteriana. Também existem meios que permitem a
diferenciação de microrganismos, baseados em suas propriedades bioquímicas, ou
17
seja, meios diferenciais. Por exemplo, o meio usado para a distinção entre
Zygosaccharomyces bailii e Saccharomyces cerevisiae. Enquanto o
Zygosaccharomyces bailii apresenta colônias de cor azul, as colônias formadas por
Saccharomyces cerevisiae são predominantemente brancas (SCHÜLLER, 1998).
1.3 NUTRIÇÃO MICROBIANA
Os microrganismos podem ser estudados em seu hábitat natural ou em meios
de cultura apropriados. Quando os microrganismos são removidos do seu meio e
cultivados em laboratório, busca-se simular ou até mesmo melhorar as condições
naturais. Assim sendo, o desenvolvimento do microrganismo dependente do
fornecimento de elementos químicos essenciais. Estes elementos são necessários
tanto para a síntese, como para desempenho das funções normais dos
componentes celulares (PELCZAR JR.; CHAN; KRIEG, 1996a).
Dentre os nutrientes essenciais para o crescimento microbiano, o carbono é
requerido por todos os microrganismos. Uma fonte de carbono é importante para a
maioria dos processos metabólicos, pois é o material sobre o qual se obtém a
energia requerida para o crescimento. Outro elemento de importância substancial é
o nitrogênio, já que é constituinte de proteínas e ácidos nucléicos e muitos outros
constituintes celulares. Poucos organismos têm a capacidades de converter o
nitrogênio atmosférico em amônia e incorporá-lo em seus constituintes celulares. A
maioria das bactérias pode usar fontes inorgânicas de nitrogênio, tais como íons
amônio ou nitrato. Outras bactérias, menos versáteis, requerem o nitrogênio sob
forma de algum aminoácido, como por exemplo, glutamina, glutamato, asparagina,
arginina ou extratos de peptídeos (TORTORA; FUNKE; CASE, 2005).
Além desses elementos, hidrogênio, oxigênio, enxofre, fósforo e ferro são
necessários ao crescimento microbiano. O hidrogênio tem seu suprimento
relacionado à água presente no meio. O oxigênio pode ser encontrado na atmosfera
gasosa do meio. O enxofre é necessário para a síntese de cisteína e metionina. Sob
a forma de sulfeto, o enxofre pode ser importante fonte de processos enzimáticos
microbianos. O fósforo é utilizado na síntese de ácidos nucléicos, lipídios e de
adenosina trifosfato (ATP). O ferro é um constituinte da catalase e citocromo. Alguns
18
compostos inorgânicos podem ser adicionados por serem co-fatores de várias
enzimas, como Mg
+2
, K
+
, Na
+
e Ca
+2
(TRABULSI et al., 2005).
1.4 CRESCIMENTO MICROBIANO
O crescimento microbiano é definido pela capacidade destes formarem
colônias ou de proliferarem em meios de cultura. Estes ensaios são morosos,
principalmente se o microrganismo em estudo apresenta uma baixa taxa de
crescimento, refletindo-se em longos tempos de incubação (horas ou dias). Por outro
lado, os sistemas de detecção do crescimento são dependentes do crescimento dos
microrganismos em ambientes artificiais. Este fato limita a interpretação dos
resultados obtidos por estes métodos, uma vez que a escolha de um meio de cultura
inadequado pode resultar numa contagem imprecisa. Além disso, algumas células
crescem apenas em condições anaeróbias, outras em condições aeróbias e, outras
em ambas as condições. Portanto, a contagem realmente representativa de todos os
microrganismos de uma determinada população apenas poderá ser feita através de
métodos ópticos (COLLINS; LYNE; GANGE, 1989).
1.4.1 Fases de crescimento
O aumento da população como um todo é relacionado à multiplicação de
qualquer célula nesta população. Para a maioria dos microrganismos inseridos em
meio de cultura adequado, cada célula cresce com um aumento balanceado de seus
constituintes. No caso do Saccharomyces cerevisiae, há reprodução por divisão
binária. Assim, após um determinado período em seu ciclo celular, cada
microrganismo que reproduz por divisão binária se divide em duas células idênticas.
Cada uma delas tem a mesma capacidade de crescimento e divisão a uma mesma
taxa, como a célula-mãe. Isto significa dizer que o número de células na população
cresce em relação exponencial ou logarítmica, já que a população dobra no mesmo
intervalo de tempo, ou seja, tempo de geração. Entretanto, o número de células que
19
participam em cada divisão dobra com cada nova geração (TRABULSI et al., 2005).
Quando o microrganismo é inoculado no meio, o crescimento não ocorre
rapidamente. A fase lag é conhecida como a fase em que o microrganismo cultivado
se adapta ao meio. A duração desta fase depende do tipo de microrganismo, da
idade e tamanho do inóculo, da natureza do meio de origem do inóculo e dos
nutrientes presentes no novo meio de cultura. Durante a fase lag, a massa e o
tamanho celular começam a aumentar antes do aumento do número de células. A
síntese de enzimas e de outras macromoléculas necessárias para a divisão celular
ocorre nesta fase (BROOKS; BUTEL; MORSE, 2000).
Durante a fase exponencial de crescimento (fase log), número e massa
celular aumentam em escala logarítmica, com um tempo de geração constante. Este
é o período de crescimento equilibrado, durante o qual todos os constituintes
celulares são produzidos em proporção constante. A taxa de divisão celular é
dependente do tipo de microrganismo, da natureza do meio, da temperatura e, para
os organismos aeróbicos, a taxa de aeração (PELCZAR JR.; CHAN; KRIEG, 1996a).
Eventualmente, o crescimento logarítmico desacelera por causa do acúmulo
da produção de resíduos, escassez de nutrientes, mudanças no pH, ou diminuição
de oxigênio. A população entra na fase estacionária, na qual o número de células
viáveis se mantém constante. Freqüentemente, existe o estado estacionário,
marcado por ser um estado de equilíbrio entre as taxas de reprodução e a de
mortalidade, no qual algumas células morrem e outras continuam se dividindo
(BURTON; ENGELKIRK, 1998).
Finalmente, quando a taxa de mortalidade excede a taxa de reprodução, o
número de células viáveis declina. O tempo para que todas as células morram difere
para cada microrganismo. Durante esta fase, células assumem formas não normal,
de tal maneira que se torna difícil o reconhecimento do microrganismo em cultivos
antigos (TRABULSI et al., 2005).
1.4.2 Efeito das condições ambientais sobre o crescimento
Além de uma combinação de nutrientes apropriados, o cultivo bem sucedido
dos vários tipos de microrganismos depende também de uma condição física
20
apropriada. Desta maneira, é importante determinar os parâmetros que influenciam
o meio físico de um microrganismo como temperatura, pH, atmosfera gasosa e
pressão osmótica.
A temperatura é específica para cada espécie microbiana, de tal maneira que
ela pode bloquear ou acelerar o crescimento. Sabe-se que todas as reações
metabólicas ocorrem mais rapidamente com aumentos da temperatura até o ponto
no qual as enzimas são desnaturadas. Entretanto, proteínas tornam-se limitantes a
baixas temperaturas, no que diz respeito ao desempenho de suas funções
biológicas. Assim sendo, a estabilidade da proteína é o principal fator que determina
o ajuste de máxima temperatura no crescimento (FORSYTHE, 2002).
A taxa de crescimento também pode ser afetada pelo pH da cultura. Existe
um valor ótimo e uma faixa sobre a qual ocorre o crescimento. Organismos que
fermentam açúcar para produzirem ácidos podem diminuir o pH do meio até o ponto
em que o crescimento é impedido. A maioria das bactérias mantém um pH interno
constante de 7,4. Este pH interno se torna difícil de manter quando o gradiente de
pH supera duas ou três unidades. Além disso, ácidos orgânicos produzidos pela
fermentação são acumulados no interior da célula e inibem reações metabólicas
(FRANCO; LANDGRAF, 2004).
A pressão osmótica do meio influencia a taxa de crescimento, de tal maneira
que as bactérias devem se adaptar a mudanças nesse parâmetro. Sabe-se que a
transferência para meios de pressão osmótica elevada é seguida pelo aumento no
acúmulo de íons. Em conseqüência, ocorre o aumento da pressão osmótica interna
como uma medida de adaptação do microrganismo. Crescimento em meios com
pressão osmótica elevada (maior que 0,5 mol L
-1
de cloreto de sódio) requer a
produção de substâncias as quais estabilizam proteínas em concentrações salinas
adequadas, tais como prolina e glicina-betaína (BROOKS; BUTEL; MORSE, 2000).
Uma das principais chaves de classificação para microrganismos é sua
resposta à presença de oxigênio. O oxigênio pode ser letal para microrganismo que
são incapazes de destruir os produtos tóxicos formados no metabolismo aeróbio.
Além disso, o oxigênio é suficientemente reativo para adquirir elétrons de outras
substâncias químicas, especialmente as flavoproteínas e quinonas do sistema de
transporte de elétrons. A transferência de dois elétrons para o oxigênio pode resultar
na formação de radicais livres, agentes tóxicos para células através de suas reações
com lipídios, ácidos nucléicos e proteínas (ADAMS; MOSS, 1995).
21
1.5 APLICAÇÕES DA CONTAGEM CELULAR
Um estudo sobre contagem celular demonstra como tal técnica é presente e
essencial para diversos ramos da ciência, seja pela formação de subprodutos
oriundos do crescimento microbiano ou para realização de diagnósticos, para fazer
inferências sobre a saúde humana. Além dos benefícios diretos, a quantificação
celular também tem sua relevância nas questões relacionadas aos processos de
controle de qualidade. Dessa maneira, tornam-se nítidos os fundamentos para
justificar o desenvolvimento de pesquisas sobre os sistemas de contagem celular.
1.5.1 Alimentos
O número de microrganismos em alimentos é um importante índice de higiene
de produtos alimentícios industriais, produzidos em larga escala. Dessa maneira,
são facilmente contaminados por uma grande variedade de espécies
microbiológicas. Os danos causados vão desde a deterioração do alimento até o
desenvolvimento de intoxicações alimentares ou infecções transmitidas por
alimentos (PELCZAR JR.; CHAN; KRIEG, 1996b). Sabe-se que o Clostridium
botulinum é um importante patógeno alimentício. Aproximadamente 450 casos de
botulismo são registrados anualmente (Hatheway, 2005). A maioria dos casos é
causada pela má preservação dos alimentos nos domicílios. Entretanto, casos de
botulismo associados aos produtos comerciais embalados a vácuo também são
verificados (KORKEALA et al., 1998).
Fica evidente então que a análise microbiológica de alimentos é questão de
saúde pública. Assim sendo, são necessários padrões e regulamentos para
assegurar que o alimento recebido pelo consumidor seja saudável, seguro e
apresente a qualidade especificada na embalagem do produto. Diversas agências
internacionais têm cooperado para definir estes padrões e regulamentações, por
exemplo, a Agência Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA), “Food Agriculture
Organization (FAO)”, a Organização Mundial da Saúde (OMS) e o “Food and Drug
Administration (FDA)”. Este último tem desenvolvido critérios específicos para os
22
alimentos (PELCZAR JR.; CHAN; KRIEG, 1996b). A aceitação microbiológica do
produto leva em consideração questões como a garantia de qualidade, ou seja,
procedimentos que assegurem a adequação do produto aos padrões exigidos. Além
disso, estimam-se também as boas práticas de fabricação, o controle de qualidade,
um alto nível de sanitização e higiene e a validação dos procedimentos. Essas
práticas são executadas por indústrias que zelam pela saúde e opinião pública.
Práticas mais simples também asseguram a validade dos produtos alimentícios, tais
como a manutenção de condições próprias durante o processo de distribuição, de
estocagem e refrigeração (KUDA; SHIMIZU; YANO, 2004).
Um dos exames laboratoriais típicos para se verificar o risco de crescimento
de microrganismos patogênicos e produção de toxinas em alimentos são os ensaios
de alimentos inoculados (RIBEIRO et al., 2003). Nesses ensaios, uma quantidade
conhecida do microrganismo é inoculada do produto, verificando-se somente após o
crescimento microbiano o número e tipos de microrganismos e os produtos do seu
metabolismo. Outros exames são baseados na monitoração de populações
microbianas, modelos que descrevem a mudança do número de microrganismos de
acordo com o tempo, as mudanças das condições ambientais do inoculo, tais como
pH, temperatura, atmosfera gasosa e pressão osmótica (HYYTIÄ et al., 1999).
Além dos aspectos referentes ao controle de qualidade, existem alimentos
que são obtidos pelo crescimento microbiano, tendo a fermentação como principal
atividade metabólica. Nesse caso, o crescimento pode conferir a preservação e
fornecer características desejáveis ao produto. Um exemplo desse último caso é
verificado na produção de vinhos. Para produção de vinhos tintos, são necessários
baixos teores de ácido málico como pré-requisito para sua comercialização o que
confere a diminuição da acidez que suaviza o paladar, quesito indispensável para os
vinhos tintos. Esti e colaboradores (2004) desenvolveram dois biossensores para
monitorar a fermentação malolática, avaliando aspetos como a concentração celular
e os teores de ácido málico e lático.
1.5.2 Fármacos
Um dos aspectos básicos do controle de qualidade de fármacos e
23
medicamentos é garantir que tais produtos não sejam veículos de transmissão de
doenças. A principal ferramenta de monitoração da presença de microrganismos
contaminantes em medicamentos é a contagem celular. A Farmacopéia brasileira
indica a contagem microbiana como parâmetro para utilização da água como
matéria-prima na produção de medicamentos. Segundo essa farmacopéia, a água
pode ser utilizada desde que a contagem não exceda 100 unidades formadoras de
colônia por mililitro.
Dois casos de acidentes veiculados à administração de medicamentos
contaminados foram verificados na China. No primeiro caso, pacientes foram
contagiados com hepatite C, devido à utilização de imunoglobulina, na província de
Guangdong. No segundo caso, seis pessoas morreram após receberem injeções de
imunoglobulina contaminada na cidade de Nanchang, capital da província de
Jiangxin. Esses exemplos demonstram a falta de garantias na segurança, na
produção e venda de medicamentos (VACINA, 2008).
A produção de drogas terapêuticas para o tratamento de doenças é uma das
aplicações emergentes da indústria farmacêutica. Através da manipulação do
material genético, um microrganismo pode adquirir novas habilidades bioquímicas,
incluindo a produção de novas substâncias. Dentre essas novas habilidades, podem
ser citadas a produção de insulina, de hormônio do crescimento humano, interferons
e interleucina-2 (PELCZAR JR.; CHAN; KRIEG, 1996b). Uma das maneiras de se
monitorar microrganismos recombinantes, como por exemplo, a Escherichia coli, é
através da contagem de células totais, da concentração de células viáveis e do
número de número de unidades formadoras de colônia (SCHÜGERL et al., 1993).
1.5.3 Ambiental
Dentre os microrganismos de interesse ambiental mais freqüentemente
encontrados, podem ser citados os rotíferos, o fitoplâncton, zooplâncton, cladóceros,
copépodos e larvas de dípteros. Esses organismos têm sua importância porque sua
presença no ambiente é compreendida como resposta de um sistema biológico a um
agente estressor, como forma de se analisar sua ação e planejar formas de controle
e monitoramento da recuperação da normalidade. São assim conhecidos como
24
indicadores biológicos ou bioindicadores. A presença e o número dos bioindicadores
podem sugerir o grau de poluição ou de degradação de um ambiente (ODUM, 1983).
A Escherichia coli é um bioindicador importante, no que diz respeito à qualidade da
água. Segundo a portaria n. º 518 do Ministério da Saúde, a água para consumo
humano deve estar ausente do bacilo, bem como de coliformes termotolerantes para
cada 100 mililitros de água.
Na Limnologia, o número de indivíduos pode expressar a biomassa, ou seja,
o peso total dos indivíduos de uma população ou comunidade por unidade de área
ou de volume num determinado tempo. O aumento da biomassa corresponde à
produção primária no ambiente aquático. Contribuem para tal aumento a quantidade
de matéria orgânica acrescida pela fotossíntese ou quimiossíntese, e as perdas com
demais processos (respiração, excreção, secreção, morte, herbivorismo)
(REYNOLDS; TUNDISI; JINO, 1983).
A contagem celular pode ser utilizada para demonstrar as relações favoráveis
ou desfavoráveis entre microrganismos. Sabe-se que certas diatomáceas podem
causar insucesso reprodutivo em espécies de copépodos. Segundo Leising (2005), é
necessário quantificar com precisão a contribuição de diferentes espécies de
diatomáceas utilizadas na alimentação dos copépodos. Tais algas contêm uma
classe de aldeídos que estão associadas à redução da produção de ovos, redução
da viabilidade dos ovos e redução da população na fase larval (naupliar)
sobrevivente.
1.5.4 Análises clínicas
A contagem celular tem no campo das análises clínicas a sua aplicação mais
evidenciada. Diversas patologias têm sido associadas à concentração de tipos
celulares específicos. Sabe-se que a contagem de células brancas do sangue pode
evidenciar a arteriosclerose na carótida e no arco aórtico (ELKIND et al., 2001). Um
outro estudo demonstrou relações significantes entre o número elevado de
leucócitos e a apoplexia, durante ou após cirurgias cardíacas (ALBERT et al., 2003).
Além disso, preconiza-se que o tratamento da asma com drogas
antiinflamatórias seja realizado após contagens reprodutíveis das células
25
inflamatórias das vias aéreas. As contagens celulares diferenciais e totais ajudam a
compreender a cinética das mudanças das células inflamatórias na asma após a
redução de corticosteróides e subseqüente re-introdução do tratamento. A contagem
celular também é utilizada para estudar os potenciais efeitos antiinflamatórios de
drogas como teofilina, agonistas de longo espectro de ação dos receptores da
adrenalina, antagonistas do leucotrieno e novas drogas em desenvolvimento
(PARAMESWARAN; HARGREAVE, 2001).
A contagem celular pode caracterizar através da perda de linfócitos T CD4+ a
infecção pelo vírus HIV-1, particularizada pela imunodefiência, doenças
oportunísticas e morte (HAMMER, 1997). Uma relação inversa existe entre o número
linfócitos CD4+ no sangue periférico e o risco de doenças associadas à HIV-1
(BATTEGAY et al., 2006). Essa relação possibilita descrever a contagem celular
como uma ferramenta para monitorar a progressão do HIV e a terapia anti-retroviral
(HAMMER et al., 1997; PATTANAPANYASAT; THAKAR, 2005; BATTEGAY et al.,
2006).
1.6 MÉTODOS DE CONTAGEM CELULAR
Nos métodos de contagem, reconhece-se que erros são inevitáveis. Alguns
erros são inerentes ao material, outros à técnica. Erros de ± 90% na contagem da
ordem de 10000 a 100000/mL podem ocorrer mesmo com as melhores técnicas
disponíveis. Por isso, é necessário combinar o máximo de cuidado na técnica com
uma interpretação imparcial dos resultados (COLLINS; LYNE; GANGE, 1989). A
escolha de um método adequado torna-se fundamental para a confiabilidade dos
resultados, como pode demonstrar o trabalho de Nunes da Silva e colaboradores
(2007). Nesse trabalho, são comparados os seguintes métodos de contagem de
plaquetas: câmara de Neubauer, considerada o método oficial e o método
automático eletrônico, onde ocorre a detecção das células através da impedância.
Foi verificada uma tendência dos analisadores automáticos em subestimar a
contagem de plaquetas, por não diferenciarem corretamente eritrócitos de plaquetas,
resultando em uma contagem inexata de plaquetas. Esse é um erro grave, pois pode
levar a um diagnóstico impreciso de trombocitopenia.
26
1.6.1 Método do peso seco
A determinação da massa e do número de células viáveis na amostra é
necessária em medições dos parâmetros de crescimento e dos efeitos de
antibióticos. Alguns antibióticos causam queda da viabilidade celular, mas não muda
a massa celular. Outros inibem somente o crescimento, enquanto que alguns
causam a lise celular. A massa celular pode ser determinada através do peso seco,
embora esta técnica requeira grande quantidade de amostra e um longo tempo.
Esse método é satisfatório para quantificar o aumento de massa de fungos
filamentosos. Nesse procedimento, o fungo é removido do meio de cultura por
filtração, para eliminar outros materiais, seco em dessecador para posterior
pesagem (OLSSON; NIELSEN, 1997).
1.6.2 Método da membrana filtrante
A aplicação deste método permite que o microrganismo seja encontrado
sobre a superfície de uma membrana de filtro de poros muito pequenos, após a
passagem de um determinado volume. Esse filtro é transferido para uma placa de
Petri contendo um suporte embebido em nutriente líquido, que permite que as
colônias se desenvolvam sobre a membrana do filtro. Esse método é usado
rotineiramente na detecção e registro de coliformes, considerados indicadores de
poluição fecal, em amostras de alimentos e água (TORTORA; FUNKE e CASE,
2005).
1.6.3 Método do número mais provável (NMP)
Essa é uma técnica estatística com base no seguinte princípio: quanto maior
o número de bactérias em uma amostra, maior será o número de diluições
necessárias para eliminar totalmente o crescimento em tubos contendo meio de
27
cultura. Esse método é mais utilizado quando as bactérias a serem contadas não
cresceriam em meio sólido. O método também é usado quando o crescimento de
bactérias em um meio líquido diferencial é usado para identificar os microrganismos.
É preciso salientar que o método fornece somente uma estimativa de 95% de
probabilidade de a população bacteriana conter um número de bactérias
(TORTORA; FUNKE; CASE, 2005).
1.6.4 Método da contagem em placa
O método de contagem em placa considera que cada colônia é originada do
crescimento e da multiplicação de um microrganismo. Isso nem sempre é verdade,
uma vez que esses freqüentemente crescem em cadeias ou como grumos. Para
refletir essa realidade, as contagens em placa são representadas como unidades
formadoras de colônia.
No procedimento deste método, placas de Petri são sistematicamente
organizadas e o inóculo é diluído em uma série de tubos de diluição. Cada tubo de
diluição subseqüente conterá um décimo do número de bactérias presentes na
anterior. Posteriormente, as amostras destes tubos são transferidas para placas de
Petri contendo meio de cultura onde ocorrerá o crescimento das colônias e a
contagem. O número de colônias é utilizado na determinação da quantidade de
bactérias presentes na amostra original (TORTORA; FUNKE; CASE, 2003).
Cabe mencionar que as principais vantagens da contagem em placa são a
contagem somente das células viáveis, a possibilidade do isolamento das colônias,
que podem ser sub-cultivadas em culturas puras, as quais podem ser facilmente
estudadas e identificadas. Além disso, há maior chance de crescimento de
microrganismos menos resistentes à presença de oxigênio.
No entanto, algumas desvantagens são apresentadas, dentre elas, a
ausência de um meio que permita o crescimento de todos os microrganismos, a
necessidade da incubação apropriada para permitir o desenvolvimento das colônias
e ser um método trabalhoso. Além disso, a necessidade de manipulação pode
originar erros nas contagens devido a erros de diluição e/ou plaqueamento (BARON;
PETERSON; FINEGOLD, 1994).
28
1.6.5 Método de contagem em câmara de Neubauer
A contagem direta é realizada em uma câmara de contagem celular, por
exemplo, a Câmara de Neubauer. Esta câmara consiste em uma lâmina dupla
adaptada à leitura em microscópio de campo claro ou ao de contraste de fase. É
considerado um método sensível para determinar densidade celular (WIGG et al.,
2003).
A câmara de Neubauer é amplamente utilizada para contagem de células
sangüíneas, na identificação da atividade imunotóxica de pesticidas e avaliação da
viabilidade celular em culturas cujo consumo de glicose é monitorado (VOHR;
RÜHL-FEHLERT, 2001; MEUWLY et al., 2006).
1.6.6 Métodos automáticos de contagem
A contagem de células é trabalhosa e demanda muito tempo. Métodos
rápidos são desejados, mas devem ser confiáveis, sensíveis e específicos. Esses
métodos têm sido usados para contagem eletrônica de partículas, medições da
produção de ATP por bactérias através da biolumenescência, mudança nas
propriedades ópticas, microcalorimetria e mudanças de pH, potencial redox,
impedância ou condutividade pelo crescimento microbiano (COLLINS; LYNE;
GANGE, 1989).
1.6.7 Citometria de fluxo
A Citometria de fluxo é uma técnica utilizada para contar, examinar e
classificar partículas microscópicas suspensas em meio líquido em fluxo. Um feixe
de luz (normalmente laser) de um único comprimento de onda é direccionado a um
meio líquido em fluxo. Dectores são apontados ao local onde o fluxo passa através
do feixe de luz; um na linha do feixe de luz e vários perpendiculares a este. Cada
29
partícula suspensa passando através do feixe dispersa a luz de uma forma, emitindo
luz de menor frequência do que o da fonte de luz (Bacal; Faulhaber, 2003).
Os principais componentes de um citômetro de fluxo são: uma célula de fluxo,
uma fonte de luz, um detector e conversor sistema análogico para digital (ADC), um
sistema de amplificação e um computador para análise de sinais.
Os parâmetros possíveis de medir são: volume e complexidade morfológica
das células, pigmentos celulares, análise de tipo de células, cinética celular, análise
e classificação de cromossomos, proteínas, antígenos, atividade enzimática, pH,
cálcio ionizado intracelular, magnésio, potencial de membrana, apoptose, viabilidade
celular, caracterização da multi resistência a fármacos em células tumorais,
glutationa (Bacal; Faulhaber, 2003).
1.6.8 Sistemas de análise por injeção em fluxo (FIA)
Uma das alternativas que atualmente se apresentam como eficientes são os
sistemas de análise por injeção em fluxo. Nesses sistemas, amostras e reagentes
são inseridos em um fluxo carregador, impulsionados através de uma bomba
peristáltica numa vazão previamente estudada. Um gradiente de concentração é
gerado em conseqüência de um processo de dispersão devido à interpenetração na
parte frontal da amostra e no espaço ocupado pela mesma a cada instante até o
detector. As principais vantagens são: baixo consumo de reagentes e amostra, alta
freqüência de amostragem, são úteis em processos de automatização de
instrumentos de análise e evita a precipitação de células na cela de fluxo por ser um
sistema dinâmico (SKOOG; WEST; HOLLER, 1996).
O sistema FIA foi descrito para contagem celular com detectores
eletroquímicos, como biossensores, monitorando o crescimento de bacteriano
durante da fermentação malolática (ESTI et al., 2004). Além disso, também foram
utilizados citômetros de fluxo, cuja detecção é baseada na radiação laser para
descrever mudanças da distribuição da população como função do tempo
(LINDBERG et al., 1994; ABU-ABSI et al., 2003).
30
1.6.9 Ensaios colorimétricos
Vários sistemas usam a modificação de testes bioquímicos convencionais,
baseados na mudança de cor de indicadores de pH no meio para indicar a presença
de metabólitos ou produtos finais (COLLINS; LYNE; GANGE, 1989).
Sabe-se que sais de tetrazólio são usados como indicadores do número de
bactérias aeróbias. Esses sais são solúveis em água, intensamente corados e
formam cristais quando são reduzidos. Além disso, podem ser extraídos com
solventes orgânicos para quantificação espectrofotométrica (STOWE et al., 1995;
KUDA; SHIMIZU; YANO, 2004). Um corante que também pode ser usado para
avaliar a viabilidade celular é o azul de tripan (VOHR; RÜHL-FEHLERT, 2001). Este
corante penetra por rupturas da membrana celular, corando somente as células não
viáveis. Dessa maneira, permite uma contagem diferencial.
1.6.10 Turbidimetria
A técnica mais simples e freqüentemente empregada é a medição da turbidez
de uma cultura líquida (KULSTAD; KULSTAD; LOVELL, 2004). Estes ensaios são
baseados no desvio de radiação por partículas, tais como células, que são
relacionadas aos seus números, tamanhos e massa.
Turbidez é a habilidade das partículas em suspensão para desviar radiação
eletromagnética. A medição da turbidez pode ser efetuada em um
espectrofotômetro. O sensor fotoelétrico converte a radiação luminosa que emerge
na superfície de uma cubeta ou cela de fluxo a um impulso elétrico, que pode ser
quantificado. Além disso, a medição da turbidez pode ser obtida por um nefelômetro.
Neste caso, os detectores são colocados em diferentes ângulos, medindo a radiação
que é de fato desviada. A quantidade de radiação desviada é dependente do
número e tamanho das partículas em suspensão. Medições da turbidez podem
detectar a presença de um organismo em uma amostra clínica ou determinar o
crescimento de uma bactéria ou fungo na presença de inibidores específicos
(BARON; PETERSON; FINEGOLD, 1994).
31
1.7 OBJETIVOS
O presente trabalho teve como objetivo propor um sistema de análise por
injeção em fluxo para a contagem de células como uma alternativa ao sistema
convencional, câmara de Neubauer. Visando a esse objetivo, as culturas de
Saccharomyces cerevisiae foram submetidas a um fármaco de ação anti-microbiana
conhecida, para contagem em câmara de Neubauer. Foram avaliadas
características analíticas em termos de seletividade, sensibilidade e exatidão.
Após a comparação das técnicas supracitadas de contagem, o sistema
proposto foi avaliado para medições em amostras de fermento biológico e probiótico,
bem como acompanhamento de proliferação celular.
1.8 JUSTIFICATIVA
Os diversos métodos tradicionais utilizados para contagem de
microrganismos são laboriosos e dependem do adequado treinamento de técnicos
por vários meses, visando a resultados precisos e confiáveis. Assim sendo,
almejam-se métodos rápidos e que dependam menos de um longo período de
adaptação a sua prática adequada. Nesse contexto, é plausível a aplicação,
alternativa, de sistemas automáticos, em especial os sistemas de análise por injeção
em fluxo (FIA). A alta freqüência analítica e a facilidade de se utilizar sistemas FIA
unidas ao baixo custo de construção e implantação justificam a pesquisa proposta.
32
2 MATERIAIS E MÉTODOS
Abaixo seguem equipamentos, reagentes e metodologias utilizadas no
presente trabalho.
2.1 EQUIPAMENTOS
Os equipamentos utilizados no presente trabalho encontram-se nos
Laboratórios de Análise Química de Fármacos e Microbiologia e Imunologia da
Universidade Federal de Alfenas.
Agitador magnético - FISATOM
®
, utilizado no preparo das soluções padrão e
na curva de crescimento;
Agitador de tubos tipo vórtex - PHOENIX
®
, modelo AP-56, usado para
homogenizar as suspensões;
Balança analítica - SARTORIUS
®
modelo BP 210S, para pesagem dos
reagentes;
Bomba peristáltica - ISMATEC
®
(Zurique, Suíça, modelo 7618-40), utilizada
para propulsão dos fluidos;
Câmara de Neubauer, usada para a contagem pelo método em câmara;
Capela de fluxo laminar - LABCONCO
®
, para realização dos procedimentos
em ambiente estéril;
Cela de fluxo de vidro, com 1 cm de passo óptico (FEMTO
®
);
Deionizador de água Milli – Q Academic - MILLIPORE
®
para a purificação da
água;
Espectofotômetro - FEMTO
®
(UV – Vis) modelo 435, detector da turbidez em
ambas curvas analíticas;
Estufa - FANEM
®
, utilizada para o controle de temperatura durante o
crescimento microbiano;
Injetor comutador 2:3:2 - CENA - USP, para a inserção da amostra no fluxo
carregador ou solução de limpeza;
Interface modelo PCI 711 - ADVANTECH
®
, utilizada para a aquisição de
33
dados;
Microsoft Excel
®
e Origin
®
, utilizado para tratamento dos dados;
Microcomputador PC - IBM, processador PENTIUM 133 MHZ, 64 MB de
memória RAM, usado para aquisição de dados;
Microscópio óptico - OLYMPUS
®
BX41 e OLYMPUS
®
CX40, usados para
contagem em câmara.
Refrigadores - CLÍMAX
®
e BRASTEMP
®
, usadas no armazenamento dos
meios de cultivo e soluções;
2.2 REAGENTES
Agar Sabouraud (BIOTEC
®
), utilizado para o crescimento das leveduras;
Álcool polivinílico (BIOTEC
®
), para estabilizar a suspensão;
Caldo Sabouraud (BIOTEC
®
), com cloranfenicol (ANALYTICA
®
), usado no
crescimento das leveduras e eliminação das bactérias contaminantes;
Cepas de Saccharomyces cerevisiae (ATCC 2601), utilizado para o preparo
das soluções estoque e padrões;
Cloreto de bário (SIGMA
®
), para o preparo de padrões de sulfato de bário;
Cloreto de sódio (SIGMA
®
), usado no preparo da solução fisiológica;
Ácido etilenodiaminotetracético (SIGMA
®
) e hidróxido de sódio (SIGMA
®
),
utilizado para o preparo da solução de limpeza do sistema FIA;
Kit de coloração Gram (NEWPROV
®
), para verificar a eliminação de bactérias;
Reagentes usados no teste de interferentes: ácido ascórbico (SIGMA
®
), ácido
fólico (SIGMA
®
), albumina (SIGMA
®
), amido (REAGEN
®
), cloreto de cálcio diidratado
(QUIMEX
®
), cloreto de sódio (SIGMA
®
), sulfato ferroso heptaidratado (VETEC
®
),
fosfato de potássio monobásico (VETEC
®
), glicose (MERCK
®
), histidina (ACROS
®
),
cloreto de magnésio heptaidratado (MERCK
®
), piridoxina (SIGMA
®
), cloreto de
potássio (SIGMA
®
) e tiamina (SIGMA
®
).
Sulfato ferroso heptaidratado (VETEC
®
) utilizado no preparo a solução
estoque e padrões de sulfato;
Timerosal (BIOTEC
®
), para cessar o crescimento das leveduras.
34
2.3 PREPARO DAS CULTURAS
Cepas de Saccharomyces cerevisiae (ATCC 2601) foram cultivadas em caldo
Sabouraud com cloranfenicol (C
11
H
12
Cl
2
O
5
), um antibiótico de espectro de ação
amplo, usado para eliminar a contaminação por bactérias. Para confirmar a
eliminação das bactérias, foi realizada a coloração Gram. Posteriormente, estas
cepas foram inoculadas em Agar Sabouraud, sem o antibiótico. Após cinco dias de
cultivo a temperatura de 28º C em estufa, as células foram transferidas com alça de
platina para uma solução fisiológica. A suspensão celular foi centrifugada e o
sedimento foi adicionado a 500 mL de uma solução fisiológica contendo timerosal
(C
9
H
9
HgNaO
2
S), numa turbidez similar ao tubo n.º 5 da escala de MacFarland
(figura 1). Todo processo de tratamento da amostra foi realizado na câmara de fluxo
laminar.
Figura 1 - Preparo das amostras
2.4 CONTAGEM EM CÂMARA DE NEUBAUER
Para a contagem das células em câmara de Neubauer, foram utilizadas as
lamínulas fornecidas em conjunto com a câmara, colocada sobre a área demarcada
Cultivo caldo Sabouraud com
cloranfenicol (40 mg L
-1
)
Cultivo em agar
Sabouraud
C
oloração de
Gram
Solução fisiológica com
timerosal (0,2 g L
-1
)
Linearidade, seletividade,
repetibilidade e
reprodutibilidade
Saccharomyces
cerevisiae ATCC 2601
35
na câmara de contagem. A suspensão celular foi homogeneizada por agitação em
vórtex por 30 segundos. Encostando a ponta da pipeta na borda da lamínula, a
câmara de contagem foi cuidadosamente preenchida, de tal forma que a suspensão
celular preenchesse apenas um lado da câmara e não chegasse aos canais de cada
lado da área de contagem. Após dois minutos, a contagem foi realizada com auxílio
de um microscópio óptico, nos quadrantes A, B, C e D, indicados na figura 2. Para
se inferir a concentração celular pelo método da câmara de Neubauer, foi utilizada a
seguinte equação:
equação (I) C (células/mL)= 10000 x N/4,
onde N é igual as células contadas nos quatro quadrantes da câmara.
Figura 2 - Desenho esquemático da câmara de Neubauer.
2.5 CONTAGEM EM SISTEMA DE ANÁLISE POR INJEÇÃO EM FLUXO
O método de determinação da concentração celular é baseado no desvio de
radiação gerado pela presença dos microrganismos. Para tanto, uma curva analítica
36
de sulfato de bário e outra de Saccharomyces cerevisiae foram preparadas. A
determinação da concentração é calculada através da combinação de um sistema
de duas equações lineares das duas curvas analíticas. Assim sendo, igualando as
duas equações tem-se:
equação (II) m
1
x C
1
+ b
1
= m
2
x C
2
+ b
2
onde:
m
1
é o coeficiente angular da curva de sulfato;
C
1
é a concentração de sulfato;
b
1
é o coeficiente linear da curva de sulfato;
m
2
é o coeficiente angular da curva de Saccharomyces cerevisiae;
C
2
é a concentração de Saccharomyces cerevisiae;
b
2
é o coeficiente linear da curva de Saccharomyces cerevisiae.
Rearranjando a equação II temos a relação entre as concentrações das
espécies (equação III).
equação (III) C
2
= m
1
/m
2
x C
1
+ (b
1
-b
2
)
2.5.1 Curva analítica de sulfato de bário
A determinação de sulfato é baseada na reação entre os íons sulfato e bário,
em meio micelar de álcool polivinílico. Uma vez que o produto formado se precipita
37
na cela espectrofotométrica, a linha de base é instável. Portanto, uma solução de
0,3% (m/v) EDTA em NaOH 0,07 mol L
-1
foi empregada para solubilizar o
precipitado.
A solução estoque de sulfato foi preparada com sulfato ferroso e as soluções
padrão (2,5 a 25,0 mg L
-1
) foram preparadas por diluições apropriadas a partir da
solução estoque.
2.5.2 Curva analítica de Saccharomyces cerevisiae
A determinação da concentração celular é baseada na relação diretamente
proporcional entre a radiação dispersa e a quantidade de microrganismos em
solução fisiológica.
A solução estoque de Saccharomyces cerevisiae foi preparada como descrito
ao final do procedimento no item 2.3 e as soluções padrão (1,47 x 10
9
a 7,34 x 10
9
células L
-1
) foram preparadas por diluições a partir da solução estoque.
2.5.3 Sistema de análise por injeção em fluxo
As leituras para ambos sistemas foram realizadas em 410 nanômetros, em
espectrofotômetro, equipado com cela de fluxo ótica de 1cm. A bomba peristáltica foi
usada para realizar o transporte dos líquidos nos tubos do polietileno (d.i. = 0.8mm)
e Tygon. A aquisição de dados foi realizada por uma interface (PCL-711 AD/DA).
O módulo do sistema FIA, para a determinação de sulfato, é mostrado na
figura 3. Através do injetor comutador (2: 3: 2), as amostras são introduzidas no fluxo
carregador. Na primeira confluência, a reação turbidimétrica ocorre devido à mistura
entre a amostra e o cloreto do bário (R2), de tal forma que o produto formado é
medido pelo espectrofotômetro. Quando o injetor comutador é movido para a
posição inicial, o EDTA (R1) é introduzido no lugar do cloreto do bário, e a linha base
do sistema é restabelecida (KRUG et al., 1983).
Para a determinação da concentração celular utilizou-se o mesmo módulo do
38
sistema FIA (figura 3) empregado para a determinação de sulfato. A principal
modificação é a troca do cloreto de bário usado na formação de sulfato de bário (R2)
por solução fisiológica. Através do injetor comutador (2: 3: 2), as amostras são
introduzidas no fluxo carregador. Na primeira confluência, ocorre a mistura da
amostra com a solução fisiológica (R2). A fração de luz que emerge da cela de fluxo
é detectada pelo espectrofotômetro. Quando o injetor comutador é movido para a
posição inicial, o EDTA (R1) é introduzido no lugar da solução fisiológica, e a linha
base do sistema é restabelecida.
Figura 3 - Módulo do sistema FIA: A = amostra; C = fluxo carregador (solução fisiológica); R1 = 0,3%
(m/v) EDTA em 0,07 mol L
-1
NaOH; R2 = 5,0 % (m/v) BaCl
2
. 2H
2
O em 0,05% (m/v) álcool
polivinílico (PVA) - para determinação de sulfato; solução fisiológica - para determinação da
concentração celular; D = detector (espectrofotômetro, λ = 410 nm); W = descarte; L = alça
de amostragem (volume = 502 µL). Os valores entre parênteses representam as taxas de
fluxo empregadas no sistema FIA (mL/min).
2.6 FIGURAS DE MÉRITO
2.6.1 Seletividade
Em geral, uma forma simples de verificar a seletividade de um método é
através do teste de interferentes. A seletividade do método proposto foi testada
Bomba peristáltica
L
L
100 cm
Descarte
Detector
Injetor comutador
Solução de Limpeza
Amostra
Carregador
R2
Descarte
39
frente a interferentes comumente presentes em probióticos e fermentos comerciais
comuns (como ácido ascórbico, ácido fólico, amido, cálcio, cloreto de sódio, ferro,
fósforo, glicose, histidina, magnésio, proteínas totais, piridoxina, potássio, e tiamina).
Alíquotas de soluções desses interferentes foram introduzidas juntamente com um
padrão de Saccharomyces cerevisiae (3,83 x 10
9
células L
-1
) a fim de produzir
concentrações próximas aos níveis dessas substâncias nas amostras em questão. A
concentração 1 é igual à concentração informada no rótulo dos produtos, obedecido
o fator de diluição da amostra. As concentrações dois e três são iguais
respectivamente a dez e cem vezes a informação fornecida no rótulo dos produtos,
conforme segue na tabela 1.
Tabela 1 - Concentrações dos interferentes (g/L).
Interferentes Concentração 1 Concentração 2 Concentração 3
Ácido ascórbico
1,55 x 10
-3
1,55 x 10
-2
1,55 x 10
-1
Ácido fólico
2,01 x 10
-8
2,01 10
-2
2,01 x 10
-6
Amido
1,01 x 10
-1
1,01 1,01 x 10
+1
Cálcio
3,61 x 10
-3
3.61 x10
-2
3,61 x 10
-1
Cloreto de sódio
5,95 x 10
-1
5,95 5,95 x 10
+1
Ferro
1,21 x 10
-6
1,21 x 10
-5
1,21 x 10
-4
Fósforo
4,20 x 10
-5
4,20 x 10
-4
4,2 x 10
-3
Glicose
5,01 x 10
-1
5,01 5,01 x 10
+1
Histidina
9,14 x 10
-3
9,14 x 10
-2
9.14 x 10
-1
Magnésio
2,11 x 10
-6
2,11 x 10
-5
2,11 x 10
-4
Proteínas totais
4,43 x 10
-1
4,43 4.43 x 10
+1
Piridoxina
2,69 x 10
-5
2,69 x 10
-4
2,69 x 10
-3
Potássio
1,33 x 10
-5
1,33 x 10
-4
1,33 x 10
-3
Tiamina
1,35 x 10
-5
1,35 x 10
-4
1,35 x 10
-3
2.6.2 Linearidade, limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ)
A linearidade foi determinada pelo coeficiente de correlação, obtido pelo
gráfico relacionado à resposta do equipamento em função de várias concentrações
do analito. Para o estudo da linearidade do sistema FIA, foram realizadas leituras de
padrões de sulfato de bário e Saccharomyces cerevisiae, cujas concentrações
40
variaram, respectivamente, entre 2,5 e 100 mg L
-1
e 1,47 x 10
9
e 1,47 x 10
10
células
L
-1
(USP30, 2007).
Para inferência dos limites de detecção e quantificação, foram realizadas dez
leituras do branco, no caso, solução fisiológica, para células e água, para sulfato. O
cálculo de ambos os limites é baseado na razão entre desvio padrão das dez leituras
do branco e o coeficiente angular de cada curva de calibração. No caso do limite de
detecção e quantificação, o valor obtido foi, respectivamente, igual a três e dez
vezes a essa razão.
2.6.3 Repetibilidade
Para o ensaio da precisão intra-dia, foram realizadas três curvas analíticas
distintas de sulfato de bário e Saccharomyces cerevisiae, obtendo-se três equações
que demonstram a relação entre os sinais de sulfato e do fungo. Foram preparadas
três réplicas autênticas de três amostras contendo Saccharomyces cerevisiae com
concentrações distintas (1,86 X 10
9
, 3,24 X 10
9
, 7,94 X 10
9
células L
-1
). A
repetibilidade foi demonstrada pela média dos coeficientes de variação (%CV) das
três amostras (USP30, 2007).
2.6.4 Reprodutibilidade
A precisão interdias é obtida por meio de alteração de condições, como
mudança de analista, reagentes ou equipamento, ou utilização do método durante
várias semanas. Para o ensaio da precisão interdias, foram realizadas curvas
analíticas distintas de sulfato de bário e Saccharomyces cerevisiae, obtendo-se três
equações que demonstram a relação entre eles, em três dias distintos e
consecutivos. A precisão foi determinada através da análise de três réplicas
autênticas de uma amostra com concentração igual a 3,24 x 10
9
células L
-1
. A
reprodutibilidade foi demonstrada pela média dos coeficientes de variação (%CV)
das três amostras obtidas em cada dia (USP30, 2007).
41
2.6.5 Exatidão
Para se avaliar a exatidão do método proposto, utilizou-se como método de
comparação a câmara de Neubauer. Assim, amostras simuladas e produtos
comerciais foram analisados em ambos os métodos, submetidos ao teste F e ao
teste t pareado.
No caso das amostras simuladas, foram preparados, dez tubos contendo
solução fisiológica, os quais receberam quantidades diferentes de microrganismos
presentes no agar Sabouraud mencionado no item 2.3. Além disso, o método
proposto foi aplicado na determinação de Saccharomyces cerevisiae nos produtos
comerciais: fermentos secos Fleischmman
®
e Dona Benta
®
, fermento fresco
Fleischmman
®
e o probiótico Organonew
®
.
2.7 APLICAÇÃO EM PRODUTOS COMERCIAIS
Na determinação do fungo em amostras comerciais, as cepas de
Saccharomyces cerevisiae foram preparadas adicionando 2,0 g da amostra a 1000
mL de solução fisiológica contendo timerosal e cloranfenicol, sob agitação à
temperatura ambiente. Após o período de uma hora, as amostras foram lidas no
sistema FIA. Para checar a exatidão, a contagem também foi feita ao microscópio
óptico, retirando-se uma alíquota de 200 µL diluída em 800 µL da solução fisiológica.
Em seguida, foi retirada uma alíquota de 20 µL e colocada na câmara de Neubauer.
2.8 APLICAÇÃO DO MÉTODO PARA MONITORAR A CURVA DE CRESCIMENTO
No preparo das curvas de crescimento, cepas de Saccharomyces cerevisiae
previamente isoladas foram transferidas para um tubo de ensaio contendo 50 mL de
caldo Sabouraud, com cloranfenicol. Após 48 horas, um mL deste caldo, foi
transferido para um erlenmeyer contendo um novo caldo, estéril, totalizando um
42
volume final de 50 mL. As amostras para monitorização da curva de crescimento
foram mantidas a 25º C, sob agitação. Todo procedimento foi realizado em capela
de fluxo laminar.
Curvas analíticas de sulfato de bário e Saccharomyces cerevisiae foram
realizadas para calibração do sistema FIA. Alíquotas de 0,2 mL das amostras foram
transferidas para tubos de ensaios esterilizados, adicionando-se 14,8 mL de solução
fisiológica. Ao mesmo tempo, o volume do meio foi ajustado com a adição de 0,2 mL
de meio de cultivo esterilizado. As leituras foram realizadas a cada hora, até que a
população microbiana atingisse a fase de crescimento estacionário (figura 4).
Entende-se que a fase de crescimento estacionário é aquela que não se percebe
aumento de sinal independente das diluições efetuadas na amostra. Para a
contagem na câmara de Neubauer foram necessárias novas diluições da amostra a
partir da oitava hora do procedimento para facilitar as contagens ao microscópio.
Figura 4 - Procedimento realizado para o ensaio da curva de crescimento.
48 horas
meio +
14,8 mL
de solução
fisiológica
Leituras:
FIA
Neubauer
Curvas
analíticas
1 mL 0,2 mL
49 mL
Caldo
Sabouraud +
Cloranfenicol
(40 mg L
-1
)
50 mL
Caldo
Sabouraud +
Cloranfenicol
(40 mg L
-1
)
43
3 RESULTADOS E DISCUSSÃO
3.1 CONTAGEM EM CÂMARA DE NEUBAUER
A figura 5 representa a leitura de uma réplica da solução estoque obtida ao
final do procedimento 2.3. O procedimento de leitura foi realizado como descrito em
2.4, sendo utlizada a equação I. Uma distribuição celular na câmara de Neubauer
também é demonstrada por Pereira (1995). Notam-se discrepâncias entre as médias
de cada quadrante, maiores que a verificada nesse estudo. São comuns variações
entre os quadros adjacentes de leituras entre 10 e até 15 células. Isso demonstra
que um dos maiores problemas da câmara de Neubauer é a falta de homogeneidade
na amostra.
Os erros nas contagens são comuns principalmente por causa da falta de
habilidade do operador. Também é freqüente associar os erros da contagem à
amostragem errada, resultando em contagens imprecisas. Para minimizar esses
erros, foram padronizados o tempo de agitação (igual a trinta segundos) e a rotação
dos tubos de ensaios (3800 rpm), usados tanto para a contagem ao microscópio
quanto para a contagem no sistema FIA.
Figura 5 - Desenho esquemático da câmara de Neubauer mostrando um resultado da contagem de
células de Saccharomyces cerevisiae.
44
3.2 ESTUDO DA CORRELAÇÃO ENTRE OS SINAIS
Nas figuras 6 e 7 estão apresentados os registros dos sinais obtidos no
sistema proposto: as leituras foram feitas em triplicata para o sistema FIA, para a
determinação de sulfato (figura 6) e Saccharomyces cerevisiae (figura 7). Pode-se
notar a boa precisão das medidas, o coeficiente de variação foi menor que 4,55% e
2,95% para as concentrações de sulfato e Saccharomyces cerevisiae,
respectivamente.
As equações lineares de ambas curvas analíticas foram relacionadas como
proposto no item 2.5, para estabelecer a proporcionalidade entre a concentração de
sulfato e a concentração de Saccharomyces cerevisiae. Assim, a equação obtida
(C
S. cerevisiae
= 2,17 x 10
8
C
Sulfato
+ 2,26 x 10
-3
) foi usada para inferir a concentração de
leveduras nas amostras. Uma das vantagens do método proposto é a possibilidade
de quantificação células através da curva analítica de sulfato de bário, sendo
dispensada a curva analítica de Saccharomyces cerevisiae. Esse fato, além de
simplificar as análises, aumenta a freqüência analítica e evita erros do operador
durante os procedimentos microbiológicos de calibração do sistema.
0 6 12
0,00
0,12
0,24
0 5 10 15 20 25
0,00
0,12
0,24
Sinal
Tempo (min)
S = 0,0087 C + 4,58 E
-4
r = 0,99975
Sinal
Concentração de sulfato (mg L
-1
)
Figura 6 - Curva analítica e registros de sinais dos padrões de sulfato (2,5, 5,0, 10,0, 15,0, 20,0 e 25,0
mg L
-1
).
45
0 6 12
0,00
0,16
0,32
2 4 6 8
0,00
0,16
0,32
Sinal
Tempo (min)
S = 4,01 X 10
-11
C - 0,0018
r = 0,9997
Sinal
Concentração de S. cerevisiae (10
9
cel L
-1
)
Figura 7 - Curva analítica e registros de sinais dos padrões de Saccharomyces cerevisiae (0,0, 1,47 x
10
9
, 2,93 x 10
9
, 4,41 x 10
9
, 5,87 x 10
9
, 7,34 x 10
9
células L
-1
).
3.3 FIGURAS DE MÉRITO
3.3.1 Seletividade
A farmacopéia americana define a seletividade de um método analítico como
sua habilidade em medir, de forma exata, um analito na presença de interferências,
as quais se espera que estejam presentes na matriz da amostra. (USP30, 2007).
Foram testados os seguintes interferentes: ácido ascórbico, ácido fólico,
amido, cálcio, cloreto de sódio, ferro, fósforo, glicose, histidina, magnésio, piridoxina,
potássio, proteínas totais e tiamina. Para os testes, a quantidade de Saccharomyces
cerevisiae mantida durante todo o experimento foi de 3,83 x 10
9
células L
-1
. Todos
os interferentes foram estudados em três concentrações conforme descrito no item
2.6.1. Os interferentes foram escolhidos considerando a composição das amostras
46
comerciais, sendo a concentração 1 do teste de interferente igual à mencionada no
rótulo do produto, observada a diluição no preparo da amostra.
Como pode ser visto na tabela 2, a maior interferência, para a concentração
1, foi menor que 6%, o que pode ser considerado aceitável, devido à complexidade
da amostra.
As interferências mais severas foram observadas para as proteínas. Esse
composto provavelmente absorve radiação eletromagnética no comprimento de
onda estudado, provocando aumento do sinal analítico.
Cabe lembrar que as concentrações que causaram maior interferência, para
as proteínas, no presente trabalho, consistem de concentrações altas e diferentes
das que são normalmente encontradas nas amostras estudadas, a concentração 1
apresentou interferência desprezível (3,85 %).
Tabela 2 - Estudo de interferentes.
Interferentes Concentração 1 Concentração 2 Concentração 3
Ácido ascórbico 1,50% 2,52% 3,50%
Ácido fólico 5,99% 5,35% 6,29%
Amido 0,55% 1,57% 9,44%
Cálcio 0,25% 1,92% 4,55%
Cloreto de sódio 0,45% 0,46% 0,70%
Ferro 4,90% 3,86% 4,55%
Fósforo 2,45% 3,14% 4,00%
Glicose 3,18% 3,20% 4,20%
Histidina 0,74% 1,57% 1,40%
Magnésio 5,24% 5,03% 6,29%
Proteínas totais 3,85% 16,35% 54,20%
Piridoxina 0,34% 0,63% 2,10%
Potássio 0,64% 0,09% 2,45%
Tiamina 1,50% 2,52% 3,50%
3.3.2 Linearidade, limite de detecção (LOD) e limite de quantificação (LOQ)
A linearidade é a resposta obtida em função da concentração do analito, a
qual deve ser estudada em um intervalo de concentração apropriado. A faixa linear
47
de resposta é dependente do composto analisado e do tipo de detector utilizado. A
linearidade foi determinada pelo coeficiente de correlação (R), obtido pelo gráfico
relacionado à resposta do equipamento em função de várias concentrações do
analito. O número mínimo de pontos geralmente aceito nos gráficos de calibração
varia entre 5 e 7 pontos (DANZER; CURRIE, 1998; INMETRO, 2003).
A tabela 3 compila os parâmetros referentes à regressão linear. Observa-se
que o método apresentou boa linearidade com r > 0,999 para ambas as
determinações realizadas, nas faixas de concentração estudadas.
Os critérios utilizados para determinar o LOD e LOQ foram baseados nos
parâmetros referentes ao coeficiente angular da curva analítica (m) e o desvio
padrão de dez leituras consecutivas de uma solução branco (σ). Dessa maneira, os
limites de detecção para sulfato e Saccharomyces cerevisiae foram,
respectivamente, 0,109 mg L
-1
e 2,37 x 10
8
células L
-1
. Os limites de quantificação
para sulfato e Saccharomyces cerevisiae foram, respectivamente, 0,363 mg L
-1
e
7,90 x 10
8
células L
-1
.
Tabela 3 - Parâmetros analíticos do método com relação à linearidade, ao limite de detecção e limite
de quantificação do método proposto.
Parâmetros Curva analítica de sulfato Curva analítica de S. cerevisiae
Faixa linear 2,5 a 25 mg L
-1
1,47 a 7,34 x 10
9
células L
-1
Coeficiente linear 4,58 x 10
-4
1,81 x 10
-3
Coeficiente angular (m) 8,7 x 10
-3
L
mg
-1
4,01 x 10
-11
L células
-1
Coeficiente de correlação (r) 0,9997 0,9993
Desvio padrão (σ) 3,16 x 10
-4
3,16 x 10
-4
LOD
a
1,09 x 10
-1
mg L
-1
2,37 x 10
8
células L
-1
LOQ
b
3,63 x 10
-1
mg L
-1
7,90 x 10
8
células L
-1
a
LOD = 3 * (σ /m)
b
LOQ = 10 * (σ/m)
3.3.3 Repetibilidade
A precisão intra-dia foi determinada através da análise das amostras em três
níveis de concentração (1,86 X 10
9
, 3,24 X 10
9
, 7,94 X 10
9
células L
-1
) com três
48
determinações para cada nível. A repetibilidade foi demonstrada pela média dos
coeficientes de variação (%CV) (Palmigiani, 2005), onde o valor obtido foi de 1,5. Os
dados apresentados na tabela 4 mostram uma boa precisão, uma vez que não foram
superiores a 2%.
Tabela 4 – Precisão do método – Repetibilidade
Concentração da amostra
a
% CV
1,86 X 10
9
células L
-1
1,7
3,24 X 10
9
células L
-1
1,6
7,94 X 10
9
células L
-1
1,3
CV
b
(%) 1,5
a
três determinações para cada nível
b
CV (nove determinações)
3.3.4 Reprodutibilidade
A precisão foi determinada através da análise de uma amostra (3,24 x 10
9
células L
-1
) em três dias diferentes. A reprodutibilidade foi demonstrada pela média
dos coeficientes de variação (%CV), onde o valor obtido foi de 11,49% Segundo
Palmigiani (2005), o coeficiente de variação deveria ser menor que 4% para
produtos farmacêuticos.
É oportuno lembrar que além de prover estimativas da repetitividade e da
reprodutibilidade de um método analítico, esses estudos fornecem uma estimativa
objetiva do desempenho do Laboratório, encorajando a autocrítica e a percepção dos
erros cometidos durante análises e, sobretudo, ajuda na identificação das necessidades
de treinamento de pessoal.
3.3.5 Exatidão
Para se avaliar a exatidão das medidas foi empregada comparação com o
método de contagem em câmara de Neubauer, no caso, amostras de próbióticos e
49
ts
√n
fermento biológico. Na tabela 5, é verificado que o intervalo de confiança do método
proposto é menor que a contagem em Câmara de Neubauer.
Tabela 5 - Comparação entre o método proposto e câmara de Neubauer em amostras simuladas.
Amostras Câmara de Neubauer
(10
9
células L
-1
)
Sistema FIA
(10
9
células L
-1
)
A 4,35 ± 2,41
1
4,73 ± 0,06
B 6,38 ± 7,02 6,63 ± 0
C 9,35 ± 7,94 10,53 ± 0,05
D 1,20 ± 1,58 1,29 ± 0,09
E 1,85 ± 0,65 1,92 ±0,03
F 2,81± 0,69 2,90 ±0,04
G 2,17 ± 0,71 2,42 ± 0,02
H 0,51 ± 1,58 0,76 ± 0,03
I 5,67 ± 1,06 5,62 ± 0,20
J 11,62 ± 4,92 10,44 ± 0,78
1
Valores são mostrados como média ± intervalo de confiança (média ± ) com α=0,05, (n=3).
Os resultados do método FIA foram comparados com os resultados da
câmara de Neubauer e não houve diferença significativa em 95% do nível de
confiança (teste-t pareado). Nesse caso, os resultados entre os métodos
convencional e proposto não foram submetidos ao teste F. Pode ser percebida na
tabela 5 que quanto maior a concentração das amostras, maior o desvio verificado,
especialmente no tocante aos resultados do método convencional.
Na câmara de Neubauer, as causas mais freqüentes de erros que modificam
os resultados da contagem são: câmaras ou pipeta mal calibradas; mal ajuste da
lamínula, da adsorção das células na pipeta, da distribuição heterogênea na câmara,
falta de experiência do operador e amostragem não representativa da suspensão
celular. A determinação para a câmara de Neubauer apresentou menor precisão
como pode ser verificado pelo intervalo de confiança mostrado na tabela 5. Na
determinação através do sistema FIA, as características vantajosas devem ser
destacadas como a rapidez na determinação (freqüência da determinação = 120 h
-
1
), além da precisão.
50
ts
√n
3.4 APLICAÇÃO EM PRODUTOS COMERCIAIS
Na tabela 6, é verificado que o intervalo de confiança do método proposto é
menor que a contagem em Câmara de Neubauer. Os resultados do método FIA
foram comparados com os resultados da câmara de Neubauer e não houve
diferença significativa em 95% do nível de confiança (teste-t pareado). Esse fato
demonstra a aplicabilidade do método proposto para quantificação de
Saccharomyces cerevisiae em produtos comerciais. Segundo Fleet (2007), novas
ferramentas analíticas que tenham a habilidade para quantificar cepas são
fundamentais para compreensão da ocorrência e significância das cepas em
alimentos e bebidas.
Maukonen e colaboradores (2006) avaliaram diferentes métodos de contagem
para probióticos, dentre eles, métodos de fluorescência ao microscópio, citometria
de fluxo e contagem em placa. É concluído neste trabalho que técnicas
fluorescentes provaram ser adequadas para uma rápida avaliação da quantidade de
células em amostras de probióticos. Entretanto admitem as limitações dessa técnica,
relacionadas principalmente à necessidade do pré-tratamento da amostra. Com
relação a esse aspecto, o presente trabalho apresenta-se como alternativa viável
para enumeração de leveduras em probióticos, uma vez que não foi necessário
nenhum pré-tratamento das amostras. Além disso, podem ser mencionadas
características como a simplicidade, o baixo custo, a precisão e a exatidão
satisfatórias.
Tabela 6 - Determinação da concentração celular através da Câmara de Neubauer e do sistema FIA
em amostras de probiótico e fermentos biológicos.
Amostras
Câmara de Neubauer
(10
9
células L
-1
)
Sistema FIA
(10
9
células L
-1
)
Organonew
®
0,897 ± 0,070
1
0,802 ± 0,017
Dona Benta
®
1,35 ± 0,05 1,37 ± 0,01
Fleischmman
®
seco
2,10 ± 0,16 2,05 ± 0,05
Fleischmman
®
fresco
1,01 ± 0,10 1,11 ± 0,02
1
Valores são mostrados como média ± intervalo de confiança (média ± ) com α=0,05, (n=3).
51
3.5 APLICAÇÃO DO MÉTODO PARA MONITORAR A CURVA DE CRESCIMENTO
Depois de otimizado, o método foi usado para monitorar o crescimento celular
(figura 8). Durante o experimento, a cultura de leveduras foi mantida sob agitação a
25°C. A cultura permaneceu em fase lag até um período de quatro horas. A partir de
então, a cultura exibe uma fase logarítmica até a décima quarta hora e, em seguida,
fase estacionária atingindo uma concentração celular igual a 1,98 x 10
11
células L
-1
.
Assim como no trabalho de Esti e colaboradores (2004), por se tratar de um sistema
FIA, diluições das amostras são facilmente aplicáveis quando a concentração celular
ultrapassa a faixa linear do método. Ao invés de se diluir a amostra previamente,
pode-se optar pela diluição em linha, no sistema FIA, pelo aumento da vazão da
solução fisiológica. Dessa maneira, minimiza os erros do operador durante as etapas
de diluição.
No trabalho de Muller (2007), a densidade óptica de uma solução contendo
Saccharomyces boulardii é comparada à massa celular da amostra (g L
-1
). Os
autores elaboraram uma curva analítica correlacionando a massa celular à medida
de densidade ótica (DO). Por regressão linear estimaram uma equação linear para
calcular a massa celular das amostras. A solução foi filtrada por uma membrana de
0,22 µm. No procedimento de crescimento celular não foi observado a fase lag
devido à utilização de um pré-inóculo. A fase log é evidenciada a partir da quinta
hora, sendo que curva apresenta uma inclinação acentuada até a décima segunda
hora.
Já o trabalho Weiss, Delproposto e Girouw (2004) corrobora com o presente
trabalho, com relação ao tempo de duração das fases lag e log, durante o
crescimento do fungo Saccharomyces cerevisiae. Segundo esses autores, culturas
inoculadas com uma concentração inicial de 1 x 10
8
células L
-1
são altamente
reprodutíveis e têm um tempo médio para alcançar o máximo de crescimento 13.9 ±
0.21 h. Ainda afirmaram que esta reprodutibilidade permite a medida quantitativa
precisa do parâmetro do crescimento.
52
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
7.5
8.0
8.5
9.0
9.5
10.0
10.5
Log [Concentração deSaccharomyces cerevisiae]
Tempo (h)
Figura 8 - Curva de crescimento de Saccharomyces cerevisiae.
53
4 CONCLUSÕES
O presente trabalho fornece um método alternativo da contagem de célula
que apresenta diversas vantagens sobre a câmara de Neubauer. O método é mais
rápido, já que a freqüência analítica é igual a 120 determinações por hora,
aproximadamente 30 vezes maior que a contagem manual.
O método de determinação turbidimétrico exige menos tempo do treinamento
de operador. Por isso, a principal característica do método desenvolvido é a
simplicidade de operação para determinação da concentração celular em amostras
de probióticos e fermento biológico.
O método apresentou seletividade satisfatória, uma vez que as interferências
mais severas foram observadas apenas para as proteínas, sendo nas concentrações
dez e cem vezes maior que o encontrado nas amostras de próbiótico e fermento
biológico.
Quanto à exatidão, não houve diferença significativa em 95% do nível de
confiança entre os resultados do método FIA e os resultados da câmara de
Neubauer.
Adicionalmente, a repetibilidade evidenciada pelo intervalo de confiança
(menor que 0,8) e o ensaio de precisão intra-dia é notavelmente boa (menor que
2,0%).
Quanto à monitoração do crescimento microbiano, os resultados foram
satisfatórios, mostrando a possibilidade de utilização do método nesses ensaios.
54
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61
APÊNDICE A - ARTIGO SUBMETIDO A REVISTA ANALYTICAL BIOCHEMISTRY
62
63
Alfenas, September 18
th
August, 2008.
Dear Editor,
We are sending you a paper named: Development of a Turbidimetric Flow
Injection Analysis System for Cell Counting, with intention to publish in the
Analytical Biochemistry. In the best of our knowledge, it is the first time that is
done.
Sincerely,
Dr. Pedro Orival Luccas
Departamento de Ciências Exatas
Universidade Federal de Alfenas
Rua Gabriel Monteiro da Silva, 714, Centro, Alfenas, Minas Gerais, Brazil
Zip code: 37130000
e-mail: pedro@unifal-mg.edu.br
phone/fax number: 21+ 55 35 3299 1262
64
Development of a Turbidimetric Flow Injection
Analysis System for Cell Counting
1
Development of FIA System for Cell Counting
Gustavo de Souza Pessôa, Marina Nali de Magalhães, Antônio Martins de
Siqueira, Célio Wisniewski, César Ricardo Teixeira Tarley, Pedro Orival
Luccas*
Departamento de Ciências Exatas, Universidade Federal de Alfenas, Rua
Gabriel Monteiro da Silva, 714, CEP 37130-000, Alfenas, Minas Gerais, Brazil
Category: Labeling procedures
*
Corresponding author. Tel +55 35 3299 1047; fax +55 35 3299 1262;
E-mail address:ped[email protected] (P.O. Luccas)
Keywords: FIA, Neubauer Chamber, Cell count, Turbidimetry, Saccharomyces cerevisiae.
Abstract
A flow injection analysis (FIA) system with turbidimetric determination for cell
counting was developed. Similar to the McFarland’s method, the present work is based on the
proportionality between the turbidimetric signals obtained for barium sulfate suspension and
cell suspension. The results obtained, using the proposed procedure, were compared with
results obtained in the Neubauer Chamber and there was no significant difference at
confidence level of 95% (paired t-test). The main advantages of the FIA system were high
sample throughput and good precision; both parameters proved to be better than conventional
1
We acknowledge financial support from the Capes, Finep and also the CNPq by M.N.M.
scholarships.
65
counting system into Neubauer Chamber. The method was also tested to monitor the cells
growth and showed satisfactory results.
Introduction
Cell count is a procedure that has been used in various areas of science and can be
executed basically by three ways: direct count
1
,
turbidimetric methods
2
and viable cells count
3
.
This parameter is important, for example, to monitor microorganism growth in culture media
which are used in microbiology, food technology, biotechnology and pharmaceutical industry
studies
4
.
Some methods, common in instrumental analytical chemistry, have also been used
for cells count including both viable and non-viable cells
5,6
. One of the most important
instrumental techniques for cells counting is turbidimetry
7
.
The present work was inspired in the McFarland method in which turbidity of cells
suspensions was compared with standard suspensions of barium sulfate
8
. One intrinsic
difficulty of the McFarland technique is the instability of the suspensions due to its
precipitations. Such problem is also present in the conventional instrumental turbidimetric
measurements. However, this drawback can be circumvented by using flow injection analysis
(FIA)
9
system as will be demonstrated in the present work.
The aims of this work were to propose and evaluate a turbidimetric FIA system for
Saccharomyces cerevisiae cell counting. Initially, analytical curves (equations) for the
analytes, with the same FIA system, were obtained with barium sulfate and S. cerevisiae
standards and a linear combination between linear equations, obtained for both analytes,
resulted in the correlation between C
Saccharomyces
and C
sulfate
. As in the McFarland technique,
after the determination of the correlation between analyzed standards, only the analytical
curve with barium sulfate was enough for cells count.
Experimental
Saccharomyces cerevisiae strains (ATCC 2601) were cultivated in Sabouraud broth
with chloramphenicol (C
11
H
12
Cl
2
O
5
), which is an antibiotic of wide use, thus, contaminants
bacteria are eliminated. A kit for gram coloration (NEWPROV) was used to confirm the
bacteria elimination. Following that, the strains were inoculated in Sabouraud agar without
antibiotic. After five days cultivation at 28º C in incubator (FANEM), the cells were collected
and inoculated in physiological solution. The cellular suspension was centrifuged and the
sediment was added in 0.9% (m/v) NaCl suspension (stock solution) containing 2 x 10
-3
w/v
thimerosal (C
9
H
9
HgNaO
2
S) to stop the yeast growth. All the sample treatment process was
done in the flow laminar chamber (LABCONCO).
Reagents and solutions: The sulfate determination is based on the reaction between
sulfate and barium ions (barium chloride - Reagen) in micellar medium of polyvinylic alcohol
(SIGMA)
16
. Sulfate stock solution was prepared with ferrous sulfate (VETEC) and reference
solutions (5.0 to 100.0 mg L
-1
) were prepared by appropriate dilutions from the stock solution.
Saccharomyces cerevisiae stock solution was prepared with turbidity similar to the
tube number 5 of McFarland scale
8
and reference solutions (1.46x10
9
to 7.34x10
9
cell L
-1
)
were prepared by appropriate dilutions from the stock solution.
Flow Injection Analyses (FIA): The readings for both systems were done at 410 nm in
a UV-Vis (FEMTO - model 482) spectrophotometer, with 1cm optical path flow cell. A
peristaltic pump (Ismatec- Zurich, Switzerland, 7618-40 model) was used to propel the fluids
through polyethylene tubes (ө = 0.8mm). The data were recorded by a PCL-711
66
(ADAVANTECH) AD/DA interface. The FIA system, for sulfate signals, is shown in Figure
1. For the best comparison the sign for cells suspensions were obtained with the same FIA
system used for barium sulfate (Figure 1), but, a physiological solution was introduced into
the carrier stream, R1 and R2 channels.
Cell count in Neubauer chamber:Aliquots of 10 until 15 µL of homogenized
suspension were introduced into a Neubauer Chamber5. The count was made through the
stereoscopic microscope (OLYMPUS BX41 and CX40).
Interference studies:The selectivity of the proposed method was tested considering the
composition of studied samples (two ferments and one probiotic samples). Thus, the studied
interferents were: ascorbic acid, folic acid, amide, calcium, sodium chloride, iron,
phosphorous, glucose, hystidine, magnesium, proteins, pyridoxine, potassium and thiamine).
Aliquots of solutions of those interferents were mixed with Saccharomyces cerevisiae
solution (3.83 x 10
9
cells L
-1
). Three interferent concentrations were examinated: the first one
was the same found in the sample and the others were ten times and a hundred times higher
than the first one.
Application in real samples:The samples were prepared adding 2.0 g of the samples to
1000 mL of physiologic solution containing thimerosal and chloramphenicol, under agitation
and constant temperature. After the period of one hour, the samples were determined in the
FIA system. To check the accuracy, the determination by the optical microscope was also
done, leaving an aliquot of 200 µL diluted in 800 µL of the physiologic solution. Soon after,
an aliquot of 20 µL was removed and placed in the camera of Neubauer.
Cells growth studies: Saccharomyces cerevisiae strains had been inoculated into an
assay tube containing 10 mL of Sabouraud broth with chloramphenicol. After 48 hours 1 mL
of the Sabouraud broth was transferred to an erlenmeyer containing a sterile new broth,
totalizing a final volume equal to 50 mL. Samples were kept at 25º C under continuous
shaking throughout the procedure. The microbial growth was followed by the proposed
method, and for this, measurements were done each hour, until the microbial population
reached the steady state of growth phase.
Results and discussion
After optimization, the obtained sulfate analytical curve was: (S = 0.0087C
sulfate
+
0.0005) and the S. cerevisiae analytical curve: (S = 4.01 x 10
-11
C
S.cerevisiae -
0.0018).
The linear equations of both analytical curves have been combined in order to
establish proportionality between the sulfate concentration and the S. cerevisiae
concentration. Thus, the obtained linear equation (C
S. cerevisiae
= 1.088 C
sulfate
+ 0.0023) can be
used to determine the microorganisms concentrations in the unknown samples.
The interference studies: There is no significant interference, based on reduced
increase of the analytical signal (in percentage) of the Saccharomyces cerevisiae solution
(3.83 x 10
9
cells L
-1
). For the concentration two and three the main interference is caused by
protein, nevertheless, these concentrations are not present in real sample, so these results
indicate that analyst should be attentive with this interfering. The accuracy test, presented
below, confirm the no occurrence of interference for the studied samples.
Precision and Accuracy studies: In order to check the accuracy of the proposed
method samples of Saccharomyces cerevisiae were prepared and the results obtained with the
FIA method were compared with the Neubauer Chamber results. According to results there
was no significant difference at 95% of confidence level (paired t-test). In the determination
through FIA system advantageous characteristics were obtained such as high sample
throughput (120 h
-1
), besides the excellent precision (Figure 1a). The limit of detection was
2.53x10
8
cell L
-1
.
67
Cells growth studies: The method was also used to monitor cells growth studies and a
typical growth curve was obtained (Fig. 1b). During the experience a yeast culture was kept
under shaking at 25°C, in lag phase, during four hours. From that point on it exhibits a
logarithmic phase up to the fourteenth hour and, from that, a stationary phase plateau of 1.98
x 10
10
cells L
-1
. Growth curves of 3 replicate yeast cultures, inoculated at an initial strain with
1 x 10
8
cells L
-1
from the same starter culture in phase growth, are highly reproducible and
have a mean average time to reach half-maximum growth of 13.9 ± 0.21 h. This
reproducibility allows precise quantitative measurement of growth parameter
10
.
Conclusion: This paper proposes an alternative method of cell counting and presents
several advantages on the Neubauer Chamber counting. The turbidimetric determination
method is more practical because it requires less time for operator training. The FIA counting
method is also faster, since the sample throughput is ca. 120 determinations per hour, about
30 times faster than the manual counting. Additionally, the precision evidenced by the
confidence interval was notably better. The FIA system proposed was applied efficiently to
monitor cell growth studies. Finally, the system is also simpler and presents low cost in
comparison to Neubauer Chamber.
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69
Figure 1
Figure 1: FIA Manifold: A = sample; C = carrier flow (H
2
O); R1 = 5.0 % (m/v) BaCl
2.
2H
2
O
in 0.05% (m/v) polyvinylic alcohol (PVA); R2 = 0.3% (m/v) EDTA in 0.07 mol L
-1
NaOH; D
= detector (spectrophotometer , 410 nm); W = waste; L = sample loop (volume = 502 µL).
The values between parentheses are the flow rates (mL/min).
70
Figure 2
(a)
Determination of cell concentration by turbidimetry and microscopical count.
Samples
Neubauer Chamber (10
9
cells L
-1
) FIA System (10
9
cells L
-1
)
Organonew
®
0.897 ± 0.082
1
0.802 ± 0.017
Dona Benta
®
1.35 ± 0.06 1.37 ± 0.01
Fleischmman
®
dry 2.10 ± 0.13 2.05 ± 0.05
Fleischmman
®
wet 1.01 ± 0.23 1.11 ± 0.02
1
Values are showed with confidence interval
(b)
Screening of growth curve
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18
7,5
8,0
8,5
9,0
9,5
10,0
10,5
Log [Concentration of Saccharomyces cerevisiae]
Time (h)
Figure 2: Applications of method (a) market samples (b) Screening of growth curve
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