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Paulo César Tavares
AVALIAÇÃO DE PERIODONTOPATÓGENOS EM
AMOSTRA DE CONVENIÊNCIA DE JOVENS E
ADULTOS DA CIDADE DE ANÁPOLIS - GO
Dissertação apresentada para obtenção do
Título de Mestre pelo Programa de Pós-
graduação do Departamento de
Odontologia da Universidade de Taubaté.
Subárea de Concentração: Periodontia
Orientador: Prof. Dr. José Roberto Cortelli
Taubaté - SP
2006
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PERIODONTOPATÓGENOS EM AMOSTRA DE CONVENIÊNCIA DE JOVENS E ADULTOS
DA CIDADE DE ANÁPOLIS – GO
UNIVERSIDADE DE TAUBATÉ - TAUBATÉ, SP.
Data: _______________________________
Resultado: __________________________
.
COMISSÃO JULGADORA
Prof. Dr. ___________________________ INSTITUIÇÃO _____________
Assinatura __________________________
Prof. Dr. ____________________________ INSTITUIÇÃO _____________
Assinatura: __________________________
Prof. Dr. ___________________________ INSTITUIÇÃO______________
Assinatura: __________________________
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Dedico este trabalho a minha esposa Maria Cristina Landeiro Tavares e
minhas filhas Paula Landeiro Tavares e Bruna Landeiro Tavares que incentivaram-me,
apoiaram-me nos momentos difíceis nesta etapa de nossas vidas.
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AGRADECIMENTOS
A DEUS que me deu forças, amparo, saúde para concluir esta importante fase da
minha vida.
Aos meus pais Therezinha André Tavares e José Carlos Tavares Filho (“In memorian”)
de quem veio toda inspiração.
Ao Orientador Prof. Dr. José Roberto Cortelli pelo apoio e dedicação nos momentos em
que eu estava à deriva e pela orientação deste trabalho.
A Dra. Débora Pallos que se mostrou uma pessoa amiga, cordial e sempre disposta a
ajudar.
Ao meu amigo e irmão Marcus Vinícius Moreira de Castro pela ajuda em vários
momentos e pelo seu jeito de querer ajudar as pessoas sem pedir nada em troca.
Aos colegas de Mestrado em especial aos Periodontistas: Amilton, Juliano, Marcelo,
Mário e Paulo Marçal.
Aos funcionários da UNITAU, em especial, a Alessandra Borges Serra e Adriana
Pellogia pela competência e apoio neste Mestrado.
Ao técnico de laboratório Jonas de Carvalho Filho pela grande ajuda, a qual sem ela a
nossa pesquisa seria muito mais trabalhosa.
À Bibliotecária Maria Teresa Buono Vieira Osório pela revisão que tornou meu trabalho
adequado às normas.
5
TAVARES, P. C. Avaliação de periodontopatógenos em amostra de conveniência
de jovens e adultos da cidade de Anápolis – GO. 2006. 71f. Dissertação (Mestrado
em Odontologia) – Departamento de Odontologia, Universidade de Taubaté, Taubaté.
Resumo
O objetivo do presente estudo foi avaliar a presença de Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Campylobacter rectus, Eikenella corrodens, Porphyromonas
gingivalis e Tannerella forsythia por PCR em 30 indivíduos de 15 a 60 de idade (37,80
±11,83) numa amostra de conveniência da cidade de Anápolis-GO. Os dados
microbianos foram associados aos parâmetros clínicos dentais e periodontais incluindo
dentes perdidos (CPOD), Índices de Placa (IP) e Gengival (IG), Profundidade de
Sondagem (PS) e Nível Clínico de Inserção (NCI). A presença bacteriana foi avaliada
por ANOVA. PS, NCI, IP e IG pelo teste t de student. A prevalência isolada e em
conjunto (sulco, mucosa e língua) por ANOVA. O número de bactérias pelo teste t de
student. Gênero, faixa etária e hábito de fumar por Wilcoxon (p<0,05). Os resultados
mostraram que não houve diferença estatística dos parâmetros clínicos em relação ao
gênero, todavia, isto foi observado nos indivíduos acima de 37 anos em função do nível
clínico de inserção (NCI) ou deste mesmo parâmetro em relação ao habito de fumar. C.
rectus (97%), T. forsythia e A. actinomycetemcomitans (90%), E. corrodens (80%) e P.
gingivalis (37%). C. rectus e A. actinomycetemcomitans apresentaram maior
prevalência na mucosa em relação ao sulco e língua, e T. forsythia, E. corrodens e P.
gingivalis maior prevalência no sulco. P.gingivalis mostrou-se mais prevalente nos
indivíduos acima de 37 anos e com maior perda de inserção clínica (PIC). Após
avaliação dos resultados podemos concluir que o número de bactérias presentes foi
elevado existindo associação entre P. gingivalis com o fator idade e perda de inserção
clínica. Não houve distribuição uniforme entre os patógenos e o local da coleta.
Palavras-chave: bactéria, epidemiologia, reação em cadeia da polimerase, doença
periodontal.
6
TAVARES, P. C. Periodontopathogens assessment in a convenient sample of young
and adult subjects from Anápolis (Go), Brazil. 2006. 71f. Dissertação (Mestrado em
Odontologia) – Departamento de Odontologia, Universidade de Taubaté, Taubaté.
Abstract
The aim of this present survey was to evaluate the presence of Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Campylobacter rectus, Eikenella corrodens, Porphyromonas
gingivalis and Tannerella forsythia in 30 subjects from 15 to 60 (37.80 ±11.83) by
polymerase chain reaction (PCR). The aim population, like convenience sample, was
examined in Anápolis-GO. The study design was performed in clinical and microbial
associations, including decay, missing, filling teeth (DMFT), plaque index (PI), gingival
index (GI), periodontal pocket depth (PPD) and clinical attachment level (CAL). The
presence of microorganisms was evaluated by ANOVA. PI, GI, PPD and CAL by
student t test. Individual presence or pool (sulci, mucosas and tongue) of
microorganisms were consider by ANOVA. Student t test examined the number of
microorganisms and gender, aging and smoking by Wilcoxon (p<0.05). The results
showed that no statistically significant difference was observed according gender,
however, clinical attachment level (CAL) was significantly different when subjects
more that 37 years old or smoking were take in consideration. The results also showed
that the prevalence of microorganisms was: C. rectus (97%), T. forsythia and A.
actinomycetemcomitans (90%), E. corrodens (80%) and P. gingivalis (37%). The
microorganisms more prevalent in mucosa than sulci and tongue were C. rectus and A.
actinomycetemcomitans, and T. forsythia, E. corrodens and P. gingivalis more prevalent
in sulci. In subjects more than 37 years old or with clinical attachment loss P. gingivalis
showed more presence. In conclusion we consider that the number of bacteria were high
when P. gingivalis was considered aging and clinical attachment loss were more
observed. Finally, no pattern of distribution were observed relate to microorganisms and
sulci, mucosa and tongue.
Key words: bacteria, epidemiology, polymerase chain reaction, periodontal disease.
7
SUMÁRIO
Resumo
Abstract
Lista
1 Introdução
2 Revisão da Literatura
2.1 Características gerais das doenças periodontais
2.2 Epidemiologia das doenças periodontais
2.3 Microrganismos periodontais / características morfológicas
2.4 Presença de microrganismos e a doença periodontal
2.5 Histopatologia da doença periodontal
2.6 Identificação microbiana
3 Proposição
4 Material e Método
4.1 Coleta de dados
4.2 Inclusão e exclusão de participantes
4.3 Coleta de dados microbiológicos
4.4 Exame microbiológico
4.5 Procedimentos estatísticos
5 Resultados
6 Discussão
7 Conclusões
Referências
Apêndice
Anexo
5
6
8
10
11
11
12
14
16
20
21
26
27
27
27
28
28
30
32
42
49
50
59
70
8
LISTA DE FIGURAS
Figura 1 Associação de periodontopatógenos subgengival em indivíduos com
doença periodontal. Baseado em Haffajee e Socransky (1994)
19
Figura 2 Prevalência de periodontopatógenos detectados pela técnica da
PCR, de acordo com Ashimoto et al. (1996)
24
Figura 3 Microrganismos e primers específicos para a reação em cadeia da
polimerase (PCR), de acordo com Ávila-Campos; Velásquez-
Meléndez (2002)
30
Figura 4 Distribuição percentual da prevalência dos periodontopatógenos
avaliados no presente estudo
34
Figura 5 Distribuição percentual da prevalência de C. rectus em função do
local da coleta
35
Figura 6 Distribuição percentual da prevalência de T. forsythia em função do
local da coleta
36
Figura 7 Distribuição percentual da prevalência de E. corrodens em função
do local da coleta
36
Figura 8 Distribuição percentual da prevalência de A.
actinomycetemcomitans em função do local da coleta
37
Figura 9 Distribuição percentual da prevalência de P. gingivalis em função
do local da coleta
37
Figura 10 Distribuição percentual da detecção dos periodontopatógenos no
sulco, mucosa e língua
38
Figura 11 Distribuição numérica da ocorrência simultânea de
periodontopatógenos
38
Figura 12 Distribuição percentual da prevalência dos periodontopatógenos
avaliados em função do gênero
39
Figura 13 Distribuição percentual da prevalência dos periodontopatógenos
avaliados em função do hábito de fumar
40
Figura 14 Distribuição percentual da prevalência dos periodontopatógenos
avaliados em função da faixa etária
40
Figura 15 Distribuição percentual da prevalência dos periodontopatógenos
avaliados em função do nível do NCI
41
9
LISTA DE TABELAS
Tabela 1 População estudada de acordo com gênero e hábito de fumar 32
Tabela 2 Valores médios de Profundidade de Sondagem - PS (mm), Nível
Clínico de Inserção – NCI (mm), Índice de Placa – IP (0/1) e Índice
Gengival – IG (0/1), em função do gênero dos indivíduos
33
Tabela 3 Valores médios de Profundidade de Sondagem - PS (mm), Nível
Clínico de Inserção – NCI (mm), Índice de Placa – IP (0/1) e Índice
Gengival – IG (0/1), em função da faixa etária dos indivíduos
33
Tabela 4 Valores médios de Profundidade de Sondagem - PS (mm), Nível
Clínico de Inserção – NCI (mm), Índice de Placa – IP (0/1) e Índice
Gengival – IG (0/1), em função do hábito de fumar dos indivíduos
34
10
1 Introdução
A doença periodontal acomete um grande número de indivíduos em todo o
mundo. O fator etiológico principal desta doença é o biofilme dental, que promove uma
reação inflamatória dos tecidos periodontais de proteção (gengiva livre e inserida) e de
suporte (cemento, osso alveolar e ligamento periodontal), em decorrência de processo
infeccioso mediado por microrganismos (AMERICAN ACADEMY OF
PERIODONTOLOGY-AAP, 1996).
Costerton et al. (1994) propuseram uma organização para o biofilme dental,
cujas formações em “cogumelo”, denominadas micro colônias, formam uma unidade
estrutural composta por diferentes espécies bacterianas. Os microrganismos anaeróbios
estritos aparecem no interior da colônia, enquanto os aeróbios ficam na parte mais
superficial, onde há maior disponibilidade de oxigênio. Toda massa deve estar aderida a
uma superfície dura não descamativa. A matriz extracelular de polissacarídeos forma
um sistema circulatório interno que levam nutrientes e remove metabólitos de todo o
sistema.
Genco (1997) descreveu o biofilme dental como agregados de bactérias que se
ligam fortemente aos dentes e às superfícies bucais. Possui arquitetura microscópica
definida, com células bacterianas dispostas em agrupamentos ou colunas de micro
colônias e ainda células epiteliais e algumas células inflamatórias.
A avaliação da presença de periodontopatógenos numa população em geral se
justifica pela possibilidade de obtenção dos dados que, uma vez associados aos
diferentes parâmetros clínicos periodontais, como, por exemplo, avaliações de
profundidade de sondagem e do nível clínico de inserção, caracterizam o perfil
periodontal dos indivíduos e ainda estabelecem as necessidades terapêuticas ideais para
a manutenção de saúde periodontal. Assim, este estudo se propôs avaliar e associar
numa amostra de conveniência da população de Anápolis-GO algumas características
clínicas representadas pelos índices de placa e gengival, mensurações de profundidade
de sondagem e do nível clínico de inserção, e, microbianas, pela prevalência de A.
actinomycetemcomitans, C. rectus, E. corrodens, P. gingivalis e T. forsythia. Sabendo-
se que este estudo é inédito nesta região, ele contribuirá decisivamente na organização
de políticas de atendimento em saúde bucal do Município.
11
2 Revisão da Literatura
2.1 Características gerais das doenças periodontais
O termo “doença periodontal” refere-se à gengivite e à periodontite. Gengivite
é uma condição inflamatória dos tecidos moles (gengiva) que envolve os dentes e
representa uma resposta inflamatória em decorrência da presença de biofilme aderido às
superfícies dentais podendo ser modificada por fatores como fumo, certas drogas e
mudanças hormonais que ocorrem na puberdade e gravidez (KINANE, 2001).
As doenças periodontais constituem um grupo de doenças infecciosas,
associadas aos fatores etiológicos locais e sistêmicos. Dentre estes, o biofilme dental, é
considerado o principal fator local causal das doenças (LÖE; THEILADE; JENSEN,
1965; SOCRANSKY; HAFFAJEE, 2002).
Löe, Theilade e Jensen (1965) descreveram as várias fases relativamente
distintas da formação do biofilme dental com algumas variações temporais nos
diferentes dentes e indivíduos. A primeira fase num período dois dias quando se elimina
os métodos clássicos de higiene bucal, havendo proliferação de cocos e bastonetes
Gram positivos e um aumento de 30% de cocos e bastonetes Gram negativos. A
segunda fase, de dois a quatro dias é caracterizada pelo aparecimento e aumento do
número de fusobacterias e filamentos. A terceira fase, de quatro a nove dias, pelo
aparecimento de espiroquetas. Nesse momento, a gengivite passa a ser clinicamente
detectável.
A exposição do tecido gengival ao biofilme dental resulta na inflamação do
tecido, que manifesta sinais clínicos da gengivite. As características da gengivite são
alterações de cor e do contorno gengival, mudança da temperatura intra-sulcular,
aumento do exudato gengival, sangramento espontâneo ou provocado (MARIOTTI,
1999).
A periodontite é precedida por gengivite e isto implica que a prevenção da
gengivite é também uma medida de prevenção para a periodontite. As limitações do
tratamento mecânico no sentido para diminuir ou suprimir microrganismos
subgengivais sugerem a utilização de antimicrobianos locais ou sistêmicos para a
complementação do tratamento mecânico (DZINK; SOCRANSKY; HAFFAJEE, 1988).
O fator etiológico primário, o biofilme dental, pode ter seu acúmulo
aumentado pela presença de fatores locais que facilitam sua retenção. A gengivite
12
quando não tratada pode evoluir para periodontite crônica. As características clínicas da
periodontite crônica são: inflamação gengival, sangramento à sondagem, aumento na
profundidade de sondagem, perda de inserção clínica e conseqüente perda óssea
alveolar (KINANE; LINDHE, 1999).
A doença periodontal é a maior responsável pela perda de dentes em seres
humanos, devido à sua natureza crônica e indolor, desenvolvendo-se de forma gradativa
e assintomática. Somente nos últimos estágios, com bolsas profundas e mobilidade
dental, ela é percebida (MACHION et al., 2000).
A periodontite é definida como uma doença inflamatória dos tecidos de
suporte dos dentes, causada por microrganismos específicos, resultando em uma
destruição progressiva do ligamento periodontal e osso alveolar (NOVAK, 2004).
Apesar dos avanços relacionados à etiopatogenia das infecções periodontais, o
diagnóstico e a classificação dessas doenças, ainda hoje, baseiam-se, quase
inteiramente, na avaliação clínica e no exame radiográfico (LOTUFO; PANNUTI;
SARAIVA, 2001). O padrão de perda óssea pode ser vertical, quando a perda de
inserção e osso em superfície dental é maior do que acontece na superfície adjacente, ou
horizontal, quando a perda de inserção e osso progride a uma taxa uniforme na maioria
das superfícies dentais. Normalmente, a perda óssea vertical está associada a defeitos
ósseos angulares e formação de bolsas intra-ósseas. A perda óssea horizontal está
associada normalmente com bolsas supra-ósseas (NAGY; NOVAK, 2004).
2.2 Epidemiologia das doenças periodontais
Amostra de conveniência é uma amostra de conveniência para nós, ou seja,
uma amostra de indivíduos que procuraram a Associação Brasileira de Odontologia de
Anápolis-Goiás para tratamento odontológico.
Medronho em 2003 afirmou que estudos epidemiológicos baseiam-se na
caracterização de saúde/doença numa população, logo as condições periodontais de um
determinado grupo de indivíduos só pode ser determinado a partir do conhecimento
epidemiológico. Por definição epidemiologia é o estudo dos determinantes do processo
saúde-doença em grupos populacionais ou ainda o estudo da distribuição e dos
determinantes de condições relacionadas à saúde ou eventos em populações específicas.
Prevalência é a proporção de pessoas em uma população que tem uma doença
em um dado ponto ou período de tempo. É calculada dividindo-se o número de pessoas
13
na população que têm a doença pelo número total de pessoas da população
(GREENBERG, 1996).
Incidência é a porcentagem média de pessoas não afetadas que desenvolverão
uma doença durante determinado período de tempo. É calculada dividindo-se o número
de novos casos da doença pelo o número de pessoas sob o risco desta doença (ADDY et
al., 1994).
Estudos epidemiológicos são executados para investigar a prevalência e a
incidência de uma doença, os fatores de risco relacionados a ela, a efetividade e a
eficácia das intervenções (ARBES JR; BECK, 2004).
Os estudos observacionais mais comuns são os do tipo transversais ou também
chamados estudos seccionais ou de prevalência. Nos estudos transversais, a presença ou
ausência de doença e as características dos membros de uma população são verificadas
em um determinado momento (ARBES JR; BECK, 2004). Estudos transversais são
caracterizados pela observação direta de determinada população selecionada ao acaso
em uma oportunidade única. Os objetivos desse tipo de estudo estão relacionados com
indivíduos em determinadas épocas. E, esta mesma relação temporal entre causa e efeito
também constitui uma de suas principais limitações, pois, informações relativas ao
tempo passado dependem da memória do indivíduo. Em algumas situações esta
dependência pode determinar um viés de memória com risco de inviabilizar algumas
das hipóteses propostas. Por isso, nem sempre se consegue estabelecer com sucesso a
relação entre a doença e a exposição temporal aos fatores de risco (ARAÚJO;
CORTELLI, 2004).
Flores-de-Jacoby et al. (1991) realizaram um estudo das condições
periodontais na cidade do Rio de Janeiro com 1854 indivíduos de 15 a 67 anos de idade
por meio do Índice de Necessidade de Tratamento Periodontal das Comunidades
(INTPC / CPITN). A prevalência da doença periodontal avançada foi de 50% nos
indivíduos com mais de 50 anos de idade. Bolsas periodontais maiores do que 6 mm de
profundidade foram altamente prevalentes quando comparadas com dados Europeus.
Neste estudo não foi observada uma maior predileção da doença pelo fator gênero.
Em estudos realizados numa população gaúcha não tratada, em que foram
examinados 401 indivíduos adultos por meio do exame completo de perda de inserção
clínica, os autores observaram — para a faixa etária de 40 a 59 anos — 82,3% dos
participantes com periodontite, porém apenas 8,9% em grau avançado. Entretanto, a
partir dos 60 anos, 66,6% dos indivíduos apresentaram periodontite, sendo 26,7% o
14
percentual de indivíduos com doença avançada. Concluíram que, a prevalência e
gravidade da periodontite estavam diretamente proporcionais à idade até os 59 anos
(OPPERMANN; SILVA; BASSANI, 2000).
Albandar em 2002 constatou maior perda de inserção clínica e reabsorção
óssea nos indivíduos adultos quando comparados aos jovens. Associou o aumento da
idade com o aumento nos valores de perda de inserção clínica. Estes achados foram
confirmados por Locker, Slade e Murray (1998) considerando o fato de que, com o
aumento da idade aumenta proporcionalmente a chance de perda de inserção clínica,
pois aumenta a exposição de diferentes fatores ao longo do tempo.
Susin et al. (2004) avaliaram a perda de inserção clínica em adultos brasileiros
associando esta condição a fatores demográficos, comportamentais e de exposição numa
amostra representativa de 853 indivíduos de 30 a 103 anos de idade. Foram avaliados
seis sítios por dente e os resultados mostraram que 79% dos indivíduos apresentavam
perda de inserção clínica 12324425236721282449225222225252
apresentavam três vezes mais chances de apresentar perda de inserção clínica moderada
quando comparada com controles de 30 a 39 anos de idade. Indivíduos fumantes
destacaram-se como portadores de perda de inserção clínica moderada (risco
relativo=2,1) ou avançada (risco relativo=3,4) quando comparado a não fumantes. Os
autores concluíram que a população alvo apresentou alta ocorrência de perda de
inserção clínica.
2.3 Microrganismos periodontais / características morfológicas
A. actinomycetemcomitans é um bastonete pequeno, de terminação
arredondada, Gram-negativo, imóvel, capnofílico, catalase negativa, sacarolítico
(SOCRANSKY; HAFFAJEE, 1999). A. actinomycetemcomitans é um importante
periodontopatógeno que elabora um grande número de fatores de virulência tais como,
fator inibidor da quimiotaxia, fatores imunossupressores, fatores citotóxicos,
lipopolissacárides (LPS), colagenases, determinantes de resistência a antibióticos (VAN
DYKE et al., 1982). Helgeland e Nordby (1993) demonstraram que A.
actinomycetemcomitans é capaz de passar através das células epiteliais. Produz
leucotoxina, seu principal fator de virulência, que pode interferir no mecanismo de
defesa do hospedeiro, capaz de destruir principalmente polimorfos mononucleares
15
(PMN) e monócitos humanos (VAN DYKE et al., 1982; HIDALGO; ÁVILA-
CAMPOS; TREVISAN Jr., 1997).
A. actinomycetemcomitans é principalmente isolado de periodontite, podendo
ser encontrado em lesões de endocardite e diferentes infecções focais (SLOTS, 1997).
Porphyromonas gingivalis é um bastonete anaeróbio, não móvel,
assacarolítico, Gram-negativo. Esta bactéria tem apresentado uma atividade proteolítica
similar à tripsina, sendo assim BANA positivo (LOESCHE, 1992). P. gingivalis tem a
capacidade de elaborar várias enzimas proteolíticas que atuam na interface hospedeiro-
parasita, contribuindo na patogênese através da degradação dos tecidos dos hospedeiros
e na modulação de seus mecanismos de defesa (HAAKE; HUANG, 2004).
P. gingivalis depende da sua capacidade proteolítica (colagenase) de degradar
o colágeno (proteínas) em pequenos peptídeos que são assimilados e utilizados
metabolicamente na produção de energia e, ainda como fontes de carbono e nitrogênio.
As enzimas do P. gingivalis proteases mais conhecidas como gingipains, ocorrem de
múltiplas formas, encontradas extracelularmente ou na superfície da célula bacteriana.
Especificamente as gingipains agem nas ligações peptídicas, quebrando as proteínas
com formação de resíduos de arginina (arg-gingipains) ou resíduos de lisinas (Lis-
gingipains) (HAAKE; HUANG, 2004).
P. gingivalis produz uma variedade de fatores de virulência incluindo
lipopolissacárides (LPS) (MILLAR et al. 1986), fimbrias (YOSHIMURA et al., 1984).
Estes fatores são considerados a maior causa de destruição dos tecidos periodontais de
maneira indireta através de produção de citocinas pelas células inflamatórias
(HAMADA et al., 1988) e pelas células do tecido conjuntivo (TAKADA et al., 1991).
Por outro lado, apresentaram efeitos destrutivos diretos tais como citotoxicidade e
degradação da membrana do P. gingivalis (MATSUDA et al., 1996).
P. gingivalis é isolado freqüentemente de amostras bacterianas subgengivais
de indivíduos com diversas formas de doença periodontal (KLEIN; GONÇALVES,
2003).
Eikenella corrodens é um microrganismo Gram-negativo do tipo bastonete
com terminações rombas e regulares, anaeróbio facultativo, assacarolítico. Tem sido
reconhecido como patógeno em osteomielites (JOHNSON; PANKEY, 1976). Além
disso, esta bactéria foi observada mais frequentemente e em níveis elevados em sítios
ativos (DZINK et al. 1985). Ashimoto, et al. (1996) usando a técnica do PCR para
determinar a prevalência de vários microrganismos encontrou uma prevalência de 70%
16
desta bactéria em pacientes com periodontite avançada. Lopez, Melhado e Leighton
(1996) detectaram a presença deste patógeno em 80% de indivíduos diagnosticados com
periodontite de início precoce. Por outro lado, Moore et al. (1985) observaram E.
corrodens nas mesmas proporções, em indivíduos com gengivite ou em condições
periodontais saudáveis. E. corrodens foi observada mais freqüentemente em sítios de
destruição periodontal, quando comparado com sítios sadios (YUAN et al. 2001).
Tanerella forsythia, anteriormente denominada T. forsythensis, Bacteroides
forsythus, é um microrganismo fusiforme, Gram-negativo, estritamente anaeróbio, não
formador de esporos, imóvel, não fermentador de carboidratos. Foi encontrado
frequentemente em maior número em lesões periodontais ativas que em lesões inativas
(DZINK, SOCRANSKY; HAFFAJEE, 1988). Indivíduos que apresentavam este
microrganismo mostravam-se mais susceptíveis a perda óssea alveolar, perda de
inserção clínica e perda dental comparados com indivíduos onde a espécie não foi
detectada (MACHTEI et al., 1999). Esta bactéria tem apresentado uma atividade
proteolítica similar à tripsina, sendo assim BANA positivo (LOESCHE, 1992). Ishikura
(2003) demonstrou que a sialidase modifica uma variedade de atividades associada ao
hospedeiro que resulta na modificação da capacidade de resposta a infecção bacteriana
e poderia ser um importante fator de virulência do T. forsythia.
Portanto, pouco é
conhecido sobre este microrganismo. Foi o microrganismo mais presente (86%) usando
teste do PCR em doença periodontal avançada (ASHIMOTO et al., 1996). Este
microrganismo tem sido associado tanto à periodontite crônica quanto à agressiva
(SAKAMOTO et al., 2002).
Campylobacter rectus é um microrganismo anaeróbio, Gram-negativo, com
mobilidade, cujas células apresentam-se com extremidades arredondadas ou achatadas,
possuindo morfologias curvas, retas ou helicoidais. C. rectus ocorre em números
aumentados em indivíduos com periodontite crônica e, foram microrganismos mais
prevalentes em sítios com doença periodontal quando comparados a indivíduos
saudáveis (TEMPRO et al., 1997).
2.4 Presença de microrganismos e a doença periodontal
A cavidade bucal humana é habitada por mais de quinhentas espécies
bacterianas (PASTER, 2001). Enquanto a maioria são comensais, uma pequena parte
destas são patógenos oportunistas, podendo causar doença periodontal (SOCRANSKY;
17
HAFFAJEE, 1994). A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, P. intermedia, T.
forsythia e F. nucleatum foram as bactérias mais encontradas em portadores de
periodontite que em indivíduos sadios. São todos periodontopatógenos significantes
para doença periodontal crônica em adultos (VAN WINKELHOFF et al., 2002).
Microrganismos específicos têm sido associados às áreas de perda de inserção
clínica e aumento da idade (LISTGARTEN; LAI; YOUNG, 1993). Outros estudos
relacionam diferentes microrganismos como P. gingivalis, P. intermedia, e A.
actinomycetemcomitans à doença periodontal (DZINK; SOCRANSKY; HAFFAJEE,
1988).
Gmür, Strub e Guggenheim em 1989, descreveram uma forte relação entre T.
forsythia e P. gingivalis em amostras subgengivais em indivíduos adultos com
diferentes profundidades de sondagem. Ambas as espécies foram detectadas mais
freqüentemente e em maior número, em bolsas periodontais profundas.
Dois importantes estudos relataram associação entre bolsas periodontais e
presença de P. gingivalis, sugerindo seu papel na etiologia e progressão da doença
periodontal (SLOTS, 1986; TAKEUCHI et al., 2001). Socransky e Haffajee (1994)
relataram a ocorrência de T. forsythia em áreas de doença periodontal destrutiva.
De acordo com Socransky et al. (1988) T. forsythia e P. gingivalis aumentam
em prevalência e em número com o aumento da profundidade de sondagem. Além
disso, o complexo vermelho (P. gingivalis, T. forsythia, T. denticola) foi fortemente
associado com sangramento à sondagem. O interesse nos testes microbiológicos para
identificar periodontopatógenos é baseado nos dados que implicam vários
microrganismos subgengivais na patogênese da doença periodontal. Os principais
microrganismos ligados com lesões destrutivas periodontais são P. gingivalis, P.
intermedia, T. forsythia, A. actinomycetemcomitans e T. denticola (ZAMBON, 1996).
Uma grande proporção de doenças periodontais em progressão tem sido associada com
presença ou níveis elevados de duas espécies: P. gingivalis e T. forsythia
(SOCRANSKY; HAFFAJEE, 1994; ALPAGOT, 1996). A presença destes patógenos
específicos, combinados com outras características gerais — extensão das lesões, tipo
de tratamento e espaço de tempo entre as manutenções — pode indicar risco futuro para
a doença (HAFFAJEE; SOCRANSKY, 1994).
Dzink, Socransky e Haffajee (1988) concluíram que diferentes
microrganismos como P. gingivalis, P. intermedia, e A. actinomycetemcomitans estão
relacionados à doença periodontal. Portanto, o procedimento clínico deveria basear-se
18
na identificação e tratamento da infecção estabelecida, assim como na prevenção de sua
recorrência. O controle do biofilme poderia aumentar a eficiência do tratamento
(LOTUFO; PANNUTI; SARAIVA, 2001).
Rodenburg et al. (1990) estudaram 242 indivíduos incluindo 138 com
periodontite avançada não tratada e 104 com sítios de doença periodontal refratária ao
tratamento clínico, onde avaliaram a ocorrência de A. actinomycetemcomitans, P.
gingivalis e P. intermedia em amostras subgengivais de lesões periodontais. Dos não
tratados, 97% apresentaram uma ou mais das espécies estudadas. Neste grupo, a
ocorrência de A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis e P. intermedia foi 54%, 48% e
63%, respectivamente. A ocorrência de A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis e P.
intermedia no grupo com sítios de doença periodontal refratária ao tratamento foi de
55%, 27% e 59%, respectivamente. Uma diferença estatisticamente significante na
prevalência do P. gingivalis foi entre os não tratados e aqueles sítios de doença
periodontal refratária ao tratamento clínico. Nos dois grupos a proporção de A.
actinomycetemcomitans foi estatisticamente significante em indivíduos com esta
bactéria como único microrganismo indicador em comparação com os infectados com
A. actinomycetemcomitans juntos com espécies de P. gingivalis e P. intermedia.
Haffajee e Socransky (1994) associaram o biofilme dental com a progressão
da doença periodontal. Espécies como A. actinomycetemcomitans, T. forsythia, C.
rectus, E. corrodens, P. gingivalis, P. intermedia, F. nucleatum, e T. denticola têm sido,
dentre centenas presentes no ambiente subgengival, relacionadas às doenças
periodontais com diversos graus de associação (Figura1).
Zambon (1996) sugeriu que a T. forsythia e P. gingivalis são fortemente
associadas com a patogênese da periodontite, perda de tecido conjuntivo e reabsorção
severa do osso alveolar.
Tran et al. (2001) fizeram um estudo longitudinal num grupo de 205
indivíduos com baixa prevalência e com periodontite crônica avançada e acompanharam
mudanças microbiológicas no desenvolvimento da periodontite. Estes indivíduos tinham
visitado seus dentistas para exame e profilaxia nos últimos seis meses, e participavam
de um programa de manutenção. Noventa e seis por cento relataram escovarem os
dentes pelo menos uma vez por dia e quarenta por cento usavam fio dental. Foi coletado
biofilme subgengival das superfícies proximais do sextante posterior de seis em seis
meses por dois anos. Todas as amostras analisadas apresentaram A.
actinomycetemcomitans, T. forsythia e P. gingivalis. Os indivíduos tinham alta
19
prevalência desses três periodontopatógenos. A presença de uma dessas três espécies
poderia prever uma futura perda de inserção na área específica. Portanto, indivíduos
com presença persistente de T. forsythia em qualquer área em todas as visitas tinham 5,3
vezes maior chance de ter pelo menos uma área na boca perdendo inserção comparando
com indivíduos com ocasional ou nenhuma presença de T. forsythia. Concluíram que a
persistência de T. forsythia indica indivíduos com alto risco, porém não necessariamente
sítios específicos com perda de inserção.
+ + + + + + +
+ +
Sob
Investigação
A. actinomycetemcomitans
P. Gingivalis
T. forsythia
P. intermedia
T. denticola
S. intermedius
P. negresens
M. micros
F. nucleatum
C. rectus
E. corrodens
Selenomonas spp.
Enterobacterias
Pseudomonas spp.
Staphylococcus spp.
D. pneumosintes
Figura 1 - Associação de periodontopatógenos subgengival em indivíduos com doença
periodontal. Baseado em Haffajee e Socransky (1994).
+ + + + - Muito forte
+ + + - Forte
+ + - Moderada
López et al. (2004) avaliaram uma associação entre raça/etnia e a composição
da microbiota subgengival encontrada na periodontite crônica. Um estudo foi executado
para determinar as características da microbiota subgengival da periodontite crônica de
chilenos residentes em Santiago do Chile. Vinte e seis indivíduos foram selecionados
(média de idade 47 ± 7 anos) com periodontite crônica, média de profundidade de
sondagem 2,63 ± 0,5 mm, média de perda clínica de inserção 3,70 ± 0,77 mm, e com
história de terapia periodontal. Amostras de biofilme dental subgengival foram colhidas
da face mesial de todos os dentes e avaliado pela presença, nível de infestação, e
proporção de 40 bactérias usando sonda de ácido desoxirribonucléico (DNA) e
checkerboard DNA-DNA hibridization. Dados microbianos dos Chilenos foram
comparados com dados de 115 indivíduos de Americanos com periodontite crônica. Os
resultados mostraram que cada bactéria testada estava presente pelo menos em 25 dos
26 indivíduos, e 12 indivíduos (46,1%) tinham as 40 bactérias. Todas as espécies
testadas estavam presentes em mais de 75% dos locais, e 25 espécies presentes em 90 %
20
ou mais dos locais incluindo espécies colonizadas em lesões periodontais avançadas.
Dezesseis das quarenta bactérias foram significantemente diferentes entre chilenos e
americanos. Complexos vermelhos, amarelos e outros complexos foram
significantemente maiores em chilenos, e Actinomyces foram maiores nos americanos.
Os autores concluíram que composição do biofilme dental subgengival foi diferente
entre indivíduos de países diferentes. Assim, cuidados devem ser tomados quando
extrapolamos os achados de um estudo para diferentes grupos étnicos.
Cortelli et al. (2005) avaliaram a presença de A. actinomycetemcomitans (de
máxima e mínima leucotoxicidade) e P. gingivalis em 25 indivíduos diagnosticados
com periodontite agressiva e em 178 com periodontite crônica. Os resultados mostraram
que o número de indivíduos que alocaram P. gingivalis foi similar a de outras
populações latino-americanas e A. actinomycetemcomitans de máxima leucotoxicidade
foi maior na população estudada quando comparada a outras populações e esteve
associada ao diagnóstico de periodontite agressiva e a bolsas periodontais maiores do
que seis mm de profundidade. Os autores concluíram que existe diferença na
prevalência de alguns periodontopatógenos entre populações e A.
actinomycetemcomitans de máxima leucotoxicidade esteve associada com bolsas
periodontais profundas.
2.5 Histopatologia da doença periodontal
Microrganismos periodontais produzem uma variedade de enzimas e toxinas
que iniciam o processo inflamatório e o conseqüente dano aos tecidos periodontais.
Suas enzimas provocam um colapso nas substâncias extracelulares tais como colágeno e
nas membranas das células do hospedeiro a fim de produzir nutrientes para o seu
crescimento. Muitas das superfícies das moléculas de proteínas das bactérias são
capazes de estimularem uma resposta imune do hospedeiro e também são capazes de
criarem inflamação local do tecido (DARVEAU; TANNER; PAGE, 1997). Portanto, os
microrganismos danificam os tecidos do hospedeiro, estimulam respostas inflamatórias
e imunes, mas seus principais objetivos são: multiplicar, crescer, e sobreviver no
interior das bolsas periodontais. Uma vez iniciados estes processos inflamatórios e
imunes, várias moléculas inflamatórias tais como proteases, citocinas, prostaglandinas e
enzimas do hospedeiro são liberadas dos leucócitos e fibroblastos ou das células
estruturais dos tecidos (GEMMELL; MARSHALL; SEYMOUR, 1997). As proteases
21
tendem a quebrar a estrutura do colágeno e assim, criar espaços para promover
infiltração de leucócitos. O colapso do tecido procede largamente sob controle do
hospedeiro. Tecidos periodontais tornam-se frouxamente aderidos à superfície dental.
Na periodontite, como o tecido conjuntivo é destruído, as células epiteliais proliferam
apicalmente junto à superfície da raiz e a bolsa torna-se mais profunda. Com o aumento
na profundidade da bolsa periodontal, ocorre então aumento no infiltrado inflamatório
do tecido. O acúmulo de biofilme dental subgengival aumenta e, além disso, existe um
aumento da densidade microbiana para promover a destruição dos tecidos periodontais.
Em bolsas profundas, a microbiota torna-se mais anaeróbia e a resposta do hospedeiro
torna-se mais destrutiva e crônica. Eventualmente, a lesão periodontal progride de tal
extensão que a perda dental torna-se inevitável (KINANE, 2001).
Para colonizar áreas subgengivais, microrganismos devem ser capazes de: se
fixar-se aos tecidos periodontais, multiplicar-se, competirem com outros
microrganismos, e ainda neutralizar os mecanismos de defesa do hospedeiro.
Substâncias do fluido gengival ajudam a prevenir a colonização e podem bloquear a
ligação das células bacterianas ao dente e superfícies teciduais. Alguns constituintes da
saliva e do fluido gengival podem precipitar bactérias e matá-las (KINANE, 2001).
2.6 Identificação microbiana
Na literatura encontramos várias técnicas de detecção bacteriana. Microscopia,
culturas, testes enzimáticos, teste imunológicos, sondas de DNA, e reação em cadeia da
polimerase (PCR) estão entre as mais utilizadas. Cada uma destas metodologias
apresenta limitações, vantagens e desvantagens (LOTUFO; PANNUTI; SARAIVA,
2001). Savitt et al. (1988) compararam os métodos de cultura e análise de sonda de
DNA para detectar A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, e P. intermedia em
amostras de biofilme dental subgengival. As amostras foram coletadas de áreas
gengivais de pacientes diagnosticados como saudáveis, com evidência de gengivite,
periodontite agressiva ou periodontite crônica. O número desses patógenos foi
determinado usando meios microbiológicos e testes bioquímicos. Os resultados foram
então comparados aos números obtidos da análise de sonda de DNA espécie específica.
Em sessenta amostras do grupo de doentes, análise de sonda DNA demonstrou 100% de
efetividade na detecção do A. actinomycetemcomitans e P. intermedia, além de 91% de
na detecção do P. gingivalis. Os testes de sonda do DNA frequentemente identificaram
22
esses patógenos em amostras que foram negativas na cultura. Os resultados sugerem
que tecnologicamente a análise de sonda de DNA é superior ao método de cultura para a
detecção do A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, e P. intermedia em biofilme
subgengival de humanos.
Técnicas de culturas de bactérias tem sido o método clássico para detecção de
microrganismos envolvidos na doença periodontal. Porém, esta técnica envolve
procedimentos que podem ser inadequados para o crescimento de algumas bactérias
anaeróbias. Este método requer que amostras sejam imediatamente processadas para
aquisição máxima de bactérias sobreviventes. O método é muito trabalhoso e só pode
identificar microrganismos junto com testes bioquímicos tais como fermentação de
açúcar e análises da atividade enzimática bacteriana (SAVITT et al., 1988). Métodos de
cultura anaeróbia são usados para detectar a maioria dos microrganismos do biofilme
dental subgengival e determinar in vitro a susceptibilidade antimicrobiana de
microrganismos bucais. Por outro lado, o método de cultura pode apresentar nível
reduzido de sensibilidade na detecção de alguns patógenos (BOUTAGA et al., 2003) e a
impossibilidade de cultivo de alguns patógenos como a T. forsythia e a demora na
obtenção dos resultados (SAKAMOTO et al., 2002; LOOMER, 2004).
As vantagens da cultura são: possibilita contagens relativas e absolutas das
espécies e capacidade de avaliar a susceptibilidade a antibióticos (SOCRANSKY et al.,
1987). As desvantagens são: 1- crescimento só de bactérias viáveis; 2- rigorosa
amostragem; 3- necessidade de condições adequadas de transporte; 4- a sensibilidade da
cultura bacteriana pode ser baixa; 5- requer equipamento específico; 6- requer pessoal
experiente; 7- é relativamente caro e demorado (SANZ et al., 2004).
Testes enzimáticos foram desenvolvidos para detectar bactérias que possuem a
enzimas tripsina tais como T. forsythia, T. denticola e P.gingivalis. Quando uma
amostra de placa que contém qualquer combinação dessas bactérias é colocado numa
tira de papel impregnado com um substrato incolor N-benzoil-DL-arginine-2-
naphthyamide (BANA), o substrato de BANA quebra e produz uma cor que vai do azul
até a cor preta, cuja intensidade é proporcional ao total da quantidade dos três
microrganismos. Este teste é incapaz de avaliar a proporção das três bactérias e nem
identificar a presença de outros microrganismos (LOOMER, 2004). A simplicidade,
rapidez da resposta e a facilidade de leitura usada fazem deste método de diagnóstico
enzimático ideal para uso clínico. A falta de provas clínicas apropriadas para validar a
utilidade de seu diagnóstico e seus problemas intrínsecos considerando baixa
23
sensibilidade (Evalusite®) e baixa especificidade (Perioscan®) fé-lo desaparecer do
mercado (SANZ et al. 2004).
Os testes imunológicos que usam anticorpos que reconhece antígenos
bacterianos específicos e a identificação destas reações específicas antígeno-anticorpo
permitem detecção de microrganismos alvos (SANZ et al. 2004). Vários testes estão
disponíveis comercialmente, incluindo a imunofluorescência microscópica direta e
indireta, Enzime-linked imumunosorbent assay (ELISA), teste de aglutinação do látex,
citofluorografia. O método tem muitas vantagens importantes incluindo baixo custo,
mas não permitem avaliação da sensibilidade antibiótica dos microrganismos
(LOOMER, 2004).
O teste do ácido nucléico consiste da seqüência do ácido nucléico que são
classificados com um marcador colorimétrico radioativo ou enzimático que liga nas
seqüências do ácido nucléico do microrganismo correspondente. Este teste pode ser
todo genoma, seqüências aleatoriamente clonadas do ácido nucléico ou
oligonucleotídios sintéticos. Dos três o teste oligonucleotídio é que tem a maior
especificidade e a mais baixa reatividade cruzada por que eles especificam genes alvos
para uma espécie bacteriana. É usado para a análise microbiana do biofilme que foi
confirmado ter maior sensibilidade que métodos de culturas. Além disso, a vantagem
deste teste é que após a coleta das amostras do biofilme não é necessário ser processada
imediatamente (LOOMER, 2004).
Métodos moleculares são largamente utilizados para identificação de amostras
bacterianas. A reação em cadeia da polimerase (PCR) tem sido largamente utilizada na
área biológica. De janeiro de 1994 a janeiro de 2006 mais de 189 mil artigos publicados
utilizando esta ferramenta como meio de pesquisa (NCBI 2 , 2006). Em
odontologia, e especialmente na periodontia, a PCR tem sido usada para identificação
de periodontopatógenos em espécies subgengivais (SLOTS; ASHIMOTO; FLYNN,
1995) e para desvendar o papel das bactérias específicas na doença periodontal devido à
detecção precisa de espécies. A PCR permite também a replicação de várias cópias do
DNA (LOOMER, 2004).
Desde 1990, o teste da reação em cadeia da polimerase tem sido usado com
alto nível de sensibilidade e tem sido de grande sucesso para identificar
periodontopatógenos de biofilme subgengival ((WATANABE; FROMMEL, 1993;
SLOTS; ASHIMOTO; FLYNN, 1995; ASHIMOTO et al., 1996; KLEIN;
GONÇALVES, 2003; LOOMER, 2004).
24
Sanz et al. em 2004, estudando métodos de detecção de microrganismos
afirmaram que não existe um único método de diagnóstico microbiológico que
demonstra característica ideal e que a escolha de teste deve basear: 1- na sensibilidade e
na especificidade; 2- na disponibilidade e no custo; A técnica de cultura é capaz de
estudar susceptibilidade antimicrobiana e as técnicas moleculares podem permitir
detecção de bactérias não cultiváveis. Cultura bacteriana ainda é o gold standart.
Contudo, avanços na tecnologia PCR quantitativo pode ter um importante papel no
futuro, uma vez que isto tem sido totalmente validado com processos clínicos bem
projetados e seus custos tem sido reduzido com mais tecnologia disponível.
Riggio et al. (1996) comparando métodos de culturas e PCR concluíram que a
PCR é um método mais preciso que os métodos de culturas para a identificação dos
periodontopatógenos A. actinomycetemcomitans e P. gingivalis.
Ashimoto, et al. (1996) usaram esta técnica para determinar a prevalência do
A. actinomycetemcomitans, T. forsythia, C. rectus, E. corrodens, P. gingivalis, P.
intermedia. P. nigrescens e T. denticola em amostras subgengivais de 50 indivíduos
com periodontite avançada, 50 indivíduos com gengivite em adulto e 50 indivíduos com
gengivite em crianças (Figura 2).
Periodontite
avançada
Gengivite em
adulto
Gengivite em
crianças
Actinobacillus
actinoyicetemcomitans
30%
14%
14%
Tannerella forsythia
86%
18%
8%
Campylobacter rectus
74%
52%
78%
Porphyromonas gingivalis
74%
10%
14%
Prevotella intermedia
58%
12%
18%
Prevotella nigrescens
52%
20%
22%
Treponema denticola
54%
16%
16%
Eikenela corrodens
70%
10%
14%
Figura 2 - Prevalência de periodontopatógenos detectados pela técnica da PCR, de
acordo com Ashimoto et al. (1996).
Klein e Gonçalves (2003) estudaram a prevalência de T. forsythia e P.
25
gingivalis em amostra de biofilme dental subgengival utilizando a reação em cadeia da
polimerase e estabeleceram a relação dessas bactérias com doença e saúde periodontal.
Indivíduos foram distribuídos em três grupos de acordo com seu diagnóstico
periodontal: grupo 1, periodontalmente sadio (n=10); grupo 2, periodontite com
profundidade de sondagem 2 5 mm (n=10); grupo 3, periodontite com profundidade de
sondagem > 5 mm (n=10). Indivíduos dos grupos 2 e 3 tinham locais de saúde e doença
periodontal. Amostras de biofilme subgengival foram obtidas com pontas de papel
absorventes esterilizadas inseridas dentro das bolsas periodontais (áreas com
periodontite) e dentro do sulco gengival saudável do mesmo indivíduo. T. forsythia não
foi detectada em nenhuma amostra de locais saudáveis em nenhum grupo. P. gingivalis
foi detectado em somente uma amostra de uma área saudável (grupo 2). Os resultados
indicaram uma possível associação entre doença periodontal e prevalência de T.
forsythia e/ou P. gingivalis.
26
3 Proposição
O objetivo do presente estudo foi de avaliar a presença de Actinobacillus
actinomycetemcomitans, Campylobacter rectus, Eikenella corrodens, Porphyromonas
gingivalis, e Tannerella forsythia em indivíduos jovens e adultos provenientes de uma
amostra de conveniência da população de Anápolis-GO.
27
4 Material e método
Este estudo do tipo transversal examinou indivíduos jovens e adultos de
uma amostra de conveniência dos habitantes da cidade de Anápolis-GO. O presente
trabalho avaliou 30 indivíduos selecionados aleatoriamente de uma amostra original
de 250 indivíduos conjuntamente examinados sob aspectos clínicos periodontais.
No presente estudo adotou-se o critério aleatório estabelecendo-se como método a
escolha de um exame microbiano de dentes previamente selecionados para cada oito
indivíduos avaliados clinicamente. Os dados microbianos foram confrontados com
parâmetros clínicos periodontais incluindo índices de placa e gengival dicotômico
(0/1), profundidade de sondagem e nível clínico de inserção.
4.1 Coleta de dados
Foi inicialmente explicado o tipo de estudo desenvolvido (Anexo A) e em
seguida os participantes assinaram o Termo de Consentimento Livre e Esclarecido
(TECLE) (Anexo B). Todos os sujeitos da pesquisa responderam a um questionário
de anamnese (história médico-odontológica, hábitos e comportamentos, além de
características demográficas) (Anexo C). Após estes procedimentos foram
submetidos aos exames clínicos odontológicos, feito por um examinador
previamente treinado e calibrado.
4.2 Inclusão e exclusão de participantes
Após a seleção dos indivíduos recrutados dentre aqueles que têm inscrição nas
clínicas odontológicas da ABO-Anápolis-GO, os indivíduos incluídos no presente
estudo foram aqueles que se apresentaram com as seguintes características:
1) Idade superior a 15 anos,
2) Indivíduos indicados para tratamento odontológico na Associação Brasileira de
Odontologia de Anápolis – Go.
3) Disponibilidade para o exame no dia e horário, indicados pelo funcionário da
clínica responsável pela marcação das consultas,
Os indivíduos que apresentaram problemas renais ou diálise, tomavam
medicamentos anticoagulantes — exceto aspirina — hemofílicos ou ainda que
28
foram informados (as) por profissionais de saúde que não deveriam se submeter ao
exame ou tratamento odontológico foram excluídos do experimento, bem como, os
indivíduos submetidos a antibioticoterapia sistêmica três meses antes do início do
estudo.
4.3 Coleta de dados microbiológicos
O responsável pelo estudo foi previamente treinado e calibrado para a
coleta microbiana na clínica de graduação da Faculdade de Odontologia de
GURUPI. O mesmo recebeu um treinamento específico em técnicas de reação em
cadeia da polimerase no Laboratório de Biologia Molecular do Instituto Básico de
Biociências da UNITAU. A calibração clínica intra-examinador foi baseada em
Araujo et al. (2003) usando o teste estatístico EPM (erro padrão da medida), e tendo
um examinador padrão como referência.
4.4 Exame microbiológico
Após a realização dos exames clínicos periodontais na amostra original,
foram coletadas amostras bacterianas do sulco/bolsa gengival das faces mésio-
vestibulares dos dentes 16, 14, 12, 21, 24, 26, 36, 34, 32, 41, 44 e 46 para avaliar a
presença dos microrganismos A. actinomycetemcomitans, P. gingivalis, E.
corrodens, C. rectus e, T. forsythia.
Procedimentos: após isolamento relativo com roletes de gaze esterilizada e
remoção do biofilme/placa dental supragengival, um cone de papel número 30
(Dentsply®) foi inserido no sulco/bolsa gengival dos dentes selecionados onde foi
mantido por 60 segundos. Coletamos também amostras da bochecha e dorso da
língua com swab estéril. Em seguida, os cones de papel, bem como os swabs foram
agrupados de acordo com o arco dentário, superior ou inferior, dorso da língua e
bochecha e colocados em micro tubo contendo 1mL de solução de Ringer reduzida
e estocados a –4
o
C. O DNA das amostras foi isolado utilizando-se matriz comercial
de purificação (Instagene, BioRad®) e estocado a -20
o
C até o processamento.
As amostras bacterianas foram processadas no Laboratório de Biologia
Molecular do Instituto Básico de Biociências da UNITAU. Inicialmente realizou a
29
homogeneização do material contido nos micro tubos em agitador mecânico
(Vortex, Phoenix, AP56) por sessenta segundos. Com o auxílio de micropipetas
(Eppendorf) 0,5 mL da amostra original foi removida de cada micro tubo e
utilizando-se outro micro tubo foi adicionado 0,5 mL de água destilada, perfazendo
um total de 1,0 mL. Este material foi então centrifugado por 4690 x g por três
minutos em microcentrífuga (Sanyo®). A partir de então o sobrenadante foi
cuidadosamente removido deixando de 0,2 a 0,3 mL no fundo do micro tubo para
não desorganizar o pellet. Adicionou-se 0,2 mL da matriz Instagene (Bio-Rad),
matriz de extração e purificação de DNA, incubando a 56
o
C em banho-maria
(Quimis) por 30 minutos. Em seguida, o material foi novamente homogeneizado
(15 seg.) e então mantido por oito minutos em banho-maria à temperatura de 100ºC.
O material foi novamente homogeneizado (15 seg.) e centrifugado por três minutos
a 4690 x g.
Após a extração do DNA, utilizou-se oligonucleotídeo iniciador (primer)
para a proteína β-actina humana com auxílio do termociclador Mastercycler
Gradient (Eppendorf).
Em seguida, a confirmação da extração do DNA as amostras foram
amplificadas por primers específicos (Figura 3) de acordo com Ávila-Campos;
Velásquez-Meléndez, 2002.
Depois do procedimento de amplificação a detecção do produto da PCR
foi realizada por eletroforese (Horizon® 11-14) em gel de agarose a 1%, contendo
40 mL de solução tamponada e 0,40g de agarose, visualizado à luz ultravioleta pela
adição de brometo de etídio (30µL) como corante fluorescente. Os géis obtidos
foram fotografados e analisados em comparação aos produtos amplificados de cepas
padrão cedido pelo Instituto Fio Cruz, RJ.
30
Microrganismo Primer
A. Actinomycetemcomitans GCTAATACCGCGTAGAGTCGG
ATTTCACACCTCACTTAAAGGT
P. gingivalis
AGGCAGCTTGCCATACTGCG
ACTGTTAGCAACTACCGATGT
Eikenella corrodens
CTAATACCGCATACGTCCTAAG
CTACTAAGCAATCAAGTTGCCC
T. forsythia
GCGTATGTAACCTGCCCGCA
TGCTTCAGTGTCAGTTACACCT
C. rectus
TTTCGGAGCGTAAACTCCTTTTC
TTTCTGCAAGCAGACACTCTT
Controle Beta-actina CGTGACATAAAGAGAAGCTGTGC
ATCAAGATCATTGCTCCTCCTGAG
Figura 3 - Microrganismos e primers específicos para a reação em cadeia da
polimerase (PCR), de acordo com Ávila-Campos e Velásquez-Meléndez (2002)
4.5 Procedimentos estatísticos
Coleta e tabulação dos dados: A coleta de dados seguiu as seguintes etapas:
1) Determinação da amostra e recrutamento dos participantes,
2) Codificação dos arquivos. Para isso usamos o número de prontuário, para
manter a identidade dos indivíduos em sigilo,
3) Codificação das fichas de diagnóstico, considerando-se as variáveis de
interesse. Um livro código foi elaborado para que os dados das fichas sejam tabulados
de forma que o sigilo seja mantido,
4) Formulação de uma base de dados com variáveis referentes aos dados
encontrados no questionário e nas fichas de exame odontológico,
5) Tabulação dos dados,
6) Formulação da base analítica dos dados.
Análise estatística: A associação entre a presença dos diferentes patógenos
examinados foi realizada por Análise de Variância (ANOVA). Os parâmetros
periodontais, PS, NCI, IP e IG foram avaliados pelo teste t de student. A prevalência
bacteriana avaliadas isoladamente ou em conjunto na dependência do sítio de coleta
31
(sulco, mucosa e língua) foram avaliadas por ANOVA. A avaliação da ocorrência do
número de bactérias de zero a cinco simultâneas foi feita pelo teste t de student.
Finalmente o gênero, faixa etária e hábito de fumar foram avaliados pelo teste de
Wilcoxon. Para esta análise levou-se em consideração a significância de 95%.
32
5 Resultados
A distribuição da população estudada, em função do gênero e hábito de fumar
está expressa na tabela 1.
A média dos valores de PS, NCI, IP e IG dos indivíduos de acordo com o
gênero, faixa etária e hábito de fumar estão expressos respectivamente nas tabelas 2, 3 e
4. Foi observada diferença estatisticamente significativa para NCI em função da faixa
etária (Tabela 3) e hábito de fumar (Tabela 4), onde os indivíduos fumantes e com
maior faixa etária apresentaram maiores valores médios de NCI. O Gênero não
apresentou interferência em nenhum dos parâmetros periodontais avaliados (p<0,05).
Tabela 1 – População estudada de acordo com gênero e hábito de fumar
Fumante
(Média idade ± DP)
Não Fumante
(Média idade ± DP)
Total
(Média idade ± DP)
Masculino 4
(38,78±9,25)
6
(38,09±11,24)
10
(37,40±14,98)
Feminino 3
(39,03±8,98)
17
(37,72±7,99)
20
(38,31±10,36)
Total 7
(39,29±10,83)
23
(37,35±12,32)
30
(37,80±11,83)
DP – Desvio padrão
33
Tabela 2 – Valores médios de Profundidade de Sondagem - PS (mm), Nível Clínico de
Inserção – NCI (mm), Índice de Placa – IP (0/1) e Índice Gengival – IG (0/1), em
função do gênero dos indivíduos
PS
(Média ± DP)
NCI
(Média ± DP)
IP
(Média ± DP)
IG
(Média ± DP)
Masculino 2,51
± 0,68
2,96
± 1,13
0,84
± 0,21
0,54
± 0,28
Feminino 2,52
± 0,54
2,53
± 0,81
0,86
± 0,16
0,74
± 0,50
TOTAL 2,52
± 0,58
2,67
± 0,93
0,85
± 0,17
0,69
± 0,45
DP – Desvio padrão;
Tabela 3 – Valores médios de Profundidade de Sondagem - PS (mm), Nível Clínico de
Inserção – NCI (mm), Índice de Placa – IP (0/1) e Índice Gengival – IG (0/1), em
função da faixa etária dos indivíduos
PS
(Média ± DP)
NCI
(Média ± DP)
IP
(Média ± DP)
IG
(Média ± DP)
282 2,34
± 0,60
2,21
± 0,89
0,85
± 0,16
0,59
± 0,21
> 37 anos 2,70
± 0,52
3,13
± 0,74
0,86
± 0,19
0,80
± 0,59
TOTAL 2,52
± 0,58
2,67
± 0,93
0,85
± 0,17
0,69
± 0,45
DP – Desvio padrão; * - Diferença estatisticamente significativa (p<0,05)
*
34
Tabela 4 – Valores médios de Profundidade de Sondagem - PS (mm), Nível Clínico de
Inserção – NCI (mm), Índice de Placa – IP (0/1) e Índice Gengival – IG (0/1), em
função do hábito de fumar dos indivíduos
PS
(Média ± DP)
NCI
(Média ± DP)
IP
(Média ± DP)
IG
(Média ± DP)
Fumante 2,59
± 0,68
3,14
± 1,03
0,96
± 0,06
0,73
± 0,20
Não
Fumante
2,49
± 0,54
2,53
± 0,85
0,82
± 0,80
0,68
± 0,50
TOTAL 2,52
± 0,58
2,67
± 0,93
0,85
± 0,17
0,69
± 0,45
DP – Desvio padrão; * - Diferença estatisticamente significativa (p<0,05)
A leitura dos géis de agarose mostrou que, independente do local de coleta, no
total de indivíduos avaliados, C. rectus apresentou a maior (p<0,05) prevalência (97%)
entre os periodontopatógenos pesquisados, seguido por T. forsythia (90%) e A.
actinomycetemcomitans (90%), depois E. corrodens (80%) e finalmente P. gingivalis
(37%) (Figura 4).
Figura 4 – Distribuição percentual da prevalência dos periodontopatógenos avaliados no
presente estudo
Diferença estatisticamente significativa (p<0,05): Escala de diferença:
> > >
20
40
60
80
100
Cr
Tf
Ec
Aa
Pg
*
35
Foi realizada uma avaliação da prevalência dos periodontopatógenos em função
do local da coleta (Figuras 4, 5, 6, 7, 8 e 9).
C. rectus (Figura 5) e A. actinomycetemcomitans (Figura 8) apresentaram maior
prevalência (p<0,05) na mucosa em comparação ao sulco e língua. Para T. forsythia
(Figura 6), e P. gingivalis (Figura 9) a maior (p<0,05) prevalência foi observada no
sulco. E. corrodens (Figura 7) a maior (p<0,05) prevalência foi observada no sulco e
língua.
Figura 5 – Distribuição percentual da prevalência de C. rectus em função do local da
coleta língua
0
20
40
60
80
100
SULCO MUCOSA
LíNGUA
TOTAL
Diferença estatisticamente significativa (p<0,05): Escala de diferença: >
36
Figura 6 – Distribuição percentual da prevalência de T. forsythia em função do local da
coleta
Diferença estatisticamente significativa (p<0,05): Escala de diferença: >
Figura 7 – Distribuição percentual da prevalência de E. corrodens em função do local
da coleta
Diferença estatisticamente significativa (p<0,05): Escala de diferença: >
0
20
40
60
80
100
SULCO MUCOSA
LÍNGUA TOTAL
0
20
40
60
80
100
SULCO MUCOSA
LÍNGUA TOTAL
37
Figura 8 – Distribuição percentual da prevalência de A. actinomycetemcomitans em
função do local da coleta
Diferença estatisticamente significativa (p<0,05): Escala de diferença: >
Figura 9 – Distribuição percentual da prevalência de P. gingivalis em função do local da
coleta
Diferença estatisticamente significativa (p<0,05): Escala de diferença: >
Foi realizada também uma avaliação da prevalência de detecção, independente
do patógeno, em função do local da coleta. Foi observada maior prevalência (p<0,05) de
detecção no sulco em comparação com a mucosa e língua (Figura 10)
0
20
40
60
80
100
SULCO MUCOSA
LÍNGUA TOTAL
0
20
40
60
80
100
SULCO MUCOSA
LÍNGUA TOTAL
38
Figura 10 – Distribuição percentual da detecção dos periodontopatógenos no sulco,
mucosa e língua.
Quando se avaliou o número de periodontopatógenos simultâneos por indivíduo,
observou-se que a ocorrência de quatro periodontopatógenos concomitantes foi a
associação mais freqüente, (p<0,05) seguido por cinco patógenos, e posteriormente por
três, dois, zero e um, periodontopatógenos (Figura 11).
Figura 11 – Distribuição numérica da ocorrência simultânea de periodontopatógenos
diferença estatisticamente significativa (p<0,05): Escala de diferença: > >
0
2
4
6
8
10
12
14
16
0 Bactéria
1 Bactéria
2 Bactérias
3 Bactérias
4 Bactérias
5 Bactérias
0
20
40
60
80
100
Sulco
Mucosa Língua
Diferença estatisticamente significativa (p<0,05): Escala de diferença: >
39
As prevalências dos periodontopatógenos foram ainda avaliadas em função do
gênero (Figura 12) e hábito de fumar (Figura 13) não apresentaram (p<0,05)
interferência na prevalência de nenhum dos periodontopatógenos avaliados. Porém, a
faixa etária (Figura 14) interferiu (p<0,05) na prevalência de P. gingivalis, onde os
indivíduos com idade acima de 37 anos apresentaram maior prevalência de P.
gingivalis.
Para avaliação da interferência do grau de doença dos indivíduos na prevalência
dos periodontopatógenos, os indivíduos foram divididos em dois grupos, em que o
primeiro grupo foi composto pelos 15 indivíduos com as menores médias de NCI,
caracterizando um grupo com média de NCI de 1,89mm. O segundo grupo, composto
com os 15 indivíduos com as maiores médias de NCI, apresentou média de NCI de 3,35
mm. A comparação da prevalência dos periodontopatógenos entre os dois grupos
mostrou maior prevalência (P<0,05) de P. gingivalis no grupo com maior média de
NCI. Os demais patógenos não mostraram diferença estatisticamente significativa para
essa avaliação (Figura 15).
Figura 12 – Distribuição percentual da prevalência dos periodontopatógenos avaliados
em função do gênero
0
20
40
60
80
100
CR
TF
EC
AA
PG
Masc
ulino
Fem inino
40
Figura 13 – Distribuição percentual da prevalência dos periodontopatógenos avaliados
em função do hábito de fumar
Figura 14 – Distribuição percentual da prevalência dos periodontopatógenos avaliados
em função da faixa etária
* - Diferença estatisticamente significativa (p<0,05)
0
20
40
60
80
100
CR
TF
EC
AA
PG
Fu m an t e
Não
Fu m an t e
0
20
40
60
80
100
CR
TF
EC
AA
PG
> 37 anos
< 37 anos
*
41
Figura 15 – Distribuição percentual da prevalência dos periodontopatógenos avaliados
em função do nível do NCI
* - Diferença estatisticamente significativa (p<0,05)
0
20
40
60
80
100
CR
TF
EC
AA
PG
NCI >
NCI <
*
42
6 Discussão
A avaliação da presença de periodontopatógenos numa população é
justificada, pois, a obtenção destes dados associados a diferentes parâmetros clínicos
periodontais incluindo presença de biofilme dental, índice gengival, mensuração de
profundidade de sondagem e nível clínico de inserção, caracterizam o perfil periodontal
destes indivíduos além das necessidades terapêuticas ideais para a manutenção de níveis
adequados diretamente relacionados à saúde bucal e indiretamente à saúde geral. Outro
aspecto relevante está na oportunidade de identificação destes microrganismos numa
amostra de conveniência da população de Anápolis-GO. Sabendo-se que este estudo,
inédito nesta região, contribuirá para a organização de políticas de atendimento em
saúde bucal, mais especificamente de atenção a saúde periodontal junto as Secretarias
de Saúde do município. E ainda, para a Associação Brasileira de Odontologia – ABO a
identificação destes problemas contribuirá para uma melhor formação dos seus
associados, cirurgiões dentistas, traduzindo num melhor atendimento populacional. E,
finalmente para a Universidade de Taubaté significará, além de uma formação discente
dentro dos melhores padrões de qualidade em pesquisa, uma contribuição significativa
na divulgação do conhecimento em outras localidades do país.
Este estudo examinou indivíduos de uma amostra de conveniência dos
habitantes da cidade de Anápolis-GO. As amostras foram compostas por jovens e
adultos que procuraram ou foram indicados para tratamento clínico odontológico na
Associação Brasileira de Odontologia de Anápolis – Go.
A cidade de Anápolis foi fundada em 1887, está a uma altitude de 1017 m e
sua área total corresponde a 1078,2 km
2
. É cortada pelas rodovias BR-060, BR-153,
BR-414, GO-222 e GO-330, o município está a 57 km de Goiânia, 160 de Brasília e 72
de Pirenópolis, numa posição estratégica para implantação de indústrias, visto a
proximidade das capitais, federal e goiana. Sua população, segundo o IBGE (2004) está
estimada em 307.977 habitantes. Sua principal atividade econômica é a indústria de
transformação e comércio de mercadorias. Pratica-se no município a pecuária extensiva,
com criação de gado de corte e leiteiro. A agricultura, que já foi a grande fonte de
riqueza no passado, hoje é praticada em caráter de subsistência com cultivo de arroz,
milho, feijão, café e mandioca, mas em função de sua localização privilegiada para o
comércio do Centro-Oeste, ainda é o principal centro de comercialização de grãos do
Estado. O Distrito Agroindustrial de Anápolis (DAIA), instalado em 9 de setembro de
43
1976, em uma área de 880 hectares, está localizado na mesoregião do centro Goiano,
junto com o entorno de Brasília e Distrito Federal, representando um total aproximado
de 4.500.000 habitantes, distribuídos por 84 municípios circunvizinhos. Trata-se da
região mais desenvolvida do Centro-Oeste e com um dos mais expressivos potenciais de
crescimento sócio-econômico apresentado nas últimas décadas, em todo o Brasil. Possui
ramal da RFFSA que será acoplado à EADI – Estação Aduaneira do Interior (Porto
Seco). A cidade é dotada de aeroporto Civil e sede da Base Aérea dos Supersônicos
Mirage (IBGE 2005; CITY BRAZIL, 2005).
Para a obtenção dos dados clínicos optou-se por avaliar dados da condição
gengival, expressados pelos índices de placa e gengival e, para avaliarmos as condições
referentes ao estado periodontal propriamente dito utilizamos médias de profundidade
de sondagem e nível clínico de inserção. Por outro lado, optamos pela escolha da
técnica da reação em cadeia da polimerase (PCR) para avaliar de forma qualitativa a
presença dos periodontopatógenos aqui pesquisados.
O responsável pelo estudo foi previamente treinado e posteriormente calibrado
tanto para obtenção dos dados clínicos quanto para a coleta microbiana, armazenamento
e transporte das amostras. Este treinamento e calibração foram realizados na clínica de
graduação da Faculdade de Odontologia de GURUPI-TO. O mesmo recebeu um
treinamento específico em técnicas da reação em cadeia da polimerase no Laboratório
de Biologia Molecular do Instituto Básico de Biociências da UNITAU, para o
processamento das amostras no teste da PCR treinamento este que possibilitou a
execução dos procedimentos laboratoriais desta técnica incluindo desde a extração do
DNA, confirmação da extração e amplificação do DNA das amostras bacterianas
coletadas e identificação das amostras por meio de visualização dos produtos
amplificados por eletroforese.
O presente trabalho avaliou 30 indivíduos selecionados aleatoriamente de uma
amostra original de 250 indivíduos conjuntamente examinados sob aspectos clínicos
periodontais. No presente estudo adotou-se o critério aleatório estabelecendo-se como
método a escolha de indivíduo para exame microbiano de sítios dentais, da mucosa e da
língua para cada oito indivíduos avaliados clinicamente. Os dados microbianos obtidos
foram então relacionados entre si (sítio dental; mucosa e língua), com os parâmetros
clínicos periodontais (índices de placa e gengival, profundidade de sondagem, nível
clínico de inserção) e finalmente com características individuais, gênero, faixa etária,
hábito de fumar e higiene bucal.
44
A técnica de cultura bacteriana tem sido um método clássico para a
identificação de microrganismos envolvidos na doença periodontal. Ressalta-se o fato
de que esta técnica é vantajosa pelo fato de permitir a determinação de antibiogramas.
Por outro lado, considera-se uma desvantagem da técnica o fato de se cultivar apenas
alguns tipos de periodontopatógenos além de que estes microrganismos necessitam estar
viáveis para seu crescimento em meio específico. Esta técnica mostra-se ainda
dispendiosa e necessita-se de muito tempo para a sua operação. Já os ensaios
enzimáticos representam uma técnica de rápida execução, pouco dispendiosa que
detecta grupos bacterianos através de informações referentes aos perfis enzimáticos dos
microrganismos, todavia esta técnica se limita apenas a poucos microrganismos
associados à doença periodontal (CORTELLI et al. 2000).
Desde 1990, o teste da reação em cadeia da polimerase tem sido usado em
larga escala e com grande sucesso na identificação de periodontopatógenos presentes no
biofilme subgengival. Esta técnica baseia-se na análise dos ácidos nucléicos, sendo
considerado o mais sensível dos testes microbiológicos. Nesta técnica selecionam-se
dois primers numa região do DNA a ser amplificada. O DNA bacteriano desnaturado
hibridiza-se com os primers que regulam a extensão do mesmo, originando seqüências
de DNA idênticas ao segmento padrão (CORTELLI et al. 2000). Por causa da qualidade
desta técnica e em função das condições de coleta, armazenamento e posterior
processamento optou-se neste estudo, pela utilização da reação em cadeia da
polimerase.
No presente estudo observou-se que, independente do local de coleta, no total de
indivíduos avaliados, C. rectus apresentou a maior prevalência (97%) entre os
periodontopatógenos pesquisados, seguido por T. forsythia (90%) e A.
actinomycetemcomitans (90%), E. corrodens (80%) e finalmente P. gingivalis (37%)
(Figura 1). Nos estudos de Slots, Ashimoto e Flynn, (1995) T. forsythia apresentou a
maior prevalência (91,4%), entre os periodontopatógenos pesquisados, seguido por C.
rectus a prevalência de (66%) e E. corrodens (66,3%), P. gingivalis (63,4%) e A.
actinomycetemcomitans (52,8%), diferentes dos nossos achados. Já os estudos de
Colombo et al. em 2002, estudando amostras de biofilme subgengival com técnica de
checkerboard DNA-DNA hybridization de indivíduos com doença periodontal e
saudáveis encontraram uma prevalência de P. gingivalis (58% e 20%), C. rectus (52%
e 28%), T. forsythia (56% e 10%), E. corrodens (52% e 38%) e A.
actinomycetemcomitans (41% e 25%) respectivamente. Já Ávila-Campos e Velásques-
45
Melendez em 2002 estudando biofilme subgengival usando as técnicas de cultura e PCR
com indivíduos com saúde e doença periodontal, encontraram uma prevalência com
PCR de A. actinomycetemcomitans (70% e 90%), P. gingivalis (66% e 78%), T.
forsythia (30% e 82%), E. corrodens (50% e 80%), C. rectus (48% e 80%)
respectivamente. Enquanto Fujise et al. em 2002, estudando biofilme subgengival
usando a técnica de PCR constataram 8,7% para T. forsythia em indivíduos com doença
periodontal e saudáveis 30% e uma freqüência alta para a combinação de P. gingivalis e
T. forsythia 32,4% (saudáveis) e 74% (doença periodontal). Diferenças entre estes
estudos podem ser devido à população estudada e tipo de técnica utilizada.
Klein e Gonçalves (2003) avaliaram a prevalência de T. forsythia e P. gingivalis
em amostra de biofilme subgengival utilizando PCR. Prevalência de 70% para T.
forsythia e 40% para P. gingivalis em indivíduos com periodontite com profundidade de
bolsas 1a 5mm. Os resultados indicaram uma possível associação entre doença
periodontal e T. forsythia e/ou P. gingivalis. Já em nossos estudos encontramos uma
grande quantidade de bactérias no sulco, mucosa e língua, sendo a P. gingivalis, com
menos prevalência, mas estatisticamente significante para a doença periodontal.
C. rectus (Figura 5) e A. actinomycetemcomitans (Figura 8) apresentaram maior
prevalência na mucosa em comparação ao sulco e à língua. Para T. forsythia (Figura 6),
e P. gingivalis (Figura 9) a maior prevalência foi observada no sulco. Para E. corrodens
(Figura 7) a maior prevalência foi observada no sulco e língua.
Podemos observar, na Figura 5, uma diferença estatisticamente significativa para
C. rectus que esteve mais presente na mucosa que no sulco e língua. Isto significa que o
sítio de colonização preferencial deste patógeno não foi o intra-sulcular, assim, se
estudos avaliarem a presença de C. rectus apenas no sulco estes dados subestimaram sua
real prevalência bucal.
Podemos observar, na Figura 6, uma diferença estatisticamente significativa
para T. forsythia que está mais presente no sulco que na língua e mucosa. Então quando
for necessário coletar amostras para pesquisar esta bactéria pode-se fazê-la somente do
sulco gengival, onde ela está mais presente segundo nossos achados.
Observamos na Figura 7, que a bactéria E. corrodens está mais presente no
sulco e língua que na mucosa — uma diferença estatisticamente significativa —
indicando que amostras para pesquisa desta bactéria poderiam ser coletadas tanto da
região do sulco gengival quanto da língua, pois neste estudo ela foi encontrada em
maior quantidade nestas duas regiões.
46
Encontramos, na Figura 8, uma diferença estatisticamente significativa que a
bactéria A. actinomycetemcomitans está mais presente na mucosa que na língua e sulco.
Para pesquisar o A. actinomycetemcomitans pode-se coletar amostra somente da
mucosa, onde foi encontrado com mais freqüência neste estudo.
Podemos observar, na Figura 9, que a bactéria P. gingivalis está mais presente
no sulco que na mucosa e língua — uma diferença estatisticamente significativa. Para
estudar a bactéria P. gingivali,s as amostras deverão ser coletadas do sulco gengival,
onde foi mais presente neste estudo
Neste estudo foi realizada também uma avaliação da prevalência de detecção,
independente do patógeno, em função do local da coleta. Foi observada maior
prevalência de detecção no sulco em comparação com a mucosa e língua (Figura 10).
Na população de adultos jovens de Anápolis, quando se avaliou o número de
periodontopatógenos simultâneos por indivíduo contatou-se uma maior freqüência de 4
periodontopatógenos, seguido por 5 patógenos, e posteriormente por três, dois, zero e
um periodontopatógenos (Figura 11). Isto significa que na população estudada, quando
o indivíduo mostrou-se positivo para os microrganismos, estes estiveram sinergicamente
presentes o que potencializaria sua ação de degradação tecidual levando a uma maior
possibilidade de destruição periodontal. Assim, a detecção de um grande número de
bactérias nos indivíduos participantes deste estudo indica um risco para desenvolver a
doença periodontal no futuro. Por isto medidas terapêuticas devem ser tomadas para a
manutenção da saúde periodontal, por parte da Secretaria de Saúde do Município ou
pelas entidades relacionadas com a saúde bucal, mais especificamente com atenção a
saúde periodontal.
Os parâmetros periodontais (presença de biofilme dental, índice gengival,
avaliação de profundidade de bolsa e nível clínico de inserção) não foram concordantes
com os números de bactérias encontradas, significando que, apesar da detecção
microbiana, os parâmetros aqui utilizados falharam nesta associação. Todavia, vale aqui
ressaltar que parâmetros clínicos periodontais refletem uma condição de sinais clínicos
da doença, enquanto os parâmetros microbianos podem antecipar-se aos sinais clínicos
mostrando um perfil microbiano ainda numa fase considerada subclínica da doença.
A prevalência dos periodontopatógenos foi ainda avaliada em função do gênero
(Figura 12), hábito de fumar (Figura 13), faixa etária (Figura 14) e nível clínico de
inserção NCI dos indivíduos (Figura 15).
47
Gênero (Figura 12) e hábito de fumar (Figura 13) não apresentaram interferência
na prevalência de nenhum dos periodontopatógenos avaliados. Porém, a faixa etária
(Figura 14) interferiu na prevalência de P. gingivalis, em que os indivíduos com idade
acima de 37 anos apresentaram maior prevalência de P. gingivalis. Portanto ter mais
idade significou risco maior para a presença de P. gingivalis. Concordando com os
nossos resultados estão vários autores onde associaram microrganismos específicos com
locais de perda de inserção clínica e com o aumento da idade. A prevalência, gravidade
da periodontite e perda do nível de inserção estavam diretamente proporcionais à idade
(FLORES-DE-JACOBY et al. 1991; LISTGARTEN, LAI E YOUNG,1993;
OPPERMANN; SILVA; BASSANI, 2000; ALBANDAR, 2002; SUSIN et al. 2004).
Socransky et al. (1988), Zambom (1996) e Gmür, Strub e Guggenheim em 1989
concluíram que perda do nível de inserção aumenta chances de detectar P. gingivalis e
T. forsythia.
Para associação entre o nível clínico de inserção, que reflete a história pregressa
da doença e a prevalência dos periodontopatógenos, os indivíduos foram divididos em
dois grupos. O primeiro foi composto pelos 15 indivíduos com menores médias
(1,89mm) de perda de inserção clínica. O segundo grupo, composto por 15 indivíduos
com as maiores médias (3,35mm) de perda de inserção clínica. A comparação da
prevalência dos patógenos periodontais entre os dois grupos mostrou maior prevalência
de P. gingivalis no grupo com maior média de perda de inserção clínica. Os demais
patógenos não mostraram diferença estatisticamente significante para essa avaliação
(Figura 15). Discordantes deste estudo estão Takamatsu et al., (1999) em que a bactéria
mais prevalente foi T. forsythia usando a técnica do PCR. Avila-Campos; Velásques-
Meléndez (2002) encontraram uma prevalência de P. gingivalis de 66% em indivíduos
saudáveis e 78% em indivíduos com doença periodontal, e uma prevalência de 30% e
90% respectivamente para T. forsythia. Fujise et al., (2002) encontraram maior
prevalência de A. actinomycetemcomitans. Klein e Gonçalves (2003) encontraram mais
prevalência de T. forsythia (100%) que de P. gingivalis (90%) em indivíduos com
bolsas maiores que cinco mm. Estes dados prevalentes encontrados diferiram daqueles
obtidos na nossa população, mostrando que o perfil microbiano populacional difere de
acordo com a população alvo e metodologia empregada.
Colombo et al. (2002) encontraram prevalência de bactérias em pacientes com
doença periodontal e saúde periodontal para P. gingivalis 58% e menos que 20% , para
C. rectus 52% e 28%, para T. forsythia 56% e 10%, para E. corrodens 52% e 38% e
48
para A. actinomycetemcomitans 40% e 22% respectivamente. E de todas as bactérias
pesquisadas, um pequeno número fortemente relacionado com sinais clínicos de doença
periodontal T. forsythia e P. gingivalis.
49
7 Conclusões
De acordo com os seguintes resultados
1 Ausência de associação entre parâmetros clínicos e gênero.
1 Maior PIC em relação ao fator idade e hábito de fumar.
1 Prevalência bacteriana C. rectus (97%), T. forsythia e A. actinomycetemcomitans
(90%) E. corrodens (80%), e P. gingivalis (37%).
1 Maior prevalência de C. rectus e A. actinomycetemcomitans na mucosa em
relação ao sulco e língua,
1 Maior prevalência de E. corrodens T. forsythia e P. gingivalis no sulco.
1 Maior prevalência de E. corrodens na língua que na mucosa.
1 P.gingivalis mais prevalente em relação ao fator idade e PIC.
Podemos concluir que o número de bactérias presentes foi elevado existindo associação
entre P. gingivalis com o fator idade e perda de inserção clínica. Não houve distribuição
uniforme entre os patógenos e o local da coleta.
50
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59
APÊNDICE
APÊNDICE A - Esclarecimento aos pacientes
Esclarecimento aos participantes da pesquisa
Neste estudo iremos pesquisar bactérias dentro da gengiva, para isto, iremos
colocar cones de papel dentro da gengiva e esperar por um minuto e passaremos um
cotonetes na língua e bochecha. Depois vamos pesquisar quais bactéria estariam
presentes tanto na gengiva quanto na língua e bochecha e com isso iremos verificar
quais bactérias estariam provocando a doença periodontal.
A doença periodontal é uma inflamação da gengiva causada por bactérias, que quando
não tratada pode evoluir e provocar a perda de osso em volta dos dentes deixando-os
moles necessitando de extraí-los.
Cada participante será identificado por número, assim a sua identidade
será preservada.
Agradeço sua participação.
Paulo César Tavares – Pesquisador
60
APÊNDICE B– Termo de consentimento para indivíduos em estudos experimentais
Título: Avaliação de periodontopatógenos em amostra de conveniência de jovens
adultos da cidade de Anápolis – Go.
Pesquisador principal: Paulo César Tavares
Descrição: Estou ciente de que os exames microbiológicos colhidos serão usados para
pesquisar a presença de 5 bactérias considerados causadores da doença periodontal. O
objetivo deste estudo será de avaliar a presença de bactérias (Actinobacillus
actinomycetemcomitans Campilobacter rectus, Tannerella forsythia, Porphyromonas
gingivalis e Eikenella corrodens). Este estudo promoverá o conhecimento das bactérias
que causam a doença periodontal bem como o perfil periodontal dos indivíduos
participantes e as necessidades terapêuticas para promoção da saúde.
Tempo envolvido e beneficio: estou ciente que nenhum tempo adicional me será
requisitado por eu participar de tal estudo.
Outras informações:
****Os indivíduos incluídos neste estudo responderão a um questionário de anamnese
(história médico-odontológica, hábitos, comportamentos e características demográficas)
e após este procedimento serão submetidos a exames odontológicos, feito por um
examinador (Cirurgião Dentista responsável pelo estudo). Os indivíduos serão
encaminhados para tratamento odontológico de que necessitam (periodontia, dentística
restauradora, endodontia, patologia oral, implantodontia, cirurgia buco-maxilo, prótese
dental, ortodontia). Participação é inteiramente voluntária e você poderá retirar-se da
participação a qualquer hora, sem afetar, de maneira alguma, o curso de seu tratamento.
Sua identidade será mantida confidencial. Responderemos a quaisquer perguntas que
você possa ter.
Custo e pagamentos:
****As necessidades de cada indivíduo serão cobradas pela ABO-GO de Anápolis por
cada procedimento realizado desde que queira fazer o tratamento.
Sigilo: estou ciente de que qualquer informação a meu respeito obtida na pesquisa será
confidencial. Estou ciente de que os dados da pesquisa, podem ser intimados com
mandato judicial. Foi me explicado que minha identidade não será revelada em qualquer
descrição ou publicação desta pesquisa.
Direito de se retirar da pesquisa: estou ciente de que posso me recusar a participar neste
estudo e que a minha decisão não afetará negativamente o atendimento a ser recebido
por esta instituição ou causar perda de benefícios aos quais, de outra forma, teria direito.
Indenização e danos: estou ciente de que no caso de danos físicos ou doença resultantes
deste procedimento não haverá indenização em dinheiro, mas qualquer emergência que
possa ser necessário me serão dados. Eu posso chamar o pesquisador para obter
informações sobre o tratamento se isto for necessário.
Consentimento voluntário: Eu certifico que li o acima exposto ou que o mesmo tenha
sido lido para mim e compreendo o seu conteúdo. Quaisquer dúvidas que eu tenha
pertinentes a pesquisa serão respondidas por um dos pesquisadores mencionados acima.
61
Quaisquer perguntas que eu tenha com relação a meus direitos como indivíduo
pesquisado, serão respondidas. Uma cópia deste documento me será entregue. Minha
assinatura abaixo significa que eu concordei em participar nesse estudo experimental.
Data _ _/ _ _ / _ _ ____________________________________________
Assinatura do paciente
____________________________________________
Testemunha
Eu declaro que expliquei ao acima mencionado a natureza e finalidade , benefícios
potenciais e possíveis riscos associados à participação neste estudo. Eu respondi a todas
as perguntas que me foram feitas e testemunhei a assinaturas acima.
Data-
_ _ / _ _ / _ _ _____________________________________________
Assinatura do pesquisador
Para menores de idade. Eu ____________________________________________
__________________________________________________ também li o acima
exposto e concordo a participação de meu filho(a).
Data _ _ / _ _ / _ _ ______________________________
_____________
Assinatura do responsável
___________________________________________
testemunha
62
APÊNDICE C – Ficha de anamnese
Número do Prontuário:
Data do exame: ___/___/___
Nome:
Centro:
Gênero: ( ) feminino ( ) masculino
Cor: ( ) Branca ( ) Preta ( ) Pardo ( ) Indígena ( ) Amarelo
Idade (em anos):
Data de nascimento: __/__/____
Estado civil: ( ) solteiro(a) ( ) casado(a) ( ) viúvo(a) ( ) separado(a)
( ) divorciado(a) ( ) vive com parceiro(a)
Naturalidade (estado aonde
nasceu):______________________________________________________________
Local de residência: ( ) zona urbana ( ) zona rural
Local de trabalho: ( ) zona urbana ( ) zona rural ( ) não trabalha
Bairro:_________________________________________________________________
_____________________
CEP:__________________________________________________________________
_____________________
Estado:________________________________________________________________
_____________________
Município:_____________________________________________________________
______________________
Profissão:______________________________________________________________
______________________
Educação: ( ) Primeiro grau incompleto ( ) Primeiro grau completo ( ) Segundo grau
incompleto
( ) Segundo grau completo ( ) Superior incompleto ( ) Superior completo ( )
Pós- graduação
Emprego atual: ( ) Trabalhador(a) com carteira assinada ( ) Trabalhador(a) sem carteira
assinada
( ) Trabalhador(a) autônomo ou dona de casa ( ) Estudante ( )
Desempregado
( ) Aposentado(a) ( ) outro ____________________
Renda familiar: ( ) Menos que 1 salário mínimo ( ) 1 a 5 salários mínimos
( ) 5 a 10 salários-mínimos ( ) > 10 salários-mínimos
63
HISTÓRIA ODONTOLÓGICA
Visita regularmente o dentista? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Freqüência ______
Data da última visita ______
Está satisfeito(a) com a saúde bucal em geral? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Está satisfeito com a aparência dos seus dentes? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Acha que seus dentes estão afetando a sua saúde de
alguma forma?
( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Tem problemas de alimentação devido a problemas
dentários?
( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Sofre de sinusite? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Respira pela boca? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Ouve ou sente algum ruído quando mastiga? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Sente dor em alguma parte da boca ou dente
quando mastiga?
( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Algum dente dói com o frio, calor ou doce? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Quando come fica com alimento preso entre os
dentes?
( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Tem dentes abalados (moles)? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Algum dente mudou de lugar? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Sente gosto desagradável na boca? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Sente a gengiva irritada, inchada ou dolorida? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Sua gengiva sangra freqüentemente? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Escova os dentes com regularidade? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Quantas vezes por dia? ______
Tipo de escova? ( )Macia ( )Média ( )Dura
Usa fio ou fita dental? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Freqüência: _______
Faz bochecho com anti-séptico? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Já fez ou faz uso de flúor? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Freqüência ______
Já fez tratamento periodontal? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
64
Há quanto tempo? ______
Já fez cirurgia periodontal (“cirurgia de gengiva”)? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Já fez tratamento endodôntico (canal)
anteriormente?
( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Já fez tratamento protético anteriormente? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Já se submeteu à cirurgia bucal? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Já fez tratamento de implante dentário? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
Sangra de maneira exagerada quando se corta ou
extrai dentes?
( ) Sim ( ) Não ( ) Não
sei
HISTÓRIA MÉDICA
Sofre de alguma doença? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Qual? _______
Há quanto tempo? _______
Está tomando algum medicamento sem orientação
médica?
( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Nome comercial _______
Há quanto tempo? _______
Quando foi ao médico pela última vez? _______
Alguma alteração em sua saúde de um modo
geral?
( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Mudança de peso nos últimos meses? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Padeceu de alguma doença grave anteriormente? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Qual? _______
Há quanto tempo? _______
Já esteve hospitalizado(a)? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
É portador de doença cardiovascular? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Qual? _______
Já teve hepatite? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Qual tipo? ( ) A ( ) B ( ) C
Já teve febre reumática? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Já teve endocardite infecciosa? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Tem dificuldade de respirar quando deitado? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Sua pressão é normal? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Pressão arterial no momento do exame: Sistólica__
_
Diastólica_
__
Fez exame de colesterol alguma vez? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Já fez exame para diabetes alguma vez? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Qual o resultado? ( )Positivo ( )Negativo
( ) Não sei
Sente sensação de boca seca freqüentemente? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Tem problemas de infecções repetidas? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Tem ou teve alergia a algum medicamento,
alimento ou substância?
( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Qual? _______
Toma(ou) algum medicamento com prescrição ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
65
médica?
Qual? _______
Sofre de asma ou bronquite? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Teve alguma doença venérea? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Qual? _______
Há quanto tempo? _______
Já fez exame para o diagnóstico de AIDS? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Fez tratamento de tumor na região da cabeça ou
pescoço?
( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Quanto tempo?
Já teve pneumonia? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Tem problema de Tireóide? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Qual? _______
Já foi diagnosticado(a) com osteoporose? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Tem ou teve o hábito de fumar? ( )
Atual
( )Ex-
fumante
( ) Nunca
fumou
Tipo de fumo? _______
_
Tempo de fumo (em anos)? _______
_
Quantidade de cigarros por dia (em número de
cigarros)?
_______
_
Se ex-fumante, há quanto tempo deixou de fumar
(em meses ou anos)
_______
_
Se, fuma atualmente, pretende parar? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não fumo
Toma(ou) medicamento para depressão? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Quanto tempo? (em meses) _______
_
( ) Atual ( ) Prévio
Toma(ou) medicamento para controlar
nervosismo ou ansiedade?
( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Quanto tempo? (em meses) _______
_
( ) Atual ( ) Prévio
Faz uso de bebida alcoólica? ( ) Atual ( ) Prévio ( ) Nunca
Qual produto bebe(ia) com mais freqüência? _______
Quantidade por semana? _______
Já fez uso de drogas/entorpecentes? ( ) Atual ( ) Prévio ( ) Nunca
Tipo? _______
Tempo de uso? _______
66
SAÚDE DA MULHER
Toma anticoncepcional? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Está grávida? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
De quantos meses? _______
Já esteve grávida antes? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Quantas vezes? _______
Quantos filhos tem? _______
Já teve filhos de parto prematuro? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Sabe o motivo? _______
Já teve filhos com baixo peso ao
nascer?
( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Qual o peso? _______
Está na menopausa? _______
Já passou da menopausa? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
Faz reposição hormonal? ( ) Sim ( ) Não ( ) Não sei
OBSERVAÇÕES:_________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
___________________________________________________________
67
APÊNDICE D – Ficha para exame dentário e periodontal do paciente
Número do Prontuário: ________________________
ÍNDICE CPOD
(C – CARIADO; P – PERDIDO; O – OBTURADO; D – DENTE HÍGIDO)
18 17 16 15 14 13 12 11 21 22 23
24 25 26 27 28
48 47 46 45 44 43 42 41 31 32 33
34 35 36 37 38
ÍNDICE DE BIOFILME: (0 = AUSÊNCIA; 1 = PRESENÇA)
DENTE DENTE
PRIMÁRIO SECUNDÁRIO V MV L
16 17
14 15
11 21
22 12
24 25
26 27
36 37
34 35
31 41
42 32
44 45
46 47
68
Número do Prontuário:________________________
EXAME PERIODONTAL:
PS – PROFUNDIDADE DE SONDAGEM
NI – NÍVEL DE INSERÇÃO
SS – SANGRAMENTO À SONDAGEM (0 = AUSÊNCIA; 1 =
PRESENÇA)
DENTE DENTE Índice
DV V MV
DL L ML
PRIMÁRIO SECUNDÁRIO
OS
16 17 NI
SS
OS
14 15 NI
SS
OS
11 21 NI
SS
OS
22 12 NI
SS
OS
24 25 NI
SS
OS
26 27 NI
SS
OS
36 37 NI
SS
OS
34 35 NI
SS
OS
31 41 NI
SS
OS
42 32 NI
SS
OS
44 45 NI
SS
OS
46 47 NI
SS
69
Número do Prontuário:________________________
OBSERVAÇÕES:_________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
________________________________________________________________
______________________________________________________
TRATAMENTO NESCESSÁRIO:
o PERIODONTIA
o DENTÍSTICA RESTAURADORA
o ENDODONTIA
o PATOLOGIA ORAL
o IMPLANTODONTIA
o CIRURGIA BUCO-MAXILO
o PRÓTESE FIXA
o PRÓTESE REMOVÍVEL
o PRÓTESE TOTAL
o ODONTOPEDIATRIA
o ORTODONTIA
70
ANEXO
ANEXO A – Cópia da aprovação do protocolo de pesquisa pelo Comitê de Ética em
Pesquisa da Universidade de Taubaté.
71
Autorizo cópia total ou parcial desta obra,
apenas para fins de estudo e pesquisa,
sendo expressamente vedado qualquer tipo
de reprodução para fins comerciais sem
prévia autorização específica do autor.
Paulo César Tavares
Taubaté – SP, Janeiro 2006.
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