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COPPE/UFRJCOPPE/UFRJ
NITRIFICAÇÃO DE EFLUENTE INDUSTRIAL EM REATOR DE LEITO MÓVEL COM
BIOFILME: EFEITO DA SALINIDADE
Simone Maria Ribas Vendramel
Tese de Doutorado apresentada ao Programa de
Pós-graduação em Engenharia Química
, COPPE,
da Universidade Federal do Rio de Janeir
o, como
parte dos requisitos necessários à obtenção do
título de Doutor em Engenharia Química.
Orientador(es): Márcia Walquíria de Carvalho
Dezotti
Geraldo Lippel Sant’Anna Junior
Rio de Janeiro
Outubro de 2009
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ii
NITRIFICAÇÃO DE EFLUENTE INDUSTRIAL EM REATOR DE LEITO MÓVEL COM
BIOFILME: EFEITO DA SALINIDADE
Simone Maria Ribas Vendramel
TESE SUBMETIDA AO CORPO DOCENTE DO INSTITUTO ALBERTO LUIZ
COIMBRA DE PÓS-
GRADUAÇÃO E PESQUISA DE ENGENHARIA (COPPE) DA
UNIVERSIDADE FEDERAL DO RIO DE JANEIRO COMO PARTE D
OS REQUISITOS
NECESSÁRIOS PARA A OBTENÇÃO DO GRAU DE DOUTOR EM CIÊNCIAS EM
ENGENHARIA QUÍMICA.
Examinada por:
________________________________________________
Profª. Márcia Walquíria de Carvalho Dezotti, D.Sc.
__________________________________________
______
Prof. Geraldo Lippel Sant’Anna Júnior, Dr. Ing.
________________________________________________
Profª. Leda dos Reis Castilho, Dr.-Ing.
________________________________________________
Profª. Magali Christe Cammarota, D.Sc.
__________________
______________________________
Prof. Hugo Moreira Soares, Ph.D.
RIO DE JANEIRO, RJ - BRASIL
OUTUBRO DE 2009
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iii
Vendramel, Simone Maria Ribas
Nitrificação de efluente industrial em reator de leito
móvel com biofilme: efeito da salinidade/ Simone Maria
Ribas Vendramel. – Rio de Janeiro: UFRJ/COPPE, 2009.
XI, 214 p.: il.; 29,7 cm.
Orientador: Márcia Walquíria de Carvalho Dezotti
Geraldo Lippel Sant’Anna Junior
Tese (doutorado) – UFRJ/COPPE/Programa de
Engenharia Química, 2009.
Referências Bibliográficas: p. 176-202.
1. Nitrificação. 2. Biofilmes. 3. MBBR. I. Dezotti,
Márcia Walquíria de Carvalho et al.. II. Universidade
Federal do Rio de Janeiro, COPPE, Programa de
Engenharia Química. III. Titulo.
iv
AGRADECIMENTOS
Aos meus orientadores, Profª. Márcia Dezotti e Prof. Geraldo Lippel Sant’Anna Jr.
À Márcia, primeiramente pela oportunidade de trabalhar no LABPOL e,
principalmente, pela amizade, incentivo e preocupação sempre demonstrados.
Ao Geraldo, primeiro por ter aceitado me orientar mesmo depois de aposentado e,
na sequência, por todo apoio, conhecimento e carinho transmitidos sempre tão
prontamente.
Ao Eduardo pelo amor, incentivo, amizade e compreensão.
Aos meus Pais por me proporcionarem ter chegado até aqui.
Às amigas que conquistei nesta longa caminhada, Ale, Dani, Mi e Carol, sendo
que cada uma contribuiu de maneira especial na minha vida e serão minhas eternas
companheiras.
À Simone Lorena, companheira de trabalho e muito mais, uma amiga/irmã que
chegou a mim para suavizar os momentos mais difíceis e tornar melhores os momentos
de tranquilidade.
A todos os colegas que passaram pelo LABPOL e alguns que permanecem, nos
meus 5 anos de intensa vivência neste laboratório. Em especial ao Antônio, por todos os
efluentes coletados e por sempre atender prontamente às minhas solicitações. A Bruna
pela ajuda e os cuidados com o meu material de trabalho. Ao Claudinei pela sugestão do
isolamento das bactérias e o auxílio na realização deste procedimento.
Aos colegas do laboratório de Bioprocessos que sempre contribuíram com o
empréstimo de reagentes e equipamentos.
À Soledad Chamorro e Victor Campos que me receberam na Universidad de
Concepción no Chile e hoje são grandes amigos. Gracias a ustedes.
v
À Juliana do Laboratório de Microbiologia Ambiental do Instituto de Microbiologia
do CCS-UFRJ, que foi solícita em me passar todo o conhecimento necessário para a
aplicação da técnica de FISH assim como fez todas as visualizações das lâminas no
microscópio de fluorescência. Ao Prof. Ulysses, responsável por este laboratório, que me
permitiu trabalhar com a Juliana e utilizar todas as suas instalações sempre que
necessário.
Ao Toni do Laboratório de Robótica do Programa de Engenharia Elétrica, que
desenvolveu a automação do sistema e foi sempre solícito em atender aos meus
chamados. Ao Prof. Fernando Lizarralde que foi o responsável pelo projeto da automação.
Aos colegas do CEFET pela ajuda e compreensão quando da minha ausência,
especialmente ao Prof. Paulo Assis e Prof. Hudson. À Profª. Neusa por passar as
amostras de efluente no CG-MASSAS.
Aos funcionários administrativos do PEQ, em especial à Paulinha e ao Arthur.
Ao PEQ pela oportunidade de aprendizado e utilização da sua estrutura.
Ao CNPq pela bolsa de auxílio ao doutorado.
Aos professores Leda, Magali e Hugo por terem aceitado o convite para participar
da banca.
vi
Resumo da Tese apresentad
a à COPPE/UFRJ como parte dos requisitos necessários
para a obtenção do grau de Doutor em Ciências (D.Sc.)
NITRIFICAÇÃO DE EFLUENTE INDUSTRIAL EM REATOR DE LEITO MÓVEL COM
BIOFILME: EFEITO DA SALINIDADE
Simone Maria Ribas Vendramel
Outubro/2009
Orientadores: Márcia Walquíria de Carvalho Dezotti
Geraldo Lippel Sant’Anna Junior
Programa: Engenharia Química
A nitrificação de efluentes da indústria química pode representar alguns desafios
devido à presença de compostos inibitórios. Efluentes
industriais, além de sua
complexidade orgânica podem apresentar níveis variáveis de concentração de sais. A fim
de investigar o efeito do sal (NaCl) sobre a nitrificação de um efluente industrial, tratado
biologicamente a nível secundário, um reator de lei
to móvel com biofilme foi operado, em
escala de bancada, no modo de bateladas sequenciais. O efluente industrial com
teor de
cloreto de 0,005% (m v
-1
) foi suplementado com NaCl até 2,0% (m v
-1
). O
ciclo de
operação do reator consistiu de: enchimento (5 min), aeração (12 ou 24 h), decantaç
ão (5
min) e esgotamento (5 min).
Um sistema CLP assegurou o funcionamento automático e o
contr
ole das variáveis pertinentes ao processo. Dados obtidos a partir de experimentos
específicos foram ajustados por um modelo cinético, que considerou as variações na
concentração de amônia, nitrito e nitrato. Os resultados indicaram que o desempenho
médio d
a nitrificação não foi influenciado pelo teor de cloreto na faixa de 0,005 a 0,6% (m
v
-1
) e manteve-se em torno de 90%. Quando o teor de cloreto foi de 1,2% (m v
-1
), queda
significativa na eficiência da nitrificação foi observada, mesmo operando com períod
o de
reação de 24 h. Ademais, foi observado efeito negativo do teor de matéria orgânica do
efluente industrial na eficiência da nitrificação, o que provavelmente foi causado pel
a
inibição da nitrificação por resíduos químicos.
vii
Abstract of Thesis presented to COPPE/UFRJ as a partial fulfillment of the requirements
for the degree of Doctor of Science (D.Sc.)
NITRIFICATION OF AN INDUSTRIAL WASTEWATER IN A MOVING-BED BIOFILM
REACTOR: EFFECT OF SALT CONCENTRATION
Simone Maria Ribas Vendramel
October/2009
Advisors: Márcia
Walquíria de Carvalho Dezotti
Geraldo Lippel Sant’Anna Junior
Department: Chemical Engineering
Nitrification of wastewaters from chemical industries can pos
e some challenges
due to the presence of inhibitory compounds. Some wastewaters, besides their organic
complexity present variable levels of salt concentration. In order to investigate the effect of
salt (NaCl) content on the nitrification of a conventiona
l biologically treated industrial
wastewater, a bench scale moving
-
bed biofilm reactor was operated on a sequencing
batch mode. The wastewater presenting a chloride content of 0.005% (w v
-1
) was
supplemented with NaCl up to 2.0% (w v
-1
). The reactor operat
ion cycle was: filling (5 min),
aeration (12 or 24h), settling (5 min) and drawing (5 min). Each experimental run was
conducted for 3 to 6 months to address problems related to the inherent wastewater
variability and process stabilization. A PLC system ass
ured automatic operation and
control of the pertinent process variables. Data obtained from selected batch experiments
was adjusted by a kinetic model, which considered ammonia, nitrite and nitrate variations.
The average performance results indicated that
nitrification efficiency was not influenced
by chloride content in the range of 0.005 to 0.6% (w v
-1
) and remained around 90%. When
the chloride content was 1.2% (w v
-1
), a significant drop on the nitrification efficiency was
observed, even operating with
a reaction period of 24 h. Also, a negative effect of the
wastewater organic matter content on nitrification efficiency was observed, which was
probably caused by growth of heterotrophs in detriment of autotrophs and nitrification
inhibition by residual chemicals.
viii
SUMÁRIO
1 Introdução ................................................................................................................ 1
2 Objetivos .................................................................................................................. 4
2.1
Objetivo Geral .................................................................................................... 4
2.2
Objetivos Específicos......................................................................................... 4
3 Revisão Bibliográfica............................................................................................... 5
3.1
Aspectos gerais da remoção biológica do nitrogênio amoniacal......................... 5
3.2
Nitrificação ....................................................................................................... 10
3.3
Parâmetros que influenciam a atividade nitrificante.......................................... 13
3.3.1
pH e alcalinidade...................................................................................... 13
3.3.2
Temperatura............................................................................................. 14
3.3.3
Oxigênio dissolvido................................................................................... 16
3.3.4
Razão carbono/nitrogênio (C/N) ............................................................... 20
3.4
Substâncias que inibem a atividade nitrificante ................................................ 21
3.4.1
Substratos e intermediários da nitrificação................................................ 23
3.4.2
Salinidade................................................................................................. 27
3.5
Desnitrificação.................................................................................................. 36
3.6
Biorreatores em batelada seqüencial (SBR) e biorreatores com biofilme
aplicados à remoção do nitrogênio amoniacal ............................................................. 41
3.7
FISH – Hibridização
in situ
por Fluorescência .................................................. 52
3.7.1
Breve histórico.......................................................................................... 52
3.7.2
Princípios da técnica de FISH................................................................... 53
3.7.3
Limitações do método............................................................................... 55
3.7.4
Aplicações................................................................................................ 57
4 Materiais e Métodos............................................................................................... 61
4.1
Descrição do biorreator de leito móvel com biofilme (MBBR)........................... 61
4.2
Efluente industrial............................................................................................. 66
4.3
Estratégia de operação do MBBR .................................................................... 67
4.4
Testes cinéticos conduzidos no MBBR............................................................. 69
4.5
Experimentos de desnitrificação em biorreator de leito móvel.......................... 70
4.5.1
Descrição da unidade experimental.......................................................... 71
4.5.2
Condições operacionais e controles ......................................................... 72
4.6
Caracterização e quantificação do biofilme ...................................................... 72
ix
4.6.1
Quantificação do biofilme por sólidos voláteis........................................... 73
4.6.2
Quantificação do biofilme por determinação de proteínas e polissacarídeos
.................................................................................................................... 74
4.6.3
Caracterização do biofilme por microscopia óptica................................... 78
4.7
Caracterização do biofilme pela técnica de Hibridização
in situ
por Fluorescência
(FISH) ........................................................................................................................... 78
4.7.1
Cultivo de células controle........................................................................ 78
4.7.2
Obtenção, fixação e hibridização da biomassa......................................... 81
4.7.3
As sondas e as condições para a hibridização ......................................... 82
4.7.4
Observação ao microscópio e aquisição das imagens.............................. 83
4.8
Métodos analíticos ........................................................................................... 84
4.8.1
Determinação de nitrogênio como N-NH
3
, N-NO
2
-
, N-NO
3
-
....................... 84
4.8.2
Determinação de cloreto........................................................................... 86
4.8.3
Determinação da demanda química de oxigênio ...................................... 86
4.8.4
Determinação de carbono orgânico dissolvido.......................................... 87
4.8.5
Determinação de sólidos suspensos totais e voláteis............................... 87
5 Resultados e Discussão........................................................................................ 89
5.1
Caracterização do efluente industrial................................................................ 89
5.2
Condições operacionais................................................................................... 91
5.3
Apresentação dos regimes operacionais........................................................ 105
5.4
Testes cinéticos conduzidos no MBBR........................................................... 115
5.5
Experimentos de desnitrificação em biorreator de leito móvel........................ 132
5.6
Caracterização e quantificação do biofilme ................................................ 13636
5.6.1
Quantificação do biofilme pela determinação de sólidos voláteis........ 13737
5.6.2
Determinação do teor de polissacarídeos e proteínas associados ao
biofilme .............................................................................................................. 14343
5.6.3
Caracterização do biofilme por microscopia óptica................................. 152
5.7
Caracterização do biofilme pela técnica de Hibridização
in situ
por Fluorescência
. ................................................................................................................ 15959
5.7.1
Cultivo das células para validação das sondas de FISH..................... 15959
5.7.2
Aplicação da técnica de FISH no biofilme do MBBR........................... 16363
6 Conclusões........................................................................................................... 172
7 Referências Bibliográficas ................................................................................ 1766
ANEXOS ....................................................................................................................... 203
x
LISTA DE ABREVIATURAS
AOB
Bactérias que Oxidam Amônia
ANAMOX
Oxidação Anaeróbia de Amônia
CANON
Completa Remoção Autotrófica de Nitrogênio via Nitrito
COD
Carbono Orgânico Dissolvido
COT
Carbono Orgânico Total
CO
2
Gás Carbônico
Cl
-
Íon Cloreto
C/N
Razão Carbono/Nitrogênio
CONAMA
Conselho Nacional do Meio Ambiente
CSLM
Microscopia Confocal de Varredura a Laser
DBO
Demanda Bioquímica de Oxigênio
DQO
Demanda Química de Oxigênio
DQOt
Demanda Química de Oxigênio Total
DQOd
Demanda Química de Oxigênio Dissolvido
EEC
“European Economic Community”
EPS
Substâncias Exopoliméricas
ETEI
Estação de Tratamento de Efluentes Industriais
FA
“Free Ammonia” – Amônia Livre
FNA
“Free Nitrous Acid” – Ácido Nitroso Livre
FEEMA
Fundação Estadual de Engenharia do Meio Ambiente
FISH
Hibridização
in situ
por Fluorescência
H
+
Íon Hidrogênio
HNO
2
Ácido Nitroso
K
L
a
Coeficiente Global ou Volumétrico de Transferência de Oxigênio
KCl
Cloreto de Potássio
MBBR
“Moving-bed Bio-reactor” – Biorreator de Leito Móvel
N
2
Nitrogênio Gasoso
N
2
O
Óxido Nitroso
N
-
HNO
2
Ácido Nitroso Quantificado como Nitrogênio
N
-
NH
3
Amônia Quantificada como Nitrogênio
xi
N
-
NO
2
-
Nitrito Quantificado como Nitrogênio
N
-
NO
3
-
Nitrato Quantificado como Nitrogênio
NaCl
Cloreto de Sódio
Na
2
CO
3
Carbonato de Sódio ou Barrilha
Na
2
SO
4
Sulfato de Sódio
NaOH
Hidróxido de Sódio
NH
2
OH
Hidroxilamina
NH
3
Amônia
NH
4
+
Íon Amônio
NO
2
-
Íon Nitrito
NO
3
-
Íon Nitrato
NO
x
Óxidos de Nitrogênio
NOB
Bactérias que Oxidam Nitrito
NTK
Nitrogênio Total Kjeldahl
O
2
Oxigênio Gasoso
OD
Oxigênio Dissolvido
OLAND
Nitrificação e Desnitrificação Autotrófica via Limitação de Oxigênio
OUR
Taxa de Consumo de Oxigênio
pH
Potencial Hidrogeniônico
PLS
Polissacarídeos
PTN
Proteínas
RBC
Biodisco
SBR
“Sequential Batch Reactor” – Reator de Bateladas Sequenciais
SHARON
“Single High Activity Reactor Ammonia Over Nitrite”
SND
Nitrificação e Desnitrificação Simultâneas
ST
Sólidos Totais
SV
Sólidos Voláteis
SST
Sólidos Suspensos Totais
SSV
Sólidos Suspensos Voláteis
T
Temperatura
TAN
Nitrogênio Amoniacal Total
WHO
“World Health Organization”
1
1 Introdução
A nitrificação é praticamente consolidada em estações de tratamento de efluentes
domésticos, contudo, no caso do tratamento de efluentes industriais, a sensibilidade e a
complexidade intrínsecas da nitrificação dificultam sua implantação de maneira estável e
satisfatória. Os vários parâmetros que influenciam este processo são freqüentemente
reportados, sendo que, recentemente, GRAHAM e colaboradores (2007) chamaram a
atenção para a caótica instabilidade da nitrificação. Assim como WAGNER e LOY (2002)
atribuíram à nitrificação a condição de “Calcanhar de Aquiles” dos processos biológicos
de tratamento de efluentes.
Por conta da complexidade e variabilidade inerente aos efluentes industriais, a
possibilidade destes conterem substâncias que venham a inibir a remoção biológica de
nitrogênio amoniacal é grande. Várias substâncias orgânicas, algumas em baixíssimas
concentrações, já foram reconhecidas como inibidoras da comunidade microbiana
nitrificante (ROY e KNOWLES, 1995, BRANDT
et al
., 2001). Substâncias inorgânicas
como metais (HU
et al
., 2002 e 2004, GRUNDITZ
et al
., 1998), sais (KARGI e DINCER,
2001, KARGI e UYGUR, 2004, UYGUR, 2006) e os próprios substratos da nitrificação
(YOO
et al
., 1999, YANG
et al.
, 2004, ISAKA
et al
., 2007) também são apontados como
interferentes neste processo. Ademais, mesmo efluentes provenientes do tratamento
secundário, ou seja, depois de tratados biologicamente, podem apresentar níveis
residuais de poluentes que causam inibição da atividade nitrificante (LUOSTARINEN
et al.,
2006, DOSTA
et al
., 2007, BASSIN, 2008, VÁZQUEZ-PADÍN
et al
., 2009).
No que se refere especificamente aos efluentes industriais que apresentam
salinidade, tem-se os hipersalinos, como a água de produção de petróleo (FREIRE
et al.,
2001, CAMPOS
et al
., 2002a), da indústria têxtil (CARLIELL
et al
., 1998) e de alimentos
enlatados (ARTIGA
et al
., 2008), com teores de salinidade acima de 3,5% (m v
-1
). Outros
efluentes como os de curtume (MUNZ
et al
., 2008) e da indústria química em geral
(YOSHIE
et al
., 2004, TSUNEDA
et al
., 2005, BASSIN, 2008) apresentam níveis de
salinidade diversos, inferiores a 3,5%. Neste caso, poucos trabalhos têm se dedicado a
investigar o efeito destas concentrações salinas na nitrificação. Ademais, efluentes com
salinidade acima de 3,5% ou hipersalinos podem ser tratados biologicamente por culturas
2
halofílicas, porém, estas culturas não são efetivas para concentrações de sal abaixo de
3,0% (WOOLARD e IRVINE, 1995). Portanto, os mesmos são tratados, em geral, em
sistemas com organismos não halofílicos e que são adversamente afetados pela
salinidade.
A desnitrificação, conforme referenciado na literatura, aparenta ser um processo
mais robusto do que a nitrificação (RABAH e DAHAB, 2004a,b). Provavelmente, esta
característica está associada aos inúmeros gêneros de bactérias que são capazes de
reduzir nitrato a nitrogênio gasoso em ambiente anóxico. A maior ênfase dos estudos
sobre a desnitrificação está na busca da melhor fonte externa de carbono (GOMEZ
et al.
,
2000, CERVANTES
et al
., 2001) e da otimização da razão C/N a ser utilizada (MODIN
et
al
., 2007). Portanto, a nitrificação se constitui em etapa limitante do processo biológico
tradicional de remoção total do nitrogênio.
Para superar a inibição causada por compostos orgânicos e os efeitos negativos
de sais na nitrificação de efluentes industriais, uma abordagem interessante é a utilização
de reatores com biofilme. A biomassa, quando aderida a suportes, permite a manutenção
de microrganismos com crescimento lento no interior do biorreator e contribui para a
adaptação gradual da comunidade microbiana às condições de estresse no meio
reacional. Nesta configuração, uma das tecnologias que tem encontrado aplicação
crescente no tratamento biológico de efluentes é a do reator de leito móvel com biofilme
(MBBR). Segundo RUSTEN
et al
. (2006), existem mais de 400 unidades de tratamento de
efluentes em larga escala que se encontram em operação em 22 países diferentes, sendo
estas baseadas nos princípios do MBBR. No entanto, grande parte das aplicações deste
biorreator é direcionada à remoção de matéria orgânica, contudo, alguns autores já
vislumbram a sua utilização para a nitrificação terciária (SALVETTI
et al
., 2006, CANTO
et
al.
, 2007, XIA
et al
., 2008).
No Brasil, o limite máximo para o descarte do nitrogênio amoniacal em cursos
d’água era de 5 mg L
-1
até 2005 e passou para 20 mg L
-1
quando a resolução CONAMA
nº 357 revogou a CONAMA nº 20. Na Europa e Estados Unidos as agências que
regulamentam os padrões de descarte de efluentes industriais exigem limites bem mais
restritivos para o descarte de nitrogênio total, os quais se encontram entre 3 e 5 mg L
-1
(SEMOM
et al.,
1997). Contudo, mesmo diante deste largo limite de descarte para o
3
nitrogênio amoniacal, conforme proposto pela comissão acima citada, a clara
complexidade do processo de nitrificação, por muitas vezes, impede que este valor seja
alcançado no efluente final.
Neste contexto, é crescente o interesse pela ecologia e microbiologia dos
processos de tratamento de efluentes para auxiliar no entendimento da diversidade e da
dinâmica das bactérias nitrificantes e sua relação com a eficiência e a estabilidade dos
processos biológicos (NOGUEIRA
et al
., 2002, MOUSSA
et a
l., 2006, HU
et al
., 2009).
Portanto, o presente trabalho se propõe a investigar a nitrificação de um efluente
industrial com crescentes concentrações salinas. Para alcançar tal objetivo optou-se pela
utilização da tecnologia MBBR, que poderá auxiliar na mitigação dos diversos fatores que
podem inibir o processo.
4
2 Objetivos
2.1 Objetivo Geral
Investigar o efeito da concentração salina (até 1,2% m v
-1
de cloreto) na nitrificação
de um efluente industrial da fabricação de borracha, empregando um biorreator do tipo
leito móvel com biofilme (MBBR – “moving-bed biofilm reactor”), operando de modo
descontínuo, na forma de bateladas sequenciais.
2.2 Objetivos Específicos
•
Verificar o desempenho da nitrificação e a possibilidade da desnitrificação,
como um tratamento terciário para o efluente industrial no mesmo
biorreator, ou seja, no MBBR;
•
Avaliar o efeito do pH, OD, matéria orgânica e, da crescente salinidade
imposta ao efluente, na eficiência da remoção do nitrogênio amoniacal;
•
Quantificar e caracterizar o biofilme desenvolvido no MBBR nas diferentes
condições operacionais estudadas;
•
Investigar a cinética da nitrificação quanto à variação da concentração
salina e da matéria orgânica e, propor um modelo cinético simplificado para
representar os perfis de variação dos substratos.
5
3 Revisão Bibliográfica
3.1 Aspectos gerais da remoção biológica do nitrogênio amoniacal
O nitrogênio desempenha importante papel na constituição das moléculas
proteicas, ácidos nucleicos, vitaminas, enzimas e hormônios – elementos vitais aos seres
vivos (BRAGA
et al.
, 2005). No caso das unidades de tratamento biológico de efluentes,
as quais dependem da atividade microbiana, o nitrogênio é extremamente necessário
para o desenvolvimento e manutenção da biomassa ativa, por conta do consumo
assimilatório do mesmo. Relata-se que uma bactéria típica contém em torno de 12% de
nitrogênio quando se refere à sua massa seca (SCHMIDELL e REGINATTO, 2007).
Por outro lado, quando os ambientes aquáticos apresentam excesso de nitrogênio,
seja na forma orgânica, amoniacal, na forma de nitrito ou nitrato, ocorre o desequilíbrio do
ambiente, que pode culminar em vários problemas como a eutrofização (VON SPERLING,
1996), a depleção do oxigênio (BERNET
et al
., 2005), a toxicidade a certos organismos
(RUSTEN
et al.
, 2006) e, em alguns casos até ao homem, como é o caso da síndrome do
bebê azul (metahemoglobinemia) causada por elevadas concentrações de nitrato na água
(BAIRD, 2006).
Desta maneira, por conta destes efeitos aliados às dificuldades que envolvem a
remoção biológica do nitrogênio, observa-se grande interesse nestes processos e nos
fenômenos que os envolvem. Na literatura as abordagens sobre o assunto são as mais
diversas, sendo que os temas de maior interesse versam sobre: o desenvolvimento de
processos com elevado desempenho de remoção; os diferentes critérios operacionais,
visando menores custos; as cinéticas das reações com o intuito de modelar e simular os
processos; a identificação da microbiota envolvida, assim como suas trajetórias
metabólicas, entre outros.
Os estudos e pequisas relacionados aos princípios e fundamentos da nitrificação e
da desnitrificação, embora venham sendo realizados desde meados do século passado
(ROQUES, 1980), permitiram ampliar de forma lenta o conhecimento em torno deste tema,
6
o que é perfeitamente justificável em função da complexidade inerente ao tema e das
inúmeras variáveis envolvidas no processo. Contudo, crescente interesse no assunto se
deu, particularmente, a partir da década de 80, sendo que na década de 90 ocorreu a
intensificação da busca por novas estratégias operacionais para a remoção das
substâncias inorgânicas nitrogenadas (SCHMIDELL e REGINATTO, 2007). No início da
década atual a reclassificação das trajetórias bioquímicas do ciclo do nitrogênio, conforme
apresentado na Figura 3.1 (AHN, 2006), abriu um leque de possibilidades no que se
refere à conversão de amônia a nitrogênio molecular além de fornecer indícios de quão
complexo este processo pode se tornar. Assim, apesar de tantos anos de estudos
dedicados à remoção biológica de nitrogênio ainda hoje se instiga o desenvolvimento de
pesquisas no tema.
Figura 3.1 –
Diversidades do ciclo do nitrogênio. A) Ciclo do nitrogênio clássico; B) Ciclo
do nitrogênio reestruturado, adaptado de AHN (2006).
Contudo, as novas possibilidades que surgiram nos últimos anos, em grande parte,
são variações do processo de conversão total do nitrogênio amoniacal a partir do nitrito
(nitrificação parcial), que diferem da nitrificação convencional, na qual o nitrato é o
principal substrato para a conversão a nitrogênio molecular. Ademais, a versatilidade das
bactérias nitrificantes revelou-se muito maior do que se supunha até então, com a
possibilidade de bactérias heterotróficas e anaeróbias (
Planctomycete
) oxidarem amônia,
assim como autotróficas e aeróbias promoverem a desnitrificação (SANT’ANNA JR., no
prelo).
Desnitrificação
N
-
fixação
Nitrificação
ANAMMOX
Nitrificação
N
-
N
-
fixação
Desnitrificação
A
B
7
Portanto, diversas denominações para estes processos têm sido sugeridas,
promovendo certa confusão de quão distintos são os princípios básicos aplicados. Desta
maneira, a Tabela 3.1 apresenta algumas das denominações encontradas na literatura e
os respectivos fundamentos aplicados para a remoção biológica do nitrogênio.
Tabela 3.1 –
Diferentes denominações atribuídas aos processos de remoção biológica do
nitrogênio amoniacal.
Denominação Princípio Básico Referências
nitrificação parcial N via nitrito
YE
et al.,
2009
YAN e HU, 2009
DONG e SUN, 2007
"shortcut" nitrificação
desnitrificação, "shortcut"
remoção biológica de
nitrogênio
N e D via nitrito
ZHANG
et al.,
2009a
DOWNING e
NERENBERG
,
2008
completa remoção
autotrófica de nitrogênio,
nitrificação desnitrificação
autotrófica, CANON
N e D via nitrito
VAZQUEZ-PADIN
et al
.,
2009, GONG
et al
., 2008
SLIEKERS
et al
., 2002
SHARON N via nitrito
HELLINGA
et al.
, 1998
MOSQUERA-CORRAL
et al.,
2005
OLAND N e D via nitrito
WINDEY
et al.,
2005
CLIPPELEIR
et al
., 2009
ANAMOX
N anaeróbia e D via
nitrito dependente de
pré-nitrificação
JETTEN
et al.
, 1999
SINHA e
ANNACHHATRE, 2007
nitrificação e desnitrificação
simultâneas (SND)
N e D via nitrito
GUO
et al
., 2009,
ASLAN e DAHAB, 2008
YOO
et al
., 1999
N e D via nitrato
SARIOGLU
et al
., 2009,
CANTO
et al.
, 2007,
MEYER
et al
., 2005
N - nitrificação e D - desnitrificação
Para que ocorra a conversão completa do nitrogênio nos processos via nitrito, o
controle de duas condições operacionais é indispensável: a inibição das bactérias que
oxidam o nitrito (NOB) e a adaptação da comunidade microbiana desnitrificante ao NO
2
, o
qual é considerado tóxico em baixas concentrações (CHUNG e BAE, 2002
apud
RUIZ
et
al
., 2006, CARRERA
et al.
, 2004).
8
Portanto, para alcançar satisfatória nitrificação parcial é necessário reduzir
seletivamente a atividade das NOB sem afetar as AOB. Desta maneira, diferentes
estratégias operacionais vêm sendo utilizadas para promover o acúmulo de nitrito durante
a nitrificação, tais como o controle do pH, da temperatura e do oxigênio dissolvido (YOO
et al
., 1999, YAN e HU, 2009).
O processo conhecido como ANAMOX (oxidação anaeróbia de amônia), por
exemplo, é um dos precursores destas novas possibilidades. Seu princípio básico é a
oxidação de amônia sob condições anóxicas, tendo o nitrito como aceptor final de elétrons
(MOSQUERA-CORRAL
et al.
, 2005) ou a desnitrificação do nitrito tendo a amônia como
doador de elétrons (SCHMIDT
et al.
, 2003). O processo ANAMOX requer
necessariamente uma pré-nitrificação, pois a atuação das bactérias ANAMOX depende da
presença de íons amônio e nitrito na mesma proporção. Portanto, este processo
compreende a nitrificação parcial aeróbia, na qual se deve alcançar 50% de conversão de
amônia a nitrito, seguida do reator anóxico (processo ANAMOX) no qual estes substratos
serão convertidos a nitrogênio molecular (DAPENA-MORA
et al
., 2004). Contudo, o
processo ANAMOX tem um desafio a ser superado, que é o seu tempo de partida. Como
nos demais sistemas anaeróbios, o rendimento da biomassa é baixo por conta do
crescimento lento das AOB anaeróbias (tempo de duplicação de 7-14 dias) e a adaptação
do lodo pode ser demorada, de no mínimo 100 dias (CLIPPELEIR
et al.,
2009).
SHARON, do inglês “single high activity reactor ammonia over nitrite”, é um dos
possíveis processos aplicados em combinação com ANAMOX para alcançar a pré-
nitrificação. Neste caso, a seleção positiva das bactérias responsáveis pela oxidação de
amônia a nitrito se dá pelo arraste das NOB do interior do biorreator, por estas serem
consideradas de crescimento mais lento do que as responsáveis pela nitritação (AOB).
Em geral, este processo permite alcançar 50% de conversão da amônia presente no
efluente, no entanto, a temperatura influencia fortemente seu desempenho em condições
inferiores a 25 ºC (JETTEN
et al.,
1997).
A combinação da nitrificação parcial com o processo ANAMOX em um único reator
tem sido proposta com diferentes denominações, tais como CANON (“completely
autotrophic nitrogen removal over nitrite”) e OLAND (“oxygen limited autotrophic
nitrification denitrification”). Sob condições de limitação de oxigênio se promove a co-
9
existência de bactérias aeróbias e anaeróbias que oxidam amônia. Neste caso, o critério
operacional para a aplicação destes processos é o controle da concentração de oxigênio
dissolvido no meio, sendo necessário não somente por causar inibição irreversível das
bactérias ANAMOX para teores de OD de até 0,5%, mas também para promover
apropriadas condições operacionais à nitrificação parcial. Nos dois sistemas (CANON e
OLAND) a inibição do crescimento das NOB se dá pela baixa afinidade destas bactérias
por oxigênio, quando comparadas com as AOB, e pela baixa afinidade por nitrito em
relação às ANAMOX (VAZQUEZ-PADIN
et al.
, 2009).
Entretanto, o controle de concentrações muito baixas de oxigênio dissolvido, com
o propósito de limitar a velocidade da respiração celular, é complicado, especialmente em
termos de operação em larga escala, o que gera dificuldades na implantação destes
processos (ZDRADEK, 2005). Ademais, se faz necessário promover adequadas
condições para o equilíbrio das comunidades microbianas aeróbias e anaeróbias
responsáveis pela oxidação da amônia. A ocorrência de maior atividade das bactérias
nitrificantes aeróbias em relação às anaeróbias resulta no acúmulo de nitrito que é inibidor
da atividade das bactérias ANAMOX (CLIPPELEIR
et al.,
2009).
O principal apelo destes novos processos se baseia na eventual economia de
energia dado o menor teor de oxigênio necessário ao processo e menor custo operacional
com a isenção da adição de fonte externa de carbono, característica da desnitrificação
convencional (RUIZ
et al.
, 2003). Porém, os detalhes dos mecanismos destes processos
ainda não estão totalmente elucidados (AHN, 2006, VADIVELU
et al
., 2007). Ademais,
promover o acúmulo de nitrito sem alcançar eficiente redução do mesmo pode ser mais
prejudicial aos ambientes aquáticos, por conta da sua elevada toxicidade quando
comparado com o nitrato (SCHMIDELL e REGINATTO, 2007).
Desta maneira, optou-se no presente trabalho por aplicar os princípios
convencionais da nitrificação e da desnitrificação. Sendo assim, breve descrição das
características gerais destas duas etapas será apresentada, como segue nas próximas
seções.
10
3.2 Nitrificação
O processo convencional de nitrificação implica basicamente na oxidação
quimiolitotrófica de amônia a nitrito e, subsequentemente, de nitrito a nitrato sob
condições estritamente aeróbias.
A amônia pode se apresentar sob duas formas no meio aquoso, como o íon
amônio (NH
4
+
) ou como amônia (NH
3
). O equilíbrio entre estas duas formas depende do
pH do meio, conforme está ilustrado na Figura 3.2.
Existe certa divergência na literatura sobre qual destas duas formas estaria sujeita
à conversão biológica. Grande parte dos trabalhos realizados que envolvem nitrogênio
amoniacal considera o íon amônio como a principal forma susceptível à conversão, outros
consideram as duas formas e utilizam a denominação TAN (nitrogênio amoniacal total) e
alguns poucos sugerem que o NH
3
é o principal substrato da nitrificação (ANTHONISEN
et
al
., 1976, YANG
et
al
., 2007).
Figura 3.2 –
Relação de equilíbrio entre N-NH
3
e N-NH
4
+
em função do pH, adaptado de
PRATES (1997)
apud
KIELING (2004).
Contudo, independente de qual a forma de nitrogênio amoniacal que realmente é
oxidada, a nitrificação ocorre em duas etapas, conforme apresentado nas equações 1
11
(oxidação de amônia a nitrito) e 2 (oxidação de nitrito a nitrato), sendo a reação global do
processo representada pela equação 3 (SCHMIDT
et al.
, 2003).
NH
4
+
+ 1,5O
2
↔
NO
2
-
+ 2H
+
+ H
2
O
∆
G = - 275 kJ mol
-1
(1)
NO
2
-
+ 0,5O
2
↔
NO
3
-
∆
G = - 74 kJ mol
-1
(2)
Reação Global:
NH
4
+
+ 2,0O
2
↔
NO
3
-
+ 2H
+
+ H
2
O
∆
G = - 349 kJ mol
-1
(3)
Cada uma destas etapas (eq. 1 e eq. 2) é realizada por gêneros diferentes de
bactérias. Essas bactérias, conhecidas generalizadamente como nitrificantes, são
autotróficas porque utilizam CO
2
como fonte de carbono. São ainda, quimiolitotróficas, por
oxidarem compostos inorgânicos, amônia e nitrito, para obtenção de energia (BROCK
et
al.
, 1997). Embora, recentemente, alguns compostos orgânicos tenham sido relatados
como possíveis fontes de carbono e energia para estes micro-organismos (SCHMIDT
et
al.
, 2003).
O oxigênio molecular participa da reação como aceptor final de elétrons (AHN,
2006). Pela reação global de nitrificação pode-se confirmar a demanda de oxigênio
dissolvido exercida para alcançar a total oxidação de amônia em meio aquoso.
Dentre as possíveis bactérias que oxidam amônia (AOB), as mais abundantes são
do gênero
Nitrosomonas,
porém
Nitrosococcus, Nitrosospira, Nitrosovibrio
e
Nitrosolobus
são também, reconhecidamente, capazes de realizar tal oxidação (AHN, 2006). Estes
micro-organismos responsáveis pela conversão de amônia a nitrito são geneticamente
diferentes, mas todos pertencem ao domínio
Bacteria
e estão classificados dentro da
mesma subdivisão
β
-
Proteobacterias
(ETCHEBEHERE, 2007). Existem também algumas
espécies identificadas exclusivamente em ambientes marinhos,
Nitrosococcus marina
e
Nitrosococcus halofila
, que são capazes de realizar a oxidação de amônia e são
pertencentes ao grupo
γ
-
Proteobacterias
(SCHMIDT
et al.
, 2003).
12
Na etapa de oxidação de nitrito a nitrato, vários gêneros de bactérias como
Nitrococcus, Nitrospira, Nitrospina
e
Nitrocystis
podem estar envolvidos. Contudo, o
gênero mais conhecido de bactéria capaz de oxidar o nitrito é
Nitrobacter
, o qual está
geneticamente relacionado à subdivisão
α
-
Proteobacterias
(AHN, 2006). Há evidências de
que
Nitrospira
é o gênero mais específico na oxidação de nitrito, enquanto os outros
gêneros são mais versáteis, o que sugere a demanda por muitas pesquisas até que o
genoma das NOB seja totalmente esclarecido (SCHMIDT
et al.
, 2003).
As equações 4 e 5 apresentam o rendimento celular e o consumo de oxigênio para
as etapas de nitritação e nitratação
,
respectivamente (EPA, 1993).
55NH
4
+
+ 76O
2
+ 109HCO
3
-
→
C
5
H
7
O
2
N + 54NO
2
-
+ 57H
2
O + 104H
2
CO
3
(4)
400NO
2
-
+ NH
4
+
+ 4H
2
CO
3
+ HCO
3
-
+ 195O
2
→
C
5
H
7
O
2
N + 3H
2
O + 400NO
3
-
(5)
A reação global de síntese e oxidação de amônia pode ser representada pela
equação 6.
NH
4
+
+ 1,83O
2
+ 1,98HCO
3
-
→
0,021C
5
H
7
O
2
N + 0,98NO
3
-
+ 1,04H
2
O + 1,88H
2
CO
3
(6)
A EPA (1993) sugere que o fator de conversão de substrato a células,
representadas pelo termo C
5
H
7
O
2
N, pode variar em uma faixa relativamente ampla, entre
0,06 e 0,20 g SSV g
-1
N-NH
4
+
oxidado (grama de sólidos suspensos voláteis por grama de
nitrogênio amoniacal convertido). SCHMIDELL e REGINATTO (2007) calcularam o
rendimento celular para a reação global apresentada na equação 6 e obtiveram o valor de
0,16 g SSV g
-1
N-NH
4
+
, sendo que a etapa relativa às bactérias do gênero
Nitrosomonas
contribui com 62,5% deste total. Estes baixos valores de conversão observados justificam
o crescimento lento das bactérias nitrificantes quando comparadas às heterotróficas, as
quais possuem fator médio de conversão da DQO em células aeróbias da ordem de 0,43
g SSV g
-1
DQO (WIESMANN, 1994).
Para que estas reações de nitrificação ocorram com satisfatório desempenho,
alguns parâmetros operacionais do processo devem ser controlados.
13
3.3 Parâmetros que influenciam a atividade nitrificante
3.3.1 pH e alcalinidade
Como visto na reação global de nitrificação (eq. 3), este processo leva à geração
de íons hidrogênio (H
+
), resultando no consumo da alcalinidade do meio com provável
queda do pH. Em geral, perdas na atividade nitrificante são constatadas quando valores
de pH no meio reacional se distanciam da neutralidade (AHN, 2006). Alterações da
condição alcalina nos biorreatores influenciam a solubilidade e, por conseqüência, a
concentração das substâncias presentes no meio, tais como a própria amônia, nitrito e
metais que podem vir a causar a inibição da atividade microbiana (FICA-PIRAS, 2000).
Contudo, há pouca concordância sobre quanto e em que ponto exatamente o pH
começa a afetar as taxas de nitrificação (CHEN
et al.
, 2006). A partir de dados compilados
da literatura observa-se que o pH ótimo para o crescimento das bactérias nitrificantes
varia amplamente e é distinto para
Nitrosomonas
e
Nitrobacter
(ver Tabela 3.2 no final da
seção 3.3.3).
Alguns trabalhos sugerem que valores de pH afastados da neutralidade têm
alcançado sucesso no desempenho da nitrificação quando é realizada a pré-aclimatação
da biomassa presente no sistema. Segundo LOUZEIRO
et
al
. (2002) este procedimento
pode proporcionar efetiva atividade nitrificante para valores de pH entre 6,0 e 9,0. Porém,
para SURAMPALLI
et al.
(1997) valores de pH acima de 9,8 e abaixo de 7,0 reduzem a
taxa da reação de oxidação de amônia para pelo menos 50% do seu valor ótimo.
Conforme discutido por VILLAVERDE
et al
. (1997), a faixa ideal de pH para a
nitrificação pode ser determinada por três efeitos diferentes que as alterações no pH
podem exercer sobre as bactérias nitrificantes: i) ativação ou desativação das AOB e NOB;
ii) efeito nutricional associado à alcalinidade; iii) inibição por amônia e ácido nitroso livres.
A ativação ou desativação das bactérias pode ocorrer por conta da ligação dos íons H
+
ou
OH
-
com os grupos ácido-base fracos das enzimas, bloqueando de maneira reversível os
seus sítios ativos. A nutrição está relacionada com a disponibilidade de carbono
inorgânico que é a fonte de carbono para os micro-organismos autotróficos. Esta
disponibilidade é controlada pelo equilíbrio químico (CO
3
-2
→
HCO
3
-
→
CO
2
) que depende
14
fortemente do pH. Para valores baixos de pH, o CO
2
é a forma predominante e será
eliminado por arraste pela aeração do meio, o que resultaria na escassez de alcalinidade
e, em pH elevado, o carbono inorgânico será transformado na sua maior parte em
carbonato, sendo a maioria dos carbonatos insolúveis e dificilmente assimiláveis. Por
outro lado, amônia e nitrito, que servem como fonte de energia para os micro-organismos
responsáveis pela sua oxidação, podem inibir a atividade biológica nitrificante quando
presentes na sua forma não ionizada, NH
3
livre e HNO
2
livre. Embora estes três efeitos
ocorram simultaneamente, a inibição por amônia livre é considerada a mais importante e,
portanto, será discutida em seção a parte no presente trabalho.
3.3.2 Temperatura
Outro parâmetro operacional de importância para a otimização da nitrificação é a
temperatura. A cinética das reações que envolvem as bactérias nitrificantes pode ser
influenciada pela temperatura, basicamente de três maneiras: pela alteração da
conformação estrutural das enzimas, por interferências nas funções básicas dos micro-
organismos e por alteração na velocidade de difusão do substrato nas células (KRAUSE,
2006).
É de conhecimento comum que o aumento da velocidade das reações biológicas é
proporcional à elevação da temperatura, respeitando o limite fisiológico das células. O
processo de nitrificação não foge à regra e obedece à lei de Arrhenius, portanto, a
atividade nitrificante aumenta com o acréscimo da temperatura. A velocidade de
crescimento específica máxima de bactérias do gênero
Nitrosomonas
é significativamente
menor do que as do gênero
Nitrobacter
no intervalo de temperatura de 10 a 20ºC, no
entanto, para temperaturas acima de 20ºC a velocidade de crescimento de
Nitrosomonas
supera a de
Nitrobacter
. A taxa de oxidação de amônio foi calculada por QIAO e
colaboradores (2009). Dos resultados obtidos, observou-se que, a partir de 20ºC, para
cada 10ºC de acréscimo na temperatura do meio reacional, ocorre o aumento da ordem
de 5,7 e 2,2 vezes nas velocidades de oxidação da amônia e do nitrito, respectivamente.
A energia de ativação para o processo de conversão da amônia foi apresentada como
sendo 120 e 48 kJ mol
-1
para faixas de 10 a 20ºC e 20 a 30ºC, respectivamente.
Contraditoriamente, YAN e HU (2009) concluíram que existe apenas uma condição de
energia de ativação, igual a 42 kJ mol
-1
, na velocidade de oxidação da amônia para
15
temperaturas entre 15 e 35ºC. Portanto, QIAO
et al.
(2009) consideram que a extensão do
efeito da temperatura sobre a nitrificação ainda está por se verificar.
RAMALHO (1983) relatou que a temperatura influencia fortemente a eficiência de
remoção do nitrogênio amoniacal, sugerindo que a temperatura ótima para a nitrificação
convencional estaria na faixa de 28 a 32ºC. Complementou ainda que a atividade
nitrificante pode ser significativamente comprometida em temperaturas abaixo de 15ºC e
que a nitrificação se torna impraticável quando as temperaturas são inferiores a 5ºC. Na
mesma linha, seguem as colocações de LOUZEIRO
et al.
(2002), os quais sugerem que a
faixa de temperatura ótima de trabalho para os micro-organismos nitrificantes varia de 35
a 42ºC.
Para estabelecer os limites de temperatura aceitáveis na operação de um reator
em batelada seqüencial (SBR), com o objetivo de promover a nitrificação e a
desnitrificação, OBAJA
et al.
(2003) conduziram seus experimentos avaliando diferentes
temperaturas aplicadas ao sistema (de 8 a 30ºC). A partir dos resultados obtidos
observaram que de 16 a 30ºC não ocorreu diferença significativa no desempenho da
nitrificação (96,3 a 99,8% de eficiência de remoção para N-NH
4
+
). Por outro lado, a
velocidade de consumo do substrato foi mais lenta para as temperaturas abaixo de 18ºC
(< 26 mg N g
-1
SSV h
-1
) e apresentou acréscimo para 30ºC (> 37 mg N g
-1
SSV h
-1
),
permanecendo constante entre 18 e 25ºC (30 mg N g
-1
SSV h
-1
). Como conclusão geral,
os autores consideraram que a nitrificação pode ser conduzida em temperaturas acima de
16ºC sem grandes alterações no seu desempenho e que, abaixo deste ponto, o
rendimento do processo pode tornar-se inaceitável para a maioria das aplicações em
escala real.
HEAD e OLESZKIEWICZ (2004) avaliaram alterações na eficiência da nitrificação
quando reatores do tipo SBR foram submetidos a quedas repentinas de temperatura.
Observaram diminuição considerável da extensão da nitrificação e que a diminuição no
desempenho do processo foi maior quando o diferencial de temperatura (10ºC) foi
aplicado às condições de temperatura mais elevadas. Os resultados apresentados
mostraram perdas de eficiência em torno de 58%, 71% e 82% para temperaturas da
ordem de 20ºC, 25ºC e 30ºC, respectivamente.
16
O efeito da temperatura sobre a taxa de nitrificação foi estudado por SALVETTI
et
al
. (2006) em dois MBBRs (biorreatores com biofilme em leito móvel) alimentados com
esgoto doméstico secundário. Um dos reatores operou sob condições limitantes de
amônia (R1) e outro sob limitação de oxigênio (R2). Os autores observaram que as taxas
de nitrificação no R1 não foram influenciadas significativamente pelas alterações de
temperatura no meio reacional (entre 10 e 28ºC) enquanto que, sob limitação de OD, o
efeito foi mais pronunciado. Temperaturas entre 23 e 28ºC promoveram melhores
condições de penetração do oxigênio no biofilme. Destes resultados, concluiu-se que o
projeto de MBBRs para nitrificação deve levar em consideração o efeito da temperatura
somente quando sua operação estiver sujeita à limitação de oxigênio.
3.3.3 Oxigênio dissolvido
Como na nitrificação convencional as bactérias envolvidas são estritamente
aeróbias, o oxigênio dissolvido (OD) no meio pode tornar-se o fator limitante para o
desempenho do processo. METCALF e EDDY (2003) relataram que as comunidades
nitrificantes requerem concentrações de OD de no mínimo 1,0 mg L
-1
, sendo que o
oxigênio se torna significativamente limitante para níveis de OD menores do que este.
Sistemas de lodos ativados, quando projetados para remoção de carbono e de amônia,
conjuntamente, requerem níveis mínimos de OD mais elevados, ou seja, superiores a 2,0
mg L
-1
(LOUZEIRO
et al.
, 2002).
A concentração crítica de oxigênio depende das características da biomassa, da
taxa total de respiração e das resistências difusionais à transferência de massa. Por
exemplo, no caso dos biofilmes, nos quais a resistência ao transporte de massa é maior,
o nível de oxigênio dissolvido deverá ser mais elevado (FICA-PIRAS, 2000).
Perfis de oxigênio dissolvido no interior de biofilmes heterotróficos-autotróficos
foram investigados por ZHANG
et al.
(1995), utilizando microeletrodos. Os resultados
apontaram para a clara diminuição de OD na camada superficial do biofilme, assim como
na região mais próxima do suporte. Estes resultados foram similares para três tipos de
biofilme investigados, indicando a provável resistência difusional na camada mais externa
e na mais interna da biomassa aderida, o que influencia diretamente as velocidades de
oxidação de amônia e nitrito.
17
A demanda teórica por oxigênio, requerida de acordo com a equação
estequiométrica para a nitrificação convencional (eq. 6 previamente apresentada), é de
aproximadamente 4,58 mg O
2
para cada grama de nitrogênio amoniacal total oxidado a
nitrato, sendo 3,43 mg O
2
para a oxidação de 1,0 mg de N-NH
3
e 1,14 mg O
2
para a
oxidação de 1,0 mg de N-NO
2
-
. Dados compilados da literatura por CHEN
et al.
(2006),
para culturas puras de bactérias nitrificantes, mostraram que a velocidade de crescimento
de
Nitrosomonas
, em geral, não é influenciada por alterações na concentração de OD
para valores acima de 1,0 mg L
-1
. No caso de
Nitrobacter
este valor é de 2,0 mg L
-1
,
evidenciando que as bactérias que oxidam nitrito são mais sensíveis às condições de OD
no meio reacional do que as que oxidam amônia.
RUIZ
et al.
(2006) investigaram a nitrificação e desnitrificação via nitrito em
biorreatores distintos acoplados em série. O parâmetro utilizado para promover a
nitrificação parcial foi o oxigênio dissolvido. Com pH e temperatura fixados, os autores
observaram que a nitrificação convencional não foi significativamente afetada para valores
de OD entre 1,7 e 5,7 mg L
-1
. O acúmulo de nitrito só foi observado para concentrações
abaixo de 1,4 mg L
-1
. A melhor condição para a nitrificação parcial, sem afetar a remoção
de amônia, foi alcançada na faixa de 0,7 - 1,4 mg OD L
-1
. Os autores relataram que a
conversão de amônia foi afetada para valores de OD inferiores a 0,5 mg OD L
-1
e
elegeram a concentração de 1,1 mg OD L
-1
como a condição ideal para alcançar a
nitrificação seguida da desnitrificação, via nitrito.
GAO
et al.
(2009) avaliaram o efeito do excesso de aeração no processo de
nitrificação e desnitrificação via nitrito em um SBR. Após 2 meses de operação estável do
SBR, alcançando 96% de acúmulo de nitrito durante a etapa de nitrificação parcial, o
acréscimo na concentração de OD (0,2 até 7,2 mg L
-1
) provocou a queda do acúmulo de
nitrito no meio em 67 pontos percentuais, direcionando o processo para a nitrificação
convencional. Por conta da efetiva oxidação de nitrito a nitrato observada, sugeriu-se que
um pequeno grupo de NOB foi resistente às condições de baixa concentração de oxigênio
aplicadas durante o período de operação em que a nitrificação parcial foi estável.
Embora os parâmetros pH, T e OD tenham sido apresentados até o momento,
separadamente, as evidências apontam para o fato de que em poucos casos a nitrificação
será influenciada apenas por um destes fatores, até porque a alteração de um deles, em
18
geral, influencia o outro. Desta maneira, alguns trabalhos têm investigado o efeito
conjunto destes três parâmetros no desempenho da nitrificação.
Como exemplo, apresenta-se o estudo realizado por YAN e HU (2009) que teve
como objetivo avaliar as características da nitrificação parcial associada à biodegradação
da matéria orgânica com biomassa imobilizada em alginato de sódio. Dentro deste escopo
foi investigada a influência dos parâmetros pH, OD e T no desempenho do processo.
Ótima atividade das AOB com satisfatória inibição das NOB foi verificada para pH igual a
8,0, tendo sido observadas pequenas alterações de desempenho entre 6,0 e 8,5. A
nitrificação parcial foi acelerada em temperaturas na faixa de 15 a 35ºC, com o aumento
gradual da concentração de nitrito e remoção de DQO, assim como o decréscimo da
concentração de amônia no meio reacional. Para valores acima de 35ºC este
comportamento inverteu-se, sugerindo que esta seria a temperatura ideal para o processo.
O máximo desempenho para a nitrificação parcial, aliado à remoção de DQO, foi
alcançado quando OD esteve compreendido entre 4,2 e 4,6 mg L
-1
. Segundo os autores,
o efeito da temperatura e do pH sobre a nitrificação parcial foi claramente minimizado por
conta da utilização da biomassa imobilizada, quando comparada com a biomassa em
suspensão, porém, o efeito do oxigênio dissolvido continuou sendo significativo.
A compilação de resultados da literatura a respeito da influência da temperatura,
pH e OD na remoção de nitrogênio amoniacal pode ser observada na Tabela 3.2. As
condições apresentadas referem-se à condição ótima de trabalho alcançada conforme o
objetivo pretendido. A diversidade dos valores apresentados ocorre por conta das
distintas possibilidades de configuração dos sistemas, como tipo de reator empregado,
característica da biomassa (em suspensão, aderida em leito fixo, aderida em leito móvel,
imobilizada), efluente empregado e, principalmente, estratégia de remoção do nitrogênio
que está se buscando.
19
Tabela 3.2 –
Compilação dos dados da literatura no que se refere às melhores condições
de pH, OD e T para alcançar a remoção biológica de nitrogênio amoniacal.
T (°C) pH
OD
(mg L
-1
)
Objetivo Biomassa Referência
25 SNDVN suspensão
GAO
et al
.,
2009
25 8 1,2 - 1,9 NP suspensão
JUBANY
et
al.
, 2009
18 - - NP
biofilme em
leito fixo
QIAO
et al.
,
2009
35 8 4,2 - 4,6
NP +
RMO
imobilizada
YAN
et al.
,
2009
21 7,5 > 2,5 NDVN
biofilme em
leito fixo
ASLAN e
DAHAB, 2008
15 – 22 7,0 - 8,0 1,5 - 2,5
SNDVN
+ RMO
biofilme em
leito móvel
XIA
et al
.,
2008
-
7,9 -
8,5 (AOB)
7,5 - 8,3 (NOB)
- NDC suspensão
PARK
et al
.,
2007
35 8 0,3 - 0,5 NP suspensão
SINHA e
ANN
.
, 2007
15 – 20 - - NDC
biofilme em
leito fixo
JEONG
et al
., 2006
30 7,8 - 7,9 0,7 - 1,4 NDVN suspensão
RUIZ
et al
.,
2006
23 – 28 - - NC
biofilme em
leito móvel
SALVETTI
et al
., 2006
30 – 35 7,5 - 8,0 3,0 - 4,0 NC -
HENZE
et al
., 2002
16 – 30 - - NDC suspensão
OBAJA
et al
., 2003
> 28 7,5 - 8,0 > 1,0 NC -
METCAL e
EDDY, 2003
20 – 25 8,0 (AOB) > 1,0 NP
biofilme em
leito fixo
VILLAVERDE
et al.,
1997
25 – 35 7,5 - 9,0 > 2,0
NDC
+ RP
suspensão
SURAMPALLI
et al
., 1997
35 (AOB)
35 - 42 (NOB)
7,5 - 8,5 - NC -
EPA,
1993
NP – nitrificação parcial; NC – nitrificação convencional; SND – nitrificação e desnitrificação
simultâneas; NDC – nitrificação e desnitrificação convencional; NDVN – nitrificação e
desnitrificação via nitrito; SNDVN – nitrificação e desnitrificação simultâneas via nitrito; RMO –
remoção de matéria orgânica; RP – remoção de fósforo.
20
3.3.4 Razão carbono/nitrogênio (C/N)
A relação carbono/nitrogênio (C/N) presente nos biorreatores possui influência
direta na dinâmica das comunidades microbianas autotróficas e heterotróficas presentes
no mesmo.
Conforme previamente apresentado, a taxa de crescimento das bactérias
nitrificantes é consideravelmente inferior a das heterotróficas e a sua constante de
afinidade por oxigênio é muito menor (MATSUMOTO
et al.,
2007). Segundo FICA-PIRAS
(2000), nestas condições o arraste ou a inibição dos micro-organismos que oxidam
amônia e nitrito em reatores de mistura, especialmente para biomassa em suspensão, é
inevitável para elevadas razões C/N. Este fato conduz à queda na eficiência ou ao
colapso total do processo de nitrificação.
Resultados observados por HU
et al.
(2009) constataram que altos valores da
razão C/N induziram à competição desfavorável das AOB em relação às bactérias
heterotróficas no que se referiu ao consumo de oxigênio, com conseqüente redução na
conversão de amônia.
A competição entre bactérias heterotróficas e nitrificantes por substratos, oxigênio
e espaço é de importante relevância no que se refere aos estudos da remoção biológica
de nutrientes, em particular para biofilmes. De acordo com estudos prévios, esta
competição resulta na estratificação da microbiota presente na estrutura dos biofilmes. O
crescimento mais acelerado das bactérias heterotróficas favorece a sua distribuição na
camada superficial da biomassa aderida, onde a concentração dos substratos é maior,
enquanto as nitrificantes crescem e permanecem no interior do biofilme. Esta camada de
heterotróficas que se forma acima das AOB e NOB constitui uma desvantagem,
principalmente quando os substratos e/ou oxigênio encontram-se em baixas
concentrações no seio do líquido, resultando em perdas no desempenho da nitrificação
(NOGUEIRA
et al.
, 2002).
XIA
et al.
(2008) utilizaram técnicas de biologia molecular para avaliar a
distribuição das AOB e das NOB em relação às bactérias heterotróficas para diferentes
razões C/N. Foi utilizado para esta finalidade um reator compacto com biomassa aderida
do tipo MBBR. Dos resultados obtidos, observou-se que a proporção
21
nitrificantes:heterotróficas, aproximadamente de 1:10, decresceu com o aumento da razão
C/N (Figura 3.3). KINDAICHI
et al.
(2004)
apud
XIA
et al.
(2008) mostraram que para
biofilmes autotróficos a proporção nitrificantes:heterotróficas foi em torno de 1:1, sendo
que AOB e NOB foram quantificadas em 28 e 22% do total de micro-organismos
presentes no biofilme.
Figura 3.3 –
Densidade de AOB e NOB em relação à densidade de heterotróficas para
três razões C/N (3/1, 5/1, 10/1), adaptado de XIA
et al.
(2008).
Além da influência que os parâmetros operacionais (pH, T, OD) e a razão C/N
podem exercer sobre a nitrificação, existem várias substâncias que reconhecidamente
interferem no processo, muitas vezes podendo levar à inibição completa da conversão de
amônia. Estas possíveis substâncias inibidoras podem ser os próprios substratos da
reação, metais pesados, sais e certos compostos orgânicos, conforme serão
apresentados a seguir.
3.4 Substâncias que inibem a atividade nitrificante
É de conhecimento comum que metais pesados, assim como compostos
orgânicos, em geral recalcitrantes, podem causar efeitos adversos sobre a microbiota
característica dos processos biológicos de tratamento de efluentes. Por conta do limitado
grupo de bactérias que são capazes de promover a nitrificação, somado ao fato de serem
porcentagem (%)
C:N 3:1 C:N 5:1
C:N 10:1
porcentagem (%)
C:N 3:1 C:N 5:1
C:N 10:1
C:N 3:1 C:N 5:1
C:N 10:1
22
considerados de crescimento lento, este processo biológico específico está ainda mais
susceptível à possível inibição causada por compostos tóxicos (JONSSON
et al
., 2000). O
grau de toxidade destas substâncias sobre a comunidade microbiana vai depender,
sobretudo, da concentração e, no caso dos metais, também da especiação destas
substâncias, além da fase de crescimento das bactérias e da concentração de biomassa
(PRINCIPI
et al
., 2006).
Alguns metais, quando presentes em baixas concentrações no meio, podem agir
como micronutrientes para a microbiota, resultando em ação benéfica. Porém, se
apresentam altas concentrações, podem formar, inespecificamente, compostos
complexos no interior das células, levando à sua ruptura (ARICAN e YETIS, 2003
apud
PRINCIPI
et al
., 2006).
GRUNDITZ
et al.
(1998) avaliaram o efeito inibitório de diferentes metais na
atividade de três culturas puras de bactérias responsáveis por três etapas distintas da
remoção total de nitrogênio amoniacal: oxidação da amônia, oxidação e redução do nitrito.
Significativo efeito inibitório foi observado para as três culturas. A oxidação do nitrito foi a
que mostrou maior sensibilidade aos metais avaliados (Cr, Ni, Cu, Zn, Pb e Cd), sendo
que zinco foi o que apresentou maior efeito inibitório em todos os casos.
Os possíveis efeitos inibitórios de níquel e cádmio na nitrificação também foram
estudados por HU
et al.
(2002). Concentrações de 1,0 mmol L
-1
de Ni e Cd inibiram
significativamente a atividade das AOB, resultando em perdas da eficiência de conversão
de amônia da ordem de 30 e 70% para os respectivos metais.
No que diz respeito aos inibidores orgânicos, tem-se relatado que existem vários
compostos de difícil biodegradação como fenol (MUNZ
et al.
, 2008), tiouréia, anilina, entre
outros que interferem negativamente na atividade nitrificante (COELHO, 1998). Entretanto,
por conta das dificuldades envolvidas no cultivo das AOB, há ainda pouca informação
sobre os efeitos das substâncias químicas tóxicas na fisiologia geral destas bactérias
(BRANDT
et al.,
2001).
Tem-se conhecimento de que surfactantes compreendem um grupo muito
importante de compostos potencialmente tóxicos, que se acredita serem prejudiciais
23
devido ao rompimento da função e da estrutura da membrana celular. Pela comparação
de culturas isentas com as adicionadas de surfactante, BRANDT
et al.
(2001) observaram
que o crescimento celular foi progressivamente inibido com o incremento da concentração
de surfactante para quatro cepas de AOB investigadas. Dos resultados obtidos, sugeriu-
se que a toxicidade por surfactantes ocorreu pela direta interação dos monômeros do
surfactante com a estrutura da parede celular dos micro-organismos. O possível
mecanismo desta ocorrência é o aumento da permeabilidade da membrana que causa a
dissipação do gradiente iônico e do potencial da membrana ou a perda dos constituintes
celulares essenciais.
BASSIN (2008) evidenciou o forte efeito inibitório de compostos orgânicos
recalcitrantes, presentes em um efluente da indústria química, no processo de nitrificação.
Apenas após o pré-tratamento do efluente com carvão ativado em pó foi possível
promover a nitrificação, chegando a alcançar 90% de eficiência de remoção do nitrogênio
amoniacal.
3.4.1 Substratos e intermediários da nitrificação
Vários trabalhos têm abordado a possível inibição das bactérias nitrificantes por
amônia e nitrito livres no meio reacional, assim como por hidroxilamina (produto
intermediário da nitrificação em condições específicas de operação). Amônia e nitrito livre
são as porções não ionizadas destes compostos presentes no meio líquido, sendo o
equilíbrio entre eles regulado pelo pH. Serão adotadas nesta discussão as siglas oriundas
do inglês FA (free ammonia) para NH
3
livre e FNA (free nitrous acid) para HNO
2
livre.
ANTHONISEN
et al.
(1976) foram os precursores dos estudos referentes à inibição
da nitrificação por FA e FNA. Estes autores observaram que os substratos dos dois
grupos microbianos envolvidos na nitrificação, amônia e nitrito, podem gerar efeitos
inibitórios sobre as bactérias envolvidas no processo, dependendo da concentração
presente. A oxidação da amônia, com conseqüente diminuição do pH, é um fator que leva
à diminuição de amônia livre, principal inibidor da ação de bactérias do gênero
Nitrobacter
no meio reacional
.
Porém, observações da inibição das NOB sem a presença de FA
deram indícios de que as mesmas também seriam sensíveis ao ácido nitroso, o qual
apresenta concentrações crescentes em relação ao nitrito conforme ocorre o decréscimo
do pH no meio. ANTHONISEN
et al.
(1976) confirmaram em seus estudos que para certas
24
concentrações de FA e FNA, bactérias tanto do gênero
Nitrosomonas
quanto do gênero
Nitrobacter
são inibidas. Contudo, espécies do gênero
Nitrobacter
mostraram-se mais
sensíveis do que
Nitrosomonas
na presença de FA, sendo que a inibição das AOB foi
observada para concentrações de 10 a 150 mg NH
3
L
-1
,
enquanto 0,1 a 1,0 mg NH
3
L
-1
foram suficientes para inibir a atividade das NOB. A atividade das AOB e das NOB foi
afetada por ácido nitroso livre em concentrações de 0,22 a 2,8 mg HNO
2
L
-1
. Os autores
chamaram a atenção de que o efeito inibitório destas substâncias na nitrificação pode
aumentar ou diminuir dependendo da condição de alguns fatores operacionais como
aclimatação da biomassa, temperatura e quantidade de micro-organismos nitrificantes
ativos. Por conta destas possibilidades, ANTHONISEN e seus colaboradores identificaram
possíveis faixas de concentração de FA e FNA inibitórias da nitrificação e montaram
diagramas para a determinação das concentrações de amônia e ácido nitroso livres, para
diferentes condições de pH e temperatura. Por conta disto, estes autores são
freqüentemente citados na literatura.
A investigação da nitrificação parcial no processo SHARON foi realizada por
MOSQUERA-CORRAL
et al.
(2005), os quais utilizaram os cálculos propostos por
ANTHONISEN
et al
. (1976) para determinar as concentrações de FA e FNA que poderiam
estar inibindo a ação das AOB. Os autores desconsideraram os possíveis efeitos destas
substâncias sobre as NOB por não ter sido identificada a formação de nitrato em qualquer
momento da operação, indicando que não houve crescimento das bactérias que oxidam
nitrito por conta dos tempos de retenção hidráulica aplicados, que foram eficientes no
arraste destes micro-organismos do interior do biorreator. As concentrações que
causaram inibição na atividade das bactérias que oxidam amônia foram calculadas e
resultaram em 10 e 0,2 mg L
-1
de FA e FNA, respectivamente.
VADIVELU
et
al
. (2007) investigaram o efeito inibitório da amônia livre no
metabolismo das bactérias do gênero
Nitrobacter
. Vários ensaios em batelada foram
realizados para medir a taxa de consumo de oxigênio (OUR) em vários níveis de FA, na
presença e ausência de carbono inorgânico (CO
2
, HCO
3
-
, CO
3
2-
). Os resultados
mostraram que a respiração foi inibida para baixas concentrações de FA (< 1,0 mg N-NH
3
L
-1
), sendo que a taxa de respiração celular foi reduzida para 12 e 25%, respectivamente,
no que se refere à ausência e presença do carbono inorgânico. FA mostrou forte efeito
inibitório no anabolismo de
Nitrobacter
. Embora não seja possível, a partir destes estudos,
25
comprovar este efeito inibitório, os dados experimentais indicam fortemente que
Nitrobacter
provavelmente deixou de crescer em concentrações de FA entre 6 e 9 mg N-
NH
3
L
-1
. Os autores concluíram que o trabalho desenvolvido mostrou a necessidade de
estudos fisiológicos para revelar o mecanismo de inibição de FA no metabolismo
microbiano e, sugeriram, ainda, que o anabolismo e o catabolismo deveriam ser
investigados separadamente. A Tabela 3.3 sumariza dados da inibição de
Nitrobacter
e
Nitrosomonas
por amônia e ácido nitroso livres (FA e FNA), apresentados por VADIVELU
et
al
. (2007).
Tabela 3.3 –
Sumário dos dados de inibição de FA e FNA sobre
Nitrobacter
e
Nitrosomonas
, adaptado de VADIVELU
et al
. (2007).
Nitrobacter
Nitrosomonas
Anabolismo Catabolismo
Anabolismo Catabolismo
FNA
provável inibição
completa em 0,02
mg N-HNO
2
L
-1
nenhuma inibição
até 0,04
mg N-HNO
2
L
-1
provável inibição
completa em 0,4
mg N-HNO
2
L
-1
inibição de 50%
entre 0,40 e 0,63
mg N-HNO
2
L
-1
FA
provável inibição
completa acima de
6,0 mg N-NH
3
L
-1
inibição de 12%
entre 6,0 e 9,0
mg N-NH
3
L
-1
nenhuma
inibição até 16
mg N-NH
3
L
-1
nenhuma
inibição até 16
mg N-NH
3
L
-1
Com a proposta de validar um modelo cinético para a nitrificação, PARK e BAE
(2009) investigaram os efeitos inibitórios da amônia e ácido nitroso não ionizados na
atividade nitrificante. Os autores relataram que o efeito da inibição de FA pode ser
considerado insignificante para condições ácidas (pH em torno de 6,0), a menos que as
concentrações de nitrogênio amoniacal sejam extremamente elevadas (acima de 10.000
mg N L
-1
para AOB e 2.000 mg N L
-1
para NOB). Da mesma maneira, a influência inibitória
de FNA pode ser desconsiderada para condições alcalinas, pH acima de 8,0. Contudo,
próximo ao pH neutro, tanto FA quanto FNA têm efeito significativo na atividade das
nitrificantes. Durante ensaios realizados em batelada, observou-se a predominância do
efeito inibitório de FA no início da reação, sendo que a partir de 100 min o efeito de FNA
prevaleceu até o final (Figura 3.4). No período inicial da batelada quando a concentração
de FA estava mais alta, a razão das taxas específicas de consumo dos substratos para
NOB foi menor do que 0,1, porém aumentou gradativamente com o decréscimo de FA,
chegando a 0,6 em 100 min e, posteriormente, manteve-se no patamar de 0,45 com o
26
aumento da concentração de FNA. O decréscimo do pH (8,0 para 6,8), aliado à conversão
eficiente de amônia, foram responsáveis pelo aumento do teor de FNA no meio reacional,
que resultou no acúmulo de 95% de nitrito mesmo quando NH
3
livre e NH
4
+
não foram
mais detectados. A inibição simultânea por FA e FNA sugere que a taxa específica de
máxima utilização do substrato pelas NOB é reduzida significativamente pelos substratos
não ionizados e os produtos da reação.
Figura 3.4 –
Resultados do ensaio realizado em batelada para avaliar o efeito inibitório de
FA e FNA na nitrificação, (
□)FA, (○)pH, (■)FNA, (♦)NO
2
/NO
x
, (
▲)
q
1
e (
▼)q
2
são razões das
taxas específicas de consumo dos substratos para AOB e NOB, respectivamente;
símbolos sólidos (ordenada da direita), símbolos vazados (ordenada da esquerda),
adaptado de PARK e BAE (2009).
A possível formação de hidroxilamina (NH
2
OH) como intermediário da reação de
oxidação de amônia, pela ausência de OD suficiente no biorreator, é uma discussão
interessante. Este composto seria responsável pelo acúmulo de nitrito no meio, por conta
da inibição das bactérias
Nitrobacter.
A hidroxilamina é formada de acordo com a seguinte reação global (COELHO,
1998):
2 NH
3
+ 2O
2
→
NH
2
OH + HNO
2
+ H
2
O (7)
FA (mg N L
-1
) e pH
FNA (mg N L
-1
) e razões q
tempo, min
FA (mg N L
-1
) e pH
FNA (mg N L
-1
) e razões q
tempo, min
27
Portanto, o nível de OD sozinho não seria o fator dominante por trás do acúmulo
do nitrito, mas sim a presença de hidroxilamina livre ou não ionizada, a qual teria relação
efetiva com a baixa atividade das NOB. Supõe-se que o efeito inibitório causado pela
presença de NH
2
OH livre, seja devido à sua capacidade de penetração através da
membrana citoplasmática das bactérias do gênero
Nitrobacter
. Este composto, então,
inibiria a enzima nitrito redutase, responsável pela oxidação do nitrito a nitrato, contudo,
este mecanismo de inibição ainda não foi totalmente esclarecido (YANG e ALLEMAN,
1992).
3.4.2 Salinidade
A salinidade, quando presente em elevadas concentrações, pode causar estresse
osmótico nas células microbianas em qualquer tipo de tratamento biológico de efluentes.
Como conseqüência observam-se significativas perdas de eficiência no desempenho dos
processos e alteração na cinética de biodegradação. Ademais, elevadas concentrações
salinas podem levar à lise celular, causando acúmulo de sólidos nos biorreatores.
No entanto, há certo conflito, reportado na literatura, no que diz respeito ao grau
de influência que o sal exerce sobre os processos biológicos. Alguns estudos mostram os
efeitos adversos que a crescente salinidade ou choques de NaCl podem causar no
desempenho destes processos, assim como em que extensão a aclimatação gradual da
biomassa pode minimizar estes efeitos (HAMODA e AL-ATTAR, 1995).
Os principais problemas observados no tratamento biológico de efluentes salinos
foram sumarizados por KARGI e DINCER (2000), sendo eles:
Adaptação limitada da biomassa: culturas convencionais não podem ser
efetivamente utilizadas para tratar efluentes com teor de salinidade acima de 3,0%,
mesmo com aclimatação gradual da biomassa;
•
Sensibilidade a mudanças na força iônica: alterações na concentração de sal de
0,5 a 2,0% geralmente causam distúrbios no desempenho do sistema. A mudança
abrupta nos teores de sal leva a efeitos mais adversos do que o incremento
gradual da concentração salina nos processos biológicos;
•
Redução da cinética de biodegradação: taxas de biodegradação diminuem com o
aumento do conteúdo salino no meio;
28
•
Alta concentração de sólidos suspensos no efluente: elevados teores de NaCl
reduzem a população de protozoários, o que influencia na capacidade de
sedimentação do lodo. A presença de sal aumenta as forças de empuxo que
causam perdas na capacidade de sedimentação.
Como o processo de nitrificação pode ser considerado o mais sensível dentre
todas as possibilidades de aplicação dos processos biológicos, as comunidades
nitrificantes estão mais sujeitas aos efeitos que as crescentes concentrações salinas
podem causar no seu desempenho. Alguns pesquisadores chamam a atenção para o fato
de que diferentes teores de salinidade observados nos efluentes influenciam, de forma
significativa e às vezes adversa, a eficiência da remoção biológica de nutrientes como o
nitrogênio (GLASS e SILVERSTEIN, 1999, CAMPOS
et al.
, 2002b).
CHEN
et al.
(2006) relataram, a partir de diversos estudos realizados, que a
capacidade máxima de nitrificação em ambientes salinos foi sempre consideravelmente
inferior à obtida em sistemas isentos de sal, mesmo quando submetidos às mesmas
condições operacionais. Contudo, estes autores frisaram que estudos realizados no
mesmo tema, por outros grupos de pesquisadores, mostraram resultados distintos, tendo-
se alcançando taxas de nitrificação similares às observadas em operações livres de sal.
No entanto, poucos pesquisadores têm se dedicado a investigar a influência da
salinidade especificamente no processo de nitrificação e, por conseqüência, na
desnitrificação. Os pesquisadores KARGI e DINCER são exceção, tendo publicado vários
artigos relacionados ao efeito salino sobre os processos biológicos, inclusive para a
nitrificação e desnitrificação. Em 1996, estudaram variações de 1 a 5% de NaCl no
desempenho de um SBR operado em sistema de batelada alimentada, utilizando efluente
sintético. Em 1998, avaliaram a biodegradação orgânica de um efluente sintético com
concentração salina entre 0 e 10% em RBC (biodisco). A partir de 1999 iniciaram estudos
especificamente dedicados ao efeito inibitório do cloreto de sódio na remoção biológica de
nutrientes. Em 2001, investigaram o efeito inibitório do sal sobre a cinética da nitrificação
e utilizaram um efluente sintético com concentrações de NaCl variando entre 0 e 5% no
processo de lodos ativados. Em 2004, KARGI, em colaboração com UYGUR, estudaram
o efeito inibitório do sal (0 a 6% de NaCl) na remoção biológica de nutrientes no SBR.
29
Dentre todos estes trabalhos, as principais conclusões obtidas em relação à remoção
biológica de nitrogênio amoniacal em efluentes salinos foram:
•
crescentes concentrações de sal nos efluentes resultaram na diminuição
proporcional da capacidade de remoção de nutrientes dos processos biológicos
(Figura 3.5);
•
concentrações salinas superiores a 3,0% no meio inibiram fortemente a atividade
da biomassa presente;
•
a sedimentabilidade do lodo, em processos com biomassa em suspensão, foi
adversamente afetada pela salinidade, resultando em altos valores de IVL
(índice volumétrico do lodo);
•
os estudos cinéticos mostraram que ocorreu inibição, pelo efeito do sal, mais
pronunciada sobre a constante de saturação do processo de nitrificação, do que
sobre a taxa específica de nitrificação (modelo de Monod).
Figura 3.5 –
Variação da concentração de N-NH
4
+
no efl
uente e sua eficiência de
remoção em função do conteúdo de sal no meio, adaptado de KARGI e UYGUR
(2004).
Com o intuito de avaliar o desenvolvimento de biofilmes em ambiente salino,
ROSA
et al.
(1998) investigaram a aplicação de um biorreator aeróbio de leito fixo
submerso no processo de nitrificação. O efluente de estudo foi sintético com 50 g L
-1
de
N-NH
4
+
, mg L
-1
remoção de N-NH
4
+
, %
teor salino, %
N-NH
4
+
, mg L
-1
remoção de N-NH
4
+
, %
teor salino, %
30
NaCl. Quando o sistema operou continuamente com tempo de retenção hidráulica de 15
horas, foi observada a queda de aproximadamente 50 pontos percentuais na eficiência de
remoção de amônia para o efluente salino, quando comparada com a eficiência do
efluente isento de sal (94% de eficiência de remoção na ausência de sal e 48% na
presença de 50 g sal L
-1
). A avaliação do biofilme mostrou que a elevada concentração
salina do efluente causou mudanças fisiológicas nas células, afetou o seu metabolismo e,
conseqüentemente, reduziu a capacidade de remoção da amônia.
PANSWAD e ANAN (1999) investigaram o efeito de vários níveis de salinidade
para um sistema anóxico/óxico, na remoção biológica de nitrogênio amoniacal. Em
condição de estado estacionário, a taxa específica de oxidação da amônia diminuiu com o
aumento da concentração dos íons cloreto. A remoção total de nitrogênio caiu de 85%
para 70% com o incremento da concentração salina de 20 para 30 g NaCl
L
-1
. Os autores
sugerem que as bactérias nitrificantes e desnitrificantes são muito sensíveis a variações
abruptas de sal no meio reacional, até mesmo quando o processo está sob longo período
de operação estável.
CAMPOS
et al.
(2002b) estudaram a aplicação do sistema de lodos ativados na
nitrificação de um efluente sintético com elevada salinidade e teor de nitrogênio amoniacal.
O biorreator operou eficientemente (próximo a 100% de remoção de nitrogênio amoniacal)
para cargas de amônia na faixa de 1 a 4 g N-NH
4
+
L
-1
d
-1
. Para concentrações de sal
acima de 525 mmol L
-1
(13,7 g NaCl L
-1
, 19,9 g NaNO
3
L
-1
e 8,3 g Na
2
SO
4
L
-1
) observou-se
acúmulo de amônia e queda brusca na eficiência da nitrificação, provavelmente devido à
sinergia do efeito inibitório dos sais com as elevadas concentrações de nitrogênio
amoniacal. Os resultados obtidos dos testes de atividade mostraram que a biomassa
adaptada foi menos sensível às elevadas concentrações salinas aplicadas.
Efeitos da salinidade sobre a remoção do nitrogênio, em um efluente da indústria
metalúrgica, foram investigados por TSUNEDA
et al.
(2005). Com este objetivo foi
utilizado o sistema de lodos ativados com dois biorreatores (óxico e anóxico) ligados em
série para promover nitrificação e desnitricação da maneira convencional. Os autores
observaram que o acréscimo de sal no sistema, de 1,0 a 5,0% em NaCl, implicou na
inibição mais acentuada da atividade nitrificante quando comparada à desnitrificação. No
biorreator para a oxidação da amônia a eficiência manteve-se em torno de 90% até o
31
incremento de 2,0% de sal, enquanto na atividade desnitrificante não foi observada
diferença significativa mesmo com 5,0% de NaCl no meio reacional. Dos resultados
obtidos, concluiu-se que para alcançar eficiência satisfatória na remoção total do
nitrogênio, deve-se manter a concentração salina abaixo de 3,0% no sistema de lodos
ativados óxico e anóxico.
WINDEY
et al.
(2005) avaliaram o processo de nitrificação e desnitrificação em
RBC (biodisco) pelo princípio OLAND. Um efluente sintético foi suplementado com
crescentes quantidades de cloreto de sódio até a concentração de 30 g L
-1
de NaCl (3,0%
m v
-1
). O reator operou satisfatoriamente durante todo o período experimental. Contudo, a
capacidade de remoção do nitrogênio amoniacal, na maior concentração salina, foi 31
pontos percentuais menor quando comparada ao período de referência (isento de sal).
Experimentos em batelada foram realizados para investigar o efeito de choques de
salinidade no processo. O incremento abrupto de 30 g L
-1
de NaCl no sistema causou
efetivo decréscimo (43%) na atividade específica de oxidação da amônia via nitrito e
perdas mais pronunciadas na atividade específica ANAMOX (96%), quando comparados
com a biomassa de referência. No que se refere ao incremento gradual de sal ao meio (3
a 4 semanas) a perda de eficiência da nitritação foi de 23% e, por sua vez, a diminuição
da atividade ANAMOX foi de 58%. Mediante os resultados apresentados os autores
concluíram que o processo OLAND possui grande potencial para tratar efluentes salinos
com elevadas concentrações de amônia, após a adaptação da biomassa.
O efeito da presença dos sais NaCl, KCl e Na
2
SO
4
, em diferentes concentrações,
na atividade específica de oxidação da amônia foi estudada em ensaios respirométricos
por MOSQUERA-CORRAL
et al.
(2005). Os resultados indicaram que os três sais
provocaram efeito similar na atividade das AOB em concentrações de até 100 mmol L
-1
.
Desta maneira, experimentos em operação contínua foram conduzidos apenas com NaCl.
Foi observado que para o incremento da concentração salina de zero para 85 mmol L
-1
de
NaCl (0,5% de sal), a conversão de amônia aumentou em 30%, sem qualquer outra
alteração nas condições do meio reacional. Somente quando o meio foi suplementado
com 342 mmol L
-1
de NaCl (2,0% de sal) foram identificadas perdas na atividade
nitrificante da ordem de 15%, o que representou 70% de decréscimo no desempenho da
nitrificação quando comparado com a condição isenta de sal. Inibição total das AOB
ocorreu quando a concentração molar de NaCl foi igual a 513 mmol L
-1
(3,0% de sal), com
32
conseqüente perda da biomassa. Contudo, foi relatado pelos autores que o processo
operou sob condições estáveis com 50% de eficiência na conversão do nitrogênio
amoniacal a nitrito, para concentrações salinas de até 427 mmol L
-1
de NaCl (2,5% de sal).
A troca do efluente sintético utilizado nos experimentos apresentados por um efluente do
processamento de peixe enlatado, previamente tratado por processo anaeróbio, levou a
perdas de 10 a 20 pontos percentuais no desempenho do processo em menos de 10 dias.
Sugeriu-se que esta redução foi ocasionada pela presença de matéria orgânica no
efluente industrial em concentrações de até 250 mg TOC L
-1
. Estes resultados evidenciam
que a utilização de efluentes sintéticos pode resultar em desempenho significativamente
distinto ao observado com efluentes reais.
Segundo MOUSSA
et al.
(2006), estudos sobre o efeito da salinidade na
nitrificação são difíceis de comparar e apresentam resultados contraditórios. Esta
contradição pode ser atribuída a vários fatores tais como: i) diferentes configurações e
instabilidade nas condições experimentais no que se refere à temperatura, pH, presença
de compostos ou fatores inibitórios; ii) a forma como o sal é introduzido no sistema, por
incremento gradual ou em pulso; iii) pelas espécies envolvidas, o uso de culturas puras ou
consórcios microbianos, com adaptação ou não da biomassa. Mediante estes argumentos,
MOUSSA e colaboradores (2006) avaliaram o efeito da salinidade na atividade e
composição das bactérias que oxidam amônia e nitrito. Culturas de nitrificantes não
adaptadas e adaptadas (10 g Cl
-
L
-1
por um ano) foram cultivadas em reatores SBR com
aumento gradual de sal de 5,0 a 40 g Cl
-
L
-1
. Em estado estacionário não foi observada
diferença significativa entre a biomassa adaptada e a não adaptada. A atividade das AOB
e NOB decresceu 36% e 11%, respectivamente, na concentração salina de 10 g Cl
-
L
-1
.
Para 40 g Cl
-
L
-1
a inibição foi quase total (95%) para ambos grupos de bactérias
nitrificantes, tanto no biorreator com adaptação (SBR1) como sem adaptação (SBR2).
Após 118 dias de operação foram restabelecidas as condições iniciais de operação nos
dois biorreatores, ou seja, SBR2 voltou a operar isento de sal e SBR1 com 10 g Cl
-
L
-1
.
Este procedimento foi adotado para avaliar a capacidade de recuperação das bactérias
nitrificantes depois de submetidas a situações de estresse salino. Foi verificado que após
duas semanas nesta nova condição, a comunidade nitrificante no SBR1 recuperou 40%
da sua atividade inicial, igualmente para as AOB e para as NOB. No caso do SBR2, a
retomada da atividade das NOB foi superior à das AOB, resultando em 53% e 33% de
oxidação de nitrito e amônia, respectivamente. Destes resultados, os autores sugerem
33
que elevadas concentrações salinas promovem apenas a inativação dos micro-
organismos responsáveis pela nitrificação.
Mediante o exposto pode-se constatar que o efeito inibitório de crescentes
concentrações salinas no processo de nitrificação é evidente. Porém, há discrepâncias no
que se refere ao grau de inibição que o sal pode causar na microbiota nitrificante,
sobretudo pela distinta influência que promove sobre as AOB e as NOB. A Tabela 3.4
sumariza alguns resultados obtidos da literatura para a remoção biológica de nitrogênio
em ambientes salinos, na qual estão apresentadas as faixas de salinidade investigadas e
os efeitos inibitórios sobre a comunidade microbiana nitrificante.
34
Tabela 3.4 – Compilação dos dados da literatura no que se refere aos efeitos inibitórios de diferentes concentrações salinas na
remoção biológica de nitrogênio amoniacal.
Faixa de sal
investigada
Impacto na atividade nitrificante Sistema Efluente Observações gerais Referências
0,5 - 3,0%
AOB - inibiçã
o a partir de 1,0%
NOB - inibição desde 0,5%
chegando a 95% de inibição com
1,0% de sal
nitrificação
parcial em
SBR
doméstico
o retorno à condição isenta de
sal não mostrou recuperação
da atividade nitrificante
YE et al.,
2009
7,4 -
8,4% e
0,2 - 1,5%
até 1,5% de sais (efluente diluído)
não foi observada inibição da
nitrificação, para o efluente bruto
(7,4 – 8,4%) a atividade nitrificante
foi completamente inibida
biomassa em
suspensão +
MBBR + MBR
processamento
de peixe
enlatado
observou-se boa eficiência na
remoção de DQO, mesmo para
os teores de sal mais elevados
ARTIGA
et al., 2008
até 4,0%
a partir de 1,0% de sal:
AOB -
36% de inibição
NOB - 11
% de inibição
4,0% de sal, 95% de inibição
das AOB e NOB
nitrificação
convencional
em SBR
sintético
a biomassa adaptada por 1
ano com 1,0% de sal não
apresentou diferença
significativa nos resultados em
relação a biomassa não
adaptada
MOUSSA
et al., 2006
até 3,0%
foram avaliadas somente as AOB
sal (2,0%) →
inibição 15%
sal (2,5%) →
inibição 50%
sal (3,0%) → inibição total
processo
SHARON com
biomassa em
suspensão
sintético
a mudança do efluente
sintético para um real alterou
de maneira negativa os
resultados obtidos
MOSQUERA-
CORRAL
et al., 2005
até 3,0%
3,0% de sal 23% de inibição das
AOB para biomassa adaptada
processo
OLAND em
RBC
sintético
o incremento da salinidade
sem adaptação da biomassa
(3,0%) causou inibição de 43%
nas AOB
WINDEY
et al., 2005
35
Tabela 3.4 – Compilação dos dados da literatura no que se refere aos efeitos inibitórios de diferentes concentrações salinas na
remoção biológica de nitrogênio amoniacal (continuação).
Faixa de sal
investigada
Impacto na atividade nitrificante Sistema Efluente Observações gerais Referências
até 6,0%
AOB e NOB sem distinção
sal (1,0%) →inibição 10%
sal (3,0%) →
inibição 30%
sal (6,0%) → inibição 88%
nitrificação
convencional
em SBR
sintético
o descréscimo na atividade
nitrificante foi diretamente
proporcional ao incremento da
salinidade
KARGI e
UYGUR,
2004
até 6,0%
maior inibição sobre as
AOB do que sobre as NOB
sintético
condições de sal mais brandas
(de 6,0 para 2,4%) mostraram
capacidade de recuperação da
atividade nitrificante
SÁNCHEZ
et al., 2004
até 3,0%
maior inibição sobre as
NOB do que as AOB
NOB desapareceram a partir de
1,8% de sal
nitrificação
convencional
em lodo
ativado
sintético
o incremento abrupto da
salinidade foi mais deletério a
atividade nitrificante do que o
aumento gradual
CHEN
et al., 2003
até 525 mmol
L
-1
(Na
2
SO
4
,
NaNO
3
, NaCl)
AOB e NOB sem distinção
sal (100 mmol L
-1
) → inibição 50%
sal (150 mmol L
-1
) → inibição 75%
> 250 mmol L
-1
→ inibição 100%
nitrificação
convencional
em lodo
ativado
sintético
testes em batelada mostraram
que a biomassa adaptada foi
menos sensível a choques de
salinidade
CAMPOS
et al., 2002b
até 5,0%
AOB e NOB sem distinção
a partir de 3,0% de sal
iniciou a inibição
sal (5,0%) → inibição 20%
nitrificação
convencional
em lodo
ativado
sintético
constantes de saturação do
modelo proposto para
nitrificação foram
adversamente afetadas pelo
incremento do sal
KARGI e
DINCER,
2001
até 3,0%
AOB e NOB sem distinção
a partir de 1,0% de sal
iniciou a inibição
sal (1,8%) → inibição 55%
nitrificação
convencional
em SBR
sintético
a inibição da biomassa
aclimatada foi 25 pontos
percentuais inferior a não
aclimatada ao sal
PANSWAD
e ANAN,
1999
36
3.5 Desnitrificação
A desnitrificação é o processo biológico complementar à nitrificação quando
deseja-se alcançar a remoção total de nitrogênio em efluentes. Por ser um processo de
baixo custo, se comparado com os físico-químicos e, por fazer parte do ciclo natural do
nitrogênio, também é utilizado para a remoção de nitrato em águas potáveis (WASIK et al.,
2001, BABARY e BOURREL, 1999). Concentrações acima de 50 mg L
-1
de NO
3
-
em
águas de abastecimento podem ser prejudiciais à saúde humana, sendo este o nível
máximo de nitrato permitido em águas limpas conforme WHO (1993) e EEC (1980) apud
SHIRIMALI e SINGH (2001). Além disso, segundo LAZAROVA et al. (1994), a
desnitrificação biológica tem provado ser um dos métodos mais avançados em termos de
alto desempenho e o único método seletivo para a completa eliminação de nitrato.
Portanto, a desnitrificação é a redução biológica de nitrito e nitrato a óxido nitroso
(N
2
O) e nitrogênio molecular (N
2
). Conforme relatado por GOMEZ et al. (2000), sua
significância fisiológica é a geração de ATP por respiração anaeróbia, na qual os íons
nitrogenados servem como aceptores finais de elétrons, sendo assim reduzidos e os
substratos carbonáceos oxidados a dióxido de carbono (CO
2
).
A maioria das bactérias desnitrificantes é heterotrófica e, principalmente,
organotrófica (MODIN et al., 2007). Ampla gama de micro-organismos, distribuídos nos
três domínios Bacteria, Archaea e Eucarya, é capaz de realizar a desnitrificação. Em geral,
os desnitrificantes são facultativos, em ambientes anóxicos utilizam o nitrato como aceptor
final de elétrons, alternativamente ao oxigênio. As bactérias que agem na desnitrificação
pertencem a uma grande variedade de grupos fisiológicos e estão filogeneticamente
dispersas, localizadas em ramos evolutivos muito diversos (ETCHEBEHERE, 2007).
Os organismos com capacidade de desnitrificar, mais freqüentemente reportados,
são as bactérias Gram-negativas pertencentes às sub-classes alfa e beta das
Proteobacterias. As principais representantes são dos gêneros Paracoccus, Alcaligenes,
Pseudomonas e Thiobacillus. Bactérias, como Bacillus, e poucas Archaeas halofílicas,
37
como Halobacterium, também são conhecidas por sua capacidade de desnitrificação
(AHN, 2006).
Apesar desta diversidade de micro-organismos que são capazes de desnitrificar e
a menor sensibilidade desse processo quando comparado com a nitrificação, a
desnitrificação não é trivial. O processo desnitrificante envolve quatro enzimas que são
seqüencialmente induzidas sob condições anóxicas (MODIN et al., 2007):
NO
3
-
→
NO
2
-
→
NO
→
N
2
O
→
N
2
(8)
Nar Nir Nor Nos
As três primeiras enzimas desnitrificantes atuantes, nitrato redutase (Nar), que
catalisa a redução de nitrato a nitrito, nitrito redutase (Nir), que catalisa a formação de
óxido nítrico a partir do nitrito e, óxido nítrico redutase (Nor), que catalisa a redução de
óxido nítrico a óxido nitroso, são mais ativas do que Nos (óxido nitroso redutase).
Óxido nitroso redutase, que catalisa a formação de nitrogênio
a partir de óxido
nitroso, é uma enzima periplasmática na maioria dos micro-organismos estudados e,
portanto, é muito mais sensível ao O
2
e às demais condições do ambiente do que as
outras três enzimas (PHILIPPOT, 2002 apud ETCHEBEHERE, 2007). Esta maior
sensibilidade da Nos pode muitas vezes levar à inibição da remoção total de nitrogênio,
devido à formação de N
2
O, em detrimento da obtenção de N
2
. Esta possibilidade tem
levado alguns autores (TSUNEDA et al., 2005) a avaliarem as causas desta inibição, por
conta deste ser um dos gases do efeito estufa. Segundo MOURA e MOURA (2001), o
N
2
O é o terceiro contribuinte mais significativo para o aquecimento global e, portanto, tem
motivado muitos estudos.
Portanto, para evitar a formação de N
2
O e proporcionar elevada eficiência do
processo de desnitrificação, se faz necessário o controle de alguns parâmetros
operacionais tais como: oxigênio dissolvido, pH, razão C/N, acúmulo de nitrito e a
natureza da fonte de carbono que, segundo KAMPSCHREUR et al. (2009), são condições
ambientais primárias, as quais regulam a atividade e a síntese das enzimas envolvidas no
processo.
38
Sendo as bactérias desnitrificantes facultativas em relação à utilização de oxigênio
dissolvido no meio, elevadas concentrações de OD não são tóxicas a estes micro-
organismos. Porém, a questão energética favorece a utilização de O
2
como aceptor final
de elétrons em detrimento dos íons NO
3
-
. Portanto, para alcançar a desnitrificação
convencional é necessário trabalhar com baixíssimas concentrações de oxigênio ou de
preferência sob condições anóxicas. Conforme apresentado por SURAMPALLI et al.
(1997), concentrações de OD superiores a 1,0 mg L
-1
inibem a desnitrificação.
Alguns pesquisadores têm se dedicado a investigar a possibilidade da
nitrificação/desnitrificação simultâneas (SND), que trata da ocorrência da desnitrificação
no mesmo ambiente aeróbio da nitrificação. Ainda não existe consenso sobre quais são
os mecanismos que prevalecem neste fenômeno, os físicos ou os microbiológicos. A
principal explicação física seria que a simultaneidade dos processos ocorre no interior dos
flocos da biomassa, como resultado da diminuição da concentração de OD por limitações
difusionais (PUZNAVA et al., 2000), ou seja, há micro-ambientes anóxicos no interior dos
flocos do lodo ou no interior dos biofilmes, que permitem a ocorrência da desnitrificação
heterotrófica com a produção de gás nitrogênio, da forma tradicional. A explicação
microbiológica para o fenômeno é que as bactérias desnitrificantes possuem variedade
fisiológica muito maior do que a prevista (TONKOVIC, 1998 e LITTLETON et al., 2002).
Sugere-se que alguns micro-organismos responsáveis pela SND seriam autotróficos
(HELMER e KUNST, 1998), dispensando, neste caso, a necessidade de uma fonte de
carbono externa facilmente assimilável. HOLMAN e WAREHAM (2005) observaram em
seus estudos que significativa SND foi alcançada em concentrações muito baixas de OD
(0,2 mg L
-1
), enquanto em concentrações mais altas (acima de 1,0 mg L
-1
) a
desnitrificação foi fortemente inibida. Embora seja interessante promover a nitrificação e a
desnitrificação no mesmo ambiente, ainda existem muitas dúvidas sobre os mecanismos
envolvidos e a real efetividade deste processo.
YOO et al. (1999), a partir de dados compilados da literatura, relataram as
possíveis vantagens da SND via nitrito, que é uma das possíveis justificativas para a
ocorrência da nitrificação/desnitrificação simultânea. Estas vantagens podem ser
enumeradas conforme segue:
• redução da demanda de matéria orgânica para a etapa de desnitrificação;
• maior taxa de desnitrificação;
39
• menor produção de lodo na etapa anóxica;
• aparente inexistência de toxicidade do nitrato aos micro-organismos;
• redução do consumo de oxigênio.
Em relação ao pH, a faixa ótima para o eficiente desempenho das bactérias
desnitrificantes se encontra provavelmente entre 6,0 e 9,0, conforme apontado por
SURAMPALLI et al. (1997) e KARGI e DINCER (2000).
Apesar do controle do pH, OD e da temperatura ser importante para alcançar a
desnitrificação, a natureza da fonte de carbono e a sua razão em relação ao nitrogênio a
ser removido têm sido exaustivamente estudada devido à sua relevância para o processo.
Como a desnitrificação em unidades de tratamento ocorre, na maioria das vezes,
na etapa terciária, subentende-se que a porção orgânica biodegradável do efluente já
tenha sido consumida, impedindo assim o satisfatório crescimento das bactérias
desnitrificantes organotróficas. Desta maneira, há necessidade de se suplementar o
processo com fontes externas de carbono para propiciar a desnitrificação. Em alguns
casos se trabalha com a recirculação do próprio efluente para suprir esta necessidade,
sendo que esta é uma tendência, devido à busca por redução nos custos. Porém, a
natureza da fonte de carbono tem marcante efeito no desempenho da desnitrificação.
Vários compostos orgânicos têm sido objeto de estudo no intuito de alcançar a
melhor eficiência do processo com a menor razão C/N. CERVANTES et al. (2001)
relataram que metanol, etanol e ácido acético são os principais compostos utilizados
neste contexto. No entanto, outras opções têm sido propostas como: glicose (KARGI e
UYGUR, 2003) e lodo hidrolisado (ÆSØY et al., 1998).
AHN (2006) sugere a equação 9 para síntese e redução do nitrato a partir do
metanol, chamando a atenção para o fato deste composto ser muito utilizado como
doador de elétrons na desnitrificação por ser relativamente barato e eficiente.
NO
3
-
+ 1,08CH
3
OH + 0,24H
2
CO
3
→ 0,056C
5
H
7
NO
2
+ 0,47N
2
+ 1,68H
2
O + HCO
3
(9)
Nesta equação, são requeridos teoricamente 2,47mg de CH
3
OH por mg de N-NO
3
-
.
40
HALLIN e PELL (1998), em seus estudos sobre propriedades metabólicas das
bactérias desnitrificantes em lodos ativados, constataram que a utilização de acetato
como fonte suplementar de carbono tem gerado as mais altas taxas de desnitrificação.
Porém, na prática, tem-se dado preferência à utilização do metanol pelo seu menor custo.
A equação 10 representa a redução de nitrato a partir de acetato, incluindo a
síntese celular de micro-organismos e foi sugerida por MATEJU et al. (1992) apud CHIU e
CHUNG (2003).
NO
3
-
+ 0,82CH
3
COOH → 0,07C
5
H
7
NO
2
+ 0,47N
2
+ 0,90H
2
O + HCO
3
-
+ 0,30CO
2
(10)
Teoricamente, 1,0 g de N-NO
3
-
consome 3,51 g de acetato para produzir 0,55 g de
novas células e 0,82 L de N
2
. A razão C/N ótima neste caso seria igual a 3,74.
KARGI e UYGUR (2003) avaliaram o efeito de diferentes fontes de carbono
(acetato de sódio, glicose e acetato-glicose na proporção 1:1) na remoção de nitrogênio
de um efluente sintético. Observaram que a melhor eficiência de remoção do nitrato se
deu quando foi utilizado acetato-glicose (1:1) como fonte de carbono e que o pior
desempenho ocorreu quando se adicionou apenas glicose.
ÆSØY et al. (1998) investigaram a eficiência de lodo hidrolisado como fonte de
carbono para a desnitrificação, em comparação com etanol, utilizando um reator de leito
fixo empacotado. Praticamente a mesma taxa de desnitrificação máxima, de 2,5 kg de N-
NO
3
-
m
-3
d
-1
foi alcançada tanto para o etanol como para o lodo hidrolisado. Porém, os
resultados mostraram que a razão de 8 a 10 g DQO/g N-NO
3
-
no afluente foi requerida
para alcançar a desnitrificação quando utilizado o lodo hidrolisado, enquanto para o etanol
esta razão foi de 4,5 g DQO/g N-NO
3
-
, ou seja, o etanol resultou na menor demanda por
oxigênio (em torno de 50%), em relação ao lodo hidrolisado, para alcançar a mesma
atividade desnitrificante.
Pelo que se apresenta na literatura, metanol, etanol e acetato são as principais
fontes de carbono utilizadas para a desnitrificação. A escolha de qual delas deve ser
utilizada é mais uma questão de conveniência, já que todas levam ao bom desempenho
do processo.
41
O efeito de várias razões C/N no processo de nitrificação e desnitrificação
tradicional foi investigado por HU et al. (2009). Para a realização dos experimentos foram
utilizados frascos agitados com efluente sintético adicionado de acetato de sódio (fonte
externa de carbono) e biomassa aderida em anéis de polipropileno. Dos resultados
obtidos pode-se constatar que a taxa específica de oxidação da amônia diminuiu com o
incremento na razão C/N, sobretudo para as razões mais elevadas (C/N = 8, 16). Em
contrapartida, a taxa de redução do nitrato no meio líquido foi de 23%, 16%, 33% e 90%
para razões C/N iguais a 0,5, 1, 2 e 4, respectivamente, sendo que para as razões 8 e 16
nitrato não foi detectado. A evidente influência do carbono orgânico na oxidação de
amônia e nitrito e redução do nitrato levaram os autores a sugerir que as nitrificantes não
são capazes de competir por oxigênio com as heterotróficas na camada externa do
biofilme, permanecendo ativas somente no seu interior. Portanto, as bactérias
responsáveis pela nitrificação estariam sujeitas à limitação de OD e, conseqüentemente,
necessitariam de mais tempo para alcançar desempenho satisfatório.
3.6 Biorreatores em batelada seqüencial (SBR) e biorreatores com biofilme
aplicados à remoção do nitrogênio amoniacal
Vários processos de tratamento estão disponíveis para a remoção de nitrogênio
amoniacal de águas residuárias. A escolha entre eles depende das características do
efluente, da concentração de amônia no mesmo e, principalmente, de questões
econômicas. Em geral, efluentes que possuem baixas concentrações de amônia, de até
50 mg L
-1
de N-NH
4
+
, concentração típica de efluentes domésticos (CAMPOS et al.,
2002b), alcançam os padrões de descarte menos restritivos, quando tratados por
processos biológicos convencionais (ex. lodos ativados). Acima destas concentrações, e
quando a legislação ambiental é mais rigorosa, processos específicos para a remoção de
amônia precisam ser empregados.
Os tratamentos propostos para esta finalidade podem ser divididos em físico-
químicos e biológicos. Dentre os físico-químicos, para a remoção de amônia, destacam-
se o processo de arraste por ar, mais conhecido por “stripping” de amônia e a adsorção
em carvão ativado. Para a remoção de nitrato destacam-se as tecnologias com
membranas: osmose inversa e eletrodiálise (MANSELL e SCHROEDER, 1999; WASIK et
42
al., 2001) além da troca iônica. Porém, estes processos são limitados por conta do
elevado custo operacional e subseqüente problema de disposição dos resíduos altamente
nitrogenados gerados (SHIRIMALI e SINGH, 2001). Ademais, estes processos propiciam
apenas a mudança de fase do poluente e não a sua remoção completa.
O tratamento biológico é o mais empregado, principalmente por ser a tecnologia
que requer menor investimento quando comparado aos demais (WANG et al., 2006) e, na
maioria das vezes, ser o mais eficiente no que diz respeito à remoção total do nitrogênio
(METCALF e EDDY, 2003). Contudo, a remoção biológica de nitrogênio amoniacal pelo
método convencional de nitrificação e desnitrificação é o processo que compartilha os
mesmos princípios do ciclo natural do nitrogênio. Este é um dos motivos pelo qual a
desnitrificação é o método mais recomendado quando se trata de água para o consumo
humano (BABARY e BOURREL, 1999).
Tradicionalmente, o processo de nitrificação e concomitante remoção de matéria
orgânica são obtidos em sistemas de lodos ativados, porém, a remoção total de nitrogênio
amoniacal, via desnitrificação, dificilmente é alcançada. Para alcançar este objetivo o
sistema precisa operar com dois ou mais reatores em série, sendo no mínimo um aeróbio
e outro anóxico (desnitrificação). Desta maneira, a necessidade de determinadas razões
C/N no meio, indispensável para se alcançar a desnitrificação, torna necessária a adição
de fonte externa de carbono na fase anóxica ou a recirculação do efluente entre os
reatores anóxico e óxico, além da característica recirculação do lodo. As razões de reciclo
utilizadas tornam, muitas vezes, o sistema complexo e de difícil otimização. Além disso, o
processo está sujeito aos problemas comuns aos sistemas de lodo ativado tais como
arraste do lodo e sensibilidade aos choques de carga, além de demandar grandes
volumes de reação (YANG et al., 2003).
Uma variação do processo de lodos ativados, a qual é muito bem aceita para
promover a nitrificação/desnitrificação, é o reator de batelada seqüencial (SBR). Suas
vantagens em relação ao método convencional podem ser enumeradas (MACE e MATA-
ALVAREZ, 2002, AKIN e UGURLU, 2005, BOOPATHY et al., 2007):
• menor custo que os tratamentos biológicos convencionais;
• requer áreas menores para implantação, por ser um processo compacto;
• possui elevada flexibilidade operacional;
43
• é capaz de suportar choques de carga hidráulica e orgânica;
• facilita o controle de problemas de sedimentação;
• requer menor atenção operacional e menos equipamentos envolvidos;
• reduz o arraste da biomassa do sistema.
A flexibilidade característica dos reatores tipo SBR favorece a otimização do
processo, assim como permite variações na estratégia operacional, tornando-se ótima
ferramenta para o estudo da biodegradação de diferentes efluentes. Como o SBR opera
no modo de bateladas seqüenciais, apresenta variação temporal de suas condições
operacionais, ou seja, as condições do meio variam com o tempo, contrariamente aos
sistemas contínuos (COELHO, 1998).
O princípio básico de operação dos reatores de batelada seqüencial está baseado
no fato de que todas as etapas pertinentes às unidades de tratamento biológico de
efluentes ocorrem em um único reator. O ciclo operacional completo do SBR envolve as
seguintes etapas: alimentação, reação, decantação e descarga ou esgotamento. Nestas
etapas podem ser previstas fases anóxicas e óxicas durante a reação, assim como
diferentes estratégias de alimentação. O tempo total de ciclo e os tempos parciais de cada
etapa são determinados caso a caso, dependendo da finalidade para a qual o processo
está sendo proposto. Por conta das características propícias à remoção biológica de
nutrientes (nitrogênio e fósforo), tem sido extensivamente aplicado para esta finalidade,
conforme pode ser observado na Tabela 3.5.
44
Tabela 3.5 – Trabalhos que utilizaram a tecnologia de SBR para a remoção de nutrientes.
Objetivo principal Efluente Referências
nitrificação e desnitrificação
simultânea via nitrito
doméstico
GUO et al., 2009
desenvolvimento de grânulos aeróbios
para remoção de nutrientes
sintético
BAO et al., 2009
investigar a característica
dos grânulos nitrificantes
sintético
BELMONTE et al., 2009
avaliar a estabilidade da "shortcut"
nitrificação e desnitrificação
industrial
1
GAO et al., 2009
balanço das AOB e NOB
no processo OLAND
sintético
CLIPPELEIR et al., 2009
desenvolvimento de grânulos
no processo CANON
Industrial
2
VAZQUEZ-PADIN et al.,
2009
investigar a dinâmica das AOB e
NOB na nitrificação convencional
sintético
WHANG et al., 2009
estudo da influência de
sais na nitrificação parcial
doméstico
YE et al., 2009
investigar a dinâmica das AOB e
NOB na nitrificação convencional
sintético
WITTEBOLLE et al.,
2009
estudo da inibição da
nitrificação por FA e FNA
sintético PARK e BAE, 2009
comparar o desempenho da nitrificação
somente em ambiente aeróbio e em
anóxico/aeróbio
sintético
DYTCZAK et al., 2008
modelagem da remoção
completa de nitrogênio via nitrito
industrial
3
DOSTA et al., 2007
modelagem da nitrificação
visando sua dependência com o pH
sintético
PARK et al., 2007
estudo da inibição
das nitrificantes por FA
sintético
VADIVELU et al., 2007
estudo da nitrificação convencional em
flocos e grânulos
sintético
CARVALHO et al., 2006
investigação do acúmulo de
nitrito e granulação das AOB
sintético KIM e SEO, 2006
efeito da salinidade
na nitrificação convencional
sintético
MOUSSA et al., 2006
efeito da salinidade na
remoção de nutrientes
sintético UYGUR, 2006
45
Tabela 3.5 – Trabalhos que utilizaram a tecnologia de SBR para a remoção de nutrientes
(continuação).
Objetivo principal Efluente Referências
monitorar e controlar a remoção
biológica de nitrogênio
sintético AKIN e UGURLU, 2005
investigar a nitrificação/desnitrificação
simultanea e a remoção de fósforo
sintético
MEYER et al., 2005
modelar e investigar o crescimento
de heterotróficos e autotróficos
sintético
MOUSSA et al., 2005
remoção de nutrientes,
nitrogênio e fósforo
suinocultura CASSIDY e BELIA, 2005
investigar a nitrificação e
desnitrificação simultanea
sintético
HOLMAN e
WAREHAM, 2005
estudar o efeito da salinidade na
desnitrificação e emissão de N
2
O
sintético
TSUNEDA et al., 2005
avaliação de distintos ciclos
operacionais na remoção de nutrientes
chorume
pré-tratado
KARGI e UYGUR, 2004
remoção de nutrientes,
nitrogênio e fósforo
suinocultura
OBAJA et al., 2003
remoção de nitrogênio e matéria
orgânica com lodo granular
sintético
YANG et al., 2003
completa remoção autotrófica de
nitrogênio via nitrito
sintético
SLIEKERS et al., 2002
controle em linha da remoção biológica
convencional de nitrogênio
industrial
4
ANDREOTTOLA et al.,
2001
remover nitrogênio amonical via
nitrificação e desnitrificação
convencional
suinocultura
BERNET et al., 2000
efeito da salinidade
na desnitrificação
sintético
GLASS e
SILVERSTEIN, 1999
nitrificação e desnitrificação
simultânea
sintético
5
WOOLARD e IRVINE,
1995
1
efluente do processamento do leite de soja;
2
efluente tratado em digestor anaeróbio com diluição;
3
efluente tratado em digestor anaeróbio;
4
efluente do processamento de madeira;
5
efluente
sintético simulando água de produção de petróleo.
Ultimamente a larga utilização de reatores com biomassa aderida também tem
instigado a sua aplicação para a remoção de nutrientes. A imobilização natural do biofilme
permite excelente retenção e acúmulo da biomassa sem a necessidade de dispositivos
46
para a separação e manutenção dos sólidos nos biorreatores. Por conta de suas
características propícias para a retenção da biomassa de maneira simples, confiável e
estável, processos com biofilme como “trickling filters” e filtros biológicos aerados
(PERSSON et al., 2002, ROWAN et al., 2003, CHEN et al., 2005), biodiscos ou RBCs
(WYFFELS et al., 2003, WINDEY et al., 2005), reatores com leito fluidizado, reatores com
biofilme em leito móvel ou MBBR e reatores com membranas submersas (LI et al., 2006,
MATSUMOTO et al., 2007, AHMED et al., 2008, ZHANG et al., 2009a, SARIOGLU et al.,
2009), têm sido empregados para remover nutrientes e outros poluentes dos efluentes
domésticos e industriais. O acerto do melhor desempenho no tratamento biológico destes
efluentes consiste em saber como os micro-organismos envolvidos vão responder às
diferentes condições operacionais (XIA et al., 2008).
Alguns estudos têm aplicado a configuração dos reatores “airlift” associada à
estratégia da biomassa aderida para promover e investigar os processos da nitrificação e
da desnitrificação. CAMPOS et al. (2003) utilizaram esta configuração de biorreator para
tratar um efluente sintético contendo uréia e formaldeído. A alimentação de 500 mg N-
NH
4
+
L
-1
resultou em ótimo desempenho nitrificante, sendo afetado somente quando
ocorreram choques de carga orgânica. GARRIDO et al. (1997) avaliaram a produção de
oxido nitroso (N
2
O) durante o processo de desnitrificação utilizando o reator “airlift” com
biofilme prioritariamente autotrófico. Aplicando carga amoniacal de 5,0 kg N-NH
4
+
m
-3
d
-1
obtiveram conversões de 99% de amônia, porém, o acúmulo de N
2
O no sistema sugeriu
ocorrência de inibição das enzimas responsáveis pela produção de N
2
e que, portanto, a
desnitrificação completa não foi alcançada nesta configuração de biorreator. KIM e KIM
(2006) estudaram a cinética de oxidação do nitrito e a competição entre Nitrobacter e
Nitrospira na nitritação. Com este objetivo utilizaram o reator “airlift” e basalto granulado
como suporte para o crescimento da biomassa. Em outro trabalho, KIM et al. (2006),
fazendo uso do mesmo tipo de biorreator tendo areia como suporte, investigaram o efeito
da temperatura e da amônia livre na nitrificação de lixiviado de aterro sanitário. Em geral,
os autores consideraram que as características deste tipo de configuração, com alta taxa
de aeração e mistura, favorecem a sua aplicação para o estudo e remoção de nutrientes
como o nitrogênio amoniacal.
O tradicional processo de leito fluidizado é empregado no tratamento biológico de
poluentes, também associado à utilização de minerais para o crescimento do biofilme.
47
RABAH e DAHAB (2004a,b) trabalharam com areia como suporte no reator de leito
fluidizado com o objetivo de caracterizar a comunidade microbiana aderida e investigar o
desempenho deste biorreator no processo de desnitrificação. Observaram que mesmo
com alta carga de nitrato (6,3 kg m
-3
leito
d
-1
) a desnitrificação foi alcançada com eficiência
de 99,8% para diferentes valores de velocidade superficial do líquido. No que diz respeito
à biomassa aderida, observaram que maiores velocidades superficiais provocaram
decréscimo da biomassa, porém, o sistema foi capaz de manter o desempenho da
desnitrificação. Posteriormente, ASLAN e DAHAB (2008) aplicaram o mesmo princípio
deste biorreator para investigar a nitrificação e a desnitrificação via nitrito, em ambientes
separados com a recirculação do efluente. GIESEKE et al. (2006) aplicou dois
biorreatores com partículas de giz como meio suporte para investigar, com técnicas de
biologia molecular, a tolerância da comunidade microbiana nitrificante ao ácido nitroso
livre. A modelagem do processo de nitrificação no reator de leito fluidizado com biofilme
também tem sido investigada (BERNET et al., 2005). VOLCKE et al. (2008) simularam a
dinâmica entre micro-organismos nitrificantes (AOB e NOB) neste tipo de biorreator
contendo como suporte mineral granulado, composto principalmente por sílica e alumina,
que é comercializado como “extendosphere
TM
”. Em geral, esta configuração promove
bons resultados no desempenho da nitrificação e da desnitrificação.
Embora considerados de operação um pouco mais complicada por conta dos
problemas de entupimento, perda de carga e formação de caminhos preferenciais
(RUSTEN et al., 2006), a tecnologia dos biofiltros e biomassa aderida em leito fixo
também tem sido empregada na remoção do nitrogênio amoniacal. JEONG et al. (2006)
utilizaram dois filtros biológicos em série, preenchidos com peças de poliestireno, no
tratamento terciário de efluente doméstico. Os autores observaram que o sistema de
biofiltros foi eficiente na remoção total do nitrogênio amoniacal mesmo quando em baixas
temperaturas características do inverno. VILLAVERDE et al. (1997) avaliaram a influência
do pH sobre a nitrificação utilizando um biofiltro submerso com partículas de pozolana.
MONTRAS et al. (2008) avaliaram a cinética e modelaram a nitrificação
convencional utilizando o processo “Biostyr
®
”, no qual o material suporte utilizado para o
crescimento da biomassa aderida é composto por esferas de poliestireno. Este processo
funciona como um tipo de biofiltro com leito expandido. Para alcançar efetivo desempenho
na conversão de amônia a nitrato, diferentes taxas de recirculação do efluente foram
48
aplicadas, e a distribuição das bactérias nitrificantes no biofilme foi investigada por
técnicas de biologia molecular. BORREGAARD (1997) estudou o processo “Biostyr
®
” em
escala industrial, para a remoção biológica de nutrientes. A escolha deste tipo de
processo se baseou principalmente na pouca disponibilidade de espaço físico para a
expansão da unidade de tratamento existente. Neste caso o biorreator “Biostyr” promoveu
nitrificação, desnitrificação e filtração do efluente, atendendo os níveis de descarte
exigidos pela legislação local para nitrogênio total e sólidos suspensos.
Os sistemas com biofilme em leito móvel, conhecidos como MBBR (do inglês
“moving-bed biofilm reactor”) têm mostrado bons resultados na nitrificação a nível de
tratamento secundário, e podem ser considerados como uma tecnologia promissora na
aplicação terciária. As principais vantagens do MBBR em relação aos demais sistemas
com biomassa aderida podem ser enumeradas como segue (RUSTEN et al. 2006,
SALVETTI et al., 2006):
• utilização do volume útil integral do biorreator para o crescimento das
comunidades microbianas;
• possibilidade de aplicar altas cargas volumétricas sem promover perdas da
biomassa;
• menor perda de carga quando comparado aos biorreatores com biofilme
em leito fixo;
• não necessita de retrolavagens e não está sujeito a problemas de
entupimento ou colmatação do leito como nos biofiltros;
• biorreatores já existentes, como de lodos ativados, podem ser adaptados
para a configuração dos MBBRs sem necessidade de grandes alterações,
resultando em ganhos no desempenho do processo.
Contudo, algumas desvantagens também podem ser atribuídas a este processo,
como o custo mais elevado de operação por conta da energia despendida para manter os
suportes em movimento no interior do reator, e algumas dificuldades na manutenção dos
tanques de tratamento, quando utilizado em larga escala.
A tecnologia dos MBBR foi desenvolvida e patenteada na década de 80 e vem
sendo amplamente difundida pela comercialização dos suportes desenvolvidos pela Anox-
Kaldness, também conhecidos como biomídias. Estes suportes são pequenas peças
49
cilíndricas com aletas internas e externas, produzidas em polietileno, com densidade
ligeiramente inferior à da água. Atualmente, outras empresas já comercializam produtos
similares como as biomídias AMB Bio Media
TM
.
A quantidade de biomídias que deve ser adicionada aos biorreatores deve ser
definida pela razão do volume ocupado pelas biomídias (em estado estático),
consideradas como cilindros sólidos e o volume do reator, sendo que a fração máxima de
enchimento deve ser de 70% do volume útil do biorreator, para permitir a adequada
movimentação dos suportes no seu interior. A área superficial específica teórica do
suporte é definida como a área superficial por unidade de volume no biorreator
(ØDEGAARD et al., 1994).
Com o objetivo de estudar a cinética dos biofilmes em sistemas nitrificantes,
LAZAROVA et al. (1997) avaliaram o sistema trifásico (gás/líquido/biomassa fixa em leito
móvel, tipo MBBR) em escala de bancada e piloto. Observaram ótimo desempenho da
nitrificação (carga de nitrogênio removida de 1,2 a 2,0 kg N m
-3
d
-1
) sem acúmulo de nitrito.
Este desempenho foi mantido para diferentes razões DQO/N-NH
4
+
. Os resultados do
estudo cinético indicaram que este tipo de processo, ou seja, biofilme em leito móvel,
assegurou as altas taxas específicas de nitrificação.
Com o objetivo de investigar as características do MBBR no pós-tratamento de
efluentes tratados anaerobiamente, LUOSTARINEN et al. (2006) focaram na remoção de
nitrogênio e possível biodegradação de compostos orgânicos residuais. Foram utilizadas
biomídias da Anox-Kaldness com área superficial específica de 500 m
2
m
-3
e
preenchimento de 50% do volume útil do reator. Completa nitrificação foi alcançada
quando foi fornecida quantidade suficiente de OD (2,0 – 3,5 mg L
-1
) ao meio reacional,
enquanto a desnitrificação foi restrita por conta da deficiência de matéria orgânica
biodegradável.
ARTIGA et al. (2008) se propuseram a estudar o desempenho de um sistema
híbrido, com três compartimentos, no tratamento biológico do efluente do processamento
de peixe enlatado (com alto teor salino). O biorreator consistiu do primeiro compartimento
com biomassa em suspensão, o segundo com biofilme em leito móvel (MBBR) e o
terceiro com membranas de ultrafiltração. O suporte utilizado no MBBR foi o K-3, material
50
de polietileno comercializado pela Anox-Kaldness. Os estudos foram realizados em duas
fases: com o efluente bruto (73 – 83 g L
-1
de sólidos dissolvidos totais) observou-se total
adaptação da biomassa heterotrófica aos elevados teores salinos (77 – 92% de eficiência
na remoção da matéria orgânica), porém, não foi observado qualquer vestígio de
nitrificação; com o efluente diluído (concentração de sais menor que 15 g L
-1
) observou-se
o incremento na biodegradação da matéria orgânica e efetiva ação nitrificante, resultando
em 90% de eficiência na conversão do nitrogênio amoniacal. ARTIGA et al. (2005) já
haviam utilizado um sistema híbrido similar para investigar o tratamento de efluentes de
curtume. Na ocasião observaram que 50 a 60% da nitrificação se deu no biofilme, sendo
que foi alcançada 97% de eficiência na conversão de amônia para o sistema completo.
A operação de um sistema híbrido em escala piloto (reator com biofilme em leito
fixo seguido de reator com biofilme em leito móvel) foi avaliada por FERRAI et al. (2009).
Os suportes utilizados para crescimento da biomassa aderida foram peças cilíndricas de
polietileno, encontradas comercialmente. A proposta do trabalho foi promover o
abrandamento dos poluentes no biorreator de leito fixo, a remoção de carbono e amônia
no compartimento de leito móvel e a recirculação do efluente nitrificado para o primeiro
biorreator para alcançar a desnitrificação. Segundo os autores, a cinética de remoção dos
substratos e os parâmetros cinéticos obtidos dos ensaios respirométricos realizados nos
dois biorreatores podem proporcionar orientações mais confiáveis para o projeto de
MBBRs. Visto que critérios de projeto para MBBRs ainda são empíricos e, em geral, estão
baseados em suposições sobre as cargas ou taxas superficiais (taxa de carga do
poluente por unidade superficial de biomidia) e o tempo de retenção hidráulica,
adequados para alcançar a qualidade requerida para o efluente.
Reatores com biofilme, inclusive os MBBR, também têm sido estudados com o
intuito de obter a nitrificação/desnitrificação simultânea (SND). Devido à natureza dos
biofilmes, estes desenvolvem macro e micro-ambientes dentro do reator, permitindo que
diferentes bactérias envolvidas nestas reações cresçam e se concentrem em zonas
favoráveis para as suas atividades metabólicas (BERNET et al., 2000).
Conforme relatado por GUO et al. (2005), as principais propostas da
nitrificação/desnitrificação simultâneas seriam a eliminação de dois reatores separados
para remoção total de nitrogênio e a eliminação da aeração intermitente, ou seja, ao invés
51
de trabalhar com subsequentes etapas anóxicas e óxicas, o processo seria totalmente
aeróbio, simplificando o sistema operacional. Neste contexto, GUO et al. (2005)
estudaram o reator tipo “airlift” com biofilme no desempenho da SND, no qual foi
alcançada eficiência de remoção, como nitrogênio total, acima de 82% nas melhores
condições operacionais do sistema.
WANG et al. (2006) estudaram a remoção de nutrientes de esgoto doméstico pela
combinação de precipitação química com o reator MBBR. Foi objetivo do trabalho
remover nitrogênio por SND, a qual foi estabelecida sob concentrações de OD de
aproximadamente 2,0 mg L
-1
e com eficiência média de remoção de nitrogênio total de
89%. Os autores concluíram que a nitrificação/desnitrificação simultâneas foi alcançada
pela limitação da difusão de oxigênio no interior do biofilme.
Verifica-se da literatura consultada, que existem inúmeras possibilidades de se
alcançar adequado desempenho na remoção biológica de nutrientes, porém, pouco se
tem investigado sobre a utilização de reatores do tipo MBBR para promover a nitrificação
e/ou desnitrificação como tratamento terciário. A conjunção das características deste
biorreator com a operação em bateladas sequenciais é ainda mais rara. Ademais, a
grande maioria dos estudos que objetivam a remoção biológica do nitrogênio,
independente da estratégia operacional aplicada, utiliza efluentes sintéticos, como pode
ser constatado na Tabela 3.5 (previamente apresentada), não estando sujeita à
variabilidade e complexidade dos efluentes reais, sobretudo os industriais. Neste contexto,
torna-se relevante a aplicação do sistema MBBR, operado em bateladas seqüenciais, no
estudo da nitrificação e possível desnitrificação terciária de um efluente industrial real com
crescentes concentrações salinas.
52
3.7 FISH – Hibridização
in situ
por Fluorescência
FISH, termo da língua inglesa que corresponde a “Fluorescent in situ
Hybridization”, é uma técnica de biologia molecular que consiste na hibridização de
sondas de oligonucleotídeos complementares à região 16S rRNA alvo. Estas seqüências
de oligonucleotideos são marcadas com um agente corante fluorescente (fluorocromo)
que permite a visualização ao microscópio de epifluorescência das células características
de certo grupo ou espécie de bactéria (AMANN et al., 1995).
Dentre as técnicas de biologia molecular mais aplicadas à microbiologia ambiental,
como a eletroforese em gel com gradiente desnaturante (DGGE), a clonagem e o
sequenciamento, FISH é a mais amplamente utilizada porque não exige purificação prévia
da amostra (JETTEN et al., 1999), permitindo a investigação in situ da ecologia
microbiana. DGGE, clonagem e sequenciamento estão baseados na extração do DNA e
na reação em cadeia da polimerase (PCR), sendo consideradas ferramentas
fundamentais nas análises microbiológicas, particularmente para a identificação de novas
espécies, mas quantitativamente limitadas por conta da necessária extração e purificação
do DNA (OKABE et al., 1996, KIM e KIM, 2006, DYTCZAK et al., 2008).
AMANN e LUDWIG (2000) chamam a atenção para algumas vantagens que
podem ser associadas à aplicação de testes por hibridização com sondas de ácidos
nucléicos: i) permite a descrição da estrutura das comunidades; ii) é rápida e segura
quando comparada com os métodos dependentes de culturas; iii) é potencialmente
quantitativa; iv) pode ser utilizada para identificar micro-organismos ainda não cultivados.
Ademais, permite o entendimento mais completo da diversidade e distribuição das
bactérias nos ambientes naturais (HU et al., 2009).
3.7.1 Breve histórico
O histórico que será aqui apresentado foi adaptado de MOTER e GÔBEL (2000).
A hibridização in situ (ISH) foi desenvolvida, independentemente, por dois grupos de
pesquisadores (PARDUE e GALL, 1969 e JOHN et al., 1969), os quais atestaram que a
técnica de hibridização do rRNA permitia que sequências de ácidos nucleicos fossem
examinadas dentro das células sem alterações da morfologia das mesmas ou da
53
integridade de seus componentes. Desde então, ISH vem sendo modificada para estudar
a evolução cromossomal, realizar análises de cromossomos, de tumores e leucemias e
investigar a citogenética de uma vasta gama de espécies. A técnica foi introduzida na
bacteriologia por GIOVANNONI et al. (1988), que foi o primeiro a usar sondas de
oligonucleotídeos com rRNA alvo na detecção microscópica de bactérias, contudo, estas
sondas eram marcadas radioativamente. Com o desenvolvimento dos marcadores
fluorescentes, os radioativos foram progressivamente substituídos por corantes não
isotópicos, conhecidos como fluoróforos.
Em 1989, DELONG foi o primeiro a usar oligonucleotideos marcados com
fluoróforos para a detecção de células microbianas. As sondas fluorescentes são mais
seguras do que as radiotivas, proporcionam melhor resolução e não exigem etapas
adicionais de detecção. Ademais, sondas fluorescentes baseadas em diferentes
oligonucleotideos marcados com corantes de diferentes comprimentos de onda de
emissão, possibilitam a detecção de várias seqüências alvo em uma única etapa de
hibridização. Desde o início da década de 90, incrementos na sensibilidade e velocidade
da técnica fizeram da Hibridização in situ por Fluorescência (FISH) uma ferramenta
poderosa nos estudos da filogenética, ecologia e diagnósticos ambientais em
microbiologia, principalmente pelos esforços de AMANN e colaboradores a partir de 1990.
3.7.2 Princípios da técnica de FISH
Em teoria, cada ribossomo dentro de uma célula bacteriana que contém uma cópia
de 5S, 16S e 23S rRNA é marcado pela sonda durante o procedimento da hibridização, e
o elevado número de ribossomos por célula promove um sinal no sistema de amplificação
(PERNTHALER et al., 2001 apud ABREU, 2004). A etapa da hibridização consiste
especificamente no emparelhamento da seqüência de oligonucleotideos da sonda,
usualmente com 15 a 30 nucleotídeos, com o rRNA alvo, conforme está representado na
Figura 3.6. Para promover esta ação as amostras são incubadas em elevadas
temperaturas dentro de recipientes hermeticamente fechados e saturados com o tampão
de hibridização. Este é composto basicamente por detergentes e sais, para promover
gradientes osmóticos, e por um agente desestabilizante de ácidos nucléicos como a
formamida. A estringência da hidridização pode ser otimizada pelo incremento no teor de
formamida que, dependendo da sonda, pode variar de 5 – 80%, e no decréscimo da
concentração salina (PHILLIPS e REED, 1996). No entanto, o principal parâmetro que
54
influencia na eficiência da hibridização é a temperatura de dissociação (Td) do
oligonucleotideo complementar à seqüência alvo. A Td influencia diretamente na
estabilidade das bases emparelhadas na hibridização e, conseqüentemente, na
especificidade da sonda (AMANN et al., 1990). Posteriormente à hibridização, promove-se
a lavagem, que é realizada em uma temperatura ligeiramente mais elevada que a Td e
tem a função de remover o excesso das sondas e, conseqüentemente, evitar a ligação
inespecífica das mesmas (PERNTHALER et al., 2001 apud ABREU, 2004). Apesar do
desenvolvimento de equações empíricas para estimar a temperatura de dissociação dos
oligonucleotideos (ABREU, 2004), é recomendável que as condições ideais de
hibridização para cada sonda sejam determinadas experimentalmente.
Figura 3.6 – Representação figurada da etapa de hibridização da técnica de FISH,
adaptada do Instituto de Pesquisa Nacional do Genoma Humano (NHGRI-USA, 2009).
Na microbiologia a molécula alvo mais comum para a aplicação de FISH é o 16S
rRNA por conta da sua estabilidade genética, contendo regiões variáveis e conservadas,
por estar presente no mecanismo da síntese protéica tendo a mesma função em todos os
organismos procariotos, além de conter informação genética suficiente para detectar
diferentes grupos filogenéticos de micro-organismos seja no domínio, gênero ou espécie
(AMANN et al., 1995, MOTER e GÔBEL, 2000, ETCHEBEHERE e MENES, 2007).
Dependendo das condições da hibridização, as sondas são capazes de formar ligações
Hibridização
in situ
por Fluor
escência
ligada com
fluorocromos
desnaturação
e
hibridização
sonda de
oligonucleotídeos
55
estáveis (híbridos via pontes de hidrogênio entre os nucleotídeos complementares) com a
região 16S do RNA nos ribossomos. Se não existir complementariedade entre a
seqüência de oligonucleotídeos da sonda e a região 16S rRNA, não ocorre hibridização
estável e os oligonucleotídeos são lavados da célula (LINDREA et al., 1999 apud ABREU,
2004).
Além de todas as variáveis que podem influenciar a eficácia da hibridização, a
etapa preliminar da fixação das células é crucial para alcançar resultados satisfatórios por
FISH (MOTER e GÔBEL, 2000). A fixação é responsável pela preservação da morfologia
de cada célula individual, manter intacto seus ribossomos, permeabilizar a membrana
celular para favorecer a penetração das sondas e reter ao máximo o rRNA alvo. Os
agentes fixadores utilizados são o paraformaldeído, no caso das bactérias Gram
negativas, e o etanol no caso das Gram positivas (ETCHEBEHERE e MENES, 2007).
A visualização do sinal da hibridização requer, no mínimo, um microscópio de
fluorescência equipado com filtros apropriados para a faixa específica de excitação e
emissão características do fluorocromo utilizado (PHILLIPS e REED, 1996). Vários
marcadores fluorescentes têm sido utilizados, sendo acoplados à extremidade 5’ das
seqüências de oligonucleotideos referentes às sondas. Os fluorocromos mais
empregados na técnica de FISH são: fluoresceína (FLUOS), tetrametilrodamina, Texas
Red, Alexa488, Alexa546 e indocarbocianinas (Cy3, Cy5 e Cy7) (AMMAN et al., 1995,
ETCHEBEHERE e MENES, 2007).
3.7.3 Limitações do método
Segundo AMANN e colaboradores (1995), o maior desafio na utilização de FISH
em amostras ambientais já não é a aplicação da técnica em si, mas a construção e
utilização de novas sondas para grupos desconhecidos de micro-organismos, sendo,
portanto, considerada uma das mais promissoras e poderosas técnicas de identificação
em biologia molecular. Por outro lado, alguns pesquisadores têm relatado certas
limitações ainda na aplicação do método, a saber (MOTER e GÖBEL, 2000, ABREU,
2004, MANSER et al., 2005, SANZ e KOCHLING, 2007):
• é necessário o conhecimento prévio do ecossistema e dos micro-organismos de
interesse, podendo levar à necessidade de combinação com outras técnicas de
identificação;
56
• a concepção de uma sonda específica e inequívoca restrita a determinado grupo
de micro-organismos nem sempre é possível, especialmente se forem aplicados
critérios metabólicos para este fim;
• em alguns casos a região alvo 16S rRNA pode ser conservada demais para
permitir o discernimento entre duas populações muito próximas filogeneticamente,
neste caso a utilização da região 23S rRNA pode ser uma alternativa;
• embora sejam normalmente abundantes, o conteúdo de rRNA das células
bacterianas pode variar consideravelmente, não apenas entre espécies, mas
também na mesma cepa, de acordo com seu estado fisiológico, que está
diretamente relacionado às taxas de crescimento. Sendo assim, baixa atividade
fisiológica pode resultar em fraca intensidade do sinal ou em resultados falsos
negativos;
• a fixação não adequada das amostras pode resultar em baixa intensidade do sinal
ou até na ausência do mesmo, pois a fixação, além de ser responsável pela
preservação da morfologia celular, deve maximizar a permeação da sonda através
da membrana citoplasmática;
• a otimização das condições de hibridização para cada sonda é um processo difícil,
que requer experiência e dedicação, muitas vezes podendo não alcançar
resultados satisfatórios;
• a quantificação dos micro-organismos pode ser subjetiva (contagem manual) e/ou
complexa (análise de imagens);
• a análise estrutural de agregados (lodo granular e biofilmes) requer microscópio
confocal o que resulta em condições restritas da análise das imagens (custo
elevado e necessidade de pessoal treinado);
• a autofluorescência de certas células e dos seus agregados microbianos (ex.
compostos orgânicos e inorgânicos), característicos das amostras de tratamento
de efluentes, resultam em avaliações subjetivas na identificação das células alvo
ou até mesmo na não validação do teste. Aparentemente, o método de fixação, o
meio de crescimento e o meio de montagem da técnica têm influência direta na
intensidade da autofluorescência.
No entanto, sendo FISH uma técnica amplamente aplicada, seus usuários têm
proposto melhorias e novas estratégias para superar algumas das suas limitações (SANZ
e KOCHLING, 2007, PARK et al., 2008).
57
3.7.4 Aplicações
Por conta da versatilidade do método FISH, inúmeras são as aplicações que tem
se dado a esta técnica, desde a área médica e veterinária até a área ambiental, sendo
que no âmbito do meio ambiente o principal enfoque está na investigação da diversidade
microbiana em amostras ambientais e de tratamento de efluentes.
Nesta última década, a técnica de FISH foi amplamente utilizada no estudo das
comunidades nitrificantes, especialmente para compreender a distribuição espacial das
AOB e das NOB em flocos, grânulos e biofilmes. Tem-se atribuído à técnica de FISH
importante papel na interpretação dos diversos fatores que contribuem para o
desempenho da oxidação do nitrogênio amoniacal. Neste contexto, a Tabela 3.6
apresenta alguns trabalhos que utilizaram FISH para investigar a comunidade nitrificante
no âmbito dos tratamentos biológicos de efluentes.
58
Tabela 3.6 – Compilação dos trabalhos da literatura que utilizaram FISH na investigação
da comunidade microbiana nitrificante.
Objetivo a alcançar com FISH Referências
avaliar a diversidade microbiana e o enriquecimento da cultura
ANAMOX a partir de três lodos de fontes distintas
DATE
et al., 2009
quantificar as AOB e as NOB em biofiltros aerados com
crescimento de biofilmes prioritariamente autotróficos
DELATOLLA
et al., 2009
avaliar a morfologia da biomassa nitrificante e a sua dinâmica em
relação ao teor de OD
GUO
et al., 2009
avaliar a eficácia da estratégia operacional no enriquecimento das
AOB em biorreatores com biomassa em suspensão
JUBANY
et al., 2009
confirmar o domínio das AOB no processo de nitrificação parcial
QIAO
et al., 2009
comparar a distribuição das AOB e das NOB em membranas
submersas com ar injetado na membrana e dissolvido no líquido
WANG
et al., 2009
comparar a comunidade microbiana na nitrificação convencional
desenvolvida a partir de três fontes distintas de biomassa
WITTEBOLLE
et al., 2009
avaliar a inibição das NOB e enriquecimento das AOB na
nitrificação e desnitrificação via nitrito em biorreator de membranas
ZHANG
et al., 2009b
avaliar a dinâmica da comunidade microbiana na remoção biológica
de nitrogênio e fósforo com diferentes fontes de carbono
AHMED
et al., 2008
avaliar a comunidade microbiana nitrificante imobilizada em
esponjas de poliuretano (Biocube)
CHAE
et al., 2008
avaliar a predominância das AOB e das NOB em um sistema
híbrido com biomassa em suspensão e aderida sobre membranas
DOWNING e
NERENBERG, 2008
avaliar a relação entre as AOB e as bactérias ANAMOX no
processo CANON utilizando um biorreator com membranas
GONG
et al., 2008
avaliar a distribuição de Nitrosomonas europaea e Nitrobacter
winogradskyi em biofilme nitrificante autotrófico
MONTRAS
et al., 2008
comparar e investigar a comunidade microbiana nitrificante em dois
biorreatores distintos (com membrana submersa e lodos ativados)
sob as mesmas condições operacionais
MUNZ
et al., 2008
avaliar a coexistência das AOB e das heterotróficas no biofilme
formado sobre membranas com o objetivo de remover
simultaneamente matéria orgânica e inorgânica nitrogenada
HU
et al., 2008
avaliar a distribuição das AOB e das NOB em relação às
heterotróficas para diferentes razões C/N na SND
XIA
et al., 2008
investigar a coexistência das AOB e das ANAMOX na nitrificação
parcial em wetlands verticais
DONG e SUN,
2007
avaliar a competição entre heterotróficas e autotróficas nitrificantes
em um biorreator tubular
ELENTER
et al., 2007
comprovar a caótica instabilidade das AOB e das NOB no processo
nitrificante convencional
GRAHAM
et al., 2007
59
Tabela 3.6 – Compilação dos trabalhos da literatura que utilizaram FISH na investigação
da comunidade microbiana nitrificante (continuação).
Objetivo a alcançar com FISH Referências
quantificar as AOB e as NOB na biomassa para modelar a limitação
do carbono inorgânico sobre a nitrificação
GUISASOLA
et al., 2007
caracterizar a comunidade das AOB imobilizadas em
polietilenoglicol gel para o tratamento de chorume
ISAKA
et al., 2007
observar a presença de bactérias heterotróficas e autotróficas no
tratamento de chorume em wetlands artificiais
SAWAITTAYOTHIN
POLPRASERT,2007
investigar a comunidade microbiana enriquecida com Nitrobacter
sob o efeito de amônia livre
VADIVELU
et al., 2007
avaliar a atividade e a estrutura da comunidade microbiana
nitrificante desenvolvida em biofilmes sob baixos valores de pH
GIESEKE
et al., 2006
avaliar a distribuição e competição entre Nitrobacter e Nitrospira na
nitratação sob diferentes concentrações de NO
2
KIM e KIM,
2006
investigar a dinâmica da comunidade microbiana na nitrificação em
biorreator com membrana submersa
LI
et al., 2006
quantificar as comunidades nitrificantes presentes em dois
biorreatores distintos (lodos ativados e membranas submersas)
MANSER
et al., 2006
avaliar a dinâmica das AOB e das NOB sob diferentes
concentrações salinas em flocos nitrificantes
MOUSSA
et al., 2006
avaliar os efeitos da amônia na comunidade microbiana anaeróbia
do biorreator UASB
CALLI
et al., 2005
investigar a dinâmica das AOB e das NOB na biomassa em
suspensão com aeração intermitente
MOTA
et al., 2005
estudar a comunidade microbiana desnitrificante no tratamento de
um efluente industrial salino
YOSHIE
et al., 2004
avaliar a dinâmica das AOB e das NOB sob diferentes
concentrações salinas no sistema de lodos ativados
CHEN
et al., 2003
investigar a possibilidade de crescimento das bactérias nitrificantes
em um sistema estabelecido para a remoção de fosfato
GIESEKE
et al., 2002
caracterizar a comunidade desnitrificante no sistema de lodos
ativados
LEE
et al., 2002
avaliar a dinâmica das bactérias nitrificantes e heterotróficas em
dois biorreatores com biofilme e tempo de retenção hidráulico
distintos
NOGUEIRA
et al., 2002
investigar a presença de Nitrosomonas no biofilme desenvolvido no
tratamento de efluente de laticínios em sistema tipo wetland
ROBERTS e
LEWIS, 2001
comparar a dinâmica da comunidade microbiana nitrificante em
biofilmes em várias estações de tratamento de efluentes
AOI
et al., 2000
AOB – bactérias que oxidam amônia; NOB – bactérias que oxidam nitrito; UASB – reator anaeróbio
com manta de lodo; SND – nitrificação e desnitrificação simultânea; ANAMOX – bactérias
anaeróbias que oxidam amônia; CANON – completa remoção autotrófica de nitrogênio via nitrito.
60
A crescente disponibilidade das ferramentas de biologia molecular tem auxiliado
na determinação de parâmetros chave na complexa ecologia das comunidades
microbianas presentes em sistemas de tratamento de efluentes. O futuro interdisciplinar
da pesquisa, na interface da ecologia microbiana molecular e da engenharia, certamente
virá a permitir a compreensão detalhada da relação entre a diversidade microbiana e a
eficiência e a estabilidade dos processos biológicos das estações de tratamento. Pelo uso
das técnicas moleculares, deverá ser possível definir parâmetros operacionais que
aumentem seletivamente a diversidade dentro de grupos funcionais de bactérias e assim
tornar a comunidade microbiana mais resistente a perturbações. Utilizando deste
conhecimento, estratégias inovadoras para o controle e o projeto de processos biológicos
de tratamento de efluentes poderão ser desenvolvidas (NOGUEIRA et al., 2002).
61
4 Materiais e Métodos
4.1 Descrição do biorreator de leito móvel com biofilme (MBBR)
Com a finalidade de investigar o efeito da salinidade (até 12 g Cl
-
L
-1
) no processo
convencional de nitrificação, montou-se, em escala de bancada, um reator de leito móvel
com biofilme (MBBR), automatizado e operado em modo de bateladas sequenciais como
um SBR.
O reator, de formato retangular, foi construído em acrílico, com volume total de 9,0
L e volume útil de 7,0 L com as seguintes dimensões principais: profundidade 0,10 m;
largura 0,18 m e altura 0,50 m. O modo de operação em bateladas sequenciais foi
escolhido por se observar na literatura forte tendência de utilização desta configuração
nos estudos que envolvem os processos de nitrificação/desnitrificação, conforme relatado
no Capítulo 3. A característica compacta deste tipo de configuração, que permite realizar
etapas aeróbias e anóxicas no mesmo reator, assim como sua flexibilidade operacional,
também contribuiu para esta escolha.
No sistema proposto se optou pelas “biomídias” para o crescimento microbiano
aderido (biofilme). Estas biomídias, em geral, são de material plástico e podem se
apresentar sob diversos formatos. Neste trabalho foram utilizadas peças cilíndricas de
polietileno, com diâmetro de 15 mm e superfície para adesão microbiana de 550 m
2
m
-3
,
conforme informações do fabricante. Este material possui marca registrada,
AMB Bio
Media
TM
,
tendo sido gentilmente cedido pela Empresa White Martins, então representante
dos produtos Dynamic Aqua Science Ltda no Brasil, fabricante deste produto. A
quantidade de biomídias utilizadas no MBBR foi equivalente a 40% do volume de leito do
mesmo (aproximadamente 1.200 peças). A Figura 4.1 apresenta uma foto ilustrativa
destas biomídias. A quantidade deste material no reator foi invariável durante todo o
período do trabalho.
62
Figura 4.1 – Ilustração das biomídias
AMB Bio Media
TM
utilizadas.
O ar foi introduzido na base inferior do reator por meio de uma peça difusora de
cerâmica sinterizada. Esta peça proporcionou adequada distribuição das bolhas de ar no
meio liquido para o suprimento de oxigênio à comunidade microbiana, bem como a
circulação das biomídias no MBBR. A vazão de ar utilizada foi medida e controlada por
rotâmetro. Para promover a homogeneização do meio durante a possível fase anóxica foi
acoplado um agitador mecânico ao biorreator, sendo este fixado em uma das paredes
laterais (Figura 4.2).
A alimentação do efluente ao reator foi realizada por bomba peristáltica. A entrada
do efluente no reator se situava em uma de suas laterais, a 0,25 m de sua base. A saída
do efluente se dava na outra lateral do MBBR, a 0,125 m da sua base. O ponto de saída
do efluente foi determinado pelo volume mínimo de líquido (1,7 L) necessário para manter
as biomídias submersas durante a etapa de esgotamento.
O sistema foi totalmente automatizado permitindo variar, sempre que necessário, o
tempo das diferentes etapas operacionais do processo. A automação da unidade foi
realizada em parceria com o GSCAR – Grupo de Simulação e Controle em Automação e
Robótica do Programa de Engenharia Elétrica da COPPE.
O sistema foi controlado por um PLC – Controlador Lógico Programável –
responsável pelo acionamento e controle de todos os periféricos. O PLC foi responsável
pelo acionamento de duas bombas peristálticas, sendo uma para alimentação do reator e
outra para homogeneização do efluente armazenado; pelo acionamento do agitador
mecânico, caso este fosse utilizado; pelo controle de nível realizado por eletrodos
63
instalados no interior do reator; além do acionamento das válvulas solenóides utilizadas
para: suprimento de ar, adição do regulador de alcalinidade (Na
2
CO
3
) do meio líquido ou
de fonte de carbono externa (possível desnitrificação), alimentação e esgotamento do
reator. O sistema também foi equipado com monitoramento em linha de oxigênio
dissolvido, temperatura e pH. Para tal foram utilizados eletrodos adequados para
operação contínua, semelhante àqueles utilizados em reatores industriais.
A Figura 4.2 ilustra o fluxograma simplificado da unidade experimental e a Figura
4.3 apresenta a foto do sistema completo montado em laboratório.
Figura 4.2 – Representação da unidade experimental: MBBR e periféricos.
PLC
aquisição
de dados
e acesso
ao PLC
OD
pH e T
nível
Entrada
do efluente
Saída do
efluente
tratado
compressor
rotâmetro
válvula de ar
Difusor de ar
entrada da
sol. Na
2
CO
3
dreno
agitador
mecânico
64
Figura 4.3 – Unidade experimental em escala de bancada.
A Figura 4.4 apresenta a parte física responsável pela automação do sistema,
incluindo a parte interna do painel de controle, onde se encontra o PLC. A Figura 4.5
apresenta uma foto mais detalhada do sistema, na qual estão nomeados os seus
respectivos componentes. A Figura 4.6 mostra em detalhe o agitador mecânico
responsável pela mistura do meio bifásico (líquido/sólido) durante a fase anóxica, o qual
se encontra acoplado perpendicularmente à parte de trás do biorreator.
Figura 4.4 – Parte física da automação.
Painel de
Controle
PLC
Painel de controle
externamente
PLC
Painel de controle
internamente
65
Figura 4.5 – Apresentação mais detalhada do MBBR e alguns periféricos.
Figura 4.6 – Agitador mecânico acoplado ao MBBR.
Agitador
Mecânico
Agitador
Mecânico
Agitador
Mecânico
Válvulas
solenóide
entrada
saída
Na
2
CO
3
ar
Rotâmetro
Medidor
de nível
Eletrodo
de pH
Medidor
de pH
Medidor
de OD
Eletrodo
de OD
Alimentação
de Na
2
CO
3
66
4.2 Efluente industrial
O efluente utilizado foi gentilmente cedido pela Petroflex, empresa produtora de
borracha sintética que, atualmente, pertence ao grupo alemão Lanxess e atende por esse
nome.
O principal intuito de utilizar este efluente foi o desafio de trabalhar com um
efluente real e que, portanto, possui uma matriz complexa e variável, diferentemente da
grande maioria dos trabalhos que investigam a nitrificação e utilizam efluentes sintéticos.
A indústria geradora do efluente trata-o nos níveis primário e secundário, o que
viabiliza o seu descarte no curso d’água com atendimento aos padrões requeridos pelo
Órgão Ambiental, no caso do Rio de Janeiro o INEA (Instituto Estadual do Ambiente). O
efluente de interesse para este estudo foi coletado periodicamente, ao longo de todo o
período experimental, na saída do tratamento secundário (lodos ativados). É de
conhecimento comum que, dependendo das características do efluente a ser tratado,
pode não ser possível alcançar bom desempenho para remoção de amônia durante o
tratamento secundário convencional.
Devido à elevada variabilidade na concentração de amônia do efluente industrial
decidiu-se por padronizar a quantidade de nitrogênio amoniacal do efluente a ser
alimentado no MBBR com adição de cloreto de amônio (NH
4
Cl). Para estudar o efeito de
diferentes concentrações salinas no processo de nitrificação, o efluente industrial também
foi suplementado com cloreto de sódio (NaCl), de acordo com as condições de trabalho
propostas.
Conforme comentado, o efluente foi coletado periodicamente (a cada 20 dias) em
bombonas de 50 litros, durante todo o período de trabalho. Para cada nova remessa, o
mesmo foi caracterizado em relação aos seguintes parâmetros: demanda química de
oxigênio (DQO) total e dissolvida, carbono orgânico dissolvido (COD), sólidos suspensos
totais e voláteis (SST e SSV), amônia, nitrato, cloreto e pH. Os resultados médios da
caracterização, obtidos para o efluente industrial, serão apresentados no Capítulo 5.
67
4.3 Estratégia de operação do MBBR
Para iniciar a operação do biorreator, operado de modo descontínuo, na forma de
bateladas seqüenciais, foi fixado um ciclo operacional de 24 horas, conforme ilustrado na
Figura 4.7.
alimentação
⇒
5 min
fase aeróbia
⇒
715 mim
fase anóxica
⇒
710 mim
decantação
⇒
5 min
esgotamento
⇒
5 min
Figura 4.7 – Etapas do ciclo operacional do MBBR no início da operação.
Cabe ressaltar que o volume alimentado em cada batelada foi de 5,3 litros,
permanecendo ao final de cada ciclo volume residual de 1,7 litros.
Antes da partida do sistema com efluente, foram realizados alguns testes de
operacionalidade. Realizaram-se testes de capacidade de homogeneização do reator, de
distribuição das biomídias, de oxigenação do meio líquido e de funcionamento da
automação.
A partida do reator foi realizada com efluente industrial suplementado apenas com
cloreto de amônia, ou seja, sem a adição de sal. Nesta fase, o reator foi inoculado com 50
mL de lodo proveniente do tanque de lodos ativados da estação de tratamento de
efluentes da indústria. Fixou-se a concentração de amônia no efluente de estudo em torno
de 100 mg L
-1
.
Após 30 dias do início da operação do biorreator, foram realizados testes de
acompanhamento da conversão da amônia ao longo da fase aeróbia do ciclo operacional,
com o objetivo de selecionar o tempo mais adequado para a duração desta etapa.
Durante os testes foram retiradas alíquotas de 30 mL do interior do MBBR a cada 1 hora
68
no período total de 10 horas. Estas amostras foram filtradas em membranas de acetato de
celulose, com tamanho de poro de 0,45 µm, e avaliadas quanto à concentração de
amônia e de nitrato.
A partir dos resultados obtidos se iniciou o ajuste da alcalinidade necessária ao
processo de nitrificação pela adição de uma solução de carbonato de sódio na
alimentação do biorreator e, posteriormente, de maneira automatizada.
Decorrido o período da implementação do ajuste de alcalinidade no meio reacional,
foi necessário realizar novos ensaios de acompanhamento de conversão da amônia.
Então, a partir destes resultados foi fixado o tempo de duração da etapa aeróbia no
biorreator.
Tendo sido ajustadas as condições de operação do processo de nitrificação, foi
dado início aos ajustes da etapa anóxica, referente à desnitrificação. Para tanto, foi
adicionado ao biorreator, de maneira automatizada, no início de cada etapa anóxica,
etanol como fonte externa de carbono. A escolha do etanol, assim como a quantidade do
mesmo adicionada, foi calculada a partir de relações estequiométricas e razões C/N
propostas na literatura (ABELING e SEYFRIED, 1992, CHIU e CHUNG, 2003, RUSTEN et
al., 2006). Como será visto no próximo capítulo, problemas operacionais impediram a
continuidade da possível etapa anóxica no ciclo operacional do biorreator.
Entre os ajustes da automação do sistema, assim como o acerto dos parâmetros
operacionais do processo, foram dispendidos 250 dias, sendo a partir de então dado início
aos regimes operacionais, como relatado a seguir.
Quatro regimes operacionais foram investigados. O parâmetro de variação que
definiu cada regime foi a salinidade, em termos de cloreto. A faixa de salinidade
investigada variou desde o teor de cloreto presente no efluente industrial
(aproximadamente 0,05 g L
-1
) até 12 g L
-1
. Os valores da salinidade do efluente no
biorreator, estabelecidos para cada regime, assim como o respectivo tempo de duração
proposto para cada um deles, estão apresentados na Tabela 4.1.
69
Na passagem do primeiro para o segundo regime operacional, assim como na
passagem para os regimes posteriores, foi feito um período de adaptação da biomassa
até se alcançar a nova condição de salinidade do meio. Esta adaptação foi realizada com
aumentos gradativos do teor de sal no meio reacional até atingir o valor de interesse.
Tabela 4.1 – Condição de salinidade imposta a cada regime de operação do biorreator.
Cl
-
(% m v
-1
)
Cl
-
(g L
-1
)
NaCl
(g L
-1
)
Tempo de operação
proposto (dias)
Regime 1 *** *** *** 90
Regime 2 0,3 3,0 5,0 120
Regime 3 0,6 6,0 10,0 120
Regime 4 1,2 12,0 20,0 120
***inerente ao efluente industrial
Para acompanhar o desempenho da nitrificação ao longo de todo o período
operacional do MBBR, foram determinadas (no mínimo 3 vezes por semana) a
concentração de amônia e nitrato no efluente inicial e final de cada ciclo de operação.
Nestas mesmas condições, foram determinados semanalmente a DQO e os teores de
SST e SSV. O carbono orgânico dissolvido e nitrito só foram determinados quando da
realização dos ensaios cinéticos, por conta de restrições dos equipamentos.
Temperatura, oxigênio dissolvido e pH foram monitorados em linha no próprio
reator utilizando medidores da marca Mettler Toledo modelos O
2
4050e e pH2050e. A
temperatura foi monitorada conjuntamente com o eletrodo de pH.
4.4 Testes cinéticos conduzidos no MBBR
Para melhor avaliar o possível impacto da crescente salinidade do meio reacional
foram determinados perfis de conversão da amônia para os quatro regimes operacionais
propostos.
70
Com este objetivo foram realizados ensaios para obter o perfil cinético de oxidação
da amônia e, consequentemente, da formação de nitrito e nitrato. Estes ensaios foram
realizados em todos os regimes operacionais, em triplicata, tendo sido utilizado um
procedimento padronizado em todos os casos.
Durante os testes foram retiradas alíquotas de 30 mL do biorreator a cada 1 hora
logo após a alimentação do efluente, ou seja, desde um tempo zero até o período total de
10 ou 12 horas. Estas amostras foram filtradas em membranas de acetato de celulose
com tamanho de poro de 0,45 µm para a determinação das concentrações de amônia,
nitrito e nitrato, conforme descrito na seção 4.8.1.
O período escolhido para a realização dos testes se deu em momentos
considerados de operação estável e na condição de maior eficiência de remoção da
amônia alcançada para cada regime operacional. Nestes ensaios o reator foi esgotado
completamente e preenchido o seu volume útil total (7,0 L) com o efluente.
Utilizou-se o período relativo ao Regime 3 para investigar também, pelo perfil
cinético de conversão da amônia, a influência do teor de matéria orgânica no processo de
nitrificação. Para esta finalidade o efluente industrial foi diluído com água da rede nas
seguintes proporções efluente:água (75:25 e 50:50). Para esta condição os ensaios
cinéticos foram conduzidos em triplicata, seguindo o mesmo procedimento descrito acima.
Para os resultados experimentais obtidos foi proposto um modelo matemático
simplificado. Devido à dificuldade de quantificar de maneira confiável a concentração de
bactérias no processo, sobretudo quando se trata de biomassa fixa, assim como de
diferenciar as bactérias que oxidam a amônia daquelas que oxidam o nitrito, se optou por
trabalhar com um modelo baseado apenas no consumo dos substratos (amônia e nitrito) e
na geração de produto (nitrato), conforme será discutido no Capítulo 5.
4.5 Experimentos de desnitrificação em biorreator de leito móvel
A etapa da desnitrificação esteve presente na proposta inicial deste trabalho e,
conforme já exposto, não foi possível promovê-la da maneira originalmente idealizada. No
71
entanto, este processo é de grande importância para o ambiente, pois o nitrato, produto
final da nitrificação convencional, também é uma substância poluente. Portanto, foi
considerado relevante verificar a possibilidade de desnitrificar o efluente tratado no MBBR.
Para esta finalidade foi montada outra unidade experimental, bastante simplificada, que
será descrita a seguir.
Este procedimento foi realizado somente no último regime operacional investigado
que equivale a condição de 12 g Cl
-
L
-1
.
4.5.1 Descrição da unidade experimental
A desnitrificação exige condições anóxicas para que os micro-organismos utilizem
o nitrato como aceptor final de elétrons ao invés do oxigênio. Para promover tal condição
colocou-se um bécher de vidro com capacidade de 2 L sobre uma placa de agitação
mecânica com barra magnética no seu interior para manter a homogeneização do meio
reacional. Neste bécher foram adicionadas biomídias em quantidade equivalente a 40%
do seu volume, para criar as condições mais próximas possíveis do processo de
nitrificação utilizado. Estas biomídias vinham sendo aclimatadas com o mesmo efluente
inicial do MBBR com o intuito de reposição das peças utilizadas para as determinações
inerentes à biomassa. Utilizou-se papel alumínio para cobrir o bécher-biorreator com o
objetivo de minimizar as possíveis trocas de oxigênio do ambiente externo com o meio
líquido. A Figura 4.8 ilustra a unidade de desnitrificação utilizada.
Figura 4.8 – Unidade experimental para o estudo da desnitrificação.
72
O efluente final do MBBR foi alimentado diariamente à unidade de desnitrificação.
A fonte externa de carbono utilizada foi o etanol na razão DQO/N-NO
-
3
igual a 4, tendo
esta razão sido escolhida arbitrariamente.
4.5.2 Condições operacionais e controles
Este biorreator operou pelo período de três meses paralelamente ao último regime
operacional do MBBR, no modo de bateladas seqüenciais com tempo de reação anóxica
de 24 horas. A alimentação do efluente foi realizada sempre de maneira instantânea após
esgotamento total do líquido tratado na batelada anterior. Os primeiros 60 dias de
operação foram destinados somente ao desenvolvimento da biomassa desnitrificante.
Foram determinados os teores de sólidos totais e voláteis da biomassa aderida
nos três meses de operação deste sistema. Oxigênio dissolvido no interior do biorreator e
o pH do efluente final foram medidos esporadicamente. A temperatura de operação foi a
ambiente do laboratório (~ 24°C).
Nos últimos 30 dias de operação foram realizados ensaios para avaliar a
velocidade de redução do nitrato presente no meio líquido, ou seja, a capacidade de
desnitrificação daquela unidade. Estes testes foram conduzidos paralelamente aos
ensaios cinéticos do MBBR para o último regime operacional e utilizou-se da mesma
metodologia aplicada, conforme descrito na seção 4.4, com exceção da determinação da
amônia a qual não foi monitorada.
Além do acompanhamento do nitrito e do nitrato no decorrer dos testes, também
foi determinado o teor de carbono orgânico dissolvido nas amostras.
4.6 Caracterização e quantificação do biofilme
Neste trabalho se optou por utilizar a determinação dos sólidos voláteis (SV),
proteínas e polissacarídeos ligados e totais, como técnicas de quantificação do biofilme.
Para a caracterização do mesmo buscou-se trabalhar com técnicas de microscopia óptica
e microscopia de fluorescência associada à biologia molecular, como é o caso da técnica
de FISH (Hibridização in situ por Fluorescência). O objetivo em realizar estes testes foi o
73
de identificar os micro-organismos nitrificantes e avaliar o possível impacto da salinidade
nas características e produção da biomassa.
4.6.1 Quantificação do biofilme por sólidos voláteis
Para efetuar a quantificação ou caracterização do biofilme foi necessário
primeiramente desenvolver um método para separar a biomassa do material suporte
(biomídias). Portanto, foi admitido um procedimento padrão para a obtenção do biofilme,
variando-se apenas o líquido de extração em função da análise a ser realizada.
Este procedimento consistiu em retirar as biomídias aleatoriamente do MBBR, em
momentos fixados para todos os ensaios. Estas foram colocadas em bécheres de 25 mL,
separadamente, com líquido suficiente para cobri-las (10 mL). Esses bécheres foram
colocados no aparelho de ultra-som (modelo MS200 da Thorrnton) por 30 min para
auxiliar no desprendimento do material aderido às biomídias. Quando não ocorria o
desprendimento total no ultra-som, utilizava-se uma agulha e se raspava delicadamente o
interior da biomídia até esta ficar praticamente limpa. Com o auxílio de uma pinça se
retirava a peça suporte do bécher e se fazia uso do líquido resultante para as
determinações de sólidos totais e voláteis (ST e SV), polissacarídeos (PLS), proteínas
(PTN) e FISH.
No caso das determinações de ST e SV o líquido de extração foi a água. Após a
retirada do material suporte se filtrava o líquido contendo o biofilme em membranas de
fibra de vidro. Na seqüência determinava-se por gravimetria o teor de sólidos totais e
voláteis conforme será descrito na seção 4.8.5.
Para calcular os valores da concentração da biomassa média obtidos nos 4
regimes operacionais estudados se utilizou das seguintes considerações:
1) multiplicou-se os resultados obtidos para SV, em mg L
-1
, pelo volume
fixo de 10 mL (valor arbitrado) adicionado a cada biomídia;
2) o valor obtido no item (1) foi multiplicado pelo número total de biomídias
no interior do biorreator e se obteve a massa média de biofilme no
MBBR;
74
3) dividiu-se o valor da massa total, obtido no item (2), pelo volume útil de
líquido no biorreator (7,0 L) e, assim, obteve-se a estimativa da
concentração média de biomassa (mg L
-1
), para cada regime
operacional estudado.
4.6.2 Quantificação do biofilme por determinação de proteínas e
polissacarídeos
Deve-se frisar que no decorrer deste trabalho serão empregados os termos “totais”
e “ligados” com referência aos teores de polissacarídeos e de proteínas. O termo “ligado”
está relacionado a estas substâncias quando as mesmas estão presentes no material
polimérico extracelular presente na membrana das células bacterianas. O termo “totais”
se refere às substâncias ligadas somadas às mesmas presentes no material intracelular
das bactérias.
Estas substâncias são diferenciadas analiticamente em função dos métodos
utilizados para a extração dos polissacarídeos (PLS) e das proteínas (PTN). No caso da
determinação de PLS e PTN totais, a metodologia de extração dos mesmos deve
promover a lise celular. Para a determinação de PLS e PTN ligados é ideal que se
obtenha o material exopolimérico, evitando o máximo possível o rompimento das células.
Neste contexto muitas técnicas são propostas para a obtenção do material ligado, pois
para a extração dos totais já existe metodologia consolidada por não serem requeridos
cuidados com a integridade da célula.
LIU e FANG (2002) e COMTE et al. (2006) fizeram estudos comparativos de várias
técnicas de extração para a obtenção das substâncias extracelulares, utilizando métodos
físicos (ultra-som, resinas de troca iônica, aquecimento) e químicos (EDTA, formaldeído +
NaOH, glutaraldeído), além de conjugações entre eles. Dentre os resultados obtidos o
método que alcançou o melhor resultado em termos de rendimento na recuperação dos
exopolímeros, com menor rompimento celular, foi o método químico que utiliza
formaldeído e hidróxido de sódio.
75
Portanto, com base nestes estudos a metodologia adotada para a extração dos
PLS e PTN ligados no presente trabalho foi adaptada dos protocolos apresentados por
LIU e FANG (2002) e COMTE et al. (2006) para formaldeído e hidróxido de sódio.
A princípio o procedimento utilizado para o desprendimento da biomassa a partir
da biomídia seguiu o mesmo protocolo empregado para a determinação dos sólidos
voláteis, porém, ao invés de se adicionar água à biomídia, adicionou-se 10 mL de solução
tampão fosfato 0,2 mol L
-1
, deixando-se por 30 min no ultra-som. Em seguida as biomídias
foram retiradas do bécher com o auxílio de pinça e o líquido transferido para um tubo
Falcon de 15 mL. Este foi centrifugado por 15 min a 1500 rpm. A seguir, o líquido
clarificado foi separado, sendo adicionados mais 10 mL do mesmo tampão ao pellet de
células. Efetuou-se agitação para ressuspender o material do fundo do tubo e adicionou-
se 0,06 mL de formaldeído 36,5% (v v
-1
), seguido de homogeneização e repouso por 1 h a
4°C. Decorrido este tempo, foram adicionados ao tubo 4 mL de NaOH 1,0 mol L
-1
,
seguidos de nova etapa de repouso por 3 h a 4°C. Em seguida, efetuou-se nova
centrifugação por 15 min a 1500 rpm e, posteriormente, filtrou-se o sobrenadante em
membrana de acetato de celulose de 0,22 µm com auxílio de filtração a vácuo. Recolheu-
se o filtrado para armazenamento em geladeira por até 24 h, para então se proceder à
determinação dos PLS e PTN ligados. O líquido separado após a primeira centrifugação
também foi analisado quanto ao teor de polissacarídeos e proteínas. Essas
determinações foram designadas por PLS e PTN “livres”, uma vez que estas substâncias
foram facilmente separadas, pois estavam fracamente ligadas ao biofilme. A Figura 4.9
apresenta de maneira esquematizada este procedimento.
76
Figura 4.9 – Esquema do procedimento utilizado para a extração dos PLS e PTN
ligados à biomassa.
Para a extração dos PLS e PTN totais se utilizou uma metodologia consolidada no
grupo de pesquisa do LABPOL (Laboratório de Controle de Poluição de Águas) que está
baseada nos estudos desenvolvidos por CAMMAROTA (1998). As biomídias foram
aleatoriamente retiradas do interior do MBBR e cada uma foi colocada em um tubo Falcon
de 50 mL, ao qual foram adicionados 10 mL de NaOH 1,0 mol L
-1
. Após agitação, deixava-
se o tubo por 5 min em banho-maria a 100°C. A seguir, retirava-se a biomídia com o
Biomídia
com
biofilme
Adicionar 10
mL de tampão
Deixar 30 min
no ultrassom
Transferir o
líquido com a
biomassa para
um tubo Falcon
Centrifugar
por 15 min
a
150
0
rpm
Transferir o sobrenadante para
outro tubo Falcon e adicionar 10
mL de tampão
fosfato
Sobrenadante
utilizado para a
determinação de
PLS e PTN livres
Homogeneizar em vórtex e adicionar
0,06 mL de formaldeído
Homogeneizar e deixar em repouso
por 1 h a 4
°
C
Adicionar 4 mL de NaOH,
homogeneizar e deixar em repouso
por 3 h a 4
°
C
Ce
ntrifugar por 15 min
a 150
0
rpm
Filtrar o sobrenadante em membrana
de 0,22 µm e armazená-lo sob
refrigeração até a determinação dos
PLS e PTN ligados
Obtenção da Biomassa
E
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t
r
a
ç
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E
x
o
p
o
l
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m
e
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o
s
77
auxílio de uma pinça e submetia-se o conteúdo do tubo à centrifugação por 15 min a 1500
rpm. Posteriormente, filtrava-se o sobrenadante em membrana de acetato de celulose
com tamanho de poro de 0,22 µm sob vácuo. O filtrado recolhido seguia para
armazenamento em geladeira por até 24 horas, para então se proceder à determinação
dos teores de PLS e PTN totais. A Figura 4.10 apresenta de maneira esquematizada o
procedimento descrito.
Figura 4.10 – Esquema do procedimento utilizado para a extração dos PLS e PTN totais.
Utilizou-se o método espectrofotométrico de DUBOIS et al. (1956) para a
determinação dos polissacarídeos livres, ligados e totais e o método espectrofotométrico
modificado de LOWRY et al. (1951) para as proteínas livres, ligadas e totais, seguindo os
protocolos apresentados por CAMMAROTA (1998).
Biomídia com biofilme
retirada do interior do
MBBR
Colocar a biomídia em um tubo
Falcon e adicionar 10 mL de NaOH
Deixar o tubo em banho-maria à
100
°
C por 5 min
Retirar a biomídia do tubo e
submetê-lo à centrifugação por 15
min a
150
0
rpm
Filtrar o sobrenadante em membrana
de 0,22 µm e armazená-lo sob
refrigeração até a determinação dos
PLS e PTN totais
78
4.6.3 Caracterização do biofilme por microscopia óptica
As observações da biomassa aderida ao suporte foram realizadas em microscópio
óptico Hund-Wetzlar, modelo H500, acoplado à câmera fotográfica Nikon Coolpix modelo
3500.
As observações ao microscópio óptico tiveram como intuito monitorar as
características gerais do biofilme, assim como a presença de possíveis protozoários ou
metazoários e relacioná-los com as condições operacionais impostas a cada regime de
trabalho no qual foram visualizados.
Para efetuar as observações na biomassa, certa quantidade de biofilme (~ 0,1 mL)
foi sugada do suporte com o auxílio de um conta-gotas e colocada diretamente sobre a
lâmina, sendo que acima da amostra foi colocada a lamínula. Este conjunto foi levado ao
microscópio óptico e observado com objetivas capazes de aumentar a visualização em
100, 400 e 1000 vezes. O zoom óptico da câmera fotográfica permitia aumento de até 10x
superior às objetivas utilizadas. Este procedimento foi realizado mensalmente durante
todo o período de trabalho.
4.7 Caracterização do biofilme pela técnica de Hibridização
in situ
por
Fluorescência (FISH)
4.7.1 Cultivo de células controle
Em geral, quando se inicia a técnica de FISH é recomendável testar as sondas
com culturas puras das bactérias de interesse para a sua validação. Por conta de
dificuldades em obter culturas puras das bactérias nitrificantes em tempo hábil, optou-se
por tentar promover o isolamento destas bactérias a partir da biomassa presente no
MBBR.
Com esta finalidade, foram realizados procedimentos adaptados do trabalho
desenvolvido por SORIANO e WALKER (1968), os quais isolaram bactérias autotróficas
que oxidam amônia a partir de amostras de solo.
79
Primeiramente foram preparados meios líquidos sintéticos específicos (Anexo I.1)
baseados na composição apresentada por SKINNER e WALKER (1961) apud SORIANO
e WALKER (1968) para o isolamento das AOB e por HENGEL apud SORIANO e
WALKER (1973) para o isolamento das NOB. A estes meios foi adicionada uma solução
de micronutrientes (Anexo I.2) conforme apresentada por CAMPOS et al. (1999). Os
meios de isolamento foram autoclavados a 121°C por 15 min.
A biomassa equivalente a três biomídias foi obtida conforme descrito na seção
4.6.1 e, então, lavada com tampão fosfato por duas vezes e adicionada a frascos de
cultura de 25 cm
2
juntamente com 50 mL dos meios sintéticos. Foram preparados frascos
distintos com os meios específicos para o crescimento das AOB e das NOB. Antes de
colocar a biomassa nos frascos esta foi sonicada por três vezes sucessivas de 30 s em
potência de 10 W no modo remoto, utilizando o aparelho sonicador Fisher Scientific
Modem 100. Este procedimento foi admitido com o objetivo de desagregar o biofilme e
favorecer o crescimento das células em suspensão. No caso dos frascos para o
isolamento das AOB foi utilizado o indicador azul de bromotimol 0,04% com o intuito de
identificar o consumo do substrato pela mudança de sua coloração do azul (quando em
meio básico) para o amarelo (quando em meio ácido). Os frascos de cultura utilizados
para o isolamento das bactérias nitrificantes podem ser visualizados na Figura 4.11.
Os frascos foram mantidos em incubadora com agitação orbital (New Brunswick
Scientific) por 20 dias a 37°C e 150 rpm. Posterior mente, estes frascos foram abertos em
capela de fluxo laminar, para a propagação das culturas enriquecidas em outros frascos
contendo meio de cultivo, fresco e estéril, específico para as AOB e as NOB, na
proporção 1:20 (cultura enriquecida:meio fresco). Na mesma ocasião estas culturas
também foram inoculadas em placas de Petri estéreis, para verificar o crescimento das
colônias. Os novos frascos com meio fresco retornaram à incubadora com agitação orbital
por mais 20 dias sob as mesmas condições anteriores e as placas de Petri foram
incubadas em estufa a 37°C.
Os meios das placas de Petri foram preparados com os meios líquidos específicos
para as AOB e as NOB e com agar-agar (18 g L
-1
). As culturas foram transferidas para as
placas de Petri com o auxílio de alça microbiológica descartável sempre em ambiente
estéril. Para observar a presença das heterotróficas preparou-se outro meio sintético
80
específico (Anexo I.3), adaptado de LIN et al. (2005), com agar-agar (18 g L
-1
). Neste
meio foram inoculadas as culturas dos frascos do enriquecimento das AOB e das NOB.
Figura 4.11 – Frascos de cultura para o enriquecimento e isolamento das bactérias
nitrificantes presentes no MBBR. A) Solução de enriquecimento para as AOB antes da
incubação; B) Solução de enriquecimento para as AOB depois da incubação; C) Solução
de enriquecimento para as NOB.
As culturas da segunda fase de enriquecimento e isolamento das bactérias
nitrificantes (20 dias após a propagação), foram inoculadas em placas de Petri com os
meios e nas condições previamente apresentadas. Estas placas foram incubadas na
estufa a 37°C e foram observadas a cada 24 horas pe lo período de 10 dias. As colônias
que se desenvolveram nas placas foram retiradas com auxílio de uma alça microbiológica
e fixadas conforme o procedimento descrito no Anexo I.4 (item I.4.2).
Reiterando, todas as soluções utilizadas foram autoclavadas por 15 min a 121°C e
foram manipuladas sob condições assépticas.
A
B
C
81
4.7.2 Obtenção, fixação e hibridização da biomassa
Foram coletadas amostras da biomassa aderida às biomídias presentes no interior
do MBBR nos quatro regimes operacionais estudados para identificar a comunidade
nitrificante com a aplicação da técnica de FISH.
Conforme previamente comentado no Capítulo 3, durante a etapa de hibridização
as células são expostas a elevadas temperaturas, detergentes e gradientes osmóticos.
Portanto, antes da hibridização, as células presentes na biomassa devem ser fixadas,
sendo esta etapa essencial para a manutenção da sua integridade morfológica.
A hibridização é realizada em lâminas de vidro cobertas com teflon, o qual perfaz
10 círculos que são chamados de poços, conforme mostrado na Figura 4.12. O teflon que
reveste as lâminas confere hidrofobicidade às mesmas, o que evita a mistura de
diferentes componentes aplicados aos poços. Para facilitar a aplicação dos reagentes,
das amostras e das sondas, as lâminas são cobertas com um gel.
Figura 4.12 – Imagem da lâmina utilizada para a aplicação da técnica de FISH.
Os protocolos utilizados para a obtenção da biomassa, a fixação das células, a
preparação das lâminas e a hibridização estão descritos no Anexo I.4.
Os procedimentos utilizados para a aplicação da técnica de FISH foram baseados
na metodologia desenvolvida por AMANN et al. (1990 e 1995) com adaptações para as
condições específicas do presente trabalho. Deu-se início à aplicação da técnica no
Laboratório de Microbiologia Básica e Biorremediação da Faculdade de Ciências
Biológicas da Universidade de Concepción no Chile, com continuidade no Laboratório de
poços
82
Microscopia Ambiental do Instituto de Microbiologia Professor Paulo de Góes da
Universidade Federal do Rio de Janeiro.
A Figura 4.13, adaptada de KIELING (2004), apresenta de forma resumida a
aplicação da técnica de FISH.
Figura 4.13 – Representação esquemática da aplicação da técnica de FISH, adaptado de
KIELING (2004).
4.7.3 As sondas e as condições para a hibridização
Para a identificação das bactérias em geral foi utilizada a sonda de
oligonucleotídeos EUB338 que é complementar à região 16S do rRNA de todo domínio
Bacteria. Para a identificação das nitrificantes, foram utilizadas as sondas de
oligonucleotídeos Nit3 (complementar à região 16S do rRNA de Nitrobacter spp) e
Nso1225 (complementar à região 16S do rRNA de todas as bactérias conhecidas que
oxidam amônia, pertencentes à subclasse β-Proteobacterias, com exceção de
Fixação das células
Hibridização por
sondas marcadas
com fluorocromos
Incubação a 46°C
Análise ao microscópio
Contagem das células
com DAPI e
sondas marcadas
Células
totais
(DAPI)
Células
hibridizadas
(sondas)
83
Nitrosomonas mobilis). As sondas para identificação das nitrificantes foram marcadas com
fluoresceína e EUB338 com rodamina. O corante celular DAPI (“4’,6 – diamidino – 2 –
phenylindole, dihydrochloride”) foi utilizado para assegurar as condições da hibridização
aplicada e a integridade das células. As sondas para as nitrificantes foram adquiridas da
Empresa Invitrogen e EUB338 foi fornecida pelo Laboratório de Microbiologia Ambiental
do Instituto de Microbiologia.
As variáveis da hibridização como a temperatura de dissociação (Td) dos
oligonucleotideos e a concentração de formamida utilizadas foram baseadas nas
informações apresentadas na literatura. Optou-se por trabalhar com a temperatura de
hibridização fixada em 46°C por ser esta amplamente utilizada. O teor de formamida
aplicado está apresentado na Tabela 4.2, a qual também mostra a seqüência dos
oligonucleotídeos referente a cada sonda utilizada e as respectivas referências
consultadas.
Tabela 4.2 – Sondas de oligonucleotídeos e condições para a hibridização aplicadas no
presente trabalho.
Sondas Sequência (5'- 3')
Formamida
(%)
Referências
EUB338 GCTGCCTCCCGTAGGAGT 20
AMANN et al.,
1990
Nso1225 CGCGATTGTATTACGTGTGA 35
MOBARRY et al.,
1996
Nit3 CCTGTGCTCCATGCTCCG 40
MOBARRY et al.,
1996
4.7.4 Observação ao microscópio e aquisição das imagens
As lâminas foram observadas em microscópio de epifluorescência Zeiss Axioplan
2 (Carl Zeiss, Alemanha) com lâmpada de mercúrio de 100W, conjunto de filtros para
DAPI (02 Carl Zeiss, Alemanha), Rodamina (15 Carl Zeiss, Alemanha) e Fluoresceína (10
Carl Zeiss, Alemanha) e equipado com câmera digital (Color View XS, AnalySiS Co). A
Tabela 4.3, adaptada de MOTER e GÖBEL (2000), apresenta os comprimentos de onda
de excitação e emissão dos fluorocromos utilizados.
84
Tabela 4.3 – Fluorocromos utilizados para a identificação dos micro-organismos
nitrificantes pela técnica de FISH, adaptada de MOTER e GÖBEL (2000).
Comprimento de onda (nm)
Fluorocromos Excitação Emissão Coloração
Fluoresceína-
isotiocianato
(FITC)
492 528 verde
Rodamina-tatrametil-isotiocianato
(TRITC)
557 576 vermelha
DAPI 372 456 azul
4.8 Métodos analíticos
Para todos os parâmetros determinados neste trabalho, referentes ao efluente tratado
no MBBR, procurou-se padronizar a nomenclatura utilizada da seguinte forma:
• efluente inicial é aquele amostrado no interior do biorreator após 1 min da
alimentação do afluente, ou seja, após o tempo necessário para a
homogeneização completa do líquido que entrou no biorreator com a porção que
permaneceu no interior do mesmo;
• efluente final é aquele que, passado o tempo de um ciclo de operação do
biorreator, foi esgotado e amostrado no barrilhete de recepção do efluente tratado.
4.8.1 Determinação de nitrogênio como N-NH
3
, N-NO
2
-
, N-NO
3
-
Para a determinação de amônia foi utilizado o método colorimétrico de Nessler
segundo o protocolo 4500-NH
3
C descrito pela AWWA (APHA, 1998). O princípio desta
técnica está baseado na reação da amônia livre (NH
3
) com iodeto de mercúrio e potássio
presente no reativo que é altamente alcalino. Esta reação leva à formação de uma
dispersão coloidal castanho-amarelada cuja intensidade de cor é proporcional à
quantidade de amônia presente na amostra. Embora este método seja indicado para uma
restrita faixa de concentração de N-NH
3
(20 µg L
-1
até 5 mg L
-1
) gerando a necessidade de
diluição das amostras em praticamente todas as determinações feitas no presente
trabalho, é uma técnica de rápida aplicação, com a possibilidade de utilizar quantidades
85
diminutas de reagente (0,1 mL de reativo de Nessler para 5 mL de amostra) e na qual o
íon cloreto não é considerado interferente.
A determinação do teor de amônia nas amostras foi obtido pela leitura da
absorvância em espectrofotometro HACH, modelo DR/2010 (o mesmo utilizado para a
DQO), a 425 nm, confrontada com a curva padrão de cloreto de amônio na faixa de 20 µg
L
-1
até 5 mg L
-1
.
Frisa-se, portanto, que no presente trabalho todas as menções ao teor de
nitrogênio amoniacal estão relacionadas à amônia (NH
3
) e não ao íon amônio (NH
+
4
), por
conta da técnica de determinação utilizada.
Tanto para a quantificação de amônia, como de nitrito e nitrato, as amostras de
efluente foram previamente filtradas em membranas de acetato de celulose com diâmetro
de poro de 0,45µm e auxílio de filtração a vácuo, sendo sempre preparadas em triplicata.
Os teores de nitrito (NO
2
-
) e nitrato (NO
3
-
) foram determinados por cromatografia
iônica. Este método gera resultados confiáveis, porém, requer cuidados na preparação da
amostra, principalmente amostras ambientais. O ideal para cromatografia de íons é que
sejam anulados ou retirados todos os compostos que não sejam íons, principalmente
matéria orgânica, antes da injeção da amostra no cromatógrafo. Esta é uma barreira para
a determinação de íons em efluentes, por esta técnica, visto que sua matriz é em grande
maioria orgânica. Recomenda-se a utilização de cartucho C
18
para a remoção de
orgânicos da amostra, o que encarece e torna mais demorada as determinações. No
presente trabalho optou-se por diluir as amostras com o intuito de se chegar a níveis de
orgânicos na faixa de ppb. A análise de íons em concentrações muito elevadas (g L
-1
)
também não é recomendada, pois pode saturar rapidamente a coluna. Nestes casos
também se utiliza o recurso da diluição.
As amostras para a determinação do nitrito e do nitrato, em todos os regimes
operacionais, foram diluídas no mínimo 100 vezes. Na condição de 12 g Cl
-
L
-1
, as
amostras antes de serem diluídas, foram filtradas em cartuchos de prata (Onguard
®
IIAg -
Dionex) para a remoção do íon cloreto.
86
O cromatógrafo de íons utilizado para estas determinações foi o da marca
DIONEX, modelo ICS90 com supressão e detector de condutividade ASRS
®
-ULTRA. Para
a determinação dos íons nitrito e nitrato foi empregada a coluna aniônica modelo AS14A
4-mm precedida de uma pré-coluna. O eluente empregado foi o carbonato de sódio
(marca Sigma-Aldrïch) em solução com concentração final de 8 mmol L
-1
e como
regenerante solução de ácido sulfúrico (marca Sigma-Aldrïch) na concentração final de 25
mmol L
-1
. O tempo de corrida de cada determinação foi de 16 min e os tempos de
retenção para os íons de interesse foram 5,9 e 8,4 min para NO
2
-
e NO
3
-
, respectivamente.
4.8.2 Determinação de cloreto
A determinação do teor de cloreto nas amostras do afluente bruto industrial foi
realizada pelo método titulométrico de Möhr, conforme a norma NT-202.R10, descrita e
recomendada pela FEEMA (1986).
4.8.3 Determinação da demanda química de oxigênio
No presente trabalho foram determinadas a DQO total e a DQO dissolvida para as
amostras do afluente industrial e para as amostras referentes ao início e ao final dos
ciclos operacionais do MBBR, com exceção do regime operacional com 12 g Cl
-
L
-1
.
A DQO dissolvida difere da total pela passagem da amostra através de
membranas de acetato de celulose de 0,45µm de diâmetro de poro com auxílio de
filtração à vácuo. Este procedimento permite remover as substâncias orgânicas
associadas aos sólidos suspensos presentes na amostra.
Para concentrações de cloreto de até 2.000 mg L
-1
a DQO foi avaliada segundo a
norma 5.220D recomendada pela AWWA (APHA, 2005). Este é o método colorimétrico
por refluxo fechado que utiliza o dicromato de potássio como oxidante e o sulfato de prata
em ácido sulfúrico como agente catalisador da reação. Para as amostras com
concentrações de cloreto entre 2.000 e 6.000 mg L
-1
utilizou-se o método adaptado por
FREIRE e SANT’ANNA JR. (1998) o qual está baseado nos princípios apresentados
acima com pequenas modificações. Para as amostras com teor de cloreto acima de 6.000
mg L
-1
a DQO não foi determinada.
87
A absorvância das amostras oxidadas foi medida no espectrofotômetro HACH,
modelo DR/2010 no comprimento de onda de 600 nm relativo à curva de calibração para
valores de DQO na faixa de 100 a 1000 mg L
-1
.
4.8.4 Determinação de carbono orgânico dissolvido
O teor de carbono orgânico dissolvido (COD) foi determinado utilizando-se o
analisador de carbono orgânico total (COT) da marca Shimadzu, modelo TOC-5000A. O
aparelho em questão promove combustão completa de todo carbono orgânico presente
na amostra em condições severas de temperatura com auxílio de catalisador e o carbono
inorgânico é diretamente transformado, por outra via, em gás carbônico sendo os dois
detectados por um analisador infravermelho. A diferença entre o CO
2
total e o obtido via
compostos inorgânicos permite identificar a quantidade de COT no material analisado.
No presente trabalho foi determinado apenas o teor de COD por conta das
amostras terem sido filtradas em membranas de acetato de celulose de 0,45µm de
diâmetro de poro.
Assim como para a DQO, existe uma limitação na utilização do aparelho para
amostras com elevadas concentrações salinas, sendo que acima de 3.000 mg L
-1
deve-se
diluir o efluente. Porém, por conta da elevada sensibilidade do equipamento foi possível
trabalhar com diluições de até 10 vezes para as amostras com maior teor de sal, o que
seria inviável no caso da DQO.
O método aplicado para as determinações de COD seguiu os procedimentos
5310A e B padronizados pela AWWA (APHA, 2005).
4.8.5 Determinação de sólidos suspensos totais e voláteis
O teor de sólidos suspensos totais e voláteis (SST e SSV) do efluente líquido foi
obtido por gravimetria utilizando-se o método de resíduo seco a 105 e 550ºC. Volumes
conhecidos das amostras foram filtrados com membranas de fibra de vidro sob filtração à
vácuo. O resíduo retido na membrana foi levado à estufa a 100ºC por no mínimo 12 horas
e posteriormente à mufla a 550ºC por 1 hora.
88
O resultado obtido após a estufa é referente aos SST. Após a calcinação se obtém
o resultado dos SSV, os quais geralmente estão associados à porção orgânica da
amostra e, portanto, podem indicar o teor da biomassa presente nas amostras de lodos e
biofilmes. No caso do presente trabalho este procedimento também foi utilizado para a
quantificação da biomassa aderida às biomídias do MBBR, porém entendeu-se que a
terminologia mais apropriada a ser utilizada neste caso seria sólidos totais e voláteis (ST
e SV), conforme apresentado anteriormente.
Os testes foram realizados segundo as metodologias 2540D e 2540E
recomendadas pela AWWA (APHA, 2005).
89
5 Resultados e Discussão
5.1 Caracterização do efluente industrial
A Tabela 5.1 apresenta os valores médios e os respectivos desvios padrão dos
resultados obtidos na caracterização do efluente industrial utilizado no trabalho. Os dados
referem-se a todo o período experimental.
Tabela 5.1 – Caracterização do efluente industrial.
Parâmetros Média e desvio
N-NH
3
(mg L
-1
) 50 ± 23
N-NO
3
(mg L
-1
) 2,2 ± 1,3
Cloreto (mg L
-1
) 50 ± 12
SST (mg L
-1
) 210 ± 101
SSV (mg L
-1
) 156 ± 69
pH 7,1 ± 0,3
A ocorrência de elevada variabilidade nos dados apresentados na Tabela 5.1 é
característica típica de efluentes industriais. Vale salientar que os valores de nitrato no
efluente são muito baixos, evidenciando que a nitrificação foi praticamente nula no
processo biológico que gerou o efluente utilizado no presente trabalho.
As substâncias orgânicas remanescentes no efluente industrial por várias vezes
influenciaram o processo de nitrificação. Por conta desta questão, os resultados médios e
seus desvios padrão, obtidos na quantificação da matéria orgânica por DQO (total e
dissolvida) e COD, são apresentados separadamente para cada condição operacional,
como pode ser observado na Tabela 5.2.
90
Tabela 5.2 – Teor de matéria orgânica do efluente industrial.
Etapas DQO
t
(mg L
-1
) DQO
d
(mg L
-1
) COD (mg L
-1
) DQO
d
/COD
250 dias iniciais
341 ± 197 255 ± 131 n.d n.d
Regime 1 278 ± 205 215 ± 132 68 ± 27 2,9 ± 0,2
Regime 2 230 ± 91 179 ± 48 72 ± 23 3,0 ± 0,2
Regime 3 218 ± 53 174 ± 32 62 ± 13 2,9 ± 0,3
Regime 4 231 ± 17 178 ± 27 55 ± 9 3,2 ± 0,2
DQO
t
- Demanda Química de Oxigênio total
DQO
d
- Demanda Química de Oxigênio dissolvida
n.d - não determinado
Os valores de DQO determinados sugerem que poderia ocorrer o favorecimento
das bactérias autotróficas nitrificantes no biofilme, porém, a variabilidade apresentada
revelou grande influência sobre o processo de nitrificação, como será comentado
posteriormente.
Nos casos em que o efluente industrial apresentou concentrações de DQO bem
superiores aos valores médios, a matéria orgânica presente, muito provavelmente
biodegradável, estava associada a problemas operacionais da ETDI na própria indústria.
Por conta disso e da constatação da relevante influência que a matéria orgânica causou
no processo de nitrificação, a partir da metade do segundo regime operacional, optou-se
por efetuar um controle mais criterioso na coleta e/ou utilização do efluente, para garantir
que a ETEI da indústria estivesse com bom desempenho, ou seja, baixa DQO.
As razões DQO
d
/COD, apresentadas na Tabela 5.2, mostram que as relações
entre DQO e carbono orgânico dissolvido obtidas para o efluente foram praticamente
constantes e se situam próximas ao valor 3.
Determinações da Demanda Bioquímica de Oxigênio (DBO
5
) foram realizadas em
3 amostras do efluente industrial coletadas no último regime operacional. Estes ensaios
foram gentilmente realizados no Laboratório de Engenharia Sanitária do Departamento de
Engenharia Sanitária e Meio Ambiente da Universidade Estadual do Rio de Janeiro
(UERJ). A metodologia utilizada foi a preconizada pelo método 5210 B DBO
5
. Os
resultados obtidos para a DBO
5
foram nulos, o que levou à conclusão de que a matéria
91
orgânica remanescente no efluente, para o quarto regime operacional foi prioritariamente
recalcitrante. No Anexo II encontram-se dois cromatogramas de amostras distintas do
efluente industrial, obtidos por cromatografia a gás acoplada a detector seletivo de
massas. Os mesmos permitem constatar a complexidade e diversidade das substâncias
presentes no efluente industrial mesmo depois de tratado biologicamente. Estas análises
foram realizadas no Instituto de Química da UFRJ, no Laboratório de Cinética Aplicada à
Química Atmosférica e Poluição.
5.2 Condições operacionais
Os testes de capacidade de homogeneização do reator e distribuição das
biomídias foram realizados com a injeção de uma solução corante no ponto de
alimentação do biorreator e apresentaram resultado satisfatório. A homogeneização total
do meio líquido se deu em menos de um minuto. A Figura 5.1 mostra o reator antes da
realização do teste e depois do mesmo finalizado, um minuto após a adição do corante.
Figura 5.1 – Fotos ilustrativas do teste de capacidade de homogeneização do meio
líquido e da distribuição das biomídias; A) antes de iniciar o teste; B) após 1 min da
injeção do corante.
A
B
92
A capacidade de oxigenação do meio líquido foi obtida a partir de testes para a
determinação do coeficiente de transferência de oxigênio (K
L
a) e se mostrou satisfatória.
No que se refere ao funcionamento da automação, problemas com entupimento
das válvulas solenóides foram constantes durante todo o período de operação do sistema.
Problemas iniciais (seis primeiros meses de funcionamento) com o controle de nível do
biorreator foram solucionados com o afastamento das peças responsáveis pelo
acionamento do sistema das paredes do reator e, também, com o controle de segurança
por tempo.
Os primeiros testes de conversão da amônia realizados para selecionar o tempo
de aeração do ciclo operacional foram conduzidos depois do trigésimo dia de operação do
MBBR. O acompanhamento da amônia removida e dos valores de pH no início e ao final
de um ciclo mostrou que a nitrificação já havia se estabelecido. A Figura 5.2 expressa
graficamente a variação dos valores de pH desde o início até completar 40 dias da
operação do biorreator.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
0 5 10 15 20 25 30 35 40
tempo, dias
pH
pH inicial
pH final
Figura 5.2 – Variação do pH ao longo do tempo, medido no início e ao final de cada ciclo
operacional, nos primeiros 40 dias de operação do MBBR.
Observa-se na Figura 5.2 que até 15 dias de operação não ocorreram variações
efetivas de pH no processo, e que a partir de então a diferença de pH entre o início e o
93
final do ciclo tornou-se mais significativa, evidenciando a ação nitrificante da biomassa,
que é caracterizada pela formação dos íons H
+
.
O oxigênio dissolvido no biorreator também foi monitorado e permaneceu na faixa
de 7,5 a 8,5 mg L
-1
. Esta concentração de OD garante que não houve, em qualquer
momento, a inibição do processo por falta de oxigênio. A temperatura do meio reacional
foi a temperatura ambiente do laboratório, que em grande parte do período de operação
do MBBR foi de 24 ± 2°C.
A Figura 5.3 apresenta graficamente os valores médios e os seus respectivos
desvios padrão, para nitrogênio amoniacal e pH, obtidos a partir dos resultados de três
testes de oxidação amostrados durante 10 horas. O oxigênio dissolvido durante todo o
período dos testes se manteve entre 8,2 e 8,7 mg L
-1
. Nitrito e nitrato não foram
monitorados.
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
0
20
40
60
80
100
120
140
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
pH
N-NH
3
, mg L
-1
tempo, horas
concentração de N-amoniacal pH no meio reacional
Figura 5.3 – Resultados de nitrogênio amoniacal e pH para a primeira batelada de testes
de acompanhamento da conversão de amônia.
Dos resultados mostrados na Figura 5.3 depreende-se que até 6 horas de aeração
foi removido, em média, 45% do nitrogênio amoniacal alimentado. Nas 4 horas seguintes
94
os valores da amônia permaneceram praticamente constantes e coincidiram com a
redução do pH (valores inferiores a 7,0). Sugere-se que pode ter ocorrido inibição das
bactérias que oxidam amônia (AOB) devido à redução dos valores de pH do meio
reacional, por conta da produção dos íons hidrogênio resultantes da própria oxidação da
amônia.
Uma das prováveis causas desta inibição é a possível presença do ácido nitroso,
conforme apresentado na seção 3.4.1. Segundo SCHMIDELL e REGINATTO (2007),
muito provavelmente, o ácido nitroso é o verdadeiro inibidor da ação das bactérias
nitrificantes.
A partir da provável inibição do processo de oxidação da amônia, por conta da
diminuição do pH, procurou-se suprir alcalinidade suficiente ao meio líquido para
neutralizar o efeito dos íons H
+
gerados durante a nitrificação. No início foi adicionada
quantidade previamente determinada de carbonato de sódio (barrilha) ao efluente
preparado para ser alimentado ao biorreator. Segundo GERARD (2002), cerca de 7,1 kg
de alcalinidade (CaCO
3
) são consumidos por kg de amônia oxidada. Posteriormente,
quando a etapa anóxica foi desabilitada, deu-se início ao suprimento automatizado de
barrilha: uma solução concentrada de carbonato de sódio armazenada em um barrilhete
colocado lateralmente acima do sistema (para promover a alimentação por gravidade)
permaneceu acoplada a uma válvula solenóide e na seqüência, ao biorreator, por meio de
mangueiras de silicone; quando o aparelho de medição do pH, colocado em linha,
detectava valores de pH abaixo de 7,0, promovia-se o acionamento (abertura) da válvula
solenóide e permitia-se a entrada da barrilha pelo período necessário até que o eletrodo
de pH detectasse novamente valores acima de 7,0, acionando-se a válvula, que era
fechada de modo automático.
Passado o período de adaptação a esta nova condição, foi realizada nova
batelada de testes de conversão da amônia. A Figura 5.4 apresenta graficamente os
valores médios e os seus respectivos desvios padrão, em termos de nitrogênio amoniacal
e da eficiência na sua conversão, obtidos a partir dos resultados de três testes
amostrados durante 10 horas.
95
0
20
40
60
80
100
0
20
40
60
80
100
120
0 0,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
Eficiência Média de Remoção, %
N-NH
3
, mg L
-1
tempo, horas
concentração de N-amoniacal Eficiência
Figura 5.4 – Valores médios de nitrogênio amoniacal e sua eficiência de remoção, obtidos
ao longo de 10 h durante a segunda batelada de testes de acompanhamento da
conversão de amônia.
Como pode ser observado na Figura 5.4, é notório que os resultados obtidos para
a oxidação da amônia, nesta segunda batelada de testes, mostraram substancial ganho
em termos da capacidade de biodegradação do substrato (NH
3
), alcançando conversão
praticamente total (97%) do nitrogênio amoniacal em 8 horas de teste. A partir destes
resultados é possível considerar que a inibição da nitritação foi solucionada pelo controle
da alcalinidade no meio reacional.
Durante estes ensaios foi possível determinar a formação do nitrato. A Figura 5.5
expressa graficamente os resultados médios e os respectivos desvios padrão obtidos
para a formação do nitrato, nos três testes realizados, assim como o perfil de conversão
da amônia e a estimativa da possível formação do nitrito. O teor de nitrito foi calculado a
partir do balanço de nitrogênio das três principais substâncias nitrogenadas envolvidas no
processo de nitrificação convencional (amônia, nitrito e nitrato).
96
0
20
40
60
80
100
120
0 0,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
N-NH
3
, N-NO
2
-
, N-NO
3
-
,
mg L
-1
tempo, horas
amônia nitrato concentração estimada de nitrito
Figura 5.5 – Valores médios de nitrato formado, perfil de amônia e a estimativa da
formação de nitrito ao longo de 10h durante a segunda batelada de testes de
acompanhamento da conversão de amônia.
Pelo perfil de formação do nitrato apresentado na Figura 5.5, infere-se que até
aproximadamente 5 horas de teste ocorreu algum tipo de inibição das bactérias que
oxidam nitrito (NOB), e que, somente a partir deste ponto, ocorreu a conversão a nitrato,
porém, de forma não muito expressiva até o final do teste. A hipótese que pode ser
considerada para este caso, baseada em relatos da literatura, é que o pH básico, em
torno de 8,0, favoreceu a presença de NH
3
livre o que inibiu a atividade das NOB até
aproximadamente 5 horas de teste. A partir deste ponto, quando a maior parte da amônia
já havia sido convertida, as NOB voltaram a ter atividade, o que culminou na formação do
nitrato, porém, em quantidades muito aquém das esperadas.
Estes resultados para a conversão do nitrato, principalmente após as primeiras 5
horas de teste, também poderiam sugerir a ocorrência da nitrificação e desnitrificação
simultâneas (SND), levando em consideração que o biofilme estava bem estabelecido e
poderia conter zonas anóxicas. Porém, comparando os valores de OD observados
durante os testes com os valores apresentados na literatura, para sistemas que
promoveram a SND (HOLMAN e WAREHAM, 2005), esta hipótese pode ser descartada.
97
Conforme apresentado na seção 3.3, alguns pesquisadores sugerem que o
acúmulo de nitrito no processo de nitrificação é influenciado pela combinação do pH,
temperatura e oxigênio dissolvido.
VILLAVERDE et al. (1997) determinaram, em seus experimentos, a interferência
dos valores de pH, entre 7,0 e 8,5, na ação das NOB. Os autores observaram que a partir
de pH igual a 7,5 deu-se início ao acúmulo do nitrito até o patamar de 85% para pH igual
a 8,5. Este acúmulo foi associado à inibição seletiva das NOB por conta da amônia livre
detectada, a qual também aumentou exponencialmente para valores de pH acima de 7,5.
Similarmente, SURMACZ-GORSKA et al. (1997) constataram que o pH é o parâmetro
decisivo na inibição da atividade das NOB e sugerem que é possível acumular nitrito
controlando o pH em torno de 8,0.
Para ABELING e SEYFRIED (1992), o principal parâmetro a ser controlado na
remoção de nitrogênio via nitrito, foi a concentração de amônia livre que, por sua vez, está
relacionada com o teor de N-amoniacal no efluente, com o pH e com a temperatura.
Segundo os autores, tanto Nitrosomonas como Nitrobacter são inibidas por amônia livre,
no entanto, Nitrobacter são mais sensíveis, sendo inibidas em concentrações mais baixas.
No que se refere aos experimentos anteriormente relatados, os valores de pH
permaneceram por todo o período dos testes em torno de 8,0, por ter sido adicionada
alcalinidade suficiente ao efluente alimentado ao MBBR. O efetivo consumo de OD,
diferentemente do que foi observado na primeira batelada destes ensaios, corroborou a
evidente melhoria na taxa de oxidação da amônia. No início dos testes, período mais ativo
da comunidade nitrificante, os valores de OD chegaram, em média, a 4,0 mg L
-1
e ao final
de 10 horas retornaram a valores próximos ao da saturação na água, evidenciando a
finalização da oxidação dos substratos. Tais observações podem ser visualizadas na
Figura 5.6.
98
2
3
4
5
6
7
8
9
0 0,5 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
tempo, horas
OD, mg L
-1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
pH
valores médios de OD valores médios de pH
Figura 5.6 – Resultados médios dos valores de pH e OD para a segunda batelada de
testes de acompanhamento da conversão de amônia.
A temperatura média durante estes ensaios manteve-se acima de 30°C,
diferentemente da maior parte do período de operação do MBBR, por conta de problemas
na manutenção da temperatura ambiente do laboratório, que coincidiu com a estação do
verão.
Mediante a apresentação destes resultados, pode-se inferir que a hipótese de
acúmulo do nitrito é bastante provável por conta dos valores de pH e temperatura estarem
próximos aos das condições apresentadas na literatura para promover a inibição das NOB.
ZDRADEK (2005) confirmou, pela aplicação de testes respirométricos em um
reator de nitritação, operado na forma de bateladas seqüenciais, que a máxima atividade
microbiana para as AOB foi alcançada na condição de pH igual a 8, coincidindo com os
valores observados nos experimentos que estão sendo discutidos no presente trabalho.
SINHA e ANNACHHATRE (2007) investigaram o efeito da variação dos
parâmetros operacionais pH, T e OD na nitrificação. O principal objetivo do trabalho foi
obter as condições ideais para promover a nitrificação parcial em um efluente sintético
inorgânico. Os experimentos conduzidos em pH igual a 8,0 e temperatura de 35°C
99
levaram à melhor condição de acúmulo do nitrito. As condições ideais de oxigênio
dissolvido no meio reacional foram observadas para valores da ordem de 0,3 a 0,5 mg L
-1
.
Nos ensaios de determinação do efeito específico do pH sobre a nitrificação, nos quais o
pH foi controlado e manteve-se em torno de 8,0 (Figura 5.7), o perfil dos resultados
obtidos para amônia e nitrito foi similar aos que foram anteriormente apresentados para
este trabalho, quando levada em consideração a hipótese do acúmulo de nitrito (Figura
5.5).
Figura 5.7 – Resultados da conversão de nitrogênio amoniacal sob condições controladas
de pH (igual a 8,0), apresentados por SINHA e ANNACHHATRE (2007).
Como o principal objetivo do acompanhamento da biodegradação da amônia foi
selecionar o tempo da fase aeróbia do ciclo operacional, determinou-se com base nos
resultados apresentados que o tempo de duração desta etapa deveria permanecer o
mesmo do início da operação do biorreator, ou seja, o tempo de reação para promover a
nitrificação foi fixado em 12 h. Esta decisão foi tomada devido à constatação da grande
variabilidade dos parâmetros relacionados ao sistema e de que a melhor condição de
oxidação da amônia, até aquele momento, foi alcançada dentro do tempo proposto (10 h).
Definidas as condições operacionais de tempo e alcalinidade na etapa nitrificante
(aeróbia), deu-se início à implementação da desnitrificação (etapa anóxica). Para esta
finalidade, etanol foi adicionado ao biorreator como fonte externa de carbono, no início da
etapa anóxica (duração de 12 horas) de cada ciclo operacional e de maneira
automatizada. Supondo a conversão total de amônia em nitrato e assumindo a razão
DQO/N-NO
3
-
igual a 6 (ABELING e SEYFRIED, 1992) como sendo a razão ideal para
promover a desnitrificação, foi calculada a quantidade necessária de etanol para
Tempo (horas)
Concentração (mg L
-1
)
Tempo (horas)
Concentração (mg L
-1
)
100
suplementar o meio reacional. O procedimento para a alimentação do etanol ao biorreator
foi praticamente o mesmo descrito anteriormente para a adição de barrilha, porém, o
parâmetro de controle da quantidade a ser adicionada foi o tempo de abertura da válvula,
diferentemente do caso da barrilha, no qual o parâmetro de controle foi o pH. Uma
solução na proporção (1:20, v v
-1
) de álcool absoluto foi preparada e colocada no
barrilhete de alimentação. Foram realizados testes para ajustar o tempo de abertura da
válvula à vazão de entrada desta solução que garantisse a quantidade de etanol
necessária à desnitrificação.
A etapa referente à implantação da desnitrificação foi iniciada quando o reator
completou 150 dias de operação e, a partir desta data, observou-se o declínio gradativo
na eficiência de conversão da amônia, culminando na perda completa da atividade
nitrificante. Manteve-se a fase desnitrificante por 35 dias. A partir do momento que não se
obteve mais resultados positivos para a conversão da amônia e nenhum indício de
recuperação da mesma, optou-se por cessar a desnitrificação e retomá-la, se possível,
em outro momento. Foram necessários 30 dias, após a retirada da alimentação do etanol
ao biorreator, para a recuperação da nitrificação. Visto que a adição de matéria orgânica
ao meio reacional foi extremamente prejudicial à comunidade microbiana autotrófica, deu-
se por encerrada a possibilidade de retomar a desnitrificação neste biorreator nas
condições apresentadas. Portanto, a partir dos 185 dias de operação o ciclo operacional
do MBBR passou a ter 730 minutos sendo: 5 min para a alimentação do afluente, 715 min
de aeração, 5 min para a decantação e 5 min para o esgotamento do efluente tratado.
A incompatibilidade da fase nitrificante previamente estabelecida com a tentativa
de implantação da desnitrificação ocorreu, muito provavelmente, devido à equivocada
escolha da relação DQO/N aliada à forma de alimentação do etanol no MBBR. Infere-se
que a alimentação de quantidades excessivas de etanol ao biorreator ocasionou o
desequilíbrio da comunidade microbiana presente, o que favoreceu o crescimento das
bactérias heterotróficas em detrimento das autotróficas (responsáveis pela nitrificação). A
quantificação da biomassa durante este período, por determinações gravimétricas do
biofilme, mostrou a ocorrência de crescimento brusco e acentuado da biomassa aderida.
Estes resultados serão apresentados na seção 5.6.1.
101
A Figura 5.8 expressa graficamente os valores de nitrogênio amoniacal no início e
no final dos ciclos operacionais, monitorados durante os primeiros 250 dias de operação
do MBBR.
0
20
40
60
80
100
120
140
0 50 100 150 200 250
tempo, dias
N-NH
3
, mg L
-1
N amoniacal inicial N amoniacal final
Figura 5.8 – Resultados da conversão de nitrogênio amoniacal desde o início da
operação do biorreator até os 250 dias subsequentes.
A Tabela 5.3 sumariza os valores médios e os respectivos desvios padrão dos
resultados relativos ao desempenho da conversão do nitrogênio amoniacal, conforme
mostrados na Figura 5.8. Para apresentar estes resultados os mesmos foram divididos
em quatro conjuntos de dados distintos, caracterizados pela maior ou menor variabilidade
na eficiência de conversão da amônia. Foram destinados 60 dias para compor o conjunto
de dados representativos da etapa referente ao início da desnitrificação até a retomada da
nitrificação.
102
Tabela 5.3 – Resultados da conversão de nitrogênio amoniacal na primeira etapa
de operação do MBBR.
Período N-NH
3
(mg L
-1
) Eficiência de
(dias)
Inicial final conversão (%)
primeiros 90 93 ± 19 32 ± 22 65 ± 23
60 intermediários 85 ± 13 12 ± 10 87 ± 12
60 refs. desnitrificação 95 ± 16 54 ± 38 47 ± 32
últimos 40 98 ± 18 9 ± 6 91 ± 6
Embora as evidências de que o desempenho da nitrificação esteve diretamente
associado às condições operacionais do processo, deve-se ressaltar que o teor de
matéria orgânica, oriundo do efluente industrial, também apresentou forte influência sobre
este desempenho. Para melhor relatar esta observação a Figura 5.9 expressa a relação
dos valores médios de DQO inicial total e dissolvida versus eficiência de conversão do
nitrogênio amoniacal, para os quatro conjuntos de dados apresentados na Tabela 5.3.
R
2
= 0,9398
R
2
= 0,9246
0
20
40
60
80
100
0 100 200 300 400 500 600
DQO inicial, mg L
-1
Conversão de N-amoniacal, %
DQO total (1)
DQO dissolvida (2)
linha de tendência (1)
linha de tendência (2)
Figura 5.9 – Conversão de nitrogênio amoniacal versus DQO inicial para os quatro
conjuntos de dados relativos aos primeiros 250 dias de operação do MBBR.
Apesar dos valores de R
2
obtidos para a correlação proposta não terem sido
excelentes (R
2
= 0,9398 para a DQO inicial total e R
2
= 0,9246 para a DQO inicial
103
dissolvida), observa-se forte tendência de queda na eficiência de conversão do nitrogênio
amoniacal com o aumento da DQO inicial, tanto para a DQO dissolvida como para a total.
Os pontos mais deslocados em relação à linha de tendência retratam a fase inicial de
operação do MBBR, sendo que neste período observou-se o maior desvio padrão para os
dados relativos à DQO (Figura 5.10), podendo ser esta uma justificativa para os valores
de R
2
.
Os resultados da eficiência média de remoção da matéria orgânica, em termos da
DQO total e dissolvida, estão sumarizados na Tabela 5.4.
Tabela 5.4 – Resultados médios e seus respectivos desvios padrão para a eficiência de
remoção da DQO total e dissolvida na fase inicial de operação do MBBR.
Período referente aos Eficiência de Remoção
Eficiência de Remoção
250 dias iniciais de
operação do MBBR
(dias)
para a DQO total
(%)
para a DQO dissolvida
(%)
primeiros 90 36 ± 10 30 ± 10
60 intermediários 36 ± 14 24 ± 16
60 refs. desnitrificação 33 ± 11 32 ± 7
últimos 40 30 ± 4 12 ± 5
É interessante observar que a eficiência de remoção da DQO total, em média, não
apresentou diferença significativa nesta fase de operação. Em relação à DQO dissolvida
os resultados médios mostram, além da alta variabilidade, expressa pelos valores do
desvio padrão, menor remoção nos últimos 40 dias. Sugere-se que a queda de eficiência
observada ocorreu por conta dos menores valores de DQO oriundos do efluente industrial,
com grande parcela de substâncias recalcitrantes.
A Figura 5.10 expressa graficamente, de maneira resumida, os resultados médios
e os respectivos desvios padrão obtidos para a DQO inicial e final (total e dissolvida).
Estes dados estão relacionados àqueles apresentados na Tabela 5.4. Os valores mais
expressivos observados na etapa referente à desnitrificação estão diretamente
relacionados à alimentação da fonte externa de carbono ao biorreator na forma de etanol.
104
0
200
400
600
800
primeiros 90 dias 60 dias
intermediários
60 dias refs.
desnitrificação
últimos 40 dias
DQO, mg L
-1
DQOtotal inicial DQOdissolvida inicial
DQOtotal final DQOdissolvida final
Figura 5.10 – Resultados médios da DQO inicial e final, total e dissolvida, desde o início
da operação do MBBR até os 250 dias subsequentes.
Os resultados obtidos para os teores de sólidos suspensos no início e no final dos
ciclos operacionais estão apresentados na Figura 5.11. Observa-se que a concentração
de sólidos no final do ciclo foi sempre inferior àquela do início. Apenas no período entre
160 e 180 dias os valores de sólidos no efluente final foram superiores ao do efluente
inicial, por conta do excessivo aporte de matéria orgânica no biorreator (etapa da
desnitrificação), o que promoveu o crescimento da biomassa também em suspensão. A
variabilidade dos sólidos suspensos (SST e SSV) iniciais foi inerente às características do
efluente industrial. As relações SSV/SST no efluente inicial e final resultaram nos valores,
0,73 ± 0,12 e 0,67 ± 0,14, respectivamente.
105
0
200
400
600
800
7 23 40 56 72 89 105 121 138 154 171 202 233
SSV final
SST final
SSV inicial
SST inicial
tempo, dias
mg L
-1
5.3 Apresentação dos regimes operacionais
Os últimos 40 dias do período inicial de operação do MBBR apresentaram
desempenho relativamente estável para a conversão de amônia. A partir de então, deu-se
início ao primeiro regime operacional dos quatro propostos para este trabalho. A Figura
5.12 ilustra a distribuição destes regimes no tempo, associados ao perfil da salinidade,
sendo este representado pelo teor do íon cloreto (Cl
-
). O tempo de operação dos regimes
incluiu o período de adaptação da biomassa para cada nova condição e foi distinto nos
quatro casos, devido às peculiaridades de cada etapa.
Figura 5.11
–
Acompanhamento dos SST e SSV no efluente inicial e final do
ciclo operacional, durante os primeiros 250 dias de trabalho do MBBR.
106
0
3000
6000
9000
12000
15000
250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850
tempo, dias
Cl
-
, mg L
-1
Regime 3
Regime 4Regime 1
Regime 2
Figura 5.12 –
Teor de íons cloreto no efluente alimentado ao biorreator nos quatro
regimes operacionais investigados. Símbolos vazados (salinidade variável referente ao
período de adaptação à nova condição), símbolos cheios (salinidade constante
característica do regime operacional em questão).
Por conta da elevada variabilidade do sistema, constatada anteriormente, não foi
possível operar o MBBR nos períodos de tempo propostos inicialmente. A Tabela 5.5
apresenta o que foi proposto, o período efetivo de operação e o tempo utilizado para a
adaptação da microbiota a cada nova condição de cloreto.
Tabela 5.5 –
Comparação da duração dos períodos propostos e os efetivos para os
quatro regimes operacionais investigados.
Regimes Cl
-1
Período de
operação
Período de
operação
Período de
adaptação
operacionais
(g L
-1
) proposto (dias) efetivo (dias) (dias)
1 0,05 90 106 250 iniciais
2 3 120 136 35
3 6 120 164 34
4 12 120 163 119
107
Para os regimes 2 e 3, 35 e 34 dias, respectivamente, foram suficientes para a
implementação gradual de cloreto ao meio. No regime 4, o acréscimo e decréscimo da
salinidade observados no período de adaptação estiveram associados a problemas
operacionais que serão comentados posteriormente.
Na Figura 5.13 está representado graficamente o acompanhamento do
desempenho da nitrificação para os quatro regimes operacionais investigados. A
conversão de amônia e a respectiva produção de nitrato estão representadas em termos
de N-NH
3
e N-NO
3
-
no início e no final de cada ciclo operacional.
Observa-se da Figura 5.13, que no regime 1, até o início do regime 2, ocorreu
maior instabilidade em relação à capacidade de conversão de amônia, fato não esperado
por ter sido este a continuação do período caracterizado como o de melhor desempenho
na primeira etapa de operação (250 dias anteriores). Entretanto, os valores de DQO inicial
nesta fase voltaram a apresentar flutuações resultando, novamente, na instabilidade do
processo de nitrificação.
No que se refere aos regimes 2 e 3 pode-se inferir que a suplementação de sal ao
meio associada ao controle mais criterioso do efluente industrial – em termos de matéria
orgânica – colaborou para estabelecer melhores condições no desempenho da conversão
biológica de amônia a nitrato, pois é notória a menor instabilidade do processo nestes
períodos. Os dois eventos ocorridos em cada uma destas etapas, que levaram à perda
total da eficiência na remoção de amônia, foram causados por problemas operacionais.
No regime 3 o problema que afetou o desempenho do processo foi a válvula
solenóide de alimentação da barrilha, a qual não estava fechando completamente,
permitindo a alimentação contínua da solução ao biorreator, o que resultou na elevação
do pH para valores acima de 9. Neste caso, supõe-se que a amônia livre foi favorecida
em relação ao íon amônio e, conforme apresentado na literatura, a amônia pode ter sido
tóxica para as próprias AOB, fato que levou à inibição total da atividade nitrificante.
108
0
20
40
60
80
100
120
140
250 280 310 340 370 400 430 460 490 520 550 580 610 640 670 700 730 760 790 820
tempo, dias
Nitrogênio, mg L
-1
amônia inicial nitrato inicial
amônia final nitrato final
0,05 g L
-1
de Cl
-
3 g L
-1
de Cl
-
6 g L
-1
de Cl
-
12 g L
-1
de Cl
Figura 5.13 –
Perfil da nitrificação: oxidação de amônia e produção de nitrato, nos quatro regimes operacionais investigados.
109
Como o último regime com 12 g Cl
-
L
-1
foi operado sob condições distintas de
adaptação ao cloreto e tempo de aeração, os resultados obtidos nesta etapa serão
apresentados mais detalhadamente. Na Figura 5.14 está representado o perfil de
conversão da amônia acompanhado das variações da concentração de cloreto
suplementado ao meio e dos distintos tempos de duração destinados à etapa aeróbia do
ciclo operacional para este último regime.
0
20
40
60
80
100
120
140
660
667
674
680
687
693
700
706
713
720
726
733
739
746
753
759
766
772
779
786
792
799
805
812
819
tempo, dias
N-NH
3
, mg L
-1
0
10
20
30
40
50
60
70
80
90
100
tempo de aeração (h) e
salinidade (%, m v
-1
)
amônia inicial amônia final salinidade tempo de aeração
Figura 5.14 –
Variação dos teores de amônia e salinidade e duração da etapa de aeração
do ciclo operacional durante o último regime investigado (12 g L
-1
).
Observa-se da Figura 5.14, que durante o período inicial de adaptação à nova
condição de cloreto, com 12 horas de aeração, a nitrificação perdeu eficiência
gradativamente e mesmo dobrando-se o tempo de aeração (24 horas) a atividade das
AOB foi quase totalmente inibida, o que levou à suposição inicial de que a microbiota
presente não estaria suportando quantidades crescentes de cloreto. A diminuição
gradativa de cloreto até a condição anterior (6 g L
-1
), como uma tentativa de recuperar a
biomassa, não causou efeito na retomada da nitrificação, sugerindo que a perda de
eficiência não estava diretamente associada ao incremento do teor de sal no meio
reacional. Em decorrência, averiguou-se outra causa para a perda da atividade nitrificante
e constatou-se que a válvula de alimentação da barrilha estava vazando novamente,
conforme ocorreu no regime 3. Porém, desta vez o pH não passou de 8,0, o que dificultou
110
a identificação do problema. Contudo, este fato associado ou não à crescente salinidade
do meio inibiu a ação das AOB.
Poucos trabalhos da literatura fazem referência à interferência da alcalinidade no
processo de nitrificação (RUSTEN et al., 2006, TOKUTOMI, et al., 2006, SIN, et al., 2008).
Ainda assim, os estudos realizados neste contexto são no sentido de investigar até que
ponto a ausência de alcalinidade suficiente no meio reacional pode interferir na
capacidade de nitrificação de um sistema. RUSTEN et al. (2006) avaliaram, pela adição
de barrilha (Na
2
CO
3
), a influência da alcalinidade na taxa de remoção de nitrogênio
amoniacal em um MBBR. Contraditoriamente ao que se constatou no presente trabalho,
os resultados apresentados por RUSTEN e seus colaboradores mostraram que o
aumento da alcalinidade no meio reacional favoreceu a taxa de biodegradação da amônia.
Resolvido o problema da válvula, retomou-se a implementação gradativa de
cloreto, mantendo-se 24 horas de aeração e suplementando-se o meio com solução de
micronutrientes (Anexo I.2), na tentativa de acelerar o processo de recuperação da
comunidade microbiana autotrófica. Desta maneira, foram necessários 10 dias para a
recuperação da nitrificação.
Portanto, quando se alcançou novamente a concentração máxima de cloreto e o
desempenho do processo mostrou-se estável, retornou-se à operação com 12 horas de
aeração, condição que afetou negativamente a nitrificação. Optou-se, portanto, em
continuar com 24 horas de aeração. No início pareceu que este tempo seria suficiente
para garantir eficiência razoável do processo, porém observou-se o decréscimo gradativo
da atividade nitrificante também nesta condição, com leve tendência de recuperação no
final do período. Depreende-se, portanto, que o teor de 12 g L
-1
de cloreto foi deletério
para a nitrificação nas condições operacionais propostas, inibindo fortemente a atividade
das AOB, mesmo sendo estas consideradas, na maioria dos trabalhos, menos sensíveis a
salinidade do que as NOB (MOUSSA et al., 2006). A inibição das bactérias que oxidam
amônia nesta condição salina pode, talvez, estar associada ao excesso de oxigênio no
meio reacional. Segundo HYNES e KNOWLES (1983) apud HAGOPIAN e RILEY (1998) a
formação de íons clorito (ClO
2
-
) inibe fortemente tanto a nitritação como a nitratação.
111
A Tabela 5.6 apresenta os valores médios representativos dos resultados
discutidos na Figura 5.13 em relação ao nitrogênio inicial e final do ciclo operacional, na
forma de amônia e nitrato, e a eficiência da conversão de nitrogênio amoniacal obtida nas
quatro condições de salinidade estudadas. Para estes valores apresentados foram
desconsiderados os dados relativos aos períodos em que a nitrifificação foi desfavorecida
por problemas operacionais do sistema.
Tabela 5.6 –
Resumo dos resultados referentes à nitrificação, obtidos para os quatro
regimes operacionais de trabalho.
Cl
-
INICIAL (mg L
-1
) FINAL (mg L
-1
) Conversão
(g L
-1
) N-NH
3
N-NO
3
N-NH
3
N-NO
3
N-NH
3
(%)
0,05 87 ± 11 13 ± 5 18 ± 15 63 ± 17 79 ± 16
3 90 ± 11 16 ± 7 5 ± 7 86 ± 13 95 ± 3
6 90 ± 6 23 ± 2 2 ± 1 104 ± 5 97 ± 1
12 89 ± 12 17 ± 6 28 ± 26 72 ± 21 71 ± 24
Os resultados médios mostraram que a melhor condição para a nitrificação foi
alcançada nos regimes 2 e 3 referentes a 3 e 6 g Cl
-
L
-1
, sendo que o regime 3 apresentou
os menores desvios padrão associados às médias. Os regimes 1 e 4 mostraram-se
similares em relação à variabilidade dos resultados, porém, o regime 4 (12 g Cl
-
L
-1
)
mostrou em média o pior desempenho para conversão de amônia, apesar do período de
aeração ter sido, neste caso, aumentado para 24 h.
No que se refere ao acompanhamento da matéria orgânica durante os regimes
operacionais, foram determinadas a DQO total e dissolvida para os 3 primeiros regimes,
sendo que para o último regime não foi possível determinar a DQO por conta da elevada
concentração salina das amostras.
A Figura 5.15 apresenta, de forma resumida, os resultados médios e os desvios
padrão obtidos para a DQO inicial e final (total e dissolvida) referentes aos regimes 1, 2 e
3. A DQO inicial e a DQO final correspondem, respectivamente, a DQO no início e no final
dos ciclos operacionais do MBBR.
112
0
50
100
150
200
250
300
350
400
0,05 3 6
Cl
-
, g L
-1
DQO, mg L
-1
DQOtotal inicial DQOdissolvida inicial
DQOtotal final DQOdissolvida final
Figura 5.15 –
Resultados médios da DQO inicial e final, total e dissolvida, para os 3
primeiros regimes operacionais estudados.
A Tabela 5.7 apresenta os valores médios da eficiência de remoção da DQO, total
e dissolvida, para os dados apresentados na Figura 5.15.
Tabela 5.7 –
Resumo dos resultados referente à eficiência de remoção da DQO total e
dissolvida, obtidos para os três primeiros regimes operacionais de trabalho.
Eficiência de Remoção (%)
Regimes
DQO
total
DQO
dissolvida
1 29 ± 9 19 ± 10
2 32 ± 6 21 ± 7
3 25 ± 3 8 ± 5
Da Figura 5.15 depreende-se que no regime sem a adição de NaCl, os resultados
obtidos para a DQO inicial apresentaram os maiores desvios padrão, fato que coincide
com a elevada variabilidade observada para a eficiência da nitrificação neste mesmo
regime. Observa-se leve tendência de aproximação dos valores médios da DQO final,
total e dissolvida, dos valores da DQO inicial dissolvida, assim como a diminuição do
desvio padrão no sentido do menor para o maior teor de íons cloreto. Este
113
comportamento ocorreu por conta do maior controle na coleta do efluente industrial, que
assim proporcionou menores variações na matéria orgânica alimentada ao MBBR.
Os valores médios de remoção da DQO total e dissolvida não apresentaram
diferença siginificativa para os regimes 1 e 2. A queda de eficiência no regime 3,
principalmente para a DQO dissolvida, ocorreu, provavelmente, por conta da menor
concentração de matéria orgânica biodegradável no efluente industrial.
Portanto, da discussão dos resultados relativos à nitrificação associados à DQO,
concluiu-se que fatores distintos (a matéria orgânica no regime 1 e a salinidade no regime
4) apresentaram interferência negativa na atividade nitrificante.
A Figura 5.16 que expressa graficamente a relação das taxas volumétricas (Cv),
nitrogenada e carbonácea, aplicadas ao biorreator com a taxa de utilização (U) do
substrato (N-NH
3
) e a concentração de cloreto nos quatro regimes operacionais
estudados, vem corroborar esta conclusão.
As variáveis Cv e U foram calculadas a partir dos valores médios da DQO total e
do nitrogênio amoniacal iniciais nos regimes 1, 2 e 3. Para o cálculo de Cv e U na
condição de 12 g Cl
-
L
-1
foram utilizados os valores médios dos ensaios cinéticos, com o
objetivo de se ter como base de cálculo o mesmo tempo de aeração. A DQO nesta
condição foi estimada a partir dos resultados de COD, também determinados nos ensaios
cinéticos.
114
0,00
0,02
0,04
0,06
0,08
0,10
0,12
0,14
0,16
0,18
0,20
0,05 3 6 12
Cl
-
, g L
-1
Cv e U amoniacal, kg m
-3
d
-1
0,00
0,05
0,10
0,15
0,20
0,25
0,30
0,35
0,40
0,45
0,50
0,55
Cv carbonácea, kg m
-3
d
-1
taxa de utilização de nitrogênio amoniacal, U
taxa volumétrica nitrogenada, Cv
taxa volumétrica carbonácea, Cv
Figura 5.16 –
Relação das taxas volumétricas, nitrogenada e carbonácea, com a taxa de
utilização do nitrogênio amoniacal para os quatro regimes operacionais.
Depreende-se, portanto, da Figura 5.16 que a Cv nitrogenada foi similar para todos
os regimes estudados. No caso da Cv carbonácea, os regimes 2, 3 e 4 apresentaram
valores próximos. Já o regime 1 operou com a taxa volumétrica, relativa à matéria
orgânica, acima do valor médio dos demais regimes (aproximadamente 0,5 kg m
-3
d
-1
superior), diferença esta suficiente para afetar negativamente o processo de nitrificação,
como pode ser observado pelo valor de U inferior ao dos regimes 2 e 3. Contudo, a
concentração salina de 12 g Cl
-
L
-1
, aplicada ao biorreator, mostrou ser a responsável pelo
maior efeito inibitório sobre a atividade microbiana nitrificante, visto que a matéria
orgânica não teve efeito preponderante nesta condição.
115
5.4 Testes cinéticos conduzidos no MBBR
Os ensaios cinéticos de conversão biológica da amônia e do nitrito, e consequente
formação do nitrato, foram conduzidos em triplicata nos quatro regimes operacionais
investigados com o intuito de observar a influência da salinidade na velocidade de
consumo dos substratos.
A Tabela 5.8 apresenta os valores médios e seus respectivos desvios padrão,
obtidos para as substâncias nitrogenadas envolvidas no processo da nitrificação
convencional nos tempos inicial e final (0 e 10 h) dos ensaios cinéticos realizados, assim
como a eficiência de remoção (conversão) alcançada para a amônia.
Tabela 5.8 –
Resumo dos resultados médios referentes à nitrificação, obtidos durante os
ensaios cinéticos realizados nos quatro regimes operacionais investigados.
Cl
-1
N-NH
3
(mg L
-1
) N-NO
-
2
(mg L
-1
) N-NO
-
3
(mg L
-1
)
(g L
-1
) Inicial Final
Remoção
(%)
Inicial Final Inicial Final
0,05 98 ± 6 32 ± 5 68 ± 6 1,0 ± 0,2 2,9 ± 0,2 5 ± 2 63 ± 6
3,0 113 ± 5 2 ± 1 98 ± 2 0,0 0,0 7 ± 1 93 ± 4
6,0 106 ± 2 25 ± 2 77 ± 7 3,2 ± 0,4 2,1 ± 0,2 8 ± 2 83 ± 1
12 111 ± 4 87 ± 7 22 ± 4 0,2 ± 0,02 0,2 ± 0,04 14 ± 1 35 ± 5
A Figura 5.17 expressa e permite comparar graficamente as curvas cinéticas
obtidas para amônia, nitrito e nitrato, respectivamente, durante o período de 10 h de teste.
Os dados apresentados são referentes aos valores médios resultantes dos ensaios
realizados em triplicata para cada regime operacional.
116
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10
N-NH
3
, mg L
-1
Regime 1 Regime 2 Regime 3 Regime 4
-1
1
3
5
7
9
11
13
15
0 2 4 6 8 10
N-NO
2
-
, mg L
-1
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10
tempo, horas
N-NO
3
-
, mg L
-1
Figura 5.17 –
Comparação dos perfis de variação da concentração de amônia (A), nitrito
(B) e nitrato (C), obtidos durante os ensaios cinéticos realizados nos quatro regimes
operacionais estudados.
A
B
C
117
Da observação da Figura 5.17 e dos resultados apresentados na Tabela 5.8 torna-
se evidente que a condição com maior teor de sal (12 g Cl
-
L
-1
) gerou o pior desempenho
na oxidação da amônia (22% de conversão), porém, nesta condição ocorreu o menor
acúmulo de nitrito no meio reacional (Figura 5.17B), sendo que a formação de nitrato
(Figura 5.17C) menos pronunciada foi conseqüência da baixa conversão do nitrogênio
amoniacal. Estes resultados sugerem que a possível interferência da salinidade sobre a
microbiota nitrificante foi mais expressiva sobre a atividade das AOB do que sobre a
atividade das NOB.
Infere-se do perfil apresentado para o nitrito (Figura 5.17B), que a condição salina
de 3 g Cl
-
L
-1
favoreceu a atividade das AOB em relação às NOB, promovendo maior
acúmulo de nitrito no meio reacional. Artigos reportados na literatura relatam que a adição
de sal em concentrações de até 5,0 g Cl
-
L
-1
favoreceram a taxa de nitrificação, tendo sido
este efeito associado ao possível estímulo que os íons cloreto proporcionaram na
atividade da microbiota nitrificante envolvida (HAMODA e AL-ATTAR, 1995, CHEN et al.,
2003).
Observa-se que as curvas que representam amônia e nitrito nos regimes 1 e 3,
conforme apresentadas na Figura 5.17A e B, mostram valores muito próximos de
decaimento da amônia e de acúmulo do nitrito, porém, com perfis distintos para o nitrito.
Como foi observada maior formação do nitrato no regime 3, quando comparada com o
regime 1 (Figura 5.17C), infere-se que o incremento da salinidade no meio reacional para
6 g Cl
-
L
-1
foi menos deletério para as NOB do que a conjunção de fatores como a baixa
concentração de íons cloreto (0,05 g Cl
-
L
-1
), porém, com maior influência da matéria
orgânica, características do regime 1. O desempenho na conversão da amônia, conforme
apresentado na Tabela 5.8, com 68 e 77% de remoção média para os regimes 1 e 3,
respectivamente, também sugere ligeira melhora na atividade das AOB na condição de 6
g Cl
-
L
-1
em relação a de 0,05 g Cl
-
L
-1
.
As curvas que representam o regime 2 na Figura 5.17, mostram que esta foi a
melhor condição operacional para a atividade da comunidade microbiana nitrificante,
resultando no ótimo desempenho da conversão de amônia (98% de eficiência média).
118
CHEN et al. (2003) observaram que 10 g Cl
-
L
-1
foi o ponto crítico para a
nitrificação em experimentos com biomassa em suspensão, embora seus resultados
mostrem que a partir de 5 g Cl
-
L
-1
ocorreu o declínio acentuado e descendente na
atividade dos micro-organismos nitrificantes até 15 g Cl
-
L
-1
. Na compilação da literatura
realizada por estes autores são citados dois trabalhos com resultados similares. YU et al.
(2001) apud CHEN et al. (2003) reportaram que variações no teor de cloreto de 3,5 g Cl
-
L
-1
para 6 g Cl
-
L
-1
causaram grande interferência no processo de nitrificação em duas
unidades de tratamento de esgoto em Hong Kong. SHEHADEH (1997) apud CHEN et al.
(2003) apresentou resultados relativos a um sistema nitrificante em suspensão e mostrou
que o nível máximo de tolerância ao sal alcançado pelos micro-organismos envolvidos foi
de 6,5 g Cl
-
L
-1
. A comparação destes resultados com aqueles obtidos no presente
trabalho sugere que a biomassa aderida pode ter promovido melhores condições de
adaptação para a comunidade microbiana nitrificante, quando comparada à biomassa em
suspensão, para teores de salinidade até 6 g Cl
-
L
-1
.
As Figuras 5.18 e 5.19 apresentam, respectivamente, os valores médios do pH e
do OD obtidos durante os testes cinéticos realizados nas quatro condições operacionais
investigadas. A temperatura não teve influência significativa sob estes ensaios porque
todos foram realizados sob a mesma condição, em torno de 24°C.
6
7
8
9
0 2 4 6 8 10
tempo, horas
pH
Regime 1 Regime 2 Regime 3 Regime 4
Figura 5.18 –
Comparação dos perfis de pH obtidos durante os ensaios cinéticos
realizados nos quatro regimes operacionais estudados.
119
O perfil do pH observado nas curvas da Figura 5.18 mostra que em nenhuma das
quatro situações apresentadas ocorreu limitação da nitrificação por conta do abaixamento
do pH, o qual esteve com exceção de um ponto, sempre acima de 7,0. O regime 4
apresentou o perfil com menor flutuação durante os ensaios devido ao menor
desempenho alcançado para a conversão do nitrogênio amoniacal.
0
2
4
6
8
0 2 4 6 8 10
OD, mg L
-1
tempo, horas
Regime 1 Regime 2 Regime 3 Regime 4
Figura 5.19 –
Comparação dos perfis de OD obtidos durante os ensaios cinéticos
realizados nos quatro regimes operacionais estudados.
No que se refere ao OD medido durante os ensaios cinéticos, é possível observar
na Figura 5.19 que os regimes 1, 3 e 4 apresentaram perfil similar em relação ao
consumo do oxigênio para a conversão de amônia e nitrito, com valores de OD
ligeiramente abaixo da sua concentração de saturação na água para a temperatura do
meio (~24°C). O perfil de OD resultante dos ensaios no regime 2 destoa dos demais,
porém está condizente com a intensa atividade nitrificante desenvolvida nesta condição
operacional (3 g Cl
-
L
-1
), observada principalmente nas primeiras 6 h dos testes. Mesmo
tendo alcançado valores de OD menores do que 1,0 mg L
-1
, aparentemente, não ocorreu
inibição das AOB. O acúmulo de nitrito nestes ensaios talvez possa estar associado à
inibição das NOB por menor disponibilidade de oxigênio no meio reacional. TOKUTOMI
(2004) observou em seus experimentos que concentrações de OD abaixo de 1,0 mg L
-1
provavelmente induziram o domínio das AOB em relação às NOB. SINHA e
ANNACHHATRE (2007) consideraram a possibilidade da inibição das NOB pelo controle
120
do teor de OD (entre 0,5 e 1 mg L
-1
) muito atrativa, principalmente pela economia de
energia e facilidade de controle operacional.
O balanço do nitrogênio para os ensaios cinéticos realizados, levando em
consideração as formas nitrogenadas de amônia, nitrito e nitrato, está representado
graficamente na Figura 5.20. Observa-se que os regimes 1 e 2 apresentaram maior perda
de nitrogênio entre o início e o final dos testes (0 e 12 h), e que nos regimes 3 e 4, com as
maiores concentrações de cloreto, esta perda foi menos pronunciada. Esta constatação
poderia sugerir que a perda de nitrogênio estaria associada de alguma maneira à
concentração salina do meio reacional, porém a influência do sal neste balanço é a
consideração menos provável. Primeiramente deve-se chamar a atenção para a
dificuldade inerente à nitrificação quando do fechamento do seu balanço de nitrogênio,
pois, conforme consta da literatura, podem existir outras formas de compostos
nitrogenados, além de amônia, nitrito e nitrato, envolvidos neste processo e que não são,
normalmente, quantificadas. Outra questão está associada à necessidade de diluição das
amostras para a quantificação destas substâncias, que inevitavelmente agrega erros,
além das diferentes metodologias utilizadas para quantificar o nitrogênio amoniacal
(espectrofotometria) e o nitrogênio na forma de nitrito e nitrato (cromatografia iônica).
Existe ainda a possibilidade da ocorrência da nitrificação e desnitrificação simultâneas
(SND), o que justificaria as perdas pela formação de N
2
, mas sua ocorrência é pouco
provável porque as condições operacionais dos experimentos realizados não foram
propícias para promover a SND, mesmo tendo os regimes 1 e 2 apresentado biofilmes
espessos. Portanto, na comparação dos 2 primeiros regimes operacionais com os 2
últimos, as evidências apontam no sentido de que a maior perda de nitrogênio esteve
associada ao crescimento mais efetivo do biofilme nos regimes iniciais, que teriam maior
demanda pelo nitrogênio disponível no meio reacional por conta do consumo assimilatório
do mesmo.
121
Regime 1
0
20
40
60
80
100
120
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12
tempo, horas
Nitrogênio, mg L
-1
nitrato
nitrito
amônia
Regime 2
0,0
20,0
40,0
60,0
80,0
100,0
120,0
140,0
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 12
tempo, horas
Nitrogênio, mg L
-1
nitrato
nitrito
amônia
Regime 3
0
20
40
60
80
100
120
140
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
tempo, horas
Nitrogênio, mg L
-1
nitrato
nitrito
amônia
Regime 4
0
20
40
60
80
100
120
140
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
tempo, horas
Nitrogênio, mg L
-1
nitrato
nitrito
amônia
Figura 5.20 –
Ilustração gráfica do balanço de nitrogênio para os ensaios cinéticos realizados nos quatro regimes operacionais
estudados.
122
Conforme estudos realizados por SAWAITTAYOTHIN e POLPRASERT (2007), o
balanço de massa para o nitrogênio em um sistema de tratamento de efluentes mostrou
que cerca de 90% da entrada de nitrogênio total foi metabolizado pela biomassa
nitrificante e que aproximadamente 8% desapareceu. Os autores atribuíram o fato à
possibilidade de outras reações microbianas, bem como adsorção e volatilização que
podem ocorrer em sistemas deste tipo.
A verificação da constante influência da matéria orgânica associada ao efluente no
processo de nitrificação durante o trabalho levou a investigar, pela aplicação dos ensaios
cinéticos, qual seria a contribuição das substâncias orgânicas na taxa de oxidação da
amônia. Com este intuito, foram preparadas bateladas do efluente industrial com diluições
de 25 e 50% (com água da rede) para a realização, em triplicata, dos testes cinéticos.
Para a discussão destes resultados será assumida a seguinte nomenclatura para as
bateladas de efluente utilizadas: i) efluente industrial diluído com 25% de água (EI75); ii)
efluente industrial diluído com 50% de água (EI50). Estes testes foram realizados durante
o terceiro regime operacional e, portanto, sob as mesmas condições operacionais
aplicadas ao mesmo (6 g Cl
-
L
-1
). Os ensaios realizados com o efluente diluído serão
comparados com o ensaio, previamente apresentado, realizado durante o regime 3 sem
diluição do efluente (100% de efluente industrial) que será denominado EI100.
A Tabela 5.9 apresenta os valores médios e respectivos desvios padrão, obtidos
para o nitrogênio na forma de amônia, nitrito e nitrato nos tempos inicial e final (0 e 10 h)
dos ensaios cinéticos realizados para EI50, EI75 e EI100, assim como a eficiência de
remoção (conversão) alcançada para a amônia nos três casos.
Tabela 5.9 –
Resumo dos resultados médios referentes à nitrificação, obtidos nos ensaios
cinéticos realizados no terceiro regime operacional com diferentes diluições do efluente
industrial.
N-NH
3
(mg L
-1
) N-NO
-
2
(mg L
-1
) N-NO
-
3
(mg L
-1
)
Afluente
Inicial Final
Remoção
(%)
Inicial Final Inicial Final
EI100
106 ± 2 25 ± 2
77 ± 1 3 ± 0,4 2 ± 0,2 8 ± 2 83 ± 1
EI75
100 ± 1 9 ± 3 91 ± 3 3 ± 0,3 2 ± 0,3 5 ± 2 86 ± 3
EI50
88 ± 6 3 ± 1 97 ± 3 7 ± 3 0 4 ± 3 84 ± 5
123
A Figura 5.21 expressa e permite comparar graficamente as curvas cinéticas
obtidas para amônia, nitrito e nitrato, na condição de 6,0 g Cl
-
L
-1
, com diferentes teores
de efluente industrial.
0
20
40
60
80
100
120
0 2 4 6 8 10
N-NH
3
, mg L
-1
EI100 EI75 EI50
0
4
8
12
16
20
24
0 2 4 6 8 10
N-NO
2
-
, mg L
-1
0
20
40
60
80
100
0 2 4 6 8 10
tempo, horas
N-NO
3
-
, mg L
-1
Figura 5.21 –
Comparação dos perfis de variação de amônia (A), de nitrito (B) e de nitrato
(C) obtidos durante os ensaios cinéticos realizados no regime 3 para EI100, EI75 e EI50.
A
B
C
124
Da Figura 5.21 infere-se que a maior diluição do afluente bruto (50%) favoreceu a
atividade das AOB em relação às NOB, evidenciado pelo maior acúmulo de nitrito (Figura
5.21B) e melhor desempenho na conversão do nitrogênio amoniacal (97%).
A Tabela 5.10 apresenta os valores médios e respectivos desvios padrão, obtidos
para a DQOdissolvida e o COD nos tempos inicial e final (0 e 10 h) dos ensaios cinéticos
apresentados na Figura 5.21. A razão DQOdissolvida/COD também está representada na
Tabela 5.10 para os dados referentes ao início e ao final dos testes.
Tabela 5.10 –
Resultados médios, referentes à matéria orgânica, obtidos nos ensaios
cinéticos realizados no terceiro regime operacional com diferentes diluições do efluente
industrial.
DQO
dissolvida
(mg L
-1
) COD (mg L
-1
) DQO
d
/COD
Efluente
Inicial Final
Remoção
(%)
Inicial Final Inicial Final
EI100
180 ± 9
154 ± 4
14 ± 1 49 ± 4 48 ± 4 3,6 3,2
EI75
142 ± 8
125 ± 3
12 ± 3 35 ± 2 35 ± 2 4,0 3,5
EI50
103 ± 4
87 ± 2 15 ± 3 24 ± 1 24 ± 2 4,2 3,6
As evidências experimentais apontam que a extensão e a velocidade da
biodegradação da amônia foram afetadas negativamente nas condições de maior teor de
matéria orgânica. A queda no desempenho da remoção de N-NH
3
foi de 97 para 77%
quando se alterou a diluição do efluente de 50% para 0%, sendo que este desempenho
não mostrou diferença considerável (91 e 97%) entre as condições EI75 e EI50,
respectivamente. METCALF & EDDY (2003) com base em dados da literatura mostraram,
para sistemas com biomassa aderida, que a taxa de nitrificação seria afetada pela razão
DBO/NTK (matéria orgânica em termos da demanda bioquímica de oxigênio e nitrogênio
total Kjeldahl), de forma que quanto maior fosse esta razão menor seria a taxa de
nitrificação.
Embora a diferença nos teores de DQO e COD no efluente inicial, para as três
situações investigadas, não seja tão significativa, dentre os compostos orgânicos
presentes no afluente bruto podem existir substâncias inibidoras da atividade biológica
nitrificante e que, portanto, a diluição das mesmas diminuiria este efeito inibitório.
125
Vale ressaltar que pela comparação dos perfis de OD obtidos nestes ensaios, a
condição referente à diluição de 50% do efluente industrial (EI50) foi a que apresentou o
consumo mais efetivo de oxigênio durante os testes, conforme pode ser visto na Figura
5.22. Embora neste caso os valores de OD não tenham sido inferiores a 2 mg L
-1
, pode-se
sugerir que, assim como proposto para o regime 2, ocorreu certa inibição na atividade das
NOB por limitação de oxigênio e, consequentemente, acúmulo de nitrito, conforme
observado na Figura 5.21B. O comportamento do pH nas três condições propostas não
mostrou diferença significativa e, portanto, não será apresentado.
0
2
4
6
8
0 2 4 6 8 10
OD, mg L
-1
tempo, horas
EI100 EI75 EI50
Figura 5.22 –
Comparação dos perfis de OD obtidos durante os ensaios cinéticos
realizados para EI100, EI75 e EI50.
Para os resultados obtidos nos ensaios cinéticos foram propostas expressões que
os representassem matematicamente, levando em consideração a formação e a oxidação
do nitrito, conforme apresentadas nas equações (1), (2) e (3).
126
−
−
−
−
−−
+
⋅⋅
=
+
⋅
−
+
⋅⋅
=
+
⋅−
=
2
2
3
2
2
3
3
2
3
33
NO
b
NO
N
NO
NO
b
NO
N
NH
a
NH
A
NO
NH
a
NH
A
NH
SK
Skb
dt
dS
SK
Sk
SK
Ska
dt
dS
SK
Sk
dt
dS
Os parâmetros acima apresentados são definidos como segue:
3
NH
S
é a concentração de amônia no meio reacional, mg L
-1
;
k
A
é a constante de velocidade específica de consumo da amônia, mg L
-1
d
-1
;
K
a
é
a constante de saturação da amônia, mg L
-1
;
−
2
NO
S
é a concentração de nitrito no meio reacional, mg L
-1
;
k
N
é a constante de velocidade especifica de consumo do nitrito, mg L
-1
d
-1
;
K
b
é
a constante de saturação do nitrato, mg L
-1
;
−
3
NO
S
é a concentração de nitrato no meio reacional, mg L
-1
;
a
e
b
são os coeficientes estequiométricos das reações de oxidação.
Embora se observe na literatura grande número de modelos propostos para
representar a oxidação da amônia, indiferente do processo utilizado para tal, é facilmente
identificável que não existe consenso no sentido de quais são as variáveis relevantes para
as equações cinéticas. Muitas vezes, modelos conceitualmente interessantes são
propostos, porém a demasiada complexidade dos mesmos, sobretudo pela dificuldade de
determinação de alguns de seus parâmetros, os torna inviáveis ou de difícil aplicação.
Por outro lado, existe certa tendência em simplificar os modelos típicos para a
nitrificação convencional em uma única etapa, influenciado pelos modelos globais das
estações de tratamento de esgoto sanitário, onde o acúmulo de nitrito é considerado
insignificante. No entanto, em algumas situações específicas como a presença de
substâncias inibidoras do processo, instabilidade operacional ou no tratamento de
Eq. (3)
Eq. (2)
Eq. (1)
127
efluentes industriais, o nitrito pode adquirir importante papel nas conversões microbianas
(SIN et al., 2008).
Para a maioria dos modelos que envolvem biorreatores, as expressões
apresentadas incluem uma variável, muito relevante, que se refere ao crescimento
microbiano. No entanto, existem limitações que dificilmente são consideradas como, por
exemplo, comunidades típicas de sistemas de lodos ativados nas quais os grupos
bacterianos autotróficos são minoria na biomassa presente e são quantificados
globalmente ou, mais especificamente, em consórcios microbianos prioritariamente
nitrificantes não ocorre distinção entre a biomassa que oxida amônia ou nitrito, sendo
considerado como um parâmetro global. Assim, a dificuldade em se determinar de forma
precisa e confiável parâmetros como a concentração microbiana ativa e real, acaba
limitando o alcance e a utilização dos modelos propostos (SANT`ANNA JR, no prelo). No
presente trabalho optou-se pela proposta de um modelo bastante simplificado, baseado
somente no consumo dos substratos de interesse, sendo parâmetros factíveis de serem
medidos e com bom grau de confiança.
Portanto, a partir do tratamento matemático dos dados experimentais obtidos em
conjunto com as expressões propostas e utilizando o software matemático Mathcad*
versão 14.0, foi possível obter os valores das constantes de velocidade específica de
consumo dos substratos (
k
A
e
k
N
) assim como suas constantes de saturação (
K
a
e
K
b
).
Cabe informar que a escolha dos parâmetros foi feita por inspeção visual, visando
selecionar aqueles que levaram ao melhor ajuste dos dados experimentais. A Tabela 5.11
apresenta os parâmetros obtidos matematicamente.
128
Tabela 5.11 –
Parâmetros cinéticos obtidos a partir do tratamento matemático dos dados
experimentais com o modelo proposto.
Cl
-1
Parâmetros Cinéticos
(g L
-1
)
k
A
(mg L
-1
)
K
a
(mg L
-1
d
-1
)
k
N
(mg L
-1
)
K
b
(mg L
-1
d
-1
)
0,05 14 60 21 1,2
3,0 40 80 40 6,0
6,0 (EI100) 19,5 60 54 11
6,0 (EI75) 19,5 48 40 10
6,0 (EI50) 38 84 54 50
12 4,0 40 11 0,4
Vericou-se no processo de ajuste que havia vários conjuntos de parâmetros (
k
e
K
)
que podiam levar a um resultado adequado. Portanto, além da instabilidade verificada no
processo de nitrificação, esta questão dificultou a interpretação dos resultados. Não é
possível observar da Tabela 5.11 uma tendência clara, a não ser pela queda significativa
de todos os parâmetros na condição de 12 g Cl
-
L
-1
. Aparentemente, a variação da
velocidade específica (
k
) de consumo dos substratos foi coerente com a discussão dos
resultados até o momento, sendo que apresentou para a oxidação da amônia valores de
k
A
iguais a 40 e 38 mg L
-1
d
-1
para o regime 2 e para o teste EI50, respectivamente. Já a
velocidade específica de consumo do nitrito não apresentou grandes alterações dentre as
condições investigadas, a não ser para os regimes 1 e 4. Contudo, a avaliação individual
de
k
e
K
não é muito assertiva e ademais as constantes de saturação não foram
sensíveis às mudanças de comportamento da nitrificação. As Figuras 5.23, 5.24 e 5.25
ilustram graficamente os resultados referentes à contrastação do modelo com os dados
experimentais para os regimes 1, 2, 3 e 4 e para as condições EI50 e EI75,
respectivamente. Os dados apresentados são os valores médios obtidos das triplicatas.
129
Regime 1
(0,05 g Cl
-
L
-1
)
-5
15
35
55
75
95
115
0 2 4 6 8 10
tempo, horas
N-NH
3
, N-NO
2
-
, N-NO
3
-
(mg L
-1
)
Amônia Exp. Nitrito Exp. Nitrato Exp.
Amônia Mod. Nitrito Mod. Nitrato Mod.
Regime 2
(3,0 g Cl
-
L
-1
)
-5
15
35
55
75
95
115
0 2 4 6 8 10
tempo, horas
N-NH
3
, N-NO
2
-
, N-NO
3
-
(mg L
-1
)
Amônia Exp. Nitrito Exp. Nitrato Exp.
Amônia Mod. Nitrito Mod. Nitrato Mod.
Figura 5.23 –
Verificação do modelo proposto (linha cheia) com os dados experimentais
obtidos dos ensaios cinéticos realizados nos regimes operacionais 1 e 2,
com 0,05 e 3 g Cl
-
L
-1
, respectivamente.
130
Regime 3 (EI100)
(6,0 g Cl
-
L
-1
)
-5
15
35
55
75
95
115
0 2 4 6 8 10
tempo, horas
N-NH
3
, N-NO
2
-
,
N-NO
3
-
(mg L
-1
)
Amônia Exp. Nitrito Exp. Nitrato Exp.
Amônia Mod. Nitrito Mod. Nitrato Mod.
Regime 4
(12,0 g Cl
-
L
-1
)
-5
15
35
55
75
95
115
0 2 4 6 8 10
tempo, h
N-NH
3
, N-NO
2
-
, N-NO
3
-
(mg L
-1
)
Amônia Exp. Nitrito Exp. Nitrato Exp.
Amônia Mod. Nitrito Mod. Nitrato Mod.
Figura 5.24 –
Verificação do modelo proposto (linha cheia) com os dados experimentais
obtidos dos ensaios cinéticos realizados nos regimes operacionais 3 e 4,
com 6 e 12 g Cl
-
L
-1
, respectivamente.
131
EI75
(6,0 g Cl
-
L
-1
)
-5
15
35
55
75
95
115
0 2 4 6 8 10 12
tempo, horas
N-NH
3
, N-NO
2
-
, N-NO
3
-
(mg L
-1
)
Amônia Exp. Nitrito Exp. Nitrato Exp.
Amônia Mod. Nitrito Mod. Nitrato Mod.
EI50
(6,0 g Cl
-
L
-1
)
-5
15
35
55
75
95
115
0 2 4 6 8 10 12
tempo, horas
N-NH
3
, N-NO
2
-
, N-NO
3
-
(mg L
-1
)
Amônia Exp. Nitrito Exp. Nitrato Exp.
Amônia Mod. Nitrito Mod. Nitrato Mod.
Figura 5.25 –
Verificação do modelo proposto (linha cheia) com os dados experimentais
obtidos dos ensaios cinéticos realizados com o efluente industrial diluído (EI75 e EI50)
durante o terceiro regime operacional (6 g Cl
-
L
-1
).
132
Da observação das Figuras 5.23, 5.24 e 5.25 depreende-se que as curvas obtidas,
a despeito de todas as considerações realizadas, mostraram um ajuste razoável dos
dados experimentais pelo modelo proposto. Este fato leva à indicação de que este modelo
pode ser utilizado para a descrição do processo de nitrificação no MBBR em questão.
A comparação de parâmetros cinéticos para processos biológicos não é uma
tarefa fácil de ser feita. Em geral, para cada tipo de sistema, deve-se obter os parâmetros
específicos que irão depender das características do reator, das características do
substrato e da biomassa. No caso de biorreatores que empregam biomassa aderida, a
comparação destes valores é ainda mais prejudicada, pois as diferentes possibilidades de
expressar os parâmetros envolvidos no processo (por unidade de área, por volume de
líquido, por biomassa aderida) e as incertezas da maneira como estas formas são obtidas,
praticamente inviabiliza o confronto dos dados disponíveis na literatura.
5.5 Experimentos de desnitrificação em biorreator de leito móvel
O afluente da unidade de desnitrificação foi o efluente final do MBBR sendo o
mesmo caracterizado conforme consta da Tabela 5.12. A razão COD/N-NO
-
3
igual a 4 foi
escolhida arbitrariamente no início da operação do sistema. A fonte externa de carbono
utilizada foi o etanol.
Tabela 5.12 –
Caracterização do efluente (antes da adição de etanol) utilizado no sistema
proposto para a desnitrificação.
Parâmetros Média e Desvio
N-NH
3
(mg L
-1
) 29 ± 24
N-NO
3
-
(mg L
-1
) 74 ± 21
COD (mg L
-1
) 55 ± 9
SST (mg L
-1
) 21 ± 4
SSV (mg L
-1
) 14 ± 4
pH 7,6 ± 0,4
133
Conforme apresentado no Capítulo 4 (seção 4.5.2), o crescimento da microbiota
desnitrificante foi acompanhado durante os três meses de operação desta unidade. A
Figura 5.26 expressa graficamente os valores médios obtidos para a biomassa aderida
durante este período.
0
200
400
600
800
1000
1200
1400
5 20 35 50 57 67 77 85
tempo, dias
ST e SV, mg L
-1
0,0
0,2
0,4
0,6
0,8
1,0
razão SV/ST
sólidos totais
sólidos voláteis
SV/ST
Figura 5.26 –
Acompanhamento do teor de sólidos totais e voláteis e da razão SV/ST
referente ao biofilme desnitrificante, durante 90 dias de operação.
Da Figura 5.26 é possível observar que a partir da adição de etanol ao sistema,
com o intuito de favorecer a desnitrificação, ocorreu o crescimento rápido da biomassa,
passando do patamar dos 150 mg L
-1
de sólidos voláteis em média, para em torno de
1.150 mg SV L
-1
após 50 dias do início da operação. A razão SV/ST mostrou que a porção
de SV em relação aos ST também aumentou na mesma direção, apresentando-se numa
faixa que variou entre 0,60 – 0,88.
Este desenvolvimento relativamente rápido da biomassa pode estar associado ao
excesso de etanol adicionado ao biorreator. A partir do primeiro ensaio cinético realizado
para este sistema detectou-se que o nitrato presente no efluente de alimentação estava
sendo rapidamente consumido, e que grande parte da fonte externa de carbono estava se
acumulando no meio reacional. A Figura 5.27 apresenta os valores obtidos para
nitrogênio como nitrato e para os compostos orgânicos dissolvidos como COD, a partir de
134
um ensaio cinético realizado no sistema proposto para avaliar o processo de
desnitrificação.
-2
8
18
28
38
48
58
68
78
88
98
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10
tempo, horas
N-NO
3
-
, mg L
-1
0
50
100
150
200
250
300
350
400
450
COD, mg L
-1
N como nitrato COD
Figura 5.27 –
Perfil de variação das concentrações de nitrato e carbono orgânico
dissolvido durante um ensaio cinético de 10 h para avaliar a desnitrificação.
Da Figura 5.27 verifica-se que em três horas de reação praticamente todo o nitrato
(97%) presente no efluente já havia sido removido e que apenas 19% do COD total havia
sido consumido. A partir deste resultado foi calculada nova razão COD/N-NO
3
-
que
resultou no valor aproximado igual a 1, desde então se adicionou ao biorreator
desnitrificante quantidade de etanol equivalente a este novo valor e não se utilizou mais a
razão COD/N-NO
3
-
igual a 4, como admitida inicialmente.
Após uma semana desta alteração ter sido realizada foi dado proseguimento a
novos ensaios cinéticos. A Figura 5.28 ilustra o perfil dos valores obtidos e seus
respectivos desvios padrão para estes novos ensaios, os quais foram realizados em
triplicata. Os valores de nitrito durante os testes ficaram abaixo do nível de detecção do
método utilizado para a sua determinação no cromatógrafo de íons.
Oxigênio dissolvido e pH foram determinados esporadicamente, sendo o OD no
interior do biorreator e o pH no efluente final. Os valores observados para OD estiveram
135
sempre próximos de zero, condição ideal para se alcançar a desnitrificação. No que se
refere ao pH, os valores determinados no efluente ao final da batelada variaram em torno
de 8,4 e 8,6, evidenciando a geração dos íons hidroxila no meio líquido.
-2
8
18
28
38
48
58
0 1 2 3 4 5 6 7
tempo, horas
N-NO
3
-
, mg L
-1
0
20
40
60
80
100
120
140
COD, mg L
-1
N como nitrato COD
Figura 5.28 –
Perfil de variação das concentrações de nitrato e carbono orgânico
dissolvido durante 7 h de ensaios com a razão COD/N-NO
3
-
igual a 1.
Para esta nova condição da razão C/N, como é possível observar na Figura 5.28,
foi alcançada ótima redução (88%) do nitrato em torno de 3 h de reação. Porém, neste
caso o consumo de carbono foi superior em aproximadamente 20 pontos percentuais
quando comparado ao primeiro ensaio cinético, sendo que grande parte do COD não
utilizado se deve provavelmente aos compostos orgânicos recalcitrantes oriundos do
efluente industrial.
DUPLA et al. (2006) avaliando o desempenho de diferentes biomídias na
desnitrificação de um efluente sintético salino (28 g L
-1
), observaram 75% de remoção de
NOx para cargas volumétricas na faixa de 0,33 – 0,85 kg N-NO
3
-
m
-3
d
-1
. O MBBR utilizado
teve 30% do seu volume preenchido com as biomídias testadas e operou em modo
contínuo com tempo de retenção hidráulica de 2 h. Estes resultados mostraram-se
próximos àqueles obtidos para a desnitrificação no presente trabalho, porém, os autores
utilizaram metanol como fonte externa de carbono e razão C/N igual a 4,3.
136
RUSTEN et al. (2006) em seus experimentos com MBBR para promover a
desnitrificação constataram que a utilização do etanol dobrou as taxas de desnitrificação,
quando comparado com o metanol nas mesmas condições experimentais. Os autores
também relataram que o uso do metanol como fonte de carbono é mais empregado na
desnitrificação por conta do seu baixo custo, porém, a partida de processos
desnitrificantes com este substrato é mais lenta por conta de poucas bactérias terem a
capacidade de utilizá-lo como fonte de carbono.
Portanto, o objetivo inicial de investigar a possível desnitrificacão do efluente
tratado no MBBR foi alcançado e em um tempo relativamente baixo se comparado com o
processo de nitrificação. Infere-se que a condição salina de 12 g Cl
-
L
-1
não resultou em
inibição evidente da comunidade microbiana desnitrificante e que a razão COD/N-NO
3
-
igual a 1 foi adequada para alcançar a desnitrificação utilizando etanol como fonte externa
de carbono no sistema proposto.
5.6 Caracterização e quantificação do biofilme
Biofilmes são sistemas muito complexos que consistem de células microbianas e
colônias embebidas em uma matriz polimérica, cuja estrutura e composição são função
da idade do biofilme e das condições ambientais (CAMMAROTA, 1998).
Embora existam relatos de que, há mais de um século, a adesão microbiana já
causasse interesse e que desde a década de 70 (COSTERTON et al., 1995) os estudos
sobre os biofilmes se intensificaram, ainda hoje existem limitações para quantificar e
caracterizar a biomassa aderida.
A maior dificuldade neste âmbito está em obter a biomassa sem grandes perdas
ou prejuízo da sua estrutura e/ou do suporte. Este aspecto torna a investigação do
crescimento microbiano aderido um desafio. Em geral, dependendo do tipo de análise ou
determinação a ser realizada se empregam diferentes métodos de obtenção da biomassa.
Quando se trata de quantificar a biomassa de maneira global, dois parâmetros são
comumente utilizados: peso seco ou sólidos voláteis. Estas são técnicas simples e
137
consolidadas para a biomassa em suspensão, porém, para biofilmes não há um
procedimento padrão para a sua utilização e, além disso, por estas técnicas não é
possível fazer distinção entre microrganismos ativos, massa inerte, exopolímeros e
substratos adsorvidos.
Neste contexto uma alternativa é a determinação de proteínas e polissacarídeos.
No entanto, estas substâncias estão presentes no interior das células microbianas e na
sua matriz extracelular, sendo conhecidas como exopolímeros. Para avaliar apenas as
substâncias presentes na matriz extracelular da biomassa são requeridas etapas
preliminares de extração e coleta dos exopolímeros para proceder aos ensaios analíticos.
A dificuldade destes métodos está em garantir a extração dos componentes de interesse
sem romper a célula microbiana. Muitos são os procedimentos de extração propostos na
literatura, no entanto, a eficácia de cada um deles não é satisfatoriamente comprovada.
Contudo, as pesquisas e informações referentes à quantificação e caracterização
de sistemas com biofilme vêm crescendo, porém, ainda mantêm as incertezas inerentes
aos métodos aplicados. Atualmente, com o desenvolvimento das técnicas de microscopia
e de biologia molecular, muitas são as alternativas de caracterização deste tipo de
biomassa. No entanto, essas técnicas são de custo elevado, exigem reagentes e
equipamentos de difícil acesso e muito critério na avaliação dos resultados.
5.6.1 Quantificação do biofilme pela determinação de sólidos voláteis
Para se chegar ao procedimento proposto na seção 4.6.1 do presente trabalho,
relativo ao desprendimento do biofilme aderido ao material suporte, foram necessários
aproximadamente 2 meses de testes. A partir de então se deu início à quantificação da
biomassa pela determinação dos sólidos voláteis (SV). A Figura 5.29 apresenta os
resultados obtidos em termos de sólidos totais e voláteis para a biomassa aderida em
função do tempo de operação do biorreator no período anterior ao início dos regimes
operacionais propostos (250 dias iniciais).
138
0
500
1000
1500
2000
2500
3000
3500
50 75 100 125 150 175 200 225 250
tempo, dias
ST e SV, mg L
-1
sólidos totais
sólidos voláteis
Figura 5.29 –
Acompanhamento dos teores de sólidos totais (ST) e voláteis (SV)
indicativos do crescimento do biofilme no MBBR durante os primeiros 250 dias de
operação.
Da Figura 5.29 depreende-se que até 100 dias de operação os sólidos voláteis
variaram dentro de uma estreita faixa entre 350 e 650 mg L
-1
, com incremento da porção
volátil do biofilme em relação à de sólidos totais. O crescimento da biomassa após este
período ocorreu, provavelmente, por conta da quantidade variável de matéria orgânica do
efluente industrial, que levou ao desenvolvimento das bactérias heterotróficas. O
crescimento exponencial da biomassa, a partir dos 150 dias de operação, coincidiu com o
início da implementação da etapa desnitrificante, conforme comentado previamente.
Infere-se que a adição de etanol ao sistema favoreceu o rápido crescimento da
comunidade heterotrófica presente, levando a um patamar de aproximadamente 2.900 mg
L
-1
de sólidos voláteis, representativo da biomassa aderida.
POLLARD (2006) quantificou a comunidade nitrificante em três condições distintas:
em uma unidade de lodos ativados para o tratamento de esgoto doméstico em escala real
(R1); em um biofiltro terciário alimentado com o esgoto tratado na unidade de lodos
ativados (R2); e em um biofiltro piloto alimentado com água subterrânea suplementada
com amônia e fosfato (R3). Para R1, no qual a nitrificação estava em segundo plano, foi
determinado que as bactérias nitrificantes autotróficas presentes perfaziam apenas 2 ±
139
1,5% da comunidade microbiana total, e 31 ± 4% para R2 e 63 ± 22% para R3. Estes
resultados mostraram a grande influência das substâncias orgânicas na dinâmica da
microbiota heterotrófica e autotrófica nos sistemas de tratamento de efluentes.
NOGUEIRA et al. (2002) quando investigaram a remoção combinada de nitrogênio e
carbono em reator com biofilme, sob diferentes tempos de retenção hidráulica,
constataram a formação de espessa camada de heterotróficos sobre o biofilme autotrófico.
Esta ocorrência, muito provavelmente, levou à limitação da atividade nitrificante por falta
de oxigênio e conseqüentes perdas no desempenho da nitrificação.
MARTIN et al. (2007) estudaram a remoção de nutrientes (nitrogênio e fósforo) em
biorreatores híbridos ligados em série. No primeiro foi utilizada argila como material
suporte e no segundo biorreator, carbono ativado granular. Os pesquisadores
quantificaram a biomassa aderida por determinações de SV e ST e utilizaram ultra-som
para efetuar o desprendimento da mesma dos suportes. Embora tenham feito uso da
mesma metodologia utilizada neste trabalho para quantificar o biofilme, os resultados não
foram apresentados. Os autores justificaram a ausência destes pela dificuldade de
alcançar boa reprodutibilidade dos resultados e, por outro foco, pela impossibilidade de
diferenciar comunidades microbianas presentes na biomassa.
REIS (2007) investigou o efeito de elevadas cargas orgânicas no desempenho de
um MBBR, utilizando o mesmo tipo de biomídias do presente trabalho. O efluente de
estudo foi sintético e a concentração de matéria orgânica, em termos de DQO, foi, em
média, de 700 mg L
-1
. Os resultados obtidos para a quantificação da biomassa aderida
variaram entre 2.770 e 4.590 mg L
-1
. Os valores de SV determinados pelo autor são
típicos de comunidades microbianas heterotróficas e, quando comparados aos valores
obtidos para a biomassa no presente trabalho, são superiores até mesmo ao maior
resultado individual observado.
A Figura 5.30 apresenta as variações na concentração de sólidos totais e voláteis,
respresentativas do biofilme, durante os quatro regimes operacionais investigados.
140
0
250
500
750
1000
1250
1500
1750
2000
2250
2500
250 280 310 340 370 400 430 460 490 520 550 580 610 640 670 700 730 760 790 820
tempo, dias
ST e SV, mg L
-1
sólidos totais
sólidos voláteis
12 g Cl
-
L
-1
6 g Cl
-
L
-1
3 g Cl
-
L
-1
0,05 g Cl
-
L
-1
Figura 5.30 – Acompanhamento do teor de sólidos totais e voláteis referente ao biofilme,
no MBBR, durante os quatro regimes operacionais investigados.
A Tabela 5.13 apresenta os valores médios dos resultados mostrados na Figura
5.30 para ST e SV e seus respectivos desvios padrão. Também está representada nesta
tabela a razão SV/ST. Para o cálculo dos valores médios de ST e SV no regime 2, foram
desconsiderados os dados referentes ao período de 460 a 490 dias, conforme será
discutido adiante.
Tabela 5.13 – Valores médios obtidos para sólidos totais e voláteis representativos do
biofilme durante os quatro regimes operacionais investigados.
Regimes ST* SV* Razão
operacionais
(mg L
-1
) (mg L
-1
) SV/ST
1 3.101 ± 363 2.523 ± 301 0,81 ± 0,05
2 3.166 ± 361 2.562 ± 307 0,81 ± 0,04
3 1.166 ± 293 1.000 ± 244 0,86 ± 0,08
4 1.439 ± 177 1.295 ± 194 0,90 ± 0,06
*ST e SV representados em termos de massa aderida por volume de reação
141
Na Figura 5.30 é possível observar que nos dois primeiros regimes a biomassa
aderida apresentou perfil variável. No final do segundo regime (dias 460 a 490) a queda
brusca de ST e SV ocorreu por conta do desprendimento da maior parte do biofilme. Este
material foi excluído do processo juntamente com o efluente tratado na forma de sólidos
suspensos. Neste período, restou apenas uma película de biofilme no interior das
biomídias, conforme será mostrado na Figura 5.33. A partir desta ocorrência, a biomassa
apresentou, durante 90 dias, valores de SV em média três vezes menores do que no
período anterior (em torno de 500 mg L
-1
). Na metade do terceiro regime operacional
ocorreu o crescimento mais acentuado da biomassa, passando em média de 850 mg L
-1
para 1.350 mg L
-1
. No regime 4, a biomassa apresentou perdas de sólidos voláteis
associada ao aumento da alcalinidade no meio reacional pela entrada de quantidade
inadequada de barrilha, conforme previamente relatado e manteve perfil variável até o
final do período. Sugere-se que a elevada variabilidade observada pela quantificação da
biomassa nos quatro regimes estudados não foi influenciada pelo teor salino no processo.
Depreende-se que a matéria orgânica e problemas operacionais do sistema foram os
principais fatores de interferência no crescimento microbiano.
A Figura 5.31 apresenta fotos comparativas das biomídias antes e após o
desprendimento do biofilme. Na parte externa das biomídias, devido ao cisalhamento
intenso entre as peças, o biofilme não é perceptível a olho nu, sendo visível somente na
parte interna das mesmas. Das fotos se observa que mesmo na condição de maior
crescimento microbiano (Figura 5.31A), o biofilme se mostrou bem fino, com característica
distinta dos biofilmes predominantemente heterotróficos que, em geral, são mais
espessos (REIS, 2007).
Algumas considerações podem ser feitas, no que se refere ao desprendimento do
biofilme, ocorrido no final do segundo regime operacional. Este fenômeno de
desprendimento “natural” da biomassa aderida vem sendo investigado por pesquisadores
com o mesmo interesse que se tem pelos fenômenos associados à adesão do biofilme. A
princípio, segundo CAMMAROTA (1998), o desprendimento se constitui na remoção de
grandes quantidades ou seções inteiras do biofilme e, aparentemente, é um processo
discreto que ocorre ao acaso.
142
Figura 5.31 – Fotos comparativas do biofilme aderido às biomídias antes (A) e depois (D)
do desprendimento do mesmo.
Alguns autores sugerem que as possíveis causas para este fenômeno seriam as
taxas de cisalhamento aplicadas e a espessura do biofilme, sendo que biofilmes muito
espessos poderiam causar limitações de transferência de oxigênio e de substrato,
levando ao enfraquecimento da matriz da biomassa aderida (CHOI e MORGENROTH,
2003; HORN
et al.
, 2003; TELGMANN
et al
., 2004). BELKHADIR (1986)
apud
CAMMAROTA (1998) considera, entretanto, que o desprendimento é o fim do
crescimento do biofilme, que se caracteriza pela lise celular nas camadas mais profundas
e pela destruição das células responsáveis pela fixação do biofilme à superfície.
Neste contexto, para o desprendimento da biomassa ocorrido neste trabalho
infere-se que, devido à característica do biofilme relativamente fino que se desenvolveu, a
possibilidade de limitação de oxigênio e substratos nas camadas mais profundas seria
pouco provável. Em relação ao cisalhamento, conforme já comentado, o biofilme cresceu
prioritariamente no interior das biomídias não estando exposto ao cisalhamento entre os
suportes. A hipótese da causa do desprendimento mais provável, neste caso, estaria
baseada nas considerações de BELKHADIR (1986)
apud
CAMMAROTA (1998), por se
tratar de um biofilme com mais de 2 anos de desenvolvimento, podendo ser considerado
um biofilme velho. Contudo, ainda não é satisfatoriamente compreendido que fração do
biofilme que se desprende e como este desprendimento afeta a estrutura, a estabilidade,
a ecologia microbiana e o próprio desempenho do processo biológico (ELENTER
et al
.,
2007).
A
D
143
5.6.2 Determinação do teor de polissacarídeos e proteínas associados ao
biofilme
A quantificação da biomassa em relação aos teores de polissacarídeos e proteínas
livres, ligados e totais foi realizada somente durante o período de estudo dos quatro
regimes operacionais propostos. Antes de iniciar tais determinações foram realizados
testes de extração dos exopolímeros conforme descrito na seção 4.6.2.
A Figura 5.32 e a Tabela 5.14 apresentam os valores médios e seus respectivos
desvios padrão, obtidos pela determinação dos polissacarídeos (PLS) livres, ligados e
totais, relacionados ao biofilme. Também estão apresentados nesta tabela as razões
PLS
ligados
/PLS
totais
, para os quatro regimes operacionais investigados.
0
100
200
300
400
500
600
Regime 1 Regime 2 Regime 3 Regime 4
Polissacarídeos, mg L
-1
livres ligados totais
Figura 5.32 – Resultado das concentrações de polissacarídeos livres, ligados e totais
obtidas nos quatro regimes operacionais investigados.
Observa-se da Figura 5.32 que os valores obtidos para as substâncias
denominadas como livres, embora apresentem leve tendência de diminuição do regime 1
para o 4, podem ser considerados insignificantes quando comparados aos valores
relativos aos PLS
ligados
e aos PLS
totais
.
144
Tabela 5.14 – Valores médios e seus respectivos desvios padrão obtidos para os
polissacarídeos relacionados ao biofilme nos quatro regimes operacionais estudados.
Cl
-1
PLS (mg L
-1
)
(g L
-1
) Livres Ligados Totais Ligados/Totais
0,05 23 ± 2 160 ± 35 445 ± 66 0,37 ± 0,12
3,0 13 ± 4 128 ± 10 192 ± 26 0,68 ± 0,10
6,0 7 ± 4 49 ± 16 113 ± 19 0,44 ± 0,13
12 7 ± 4 116 ± 43 192 ± 54 0,60 ± 0,08
A razão PLS
ligados
/PLS
totais
permite observar que os resultados variaram em uma
faixa razoavelmente ampla (0,37 – 0,68) sendo que: os PLS
ligados
representaram em média
37% e 44% dos PLS
totais
no primeiro e terceiro regimes operacionais, respectivamente, e
68% e 60% no segundo e quarto regimes de operação, respectivamente. Em decorrência,
sugere-se que a relação entre a concentração de PLS
ligados
e PLS
totais
associada ao
biofilme não foi diretamente influenciada pela matéria orgânica presente no meio reacional,
mas sim pelo incremento dos íons cloreto. A adição de sal no regime 2, possivelmente,
pode ter ativado algum mecanismo de proteção das células com relação ao estresse
osmótico, o que resultou na maior quantidade de PLS
ligados
em relação aos PLS
totais
. Esta
condição foi recorrente quando se dobrou a quantidade de íons cloreto no meio reacional
do terceiro para o último regime, promovendo nova reação da microbiota presente.
A Figura 5.33 e a Tabela 5.15 apresentam os valores médios e seus respectivos
desvios padrão, obtidos pela determinação das proteínas (PTN) livres, ligadas e totais,
relacionadas ao biofilme. Também estão apresentadas na Tabela 5.15 as razões
PTN
ligadas
/PTN
totais
, para os quatro regimes operacionais investigados.
145
0
200
400
600
800
1000
Regime 1 Regime 2 Regime 3 Regime 4
Proteínas, mg L
-1
livres ligadas totais
Figura 5.33 – Resultado das concentrações de proteínas livres, ligadas e totais obtidas
nos quatro regimes operacionais investigados.
Tabela 5.15 – Valores médios e seus respectivos desvios padrão obtidos para as
proteínas relacionadas ao biofilme nos quatro regimes operacionais estudados.
Cl
-1
PTN (mg L
-1
)
(g L
-1
) Livres Ligadas Totais Ligadas/Totais
0,05 71 ± 17 99 ± 26 882 ± 80 0,11 ± 0,03
3,0 27 ± 11 48 ± 19 560 ± 63 0,08 ± 0,02
6,0 7 ± 4 8 ± 5 157 ± 38 0,06 ± 0,05
12 3 ± 2 9 ± 4 291 ± 82 0,03 ± 0,01
Observa-se da Figura 5.33 que os resultados obtidos para as proteínas
denominadas como livres, embora apresentem leve perfil de queda do regime 1 para o 4,
podem ser consideradas insignificantes em relação às PTN
totais
. Da mesma forma, os
valores das PTN
ligadas
nos regimes 3 e 4 podem ser desconsiderados. Já os valores de
PTN
ligadas
nos regimes 1 e 2 podem estar associados à concentração de matéria orgânica
no meio reacional. Quando na presença de razoável quantidade de compostos orgânicos
biodegradáveis, as proteínas são mais atuantes por conta das enzimas que catalisam a
hidrólise das macromoléculas orgânicas e do material particulado. Vale ressaltar que os
regimes 1 e 2 foram caracterizados por apresentarem maior variabilidade na composição
146
orgânica do efluente, resultando inclusive em biofilmes mais densos e, que os regimes 3 e
4 trabalharam sob condições mais controladas destas substâncias.
A razão PTN
ligadas
/PTN
totais
esteve compreendida em uma faixa mais estreita (0,03
– 0,11) do que aquela obtida para os PLS, apresentando valores próximos nos dois
regimes intermediários (8% e 6% de PTN
ligadas
em relação às PTN
totais
), 11% no regime 1,
caracterizado pela maior interferência da matéria orgânica e, 3% no último regime, o qual
esteve sob condições operacionais adversas, porém, sob menor influência do material
carbonáceo no meio reacional.
Apesar de se observar claramente nas Figuras 5.32 e 5.33 a tendência de queda
na concentração, tanto para as proteínas como para os polissacarídeos ligados e totais,
do primeiro para o terceiro regime e leve aumento destas concentrações na condição de
maior salinidade no meio, relacionar estas substâncias entre si e com a concentração da
biomassa no MBBR, permite avaliar de maneira mais acurada o comportamento das
mesmas e estabelecer uma possível comparação com os resultados apresentados na
literatura. Portanto, a Figura 5.34 expressa graficamente os valores médios obtidos para
as razões PLS
ligados
/SV, PLS
totais
/SV, PTN
totais
/SV em cada condição experimental
investigada, e .a Tabela 5.16 apresenta os valores médios e os respectivos desvios
padrão para estas razões.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Regime 1 Regime 2 Regime 3 Regime 4
razão PLS/SV e PTN/SV
PLS ligados/SV PLS totais/SV PTN totais/SV
Figura 5.34 – Representação dos valores médios e seus respectivos desvios padrão para
as razões polissacarídeos e proteínas em relação à biomassa aderida (SV) nos quatro
regimes operacionais investigados.
147
Tabela 5.16 – Valores médios e seus respectivos desvios padrão obtidos para as razões
polissacarídeos e proteínas em relação à biomassa aderida (SV) nos quatro regimes
operacionais investigados.
Cl
-1
SV PLS/SV PTN/SV
(g L
-1
)
(mg L
-1
)
Ligados Totais Totais
0,5 1.495 ± 182 0,11 ± 0,03 0,30 ± 0,02 0,60 ± 0,09
3,0 1.490 ± 217 0,09 ± 0,02 0,13 ± 0,03 0,40 ± 0,08
6,0 467 ± 76 0,11 ± 0,04 0,25 ± 0,10 0,35 ± 0,10
12 743 ± 103 0,16 ± 0,08 0,27 ± 0,10 0,40 ± 0,15
Dos dados apresentados na Figura 5.34 e Tabela 5.16 depreende-se que as três
razões avaliadas mostraram perfil de comportamento distinto para os regimes
operacionais investigados. A razão média dos PLS
ligados
/SV permaneceu praticamente
constante nos 3 primeiros regimes com leve acréscimo, porém maior dispersão, no
regime 4. Os valores médios para a razão PLS
totais
/SV se mostraram bastante próximos
nos regimes 1, 3 e 4 e apresentaram decréscimo em torno de 50% para a condição de 3 g
Cl
-
L
-1
(regime 2). No caso da razão PTN
totais
/SV na condição operacional sem adição de
sal se obteve o valor médio mais expressivo (60% de proteínas em relação aos sólidos
voláteis), sendo que os 3 regimes posteriores mantiveram praticamente o mesmo patamar
em torno de 40% de proteína em relação aos SV. Os trabalhos realizados por FREIRE
et
al.
(2001) e CAMPOS
et al.
(2002a) também constataram maior teor de proteínas do que
de polissacarídeos na biomassa presente no tratamento biológico de efluentes industriais
salinos.
DEORSOLA (2006) avaliou o comportamento de um lodo ativado, operado em
modo de bateladas sequenciais, quando adicionado de diferentes concentrações de sais
monovalentes e divalentes. Segundo a autora, no primeiro choque de salinidade, quando
o teor dos íons monovalentes passou de 0% para 2% (m v
-1
), houve redução da
quantidade de PLS
ligados
à biomassa. Porém, o aumento da salinidade de 2 para 4 e para
6% (m v
-1
) foi acompanhado pelo aumento da razão PLS/SSV. No que se refere ao
presente trabalho, a razão PLS
ligados
/SV foi praticamente invariável até a condição de 0,6%
(m v
-1
) de íon cloreto, apresentando leve aumento quando alcançado o teor de cloreto de
1,2% (m v
-1
) no MBBR.
148
A Figura 5.35 e a Tabela 5.17 apresentam os valores médios obtidos para as
razões PLS
ligados
/PTN
totais
, PTN
ligadas
/PLS
ligados
, PLS
totais
/PTN
totais
em cada condição
experimental investigada.
0,0
0,1
0,2
0,3
0,4
0,5
0,6
0,7
0,8
0,9
1,0
Regime 1 Regime 2 Regime 3 Regime 4
razão PLS/PTN e PTN/PLS
PLS ligados/PTN totais
PTN ligadas/PLS ligados
PLS totais/PTN totais
Figura 5.35 – Representação dos valores médios e seus respectivos desvios padrão para
as razões polissacarídeos e proteínas em relação à biomassa aderida nos quatro regimes
operacionais estudados.
Assim como para as razões PTN/SV e PLS/SV, da Figura 5.35 é possível observar
que o perfil das razões PLS
ligados
/PTN
totais
, PTN
ligadas
/PLS
ligados
, PLS
totais
/PTN
totais
em relação
ao incremento do teor de sal no MBBR também foi distinto para os três parâmetros
avaliados.
Neste caso optou-se pelo tratamento estatístico dos conjuntos de dados para
auxiliar na discussão dos resultados. Por conta da expressiva variabilidade representada
pelo desvio padrão destes parâmetros, utilizou-se o teste F de Fisher ao invés do teste t
de Student, para comparar as razões PLS/PTN nos quatro regimes operacionais. O teste
F trabalha com as variâncias dos conjuntos de dados, o que permite comparações mais
eficientes entre diferentes variâncias amostrais. Os valores de F, assim como os
intervalos de confiança das variâncias, foram obtidos com o auxílio do Programa
Computacional Statistica versão 6.0.
149
Tabela 5.17 – Valores médios e seus respectivos desvios padrão obtidos para as distintas
razões polissacarídeos e proteínas nos quatro regimes operacionais investigados.
Cl
-1
PLS
ligados
/PTN
totais
PTN
ligadas
/PLS
ligados
PLS
totais
/PTN
totais
(g L
-1
)
0,05 0,18 ± 0,04 0,63 ± 0,14 0,51 ± 0,09
3,0 0,23 ± 0,04 0,37 ± 0,14 0,34 ± 0,03
6,0 0,33 ± 0,12 0,19 ± 0,14 0,70 ± 0,20
12,0 0,40 ± 0,11 0,07 ± 0,03 0,67 ± 0,10
No que diz respeito aos resultados apresentados para a razão PLS
ligados
/PTN
totais
,
pode-se inferir que ocorreu leve incremento no teor de PLS
ligados
em relação às PTN
totais
da
biomassa, do primeiro para o último regime operacional. Este resultado está de acordo
com os resultados obtidos por DEORSOLA (2006) que em seu trabalho observou
tendência crescente da razão PLS
ligados
/PTN
totais
com o aumento do teor de sal,
enfatizando que a salinidade provocou aumento da concentração dos polissacarídeos
extracelulares e redução do teor de proteína da biomassa. Por outro lado, a aplicação do
teste F mostrou que não existe diferença significativa entre os conjuntos de dados
referentes às condições de 0,05 e 3 g Cl
-
L
-1
e 6 e 12 g Cl
-
L
-1
,
respectivamente, ou seja,
os regimes 1 e 2 separadamente dos regimes 3 e 4 apresentam em média, com 95% de
confiança, o mesmo comportamento para a razão PLS
ligados
/PTN
totais
. Desta maneira,
sugere-se que menores teores de matéria orgânica, além do incremento da salinidade
acima de 6 g Cl
-
L
-1
foram os principais fatores de interferência nesta relação.
Para a razão PTN
ligadas
/PLS
ligados
observa-se na Figura 5.35 a tendência de queda
da condição com menor teor de sal para a mais salina. Portanto, ocorreu o decréscimo da
porção de PTN
ligadas
à biomassa em relação aos PLS
ligados
com o incremento dos íons
cloreto no meio reacional. Pelo teste F com nível de confiança de 95%, apenas o regime
com 12 g Cl
-
L
-1
apresentou diferença significativa em relação aos quatro regimes
estudados. Isto sugere que somente o teor de sal mais elevado interferiu diretamente na
relação PTN
ligadas
/PLS
ligados
.
No caso da razão PLS
totais
/PTN
totais
não se identificou qualquer perfil de
comportamento. A partir da aplicação do teste F para os conjuntos de dados
150
representativos desta razão, obteve-se com 95% de certeza que o regime 2 foi o único a
apresentar diferença significativa entre as razões dos quatro regimes operacionais
estudados. Depreende-se, portanto, que neste caso não é possível relacionar a variação
destas substâncias com os parâmetros salinidade ou matéria orgânica.
AHN
et al.
(2007) avaliaram o teor de exopolímeros, como carboidratos e proteínas,
no tratamento de um efluente sintético com alta carga orgânica e nitrogenada, utilizando
um reator biológico com membranas submersas. Os autores constataram que não
ocorreram diferenças significativas no conteúdo das proteínas e carboidratos associados
ao biofilme formado sobre as membranas, em relação às diferentes taxas de recirculação
do efluente aplicadas. Portanto, não foi possível observar qualquer tendência de variação
da razão carboidratos/proteínas com as diferentes condições operacionais aplicadas ao
processo.
Além do teste F, também foi calculada, com o auxílio do Programa Statistica, a
matriz de correlação para as razões PLS
ligados
/PTN
totais
, PTN
ligadas
/PLS
ligados
,
PLS
totais
/PTN
totais
, com a finalidade de conhecer o grau de dependência entre estas
variáveis. Contrariamente ao que era esperado, os únicos parâmetros que apresentaram
razoável grau de dependência, para os 4 regimes operacionais estudados, foram os
PLS
totais
e as PTN
totais
. Para as razões PLS
ligados
/PTN
totais
(relação mais utilizada na
literatura) e PLS
ligados
/PTN
ligadas
foi observada apenas leve correlação para o regime com
maior teor salino (12 g Cl
-
L
-1
), sendo que se pode considerar que estes parâmetros
apresentaram grau de flutuação independente entre eles. Este fato pode ser devido à
interferência de diversos fatores na produção destas substâncias, e também por conta da
elevada variabilidade dos resultados.
Conforme comentado anteriormente, as muitas variáveis relacionadas à extração e
determinação dos exopolímeros (substâncias ligadas), assim como a diversidade das
características inerentes à cada unidade de tratamento de efluentes, tornam muito
complexa a comparação com os resultados apresentados na literatura. Por outro lado,
quando comparados resultados obtidos a partir da mesma metodologia de determinação
dos PLS e PTN os valores observados mostraram-se relativamente próximos. A Tabela
5.18 sumariza os valores encontrados por alguns autores que usaram a mesma
metodologia para determinação destas razões. Os dados apresentados correspondem
151
aos PLS
ligados
e PTN
totais
para sistemas com biomassa em suspensão (flocos) e biomassa
aderida (biofilme). É interessante observar que, apesar da diversidade das características
dos trabalhos desenvolvidos, estas relações mostraram-se bem próximas para os flocos
microbianos e biofilmes.
Tabela 5.18 – Razões dos parâmetros SSV, PTN e PLS para flocos e biofilmes, adaptado
de SANT’ANNA JR. (2007).
PLS
lig
/SSV PTN
tot
/SSV PLS
lig
/PTN
tot
Reator ou
Processo
Referência
Biofilmes 0,09 – 0,16 0,35 – 0,60 0,18 – 0,40 MBBR
este
trabalho
0,05 – 0,07 0,39 – 0,52 0,12 – 0,20
leito
submerso
VENDRAMEL,
2004
0,04 – 0,35
fluxo sobre
placas
CAMMAROTA,
1998
Flocos 0,02 – 0,03 0,23 – 0,38 0,10 SBR*
FREIRE
et al.,
2001
0,18 – 0,32 air-lift
CAMPOS
et al.,
2002a
0,06 – 0,08 0,17 – 0,46 0,10 – 0,24 lodo ativado
MATIAS,
2000
0,01 – 0,04 0,12 – 0,25 0,08 – 0,20 SBR*
DEORSOLA,
2006
*reator de batelada seqüencial – efluente salino
Apesar da importância das substâncias poliméricas, principalmente as
extracelulares (EPS), na formação de flocos microbianos e biofilmes e o contínuo
interesse dos pesquisadores no tema, o entendimento da dinâmica dos EPS nos
consórcios microbianos ainda é limitado e a elucidação de sua composição e funções
ainda se faz necessária (PARK e HELM, 2008).
152
5.6.3 Caracterização do biofilme por microscopia óptica
A microscopia óptica é uma ferramenta que vem sendo utilizada com crescente
freqüência como controle operacional em estações de tratamento de efluentes (ETEs)
com biomassa em suspensão (ex. lodos ativados) por conta da significativa presença de
protozoários e metazoários nos processos biológicos aeróbios. Neste contexto, estudos
da interação entre protozoários, metazoários e flocos microbianos estão praticamente
consolidados (JENKINS
et al,.
1993), podendo ser diretamente relacionados ao
desempenho das ETEs e à qualidade dos efluentes tratados.
Por outro lado, esta é uma realidade somente para a biomassa em suspensão em
tratamentos secundários – os quais têm como objetivo principal a remoção da matéria
orgânica dissolvida. No caso da biomassa aderida (biofilmes) não existe muito
conhecimento a respeito da importância ou relação desses micro-organismos com as
questões operacionais, sobretudo quando se trata do processo de nitrificação no
tratamento terciário.
Portanto, as observações do biofilme ao microscópio óptico, realizadas durante o
presente experimento, tiveram como objetivo acompanhar a dinâmica dos possíveis
protozoários presentes na microbiota desenvolvida no MBBR em questão. A Figura 5.36
apresenta as observações realizadas ao microscópio no final da primeira etapa de
operação do biorreator (primeiros 250 dias).
As fotomicrografias da Figura 5.36 mostram que a biomassa desenvolvida até
então pode ser considerada densa, sem a presença de bactérias filamentosas
(características da biomassa em suspensão) e com boa diversidade de protozoários e
metazoários, porém, com baixa densidade dos mesmos.
153
Figura 5.36 – Fotomicrografias do biofilme no final dos primeiros 250 dias de operação do
MBBR. (A) ciliado séssil da espécie
Epistylis
sp.; (B) ciliado livre-natante da espécie
Euplotes
sp.; (C) ameba com teca; (D) ciliado livre-natante da espécie
Paramecium
sp.;
(E) rotíferos.
A
B
C
D
E
154
As Figuras 5.37, 5.38, 5.39 e 5.40 apresentam as observações realizadas ao
microscópio óptico durante os regimes 1, 2, 3 e 4, respectivamente.
Figura 5.37 – Fotomicrografias do biofilme durante o primeiro regime de operação do
MBBR (regime 1 = 0,05 g Cl
-
L
-1
). (A) provável ameba com teca; (B) nematódeos; os
demais organismos presentes nas microfotografias não foram identificados.
Das fotomicrografias que representam as características gerais visualizadas no
regime 1 (Figura 5.37), depreende-se que o biofilme manteve-se denso como na condição
anterior (Figura 5.36), porém, com menor diversidade de protozoários, ausência dos
metazoários (rotíferos) e presença de nematódeos, que estão normalmente associados a
A
B
B
155
lodos velhos (SALVADO
et al
., 2004). Comparando-se o regime 1 com o final da etapa
operacional anterior, infere-se que as alterações visualizadas na microbiota coincidem
com a queda de desempenho no processo de nitrificação e, ademais, que os mesmos
parâmetros que afetaram o processo, conforme previamente explicado, provocaram
alterações na dinâmica dos protozoários e o desaparecimento dos rotíferos.
Figura 5.38 – Fotomicrografias do biofilme durante o segundo regime de operação do
MBBR (regime 2 = 3 g Cl
-
L
-1
). (A) ciliados livre-natantes; (B) nematódeos.
No regime 2, as fotomicrografias apresentadas na Figura 5.38 mostram que o
biofilme tornou-se ainda mais denso do que nos períodos anteriores e que ocorreu a
A
B
B
156
presença de protozoários apenas da classe
Ciliata
do tipo livre-natantes, porém de uma
dimensão que não foram passíveis de identificação. Os nematódeos permaneceram
durante esta condição operacional.
Figura 5.39 – Fotomicrografias do biofilme durante o terceiro regime de operação do
MBBR (regime 3 = 6 g Cl
-
L
-1
). (A) ciliados sésseis; (B) ameba com teca; (C) possível
rotífero; (E) ciliado livre-natante.
Da Figura 5.39, referente ao regime 3, observa-se pelas microfotografias que
mesmo após a ocorrência do desprendimento do biofilme no final do regime 2, o mesmo
se desenvolveu satisfatoriamente apresentando certa densidade e baixa diversidade de
A
A
A
A
B
C
E
157
protozoários. Infere-se que a biomassa, prioritariamente autotrófica, também gerou
condições para o crescimento de alguns protozoários e que a concentração de 6 g Cl
-
L
-1
não teve efeito inibitório sobre os mesmos. Os nematódeos, nesta condição, não se
fizeram presentes em qualquer das observações realizadas ao microscópio.
Figura 5.40 – Fotomicrografias do biofilme durante o último regime de operação do MBBR
(regime 4 = 12 g Cl
-
L
-1
). (A), (B), (C) e (D) ciliados sésseis.
No caso do regime 4, representado pelas fotomicrografias da Figura 5.40, sugere-
se que 12 g Cl
-
L
-1
levou à efetiva diminuição da diversidade e densidade dos protozoários.
Foi detectada apenas a presença de ciliados sésseis e de uma única espécie. Sugere-se
C
A
B
D
158
que as pequenas partículas brilhantes associadas à biomassa, nesta condição salina,
possam ser decorrentes do acúmulo de cristais de sal no biofilme.
DEORSOLA (2006) verificou no processo de lodos ativados o desaparecimento de
protozoários e metazoários em concentrações de NaCl a partir de 2% (m v
-1
), condizente
com a condição de salinidade do regime 4 no presente trabalho. Durante seus
experimentos, DEORSOLA (2006) também observou o aumento da turbidez no meio
líquido, indicando fragmentação dos flocos em suspensão com o incremento da salinidade,
pela incorporação dos cátions à biomassa microbiana. Esta ocorrência contribuiu para a
desfloculação da biomassa em suspensão, resultando em problemas na sedimentação do
lodo. No caso da biomassa aderida, a possível incorporação de sais ao biofilme não
acarretou problemas operacionais ao processo por conta da inexistência da etapa de
sedimentação.
Segundo POOLE (1984)
apud
ABREU (2004), em estações de tratamento de
lodos ativados as amebas tecadas são abundantes ou dominantes em condições de
operação caracterizadas por baixa carga orgânica, longo tempo de retenção e alta
concentração de OD, sendo estas características consideradas ideais para alcançar
excelente desempenho na remoção de amônia pela via biológica convencional. No que se
refere ao presente trabalho, em todas as observações do biofilme realizadas ao
microscópio, quando em condições de bom desempenho para a nitrificação, pode-se
constatar a presença de amebas tecadas, porém, muito aquém da ocorrência sugerida
por POOLE (1984)
apud
ABREU (2004).
O índice biótico de lodos (IBL) é um método que foi proposto por MADONI (1994)
para avaliar a abundância e diversidade dos protozoários sob os diferentes fatores físico-
químicos aplicados aos sistemas de tratamento biológico. Fazendo uso do IBL, MADONI
(1994) concluiu que a riqueza em espécies de protozoários tende a se alterar com a carga
orgânica presente. O maior número de espécies foi observado para cargas
compreendidas entre 0,2 e 0,3 kg DBO
5
kg
-1
SSV d
-1
, ocorrendo o decréscimo da
densidade da microbiota com a diminuição da carga mássica. Contudo, este autor sugere
que em unidades de tratamento com objetivo de remoção da amônia, espera-se encontrar
uma microbiota menos abundante do que nos processos que visam a biodegradação de
159
compostos orgânicos, sendo que esta consideração coincidiu com as observações
realizadas no presente trabalho.
O teor mínimo de NaCl e o tempo de contato requiridos para a total eliminação de
protozoários e metazoários sem afetar a atividade das bactérias autotróficas foi
investigado por MOUSSA
et al.
(2005). Os autores cultivaram a comunidade nitrificante
em um SBR com biomassa em suspensão e constataram que a adição de 5 g Cl
-
L
-1
ao
meio e exposição a esta condição por 1 h foi totalmente deletério aos protozoários e
metazoários, porém não afetou a atividade das bactérias nitrificantes. Visualizações ao
microscópio permitiram constatar a perda na mobilidade destes organismos e
consequente inchaço dos mesmos, provavelmente por conta do aumento da pressão
osmótica.
5.7 Caracterização do biofilme pela técnica de Hibridização
in situ
por
Fluorescência
A técnica de Hibridização
in situ
por Fluorescência (FISH) foi aplicada com o
objetivo de detectar as bactérias responsáveis pela nitrificação convencional no MBBR e,
possivelmente, associar a dinâmica das mesmas com as características dos quatro
regimes operacionais investigados.
Por conta das dificuldades encontradas na detecção das bactérias presentes na
biomassa, primeiramente pela autofluorescência associada às amostras, e por não se ter
alcançado as condições ideais de aplicação do método para a comunidade microbiana em
questão, o objetivo da utilização do FISH foi parcialmente alcançado.
5.7.1 Cultivo das células para validação das sondas de FISH
Pelo procedimento descrito na seção 4.7.1 foi possível promover o crescimento
isolado de pelo menos uma espécie de AOB e uma de NOB. Após 10 dias de incubação
na estufa a 37
°
C, as culturas inoculadas nas placas de Petri apresentaram as
características visualizadas na Figura 5.41.
160
Figura 5.41 – Placas após 10 dias de incubação para o isolamento das bactérias que
oxidam amônia e nitrito. (A) placa para isolamento das AOB; (B) placa para isolamento
das NOB com a cultura destacada no detalhe; (C) placa com meio heterotrófico antes da
incubação; (D) placa com meio heterotrófico depois da incubação.
A coloração esverdeada observada na placa para isolamento das AOB (Figura
5.41A) ocorreu por conta da presença do mesmo indicador de pH utilizado no meio de
isolamento líquido e, conseqüentemente, pela produção dos íons H
+
durante a conversão
de amônia.
Depreende-se da visualização das placas apresentadas na Figura 5.41 que o
crescimento das bactérias autotróficas foi praticamente insignificante quando comparado
com o das heterotróficas no mesmo período de tempo. Das placas A e B, apresentadas
na Figura 5.41, as culturas foram removidas, lavadas com tampão fosfato e fixadas para a
validação das sondas de FISH, seguindo os procedimentos apresentados no Anexo I.4.
As culturas removidas das placas de isolamento, depois de fixadas, foram
hibridizadas com as respectivas sondas de identificação para cada grupo de bactérias de
C
A
B
D
161
interesse, sonda Nso1225 para as AOB e sonda Nit3 para as NOB. Durante a preparação
das lâminas, para cada poço com sonda foi montado um poço apenas com a amostra e o
tampão de hibridização para o controle negativo da possível autofluorescência das
culturas, ou seja, nesta condição não se deveria observar fluorescência. DAPI foi
adicionado a todos os poços para verificar a integridade das células. Assim, as sondas
para a identificação das AOB e das NOB foram validadas, conforme ilustram as Figuras
5.42 e 5.43.
Figura 5.42 – Fotomicrografias dos resultados obtidos para a validação da sonda
Nso1225 referente à identificação das AOB pela aplicação da técnica de FISH. As
imagens lado a lado estão focadas no mesmo campo de visualização do microscópio,
porém, com filtros distintos para DAPI (a – c) e para a sonda específica Nso1225 (b – d).
As imagens da linha inferior são o controle da autofluorescência sem adição da sonda
(s/sd) e as da linha superior são os testes com sonda (c/sd); barra igual a 20
µ
m.
c/Sd c/Sd
s/Sd
s/Sd
d
c
a
b
162
Figura 5.43 – Fotomicrografias dos resultados obtidos para a validação da sonda Nit3
referente à identificação das NOB pela aplicação da técnica de FISH. As imagens lado a
lado estão focadas no mesmo campo de visualização do microscópio, porém com filtros
distintos para DAPI (a – c) e para a sonda específica Nit3 (b – d). As imagens da linha
inferior são o controle da autofluorescência sem adição da sonda (s/sd) e as da linha
superior são os testes com sonda (c/sd); barra igual a 20
µ
m.
As sondas foram validadas com sucesso, porém depreende-se pela visualização
das imagens nas Figuras 5.42d e 5.43d, que existe uma leve autofluorescência associada
às culturas, mais evidente para as AOB. Este fato será discutido na próxima seção.
c/Sd c/Sd
s/Sd s/Sd
d
c
a
b
163
5.7.2 Aplicação da técnica de FISH no biofilme do MBBR
A primeira dificuldade encontrada na aplicação da técnica de FISH para as
amostras do MBBR foi a autofluorescência inerente às mesmas. O resultado obtido pela
primeira realização do teste (regime 1) apenas com DAPI e a sonda EUB338 (domínio
Bacteria
), gerou a necessidade de investigar maneiras de dissociar a biomassa, sem
danificar as células, para diminuir a influência da autofluorescência identificada nas
amostras. A Figura 5.44 apresenta as imagens obtidas no microscópio de fluorescência
que ilustram o ocorrido.
Figura 5.44 – Fotomicrografias dos resultados obtidos da aplicação de FISH para as
amostras da biomassa do regime 1. As imagens lado a lado estão focadas no mesmo
campo de visualização do microscópio, porém com filtros distintos para DAPI (a – c) e
para a sonda EUB338 (b – d). As imagens da linha inferior são o controle da
autofluorescência sem adição da sonda (s/sd) e as da linha superior são os testes com
sonda (c/sd); barra igual a 20
µ
m.
c/Sd c/Sd
s/Sd s/Sd
d
c
a
b
164
Infere-se da Figura 5.44d, sem adição de sonda, que as amostras apresentaram
forte autofluorescência, principalmente quando associadas ao aglomerado microbiano
(grumos). No caso dos testes com a sonda EUB338 (Figura 5.44b) a autofluorescência na
região onde as células estão organizadas em grumos impediu a visualização da marcação
individual das mesmas. Por outro lado, nem todas as células individualizadas observadas
com DAPI (Figura 5.44a) apresentaram marcação, o que sugere que as condições
aplicadas ao ensaio não permitiram o adequado acesso da sonda às células. Infere-se
que a autofluorescência observada seja inerente à matriz extracelular do biofilme,
representada pelos grumos e que esta seja autofluorescente ou, ainda, que esta matriz
possa estar se unindo à sonda de maneira inespecífica.
Segundo DE LOS REYS
et al.
(1997), amostras de lodos ativados contêm matéria
orgânica e células que autofluorescem, resultando em incertezas na marcação das
sondas de oligonucleotídeos. Contudo, nenhum dos trabalhos consultados na literatura
coloca qualquer relato sobre problemas de autofluorescência na identificação de bactérias
nitrificantes. Ademais, pouquíssimos artigos publicados comentam sobre problemas com
a autofluorescência das amostras ambientais, talvez por conta da maioria dos trabalhos
serem realizados com amostras a partir de meios sintéticos, sugerindo que o problema da
autofluorescência pode estar associado a amostras de biomassa destinadas ao
tratamento de efluentes reais.
A partir destas considerações, primeiramente foram testadas todas as etapas do
ensaio para verificar se algum reagente poderia estar conferindo esta autofluorescência
às amostras. Os resultados relativos a este teste mostraram que a amostra em si, depois
de fixada, já se apresentava autofluorescente. Neste caso, poderia ainda se associar o
fato aos reagentes utilizados na etapa de fixação, porém, isto não poderia ser averiguado
para todos os regimes por não existirem amostras disponíveis para nova etapa de fixação.
Portanto, focou-se no objetivo de desagregar o aglomerado microbiano em que se
encontravam as células de interesse.
Duas metodologias foram aplicadas com este intuito: cisalhamento da biomassa
pré-fixada com pérolas de vidro e utilização do sonicador sob várias condições de tempo.
Os dois métodos mostraram sensível melhora nos resultados, porém, não solucionaram
totalmente o problema. Contudo, deu-se preferência à utilização do sonicador pela maior
165
facilidade de aplicação, sendo que as amostras, antes de serem hibridizadas, foram
sonicadas por 30s, com intervalos de 30s, por 3 vezes consecutivas.
Para as amostras dos regimes 3 e 4 foi possível utilizar novos reagentes para a
fixação das células, no entanto, este procedimento não apresentou diferença significativa
em relação à autofluorescência.
No que se refere à fraca marcação da sonda nas células individualizadas, foram
testados tempos de hibridização mais longos (3, 12 e 18h) e 5 pontos percentuais a mais
nos teores de formamida utilizados no tampão de hibridização. Contudo, não foi possível
identificar melhorias no resultado final pela aplicação destas novas condições. Portanto,
optou-se por permanecer com as condições sugeridas na literatura, conforme
apresentadas na Tabela 4.2 da seção 4.7.3 para a formamida e 90 minutos para o tempo
de hidridização.
Considerações sobre a intensidade do sinal das sondas, que a princípio é
proporcional ao conteúdo de rRNA das células e, conseqüentemente, à sua atividade,
necessitam ainda ser exploradas. Contudo, nitrificantes parecem manter o seu conteúdo
de rRNA durante os períodos de baixa atividade, assim a intensidade do sinal não
necessariamente reflete a atividade metabólica do momento da fixação destas células
(MANSER
et al
., 2005).
A Figura 5.45 apresenta um resultado típico do controle positivo e do controle
negativo efetuados para todos os testes realizados. O controle positivo refere-se à
utilização de uma cultura pura de
Escherichia coli
(
E. coli
), sendo que um dos poços
efetua-se a hibridização com a sonda EUB338 e em outro sem a sonda para verificar a
efetividade do teste. Para o controle negativo foi hibridizada com a sonda EUB338
(específica para bactérias) uma cultura pura de protozoários flagelados (
Trypanosoma
cruzi
-
T. cruzi
), para garantir que a sonda estivesse se fixando apenas a bactérias.
166
Figura 5.45 – Fotomicrografias típicas do controle negativo com
T. cruzi
(primeira linha) e
com
E. coli
(segunda linha), e do controle positivo com
E. coli
(terceira linha) para os
ensaios de FISH realizados. As imagens lado a lado estão focadas no mesmo campo de
visualização do microscópio, porém, com filtros distintos para DAPI (a – c – e) e para
EUB338 (b – d – f); barra igual a 20
µ
m.
c/Sd c/Sd
s/Sd s/Sd
d
c
a
b
s/Sd
s/Sd
e
f
c/Sd c/Sd
s/Sd s/Sd
d
c
a
b
c/Sd
c/Sd
e
f
167
Da Figura 5.45 depreende-se que as condições de hibridização utilizadas foram
adequadas para promover a marcação eficiente das células
E. coli
e que o controle
negativo atestou a aplicabilidade da sonda.
A Figura 5.46 apresenta as imagens obtidas para o controle da autofluorescência
dos ensaios de FISH nos quatro regimes experimentais investigados. Neste caso as
amostras hibridizadas sem sonda mostraram que mesmo com a presença de pontos de
autofluorescência associada aos aglomerados microbianos, evidenciados nas Figuras
5.46d e 5.46f, foi possível visualizar o sinal de fluorescência das sondas quando ligadas
às células de interesse.
Nas Figuras 5.47 e 5.48 estão apresentadas as imagens obtidas no microscópio
de fluorescência após a aplicação da técnica de FISH para o biofilme desenvolvido nos
regimes operacionais 1, 2, 3 e 4. A Figura 5.47 mostra imagens típicas obtidas pela
visualização das amostras da biomassa hibridizadas com a sonda Nso1225 para a
detecção das AOB. A Figura 5.48 apresenta as imagens típicas obtidas para a detecção
das NOB com a sonda Nit3. Ambas as Figuras 5.47 e 5.48 apresentam na primeira coluna
as amostras marcadas com DAPI, na segunda coluna as amostras marcadas com as
sondas específicas (Nso1225 e Nit3) e, na terceira coluna, a mesma região de
visualização das duas primeiras colunas em campo claro.
Observou-se pelos ensaios de FISH realizados e conforme pode ser visualizado
nas Figuras 5.47 e 5.48 que o sinal da fluorescência em todos os casos foi muito fraco,
dificultando a avaliação da dinâmica das bactérias nitrificantes com o acréscimo de sal ao
meio. Em geral, quando ocorre a ausência de sinal sugere-se que as células fixadas
poderiam estar mortas ou com baixa atividade metabólica. No caso de sinal fraco, pode-
se atribuir o fato à deficiente permeabilização das sondas. Para melhorar a
permeabilidade das células é possível utilizar agentes químicos e ou biológicos que
favorecem este processo, porém, não é comum a utilização dos mesmos para células
Gram-negativas, como é o caso das nitrificantes (ABREU, 2004). A diferença na
tonalidade do fundo das imagens se deu por conta da busca pela melhor condição na
visualização do sinal das sondas, com o intuito de diminuir o ruído de fundo e minimizar o
efeito da autofluorescência.
168
Figura 5.46 – Fotomicrografias do controle negativo dos ensaios típicos de FISH para os
quatro regimes operacionais investigados. As imagens lado a lado estão focadas no
mesmo campo de visualização do microscópio com filtros distintos para DAPI (a – c – e –
h) e para as sondas específicas (b – d – f – i). As imagens referentes às linhas
correspondem aos regimes 1, 2, 3 e 4, respectivamente da primeira para a última linha;
barra igual a 20
µ
m.
a
e
h
c
b
f
i
d
169
Figura 5.47 – Fotomicrografias dos ensaios típicos para a detecção das bactérias que
oxidam amônia com a sonda Nso1225 para os quatro regimes operacionais investigados.
As imagens lado a lado estão focadas no mesmo campo de visualização do microscópio,
porém, com filtros distintos para DAPI (a – d – h – m), para a sonda Nos1225 (b – e – k –
n) e em campo claro (c – f – l – o). As imagens referentes às linhas correspondem aos
regimes 1, 2, 3 e 4, respectivamente da primeira para a última linha; barra igual a 20
µ
m.
a
b
c
h
k
l
m
n
o
d
e
f
170
Figura 5.48 – Fotomicrografias dos ensaios típicos para a detecção das bactérias que
oxidam nitrito com a sonda Nit3 para os quatro regimes operacionais investigados. As
imagens lado a lado estão focadas no mesmo campo de visualização do microscópio,
porém, com filtros distintos para DAPI (a – d – h – m), para a sonda Nos1225 (b – e – k –
n) e em campo claro (c – f – l – o). As imagens referentes às linhas correspondem aos
regimes 1, 2, 3 e 4, respectivamente da primeira para a última linha; barra igual a 20
µ
m.
a
b
c
h
k
l
m
n
o
d
e
f
171
A aplicação da técnica de FISH no presente trabalho não permitiu avaliar a
densidade das bactérias nitrificantes assim como a sua dinâmica em relação ao
incremento de sal por conta da dificuldade em visualizar os sinais emitidos pelas sondas
hibridizadas. Contudo, foi possível constatar o crescimento da comunidade nitrificante no
MBBR com representantes dos domínios
Nitrosomonas
e
Nitrobacter
.
Melhorias no nível de detecção das sondas e diferenciação da autofluorescência
poderiam ser alcançadas com a utilização do microscópio confocal de varredura a laser –
CLSM (De Los REYS
et al.,
1997), porém, este equipamento ainda tem disponibilidade
restrita no Brasil. KIM
et al
. (2006) utilizaram sondas Nso1225 e Nsm156 para detectar as
AOB e, Nit3 e Ntspa662 para as NOB em um biorreator tipo “airlift” com biofilme. Os
autores observaram, utilizando FISH com CLSM, que as AOB se distribuíram na
superfície da biomassa aderida até 100
µ
m de profundidade, sendo que 60% do total das
AOB foram identificadas como
Nitrosomonas.
A hibridização para a identificação das NOB
mostrou distribuição similar entre
Nitrobacter
(Nit3) e
Nitrospira
(Ntspa662)
.
A partir de dados recentes da literatura, WHANG
et al
. (2009) relataram que
Nitrosomonas
e
Nitrobacter
são consideradas as bactérias mais importantes envolvidas
no processo de nitrificação. Contudo, as possibilidades de identificação a nível molecular
indicam que
Nitrosospira
é tão presente quanto
Nitrosomonas
e que, freqüentemente,
Nitrospira
(bactérias que oxidam nitrito) são dominantes em sistemas de lodos ativados.
Estes autores também consideraram que apesar de vários estudos destinados à
investigação das comunidades de bactérias nitrificantes em processos de tratamento de
efluentes, o entendimento da dinâmica entre a presença destes micro-organismos e o
desempenho da nitrificação em instalações em escala real ainda é muito limitado.
172
6 Conclusões
Dos estudos desenvolvidos no presente trabalho, no qual se utilizou um biorreator
com biomassa aderida (MBBR), operado de modo descontínuo (bateladas seqüenciais),
para promover a nitrificação de um efluente industrial, foi possível obter as seguintes
conclusões:
Verificou-se que o ajuste do pH do meio reacional foi primordial para garantir as
condições de implantação e manutenção da atividade das bactérias que oxidam amônia
(AOB) e, possivelmente, das que oxidam nitrito (NOB). Constatou-se que para valores de
pH abaixo de 7,0 e acima de 8,0 a atividade das AOB foi negativamente afetada, sendo
que em alguns casos houve inibição total da nitrificação. Valores de pH entre 7,0 e 7,5
foram considerados ideais para promover eficiente conversão do nitrogênio amoniacal.
Em relação ao nível de oxigênio dissolvido (OD) no meio reacional, não foi
observada, durante a operação do MBBR, a inibição do processo por insuficiência deste
aceptor de elétrons. Os menores valores de OD observados durante o período de trabalho
estiveram sempre acima de 2,0 mg L
-1
, com exceção do período final do regime 2, quando
os valores de OD variaram entre 0,5 e 1,5 mg L
-1
nas primeiras 5 h de aeração de cada
ciclo. Porém, mesmo nessas condições, foi constatada intensa atividade das bactérias
nitrificantes.
A matéria orgânica remanescente no efluente industrial, que alimentou o MBBR,
mostrou considerável interferência na atividade das bactérias nitrificantes. No período
inicial de operação do MBBR, com maior teor afluente de matéria orgânica (DQO solúvel
inicial de 111 a 365 mg L
-1
), a conversão da amônia variou em uma ampla faixa (entre 42
e 98%), desconsiderados os eventos operacionais atípicos e o período relativo à tentativa
de implantar a desnitrificação no reator. O efeito negativo do teor de matéria orgânica
alimentada ao MBBR, principalmente sobre a atividade das AOB, tornou-se mais evidente
a partir dos resultados obtidos nos ensaios cinéticos, visto que a oxidação da amônia
alcançou eficiências de 97, 91 e 77% quando a DQO dissolvida inicial foi de 103, 142 e
180 mg L
-1
, respectivamente. Estes resultados confirmaram que, mesmo para uma faixa
173
restrita de variação da DQO e para valores relativamente baixos, a matéria orgânica teve
pronunciado efeito prejudicial sobre o desempenho da nitrificação.
O incremento dos íons cloreto no meio reacional pela adição de NaCl não teve
influência significativa sobre a nitrificação até teores de 6 g Cl
-
L
-1
. Para a condição de 12
g Cl
-
L
-1
(regime 4), o efeito da salinidade sobre a comunidade microbiana nitrificante foi
mais pronunciado e acarretou em queda da conversão da amônia de cerca de 30 pontos
percentuais em relação aos valores médios dos regimes 2 e 3. A alteração do tempo de
aeração no MBBR (regime 4), de 12 para 24 h, não foi suficiente para compensar a perda
de atividade, em especial das AOB, visto que praticamente todo o nitrito gerado foi
oxidado a nitrato.
Os testes cinéticos realizados nos 4 regimes operacionais investigados, que
permitiram obter os perfis de variação das concentrações das substâncias de interesse,
corroboraram as observações feitas durante o acompanhamento operacional diário, além
de possibilitar a determinação do perfil de variação do nitrito. O acúmulo de nitrito no meio
reacional mostrou-se um pouco mais pronunciado no regime 2 quando comparado com os
demais. Nos regimes 1, 3 e 4 o valor máximo de N-NO
2
-
observado foi menor do que 5
mg L
-1
, enquanto no regime 2 essa espécie alcançou o patamar de aproximadamente 15
mg L
-1
.
O modelo cinético proposto para representar os perfis de variação dos substratos
e produtos permitiu ajuste satisfatório dos dados experimentais. O teor de nitrito foi o
parâmetro que apresentou maior discrepância em relação às previsões do modelo,
provavelmente, em função dos baixos valores observados no meio reacional. Não foi
possível verificar claramente o efeito da crescente salinidade na cinética de oxidação da
amônia, porém, foi notório que o ajuste dos dados do regime 4, de maior salinidade (12 g
Cl
-
L
-1
), foi alcançado com os menores valores das constantes do modelo.
Em relação ao biofilme (biomassa aderida) foi possível constatar a elevada
influência da matéria orgânica no acúmulo do mesmo. Nos períodos em que a DQO inicial
foi maior houve intenso crescimento da biomassa por favorecimento das bactérias
heterotróficas. O balanço de nitrogênio, nos regimes 1 e 2, também apresentou as
maiores diferenças para o seu fechamento, provavelmente por conta do maior consumo
174
assimilatório do nitrogênio. Nos regimes 1 e 2 a concentração de biomassa aderida no
interior do biorreator (em torno de 2500 mg L
-1
) foi pelo menos 2 vezes maior do que nos
regimes 3 e 4, nos quais se considerou que o biofilme seria prioritariamente autotrófico
por conta da menor influência da DQO e após o episódio de desprendimento natural da
biomassa aderida.
Durante todo o período experimental o biofilme se desenvolveu mais intensamente
na superfície interna das biomídias. Portanto, infere-se que o desprendimento natural da
biomassa aderida, ao final do regime 2, ocorreu, muito provavelmente, por conta da idade
do biofilme, visto que o mesmo não estava exposto ao constante cisalhamento das
biomídias no interior do MBBR.
O acompanhamento dos polissacarídeos e proteínas ligados e totais associados
ao biofilme, durante os 4 regimes operacionais, não permitiu observar tendências claras
do efeito do incremento da salinidade no MBBR. A alteração mais detectável referiu-se às
razões entre proteínas e polissacarídeos ligados (PTN
ligadas
/PLS
ligados
) e esta última
variável e proteínas totais (PLS
ligados
/PTN
totais
), que apresentaram tendências de queda e
de aumento, respectivamente, com o aumento da salinidade. Destes resultados
depreende-se que a salinidade promoveu o aumento na produção dos PLS
ligados
em
relação ao conteúdo de PTN
totais
e PTN
ligadas
. Este comportamento era esperado, pois, em
geral, o aumento de exopolímeros produzidos por bactérias corresponde a um mecanismo
de defesa em relação às condições adversas do meio em que estão submetidas, no caso
do presente trabalho, ao estresse salino.
As observações do biofilme por microscopia óptica revelaram gradual diminuição
da abundância e diversidade dos protozoários e metazoários com o aumento do teor de
sal no MBBR. Este comportamento também coincidiu com o decréscimo na variabilidade
e nos aportes de DQO ao biorreator. No regime 4, com o maior teor de sal (1,2%, m v
-1
),
foram observadas pequenas partículas brilhantes associadas à biomassa, provavelmente
decorrentes do acúmulo de cristais de sal no biofilme.
Não se teve o êxito esperado com a técnica de FISH para identificar as bactérias
nitrificantes e, possivelmente, avaliar a sua dinâmica em relação ao incremento de sal ao
meio reacional. Contudo, apesar das dificuldades encontradas foi possível constatar, com
175
a aplicação da técnica, a presença das bactérias nitrificantes do gênero
Nitrosomonas
(representante das AOB) e do gênero
Nitrobacter
(representantes das NOB) no biofilme
desenvolvido no MBBR.
A desnitrificação do efluente tratado (regime 4) no MBBR foi conduzida em outra
unidade experimental. Os resultados indicaram remoção de 88% de nitrogênio a partir do
nitrato em 3 horas de reação. Este tempo equivale a aproximadamente 40% do tempo
necessário para obter altas eficiências de nitrificação (8 horas de aeração). Este
desempenho foi alcançado sob a condição salina de 12 g Cl
-
L
-1
, o que permite inferir que
esta concentração de íons cloreto não promoveu inibição da comunidade microbiana
desnitrificante. A quantidade de carbono (etanol) necessária para promover eficiente
redução do nitrato no meio reacional correspondeu à razão COD/N-NO
3
-
igual a 1.
A automação da unidade experimental em questão foi de grande relevância por
permitir desenvolver os experimentos em modo de operação descontínuo por um longo
período de tempo, de maneira controlada e relativamente estável. Problemas
operacionais ocorridos durante os experimentos foram relativos somente ao entupimento
das válvulas solenóides, que possivelmente teriam sido evitados se houvesse
manutenção preventiva das mesmas por períodos pré-determinados. A escolha da
operação do MBBR em modo de bateladas sequenciais foi adequada por proporcionar
maior flexibilidade na alteração dos parâmetros operacionais, principalmente no que se
refere ao tempo de reação. Ademais, possibilitou a realização dos ensaios cinéticos no
próprio biorreator sem qualquer alteração das condições experimentais aplicadas.
A despeito da complexidade do processo de nitrificação, pode-se afirmar que foi
alcançada com êxito a nitrificação do efluente industrial, que possuía uma matriz
extremamente complexa e variável, no MBBR proposto.
176
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203
ANEXO I.1
Composição dos meios sintéticos autotróficos para o enriquecimento e isolamento
das AOB e das NOB
Componentes Teor no meio sintético (g L
-1
)
AOB
(SKINNER e WALKER,
1961
apud
SORIANO e
WALKER, 1968)
NOB
(HENGEL
apud
SORIANO e
WALKER, 1973)
Cloreto de amônio 0,15 -
Sulfato de amônio 0,35 -
Nitrito de sódio - 2,0
Sulfato de magnésio heptahidratado 0,11 0,05
Fosfato de potássio monobásico 0,22 -
Fosfato de potássio dibásico - 0,1
Cloreto de cálcio dihidratado 0,04 -
Carbonato de cálcio - 0,01
Cloreto de sódio 20 20
Solução de carbonato de sódio 5%
para ajuste do pH
4,0 mL L
-1
-
Indicador azul de bromotimol 0,04% 12 mL L
-1
-
Solução de micronutrientes
(Campos
et al.
, 1999)
0,5 mL L
-1
0,5 mL L
-1
204
ANEXO I.2
Composição da solução de micronutrientes adicionada aos meios sintéticos para o
enriquecimento e isolamento das AOB e NOB (CAMPOS
et al.
, 1999)
Componentes
Teor na solução de
micronutrientes
(g L
-1
)
EDTA 50
Sulfato de ferro heptahidratado
2,7
Sulfato de zinco 12,5
Cloreto de cálcio 5,5
Cloreto de manganês 3,2
Sulfato de cobre 1,0
Molibdato de amônio 1,0
Cloreto de cobalto 0,9
205
ANEXO I.3
Composição do meio sintético heterotrófico para o crescimento das bactérias
presentes nos frascos de isolamento, adaptado de LIN
et al.
(2005)
Componentes
Teor no meio sintético
(g L
-1
)
Amido solúvel 0,13
Glicose 0,33
Peptona 0,06
Fosfato de potássio
monobásico
0,05
Sulfato de magnésio
heptahidratado
0,07
Bicarbonato de sódio 0,67
Cloreto de amônio 0,15
Cloreto de sódio 20
Solução de micronutrientes
(CAMPOS
et al
., 1999)
0,1 mL L
-1
206
ANEXO I.4
Protocolo para a aplicação da técnica de FISH
I.4.1 - Procedimento utilizado para obter a biomassa aderida
1- Retirou-se aleatoriamente do biorreator três biomídias, sempre em torno de cinco
horas de aeração, momento considerado como o de maior atividade celular;
2- Colocou-se cada biomídia em um bécher de vidro no qual foi adicionado 5 mL de
solução 1xPBS (tampão fosfato salino). Posteriormente, o bécher foi colocado no
aparelho de ultra-som MS200 marca Thornton, onde permaneceu por 30 min;
3- Terminado o tempo destinado ao ultra-som retirou-se, com o auxílio de uma pinça,
a biomídia do meio líquido. No caso de restar algum material aderido à peça o
mesmo era retirado com o auxílio de uma agulha;
4- O líquido restante foi transferido para um tubo Falcon de 15 mL o qual foi levado à
centrífuga (marca Quimis) por 15 min a 1500 rpm;
Terminado o tempo destinado à centrifugação, o sobrenadante foi descartado e o
material centrifugado referente à biomassa presente nos três tubos iniciais, foi misturado
em um único tubo Falcon e, então, deu-se prosseguimento à etapa de fixação.
I.4.2 Procedimento e soluções da etapa de fixação
Soluções Estoque:
•
tampão fosfato de sódio 0,5 mol L
-1
(pH 7,2-7,4)
•
NaCl 5,0 mol L
-1
•
tampão 3xPBS (NaCl 390 mmol L
-1
e tampão fosfato 30 mmol L
-1
em pH 7,2 – 7,4)
•
tampão 1xPBS (NaCl 130 mmol L
-1
e tampão fosfato 10 mmol L
-1
em pH 7,2 – 7,4)
*Esterilizar e guardar as soluções estoque na geladeira por no máximo 6 meses.
Agente fixador
Solução 4% paraformaldeído (PFA) em tampão PBS
Preparação:
1. Aquecer 20 mL de água destilada a 60
o
C;
2. Agregar 1,2121g de paraformaldeído (com cuidado para não aspirar) e gotas de
NaOH 2 mol L
-1
até dissolução do PFA (não mais que 5 – 10 min.); tomar cuidado
com os vapores tóxicos;
207
3. Agregar 10 mL de 3x PBS;
4. Esfriar a 20
o
C e ajustar o pH a 7,2 – 7,4 com gotas de HCl. Se houver precipitado,
filtrar em membrana 0,45
µ
m;
5. Armazenar a 4
o
C por não mais que duas semanas.
Procedimento utilizado para a fixação das células presentes na biomassa:
1- Adicionou-se 4 mL de solução 1xPBS e 12 mL de solução PFA-PBS 4% fria à
biomassa presente no tubo Falcon, esta foi ressuspendida e homogeneizada no
agitador de tubos da marca Phoenix por 30 s, e então incubada a 4ºC por três
horas;
2- Passado o tempo destinado à incubação, o tubo Falcon foi levado à centrifuga nas
mesmas condições aplicadas para a obtenção da biomassa e, posteriormente, o
sobrenadante foi descartado;
3- Sobre a biomassa centrifugada foi adicionado 5 mL de solução 1xPBS, sendo a
mesma ressuspendida no agitador de tubos e centrifugada nas mesmas condições
anteriores, descartando-se o sobrenadante;
4- Adicionou-se, então, quantidade equivalente de solução 1xPBS e etanol 96% PA e
promoveu-se a ressuspensão da biomassa;
5- As amostras fixadas foram armazenadas no freezer até serem hibridizadas.
A quantidade de solução 1xPBS e etanol adicionada foi determinada
empiricamente tendo variado entre 2,5 e 5,0 mL para cada reagente, dependendo da
menor ou maior quantidade de sólidos a serem fixados.
I.4.3 Procedimento e soluções da etapa de hibridização
Soluções Estoque:
•
Tris-HCl 1,0 mol L
-1
em pH 7,4
•
Na
2
EDTA 0,5 mol L
-1
•
NaCl 5,0 mol L
-1
•
Dodecil Sulfato de Sódio (SDS 10%)
•
Meio de montagem (glicerol:PBS, 5:1)
208
Preparo da solução de hibridização e do tampão de lavagem
A solução de hibridização e o tampão de lavagem devem ser preparados no
mesmo dia da hibridização. Os dois possuem os mesmos reagentes a não ser pela adição
de formamida na solução de hibridização.
O teor de alguns reagentes nestas soluções pode ser alterado conforme a
necessidade de cada amostra (conforme previamente comentado) sendo que estas
condições terão que ser obtidas empiricamente.
As Tabelas I.4.3.1 e I.4.3.2 apresentam, respectivamente, as condições para a
preparação do tampão de hibridização e do tampão de lavagem, sendo que o SDS 10%
deve ser o último componente a ser adicionado para evitar a precipitação na solução.
Tabela I.4.3.1 - Tampão de hibridização.
Componentes Volume na solução estoque Concentração final
NaCl 5,0 mol L
-1
3,6 mL 0,9 mol L
-1
Na
2
EDTA 0,5 mol L
-1
200
µ
L
5,0 mmol L
-1
Tris-HCl 1,0 mol L
-1
400
µ
L
20 mmol L
-1
SDS 10%
20
µ
L
0,01%
Formamida % condizente com a sonda utilizada
Água ultrapura completar para o volume final de 20 mL
Tabela I.4.3.2 - Tampão de lavagem.
Componentes Volume na solução estoque
Concentração
final
NaCl 5,0 mol L
-1
Dependente do teor de
formamida no tampão de
hibridização
ver Tabela I.4.3.3
Na
2
EDTA 0,5 mol L
-1
500
µ
L
5,0 mmol L
-1
Tris-HCl 1,0 mol L
-1
1000
µ
L
20 mmol L
-1
SDS 10%
50
µ
L
0,01%
Água ultrapura completar para o volume final de 50 mL
209
A Tabela I.4.3.3 apresenta a relação entre o teor de formamida no tampão de
hibridização e a concentração de NaCl no tampão de lavagem, que são parâmetros que
variam conforme as sondas e as amostras utilizadas.
Tabela I.4.3.3 – Relação do teor de formamida no tampão de hibridização com a
concentração de NaCl no tampão de lavagem.
Teor (%) de formamida no
tampão de hibridização
Volume (em
µ
L) de NaCl
5,0 mol L
-1
para um
volume final de 50 mL no
tampão de lavagem
Concentração final de
NaCl no tampão de
lavagem em mol L
-1
0 8900 900
5 6260 636
10 4400 450
15 3080 318
20 2150 225
25 1490 159
30 1020 112
35 700 80
40 460 56
45 300 40
50 180 28
55 100 20
60 40 14
65 0 -
Antes da hibridização propriamente dita, deve-se fazer o recobrimento das lâminas
com gel. Segue o procedimento:
1- Preparar 100 mL de gel;
2- Aquecer água ultrapura até 55 - 60ºC. Adicionar 0,1 g de gelatina em pó sob
intensa agitação e, na sequência, adicionar 0,01 g de sulfato de cromo e potássio.
Deixar reservada certa quantidade da água para o caso da temperatura passar de
60ºC;
210
3- Aguardar a dissolução total dos reagentes, sob a temperatura indicada, durante no
máximo 10 min;
4- Transferir a solução gel para um porta lâminas e mergulhá-las no mesmo por 1
min;
5- Retirar as lâminas evitando a formação de bolhas e colocá-las em outro porta
lâminas seco para que as mesmas sequem em temperatura ambiente.
Protocolo para a etapa de Hibridização
1. Adição das amostras
Adicionar as células pré-fixadas às lâminas secas em quantidade dependente da
turbidez da amostra. Pode variar de 1 a 5
µ
L. Espalhar a gota de amostra
cuidadosamente em cada poço tomando o cuidando de não raspar o gel. Deixar
secar a temperatura ambiente; o tempo é indeterminado.
2. Desidratação
Preparar 3 tubos Falcon de 50 mL com soluções de álcool etílico PA (50, 70, e
100%). Mergulhar as lâminas, previamente secas, por 3 min em cada solução
iniciando pela de menor concentração.
3. Tubos de hidridização
Utilizar tubos Falcon de 50 mL preparados com papel toalha umedecido na
solução de hibridização como câmara de hibridização. Pré-aquecer os mesmos na
estufa (46ºC) durante o tempo de preparo das lâminas.
4. Adição da sonda e da solução de hibridização às lâminas
Cada poço da lâmina comporta até 10
µ
L. Adiciona-se 9
µ
L da solução de
hibridização e 1
µ
L da sonda. Nos poços controle se adiciona apenas a solução de
hibridização (10
µ
L). Colocar as lâminas dentro dos tubos Falcon pré-aquecidos e
deixar na estufa pelo tempo e temperatura determinados.
211
5. Preparo da solução de lavagem
Aquecer a solução de lavagem em banho-maria por 5 min mantendo a
temperatura constante em 48ºC, antes de receber as lâminas. Retirar rapidamente
as lâminas do tubo de hibridização e passar para o tubo de lavagem, virar o tubo,
delicadamente, de um lado para o outro para homogeneizar e levar ao banho-
maria (48ºC) por 20 min. Ao retirar a lâmina do banho de lavagem lavá-la com um
pissete de água (no mínimo destilada) dos dois lados. Colocar as lâminas para
secar ao abrigo da luz em temperatura ambiente. O tempo é indeterminado, deve-
se esperar a lâmina secar completamente.
6. Adição de DAPI
Depois das lâminas secas adicionar 10
µ
L de DAPI em cada poço e deixar por 5
min ao abrigo da luz. Após os 5 min lavar com álcool 70%, retornar ao abrigo da
luz e deixar secar.
7. Adição do meio de montagem
Adicionar uma gota do meio de montagem no centro de cada poço e colocar uma
lamínula sobre a lâmina. Pressionar a lamínula para retirar possíveis bolhas. Antes
de adicionar as lamínulas imergi-las no álcool e limpá-las suavemente com papel.
Guardar as lâminas no congelador ao abrigo da luz ou observar ao microscópio.
212
ANEXO II
Cromatograma CG-MASSAS
Para obter os cromatogramas apresentados foi utilizado um cromatógrafo a gás
(CG) modelo 6890 (marca Agilent) acoplado ao detector seletivo de massas (DSM)
modelo 5973 (marca Agilent), com ionização por impacto eletrônico.
As condições de análise por CGAR utilizadas foram: injeção de 1 µL da amostra
sem divisão de fluxo, com abertura da válvula de divisão de fluxo por 0,8 min; temperatura
do injetor: 250ºC; coluna capilar: DB-WAX (Carbowax) com 30 m de comprimento, 0,25
mm de diâmetro interno e 0,25 µm de fase (J&W Scientifics); programação de
temperatura do forno: 40ºC por 5 min, 4ºC min
-1
até 230ºC. O solvente utilizado na
extração dos compostos orgânicos foi o diclorometano (Sigma-Aldrïch).
213
5.00 10.0015.0020.0025.0030.00 35.00 40.00 45.00 50.00 55.00 60.00
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
2000000
2200000
2400000
2600000
2800000
3000000
3200000
3400000
3600000
3800000
4000000
4200000
4400000
4600000
4800000
5000000
5200000
5400000
5600000
5800000
6000000
6200000
6400000
Time-->
Abundance
TIC: LIN.D
214
5.00 10.00 15.00 20.0025.0030.00 35.00 40.00 45.0050.0055.00 60.00
200000
400000
600000
800000
1000000
1200000
1400000
1600000
1800000
2000000
2200000
2400000
2600000
2800000
3000000
3200000
3400000
3600000
3800000
4000000
4200000
4400000
4600000
4800000
Time-->
Abundance
TIC: LIN_R.D
215
Livros Grátis
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