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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
AVALIAÇÃO DE ESPUMAS COM PRINCÍPIOS ATIVOS NA
REDUÇÃO DE CONTAMINAÇÕES MICROBIANAS
VALDEMIRA SANTINA DAGOSTIM
CRICIÚMA (SC), NOVEMBRO DE 2007
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UNIVERSIDADE DO EXTREMO SUL CATARINENSE
PROGRAMA DE PÓS-GRADUAÇÃO EM CIÊNCIAS DA SAÚDE
AVALIAÇÃO DE ESPUMAS COM PRINCÍPIOS ATIVOS NA
REDUÇÃO DE CONTAMINAÇÕES MICROBIANAS
Dissertação apresentada ao Programa de Pós-
Graduação em Ciências da Saúde da
Universidade do Extremo Sul Catarinense, para
obtenção do título de Mestre em Ciências da
Saúde. Linha de Pesquisa em Novos
Compostos com Atividade Biológica.
Orientador: Prof. Dr. Elídio Angioletto
CRICIÚMA (SC), NOVEMBRO DE 2007
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A razão de minha existência...
Meu sol...minha lua...
O ar que respiro...
Minha linda filha Sarah.
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“A grandeza de um ser humano não esta no quanto ele sabe, mas no quanto
ele tem consciência que não sabe. O destino não é freqüentemente inevitável,
mas uma questão de escolha. Quem faz escolha, escreve sua própria
história, constrói seus próprios caminhos”.
(Augusto Cury)
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AGRADECIMENTOS
A Deus, que nos ensina que é necessário fazer coisas habituais da vida
com extraordinário amor e que pequenas ações feitas com amor são mais
importantes que grandes ações feitas para a glória pessoal.
A minha família, que sem ela nada disso poderia estar sendo
concretizado.
Ao professor Dr Elidio Angioletto, meu orientador, pela competência,
seriedade, paciência e orientação em todas as etapas deste trabalho.
Ao Professor Dr Marcos Marques da Silva Paula, pela disponibilidade e
valiosa colaboração.
Ao colega M.Sc. Claus Troger Pich pela disposição, companheirismo,
solidariedade e imensa disposição em colaborar com esta tese. Meu muito obrigado.
Ao Professor Dr. Newton B. Lucchiari, in memoriam, pelas suas
contribuições claras e firmes na banca de qualificação do projeto.
A Universidade do Extremo Sul Catarinense – em especial ao
Departamento de Enfermagem em que atuo como docente, por acreditar no meu
trabalho.
A empresa Mannes, meus sinceros agradecimentos.
A todos os professores do Departamento de Enfermagem da UNESC, que
de uma forma ou de outra auxiliaram na adequação dos horários para que eu tivesse
melhores condições de pesquisa e pela amizade.
Aos meus amigos do mestrado, principalmente a Ivanir Pra da Silva
Thomé pela sua dedicação e paciência e ao Renan Ceretta pela originalidade nas
abordagens e seu entusiasmo constante. Aos demais, todo meu carinho.
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Aos bolsistas do laboratório LADEBIMA, em especial o amigo Davi Ludivig
Gonçalves, que não mediu esforços nesta pesquisa e, acima de tudo, pela grandeza
e profissionalismo.
A minha grande amiga Mágada, que não poupou esforços em “levantar-
me” cada vez que as adversidades insistiam em me fazer cair. Assim mostrou-me
que existe algo muito maior que nos guia e nos ama.
E a todos que de uma forma ou outra contribuíram para que eu pudesse
concluir mais esta jornada em minha vida profissional.
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RESUMO
No presente estudo se avaliou a eficiência dos antimicrobianos comerciais Triclosan,
Maxgard 1000, isotiazolona, piritionato de zinco e Prottec mxd 600 incorporados em
matriz de espumas poliméricas. Utilizou-se nesta avaliação concentrações de 0.2%,
0.5% e 1% em massa dos aditivos, visando à produção de colchões que atuem na
redução de infecções em internamentos hospitalares ou domiciliares. Inicialmente
produziram-se espumas aditivadas com princípios antimicrobianos e realizaram-se
os testes microbiológicos de difusão em Agar utilizando a técnica Pour Plate e
contagem de células viáveis em função do tempo. Os microrganismos utilizados
para os testes iniciais foram Bacillus subtilis, Escherichia coli, Pseudomonas
aeruginosa, Salmonella choleraesuis, Staphylococcus aureus e Cândida albicans.
Esses microrganismos são apontados como os de maior incidência em infecções
nosocomiais. Na segunda etapa do trabalho, utilizando os resultados da otimização
anteriormente realizada, produziram-se os colchões que foram utilizados para os
testes em pacientes acamados em internação domiciliar. Realizaram-se ainda testes
de genotoxicidade com estas espumas. Os resultados apontam para uma redução
significativa no número de microrganismos presentes nas espumas com principio
ativo juntamente com a ausência de efeitos colaterais para o paciente.
Palavras-chave: Infecção Hospitalar; Infecção Domiciliar; Biocidas; Princípios
Antimicrobianos.
8
ABSTRACT
On this research, efficiency of commercial antimicrobials such as Triclosan, Maxgard
1000, isotiazolona, zinc piritonat and Prottec mxd 600 was evaluated while being
incorporated in polymeric foam matrix. Concentration of 0,2%, 0,5% and 1% of
additive mass were used on this evaluation, aiming to the production of infection
reduction mattresses for in hospital or home treatment. Initially, additive foam was
produced with anti-micro biotic principles and Agar diffusion micro biotic tests were
made, using the Pour Plate technique and viable cell count in function of time. The
Microorganisms used for initial testing were Bacillus subtilis, Escherichia coli,
Pseudomonas aeruginosa, Salmonella choleraesuis, Staphylococcus aureus and
Cândida albicans. These microorganisms are usually responsible for the largest
number of nosocomial infections. On the second stage of the research, using the
results of previous optimizing, mattresses used for home cared patients were
produced. Genotoxicity tests were conducted with these foams. The results point to a
significant decrease on the number of microorganisms found within the active-
principle foam along with the lack of collateral effects for the patient.
Keywords: Hospital Infection; Home Infection; Biocides; Anti-Microbial Principles.
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LISTA DE ABREVIATURAS E SIGLAS
ANVISA - Agência Nacional de Vigilância Sanitária
ATCC - American Type Culture Collection
AVE - Acidente Vascular Encefálico
BHI - Brain and Heart Infusion
BS - Bacillus subtilis
CA - Cândida albicans sp.
CBM - Concentração Bactericida Mínima
CCIH - Comissões de Controle de Infecções Hospitalares
CDC - Centers for Disease Control and Prevention
CIM - Concentração Inibitória Mínima
CPDC - National Nosocomial Infection Surveillance
EC - Escherichia coli
EPI - Equipamentos de Proteção Individual
EUA - Estados Unidos da América
I - Inferior
IH - Infecção Hospitalar
INAMPS - Instituto Nacional de Previdência Social
JCAHO - Joint Commission on Accreditation of Hospital Organizations
M - Meio
MO - Microrganismos
NNIS - National Nosocomial Infections Surveillance
OMS - Organização Mundial de Saúde
PA - Pseudomonas aeruginosa
10
PCA - Plate Count Agar
PID - Programa de internação Domiciliar
S - Superior
S A - Staphylococcus aureus
SC - Salmonella choleraesuis
SENIC - Study on the Efficacy of Nosocomial Infection Control
TCE - Traumatismo Crânio - Encefálico
UFC - Unidades Formadoras de Colônias
UNESC - Universidade do Extremo Sul Catarinense
UTI - Unidade de Terapia Intensiva
ZPT - Piritionato de zinco
11
LISTA DE FIGURAS
Figura 1: Descrição simplificada do teste cometa.....................................................53
Figura 2: Classificação do dano ao DNA...................................................................54
Figura 3: Molécula de Triclosan.................................................................................59
Figura 4: Molécula de Benzotiazolona......................................................................60
Figura 5: Consumo global de biocidas para plásticos 2005.....................................62
Figura 6: Molécula de Piritionato de Zinco...............................................................63
Figura 7: Fluxograma da metodologia empregada....................................................67
Figura 8: Equipamento utilizado na fabricação de espuma em laboratório..............68
Figura 9: Espuma de poliuretano aditivada com biocidas.........................................69
Figura 10: Esquema representativo da eletroforese em gel de agarose...................78
Figura 11: Esquema representativo do Teste Cometa..............................................80
Figura 12: Técnica da coleta de amostras em colchões com e sem o princípio
ativo............................................................................................................................83
Figura 13: Amostras do colchão poliuretano e o colchão viscoelástico....................85
Figura 14: Resultados referentes ao ensaio do teste de difusão em Agar................90
Figura 15: Variação do número de microrganismos quando expostos as diversas
concentrações de Twenn 80 frente ao tempo............................................................91
Figura 16: Placas sem presença de microrganismos..............................................100
Figura 17: Presença de microrganismos em amostras...........................................101
12
LISTA DE TABELAS
Tabela 1: Índice de infecção hospitalar em UTI segundo o sítio da infecção............38
Tabela 2: Microrganismos envolvidos na maioria das infecções hospitalares...........41
Tabela 3: Microrganismos padronizados pela ANVISA.............................................70
Tabela 4: Esquematização de padronização das amostras de sangue total............77
Tabela 5: Teste de difusão em Agar..........................................................................87
Tabela 6: Contagem de Células Viáveis....................................................................93
Tabela 7: Resultado dos testes de genotoxicidade em espumas com e sem os
princípios ativos e água destilada.............................................................................95
Tabela 8: Resultados dos ensaios da presença de microrganismos nos colchões
com e sem princípios antimicrobianos com o meio PCA...........................................99
Tabela 9: Resultados dos ensaios da presença de microrganismos nos colchões
com e sem princípios antimicrobianos com o meio Sabouraud 2%........................102
Tabela 10: Resultados dos ensaios da presença de microrganismos nos colchões
com e sem princípios antimicrobianos com o meio PCA.........................................103
Tabela 11: Resultados dos ensaios da presença de microrganismos nos colchões
viscoelástico com e sem princípios antimicrobianos em meio Sabouraud 2%......105
13
SUMÁRIO
1 INTRODUÇÃO........................................................................................................16
2 OBJETIVOS............................................................................................................21
2.1 Objetivo Geral.......................................................................................................21
2.2 Objetivos Específicos...........................................................................................21
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA...................................................................................22
3.1 Breve Histórico da Infecção Hospitalar................................................................24
3.1.1 Infecção Hospitalar............................................................................................28
3.1.2 As Infecções Hospitalares no Mundo................................................................31
3.1.3 As Infecções Hospitalares no Brasil..................................................................34
3.2 Microrganismos de Maior Incidência nas Infecções Hospitalares e
Domiciliares................................................................................................................39
3.3 Assistência Domiciliar...........................................................................................43
3.4 Mutagenicidade e Genotoxicidade.......................................................................48
3.4.1 Testes de Genotoxicidade e Mutagênese.........................................................50
3.4.2 Teste Cometa....................................................................................................51
3.5 Biocidas................................................................................................................55
3.5.1 Triclosan............................................................................................................58
3.5.2 Isotiazolona.......................................................................................................60
3.5.3 Piritionato de Zinco............................................................................................62
4 MATERIAIS E MÉTODOS......................................................................................65
4.1 Local de Estudo....................................................................................................65
4.2 Procedimentos Éticos da Pesquisa......................................................................66
4.3 Análises Laboratoriais..........................................................................................66
4.3.1 Fabricação das Espumas com o Princípio Antimicrobiano...............................68
14
4.3.2 Análise do Potencial Antimicrobiano das Espumas..........................................69
4.3.3 Ativação dos Microrganismos............................................................................69
4.3.4 Meio de Crescimento e de Cultura....................................................................71
4.3.5 Técnica de POUR PLATE.................................................................................71
4.3.6 Teste de Difusão em Agar.................................................................................72
4.3.7 Teste de Toxicidade do Tween 80....................................................................74
4.3.8 Contagem de Células Viáveis em Função do Tempo.......................................74
4.3.9 Estudo de Genotoxicidade................................................................................76
4.3.9.1 Obtenção de Sangue Total e Tratamento......................................................76
4.3.9.2 Teste Cometa.................................................................................................78
4.4 Etapa Desenvolvida nas Residências..................................................................80
4.4.1 Descrições das Condições Gerais dos Pacientes.............................................81
4.4.2 Ensaios Microbiológicos em Colchões de Poliuretano com e sem o Princípio
Ativo Piritionato de Zinco 0,5%...................................................................................82
4.4.2.1 Preparação dos Meios de Cultura..................................................................82
4.4.2.2 Coleta nas Residências..................................................................................82
4.4.3 No Laboratório LADEBIMA................................................................................84
4.4.3.1 Ensaios Microbiológicos em Colchões Viscoelásticos com e sem o Princípio
Ativo Piritionato de Zinco 0,5% in loco......................................................................84
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO..............................................................................86
5.1 Fabricação das Espumas com o Princípio Antimicrobiano..................................86
5.2 Análise do Potencial Antimicrobiano das Espumas – LADEBIMA.......................86
5.2.1 Teste de Difusão em Agar.................................................................................87
5.2.2 Teste Toxidade Tween 80.................................................................................91
15
5.2.3 Contagens de Células Viáveis em Função do Tempo......................................92
5.2.4 Estudo de Genotoxicidade - Teste Cometa na Espuma Selecionada..............94
5.2.4.1 Índice de Dano...............................................................................................95
5.2.4.2 Freqüência de Dano DNA..............................................................................97
5.2.5 Etapa Desenvolvida nas Residências - In Loco................................................98
5.2.5.1 Ensaios Microbiológicos em Colchões de Poliuretano com e sem o Princípio
Ativo Piritionato de Zinco 0,5% in loco......................................................................99
5.2.5.2 Ensaios Microbiológicos em Colchões Viscoelastico com e sem o Princípio
Ativo Piritionato de Zinco 0,5% in loco.....................................................................103
6 CONCLUSÃO.......................................................................................................107
7 SUGESTÃO PARA TRABALHOS FUTUROS.....................................................108
REFERÊNCIAS........................................................................................................109
ANEXOS..................................................................................................................124
16
1 INTRODUÇÃO
A globalização da economia e por conseqüência o aumento da
competitividade internacional impõe às indústrias a necessidade de elevar a
qualidade de seus produtos e dos processos de produção. Um fator diferencial que
pode ser decisivo na escolha de um determinado produto pelo mercado cada vez
mais exigente, é o acréscimo de uma nova propriedade àquelas já existentes.
Do aprimoramento das propriedades em espumas para colchões veio a
idéia de se unir as propriedades antimicrobianas àquelas já tradicionalmente
existentes nesses produtos. Nos últimos anos têm surgido no mercado nacional e
internacional alguns produtos com estas características.
Em diversos segmentos, principalmente na área da saúde, existe a
necessidade de produtos com características antimicrobianas. Os problemas
causados por microrganismos preocupam constantemente os profissionais das
áreas onde a sua presença pode afetar a saúde das pessoas, como por exemplo,
indústrias de alimentos, hospitais, creches, sanitários públicos, hotéis, motéis,
estações rodoviárias, aeroportos, entre outros.
Na área da saúde pública podem ser economizados muitos recursos
quando a atuação antimicrobiana for preventiva, pois se pode, assim, evitar
contaminações causadas por fungos e bactérias de diversas espécies.
O controle das infecções nunca foi tão necessário quanto é hoje, não
somente nos ambientes hospitalares, mas também em outros ambientes
profissionais, como consultórios, clínicas médicas e veterinárias, cabeleireiros,
laboratórios de indústrias alimentícias e farmacêuticas entre outros (Kuriki, 1997).
O controle de infecção na área da saúde deve ser praticado onde sempre
existir um potencial para exposição a vírus, bactérias, fungos ou outros
17
microrganismos. Não bastando somente utilizar o instrumental esterilizado, mas
também a conscientização dos profissionais pelo uso de técnicas assépticas e
procedimentos que garantam tanto ao profissional quanto ao paciente e ao
ambiente, um tratamento sem risco de contaminação. Nesse sentido, a preocupação
do homem em tornar os materiais isentos de microrganismos data de muito tempo, e
ainda o desenvolvimento da cultura de se reconhecer à importância de se proteger
de fontes de infecção.
O ambiente hospitalar representa o espaço dos movimentos de infecção,
ou seja, a relação entre a possibilidade de estar em condições seguras de saúde e,
ao mesmo tempo, exposto às condições naturais e sociais do conviver com as
doenças Infecto-contagiosas. É o espaço simbolicamente considerado, como “o
espaço destinado aos doentes”.
A incidência de IH (Infecção Hospitalar) exerce um considerável impacto
sobre os quadros de morbidade e mortalidade, incorrendo em maiores dispêndios de
recursos financeiros, sendo desta forma reconhecida como um grave problema de
saúde pública (Erdmann e Lentz, 2004).
Os riscos de IH estão presentes no ambiente hospitalar, o que nos
adverte da necessidade de administrá-los da melhor forma possível, considerando
não ser possível eliminá-los totalmente. É importante que sejam tomadas medidas
de qualificação da assistência hospitalar, através de prevenção, promoção e
redução das infecções hospitalares nas instituições. De qualquer forma, as IH e as
infecções de um modo geral, ainda desafiam a ciência, a tecnologia, e a
compreensão da natureza nas suas formas vivas.
Infecção Hospitalar (IH) é aquela adquirida após a admissão do paciente
no ambiente hospitalar e que se manifesta durante a internação ou após a alta,
18
quando puder ser relacionada com a internação ou procedimentos hospitalares
(Portaria 2.616, MS-1998). A ocorrência de infecções hospitalares tem sido
reconhecida como grave problema de saúde pública no mundo e a principal causa
de iatrogenias da pessoa hospitalizada e submetida a intervenções curativas. Isto
representa um paradoxo conceitual no sistema de saúde uma doença é gerada
quando se busca a cura de outra (Lacerda et al 1996). A Organização Mundial de
Saúde reconhece que as infecções hospitalares constituem um substancial
problema internacional de saúde pública (Schaffner, 1997).
O problema das infecções hospitalares perdura, principalmente, em
hospitais que possuem dificuldades financeiras, os quais não conseguem cumprir
com todas as determinações do Ministério da Saúde/ANVISA, no sentido de eliminá-
la. Da mesma forma, nos hospitais públicos, onde a superlotação é corriqueira em
conseqüência de fatores sócio-econômicos, tem-se um ambiente propício ao
desenvolvimento de microrganismos que são potencialmente contaminantes.
A infecção hospitalar ainda representa uma das maiores ameaças aos
pacientes hospitalizados, tanto no sentido do risco de complicações do quadro
clinico, da prolongação de internação e do risco de morte. Nas internações
domiciliares, este risco também é evidente, quando o paciente internado apresenta
comprometimento de seu sistema imunológico relacionado a doenças prévias como
a AVE (Acidente Vascular Encefálico), ao TCE (Traumatismo Crânio - Encefálico) e
suas seqüelas e outros eventos que promovem a permanência do paciente ao leito.
Ainda é necessário considerar o aumento do risco de infecções relacionadas à
possibilidade de maus hábitos de higiene.
A doença produz sofrimentos nem sempre possíveis de serem sanados,
mas as condições disponíveis para o acolhimento e o cuidado com a pessoa
19
internada (seja hospitalar ou domiciliar) podem ser uma fonte de conforto que venha
amenizar o mal estar causado pela doença (Pereira e Bellato, 2004).
A redução das infecções permite uma importante economia financeira
para as instituições da área da saúde pública e, conseqüentemente, trazendo
inúmeros benefícios aos usuários dos serviços de saúde e aos profissionais da área.
Estudos têm sido desenvolvidos e comprovam a possibilidade de
infecções com origem nos colchões hospitalares segundo Andrade et al (2000), em
virtude disso, tem-se desenvolvido ações profiláticas no que se refere à limpeza, na
troca de lençóis e capas de colchões e, ainda assim, o problema é somente
minimizado.
Franzin (2003), tem proposto experiências que minimizem ou eliminem a
presença de microrganismos em colchões hospitalares através do desenvolvimento
de um princípio ativo que atue como antimicrobianos. Assim, já existem aditivos
químicos comercialmente disponíveis que podem ser adicionados em diversos
polímeros, permitindo o desenvolvimento de colchões com capacidade
antimicrobiana.
Para que esses colchões possam ser produzidos é necessária a
associação de polímeros como o poliuretano, a borracha, o poliestireno e o cloreto
de polivinila. Depois, é adicionado um agente expansor que libera gases inertes
produzindo bolhas em todo o volume da peça polimérica.
Desenvolvemos esta pesquisa acreditando que os colchões com princípio
ativo implantados são menos susceptíveis à hospedagem de microrganismos (os
quais podem ser origem das infecções hospitalares - domiciliares), e que uma vez
produzidos, terão vida prolongada quanto à eficiência no controle de vetores
causadores de infecções.
20
Objetivou-se, de forma geral, identificar a efetividade
1
de princípios
antimicrobianos em espumas, com vistas à redução da carga microbiana, tendo
como hipóteses de que espumas com princípio ativo serão menos susceptíveis a
hospedarem microrganismos que podem ser origem das infecções hospitalares /
domiciliares. Ainda, que ocorrerá uma diferença estatística no nível de
microrganismos que poderá justificar a utilização de colchões antimicrobianos.
1
Efetividade - O que é real, positivo e existe de fato. ROCHA, RUTH. Minidicionário. São Paulo,
Scipione, 2000.
21
2 OBJETIVOS
2.1 Objetivo Geral
Avaliar a efetividade de princípios antimicrobianos em colchões, visando à
redução de infecções hospitalares/domiciliares.
2.2 Objetivos Específicos
Analisar se os aditivos antimicrobianos, Triclosan, Isotiazolona ,
Maxgard 1000, Prottec MXD 600 e Piritionato de zinco em
espumas,nas concentrações de 0,2%,0,5% e 1,%, na redução
microrganismos infectantes.
Avaliar a redução relativa de agentes com potencial infectante nos
colchões com princípio antimicrobiano, comparando com colchões sem
o mesmo princípio.
Estudar o comportamento do princípio antimicrobiano implantado nos
colchões em relação à genotoxicidade.
22
3 REVISÃO BIBLIOGRÁFICA
Nos últimos 30 anos, a medicina vem experimentando grandes avanços
tecnológicos associados à necessidade de compreensão cada vez maior dos
mecanismos fisiopatológicos das doenças. Estes mecanismos são suportes vitais
para pacientes criticamente enfermos e vêm permitindo sobrevida intra-hospitalar
cada vez mais prolongada. Paradoxalmente, o mesmo aparato tecnológico e a
sobrevida prolongada expõem pacientes críticos a um risco maior de
desenvolvimento de infecção (Couto, 2001).
O controle de infecção é uma filosofia de trabalho onde é necessário
verificar a eficácia dos equipamentos utilizados na esterilização, agentes químicos
escolhidos, o controle e eficácia da esterilização, a qualidade da água, o
armazenamento do material esterilizado, o uso de equipamento de proteção
individual, o destino do lixo contaminado e a constante capacitação dos profissionais
envolvidos no processo. A cada dia enfrenta-se uma realidade diferente e as
mudanças freqüentes nos protocolos de atendimento, juntamente com a evolução
dos produtos e equipamentos, obrigam os profissionais da área da saúde a se
atualizarem constantemente e a transformar em suas práticas diárias,
restabelecendo normas de conduta e procedimentos que garantam um tratamento
sem riscos de contaminação (Cottone et al, 1991).
Na abordagem da história, Silva (2003) coloca que as infecções
hospitalares são relatadas desde a idade média, época em que se iniciou a
hospitalização. No entanto, ao longo da história, transformaram-se, assim como a
saúde e a forma de adoecer, tomando proporções gigantescas. Hoje, a infecção
hospitalar é mundialmente considerada um problema de saúde pública e se
23
necessita mobilização no sentido de explicar, monitorar e principalmente de preveni-
las.
Para Cabamo (2005), as infecções hospitalares são efeitos adversos que
podem estar relacionadas com a admissão do paciente no hospital. Elas foram
contextualizadas no universo hospitalar porque, durante os últimos 40 anos, talvez
um pouco mais, o atendimento médico centralizou-se nestas instituições. Por
exemplo, os pacientes com câncer em tratamento quimioterápico passam a maior
parte do tempo dentro do hospital e era comum desenvolverem infecções que
parecem relacionadas ao ambiente hospitalar ou com a proximidade de outras
pessoas doentes.
Segundo Smetlzer e Bare (1998), o contato direto é a maneira mais
comum de contaminar um paciente com microrganismos de origem exógena. A flora
cutânea é composta de germes Gram-positivos. A equipe de trabalho do hospital
(medicina, enfermagem, higienização) são as principais fontes da maioria dos
agentes patogênicos nosocomiais, enquanto que em pacientes que tenham recebido
transplante ou estejam imunossuprimidos, a flora endógena é a principal fonte de
microrganismos.
Para Gallo (1997), o paciente submetido aos cuidados intensivos,
considerados mais graves, apresenta menor grau de defesa e, por isso, estão,
consideravelmente, em maior risco para o aparecimento de infecções nosocomiais.
O contexto hospitalar pode ser estudado sob óticas diferentes, e se
analisarmos como prestador de serviços, sua missão primordial é a de assistência
curativa ou secundária de boa qualidade, aos que dela necessitam (Leavell & Clark,
1976). Essa assistência se consolida através do emprego de técnicas e métodos
para diagnóstico e terapêutico, cuja finalidade é de devolver a sociedade, cidadãos
24
em melhor estado de saúde ou curados. Porém, o fracasso da missão institucional
pode significar a morte do paciente ou a instalação de iatrogenias (Prade, 2002).
3.1 Breve Histórico da Infecção Hospitalar
As infecções hospitalares, por sua alta freqüência e graves
conseqüências, enquadram-se como um dos principais problemas mundiais de
saúde pública e têm sido foco de muitas discussões no último século, em especial.
A história das infecções confunde-se com a própria história da
humanidade. Indícios de infecções datam dos primórdios dos tempos, quando o ser
humano, em sua luta constante contra a doença e a morte, passou a reunir doentes,
independente das moléstias, em locais insalubres, sem boas condições de
iluminação, ventilação ou cuidados, tornando, assim, inevitável à disseminação de
várias doenças, principalmente as infecciosas (Fernandes et al, 2000).
O impacto das doenças infecciosas na evolução da espécie humana é de
difícil avaliação, tanto pela complexidade em si, como pela escassez de dados e
pontos controversos, prejudicando as conclusões do paleontologista (Rodrigues,
1997).
Não é fácil caracterizar o que se passou com o estado da medicina
teórica e prática durante a Idade Média. Os hospitais transformaram-se em espaços
de reclusão, dirigidos por ordens religiosas. Além de instituição da caridade, também
eram locais das quarentenas, espaços impingidos aos que podiam afetar a harmonia
das vilas e das comunidades, principalmente nos períodos das pestes (Moraes
2005).
25
Hospitais, lazaretos, leprosários, seja qual for o nome dado ao lugar que
neste período era destinado aos que careciam de assistência, mais religiosa do que
de cura física, eles pouco têm em comum com os nossos conhecidos hospitais, pois
a medicina desenvolveu-se neste período distante do ambiente “hospitalar”
(Foucault, 1979).
São do ano de 325 as primeiras referências à existência de hospitais,
quando os bispos reunidos no concílio de Nicéia foram instruídos para construí-los
ao lado das catedrais. Durante séculos, os doentes foram tratados sem serem
separados e/ou isolados quanto à nosologia que apresentavam. Contudo, na
sociedade antiga, como na moderna, estas infecções sempre causaram impactos e
preocupações na área médica por seu alto índice de mortalidade (Couto, 1999).
Durante a modernidade, os hospitais deixaram de pertencer, na sua
totalidade, às ordens religiosas, mas se mantiveram com caráter de assistência
social, acumulando outro papel: tais quais os estabelecimentos penais da época,
eles eram responsáveis pelo controle e disciplinamento da vida urbana, segregando
pessoas tidas como perigosas à comunidade, como os mendigos, vadios,
imigrantes, loucos, portadores de doenças repulsivas, entre outros (Antunes, 1999).
Estes hospitais, muitas vezes, tornavam-se fonte de desenvolvimento de
doenças, ao invés de servirem como ambiente que promovesse a cura. As camas
coletivas, a mistura de doentes agudos com os convalescentes, a superlotação, falta
de recursos e, conseqüentemente, os altos índices de mortalidade, faziam com que
eles fossem, muitas vezes, nocivos à vida.
O alto risco provocado por uma internação hospitalar fazia com que os
ricos se afastassem dos hospitais, preferindo o tratamento domiciliar (Antunes,
1999), e isto era possível, segundo Moraes (2005 apud Porter 2002), pois na época
26
não havia procedimentos médicos exclusivamente hospitalares. Podia-se operar o
paciente na mesa da cozinha ou dar à luz em casa.
Evolutivamente, observa-se a associação entre determinadas práticas
médicas e a ocorrência de infecção hospitalar. Só no início do século XIX, na
Inglaterra, é implementado formalmente o isolamento de algumas doenças, como
varicela, e os resultados da eficácia do procedimento passam a ser relatados. Em
1864, em Londres, é descrita a disseminação de tipo hospitalar e as diferenças entre
hospitais com e sem isolamento são evidenciadas (Couto, 1999).
A introdução de procedimentos para melhorar as condições sanitárias e
as práticas de higiene instituídas nos hospitais, ocorridas no final do século XIX,
reduziu drasticamente as taxas de infecção hospitalar.
Os principais expoentes e líderes desta inquietante batalha do controle da
infecção hospitalar foram Wendel, Holmes, Semmelweis, Nightingale, Pasteur e
Lister.
Couto et al, (1999) contam que, na Universidade de Viena, foi realizado
um trabalho, em 1847, pelo médico húngaro Ignac F. Semmelweis, pioneiro da
epidemiologia hospitalar, mostrando que infecções puerperais matavam 25% das
gestantes que davam à luz em ambiente hospitalar tradicional. O índice caia para
cerca de 2% em ambientes liderados por parteiras, demonstrando ter muito mais
cuidado com assepsia que os procedimentos realizados no hospital. Nesta ocasião,
institui-se pela primeira vez a medida simples da lavagem das mãos com água
clorada, antes do atendimento às parturientes, entre outros procedimentos.
Essa intervenção de Semmerlweis é a primeira evidência de que o uso de
anti-séptico nas mãos reduz efetivamente a transmissão de infecções, tornando-o
conhecido em epidemiologia hospitalar. Infelizmente, suas recomendações
27
compartilhadas por Holmes (1809-1894), alguns anos antes, nos EUA (1843), não
foram levadas a sério por seus colegas até cem anos depois, quando foram
realizadas importantes descobertas nesta área (Kuplick, 2003).
A precursora da enfermagem, Florence Nigthingale, também foi uma das
pioneiras na redução de infecções hospitalares. Foi convidada pelo Ministro da
Guerra da Inglaterra para trabalhar nos hospitais militares, na Guerra da Criméia. A
mortalidade entre os hospitalizados era de 40%, após implantação e implementação
de cuidados de enfermagem calcados em medidas sanitárias (higiene pessoal e
ambiente) propostas por Florence, a mortalidade decresce para 2% entre os
soldados (Couto, 2003).
Em 1863, Florence descreveu uma série de cuidados e estratégias
relacionadas aos pacientes e ao meio, com o objetivo de diminuir o risco de infecção
hospitalar, padronizou procedimentos de enfermagem, principalmente no que diz
respeito às questões relacionadas à higiene e limpeza no hospital. Organizou ainda
a enfermagem no desenvolvimento dos cuidados, utilizou-se de dados estatísticos
para administrar e avaliar resultados, utilizou colchões de palhas ao invés do chão,
para atender os enfermos, fez uso de escovão para a limpeza, local adequado para
alimentação, lavagem das roupas, rede de esgoto e água quente para as
enfermarias, conforme explicita Couto et al (1999, p. 02):
[...] muito do trabalho de Nigthingale foi desenvolvido em colaboração com
William Farr, que fazia uma interpretação estatística dos dados de saúde.
Suas investigações se dão especialmente no campo de mortalidade, e a
parceria estendeu-se por mais de 20 anos.
Muito se aprendeu com Florence e posteriormente, com o avanço da
microbiologia, que foi capaz de trazer à luz do conhecimento humano, informações
sobre biologia molecular dos organismos, identificando seus códigos genéticos.
28
3.1.1 Infecção Hospitalar
É certo que diversos são os fatores que influenciam no binômio saúde –
doença, e por isso é pertinente implementar políticas efetivas que visam o controle
de infecções tanto em âmbito hospitalar quanto em nível primário de atenção.
Dentre tantas possibilidades de etiologias de doenças, uma classe
crescente atualmente é a que tem origem infecciosa, sendo a infecção o fenômeno
microbiano, caracterizado por uma resposta inflamatória frente à presença de
microrganismo ou à invasão destes nos tecidos (Bone et al, 1992). Uma doença
infecciosa é aquela em que o patógeno invade um hospedeiro susceptível, uma
pessoa ou um animal. Neste processo, ao menos uma parte do ciclo vital do
patógeno acontece dentro do hospedeiro, e, como resultado, doenças
freqüentemente surgem. Para Tortora (2005) os microrganismos podem ser
encontrados em todo o ecossistema e importantes para manter o equilibro ecológico
na terra. Alguns destes vivem em seres humanos, outros animais e são necessários
para a manutenção da saúde, alguns na produção alimentícia e muitos outros na
causa de diversas patologias.
Estes microrganismos (patógenos) que podem causar doenças são de
importância fundamental para este trabalho. É conhecendo seus mecanismos de
ação que podemos diminuí-los ou eliminá-los do meio, prevenindo assim sua
disseminação.
Os microrganismos são seres minúsculos, individualmente muito
pequenos para serem vistos a olho nu. O grupo inclui as bactérias, fungos,
protozoários e algas microscópicas, bem como os vírus.
29
É sabido que uma pequena parte desses microrganismos são patógenos
e causadores de malefícios aos seres humanos, por produzirem compostos tóxicos
ou por causarem infecção direta, daí ser necessário o conhecimento mais
aprofundado desses microrganismos para a saúde e as ciências afins. Sabemos que
os microrganismos existem praticamente em todos os lugares e até bem pouco
tempo, antes da invenção do microscópio, os microrganismos eram desconhecidos
dos cientistas. Em seus escritos, Tortora (2005, p.02) enfatiza que:
[...] milhares de pessoas morreram em epidemias devastadoras, cujas
causas não eram conhecidas. A deterioração dos alimentos freqüentemente
não podia ser controlada, e famílias inteiras morreram porque as vacinas e
os antibióticos não estavam disponíveis para combater as infecções.
Podemos ter uma idéia de como o nosso conhecimento atual sobre
microbiologia se desenvolveu considerando a história dos primórdios da
microbiologia, que modificou nossas vidas.
O corpo humano é continuamente habitado por diversos microrganismos
diferentes, seja sobre ou no interior do nosso corpo. Eles fazem parte da
microbiótica normal, que tanto pode beneficiar como causar prejuízos.
A maioria das doenças infecciosas é iniciada por colonização que pode
resultar em eliminação do microrganismo ou infecção. Quando da eliminação dos
microrganismos, o hospedeiro não corre riscos, já na infecção, os microrganismos
proliferam e induzem uma reação por resposta imune ou de qualquer outro tipo. Esta
infecção pode ter várias conseqüências, dentre as quais dano tecidual e disfunção
corporal.
Os avanços tecnológicos relacionados aos procedimentos invasivos,
diagnósticos e terapêuticos, e o aparecimento de microrganismos multiresistentes
aos antimicrobianos utilizados rotineiramente nos estabelecimentos hospitalares
tornaram as infecções em unidades assistenciais um problema de saúde pública. Lê-
se saúde pública, na definição de Araújo (1995, p. 07) como:
[...] a ciência e a arte de prevenir as doenças, de prolongar a vida e
melhorar a saúde e a eficiência mental dos indivíduos, por meio dos
30
esforços organizados da comunidade tendo em vista o saneamento do meio
ambiente, a luta contra as doenças que apresentam importância social, o
ensino aos indivíduos de regras de higiene pessoal,a organização dos
serviços médicos e de enfermagem com a finalidade de diagnóstico
precoce e do tratamento preventivo da doença, assim como por em
execução as medidas sociais convenientes para assegurar a cada membro
da coletividade um nível de vida adequado à manutenção da saúde de
forma que cada indivíduo possa usufruir seu direito à longevidade.
A Organização Mundial de Saúde (OMS), em 1946, estabeleceu como
definição de saúde “um estado de completo bem estar físico, mental e social, e não
apenas a ausência de distúrbios ou doença”. Este conceito utópico é criticado
amplamente, uma vez que seu objetivo dificilmente poderia ser alcançado, porém
representou um grande avanço por não considerar somente o oposto de doença.
Com base na resolução da VIII Conferência Nacional de Saúde, realizada
na capital do país, Brasília, em 1986, estabeleceu-se uma ampliação no conceito de
saúde, com um sentido mais abrangente, assim enfatizado:
[...] a saúde é o resultado das condições de alimentação, habitação,
educação, renda, meio ambiente, trabalho, transporte, emprego, lazer,
liberdade, acesso e posse de terra e acesso aos serviços de saúde. É
assim, antes de tudo, o resultado das formas de organização social da
produção, as quais podem gerar grandes desigualdades nos níveis de vida.
(BRASIL, 1986, p 4.).
Quando não temos acesso aos bens ou o temos em quantidade
insuficiente para as nossas necessidades, isso interfere no fator biológico
desencadeando e determinando o processo saúde – doença.
As infecções hospitalares representam um grave problema médico e
social e o seu conhecimento mais aprofundado na prevenção e controle, constituem
um desafio a ser enfrentado.
Define-se, infecção hospitalar como “infecção adquirida após admissão do
paciente no hospital e que se manifesta durante a internação ou após a alta, quando
puder ser relacionado com a internação o procedimento hospitalar” (Machado et al,
1997; Martins, 2001). Conforme os mesmos autores, quando não é conhecido o
período de incubação de um microrganismo e não há evidência clínica ou
31
laboratorial de infecção no momento da admissão, considera-se infecção hospitalar
aquela que se manifesta após 72 horas de internação, assim como aquelas
infecções relacionadas a procedimentos invasivos, independente do momento da
manifestação.
Segundo o Ministério da Saúde (Portaria n. 930, de 27 de agosto de
1992):
[...] infecção hospitalar é qualquer infecção adquirida após a internação do
paciente e que se manifesta durante a internação ou mesmo após a alta,
quando puder ser relacionada com a internação ou procedimentos
hospitalares [...]. E ao falar de infecção comunitária, define assim [...] a
infecção constatada ou em incubação no ato da admissão do paciente,
desde que não relacionado com internação anterior no mesmo hospital.
O ambiente hospitalar é inevitavelmente um grande reservatório de
patógenos virulentos e oportunistas, de modo que as infecções hospitalares podem
ser adquiridas não apenas por pacientes, que apresentam maior susceptibilidade,
mas também, embora menos freqüentemente, por visitantes e funcionários do
próprio hospital.
3.1.2 As Infecções Hospitalares no Mundo
A partir do século XX, com a introdução dos antimicrobianos, o problema
da IH e comunitária parecia estar relegados ao passado. Criou-se uma perspectiva
utópica de que estes agentes controlariam todas as infecções e principalmente as
cirúrgicas. Em meados da década de 1950, nos EUA, foram registrados os primeiros
surtos de infecções de Staphilococcus spp, cada vez mais resistentes aos
antimicrobianos existentes. Esse surto levou ao conhecimento mundial a
necessidade de criarem-se programas de vigilância e controle de IH (Rodrigues,
1997; Couto et al, 2003; Kuplich, 2003).
32
Na década de 1960, EUA e paises da Europa introduziram as Comissões
de Controle de Infecções Hospitalares (CCIH). O “Centers for Disease Control and
Prevention” (CDC) recomendou aos hospitais que monitorassem as ocorrências de
infecções através da vigilância epidemiológica. Em 1968 o CDC, iniciou cursos de
aperfeiçoamento para o controle de infecções hospitalares.
E em 1970 o mesmo órgão criou o projeto “National Nosocomial Infections
Surveillance” (NNIS), a fim de padronizar as ações de vigilância epidemiológica
(ibicit).
Rodrigues et al (1997) de 1974 a 1983, aplicaram-se ao “Study on the
Efficacy of Nosocomial Infection Control” (SENIC), e que tiveram seus resultados
publicados em 1985, baseados na avaliação nacional da efetividade dos programas
de prevenção e controle das infecções hospitalares, nos EUA. Esta pesquisa foi um
dos primeiros estudos multicêntricos da história da medicina e se caracterizou pelo
rigor no uso de método epidemiológico (Couto et al, 2003).
Este estudo retrospectivo, que envolveu vários hospitais norte
americanos, evidenciou uma redução de 32% das IH nos hospitais com
implementação de programas efetivos de controle de infecção e um aumento de 9%
a 31% naqueles que não possuíam ou não realizaram nenhum tipo de controle
(Zanon e Neves, 1987).
Partindo deste pressuposto, o NNIS, utilizando os resultados do SENIC,
propõe a metodologia NNIS, que consiste em um sistema de vigilância
epidemiológica das IH, a partir de quatro componentes importantes para a sua
redução. São os componentes globais, componentes da unidade de terapia intensiva
(UTI), componentes cirúrgicos e os componentes dos berçários de alto risco
(Martins, 2001).
33
Atualmente, vários hospitais dos Estados Unidos e do Brasil utilizam um
ou mais componentes da metodologia NNIS para a vigilância epidemiológica das IH.
O serviço de prevenção de IH passou a ser considerado programa prioritário de
garantia de qualidade na área de assistência médica.
A infecção hospitalar tem aliado os epidemiologistas, que buscam, junto a
outros profissionais, melhorias nos serviços e diminuição dos custos Andreoli et al
(1994, p. 590) relatam que:
O paciente internado nos Estados Unidos da América corre um risco de
cerca de 5 a 10% de vir a apresentar uma infecção nosocomial. Essas
infecções resultam em taxas de morbidade e mortalidade importantes (cerca
de 1% dessas infecções é fatal, e outros 4 % contribuem para o óbito),
aumentando bastante os custos médicos (mais de US$ 1 bilhão por ano)
.
As infecções hospitalares, nos paises em desenvolvimento, representam
um importante problema de saúde pública, que não é universalmente reconhecido.
Na América latina, taxas de infecções hospitalares variam de 10 a 26% com um
impacto severo na morbidade e mortalidade e um considerável gasto financeiro
(Erdmann e Lentz, 2004).
Em um recente artigo publicado no Journal of the American Medical
Association, Young et al (2005) pesquisaram em 20% dos hospitais nos Estados
Unidos, e concluíram que as infecções hospitalares fazem com que os pacientes,
em média, permaneçam 9,58 dias adicionais no nosocômio, com um custo acrescido
em U$38.656,00 em sua hospitalização e aumentam o risco de morte em 4,31%. Em
resposta a esta problemática de âmbito nacional, a Joint Commission on
Accreditation of Hospital Organizations (JCAHO) aprovou normativas que
proporcionam mecanismos que impeçam a ocorrência de infecção.
34
3.1.3 As Infecções Hospitalares no Brasil
No Brasil, o início das preocupações com infecções hospitalares surgiu
com o processo de industrialização acelerado, promovido pelo governo de Juscelino
Kubischek, com o desenvolvimento de ações voltadas para seu controle e
prevenção. Estas ações foram impulsionadas pelos problemas decorrentes dos
surtos por estafilococos resistentes à penicilina, enfrentados pelos países com
medicina tecnologicamente avançada (Fernandes, 2000).
A primeira iniciativa para criação de uma CCIH (Comissão de Controle de
Infecção Hospitalar), data de 1963, no Hospital Ernesto Dornelles, em Porto Alegre –
RS (Pereira, 1987). Já na década de 70, vários hospitais criaram suas comissões de
controle, dentre os quais se destacam: Hospital das Clínicas da Universidade de São
Paulo, Hospital de Ipanema, Instituto Nacional de Previdência Social (INAMPS) e o
Hospital das Clínicas da Universidade Federal de Pernambuco e de Minas Gerais
(Rodrigues, 1997; Martins, 1998).
As primeiras portarias determinando a criação e organização de CCIHs
foram dirigidas especificamente para os hospitais do Instituto Nacional de
Previdência Social.
Em 1983, o problema da IH foi assumido pelo Estado, com o advento da
Portaria nº 196 do Ministério da Saúde, que determinou a obrigatoriedade de criação
de CCIHs em todos os hospitais brasileiros, sendo as secretarias de saúde
responsáveis por promover a sua implementação e fiscalização (Brasil, 1983;
Martins, 1998; Couto, 2003; Fernandes, 2000).
Somente a partir de 1985, com a repercussão da morte do ex-presidente
Tancredo Neves, em conseqüência de suposta infecção hospitalar, esta questão
35
assumiu maior dimensão, sensibilizando a população e, principalmente, os
profissionais da área de saúde.
Em razão de resultados poucos satisfatórios e inexpressivos decorrentes
da edição da Portaria nº 196, o Ministério da Saúde iniciou um programa de
treinamento de recursos humanos em várias regiões do país, a fim de capacitar os
profissionais de saúde para atuarem de maneira mais efetiva no trabalho de controle
das infecções hospitalares, junto com as CCIHs recém implementadas. Apesar de
todos esses esforços, incluindo gastos financeiros enormes com treinamentos,
manuais e contratações, o Ministério reconhece que somente 10% dos hospitais
criaram as comissões, não se verificando decréscimo nos índices de infecções
hospitalares ou melhora do funcionamento das mesmas (Anvisa, 2000; Couto,
2003).
Com a publicação da Portaria nº 140, de abril de 1987, foi criada a
Comissão Nacional de Infecção Hospitalar e, em 1988, o controle de infecção foi
oficializado como um programa nacional da Secretaria Nacional de Programas
Especiais, de acordo com a Portaria n
o
. 232, de abril de 1998 (Brasil, 1998; Martins,
2001).
Já na década de 90, com a publicação da Portaria nº 930, em agosto de
1992, notou-se um avanço na profissionalização das medidas ligadas ao controle
das infecções, ao determinar que todos os hospitais do país instituíssem, além das
CCIHs, Serviços de Controle de Infecção Hospitalar (SCIH), constituído por no
mínimo um médico e um enfermeiro, para cada 200 leitos. Caberia ao SCIH executar
as ações de controle de infecção determinadas pela CCIH. Em 1997, a Lei Federal
no 9.431, substituiu a Portaria n
o
930 de 1992, dando caráter definitivo às medidas
estabelecidas por esta Portaria (Brasil 1992; Martins, 2001).
36
Em 1998, foi editada à Portaria do Ministério da Saúde n° 2.616, que
passa a regulamentar as ações de controle de infecção hospitalar no país em
substituição à Portaria n° 930, de 1992. Essa Portaria traz novas diretrizes, tais
como: organização e competências da CCIH; Conceitos e critérios diagnósticos das
infecções hospitalares, orientações sobre a vigilância epidemiológica das infecções
hospitalares, dentre outros, até então pouco discutidos, constituindo-se assim, mais
um avanço no que se refere aos aspectos legais do controle das infecções
hospitalares no país.
No Brasil, apesar de não existirem estatísticas nacionais que revelem a
realidade do problema, estima-se, segundo o Ministério da Saúde, a taxa média de
infecção hospitalar em cerca 6,5% a 15%. Cabe lembrar que o índice de infecção
hospitalar varia significativamente, pois está diretamente relacionada com o nível de
atendimento e complexidade de cada hospital, conforme informado no Congresso
Brasileiro de Controle de Infecção e Epidemiologia Hospitalar em Salvador (2004).
[...] o Ministério da Saúde tem norteado as ações de saúde no sentido de
controlar e/ou melhorar a assistência. Em 1994, foi realizado,
simultaneamente, estudo e pesquisa nacional para conhecer e avaliar a
qualidade das ações em controle de infecção hospitalar. Os resultados
apontam incidência média de infecção hospitalar 15,5% e freqüência de
hospitais que executam procedimentos de risco corretamente 42,5%. O
objetivo deste estudo é fazer relato da situação das comissões de controle
de infecção hospitalar no contexto das políticas de saúde em Santa
Catarina. Existem, em todo o Estado, 177 comissões de controle de
infecção hospitalar, totalizando 77%. Atualmente, são 16 hospitais
acreditados em controle de infecção e 30 em preparação para avaliação da
acreditação (Silva, 2003, p.108).
As infecções hospitalares representam importantes causas de morbi-
mortalidade e aumentos significativos nos custos assistenciais. Estão associadas à
assistência à saúde em nível hospitalar e podem manifestar-se no período de
internação ou após as altas hospitalares. Seguindo a epidemiologia das doenças
infecciosas, as infecções hospitalares podem estar relacionadas a fatores
intrínsecos do hospedeiro, agente etiológico e fatores ambientais. Cerca de 70% das
37
infecções hospitalares são de origens endógenas e as demais são exógenas (Couto,
1999).
Estes índices projetam o tamanho da problemática das infecções
hospitalares, no entanto são extremamente variáveis, pois, dependendo do porte do
hospital, tipo, complexidade do atendimento, das características dos pacientes e dos
recursos disponíveis para o tratamento, bem como, do tipo de protocolo para coleta
na elaboração dos índices, pode, muitas vezes, haver distorção dos dados.
Abordar questões financeiras, em se tratando de saúde, é
indubitavelmente um tanto delicado. Isso tem requerido dos gerentes e dos
profissionais da saúde atenção especial, que, por um lado, precisam prestar
atendimento o mais eficaz e correto possível e, por outro lado, atender a restrições
orçamentárias e de custo operacional.
A importância de se atuar no controle efetivo da infecção hospitalar é no
sentido de se evitar maiores prejuízos, não somente do ponto de vista humano, mas
financeiro, político e social. Também nos hospitais públicos, onde as superlotações
são corriqueiras em conseqüência de uma série de fatores sócio-econômicos, tem-
se um ambiente propício ao desenvolvimento de microrganismos que são potenciais
contaminantes. Na abordagem de Martins (2001), enfatiza a extensa área física do
Brasil, uma população heterogênea , de uma forma geral, desnutrida, carente , baixo
poder aquisitivo e principalmente desinformada dentre outras peculiaridade. A
automedicação é prática rotineira para os individuo, os antibióticos com uso
indiscriminado e incorreto. No momento da necessidade de internação, o indivíduo,
já com resistência diminuída por diversos fatores ou doenças básicas, portador de
uma flora endógena alterada pelo uso prévio, incorreto e irregular de antibióticos,
terá um maior risco de contrair infecção hospitalar.
38
No quadro abaixo se percebe a grande variação dos números indicativos
das infecções hospitalares em uma Unidade de Terapia Intensiva de um hospital de
grande porte do município de Criciúma, no período de 2000 a 2004, segundo o sítio
da Infecção.
Tabela 1: Índice de infecção hospitalar em UTI segundo o sítio da infecção
2000 2001 2002 2003 2004
Trato respiratório 48,1 65,6 28,9 42,6 39,3
Trato geniturinário 33,3 25 39,5 24,7 26,8
Tecido tegumentar 11,1 3,1 0 3,7 16,1
Septicemia 7,4 0 26,3 22,2 12,5
Outros 0 6,3 5,3 7,4 17,9
Fonte: Bitencourt, (2006).
Segundo David (1998), a infecção é manifestada freqüentemente no
paciente grave, internado em UTI. Os métodos invasivos, como a cateterização
urinária, intubação traqueal, a ventilação mecânica e cateteres intravasculares são
responsáveis por grande número destas infecções, que podem levar a bacteremias
(secundárias). Os dados da tabela 01 demonstram oscilação significativa de
percentuais de infecção por sítios.
De qualquer forma, o sítio mais freqüente é o trato respiratório, o que é
compreensível, pois nas UTIs um grande percentual de pacientes permanecem em
ventilação mecânica e este é um processo invasivo que depende da obediência aos
princípios de anti-sepsia no processo, da resposta orgânica de cada indivíduo, de
seu sistema imunológico e da situação clínica atual e pregressa do paciente.
39
3.2 Microrganismos de Maior Incidência nas Infecções Hospitalares e
Domiciliares
O CDC (Centers for Disease Control and Prevention) estimam que de 5%
a 15% de todos os pacientes hospitalizados adquirem algum tipo de infecção
hospitalar. No entanto, mesmo com o avanço tecnológico, as taxas de infecções
hospitalares aumentaram 36% nos últimos 20 anos. Cerca de dois milhões de
pessoas, nos Estados Unidos, adquirem infecções hospitalares por ano e mais de
cem mil morrem em conseqüência delas. As infecções hospitalares representam a
quarta causa de mortes nos EUA, após doenças cardíacas, oncologias e acidentes
vasculares cerebrais (Tortora, 2005).
O meio ambiente hospitalar, incluindo o ar, a água e as superfícies
inanimadas que cercam o paciente, guarda íntima relação com as infecções
hospitalares, podendo proporcionar focos de contato e de transmissão (Andrade,
2000).
Muitos esforços foram dispendidos para matar ou impedir o crescimento
ou disseminação de microrganismos no hospital, pois o ambiente hospitalar é um
grande reservatório para uma variedade de patógenos. Cabe salientar que certos
componentes da microbiótica normal do corpo humano são oportunistas e com o
hospedeiro susceptível, cuja defesa está comprometida no hospital, o risco torna-se
iminente. Já em pessoas saudáveis, os microrganismos que causam infecções
hospitalares não resultam em quadro de enfermidade.
A maioria das infecções hospitalares causadas por microrganismos gram-
positivos aconteceu na década de 40 e 50. Em determinados momentos, a bactéria
gram-positivo Staphylococcus aureus era a principal causa das infecções
hospitalares. Na década de 70, os grandes vilãos das infecções hospitalares ficaram
40
a cargo dos bastonetes gram-negativos, como o E. coli e Pseudomonas aeruginosa.
Durante a década de 80, a bactéria gram-positiva resistente a antibióticos,
Staphylococcus aureus, os estafilococos coagulase-negativos e o Enterococcus ssp,
surgiram como patógenos nosocomiais. Na década de 90, as bactérias gram-
positivas foram responsáveis por 34% das infecções hospitalares e quatro
patógenos gram-negativos respondiam por 32% das infecções. Em 2000, a
resistência a antibióticos nas infecções hospitalares continuou sendo a grande
preocupação dos pesquisadores (Tortora, 2005).
Os principais patógenos relacionados à etiologia das infecções
nosocomiais, conforme Tortora (2005) estão descritas resumidamente na tabela 02,
pelo CPDC (National Nosocomial Infection Surveillance).
Estudos comprovam que as chances de se adquirir infecções hospitalares
são maiores se o paciente apresenta quadro infeccioso prévio, pois sua resistência
imunológica já está comprometida, porém, não se pode deixar de considerar a
parcela de responsabilidade conferida à má utilização de técnicas de assepsia de
áreas e artigos envolvidos.
As fontes de microrganismos que causam essas infecções classificam-se
em duas categorias: as fontes endógenas são causadas por agentes potencialmente
patógenos encontrados na flora normal humana do próprio paciente em virtude de
um desequilíbrio entre esses microrganismos e os mecanismos de defesa
antinfecciosa do doente. Admite-se que a maioria das infecções hospitalares seja de
origem endógena: as fontes exógenas podem ser causadas através da
contaminação ambiental ou das mãos colonizadas de pessoas. São microrganismos
da flora humana normal, transferida de outros pacientes ou do ambiente hospitalar, a
pacientes comprometidos (Zanon e Neves, 1987).
41
Tabela 2: Microrganismos envolvidos na maioria das infecções hospitalares
Microrganismos
% de Infecções
Totais
% Resistente a
Antibióticos
Infecções Causadas
Staphylococcus aureus,
estafilococos coagulase-
negativos,enterococos
34%
25 – 87%
Infecções do corte cirúrgico,
pneumonia sepse,infecções
trato urinário.
E.coli, Pseudomonas
aeroginosa, Enterobacter ssp.,
e Klebsiella pneumoniae
32%
3 – 34%
Pneumonia infecções do
corte cirúrgico.
Clostridium difficile
17%
Causa quase a metade de
todas as infecções
hospitalares.
Fungos (principalmente
Cândida albicans)
10%
Infecções trato urinário e
sepse.
Outras bactérias gram-
negativas( Acinetobacter,
Citrobacter,Haemophilus)
7%
Infecções trato urinário e em
cortes cirúrgicos.
Fonte: CPDC-National Nosocomial Infection Surveillance. (apud Tortora 2005)
Com relação à etiologia e fisiopatologia, Gallo (2003), diz que a infecção
nosocomial específica, que surgem mais freqüentemente em paciente de cuidados
intensivos inclui as infecções das vias respiratórias, vias urinárias, feridas cirúrgicas
e bactérias freqüentemente associadas com dispositivos invasivos.
Não se pode, porém, deixar de considerar a realidade dos hospitais
brasileiros, que possuem uma alta rotatividade em seus leitos, cuja limpeza e da
enfermaria não tem merecido as devidas considerações, acarretando um problema
que tende a se agravar, principalmente quando associado ao déficit de recursos
humanos no setor, levando a um desqualificado serviço de higienização.
Andrade et al (2000) relatam uma pesquisa realizada em um hospital
geral público de ensino e de pesquisa, localizado em uma cidade do interior do
42
Estado São Paulo, em que tecem algumas considerações acerca da importância de
se analisar as condições microbiológicas dos colchões do referido hospital, antes e
depois da limpeza de unidade terminal do paciente. Foram selecionadas algumas
especialidades por meio de sorteio aleatório. A limpeza foi realizada pelos
integrantes da equipe de enfermagem, por ação mecânica, isto é, pela fricção
manual, associada com solução detergente-desinfetante de fenol sintético, sendo a
orientação e a supervisão responsabilidade dos enfermeiros. Conclui ele
[...] embora as principais causas de infecção hospitalar estejam
relacionadas com os doentes susceptíveis à infecção e com os métodos-
diagnósticos e terapêuticos utilizados, não se pode deixar de considerar a
parcela de responsabilidade relacionada aos padrões de assepsia e de
higiene do ambiente hospitalar. Assim, tem sido responsabilidade da
enfermagem a busca por um ambiente hospitalar biologicamente seguro e
confortável, desde Florence Nightingale. Dentre as atividades executadas
no cotidiano dos hospitais há a limpeza de unidade, reconhecendo-a como
uma das formas de manter o ambiente hospitalar biologicamente seguro.
(Andrade et al, 2002)
Já Mundim et al (2001), em sua pesquisa salientam que foram analisadas
amostras de 50 colchões no período entre 2000 e 2001. Através de meios de
cultura, foi pesquisada a posição de colônias de Staphylococcus aureus em
colchões, visando avaliar a eficácia do procedimento de limpeza e desinfecção dos
leitos do Hospital Escola da Faculdade de Medicina do Triângulo Mineiro. As
amostras foram coletadas e semeadas pela técnica de esgotamento. Na análise
estatística, observou-se que houve crescimento de 15,6%, sendo 87,2% antes e
12,8% após a limpeza e desinfecção. Os resultados da pesquisa apontam que:
[...] embora o objetivo deste trabalho tenha sido somente relacionado ao S.
aureus, outros microrganismos tão patogênicos quanto essa bactéria pode
estar apresentando o mesmo padrão de comportamento já descrito, por
outros autores. Os autores concluem ser imprescindível que o processo de
desinfecção, nos leitos hospitalares, deva ser realizado de acordo com a
necessidade e não segundo critérios pré-determinados (Mundin et al, 2000,
p. 688).
Muito se tem estudado e pesquisado dentro do contexto infecção
hospitalar, como já descrito anteriormente. Tipple et al (2003, 249)trazem em seu
43
artigo algumas reflexões sobre medidas preventivas e a não adesão dos
profissionais da saúde às medidas de prevenção, afirmando que:
[...] aspectos preocupantes relacionados ao meio ambiente, decorrentes do
uso de materiais descartáveis apesar dos benefícios que representam para
a segurança, redução dos custos operacionais, dentre outros. Todas essas
questões são apresentadas como desafio para o ensino do controle de
infecção na formação dos profissionais da área da saúde e apresentam
alguns pressupostos norteadores. A formação profissional precisa
responder a essa indiscutível necessidade social e que começa a se
configurar em exigência legal. Nesse sentido, concordamos com alguns
autores quando afirma que realizar controle de infecção é uma
responsabilidade moral e legal, que torna a razão do trabalho verdadeira, a
lei, desnecessária, e valoriza o profissional de saúde e a profissão.
3.3 Assistência Domiciliar
A construção de um modelo assistencial que vislumbra não somente a
assistência hospitalocêntrico, mas uma complementação de trabalho, sempre foi o
sonho de muitos profissionais de saúde. Um modelo que possa dar subsídio para
evitar hospitalização desnecessária, humanizando o cuidado, resgatando a
autonomia do paciente, evitando intercorrências hospitalares em pacientes crônicos
e reduzindo o sofrimento de forma humanizada, em situação de cuidados paliativos.
Estudos realizados sobre gastos públicos com atenção à saúde, há
discrepância entre os gastos hospitalares em relação aos da atenção básica e de
média complexidade. A elevação do custo da atenção hospitalar está relacionada
com o alto índice de internação e com o crescente uso de alta tecnologia.
Corroborando com a análise, Anderson (1986, apud Duarte, 2000) onde
coloca que as intervenções na assistência domiciliar equivalem a um terço dos
custos das intervenções realizadas comparativamente em ambientes hospitalares.
Neste contexto, Cruz (2001) coloca que a implantação de serviços de
saúde em âmbito domiciliar pode ser a estratégia que possibilitará um maior
44
aproveitamento de leitos hospitalares e um melhor atendimento das necessidades
terapêuticas dos grupos humanos na comunidade.
Não há duvidas da necessidade de se expandir o atendimento fora do
âmbito hospitalar e, neste contexto, o Programa de Internação Domiciliar veio
auxiliar e garantir aos muitos usuários do sistema de saúde, um atendimento de
referência. Define-se, assistência domiciliar, internação domiciliar ou atenção
domiciliar, como um atendimento dispensado no domicílio, aos pacientes já
atendidos no hospital, que procura adequar os meios de saúde assistenciais
disponíveis aos recursos e às necessidades da comunidade a ser atendida, pelo
qual se pretende manter a continuidade do tratamento no ambiente familiar,
reduzindo assim, o tempo e/ou necessidade de internação hospitalar. Assim,
minimiza ainda o desgaste emocional familiar e do próprio paciente desencadeado
pela hospitalização. O Ministério da Saúde, em nota técnica do CONASS, de
02/2006, define internação domiciliar como sendo:
Conjunto de atividades prestadas no domicílio, a pacientes que exije
atenção mais intensa, mas que possa ser mantida em casa, desde que
disponha de atenção contínua de um cuidador treinado e supervisão por
pelo menos um membro da equipe de saúde; Direcionado à pacientes com
agravos agudos, ou crônicos agudizados, cuja internação hospitalar pode
ser evitada caso lhes seja assegurada assistência em casa. Evidentemente
necessitam cuidados mais freqüentes sobretudo, médicos e de
enfermagem. Seu alcance é tanto maior quanto mais intensivo for o cuidado
ofertado em casa, e quanto mais ágil e eficiente for à retaguarda para uma
eventual internação. (CONASS – Nota Técnica 02/2006).
A Agencia Nacional de Vigilância Sanitária (ANVISA, 2003), coloca que o
termo genérico “Assistência Domiciliar” representa diversas modalidades de atenção
à saúde desenvolvidas no domicílio, entre elas o Atendimento e a Internação
Domiciliar. O “Atendimento Domiciliar” é um conjunto de atividades de caráter
ambulatorial, programadas e continuadas, por meio de ações preventivas e/ou
assistenciais, com participação de equipe multiprofissional. Já o termo “Internação
Domiciliar” representa um conjunto de atividades caracterizadas pela atenção em
45
tempo integral para pacientes com quadro clínico mais complexo e necessidade de
tecnologia especializada e recursos humanos, equipamentos, materiais,
medicamentos, atendimento de urgência/emergência e transporte.
Para melhor entendimento, cabe ressaltar que há muitos anos vem sendo
discutida a questão da assistência domiciliar, conforme descreve Ramallo & Tamayo
(1998 apud Rehen e Trad, 2005), referindo que o surgimento desta forma de
assistência deu-se em 1947, nos EUA, com o intuito de descongestionar a área
hospitalar e proporcionar ao paciente e o familiar um ambiente psicologicamente
mais favorável. Essas experiências multiplicaram-se na América do Norte e na
Europa. Em 2000, nos EUA, a National Association for Home Care, revelou que
havia 20.215 organizações cobrindo mais de oito milhões de pacientes por ano.
No Brasil, a assistência hospitalar teve inicio na época da colonização. A
partir da década de 1920, com a criação do Departamento Nacional de Saúde
Pública, a assistência hospitalar no Brasil estaria cada vez mais relacionada com as
políticas de Previdência Social.
A oferta de leitos hospitalares, a partir de 1930, foi ampliada e mostrou
que houve dois importantes momentos de crescimento da rede hospitalar brasileira.
No primeiro, entre os anos de 1933 e 1942, o número dos estabelecimentos cresceu
90%, e depois, entre os anos de 1965 e 1976, quando os índices de crescimento
ficaram em torno dos mesmos 90% de crescimento. Já entre os anos de 1984 e
1996 observou-se um decréscimo de 6,9%.
A assistência hospitalar assume grande importância na prestação de
serviços de saúde por volta de 1945, consolidando-se, em menos de uma década,
como elemento central deste sistema. Esse processo demandou novas relações
entre profissionais e novas formas de pensá-lo e geri-lo (Schraiber, 1997).
46
A partir da década 50, a assistência médica centrou-se definitivamente no
ambiente hospitalar. A Organização Hospitalar define hospital como sendo uma
“Instituição destinada a internar, para diagnóstico e tratamento, as pessoas que
necessitam de assistência médica diária e cuidados constantes de enfermagem”
(Perrone, 1958). Assim, a partir deste conceito, os hospitais são classificados como
todo estabelecimento de saúde que assume internação, independentemente do
número de leitos. Esta divisão, inclusive, subdivide os estabelecimentos de saúde
em hospitalares e para-hospitalares.
Ainda que a atenção hospitalar seja indiscutivelmente importante e
imprescindível, não é a única e, sequer, a mais importante. Com o envelhecimento
da população e a cronificação de certas doenças, modalidades alternativas à
hospitalização, que utilizam o domicílio como lugar de cuidado tem apresentado
rápido e expressivo crescimento no Brasil. Entre elas, a internação domiciliária
(www.saude.gov.br).
Em abril de 2002 foi sancionada pelo Ministério da Saúde a Lei nº 10.424,
que estabelece, no âmbito do SUS, o atendimento e o PID (Programa de internação
Domiciliar). Essa Lei inclui, principalmente, os procedimentos médicos, de
enfermagem, fisioterapêuticos, psicológicos e de assistência social, necessários ao
cuidado integral dos usuários em seu domicílio (Brasil, 2002).
O cuidado com os Programas de Internação Domiciliar representa uma
estratégia na reversão da atenção centralizada nos hospitais para a construção de
nova lógica com enfoque em promoção e prevenção à saúde, diminuição de riscos e
humanização da atenção. Devem ser engendradas estratégias para permitir sua
implantação na rede pública e, com isso, contribuir para a definição de políticas
47
públicas de saúde rumo à efetivação dos princípios do Sistema Único Saúde (Silva,
2005).
O Ministério da Saúde preconiza a internação domiciliar como uma diretriz
para a equipe básica de saúde, destacando que a mesma não substitui a internação
hospitalar e que deve ser sempre utilizada no intuito de humanizar e garantir maior
conforto à população. Para tanto, deve ser realizada quando as condições clínicas
do usuário e a situação da família o permitir (Brasil, 1997).
A ampliação de cuidados domiciliares como estratégia nos serviços de
Internação Domiciliar configura novos saberes e fazeres na equipe de saúde que
valorizam características do trabalho voltadas para a integralidade, intersubjetividade
e cuidado centrado na família. (http://www.ufmg.br/redeunida/oficinas)
A partir da alta hospitalar, torna-se fundamental uma interação entre
nosocômio e domicílio, integrando a atuação nesses dois espaços, de modo a
permitir a continuidade da assistência com maior efetividade das ações, diminuição
das re-internações e, por conseguinte, redução de custos na saúde.
Nos últimos tempos, esta prática tem sido crescente no mundo. Um
movimento que busca respostas para os altos custos com a rede hospitalar é a
insatisfatória resposta comprovada pelos indicadores de qualidade de saúde das
populações. A análise dos gastos públicos com atenção à saúde revela que há
disparidade entre os gastos hospitalares e os gastos na atenção básica e de média
complexidade (Silva, 2005).
Os cuidados de saúde a domicílio constituem uma oportunidade
desafiadora e recompensadora de prestar atendimento às pessoas, constituindo
uma área que mais cresce na prestação do cuidado de saúde. A enfermagem
participa ativamente desse processo e este cuidar universal já vem de uma tradição
48
na história da enfermagem. Segundo a American Nurses Association (1986, apud
Hood e Dincher,1995, p.267):
A atividade de enfermagem em saúde comunitária promove e preserva a
saúde das populações, integrando as habilidades e os conhecimentos que
são relevantes à enfermagem e a à saúde pública. A prática é abrangente e
geral, não se limitando a uma faixa etária especial ou a um grupo de
diagnóstico; ela é contínua e não limitada a um atendimento eventual.
3.4 Mutagenicidade e Genotoxicidade
A genotoxicidade é o setor da genética que estudam os processos que
alteram as bases genéticas da vida, seja nas estruturas físico-química do DNA, em
que os processos são classificados de mutagênese, seja nas alterações do
determinismo genético a nível celular ou orgânico, onde são identificados
respectivamente como carcinogênese e teratogênese. A mutagênese,
carcinogênese e teratogênese são agrupadas em uma área de estudo porque um
mesmo processo ou produto pode produzir os três efeitos. Cada área destas tem
suas peculiaridades e possui os seus especialistas em função da complexidade dos
processos e nível de conhecimentos destas áreas da ciência. Atualmente estão
sendo intensamente pesquisados, pois se relacionam com malformações, doenças
congênitas, genéticas e degenerativas, envelhecimento celular e do corpo, câncer,
entre outras doenças (Erdtmann, 2003).
Ao referenciar mutação, o mesmo autor a refere como sendo qualquer
alteração de DNA. Mas quando se analisa todo o processo de mudança do DNA,
nota-se que alguns são chamados de normais, pois são previstos e regulados
geneticamente.
49
O aparecimento de mutações está associado ao desenvolvimento de
neoplasias. Após passar por várias divisões, uma célula poderá acumular mutações
que, se em número elevado, poderão determinar a perda do controle de sua divisão,
determinando, assim, o aparecimento do câncer (Ribeiro et al, 2003).
Os mecanismos de mutagênese e carcinogênese parecem estar
intrinsecamente ligados. A mutação é uma conseqüência do dano no DNA e este
pode ser o estágio inicial no processo pelo qual a maioria dos carcionógenos
químicos inicia a formação do tumor. Muitos estudos têm mostrado que mutações
em vários genes críticos têm sido encontradas nas neoplasias. Os primeiros genes
identificados foram os que ocorrem em um ou poucos códons críticos, podem gerar
um produto gênico ativado que causa a transformação celular. Por outro lado, há os
genes supressores de tumor, que codificam proteínas essenciais para o controle do
crescimento celular. Quando esses genes são inativados por perda da seqüência ou
mutação, podem resultar em crescimento celular aberrante (Ribeiro et al, 2003).
As mutações podem ser classificadas em mutações gênicas e
cromossômicas. Mutações gênicas são modificações hereditárias que ocorrem em
um local gênico específico, podendo envolver substituição, adição ou perda de uma
única base. Mutações cromossômicas ocorrem quando as modificações forem
maiores alternando os cromossomos, sendo que as mutações estruturais são
aquelas que modificam a estrutura do cromossomo e mutações numéricas são
aquelas que alteram seu número (Borges-Osório e Robinson, 2001).
Das mutações pode decorrer uma série de problemas na grande maioria
maléfica, incluindo malformação, câncer, envelhecimento e morte. A mutação é a
origem de toda a variabilidade genética existente em todas as formas de vida, cujo
DNA possibilita também maravilhosas manifestações. Por isto se diz que sem a
50
mutação a vida seria inimaginável, apesar do potencial danoso que ela possui
(Erdtmann, 2003).
Encontra-se em nosso ambiente muitos agentes genotóxicos que podem
causar diversos efeitos sobre nossa saúde, alguns destes expressos imediatamente,
enquanto outros levam anos ou décadas para se manifestarem. Os principais efeitos
são os cânceres e doenças genéticas nas gerações seguintes. Muitos esforços têm
sido feito continuamente para identificar os agentes genotóxicos, a fim de se
reconhecer condições de exposição danosa e monitorar populações que podem
estar sofrendo exposição excessiva, com o objetivo de prevenir conseqüências
adversas sobre a população (Maluf e Erdtmann, 2003).
3.4.1 Testes de Genotoxicidade e Mutagênese
Os testes regulatórios de genética toxicológica constituem-se em uma
série de testes de mutagenicidade, bem definidos, selecionados para detectar
agentes químicos e físicos capazes de induzir mutações (Ribeiro et al, 2003).
Para avaliar a atuação de substância sobre o DNA de células expostas ou
até mesmo seus efeitos indiretos sobre este, foram desenvolvidos os testes de
mutagênese, estes podem avaliar a genotoxicidade de substâncias. A preocupação
sobre o efeito mutagênico e carcinogênico de agentes genotóxicos em seres
humanos expostos ocupacionalmente, acidentalmente ou por estilo de vida, é
crescente no meio científico (Villela, 2003).
Atualmente, existe uma grande quantidade de testes que permitem avaliar
a genotoxicidade, toxicidade ao DNA, a mutagênese, taxa de mutação e a
51
carcinogênese em uma grande variedade de modelos. Estes testes permitem
também avaliar se substâncias variadas possuem a capacidade de proteger o DNA
do ataque de outras substâncias, tanto inativando-as como promovendo um
aumento dos sistemas de defesa das células (Guecheva et al, 2001; Maluf e
Erdtmann, 2000).
3.4.2 Teste Cometa
O teste cometa pode ser realizado em qualquer organismo vivo ou tipo
celular, apresentando algumas vantagens quando comparado a outros testes,
porém, não é utilizado para detectar mutações, mas sim lesões genômicas.
Diferente das mutações, as lesões detectadas pelo teste cometa são passiveis de
correção. Assim sendo, o teste cometa pode ser também utilizado para estudos de
reparo do DNA, trazendo informações importantes sobre a cinética e o tipo de lesão
reparada, embora não possibilite inferir na fidedignidade do processo de reparo
(Ribeiro et al, 2003).
Este método pode ser realizado de horas a dias, além de ser aplicado a
qualquer célula de organismo vivo, tornando-o um excelente método para avaliações
ambientais, de fármacos e produtos químicos (Silva et al, 2000; Maluf e Erdtmann,
2000). Também pode ser avaliado o número de células que tiveram ou não o seu
DNA afetado e este valor é chamado de “freqüência de dano ao DNA”. É expresso
como porcentagem de células que tiveram algum dano mensurável ao seu código
genético.
52
A maioria dos estudos é realizada com amostras de sangue periférico,
sendo recomendado, quando possível, o isolamento de linfócitos, visto que outras
células nucleadas podem confundir a análise (Collins et al 1997).
O ensaio possibilita o acesso às quebras do DNA de uma célula e poucos
milhares de células (de 1 a 10.000 células) são suficientes para a sua realização
(Collins et al, 1997; Oliveira, 1999).
Resumidamente, a metodologia do teste cometa consiste na suspensão
de um pequeno número de células (sangue total) em fina camada de gel agarose,
sobre lâmina de microscópio. Estas células são lisadas in situ, ou seja, removendo
sua membrana celular e o conteúdo citoplasmático. Com a imersão destas laminas
em um tampão de pH 13,0 a 13,5, acontece o “desenrolamento” da cadeia de DNA.
Posteriormente, as lâminas são submetidas a uma corrente elétrica, eletroforisadas.
A corrente elétrica empurra o DNA para fora do núcleo, fragmentos de
DNA menores, mais relaxados, migram mais rapidamente no sentido da corrente.
Após a migração, é feita a neutralização e fixação. As lâminas são coradas com
agentes redutores como o nitrato de prata para serem analisadas no microscópio, e,
após essa seqüência, a imagem refletida, ou seja, o cometa permite avaliar a
extensão dos danos no DNA causados por agentes genotóxicos.
O Teste Cometa está esquematizado conforme mostra a figura 1.
53
Figura 1: Descrição simplificada do teste cometa
Fonte: Modificado de Silva, Erdtmann e Henriques (2003).
O teste do cometa é essencialmente um teste comparativo. Assim, é
sempre necessária a presença simultânea de controle negativo e positivo para os
experimentos. Deve-se ter em mente que não existe célula sem dano no DNA, visto
que o próprio metabolismo celular pode gerar em torno de 1000 lesões diárias no
DNA/célula (Ribeiro et al, 2003).
As células são classificadas visualmente em cinco classes (conforme
figura 2), de acordo com o tamanho da cauda, danos podem variar da classe 0 à
classe 4. Assim, o índice de danos de cada grupo estudado pode ir do zero (100x0;
100 células observadas completamente sem danos) a 400 (100x4; 100 células
observadas com dano máximo). (Villela et al, apud Silva et al, 2003), ou seja, o
índice de dano individual foi obtido pela soma dos produtos resultantes da
multiplicação do número de células em cada classe pelo valor correspondente à
classe de dano (zero - quatro), segundo a fórmula que se segue: índice de dano =
(número de células classe zero X zero) + (número de células classe um X um) +
54
(número de células classe dois X dois) + (número de células classe três X três) +
(número de células classe quatro X quatro). O índice de dano poderá variar de zero,
quando todas as células apresentam ausência de dano (50 x zero), até 200, quando
todas as células apresentam dano máximo (50 x quatro).
Figura 2: Classificação do dano ao DNA
Fonte: Modificado de Silva, Erdtmann e Henriques(2003).
3.5 Biocidas
Os materiais antimicrobianos são compostos dotados de capacidade de
inibir o crescimento ou matar determinados microrganismos. A aplicação desta
classe de materiais é muito vasta, podendo ser aplicados nos mais diversos
produtos e processos. A busca de alternativas para o controle ou eliminação de
microrganismos nocivos a saúde humana, durante toda a história da humanidade, se
apresenta como uma necessidade vital à permanência dos seres vivos. Para este
controle, os agentes biocidas vêm sendo aplicados há séculos.
55
Atualmente, a quantidade de produtos químicos sendo utilizados para o
controle dos microrganismos é enorme no mercado. Alguns desses compostos
químicos antimicrobianos reduzem o número de microrganismos nas superfícies de
materiais inanimados, como assoalho, mesas, camas, colchões, entre outros.
Outros, por sua vez, são utilizados nas lesões de pele para prevenir infecções. Ainda
há aqueles que eliminam microrganismos patogênicos das águas.
Durante a evolução da raça humana, muitas foram às epidemias
originadas por bactérias e vírus que direcionaram muitos ramos da ciência na busca
de métodos eficazes no combate de microrganismos nocivos à saúde. O
desenvolvimento de anti-sépticos cirúrgicos no século XIX marcou a introdução do
uso de desinfetantes. Desde esta época, o uso de água clorada, carvão e soluções
fenólicas puras foram aumentados significativamente no controle de infecções
hospitalares. Um número relativamente grande de compostos químicos foi
introduzido na fabricação de produtos que são hoje aplicados em escolas e
farmácias. Ainda hoje, mercúrio clorado, sulfato de cobre, peróxido de hidrogênio e
agentes liberadores de cloro são aplicados como agentes biocidas. São hoje
utilizados biocidas nos gêneros alimentícios e na medicina para aumentar a
longevidade dos alimentos e produtos farmacêuticos e para manter a esterilidade de
determinados compostos (produtos farmacêuticos) (Maillard, 2002).
Mesmo com o aumento do número de compostos capazes de agirem
contra tais microrganismos, muitas cepas bacterianas emergiram, tornando as
provas de sensibilidade uma necessidade prática para a humanidade. Desde então,
o elevado número de doenças geradas por microrganismos e a necessidade
extrema do desenvolvimento de novos métodos para o controle da proliferação e
prevenção de doenças causadas por agentes microbiológicos nocivos à saúde
56
humana, forçaram o direcionamento de linhas de pesquisa e o avanço da ciência. O
estudo e desenvolvimento de materiais com propriedades antimicrobianas, ou seja,
materiais que apresentam um potencial de eliminação de bactérias, fungos e outros
microrganismos.
Desta forma, a apresentação de produtos e técnicas pelas indústrias no
desenvolvimento de agentes com ação biocida, inibindo ou conduzindo à morte
colônias de determinados microrganismos, tem sido crescente. Muitos
procedimentos têm sido sugeridos e adotados no processo de desenvolvimento e
fabricação de produtos, visando o controle de possíveis doenças geradas por
microrganismos, proporcionando não só o combate à possível infecção do ser
humano após o contato com os microrganismos, mas também prevenindo as
doenças, não permitindo a infecção por agentes patológicos (Fiori, 2006).
As inúmeras atividades de pesquisa proporcionaram o desenvolvimento
de materiais com propriedades especiais, denominados materiais antimicrobianos.
Tais propriedades podem ser agregadas durante o seu desenvolvimento,
envolvendo técnicas específicas e formulações adequadas que apresentem ação
biocida e que, ao mesmo tempo, não comprometam as propriedades dos materiais,
ou sejam iatrogênicas.
Estes agentes antimicrobianos podem ser empregados na forma de
aditivos na fabricação de produtos antimicrobianos com destinos de aplicação
específicos. Muitas atividades de pesquisa têm sido realizadas recentemente
envolvendo investigações a respeito das atividades antimicrobianas de novos
compostos com o intuito de se obter níveis apropriados de desinfecção e
esterilização de superfícies e materiais, especialmente nos ambientes hospitalares.
57
A eficácia antimicrobiana de diversas formulações biocidas foi estudada e
relatada por pesquisadores, para vários agentes antibacterianos. Ainda, trabalhos
envolvendo alguns fatores que influenciam suas atividades foram realizados e
relatados muito bem por Russell e colaboradores (Russell et al, 1999). Os
mecanismos de ação dos biocidas têm sido estudados recentemente, no entanto os
registros ainda são limitados. Entender tais mecanismos, juntamente com a
influência dos fatores na atividade, tornou-se uma necessidade fundamental para o
melhor uso das formulações biocidas e para o controle dos microrganismos
(Maillard, 2002).
A utilização de agentes antimicrobianos como aditivos na produção de
materiais biocidas requerem avaliações rigorosas a respeito do efeito biocida no
material e da influência dos procedimentos adotados para a aditivação do material.
Muitos destes agentes são tóxicos em elevadas concentrações e sofrem
degradações a partir de determinadas temperaturas e tipos de atmosferas. Desta
forma, faz-se necessário à otimização do aditivo, de modo a se obter um material
biocida adequado às suas aplicações e o controle rigoroso das variáveis dos
processos adotados nos procedimentos de fabricação.
Alguns biocidas foram testados em espumas nesta pesquisa, sendo eles,
o triclosan, piritionato de zinco, isotiazolona, Maxgard 1000 e o Prottec MXD 600
biocidas estes, já produzidos em larga escala no mercado industrial.
58
3.5.1 Triclosan
Durante os últimos trinta anos, o triclosan tornou-se o bifenol mais potente
e extensamente usado. Triclosan tem sido testado extensivamente em estudos com
animais e humanos, toxicidade aguda, crônica, mutagenicidade, reprodução e
investigação de deformação foram revistos recentemente (Schweizer, 2001).
Triclosan é o ingrediente ativo em uma multidão de produtos de cuidado
médico e de consumo, com propriedades germicidas. É um sintético, não iônico,
agente antimicrobiano de amplo espectro, possui características antibacterianas,
algumas antifúngicas e de propriedade antivirais. Triclosan é bastante insolúvel em
solução aquosa, a menos que o pH seja alcalino, e prontamente solúvel na maioria
dos solventes orgânicos.
Os fenóis e compostos fenólicos foram descritos anteriormente, sendo
que um dos pioneiros a utilizar foi Lister, conforme aborda Tortora (2005, p. 194):
Lister foi o primeiro a usar o fenol (acido carbólico) para controlar infecções
cirúrgicas na sala de operação. O uso de fenol foi sugerido devido à sua
capacidade de controlar odor do esgoto. Nos dias atuais, ele é raramente
usado como anti-séptico ou desinfetante, pois irrita a pele e tem um odor
desagradável. Contudo, em concentrações acima de 1% (como em alguns
sprays para a garganta), o fenol tem um efeito antibacteriano significativo.
E continua descrevendo o autor que os derivados de fenol contêm uma
molécula de fenol, que foi quimicamente alterada para reduzir suas qualidades
irritantes ou aumentar sua atividade antibacteriana, em combinação com um sabão
ou detergente. Exercem atividades antimicrobianas, lesando as membranas
plasmáticas lipídicas, o que resulta em vazamento do conteúdo celular. Por estes
motivos, os compostos fenólicos são agentes aceitáveis para desinfetar o pus, a
saliva e as fezes.
59
Triclosan é um outro bifenol amplamente usado e seu uso está tão
difundido atualmente que foram relatadas bactérias mais resistentes a ele, criando
uma preocupação quanto ao efeito do triclosan sobre a resistência dos micróbios a
certos antibióticos.
Por apresentar elevada eficiência na ação antimicrobiana, aplica-se o
triclosan com concentrações relativamente baixas, da ordem de 0,05 a 1,50 % em
massa, de acordo com as funções solicitadas pelos produtos de interesse. O mesmo
apresenta um largo espectro de ação antimicrobiana, envolvendo bactérias Gram-
negativas e Gram-positivas, sendo de ação bacteriostática em baixas concentração
e bactericida em altas concentrações (Russell, 2004).
A estrutura molecular do Triclosan corresponde a um derivado de um éter
difenílico, conhecido por 2,4,4’ Tricloro-2’-éter hidroxidifenil ou 5-Cloro-2-fenol (2,4-
diclorofenoxi). A molécula (figura 3) apresenta peso molecular de 289,50 g/mol,
ponto de fusão entre 55
o
C e 58
o
C, aparência de pó branco, odor suave e
levemente aromático.
Figura 3: Molécula de Triclosan
Fonte: Tortora (2005).
O triclosan inibe as ações de uma enzima necessária para a biossíntese
de ácidos graxos (lipídeos), que afeta a integridade da membrana plasmática. É
60
especialmente eficaz contra bactérias gram-positivas, mas também funciona bem
contra fungos e bactérias gram-negativas. Existem algumas exceções, como
Pseudomonas aeruginosa, uma bactéria gram-negativa que é muito resistente ao
triclosan, bem como a muitos outros antibióticos e desinfetantes. Em concentrações
acima de 10%, o fenol tem um efeito antibacteriano significativo (Tortora, 2005).
3.5.2 Isotiazolona
Os biocidas são substâncias que inibem o crescimento de microrganismos
ou os extermina. São divididos basicamente em três categorias: os bactericidas, os
fungicidas e os algicidas. Os biocidas são utilizados para aumentar a vida útil de
uma infinidade de produtos industriais.
As isotiazolonas são substâncias com a formulação N-butil-1,2-
benziaotiazolin-3-ona, p
ossuem
nome químico ( benzotiazolonas) e sua estrutura
é observada na figura 4.
Figura 4: Molécula de Benzotiazolona
Fonte: Arch Chemicals, (2005)
61
O conhecimento da estrutura e da fisiologia celular das bactérias é
essencial para uma compreensão da atividade anti-bacteriana da benzotiazolona. A
parede celular mantém a forma e a integridade do organismo nas circunstâncias
osmóticas desfavoráveis. As paredes celulares das bactérias Gram-positivas
consistem em uma camada de peptídioglicano intimamente ligado com ácido
teicoico. Organismos Gram-negativos, por exemplo, Escherichia coli e a
Pseudomonas aeruginosa, possuem as paredes das células compostas de uma
camada de peptidioglicano, menos espessa do que aquela de organismos Gram-
positivos e ainda uma membrana exterior formada lipoproteínas, fosfolipídios e
liposacarídeos.
A membrana citoplasmática, ao contrário da parede celular, tem pouca
força mecânica. Entretanto, sua integridade é vital para realizar muitas funções
celulares. Sua estrutura é considerada de uma bicamada de fosfolipídio em que as
proteínas são encontradas a várias profundidades. Estas proteínas podem ser
estruturais ou enzimáticas. A membrana citoplasmática é a barreira seletiva que
regula a passagem dos solutos para fora do citoplasma. Além, a membrana é o local
de inúmeros processos metabólicos.
O biocida isotiazolona, substituto do formaldeído, foi sintetizado, pela
Rohm and Haas, em 1964, e hoje é a base de bactericidas oferecidos por diversas
empresas.
Esse produto é comercializado no Brasil sob a denominação Vanquish
100, líquido marrom viscoso, inodoro, não é um produto inflamável, porém a
decomposição térmica pode liberar fumos tóxicos e irritantes. Quanto à exposição, é
informado em sua ficha técnica que é corrosivo para a pele e olhos; já no meio
ambiente, é extremamente tóxico à vida aquática.
62
3.5.3 Piritionato de Zinco
O consumo global de biocidas formulados para plásticos foi de 15.4
milhões de kg (34 milhões de libras) em 2005, aproximadamente um terço destes é
destinado à Europa e à América do Norte, conforme estimativas de Townsend
Polymer Information Service, como pode ser visualizada na figura 05.
(
http://www.addcomp.com)
Figura 5: Consumo global de biocidas para plásticos 2005
Fonte: Townsend Polymer Information Service (2005)
Estes dados demonstram a crescente demanda na utilização dos biocidas
e o piritionato de zinco, que possui largo espectro em relação às bactérias, algas e
fungos, possui baixa toxicidade e esta entre os biocidas mais utilizados.
O piritionato de zinco é um composto orgânico apolar (insolúveis em
água), baixa polarização, com ligações covalentes (ligações entre ametais) e possui
em sua estrutura química C
10
H
8
N
2
O
2
S
2
Zn. Sua molécula é representada na figura 6.
63
Figura 6: Molécula de Piritionato de Zinco
Fonte: Guthery e Anderson (2005).
O pirtionato de zinco (ZPT) é um agente antifúngico amplamente utilizado
nas indústrias de cosméticos, principalmente para o tratamento de caspa e dermatite
seborréica. Também tem propriedades anti-bacterianas e é eficaz para muitos
patógenos como os Streptococcus e Staphylococcus. Outros usos envolvem o
tratamento de psoriasis, do eczema, pé de atletas, das dermatites atípicas, vitiligo,
entre outras. Enfatiza - se que nesta área de atuação há uma vasta literatura acerca
do biocida. ZPT é conhecido e utilizado por possuir efeitos bactericida e fungicida,
principalmente em produtos cosméticos. Possui uma longa história no contexto
médico por possuir numerosas aplicações científicas e industriais. O composto tem
uma linha mestra registrada com o FDA. De uns 1350 compostos selecionados, ZPT
era um dos compostos antifúngico e antibacteriano mais efetivo examinado
(Snyder,1965; Olin 1993). ZPT provou ser eficaz mesmo em concentrações baixas,
contra as bactérias gram-positivas, gram-negativas e os fungos.
A ficha técnica deste produto vendido no Brasil traz os seguintes dados: é
um produto antimicrobiano, sendo a composição química Mercapto-N-óxido, sólido
tóxico, orgânico, cor âmbar. Produto não inflamável, porém à exposição ao fogo
64
pode produzir gases nocivos. Quando da exposição, é irritante aos olhos e pele,
sendo possível o aparecimento de queimaduras. No meio ambiente, polui os rios, a
flora, o solo e o ar e prejudica a fauna.
65
4 MATERIAIS E MÉTODOS
Este trabalho foi dividido em duas grandes etapas, a saber: etapa
laboratorial e etapa de campo. Na etapa laboratorial desenvolveram-se e
otimizaram-se as espumas e a metodologia a ser empregada nas análises
microbiológicas. A primeira etapa serviu de subsídio para otimização e fabricação
dos colchões. Após os mesmos foram alocados em residências de pacientes
acamados, para avaliação da efetividade dos princípios antimicrobianos utilizados.
4.1 Local de Estudo
O presente estudo iniciou em 2005 e foi desenvolvido em diferentes
locais, a saber:
Empresa Mannes, fabricante e fornecedora das espumas com e sem
os princípios antimicrobianos e dos colchões para pesquisa.
Laboratório de Desenvolvimento de Biomateriais e Materiais
Antimicrobianos (LADEBIMA) da UNESC, sob a coordenação do Dr.
Elidio Angioletto.
Laboratório de Bioquímica - UNESC, sob a coordenação do Prof. M.Sc
Claus Troger Pich.
Residência de duas pacientes participantes da pesquisa. A primeira no
bairro Cristo Redentor e a segunda no bairro Santa Augusta, no
município de Criciúma.
66
4.2 Procedimentos Éticos da Pesquisa
O projeto de pesquisa foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da
UNESC, sob número 360/2006 (anexo 01), em atendimento às Normas de Pesquisa
em Saúde do Conselho Nacional de Pesquisa em Saúde, Resolução nº 196, de
outubro de 1996.
Em cumprimento aos preceitos éticos, que têm como principal objetivo a
garantia do respeito às pessoas, a justiça e eqüidade, foram explicitadas todas as
fases do projeto aos participantes e depois de manifestarem ter compreendido e
aceito, assinaram o Termo de Consentimento Livre e Informado (Apêndice 01), no
qual constam os objetivos da pesquisa, da possibilidade de sua desistência em
qualquer etapa da mesma, da manutenção de sua identidade em sigilo, de sua
autorização para publicação dos dados e as formas de contato com a pesquisadora
e Comitê de Ética.
4.3 Análises Laboratoriais
Para uma melhor compreensão da metodologia empregada na pesquisa,
elaborou-se um fluxograma para visualização dos caminhos percorridos,
apresentados na Figura 7.
67
Figura 7: Fluxograma da metodologia empregada
Fabricação das
E
spumas
Com e sem os princípios antimicrobianos
(empresa Mannes)
Amostras das Espumas:
Triclosan;
Isotiazolona
Piritionato de Zinco
Maxgard 1000
Prottec MXD 600
Análises Laboratoriais
Teste da Toxicidade doTween 80
Contagem de Células Viáveis
Teste de Difusão Agar
Teste Genotoxicidade
Escolha do
B
ioc
ida
Princípio antimicrobiano mais efetivo para
fabricação do colchão (espuma)
Fabricação dos Colchões
Com o princípio antimicrobiano pela Empresa
Mannes.
Análise
L
aboratorial do
C
olchão no
D
omicílio
Resultados e Discussões
68
4.3.1 Fabricação das Espumas com o Princípio Antimicrobiano
No laboratório da empresa MANNES, iniciou-se uma série de testes
utilizando como base as espumas empregadas na fabricação de colchões. A esta
espuma base, foram adicionados diversos princípios antimicrobianos em três
concentrações distintas, 02%, 05%, 1%, em massa.
Os princípios ativos testados foram: Triclosan, Isotiazolona, Piritionato de
Zinco, Maxgard1000, Prottec MXD 600 e o branco (sem princípio ativo). No
laboratório experimental da empresa Mannes, foram fabricadas as espumas, em um
equipamento (protótipo), conforme visualizada na Figura 8. O aspecto do produto
final, a espuma, pode ser observado na Figura 9.
Figura 8: Equipamento utilizado na fabricação de espuma em laboratório
Fonte: Empresa Mannes (2007)
69
Figura 9: Espuma de poliuretano aditivada com biocidas
Fonte: Empresa Mannes (2006)
4.3.2 Análise do Potencial Antimicrobiano das Espumas
Desenvolveu-se uma metodologia específica para a análise do potencial
antimicrobiano das espumas. A metodologia sugerida no protocolo da empresa
Mannes, Modified New York State Test Protocol to be followed for evaluation of PU
Antibacterial Sponges, não se apresentou eficaz nos testes das espumas.
Foram utilizados na etapa laboratoriais os seguintes procedimentos e
métodos: Técnica de POUR PLATE, Teste de Difusão em Agar, Contagem de
Células Viáveis, Estudo da Toxicidade do Tween 80, Mutagenicidade por Teste
Cometa.
4.3.3 Ativação dos Microrganismos
Para realização dos testes de Difusão em Agar, Contagem de Células
Viáveis, Estudo da Toxicidade do Tween 80 e a Mutagenicidade por Teste Cometa,
70
foi necessária a ativação de diversos microrganismos, todos registrados no
American Type Culture Collection (ATCC). A descrição dos microrganismos e
conseqüentes registros junto ao ATCC podem ser visualizados na tabela 3.
Os microrganismos utilizados na pesquisa foram adquiridos junto à
fundação André Toselo, e cedidos pelo LADEBIMA da Universidade do Extremo Sul
Catarinense.
Tabela 3: Microrganismos padronizados pela ANVISA
Microrganismos Sigla usada
Procedência
Bacillus subtilis
BS ATCC 6633
Escherichia coli
EC ATCC 8739
Pseudomonas aeruginosa
PA ATCC 9027
Salmonella choleraesuis, e
SC ATCC 14028
Staphylococcus aureus
S A ATCC 25923
Cândida albicans sp.
CA ATCC 10231
Fonte: fundação André Toselo - cedido por LADEBIMA (2006)
O método empregado para ativação dos microrganismos foi o
padronizado pelo laboratório – LADEBIMA - e descrito em literatura como JIS – L-
1902 (1990, apud ANGIOLETTO 2003), ou seja, os microrganismos permanecem
em refrigeração a - 45
o
C. Os microrganismos testados são retirados da refrigeração
e expostos à temperatura ambiente para descongelar; após esta etapa, foram
preparados dois tubos contendo 10 mL de meio de cultura Brain Heart Infusion
(BHI), um para o experimento e o outro para manutenção do banco de
microrganismos.
Destes meios, foi retirada uma alíquota de 0,3 mL dos microrganismos
descongelados e colocados em cada um dos dois tubos; em seguida, levou-se os
71
tubos contendo Brain Heart Infusion (BHI) e microrganismos para a estufa a 37
o
C,
por 24 horas. Decorrido o tempo determinado, verificou-se o turvamento.
Com um dos tubos, procedeu-se o congelamento do microrganismo. No
outro tubo, procedeu-se a inoculação, utilizando a concentração equivalente à
turvação 0,5 da escala Mc-Farland (Pelkzar et al, 1998), ajustando através das
diluições seriadas, para uma concentração inicial de 10
6
colônias por mL.
4.3.4 Meio de Crescimento e de Cultura
Em função do número de amostras foram preparados os meios de cultura
Ágar Plate Count (PCA – Plate Count Agar de 500g – HIMEDIA Laboratorios Pvt.
Limitada – Índia) e Ágar Sabouraud a 2% ( Agar Sabouraud a 2% - 500g - ISOFAR –
Rio de Janeiro.) para as leveduras e fungos.
O caldo nutriente utilizado foi o BHI – Brain Heart Infusion – 500g / 13,5
litros, OXOID Laboratório.
4.3.5 Técnica de POUR PLATE
Foram realizados testes que serviram para avaliações qualitativas, de
acordo com a existência de halo de inibição, demonstrando a atividade dos
princípios ativos: triclosan, Isotiazolona, Piritionato de Zinco, Maxgarden 1000 e
Prottec MXD 600 e a espuma sem o principio antimicrobiano, todos aplicados com
fins bactericidas.
72
Na técnica de Pour plate, a inoculação do microrganismo em Agar é feita
antes de sua solidificação, mas, ao retirar o meio da autoclave é necessário
arrefecer o preparado a uma temperatura de até 45
o
C. Nesta técnica, o meio de
cultura arrefecido, mas ainda líquido, é misturado com inóculo de bactérias,
posteriormente vertido em placas de petri e incubado. Assim, as colônias podem
desenvolver-se por todo o meio.
Para a técnica de Pour plate ou incorporação, primeiramente procedeu-se
à esterilização de todo o material utilizado no experimento. O material foi
autoclavado conforme preconiza o manual e normas técnicas do MS (2001),
orientações gerais para Central de Esterilização.
Inicialmente, procedeu-se a ativação dos microrganismos conforme
descrita no item 4.3.3. Em seguida, retirou-se 100 µl de microrganismos que foram
inseridos nas placas de petri esterilizadas já identificadas. Em seguida, procedeu-se
à colocação de15 mL de Agar líquido, executando-se movimentos rotativos na placa
sobre a bancada, fez-se a homogeneização. Colocaram-se os corpos de provas e
após a completa solidificação do Agar, inverteu-se a placa, colocando em estufa de
Pasteur a 37
o
C por 24 horas.
Após o período de incubação, procedeu-se a leitura e análise dos dados.
Todos os testes foram realizados em duplicata e o resultado é a média aritmética.
4.3.6 Teste de Difusão em Agar
O meio de cultura utilizado nos testes para as bactérias aeróbicas foi o
Plate Count Agar. Para a realização dos testes com as leveduras, foi utilizado o meio
de cultura Agar Sabouraud 2%.
73
Utilizou-se as amostras (espumas) com dimensões aproximadas de 5mm
por 2mm, disponíveis com a concentração máxima de principio ativo, ou seja:
Triclosan 1%, Isotiazolona 0,5% , Piritionato de Zinco 1,0% e Maxgard 1000 0,5% ,
Prottec MXD 600 e a espuma sem o princípio ativo.
Primeiramente as espumas foram colocadas em placas de petri,
esterilizadas, em seguida pulverizadas em ambos os lados com álcool 70%, de
forma a fazer uma desinfecção nas mesmas. Após a desinfecção, as espumas
(amostras) foram colocadas em estufa de Pasteur, numa temperatura de
aproximadamente 40
0
C, para secagem.
Os microrganismos foram padronizados pela escala 0,5 de Mc Farland
(aproximadamente 10
6
microrganismos por mL). Inoculou-se 100 µl de
microrganismos com PCA líquido (técnica de POUR PLATE). Realizou-se leves
movimentações circulares com as placas contendo os microrganismos e PCA
líquido, para que a homogeneização completa fosse conseguida. Em seguida
colocaram-se as amostras de espumas submersas em cada placa contendo PCA,
deixando solidificar e em seguida incubou-se por 24 horas.
Decorrido o período de incubação, foram efetuadas as leituras e
mensuração do diâmetro do halo de inibição. Todos os testes foram realizados em
duplicata e o resultado é a média aritmética.
4.3.7 Teste de Toxicidade do Tween 80
Para dar prosseguimento aos testes, fez-se necessária a verificação da
toxicidade do Tween 80 e sua influência sobre os microrganismos, por ser este
74
detergente e neutralizador necessário na realização dos testes laboratoriais. A
metodologia empregada é de utilização do LADEBIMA com adaptações da ANVISA
(2006).
Para demonstrar a influência do surfactante Tween 80 sobre os
microrganismos, foram realizados testes com diferentes concentrações frente ao
tempo de incubação.
O microrganismo utilizado para este experimento foi bactéria
Staphylococcus aureus. As concentrações do surfactante Tween 80 foram 0%,
0.5%,1.0%, 2.0%,5.0% e 10.0% nos diversos tempos, ou seja, T
0
, T
1
, T
2
, T
3
, T
6
e
T
12
. Este tempo esta representada nos subscritos em horas de exposição dos
microrganismos.
Primeiramente, preparou-se 10 mL de solução salina e se colocou o
Tween 80 nas concentrações 0%, 0.5%, 1,0%, 2,0%, 5,0% e 10,0%. A seguir
ajustou-se o microrganismo conforme escala 0,5 de Mc Farland. Em seguida, em
cada tempo, retirou-se uma alícota de 1 mL da solução salina com o Tween 80 em
diversas concentrações e inoculou-se em meio PCA; com auxilio da alça de
Drigalski , semeou-se as placas de Petri nos tempos: T
0
, T
1
,T
2
,T
3
,T
6
e T
12.
A cada tempo estipulado, as placas de petri foram sendo semeadas e
após colocadas em estufa de Pasteur a 37
o
C, num período de 24 horas e após
este período procedeu-se a leitura dos resultados.
4.3.8 Contagem de Células Viáveis em Função do Tempo
A metodologia empregada para este teste seguiu a padronização do
LADEBIMA, e as amostras foram divididas até que atingissem as dimensões de 2,5
75
x 2,5 x 5 mm. A seguir, estas amostras foram desinfectadas com álcool a 70%, e
levadas à estufa a 40
0
C para secagem.
Realizada esta primeira etapa, foram colocadas em tubos de ensaios
contendo 10 mL de solução salina e inserido 0,1 mL de detergente e neutralizador,
o surfactante Tween 80.
Procedeu-se movimentação sistemática e repetitiva do tubo até a
completa homogeneização da solução e, a seguir, diluiu-se o número de
microrganismos – bactérias selecionadas, conforme escala 0,5 de Mc Farland, com
aproximadamente 10
6
microrganismos por ml.
Inoculou-se 1 ml do microrganismo
diluido dentro do tubo com salina e com o Tween 80, agitando-se vigorosamente.
A seguir, as amostras foram inseridas dentro dos tubos de ensaio. O
passo seguinte foi transferir uma alíquota de 100 µl para uma placa de Petri
contendo meio PCA e, com auxílio de uma alça de Drigalski espalhou-se o
preparado de maneira uniforme por toda a placa.
Depois de semeadas em seus respectivos tempos, as amostras foram
colocadas em estufa de Pasteur a 37
o
C, por 24 horas. As amostras foram feitas em
duplicatas com os dois microrganismos nos tempos: T
0
, T
1
,T
2
,T
3
,T
6
e T
12.
Decorrido o período de incubação, foi efetuada a leitura de todas as
placas. Todos os testes foram realizados em duplicata e o resultado é a média
aritmética. Ao término desta análise, foi possível identificar o princípio que melhor
expressou efetividade para realizar o teste cometa e a confecção do colchão, que foi
alocado na residência dos dois participantes da pesquisa.
76
4.3.9 Estudo de Genotoxicidade
Entre os efeitos residuais que os princípios antimicrobianos podem causar
está a genotoxicidade. Desta maneira, foram avaliados neste estudo os possíveis
danos ao DNA causados pelo princípio antimicrobiano piritionato de zinco
incorporado à espuma nas concentrações de 0,2%, 0,5% e 1,0 %, tendo como
controle negativo à espuma sem o princípio (branco) e a água. O teste foi realizado
com este princípio antimicrobiano pelo fato de o mesmo apresentar melhor
efetividade na maioria dos testes microbiológicos realizados. O estudo de
genotoxicidade foi realizado com base no protocolo do ensaio cometa em sangue
total, executado junto ao grupo de Pesquisa em Imunologia e Genética da
Universidade do Extremo Sul Catarinense, sob a orientação do Profº. Claus Tröger,
Pich, no laboratório de Bioquímica da UNESC.
4.3.9.1 Obtenção de Sangue Total e Tratamento
Foram selecionados oito indivíduos (A - H) de ambos os sexos, idade
entre 18 a 55 anos, não fumantes, sem uso de qualquer tipo de droga ou tratamento
médico. Após a leitura e assinatura do termo de consentimento livre e esclarecido
(Apêndice 1), procedeu-se a coleta de sangue conforme técnica citada por Pagana
(2001), para a qual se utilizou seringas de 10 ml descartáveis, previamente
heparinizadas. O volume coletado foi transferido para tubos de ensaio de 5 mL.
Amostras de 200µl (0,2mL) de sangue total foram inseridas em um
eppendorf contendo espuma de tamanho aproximado de 1,5 cm, formato piramidal,
77
nas concentrações de 0,2% 0,5% e 1,0%. Estes foram incubados a 37ºC por duas
horas.
Após este período, as amostras foram centrifugadas em um equipamento
de modelo - Centrifuge Eppendorf 5415 D, com velocidade de 2500 rpm durante
sessenta segundos. O processo foi realizado pela necessidade de separar o sangue
das amostras de espumas.
Para melhor identificação foram padronizadas as amostras com as
devidas concentrações sangue total e produto, conforme visualização da tabela 04.
Tabela 4: Esquematização de padronização das amostras de sangue total
0,2%
Concentrações
0,5%
1,0%
Branco/sem
princípio
Água
Doador A A1E A2E A3E A4 A5E
Doador B B1E B2E B3E B4 B5E
Doador C C1E C2E C3E C4 C5E
Doador D D1E D2E D3E D4 D5E
Doador E E1E E2E E3E E4 E5E
Doador F F1E F2E F3E F4 F5E
Doador G G1E G2E G3E G4 G5E
Doador H H1E H2E H3E H4 H5E
Fonte: Dados da pesquisadora
A primeira letra representa o individuo doador de sangue. O número
representa a concentração, ou seja, 0,2%, 0,5% e 1,0% correspondem aos números
1, 2 e 3 respectivamente. Os números 4 e 5 correspondem ao branco e água,
respectivamente. A letra E indica a espuma contendo o princípio ativo, Piritionato de
Zinco.
78
4.3.9.2 Teste Cometa
Após esta etapa do tratamento, as células foram colhidas e dissolvidas
em agarose low-melting point (0,75%) e colocadas sobre uma lâmina de microscopia
com pré-cobertura de agarose (1,5%). As lâminas foram feitas em duplicata para
cada tratamento. As células em agarose, foram lisadas com uma solução de lise
(2,5M NaCl, 100mM EDTA, 10mM de Tris, 1% Triton X-100 e 10% DMSO pH 10) por
no mínimo duas horas. Após o processo de lise, as lâminas foram colocadas em
uma cuba de eletroforese horizontal contendo uma solução tampão (300mM NaOH e
1 mM EDTA, pH 13,00-13,50 a 4°C), que permite o desenrolamento do DNA. As
lâminas foram incubadas por 20 minutos nesta solução alcalina. Após esta etapa,
ligou-se a fonte eletroforética PWSYS – 300PW a uma corrente elétrica com
intensidade de 300mA e 25 V sendo aplicada por 15 minutos a 4°C. Observa-se na
Figura 7, a esquematização do processo de eletroforese, em que (A) a matriz é
solidificada deixando em forma de poços; (B) as amostra são depositadas no poço;
(C) são submetidas a um campo elétrico; e (D) os fragmentos apresentam uma
migração diferencial.
Figura 10: Esquema representativo da eletroforese em gel de agarose
Fonte: Modificado de Oliveira (2006).
79
As lâminas foram então neutralizadas com solução de Tris, 0.4M,
reduzindo o pH de 13,0 para pH 7.5, com finalidade de controlar o pH da agarose,
que foi reduzido a 7,5. Aguardou-se cinco minutos, escorreu-se a solução
neutralizadora e se repetiu este processo de neutralização por mais duas vezes.
Depois de secadas em estufa a 37º C, por 90 minutos as lâminas foram
fixadas por uma solução contendo ácido tricloroacético a 15%, sulfato de zinco a 5%
e glicerol a 5% , ao final deste processo, as lâminas foram lavadas com água
destilada por três vezes e secas em estufa por 90 minutos a 37
0
C. e, então, fixadas
com solução corante contendo carbonato de sódio a 5% mais nitrato de amônio a
0,1%, nitrato de prata a 0,1%, ácido tungstosilicico a 0,25% e formaldeído a 0,15%
e incubadas durante 15 minutos, em banho-maria, a 37
0
C. Após a incubação, as
lâminas foram mergulhadas em uma solução de parada (ácido acético 1%.) por 5
minutos (Singh et al,1988; Hartmann e Speit, 1997).
Foi analisado um total de 100 células para cada grupo teste, 50 por
lâminas, em microscópio óptico NIKON
®
, com aumento de 400x, onde se observou
que os núcleos contendo DNA intacto se apresentavam redondos. Nas células
lesadas observou-se a migração de DNA para fora do núcleo, apresentando forma
similar a um “cometa”, de onde se origina a nomenclatura do teste (Figura 2).
Os dados foram registrados em um formulário previamente estabelecido
(Apêndice 2) . A análise estatística utilizada foi ANOVA.
80
Amostras Eppendorfs
identificados
Sangue total
inseridos no
eppendorf
As amostras na
centrifugadas
Amostra já
centrifugada
Amostras em
laminas
Colocadas em
geladeira
Retirar as
lamínulas
Amostras
Eletroforizadas
Amostras sendo
fixadas/coradas
Amostras
coradas
Amostras já
coradas
secagem
Figura 11: Esquema representativo do Teste Cometa
Fonte: Dados da pesquisadora
4.4 Etapa Desenvolvida nas Residências
O objetivo primordial do teste foi expor os colchões com o princípio ativo
Piritionato de Zinco 0,5% e os colchões sem o principio, no ambiente do paciente,
para averiguar a eficácia do mesmo quanto à propriedade antimicrobiana. As
pacientes participantes da pesquisa são idosas, com acidente vascular encefálico,
diabetes mellitus, acamadas, e necessitando de cuidados permanentes.
Foram fabricados dois colchões de poliuretano, com 0,5% de princípio
ativo piritionato de zinco, e dois colchões sem o princípio. Estes colchões foram
alocados em duas residências, com pacientes com patologias e condições sócios
econômicos semelhantes.
Dos colchões fornecidos pela empresa Mannes, retirou-se a napa
protetora, e se avaliou a presença de microrganismos diretamente na espuma. O
colchão com princípio antimicrobiano, com coloração branca, foi colocado na casa
81
um (C1). O colchão com a coloração cinza (sem o princípio antimicrobiano) foi
colocado na casa dois (C2).
Os colchões viscoelásticos não foram revestidos com a camada de napa.
Estes foram alocados na residência das pacientes no segundo período da pesquisa.
É pertinente colocar que foram realizadas para cada colchão, doze coletas, sendo
que as visitas ocorreram em dias alternados.
4.4.1 Descrições das Condições Gerais dos Pacientes
Casa 1: A paciente residente na Casa 1 é uma senhora aposentada de 68
anos uma filha, diabética, hipertensa, com história de AVE (Acidente Vascular
Encefálico) aproximadamente há um ano. A senhora N é totalmente dependente de
um familiar para atender suas necessidades básicas. Mesmo apresentando
movimentação normal em membro superior e inferior E, a Senhora N. realiza suas
necessidades fisiológicas no leito ( fraldas descartáveis), bem como higiene pessoal
e alimentação. A mesma é estimulada ao autocuidado, porém, inicialmente não foi
observada nenhuma mudança de comportamento. As condições gerais de higiene
na residência são extremamente precárias.
Casa 2: A paciente residente na casa 2, viúva, tem 80 anos, três filhos,
pensionista. Diabética, hipertensa e com história de AVE aproximadamente há 15
anos e com novo episódio anos depois. Foi atropelada e em decorrência ao acidente
apresenta atrofias em membros superiores. Há menos de dois anos perdeu o
esposo (alcoólatra) e a partir daquele momento, apresenta quadro depressivo,
segundo equipe do Programa Saúde da Família. A senhora I possui movimentação
82
restrita e severa, porém com auxílio de familiares e de pessoas da comunidade
permanece a maioria do período semi - sentada fora do leito. Suas necessidades
fisiológicas são feitas no leito (fraldas descartáveis). As condições gerais de higiene
na residência são extremamente precárias.
4.4.2 Ensaios Microbiológicos em Colchões de Poliuretano com e sem o
Princípio Ativo Piritionato de Zinco 0,5%
4.4.2.1 Preparação dos Meios de Cultura
No LADEBIMA, foram preparados os meios de culturas para receber as
amostras coletadas in loco. O meio de cultura utilizado nos testes para verificar a
existência de bactérias aeróbicas foi o Plate Count Agar. Para a verificação da
existência de fungos e leveduras foi utilizado o meio de cultura Agar Sabouraud 2% .
Utilizou-se o isopor no transporte das amostras coletadas das residências
até o LADEBIMA, em temperatura aproximada de 20
o
C. O trajeto percorrido para a
coleta das amostras nas casas das pacientes, pela pesquisadora foi de
aproximadamente 50 km/dia.
4.4.2.2 Coleta nas Residências
Primeiramente, foram mapeados no colchão os pontos de maior
permanência da paciente, ou seja, superior (S), meio (M) e inferior (I); Foram
83
realizados movimentos rotatórios com o swab estéril em cada ponto estipulado nos
colchões, ou seja, foram necessários doze swabs para cada coleta, seis para o meio
de cultura BHI e seis swabs em solução salina, cuja técnica é esquematizada na
Figura 12.
Utilizando swab estéril varreu-se uma área de 100 mm x 100mm em cada
ponto estipulado nos colchões. Após coletado a amostra do primeiro ponto
delineado, abriu-se o tubo contendo Caldo Nutriente Brain and Heart Infusion (BHI),
flambou-se a borda do tubo de ensaio, evitando assim, a contaminação do meio. Em
seguida, colocou-se 4 cm do swab já com amostra dentro do tubo. Realizou-se
novamente a flambagem e se procedeu –se o fechamento do tubo.
Este procedimento foi realizado nos demais pontos delineados nos
colchões de poliuretano. As amostras coletadas foram colocadas numa caixa de
isopor, em uma temperatura aproximada de 20
o
C e em seguida foram
encaminhadas ao LADEBIMA. A esquematização do procedimento pode ser
visualizada em Figura 12.
A. Material Utilizado B. Partes do Colchão C. Coleta com Swab D. Flambagem ponta
tubo
E. Corte do Swab
F. tubos contendo
solução salina e BHI
com swab
G. semeadura nas
placas
H. espalhamento com
alça de drygalski
I. incubação em
estufa de Pasteur
J. Placa semeada
e já incubada
Figura 12: Técnica da coleta de amostras em colchões com e sem o princípio ativo
Fonte: Dados da pesquisadora
84
4.4.3 No Laboratório LADEBIMA
No laboratório, as amostras coletadas foram colocadas em estufa de
Pasteur a 37
o
C, por 24 horas. Após o período de incubação, os tubos contendo o
meio nutriente caldo BHI foram avaliados quanto ao seu turvamento. Os tubos
contendo solução salina foram semeados em meio de cultura sólida Plate Count
Agar (PCA) e Meio nutriente sólido Agar Sabouraud 2%, conforme esquematizado
na Figura 12.
O passo seguinte foi transferir 100 µl da amostra contida nos tubos de
salinas para as placas de petri contendo meio Plate Count Agar (PCA). Com auxílio
de uma alça de Drigalski, semeou-se a amostra de maneira uniforme.
As amostras foram encaminhadas à estufa de Pasteur em temperatura de
37
o
C, por 24 horas. Após o período de incubação, foram efetuadas as leituras de
todas as placas. Todos os testes foram realizados em duplicata.
4.4.3.1 Ensaios Microbiológicos em Colchões Viscoelásticos com e sem o
Princípio Ativo Piritionato de Zinco 0,5% in loco
Para a realização da técnica de coleta dos colchões viscoelásticos, foi
necessário utilizar o mesmo procedimento empregado na coleta de amostra nos
colchões de poliuretanos, como esquematizado na Figura 12.
Os colchões viscoelásticos apresentam envolto uma camada de tecido,
diferente dos colchões de poliuretanos. Na Figura 13 estão demonstrados estes
colchões com os respectivos envoltos nos colchões.
85
Figura 13: Amostras do colchão poliuretano e o colchão viscoelástico
Fonte: Empresa Mannes (2006)
86
5 RESULTADOS E DISCUSSÃO
5.1 Fabricação das Espumas com o Princípio Antimicrobiano
Os materiais antimicrobianos são compostos com capacidade de inibir o
crescimento ou matar determinados microrganismos. O uso destes materiais pode
ser aplicado nos mais diversos produtos e processos.
A busca de alternativas para o controle ou eliminação de microrganismos
nocivos à saúde humana durante toda a história da humanidade, apresenta-se
como uma necessidade vital à permanência dos seres vivos. Para este controle, os
agentes biocidas vêm sendo aplicados há séculos, principalmente para a
preservação da pureza da água e de gêneros alimentícios. Ainda, vários agentes
com propriedades antimicrobianas também têm sido usados na limpeza de
ferimentos e em outros procedimentos (Maillard, 2002).
A empresa Mannes, em parceria com a Universidade do Extremo Sul
Catarinense, conforme convênio firmado desenvolveu em seu próprio laboratório,
espumas com princípios antimicrobianos comerciais. Utilizou-se os seguintes
princípios antimicrobianos: Triclosan, Maxgard 1000, Isotiazolona, Prottec MXD 600
e o Piritionato de zinco em diversas concentrações.
5.2 Análise do Potencial Antimicrobiano das Espumas – LADEBIMA
O objetivo primordial das análises do potencial antimicrobianos das
espumas foi averiguar a eficácia do princípio ativo nas espumas, para diminuir a
87
infecção. Os microrganismos utilizados foram às bactérias Staphylococcus aureus e
Escherichia coli, Cândida Albicans e Pseudomonas Aeroginosa, Salmonela
Choleraesuis.
Estas análises preliminares nas espumas, foram de primordial importância
para a determinação do princípio ativo e da concentração na confecção final de um
produto (colchão) que melhor atendesse à necessidade do tema proposto.
5.2.1 Teste de Difusão em Agar
Nos ensaios laboratoriais, os resultados obtidos nos testes de difusão em
Agar são apresentados na Tabela 05. Os resultados expressos em centímetros
representam as médias aritméticas dos halos de inibição formados.
Tabela 5: Teste de difusão em Agar
Princípio Ativo S.A C.A P.A. E.C. S.C
Halo/cm
Branco 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Maxgard 0,5% 0,00 0,00 0,00 0,00 0,00
Triclosan 1,0% 4,12 0,00 0,00 1,30 0,00
Piritionato de Zinco 1,0% 10,50 3,60 4,40 3,40 2,65
Izotiazolona 0,5% 5,50 3,10 0,00 0,00 0,00
Prottec MXD 600 0,92 - 1,1 1,7 -
Fonte: Dados da pesquisadora
Conforme pode ser visualizado na tabela 05 e confirmado na figura 14, o
principio ativo Piritionato de zinco 1% apresentou os maiores halos inibitórios para
88
todos os microrganismos, sugerindo uma efetividade do produto sobre os
microrganismos testados.
Entende-se por halo inibitório como a área onde ocorre ausência de
crescimento de bactéria ao redor da amostra em que os agentes antimicrobianos
estão atuando e se difundem através do meio de cultura (Agar) formando uma zona
de inibição.
Observa-se a ausência de halo inibitório para a concentração de 0,5% de
Maxgard 1000. Infere-se, em decorrência deste teste, que o mesmo não possui
efetividade sobre os microrganismos Staphylococcus aureus, Pseudomonas
aeruginosa , Cândida albicans , Escherichia coli e Salmonela choleraesuis.
Para a concentração de 0,5% de Isotiazolona, pode ser afirmado que o
corpo de prova apresenta ação sobre o microrganismo Staphylococcus aureus.
Quando observada a ação frente aos microrganismos Cândida albicans,
Psedomonas aeroginosas, Salmonela choleraesuis e Escherichia coli, não se
percebe a presença do halo de inibição.
Ao analisar as placas com concentração a 1,0% de Piritionato de Zinco,
observa-se que ocorre efetividade sobre os microrganismos Staphylococcus aureus,
Pseudomonas aeruginosa, Cândida albicans, Salmonela choleraesuis e Escherichia
coli .
Quando se testou a concentração de 1,0% de Triclosan, ocorreu a
presença de halo inibitório somente sobre os microrganismos Staphylococcus
aureus e Escherichia coli. Os resultados apontam uma maior efetividade nos
microrganismos Staphylococcus aureus quando comparado com Escherichia coli .
Isso possivelmente é decorrente da característica da Escherichia coli,
haja vista ser uma bactéria gram negativa e sua parede celular possuir uma camada
89
de proteção adicional. Esse comportamento já havia sido observado no trabalho de
Barrone e Levin (2004, p 25).
Acredita-se que geralmente a estrutura externa da bactéria é
responsável pelas diferentes respostas para os princípios ativos dos
biocidas. Por exemplo, a estrutura externa da membrana para a
bactéria Gram-negativa ((Nikaido and Vaara 1985; Gilbert et al. 1990)
e a parede celular das micobactérias (Trias and Benz 1994) atuam
como barreiras permeabilizantes e são responsáveis pela resistência
intrínseca destes microorganismos aos compostos antimicrobianos.
Tais estruturas são as principais nos estudos da eficácia e dos
mecanismos de ação de biocidas).
Quando exposta aos microrganismos, Cândida albicans, Salmonela
choleraesuis e Pseudomonas aeruginosa, o halo inibitório na placa é inexpressivo ou
inexistente.
O Triclosan é um composto químico muito utilizado pela indústria devido
as suas propriedades especiais bactericidas e fungicidas. Este agente antibacteriano
vem sendo estudado e aplicado em diferentes segmentos industriais há mais de 20
anos (Russell, 2004). O composto é aplicado na fabricação de detergentes líquidos,
sabonetes, desodorantes, cosméticos, loções, cremes antimicrobianos, creme dental
e como aditivo em polímeros e produtos para a indústria têxtil, segundo Sanchez et
al (2005). Mesmo tendo estas propriedades, após incorporado o princípio ao
colchão,ao serem e realizados os testes, o mesmo não se apresentou tão eficaz,
quando comparado ao isotiazolona e ao Piritionato de zinco.
Com o princípio ativo Prottec MXD 600 ocorreu a presença de pequeno
halo inibitório, podendo-se afirmar que nesta concentração o corpo de prova
apresenta ação pequena sobre os microrganismos Escherichia coli , Psedomonas
aeruginosas e Staphylococcus aureus. Por apresentarem um comportamento
irregular, os microrganismos Cândida albicans e Salmonela choleraesuis, não foram
expostos na Figura 14.
90
Já os resultados do crescimento dos microrganismos, quando a espuma
sem o princípio ativo (branco) é exposta, lê-se, a não ocorrência de halo inibitório.
Esta afirmativa pode ser comprovada observando-se a Figura 14 para todos os
microrganismos testados.
Principio
Ativo
MO
S.A
C.A
P.A.
E.C.
S.C
Branco
Max 0,5%
Triclosan
1,0%
Piritionato de
Zinco 1,0%
Isotiazolona
0,5%
Prottec MXD
600
Figura 14: Resultados referentes ao ensaio do teste de difusão em Agar
91
5.2.2 Teste Toxidade Tween 80
O teste de toxidade Tween 80 teve como objetivo avaliar se a adição de
um surfactante aos microrganismos poderia inibir o crescimento ou mesmo atuar
como um agente antimicrobiano. A utilização do surfactante fez-se necessária
porque as espumas apresentaram tensão superficial que distorciam os resultados
das análises realizadas.
Pode ser observado na Figura 15 que ocorreu a presença de UFC
(Unidades Formadoras de Colônias) em todos os tempos e concentrações testadas.
Tempo T
0
T
2
T
6
T
12
Branco
1%
2%
5%
10%
Figura 15: Variação do número de microrganismos quando expostos as diversas
concentrações de Twenn 80 frente ao tempo
92
Não se observa relevância estatística entre as diversas concentrações e
entre a amostra sem o Tween. O surfactante Tween 80, não apresentou toxicidade
detectável para nenhuma das bactérias em nenhum tempo estabelecido, mesmo
para as concentrações mais altas. Cabe aqui ressaltar que a utilização do
surfactanteTween 80 não comprometeu, nem distorceu os resultados, quando foi
utilizado na realização do teste de contagem de células viáveis. O surfactante
Tween não apresenta toxicidade nem interfere no teste.
5.2.3 Contagens de Células Viáveis em Função do Tempo
Após as análises dos princípios ativos triclosan, Piritionato de zinco,
isotiazolona, prottec MXD 600, Maxgard 1000 e a espuma sem princípio em relação
com o teste de difusão em Agar, e a verificação da presença ou não de interferência
do surfactante Tween 80, sobre os microrganismos, chegou o momento de averiguar
o comportamento destes princípios quanto à contagem de células viáveis em relação
ao tempo, ou seja, curva de morte.
Salienta-se que diversas dificuldades ocorreram durante todo o processo
de construção da metodologia, e muitas análises foram realizadas até que se
chegasse a uma adequação de metodologia que melhor permitisse analisar os
resultados e que mantivesse confiabilidade. Os dados contidos na tabela 6 foi a
expressão final dos resultados obtidos, ao final de todo o processo de adequação da
metodologia. Cabe ressaltar que estes resultados juntamente com os demais, foram
de suma importância para se chegar a um produto final com a eficiência e
efetividade que se esperava: um colchão com o principio antimicrobiano.
93
Tabela 6: Contagem de Células Viáveis
Triclosan 1% Piritionato zinco
1%
Isotiazolona 0,5% rPottec MXD 600 S/
principio
SA EC SA EC S A EC SA EC S A EC
T0 * * * * * * * * * *
T1 * * * * * * 316 56 * *
T2 * * 1 180 0 10 0 1 * *
T3 * 34 0 68 1 3 1 0 * *
T6 276 11 0 62 6 1 0 0 * *
T12 8 4 0 10 0 0 0 0 * *
Fonte: Dados da pesquisadora
Conforme pode ser observado na tabela 6, com a maioria dos princípios
ativos testados até o tempo de uma hora, houve a apresentação de incontáveis
microrganismos. O Triclosan 1% apresentou efetividade frente ao microrganismo
Staphylococcus aureus a partir do tempo 6, e frente ao microrganismo Escherichia
coli , observou-se que o número de microrganismo vai decrescendo com o tempo,
porém, mesmo no tempo em que foram realizados os testes não eliminou – se
totalmente os microrganismos. Esse efeito é interpretado como sendo
bacteriostático.
Com o princípio ativo pirirtionato de zinco, frente à bactéria
Staphylococcus aureus, o resultado apresentado foi diminuição no número de
microrganismo frente ao tempo. Evidencia a ausência e crescimento de
microrganismo a partir do tempo 2. Já em relação ao microrganismo Escherichia coli,
observou-se uma decrescente diminuição em função do tempo.
Observou-se que o princípio ativo isotiazolona, mesmo em diferentes
concentrações frente às bactérias S.A. e EC, a partir do tempo T2, torna-se efetivo,
bem como o princípio ativo Prottec MXD 600, frente aos microrganismos S A. e EC
94
com o qual o número de microrganismos vai decrescendo com o tempo, até serem
eliminados totalmente.
Considerando os resultados obtidos, pode-se analisar que os mesmos
comportaram-se satisfatoriamente, haja vista que quando exposto com o tempo
acima de duas horas os microrganismos expostos aos princípios ativos testado não
sobreviveram ou decresciam com o passar do tempo, enquanto no branco, (sem o
princípio) não foram observadas mudanças no número de microrganismos nos
tempos testados. Isso denota a eficiência do biocida frente aos microrganismos
exposto.
5.2.4 Estudo de Genotoxicidade - Teste Cometa na Espuma Selecionada
O teste de genotoxicidade foi realizado somente com a amostra de
principio ativo, Piritionato de zinco, nas três concentrações, 0,2%, 0,5% e 1,0%,
tendo em vista que nas análises realizadas foi o principio que melhor apresentou
efetividade esperada para a fabricação do colchão alocado nas residências.
A simplicidade e sensibilidade do Ensaio do Cometa fazem dele um
sistema adequado de teste para biomonitoramento a níveis crônicos de exposição,
podendo ser utilizado em inúmeras análises, nas quais se podem avaliar células
viáveis (Belpaeme et al, 1998). Além das vantagens citadas e do relativo baixo
custo, o Ensaio do Cometa difere de outros ensaios que detectam danos no DNA
por requerer células viáveis, mas não em divisão, permitindo, assim, sua aplicação a
qualquer tipo de tecido dos quais células vivas possam ser obtidas (Collins et al,
1997; Ribeiro et al, 2003).
95
Os resultados foram tabelados no programa Microsoft Excel e teve como
ferramenta estatística a Anova do programa Instat
®
da empresa Grahpad.
5.2.4.1 Índice de Dano
Em incubação de sangue total exposto ao produto final, a espuma com o
piritionato de zinco, não se encontrou valores significativamente diferentes dos
controles negativos, água destilada e a espuma desprovida de princípio
antimicrobiano. Na tabela 7, são apresentados os resultados das amostras em
duplicata do teste cometa, onde estão representados os possíveis danos ao DNA
em comparação aos controles negativos. Sabe-se que o índice de dano é a medida
da fragmentação do DNA nas células observadas.
Tabela 7: Resultado dos testes de genotoxicidade em espumas com e sem os
princípios ativos e água destilada
Amostras Média do índice de dano ±
desvio padrão
Média da freqüência
± desvio padrão
Piritionato Zinco 0,2% 41,250 ± 31,65 22,000 ± 10,74
Piritionato Zinco 0,5% 30,875 ± 16,01 18,125 ± 6,58
Piritionato Zinco 1,0% 30,250 ± 14,11 18,125 ± 6,71
Branco 21,250 ± 12,79 16,000 ± 7,52
H
2
O 18,00 ± 4,21 16,750 ± 4,06
Fonte: Dados da pesquisadora
O Gráfico 01 demonstra a média do índice de dano causado pelo
piritionato de zinco nas diversas concentrações testadas em sangue total dos oito
indivíduos, comparando com as substâncias teste.
96
Na concentração de 0,2%, a média do índice de dano foi de 41, 25, na
concentração de 0,5 % foi de 30,875, já na concentração de 1% a média
encontrada de 30,25.
Observa-se que no Gráfico 02 não se encontrou nenhum valor
significativamente diferente do controle negativo, ou seja, a água e as espumas sem
o princípio. Observa-se também que mesmo as espumas desprovidas de princípio
comparadas com as espumas com o principio ativo não diferem do controle
negativo.
18,000
21,250
30,250
30,875
41,250
0
10
20
30
40
50
60
70
80
0,20% 0,50% 1,00% Branco H2O
Tratamento
Índice de dano ao DNA
Gráfico 1: Índice de dano ao DNA celular para o Piritionato de Zinco 0,2%, 0,5% e 1,0%
Quando comparadas às incubações contendo o Piritionato zinco com os
controles negativos, não foram observadas diferenças estatisticamente significativas
em todas as concentrações.
97
5.2.4.2 Freqüência de Dano DNA
A freqüência é a porcentagem de células com alteração do DNA
observada em cada grupo de espumas contendo uma concentração de Piritionato de
zinco e nos controles negativos espuma sem principio (branco) e H
2
O.
No Gráfico 02, nota-se que há freqüência de dano ao DNA do sangue total
expostos ao Piritionato de zinco nas diversas concentrações. Foi realizada a média
do material coletado dos oitos indivíduos participantes da pesquisa e analisados,
observou-se que na concentração 0,20% encontrou-se uma freqüência de 22, 00, já
nas concentrações de 0,50% e 1,0% a freqüência observada foi de 18,125.
Nota-se que a freqüência de danos para o Piritionato de zinco, quando
comparadas ao controle negativo - branco e a água - não há significâncias
estatísticas em nenhuma das concentrações.
16,750
16,000
18,125
18,125
22,000
0
5
10
15
20
25
30
35
0,20% 0,50% 1,00% Branco H2O
Tratamento
Freqüência de dano ao DNA
Gráfico 2: Média da Freqüência de dano ao DNA causado pelo princípio ativo
Piritionato de Zinco 0,5%.
98
A diferença entre os grupos foi avaliada pela análise de variância de uma
via (ANOVA) e os resultados foram expressos com a média ± dp e as diferenças
foram consideradas estatisticamente significativas para p<0,05.
Os resultados indicam que o piritionato de zinco tanto no índice quanto na
freqüência não produziu alterações no DNA de células sanguíneas após o teste. Não
existe uma variância significativa entre as amostras maior que a esperada pela
aleatoriedade.
5.2.5 Etapa Desenvolvida nas Residências - In Loco
Atualmente existe uma tendência ao tratamento de pacientes fora do
contexto hospitalar, ou seja, em hospitais dia e até mesmo na residência do enfermo
(home care,- assistência domiciliar), As infecções classicamente consideradas
hospitalares estão ocorrendo também nesses ambientes e surge a partir deste
contexto a denominada infecção associada a assistência à saúde (Barone e Levin,
2004). Atualmente com o incentivo do Ministério da Saúde referente à des-
hospitalização e a criação das Estratégias de Saúde da Família, visando inclusive o
cuidado no domicílio, o cuidado na residência vem recebendo mais adeptos.
Profissionais cada vez mais instrumentalizados e o familiar (cuidador), participativo e
a receita para que o indivíduo permaneça em seu lar. I
99
5.2.5.1 Ensaios Microbiológicos em Colchões de Poliuretano com e sem o
Princípio Ativo Piritionato de Zinco 0,5% in loco
A seguir são descritos os resultados referentes à avaliação da presença
de microrganismos formadores de colônias nos colchões com e sem o principio, nos
meios de cultura PCA e Sabouraud 2%. Podem ser visualizados na Tabela 8 os
resultados dos ensaios microbiológicos nos colchões in loco, com meio PCA.
Ressalta-se que a casa 1, foi a que possuía o colchão com o principio ativo
piritionato de zinco.
Tabela 8: Resultados dos ensaios da presença de microrganismos nos
colchões com e sem princípios antimicrobianos com o meio PCA.
Coleta S
1
M
1
I
1
S
2
M
2
I
2
1 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 70 66
3 0 0 55 5 * *
4 0 0 0 13 * *
5 0 0 0 * * *
6 0 * 0 13 * *
7 1 * * 1 * *
8 0 0 0 * * *
9 0 0 0 * * *
10 * * 85 * * *
11 0 0 0 * * *
12 0 * 0 10 * *
Legenda: S
1
– superior casa 1; M
1
- meio casa 1 e I
1
inferior casa1;
S
2
– superior casa 2; M
2
meio casa 2 e I
2
– inferior casa 2
* microrganismos incontáveis
100
Coletou-se uma amostra, designada coleta um, antes da colocação do
colchão no ambiente das pacientes. Pode-se observar que não houve o crescimento
de microrganismos, como mostra a Figura 16.
Figura 16: Placas sem presença de microrganismos
Fonte: Dados da pesquisadora
Na sexta coleta observou-se que na parte média do colchão houve
presença de microrganismos. Justifica-se, pois neste período (o colchão encontra-se
a mais de 20 dias na residência) a paciente foi acometida de gastroenterite (Diarréia)
e na impossibilidade de deambular, houve extravasamento de eliminações
intestinais (fezes líquidas) no colchão teste. A partir desta ocorrência, evidenciou-se
a presença constante de microrganismos nas amostras coletadas. Na Figura 17,
pode-se observar a placa com crescimento de microrganismos.
101
Figura 17: Presença de microrganismos em amostras
Fonte: Dados da pesquisadora
Observa-se que na casa dois, residência designada a permanecer com o
colchão sem o princípio ativo, há presença de crescimento de microrganismos na
maioria das amostras. Porém, na parte superior, onde há presença do travesseiro,
nota-se que há uma diminuição ou a inexistência da presença de microrganismo nas
amostras coletadas.
Observou-se ainda, na tabela 9, que no caso do colchão sem o principio
antimicrobiano o número de microrganismos é expressivamente alto.
Quando coletadas as amostras e expostas ao meio sabouroud 2%, os
resultados apresentam-se como mostra a Tabela 9.
102
Tabela 9: Resultados dos ensaios da presença de microrganismos nos
colchões com e sem princípios antimicrobianos com o meio Sabouraud
2%.
Coletas S
1
M
1
I
1
S
2
M
2
I
2
1 0 0 0 0 0 0
2 0 0 0 0 39 66
3 7 0 0 0 * *
4 0 0 0 0 * *
5 0 0 0 * * *
6 0 * 0 7 * *
7 0 0 0 0 * *
8 0 0 0 * * *
9 * * 35 * * *
10 * 0 0 * * *
11 0 0 0 1 * *
12 0 * 0 0 * *
Legenda: S
1
– superior casa 1; M
1
- meio casa 1 e I
1
inferior casa1;
S
2
– superior casa 2; M
2
meio casa 2 e I
2
– inferior casa 2
* microrganismos incontáveis
Em concordância ao observado nas Tabelas 8 e 9 observou-se o
crescimento de microrganismos em número expressivo no colchão sem o principio
antimicrobiano.
Observa-se somente que na coleta número 01 não houve o crescimento
de microrganismos devido à não exposição do paciente no colchão.
103
5.2.5.2 Ensaios Microbiológicos em Colchões Viscoelastico com e sem o
Princípio Ativo Piritionato de Zinco 0,5% in loco
A seguir são descritos os resultados referentes à avaliação da presença
de microrganismos formadores de colônias nos colchões viscoelástico com e sem
principio, conforme pode ser visualizado na tabela 10, com a utilização do meio
PCA. O colchão com o principio ativo piritionato de zinco, encontra-se na casa 1.
Tabela 10: Resultados dos ensaios da presença de microrganismos
nos colchões com e sem princípios antimicrobianos com o meio PCA
Coleta S
1
M
1
I
1
S
2
M
2
I
2
1 0 0 0 0 0 0
2 10 0 22 0 * 0
3 4 * 0 5 3 0
4 24 60 1 * * 97
5 2 1 0 12 * *
6 * * * * * *
7 39 3 1 1 * *
8 130 * 43 * * 12
9 195 268 115 * * 1
10 11 * 98 * * 189
11 3 * 0 * 122 74
12 5 * 16 * * *
Legenda: S
1
– superior casa 1; M
1
- meio casa 1 e I
1
inferior casa1;
S
2
– superior casa 2; M
2
meio casa 2 e I
2
– inferior casa 2
* microrganismos incontáveis
104
Conforme se observou na Tabela 10, a coleta das amostras antes da
colocação do colchão no ambiente das pacientes não apresentou nenhum
crescimento de microrganismos.
A paciente da casa um permanece sem muita alteração no quadro, ou
seja, mesmo sendo estimulada, não aceita ser retirada do leito e nos horários de
refeição nem na posição semi folwer (posição de semi sentada) a mesma concorda
em permanecer, desta forma há presença de restos de alimentos nas roupas de
cama e colchão. A higiene pessoal é realizada no próprio leito (banho de leito).
Observa-se que na casa dois, (colchão viscoelástico sem a presença de
principio antimicrobiano) onde a paciente, mesmo com muitas dificuldades, é
retirada do leito diariamente e sua higiene não é realizada no leito, há presença de
crescimento de microrganismos na maioria das amostras.
Ë pertinente colocar que em ambos os colchões, com e sem o princípio,
na região centralizada (meio) onde acontece à maioria do extravasamento das
necessidades fisiológicas das pacientes (fezes e urina) a incidência de
microrganismos é maior.
Observa-se ainda na tabela 10 que no caso do colchão sem o principio
antimicrobiano o número de microrganismos permaneceu sendo expressivamente
alto. As amostras quando semeadas em meio sabouraud, apresentaram os
seguintes resultados, conforme mostrou a Tabela 11.
105
Tabela 11: Resultados dos ensaios da presença de microrganismos nos
colchões viscoelástico com e sem princípios antimicrobianos em meio
Sabouraud 2%
Coletas S
1
M
1
I
1
S
2
M
2
I
2
1 0 0 0 0 0 0
2 1 0 2 0 * 0
3 0 0 0 5 0 1
4 1 0 14 * * 11
5 0 0 0 0 * 0
6 * * 3 * * *
7 0 0 0 1 * *
8 5 0 0 * * 0
9 10 265 13 * * 1
10 0 * 15 * * 0
11 0 * 0 0 2 0
12 1 * 24 * * *
Legenda: S
1
– superior casa 1; M
1
- meio casa 1 e I
1
inferior casa1;
S
2
– superior casa 2; M
2
meio casa 2 e I
2
– inferior casa 2
* microrganismos incontáveis
Em concordância ao observado na Tabela 10 e na Tabela 11 observou-se
o crescimento de microrganismos em número expressivo no colchão sem o princípio
antimicrobiano.
Observou-se também que o colchão com o princípio antimicrobiano, ao
ser exposto ao meio Sabouraud 2%, possui uma maior efetividade, ou seja, sua
ação como inibidor de crescimento foi mais evidenciado.
É pertinente colocar que na área central (meio) a incidência de
proliferação de microrganismos foi maior em ambas as análises. Observou-se
somente que na coleta número 1, não houve o crescimento de microrganismos
devido à não exposição do paciente no colchão.
106
Salienta-se ainda a presença do tecido sobre a espuma, nele não há a
presença do princípio antimicrobiano, a presença do tecido prejudica a análise
comparativa entre os dois tipos de espumas, pois no primeiro caso, (poliuretano) não
havia barreira adicional sobre os colchões.
107
6 CONCLUSÃO
Os estudos realizados acerca da utilização de espumas com princípios
antimicrobianos para redução de infecção domiciliar e hospitalar levaram às
seguintes conclusões:
Dos resultados obtidos, pode-se concluir que dos princípios
antimicrobianos em estudo que obtiveram melhores resultados frente
aos microrganismos testados foram o Piritionato de zinco e a
isotiazolona.
A utilização do tween 80 como tensoativo surfactantes não interfere de
forma negativa nos resultados, ou seja, não atua como bactericida ou
como bacteriostático.
Nos colchões com aditivos antimicrobianos é observado um menor
número de microrganismos ativos. É significativa a diferença quando
comparado aqueles sem o princípio.
O teste de genotoxicidade foi realizado somente com a amostra de
principio ativo, Piritionato de zinco, tendo em vista que nas análises
realizadas foi o principio que melhor apresentou efetividade esperada
para a fabricação do colchão alocado nas residências. Pela análise
ANOVA os resultados do teste indica que o biocida testado tanto no
índice quanto na freqüência não produziram alterações
estatisticamente significativa no DNA de células sangüíneas.
O colchão contendo o piritionato de zinco na concentração de 0,5% é
recomendado para uso domiciliar.
108
7 SUGESTÃO PARA TRABALHOS FUTUROS
Para dar prosseguimento ao estudo, algumas sugestões serão esboçadas:
Recolhimento periódico de amostras dos colchões in loco, para
verificação de possíveis perdas de efetividade.
Testar o piritionato de zinco em revestimentos de colchão para uso
hospitalar e/ou domiciliar.
Confecção de um artigo referente à assistência prestada a pacientes
acamados relacionando com a teórica de Dorothea Orem.
109
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124
ANEXOS
125
ANEXO I - Termo consentimento livre e esclarecido
TERMO DE CONSENTIMENTO LIVRE E ESCLARECIDO
Eu, _______________________________________, portador(a) da Cédula de
Identidade nº_______,residente no município __________, declaro ter sido
informado(a) sobre as atividades de pesquisa intitulada “ UTILIZAÇÃO DE
ESPUMAS COM PRINCÍPIOS ANTIMICROBIANOS NA REDUÇÃO DE
INFECÇÕES HOSPITALARES (DOMICILIARES)”, dissertação orientada pelo
Profº Drº. Elídio Angioletto, com a orientanda Valdemira Santina Dagostim. Onde me
foi esclarecido quanto aos objetivos a metodologia, as intercorrências, entre outras
informações pertinentes ao projeto de pesquisa.
As situações abordadas são de interesse exclusivo ao ensino e à
pesquisa, servindo para a obtenção do título de Mestre em Ciências da Saúde, e
serão utilizados somente para este fim, garantindo-se a manutenção do sigilo sobre
as ocorrências da pessoa ou grupo atendidos, preceitos éticos, estes, assegurados
pela Resolução nº 196/96 do Conselho Nacional de Saúde – CNS, que regulamenta
as pesquisas envolvendo seres humanos.
Salientou-me ainda que não há qualquer obrigatoriedade de minha
participação, podendo eu desistir em qualquer momento da pesquisa, sem prejuízo
de qualquer espécie. Os resultados irão fomentar a base de dados sobre infecção
hospitalar e criação de novas tecnologias na redução da infecção hospitalar.
Dúvidas a respeito deste estudo poderão ser sanadas através do fone:
(48) 8402-6356 (Pesquisadora) ou (48) 3431.2500, Comitê de Ética da UNESC.
Assim sendo, autorizo a publicação dos dados acima desde que
assegurados os preceitos éticos da pesquisa.
Criciúma, SC ...../...../......
Participante ou Responsável Legal
CPF nº
126
ANEXO II - Ensaio Cometa
LÂMINA:__________
LÂMINA:____________
DATA DA ELETROFORESE:___/____/____ DATA DA
ELETROFORESE:___/___/____
DATA DA COLORAÇÃO: _____/____/_____ DATA DA COLORAÇÃO:
____/____/_____
DATA DA LEITURA: _________/____/_____ DATA DA LEITURA:
_____/____/________
CELULA DANO CELULA
DANO CELULA DANO
CELULA DANO
1. 26. 1. 26.
2. 27. 2. 27.
3. 28. 3. 28.
4. 29. 4. 29.
5. 30. 5. 30.
6. 31. 6. 31.
7. 32. 7. 32.
8. 33. 8. 33.
9. 34. 9. 34.
10. 35. 10. 35.
11. 36. 11. 36.
12. 37. 12. 37.
13. 38. 13. 38.
14. 39. 14. 39.
15. 40. 15. 40.
16. 41. 16. 41.
17. 42. 17. 42.
18. 43. 18. 43.
19. 44. 19. 44.
20. 45. 20. 45.
21. 46. 21. 46.
22. 47. 22. 47.
23. 48. 23. 48.
24. 49. 24. 49.
25. 50.
25. 50.
CLASSE
DO DANO
Nº DE
CELULAS
INDICE DO
DANO
(C x N)
CLASSE
DO DANO
Nº DE
CELULAS
INDICE DO
DANO
(C x N)
0 0
1 1
2 2
3 3
4 4
TOTAL 50
TOTAL 50
RESPONSAVEL/ASSINATURA:_________________________________________
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