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PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM AGRONOMIA
Avaliação da variabilidade genética e agrupamento de acessos e
cultivares de Brachiaria por marcadores de RAPD
ANA CLAUDIA AMBIEL
Presidente Prudente – SP
2007
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PRÓ-REITORIA DE PESQUISA E PÓS-GRADUAÇÃO
MESTRADO EM AGRONOMIA
Avaliação da variabilidade genética e agrupamento de acessos e
cultivares de Brachiaria por marcadores de RAPD
ANA CLAUDIA AMBIEL
Dissertação apresentada a Pró-Reitoria de
Pesquisa e Pós-Graduação, Universidade do
Oeste Paulista, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Agronomia.
Área de Concentração: Produção Vegetal
Orientador: Prof. Dr. Nelson Barbosa Machado
Neto
Presidente Prudente – SP
2007
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FICHA CATALOGRÁFICA
ANA CLAUDIA AMBIEL
Avaliação da variabilidade genética e agrupamento de acessos e
cultivares de Brachiaria por marcadores de RAPD
Dissertação apresentada a Pró-Reitoria de
Pesquisa e Pós-Graduação, Universidade do
Oeste Paulista, como parte dos requisitos para
obtenção do título de Mestre em Agronomia.
Presidente Prudente, 18 de julho 2006.
BANCA EXAMINADORA
________________________________________
Prof. Dr. Nelson Barbosa Machado Neto
orientador
Universidade do Oeste Paulista
________________________________________
Prof. Dr. Rogério Fernandes de Souza
Universidade Estadual de Londrina
________________________________________
Prof. Dr. José Salvador Simoneti Foloni
Universidade do Oeste Paulista
AGRADECIMENTOS
Ao professor orientador, Dr. Nelson Barbosa Machado Neto, que além de
orientador é um grande amigo.
Ao meu colega de trabalho José Eduardo Creste pelos conselhos e
palavras de incentivo.
A colega Luciana Machado Guaberto e a aluna Talita Marques Vanderlei
as quais serei sempre grata.
Ao programa de pós-graduação da Universidade do Oeste Paulista pela
disponibilização de recursos financeiros e equipamentos para a realização das análises
moleculares.
E a EMBRAPA – CNPGC, que gentilmente cedeu material do banco de
germoplasma, sem o qual não seria possível a realização deste trabalho.
Muito Obrigada !
DEDICATÓRIA
Dedico ao meu marido Eduardo pelo incentivo e colaboração e aos meus
filhos Helena e Paulo que sempre compreenderam a ausência da mãe em muitos
momentos ao longo destes anos.
E a toda a minha família que mesmo de longe acompanha e torce pelas
minhas conquistas.
“[...] tudo vale a pena se a alma não é pequena [...]”
Fernando Pessoa
SUMÁRIO
INTRODUÇÃO ......................................................................................................................................... 7
REFERÊNCIAS ..................................................................................................................................... 11
CAPÍTULO I - AGRUPAMENTO DE ACESSOS E CULTIVARES DE TRÊS ESPÉCIES DE
BRACHIARIA POR RAPD ...................................................................................................................... 12
RESUMO .................................................................................................................................. 13
ABSTRACT ............................................................................................................................... 14
INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 15
MATERIAL
E
MÉTODOS ........................................................................................................... 19
RESULTADOS
E
DISCUSSÃO .................................................................................................. 22
CONCLUSÕES ......................................................................................................................... 28
REFERÊNCIAS ......................................................................................................................... 29
CAPÍTULO II - ESTUDO DA DISSIMILARIDADE GENÉTICA EM ACESSOS E CULTIVARES DE
BRACHIARIA POR RAPD ...................................................................................................................... 33
RESUMO .................................................................................................................................. 34
ABSTRACT ............................................................................................................................... 35
INTRODUÇÃO .......................................................................................................................... 36
MATERIAL
E
MÉTODOS ........................................................................................................... 39
RESULTADOS
E
DISCUSSÃO .................................................................................................. 43
CONCLUSÕES ......................................................................................................................... 51
REFERÊNCIAS ......................................................................................................................... 52
7
INTRODUÇÃO
No Brasil as cadeias produtivas de carne e leite têm importante
participação no PIB nacional e na pauta de exportações brasileiras. Com um rebanho
bovino de aproximadamente 207 milhões de cabeças (IBGE, 2005), este tem como
principal fonte de alimento as pastagens. Assim, os sistemas de produção a pasto
abastecem o mercado interno de carne e leite com preços acessíveis, além de
propiciar ao país uma importante vantagem competitiva no mercado internacional
desses dois produtos.
O Brasil é um país com mais 845 milhões de hectares. Do total do seu
território, 28% é considerado área agricultável. Nesse contexto, as pastagens naturais
e cultivadas aparecem com excepcional destaque, ocupando cerca de 177 milhões de
hectares, ou seja, 73% da área do setor agropecuário (IBGE, 1996).
As gramíneas do gênero Brachiaria, de origem Africana, foram
introduzidas no Brasil a partir da década de 1950. Entretanto, a verdadeira expansão
ocorreu nas décadas de 1970 e 1980, principalmente nas regiões de clima mais
quente (ZIMMER et al., 1988). Na região do cerrado, a introdução do gênero
Brachiaria foi, sem dúvida alguma, o elemento responsável pela grande expansão da
pecuária. Estima-se que, no Brasil, 85% das pastagens implantadas seja do gênero
Brachiaria (KELLER-GREIN et al., 1996). O Brasil é maior produtor de sementes de
forrageiras tropicais do mundo. Considera-se que anualmente são comercializadas
100.000 toneladas de sementes de forrageiras tropicais, com um valor bruto estimado
em US $ 100 milhões. O País é também o maior exportador, com um volume
aproximado de 5 mil toneladas de sementes exportadas anualmente, principalmente
para suprir os mercados da América do Sul e Central (ANDRADE, 2004).
O gênero Brachiaria é constituído por cerca de cem espécies. No Brasil,
foram encontradas 15 espécies deste gênero, sendo sete de introdução recente: B.
brizantha, B. decumbens, B. dictyneura, B. humidicola, B. arrecta, B. ruziziensis e B.
vittata. As outras espécies foram introduzidas há várias décadas e são consideradas
naturalizadas: B. extensa, B. mutica e B. plantagíena. Além dessas, ocorrem cinco
8
espécies nativas: B. adspersa, B. fasciculata, B. mollis, B. reptens e B. venezuelae
(SOARES FILHO, 1996).
Porém, somente cinco acessos pertencentes a três espécies de
Brachiaria (B. brizantha, B. decumbens e B. humidicola) deram origem aos 20
cultivares liberados em diversos países da América tropical, entre eles: Brasil, Cuba,
México, Venezuela, Costa Rica, Colômbia, Panamá e Equador. Como conseqüência
desse fato, a base genética dos materiais cultivados de Brachiaria é extremamente
estreita, e os conhecimentos adquiridos sobre o gênero estão baseados em poucos
genótipos (KELLER-GREIN et al., 1996).
Além disso, as espécies de maior importância agronômica
(B.decumbens e B.brizantha) são predominantemente tetraplóides (2n=4x=36) e
apomíticas. A apomixia é caracterizada pelo desenvolvimento do embrião a partir de
uma célula não-fertilizada, ou seja, a formação do embrião ocorre sem a fusão dos
gametas masculino e feminino. Assim, a descendência contém exatamente a
constituição genética da planta-mãe. Esse fato também dificulta o aumento da
variabilidade genética desse gênero (ASSIS et al., 2003). Entretanto, Valle (1990)
encontrou acessos totalmente sexuais em espécies tidas como apomíticas
obrigatórias (B. decumbens, B. dictyoneura e B. jubata), e sexualidade alta em
espécies de importância econômica (B. brizantha e B. humidicola). E para Marcos
Filho (2005), a apomixia geralmente não é completa, podem ocorrer uma taxa de
variável de sexualidade, de acordo com a região e ano de produção. Cita como
exemplo, o capim colonião no qual se encontra uma taxa de sexualidade média de
5%
As espécies com maior difusão e importância econômica no Brasil são:
B. brizantha, B. decumbens, B. ruziziensis e B. humidicola. B. brizantha apresenta
uma ampla distribuição natural em toda a África Tropical (KELLER-GREIN et al.,
1996), ocorrendo sob uma precipitação anual acima de 800 mm. Nos lugares de
origem, B. brizantha varia consideravelmente, sendo possível a seleção de tipos
distintos. Esta espécie diferencia-se de B. decumbens e B. ruziziensis por ser de porte
quase ereto, enraizar muito pouco nos nós, possuir folhas pilosas em forma de canoa
e rácemos geralmente mais longos. É uma espécie perene, cespitosa, com colmos
9
eretos ou suberetos, pouco radicantes nos nós inferiores, e com porte de 1 a 1,5 m de
altura (SOARES FILHO, 1996).
B. ruziziensis está mais proximamente relacionada com B. decumbens,
da qual difere, no entanto por ser de porte maior e apresentar a gluma inferior distante
do resto da espigueta (SOARES FILHO, 1996). É originária da África, porém,
apresenta distribuição natural bastante restrita (KELLER-GREIN et al., 1996),
ocorrendo em condições úmidas e não inundáveis. É uma espécie perene, subereta,
com 1-1,5 m de altura, apresenta a base decumbente e radicante nos nós inferiores.
Possui rizomas fortes, em forma de tubérculos arredondados e com até 15 mm de
diâmetro. As folhas são lineares e lanceoladas, de cor verde amareladas
(SEIFFERT,1980).
B. decumbens é uma espécie perene, que ocorre de forma nativa no
leste tropical da África, restrita a uma estreita faixa de latitude (KELLER-GREIN et al.,
1996) em altitudes acima de 800 m, sob um clima moderadamente úmido, em
pastagens abertas ou em áreas com arbustos esporádicos e em solos férteis
(BOGDAN, 1977 apud SOARES FILHO, 1996). No Brasil há dois tipos bastante
distintos: o primeiro foi introduzido pelo IPEAN (Instituto de Pesquisa Agropecuária do
Norte) em 1965 sob a denominação de cultivar IPEAN; o segundo, por São Paulo em
1970 proveniente da Austrália, mas de origem africana, denominado cultivar Basilisk.
Sendo este cultivar o mais plantado na região dos cerrados, é perene, de 0,6-1 m de
altura, subereto e pouco radicante. As folhas são linear-lanceoladas, com 150-250
mm de comprimento e 20 mm de largura, rígidas e esparsamente pilosas. A planta
forma relvado com folhas junto ao solo (SEIFFERT, 1984).
B. humidicola é originária da África Equatorial, com ampla distribuição
natural (KELLER-GREIN et al., 1996). Apresenta como características: alta
capacidade de adaptação a vários tipos de solos, especialmente, os de baixa
fertilidade e com alto nível de umidade; rebrota vigorosa, mesmo com manejo baixo e
intervalos pequenos de cortes sob pastejo; estolões finos e fortes; folhas de cor
verde-pálida e fortemente denticuladas nas margens; resistencia ao pastejo e
apresenta boa tolerância ao encharcamento, podendo ser plantada em várzeas; não
10
tolerante ao fogo e com produção de pouca semente (até 50 kg/ha); seu principal
atributo são os fortes estolões produzidos com a alta habilidade de enraizamento,
promovendo rápida cobertura do solo, que o protege e, ainda, compete com as
pragas (SOARES FILHO, 1996).
B. arrecta, mais conhecida como “Tanner grass”, é originária da África
de locais encharcados e nas margens de lagos e rios. É perene, subereta, fortemente
radicante nos nós inferiores. As folhas são lanceoladas, brilhantes de aspecto
suculento e de cor verde-escura. É uma gramínea muito agressiva, com preferência
para locais úmidos ou alagados, exige solos de média fertilidade, porém não tolera
solos secos. Não possui sementes viáveis, sendo a multiplicação feita através de
material vegetativo (ROCHE et al., 1990 apud SOARES FILHO, 1996).
Brachiaria híbrido cv. ‘Mulato’ é o primeiro híbrido comercial obtido no
Centro Internacional em Agricultura Tropical (CIAT) em Cali, Colômbia. É originário do
cruzamento de um acesso sexual tetraploidizado de B. ruziziensis com a espécie
tetraplóide B. brizantha cv. ‘Marandu’. O capim Mulato se adapta a solos de boa
drenagem, de fertilidade média a alta, com pH acima de 5.0, exigindo uma
precipitação anual de pelo menos 600mm em sequeiro. A forrageira suporta bem os
longos períodos de estiagem, entre 7 a 8 meses, devido a seu sistema radicular
profundo (ARGEL et al., 2006).
11
REFERÊNCIAS
ANDRADE, R. P. et al. A parceria EMBRAPA-UNIPASTOS e seu impacto na
pesquisa e desenvolvimento de pastagens tropicais do Brasil. Matéria Técnica 2004.
Disponível em:
http://www.abrasem.com.br/materia_tecnica/2004/0008_parceria_embrapa_unipastos.htm
Acesso em 27 de maio de 2007
ARGEL, P.J. et al. Cultivar Mulato (Brachiaria híbrido CIAT 36061) Gramínea de
alta producción y calidad forrajera para los trópicos. Publication CIAT/Semilhas
Papalotla. 24 p. , 2006.
ASSIS, G.M.L. et al.
Discriminação de Espécies de Brachiaria Baseada em Diferentes
Grupos de Caracteres Morfológicos.
Revista da Sociedade Brasileira de Zootecnia, v.
32, n. 3, p. 576-584, 2003.
SOARES FILHO, C. V. et al. Brachiaria – Espécies e variedades recomendadas para
diferentes condições. Campinas, CATI, (Boletim Técnico, 226) 26 p., 1996.
IBGE Censo Agropecuário 1996. Disponível em:
http://www.sidra.ibge.gov.br/bda/agric/ Acesso em 20 de maio de 2007
KELLER-GREIN, G. et al. Natural variation in Brachiaria and existing germplasm
collections. In: MILES, J. W. et al. (Eds.). Brachiaria: Biology, Agronomy, and
Improvement. Cali: CIAT, p.18-45, 1996.
MARCOS FILHO, J. Fisiologia de Sementes de plantas cultivadas. FEALQ,
Piracicaba, 495p., 2005
SEIFFERT, N.F. Gramíneas forrageiras do gênero Brachiaria. Campo Grande,
Embrapa- CNPGC (Circular Técnica, 1) 74 p., 1984
ZIMMER, A. H. et al. Manejo de plantas forrageiras do gênero Brachiaria. In:
SIMPÓSIO SOBRE MANEJO DA PASTAGEM, 9., Piracicaba, 1988. Anais...
Piracicaba, FEALQ, p. 141-183, 1988
12
CAPÍTULO I
Agrupamento de acessos e cultivares de três espécies de Brachiaria por RAPD
13
RESUMO
Agrupamento de acessos e cultivares de três espécies de Brachiaria por RAPD.
O propósito deste trabalho foi determinar a similaridade genética de entre acessos de
germoplasma e cultivares comerciais três espécies de Brachiaria (inter e
intraespecífica), através de marcadores RAPD. Sementes foram utilizadas como fonte
de DNA. 10 primers decâmeros foram selecionados de 120 primers avaliados,
produzindo 107 bandas polimórficas, as quais foram utilizados para a análise de
variância molecular (AMOVA), o coeficiente de similaridade de Jaccard e índices de
fixação gênica. 24,40% da variabilidade genética total está contida entre as espécies
e 75,60% dentro destas, com índice de fixação gênica (FST) 0,24. No dendrograma
houve a formação de dois ramos, um formado por P. maximum e B. arrecta e o outro
subdividido em três: todas amostras de B. ruziziensis; todos os acessos de B.
decumbens e três acessos de B. brizantha e o último com dois acessos de B.
brizantha mais as B. brizantha comerciais e a B. decumbens cv ‘Basilisk’. Foi possível
agrupar os acessos e cultivares de Brachiaria através de RAPD. O índice de variabilidade
genética entre espécies foi considerado baixo, sendo inferior a valores determinados em
algumas espécies autógamas. B. brizantha apresenta maior variabilidade genética e menor
FST indicando maior fluxo gênico intra-específico do que as outras.
PALAVRAS CHAVES: Brachiaria, marcadores moleculares, variabilidade genética,
dendrograma, índice de fixação gênica
14
ABSTRACT
RAPD grouping of accesses and cultivars of three Brachiaria species
The aim of this work was the determination of intra and intergenetic similarity between
three Brachiaria species among germplasm accesses and commercial materials
throughout RAPD markers. Seeds were used as DNA source. 10 decamers primers
were selected between 120 primers assayed and 107 polymorphic bands were used to
perform the molecular variance analysis (AMOVA), Jaccard similarity and species
fixation index. 24.4% of the total variability was contained between species and 75.6%
inside the species, with a species fixation index (FST) of 0.24. The tree showed that
two major branches were formed, one with the three outgroup species and other with
the species, this one split in three minor branches one with all B. ruziziensis samples;
other with all B. decumbens accessions and three of B. brizantha and the last with two
B. brizantha accesses, all commercial cultivars and B. decumbens cv. ‘Basilisk’. It
was possible to group, throughout RAPD, Brachiaria accesses and cultivars. The
genetic variability index between species was considered low and somehow low when
faced with autogamous species. B.brizantha showed the highest genetic variability and the
lowest FST what means that there is a higher genetic flux intra specific than the others.
KEY WORDS: Brachiaria, molecular markers, genetic variability, dendrogram, genetic
fixation index
15
INTRODUÇÃO
As espécies de Brachiaria têm alta produção de matéria seca,
apresentam excelente resposta a fertilizantes, são perenes, e permanecem verdes
mesmo durante os períodos de baixos índices pluviométricos. Os valores nutricionais
indicam alta palatabilidade, o que proporciona aos animais altos níveis de ingestão
(Ndikumana e Leeuw, 1996).
Sete espécies africanas perenes (B. arrecta, B. brizantha, B.
decumbens, B. dictyoneura, B. humidicola, B. mutica, e B. ruziziensis) têm sido
amplamente utilizadas como forrageiras especialmente na América tropical, e em
menores proporções na Ásia, no Sul do Pacífico e na Austrália. Na América do Sul e
Central as principais gramíneas tropicais utilizadas pertencem ao gênero Brachiaria.
Somente no Brasil existem aproximadamente 40 milhões de hectares de pastagem de
Brachiaria, sendo que mais de 85% ocupado por B. decumbens cv. 'Basilisk e B.
brizantha cv. 'Marandu' (Keller-Grein et al., 1996).
Todavia, a base genética dos cultivares comerciais de Brachiaria é
extremamente estreita, devido a origens das mesmas estarem ligadas a somente uns
poucos acessos de três espécies de Brachiaria (B. brizantha, B. decumbens e B.
humidicola; Keller-Grein et al., 1996) e a predominância da apomixia, que confere à
descendência a mesma constituição genética da planta-mãe. Todavia, aparentemente
a apomixia parece não ser completa, permitindo alguma taxa de recombinação entre
e dentro das espécies de acordo com as condições de ano e local de produção
(Marcos Filho, 2005).
Para Shelton (2007) a identificação correta entre algumas espécies de
Brachiaria é difícil e até mesmo confusa. Por exemplo na estação de pesquisa de
Kitale, no Kênia, por muito tempo as B. ruzuziensis e B. brizantha não foram
diferenciadas. Outro problema de identificação acontece com o cv ‘Basilisk’
amplamente difundido como sendo uma B. decumbens, mas segundo Maass (1996)
citando Renvoize et al. (1996) a classificação correta é uma B. brizantha, sugerindo,
porém, que nenhuma alteração seja feita, antes de uma completa revisão e
classificação taxonômica do gênero.
16
A taxonomia do gênero Brachiaria não é satisfatória nem em relação à
posição entre as espécies e nem na inter-relação com outros gêneros, não existindo
chave adequada para Brachiaria, embora uma classificação setorial tenha sido
proposta por Stapf (1919) para 56 espécies africanas e, em nível mundial, por Pilger
(1940) para 50 espécies (ambos citados por Renvoize et al., 1996). Estes
propuseram, para tanto, a aplicação de análises estatísticas da morfologia, aliadas à
outras informações, como forma de proporcionar um sistema razoável de
classificação ainda inexistente (Renvoize et al., 1996).
Porém, o conhecimento de variabilidade e divergência genética entre
acessos e espécies do gênero Brachiaria é de fundamental importância para o
sucesso no melhoramento intra e interespecífico neste gênero (Assis et al., 2001).
Além disso, o conhecimento da diversidade genética entre os acessos contribui para a
redução nos custos de manutenção dos bancos de germoplasma, pois permitem a
eliminação dos acessos similares. (Machado Neto et al., 2002).
Com o objetivo de avaliar a variabilidade existente, vários autores
trabalharam com diferentes variáveis como Valle (1990) que utilizou descritores
morfológicos, não afetados pelo meio-ambiente, ou seja, características de origem
genética para avaliar 73 acessos de B. brizantha, B. ruziziensis, B. jubata e B.
decumbens. B. brizantha, B. decumbens e B. ruziziensis, classificando-as de forma
distinta. Alguns acessos apresentaram pequena distância filogenética, permitindo o
intercambio gênico entre espécies, deste que as ploidias coincidam e exista
sexualidade. B. jubata, contudo, apresentou maior individualidade quando comparado
com as outras três espécies. Na análise intra-específica, observou-se que B.
brizantha, com maior número de acessos, apresentou maior variabilidade nas
características estudadas, quando comparadas B. decumbens e B. ruziziensis.
De forma análoga, Assis et al. (2003) analisaram 301 acessos,
pertencentes a seis diferentes espécies de Brachiaria. Entre os grupos de caracteres
estudados, os vegetativos e reprodutivos foram os mais discriminantes para as
espécies. Assim, B. decumbens e B. humidicola só foram discriminados pelos
caracteres de pilosidade; B. jubata e B. dictyoneura foram completamente
discriminadas pelos caracteres vegetativos e B. brizantha e B. ruziziensis foram
17
discriminadas pelos caracteres reprodutivos. Porém, nenhum caractere foi capaz de
separar em grupos diferentes as espécies B. humidicola e B. dictyoneura.
Machado Neto et al. (2002) utilizando-se de eletroforese de proteína,
extraída de sementes, para verificar a diferença entre cinco acessos de seis espécies
de Brachiaria concluíram que em B. brizantha, B. decumbens, B. ruziziensis, B.
humidicola e B. nigropedata os acessos apresentaram variações suficientes para
separar os acessos e que em B. jubata os acessos são geneticamente muito
homogêneos.
Caracteres morfológicos têm sido utilizados, tradicionalmente, como
assinaturas da identidade, pureza varietal e genética, constituindo-se em uma base
pobre por ser uma medida indireta da composição genética do material sofrendo forte
influência ambiental. Caracteres moleculares revelam diferenças genéticas mais
rapidamente, com maior precisão e sem o obscurecimento causado pelo efeito
ambiental, oferecendo vantagens significativas em termos de discriminação,
confiabilidade, rapidez e custo reduzido (Assis et al., 2003). Uma técnica
relativamente nova, o RAPD (Random Amplified Polymorphic DNA; Williams et al.,
1990), tem sido adotada por alguns pesquisadores envolvidos no desenvolvimento de
métodos de identificação de cultivares (Weeden, 1992; Menezes et al., 2002)
principalmente por ser uma técnica simples que não requer nenhuma informação
prévia sobre seqüências de nucleotídeos do genoma da espécie, além de ser
bastante acessível e de custo relativamente baixo que pode ser utilizado onde as
informações moleculares ainda são escassas.
Comparando os métodos tradicionalmente utilizados para determinação
da pureza genética e identificação de cultivares, McDonald (1995) defende algumas
vantagens da utilização de RAPDs: (i) marcadores RAPD proporcionam grande
potencial para a discriminação de cultivares já que a composição de nucleotídeos de
um gene está sendo diretamente determinada em vez do produto da expressão do
gene, como uma enzima; (ii) a versatilidade da análise de RAPD é maior do que da
eletroforese de proteína. Mais de 700 “primers” estão disponíveis, contra apenas 20
sistemas enzimáticos; (iii) a análise de RAPD requer os mesmos equipamentos gerais
e qualidade profissional que a técnica de eletroforese de proteína, apenas alguns
18
equipamentos adicionais são necessários, como o termociclador; (iv) o custo e o
tempo, para uma análise completa de RAPD, são equivalentes aos protocolos atuais
de eletroforese de proteínas.
Esse trabalho teve como objetivos determinar, a similaridade genética
inter e intraespecífica entre acessos de germoplasma e cultivares comerciais de três
espécies de Brachiaria, através de marcadores RAPD.
19
MATERIAL E MÉTODOS
O experimento foi conduzido no laboratório de Genética Molecular e
Citogenética da Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE, em Presidente
Prudente – SP. Utilizou-se como fonte de DNA sementes de cinco diferentes acessos
das espécies de B. brizantha, B. decumbens e B. ruziziensis cedidas pela EMBRAPA
– Gado de Corte (Empresa Brasileira de Pesquisa Agropecuária - Centro Nacional de
Pesquisa de Gado de Corte) e de cultivares comerciais das mesmas espécies, além
de uma amostra da Brachiaria híbrida cv ‘Mulato’, dois cultivares comercias de
Panicum maximum, ‘Mombaça’ e ‘Tanzânia’ e folhas de B. arrecta totalizando 27
amostras (Tabela 1).
Para a extração de DNA utilizou-se o método de Doyle e Doyle (1987)
com adaptações. Utilizou-se de 6 a 8 sementes por amostra, as quais foram
maceradas em cadinho de porcelana; exceto B. arrecta, da qual aproximadamente
1cm
2
de folha foi macerado em nitrogênio líquido. Após maceração o material foi
transferido para microtubos de 1,5mL contendo 700µL de tampão CTAB 2% à 65°C.
O material foi homogeneizado e mantido à 65°C por 4 0 minutos. Acrescentaram-se
então 700µL de clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) e homogeneizou-se por inversão.
As amostras foram centrifugadas a 12000 rpm por 15 minutos, sendo a porção
aquosa recuperada e transferida para outro tubo, l acrescentando-se 8% de acetato
de amônio a 7,5M e 54% do volume total de isopropanol absoluto a -20ºC, mantendo-
se nesta temperatura por 24 horas. Posteriormente o material foi centrifugado a
14000rpm por 5 minutos, o sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado com
700µL de etanol 70% a 8ºC, centrifugando-se novamente a 14000rpm por 1 minuto. O
etanol foi descartado e o precipitado seco em fluxo de ar à temperatura ambiente. O
DNA foi hidratado em 100µL de tampão TE em banho seco por 1 hora à 55°C e
quantificado em espectrofotômetro, a 260 nm, e diluído com TE para a concentração
de 10ng µL
-1
.
As condições de amplificação foram baseadas em Williams et al. (1990)
com modificações. O DNA genômico foi amplificado em um volume de reação de
25µL, contendo 10% de tampão Tris-KCl (Tris-HCl 20mM, pH 8,4 e KCl 50mM), 1,5
20
mM MgCl
2,
0,4µM de primer (oligonucleotídeos), 0,2µM de cada dNTP, uma unidade
de Taq DNA Polimerase e DNA molde. As reações de RAPD foram amplificadas em
termociclador “MJ – PTC 100” programado para 43 ciclos com passo inicial de
desnaturação a 94°C por três minutos, seguidos por um minuto a 94°C para
desanelamento, um minuto a 37°C para anelamento com primers e 30 segundos a
72ºC para elongação da cadeia, dando-se após 43 ciclos um passo final de extensão
a 72°C por cinco minutos.
Tabela 1. Relação dos acessos e dos cultivares comerciais de Brachiaria com o
respectivo código, identificação (Ident.), registro nacional de germoplasma/cultivares,
região e pais de origem do material catalogado no banco de germoplasma da
Embrapa – Gado de Corte.
Acessos da Embrapa
–
Gado de Corte
Código Ident.
Registro
Região de origem
-
Pais
B. ruziziensis
ruz1 R100 BRA005541
Trans Nzoia/Quênia
B. ruziziensis
ruz2 R106 BRA005649
Bujumbura/Burundi
B. ruziziensis
ruz3 R108 BRA005584
Cibitoke/Burundi
B. ruziziensis
ruz4 R109 BRA005631
Ruyigi/Burundi
B. ruziziensis
ruz5 R128 BRA002291
-------
B. decumbens
de1 D53 PI355744 -------
B. decumbens
de2 D7 BRA004472
South Nyanza/Quênia
B. decumbens
de3 D9 BRA004499
Nakuru/Quênia
B. decumbens
de4 D58 BRA000191
Embrapa- CPATU/Brasil
B. decumbens
de5 D59
BRA000116
Embrapa CNPMF /Brasil
(cv 'Ipean')
B. brizantha
Briz1 B158 BRA003719
Bungoma/Etiópia
B. brizantha
Briz2 B23 BRA001945
Embrapa CNPGC/Brasil
B. brizantha
Briz3 B67 BRA003336
Ilubabor/Etiópia
B. brizantha
Briz4 B112 BRA002844
Welega/Etiópia
B. brizantha
Briz5
B127
BRA003107
Gamo Gofa/Etiópia
Cultivares comerciais
B. brizantha cv ‘MG4’ brizMG4
02256
B. brizantha cv ‘Marandu’ brizMar
02250
B. brizantha cv `La libertad` brizLaliber
B. brizantha cv ‘Xaraés’ brizXaraes
04509
B. brizantha cv ‘MG5’ brizMG5
04509
B. decumbens cv ‘Basilisk’ decBasi
02277
B. ruziziensis Ruzi-a
02043
B. ruziziensis Ruzi-b
02043
B. arrecta arrecta
Híbrido cv ‘Mulato’ mulat 09669
P.maximum cv ‘Mombaça’ mombaça
01697
P.maximum cv ‘Tanzania’ tanzania
01699
21
As amplificações foram feitas em duas condições, com 25 e 50ng de
DNA molde, sendo consideradas apenas as bandas presentes nas duas
amplificações.
Os produtos de amplificação foram submetidos a eletroforese em géis de
agarose 1,5% (p/v) utilizando o tampão de corrida TBE ½X. O ladder AMRESCO
100pb foi utilizado como marcador de peso molecular. Os géis foram corados com
brometo de etídeo e visualizados em câmara com iluminação ultravioleta (câmara
CCD Alpha-Inmotech) sendo as imagens capturadas pelo software Chemilmager.
Testaram-se 120 primers decâmeros arbitrários da OPERON
Technologies Inc dos grupos A, C, D, G, X e Y. Para a primeira fase da seleção do
primers utilizou-se a amostra de B. brizantha cv ‘MG4’ pela maior disponibilidade de
material. Foram pré-selecionados 43 primers, por apresentarem bandas di, tri e
polimórficas bem visíveis. Na segunda fase os primers pré-selecionados foram
testados em uma amostra de B. ruziziensis. Seguindo os mesmos critérios,elegeram-
se dez primers para serem utilizados nas reações de RAPD em todas as amostras.
A presença ou ausência de bandas de tamanhos moleculares idênticos
foi usada para a construção de uma matriz de similaridade com base no cálculo do
coeficiente de similaridade de Jaccard, codificando “1” como a presença da banda no
gel e “0” como sua ausência. A fim de representar graficamente o padrão de
divergência genética, com a matriz de similaridade, foi construído um dendrograma
com o algoritmo de agrupamento UPGMA (Unweighted Pair-Group Method Using an
Arithmetic Average) utilizando-se para essa análise o programa NTSYS 2.0 (Rohlf,
1998).
A análise da variância molecular (AMOVA) foi calculada através da
decomposição total nos seus componentes entre e dentro de espécies utilizando-se
as distâncias ao quadrado (Excoffier et al., 1992) com auxílio do programa Arlequim
(Excoffier et al., 2006). Foi realizada para os quinze acessos do banco de
germoplasma da EMBRAPA – Gado de Corte e todos os cultivares comerciais e para
B. arrecta, excluídos os Panicum, sendo o híbrido cv ‘Mulato’ analisado junto com o
grupo de B. brizantha.
22
RESULTADOS E DISCUSSÃO
No dendrograma (figura 1) pode-se observar que a B. arrecta não foi
classificada no mesmo grupo das demais espécies de Brachiaria estudadas, assim
como as duas amostras de P. maximum. B. arrecta apresentou um baixo coeficiente
de similaridade em relação às demais amostras. Essa espécie apresenta um conjunto
de características vegetativas e reprodutivas bastante distinto, o que facilmente a
diferencia das outras espécies de Brachiaria. Renvoize et al. (1996) classifica através
daquelas a B. arrecta como pertencente ao grupo 3 e a B. brizantha, B. decumbens e
B. ruziziensis no grupo 5 .
O segundo grupo subdividiu-se em três subgrupos. O primeiro composto
por todas as amostras de B. ruziziensis; o segundo por todas as B. decumbens e por
três acessos de B. brizantha, todos eles com origem em banco de germoplasma e o
terceiro reunindo os dois acessos de B. brizantha restantes, as B. brizantha
comerciais, inclusive o híbrido cv 'Mulato' e a B. decumbens cv 'Basilisk'.
Atentando-se para a variabilidade genética dentro dos acessos é
possível destacar que há menor variabilidade genética entre os acessos de B.
decumbens e B. ruziziensis quando comparados com os acessos de B. brizantha.
Valle (1990) concluiu, através de análises multivariadas, para caracteres
morfológicos, que as espécies B. brizantha, B. decumbens e B. ruziziensis estão
superpostas, porém, B. brizantha é a que apresenta maior variabilidade nas
características estudadas, enquanto as outras duas espécies estão circunscritas a
áreas menores no gráfico de distribuição, indicando maior homogeneidade
morfológica entre os componentes analisados.
Considerando que os cultivares 'MG5' e 'Xaraés' tem a mesma origem
(acesso CIAT 26110), estão registrados com o mesmo número (04509) no cadastro
Nacional de Cultivares e são apomíticas, estes deveriam apresentar alto coeficiente
de similaridade, o que não foi observado. Isto pode ser explicado pela extração de
DNA de um “bulk” de sementes comerciais, sujeito a contaminação do material com
outras sementes de Brachiaria, fato comum nos campos de sementes. O mesmo se
aplica para os cultivares 'MG4' e 'La Libertad'. Todavia, apesar das sementes de
23
Coefficient
0.24 0.38 0.53 0.68 0.83
ruz1
ruz2
ruz4
ruz5
ruz3
ruzi-a
ruzi-b
de1
de2
de3
de4
de5
briz1
briz2
briz3
briz4
briz5
brizMAR
decBASIL
brizLALIBER
mulato
brizMG4
brizMG5
brizXARAES
arrecta
Mombaça
tanzania
B.ruziziensis (a e b) serem comerciais tal contaminação, não se fez sentir, pois as
mesmas seguiram o padrão da espécie, ficando todas no mesmo clado. A
confirmação desses resultados necessita de confirmação utilizando como fonte de
DNA folhas de plantas identificadas morfologicamente.
O cultivar de B. decumbens cv ′Basilisk′ apresentou maior proximidade
genética com o grupo da B. brizantha do que com as B. decumbens, corroborando as
observações de Renvoize et. al. (1996) de que o cultivar ′Basilisk′, amplamente
utilizado, e comumente identificado com B. decumbens é na verdade uma B.
brizantha.
Figura 1. Dendrograma obtido pelo agrupamento UPGMA das amostras de Brachiaria
com base no cálculo do coeficiente de similaridade de Jaccard utilizando o programa
NTSYS 2.0.
Na Tabela 2, podem-se observar os dez primers selecionados e a
seqüência destes, o número de bandas, o número de bandas polimórficas e o
tamanho dos fragmentos amplificados. Os fragmentos amplificados variaram de 200
24
pb a 1450 pb, encontrando-se dentro dos limites de 200 pb a 1500 pb, nos quais a
técnica RAPD, segundo Liu et al., (1999), apresenta boa reprodutibilidade.
Tabela 2.
Seqüências nucleotídicas dos primers, número de bandas, número de
bandas polimórficas e tamanho dos fragmentos amplificados em Brachiaria
Primers
Seqüência de
nucleotídeos (5’
→ 3’)
Nº de
bandas
Nº de bandas
polimórficas
Tamanho dos
fragmentos (pb)
A5
AGG GGT CTT G 9 8 260 a 1000
A9
GGG TAA CGC C 10 10 200 a 1000
D11
AGC GCC ATT G 10 8 300 a 900
G5
CTG AGA CCG A 12 12 200 a 1000
G9
CTG ACG TCA C 11 10 300 a 1300
G10 AGG GCC GTT C 7 7 300 a 1000
G17 ACG ACC GAC A 14 13 200 a 1200
X15 CAG ACA AGC C 11 10 300 a 1450
X17 GAC ACG GAC C 13 12 300 a 1000
Y1 GTG GCA TCT C 12 12 300 a 1300
Apesar de toda a importância que a espécie apresenta, pouco se
conhece a respeito da diversidade genética presente entre e dentro das espécies
cultivadas. Este conhecimento é de fundamental importância para o estabelecimento
das estratégias de melhoramento genético e de conservação destes materiais.
Através da análise de variância molecular (AMOVA), com base nos
dados de 107 bandas polimórficas verificou-se que 24,40% da variabilidade genética
total está contida entre as espécies de B. brizantha, B. decumbens, B. ruziziensis e B.
arrecta analisadas e 75,60% do total está contida dentro das espécies (entre os
acessos e os cultivares comerciais das mesmas espécies) conforme tabela 3.
Estudos sobre estrutura genética já demonstraram que a distribuição da
variação genética não é aleatória dentro das populações. De acordo com Hamrick
(1983) ela é determinada pelas seguintes características: sistema reprodutivo,
distribuição geográfica da espécie, tamanho efetivo das populações, modo de
reprodução e fluxo gênico através da dispersão do pólen. Sendo também resultado de
25
um conjunto de fatores evolutivos, que atuam na diversidade genética, introduzindo
novos alelos ou modificando as freqüências sendo eles: mutação, migração, seleção
natural e deriva genética (Weir, 1990).
Tabela 3: Resultado da análise de variância molecular (AMOVA) das espécies
comerciais e acessos de Brachiaria, agrupadas em 4 espécies (B. brizantha, B.
decumbens, B. ruziziensi e B. arrecta) obtidos por marcadores moleculares de RAPD
Fonte de variação GL SQ
Componentes de
variação
Porcentagem de
variação
Entre espécies 3 131,998 5,074 24,40%
Dentro de espécies 21 330,162 15,722 75,60%
Total 24 462,160 20,796
Espécies alógamas são, por definição, muito mais variáveis que as
autógamas (Yanaka, 2005). Em algumas populações de espécies alógamas, pode ser
encontrada variabilidade intrapopulacional maior que inter-populacional, como em
Lolium perenne (Sweeney & Dannenberger, 1994), Trifolium pratense (Kongkiatngam
et al., 1995), Medicago sativa ( Crochemore et al., 1996). Ferdinandez & Coulman
(2002) também detectaram variabilidade por RAPD e AFLP maior dentro das
populações que entre as populações analisadas de B. inermis e B. riparius. Dados
semelhantes foram obtidos por Vieira et al. (2004) em Lolium multiflorum, uma
alógama cultivada em largas extensões, 98% da diversidade total está contida dentro
das populações, enquanto que a diversidade genética entre as populações foi de
apenas 2%. Isto reduz a possibilidade de deriva genética e de endogamia,
contribuindo dessa maneira para a manutenção da alta diversidade genética dentro
das populações. Em várias outras espécies de forrageiras observou-se alta
variabilidade dentro das populações, em Bromus innermis, (Diaby e Casler, 2005);
bromegrass (Bromus riparius Rehm.; Ferdinandez et al., 2001), grama azul
(Bouteloua gracilis tion.; Phan, 2000), buffalograss (Buchloe¨ dactyloides, Peakall et
al., 1995); B. auleticus (Rivas, 2001), Lolium perenne L. (Huff, 1997; Kubik , 2001),
Chloris gayana K. (Ubi , 2003) e Pascopryum smithii (Larson , 2003).
26
Antagonicamente, alta diversidade genética entre populações é
encontrada principalmente para espécies autógamas, desde que as mesmas não
estejam sobre pressão de seleção artificial. Em Campanula microdonta Koidz., Oiki et
al. (2001) estabeleceram que 54 % da variância total estava dentro das populações e
46% entre populações, por análise de RAPD.
Garris et al. (2005) analisaram 234 acessos de arroz, representando
uma ampla distribuição geográfica pelo mundo do O. sativa através de microssatélites
e atribuíram 62,5% da variância total dentro das populações e 37,5% entre
populações. Esses resultados podem ser explicados pelo sistema de reprodução
autógama do arroz.
Liu et al. (2003) analisaram 260 linhas endogâmicas de milho, por
microssatélites, que representavam a diversidade genética dos cultivares comerciais
de importância ao melhoramento de clima temperado e várias linhas tropicais e
subtropicais encontrando apenas 8,3% de variância entre populações.
Para as espécies apomíticas, como é o caso da maioria dos acessos e
cultivares do presente trabalho, espera-se que a variação intrapopulacional seja
mínima ou nula, quando se utiliza AMOVA para a análise de indivíduos agrupados em
diferentes populações.
O parâmetro FST estima o fluxo gênico a partir da variância das
freqüências gênicas entre populações ou espécies, onde o menor valor indica que há
fluxo gênico entre as populações, por conseqüência maior a variabilidade genética.
Lu et al. (2005) estudaram a variabilidade genética em populações de
arroz selvagem (Zizania palustris var. palustris), no norte do estado de Wisconsin,
EUA e afirmaram que o FST de 0,30 encontrado está especialmente alto entre essas
populações, sugerindo baixas taxas de fluxo gênico entre as populações. Além disso
os autores sugerem que no estudo do fluxo gênico entre populações deva ser incluído
informações sobre a distribuição geográfica e o tamanho das populações. De modo
oposto, um alto nível de fluxo gênico entre as populações poderia também
homogeneizar a composição genética das populações, diminuindo a correlação entre
distancia geográfica e genética e levando a um baixo nível de FST.
27
Os valores absolutos do FST das espécies de Brachiaria variaram de
0,244 a 0,380, com valor médio de 0,244 (tabela 4). B. brizantha apresentou o menor
índice de fixação gênica, sendo 11,4% inferior ao médio, revelando ainda ter o maior
número de bandas polimórficas, indicando um maior fluxo gênico e por conseqüência
maior variabilidade genética, fato também observado no dendrograma (figura 1).
Deve-se considerar que das espécies estudadas, B. brizantha apresenta
o maior número de amostra (11) sendo 6 de cultivares comerciais, que apesar de
terem uma base genética muito estreita (Keller-Grein et al., 1996), foram selecionados
e lançados como cultivar nas últimas décadas. Para Garris et al., 2005, populações
que estão sob pressão de seleção apresentam menores valores de FST.
Tabela 4: Índices de fixação gênica (FST) médio e dentro das espécies, números de
amostras e o número de bandas polimórficas de cada espécie, obtidos pela análise
de variância molecular (AMOVA) dos acessos e cultivares comerciais de B. brizantha,
B. decumbens, B. ruziziensis e B. arrecta.
Espécies
FST (valores
absolutos)
FST %
Num.
amostras
Número de bandas
polimórficas na
espécie.
B. brizantha
0,216 -11,4% 11 89
B. decumbens
0,272 11,7% 6 57
B. ruziziensis
0,244 0,0% 7 74
B. arrecta
0,380 55,6% 1 0
Médio
0,244 25 107
FST % - valores relativos em porcentagem comparados com o FST médio de 0,244
28
CONCLUSÕES
Através dos marcadores moleculares de RAPD foi possível agrupar os
acessos e cultivares comerciais de Brachiaria, ferramenta que poderá auxiliar na
construção de uma chave taxonômica para o gênero.
Considerando a maioria das Brachiarias estudadas, como apomíticas ou
com apomixia facultativa, o índice de variabilidade genética entre espécies pode ser
considerado baixo, pois é inferior a valores encontrados para algumas espécies
autógamas. Para espécies apomíticas, a escassez de estudos realizados, não permite
comparações.
Entre as espécies estudadas a B. brizantha apresenta maior variabilidade
genética, maior número de bandas polimórficas e menor FST indicando maior fluxo gênico
intra-espécies do que as B. decumbens e B. ruziziensis.
A B. decumbens cv ‘Basilisk’ apresenta maior proximidade genética com o
grupo das B. brizantha do que com as B. decumbens.
Sugerimos outros estudos para a confirmação desses resultados
utilizando como fonte de DNA folhas de plantas sistematicamente identificadas.
29
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33
CAPITULO II
Dissimilaridade genética em acessos e cultivares de Brachiaria por RAPD
34
RESUMO
Dissimilaridade genética em acessos e cultivares de Brachiaria por RAPD
Este trabalho teve como objetivo estudar a dissimilaridade genética entre acessos de
seis diferentes espécies de Brachiaria e os principais cultivares comerciais através de
marcadores moleculares de RAPD. Foi extraído DNA de sementes de cinco diferentes
acessos de seis espécies de Brachiaria (B. decumbens, B. ruziziensis, B. nigropedata,
B. humidicola, B. jubata e B. brizantha), cedidas pela EMBRAPA – Gado de Corte, de
doze cultivares comerciais, dois cultivares de P. maximum e de folhas da B. arrecta.
120 primers foram testados e 10 selecionados e amplificados em duas diferentes
concentrações de DNA molde produzindo um total de 114 bandas polimórficas. Com
auxílio do Programa Genes 2007, foram estimados os índices de dissimilaridade
genética para todos as amostras analisadas. Considerando todas as amostra de
Brachiaria, o intervalo de dissimilaridade observado foi de 0,262 a 0,907 e entre os 30
acessos variaram de 0,262 a 0,880, sendo menor entre dois acessos de B.
decumbens. Os materiais foram agrupados pelo método de agrupamento de ligação
média entre grupos (UPGMA) e formaram-se quatro grupos distintos: grupo I com P.
maximum e B. arrecta, grupo II com todos os acesso de B. jubata; grupo III com todos
os acessos de B. nigropedata e no grupo IV todos os acessos e cultivares comerciais
das espécies B. ruziziensis, B. decumbens, B. brizantha e B. humidicola. Foi possível
agrupar os acessos e cultivares comerciais de Brachiaria através dos marcadores
moleculares de RAPD, ferramenta que poderá auxiliar na solução de problemas
taxonômicos no gênero. Além de verificar uma correlação entre a dissimilaridade média
dos acessos de uma mesma espécie e a distribuição natural das espécies no
continente Africano. Espécies com distribuição natural estreita, como a B. decumbens
e B. ruziziensis apresentaram baixa dissimilaridade genética, enquanto que, espécies
com ampla distribuição natural apresentam altas taxas de dissimilaridade.
.
PALAVRAS CHAVES: Brachiaria, marcadores moleculares, dissimilaridade genética,
dendrograma,
35
ABSTRACT
Genetic dissimilarity among accesses and cultivars of Brachiaria
estimated by RAPD markers.
The main objective of this work was to study the genetic dissimilarity among
germplasm accesses of six Brachiaria species and the most important cultivars
through RAPD markers. DNA was extracted form seed of five different accesses of the
following Brachiaria species (B. decumbens, B. ruziziensis, B. nigropedata, B.
humidicola, B. jubata e B. brizantha) donated by EMBRAPA – CNPGC, and from 12
commercial cultivars, two P. maximum and from leaves of B. arrecta. 120 primers
were tested and 10 were selected and amplified in two different concentrations of
template DNA, producing 114 polymorphic bands. With the aim of GENES program
the dissimilarity indexes were estimated for all samples analysed. The range, for all
samples, was between 0,262 and 0,907; and between the accesses from 0.262 to
0.880. The lowest range was between two B.decumbens accesses. They were
grouped by UPGMA and four groups could be clearly distinct: group I with the out
groups - P.maximum and B. arrecta; group II all accesses of B. jubata; group III with
the B. nigropedata and group IV with all accesses and commercial materials of
B.ruziziensis, B. decumbens, B. brizantha and B. humidicola. It was possible to group
all accesses and cultivars of Brachiaria, through RAPD markers and it could be helpful to
solve taxonomic problems within the genus and allowed to verify the dissimilarity inside one
species as the natural distribution in the African continent. Species with a narrow range as
B. decumbens and B. ruziziensis showed low levels of dissimilarity and natural widely
spread species showed high dissimilarity levels.
KEY WORDS: Brachiaria, molecular markers, genetic variability, dendrogram, genetic
fixation index
36
INTRODUÇÃO
As gramíneas do gênero Brachiaria abriram novas expectativas para a
pecuária tropical, devido a sua ampla faixa de adaptação, maior quantidade de
forragem e superior qualidade nutricional, além da propagação por sementes.
Sabe-se que a pastagem é a base da produção de bovinos de corte no
Brasil, e a área de pastagem com espécies cultivadas situam-se em torno de 115
milhões de hectares, com a predominância das Brachiarias (ZIMMER & EUCLIDES
FILHO, 1997; ZIMMER & EUCLIDES, 2000).
Já é realidade na pecuária nacional a intensificação dos sistemas de
produção, tornando necessário o desenvolvimento de novos cultivares forrageiros,
que combinem elevada capacidade de produção com alta qualidade e que
apresentem tolerância a condições ecológicas adversas. O lançamento de cultivares
melhorados é uma demanda constante que requer um processo contínuo de
introdução e avaliação.
O sucesso de qualquer programa de melhoramento ou de conservação
é dependente do conhecimento da quantidade de variação presente na espécie de
interesse. Em relação ao gênero Brachiaria existem sete importantes coleções no
mundo, que possuem um total de 987 acessos de 33 espécies conhecidas (KELLER-
GREIN et al., 1998). Entre as espécies de Brachiaria existe grande variabilidade
natural, com isso, identificar caracteres realmente discriminantes torna-se uma difícil
tarefa (ASSIS et al., 2003; RENVOIZE et al.,1996).
Além disso, caracteres morfológicos e agronômicos, usados para a
medição da diversidade genética em determinadas populações, apresentam uma
grande dificuldade na identificação de grupos taxonômicos próximos. Esta dificuldade
deve-se ao fato de que a grande maioria dos caracteres vegetativos é influenciada por
fatores ambientais. Para tentar solucionar este problema, técnicas moleculares têm
sido utilizadas para monitorar a variabilidade genética (PARKER et al.,1998).
Para Vilela-Morales e Valois (2000) é nos acessos de germoplasma que
podem ser encontradas fontes de variabilidade genética para a obtenção de genótipos
37
produtivos, mais adaptados às diversas condições ecológicas e resistentes a fatores
bióticos e abióticos, em consonância com as necessidades do desenvolvimento
agropecuário sustentável.
Para Chiari et al. (2006) a utilização de recursos genéticos, nativos e/ou
exóticos, é estratégica no desenvolvimento de novas variedades de forrageiras e
depende da identificação de acessos superiores, tanto do ponto de vista agronômico
quanto da variabilidade genética, para sua utilização em programas de melhoramento.
O conhecimento da variabilidade genética disponível no banco de germoplasma é
extremamente relevante para o planejamento de cruzamentos divergentes bem como
para orientar novas coletas ou intercâmbio de germoplasma para características de
interesse específicos.
Cruz (2006) vai além e diz que o sucesso de um programa de
melhoramento reside na existência de variabilidade na população de trabalho e
recomenda, para a formação de população-base, o intercruzamento entre cultivares
superiores e divergentes. Sendo que essa divergência pode ser avaliada a partir de
características agronômicas, morfológicas e moleculares. As informações múltiplas de
cada cultivar são expressas em medidas de dissimilaridade, que representam a
diversidade que há no conjunto estudado.
A demanda da agropecuária por recursos genéticos necessita cada vez
mais da utilização de métodos e processos biotecnológicos para alcançar o sucesso
da agropecuária sustentável. Na aplicação de biotecnologias para atender às
demandas de recursos genéticos, entre outros, são considerados vários processos
entre eles os marcadores moleculares (VILELA-MORALES e VALOIS, 2000).
Dentre os diversos tipos de marcadores atualmente disponíveis, os
marcadores de RAPD destacam-se pela simplicidade, rapidez, baixo custo, demanda
de quantidades mínimas de DNA, análise de um grande número de locos e a
possibilidade de estudo de espécies sobre as quais não se tem nenhum tipo de
informação genética. Entre as limitações da técnica, duas podem ser consideradas as
mais importantes. Uma delas se refere à característica dominante dos marcadores
RAPD, o que não permite a diferenciação de indivíduos heterozigotos. E a, outra, é a
38
questão da baixa repetibilidade de algumas bandas (LACERDA, 2002). Todavia, o
uso destes marcadores não é inválido (SIMMONS, 2007).
A característica dominante da técnica de RAPD certamente traz alguns
inconvenientes, principalmente do ponto de vista da análise estatística. Porém, Clark
& Lanigan (1993) e Stewart & Excoffier (1996) são alguns dos autores que têm
procurado desenvolver metodologias de análise dos dados visando contornar o
problema da dominância. Em relação a baixa repetibilidade de algumas bandas,
muitos destes estudos destacam que alterações nas concentrações de cloreto de
magnésio, DNA genômico, primer e Taq polimerase são as principais causas para o
aparecimento de bandas consideradas artefatuais. De qualquer forma, parece haver
um consenso de que a realização de estudos prévios para a escolha dos primers mais
adequados para a espécie alvo do estudo, o estabelecimento das concentrações
ótimas dos reagentes e do programa de PCR e uma cuidadosa atenção aos detalhes
reduzem bastante a possibilidade de se obter bandas de baixa repetibilidade (HEUN
& HELENTJARIS, 1993; VIRK et al., 1995).
Chiari et al. (2006) destaca a importância de conhecer a variabilidade
genética entre os acessos de Brachiaria, disponíveis no banco de germoplasma, para
se obter sucesso nos programas de melhoramento, no planejamento de cruzamentos
divergentes e para orientação de novas coletas ou intercambio de germoplasma. Para
Rocha et al. (2006) uma aplicação dos marcadores moleculares em programas de
melhoramento de Brachiaria está na determinação da variabilidade genética
disponível, auxiliando na escolha de genitores para programas de hibridação inter e
intraespecíficas.
Recentes trabalhos já mostraram a alta variabilidade genética existente
entre os acessos de B. humidicola do banco de germoplasma da Embrapa – Gado de
Corte, fazendo deste um germoplasma valioso para o melhoramento e seleção de
novos cultivares, justificando a sua manutenção (CHIARI et al., 2006).
O propósito deste trabalho foi estudar a dissimilaridade genética entre
acessos de seis diferentes espécies de Brachiaria e os principais cultivares
comerciais através de marcadores moleculares de RAPD.
39
MATERIAL
E
MÉTODOS
O experimento foi conduzido no laboratório de Genética Molecular e
Citogenética da Universidade do Oeste Paulista – UNOESTE, em Presidente
Prudente – SP.
Utilizou-se como fonte de DNA sementes de cinco diferentes acessos de
seis espécies de Brachiaria (B. brizantha, B. decumbens, B. ruziziensis, B. jubata, B.
nigropedata e B. humidicola) cedidas pela EMBRAPA – Gado de Corte e de onze
cultivares comerciais das espécies B. brizantha, B. decumbens, B. humidicola, B.
ruziziensis, uma amostra da Brachiaria híbrida cv ‘Mulato’, dois cultivares comercias
de P. maximum (‘Mombaça’ e ‘Tanzânia’) e folhas da B. arrecta totalizando 44
amostras conforme descrito nas Tabelas 1 e 2.
Para a extração de DNA utilizou-se o método de Doyle e Doyle (1987)
com adaptações. Foram utilizadas de 6 a 8 sementes por amostra, as quais foram
totalmente maceradas em cadinho de porcelana exceto para B. arrecta da qual
aproximadamente 1cm
2
de folha foi macerado em nitrogênio líquido. Após a
maceração o material foi transferido para microtubos de 1,5mL contendo 700µL de
tampão CTAB 2% previamente aquecido a 65°C. O mater ial foi homogeneizado e
mantido a 65°C por 40 minutos. Em seguida foram acr escidos 700µL de
clorofórmio:álcool isoamílico (24:1) e homogeneizados por inversão. As amostras
foram centrifugadas a 12000 rpm por 15 minutos. A porção aquosa foi recuperada e
transferida para outro tubo, ao qual foi acrescentado 8% do volume transferido de
acetato de amônio a 7,5M e 54% do volume total de isopropanol absoluto a -20ºC e
mantidos nesta temperatura por 24 horas. Posteriormente, o material foi centrifugado
a 14000 rpm por 5 minutos. O sobrenadante foi descartado e o precipitado lavado
com 700µL de etanol 70% a 8ºC, sendo novamente centrifugados a 14000rpm por 1
minuto. O etanol foi descartado e o precipitado foi seco em um fluxo de ar a
temperatura ambiente. Para a hidratação do DNA foram adicionados 100µL de
tampão TE em banho seco por 1 hora a 55°C.
O DNA foi quantificado em espectrofotômetro no comprimento de onda
de 260 nm, e diluído em TE para uma concentração de 10ng µL
-1
.
40
TABELA 1. Relação dos acessos de Brachiaria com o respectivo código,
identificação (Ident.), o número no registro nacional de germoplasma, região e pais
de origem do material catalogado no banco de germoplasma da Embrapa – Gado de
Corte
Acessos da
Embrapa
CNPGC
Código Ident. Registro Local de origem - Pais
B. ruziziensis B. ruziz 1 R100 BRA005541 Trans Nzoia/Quênia
B. ruziziensis B. ruziz 2 R106 BRA005649 Bujumbura/Burundi
B. ruziziensis B. ruziz 3 R108 BRA005584 Cibitoke/Burundi
B. ruziziensis B. ruziz 4 R109 BRA005631 Ruyigi/Burundi
B. ruziziensis B. ruziz 5 R128 BRA002291 -------
B. decumbens B. decum 1 D53 PI355744 Bogotá/Colômbia
B. decumbens B. decum 2 D7 BRA004472 South Nyanza/Quênia
B. decumbens B. decum 3 D9 BRA004499 Nakuru/Quênia
B. decumbens B. decum 4 D58 BRA000191 Embrapa- CPATU/Brasil
B. decumbens B. decum 5 D59 BRA000116
Embrapa CNPMF/Brasil (cv
'Ipean')
B. brizantha B. briz 1 B158 BRA003719 Bungoma/Etiópia
B. brizantha
B. briz
2
B23
BRA001945
Embrapa CNPGC/Brasil
B. brizantha B. briz 3 B67 BRA003336 Ilubabor/Etiópia
B. brizantha B. briz 4 B112 BRA002844 Welega/Etiópia
B. brizantha B. briz 5 B127 BRA003107 Gamo Gofa/Etiópia
B. jubata B. jubata 1 J17 BRA005223 Idamo/Etiópia
B. jubata B. jubata 2 J13 BRA005533 Yumba/Ruanda
B. jubata B. jubata 3 J8 BRA005461 Trans Nzoia/Quênia
B. jubata
B. jubata
4
J4
BRA005291
Ungoma/Quênia
B. jubata B. jubata 5 J30 BRA05380 Ericho/Quênia
B. nigropedata B. nigro 1 N203 CIAT16923 Masvingo/Zimbabwe
B. nigropedata B. nigro 2 N190 BRA001123 -------
B. nigropedata B. nigro 3 N191 BRA005916 Hwange/Zimbabwe
B. nigropedata B. nigro 4 N202 CIAT16921 BIKITA/Zimbabwe
B. nigropedata B. nigro 5 N197 CIAT16911 Urungwe/Zimbabwe
B. humidicola B. humi 1 H10 BRA004952 Inyanga/Zimbabwe
B. humidicola B. humi 2 H12 BRA004979 Inyanga/Zimbabwe
B. humidicola B. humi 3 H13 BRA005011 Masvingo/Zimbabwe
B. humidicola B. humi 4 H108 BRA001937 Embrapa CNPGC/Brasil
B. humidicola B. humi 5 H112 BRA002208 CSIRO/Austrália
As condições de amplificação foram baseadas em Williams et al. (1990)
com algumas modificações. O DNA genômico foi amplificado em um volume de
reação de 25µL, no qual utilizou-se 10% de tampão Tris-KCl (Tris-HCl 20mM, pH 8,4
e KCl 50mM), 1,5 mM MgCl
2,
0,4µM de primer (oligonucleotídeos), 0,2µM de cada
dNTP, uma unidade de Taq DNA Polimerase com diferentes concentrações de DNA
molde (25 e 50ng). As reações de RAPD foram amplificadas em um termociclador “MJ
41
– PTC 100” programado para 43 ciclos com o passo inicial de desnaturação a 94°C
por três minutos, 94°C por um minuto para desanelam ento, 37°C para anelamento
com primers por um minuto e 72ºC para elongação da cadeia por 30 segundos. Ao
final de 43 ciclos foi dado um passo final de extensão a 72°C por cinco minutos.
TABELA 2. Relação dos cultivares comerciais de Brachiaria com o respectivo código
e o número no registro nacional de cultivares.
Cultivares comerciais
Código
Registro
B. brizantha cv ‘MG4’ B. briz MG4 02256
B. brizantha
cv
‘Marandu’
B. briz
Mar
02250
B. brizantha cv `La libertad` B. briz Laliber
B. brizantha cv ‘Xaraés’
B. briz Xaraes 04509
B. brizantha cv ‘MG5’ B. briz MG5 04509
B. decumbens cv ‘Basilisk’ B. dec Basilisk
02277
B. humidicola B. hum - a 04189
B. humidicola
B. hum
-
b
04189
B. ruziziensis B. ruzi - a 02043
B. ruziziensis B. ruzi - b 02043
B. arrecta B. arrecta
B. híbrida cv ‘Mulato Mulato 09669
P.maximum
cv ‘Mombaça’
Mombaça
01697
P.maximum cv ‘Tanzânia’ Tanzânia 01699
Os produtos de amplificação foram submetidos à eletroforose em gel de
agarose 1,5% (p/v) utilizando o tampão de corrida TBE ½X. O ladder AMRESCO
100pb foi utilizado como marcador de peso molecular. Os géis foram corados com
brometo de etídeo e visualizados em uma câmara com iluminação ultravioleta
(câmara CCD Alpha-Inmotech) e as imagens capturadas pelo software Chemilmager.
Foram testados 120 primers decâmeros de combinações arbitrárias do
conjunto OPERON Technologies Inc dos grupos A, C, D, G, X e Y. Para a primeira
fase da seleção do primers optou-se em utilizar a amostra de B. brizantha cv ‘MG4’
pela maior disponibilidade de material. Foram pré-selecionados 43 primers, por
apresentarem bandas di, tri e polimórficas bem visíveis. Na segunda fase os primers
pré-selecionados foram testados em uma amostra de B. ruziziensis e outra de B.
jubata. Seguindo os mesmos critérios, foram eleitos dez primers para serem utilizados
nas reações de RAPD em todas as amostras.
Os perfis de RAPD de cada amostra foram analisados, com auxílio do
programa LabImage, pela presença (1) ou ausência (0), de bandas de tamanhos
42
moleculares idênticos para cada primer. Foram consideradas as bandas reproduzidas
nas duas diferentes concentrações de DNA. Em seguida, foi construída uma matriz de
dissimilaridade genética usando o Programa Genes - Aplicativo computacional em
genética e estatística (CRUZ, 2006), versão 2007.0.0. Com o mesmo programa foi
possível representar graficamente o padrão de divergência genética, pela construção
de um dendrograma pelo método de agrupamento de ligação média entre grupos
(UPGMA).
UPGMA é o método mais simples de construção de árvores filogenéticas
a partir de dados de distância. Emprega um algoritmo seqüencial de agrupamento, no
qual as relações são identificadas em ordem de similaridade, e a árvore é construída
passo a passo. Primeiro identifica-se entre todas as unidades estudadas as duas mais
similares considerando como se fosse uma unidade. Subseqüentemente, do resto do
grupo identifica-se outra unidade com maior similaridade, e assim por diante (BUSO,
2005).
43
RESULTADOS
E DISCUSSÃO
As 42 amostras de várias espécies do gênero Brachiaria e as 2 amostras
do gênero Panicum foram amplificadas com 10 primers selecionados, os quais
geraram um total de 114 bandas, perfazendo uma média de 11,4 bandas por primer,
sendo todos polimórficos. Os tamanhos variaram de 200 a 1450 pb como pode ser
observado na Tabela 3. Valores semelhantes foram encontrados por Chiari et al.
(2006) que em 58 acessos de B. humidicola encontraram 10 bandas por primer.
Porém, Rocha et al. (2006) avaliando acessos de B. brizantha, B. decumbens, B.
humidicola e B. ruziziensis, todos do banco de germoplasma da Embrapa – Gado de
Corte, obtiveram maior número de bandas, 17 por primer, dos quais 98% foram
polimórficos. Em Brachiaria dictyoneura, Zorzatto et al. (2006) utilizaram 11 primers
em oito acessos, perfazendo uma média de 7,9 bandas por primer, das quais 84%
polimórficas. O número de bandas encontrado no presente trabalho, que segundo
Telles et al. (2001) é mais importante que o de primers, está de acordo com o número
obtido por vários outros autores para a estimativa da diversidade genética pela
técnica de RAPD.
TABELA 3.
Seqüências nucleotídicas dos primers, número de bandas polimórficas e
tamanho dos fragmentos amplificados em todas as amostras.
Primers
Seqüência de
nucleotídeos (5’ → 3’)
Nº de loci
polimórficos
Tamanho dos
fragmentos (pb)
A5 AGG GGT CTT G 10 260 a 1000
A9 GGG TAA CGC C 10 200 a 1000
D11 AGC GCC ATT G 10 300 a 900
G5 CTG AGA CCG A 12 200 a 1000
G9 CTG ACG TCA C 11 300 a 1300
G10 AGG GCC GTT C 8 300 a 1000
G17 ACG ACC GAC A 16 200 a 1300
X15 CAG ACA AGC C 12 300 a 1450
X17 GAC ACG GAC C 13 300 a 1000
Y1 GTG GCA TCT C 12 300 a 1300
44
Foram estimados os índices de dissimilaridade genética para todos as
amostras analisadas (tabela 4, 5 e 6). Não considerando P. maximum, o intervalo de
dissimilaridade observado entre as amostras foi de 0,262 a 0,907, demonstrando uma
significativa variabilidade genética entre os acessos e cultivares do gênero Brachiária.
Outros trabalhos, que avaliaram a variabilidade genética utilizando RAPD em
gramíneas, tiveram resultados similares. Por exemplo, Dong et al. (2003) obtiveram
em Vetiveria zizanioides valores de dissimilaridade genética que variaram de 0,005 a
0,495 e Chandra et al. (2004) em Dichantium annulatum de 0,02 a 0,62.
Para cada espécie foi destacados o maior e o menor valor de
dissimilaridade genética encontrado entre os acessos, que podem ser observados na
tabela 7.
Tabela 7. Maior e menor dissimilaridade genética, em porcentagem, entre acessos
de cada espécie estudada e o país de origem de cada material.
Maior dissimilaridade Menor dissimilaridade
Espécie Acessos Origem Valor (%)
Acessos Origem Valor (%)
B. jubata
BRA005533 Ruanda
70,2
BRA005291 Quênia
40,5
BRA05380 Quênia BRA05380 Quênia
B. ruziziensis
BRA005649 Burundi
55,6
BRA005541
Quênia
34
BRA005584 Burundi BRA005649 Burundi
B. decumbens
BRA000191 Brasil
53,9
BRA000191
Brasil
26,2
PI355744 Colômbia BRA000116
Brasil
B. nigropedata
CIAT16911 Zimbabwe
57,7
BRA005916
Zimbabwe
34,8
CIAT16923 Zimbabwe CIAT16911 Zimbabwe
B. humidicola
BRA002208 Austrália
63,6
BRA001937 Brasil
40,5
BRA004952
Zimbabwe
BRA002208 Austrália
B. brizantha
BRA003336 Etiópia
72,3
BRA001945 Brasil
46
BRA003107 Etiópia BRA003719 Etiópia
Não foi possível estabelecer nenhuma relação entre o local de origem
dos acessos e os valores de dissimilaridade. Chiari et al. (2006), através do método
de agrupamento entre acessos de B. humidicola, também não relacionaram a
formação dos grupos ao local de origem dos acessos.
45
TABELA 4. Matriz de dissimilaridade genética entre todos os acessos do banco de germoplasma da Embrapa – CNPGC. Presidente Prudente/SP, 2007.
Brachiaria jubata Brachiaria ruzizienze Brachiaria decumbens Brachiaria nigropedata Brachiaria humidicola Brachiaria brizantha
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4
Brachiaria
jubata
2 0,648
3 0,550 0,651
4 0,600 0,677 0,452
5 0,537
0,702
0,450 0,405
Brachiaria
ruzizienze
1 0,776 0,639 0,741 0,721 0,684
2 0,807 0,662 0,727 0,729 0,667
0,340
3 0,778 0,708 0,764 0,696 0,704
0,380
0,556
4 0,828 0,699 0,793 0,790 0,759
0,463 0,367 0,471
5 0,782 0,694 0,722 0,746 0,732
0,453 0,481 0,490 0,451
Brachiaria
decumbens
1 0,722 0,685 0,754 0,690 0,696
0,645 0,714 0,614 0,650 0,667
2 0,754 0,662 0,742 0,779 0,730
0,621 0,603 0,590 0,581 0,641 0,411
3 0,793 0,707 0,759 0,695 0,724
0,672 0,656 0,644 0,633 0,650 0,463 0,333
4 0,833 0,732 0,774 0,772 0,782
0,721 0,684 0,741 0,707 0,702
0,539
0,463 0,362
5 0,821 0,690 0,741 0,741 0,750
0,714 0,678 0,690 0,632 0,695 0,509 0,407 0,298 0,262
Brachiaria
nigropedata
1 0,818 0,757 0,759 0,800 0,768
0,571 0,649 0,636 0,717 0,667 0,700 0,651 0,705 0,737 0,750
2 0,860 0,740 0,712 0,800 0,768
0,730 0,717 0,684 0,758 0,774 0,742 0,651 0,683 0,759 0,729 0,490
3 0,864 0,730 0,746 0,807 0,776
0,698 0,683 0,738 0,746 0,742 0,689 0,619 0,714 0,767 0,738 0,510 0,449
4 0,828 0,716 0,727 0,810 0,737
0,661 0,644 0,762 0,710 0,726 0,734 0,667 0,719 0,729 0,762 0,547 0,460 0,388
5 0,839 0,704 0,712 0,820 0,790
0,730 0,695 0,790 0,758 0,754 0,700 0,629 0,683 0,737 0,707
0,577
0,458 0,348 0,362
Brachiaria
humidicola
1 0,837 0,708 0,717 0,694 0,674
0,737 0,673 0,712 0,722 0,667 0,654 0,695 0,580 0,609 0,604 0,778 0,731 0,764 0,746 0,755
2 0,789 0,732 0,774 0,793 0,782
0,742 0,684 0,696 0,684 0,679 0,690 0,703 0,649 0,679 0,696 0,737 0,714 0,787 0,729 0,780 0,439
3 0,824 0,739 0,808 0,782 0,745
0,636 0,667 0,704 0,714 0,635 0,623 0,667 0,549 0,544 0,600 0,768 0,768 0,817 0,780 0,810 0,581 0,511
4 0,796 0,754 0,755 0,778 0,740
0,767 0,776 0,768 0,797 0,750 0,759 0,726 0,648 0,706 0,673 0,764 0,667 0,727 0,754 0,692
0,636
0,565 0,600
5 0,880 0,831 0,840 0,875 0,800
0,776 0,764 0,755 0,786 0,712 0,698 0,667 0,600 0,660 0,653 0,726 0,674 0,736 0,741 0,674 0,610 0,568 0,571 0,405
Brachiaria
brizantha
1 0,736 0,712 0,790 0,724 0,660
0,677 0,705 0,695 0,705 0,632 0,621 0,597 0,603 0,549 0,574 0,690 0,774 0,742 0,726 0,690 0,640 0,630 0,580 0,679 0,604
2 0,778 0,743 0,764 0,763 0,750
0,672 0,655 0,712 0,678 0,574 0,726 0,613 0,597 0,623 0,593 0,707 0,750 0,797 0,781 0,750 0,686 0,623 0,654 0,673 0,653 0,460
3 0,744 0,791 0,809 0,755 0,739
0,722 0,755 0,720 0,731 0,700 0,686 0,702 0,612 0,702 0,694 0,714 0,765 0,839 0,800 0,789 0,659 0,644 0,682 0,643 0,650 0,587 0,512
4 0,772 0,803 0,800 0,758 0,724
0,819 0,794 0,824 0,829 0,791 0,797 0,750 0,727 0,738 0,750 0,746 0,785 0,694 0,677 0,726 0,776 0,695 0,746 0,696 0,727 0,672 0,710 0,692
5 0,760 0,797 0,815 0,810 0,821
0,778 0,767 0,737 0,724 0,719 0,684 0,698 0,667 0,698 0,759 0,817 0,776 0,803 0,746 0,776 0,789 0,647 0,653 0,700 0,681 0,623 0,691
0,723
0,643
Em negrito e sublinhado o maior e o menor valor, respectivamente, de dissimilaridade entre os acessos dentro de cada espécie.
46
TABELA 5: Matriz de dissimilaridade genética entre todos os acessos do banco de germoplasma da Embrapa - CNPGC e os cultivares comerciais. Presidente
Prudente/SP, 2007.
Brachiria jubata Brachiria ruzizienze Brachiria decumbens Brachiria nigropedata Brachiria humidicola Brachiria brizantha
1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5 1 2 3 4 5
B.briz MG4 0,821 0,792 0,764 0,763 0,814
0,734 0,721 0,712 0,655 0,717
0,661 0,613 0,571 0,623 0,593
0,810 0,729 0,738 0,700 0,707
0,660 0,596 0,704 0,722 0,653
0,672 0,643 0,769 0,689 0,531
B. briz Mar
0,827 0,811 0,811 0,786 0,774
0,712 0,741 0,732 0,719 0,691
0,655 0,650 0,611 0,640 0,685
0,750 0,772 0,691 0,696 0,727
0,681 0,612 0,617 0,638 0,581
0,588 0,709 0,745 0,585 0,477
B. dec Basilisk
0,810 0,769 0,797 0,813 0,763
0,727 0,672 0,705 0,650 0,667
0,586 0,587 0,518 0,593 0,589
0,762 0,721 0,750 0,714 0,742
0,679 0,643 0,648 0,667 0,620
0,621 0,661 0,759 0,683 0,500
B. hum - a
0,729 0,743 0,833 0,848 0,796
0,754 0,783 0,754 0,783 0,759
0,679 0,650 0,684 0,692 0,685
0,772 0,772 0,839 0,803 0,772
0,708 0,583 0,556 0,546 0,644
0,642 0,660 0,659 0,684 0,660
B. ruzi - a
0,722 0,629 0,732 0,794 0,783
0,708 0,714 0,746 0,694 0,667
0,586 0,565 0,661 0,690 0,638
0,721 0,762 0,730 0,672 0,678
0,814 0,754 0,719 0,780 0,722
0,667 0,746 0,782 0,761 0,707
B. briz Laliber
0,803 0,750 0,750 0,769 0,738
0,625 0,629 0,593 0,607 0,576
0,590 0,450 0,500 0,597 0,617
0,719 0,677 0,688 0,672 0,677
0,702 0,597 0,600 0,643 0,569
0,500 0,593 0,685 0,641 0,537
B. briz Xaraes
0,820 0,771 0,804 0,862 0,811
0,724 0,685 0,673 0,608 0,704
0,737 0,564 0,648 0,680 0,647
0,807 0,741 0,772 0,754 0,764
0,776 0,706 0,740 0,784 0,771
0,704 0,722 0,761 0,719 0,726
B. hum - b
0,825 0,795 0,768 0,767 0,754
0,719 0,683 0,625 0,683 0,700
0,730 0,721 0,672 0,767 0,695
0,754 0,643 0,742 0,766 0,754
0,667 0,604 0,709 0,654 0,660
0,762 0,738 0,796 0,791 0,719
B. briz MG5
0,828 0,798 0,750 0,771 0,800
0,779 0,769 0,742 0,750 0,746
0,773 0,706 0,698 0,729 0,700
0,738 0,625 0,705 0,710 0,738
0,810 0,750 0,800 0,817 0,807
0,746 0,700 0,800 0,633 0,604
B. ruzi - b
0,790 0,685 0,754 0,754 0,803
0,600 0,579 0,564 0,554 0,597
0,698 0,672 0,683 0,754 0,661
0,700 0,762 0,710 0,773 0,721
0,814 0,754 0,763 0,737 0,790
0,769 0,726 0,759 0,723 0,750
B. arrecta
0,816 0,882 0,889 0,818 0,830
0,783 0,871 0,807 0,853 0,869
0,797 0,870 0,875 0,898 0,885
0,845 0,845 0,869 0,889 0,883
0,907 0,839 0,830 0,827 0,885
0,790 0,867 0,857 0,714 0,745
Mulato 0,750 0,756 0,820 0,778 0,787
0,629 0,698 0,689 0,739 0,672
0,683 0,714 0,688 0,738 0,750
0,803 0,838 0,791 0,776 0,821
0,754 0,695 0,655 0,696 0,750
0,650 0,689 0,786 0,667 0,510
Mombaça 0,814 0,788 0,780 0,758 0,807
0,692 0,719 0,750 0,719 0,714
0,703 0,714 0,765 0,778 0,788
0,766 0,766 0,843 0,812 0,785
0,836 0,868 0,807 0,823 0,814
0,714 0,769 0,848 0,817 0,712
Tanzânia 0,814 0,772 0,780 0,758 0,787
0,692 0,698 0,750 0,739 0,714
0,683 0,714 0,765 0,758 0,750
0,726 0,746 0,809 0,794 0,766
0,817 0,815 0,787 0,841 0,793
0,672 0,730 0,807 0,800 0,712
TABELA 6: Matriz de dissimilaridade genética entre os cultivares comericais. Presidente Prudente/SP, 2007.
.
47
Observando a Tabela 4, os valores de dissimilaridade genética
encontrado entre os 30 acessos analisados variaram de 0,262 a 0,880, sendo
menor entre dois acessos de B. decumbens, o BRA000191 (B. decum 4) e o
BRA000116 (B. decum 5). A maior dissimilaridade encontrada foi entre o acesso
de B. humidicola BRA002208 (B. humi 5) e o acesso de B. jubata BRA005223 (B.
jubata 1). Um amplo intervalo de dissimilaridade 0,339 a 0,915, também foi
observado por Rocha et al. (2006) em 14 acessos pertencentes ao banco de
germoplasma da Embrapa – Gado de Corte de quatro espécies de Brachiaria, B.
brizantha, B. decumbens, B. humidicola e B. ruziziensis, através de marcadores
RAPD. Igualmente, os dois acessov
48
Neste estudo, pôde-se verificar uma correlação entre a
dissimilaridade média dos acessos de uma mesma espécie e a distribuição natural
destas no continente Africano. As duas espécies de menor dissimilaridade
genética, B. decumbens e B. ruziziensis, apresentam uma estreita faixa de
distribuição natural. Os acessos de B. decumbens que compõe o banco de
germoplasma foram coletados no oeste do Quênia, Rwanda e Burundi, nas
latitudes 4º21’S a 1º09’N. E os acessos de B. ruziziensis também foram coletados
em Burundi, Rwanda e Quênia nas latitudes 4º05’S a 2º54’S. Porém, as espécies
com maior dissimilaridade média entre os acessos possuem ampla distribuição
natural, como exemplo, B. brizantha que é encontrada em toda a África Tropical,
entre as latitudes 25º05’S a 12º36’N, com distribuição semelhante para a B. jubata,
B. humidicola e B. nigropedata (KELLER-GREIN et al., 1996). Pode-se inferir que
as espécies de Brachiaria que apresentam ampla distribuição natural adaptaram-
se a diferentes condições edafoclimáticas
graças a alta variabilidade genética.
Os mesmos acessos de Brachiaria deste trabalho foram utilizados por
Machado Neto et al. (2002) para verificar as diferenças intra-espécies através da
eletroforese de proteína (SDS-PAGE) extraídas das sementes, quando foi possível
verificar que os acessos de Brachiaria apresentaram variações em quase todas as
espécies, sendo a B. jubata geneticamente mais homogênea que as outras
espécies estudadas, o que diverge do presente trabalho em que a similaridade
média entre os acessos de B. jubata foi inferior a B. decumbens, B. ruziziensis, B.
nigropedata e B. humidicola.
Os valores de dissimilaridade genética para todas as amostras
(Tabela 4, 5 e 6) foram utilizados para as análises de agrupamento pelo método de
agrupamento de ligação média entre grupos (UPGMA). Para representar
graficamente o padrão de dissimilaridade genética esses dados foram utilizados na
construção de um dendrograma (Figura 1).
49
50
O dendrograma revelou semelhança com a classificação por
caracteres morfológicos proposto por Renvoize et al. (1996), isolando B. arrecta,
pertencente ao grupo 3, das demais espécies de Brachiaria. B. jubata e B.
nigropedata, classificadas nos grupos 6 e 2, respectivamente, foram separadas
das espécies pertencentes ao grupo 5, composto pela B. decumbens, B. brizantha
e B. ruziziensis. Porém, de forma não coerente, B. humidicola classificada no
mesmo grupo da B. jubata (grupo 6) por Renvoize et al. (1996) apresentou neste
estudo uma maior proximidade genética com as espécies do grupo 5.
51
CONCLUSÕES
Através dos marcadores moleculares de RAPD foi possível estabelecer
que as espécies de Brachiaria estudadas apresentam amplo intervalo de
dissimilaridade (0,262 a 0,907) entre acessos e cultivares comerciais.
Esses dados indicam uma alta variabilidade genética dentro de cada
espécie, o que justifica a manutenção de todos os acessos estudados no banco de
germoplasma e servem de subsídio para programas de melhoramento no gênero
Brachiaria.
Pode-se verificar uma correlação entre a dissimilaridade média dos
acessos de uma mesma espécie e a sua distribuição natural no continente
Africano. Espécies com distribuição natural estreita, como B. decumbens e B.
ruziziensis apresentaram menor dissimilaridade genética, enquanto que, espécies
com ampla distribuição natural apresentaram altos valores de dissimilaridade.
Foi possível agrupar os acessos e cultivares comerciais de Brachiaria,
através dos marcadores moleculares de RAPD, ferramenta que poderá auxiliar na
construção de uma chave taxonômica para o gênero.
52
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