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Como controle positivo utilizamos a fitohemaglutinina (PHA) (Sigma-Aldrich, St. Louis,
EUA) na concentração de 1ug/poço (5ug/mL).
Para a realização destes experimentos, placas de filtração (Millipore Corporation,
Bedford, EUA) de 96 poços foram lavadas três vezes com tampão salina-fosfato (Gibco
Invitrogen, Grand Island, EUA) uma vez concentrado (PBS 1X – 200 µL/poço), Os poços
foram preenchidos com anticorpos monoclonais de captura anti-IFN-γ humano (100
µL/poço) (Cell Sciences Diaclone, France) e incubados a 4° C por no mínimo 18hs. As
placas foram lavadas novamente três vezes com PBS (Gibco Invitrogen, Grand Island,
EUA) 1X (200 µL/poço) e bloqueadas com RPMI (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA)
completo-SFB 10% (Gibco Invitrogen, Grand Island, EUA) (100 µL/poço) por 30 minutos
a 37° C em atmosfera de 5%CO
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(Heraeus Instruments, Germany). A seguir, 100 µL de
CMSP dos pacientes foram adicionadas aos poços a uma concentração de 10
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céls/poço,
seguido-se da adição dos antígenos PPD, ESAT-6, 38Kda/CFP-10 e PHA (controle
positivo) ou meio de cultura sozinho (controle negativo), todos em duplicata. Para cada
visita foram utilizados 10 poços (1,2x10
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cels) por paciente. Cabe ressaltar que, para fins
comparativos, as amostras de CMSP dos pacientes obtidas nos diferentes momentos do
estudo (D1 a D90 ou 120) foram testadas na mesma placa de cultura.
As placas foram incubadas por 40 horas a 37°C em estufa com atmosfera de 5% de
CO
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(Heraeus Instruments, Germany) Após esse período, as placas foram lavadas por três
vezes com PBS 1X (Gibco Invitrogen, Grand Island, EUA) , três vezes com PBS 1X-
Tween 20 (Merck Schuchardt OHG, Hohenbrunn, Germany) a 0,05%, e três vezes com
PBS 1X (Gibco Invitrogen, Grand Island, EUA) e em seguida foram adicionadas alíquotas
de 100 µL/poço de anticorpos anti-IFN-γ biotinilados (Cell Sciences Diaclone, France),
diluídos a 1/500 em PBS-BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA) 1%. Após incubação a 37°
C por 4 horas, as placas foram novamente lavadas por três vezes com PBS 1X (Gibco
Invitrogen, Grand Island, EUA) e então adicionadas alíquotas de 100 µL/poço de uma
solução de streptoavidina fosfatase alcalina (Amersham Biosciences, England), diluída a
1/1000 em PBS contendo 1% de BSA (Sigma-Aldrich, St. Louis, EUA). Após incubação
de uma hora a 37° C, as placas foram lavadas novamente por três vezes com PBS 1X
(Gibco Invitrogen, Grand Island, EUA) antes da adição de 100uL/poço do substrato
cromógeno 5-bromo-4-cloro-3-indolil fosfato e do agente catalizador nitroblue tetrazolium